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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-29
(45)【発行日】2024-09-06
(54)【発明の名称】情報保存のための方法、組成物およびデバイス
(51)【国際特許分類】
C12P 19/34 20060101AFI20240830BHJP
C07H 21/04 20060101ALI20240830BHJP
【ＦＩ】
C12P19/34 A ZNA
C07H21/04 A
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2018546548
(86)(22)【出願日】2017-02-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-05-16
(86)【国際出願番号】 US2017020044
(87)【国際公開番号】W WO2017151680
(87)【国際公開日】2017-09-08
【審査請求日】2020-02-18
【審判番号】
【審判請求日】2022-03-22
(31)【優先権主張番号】62/301,538
(32)【優先日】2016-02-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/415,430
(32)【優先日】2016-10-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】518309127
【氏名又は名称】イリディア・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｉｒｉｄｉａ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】ポール・プレドキ
(72)【発明者】
【氏名】マジャ・キャシディ
【合議体】
【審判長】福井 悟
【審判官】中根 知大
【審判官】加々美 一恵
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００４／０００１３７１（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
C12M 1/00-3/10
C12Q 1/00-3/00
C12P 1/00-41/00
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも２つの別個のモノマーまたはオリゴマーを含む荷電ポリマーをナノチップ中で合成する方法であって、該ナノチップは、単一のモノマーまたはオリゴマーのみが１回の反応サイクルにおいて付加され得るように、１以上のモノマーまたはオリゴマーを緩衝液中で末端が保護された形態で荷電ポリマーに付加するための試薬を含む１以上の付加チャンバー；および、緩衝液を含むが、１以上のモノマーまたはオリゴマーの付加に必要な全ての試薬を含むわけではない、１以上の保存チャンバーを含み、ここでこれらのチャンバーは１以上のナノポアを含む１以上の膜により分離されており、ナノポアは、荷電ポリマーを通過させるのに十分な大きさであるが、１以上のモノマーまたはオリゴマーの付加のための少なくとも１つの試薬を通過させるには小さすぎるため、荷電ポリマーはナノポアを通過できるが、１以上のモノマーまたはオリゴマーを付加するための試薬の少なくとも１つは通過できず、そしてナノポアの直径が２～５ｎｍを有し、
該方法は、
（ａ）第１の末端および第２の末端を有する荷電ポリマーの第１の末端を電気的引力によって付加のチャンバーに移動させ、それによってモノマーまたはオリゴマーを第１の末端にブロック化された形態で付加する工程、
（ｂ）付加されたモノマーまたはオリゴマーをブロック化された形態で有する荷電ポリマーの第１の末端を保存チャンバーに移動させる工程、
（ｃ）付加されたモノマーまたはオリゴマーを脱ブロック化する工程、および
（ｄ）所望のポリマー配列が得られるまで工程ａ～ｃを反復する工程、ここで工程ａ）で付加されるモノマーまたはオリゴマーは同一であるか、または異なっている、
を含むものであり、
荷電ポリマーはＤＮＡであり、モノマーはヌクレオチドであり、そしてオリゴマーはオリゴヌクレオチドである、
方法。
【請求項2】
ナノチップ中で核酸を合成する方法であって、ナノチップは、少なくとも１つのナノポアを含む膜により分離されている少なくとも付加チャンバーおよび保存チャンバーを含み、合成は、第１の末端および第２の末端を有する核酸の第１の末端にヌクレオチドを付加するサイクルにより緩衝液中で実行され、ここで核酸の第１の末端は１以上の付加チャンバー（ヌクレオチドを付加できる試薬を含む）と１以上の保存チャンバー（ヌクレオチドを付加するのに必要な試薬を含まない）との間を電気的引力によって移動し、チャンバーは１以上のナノポアをそれぞれ含む１以上の膜により分離されており、ナノポアは核酸の通過を可能とするのに十分大きいが、ヌクレオチドの付加に必須の少なくとも１つの試薬の通過を可能とするには小さいものであり、そしてナノポアの直径が２～５ｎｍを有する、方法。
【請求項3】
核酸にヌクレオチドを付加する試薬がポリメラーゼを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ヌクレオチドが３’保護形態で付加され、保存チャンバーが付加されたヌクレオチドを脱保護できる試薬を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項5】
ポリマー配列が機械可読コードに対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
合成完了後に荷電ポリマーまたは荷電ポリマーのコピーがナノチップから取り出される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
合成完了後に荷電ポリマーがナノチップに残る、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
少なくとも２つの別個のモノマーまたはオリゴマーを含む荷電ポリマーを合成するためのナノチップであって、１以上のナノポアを含む膜により分離されている少なくとも第１および第２の反応チャンバーを含み、各反応チャンバーは荷電ポリマーをチャンバーに引き出す１以上の電極を含み、第１の反応チャンバーは、電解質媒体、および、モノマーまたはオリゴマーをポリマーに付加するための試薬をさらに含み、該モノマーまたはオリゴマーは、１回に１つのみが付加され得るように保護されており、第２の反応チャンバーは、電解質媒体、および、かくして付加されたモノマーまたはオリゴマーを脱保護するための試薬をさらに含み、ナノポアは、ポリマーの通過を可能とするのに十分大きいが、モノマーまたはオリゴマーをポリマーに付加するための試薬、および、かくして付加されたモノマーまたはオリゴマーを脱保護するための試薬の通過を可能とするには小さいものであり、荷電ポリマーはＤＮＡであり、モノマーはヌクレオチドであり、そしてオリゴマーはオリゴヌクレオチドであり、そしてナノポアの直径が２～５ｎｍを有する、ナノチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年２月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／３０１,５３８号、および２０１６年１０月３１日に出願された同第６２／４１５,４３０号に対する優先権を主張し、これらの各内容は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本願は、２０１６年２月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／３０１,５３８号、および２０１６年１０月３１日に出願された同第６２／４１５,４３０号に対する優先権を主張し、これらの各内容は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
分野
本発明は、ポリマー（例えば核酸）を合成および配列決定するナノポアデバイスを用いた、情報の保存および取り出しに有用な新規の方法、組成物およびデバイスに関する。
本発明は、ポリマー（例えば核酸）を合成および配列決定するナノポアデバイスを用いた、情報の保存および取り出しに有用な新規の方法、組成物およびデバイスに関する。
【背景技術】
【0003】
今まで以上に多いデータを、今まで以上に小さいが、その容量はより大きい保存デバイスを用いて、物理媒体上または物理媒体内に保存するという継続的な要望がある。保存されるデータの量は２年毎に２倍のサイズになることが報告されており、ある研究によると、２０２０年までに我々が作製およびコピーするデータの量は年間４４ゼタバイト、即ち４４兆ギガバイトに達する。さらに、既存のデータ記憶媒体（ハードドライブ、光学式メディアおよび磁気テープなど）は相対的に不安定であり、長期保存後に破損する。
【0004】
長期間（例えば数十年または数百年）大容量のデータを保存するための代替の手法が緊急に必要とされている。
【0005】
ＤＮＡを用いてデータを保存することが提案されている。ＤＮＡは極めて安定であり、理論上は膨大なデータをコードでき、非常に長期間データを保存できる。例えば、Bancroft, C., et al., Long-Term Storage of Information in DNA, Science (2001) 293: 1763-1765を参照のこと。さらに、保存媒体としてのＤＮＡは従来のデジタル保存媒体のセキュリティリスクの影響を受けない。しかし、この着想を実行するための実用的な手法はない。
【0006】
例えば、ＷＯ２０１４／０１４９９１はＤＮＡオリゴヌクレオチド上にデータを保存する方法を記述し、ここで情報は１つのヌクレオチドを１ビットとするバイナリ形式で、９６ビット（９６ヌクレオチド）のデータブロック、１９ヌクレオチドのアドレス配列、並びに増幅および配列決定のための隣接配列を用いてコードされている。次いでコードは、配列をＰＣＲを用いて増幅し、高速シークエンサー（Illumina HiSeq装置など）を用いて配列決定することによって読み取られる。その後、データブロック配列がアドレスタグを用いて正しい順序で配置され、アドレス配列および隣接配列が除去され、配列データがバイナリコードに翻訳される。このような手法にはかなりの制約がある。例えば、９６ビットのデータブロックは（１文字毎またはスペース毎に従来の１バイトまたは８ビットを用いて）１２文字しかコードできない。「ハウスキーピングな」情報に対する保存されている有用な情報の割合が低く、約４０％の配列情報がアドレスおよび隣接ＤＮＡに使われる。該明細書は、５４,８９８個のオリゴヌクレオチドを用いて一冊の本をコードすることを記述している。オリゴヌクレオチドを合成するのに使用されている、インクジェット印刷される高忠実度のＤＮＡマイクロチップはオリゴのサイズを制限した（記述された１５９ヌクレオチド長が上限であった）。さらに、オリゴヌクレオチドの読み取りは増幅および単離を必要とし、これはエラーのさらなる可能性を導入する。ＷＯ２００４／０８８５８５Ａ２；ＷＯ０３／０２５１２３Ａ２；C. BANCROFT: "Long-Term Storage of Information in DNA", Science (2001) 293 (5536): 1763c-1765; COX J P L: "Long-term data storage in DNA", Trends in Biotechnology (2001)19(7): 247-250も参照のこと。
【0007】
２５年間以上認識されているように、ＤＮＡの潜在的な情報密度および安定性は、ＤＮＡをデータ保存のための魅力的な媒体にしているが、大量のデータをこの形式で書き込み、読み取るための実用的な手法は未だない。
【発明の概要】
【0008】
我々は、核酸配列を合成するナノ流体システムおよび配列を読み取るナノポアリーダーを用いた、核酸保存のための新規な手法を開発した。我々の手法は、数百、数千または数数百万塩基長のＤＮＡ鎖の合成、保存および読み取りを可能にする。配列が長いため、情報密度が上述の手法よりもはるかに高くなるように、相対的に小さな割合の配列のみが同定情報に使われる。さらに、いくつかの実施態様において、合成された核酸はナノチップ上の特定の位置を有し、従って配列は同定情報なしで特定され得る。ナノチャンバーにおいて実行される配列決定は非常に迅速であり、ナノポアを介した配列の読み取りは極めて迅速であり得、最大で１秒毎に百万塩基の桁数であり得る。２種類の塩基のみを必要とするため、この配列決定は、４種類の塩基（アデニン、チミン、シトシン、グアニン）間を区別しなければならない配列決定の手段よりも迅速かつ正確であり得る。特定の実施態様において、２つの塩基は互いに対にならず、二次構造を形成せず、異なるサイズのものである。例えばこの目的のために、アデニンとシトシンは、ハイブリダイズする傾向があるアデニンとチミン、または類似のサイズであるアデニンとグアニンより良好である。
【0009】
いくつかの実施態様において、このシステムはデータをコードする長いポリマーを合成するのに使用され得、このポリマーは増幅および／または放出され得、次いで異なるシークエンサー上で配列決定され得る。他の実施態様において、該システムはカスタムＤＮＡ配列を提供するために使用され得る。さらなる他の実施態様において、該システムはＤＮＡ配列を読み取るために使用され得る。
【0010】
ある実施態様において使用されるナノチップは、少なくとも１つのナノポアによって連結されている少なくとも２つの別々の反応区画を含み、これは少なくともいくつかの成分が混合するのを妨げるが、ＤＮＡまたは他の荷電ポリマー（例えばＲＮＡまたはペプチド核酸（ＰＮＡ））の単一の分子のみを、ある反応区画から別の反応区画に制御可能な様式で通過させる。ポリマー（またはモノマーが付加されたポリマーの少なくとも末端）のある区画から別の区画への移行は、例えば大きすぎるために、または、基板または嵩高い部分に係留されているためにナノポアの通過を妨げられる酵素を使用して、ポリマーに連続的な操作／反応（塩基の付加など）を行うことを可能にする。ナノポアセンサーは、ポリマーの移動または位置およびその状態、例えばその配列や、試みた反応が成功したか否かを、折り返し報告する。これはデータを書き込み、保存し、読み取ることを可能にし、例えば、ここで、塩基配列は機械可読コード（例えば各塩基または塩基の群が１または０に対応する、バイナリコード）に対応する。
【0011】
従って、本発明は特に以下の実施態様を含む。
・少なくとも２つの異なるモノマーを含む荷電ポリマー（例えばＤＮＡ）の合成のためのナノチップ、ここで該ナノチップは１以上のナノポアによって分離されている２以上の反応チャンバーを含み、各反応チャンバーは、電解液、荷電ポリマーをチャンバー内に引き込むための１以上の電極、および、モノマーまたはオリゴマーのポリマーへの付加を促進する１以上の試薬を含む。ナノチップは、場合により、ＤＮＡをガイドし、運び、かつ／または制御する機能的要素と共に構成され得、場合によりＤＮＡの円滑な流れを可能とするように、またはＤＮＡに結合するように選択された物質で被覆または作成されていてもよく、ナノポアに近接した電極を提供および制御するナノ回路要素を含み得る。例えば、１以上のナノポアは、場合によりそれぞれが、ナノポアを通したポリマーの移動を制御でき、かつ／または、ナノポアとポリマーの境界面における電位、電流、抵抗または静電容量の変化を検出できる電極に結合していてもよく、それにより、ポリマーが１以上のナノポアを通過する際にその配列を検出し得る。特別な実施態様では、ポリメラーゼまたは部位特異的リコンビナーゼを用いてオリゴマーが合成される。いくつかの実施態様では、ポリマーは合成中に配列決定され、検出および場合により誤りの修正を可能にする。いくつかの実施態様では、かくして得られたポリマーはナノチップ上に保存され、ポリマーの配列中にコードされた情報にアクセスすることが望まれるときに配列決定され得る。
・少なくとも２つの異なるモノマーを含む荷電ポリマー（例えばＤＮＡ）の合成のためのナノチップ、ここで該ナノチップは１以上のナノポアによって分離されている２以上の反応チャンバーを含み、各反応チャンバーは、電解液、荷電ポリマーをチャンバー内に引き込むための１以上の電極、および、モノマーまたはオリゴマーのポリマーへの付加を促進する１以上の試薬を含む。ナノチップは、場合により、ＤＮＡをガイドし、運び、かつ／または制御する機能的要素と共に構成され得、場合によりＤＮＡの円滑な流れを可能とするように、またはＤＮＡに結合するように選択された物質で被覆または作成されていてもよく、ナノポアに近接した電極を提供および制御するナノ回路要素を含み得る。例えば、１以上のナノポアは、場合によりそれぞれが、ナノポアを通したポリマーの移動を制御でき、かつ／または、ナノポアとポリマーの境界面における電位、電流、抵抗または静電容量の変化を検出できる電極に結合していてもよく、それにより、ポリマーが１以上のナノポアを通過する際にその配列を検出し得る。特別な実施態様では、ポリメラーゼまたは部位特異的リコンビナーゼを用いてオリゴマーが合成される。いくつかの実施態様では、ポリマーは合成中に配列決定され、検出および場合により誤りの修正を可能にする。いくつかの実施態様では、かくして得られたポリマーはナノチップ上に保存され、ポリマーの配列中にコードされた情報にアクセスすることが望まれるときに配列決定され得る。
【0012】
・上記のナノチップを用いて、ポリマー、例えばＤＮＡを合成する方法。
・配列が本質的にハイブリダイズしないヌクレオチド、例えばアデニンおよびシトシンヌクレオチド（ＡおよびＣ）のみからなり、例えばデータ保存の方法における使用のために、バイナリコードに対応する順番で配列されている一本鎖ＤＮＡ分子。
・バイナリコードに対応する一連のヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ、ここで、二本鎖ＤＮＡはさらに含む
・ナノポアシークエンサーを使用することを含む、ＤＮＡにコードされたバイナリコードを読み取る方法。
・上記ナノチップを用いて、少なくとも２つの異なるモノマーを含む荷電ポリマー、例えばＤＮＡを作成する、データ保存の方法およびそのためのデバイス、ここで、該モノマーはバイナリコードに対応する順番で配列される。
・配列が本質的にハイブリダイズしないヌクレオチド、例えばアデニンおよびシトシンヌクレオチド（ＡおよびＣ）のみからなり、例えばデータ保存の方法における使用のために、バイナリコードに対応する順番で配列されている一本鎖ＤＮＡ分子。
・バイナリコードに対応する一連のヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ、ここで、二本鎖ＤＮＡはさらに含む
・ナノポアシークエンサーを使用することを含む、ＤＮＡにコードされたバイナリコードを読み取る方法。
・上記ナノチップを用いて、少なくとも２つの異なるモノマーを含む荷電ポリマー、例えばＤＮＡを作成する、データ保存の方法およびそのためのデバイス、ここで、該モノマーはバイナリコードに対応する順番で配列される。
【0013】
本発明の適用性のさらなる態様および範囲は、以下に提供される詳細な説明から明らかとなる。詳細な説明および特定の実施例は好ましい実施態様を示すが、説明のみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【0014】
本発明は、詳細な説明および添付の図面からより十分に理解される。
【0015】
【0016】
【図19】図１９は、ナノポアを含む膜に沿って結合している一連のＤＮＡ分子を示し、それぞれはナノポアに隣接する電極の制御下にあり、膜の両側にフローレーンを伴う。例えば、図示されているように、左のフローレーンはバッファー洗浄／３’ブロック化ｄＡＴＰ（Ａ）／バッファー洗浄／３’ブロック化ｄＣＴＰ（Ｃ）／バッファー洗浄の流れを与え、ここでＤＮＡ分子は所望のヌクレオチドが存在する場合にのみフローチャンバー中に導かれる。右のレーンは脱ブロック化試薬を与え、ヌクレオチドの３’末端を脱保護し、さらなるヌクレオチドの付加を可能にする。ある実施態様では、左のレーンがバッファーで洗浄されている際に、脱ブロック化試薬が流れる。別の実施態様では、脱保護化剤は非常に嵩高く、ナノポアを通って左のレーンに渡れない。
【0017】
【図23】図２３は、ナノポアシークエンサーのためのフォーマットを示し、ここでポリマー配列は容量変動を用いて読み取られる。この静電容量の読み出しのスキームにおいて、電極はコンデンサの上下のプレートを形成し、これはナノポアを含む膜によって分離されている。コンデンサは共振回路に埋め込まれ、ここで直流を振動させて荷電ポリマーをナノポアから引き出し得る。ポリマー、例えばＤＮＡがナノポアを通過する際に、高周波インピーダンス分光法を用いて、静電容量の変化が測定される。特にＤＮＡを用いるとき、この手法の大きな利点は、測定頻度が非常に高く（各サイクルに１測定が有効なので、１００ＭＨｚの周波数は毎秒１億回の測定に相当する）、ナノポアを介するモノマーの移行よりもはるかに速くなり得ることである（例えば、ＤＮＡは、何らかの形で抑制されない限り、電流に応答して毎秒１００万個のヌクレオチドの桁数の速度でナノポアを通過する）。
【0018】
【図24】図２４は、例えば２ビットまたはバイナリコード化のための、２つの異なる種類のモノマーまたはオリゴマーを付加するのに適した、二重の付加チャンバーの配置を示す。図の上部は上面図を示す。下部は側面の断面図を示す。この実施態様における完全なデバイスは、最大で３つの独立して製造された層から組み立てられてウエハー接合により接合され得るか、または、単一の基板をエッチングすることによって形成され得る。チップは、電気制御層（１）、保存チャンバーの上に２つの付加チャンバーを含み、第１および第２の付加チャンバーへのナノポア導入部の間に荷電ポリマー（例えばＤＮＡ）が係留されるフルイディクス層（２）、および、電気的アース層（３）を含む。
【0019】
【図25】図２５は、図２４の二重の付加チャンバーの配置の操作を示す。各付加チャンバーの底部にナノポアがあることが観察される（４）。ナノポアは、例えばＦＩＢ、ＴＥＭ、ウェットエッチングもしくはドライエッチングを用いて、または誘電破壊により、穿孔することによって作成される。ナノポアを含む膜（５）は、例えば、１原子層から数十ｎｍの厚さである。この膜は、例えば、ＳｉＮ、ＢＮ、ＳｉＯｘ、グラフェン、遷移金属ジカルコゲナイド、例えばＷＳ２またはＭｏＳ２から作成される。ナノポア膜（５）の下に、保存チャンバーまたは脱ブロック化チャンバー（６）があり、これは、付加チャンバーの１つにおいてモノマーまたはオリゴマーが付加された後にポリマーを脱保護するための試薬を含む（１回に１つのモノマーまたはオリゴマーのみが付加されるように、モノマーまたはオリゴマーは末端が保護された形式で付加されることが想起される）。ポリマー（７）は、電気制御層（１）において電極の極性を変化させることにより、付加チャンバーから出し入れできる。
【0020】
【0021】
【図27】図２７は、複数の組の図２４および図２５に示される二重の付加チャンバーを有するナノポアチップの上面図を示し、これは複数のポリマーを並行して合成することを可能にする。モノマー（ここではＡおよびＧで表されるｄＡＴＰおよびｄＧＴＰヌクレオチド）は、連続的な流路を通って各チャンバーにロードされる。１以上の共通の脱ブロック化剤のフローセルは、付加チャンバーの１つにおけるモノマーまたはオリゴマーの付加後に、ポリマーを脱保護することを可能にする。これはまた、ポリマーを要求に応じて分離し（例えば、ＤＮＡの場合に制限酵素を用いて、またはナノポアに隣接する表面からの化学的分離）、外部に集めることを可能にする。この特別な実施態様において、脱ブロック化剤のフローセルは、付加チャンバーを満たすために使用される流体ロードチャネルに対して垂直である。
【0022】
【図28】図２８は、二重の付加チャンバーの配置のための配線のさらなる詳細を示す。電気制御層（１）は、金属またはポリシリコンで作られた配線を含む。配線の密度は、誘電体堆積（例えば、ＰＥＣＶＤ、スパッタリング、ＡＬＤなどによる）によって与えられる電気的隔離を伴う３次元スタッキングによって増大する。ある実施態様における付加チャンバーによる上部の電極との接触（１１）は、深堀り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）（クライオ処理またはＢＯＳＣＨ処理）によるシリコン貫通電極（ＴＳＶ）を用いてなされる。個々の電圧制御（１２）は各付加チャンバーを個々に処理することを可能にし、これは複数のポリマーの配列を並列して微細制御することを可能にする。図の右側は複数の付加セルのための配線を図示する上面図を示す。電気アース層（３）は（示されるように）共通でもよく、またはセル間のクロスカップリングを減少させるために分割されていてもよい。
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【図33】図３３はＤＮＡのナノポア付近への固定を示す。パネル（１）は、左のチャンバーにおいて、一端にオリガミ構造を有するＤＮＡを示す（実際のナノチップにおいて、このような多数のオリガミ構造が左のチャンバー内に最初に存在する）。パネル（２）は右に陽極がある系を説明し、これはＤＮＡをナノポアに導く。ＤＮＡ鎖はナノポアを通過できるが、オリガミ構造は大きすぎて通過できず、従ってＤＮＡは「はまり込む」。電流を止めるとＤＮＡは拡散できる（パネル３）。ＤＮＡ鎖の末端がナノポア付近の表面に接触すると、適切な化学により結合できる。パネル（４）では、制限酵素が添加され、これはＤＮＡからオリガミ構造を切り取る。チャンバーを洗浄し、酵素および残留しているＤＮＡを除去する。最終的な結果はナノポア付近に結合した単一のＤＮＡ分子であり、これはナノポアを通って行き来できる。
【0028】
【図34】図３４は基本的な機能性のナノポアを示す。各パネルにおいて、ｙ軸は電流（ｎＡ）であり、ｘ軸は時間（秒）である。左のパネル「ＲＦノイズのスクリーニング」はファラデーケージの有用性を示す。ナノポアを有さないチップをフローセル内に配置し、３００ｍＶをかける。ファラデーケージの蓋を閉じると（最初の矢印）、ノイズの減少が見られる。ラッチを閉じると（２番目の矢印）、小さなスパイクが生じる。電流は約０ｎＡであることが分かる。ポアの作製後（中央のパネル）、３００ｍＶの適用（矢印）は約３.５ｎＡの電流をもたらす。ＤＮＡをアースチャンバーに適用し、＋３００ｍＶをかけると、ＤＮＡの移行（右のパネル）が電流の一過性の減少として観察され得る。（注釈、この場合にＴＳバッファーが使用されている：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１Ｍ ＮａＣｌ。）ラムダＤＮＡがこのＤＮＡ移行実験に使用されている。
【0029】
【0030】
【0031】
【図37】図３７は、正しい組み立ておよび機能を確認するＤＮＡオリガミの制限酵素切断を示す。左端のレーンはＭＷスタンダードを与える。オリガミをＡｌｗＮ１およびＳｗａ１で切断することによって、制限部位を試験する。４つの試験レーンは以下の試薬を含む（単位はマイクロリットル）：
【表1】
【0032】
【0033】
【図39】図３９は、異なるバッファー系（ＭＰＢＳおよびＨＫバッファー）における、ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドのストレプトアビジンで被覆されたビーズへの結合を、対照のＢＳＡで被覆されたビーズへの結合と比較して示す。左のバー「負の対照」は、ビーズに結合する前の試験溶液からのオリゴの蛍光である。中央のカラムはＢＳＡビーズと結合した後の「ＢＳＡビーズ」の蛍光を示し、右のカラムはストレプトアビジンビーズと結合した後の「ＳＡビーズ」の蛍光を示す。両方のバッファー系において、対照と比較してストレプトアビジンビーズによって蛍光が減少し、これはビオチン標識されたオリゴヌクレオチドが種々のバッファー系においてストレプトアビジンで被覆されたビーズによく結合していることを示す。
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【発明を実施するための形態】
【0040】
以下の好ましい実施態様の説明は本来単なる例示であり、いかなる方法においても本発明、その出願または使用を限定することを意図しない。
【0041】
あらゆる箇所で使用される場合において、範囲は範囲内のあらゆる値を記載するための省略表現として使用される。範囲内のあらゆる値が範囲の終端として選択され得る。さらに、本明細書において引用される全ての参考文献は、参照されることによってその全体が本明細書に組み込まれる。本開示における定義と引用された参考文献の定義における矛盾の場合、本開示が支配する。
【0042】
他に明記されない限り、本明細書および本明細書の他の場所において表される全ての割合および量は、重量による割合を指すものとして理解されるべきである。所定の量は、物質の有効な重量に基づく。
【0043】
本明細書における「ナノチップ」はナノ流体デバイスを指し、これは流体を含む複数のチャンバーおよび場合により流体の流動を可能にするチャンネルを含み、ここでナノチップの特徴（例えばチャンバーを互いに分離する要素の幅）の限界寸法は、１原子から１０ミクロンの厚さであり、例えば１ミクロン（例えば０.０１～１ミクロン）よりも小さい。ナノチップにおける物質の流動は電極によって調節され得る。例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡは負に帯電しているため、これらは正に荷電した電極に引き寄せられる。例えば、Gershow, M, et al., Recapturing and Trapping Single Molecules with a Solid State Nanopore, Nat Nanotechnol. (2007) 2(12): 775-779を参照のこと、これは参照によって本明細書に組み込まれる。流体の流動は場合により、ゲート要素によって、そして、流体をナノチップ内部または外部へ流し、注入し、かつ／または吸引することによっても調節され得る。この系は、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）の正確な多重分析ができる。ある実施態様において、ナノチップはシリコン材料（例えば二酸化ケイ素または窒化ケイ素）で作製され得る。窒化ケイ素（例えばＳｉ３Ｎ４）は化学的に相対的に不活性であり、わずか数ｎｍの厚さの場合でさえ、水およびイオンの拡散に対して有効な障壁を与えるため、この目的のために特に望ましい。二酸化ケイ素は化学修飾するのに優れた表面であるため、（本明細書の実施例で使用されるように）二酸化ケイ素もまた有用である。あるいは、ある実施態様において、ナノチップは、単一分子と同程度の薄さのシートを形成できる材料（単層材料とも呼ばれる）で全体的または部分的に作製されてもよい（例えばグラフェン（例えばHeerema, SJ, et al, Graphene nanodevices for DNA sequencing, Nature Nanotechnology (2016) 11: 127-136; Garaj S et al., Graphene as a subnanometre trans-electrode membrane, Nature (2010) 467 (7312), 190-193に記載され、各内容は参照によって本明細書に組み込まれる）または例えば二硫化モリブデン（ＭｏＳ２）（Feng, et al., Identification of single nucleotides in MoS2 Nanopores, Nat Nanotechnol. (2015) 10(12):1070-1076に記載され、この内容は参照によって本明細書に組み込まれる）もしくは窒化ホウ素（Gilbert, et al. Fabrication of Atomically Precise Nanopores in Hexagonal Boron Nitride, eprint arXiv:1702.01220 (2017)に記載されている）などの遷移金属ジカルコゲナイド）。
【0044】
いくつかの実施態様において、ナノチップは相対的に堅く、不活性であるそのような単層材料（例えばＭｏＳ２などの少なくともグラフェンと同程度に不活性で堅い単層材料）を含む。単層材料は、例えばナノポアを含む膜の全部または一部として使用され得る。ナノチップは金属と共に部分的に一列に並べられ得る（例えば、壁は層状にされ得（例えば金属－窒化ケイ素－金属）、次いで核酸が起電力によってナノポアを通って前後に移動でき、ナノポアを通過した際の電位の変化を測定することによって配列決定され得るように、金属はナノポアの付近に制御可能な電極対を与えるように配置される）。
【0045】
ＤＮＡを配列決定するナノチップナノ流体デバイスは一般的に知られており、例えば、Li, J., et al, Solid-state nanopore for detecting individual biopolymers, Methods Mol Biol. (2009)544:81-93; Smeets RM, et al. Noise in solid-state nanopores, PNAS (2008)105(2):417-21; Venta K, et al., Differentiation of short, single-stranded DNA homopolymers in solid-state nanopores, ACS Nano. (2013)7(5):4629-36; Briggs K, et al. Automated fabrication of 2-nm solid-state nanopores for nucleic acid analysis, Small (2014)10(10):2077-86;およびChen Z, DNA translocation through an array of kinked nanopores, Nat Mater. (2010)9(8):667-75に記載され、例えばナノポアを含むナノチップの設計および製造に対する教示のために、各内容の全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【0046】
本明細書における「ナノポア」は、１ミクロン未満の直径（例えば２～２０ｎｍの直径、例えば２～５ｎｍのオーダー）を有するポアである。一本鎖ＤＮＡは２ｎｍのナノポアを通過できる；一本鎖または二本鎖ＤＮＡは４ｎｍのナノポアを通過できる。非常に小さいナノポア（例えば２～５ｎｍ）を有することは、ＤＮＡは通過できるが、より大きなタンパク質酵素は通過できず、これによってＤＮＡ（または他の荷電ポリマー）の制御された合成を可能にする。より大きなナノポア（またはより小さなタンパク質酵素）を使用する場合、タンパク質酵素がナノポアを通過することを妨げる基質（例えばより大きなタンパク質などのより大きな分子、ビーズまたはチャンバー内の表面）にタンパク質酵素をコンジュゲートさせてもよい。種々のナノポアが公知である。例えば、生物学的ナノポアは膜（脂質二重膜など）中のポア形成タンパク質の会合によって形成される。例えば、α－ヘモリジンおよび類似のタンパク質ポアが細胞膜中において天然に見出されており、これらはイオンまたは分子を細胞内および細胞外に輸送するチャネルとして働き、このようなタンパク質はナノチャネルとして別の目的で使用され得る。固体のナノポアは、例えばフィードバック制御された低エネルギーイオンビームスカルプティング（ＩＢＳ）または高エネルギー電子ビーム照射を用いて、例えば合成膜に穴を形成することによって、合成材料（窒化ケイ素またはグラフェンなど）において形成される。ハイブリッドのナノポアは、ポア形成タンパク質を合成材料中に埋め込むことによって作製され得る。金属表面または電極がナノポアの両末端または両側にある場合、ナノポアに沿った電流が電解質媒体を介してナノポアを通って確立され得る。電極は、あらゆる伝導性材料（例えば銀、金、白金、銅、二酸化チタン、例えば塩化銀で被覆された銀）で作製され得る。
【0047】
固体（窒化ケイ素、膜）においてナノポアを形成する方法は公知である。ある手法において、シリコン基板を膜材料（例えば窒化ケイ素）で被覆し、膜の全体の形状をフォトリソグラフィーおよびウェット化学エッチングを用いて作成し、ナノチップに組み込むのに望ましいサイズ（例えば約２５ｘ２５ミクロン）の窒化ケイ素膜を与える。最初の０.１ミクロンの直径の穴または空洞を窒化ケイ素膜に集束イオンビーム（ＦＩＢ）を用いて開ける。イオンビームスカルプティングは、より大きなポアを収縮させること（例えばイオンビームによって誘導される膜表面上の横方向の質量輸送によって）、または空洞が最終的につながったときに縁の鋭いナノポアとなるように、膜材料を反対側からの空洞を含む膜の平坦面からイオンビームスカルプティングによって層ごとに除去することのいずれかによってナノポアを形成し得る。イオンビームの露光が消えると、ポアを通って伝達されるイオン電流は、所望のポアのサイズに適している。例えば、Li, J., et al., Solid-state nanopore for detecting individual biopolymers, Methods Mol Biol. (2009)544:81-93参照のこと。あるいはナノポアは、ＴＥＭにおける高エネルギー（２００～３００ｋｅＶ）電子ビーム照射を用いて形成され得る。半導体加工技術、電子ビームリソグラフィー、ＳｉＯ２マスク層の反応性イオンエッチングおよびＳｉの異方性ＫＯＨエッチングを用いて、ピラミッド形の２０ｘ２０ｎｍおよびそれよりも大きいポアを４０ｎｍの厚さの膜に作成する。ＴＥＭにおける電子ビームを用いて、より大きい２０ｎｍのポアをより小さいポアに縮小する。ＴＥＭは縮小する過程をリアルタイムで観察することを可能にする。より薄い膜（例えば＜１０ｎｍの厚さ）を用いて、ナノポアはＴＥＭにおける高エネルギー集束電子ビームで穿孔され得る。一般的に、Storm AJ, et al. Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision. Nature Materials (2003) 2:537-540; Storm AJ, et al. Translocation of double-stranded DNA through a silicon oxide nanopore. Phys. Rev. E (2005)71:051903; Heng JB, et al. Sizing DNA Using a Nanometer-Diameter Pore. Biophys. J (2004) 87(4):2905-11を参照すること、ここで各内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【0048】
他の実施態様において、Kwok, et al., "Nanopore Fabrication by Controlled Dielectric Breakdown," PLOS ONE (2014) 9(3): e92880に記載される（この内容は参照によって本明細書に組み込まれる）ように、ナノポアは、膜の比較的高い電位差を利用して、誘電破壊によって作製され、ここで電流が検出されるまで電位を上昇させる。
【0049】
これらの技術を用いて、かつ当然だが使用される実際の技術並びに膜の厚さおよび実際の組成に依存して、窒化ケイ素などの固体材料におけるナノポアの全体の形状は、最も狭い点（即ち実際のナノポア）で先端が一体となっている２つの漏斗に大まかに似ていてもよい。そのような一対の円錐の形状は伝導性であり、ナノポアを介してポリマーを出入りさせる。イメージング技術（例えば原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）または透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、特にＴＥＭ）が、ナノ膜（nanomembrane）のサイズ、位置および形状、ＦＩＢの穴または空洞、並びに最終的なナノポアを検証および測定するのに使用され得る。
【0050】
いくつかの実施態様において、ポリマー（例えばＤＮＡ）の一端はナノポア付近またはナノポアに通じる漏斗の内壁に係留される。ポリマーの一端がナノポアの近くに係留されている場合、ポリマーは拡散によって最初にナノポアに近づき、次いで電気的勾配によって導かれるため、勾配によって導かれる運動は最大化され、拡散の運動は最小化され、これによって速度および効率が増強される。例えば、Wanunu M, Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient, Nat Nanotechnol. (2010) 5(2):160-5; Gershow M., Recapturing and trapping single molecules with a solid-state nanopore. Nat Nanotechnol. (2007) 2(12):775-9; Gershow, M., Recapturing and Trapping Single Molecules with a Solid State Nanopore. Nat Nanotechnol. (2007) 2(12): 775-779参照のこと。
【0051】
ある実施態様において、ポリマー（例えばＤＮＡ）の一端をビーズに結合させ、ポリマーをポアに通す。ビーズとの結合は、ポリマーが隣接するチャンバーの分離膜の反対側にあるナノポアを最後まで通って移動するのを妨げる。次に電流を止め、ポリマー（例えばＤＮＡ）を、分離膜の反対側のチャンバーにおけるナノポアに隣接する表面に結合させる。例えば、ある実施態様において、ｓｓＤＮＡの一端を５０ｎｍのビーズに共有結合させ、他端をビオチン化する。ストレプトアビジンを、分離膜の反対側のチャンバーの領域に所望の結合点で結合させる。ＤＮＡは電位差によってナノポアから引き出され、ビオチンはストレプトアビジンと結合する。ビーズおよび／またはナノポアに隣接する表面との結合は、共有結合または強い非共有結合（ビオチン－ストレプトアビジン結合など）のいずれかであり得る。次にビーズを酵素で切り離し、洗い流す。いくつかの実施態様において、K. Nishigaki, Type II restriction endonucleases cleave single-stranded DNAs in general. Nucleic Acids Res. (1985) 13(16): 5747-5760に記載される（これは参照によって本明細書に組み込まれる）ように、一本鎖ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡを切断する酵素で切断される。他の実施態様において、相補的なオリゴヌクレオチドが二本鎖制限部位を作製するために与えられ、これは次に対応する制限酵素で切断され得る。
【0052】
ポリマーがナノポアを通過する際に、ポリマーが通過する際のナノポアの部分的な閉塞によって生じるナノポアにかかる電位差または電流の変化を検出でき、異なるモノマーはそれらの異なるサイズおよび静電ポテンシャルによって区別できるため、ポリマー内のモノマーの配列を同定するのに使用できる。
【0053】
本明細書に記載されるように、ＤＮＡの製造方法におけるナノポアを含むナノチップの使用は当分野で開示されていないが、そのようなチップは周知であり、ＤＮＡの迅速な配列決定のために市販されている。例えば、MinION（Oxford Nanopore Technologies, Oxford, UK）は小さく、ノートパソコンに取り付けることができる。一本鎖ＤＮＡがタンパク質ナノポアを１秒毎に３０塩基通過する際、MinIONは電流を測定する。ポア内のＤＮＡ鎖はイオン流を妨害し、これは配列内のヌクレオチドに対応する電流の変化をもたらす。Mikheyev, AS, et al. A first look at the Oxford Nanopore MinION 配列r, Mol. Ecol. Resour. (2014)14, 1097-1102。MinION の精度は不十分であり、繰り返しの配列決定を必要とするが、読み取られるＤＮＡが容易に区別できる２つの塩基（例えばＡとＣ）のみを含む場合、本発明のナノチップを用いた配列決定の速度と精度は著しく改善され得る。
【0054】
いくつかの実施態様において、ナノポアを含む膜は、絶縁コア材料（例えば窒化ケイ素膜）の両側に金属表面を含む、３層の形態を有し得る。この実施態様において、例えばナノポアを流れる電流が電極間に電解質媒体を介してナノポアを通って確立され得、この電流がポリマーをナノポアに通らせ得、極性を反転させることによってポリマーを引き戻し得るように、金属表面は例えばリソグラフィーの手段によって形成され、各ナノポアの各末端における対の電極を含むマイクロ回路を与える。ポリマーがナノポアを通過する際、電極はナノポアにかかる電位の変化を測定し得、ポリマー内のモノマーの配列を同定する。
【0055】
いくつかの実施態様において、ポリマーの配列はデータを保存するために設計される。いくつかの実施態様において、データはバイナリコード（１と０）で保存される。いくつかの実施態様において、各塩基は１または０に対応する。他の実施態様において、２以上の塩基の容易に認識される配列が１に対応し、他の２以上の塩基の容易に認識される配列が０に対応する。他の実施態様において、データは３進コード、４進コードまたは他のコードで保存され得る。特別な実施態様において、ポリマーはＤＮＡ（例えば一本鎖ＤＮＡ）であり、ここでＤＮＡは２種の塩基のみを含み、いかなる自己ハイブリダイズできる塩基も含まない（例えばＤＮＡは、アデニンとグアニン、アデニンとシトシン、チミジンとグアニン、またはチミジンとシトシンを含む）。いくつかの実施態様において、２種の塩基には、１以上の追加の塩基が点在してもよく、例えばＡとＣは、例えばコード配列中に中断を示すことによって配列を「分断する」ために、有意な自己ハイブリダイゼーションをもたらさない頻度で、Ｔを含み得る。他の実施態様において、例えば核酸が二本鎖である場合、いくつかまたは全ての利用可能な塩基が用いられ得る。
【0056】
ヌクレオチド塩基は天然であってもよく、またはいくつかの実施態様において、例えばMalyshev, D. et al. "A semi-synthetic organism with an expanded genetic alphabet", Nature (2014) 509: 385-388に記載される（これは参照によって本明細書に組み込まれる）ように、非天然塩基からなってもよく、または非天然塩基を含んでもよい。
【0057】
ある実施態様において、データは単一のモノマー（例えばＤＮＡの場合、単一のヌクレオチド）のポリマーへの付加によって保存される。ある実施態様において、ポリマーはＤＮＡであり、モノマーはアデニン（Ａ）およびシトシン（Ｃ）残基である。（ｉ）ＡとＣは大きなサイズの違いを有し、従ってナノポアによる区別が容易となるはずであり、（ｉｉ）ＡとＣは互いに対形成しないため、ナノポアの信号の解釈を複雑にし得る有意な二次構造を形成せず、（ｉｉｉ）Ｇはグアニン四重鎖を形成することが知られているため、同様の理由のためにあまり好ましくないことから、ＡおよびＣ残基が有利である。ヌクレオチドは末端トランスフェラーゼ（またはポリヌクレオチドホスホリラーゼ）によって付加されるが、単一のヌクレオチドのみが一度に付加されるように、ヌクレオチドは３’ブロック化されている。ブロック化は次のヌクレオチドの付加の前に除去される。
【0058】
いくつかの実施態様において、ＤＮＡはナノチップ内に置かれる。他の実施態様において、ＤＮＡは取り出され、例えば長期間の安定性を増強するために、場合により二本鎖ＤＮＡに変換され、かつ／または、場合により結晶形に変換される。さらなる他の実施態様において、ＤＮＡは増幅され得、増幅されたＤＮＡは長期間の保存のために取り出されるが、元の鋳型ＤＮＡ（例えばナノチップ内のチャンバーの壁に結合しているＤＮＡ）はナノチップ内に残され得、これは読み取られ得、かつ／または追加のＤＮＡを作製するために鋳型として使用され得る。
【0059】
いくつかの実施態様において、ＤＮＡまたは他のポリマーは合成中にナノポアに近接した表面に係留されている。例えば、ある実施態様において、ＤＮＡ分子の３’末端が、保持チャンバーから、ナノポアを通して、３’保護されたｄＮＴＰを付加するポリメラーゼまたは末端トランスフェラーゼ酵素と共に３’保護されたｄＮＴＰの流れを含むフローチャンバーに引き出され得るように、または、ｄＮＴＰを付加しないようにナノポアが酵素を排除している保持チャンバーに保持され得るように、一本鎖ＤＮＡ分子は各５’末端がナノポアに近接した表面に結合されており、各ナノポアにおける電流はそのナノポアのための電極によって独立して調節され得る。例えば図１２～１６並びに図１８および図１９の描写を参照すること。他の実施態様において、一本鎖ＤＮＡは、下記により詳細に記述されるように、トポイソメラーゼを用いて（結合された３’末端を伴う）５’末端への付加によって構築される。各ＤＮＡ分子が各サイクルに関与するか否かを制御することによって、各ＤＮＡ分子の配列が、例えば以下のように正確に制御され得る：
Ａを流す＝３’保護されたｄＡＴＰ
Ｃを流す＝３’保護されたｄＣＴＰ
【表2】
Ｃを流す＝３’保護されたｄＣＴＰ
【0060】
この図式におけるナノポア１およびナノポア２は異なるＤＮＡ鎖と結合しており、その位置（フローチャンバー内または外）は別々に制御できる。ＤＮＡは、保持チャンバー内の特異的な酵素によって、または、フローチャンバー内の流れを変化させ、酵素的手段、化学的手段、光触媒の手段または他の手段によって脱保護をもたらすことによって、脱保護され得る。ある実施態様において、脱ブロック化試薬が基本単位のヌクレオチドを脱保護しないように、脱ブロック化試薬はＡを流すサイクルとＣを流すサイクルの間（例えば、フローチャンバーがバッファーで洗浄されている時）に流れる。他の実施態様において、脱保護剤は非常に嵩高いため、ナノポアを通ってフローチャンバーに渡ることはできない。
【0061】
上述の例の最終結果は、ＡおよびＣがナノポア１のＤＮＡに付加され、ＣおよびＣがナノポア２のＤＮＡに付加されることであろう。
【0062】
他の実施態様において、チャンバーの配置は類似しているが、ナノポアに近接した表面に係留されている二本鎖ＤＮＡを用いて、それぞれバイナリコードに対応している（例えば２以上の種類の）オリゴヌクレオチドフラグメントが、例えば部位特異的リコンビナーゼ（即ち、部位特異的組換え配列として知られる配列セグメント中の核酸の二本鎖の少なくとも一方の鎖を自発的に認識および切断する酵素）を用いて、例えば以下に記述されるトポイソメラーゼを装填された（topoisomerase-charged）オリゴヌクレオチドを用いて、連続的に付加される。
【0063】
ある実施態様において、荷電ポリマー（例えばＤＮＡ）を合成後に凝集状態で保持することが望ましい場合がある。これにはいくつかの理由がある：
・ポリマーはこの形状においてより安定であるはずである、
・ポリマーを凝集させることはクラウディングを低く保ち、小さな体積でより長いポリマーの使用を可能にする、
・秩序のある凝集は、ポリマーがノットまたはもつれを形成する可能性を減少させ得る、
・任意のチャンバーが相互接続されている場合、電流が適用された場合に想定されているポアとは異なるポアをポリマーが通過して長くなることを防ぐのに役立つ、
・凝集はポリマーを電極から離すのに役立ち、ここで電気化学はポリマーを損傷させ得る。
・ポリマーはこの形状においてより安定であるはずである、
・ポリマーを凝集させることはクラウディングを低く保ち、小さな体積でより長いポリマーの使用を可能にする、
・秩序のある凝集は、ポリマーがノットまたはもつれを形成する可能性を減少させ得る、
・任意のチャンバーが相互接続されている場合、電流が適用された場合に想定されているポアとは異なるポアをポリマーが通過して長くなることを防ぐのに役立つ、
・凝集はポリマーを電極から離すのに役立ち、ここで電気化学はポリマーを損傷させ得る。
【0064】
ヒト細胞は約１０ミクロンであるが、８０億塩基対のＤＮＡを含む。このＤＮＡを伸ばすと１メートルを超える。ＤＮＡはヒストンタンパク質に巻き付いているため、細胞に収まっている。ある実施態様において、ヒストンまたは類似のタンパク質は本発明のナノチップにおいて類似の機能を提供する。いくつかの実施態様において、ナノチップの内部表面は、荷電ポリマー（例えばＤＮＡ）がそれらに弱く張り付く傾向を持つように、わずかに正に帯電している。
【0065】
ある実施態様において、荷電ポリマー、例えば一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、ナノポアに近接した表面に結合している。これは様々な方法で達成され得る。一般に、ナノポアを通過できないほど大きな直径（例えば＞１０ｎｍ、例えば２０～５０ｎｍ）を有する相対的に嵩高い構造体（例えばビーズ、タンパク質、または（以下に記述される）ＤＮＡオリガミ構造）にポリマーを結合し、電流を用いて荷電ポリマーをナノポアを通して引っ張り、嵩高い構造から遠いポリマーの末端をナノポアに隣接する表面に係留し、嵩高い構造を切り離すことによって、ポリマーをナノポアに局在化させる。
【0066】
嵩高い構造から遠いポリマーの末端をナノポアに隣接する表面に係留する工程は様々な方法で達成され得る。ある実施態様において、ポリマーは一本鎖ＤＮＡであり、一本鎖ＤＮＡの一部と相補的な予め結合しているＤＮＡ鎖（約５０ｂｐ）が存在し、一本鎖ＤＮＡと予め結合しているＤＮＡ鎖は塩基対形成を介して結合できる。この塩基対形成が十分強い場合、ＤＮＡを操作している間でさえ係留し続けるのに十分である。この結合方法の利点は、ＤＮＡの長期間の保存のために望まれる場合、ＤＮＡをナノポアチップから取り出せることである。あるいは、この鎖は、結合化学（例えば、下記の実施例１に記載されるストレプトアビジン－ビオチン共役）または「クリック」ケミストリー（Kolb, et al. Angew. Chem. Int. Ed. (2001)40: 2004-2021参照のこと、これは参照によって本明細書に組み込まれる）のいずれか、および／または酵素的結合（例えば、オリゴを遠い表面にあらかじめ共有結合させ、次にＤＮＡリガーゼを用いてそれらを結合させることによる）を用いて、表面に共有結合される。
【0067】
鎖の遠い末端がナノポアに隣接する表面に結合すると、嵩高い構造は、例えば嵩高い構造付近の制限部位を切断するエンドヌクレアーゼを用いて切断される。
【0068】
嵩高い構造は、ビーズ、嵩高い分子（例えばＤＮＡ鎖に可逆的に結合するタンパク質）、またはＤＮＡオリガミ構造であり得る。ＤＮＡオリガミは３次元ＤＮＡ構造を作製するための塩基対形成の使用を含む。ＤＮＡオリガミ技術は一般にBell, et al, Nano Lett. (2012)12: 512-517に記述され、これは参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、本発明において、ＤＮＡオリガミは、単一のＤＮＡ分子をナノポアに隣接する表面に結合させるために使用され得る。ある実施態様において、この構造は「ハニカム状の立方体」（例えば各辺が約２０ｎｍ）である。これは、この部分のＤＮＡが（添付書類にある通り）ナノポアを通過するのを妨げる。オリガミ構造に結合する長鎖の（一本鎖または二本鎖）ＤＮＡが存在する。オリガミ構造がナノポアに直面し、さらなる進行を阻害するまで、ＤＮＡ鎖はナノポアを通って進む。その後電流を止め、鎖をナノポアに隣接する表面に結合させる。
【0069】
別の実施態様において、オリガミ構造を伴う荷電ポリマー（例えばＤＮＡ）は、３つのチャンバー配置の中央のチャンバーにある。オリガミはＤＮＡが他の２つのチャンバー（または２つのチャンバーの例において他の１つのチャンバー）に完全に入るのを防ぐ。従って、この例において、ポリマーは表面に係留されることを必要としない。これはポリマーが結び目を作るリスクを減少させ、ポリマーの一端を表面に結合する工程、および他端の嵩高い部分を切断する工程の必要性を回避する。オリガミを含むチャンバーの体積は、ポリマーが相対的にポアの近くに留まるようにできるだけ小さくするべきであり、これは電流がかけられた場合にポリマーが迅速に移動するのを確実にするのに役立つ。ポリマーのオリガミ部分を含む中央のチャンバーは他の中央のチャンバーと相互接続できない（そうでなければ種々のポリマーが混合する）が、他のチャンバー（または３つのチャンバーの例ではチャンバーの組）は相互接続できることを注記しておく。ＤＮＡが他のチャンバーに移動する際、ポリマーは必ずポアの近くにある（実際にはその一部はポアの内部にある）ため、これらの他のチャンバーは、所望により、より大きな体積を有してもよい。
【0070】
いくつかの実施態様において、デバイスは３つの直列のチャンバーを含み、ここで付加チャンバーは流れを可能にするために連続しており、共通の電極を有するが、「脱保護」チャンバーはナノポアを通る流れ以外は流体的に隔離されており、固有の電極を有する。
【0071】
他の実施態様において、ＤＮＡまたは他の荷電ポリマーは係留されないが、合成チャンバーと脱保護チャンバーとの間をチャンバー内の電極の制御下で移動でき、一方ポリメラーゼおよび脱保護化剤はチャンバーを接続するナノポアを通過できないほど嵩高く、かつ／または、チャンバー内の表面に係留されているため、チャンバー間の移動を制限される。例えば図１～９および１６～１７を参照のこと。
【0072】
荷電ポリマーをナノポアを通して移動させるために必要とされる電流は、例えばポリマーの性質、ナノポアのサイズ、ナノポアを含む膜の材料および塩濃度に依存し、要求に応じて特定のシステムに最適化される。本明細書の実施例において使用されるＤＮＡの場合、電圧および電流の例は、例えば１００ｍＭ～１Ｍの桁数の塩濃度で、５０～５００ｍＶ（通常１００～２００ｍＶ）および１～１０ｎＡ（例えば約４ｎＡ）である。
【0073】
荷電ポリマー、例えばＤＮＡのナノポアを通る移動は、通常、非常に速く、例えば１塩基毎に１～５μｓ、即ち１秒毎に１００万塩基の桁数（周波数の用語を採用する場合、１ＭＨｚ）であり、これはシステムにおいてノイズと区別される正確な読み取りを得るための課題を示す。本方法を使用して、（ｉ）測定可能な特徴的な変化をもたらすために、ヌクレオチドは、配列中で、例えば連続して約１００回、繰り返される必要がある、または、（ｉｉ）アルファヘモリジン（αＨＬ）またはマイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）などのタンパク質のポアを使用すること、これは、塩基がポリマーを通過する際に複数の読み取りの可能性のある比較的長いポアを提供し、いくつかの場合では、そのポアを通して１回に１個の塩基に制御されたＤＮＡの供給をもたらすように調整でき、いくつかの場合では、各塩基が通過する際にそれを切断するエキソヌクレアーゼを使用する。様々なアプローチが可能であり、例えば、
・ポリマーの速度を、約１ＭＨｚから約１００～２００Ｈｚに落とすこと、例えば、電圧をかけるとより粘性が増し、それにより、ナノポアを通過するポリマーの速度を落とす電気粘性流体を含む媒体、または、媒体の粘性を光により制御できるプラズモンの流体系；または、分子モーターまたはラチェットを使用する；
・ポリマー中、例えば一本鎖ＤＮＡ中に、ナノポアにはまるために直鎖状にされなければならない嵩高い二次構造、例えば、「ヘアピン」、「ハンマーヘッド」または「ダンベル」の配置を形成する配列を提供し、それにより、情報の密度を薄くし、長い期間を有するシグナルを提供する；
・同じ配列の多数の読み取りを提供すること、例えば、急速に変化する電流を使用して、同じ配列フレームの多数の読み取りを可能にし、分子を次の配列フレームに引き出す直接的な電流の短いバーストと組み合わせることにより、配列全体を複数回読み取ることにより、または、複数の同一配列を並行して読み取ることによる。各場合で読み取りをまとめて、シグナルを増幅する共通の読み取りを提供する；
・電流または抵抗の変化を直接測定するよりも、むしろ、モノマー（例えば、ヌクレオチド）がナノポアを通過する際の静電容量の変化により誘導される高周波数のシグナルにおけるインピーダンスの変化を測定すること；
・異なる塩基間の電流、抵抗または静電容量の差異を増強すること、例えば、サイズがより大きく異なるか、または、その他の方法で修飾されて異なるシグナルを与える非天然塩基を使用することにより、または、大きいサイズのために増強されたシグナルをもたらす「ヘアピン」、「ハンマーヘッド」または「ダンベル」配置などのより大きい二次構造をＤＮＡ中に形成することによる；
・光学的読み取りシステムを使用すること、例えば、その内容が参照によって本明細書に組み込まれるNam, et al., "Graphene Nanopore with a Self-Integrated Optical Antenna", Nano Lett. (2014)14: 5584-5589に記載されるものなどの、光トランスデューサー（または光シグナルエンハンサー）として作用して標準的イオン電流測定を補足または代替する、ナノポアに隣接した集積化光アンテナを使用すること。いくつかの実施態様では、それぞれ異なるモノマーが、ナノポアとその光学アンテナのジャンクションを通過するときにシグネチャー強度で蛍光を発するように、モノマー、例えばＤＮＡヌクレオチドを蛍光染料で標識する。いくつかの実施態様では、例えば、各内容が参照によって本明細書に組み込まれるMcNally et al., "Optical recognition of converted DNA nucleotides for single molecule DNA sequencing using nanopore arrays", Nano Lett. (2010)10(6): 2237-2244, および Meller A., "Towards Optical DNA Sequencing Using Nanopore Arrays", J Biomol Tech. (2011) 22(Suppl): S8-S9に記載されるように、ポリマーが高速でナノポアを通過するときに、固相のナノポアが蛍光標識をはがし、一連の検出可能な光子のバーストを導く。
・ポリマーの速度を、約１ＭＨｚから約１００～２００Ｈｚに落とすこと、例えば、電圧をかけるとより粘性が増し、それにより、ナノポアを通過するポリマーの速度を落とす電気粘性流体を含む媒体、または、媒体の粘性を光により制御できるプラズモンの流体系；または、分子モーターまたはラチェットを使用する；
・ポリマー中、例えば一本鎖ＤＮＡ中に、ナノポアにはまるために直鎖状にされなければならない嵩高い二次構造、例えば、「ヘアピン」、「ハンマーヘッド」または「ダンベル」の配置を形成する配列を提供し、それにより、情報の密度を薄くし、長い期間を有するシグナルを提供する；
・同じ配列の多数の読み取りを提供すること、例えば、急速に変化する電流を使用して、同じ配列フレームの多数の読み取りを可能にし、分子を次の配列フレームに引き出す直接的な電流の短いバーストと組み合わせることにより、配列全体を複数回読み取ることにより、または、複数の同一配列を並行して読み取ることによる。各場合で読み取りをまとめて、シグナルを増幅する共通の読み取りを提供する；
・電流または抵抗の変化を直接測定するよりも、むしろ、モノマー（例えば、ヌクレオチド）がナノポアを通過する際の静電容量の変化により誘導される高周波数のシグナルにおけるインピーダンスの変化を測定すること；
・異なる塩基間の電流、抵抗または静電容量の差異を増強すること、例えば、サイズがより大きく異なるか、または、その他の方法で修飾されて異なるシグナルを与える非天然塩基を使用することにより、または、大きいサイズのために増強されたシグナルをもたらす「ヘアピン」、「ハンマーヘッド」または「ダンベル」配置などのより大きい二次構造をＤＮＡ中に形成することによる；
・光学的読み取りシステムを使用すること、例えば、その内容が参照によって本明細書に組み込まれるNam, et al., "Graphene Nanopore with a Self-Integrated Optical Antenna", Nano Lett. (2014)14: 5584-5589に記載されるものなどの、光トランスデューサー（または光シグナルエンハンサー）として作用して標準的イオン電流測定を補足または代替する、ナノポアに隣接した集積化光アンテナを使用すること。いくつかの実施態様では、それぞれ異なるモノマーが、ナノポアとその光学アンテナのジャンクションを通過するときにシグネチャー強度で蛍光を発するように、モノマー、例えばＤＮＡヌクレオチドを蛍光染料で標識する。いくつかの実施態様では、例えば、各内容が参照によって本明細書に組み込まれるMcNally et al., "Optical recognition of converted DNA nucleotides for single molecule DNA sequencing using nanopore arrays", Nano Lett. (2010)10(6): 2237-2244, および Meller A., "Towards Optical DNA Sequencing Using Nanopore Arrays", J Biomol Tech. (2011) 22(Suppl): S8-S9に記載されるように、ポリマーが高速でナノポアを通過するときに、固相のナノポアが蛍光標識をはがし、一連の検出可能な光子のバーストを導く。
【0074】
ある実施態様では、荷電ポリマーは核酸、例えば一本鎖ＤＮＡであり、その配列が二次構造をもたらす。参照により本明細書に組み込まれるBell, et al., Nat Nanotechnol.(2016)11(7):645-51は、固相ナノポア形式で検出可能なダンベル配置の比較的短い配列を使用して免疫アッセイの抗原を標識することを記載している。Bellらに使用されたナノポアは、ダンベル構造全体がポアを通過できるように比較的大きかったが、ダンベル配置の直径よりも小さいナノポアを使用すると、ＤＮＡは「ファスナーを開かれ（unzip）」、直鎖状になる。より複雑な配置、例えば、各ビットがｔＲＮＡに似た配列に対応する配置を使用できる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるHenley, et al. Nano Lett. (2016)16: 138-144を参照されたい）。従って、本発明は、少なくとも２種類の二次構造を有し、その二次構造がデータ（例えば、１つのタイプの二次構造が１であり、第２の二次構造が０であるバイナリデータ）をコードする荷電ポリマー、例えば一本鎖ＤＮＡを提供する。他の実施態様では、二次構造を使用して、ＤＮＡのナノポア通過を減速するか、または、配列に中断をもたらし、配列の読み取りを容易にする。
【0075】
他の実施態様では、本発明は一連の少なくとも２つの異なるＤＮＡモチーフを含むＤＮＡ分子を利用し、各モチーフは特定のリガンド（例えば二本鎖ＤＮＡに対する遺伝子調節タンパク質、または、一本鎖ＤＮＡに対するｔＲＮＡ）に特異的に結合し、少なくとも２つの異なるＤＮＡモチーフが（例えば１つのモチーフが１であり、第２のモチーフが０であるバイナリコードで）情報をコードし、例えば、リガンドは、ＤＮＡがナノポアを通過する際にナノポアにかかるシグナルの差異（例えば電流または静電容量の変化）を増強する。
【0076】
上記で論じた通り、異なるモノマーがナノポアを通過するとき、それらは、主としてナノポアを物理的に塞ぎ、ナノポアのコンダクタンスを変化させることにより、ナノポアを通る電流に影響を与える。既存のナノポアシステムでは、この電流の変化を直接測定する。現行の読み取りシステムの問題は、システムにかなりのノイズがあり、ＤＮＡの場合、例えば、異なるヌクレオチドユニットがナノポアを通過する際の電流変動を測定するときに、異なるモノマー間、例えば異なる塩基間の差異を正確に検出するには、１００分の１秒の桁数で、比較的長い積分時間が必要とされることである。最近、インピーダンスおよび静電容量の変化が、塩および生体分子の複雑な相互作用の可能性にも拘わらず、細胞および生物システムを研究するのに有用であり得ることが示された。例えば、Laborde, et al. Nat Nano. (2015)10(9):791-5（参照により本明細書に組み込まれる）は、高周波インピーダンス分光法を、生理的塩条件下で静電容量の小さい変化を検出し、微粒子および生きている細胞をデバイの限界（Debye limit）を超えて画像化するのに使用できることを立証している。
【0077】
従って、本発明のある実施態様では、電流の変動を直接測定するよりも、むしろ、容量変動を測定し、例えば、モノマー（例えば、ヌクレオチド）がナノポアを通過する際の静電容量の変化により誘導される無線周波シグナルの相変化を測定することにより、荷電ポリマーの配列を同定する。
【0078】
簡潔に述べると、静電容量は、一方の電気伝導体と他方の電気伝導体の間にギャップがあるいかなる回路にも存在する。電流は静電容量と共に直接的に変動するが、静電容量と同時には変動しない。例えば、交流電流の容量回路で電流と電圧を経時的にプロットする場合、電流と電圧の両方がそれぞれ正弦波を形成するが、波の位相は不一致であるとわかるであろう。電流に変化があるとき、静電容量に変化があり、それはシグナルの位相の変化に反映される。無線周波交流電流は一定の周波数と振幅のシグナルをもたらすが、シグナルの位相は回路の静電容量に伴って変動する。本願のシステムでは、荷電ポリマーがナノポアを通って（ＤＮＡの場合は陽極に向かって）引き出されるように、交流電流よりも、むしろ、脈流直流電流（即ち、極性が維持され、一方の電極は陽極のままであり、他方は陰極のままであるように、電圧は２つの値の間で変化するが、「ゼロ」のラインを超えない）を使用する。ナノポア中に何もない場合、静電容量は１つの値であり、それはポリマーの異なるモノマーがナノポアを通過するときに変化する。適する周波数の範囲は、無線周波数の範囲にあり、例えば１ＭＨｚ～１ＧＨｚ、例えば５０～２００ＭＨｚ、例えば約１００ＭＨｚであり、例えば、媒体の有意な誘電加熱を引き起こし得る高マイクロ波の周波数より低い。干渉の可能性を低減するために、複数のナノポアを１つの無線周波数の入力ラインで同時に測定できるように、異なるナノポアに異なる周波数を適用できる。
【0079】
インピーダンスの変化（例えば、静電容量の変化に起因するもの）を高周波数で測定することは、１／ｆノイズ、即ち、電気的測定回路に内在する「ピンク」ノイズの影響を低減するので、ある一定の期間に利用できるシグナル対ノイズを高める。所定の期間内に多くの測定が行われるので、高周波数のシグナルの使用はシグナル対ノイズ比を高め、環境またはデバイスの変動およびゆらぎに起因するインピーダンス変化と容易に区別される、より安定なシグナルをもたらす。
【0080】
これらの原理を本発明に応用して、本発明は、ある実施態様では、モノマー（例えば、ヌクレオチド）がナノポアを通過する際の静電容量の変化により誘導される高周波数のシグナルにおけるインピーダンスの変化を測定する方法を提供する。例えば、少なくとも２つの異なる種類のモノマーを含む荷電ポリマー、例えばＤＮＡ分子のモノマー配列を読み取る方法を提供し、これは、無線周波数の脈流直流電流を、例えば１ＭＨｚ～１ＧＨｚ、例えば５０～２００ＭＨｚ、例えば約１００ＭＨｚの周波数でナノポアにかけ、脈流直流電流が荷電ポリマーをナノポアを通して引き出し、荷電ポリマーがナノポアを通過する際にナノポアの容量変動を測定することによりモノマー配列を読み取ることを含む。
【0081】
いくつかの実施態様では、本発明は、少なくとも２つの別個のモノマーを含む荷電ポリマー、例えばＤＮＡの配列決定用のナノチップを提供する。そのナノチップは、少なくとも第１および第２の反応チャンバーを含み、これらはそれぞれ電解質媒体を含み、１以上のナノポアを含む膜により分離されており、回路に（例えば向かい合うプレートの形態で）連結された電極対が１以上のナノポアを含む膜のいずれかの側に配置されており、電極は１～３０ミクロン、例えば約１０ミクロン離されていて、荷電ポリマーを、ナノポアを通して、例えば１つのチャンバーから次のチャンバーに引き出すために、無線周波数の脈流直流電流、例えば１ＭＨｚ～１ＧＨｚが電極にかけられたときに、電極間のギャップが静電容量を有するように、そして、脈流直流無線周波数電流の位相が、荷電ポリマーがナノポアを通過する際の静電容量の変化に伴って変化し、それにより、荷電ポリマーのモノマー配列の検出を可能にするようになっている。ある種の実施態様では、ナノチップは複数のセットの反応チャンバーを含み、１セット内の反応チャンバーは、１以上のナノポアを有する膜により分離されており、これらの反応チャンバーのセットは、反応チャンバーのセット間の電気的干渉を最小にし、かつ／または、複数の線状ポリマーを分離してそれらが並行して配列決定されることを可能にする、スクリーニング層により分離されている。
【0082】
例えば、ある実施態様では、電極は、共振回路に埋め込まれたコンデンサの上下のプレートを形成し、ＤＮＡがプレート間のポアを通過する際に静電容量の変化が測定される。
【0083】
ある種の実施態様では、ナノチップは、例えば、下記のナノチップ１のいずれかに従って、ポリマー、例えばＤＮＡを合成するための試薬をさらに含む。
【0084】
従って、ある実施態様では、本発明は少なくとも２つの別個のモノマーを含む荷電ポリマー［例えば、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）］をナノチップ中で合成する方法（方法１）を提供し、このナノチップは、
単一のモノマーまたはオリゴマーのみが１つの反応サイクルにおいて付加され得るように、１以上のモノマー［例えばヌクレオチド］またはオリゴマー［例えば、オリゴヌクレオチド］を、緩衝液中で、末端が保護された形態で、荷電ポリマーに付加するための試薬を含む、１以上の付加チャンバー；および、
緩衝液を含むが、１以上のモノマーまたはオリゴマーの付加に必要な全ての試薬を含むわけではない、１以上の保存チャンバー
（ここで、チャンバーは、１以上のナノポアを含む１以上の膜により分離されており、
荷電ポリマーはナノポアを通過できるが、１以上のモノマーまたはオリゴマーの付加用の試薬の少なくとも１つは通過できない）
を含み、
この方法は、
ａ）第１の末端と第２の末端を有する荷電ポリマーの第１の末端を、電気的引力により付加チャンバーに移動させ、それによりモノマーまたはオリゴマーをブロック化された形態で第１の末端に付加すること、
ｂ）荷電ポリマーの第１の末端を、ブロック化された形態で付加されたモノマーまたはオリゴマーと共に、保存チャンバーへ移動させること、
ｃ）付加されたモノマーまたはオリゴマーを脱ブロック化すること、および、
ｄ）所望のポリマー配列が得られるまで、工程ａ～ｃを繰り返すこと、ここで、工程ａ）で付加されるモノマーまたはオリゴマーは、同じであるか、または異なる、
を含む。
単一のモノマーまたはオリゴマーのみが１つの反応サイクルにおいて付加され得るように、１以上のモノマー［例えばヌクレオチド］またはオリゴマー［例えば、オリゴヌクレオチド］を、緩衝液中で、末端が保護された形態で、荷電ポリマーに付加するための試薬を含む、１以上の付加チャンバー；および、
緩衝液を含むが、１以上のモノマーまたはオリゴマーの付加に必要な全ての試薬を含むわけではない、１以上の保存チャンバー
（ここで、チャンバーは、１以上のナノポアを含む１以上の膜により分離されており、
荷電ポリマーはナノポアを通過できるが、１以上のモノマーまたはオリゴマーの付加用の試薬の少なくとも１つは通過できない）
を含み、
この方法は、
ａ）第１の末端と第２の末端を有する荷電ポリマーの第１の末端を、電気的引力により付加チャンバーに移動させ、それによりモノマーまたはオリゴマーをブロック化された形態で第１の末端に付加すること、
ｂ）荷電ポリマーの第１の末端を、ブロック化された形態で付加されたモノマーまたはオリゴマーと共に、保存チャンバーへ移動させること、
ｃ）付加されたモノマーまたはオリゴマーを脱ブロック化すること、および、
ｄ）所望のポリマー配列が得られるまで、工程ａ～ｃを繰り返すこと、ここで、工程ａ）で付加されるモノマーまたはオリゴマーは、同じであるか、または異なる、
を含む。
【0085】
例えば、本発明は、以下のものを提供する。
１.１ ポリマーが核酸である、例えば、ポリマーがＤＮＡまたはＲＮＡである、例えば、ＤＮＡ、例えばｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡである、方法１。
１.１ ポリマーが核酸である、例えば、ポリマーがＤＮＡまたはＲＮＡである、例えば、ＤＮＡ、例えばｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡである、方法１。
【0086】
１.２ ポリマー、例えば核酸の第２の末端が保護されているか、またはナノポアに隣接する基板に結合している、上述のいずれかの方法。
【0087】
１.３ 各チャンバー内の電極間に電圧をかけることにより電気的引力が提供され、電極間の極性および電流を、例えば核酸が陽極に誘引されるように制御できる、上述のいずれかの方法。
【0088】
１.４ ポリマーが核酸であり、
（ｉ）核酸の第１の末端が３’末端であり、ヌクレオチドの付加が５’から３’への方向であり、ポリメラーゼにより触媒され、例えば、ポリメラーゼは（例えば、そのサイズのために、または、第１のチャンバー内の基板に係留されているために）ナノポアを通過できなくされており、ヌクレオチドは、付加時に３’－保護されており、３’－保護ヌクレオチドを核酸の３’－末端に付加した後、核酸上の３’－保護基を、例えば、保存チャンバー内で除去する；または
（ｉｉ）核酸の第１の末端が５’末端であり、ヌクレオチドの付加が３’から５’への方向であり、ヌクレオチドは、付加時に５’－保護されており、５’－保護ヌクレオチドを核酸の５’－末端に付加した後、５’－保護基を、例えば、第２のチャンバー内で除去する；（例えば、５’－保護ヌクレオチド上のリン酸は、ナノポアを通過できない嵩高い基に５’－保護基を介して結合したヌクレオシドホスホラミダイトであり、核酸へのカップリングに続いて、未反応のヌクレオチドを洗い流し、嵩高い５’－保護基を核酸から切り離し、洗い流し、核酸の５’－末端を保存チャンバーに移動できるようにされている）；
ここで、核酸へのヌクレオチドの付加は、１以上の付加チャンバーを出入りする核酸の第１の末端の動きにより制御され、このサイクルは所望の配列が得られるまで継続される、
上述のいずれかの方法。
（ｉ）核酸の第１の末端が３’末端であり、ヌクレオチドの付加が５’から３’への方向であり、ポリメラーゼにより触媒され、例えば、ポリメラーゼは（例えば、そのサイズのために、または、第１のチャンバー内の基板に係留されているために）ナノポアを通過できなくされており、ヌクレオチドは、付加時に３’－保護されており、３’－保護ヌクレオチドを核酸の３’－末端に付加した後、核酸上の３’－保護基を、例えば、保存チャンバー内で除去する；または
（ｉｉ）核酸の第１の末端が５’末端であり、ヌクレオチドの付加が３’から５’への方向であり、ヌクレオチドは、付加時に５’－保護されており、５’－保護ヌクレオチドを核酸の５’－末端に付加した後、５’－保護基を、例えば、第２のチャンバー内で除去する；（例えば、５’－保護ヌクレオチド上のリン酸は、ナノポアを通過できない嵩高い基に５’－保護基を介して結合したヌクレオシドホスホラミダイトであり、核酸へのカップリングに続いて、未反応のヌクレオチドを洗い流し、嵩高い５’－保護基を核酸から切り離し、洗い流し、核酸の５’－末端を保存チャンバーに移動できるようにされている）；
ここで、核酸へのヌクレオチドの付加は、１以上の付加チャンバーを出入りする核酸の第１の末端の動きにより制御され、このサイクルは所望の配列が得られるまで継続される、
上述のいずれかの方法。
【0089】
１.５ かくして合成されるポリマー中のモノマーまたはオリゴマーの配列［例えば、核酸中のヌクレオチドの配列］がバイナリコードに対応する、上述のいずれかの方法。
１.６ かくして合成されるポリマーが一本鎖ＤＮＡである、上述のいずれかの方法。
１.７ モノマーまたはオリゴマー［例えば、ヌクレオチド塩基］をそれらがナノポアを通過する際に配列決定し、配列決定におけるエラーを同定することにより、ポリマー［例えば核酸］の配列を加工または合成中に確認する、上述のいずれかの方法。
１.６ かくして合成されるポリマーが一本鎖ＤＮＡである、上述のいずれかの方法。
１.７ モノマーまたはオリゴマー［例えば、ヌクレオチド塩基］をそれらがナノポアを通過する際に配列決定し、配列決定におけるエラーを同定することにより、ポリマー［例えば核酸］の配列を加工または合成中に確認する、上述のいずれかの方法。
【0090】
１.８ かくして合成されるポリマーが一本鎖ＤＮＡであり、少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％、例えば、実質的に全ての配列中の塩基が、鎖中の他の塩基とハイブリダイズしない２つの塩基から選択され、例えばアデニンおよびシトシンから選択される塩基である、上述のいずれかの方法。
【0091】
１.９ 異なる配列を有するポリマー［オリゴヌクレオチド］が得られるように、ポリマーが１以上の付加チャンバーまたは１以上の保存チャンバーに存在するか否かを個別に制御することにより、複数のポリマー［例えばオリゴヌクレオチド］が並行して独立に合成される、上述のいずれかの方法。
【0092】
１.１０ 異なるモノマーまたはオリゴマー、例えば異なるヌクレオチドを付加するのに適する試薬を含む少なくとも２つの付加チャンバーがあり、例えば、第１のモノマーまたはオリゴマーの付加に適する試薬を含む１以上の付加チャンバー、および、第２の異なるモノマーまたはオリゴマーの付加に適する試薬を含む１以上の付加チャンバーがあり、例えば、アデニンヌクレオチドの付加に適する試薬を含む１以上の付加チャンバー、および、シトシンヌクレオチドの付加に適する試薬を含む１以上の付加チャンバーがある、上述のいずれかの方法。
【0093】
１.１１ 少なくとも１つの付加チャンバーがフローチャンバーであり、（ｉ）第１のモノマーまたはオリゴマーの付加に適するフローチャンバー試薬を提供すること、（ｉｉ）洗い流すこと、（ｉｉｉ）第２の異なるモノマーまたはオリゴマーの付加に適するフローチャンバー試薬を提供すること、および、（ｉｖ）洗い流すこと、を含むフローサイクルを提供し、合成が完了するまでこのサイクルを繰り返し、ポリマー中のモノマーまたはオリゴマーの配列は、各サイクルの工程（ｉ）または（ｉｉｉ）において、ポリマーの第１の末端をフローチャンバーに導入するか、またはそこから排除することにより制御される、上述のいずれかの方法；
【0094】
１.１２ ポリマーがＤＮＡであり、少なくとも１つの付加チャンバーがフローチャンバーであり、（ｉ）第１の種類のヌクレオチドの付加に適するフローチャンバー試薬を提供すること、（ｉｉ）洗い流すこと、（ｉｉｉ）第２の種類のヌクレオチドの付加に適するフローチャンバー試薬を提供すること、および、（ｉｖ）洗い流すこと、を含むフローサイクルを提供し、合成が完了するまでこのサイクルを繰り返し、配列は、フローチャンバーにおけるＤＮＡの第１の末端（例えば３’－末端）の有無を制御することにより制御される、上述のいずれかの方法。
【0095】
１.１３ ポリマーがＤＮＡであり、少なくとも１つの付加チャンバーがフローチャンバーであり、（ｉ）第１の種類のヌクレオチドの付加に適するフローチャンバー試薬を提供すること、（ｉｉ）洗い流すこと、（ｉｉｉ）第２の種類のヌクレオチドの付加に適するフローチャンバー試薬を提供すること、および、（ｉｖ）洗い流すこと、（ｉ）第３の種類のヌクレオチドの付加に適するフローチャンバー試薬を提供すること、（ｉｉ）洗い流すこと、（ｉｉｉ）第４の種類のヌクレオチドの付加に適するフローチャンバー試薬を提供すること、および、（ｉｖ）洗い流すこと、を含むフローサイクルを提供し、合成が完了するまでこのサイクルを繰り返し、配列は、異なる種類のヌクレオチドの付加に適する試薬が存在するときにフローチャンバーにおけるＤＮＡの第１の末端（例えば３’－末端）の有無を制御することにより制御される、上述のいずれかの方法。
【0096】
１.１４ ポリマーがＤＮＡであり、ナノチップがフローチャンバーである２つの付加チャンバーを含み、（ａ）第１のフローチャンバーが、（ｉ）第１の種類のヌクレオチドの付加に適するフローチャンバー試薬を提供すること、（ｉｉ）洗い流すこと、（ｉｉｉ）第２の異なる種類のヌクレオチドの付加に適するフローチャンバー試薬を提供すること、および、（ｉｖ）洗い流すこと、を含むフローサイクルを提供し、合成が完了するまでこのサイクルを繰り返し、そして、（ｂ）第２のフローチャンバーが、（ｉ）第３の種類のヌクレオチドの付加に適する第２のフローチャンバー試薬を提供すること、（ｉｉ）洗い流すこと、（ｉｉｉ）第４の異なる種類のヌクレオチドの付加に適する第２のフローチャンバー試薬を提供すること、および、（ｉｖ）洗い流すこと、を含むフローサイクルを提供し、合成が完了するまでこのサイクルを繰り返し、ここで、ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰから選択され、配列は、ＤＮＡの第１の末端（例えば３’－末端）を、次の所望のヌクレオチドが提供された場合にフローチャンバーに導入することにより制御される、上述のいずれかの方法。
【0097】
１.１５ ポリマーがＤＮＡであり、ナノポアチップが、ｄＡＴＰを付加するための１以上の付加チャンバー、ｄＴＴＰを付加するための１以上の付加チャンバー、ｄＣＴＰを付加するための１以上の付加チャンバー、および、ｄＧＴＰを付加するための１以上の付加チャンバーを含む、上述のいずれかの方法。
【0098】
１.１６ 合成されるポリマー［例えば核酸］が、それぞれ、それらの第２の末端を介して、ナノポアに近接する表面に結合している、上述のいずれかの方法。
【0099】
１.１７ ポリマー［例えば核酸］の配列が、ポリマーがナノポアを通過する際の電圧、電流、抵抗、静電容量および／またはインピーダンスの変化を検出することにより、各サイクルに続いて決定される、上述のいずれかの方法。
【0100】
１.１８ ポリマーが核酸であり、核酸の合成が、緩衝液、例えば、ｐＨ７～８.５、例えば約ｐＨ８とするためのバッファー、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、適当な酸、および、場合によりキレーター、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含むバッファー、例えば、Ｔｒｉｓベース、酢酸およびＥＤＴＡの混合物を含むＴＡＥバッファー、または、Ｔｒｉｓベース、ホウ酸およびＥＤＴＡの混合物を含むＴＢＥバッファーを含む溶液中で；例えば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、または、例えば、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－アセテート、１０ｍＭ酢酸マグネシウムを含む溶液（ｐＨ７.９＠２５℃）中で起こる、上述のいずれかの方法。
【0101】
１.１９ ポリマーが一本鎖ＤＮＡであり、合成された一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換することをさらに含む、上述のいずれかの方法。
【0102】
１.２０ ポリマー［例えば核酸］を、ポリマー合成の完了後にナノチップから取り出すことをさらに含む、上述のいずれかの方法。
【0103】
１.２１ ポリマーが核酸であり、適切なプライマーおよびポリメラーゼ（例えばＰｈｉ２９）を使用して、合成された核酸のコピーを増幅および回収することをさらに含む、上述のいずれかの方法。
【0104】
１.２２ ポリマーが核酸であり、合成された核酸を制限酵素で切断し、核酸をナノチップから取り出すことをさらに含む、上述のいずれかの方法。
【0105】
１.２３ ポリマーが核酸であり、かくして合成された核酸を増幅することをさらに含む、上述のいずれかの方法。
【0106】
１.２４ ポリマー［例えば、核酸］をナノチップから取り出し、ポリマーを結晶化することをさらに含む、上述のいずれかの方法。
【0107】
１.２５ ポリマーが核酸であり、例えば、例えば参照により本明細書に組み込むＵＳ８２８３１６５Ｂ２に記載されている通り、核酸を含む溶液を、１以上のバッファー（例えば、ホウ酸バッファー）、抗酸化剤、湿潤剤、例えばポリオール、および、場合により、キレート剤と共に乾燥させることにより；または、核酸とポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）－ポリ（ｌ－リジン）（ＰＥＧ－ＰＬＬ）ＡＢ型ブロックコポリマーとの間にマトリックスを形成することにより；または、相補的核酸鎖またはＤＮＡに結合するタンパク質の添加により、核酸を安定化することをさらに含む、上述のいずれかの方法。
【0108】
１.２６
（ｉ）核酸を、３’－保護ヌクレオチドと、付加チャンバー中で、３’－保護ヌクレオチドの核酸の３’末端への付加を触媒するポリメラーゼの存在下で、反応させること；
（ｉｉ）かくして得られた３’－保護核酸の少なくとも３’末端を、付加チャンバーから、少なくとも１つのナノポアを通して、保存チャンバーに引き出すこと、ここで、ポリメラーゼは（例えば、そのサイズのために、または、第１のチャンバー内の基板に係留されているために）ナノポアを通過できなくされている；
（ｉｉｉ）３’－保護核酸を、例えば化学的または酵素的に、脱保護すること；および
（ｉｖ）さらなる３’－保護ｄＮＴＰをオリゴヌクレオチドに付加することが望ましい場合は、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）が繰り返されるように、オリゴヌクレオチドの３’末端を同一または異なる付加チャンバーに引き出すこと、または、それが望ましくない場合は、所望の３’－保護ｄＮＴＰが付加チャンバーに提供されるさらなるサイクルまで、核酸の３’末端を保存チャンバーに留まらせること；および
（ｖ）所望の核酸配列が得られるまで工程（ｉ）～（ｉｖ）を繰り返すこと、
を含む、上述のいずれかの方法。
（ｉ）核酸を、３’－保護ヌクレオチドと、付加チャンバー中で、３’－保護ヌクレオチドの核酸の３’末端への付加を触媒するポリメラーゼの存在下で、反応させること；
（ｉｉ）かくして得られた３’－保護核酸の少なくとも３’末端を、付加チャンバーから、少なくとも１つのナノポアを通して、保存チャンバーに引き出すこと、ここで、ポリメラーゼは（例えば、そのサイズのために、または、第１のチャンバー内の基板に係留されているために）ナノポアを通過できなくされている；
（ｉｉｉ）３’－保護核酸を、例えば化学的または酵素的に、脱保護すること；および
（ｉｖ）さらなる３’－保護ｄＮＴＰをオリゴヌクレオチドに付加することが望ましい場合は、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）が繰り返されるように、オリゴヌクレオチドの３’末端を同一または異なる付加チャンバーに引き出すこと、または、それが望ましくない場合は、所望の３’－保護ｄＮＴＰが付加チャンバーに提供されるさらなるサイクルまで、核酸の３’末端を保存チャンバーに留まらせること；および
（ｖ）所望の核酸配列が得られるまで工程（ｉ）～（ｉｖ）を繰り返すこと、
を含む、上述のいずれかの方法。
【0109】
１.２７ ポリマーが核酸の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であり、１以上のナノポアが、ｓｓＤＮＡを通過させるが、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を通過させない直径、例えば、約２ｎｍの直径を有する、上述のいずれかの方法。
【0110】
１.２８ モノマーが３’－保護ヌクレオチド、例えば、例えばデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）から選択されるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、例えばｄＡＴＰまたはｄＣＴＰである、上述のいずれかの方法。
【0111】
１.２９ ポリマーが核酸であり、ヌクレオチドの核酸への付加がポリメラーゼ、例えば、鋳型に依存しないポリメラーゼ、例えば、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）またはポリヌクレオチドホスホリラーゼにより触媒される、例えば、ポリメラーゼがＤＮＡの３’－ヒドロキシル末端でデオキシヌクレオチドの組み込みを触媒する、上述のいずれかの方法。
【0112】
１.３０ 膜が、複数のナノポアと、それぞれナノポアに近接する表面に結合した複数のポリマー、例えば、ナノポアに近接する表面に５’末端を介して結合した複数の核酸を含む、上述のいずれかの方法。
【0113】
１.３１ それぞれナノポアに近接する表面に結合した複数のポリマー、例えば、ナノポアに近接する表面に５’末端で結合した複数の核酸が、独立して合成され、各ナノポアが電極対を伴い、電極対の一方の電極がナノポアの一方の末端に近接した位置にあり、他方の電極がナノポアの他方の末端に近接した位置にあり、電極対により与えられる電流により各ポリマーを第１および第２のチャンバーの間で独立して動かせるようにする、上述のいずれかの方法。
【0114】
１.３２ ポリマーが、ナノポアに近接する表面に５’末端で結合した３’－保護核酸であり、３’－保護核酸の３’末端が、電気力を使用することにより、例えば、隣接するチャンバー内の電極からかけられる電気力を使用することにより、ナノポアを通して引き出される、上述のいずれかの方法。
【0115】
１.３３ 新しい３’－保護ｄＮＴＰが、第１の３’－保護ｄＮＴＰと同一であるか、または異なる、１.２０の方法。
【0116】
１.３４ サイクルの工程（ｉ）で使用される３’－保護ｄＮＴＰが、各サイクルで３’－保護ｄＡＴＰと３’－保護ｄＣＴＰの間で交互になる、１.２０の方法。
【0117】
１.３５ ポリマーが核酸であり、核酸の脱保護が、ｓｓＤＮＡ上の３’－保護基を除去するが３’保護ｄＮＴＰ上の３’－保護基を除去しない酵素により実行される、上述のいずれかの方法。
【0118】
例えば、本発明は、ナノチップ中で核酸を合成する方法を提供し、ナノチップは、少なくとも１つのナノポアを含む膜で分離されている少なくとも第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを含み、合成は、第１の末端および第２の末端を有する核酸の第１の末端へのヌクレオチド付加のサイクルにより緩衝液中で実行され、ここで、核酸の第１の末端は、１以上の付加チャンバー（ヌクレオチドを付加できる試薬を含む）と１以上の保存チャンバー（ヌクレオチドの付加に必要な試薬を含まない）の間で電気的引力により動かされ、チャンバーは、各々１以上のナノポアを含む１以上の膜により分離されており、ナノポアは、核酸を通過させるのに十分な大きさであるが、ヌクレオチドの付加に必須の少なくとも１つの試薬を通過させるには小さすぎ、例えば、この方法は記載された方法１のいずれかに対応する。
【0119】
ある種の実施態様では、ポリマーの配列はバイナリコードに対応し、例えば、ポリマーが核酸であり、配列がバイナリコードに対応し、各ビット（０または１）が塩基、例えばＡまたはＣにより表される。
【0120】
ある種の実施態様では、ポリマーはＤＮＡである。
【0121】
ある他の実施態様では、各ビットは、単一のモノマーよりも、むしろ、モノマーの短い配列により表される。例えば、そのようなある実施態様では、ＤＮＡの塊を合成し、各塊はナノポアを介して独自のシグナルを生成し、０または１に対応する。この実施態様は、単一のヌクレオチドをナノポア中で、特に固相ナノポア中で検出するのがより難しい点である種の利点を有するので、塊を使用すると、ポリマーにおける情報の密度は相応して減少するが、読み取りのエラーは生じにくくなる。
【0122】
例えば、部位特異的リコンビナーゼ、即ち、部位特異的組換え配列として知られている配列セグメント内で核酸二本鎖の少なくとも一方の鎖を自発的に認識して切断する酵素を使用して、（二本鎖）ヌクレオチドの塊を付加できる。あるそのような実施態様では、部位特異的リコンビナーゼは、トポ結合した（topo-conjugated）ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチド塊を配列に連結するのに使用されるトポイソメラーゼである。これらのオリゴヌクレオチド自体は、制限酵素で切断されるまで、さらなる連結に適合する構造を有さない。ワクシニアウイルストポイソメラーゼＩは、ＤＮＡ配列５’－（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴ－３’を特異的に認識する。トポイソメラーゼは、二本鎖ＤＮＡに結合し、５’－（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴ－３’切断部位でそれを切断する。トポイソメラーゼはＤＮＡを一方の鎖のみで切断するので切断は完全ではなく（他方の鎖に近傍のニックがあることは、ある種の二本鎖切断をもたらすが）、切断時に、トポイソメラーゼは３’ヌクレオチドの３’リン酸に共有結合することに留意されたい。その後、その酵素は、ＤＮＡの３’末端に共有結合したままであり、共有結合的に保持された鎖を、最初に切断されたのと同じ結合で再連結でき（ＤＮＡ弛緩において生じる通り）、あるいは、適合するオーバーハングを有する異種のアクセプターＤＮＡに再連結し、組換え分子を生成できる。この実施態様では、トポイソメラーゼ組換え部位およびトポイソメラーゼ連結部位を生成する制限部位に隣接した、ｄｓＤＮＡドナーオリゴヌクレオチド（例えば、一方は「０」、他方は「１」の、少なくとも２つの異なる配列のうち１つを含む）を生成する。これらのカセットは、トポ装填される（Topo-charged）；即ち、それらは、レシーバーオリゴヌクレオチド上のトポイソメラーゼ連結部位にそれらを結合させるトポイソメラーゼに共有結合する。伸長しているレシーバーのＤＮＡ鎖が制限酵素で切断されると、トポ装填されたカセットに連結できるようになる。よって、伸長しているＤＮＡを制限酵素からトポ装填されたカセットに連続的に循環させるだけでよく、各サイクルが他のドナーオリゴヌクレオチドを付加する。関連するアプローチがクローニングのために説明されており、例えば、参照により本明細書に組み込む Shuman S., Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase. J Biol Chem. (1994); 269(51):32678-84を参照されたい。
【0123】
類似の戦略を用いて、単一の塩基を付加できる。適当な一本鎖の「脱保護された」「アクセプター」ＤＮＡの存在下で、トポ装填されたＤＮＡは、そのトポイソメラーゼによりアクセプターに酵素的かつ共有結合的に連結（「付加」）され、トポイソメラーゼはこの過程でＤＮＡから除去される。ＩＩＳ型制限酵素は、１つの塩基（「付加」されている塩基）以外の付加されたＤＮＡを全て切り離せる。この脱保護－付加の過程を繰り返し、さらなる塩基（ビット）を付加できる。本明細書において実施例で立証される通り、単一のヌクレオチドを標的一本鎖ＤＮＡの５’末端に付加するために、トポ／ＩＩＳ型制限酵素の組合せを使用することができる。ＩＩＳ型制限酵素の使用は、認識配列とは異なる位置でのＤＮＡの切断を可能にする（他のＩＩＳ型制限酵素は、https://www.neb.com/tools-and-resources/selectioncharts/type-iis-restriction-enzymes に見出される）。この系においてイノシン（「普遍的塩基」として作用し、他のいかなる塩基とも対になる）を使用すると、この反応は、標的ＤＮＡにいかなる配列の要件も付さずに生じ得る。一本鎖標的ＤＮＡに付加されるヌクレオチドの正体は、ワクシニアトポイソメラーゼが３’リン酸を介して結合する３’ヌクレオチドである。ワクシニアトポイソメラーゼの認識配列は（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴであるので、この系を標的ＤＮＡに「Ｔ」を付加するのに使用した。関連するトポイソメラーゼのＳＶＦがあり、それは認識配列ＣＣＣＴＧを使用できる（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8661446）。従って、ＳＶＦは「Ｔ」の代わりに「Ｇ」を付加するのに使用できる。ワクシニアトポと組み合わせると、バイナリデータは、ＴおよびＧでコードされ得る。
【0124】
単一の塩基の付加の他のアプローチでは、５’リン酸が保護基を提供し、３’から５’への方向の単一の塩基の付加をもたらす。装填反応は、５’リン酸基を有する単一のＴ（またはＧ、または所望により他のヌクレオチド）をトポイソメラーゼに装填する。装填されたトポイソメラーゼが５’ブロック化されていない（リン酸化されていない）一本鎖ＤＮＡ鎖を「見つける」と、それはその鎖にＴを付加し、５’にＴが付加されたＤＮＡをもたらす。この付加は、トポイソメラーゼおよび一本鎖アクセプターＤＮＡが結合できる配列を有するアダプターＤＮＡの存在により促進される（アダプターＤＮＡは触媒的である－それは、繰り返される反応において、鋳型として再使用され得ることに留意されたい）。付加されたヌクレオチドは５’リン酸を有するので、５’リン酸を除去するホスファターゼに曝されるまで、さらなる付加の基質にならない。単一の「Ｔ」を標的一本鎖ＤＮＡの５’末端に付加するワクシニアトポイソメラーゼおよび単一の「Ｇ」を付加するＳＶＦトポイソメラーゼを使用して、この過程を繰り返し、かくして、ＴおよびＧのバイナリ情報をコードする配列を構築できる。他のトポイソメラーゼを使用してＡまたはＣを付加できるが、この反応の効率は低い。
【0125】
トポイソメラーゼに媒介される戦略を使用する利点の１つは、モノマーがトポイソメラーゼに共有結合し、従って、「脱出」して他の反応に干渉できないことである。ポリメラーゼを使用すると、モノマーは拡散でき、ポリメラーゼおよび／または脱ブロック化剤は特異的（例えばＡ対Ｃに選択的）であるべきであるか、あるいは、混合する機会がないように、モノマーはフローにより提供される。
【0126】
ある態様では、本発明は単一のヌクレオチドを装填されたトポイソメラーゼ、即ち、単一のヌクレオチドに結合したトポイソメラーゼを提供する。ここで、例えば、トポイソメラーゼは、ヌクレオチドの３’－リン酸を介して結合し、ヌクレオチドは５’－位で保護、例えば、リン酸化されている。
【0127】
他の態様では、本発明は、単一のヌクレオチドまたはオリゴマーをＤＮＡ鎖に３’から５’への方向で付加することにより、トポイソメラーゼに媒介される連結を用いるＤＮＡ分子の合成方法（方法Ａ）を提供し、それは、（ｉ）所望のヌクレオチドまたはオリゴマーを装填されたトポイソメラーゼとＤＮＡ分子を反応させること、ここで、ヌクレオチドまたはオリゴマーは、５’末端でのさらなる付加を妨げられている、次いで、（ｉｉ）かくして形成されたＤＮＡの５’末端を脱ブロック化し、所望のヌクレオチド配列が得られるまで工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すことを含む。例えば、以下のものが提供される。
【0128】
Ａ１.１ （ｉ）５’保護形態の所望のヌクレオチドがＤＮＡの５’末端に付加されるように、ＤＮＡ分子を、５’保護形態、例えば、５’リン酸化形態の所望のヌクレオチドを装填したトポイソメラーゼと反応させること、次いで、（ｉｉ）かくして形成されたＤＮＡの５’末端を、ホスファターゼ酵素を使用して脱保護すること、および、所望のヌクレオチド配列が得られるまで工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すことを含む、単一のヌクレオチドを３’から５’への方向で付加することによるＤＮＡ分子の合成方法である、方法Ａ；または
【0129】
Ａ１.２ （ｉ）所望のオリゴマーを装填されたトポイソメラーゼとＤＮＡ分子を反応させ、それによりオリゴマーをＤＮＡ分子に連結すること、次いで、（ｉｉ）制限酵素を使用して、他のオリゴマーのトポイソメラーゼに媒介される連結のための５’部位を提供すること、および、所望のオリゴマー配列が得られるまで工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すことを含む、オリゴマーを３’から５’への方向で付加することによるＤＮＡ分子の合成方法である、方法Ａ。
【0130】
Ａ１.３ ＤＮＡ中のニックを封じるリガーゼおよびＡＴＰを提供することを含む、上述のいずれかの方法［ＮＢ：トポイソメラーゼ連結は、一方の鎖のみを連結する］。
【0131】
Ａ１.４ トポイソメラーゼ装填ドナーオリゴヌクレオチドが、トポイソメラーゼを有する鎖と相補的な鎖に５’オーバーハングを含み、ポリイノシン配列を含む、上述のいずれかの方法［ＮＢ：イノシンは「普遍的塩基」として作用し、他のいかなる塩基とも対になる］。
【0132】
Ａ１.５ 制限酵素が、単一の塩基（「付加」されている塩基）以外の付加されたＤＮＡを全て切り離せるＩＩＳ型制限酵素である、上述のいずれかの方法。
【0133】
Ａ１.６ トポイソメラーゼが、ワクシニアトポイソメラーゼおよびＳＶＦトポイソメラーゼＩから選択される、上述のいずれかの方法。
【0134】
Ａ１.７ ワクシニアトポイソメラーゼ（（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴを認識する）を使用してｄＴＴＰヌクレオチドを付加し、ＳＶＦトポイソメラーゼＩ（ＣＣＣＴＧを認識する）を使用してｄＧＴＰヌクレオチドを付加し、例えばバイナリコードを提供する、上述のいずれかの方法
【0135】
Ａ１.８ ＤＮＡが二本鎖であり、保存チャンバーがさらにリガーゼおよびＡＴＰを含み、トポイソメラーゼにより連結されなかったＤＮＡ鎖を修復する、上述のいずれかの方法。
【0136】
Ａ１.９ 遊離のトポイソメラーゼのＤＮＡオリゴマーへの結合および活性を抑制するトポイソメラーゼ阻害剤の使用を含み、例えば、阻害剤がノボビオシンおよびクーママイシンから選択される、上述のいずれかの方法。
【0137】
Ａ１.１０ かくして提供されるＤＮＡ鎖が、チミジン（Ｔ）ヌクレオシドおよびデオキシグアニジン（Ｇ）ヌクレオシドを含む配列を有する、上述のいずれかの方法。
【0138】
Ａ１.１１ トポイソメラーゼが単一の塩基を付加するが、トポイソメラーゼにより付加された塩基から５’方向の１つのヌクレオチドである位置で制限酵素が切断する、上述のいずれかの方法。
【0139】
Ａ１.１２ かくして提供されたＤＮＡ鎖が、「ＴＴ」および「ＴＧ」ジヌクレオチドの配列を含む配列を有する、上述のいずれかの方法。
【0140】
Ａ１.１３ ＤＮＡが一本鎖である、上述のいずれかの方法、
Ａ１.１４ ＤＮＡが二本鎖である、上述のいずれかの方法。
Ａ１.１４ ＤＮＡが二本鎖である、上述のいずれかの方法。
【0141】
Ａ１.１５ ＤＮＡが基板または磁気ビーズ上にあり、所望の配列を与えるのに必要な試薬に選択的に暴露されるか、またはそれから除去され得る、上述のいずれかの方法。
【0142】
Ａ１.１６ ＤＮＡの付加または脱ブロック化用の一部または全部の試薬がフローにより供給され、洗い流すことにより除去される、上述のいずれかの方法。
【0143】
Ａ１.１７ 単一のヌクレオチドまたはオリゴマーの一本鎖ＤＮＡへの結合が、トポイソメラーゼおよび一本鎖アクセプターＤＮＡが結合できる配列を有するアダプターＤＮＡの存在により促進される、上述のいずれかの方法。
【0144】
Ａ１.１８ 例えば下記方法２のいずれかに記載される通り、ナノポアがトポイソメラーゼを含むチャンバーをホスファターゼまたは制限酵素を含むチャンバーから隔てている系において実施され、ナノポアが電気的引力によるＤＮＡの移動を可能にするが、酵素の移動は可能にしない、上述のいずれかの方法。
【0145】
生じ得る１つの懸念は、ポリＧ配列がＧ四重鎖二次構造を形成し得ることである。制限酵素を１塩基戻し（トポ配列の５’に）、同様のトポ／ＩＩＳ戦略に従うことにより、「ＴＴ」または「ＴＧ」を付加でき、これらはそれぞれ異なるビットを表し得る。これは１ビットをコードするのに２塩基を要するが、ポリＧ配列を回避できる利点がある。他の実施態様では、トポ認識配列の３’末端にある他の塩基は、（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴより効率は低いが、（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＡ、（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＣおよび（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＧを用いて、ポックスウイルストポイソメラーゼを使用する結合を可能にする（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17462694）。タンパク質工学／選択技術を使用して、同様にこれらの反応の効率を改善することができ、同様のアプローチを、非標準塩基の付加に使用できる。
【0146】
ある種の実施態様では、この方法によりＤＮＡを合成する方法は、ＤＮＡをリガーゼおよびＡＴＰで処理することを含む。トポイソメラーゼは、ＤＮＡの片側しか連結しない（他方には、本質的にニックがある）。リガーゼは、ニックを修復し、トポイソメラーゼ自体が反応産物を再切断し、それを切り離さないことを確実にする。
【0147】
ある種の実施態様では、この方法は、遊離のトポイソメラーゼのＤＮＡオリゴマーに対する結合および活性を抑制するために、トポイソメラーゼ阻害剤の使用を含む。適する阻害剤には、ノボビオシンおよびクーママイシンが含まれる。低レベルのトポイソメラーゼ活性はコイル状ＤＮＡの「弛緩」を助け、特に長いＤＮＡ鎖を合成するときに有用であるので、完全な阻害は望ましくないことに留意されたい。
【0148】
従って、他の実施態様では、本開示は、ナノチップ中でＤＮＡを合成する方法（方法２）を提供し、ナノチップは、トポイソメラーゼ装填オリゴヌクレオチド（即ち、３’末端でトポイソメラーゼに結合したオリゴヌクレオチド）を含む１以上の付加チャンバー、および、制限酵素または脱ブロック化剤、例えばホスファターゼを含む１以上の保存チャンバーを含み、これらのチャンバーは、適合する緩衝液も含み、少なくとも１つのナノポアを含む膜により分離されており、ここで、トポイソメラーゼおよび制限酵素は、ナノポアの通過を妨げられており（例えば、それらは大きすぎるので、かつ／または、それらは第１および第２のチャンバーの基板にそれぞれ係留されているので）、合成は、単一のヌクレオチドまたは短いオリゴヌクレオチド塊を、第１の末端および第２の末端を有する核酸の第１の末端に付加するサイクルにより実行され、ここで、核酸の第１の末端は、電気的引力により付加チャンバーと保存チャンバーの間を動かされ、例えば、ある実施態様では以下の通りである：
（ｉ）レシーバーＤＮＡ（例えば、二本鎖ＤＮＡ）の５’末端を、電気力により、第１の付加チャンバーに移動させること、
（ｉｉ）第１の付加チャンバーに、トポイソメラーゼ装填ドナーオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、ドナーオリゴヌクレオチドは、トポイソメラーゼ結合部位、情報配列（例えば、少なくとも２つの異なるヌクレオチドまたは配列から選択され、例えば、バイナリコードで、一方の配列が「０」に、他方が「１」に対応する）、制限酵素により切断されるとトポイソメラーゼ連結部位を与える制限部位を含む；
（ｉｉｉ）ドナーオリゴヌクレオチドがレシーバーＤＮＡに連結し、かくしてそれを伸長するのに十分な時間をとること；
（ｉｖ）かくして伸長されたレシーバーＤＮＡの５’末端を、電気力により、保存チャンバーに移動させ、例えば、制限酵素がレシーバーＤＮＡを切断してトポイソメラーゼ連結部位をもたらすように、または、単一のヌクレオチドの付加の場合、脱ブロック化剤、例えば、ホスファターゼが、一本鎖ＤＮＡ上に５’が脱ブロック化されたヌクレオチドを生成するようにすること；および
（ｖ）所望のＤＮＡ配列が得られるまで、工程（ｉ）～（ｉｖ）のサイクルを繰り返し、同一または異なる情報配列を有するオリゴヌクレオチドを付加すること。
（ｉ）レシーバーＤＮＡ（例えば、二本鎖ＤＮＡ）の５’末端を、電気力により、第１の付加チャンバーに移動させること、
（ｉｉ）第１の付加チャンバーに、トポイソメラーゼ装填ドナーオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、ドナーオリゴヌクレオチドは、トポイソメラーゼ結合部位、情報配列（例えば、少なくとも２つの異なるヌクレオチドまたは配列から選択され、例えば、バイナリコードで、一方の配列が「０」に、他方が「１」に対応する）、制限酵素により切断されるとトポイソメラーゼ連結部位を与える制限部位を含む；
（ｉｉｉ）ドナーオリゴヌクレオチドがレシーバーＤＮＡに連結し、かくしてそれを伸長するのに十分な時間をとること；
（ｉｖ）かくして伸長されたレシーバーＤＮＡの５’末端を、電気力により、保存チャンバーに移動させ、例えば、制限酵素がレシーバーＤＮＡを切断してトポイソメラーゼ連結部位をもたらすように、または、単一のヌクレオチドの付加の場合、脱ブロック化剤、例えば、ホスファターゼが、一本鎖ＤＮＡ上に５’が脱ブロック化されたヌクレオチドを生成するようにすること；および
（ｖ）所望のＤＮＡ配列が得られるまで、工程（ｉ）～（ｉｖ）のサイクルを繰り返し、同一または異なる情報配列を有するオリゴヌクレオチドを付加すること。
【0149】
例えば、本発明は、以下を提供する。
２.１ レシーバーＤＮＡの３’末端がナノポアに近接して結合しており、レシーバーオリゴヌクレオチドの５’末端がトポイソメラーゼ連結部位を含む方法２であって、工程（ｉｖ）の後に、第１の付加チャンバーを洗い流し、新しいトポイソメラーゼ装填ドナーオリゴヌクレオチドを第１の付加チャンバーに提供することにより、さらなるオリゴヌクレオチドをレシーバーＤＮＡの５’末端に付加することを含み、ここで、新しいドナーオリゴヌクレオチドは、以前のドナーオリゴヌクレオチドとは異なる情報配列を有し；新しいドナーオリゴヌクレオチドがレシーバーＤＮＡに付加されるのが望ましい場合、レシーバー核酸の５’末端を第１のチャンバーに引き戻し、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を繰り返し、または、それが望ましくない場合、所望のドナーオリゴヌクレオチドが第１のチャンバーに提供されるまで、レシーバーＤＮＡを第２のチャンバーに留まらせる、方法２。
２.１ レシーバーＤＮＡの３’末端がナノポアに近接して結合しており、レシーバーオリゴヌクレオチドの５’末端がトポイソメラーゼ連結部位を含む方法２であって、工程（ｉｖ）の後に、第１の付加チャンバーを洗い流し、新しいトポイソメラーゼ装填ドナーオリゴヌクレオチドを第１の付加チャンバーに提供することにより、さらなるオリゴヌクレオチドをレシーバーＤＮＡの５’末端に付加することを含み、ここで、新しいドナーオリゴヌクレオチドは、以前のドナーオリゴヌクレオチドとは異なる情報配列を有し；新しいドナーオリゴヌクレオチドがレシーバーＤＮＡに付加されるのが望ましい場合、レシーバー核酸の５’末端を第１のチャンバーに引き戻し、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を繰り返し、または、それが望ましくない場合、所望のドナーオリゴヌクレオチドが第１のチャンバーに提供されるまで、レシーバーＤＮＡを第２のチャンバーに留まらせる、方法２。
【0150】
２.２ 複数のレシーバーＤＮＡ分子が独立して並行して合成され、それらが第１のチャンバーに存在するか否かを別々に制御することにより、異なる配列を有するＤＮＡ分子が得られるようにする、上述のいずれかの方法。
【0151】
２.３ それぞれ３’末端でナノポアに近接する表面に結合した複数のレシーバーＤＮＡ分子が独立して合成され、各ナノポアが電極対を伴い、電極対の一方の電極がナノポアの一方の末端に近接した位置にあり、他方の電極がナノポアの他方の末端に近接した位置にあり、電極対により与えられる電流により各レシーバーＤＮＡ分子を第１のチャンバーと第２のチャンバーの間で独立して動かせるようにする、上述のいずれかの方法。
【0152】
２.４ サイクルの工程（ｉ）で使用されるドナーオリゴヌクレオチドが、各サイクルで第１の情報配列を含むドナーオリゴヌクレオチドと第２の情報配列を含むドナーオリゴヌクレオチドの間で交互になる、上述のいずれかの方法。
【0153】
２.５ レシーバーＤＮＡの５’末端を第１の付加チャンバーに戻して同じ情報配列を有するオリゴヌクレオチドを付加することにより、または、レシーバーＤＮＡの５’末端を、３’末端でトポイソメラーゼに結合したドナーオリゴヌクレオチドを有する第２の付加チャンバーに移動させることにより（ここで、第２の付加チャンバー中のドナーオリゴヌクレオチドは、第１の付加チャンバー中のドナーオリゴヌクレオチドとは異なる情報配列を有する）、さらなるオリゴヌクレオチドをレシーバーＤＮＡの５’末端に付加する工程を含む、方法２。
【0154】
２.６ ドナーオリゴヌクレオチドが以下の構造：
［ここで、Ｎは任意のヌクレオチドを表し、制限酵素はＡｃｃ１であり、これは、ＤＮＡ（例えば上記の配列中のＧＴＣＧＡＣ）を切断し、適切なオーバーハングを提供できる］
を有する、上述のいずれかの方法。
【化1】
を有する、上述のいずれかの方法。
【0155】
２.７ ドナーオリゴヌクレオチドがヘアピン構造を有する上述のいずれかの方法、例えば、上下の鎖のＮＮＮＮＮ基が結合している２.６。
【0156】
２.８ トポイソメラーゼ装填オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、以下の構造：
を有する、上述のいずれかの方法。
【化2】
【0157】
２.９ トポイソメラーゼ装填オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、以下の構造：
を有する、上述のいずれかの方法。
【化3】
【0158】
２.１０ トポイソメラーゼ装填オリゴヌクレオチドを用いる、上述のいずれかの方法。
２.１１ オリゴヌクレオチドがナノポアを通過する際の電圧、電流、抵抗、静電容量および／またはインピーダンスの変化を検出することにより、合成されたＤＮＡの配列を各サイクルに続いて決定する、上述のいずれかの方法。
２.１１ オリゴヌクレオチドがナノポアを通過する際の電圧、電流、抵抗、静電容量および／またはインピーダンスの変化を検出することにより、合成されたＤＮＡの配列を各サイクルに続いて決定する、上述のいずれかの方法。
【0159】
２.１２ ＤＮＡの合成が、緩衝液、例えば、ｐＨ７～８.５、例えば約ｐＨ８とするためのバッファー、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、適当な酸、および、場合によりキレーター、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含むバッファー、例えば、Ｔｒｉｓベース、酢酸およびＥＤＴＡの混合物を含むＴＡＥバッファー、または、Ｔｒｉｓベース、ホウ酸およびＥＤＴＡの混合物を含むＴＢＥバッファーを含む溶液中で；例えば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、または、例えば、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－アセテート、１０ｍＭ酢酸マグネシウムを含む溶液（ｐＨ７.９＠２５℃）中で起こる、上述のいずれかの方法。
【0160】
２.１３ ＤＮＡをナノチップから取り出すことをさらに含む、上述のいずれかの方法。
上述のいずれかの方法。
上述のいずれかの方法。
【0161】
２.１４ かくして合成されたＤＮＡを増幅することをさらに含む、上述のいずれかの方法。
【0162】
２.１５ ＤＮＡをナノチップから取り出し、ＤＮＡを結晶化することをさらに含む、上述のいずれかの方法。
【0163】
２.１６ 例えば参照により本明細書に組み込むＵＳ８２８３１６５Ｂ２に記載されている通り、ＤＮＡを含む溶液を、１以上のバッファー（例えば、ホウ酸バッファー）、抗酸化剤、湿潤剤、例えばポリオール、および、場合によりキレート剤と共に乾燥させること；または、核酸とポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）－ポリ（ｌ－リジン）（ＰＥＧ－ＰＬＬ）ＡＢ型ブロックコポリマーとの間にマトリックスを形成することなどにより、核酸を安定化することをさらに含む、上述のいずれかの方法。
【0164】
２.１７ ＤＮＡ中のニックを封じるリガーゼおよびＡＴＰを提供することを含む、上述のいずれかの方法［ＮＢ：トポイソメラーゼ連結は、一方の鎖のみを連結する］。
【0165】
２.１８ トポイソメラーゼを装填されたドナーオリゴヌクレオチドが、トポイソメラーゼを有する鎖と相補的な鎖に５’オーバーハングを含み、ポリイノシン配列を含む、上述のいずれかの方法［ＮＢ：イノシンは「普遍的塩基」として作用し、他のいかなる塩基とも対になる］。
【0166】
２.１９ 制限酵素が、単一の塩基（「付加」されている塩基）以外の付加されたＤＮＡを全て切り離せるＩＩＳ型制限酵素である、上述のいずれかの方法。
【0167】
２.２０ トポイソメラーゼが、ワクシニアトポイソメラーゼおよびＳＶＦトポイソメラーゼＩから選択される、上述のいずれかの方法。
【0168】
２.２１ ワクシニアトポイソメラーゼ（（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴを認識する）を使用してｄＴＴＰヌクレオチドを付加し、ＳＶＦトポイソメラーゼＩ（ＣＣＣＴＧを認識する）を使用してｄＧＴＰヌクレオチドを付加し、例えばバイナリコード情報を提供する、上述のいずれかの方法。
【0169】
２.２２ 保存チャンバーがさらにリガーゼおよびＡＴＰを含み、トポイソメラーゼにより連結されなかったＤＮＡ鎖を修復する、上述のいずれかの方法。
【0170】
２.２３ 遊離のトポイソメラーゼのＤＮＡオリゴマーへの結合および活性を抑制するトポイソメラーゼ阻害剤の使用を含み、例えば、阻害剤がノボビオシンおよびクーママイシンから選択される、上述のいずれかの方法。
【0171】
２.２４ かくして提供されるＤＮＡ鎖が、チミジン（Ｔ）ヌクレオシドおよびデオキシグアニジン（Ｇ）ヌクレオシドを含む配列を有する、上述のいずれかの方法。
【0172】
２.２５ トポイソメラーゼが単一の塩基を付加するが、トポイソメラーゼにより付加された塩基から５’方向の１つのヌクレオチドである位置で制限酵素が切断する、上述のいずれかの方法。
【0173】
２.２６ かくして提供されたＤＮＡ鎖が、「ＴＴ」および「ＴＧ」ジヌクレオチドの配列を含む配列を有する、上述のいずれかの方法。
【0174】
２.２７ 単一のヌクレオチドを３’から５’への方向で付加することによりＤＮＡ分子を合成する方法であって、（ｉ）５’保護形態の所望のヌクレオチドがＤＮＡの５’末端に付加されるように、ＤＮＡ分子を、５’保護形態、例えば５’リン酸化形態の所望のヌクレオチドを装填されたトポイソメラーゼと反応させること、次いで、（ｉｉ）ホスファターゼ酵素を使用して、かくして形成されたＤＮＡの５’末端を脱保護すること、および、所望のヌクレオチド配列が得られるまで、工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すことを含む、上述のいずれかの方法。
【0175】
２.２８ オリゴマーを３’から５’への方向で付加することによりＤＮＡ分子を合成する方法であって、（ｉ）ＤＮＡ分子を、所望のオリゴマーを装填されたトポイソメラーゼと反応させ、それにより、オリゴマーをＤＮＡ分子に連結させること、次いで、（ｉｉ）制限酵素を使用して、トポイソメラーゼに媒介されるさらなるオリゴマーの連結のために５’部位を提供すること、および、所望のヌクレオチド配列が得られるまで、工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すことを含む、上述のいずれかの方法。
２.２９ 記載される方法Ａに準じる方法である、上述のいずれかの方法。
２.２９ 記載される方法Ａに準じる方法である、上述のいずれかの方法。
【0176】
合成反応の生成物を、検出し、品質管理の目的で調査し、ポリマーにコードされたデータを抽出するために読み取ることができる。例えば、ＤＮＡを常套の手段で増幅し、配列決定し、ナノポアの配列決定の頑健性を確認し得る。
【0177】
他の実施態様では、本発明は、トポイソメラーゼ結合部位、情報配列（例えば、少なくとも２つの異なる配列から選択され、例えば、バイナリコードで、一方の配列が「０」に、他方が「１」に対応する）、および、制限酵素により切断されるとトポイソメラーゼ連結部位を与える制限部位を含む、例えば、以下の配列:
［ここで、情報配列ＡまたはＢは、３～１２個、例えば、約８個のヌクレオチドの配列である］
を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。
【化4】
を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。
【0178】
他の実施態様では、本発明は、トポイソメラーゼを装填されたオリゴヌクレオチドであって、トポイソメラーゼ結合部位、情報配列（例えば、少なくとも２つの異なる配列から選択され、例えば、バイナリコードで、一方の配列が「０」に、他方が「１」に対応する）、および、制限酵素により切断されるとトポイソメラーゼ連結部位を与える制限部位を含むオリゴヌクレオチド；例えば、以下の構造を有するトポイソメラーゼを装填されたオリゴヌクレオチド：
［ここで、情報配列ＡまたはＢは、３～１２個、例えば、約８個のヌクレオチドの配列であり、＊は、オリゴヌクレオチドに共有結合したトポイソメラーゼ；例えば、トポイソメラーゼはワクシニアウイルストポイソメラーゼＩである］
を提供する。
【化5】
を提供する。
【0179】
他の実施態様では、本発明は、上記の一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子であって、一本鎖またはコード配列が、本質的にハイブリダイズしない塩基、例えばアデニンおよびシトシン（ＡおよびＣ）からなり、それらが、例えばデータ保存方法における使用のために、バイナリコードに相当する配列で配置されている、ＤＮＡ分子を提供する。例えば、本発明は、ＤＮＡが一本鎖または二本鎖であり、少なくとも１０００ヌクレオチド長、例えば、１０００～１,０００,０００ヌクレオチド、例えば、５,０００～２０,０００ヌクレオチド長であり、ヌクレオチドの配列がバイナリコードに対応する、ＤＮＡ（ＤＮＡ１）；例えば、以下のものを提供する。
【0180】
１.１ ＤＮＡが一本鎖であるＤＮＡ１。
１.２ ＤＮＡが二本鎖であるＤＮＡ１。
１.２ ＤＮＡが二本鎖であるＤＮＡ１。
【0181】
１.３ 一本鎖またはコード配列中のヌクレオチドが、アデニン、チミンおよびシトシンヌクレオチドから選択され、例えば、アデニンおよびシトシンヌクレオチド、または、チミンおよびシトシンヌクレオチドから選択される、上述のいずれかのＤＮＡ。
【0182】
１.４ 一本鎖の形態のときに有意な二次構造を形成しないように、主としてハイブリダイズしないヌクレオチドからなる、上述のいずれかのＤＮＡ。
【0183】
１.５ ヌクレオチドが、少なくとも９５％、例えば９９％、例えば１００％、アデニンおよびシトシンヌクレオチドである、上述のいずれかのＤＮＡ。
【0184】
１.６ 連続的な１または０をより容易に読み取れるように、バイナリコードを含むヌクレオチドを分離または分断するために、例えば、１と０、または１と０のグループを分離するために、付加されたヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含む、上述のいずれかのＤＮＡ。
【0185】
１.７ （ａ）バイナリコードの各ビットが単一のヌクレオチドに対応する、例えば１および０が、各々ＡまたはＣに対応する；または、（ｂ）バイナリコードの各ビットが、１より多いヌクレオチド、例えば２、３または４個のヌクレオチドの連続物、例えば、ＡＡＡまたはＣＣＣに対応する、上述のいずれかのＤＮＡ。
【0186】
１.８ 結晶化されている、上述のいずれかのＤＮＡ。
１.９ 例えば参照により本明細書に組み込むＵＳ８２８３１６５Ｂ２に記載されている通り、核酸を含む溶液を、１以上のバッファー塩（例えば、ホウ酸バッファー）、抗酸化剤、湿潤剤、例えばポリオール、および、場合により、キレート剤と共に乾燥形態で；かつ／または、核酸とポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）－ポリ（ｌ－リジン）（ＰＥＧ－ＰＬＬ）ＡＢ型ブロックコポリマーとの間のマトリックス中に；かつ／または、相補的核酸またはＤＮＡに結合するタンパク質と共に提供される、上述のいずれかのＤＮＡ。
１.９ 例えば参照により本明細書に組み込むＵＳ８２８３１６５Ｂ２に記載されている通り、核酸を含む溶液を、１以上のバッファー塩（例えば、ホウ酸バッファー）、抗酸化剤、湿潤剤、例えばポリオール、および、場合により、キレート剤と共に乾燥形態で；かつ／または、核酸とポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）－ポリ（ｌ－リジン）（ＰＥＧ－ＰＬＬ）ＡＢ型ブロックコポリマーとの間のマトリックス中に；かつ／または、相補的核酸またはＤＮＡに結合するタンパク質と共に提供される、上述のいずれかのＤＮＡ。
【0187】
１.１０ 記載される方法１または記載される方法２または記載される方法Ａのいずれかにより製造された、上述のいずれかのＤＮＡ。
【0188】
ナノチップは、例えば図２３～２９に示す通りに作製できる。例えば、ある形式では、各ポリマー鎖は２個または４個の付加チャンバーを伴い、２個の付加チャンバーの形式は、ポリマー中にバイナリコードをコードするのに有用であり、４個の付加チャンバーの形式は、カスタムＤＮＡ配列を作製するのに特に有用である。各付加チャンバーは、個別に制御可能な電極を含む。付加チャンバーは、バッファー中のポリマーにモノマーを付加する試薬を含む。付加チャンバーは、１以上のナノポアを含む膜により、保存チャンバーから分離されており、それは、複数の付加チャンバーに共通であり得、付加チャンバーで付加された保護モノマーまたはオリゴマーを脱保護する脱保護試薬およびバッファーを含む。ナノチップは、多数のポリマーの並列合成を可能にする複数の付加チャンバーのセットを含む。
【0189】
高帯域幅かつ低ノイズのナノポアセンサーおよび検出電子工学が、単一ＤＮＡ塩基の分解能を達成するのに重要である。ある種の実施態様では、ナノチップは、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）チップに電気的に連結している。例えば、参照によりその内容を本明細書に組み込む、Uddin, et al., "Integration of solid-state nanopores in a 0.5 μm cmos foundry process", Nanotechnology (2013) 24(15): 155501に記載の通り、固相ナノポアは、ＣＭＯＳプラットフォーム内に、バイアス電極およびカスタム設計された増幅電子工学の近傍に組み込むことができる。
【0190】
他の実施態様では、本開示は、少なくとも２個の別個のモノマーを含む荷電ポリマー、例えばＤＮＡを、合成および／または配列決定するためのナノチップ（ナノチップ１）であって、１以上のナノポアを含む膜により分離されている少なくとも第１および第２の反応チャンバーを含み、各反応チャンバーは、荷電ポリマーをチャンバー内に引き出すための１以上の電極を含み、電解質媒体および場合によりモノマーをポリマーに付加するための試薬をさらに含むナノチップを提供し、例えば、以下のものを提供する。
【0191】
１.１ ナノポアの直径が２～２０ｎｍ、例えば２～１０ｎｍ、例えば２～５ｎｍである、ナノチップ１。
【0192】
１.２ ナノチップの反応チャンバーの壁の一部または全部が、シリコン材料、例えば、シリコン、二酸化ケイ素、窒化ケイ素またはこれらの組合せ、例えば窒化ケイ素を含む、上述のいずれかのナノチップ。
【0193】
１.３ ナノチップの反応チャンバーの壁の一部または全部が、シリコン材料、例えば、シリコン、二酸化ケイ素、窒化ケイ素またはこれらの組合せ、例えば窒化ケイ素を含み、ナノポアの一部または全部がイオン照射により作製されたものである、上述のいずれかのナノチップ。
【0194】
１.４ ナノポアの一部または全部が、ポア形成タンパク質のα－ヘモリジンを含む膜、例えば脂質二重膜で構成されている、上述のいずれかのナノチップ。
【0195】
１.５ 反応チャンバーの壁の一部または全部が、試薬との相互作用を最小にするために被覆されている、例えば、ポリエチレングリコールなどのポリマーで、または、ウシ血清アルブミンなどのタンパク質で被覆されている、上述のいずれかのナノチップ。
【0196】
１.６ 電解質媒体を含む、上述のいずれかのナノチップ。
１.７ ｐＨ７～８.５、例えば約ｐＨ８とするためのバッファー、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、適当な酸、および、場合によりキレーター、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含むバッファー、例えば、Ｔｒｉｓベース、酢酸およびＥＤＴＡの混合物を含むＴＡＥバッファー、または、Ｔｒｉｓベース、ホウ酸およびＥＤＴＡの混合物を含むＴＢＥバッファーを含む溶液中で；例えば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、または、例えば、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－アセテート、１０ｍＭ酢酸マグネシウムを含む溶液（ｐＨ７.９＠２５℃）などのバッファーを含む電解質媒体を含む、上述のいずれかのナノチップ。
１.７ ｐＨ７～８.５、例えば約ｐＨ８とするためのバッファー、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、適当な酸、および、場合によりキレーター、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含むバッファー、例えば、Ｔｒｉｓベース、酢酸およびＥＤＴＡの混合物を含むＴＡＥバッファー、または、Ｔｒｉｓベース、ホウ酸およびＥＤＴＡの混合物を含むＴＢＥバッファーを含む溶液中で；例えば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、または、例えば、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－アセテート、１０ｍＭ酢酸マグネシウムを含む溶液（ｐＨ７.９＠２５℃）などのバッファーを含む電解質媒体を含む、上述のいずれかのナノチップ。
【0197】
１.８ モノマーをポリマーに付加するための試薬を含む、上述のいずれかのナノチップ。
【0198】
１.９ ポリマーの合成（例えば、モノマーまたはモノマーのグループを連続的にポリマーに付加することによる「書き込み」）および配列決定（例えば、モノマーがナノポアを通過する際の電流および／またはインダクタンスの変化を測定することによる「読み取り」）の両方が可能である、上述のいずれかのナノチップ。
【0199】
１.１０ 例えば、ナノポアを流れる電流が電解質媒体を介してナノポアを通って確立され得るように、例えば、電流がナノポアを通してポリマーを引き出すことができ、ポリマーがナノポアを通過する際、ナノポアにかかる電位の変化を測定し得、ポリマー内のモノマーの配列を同定するのに使用し得るように、１以上のナノポアを含む膜が両側に金属表面を含み、金属表面は、絶縁体、例えば窒化ケイ素膜により分離されており、金属表面は、例えばリソグラフィーの手段により、各ナノポアの各末端に電極をもたらすように形成されている、上述のいずれかのナノチップ。
【0200】
１.１１ ＤＮＡである荷電ポリマーを含む、上述のいずれかのナノチップ。
１.１２ 一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である荷電ポリマーを含む、上述のいずれかのナノチップ。
１.１２ 一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である荷電ポリマーを含む、上述のいずれかのナノチップ。
【0201】
１.１３ 予め決定された制限部位を含むＤＮＡである荷電ポリマーを含む、上述のいずれかのナノチップ。
【0202】
１.１４ ＤＮＡである荷電ポリマーを含み、ＤＮＡが上記のＤＮＡ１に記載のＤＮＡである、上述のいずれかのナノチップ。
【0203】
１.１５ ＤＮＡである荷電ポリマーを含み、ＤＮＡが少なくとも９５％、例えば９９％、例えば１００％のアデニンおよびシトシンを含む、上述のいずれかのナノチップ。
【0204】
１.１６ ＤＮＡである荷電ポリマーを含み、ＤＮＡがアデニンおよびシトシンのみを含む、上述のいずれかのナノチップ。
【0205】
１.１７ バッファーおよび試薬の導入および洗い流しを可能にする１以上のポートを含む、上述のいずれかのナノチップ。
【0206】
１.１８ 緩衝液、例えば、ｐＨ７～８.５、例えば約ｐＨ８とするためのバッファー、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、適当な酸、および、場合によりキレーター、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含むバッファー、例えば、Ｔｒｉｓベース、酢酸およびＥＤＴＡの混合物を含むＴＡＥバッファー、または、Ｔｒｉｓベース、ホウ酸およびＥＤＴＡの混合物を含むＴＢＥバッファーを含む溶液；例えば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、または、例えば、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－アセテート、１０ｍＭ酢酸マグネシウムを含む溶液（ｐＨ７.９＠２５℃）を含む、上述のいずれかのナノチップ。
【0207】
１.１９ 保存およびその後の再水和のために凍結乾燥されているか、または、凍結乾燥することができる、例えば、ナノチップの構造が、水和性または水透過性ポリマーを含む、上述のいずれかのナノチップ。
【0208】
１.２０ 例えば、ナノチップの構造が、水和性または水透過性ポリマーを含み、一度書き込みプロセスが完了したら、使用に先立ち水和され、場合により、長期保存のために凍結乾燥される、乾燥形態で合成される上述のいずれかのナノチップ。
【0209】
１.２１ 荷電ポリマー、例えばＤＮＡが、ヒストンで安定化されている、上述のいずれかのナノチップ。
１.２２ 内表面が正に荷電されている、上述のいずれかのナノチップ。
１.２２ 内表面が正に荷電されている、上述のいずれかのナノチップ。
【0210】
１.２３ 電極が、無線周波数の脈流直流電流を、例えば１ＭＨｚ～１ＧＨｚ、例えば５０～２００ＭＨｚ、例えば約１００ＭＨｚの周波数でナノポアにかけることができる容量回路に、作動可能に連結されており、例えば、脈流直流電流が荷電ポリマーをナノポアを通して引き出すことができ、荷電ポリマーがナノポアを通過する際にナノポアの容量変動を測定することによりモノマー配列を決定できる、上述のいずれかのナノチップ。
【0211】
１.２４ 付加チャンバーの１つにおけるモノマーまたはオリゴマーの付加後に、ポリマーを脱保護するための試薬を含む保存チャンバーまたは脱ブロック化剤チャンバーを含む、上述のいずれかのナノチップ。
１.２５ 複数の付加チャンバーの対を含む、上述のいずれかのナノチップ。
１.２５ 複数の付加チャンバーの対を含む、上述のいずれかのナノチップ。
【0212】
１.２６ 例えば図２４に記載の、ウエハー接合によって接合された電気制御層、フルイディクス層および電気的アース層を含む、上述のいずれかのナノチップ。
【0213】
１.２７ ナノポアが、ＦＩＢ、ＴＥＭ、ウェットエッチングもしくはドライエッチングを用いて穿孔することによって作成される、上述のいずれかのナノチップ。
【0214】
１.２８ ナノポアを含む膜が１原子層から３０ｎｍの厚さである、上述のいずれかのナノチップ。
【0215】
１.２９ ナノポアを含む膜が、ＳｉＮ、ＢＮ、ＳｉＯｘ、グラフェン、遷移金属ジカルコゲナイド、例えばＷＳ２またはＭｏＳ２で作られたものである、上述のいずれかのナノチップ。
【0216】
１.３０ 金属またはポリシリコンで作られた配線を含む、上述のいずれかのナノチップ。
【0217】
１.３１ 配線の密度が、誘電成膜（例えば、ＰＥＣＶＤ、スパッタリング、ＡＬＤなどによる）によって与えられる電気的遮蔽を伴う３次元スタッキングによって増大する、上述のいずれかのナノチップ。
【0218】
１.３２ 付加チャンバーにおける電極との接触が、深堀り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）によるシリコン貫通電極（ＴＳＶ）を用いて、例えば、クライオ処理またはＢＯＳＣＨ処理を用いて、または、ウェットシリコンエッチングによりなされる、上述のいずれかのナノチップ。
【0219】
１.３３ 各付加チャンバーの電極の個別の電圧制御が、各付加チャンバーの電極を個別に制御およびモニターすることを可能にする、上述のいずれかのナノチップ。
【0220】
１.３４ 各ポリマーが第１の付加チャンバー、第２の付加チャンバーおよび脱ブロック化チャンバーを伴う、上述のいずれかのナノチップ。
【0221】
１.３５ １以上のチャンバーに流体のフローがある、上述のいずれかのナノチップ。
１.３６ １以上のチャンバーが流体的に分離されている、上述のいずれかのナノチップ。
１.３７ 脱ブロック化チャンバーに流体のフローがある、上述のいずれかのナノチップ。
１.３８ 付加チャンバーに共通の流体のフローがある、上述のいずれかのナノチップ。
１.３６ １以上のチャンバーが流体的に分離されている、上述のいずれかのナノチップ。
１.３７ 脱ブロック化チャンバーに流体のフローがある、上述のいずれかのナノチップ。
１.３８ 付加チャンバーに共通の流体のフローがある、上述のいずれかのナノチップ。
【0222】
１.３９ チャンバー間の配線が、類似する種類のチャンバーで（例えば、第１の付加チャンバーで、第２の付加チャンバーで、脱チャンバーで）共通である、上述のいずれかのナノチップ。
【0223】
１.４０ 付加チャンバーが個別の電圧制御を有し、脱ブロック化チャンバーが共通の電気的アースを有する、上述のいずれかのナノチップ。
【0224】
１.４１ 脱ブロック化チャンバーが個別の電圧制御を有し、第１の付加チャンバーが共通の電気的アースを有し、第２の付加チャンバーが共通の電気的アースを有する、上述のいずれかのナノチップ。
【0225】
１.４２ ナノチップがウエハー接合によって作製され、チャンバーが接合に先立ち所望の試薬で予め満たされる、上述のいずれかのナノチップ。
１.４３ １以上の内部表面がシラン処理されている、上述のいずれかのナノチップ。
１.４３ １以上の内部表面がシラン処理されている、上述のいずれかのナノチップ。
【0226】
１.４４ 流体の導入または除去のための１以上のポートを含む、上述のいずれかのナノチップ。
【0227】
１.４５ チャンバー内の電極が荷電ポリマーとの直接的接触を制限されている、例えば、ナノポアに隣接する表面に結合した荷電ポリマーが到達できないほど、電極がナノポアから離れて配置されている、または、水および単一原子のイオン（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋およびＣｌ－イオン）を通過させるが、ポリマーまたはポリマーに加わるべきモノマーまたはオリゴマー試薬は通過させない物質により電極が保護されている、上述のいずれかのナノチップ。
【0228】
１.４６ 相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）チップに電気的に連結している、上述のいずれかのナノチップ。
【0229】
例えば、ある実施態様では、本発明は、少なくとも２つの別個のモノマーを含む荷電ポリマー、例えばＤＮＡの配列決定のために、ナノチップ、例えば、上記ナノチップ１のいずれかに記載のナノチップを提供し、ナノチップは、電解質媒体を含み、１以上のナノポアを含む膜により分離されている、少なくとも第１および第２の反応チャンバーを含み、各反応チャンバーは、膜の反対側に配置された少なくとも１対の電極を含み、電極は、無線周波数の脈流直流電流を、例えば１ＭＨｚ～１ＧＨｚ、例えば５０～２００ＭＨｚ、例えば約１００ＭＨｚの周波数でナノポアにもたらすことができる容量回路に作動可能に連結されており、例えば、脈流直流電流は、荷電ポリマーをナノポアを通して引き出すことができ、荷電ポリマーがナノポアを通過する際にナノポアの容量変動を測定することによりモノマー配列を読み取ることができる。
【0230】
他の実施態様では、本発明は、少なくとも２つの異なる種類のモノマーを含む荷電ポリマー、例えばＤＮＡ分子のモノマー配列を読み取る方法を提供し、その方法は、無線周波数の脈流直流電流を、例えば１ＭＨｚ～１ＧＨｚ、例えば５０～２００ＭＨｚ、例えば約１００ＭＨｚの周波数でナノポアにかけ、脈流直流電流が、荷電ポリマーをナノポアを通して引き出し、荷電ポリマーがナノポアを通過する際にナノポアの容量変動を測定することによりモノマー配列を読み取ることを含む。
【0231】
他の実施態様では、本発明は、情報を保存するための方法における上記ＤＮＡ１の使用を提供する。
【0232】
他の実施態様では、本発明は、情報を保存するための方法における一本鎖ＤＮＡの使用を提供し、この方法では、例えば、配列は実質的に自己ハイブリダイズしない。
【0233】
他の実施態様では、本発明は、データ保存方法およびデバイスを提供し、これは、例えば、上記方法１および／または２のいずれかに従って、少なくとも２つの異なる種類のモノマーを含む荷電ポリマー、例えばＤＮＡを作製するために、ナノチップ、例えば、上記ナノチップ１のいずれかを使用し、モノマーまたはオリゴマーがバイナリコードに対応する順番で配列される。
【0234】
例えば、ある実施態様では、かくして合成されたポリマーを含むナノチップは、ナノチップを活性化することができ、ポリマーをナノチップに通過させることによりポリマーの配列をいつでも検出できるので、データ保存デバイスを提供する。他の実施態様では、ポリマーはナノチップから取り出され、または、増幅され、増幅されたポリマーがナノチップから取り出され、必要なときまで保存され、常套のシークエンサー、例えば、常套のナノポア配列決定デバイスにより、読み取られる。
【0235】
他の実施態様では、本発明は、例えば上記方法１または上記方法２のいずれかに従って上記のＤＮＡ１を合成することを含む、情報の保存方法を提供する。
【0236】
他の実施態様では、本発明は、本明細書に記載の通りに、ナノポアシークエンサーを使用して、例えば上記ナノチップ１を使用して、例えば上記ＤＮＡ１にコードされているバイナリコードを読み取る方法を提供する。
【0237】
荷電ポリマーを分解する酵素、例えば、ＤＮＡを加水分解するデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を使用して、ナノチップが消去される、上述のいずれかの方法。
【実施例】
【0238】
実施例
実施例１－ナノポアに隣接するＤＮＡの一方の末端の固定、および、電流によるＤＮＡの前進および後退の制御
ＤＮＡが、関連するタンパク質がチャンバー間を移動しない条件下で、ナノポアで分離された２つのチャンバーの間を電流により行き来することを立証するために、実験手順を開発した。
実施例１－ナノポアに隣接するＤＮＡの一方の末端の固定、および、電流によるＤＮＡの前進および後退の制御
ＤＮＡが、関連するタンパク質がチャンバー間を移動しない条件下で、ナノポアで分離された２つのチャンバーの間を電流により行き来することを立証するために、実験手順を開発した。
【0239】
２つのチャンバーを含むナノチップを窒化ケイ素から作製した。＜４ｎｍ（ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ）および２ｎｍ（ｓｓＤＮＡのみ）のナノポアを、Briggs K, et al. Automated fabrication of 2-nm solid-state nanopores for nucleic acid analysis, Small (2014)10(10):2077-86 に記載の通りに調製した。２つのチャンバーを「遠い」チャンバーおよび「近い」チャンバーと称し、遠いチャンバーは、ＤＮＡの３’末端が結合しているチャンバーである。
【0240】
ｓｓＤＮＡ（２ｎｍポア）およびｓｓＤＮＡ＋ｄｓＤＮＡ（４ｎｍポア）はナノポアを通過するが、タンパク質はしないことが示される。ナノポアの通過は、電流の混乱により検出される。
【0241】
ポア表面へのＤＮＡの結合：５’アミノ修飾ＤＮＡを、カルボジイミドに媒介される結合により、カルボキシ被覆されたポリスチレンビーズ（Fluoresbrite（登録商標）BB Carboxylate Microspheres 0.05μm、Polysciences, Inc.）に結合させる。ＤＮＡの３’をビオチンで標識する。ＤＮＡは、予め特定した長さのものである。
【0242】
ストレプトアビジン結合: Arafat, A. Covalent Biofunctionalization of Silicon Nitride Surfaces. Langmuir (2007) 23 (11): 6233-6244 に記載の通り、結合は、窒化ケイ素ナノポアコンジュゲートストレプトアビジンの「遠い」側で、その表面に対して行った。
【0243】
ナノポアに近いＤＮＡの固定：バッファー中のＤＮＡ結合ポリスチレンビーズを、「近い」チャンバーに添加し、バッファーを「遠い」チャンバーに添加する（標準バッファー：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ）。電流の混乱が観察されるまで電圧（約１００ｍＶ）をかける（Axon Nanopatch200B パッチクランプ増幅器を使用）。５０ｎｍのビーズはナノポアを通過できず、よって、ＤＮＡ鎖が通り過ぎ、ビーズがナノポアの末端に押しつけられるときに、電流が大きく乱れる。ＤＮＡが、ビオチンの結合により、遠い側に固定されたストレプトアビジンに不可逆的に結合するまで、電流を１～２分間維持する。ＤＮＡが固定されたことを確認するために、電流を逆にする。ＤＮＡがポアの中または外にあれば、異なる電流が観察される。ＤＮＡが固定されていないことがわかったら、この過程を繰り返す。
【0244】
エンドヌクレアーゼによるビーズの解放：制限酵素バッファー中の制限酵素を、ＤＮＡが結合しているチャンバーに添加する。ある実施態様では、ＤＮＡは一本鎖であり、一本鎖ＤＮＡを切断する酵素により切断できる制限部位を含む。例えば、Nishigaki, K., Type II restriction endonucleases cleave single-stranded DNAs in general. Nucleic Acids Res. (1985) 13(16): 5747-5760 を参照されたい。代替的な実施態様では、相補的オリゴヌクレオチドをＤＮＡが結合しているチャンバーに添加し、３０分間ハイブリダイズさせ、ｄｓＤＮＡを創出し、次いで、制限酵素を添加する。ビーズが解放されたら、それを洗い流す。電流を前後に切り換え、ＤＮＡがポアを通って出入りすることを確認する。
【0245】
前進および後退の制御を立証する：標準バッファーを使用して、シグナルの混乱が観察されるまで、電流を前向きにかけ、ＤＮＡが通過した後、「通常」に戻す。シグナルの混乱が観察されるまで、逆の電流をかける。ＤＮＡがポアに留まると、シグナルは通常に戻らないことが観察される。前向きおよび逆向きの電流をかけることを数サイクル繰り返し、ＤＮＡがナノポアを通って前進および後退することを確認する。
【0246】
実施例１ａ：二酸化ケイ素チップにおいてナノポアに隣接してＤＮＡを固定する
ナノチップ内壁を二酸化ケイ素で作製する。両側をシラン処理するが、オリゴヌクレオチドをチップ壁の片側だけに結合させ、次いで、ナノポアを創出する。
ナノチップ内壁を二酸化ケイ素で作製する。両側をシラン処理するが、オリゴヌクレオチドをチップ壁の片側だけに結合させ、次いで、ナノポアを創出する。
【0247】
シラン処理：チップ壁の表面を３０℃でピラニア溶液（様々な銘柄を購入でき、一般的に、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の混合物を含み、表面から有機残渣を除去する）で処理し、再蒸留水で洗浄する。５０％メタノール（ＭｅＯＨ）、４７.５％ＡＰＴＥＳ、２.５％ナノピュアＨ２Ｏで（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）の原液を調製し、＞１時間、４℃で熟成させた。ＡＰＴＥＳ原液を、次いで、ＭｅＯＨで１：５００に希釈し、室温でチップ壁に適用し、インキュベートする。次いで、チップ壁をＭｅＯＨですすぎ、１１０℃で３０分間乾燥させる。
【0248】
結合：次いで、チップ壁を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１,４－フェニレンジイソチオシアナート（ＰＤＣ）の０.５％ｗ／ｖ溶液中、５時間室温でインキュベートする。ＤＭＳＯで２回軽く洗浄し、再蒸留水で２回軽く洗浄する。次いで、チップ壁を、再蒸留水（ｐＨ８）中で１００ｎＭアミン修飾一本鎖ＤＮＡオリゴマー（約５０ｍｅｒｓ）と終夜３７℃でインキュベートする。次いで、チップ壁を２８％アンモニア溶液で２回洗浄し、未反応の物質を不活性化し、再蒸留水で２回洗浄する。次いで、１以上のナノポアを壁に創出する。
【0249】
ナノチップの作製が完了したら、内壁を約５０ｂｐ長のＤＮＡオリゴマーで被覆する。これは、ｓｓＤＮＡを比較的嵩高い構造（例えば、ナノポアを通過できないほど大きな直径を有するビーズ、タンパク質、またはＤＮＡオリガミ構造）に結合させ（ここで、表面に結合したＤＮＡに相補的な配列は、嵩高い構造から離れている）、電流を使用して荷電ポリマーをナノポアを通して引き出し、ｓｓＤＮＡを、ナノポアに隣接する相補的な表面に結合したＤＮＡオリゴマーと結合させ、嵩高い構造を切り離すことにより、表面に結合したＤＮＡに相補的な末端配列を有する一本鎖ＤＮＡをナノポアに配置することを可能にする。
【0250】
実施例２：ＤＮＡ合成－単一のヌクレオチドの付加
適当な電流をかけ、ＤＮＡの動きを検出することにより、ＤＮＡを「保存」チャンバーに動かす。
適当な電流をかけ、ＤＮＡの動きを検出することにより、ＤＮＡを「保存」チャンバーに動かす。
【0251】
適当なバッファー（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－アセテート、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、ｐＨ７.９＠２５℃）中の末端トランスフェラーゼ酵素（TdT, New England Biolabs）、および、可逆的にブロック化されたｄＡＴＰ＊を、「付加」チャンバーに添加する。また、バッファーを「保存」チャンバーに添加する。
【0252】
３’－ＯＨに可逆的なブロック化を有するｄＮＴＰを使用して、ヌクレオチドをＤＮＡに付加する。ＤＮＡ鎖に付加されると、次のｄＮＴＰは、ブロック化されたｄＮＴＰが脱ブロック化されるまで、付加できない。
【0253】
脱ブロック化は、化学的または酵素的であり得る。様々なアプローチが利用される：
ａ．３’Ｏ－アリル：アリルは、Ju J, Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators. Proc Natl Acad Sci U S A. (2006);103(52):19635-40 に記載の通り、水性緩衝液中でＰｄに触媒される脱アリル化により；または、Shankaraiah G., et al., Rapid and selective deallylation of allyl ethers and esters using iodine in polyethylene-400. Green Chem. (2011)13: 2354-2358 に記載の通り、ポリエチレングリコール－４００中のヨウ素（１０ｍｏｌ％）を使用することにより、除去される。
ａ．３’Ｏ－アリル：アリルは、Ju J, Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators. Proc Natl Acad Sci U S A. (2006);103(52):19635-40 に記載の通り、水性緩衝液中でＰｄに触媒される脱アリル化により；または、Shankaraiah G., et al., Rapid and selective deallylation of allyl ethers and esters using iodine in polyethylene-400. Green Chem. (2011)13: 2354-2358 に記載の通り、ポリエチレングリコール－４００中のヨウ素（１０ｍｏｌ％）を使用することにより、除去される。
【0254】
ｂ．３’Ｏ－ＮＨ２：ＵＳ８０３４９２３に記載の通り、アミンは、緩衝化されたＮａＮＯ２中で除去される。
【0255】
ｃ．３’－リン酸。リン酸は、エンドヌクレアーゼＩＶ（New England Biolabs）で加水分解される。エンドヌクレアーゼＩＶにより除去できる他の可能な３’修飾には、ホスホグリコアルデヒドおよびデオキシリボース－５－リン酸が含まれる。
【0256】
ｄ．３’－Ｏ－Ａｃ：酢酸は、Ud-Dean, A theoretical model for template-free synthesis of long DNA sequence. Syst Synth Biol (2008) 2:67-73 に記載の通り、酵素的加水分解により除去される。
【0257】
次いで、適当な電流をかけ、ＤＮＡの動きを検出することにより、ＤＮＡを「遠い」チャンバーに動かす。バッファーを交換し、上記ａ～ｄに記載の通りに脱ブロック化バッファー／液を加えることにより、ＤＮＡを脱保護する。
所望によりプロセスを繰り返し、目的の配列を作製する。
所望によりプロセスを繰り返し、目的の配列を作製する。
【0258】
実施例３：ＤＮＡ合成：オリゴヌクレオチド塊の付加
二本鎖ＤＮＡの３’末端を、４ｎｍの開口部を有するナノポアに隣接して結合させる。ＤＮＡの５’末端は、（５’から３’に読んで）ＣＧのオーバーハングを有する。
二本鎖ＤＮＡの３’末端を、４ｎｍの開口部を有するナノポアに隣接して結合させる。ＤＮＡの５’末端は、（５’から３’に読んで）ＣＧのオーバーハングを有する。
【0259】
以下の通りにオリゴカセットＡおよびＢを作製する：
【化6】
【0260】
コードＡおよびコードＢは、各々、情報配列を表す。Ｎは、任意のヌクレオチドを表す。５’配列はトポイソメラーゼ認識部位を含み、３’配列はＡｃｃ１制限部位を含む。オリゴをトポイソメラーゼに曝すと、トポイソメラーゼは３’チミジンに結合する：
【化7】
【0261】
適当な電流をかけることにより、ＤＮＡを「近い」チャンバーに動かし、ＤＮＡの動きを検出する。トポイソメラーゼを装填された「コードＡ」オリゴを、「付加」チャンバーに提供する。適当な電流をかけることにより、ＤＮＡを付加チャンバーに動かし、ＤＮＡの動きを検出し、その際にコードＡオリゴがＤＮＡに結合する。Ａｃｃ１を「保存」チャンバーに添加し、そこでそれは制限部位を切断し、トポイソメラーゼ連結部位をもたらす。
【0262】
所望の配列に到達するまでこのプロセスを繰り返し、他の「コードＡ」または「コードＢ」を付加する。「保存」チャンバーに新しいＡｃｃ１を継続的に添加する必要はないことに留意されたい；コードＡまたはコードＢから切り換えるときに、「付加」チャンバー中のコードＡまたはコードＢオリゴを洗い流すだけでよい。
【0263】
ｓｓＤＮＡのみを通過させるポアで配列決定するために、上記のプロトコールにいくつかの変更が必要である。ｓｓＤＮＡのみが通過する小さいポア（２ｎｍ）にｄｓＤＮＡが遭遇すると、相補鎖が「脱落する」ことが既に知られている。従って、この合成を２ｎｍのポアで行うのなら、正しいｄｓＤＮＡが他方の側で確実に再形成できるようにしなければならない。このために、「ＣＧＡＡＧＧＧ＜コードＡまたはＢ＞ＧＴＣＧＡＣＮＮＮＮＮ」を、近いチャンバーに（制限部位が創成されるように）、「ＣＧＡＡＧＧＧ＜コードＡまたはＢ＞ＧＴ」を遠いチャンバーに（トポ適合部位が生成されるように）加え得る。
【0264】
上述の方法を詳しく述べると、ＤＮＡにコードされた情報を、≧２の連続的付加（データの２ビットを表す）で、伸長しているＤＮＡ鎖に連続的に「付加」し、その各々が「付加」および「脱保護」の工程を含むことを立証する。コンセプトの最適化および検証のための初期の実験は、マイクロチューブで実施する。
【0265】
この実施例に記載のアプローチでは、情報の１ビットは、一連のヌクレオチド中にコードされる。「付加」されるＤＮＡのビットは、ワクシニアトポイソメラーゼＩ（トポ）に結合した短いｄｓＤＮＡ配列である。適当な「脱保護」「アクセプター」ＤＮＡの存在下で、トポ装填されたＤＮＡの「ビット」は、トポイソメラーゼによりアクセプターに酵素的かつ共有結合的に連結（「付加」）され、このプロセスのトポイソメラーゼは、その後ＤＮＡから除去される。次いで、制限酵素は、付加されたビットを切断してそれを「脱保護」し、次のビットを付加するための適当な「アクセプター」配列を創成する。
【0266】
トポ装填：一般的な装填スキームは以下の通りであり、図２２および下記に図解され、ここで、Ｎは任意のヌクレオチド、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣは、各々アデニン、チミン、グアニンおよびシトシン塩基を有するヌクレオチドを表す。相互の上にあるＮは、相補的である。この実施例は制限酵素ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩを使用するが、基本的戦略は、例えば実施例４で立証する通り、他の制限酵素でも成立する。
【化8】
【化9】
【0267】
以下のオリゴヌクレオチドを、Integrated DNA Technologies (IDT)に発注する。一部のオリゴヌクレオチドの末端の「ｂ」は、ビオチンを示す）：
BAB: CGATAGTCTAGGCACTGTTTGCTGCGCCCTTGTCCGTGTCGCCCTTATCTACTTAAGAGATCATACAGCATTGCGAGTACG
B1: b-CACGTACTCGCAATGCTGTATGATCTCTTAAGTAGATA
B2: ATCTACTTAAGAGATCATACAGCATTGCGAGTACG
TA1: b-CACACTCATGCCGCTGTAGTCACTATCGGAAT
TA2: AGGGCGACACGGACAGTTTGAATCATACCG
TA3b: AACTTAGTATGACGGTATGATTCAAACTGTCCGTGTCGCCCTTATTCCGATAGTGACTACAGCGGCATGAG
TB1: b-CACACTCATGCCGCTGTAGTCACTATCGGAAT
TB2: AGGGCGCAGCAAACAGTGCCTAGACTATCG
TB3b: AACTTAGTATGACGATAGTCTAGGCACTGTTTGCTGCGCCCTTATTCCGATAGTGACTACAGCGGCATGAG
FP1: CACGTACTCGCAATGCT
FP2: CGGTATGATTCAAACTGTCCG
FP3: GCCCTTGTCCGTGTC
オリゴヌクレオチドをＴＥバッファー中に１００ｕＭに溶解し、－２０Ｃで保存する。
BAB: CGATAGTCTAGGCACTGTTTGCTGCGCCCTTGTCCGTGTCGCCCTTATCTACTTAAGAGATCATACAGCATTGCGAGTACG
B1: b-CACGTACTCGCAATGCTGTATGATCTCTTAAGTAGATA
B2: ATCTACTTAAGAGATCATACAGCATTGCGAGTACG
TA1: b-CACACTCATGCCGCTGTAGTCACTATCGGAAT
TA2: AGGGCGACACGGACAGTTTGAATCATACCG
TA3b: AACTTAGTATGACGGTATGATTCAAACTGTCCGTGTCGCCCTTATTCCGATAGTGACTACAGCGGCATGAG
TB1: b-CACACTCATGCCGCTGTAGTCACTATCGGAAT
TB2: AGGGCGCAGCAAACAGTGCCTAGACTATCG
TB3b: AACTTAGTATGACGATAGTCTAGGCACTGTTTGCTGCGCCCTTATTCCGATAGTGACTACAGCGGCATGAG
FP1: CACGTACTCGCAATGCT
FP2: CGGTATGATTCAAACTGTCCG
FP3: GCCCTTGTCCGTGTC
オリゴヌクレオチドをＴＥバッファー中に１００ｕＭに溶解し、－２０Ｃで保存する。
【0268】
後述の通りにオリゴヌクレオチドを混合し、９５℃に５分間加熱し、次いで、温度を３分間に５℃の速度で２０℃に達するまで下げることにより、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを作製する。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを４℃または－２０℃で保存する。オリゴヌクレオチドの組合せは以下の通りである：
B1/2
48 uL B1
48 uL B2
4 uL 5M NaCl
A5
20 uL TA1
20 uL TA2
5 uL TA3b
4 uL 5M NaCl
51 uL TE
B5
20 uL TB1
20 uL TB2
5 uL TB3b
4 uL 5M NaCl
51 uL TE
B1/2
48 uL B1
48 uL B2
4 uL 5M NaCl
A5
20 uL TA1
20 uL TA2
5 uL TA3b
4 uL 5M NaCl
51 uL TE
B5
20 uL TB1
20 uL TB2
5 uL TB3b
4 uL 5M NaCl
51 uL TE
【0269】
以下のバッファーおよび酵素をこの実施例で使用する：
ＴＥ：１０Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０
ＷＢ：１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０
１ｘＴｏｐｏ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２
１ｘＲＥ：５０ｍＭ Ｋ－酢酸、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－酢酸、１０ｍＭ Ｍｇ－酢酸、１００ｕｇ／ｍｌ ＢＳＡ ｐＨ７.９＠２５Ｃ
ワクシニアＤＮＡトポイソメラーゼＩ（トポ）は、Monserate Biotech (10,000 U/mL）から購入する
ＨｙｐＣＨ４ＩＩＩは、ＮＥＢから購入する
ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（s-MagBeads）は、ThermoFisher から購入する。
ＴＥ：１０Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０
ＷＢ：１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０
１ｘＴｏｐｏ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２
１ｘＲＥ：５０ｍＭ Ｋ－酢酸、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－酢酸、１０ｍＭ Ｍｇ－酢酸、１００ｕｇ／ｍｌ ＢＳＡ ｐＨ７.９＠２５Ｃ
ワクシニアＤＮＡトポイソメラーゼＩ（トポ）は、Monserate Biotech (10,000 U/mL）から購入する
ＨｙｐＣＨ４ＩＩＩは、ＮＥＢから購入する
ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（s-MagBeads）は、ThermoFisher から購入する。
【0270】
アクセプターを、次の通りに調製する：５ｕＬのs-magbeads を２００ｕＬのＷＢで１回洗浄する（結合時間１分間）。５ｕＬのＢ１／２＋１９５ｕＬのＷＢをビーズに添加し、１５分間室温でインキュベートし、次いで、２００ｕＬのＷＢで１回洗浄し、次いで、２００ｕＬの１ｘＴｏｐｏで１回洗浄し、１５０ｕＬの１ｘＴｏｐｏに再懸濁する。
【0271】
トポ装填されたＡ５（図２０参照）を、以下の通りに調製する：４ｕＬの１０ｘトポバッファー＋２３ｕＬの水＋８ｕＬのＡ５＋５ｕＬのトポを、３７℃で３０分間インキュベートし、５ｕＬのs-magbeads（２００ｕＬのＷＢで１ｘ洗浄、２００ｕＬの１ｘトポで１ｘ洗浄、１５０ｕＬの１ｘトポに再懸濁）に添加し、室温で１５分間結合させる。
【0272】
装填Ａ５をアクセプターに「付加」する：s-magbeads を、トポ装填Ａ５から除去し、アクセプターに添加し、３７℃で６０分間インキュベートする。アリコートを取り出し、ＴＥ中に１／２００で希釈し、－２０Ｃで保存する。
【0273】
脱保護：物質を２００ｕＬのＷＢで１回洗浄し、２００ｕＬの１ｘＲＥで１回洗浄し、１５ｕＬの１０ｘＲＥおよび１２０ｕＬの水に再懸濁する。１５ｕＬのＨｙｐＣＨ４ＩＩＩを添加する。混合物を３７℃で６０分間インキュベートし、次いで２００ｕＬのＷＢで１回洗浄し、２００ｕＬの１ｘトポで１回洗浄し、「アクセプター－Ａ５」と称する生成物を産生する。
【0274】
トポ装填Ｂ５（図２１参照）を、次の通りに調製する：４ｕＬの１０ｘトポバッファー、２３ｕＬの水および８ｕＬのＢ５＋５ｕＬトポを合わせ、３７℃で３０分間インキュベートする。生成物を５ｕＬのs-magbeads（２００ｕＬのＷＢで１ｘ洗浄、２００ｕＬのトポで１ｘ洗浄、１５０ｕＬの１ｘトポに再懸濁）に添加し、室温で１５分間結合させる。
【0275】
装填されたＢ５をアクセプター－Ａ５に「付加」する：s-magbeads をトポ装填Ｂ５から除去し、アクセプター－Ａ５に添加し、３７℃で６０分間インキュベートする。アリコートを取り出し、ＴＥ中に１／２００で希釈し、－２０℃で保存する。
【0276】
脱保護：物質を２００ｕＬのＷＢで１回洗浄し、２００ｕＬの１ｘＲＥで１回洗浄し、１５ｕＬの１０ｘＲＥおよび１２０ｕＬの水に再懸濁する。１５ｕＬのＨｙｐＣＨ４ＩＩＩを添加し、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。
【0277】
上記の反応が機能したことの確認は、Ａ５（Ａ５が付加されたアクセプター：工程ｉｉｉ、図解の「Ａ５付加」）およびＢ５（Ｂ５が付加されたアクセプター－Ａ５：工程ｖｉ、図解の「Ｂ５付加」）のアリコートのＰＣＲ増幅により行った。「鋳型なし」をＡ５の負の対照として使用し、Ａ５をＢ５の負の対照として使用し、オリゴＢＡＢをＢ５の正の対照として使用する。Ａ５ＰＣＲに予想される生成物のサイズは６８ｂｐであり、Ｂ５ＰＣＲに予想される生成物のサイズは、５７ｂｐである。（予想サイズ約４７ｂｐのＢ１／２もゲルに流すが、オーバーハングがあり、ビオチン化されているため、これは近似値であり得る）。ＰＣＲ反応（９５／５５／６８（各１分間）の３０サイクルを次の通りに実施する：
【表3】
【0278】
４－２０％Ｔｒｉｓ－グリシンゲルを用いるＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、予想されるサイズのオリゴヌクレオチドが産生されることを確認する。装填は上記の通りに実施するが、装填（３７℃のインキュベーション工程）の直後に、ローディングバッファーを混合し、サンプルを７０℃に２分間加熱し、ゲルに流す前に冷ます。ゲルをクーマシーで染色する。負の対照として、トポの代わりに水を反応に添加する。図３０は結果を示し、Ａ５ＰＣＲおよびＢ５ＰＣＲに予想される生成物サイズに対応するバンドを明確に示している。
【0279】
かくして、トポイソメラーゼ装填ＤＮＡカセットを介するＤＮＡビットの付加および制限酵素により実行される脱保護は、実施可能であることが示される。これらのコンセプトの検証実験において、ＤＮＡはストレプトアビジン結合磁気ビーズにより固定され、異なる反応混合物に連続的に移動するが、ナノポアチップの形式では、別個の反応チャンバーを創成し、電流を使用してＤＮＡをこれらの異なる反応チャンバーに動かす。
【0280】
最終的に、情報の「ビット」に対応するＤＮＡ配列の連続的付加を実行すると、予想されるＤＮＡ配列が創成されることを、ＰＣＲにより立証する。これらの反応は設計された通りに作用し、最適化は最小限でよい。
【0281】
実施例２および３に記載の通りに作製されたＤＮＡを回収し、購入できるナノポアシークエンサー（Oxford Nanopore の MinION）を使用して配列決定し、所望の配列が得られることを裏付ける。
【0282】
実施例４－ＤＮＡ合成：異なる制限酵素を使用するオリゴヌクレオチド塊の付加
以下の合成は、実施例３と同様に、ただし、「ACGCGT」で切断して
を形成する制限酵素ＭｌｕＩを使用して実行する。
以下の合成は、実施例３と同様に、ただし、「ACGCGT」で切断して
【化10】
【0283】
この実施例では、ＴＯＰＯが装填され、装填されたＴＯＰＯがＤＮＡをＭｌｕＩで切断されたＤＮＡに移動できるようにする配列相補性を有する複合体を形成する：
【化11】
【0284】
先行する実施例と同様のプロセスにより、装填されたＴＯＰＯを使用して、相補的なアクセプター配列を有する合成されている鎖の５’末端にオリゴマーを付加し、それによりＴＯＰＯを解放し、その鎖は、ＭｌｕＩを用いて「脱保護」され、このサイクルはオリゴマーの所望の配列が得られるまで繰り返される。
【0285】
実施例５－トポイソメラーゼ戦略を用いる単一の塩基の付加
トポイソメラーゼのシステムを、単一の塩基を一本鎖ＤＮＡ鎖に付加するように設計することもできることを見出した（「カセット」を付加することを記載する実施例３と比較）。「付加」されるＤＮＡビットは、ワクシニアトポイソメラーゼＩ（トポ）に結合した短いＤＮＡ配列に含まれる。適当な一本鎖の「脱保護」「アクセプター」ＤＮＡの存在下で、トポ装填されたＤＮＡは、トポイソメラーゼによりアクセプターに酵素的かつ共有結合的に連結され（「付加」）、それは、このプロセスにおいてＤＮＡから除去される。ＩＩＳ型制限酵素は、単一の塩基（「付加」されている塩基）以外の付加されたＤＮＡを全て切り離せる。この脱保護－付加の過程を繰り返し、さらなる塩基（ビット）を付加する。
トポイソメラーゼのシステムを、単一の塩基を一本鎖ＤＮＡ鎖に付加するように設計することもできることを見出した（「カセット」を付加することを記載する実施例３と比較）。「付加」されるＤＮＡビットは、ワクシニアトポイソメラーゼＩ（トポ）に結合した短いＤＮＡ配列に含まれる。適当な一本鎖の「脱保護」「アクセプター」ＤＮＡの存在下で、トポ装填されたＤＮＡは、トポイソメラーゼによりアクセプターに酵素的かつ共有結合的に連結され（「付加」）、それは、このプロセスにおいてＤＮＡから除去される。ＩＩＳ型制限酵素は、単一の塩基（「付加」されている塩基）以外の付加されたＤＮＡを全て切り離せる。この脱保護－付加の過程を繰り返し、さらなる塩基（ビット）を付加する。
【0286】
トポ装填：一般的な装填プロトコールは、実施例３と同様であり、以下の通りである：
【化12】
【0287】
実施例３と同様に、相互の上にあるＮは相補的である。Ｉはイノシンである。ビオチンを使用して未反応生成物および副生成物を除去する。単一の塩基の付加は、以下の通りに実行する。
【化13】
【0288】
脱保護は、ＢｃｉＶＩ制限酵素（部位は太字）を使用して、以下のように例示される：
【化14】
【0289】
以下のオリゴヌクレオチドを商業的に合成する（Ｂ＝ビオチン、Ｐ－リン酸、Ｉ＝イノシン）：
NAT1 CACGTCAGGCGTATCCATCCCTTCACGTACTCGCAATGCTGTATGGCGAT
NAT1b P-CACGTCAGGCGTATCCATCCCTTCACGTACTCGCAATGCTGTATGGCGAT-B
NAT9cI P-IIIIIAAGGGATGGATACGCCTGACGTG
NAT9x P-ATCGCCATACAGCATTGCGAG
NAT9 ACGTGAAGGGATGGATACGCCTGACGTG
Nat9Acc CACGTAGCAGCAAACAGTGCCTAGACTATCG
Nat1P CACGTCAGGCGTATCCATCC
FP4 CGATAGTCTAGGCACTGTTTG
オリゴヌクレオチドをＴＥバッファー中１００μＭに溶解し、－２０℃で保存する。
NAT1 CACGTCAGGCGTATCCATCCCTTCACGTACTCGCAATGCTGTATGGCGAT
NAT1b P-CACGTCAGGCGTATCCATCCCTTCACGTACTCGCAATGCTGTATGGCGAT-B
NAT9cI P-IIIIIAAGGGATGGATACGCCTGACGTG
NAT9x P-ATCGCCATACAGCATTGCGAG
NAT9 ACGTGAAGGGATGGATACGCCTGACGTG
Nat9Acc CACGTAGCAGCAAACAGTGCCTAGACTATCG
Nat1P CACGTCAGGCGTATCCATCC
FP4 CGATAGTCTAGGCACTGTTTG
オリゴヌクレオチドをＴＥバッファー中１００μＭに溶解し、－２０℃で保存する。
【0290】
ハイブリダイゼーション：記載したオリゴヌクレオチドを混合し、９５℃に５分間加熱し、次いで、温度を２０℃に達するまで３分間に５℃下げることにより、以下のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを作製する。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを４℃または－２０℃で保存する。
NAT1b/NAT9cI/NAT9x
8 μL NAT1B
10 μL NAT9cI
10 μL NAT9x
48 μL TE
4 μL 5M NaCl
NAT1/NAT9cI
10 μL NAT1
10 μL NAT9cI
80 uL PBS
NAT1/NAT9
10 μL NAT1
10 μL NAT9
80 uL PBS
NAT1b/NAT9cI/NAT9x
8 μL NAT1B
10 μL NAT9cI
10 μL NAT9x
48 μL TE
4 μL 5M NaCl
NAT1/NAT9cI
10 μL NAT1
10 μL NAT9cI
80 uL PBS
NAT1/NAT9
10 μL NAT1
10 μL NAT9
80 uL PBS
【0291】
バッファーおよび酵素：以下のバッファーを使用する：
ＴＥ：１０Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２.７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１.８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）（ｐＨ７.４）
１０ｘ Cutsmart：５００ｍＭ ＫＡｃ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ａｃ、１００ｍＭ Ｍｇ－Ａｃ、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ ｐＨ７.９
ＢｃｉＶＩはＮＥＢから購入し、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ (s-MagBeads) はThermoFisher から購入する。
ＴＥ：１０Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２.７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１.８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）（ｐＨ７.４）
１０ｘ Cutsmart：５００ｍＭ ＫＡｃ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ａｃ、１００ｍＭ Ｍｇ－Ａｃ、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ ｐＨ７.９
ＢｃｉＶＩはＮＥＢから購入し、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ (s-MagBeads) はThermoFisher から購入する。
【0292】
付加反応は以下の通りに実行する。
１．トポ装填：下表の通りに試薬を合わせる：
１．トポ装填：下表の通りに試薬を合わせる：
【表4】
【0293】
次いで、試薬を３７℃で３０分間インキュベートする。トポバッファー中のストレプトアビジン磁気ビーズ（５ｕＬ）を使用して、室温で１０分間結合させた後、副生成物を除去する。
【0294】
２．反応：下表の通りに試薬を合わせる：
【表5】
【0295】
次いで、試薬を３７℃で３０分間インキュベートする。付加反応は以下の通りに進行すると予想される：
【化15】
【0296】
アスタリスク（＊）はトポイソメラーゼを表す。ＮＡＴ９ｃＩはリン酸化されているが、図解の目的では表示されていないことに留意されたい。
【0297】
装填されたトポがアクセプター配列に存在するとき、以下の反応に進む:
【化16】
【0298】
ＰＣＲ増幅およびアガロースゲルでの生成物の分子量の測定により、予想された生成物が産生されたことを確認する。正しいサイズのバンドをレーン１（実験）に示し、負の対照にバンドを示さない、図３０参照。
【0299】
Ｂ．脱保護反応：下表の通りに試薬を合わせる：
【表6】
【0300】
試薬を３７℃で９０分間インキュベートする。脱保護反応のために、購入したオリゴヌクレオチドを用いて付加反応の代表的な生成物を作製し、ＢｃｉＶＩ制限酵素による切断について試験する：
【化17】
【0301】
切断部位の３’が「通常の」塩基と向かい合うイノシンの連続であることから、制限酵素が意図通りにＤＮＡを切断するか否かはわからなかった。正の対照として、「適切な」塩基対のＮＡＴ１／ＮＡＴ９ｃＩの同等物を作製した（ＮＡＴ１／ＮＡＴ９ｃ）：
【化18】
【0302】
生成物のＰＣＲ増幅と、それに続くアガロースゲルでの分子量の測定（図３１）は、酵素が意図通りに作用することを示す。正の対照には、切断されないと大きいバンドが観察されるが（レーン１）、切断されると小さいバンドが観察される。同じパターンがＮＡＴ１／ＮＡＴ９ｃＩで観察され、イノシンの存在が切断を無効化または妨害しないことを示す。少量の未切断生成物がＮＡＴ１／ＮＡＴ９ｃＩで残っていると思われ、少なくともこれらの条件下で、切断はＮＡＴ１／ＮＡＴ９ｃほど有効ではないことを示唆する。切断効率は、バッファー条件の変更、および／または、ＮＡＴ９ｃＩの５’末端にイノシンをもっと付加することにより改善され得る。
【0303】
上述の実施例は、トポ／ＩＩＳ型制限酵素の組合せを使用して、単一のヌクレオチドを標的一本鎖ＤＮＡの５’末端に付加することができることを示す。配列ＣＣＣＴＧ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8661446）を認識する関連トポイソメラーゼのＳＶＦは、類似のプロセスを用いて、「Ｔ」の代わりに「Ｇ」を付加するために使用され、かくして、ＴおよびＧでバイナリ情報をコードする配列の構築を可能にする。
【0304】
上記の通り、トポイソメラーゼ戦略を使用してｄｓＤＮＡを生成する場合、反対側の鎖のＤＮＡにおけるニックは、リガーゼをＡＴＰと共に使用して修復できる。しかしながら、本実施例のように単一のヌクレオチドを付加するとき、修復されるべきニックはなく、リガーゼを使う必要もないように、一本鎖ＤＮＡを構築している。
【0305】
実施例６－トポイソメラーゼの戦略を５’リン酸結合と組み合わせて用いる単一の塩基の付加
単一の塩基の付加に対する別のアプローチでは、３’から５’への方向で単一の塩基対の付加をもたらすために、ブロッキング基として５’リン酸を使用する。装填反応は、トポイソメラーゼに、５’リン酸基を有する単一のＴ（またはＧ、または所望により他のヌクレオチド）を装填する。装填されたトポイソメラーゼが５’がブロック化されていない（リン酸化されていない）一本鎖ＤＮＡ鎖を「見つける」と、それはＴをその鎖に付加し、５’にＴが付加されたＤＮＡをもたらす。この付加は、トポイソメラーゼおよび一本鎖アクセプターＤＮＡが結合できる配列を有するアダプターＤＮＡの存在により促進される。（アダプターＤＮＡは触媒的であることに留意されたい－反復される反応において、鋳型として再使用できる。）付加されたヌクレオチドは５’リン酸を有するので、５’リン酸を除去するホスファターゼに暴露されるまで、さらなる付加の基質にはならない。標的一本鎖ＤＮＡの５’末端に単一の「Ｔ」を付加するためにトポを、単一の「Ｇ」を付加するためにＳＶＦトポイソメラーゼを使用してこの過程を繰り返し、かくして、ＴおよびＧのバイナリ情報をコードする配列の構築を可能にする。この過程を、以下の通り、模式的に示す：
単一の塩基の付加に対する別のアプローチでは、３’から５’への方向で単一の塩基対の付加をもたらすために、ブロッキング基として５’リン酸を使用する。装填反応は、トポイソメラーゼに、５’リン酸基を有する単一のＴ（またはＧ、または所望により他のヌクレオチド）を装填する。装填されたトポイソメラーゼが５’がブロック化されていない（リン酸化されていない）一本鎖ＤＮＡ鎖を「見つける」と、それはＴをその鎖に付加し、５’にＴが付加されたＤＮＡをもたらす。この付加は、トポイソメラーゼおよび一本鎖アクセプターＤＮＡが結合できる配列を有するアダプターＤＮＡの存在により促進される。（アダプターＤＮＡは触媒的であることに留意されたい－反復される反応において、鋳型として再使用できる。）付加されたヌクレオチドは５’リン酸を有するので、５’リン酸を除去するホスファターゼに暴露されるまで、さらなる付加の基質にはならない。標的一本鎖ＤＮＡの５’末端に単一の「Ｔ」を付加するためにトポを、単一の「Ｇ」を付加するためにＳＶＦトポイソメラーゼを使用してこの過程を繰り返し、かくして、ＴおよびＧのバイナリ情報をコードする配列の構築を可能にする。この過程を、以下の通り、模式的に示す：
【0306】
【化19】
【0307】
【化20】
【0308】
実施例７－ナノポアに隣接してＤＮＡを結合させるためのＤＮＡオリガミの使用
一端に大きいオリガミ構造を有するＤＮＡ鎖をナノポア中に捕捉し、ＤＮＡの末端のビオチン部分を介して、表面に結合したストレプトアビジンに固定する。オリガミ構造を制限酵素で切断した後、電流の混乱により確認される通り、固定されたＤＮＡはポアを通って行き来できる。固定は、ポアを通る単一のＤＮＡ分子の動きの制御を可能にし、それは、ＤＮＡへの情報の「読み取り」および「書き込み」を可能にする。
一端に大きいオリガミ構造を有するＤＮＡ鎖をナノポア中に捕捉し、ＤＮＡの末端のビオチン部分を介して、表面に結合したストレプトアビジンに固定する。オリガミ構造を制限酵素で切断した後、電流の混乱により確認される通り、固定されたＤＮＡはポアを通って行き来できる。固定は、ポアを通る単一のＤＮＡ分子の動きの制御を可能にし、それは、ＤＮＡへの情報の「読み取り」および「書き込み」を可能にする。
【0309】
図３５に示す通り、大きすぎてナノポアにはまれない嵩高い二本鎖ＤＮＡユニットが形成され、一本鎖領域が、合成中に付加されるべきＤＮＡを係留するのに役立つ２つの短い二本鎖領域により、その嵩高い部分に連結される。次いで、一本鎖領域を分離し、ナノポアに隣接する表面に係留し、オリガミ構造を解放し得る。図３３参照。
【0310】
ナノポアを、２０ｎｍ ＳｉＯ２を有する３ｍｍのチップに、５０＊５０μｍの開口部で形成する。チップは Nanopore Solutions により提供される。ナノポアカセットホルダーおよびフローセルは、Nanopore Solutions により提供される。増幅器は、Tecella Pico 2 増幅器である。これは、制御のためにｕｓｂ－コンピューターインターフェースを使用する、ｕｓｂから電源供給される増幅器である。Tecella は、増幅器を制御する（Windows）ソフトウェアを供給する。回路計は、０.１ｕＡまで低い電流を検出できる FLUKE 17B+ Digital Multimeter である。無線周波数ノイズのスクリーニングのために、ＵＳＢインターフェースを有する Concentric Technology Solutions TC-5916A Shield Box (Faraday Cage) を使用する。オリゴヌクレオチドは IDT.com から入手する。「ＰＳ」は、http://www.gelest.com/product/o-propargyl-n-triethoxysilylpropylcarbamate-90/のプロパルギルシラン－Ｏ－（プロパルギル）－Ｎ－（トリエトキシシリルプロピル）カルバメートである。
【0311】
オリガミ構造は、一辺約２０ｎｍの「ハニカム状の」立方体オリガミ構造を有する一本鎖ｍ１３をベースとする。それぞれユニークな制限部位を含む、ハニカムに隣接する二本鎖領域がある。これらの部位の１つを用いて修飾ＤＮＡを結合させ、ナノポア近傍での結合を可能にし、ＤＮＡが結合したら、他の部位を用いてオリガミ構造を切り離す。
【0312】
ナノポア形成：以下の通りに、誘電破壊を使用してチップにナノポアを形成させる：
１．チップを注意深くカセットにマウントする
２．ウェッティング：１００％エタノールを注意深くピペットでチップに置く。気泡を除去しなければならない。しかしながら、チップ上の溶液を直接ピペッティングすることは避けるべきであり、さもないとチップは割れ得る（ＳｉＯ２はわずか２０ｎｍである）。
３．表面処理：エタノールを除去し、新たに調製したピラニア溶液（７５％硫酸、２５％過酸化水素（３０％））をピペットでチップに置く。（ピラニア溶液を室温にさせる）。３０分間放置する。
４．蒸留水で４回すすぐ。
５．ＨＫバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８、１Ｍ ＫＣｌ）で２回すすぐ。
６．カセットをフローセル中に組み立てる。
７．フローセルの各チャンバーに７００μＬのＨＫバッファーを添加する。
８．増幅器に取り付けた銀電極を挿入し、ファラデーケージを閉じる。
９．３００ｍＶで抵抗を試験する。電流は検出されるべきではない。もし検出されたら、チップは割れていると思われ、やり直さなければならない。
１０．電極を６ＶのＤＣ電流に接続し、回路計で電流を試験する。電流は低いべきであり、変化しないべきである。電圧を１.５Ｖ上げ、抵抗が増加するまで電圧を維持する。５～１０分後に抵抗が増加しなければ、電圧をさらに１.５Ｖ上げ、再試行する。抵抗が増加するまで繰り返し、その時点でかけた電圧をすぐに止めるべきである。（十分な電圧で、誘電破壊が起こり、ＳｉＯ２膜に「ポア」が作られる。最初にできたとき、ポアは小さいが、電圧を維持すると大きくなる。）
１１．増幅器を使用してポアを試験する。３００ｍＶで数ｎＡの電流が見られるべきである。電流が高いほど、ポアは大きい。
１．チップを注意深くカセットにマウントする
２．ウェッティング：１００％エタノールを注意深くピペットでチップに置く。気泡を除去しなければならない。しかしながら、チップ上の溶液を直接ピペッティングすることは避けるべきであり、さもないとチップは割れ得る（ＳｉＯ２はわずか２０ｎｍである）。
３．表面処理：エタノールを除去し、新たに調製したピラニア溶液（７５％硫酸、２５％過酸化水素（３０％））をピペットでチップに置く。（ピラニア溶液を室温にさせる）。３０分間放置する。
４．蒸留水で４回すすぐ。
５．ＨＫバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８、１Ｍ ＫＣｌ）で２回すすぐ。
６．カセットをフローセル中に組み立てる。
７．フローセルの各チャンバーに７００μＬのＨＫバッファーを添加する。
８．増幅器に取り付けた銀電極を挿入し、ファラデーケージを閉じる。
９．３００ｍＶで抵抗を試験する。電流は検出されるべきではない。もし検出されたら、チップは割れていると思われ、やり直さなければならない。
１０．電極を６ＶのＤＣ電流に接続し、回路計で電流を試験する。電流は低いべきであり、変化しないべきである。電圧を１.５Ｖ上げ、抵抗が増加するまで電圧を維持する。５～１０分後に抵抗が増加しなければ、電圧をさらに１.５Ｖ上げ、再試行する。抵抗が増加するまで繰り返し、その時点でかけた電圧をすぐに止めるべきである。（十分な電圧で、誘電破壊が起こり、ＳｉＯ２膜に「ポア」が作られる。最初にできたとき、ポアは小さいが、電圧を維持すると大きくなる。）
１１．増幅器を使用してポアを試験する。３００ｍＶで数ｎＡの電流が見られるべきである。電流が高いほど、ポアは大きい。
【0313】
図３４は基本的な機能するナノポアを示す。各パネルにおいて、ｙ軸は電流（ｎＡ）であり、ｘ軸は時間（秒）である。左のパネル「ＲＦノイズのスクリーニング」はファラデーケージの有用性を示す。ナノポアを有さないチップをフローセル内に配置し、３００ｍＶをかける。ファラデーケージの蓋を閉じると（最初の矢印）、ノイズの減少が見られる。ラッチを閉じると（２番目の矢印）、小さなスパイクが生じる。電流が約０ｎＡであることが分かる。ポアの製造後（中央のパネル）、３００ｍＶの適用（矢印）は約３.５ｎＡの電流をもたらす。ＤＮＡをアースチャンバーに適用し、＋３００ｍＶをかけると、ＤＮＡの移行（右のパネル）が電流の一過性の減少として観察され得る。（この場合にＴＳ緩衝液が使用されていることを言及しておく：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１Ｍ ＮａＣｌ。）ラムダＤＮＡがこのＤＮＡ移行実験に使用されている。
【0314】
塩化銀電極：
１．銀ワイヤーを絶縁銅ワイヤーにはんだ付けする。
２．銅ワイヤーを磨き、銀を新しい３０％次亜塩素酸ナトリウムに３０分間浸す。
３．銀は濃灰色の被覆（塩化銀）を得るはずである。
４．銀ワイヤーを蒸留水でよくすすぎ、乾燥させる。
５．それはもう使用できる。
１．銀ワイヤーを絶縁銅ワイヤーにはんだ付けする。
２．銅ワイヤーを磨き、銀を新しい３０％次亜塩素酸ナトリウムに３０分間浸す。
３．銀は濃灰色の被覆（塩化銀）を得るはずである。
４．銀ワイヤーを蒸留水でよくすすぎ、乾燥させる。
５．それはもう使用できる。
【0315】
ビーズのシラン処理：シラン処理の方法は、まずＳｉＯ２被覆磁気ビーズ（GBioscience）で開発／試験する。以下のプロトコールを採用する：
１．新鮮なピラニア溶液中で３０分間ビーズを予処理する。
２．蒸留水で３回洗浄する。
３．メタノールで２回洗浄する。
４．ＡＰＴＥＳ原液をメタノールで１：５００に希釈する。
５．希釈したＡＰＴＥＳをビーズに添加し、ＲＴで４５分間インキュベートする。
６．メタノールですすぐ。
７．１００℃で３０分間。
８．真空下で保存する。
１．新鮮なピラニア溶液中で３０分間ビーズを予処理する。
２．蒸留水で３回洗浄する。
３．メタノールで２回洗浄する。
４．ＡＰＴＥＳ原液をメタノールで１：５００に希釈する。
５．希釈したＡＰＴＥＳをビーズに添加し、ＲＴで４５分間インキュベートする。
６．メタノールですすぐ。
７．１００℃で３０分間。
８．真空下で保存する。
【0316】
シリコンチップのシラン処理
１．ナノポアを有するチップをカセットにマウントする。
２．メタノールですすぎ、気泡を注意深く除去する。
３．新鮮なピラニア溶液（室温に平衡化したもの）を添加し、３０分間インキュベートする。
４．蒸留水で４回洗浄する。
５．メタノールで３回洗浄する。
６．ＡＰＴＥＳ原液をメタノールで１：５００に希釈し、これを使用してチップを２回洗浄する。ＲＴで４５分間インキュベートする。
７．メタノールで２回すすぐ。
８．気流のもとで乾燥させる。
９．真空下で終夜保存する。
１．ナノポアを有するチップをカセットにマウントする。
２．メタノールですすぎ、気泡を注意深く除去する。
３．新鮮なピラニア溶液（室温に平衡化したもの）を添加し、３０分間インキュベートする。
４．蒸留水で４回洗浄する。
５．メタノールで３回洗浄する。
６．ＡＰＴＥＳ原液をメタノールで１：５００に希釈し、これを使用してチップを２回洗浄する。ＲＴで４５分間インキュベートする。
７．メタノールで２回すすぐ。
８．気流のもとで乾燥させる。
９．真空下で終夜保存する。
【0317】
ビーズのストレプトアビジン結合：ストレプトアビジン結合は、まず、上記で調製されたシラン処理ビーズで開発／試験する。
１．シラン処理ビーズを改変リン酸緩衝食塩液（ＭＰＢＳ）で洗浄する。
２．ＭＰＢＳ中の１.２５％グルタルアルデヒド溶液を新たに作る（冷凍保存した５０％グルタルアルデヒド原液を使用する）。
３．１.２５％グルタルアルデヒドをビーズに添加し、１５分ごとに静かに上下にピペッティングしながら、６０分間静置する。
４．ＭＰＢＳで２回洗浄する。
５．水で２回洗浄する。
６．真空下で乾燥させる。
７．ストレプトアビジン（ＭＰＢＳ中５００μｇ／ｍＬ）をビーズに添加し、６０分間インキュベートする（負の対照のビーズには、ストレプトアビジンの代わりにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＭＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）を用いる）。
８．ストレプトアビジンを除去し、ＢＳＡ（ＭＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）を添加する。６０分間インキュベートする。
９．ＭＰＢＳで２回洗浄する。
１０．４℃で保存する。
１．シラン処理ビーズを改変リン酸緩衝食塩液（ＭＰＢＳ）で洗浄する。
２．ＭＰＢＳ中の１.２５％グルタルアルデヒド溶液を新たに作る（冷凍保存した５０％グルタルアルデヒド原液を使用する）。
３．１.２５％グルタルアルデヒドをビーズに添加し、１５分ごとに静かに上下にピペッティングしながら、６０分間静置する。
４．ＭＰＢＳで２回洗浄する。
５．水で２回洗浄する。
６．真空下で乾燥させる。
７．ストレプトアビジン（ＭＰＢＳ中５００μｇ／ｍＬ）をビーズに添加し、６０分間インキュベートする（負の対照のビーズには、ストレプトアビジンの代わりにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＭＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）を用いる）。
８．ストレプトアビジンを除去し、ＢＳＡ（ＭＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）を添加する。６０分間インキュベートする。
９．ＭＰＢＳで２回洗浄する。
１０．４℃で保存する。
【0318】
シリコンチップのストレプトアビジン結合
１．シラン処理されたチップをエタノールで２回すすぐ。
２．シラン処理されたチップをＭＰＢＳで２回すすぐ。
３．ＭＰＢＳ中の１.２５％グルタルアルデヒド溶液を新たに作る（冷凍保存した５０％グルタルアルデヒド原液を使用する）。
４．チップを１.２５％グルタルアルデヒドで２回すすぎ、１５分ごとに静かに上下にピペッティングしながら、６０分間静置する。
５．ＭＰＢＳで２回洗浄する。
６．水で２回洗浄する。
７．気流のもとで乾燥させる。
８．チップの２分の１にＢＳＡ（ＭＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）を添加し、他方にストレプトアビジン（ＭＰＢＳ中５００μｇ／ｍＬ）を添加する。６０分間インキュベートする。チップのどちらの半分がストレプトアビジン修飾されているかを示す印をカセットにつける。
９．チップの両方の半分をＢＳＡ（ＭＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）ですすぐ。６０分間インキュベートする。
１０．ＭＰＢＳで洗浄する。
１．シラン処理されたチップをエタノールで２回すすぐ。
２．シラン処理されたチップをＭＰＢＳで２回すすぐ。
３．ＭＰＢＳ中の１.２５％グルタルアルデヒド溶液を新たに作る（冷凍保存した５０％グルタルアルデヒド原液を使用する）。
４．チップを１.２５％グルタルアルデヒドで２回すすぎ、１５分ごとに静かに上下にピペッティングしながら、６０分間静置する。
５．ＭＰＢＳで２回洗浄する。
６．水で２回洗浄する。
７．気流のもとで乾燥させる。
８．チップの２分の１にＢＳＡ（ＭＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）を添加し、他方にストレプトアビジン（ＭＰＢＳ中５００μｇ／ｍＬ）を添加する。６０分間インキュベートする。チップのどちらの半分がストレプトアビジン修飾されているかを示す印をカセットにつける。
９．チップの両方の半分をＢＳＡ（ＭＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）ですすぐ。６０分間インキュベートする。
１０．ＭＰＢＳで洗浄する。
【0319】
ここで使用するバッファーは、以下の通りに作製する：
ＭＰＢＳ：８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０.２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、１.４４ｇ／Ｌリン酸二ナトリウム、０.２４０ｇ／Ｌリン酸カリウム、０.２ｇ／Ｌポリソルベート－２０（ｐＨ７.２）
ＰＢＳ：８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０.２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、１.４４ｇ／Ｌリン酸二ナトリウム、０.２４０ｇ／Ｌリン酸カリウム
ＴＳ：５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８.０、１ＭＮａＣｌ
ＨＫ：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８.０、１Ｍ ＫＣｌ
ＴＥ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０
ピラニア溶液：７５％過酸化水素（３０％）＋２５％硫酸
ＡＰＴＥＳ原液：５０％メタノール、４７.５％ＡＰＴＥＳ、２.５％ナノピュア水。４℃で少なくとも１時間熟成させる。４℃で保存する。
ＰＤＣ原液：ＤＭＳＯ中の０.５％ｗ／ｖ１,４－フェニレンジイソチオシアナート
ＭＰＢＳ：８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０.２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、１.４４ｇ／Ｌリン酸二ナトリウム、０.２４０ｇ／Ｌリン酸カリウム、０.２ｇ／Ｌポリソルベート－２０（ｐＨ７.２）
ＰＢＳ：８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０.２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、１.４４ｇ／Ｌリン酸二ナトリウム、０.２４０ｇ／Ｌリン酸カリウム
ＴＳ：５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８.０、１ＭＮａＣｌ
ＨＫ：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８.０、１Ｍ ＫＣｌ
ＴＥ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０
ピラニア溶液：７５％過酸化水素（３０％）＋２５％硫酸
ＡＰＴＥＳ原液：５０％メタノール、４７.５％ＡＰＴＥＳ、２.５％ナノピュア水。４℃で少なくとも１時間熟成させる。４℃で保存する。
ＰＤＣ原液：ＤＭＳＯ中の０.５％ｗ／ｖ１,４－フェニレンジイソチオシアナート
【0320】
オリゴヌクレオチド（５’から３’へ）を注文する：
o1 CTGGAACGGTAAATTCAGAGACTGCGCTTTCCATTCTGGCTTTAATG
o3 GGAAAGCGCAGTCTCTGAATTTAC
N1 CTTACTGGAACGGCTATCGATATCGCAGCAGGACAGA
BN1 Biotin-CTTACTGGAACGGCTATCGATATCGCAGCAGGACAGA
N2 GTCCTGCTGCGATATCGATAGCCGTTCCAGTAAG
o1 CTGGAACGGTAAATTCAGAGACTGCGCTTTCCATTCTGGCTTTAATG
o3 GGAAAGCGCAGTCTCTGAATTTAC
N1 CTTACTGGAACGGCTATCGATATCGCAGCAGGACAGA
BN1 Biotin-CTTACTGGAACGGCTATCGATATCGCAGCAGGACAGA
N2 GTCCTGCTGCGATATCGATAGCCGTTCCAGTAAG
【0321】
オリゴヌクレオチド対のハイブリダイゼーションは、以下の通りに実行する：
１．オリゴの原液をＴＥバッファー中、１００ｕＭの濃度で作製する
２．オリゴをＰＢＳで１０μＭに希釈する
３．サーマルサイクラーで８５℃に５分間加熱する
４．３分間に５℃の勾配をつけて２５℃まで冷ます
５．４℃または－２０℃で保存する
１．オリゴの原液をＴＥバッファー中、１００ｕＭの濃度で作製する
２．オリゴをＰＢＳで１０μＭに希釈する
３．サーマルサイクラーで８５℃に５分間加熱する
４．３分間に５℃の勾配をつけて２５℃まで冷ます
５．４℃または－２０℃で保存する
【0322】
ストレプトアビジン結合：ＳｉＯ２へのストレプトアビジンの結合を、ＳｉＯ２被覆した磁気ビーズを使用して開発および試験し、次いで、そのプロトコールをＳｉＯ２チップに適合させた。ビオチン化オリゴのストレプトアビジンおよびＢＳＡ結合ビーズへの結合を試験する。予想通り、無視できる結合がＢＳＡ結合ビーズで観察され、強い結合がストレプトアビジン結合ビーズで観察される。図３８参照。結合を高塩濃度で実施するとより便利であろうから（ＤＮＡの移動を高塩濃度で実施する）、ビーズがＨＫバッファー中で結合する能力も試験する。ＨＫバッファー中の結合は、ＭＰＢＳバッファー中の結合に匹敵する（図３９）。
【0323】
オリガミコンストラクトを作製し、上記の通り、作動可能であることを図３５～３７で確認する。オリゴヌクレオチドを用いてオリガミ構造のビオチン化を試験する。上記図３７に示す「オリガミの」結果から、ＡｌｗＮＩ部位が活性であることが既にわかっている。オリガミＤＮＡの正確な配列のセグメントを再創成するオリゴヌクレオチド対を下記で使用する（ｏ１／ｏ３）。オリガミ分子を以下に示す：
【化21】
【0324】
オリゴ対ｏ１／ｏ３は、以下の通りである。
【化22】
【0325】
下記の反応に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、および、オリガミ配列の３’側のオーバーハングに相補的なビオチン化されたオリゴ（それは長いｓｓＤＮＡ配列に結合しており、ｓｓＤＮＡ配列はオリガミの他方の側に結合している）の存在下で、ＤＮＡをＡｌｗＮＩで切断する：
【化23】
【0326】
この戦略では、ＡｌｗＮ１は標的ＤＮＡを切断する。リガーゼを添加すると、このＤＮＡは再び連結され得るが、制限酵素は再度切断するであろう。しかしながら、（ｏ１／ｏ３の）（右の）断片がＢＮ１／Ｎ２に結合すると、制限部位は再創成されず、この生成物は切断されない。制限酵素の有無で試験することにより、特異的結合を確認する：
【表7】
【0327】
リガーゼ以外の全ての試薬を添加し、溶液を３７℃で６０分間インキュベートする。リガーゼを添加し、溶液を終夜１６℃でインキュベートする。１０ｘｌｉｇ ｂｕｆｆは、ＮＥＢ １０ｘ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファーを表す。リガーゼはＮＥＢ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼである。ｏ１／ｏ３およびｎ１／ｎ２は、上記の通り、アニールしたオリゴ対を表す。単位はマイクロリットルである。アガロースゲル分析は、ＡｌｗＮＩの存在下で、より大きい生成物が形成されることを確認し、それは、オリガミ構造に結合した長いｓｓＤＮＡアームに結合したビオチン化オリゴヌクレオチドに相当する。同様の戦略を、所望により、３’ビオチン化に使用する。
【0328】
ＤＮＡが電圧に誘導されてポアを通って移動することを検出するナノポアを形成および使用する能力、そのビオチンから遠い末端で結合した長いｓｓ領域を有するオリガミ分子の創成、ストレプトアビジンの二酸化ケイ素への結合、および、それを使用してビオチン化ＤＮＡを捕捉することを、上記で立証する。これらのツールを使用して、単一のＤＮＡ分子をナノポアの近くに結合させ、その動きを制御する。
【0329】
第１工程は、ストレプトアビジンをＳｉＯ２ナノポアの１つの表面に（そしてＢＳＡを他方の側に）結合させることである。これは、上記のプロトコールにより達成される。得られるポアは、それらが最初に有するよりも低い電流を有する傾向がある。いくつかの短い６ｖのパルスの後、電流を元の電流近くに戻す。この時点の機能しているナノポアを図４０に示す。
【0330】
次に、オリガミＤＮＡを挿入する。オリガミＤＮＡを適当なチャンバーに加え、電流を流すと、オリガミはチャンバーに入る。この代表例を図４１に示す。オリガミが最終濃度５０ｐＭで導入されたときの実験結果は、オリガミを有するＤＮＡが比較的早く（典型的には数秒で）ポアに入り、それがその結果としてのナノポアを流れる電流の減少（例えば、これらの実施例では、オリガミ挿入前の電流は約３ｎＡであり、挿入後は約２.５ｎＡである）により検出可能であることを裏付ける。電流がより長い時間流れれば、二重の挿入が観察できる。より高い濃度を使用すると、挿入が起こるのが早すぎて観察できない。
【0331】
挿入されたＤＮＡのチップへの結合。オリガミがナノポアに挿入された後、再度電圧をかけるまで、１５分間経過させる。オリガミのｓｓＤＮＡ領域の末端はビオチンを含み、ストレプトアビジンがナノポアの表面に結合している。ストレプトアビジンは共有結合に近い結合定数でアビジンに結合する。この１５分間は、ＤＮＡを拡散させ、ビオチン末端がストレプトアビジンを発見し結合することを可能にする。ＤＮＡが実際に表面に結合していたら、電圧を逆にしたときに観察される電流は以前よりもわずかに少ないはずである。また、電流を前後に切り換えると、空いているポアで見られるよりも低い電流を双方向でもたらすはずである。ここで示す実施例では、空いているポアは約３ｎＡの電流を示す。図４２は、結合したＤＮＡの代表例を示し、図４３は、結合したオリガミＤＮＡを切り換える電圧の実験結果を示す。双方向で見られる電流は約＋／－２.５ｎＡであり、空いているポアで観察される約＋／－３ｎＡよりも低いことに留意されたい。ＤＮＡが表面に結合していなかったら、電圧を切り換えると元の電流が回復するであろう（図４４）。
【0332】
オリガミ構造を除去するために、オリガミ構造を含むフローセルチャンバー内のバッファーを除去し、１ｕＬ Ｓｗａ１／２０Ｌを含む１ｘＳｗａ１バッファーで置き換える。他のフローセルチャンバー内のバッファーを、Ｓｗａ１を含まない１ｘＳｗａ１バッファーで置き換える。これを室温で６０分間インキュベートし、次いでＨＫバッファーで洗浄し、電圧をかける。図４５に示すＤＮＡの前進および後退は、図４６に示す実験データにより裏付けられ、固定されたＤＮＡがＳｉＯ２ナノポアを通って制御されて動くことを示す。
【0333】
実施例８－ポリマーをナノポアに隣接する表面に結合させる代替的手段
上述の実施例は、ＤＮＡをビオチン化し、結合表面をストレプトアビジンで被覆することによる、ナノポアに隣接する表面へのＤＮＡの結合を記載する。ポリマー結合のいくつかの代替的手段を図４７に示す。
ａ）ＤＮＡハイブリダイゼーション：ある方法では、本発明の方法において伸長されるＤＮＡを、ナノポアの近傍に結合している短いオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。合成が完了したら、合成されたＤＮＡは制限酵素を必要とせずに容易に取り出すことができ、または、結合したオリゴヌクレオチドと合成されたＤＮＡにより形成される二本鎖は、制限酵素の基質を提供できる。この実施例では、ビオチン－ストレプトアビジンを用いて短いオリゴマーを表面に結合させるか、または、以下の通り、１,４－フェニレンジイソチオシアナートを使用して連結させる：
上述の実施例は、ＤＮＡをビオチン化し、結合表面をストレプトアビジンで被覆することによる、ナノポアに隣接する表面へのＤＮＡの結合を記載する。ポリマー結合のいくつかの代替的手段を図４７に示す。
ａ）ＤＮＡハイブリダイゼーション：ある方法では、本発明の方法において伸長されるＤＮＡを、ナノポアの近傍に結合している短いオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。合成が完了したら、合成されたＤＮＡは制限酵素を必要とせずに容易に取り出すことができ、または、結合したオリゴヌクレオチドと合成されたＤＮＡにより形成される二本鎖は、制限酵素の基質を提供できる。この実施例では、ビオチン－ストレプトアビジンを用いて短いオリゴマーを表面に結合させるか、または、以下の通り、１,４－フェニレンジイソチオシアナートを使用して連結させる：
【0334】
ビオチン化ＤＮＡのＳｉＯ２への結合：
Ａ．シラン処理：
１．予処理：ｎｈａ溶液３０分間、再蒸留Ｈ２Ｏ（ｄｄＨ２Ｏ）で洗浄する
２．ＡＰＴＥＳ原液の調製：５０％ＭｅＯＨ、４７.５％ＡＰＴＥＳ、２.５％ナノピュアＨ２Ｏ：熟成＞１時間４℃
３．ＡＰＴＥＳ原液をＭｅＯＨ中で１：５００に希釈する
４．チップを室温でインキュベートする
５．ＭｅＯＨですすぐ
６．乾燥させる
７．１１０℃で３０分間加熱する
Ａ．シラン処理：
１．予処理：ｎｈａ溶液３０分間、再蒸留Ｈ２Ｏ（ｄｄＨ２Ｏ）で洗浄する
２．ＡＰＴＥＳ原液の調製：５０％ＭｅＯＨ、４７.５％ＡＰＴＥＳ、２.５％ナノピュアＨ２Ｏ：熟成＞１時間４℃
３．ＡＰＴＥＳ原液をＭｅＯＨ中で１：５００に希釈する
４．チップを室温でインキュベートする
５．ＭｅＯＨですすぐ
６．乾燥させる
７．１１０℃で３０分間加熱する
【0335】
結合：
１．チップをＰＤＣ原液で５時間（室温）処理する（ＰＤＣ原液：ＤＭＳＯ中の０.５％ｗ／ｖ１,４－フェニレンジイソチオシアナート）
２．ＤＭＳＯで２回洗浄する（短く）
３．ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄する（短く）
４．ｄｄＨ２Ｏ（ｐＨ８）中、１００ｎＭアミノ修飾ＤＮＡ、Ｏ／Ｎ３７℃
５．２８％アンモニア溶液で２回洗浄する（不活性化）
６．ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄する
１．チップをＰＤＣ原液で５時間（室温）処理する（ＰＤＣ原液：ＤＭＳＯ中の０.５％ｗ／ｖ１,４－フェニレンジイソチオシアナート）
２．ＤＭＳＯで２回洗浄する（短く）
３．ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄する（短く）
４．ｄｄＨ２Ｏ（ｐＨ８）中、１００ｎＭアミノ修飾ＤＮＡ、Ｏ／Ｎ３７℃
５．２８％アンモニア溶液で２回洗浄する（不活性化）
６．ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄する
【0336】
結合したオリゴヌクレオチドに相補的な末端配列を有する一本鎖ＤＮＡを、上記の通りに導入し、結合したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。
【0337】
ｂ）クリックケミストリー：クリックケミストリーとは、簡潔かつ熱力学的に効率的で、毒性または高反応性の副生成物を創成せず、水または生物適合性溶媒中で行われ、目的の物質を特定の生体分子に結合させるのにしばしば使用される反応についての、一般的な用語である。この場合のクリック結合は、ａ）でオリゴヌクレオチドの結合に使用されたのと同様の化学を使用するが、ここでは、本発明の方法において合成の過程で伸長されるポリマーを結合するのにそれだけが使用される。この実施例ではＤＮＡはポリマーであるが、この化学は、適合するアジド基の付加により官能化された他のポリマーを結合させるのにも使える。
【0338】
シラン処理：
１．予処理：ピラニア溶液３０分間、ｄｄＨ２Ｏで洗浄する
２．ＰＳ（プロパルギルシラン）原液の調製：５０％ＭｅＯＨ、４７.５％ＰＳ、２.５％ナノピュアＨ２Ｏ：熟成＞１時間、４Ｃ
３．ＡＰＴＥＳ原液をＭｅＯＨで１：５００に希釈する
４．チップを室温でインキュベートする
５．ＭｅＯＨですすぐ
６．乾燥させる
７．１１０℃で３０分間加熱する
１．予処理：ピラニア溶液３０分間、ｄｄＨ２Ｏで洗浄する
２．ＰＳ（プロパルギルシラン）原液の調製：５０％ＭｅＯＨ、４７.５％ＰＳ、２.５％ナノピュアＨ２Ｏ：熟成＞１時間、４Ｃ
３．ＡＰＴＥＳ原液をＭｅＯＨで１：５００に希釈する
４．チップを室温でインキュベートする
５．ＭｅＯＨですすぐ
６．乾燥させる
７．１１０℃で３０分間加熱する
【0339】
アジド官能基で終結するＤＮＡは、この表面に共有結合する（図４７に示す通り）。アジドで終結するオリゴを注文し、先にＤＮＡへのビオチンの付加について記載した通り、より長いオリガミＤＮＡに結合させる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【配列表】