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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-29
(45)【発行日】2024-09-06
(54)【発明の名称】細胞群及びその取得方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/078 20100101AFI20240830BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20240830BHJP
A61K 35/51 20150101ALI20240830BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240830BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240830BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20240830BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240830BHJP
【ＦＩ】
C12N5/078
A61K35/15
A61K35/51
A61P9/00
A61P9/10
A61P17/02
A61P29/00
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021566846
(86)(22)【出願日】2020-10-08
(86)【国際出願番号】 JP2020039003
(87)【国際公開番号】W WO2021131261
(87)【国際公開日】2021-07-01
【審査請求日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】P 2019231606
(32)【優先日】2019-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】502285457
【氏名又は名称】学校法人順天堂
(73)【特許権者】
【識別番号】519457937
【氏名又は名称】株式会社リィエイル
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100107386
【弁理士】
【氏名又は名称】泉谷 玲子
(72)【発明者】
【氏名】田中 里佳
(72)【発明者】
【氏名】古賀 三奈子
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１１－１６０６６１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／１４６１３１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／０６８２１７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】MASUDA, Haruchika et al.，Vasculogenic Conditioning of Peripheral Blood Mononuclear Cells Promotes Endothelial Progenitor Cell，Journal of the American Heart Association，2014年，Vol.3, e000743，pp.1-29
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／０７８
Ａ６１Ｋ ３５／１５
Ａ６１Ｋ ３５／５１
Ａ６１Ｐ ９／００
Ａ６１Ｐ ９／１０
Ａ６１Ｐ １７／０２
Ａ６１Ｐ ２９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、１０～１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子、１～５００ｎｇ／ｍＬのインタ一ロイキン６、１０～１０００ｎｇ／ｍＬのＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、１～５００ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン及び５～５００ｎｇ／ｍＬの血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、０．１容量％以上２０容量％以内の濃度の血清、を含む培地中で培養して得られ、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が６０％以上であり、そして、ＣＣＲ２（－）である細胞が９５％以上である、細胞群であって ここにおいて、培地は、因子として幹細胞因子及びインタ一ロイキン６の双方を同時に含むことはない、前記細胞群。
【請求項2】
培地が、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子から選択される３因子又は４因子を含む、請求項１に記載の細胞群。
【請求項3】
血清が、ウシ又はヒトの血清である、請求項１又は２に記載の細胞群。
【請求項4】
培地が、５０～５００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子、５～１００ｎｇ／ｍＬのインタ一ロイキン６、５０～５００ｎｇ／ｍＬのＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、５～１００ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン及び２０～１００ｎｇ／ｍＬの血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、０．５容量％以上１０容量％以内の濃度の血清、を含む、請求項１に記載の細胞群。
【請求項5】
ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が５０％以上である、請求項４に記載の細胞群。
【請求項6】
ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が８０％以上である、請求項４又は５に記載の細胞群。
【請求項7】
請求項１－６のいずれか１項に記載の細胞群の取得方法であって、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、１０～１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子、１～５００ｎｇ／ｍＬのインタ一ロイキン６、１０～１０００ｎｇ／ｍＬのＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、１～５００ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン及び５～５００ｎｇ／ｍＬの血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、０．１容量％以上２０容量％以内の濃度の血清、を含む培地中で培養する、ことを含み、 ここにおいて、培地は、因子として幹細胞因子及びインタ一ロイキン６の双方を同時に含むことはない、前記方法。
【請求項8】
細胞群において、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が５０％以上である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
培地が、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子から選択される３因子又は４因子を含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項10】
血清がウシ胎児血清である、請求項７－９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
培地が、５０～５００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子、５～１００ｎｇ／ｍＬのインタ一ロイキン６、５０～５００ｎｇ／ｍＬのＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、５～１００ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン及び２０～１００ｎｇ／ｍＬの血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、０．５容量％以上１０容量％以内の濃度の血清を含む、請求項７－１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
請求項１－６のいずれか１項に記載の細胞群を含む、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療用組成物。
【請求項13】
虚血性疾患が、四肢虚血である、請求項１２に記載の治療用組成物。
【請求項14】
虚血性疾患が、潰瘍を伴う四肢虚血である、請求項１２又は１３に記載の治療用組成物。
【請求項15】
血管新生及び／又は創傷治癒を促進する、請求項１２－１４のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞群及びその取得方法、に関する。本発明の細胞群は、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養して得られる、ものである。本発明はまた、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養して得られる細胞群を含む、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療用組成物、に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、虚血性疾患を対象として、骨髄単核球移植治療や末梢血幹細胞採取による血管内皮前駆細胞（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ；ＥＰＣ）を用いた細胞移植治療法がおこなわれるようになった。それゆえ、ＥＰＣを大量に培養する技術が特に求められていた。ＣＤ３４及び／又はＣＤ１３３陽性細胞からの血管内皮前駆細胞の生体外増幅方法は、効率的なＥＰＣの培養技術を提供することを可能にした（特許文献１）。さらに血管内皮細胞分化動態解析方法によって内皮細胞様大コロニー（分化型ＥＰＣコロニー）形成細胞と内皮細胞様小コロニー（未分化型ＥＰＣコロニー）形成細胞が存在することが明らかになり細胞移植による治療効果を予測、把握することを可能にした（特許文献２）。また骨髄単核球からＣＤ３４及び／又はＣＤ１３３陽性細胞を効率的に増幅させる方法を示した（特許文献３）。
【0003】
国際公開ＷＯ２０１４／０５１１５４に示されるように、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球画分から血管内皮前駆細胞又は抗炎症・免疫寛容誘導細胞が富化した細胞群を増幅させる方法（以下、本明細書において、「ＱＱ－ＭＮＣ法」）と呼称する場合がある）を記載している。当該方法は、（１）幹細胞因子（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦ），（２）インターロイキン６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６；ＩＬ－６），（３）ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＭＳ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３ ｌｉｇａｎｄ；ＦＬ），（４）トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＴＰＯ）及び（５）血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）の５つの因子を含む無血清培地で、単核球を培養することにより、ＥＰＣを含む細胞群を生体外で増幅する、というものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
［特許文献１］国際公開 ＷＯ２００６／０９０８８２
［特許文献２］国際公開 ＷＯ２００６／０９０８８６
［特許文献３］国際公開 ＷＯ２００６／０９３１７２
［特許文献４］国際公開ＷＯ２０１４／０５１１５４
［特許文献２］国際公開 ＷＯ２００６／０９０８８６
［特許文献３］国際公開 ＷＯ２００６／０９３１７２
［特許文献４］国際公開ＷＯ２０１４／０５１１５４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明者らは、鋭意研究に努めた結果、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で、培養することにより、血管再生能及び創傷治癒能を有し、かつ、ＱＱ－ＭＮＣ法によって得られる細胞群とは異なる新たな細胞群の取得に成功し、本発明を想到した。
【0006】
本発明は、細胞群を提供することを目的とする。本発明の細胞群は、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養して得られる、ものである。
【0007】
本発明はまた、細胞群の取得方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養する、ことを含む。
【0008】
本発明はさらに、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療用組成物を提供することを目的とする。本発明の組成物は、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養して得られる細胞群を含む。
【課題を解決するための手段】
【0009】
限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］ 骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養して得られる、細胞群。
［態様２］ 培地が、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子から選択される３因子又は４因子を含む、態様１に記載の細胞群。
［態様３］ 血清が、ウシ又はヒトの血清である、態様１又は２に記載の細胞群。
［態様４］ 血清が、培地中に０．５容量％以上１０容量％の濃度で含まれる、態様１－３のいずれか１項に記載の細胞群。
［態様５］ ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が６０％以上であり、そして、ＣＣＲ２（－）である細胞が９５％以上である、態様１－４のいずれか１項に記載の細胞群。
［態様６］ ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が５０％以上である、態様５に記載の細胞群。
［態様７］ ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が８０％以上である、態様５又は６に記載の細胞群。
［態様８］ 骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養する、ことを含む、態様１－７のいずれか１項に記載の細胞群の取得方法。
［態様９］ 細胞群において、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が６０％％以上であり、そして、ＣＣＲ２（－）である細胞が９５％以上である、態様８に記載の方法。
［態様１０］ 細胞群において、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が５０％以上である、態様８又は９に記載の方法。
［態様１１］ 培地が、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子から選択される３因子又は４因子を含む、態様８－１０のいずれか１項に記載の方法。
［態様１２］ 血清がウシ胎児血清である、態様８－１１のいずれか１項に記載の方法。
［態様１３］ 血清が、培地中に０．５容量％以上１０容量％の濃度で含まれる、態様８－１２のいずれか１項に記載の方法。
［態様１４］ 態様１－７のいずれか１項に記載の細胞群を含む、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療用組成物。
［態様１５］ 虚血性疾患が、四肢虚血である、態様１４に記載の治療用組成物、
［態様１６］ 虚血性疾患が、漬瘍を伴う四肢虚血である、態様１４又は１５に記載の治療用組成物。
［態様１７］ 血管新生及び／又は創傷治癒を促進する、態様１４－１６のいずれか１項に記載の治療用組成物。
［態様１］ 骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養して得られる、細胞群。
［態様２］ 培地が、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子から選択される３因子又は４因子を含む、態様１に記載の細胞群。
［態様３］ 血清が、ウシ又はヒトの血清である、態様１又は２に記載の細胞群。
［態様４］ 血清が、培地中に０．５容量％以上１０容量％の濃度で含まれる、態様１－３のいずれか１項に記載の細胞群。
［態様５］ ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が６０％以上であり、そして、ＣＣＲ２（－）である細胞が９５％以上である、態様１－４のいずれか１項に記載の細胞群。
［態様６］ ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が５０％以上である、態様５に記載の細胞群。
［態様７］ ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が８０％以上である、態様５又は６に記載の細胞群。
［態様８］ 骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養する、ことを含む、態様１－７のいずれか１項に記載の細胞群の取得方法。
［態様９］ 細胞群において、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が６０％％以上であり、そして、ＣＣＲ２（－）である細胞が９５％以上である、態様８に記載の方法。
［態様１０］ 細胞群において、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が５０％以上である、態様８又は９に記載の方法。
［態様１１］ 培地が、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子から選択される３因子又は４因子を含む、態様８－１０のいずれか１項に記載の方法。
［態様１２］ 血清がウシ胎児血清である、態様８－１１のいずれか１項に記載の方法。
［態様１３］ 血清が、培地中に０．５容量％以上１０容量％の濃度で含まれる、態様８－１２のいずれか１項に記載の方法。
［態様１４］ 態様１－７のいずれか１項に記載の細胞群を含む、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療用組成物。
［態様１５］ 虚血性疾患が、四肢虚血である、態様１４に記載の治療用組成物、
［態様１６］ 虚血性疾患が、漬瘍を伴う四肢虚血である、態様１４又は１５に記載の治療用組成物。
［態様１７］ 血管新生及び／又は創傷治癒を促進する、態様１４－１６のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図3】図３は、５３歳糖尿病女性患者の末梢血より調製したＲＥ－０１の構成細胞成分に関するフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）の解析結果を示す。比較例として、５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ－ＱＱ）を用いた。
【発明を実施するための形態】
【0011】
１．細胞群
本発明は、細胞群に関する。
本発明は、細胞群に関する。
【0012】
本発明の細胞群は、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養することによって得られる。
【0013】
上記細胞群は、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を培養することによって得られる。上記細胞群の取得のために用いられる「単核球」とは、末梢血、骨髄又は臍帯血等に含まれる円形核を持つ細胞の総称で、リンパ球、単球、マクロファージ、血管内皮前駆細胞、造血幹細胞等が含まれる。例えば、動物から骨髄、臍帯血又は末梢血を採取し、それを例えば単核球分離用採血管を用いることにより、又は密度勾配遠心法に付して該分画を抽出することにより単核球が得られる。密度勾配遠心法としては、単核球分画が形成されれば特に限定されない。例えば、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてもよい。
【0014】
骨髄、臍帯血又は末梢血が由来する動物種は、特に限定されない。動物種には、虚血性疾患、炎症性疾患、又は難治性創傷等の疾患に対する細胞移植療法が適用されるヒトを含む哺乳動物一般が含まれる。臨床応用という目的に鑑みれば、好ましくはヒトである。
【0015】
骨髄、臍帯血又は末梢血が由来する対象は特に限定されない。一態様として、例えば、健常者、糖尿病患者、又は、重症下肢虚血の患者であってもよい。
【0016】
幹細胞因子（ＳＣＦ）は、２４８個のアミノ酸からなる分子量約３０，０００の糖タンパク質である。選択的スプライシングにより可溶型と膜結合型が存在するが、上記細胞群の取得のためにＳＣＦは単核球の培養に有用である限りいずれのタイプのＳＣＦでもよい。好ましくは可溶型である。ＳＣＦの由来等は特に限定されない。非限定的に、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。培養培地中のＳＣＦの濃度は、用いるＳＣＦの種類によっても異なり、単核球の培養に有用である限り特に限定されない。ヒト組換えＳＣＦの場合であれば、非限定的に、例えば１０～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【0017】
インターロイキン６（ＩＬ－６）は、Ｂ細胞の抗体産生細胞への最終分化を誘導する因子として単離された分子量２１万の糖タンパク質である。ＩＬ－６は、一般に、免疫応答、造血系や神経系細胞の増殖分化、急性期反応等に関与することが知られている。上記細胞群の取得のために用いるＩＬ－６は、特に限定されず、適宜選択される。ヒトの単核球の培養に用いる場合には、ヒトＩＬ－６が好ましく、安定した供給が見込まれる組換え体が特に好ましい。商業的に入手可能なものが知られている。培養培地中のＩＬ－６の濃度は、用いるＩＬ－６の種類によっても異なり、単核球の培養に有用である限り特に限定されない。ヒト組換えＩＬ－６の場合であれば、非限定的に、例えば１～５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５～１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
【0018】
ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬ）は、初期造血制御において重要な役目を担う受容体型チロシンキナーゼのリガンドとして知られている。いくつかの選択的スプライシングによる産物が知られているが、造血系幹細胞の増殖を刺激するという報告がある。上記細胞群の取得のために用いるＦＬは、単核球の培養に有用である限り、いずれのタイプのＦＬであってもよい。商業的に入手可能なものが知られている。培養培地中のＦＬの濃度は、用いるＦＬの種類によっても異なり、単核球の培養に有用である限り特に限定されない。ヒト組換えＦｌｔ－３リガンドの場合であれば、非限定的に、例えば１０～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【0019】
トロンボポエチン（ＴＰＯ）は、造血系サイトカインの一種であり、造血幹細胞から巨核球が作られる過程に特異的に作用し、巨核球の産生を促進することが知られている。上記細胞群の取得のために用いるＴＰＯの由来等は特に限定されない。安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。培養培地中のＴＰＯの濃度は、用いるＴＰＯの種類によっても異なり、単核球の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＴＰＯの場合であれば、非限定的に、例えば１～５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５～１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
【0020】
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に特異的に作用する増殖因子であり、主に血管周囲の細胞で産生されることが知られている。選択的スプライシングによってサイズの異なる数種のＶＥＧＦタンパク質が産生されるが、上記細胞群の取得のために用いるＶＥＧＦはＥＰＣのコロニー形成を可能にする限りいずれのタイプのＶＥＧＦでもよい。好ましくはＶＥＧＦ１６５である。ＶＥＧＦの由来等は特に限定されない。安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。培養培地中のＶＥＧＦの濃度は、用いるＶＥＧＦの種類によっても異なり、単核球の培養に有用である限り特に限定されな。ヒト組換えＶＥＧＦ１６５の場合であれば、非限定的に、例えば約５～５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０～１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【0021】
単核球の培養に用いる培養培地に添加される各種因子はまた、非限定的に、単核球が由来する動物と同種の動物に由来する因子で統一してもよい。このように単核球及び各種因子の由来を統一することで、同種異系移植等の同種移植に好適な細胞培養物が得られる。また、細胞移植が意図される個体由来の単核球を用いることで、同種同系移植に好適な細胞培養物を得ることも可能である。
【0022】
上記した各成分は培養培地で所定の濃度に溶解するか、あるいはあらかじめ各成分の濃縮液（ストック溶液）を調製し、培養培地で所定の濃度に希釈することによって、単核球を培養するための培養培地を調製することができる。例えば市販の培養培地に必要な成分を所定の濃度となるよう溶解した後、濾過滅菌等により滅菌するか、あるいは濾過滅菌等により滅菌したストック溶液を無菌的に市販の培養培地に添加、希釈することによって培養培地を調製することができる。濾過滅菌は当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば０．２２μｍや０．４５μｍのミリポアフィルター等を用いて行う。
【0023】
本発明で用いられる「培養培地」は、当分野で通常用いられている培地を利用することができ、例えば造血幹細胞の増殖用培地として知られている培養地を用いることができる。培養培地として用いられる基礎培地としては、例えば、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、ＳＣＧＭ、ＥＢＭ等が挙げられる。
【0024】
上記細胞群を取得するために、単核球を培養するための培地は、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子の他に、血清、を含む。
【0025】
血清の種類は特に限定されない。非限定的に、一態様において、血清は、ウシ又はヒトの血清である。一態様において、血清は、ウシ胎児血清及び／又はヒト血清アルブミンである。培地中における血清の濃度も特に限定されない。一態様において、血清は培地中に、０．１容量％以上、０．３容量％以上、０．５容量％以上含まれる。培地中の血清の濃度の上限は特にない。一態様において、３０容量％以内、２０容量％以内、１０容量％以内、５容量％以内である。非限定的に、血清は、培地中に０．１容量％以上２０容量％の濃度、培地中に０．５容量％以上１０容量％の濃度で含まれる。
【0026】
単核球培養は、単核球を含有する細胞懸濁液を、上述した因子及び血清を含む培地に添加することにより行われる。細胞懸濁液としてはまた、単核球を含有する体液自体（例えば、骨髄液、臍帯血、末梢血）を用いることもできる。単核球の培養条件は特に限定されず、通常当分野で実施される条件で実施することができる。非限定的に、例えば、５％ＣＯ２雰囲気下、約３７℃で培養される。培養期間は、非限定的に例えば、３日間以上であり、５日間以内、６日間以内、７日間以内、１０日間以内である。例えば、３日間－１０日間、３日間－６日間である。単核球の培地中の濃度は、単核球の培養を可能とする限り特に限定されないが、例えば約０．１～１０×１０６細胞／ｍｌ、より好ましくは約０．５～５×１０６細胞／ｍｌである。
【0027】
本明細書において、「細胞群」とは、単核球を上述した因子及び血清を含有する培地で培養した結果得られる細胞の総称である。
【0028】
単核球の培養に用いる培養培地は、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される因子のうち、４以下の因子を含む。
【0029】
一態様において、培地は、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子から選択される、２以上の因子、又は３以上の因子を含む。一態様において、培地は、上記５因子から選択される、２以上４以下の因子を含む。一態様において、培地は、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子から選択される、３因子又は４因子を含む。
【0030】
非限定的に、単核球の培養に用いる培養培地は、従って本発明の培養方法で用いられる培養培地は例えば、ｉ）ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子の組み合わせ、あるいは、ｉｉ）幹細胞因子、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、及び血管内皮細胞増殖因子の組み合わせを含む。培地は、より好ましくは、約８０～１２０ｎｇ／ｍｌのＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、約１５～２５ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン及び約４０～６０ｎｇ／ｍｌの血管内皮細胞増殖因子の組み合わせを含む。
【0031】
一態様において、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養することによって得られる細胞群は、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞を、培養前の単核球の細胞群よりも多く含む。非限定的に、培養により、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の割合が、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上に増幅される。非限定的に、細胞群中、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が細胞群全体の、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上である。そして細胞群は、ＣＣＲ２（－）である細胞を、培養前の単核球の細胞群よりも多く含む。非限定的に、培養により、ＣＣＲ２（－）である細胞の割合が、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上に増幅される。非限定的に、細胞群中、ＣＣＲ２（－）である細胞が、細胞群全体の６０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上である。非限定的に、一態様において、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）及びＣＤ３（＋）である細胞が６０％以上であり、そして、ＣＣＲ２（－）である細胞が９５％以上である。
【0032】
骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養することにより、安定的に、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）及びＣＤ３（＋）をより多く含む細胞群を得ることができる。さらにＱＱ－ＭＮＣ法によって得られる細胞群よりも、抗炎症性マクロファージＭ２を含むＣＤ２０６陽性中のＣＸＣＲ４陽性細胞の割合が顕著に増える。非限定的に、本発明者らは、上記培養により、以下の効果の観察されることが見いだされた。
【0033】
抗炎症性マクロファージＭ２を含むＣＤ２０６陽性が増加する；
血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含むＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞が増加する；
Ｔ細胞、特にＨｅｌｐｅｒ Ｔ細胞やＡｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｔ細胞などのＣＤ３陽性細胞が増加する。
血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含むＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞が増加する；
Ｔ細胞、特にＨｅｌｐｅｒ Ｔ細胞やＡｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｔ細胞などのＣＤ３陽性細胞が増加する。
【0034】
一方、炎症性単球／マクロファージであるＣＣＲ２陽性細胞、Ｂ細胞（ＣＤ１９陽性細胞）及びＮＫ細胞（ＣＤ５６陽性細胞）は減少することが観察された。
【0035】
非限定的に、一態様において、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養することによって得られる細胞群は、ＱＱ－ＭＮＣ法によって得られる細胞群よりも、より高い回収率を示す。さらに、生存率が高い。そして、回収後の安定性にも優れている。これらは、より高い治療効果をもたらすものである。
【0036】
一態様において、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養することによって得られる細胞群において、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞を、培養前の単核球の細胞群よりも多く含む。非限定的に、培養により、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞の割合が、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上に増幅される。非限定的に、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上である。一態様において、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が５０％以上である。一態様において、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が８０％以上である。
【0037】
本発明の細胞群は、ＱＱ－ＭＮＣ法によって得られる細胞群よりも特にこのＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞をより多く含む細胞群である。
【0038】
２．細胞群の取得方法
本発明はまた、細胞群の取得方法に関する。
本発明はまた、細胞群の取得方法に関する。
【0039】
本発明の方法は、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養する、ことを含む。
【0040】
「細胞群」、「単核球」、「幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子」の各因子、「血清」、「培地」等については、上記「１．細胞群」で説明した通りである。
【0041】
細胞群における、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）及びＣＤ３（＋）である細胞の割合、ＣＣＲ２（－）である細胞の割合、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞の割合、についても、上記「１．細胞群」で説明した通りである。
【0042】
一態様において、上記方法によって得られる細胞群において、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）及びＣＤ３（＋）である細胞が８０％以上であり、そして、ＣＣＲ２（－）である細胞が９５％以上である。
【0043】
一態様において、上記方法によって得られる細胞群において、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が５０％以上である。
【0044】
一態様において、上記方法において、培地は、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子から選択される３因子又は４因子を含む。
【0045】
一態様において、上記方法において、血清は、ウシ又はヒトの血清である。一態様において、血清はウシ胎児血清である。一態様において、血清は、培地中に０．５容量％以上１０容量％の濃度で含まれる。
【0046】
３．治療用組成物
本発明は、さらに、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療用組成物に関する。本発明の治療用組成物は、「１．細胞群」で説明した細胞群を含む。細胞群が由来する単核球は、治療用組成物を使用する対象に由来しても（自家）、治療用組成物を使用する対象以外に由来しても（他家）よい。
本発明は、さらに、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療用組成物に関する。本発明の治療用組成物は、「１．細胞群」で説明した細胞群を含む。細胞群が由来する単核球は、治療用組成物を使用する対象に由来しても（自家）、治療用組成物を使用する対象以外に由来しても（他家）よい。
【0047】
「虚血性疾患」は、血量の減少によって組織内の血流が下がり、細胞の変性、萎縮、線維化などの組織障害が生じることによって起こる疾患である。虚血はその原因により、閉塞性虚血、圧迫性虚血、痙攣性虚血、代償性虚血に大別される。虚血が持続すると細胞の変性、萎縮、線維化が生じる。「虚血性疾患」には、四肢虚血、虚血性潰瘍、虚血性心疾患、脳梗塞等が含まれる。「脳梗塞」（又は脳軟化症）は、脳を栄養する動脈の閉塞、又は狭窄のため、脳虚血を来たし、脳組織が酸素、又は栄養の不足のため壊死、又は壊死に近い状態になる事をいう、脳血栓及び脳塞栓に分類される。「四肢虚血」は、手足に血液を供給する動脈が狭窄又は閉塞する疾患であり、この閉塞性動脈硬化症が重症化すると、重症の四肢虚血となり、疼痛などの症状及び難治性の潰瘍が生じ、最悪の場合、切断が必要になる場合もある。非限定的に、四肢は一態様において下肢である。
【0048】
非限定的に、一態様において、虚血性疾患は、四肢虚血である。虚血性疾患は、潰瘍を伴う四肢虚血である。
【0049】
「炎症性疾患」は、なんらかの原因により組織損傷などの異常が生じることで症状を起こす疾患の総称である。炎症性疾患には、クローン病、肝硬変、肝炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患等が含まれる。
【0050】
上記治療用組成物は、血管新生及び／又は創傷治癒を促進する。よって、血管新生及び／又は創傷治癒により治療できる疾患に適用することができる。「血管新生及び／又は創傷治癒により治療できる疾患」としては、例えば、虚血性疾患（例えば、心筋梗塞、狭心症等の虚血性心疾患、下肢虚血性動脈硬化症等の下肢虚血、バージャー（Ｂｕｅｒｇｅｒ）病）、血管損傷が挙げられる。また、皮膚潰瘍等の創傷を治癒するため、あるいは人工血管の作製に使用できる。治療用組成物の適用の効果は、自体公知の方法により確認できる。例えば血管新生により治療できる疾患が下肢虚血性疾患である場合には、移植後の治療効果を例えば下肢血流量及び壊死改善率を調べることによって評価することができる。血流量の増加の測定はレーザドップラーイメージング解析の値を測定することによって行うことができる。また壊死改善率はリムサルベージスコアとして目視により測定することができる。
【0051】
上記治療用組成物の使用態様は特に限定されない。有効成分たる細胞群そのものであってもよいし、細胞群を液状媒体に懸濁したものであってもよい。液体媒体はヒトに注入可能な液体であればいずれであってもよく、例えば、等張電解質輸液やリン酸緩衝液や生理食塩水あるいは無血清培地であるＤＭＥＭなども利用可能である。また液体媒体にはアルブミンなど細胞の生存に好ましい化合物が含まれてもよい。好ましくはアルブミンを含む化合物として患者由来の血清があげられる。また凍結保存する場合には凍結細胞保存液などで懸濁したものであってもよい。
【0052】
上記治療用組成物の適用対象は、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療が必要である対象であれば、特に限定されない。非限定的に、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ネズミ、モルモット等が含まれる。
【0053】
４．キット
本発明はさらにまた、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を培養し、細胞群を取得するためのキットに関する。
本発明はさらにまた、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を培養し、細胞群を取得するためのキットに関する。
【0054】
上記キットは、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地を含む。各因子、血清は、培地に予め添加されていてもよいし、あるいは、別々の容器に格納されており、使用時に培地に添加されてもよい。
【0055】
「細胞群」、「単核球」、「幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子」の各因子、「血清、「培地」等については、上記「１．細胞群」で説明した通りである。
【0056】
５．治療方法等
本発明はまた、「１．細胞群」で説明した細胞群を、必要のある対象に適用することを含む、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療方法に関する。
本発明はまた、「１．細胞群」で説明した細胞群を、必要のある対象に適用することを含む、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療方法に関する。
【0057】
本発明はさらに、「１．細胞群」で説明した細胞群の、必要のある対象に適用することを含む、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療方法への使用、あるいは、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療用組成物への使用、に関する。
【0058】
「虚血性疾患」、「炎症性疾患」又は「難治療性創傷」、「細胞群の適用態様」、「適用対象」等については、「３．治療用組成物」に記載した通りである。
【実施例】
【0059】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【0060】
実施例１ ＲＥ－０１細胞群の培養
本実施例において、末梢血より単核球を単離し培養した。
本実施例において、末梢血より単核球を単離し培養した。
【0061】
（１）単核球の単離
健常人もしくは糖尿病患者のボランティアから、ＢＤ バキュテイナ（登録商標）ＣＰＴ（商標）ＢＤ社製）単核球分離用採血管を用いて１００ｍＬの末梢血を採取した。採血後、そのまま採血管を遠心した後、輸送、到着後培養開始までは冷蔵で保管した。単核球及び血漿を含むＣＰＴ（商標）採血管内のゲルバリアより上を遠心管へ回収し、少量のＥＤＴＡ－ＰＢＳでゲルバリア上など採血管内を洗いこみ、同じ遠心管へ回収した。細胞を回収した遠心管をＥＤＴＡ－ＰＢＳでメスアップしたのち、遠心分離（３００ｘｇ、室温、１５分間）し、沈査として細胞を回収した。回収された細胞は、混入する赤血球を除くためＡＣＫ溶血緩衝液（１５ｍＬ／管）（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ社製）中、室温で５分間インキュベートした。ＡＣＫ溶血緩衝液の組成は、ＮＨ４Ｃｌ ８，２９０ｍｇ／ｌ；ＫＨＣＯ３ １，０００ｍｇ／ｌ；ＥＤＴＡ．Ｎａ２・２Ｈ２Ｏ ３７ｍｇ／ｌである。その後、ＥＤＴＡ－ＰＢＳでメスアップし、遠心分離（２００ｘｇ、室温、１０分間）又は（１００ｘｇ、室温、１５分間）で細胞を回収する操作を２回繰り返した。
健常人もしくは糖尿病患者のボランティアから、ＢＤ バキュテイナ（登録商標）ＣＰＴ（商標）ＢＤ社製）単核球分離用採血管を用いて１００ｍＬの末梢血を採取した。採血後、そのまま採血管を遠心した後、輸送、到着後培養開始までは冷蔵で保管した。単核球及び血漿を含むＣＰＴ（商標）採血管内のゲルバリアより上を遠心管へ回収し、少量のＥＤＴＡ－ＰＢＳでゲルバリア上など採血管内を洗いこみ、同じ遠心管へ回収した。細胞を回収した遠心管をＥＤＴＡ－ＰＢＳでメスアップしたのち、遠心分離（３００ｘｇ、室温、１５分間）し、沈査として細胞を回収した。回収された細胞は、混入する赤血球を除くためＡＣＫ溶血緩衝液（１５ｍＬ／管）（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ社製）中、室温で５分間インキュベートした。ＡＣＫ溶血緩衝液の組成は、ＮＨ４Ｃｌ ８，２９０ｍｇ／ｌ；ＫＨＣＯ３ １，０００ｍｇ／ｌ；ＥＤＴＡ．Ｎａ２・２Ｈ２Ｏ ３７ｍｇ／ｌである。その後、ＥＤＴＡ－ＰＢＳでメスアップし、遠心分離（２００ｘｇ、室温、１０分間）又は（１００ｘｇ、室温、１５分間）で細胞を回収する操作を２回繰り返した。
【0062】
（２）血清培地での培養
（１）で回収した単核球細胞を、１ｍＬの増殖培地（５０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ１６５、２０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬ Ｆｌｔ－３リガンド、１００単位／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、０．５％ ＦＢＳを添加した ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標） ＩＩ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（シグマ－アルドリッチ社製、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｓ０１９２））に懸濁し、その一部を使用してトリパンブルーを用いた細胞数計数を行った。得られた細胞増殖培地中で、細胞濃度を１ｘ１０６／ｍＬに調製し、６穴培養プレートの各ウェルに２ｍＬずつ播種した。通常の培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）で５日間培養した。５日間の培養終了後、遠心管に回収し、２５０ｘｇ（～１０００ｒｐｍ）で７－１０分間、遠心洗浄を３回実施した。遠心後、細胞数計測、生存率測定、ＱＣ（確認）試験用のサンプルを除き、残りの細胞はＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、２．５％ ヒトアルブミン血清に懸濁し、８ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度になるように調整した。以下、得られた細胞群を「ＲＥ－０１」と呼称する場合がある。
（１）で回収した単核球細胞を、１ｍＬの増殖培地（５０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ１６５、２０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬ Ｆｌｔ－３リガンド、１００単位／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、０．５％ ＦＢＳを添加した ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標） ＩＩ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（シグマ－アルドリッチ社製、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｓ０１９２））に懸濁し、その一部を使用してトリパンブルーを用いた細胞数計数を行った。得られた細胞増殖培地中で、細胞濃度を１ｘ１０６／ｍＬに調製し、６穴培養プレートの各ウェルに２ｍＬずつ播種した。通常の培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）で５日間培養した。５日間の培養終了後、遠心管に回収し、２５０ｘｇ（～１０００ｒｐｍ）で７－１０分間、遠心洗浄を３回実施した。遠心後、細胞数計測、生存率測定、ＱＣ（確認）試験用のサンプルを除き、残りの細胞はＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、２．５％ ヒトアルブミン血清に懸濁し、８ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度になるように調整した。以下、得られた細胞群を「ＲＥ－０１」と呼称する場合がある。
【0063】
実施例２ ＲＥ－０１細胞群の特性評価
【0064】
（１）フローサイトメトリー解析
本実施例では、実施例１において、健常人の末梢血から３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養によって得られた細胞群（「ＲＥ－０１」と呼称する。）について、細胞群の特徴をより明らかにするため、フローサイトメトリー解析を行った。
本実施例では、実施例１において、健常人の末梢血から３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養によって得られた細胞群（「ＲＥ－０１」と呼称する。）について、細胞群の特徴をより明らかにするため、フローサイトメトリー解析を行った。
【0065】
ＦＡＣＳ緩衝液（組成：２％ ＦＢＳを添加した２ｍＭ ＥＤＴＡ－ＰＢＳ）中に懸濁した細胞（１．５×１０６細胞／３００μＬ－ＦＡＣＳ緩衝液）にＦＣブロッキング試薬（ミルテニィ社製）を１０μＬ添加し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後の細胞群を、染色反応用チューブに等量ずつ分注した（１００μＬ／チューブ×３チューブ）。各アリコートに各一次抗体を２μＬ添加し、４℃で２０分間培養した。その後１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、染色された細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁した（５×１０５細胞／２００～３００μＬ－ＦＡＣＳ緩衝液）。フローサイトメトリー計測は、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標） ＩＩＩセルソーター（ＢＤ社製）を用いて行った。
【0066】
具体的には、得られた細胞群における各細胞表面マーカーに対する抗体を用いて各細胞表面マーカーの発現を調べた。なお、各細胞表面マーカーに対する抗体は、いずれも下記の市販のものを使用した。
【0067】
抗ＣＤ２０６抗体：ＰＥ／Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ２０６ （ＭＭＲ）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）；
抗ＣＤ３４抗体：ＰＥ標識抗ヒトＣＤ３４抗体（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ社製）；
抗ＣＤ３抗体：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００標識抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ社製）；
抗ＣＸＣＲ４抗体：ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）抗体（ＢＤ社製）；
抗ＣＣＲ２抗体：ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５標識ヒトＣＤ１９２ （ＣＣＲ２）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）。
抗ＣＤ３４抗体：ＰＥ標識抗ヒトＣＤ３４抗体（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ社製）；
抗ＣＤ３抗体：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００標識抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ社製）；
抗ＣＸＣＲ４抗体：ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）抗体（ＢＤ社製）；
抗ＣＣＲ２抗体：ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５標識ヒトＣＤ１９２ （ＣＣＲ２）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）。
【0068】
結果を図１に示す。図１に示すように、ＲＥ－０１は、ＦＡＣＳによるＳｃａｔｔｅｒ解析において構成する細胞成分のサイズ（横軸：ＦＳＣ）と細胞内に含まれる顆粒等細胞構成成分の密度（縦軸：ＳＳＣ）により大きく３つの生細胞集団に分けられる（本明細書において、各々「Ａ領域」、「Ｂ領域」，「Ｃ領域」と呼称する）。培養前の末梢血単核球では、Ａ、Ｂ領域のみが現れ、Ｃ領域は見られない。Ａ領域には主にリンパ球が含まれ、Ｂ領域には単球が含まれる。増殖培地（実施例１の（２）血清培地）を用いた培養によって得られたＲＥ－０１では、血管内皮前駆細胞（ＣＤ３４陽性細胞）がＡ領域からＢ領域へ移動するほか、Ｍ２マクロファージ（ＣＤ２０６陽性細胞）を多く含むＣ領域が現れる。
【0069】
また、別の健常人から採取した単核球から実施例１に記載の３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養によって得られたＲＥ－０１のフローサイトメトリー解析の結果をを図２に示す。異なる個体の健常人の場合も同様に、Ａ、Ｂ、Ｃの３領域が現れた。また、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が８６．５７％であり、そして、ＣＣＲ２（＋）が０．３３％であることからＣＣＲ２（－）である細胞が９９．６７％であった。さらに、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞は９２．９７％であった。
【0070】
実施例３ ＲＥ－０１細胞群とＭＮＣ－ＱＱ細胞群との比較
【0071】
（１）ＲＥ－０１とＭＮＣ－ＱＱの培養
健常人と糖尿病患者から採取した単核球を、実施例１と同様に、３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養し、ＲＥ－０１を得た。
健常人と糖尿病患者から採取した単核球を、実施例１と同様に、３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養し、ＲＥ－０１を得た。
【0072】
比較例として、ＲＥ－０１細胞と同様に単核球を単離したのち、ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標） ＩＩ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（シグマ－アルドリッチ社製、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｓ０１９２）を用いた。血清は添加せず、１００単位／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンに５０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ１６５、２０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬ Ｆｌｔ－３リガンド、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－６の５種類の各因子を無菌的に添加することにより調製した。得られた細胞を増殖培地で１ｘ１０６／ｍＬに調製し、６穴培養プレートの各ウェルに２ｍＬずつ播種し、通常の培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）で７日間培養した。７日間の培養終了後、遠心管に回収し、２５０ｘｇ（～１０００ｒｐｍ）で７－１０分間、遠心洗浄を３回実施した。遠心後、細胞数計測、生存率測定、ＱＣ（確認）試験用のサンプルを除き、残りの細胞はＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、２．５％ ヒトアルブミン血清に懸濁して８ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度になるように調製した。以下、得られた細胞群を「ＭＮＣ－ＱＱ」と呼称する場合がある。
【0073】
（２）フローサイトメトリー解析
実施例１において、糖尿病患者の末梢血から３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養によって得られた細胞群と、上記（１）の５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ－ＱＱ）について、フローサイトメトリーを行い、両者を比較した。具体的には、得られた細胞群における各細胞表面マーカーに対する抗体を用いて各細胞表面マーカーの発現を調べた。
実施例１において、糖尿病患者の末梢血から３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養によって得られた細胞群と、上記（１）の５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ－ＱＱ）について、フローサイトメトリーを行い、両者を比較した。具体的には、得られた細胞群における各細胞表面マーカーに対する抗体を用いて各細胞表面マーカーの発現を調べた。
【0074】
結果を図３に示す。ＲＥ－０１はＭＮＣ－ＱＱと比較して、培養後の回収率及び生存率が高かった。さらに、培養後に新たにできる細胞群であるＣ領域の細胞の割合が多く、特に細胞群の有効性を担う細胞種のひとつであるＣＤ２０６＋細胞の割合が多かった。さらに驚くべきことにＣＤ２０６＋中のＣＸＣＲ４＋の割合が顕著に多く、ＲＥ－０１とＭＮＣ－ＱＱの細胞群はその細胞組成が異なっていることが分かった。
【0075】
（３）ａｃＬＤＬ取り込み能
実施例１において糖尿病患者の末梢血単核球より調製された、３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＲＥ－０１）と、比較例として、５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ－ＱＱ）を用いてそのａｃＬＤＬ（アセチル化低密度リポタンパク質）取り込み能を検討した。
実施例１において糖尿病患者の末梢血単核球より調製された、３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＲＥ－０１）と、比較例として、５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ－ＱＱ）を用いてそのａｃＬＤＬ（アセチル化低密度リポタンパク質）取り込み能を検討した。
【0076】
１．５ｍＬチューブに回収したＲＥ－０１又はＭＮＣ－ＱＱ（１ｘ１０５個）を基礎培地（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ）５００μＬ中に懸濁し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識されたａｃＬＤＬ ５μＬを添加、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベート終了後のチューブにＦＡＣＳ緩衝液１ｍＬを加え、転倒混和した。その後、５分間の遠心操作（２５０ｘｇ、４℃）を行い、細胞を沈査として回収した。回収した細胞（ＲＥ－０１）を３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し測定まで氷中冷却保存した。測定直前にＤＡＰＩ（２μＬ）を添加し、フローサイトメーターを用いた測定にてａｃＬＤＬ及び ＤＡＰＩを取り込んだ細胞の割合を求めた。
【0077】
結果を以下の表１に示す。
【表1】
【0078】
表１に示すように、全体、特にＣ領域においてａｃＬＤＬの取り込みが高いことが判明した。このことは、２つの細胞群（ＲＥ－０１及びＭＮＣ－ＱＱ）について、実施例２で示した組成の違いが機能の違いに結びつくことを裏付けるものである。
【0079】
（４）血管形成能
本実施例では、健常人の血液から採取した単核球について、実施例１と同様の方法で血清培地を用いて培養して得られた細胞群（ＲＥ－０１）を用いて、その血管形成能を検討した。比較例として、５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ－ＱＱ）を用いた。管腔形成能を持つヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｌｏｎｚａ社、スイス、バーゼルより入手）を、８～１０継代で使用し、各群の細胞とＨＵＶＥＣと共培養した。９６ウェルのプレートに基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標） Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製，米国、ＮＹ））５０μｌ／ウェルを分注し、３７℃、３０分コーティングした。一方、各細胞群を、ＤｉＩ－Ａｃ－ＬＤＬで標識するために、ＩＭＤＭ ５００μｌ＋ＤｉＩ－Ａｃ－ＬＤＬ ５μｌに懸濁し、３７℃、１時間インキュベートした。
本実施例では、健常人の血液から採取した単核球について、実施例１と同様の方法で血清培地を用いて培養して得られた細胞群（ＲＥ－０１）を用いて、その血管形成能を検討した。比較例として、５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ－ＱＱ）を用いた。管腔形成能を持つヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｌｏｎｚａ社、スイス、バーゼルより入手）を、８～１０継代で使用し、各群の細胞とＨＵＶＥＣと共培養した。９６ウェルのプレートに基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標） Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製，米国、ＮＹ））５０μｌ／ウェルを分注し、３７℃、３０分コーティングした。一方、各細胞群を、ＤｉＩ－Ａｃ－ＬＤＬで標識するために、ＩＭＤＭ ５００μｌ＋ＤｉＩ－Ａｃ－ＬＤＬ ５μｌに懸濁し、３７℃、１時間インキュベートした。
【0080】
標識後、各細胞群を１ｘ１０３／２０μｌ、及び、ＨＵＶＥＣを５ｘ１０３／２０μｌになるよう、各々ＰＢＳに再懸濁した。細胞数を調整した懸濁液を、試験細胞群とＨＵＶＥＣが１：１になるよう混和し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上に５０μｌずつ添加した。３７℃、５％ＣＯ２下で、１０時間以上タイムラプス蛍光顕微鏡（オリンパス社製、東京、日本）庫内で培養しつつ写真撮影を行い、培養終了後に倍率１００倍で、形成した管腔数、並びに、管腔構造中に取り込まれている蛍光標識された試験細胞数を目視でカウントした。
【0081】
結果を図４に示す。図４Ａは、形成した管腔数の培養開始からの時間変化、図４Ｂは、培養開始から２．７５時間後の形成した管腔数を示す。また図４Ｃに、培養開始から２．７５時間後の管腔構造中に取り込まれている蛍光標識された試験細胞数を示す。ＨＵＶＥＣとＲＥ－０１を一定時間共培養した際の管腔形成能は、ＨＵＶＥＣのみで培養、あるいは、ＨＵＶＥＣとＭＮＣ－ＱＱとの共培養に比べ、向上していた。さらに、ＲＥ－０１はより多くの細胞が、形成された管腔構造中に取り込まれていた。すなわち、生体外においてＲＥ－０１は、無血清培地でより長時間（７時間）培養したＭＮＣ－ＱＱよりもＩｎ ｖｉｔｒｏ血管形成能が高いことが明らかになった。このことは、２つの細胞群（ＲＥ－０１及びＭＮＣ－ＱＱ）について、実施例３で示した組成の違いが機能の違いに結びつくことを裏付けるものである。
【0082】
（５）マウス下肢虚血モデルによる効果
健常人の血液から採取した単核球を、実施例１と同様の方法で培養した細胞群を用いて、その下肢虚血に対する治療効果をマウスの下肢虚血モデルを用いて検討した。比較例として、５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ－ＱＱ）を用いた。
健常人の血液から採取した単核球を、実施例１と同様の方法で培養した細胞群を用いて、その下肢虚血に対する治療効果をマウスの下肢虚血モデルを用いて検討した。比較例として、５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ－ＱＱ）を用いた。
【0083】
（６）安定性試験
健常人の血液から採取した単核球を、実施例１と同様の方法で培養した細胞群を用いて、回収後７２時間までの安定性を細胞数及び生存率で検討を行った。比較例として、５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ－ＱＱ）を用いた。
健常人の血液から採取した単核球を、実施例１と同様の方法で培養した細胞群を用いて、回収後７２時間までの安定性を細胞数及び生存率で検討を行った。比較例として、５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ－ＱＱ）を用いた。
【0084】
実施例４ ＲＥ－０１細胞群の培養及び特性評価
本実施例において、重症下肢虚血の患者の末梢血より単核球を単離し培養した。さらに、得られた細胞群の特性評価を行った。
本実施例において、重症下肢虚血の患者の末梢血より単核球を単離し培養した。さらに、得られた細胞群の特性評価を行った。
【0085】
（１）単核球の単離
重症下肢虚血の患者の末梢血より単核球を単離した。単離は実施例１と同様に行った。
重症下肢虚血の患者の末梢血より単核球を単離した。単離は実施例１と同様に行った。
【0086】
具体的には、重症下肢虚血の患者から、ＢＤ バキュテイナ（登録商標）ＣＰＴ（商標）ＢＤ社製）単核球分離用採血管を用いて１００ｍＬの末梢血を採取した。採血後、そのまま採血管を遠心した後、輸送、到着後培養開始までは冷蔵で保管した。単核球及び血漿を含むＣＰＴ（商標）採血管内のゲルバリアより上を遠心管へ回収し、少量のＥＤＴＡ－ＰＢＳでゲルバリア上など採血管内を洗いこみ、同じ遠心管へ回収した。細胞を回収した遠心管をＥＤＴＡ－ＰＢＳでメスアップしたのち、遠心分離（３００ｘｇ、室温、１５分間）し、沈査として細胞を回収した。回収された細胞は、混入する赤血球を除くためＡＣＫ溶血緩衝液（１５ｍＬ／管）（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ社製）中、室温で５分間インキュベートした。ＡＣＫ溶血緩衝液の組成は、ＮＨ４Ｃｌ ８，２９０ｍｇ／ｌ；ＫＨＣＯ３ １，０００ｍｇ／ｌ；ＥＤＴＡ．Ｎａ２・２Ｈ２Ｏ ３７ｍｇ／ｌである。その後、ＥＤＴＡ－ＰＢＳでメスアップし、遠心分離（２００ｘｇ、室温、１０分間）又は（１００ｘｇ、室温、１５分間）で細胞を回収する操作を２回繰り返した。
【0087】
（２）血清培地での培養
単離した単核球を実施例１と同様に血清培地で培養した。基本培地としてｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）の代わりにＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ））を使用した点、並びに、血清としてＦＢＳに加えてヒトアルブミン血清も添加した点が、実施例１と相違する。
単離した単核球を実施例１と同様に血清培地で培養した。基本培地としてｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）の代わりにＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ））を使用した点、並びに、血清としてＦＢＳに加えてヒトアルブミン血清も添加した点が、実施例１と相違する。
【0088】
具体的には、（１）で回収した単核球細胞を、１ｍＬの増殖培地（５０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ１６５、２０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬ Ｆｌｔ－３リガンド、１００単位／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、０．５％ ＦＢＳ、０．５％ ヒトアルブミン血清を添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ））に懸濁し、その一部を使用してトリパンブルーを用いた細胞数計数を行った。得られた細胞増殖培地中で、細胞濃度を１ｘ１０６／ｍＬに調製し、６穴培養プレートの各ウェルに２ｍＬずつ播種した。通常の培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）で５日間培養した。５日間の培養終了後、遠心管に回収し、２５０ｘｇ（～１０００ｒｐｍ）で７－１０分間、遠心洗浄を３回実施した。遠心後、細胞数計測、生存率測定、ＱＣ（確認）試験用のサンプルを除き、残りの細胞はＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、２．５％ ヒトアルブミン血清に懸濁し、８ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度になるように調整した。
【0089】
（３）フローサイトメトリー解析
本実施例では、（１）、（２）において、重症下肢虚血の患者末梢血から単離した単核球を３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養によって得られた細胞群（実施例１と同様に「ＲＥ－０１」と呼称する。）について、細胞群の特徴をより明らかにするため、フローサイトメトリー解析を行った。
本実施例では、（１）、（２）において、重症下肢虚血の患者末梢血から単離した単核球を３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養によって得られた細胞群（実施例１と同様に「ＲＥ－０１」と呼称する。）について、細胞群の特徴をより明らかにするため、フローサイトメトリー解析を行った。
【0090】
ＦＡＣＳ緩衝液（組成：２％ ＦＢＳを添加した２ｍＭ ＥＤＴＡ－ＰＢＳ）中に懸濁した細胞（１．５×１０６細胞／３００μＬ－ＦＡＣＳ緩衝液）にＦＣブロッキング試薬（ミルテニィ社製）を１０μＬ添加し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後の細胞群を、染色反応用チューブに等量ずつ分注した（１００μＬ／チューブ×３チューブ）。各アリコートに各一次抗体を２μＬ添加し、４℃で２０分間培養した。その後１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、染色された細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁した（５×１０５細胞／２００～３００μＬ－ＦＡＣＳ緩衝液）。フローサイトメトリー計測は、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標） ＩＩＩセルソーター（ＢＤ社製）を用いて行った。
【0091】
具体的には、得られた細胞群における各細胞表面マーカーに対する抗体を用いて各細胞表面マーカーの発現を調べた。なお、各細胞表面マーカーに対する抗体は、いずれも下記の市販のものを使用した。
【0092】
抗ＣＤ２０６抗体：ＰＥ／Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ２０６ （ＭＭＲ）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）；
抗ＣＤ３４抗体：ＰＥ標識抗ヒトＣＤ３４抗体（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ社製）；
抗ＣＤ３抗体：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００標識抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ社製）；
抗ＣＸＣＲ４抗体：ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）抗体（ＢＤ社製）；
抗ＣＣＲ２抗体：ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５標識ヒトＣＤ１９２ （ＣＣＲ２）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）。
抗ＣＤ３４抗体：ＰＥ標識抗ヒトＣＤ３４抗体（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ社製）；
抗ＣＤ３抗体：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００標識抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ社製）；
抗ＣＸＣＲ４抗体：ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）抗体（ＢＤ社製）；
抗ＣＣＲ２抗体：ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５標識ヒトＣＤ１９２ （ＣＣＲ２）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）。
【0093】
結果を図５に示す。図５に示すように、重症下肢虚血の患者末梢血から単離した単核球を培養した細胞群でも、実施例２と同様にＡ、Ｂ、Ｃの３領域が現れた。また、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が８３．７２％であり、そして、ＣＣＲ２（＋）が１．６３％であることからＣＣＲ２（－）である細胞が９８．３７％であった。さらに、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞は８３．７２％であった。
【0094】
以上、重症下肢虚血の患者からも、実施例１の健常人もしくは糖尿病患者と同様に、３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養によってＲＥ－０１細胞群、特に、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が８０％以上であり、ＣＣＲ２（－）である細胞が９５％以上であり、そして、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が８０％以上であるＲＥ－０１細胞群、が得られることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【0095】
本発明により、高い血管再生能及び創傷治癒能を有する新たな細胞群が提供される。本発明の細胞群は、例えば、難病の四肢虚血疾患の患者の治療薬としての使用できる。これにより、例えば、切断の回避が可能になるなど、患者ＱＯＬの向上、介護負担の軽減などライフイノベーションをもたらすことが可能であり、社会的意義が大きい。また、新規な細胞群の提供は、新たな治療戦略の構築につながるとともに、血管病変全般に対する知見をもたらしうる。さらに本細胞群は高い有効性に加え、驚くべきことに、既存のＱＱ－ＭＮＣ法に比べて短い培養期間で安定的に高い回収率及び生存率を達成し、また製造後にもより安定であるため、産業上非常に大きなメリットとなりうる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
