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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-30
(45)【発行日】2024-09-09
(54)【発明の名称】アレルギー疾患を処置することに用いるための組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/00 20060101AFI20240902BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240902BHJP
A61K 47/56 20170101ALI20240902BHJP
C12Q 1/6897 20180101ALI20240902BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240902BHJP
【ＦＩ】
A61K39/00 H
A61P37/08
A61K47/56
C12Q1/6897 ZNA
G01N33/15 Z
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021504064
(86)(22)【出願日】2020-02-28
(86)【国際出願番号】 JP2020008427
(87)【国際公開番号】W WO2020179700
(87)【国際公開日】2020-09-10
【審査請求日】2022-12-07
(31)【優先権主張番号】P 2019037353
(32)【優先日】2019-03-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2019086233
(32)【優先日】2019-04-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２７年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、革新的先端研究開発支援事業「アレルギー疾患・自己免疫疾患などの発症機構と治療技術」委託事業、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】504171134
【氏名又は名称】国立大学法人 筑波大学
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(72)【発明者】
【氏名】渋谷 彰
(72)【発明者】
【氏名】金丸 和正
【審査官】伊藤 基章
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５０７９４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５３４８２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５３４２００（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／００２４９６１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】加藤紀彦，シグレックとムチン糖鎖の相互作用を介した炎症抑制機構 ムチン糖鎖のアレルギー性免疫応答における役割，化学と生物，2016年，Vol. 54, No. 6，pp. 375-6，ISSN: 1883-6852
【文献】角田義弥, 外3名，気道ムチン糖鎖はSiglec-Fリガンドとして好酸球のアポトーシスを誘導する，臨床免疫・アレルギー科，2016年，Vol. 65, No. 5，pp. 468-71，ISSN: 1881-7930
【文献】KANEMARU, K. et al.，Clec10a regulates mite-induced dermatitis，Sci Immunol，Vol. 4, No. 42，2019年12月06日，Article No. eaax6908, pp. 1-14，ISSN: 2470-9468
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３９／００
Ａ６１Ｋ ３８／００
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ｃ１２Ｎ ５／００
Ｃ１２Ｎ １５／００
Ｃ１２Ｑ １／００
Ｇ０１Ｎ ３３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドを含む、アレルギー疾患を処置することに用いるための組成物であって、リガンドは、Ｔ抗原、Ｔｎ抗原、およびＬｅＡからなる群から選択される少なくとも１種の糖鎖を含み、Ａｓｇｒ１に結合することによって当該受容体の下流シグナルを正に制御する、組成物｛但し、前記リガンドは、ムチンでもムチン様タンパク質でもなく、かつ、ＬｅＸを含まない｝。
【請求項2】
アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドを含む、アレルギー疾患を処置することに用いるための組成物であって、リガンドが、Ｔ抗原、Ｔｎ抗原、およびＬｅＡからなる群から選択される少なくとも１種の糖鎖を提示するポリマー性の足場を含み、Ａｓｇｒ１に結合することによって当該受容体の下流シグナルを正に制御する、組成物｛但し、前記リガンドは、ムチンでもムチン様タンパク質でもなく、かつ、ＬｅＸを含まない｝。
【請求項3】
リガンドが、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１のリガンドである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
ポリマー性の足場が、１ｋＤａ～１００ｋＤａの重量平均分子量を有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項5】
ポリマー性の足場が、ポリ乳酸、ポリアクリルアミド、ポリビニル、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリルニトリル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタラート、ナイロン、コラーゲン、ヒドロキシエチルメタクリレート、キトサン、キチン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、およびこれらの共重合体からなる群から選択される、請求項２または４に記載の組成物。
【請求項6】
アレルギー疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、じんましん、アレルギー性喘息、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎およびアナフィラキシーショックからなる群から選択される１以上である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
アレルギー疾患が、チリダニを原因とするものである、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
被検化合物が、アレルギー疾患を処置することに用いるための物質であることを検査する方法であって、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）の細胞外領域と膜貫通領域とＣＤ３ζの細胞内領域を含む融合タンパク質を発現する動物細胞であって、ＣＤ３ζシグナルで活性化するプロモーターと作動可能に連結したレポーターをコードする遺伝子を有する動物細胞と被検化合物とを接触させることと、
レポーターの発現レベルが増強した場合に、当該被検化合物がＡｓｇｒ１に結合することによって当該受容体の下流シグナルを正に制御し、アレルギー疾患を処置することに用いるための物質であると決定すること
を含む、方法。
【請求項9】
アレルギー疾患を処置することに用いるための物質を取得する方法であって、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１に結合する物質群から、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１の細胞外領域と膜貫通領域とＣＤ３ζの細胞内領域を含む融合タンパク質を発現する動物細胞であって、ＣＤ３ζシグナルで活性化するプロモーターと作動可能に連結したレポーターをコードする遺伝子を有する動物細胞と物質とを接触させるレポーターアッセイにおいて前記レポーターの発現レベルを増強させる物質を選択または取得することを含み、前記レポーターの発現レベルを増強させることは、当該物質がアレルギー疾患の処置に有効であることを示す、方法。
【請求項10】
請求項９に記載の方法であって、得られた物質が、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１の下流で抑制性ＩＴＡＭを介する制御性シグナリングを正に制御することを確認することをさらに含む、方法。
【請求項11】
得られた物質を含む組成物を得ることをさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項12】
請求項９または１０に記載の方法であって、得られた物質がＴＬＲ４シグナルにより誘発される炎症またはアレルギー性疾患の処置に有効であることを確認することをさらに含む、方法。
【請求項13】
請求項１２に記載の方法であって、ＴＬＲ４シグナルにより誘発される炎症またはアレルギー性疾患が、チリダニ（ＨＤＭ）により誘発される炎症またはアレルギー性疾患である、方法。
【請求項14】
請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法であって、前記物質がチリダニ（ＨＤＭ）抽出物を含む、方法。
【請求項15】
請求項９～１４のいずれか一項に記載の方法であって、前記物質が脱シアリル化した糖タンパク質またはアシアロ糖タンパク質を含む、方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アレルギー疾患を処置することに用いるための組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
チリダニ（ＨＤＭ）は、アトピー性皮膚炎や喘息などのアレルギー疾患の主なアレルゲンである（非特許文献１および２）。ＮＣ／ＮｇａマウスはＨＤＭに対して感受性を有するマウス系統であり、ＨＤＭに対して他の系統と比較してより重度の皮膚炎を発症する（非特許文献３）。しかしながら、その発症機序についてはほとんど明らかにされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【文献】Ｂｉｅｂｅｒ， Ｔ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３５８： １４８３－１４９４， ２００８
【文献】Ｊａｃｑｕｅｔ， Ａ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．， １７： ６０４－６１１， ２０１１
【文献】Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． Ｒｅｓ．， ３０１： ７３９－７４６， ２００９
【発明の概要】
【0004】
本発明は、アレルギー疾患を処置することに用いるための組成物を提供する。
【0005】
本発明者らは、チリダニによる皮膚炎の発症や悪化に、マウスでは、Ｃｌｅｃ１０ａが関与することを明らかにした。本発明者らはまた、ヒトでは、Ｃｌｅｃ１０ａの構造的機能的カウンターパートがＡｓｇｒ１であることを明らかにし、また、チリダニによる皮膚炎の発症や悪化に、ヒトでは、Ａｓｇｒ１が関与することを明らかにした。発明者らはさらに、チリダニには、マウスＣｌｅｃ１０ａおよびヒトＡｓｇｒ１に結合する物質であって、かつ、アレルギー発生を抑制する物質（例えば、Ｃｌｅｃ１０ａリガンドまたはＡｓｇｒ１リガンド）が含まれていることを明らかにした。発明者らはさらに、Ｃｌｅｃ１０ａのリガンドが、Ｏ結合型糖鎖、特に、Ｔ抗原（Ｇａｌβ（１－３）ＧａｌＮＡｃ）、Ｔｎ抗原（αＧａｌＮＡｃ）を含み、ＡＳＧＲ１がこれらのいずれにも結合することを明らかにした。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【0006】
すなわち、本発明によれば、例えば以下に示される発明が提供される。
（１）アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドを含む、アレルギー疾患を処置することに用いるための組成物。
（２）アレルギー疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、じんましん、アレルギー性喘息、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎およびアナフィラキシーショックからなる群から選択される１以上である、上記（１）に記載の組成物。
（３）アレルギー疾患が、チリダニを原因とするものである、上記（１）または（２）に記載の組成物。
（４）リガンドが、Ｔ抗原およびＴｎ抗原のいずれか、または両方を含む、上記（１）～（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）リガンドが、Ｔ抗原およびＴｎ抗原からなる群から選択される糖鎖である、上記（１）～（３）のいずれかに記載の組成物。
（６）リガンドが、ムチン様タンパク質またはムチンである、上記（１）～（４）のいずれかに記載の組成物。
（７）リガンドが、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１のリガンドである、上記（１）～（６）のに記載の組成物。
本発明によればまた、以下の発明が提供される。
（１Ａ）アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドを含む、アレルギー疾患を処置することに用いるための組成物。
（２Ａ）アレルギー疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、じんましん、アレルギー性喘息、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎およびアナフィラキシーショックからなる群から選択される１以上である、上記（１Ａ）に記載の組成物。
（３Ａ）アレルギー疾患が、チリダニを原因とするものである、上記（１Ａ）または（２Ａ）に記載の組成物。
（４Ａ）リガンドが、Ｔ抗原、Ｔｎ抗原、ＬｅＡ、およびＬｅｘからなる群から選択される少なくとも１種の糖鎖を含む、上記（１Ａ）～（３Ａ）のいずれかに記載の組成物。
（５Ａ）リガンドが、Ｔ抗原、Ｔｎ抗原、ＬｅＡ、およびＬｅｘからなる群から選択される少なくとも１種の糖鎖を提示するポリマー性の足場を含む、上記（１Ａ）～（３Ａ）のいずれかに記載の組成物。
（６Ａ）リガンドが、ムチン様タンパク質またはムチンである、上記（１Ａ）～（４Ａ）のいずれかに記載の組成物。
（７Ａ）リガンドが、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１のリガンドである、上記（１Ａ）～（６Ａ）のに記載の組成物。
（８Ａ）ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１の細胞外領域と膜貫通領域とＣＤ３ζの細胞内領域を含む融合タンパク質を発現する動物細胞であって、ＣＤ３ζシグナルで活性化するプロモーターと作動可能に連結したレポーターをコードする遺伝子を有する動物細胞。
（９Ａ）被検化合物が、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１を活性化する化合物であることを検査する方法であって、
上記（８Ａ）に記載の細胞と被検化合物とを接触させることと、
レポーターの発現レベルが増強した場合に、当該被検化合物がヒトアシアロ糖タンパク質受容体１に結合する化合物であると決定すること
を含む、方法。
（１）アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドを含む、アレルギー疾患を処置することに用いるための組成物。
（２）アレルギー疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、じんましん、アレルギー性喘息、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎およびアナフィラキシーショックからなる群から選択される１以上である、上記（１）に記載の組成物。
（３）アレルギー疾患が、チリダニを原因とするものである、上記（１）または（２）に記載の組成物。
（４）リガンドが、Ｔ抗原およびＴｎ抗原のいずれか、または両方を含む、上記（１）～（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）リガンドが、Ｔ抗原およびＴｎ抗原からなる群から選択される糖鎖である、上記（１）～（３）のいずれかに記載の組成物。
（６）リガンドが、ムチン様タンパク質またはムチンである、上記（１）～（４）のいずれかに記載の組成物。
（７）リガンドが、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１のリガンドである、上記（１）～（６）のに記載の組成物。
本発明によればまた、以下の発明が提供される。
（１Ａ）アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドを含む、アレルギー疾患を処置することに用いるための組成物。
（２Ａ）アレルギー疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、じんましん、アレルギー性喘息、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎およびアナフィラキシーショックからなる群から選択される１以上である、上記（１Ａ）に記載の組成物。
（３Ａ）アレルギー疾患が、チリダニを原因とするものである、上記（１Ａ）または（２Ａ）に記載の組成物。
（４Ａ）リガンドが、Ｔ抗原、Ｔｎ抗原、ＬｅＡ、およびＬｅｘからなる群から選択される少なくとも１種の糖鎖を含む、上記（１Ａ）～（３Ａ）のいずれかに記載の組成物。
（５Ａ）リガンドが、Ｔ抗原、Ｔｎ抗原、ＬｅＡ、およびＬｅｘからなる群から選択される少なくとも１種の糖鎖を提示するポリマー性の足場を含む、上記（１Ａ）～（３Ａ）のいずれかに記載の組成物。
（６Ａ）リガンドが、ムチン様タンパク質またはムチンである、上記（１Ａ）～（４Ａ）のいずれかに記載の組成物。
（７Ａ）リガンドが、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１のリガンドである、上記（１Ａ）～（６Ａ）のに記載の組成物。
（８Ａ）ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１の細胞外領域と膜貫通領域とＣＤ３ζの細胞内領域を含む融合タンパク質を発現する動物細胞であって、ＣＤ３ζシグナルで活性化するプロモーターと作動可能に連結したレポーターをコードする遺伝子を有する動物細胞。
（９Ａ）被検化合物が、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１を活性化する化合物であることを検査する方法であって、
上記（８Ａ）に記載の細胞と被検化合物とを接触させることと、
レポーターの発現レベルが増強した場合に、当該被検化合物がヒトアシアロ糖タンパク質受容体１に結合する化合物であると決定すること
を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】図１は、ＮＣ／ＮｇａマウスにおけるＣｌｅｃ１０ａのナンセンス変異がＨＤＭ誘発性皮膚炎を引き起こすことを示す図である。パネルａは、Ｃｌｅｃ１０ａ遺伝子と、Ｃ５７ＢＬ／６ＪのＣｌｅｃ１０ａ（ＮＭ＿０１０７９６）、ＮＣ／Ｎｇａ－Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｔ（ｃ．７０６Ｔ／Ｔ）、およびＮＣ／Ｎｇａ－Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｃ（ｃ．７０６Ｔ／Ｃ）マウスにおけるナンセンス変異部位（ｃ．７０６）のＤＮＡ配列とを示す。Ｃｌｅｃ１０ａの全長が複数の白抜きの四角とそれを貫く線によって表され、白抜きの四角は遺伝子のコード領域を表し、線はイントロンを示す。ＣＴＬＤは、ｃ型レクチン様ドメインを表す。パネルｂは、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＮＣ／ＮｇａマウスのそれぞれのＣｌｅｃ１０ａの模式図を示す。ＴＭは、膜貫通ドメインを表す。パネルｃは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＮＣ／Ｎｇａ－Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｔマウス、ＮＣ／Ｎｇａ－Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｃマウスの背側皮膚のＰＩ－ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋Ｌｉｎｅａｇｅ（ＣＤ３， ＣＤ１９， ＮＫ１．１， およびＬｙ－６Ｇ）－ＥｐＣＡＭ－細胞における、マクロファージ（ＭＰ）（ＣＤ６４＋ＭｅｒＴＫ＋）、従来型ＤＣ（ｃＤＣ）（ＣＤ６４－ＭｅｒＴＫ－）、および単球由来樹状細胞（ＣＤ６４－ＭｅｒＴＫｌｏ）の細胞表面のＣｌｅｃ１０ａの発現を示す。影付きのヒストグラムは、アイソタイプコントロール抗体（Ａｂ）を用いた染色を示す。パネルｄは、抗Ｃｌｅｃ１０ａモノクローナル抗体（ｍＡｂ）および４′，６－ジアミジノ－２－フェニリンドール（ＤＡＰＩ）で染色された、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＮＣ／Ｎｇａ－Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｔマウス、ＮＣ／Ｎｇａ－Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｃマウスの背側の皮膚の組織切片の蛍光顕微鏡像を示す。Ｅは、表皮、Ｄは、真皮を表す。スケールバーは、１００μｍである。パネルｅ～ｉは、ＮＣ／Ｎｇａ－Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｔマウス、ＮＣ／Ｎｇａ－Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｃマウスの背側皮膚に週２回、ＨＤＭ軟膏を適用した結果を示す。パネルｅは、皮膚炎スコアを示し、パネルｆは、１４日目における外観を示し、パネルｇおよびｈは、組織切片（ヘマトキシリン・エオシン染色）と上皮厚をそれぞれ示す。パネルｉは、好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ－６Ｇ＋）、好酸球（ＣＤ１１ｂ＋Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ＋）、およびＬｙ－６Ｃｈｉ単球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ－６Ｇ－Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ－Ｌｙ－６Ｃｈｉ）の個体総数を示す。＊は、ｐ ＜ ０．０５を表し、＊＊はｐ ＜ ０．０１を表し、＊＊＊は、ｐ ＜ ０．００１を表す（独立両側Ｓｔｕｄｅｎｔ′ｓ ｔ－検定）。データは、平均値±ＳＥＭを示す。
【図2】図２は、Ｃｌｅｃ１０ａがＨＤＭ誘発性の免疫応答を阻害することを示す。パネルａ～ｆは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスとＣｌｅｃ１０ａ－／－マウスの背側皮膚に週２回、ＨＤＭ軟膏を適用した結果を示す。パネルａおよびｂは、特定時点における組織と上皮厚をそれぞれ示す（ｎ＝３，６，５）。パネルｃおよびｄは、野生型マウスとＣｌｅｃ１０ａ－／－マウス間での比較を示す。パネルｅは、特定時点における野生型マウスとＣｌｅｃ１０ａ－／－マウスの皮膚ＣＤ４５＋細胞中の好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ－６Ｇ＋）を同定するフローサイトメトリを示す。パネルｆは、ＨＤＭの局所適用の３時間後における皮膚のＷＴおよびＣｌｅｃ１０ａ－／－のＭＨＣＩＩ＋のＭＰおよびＤＣから得られたｍＲＮＡの定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果である。パネルｇは、ＨＤＭで刺激した野生型またはＣｌｅｃ１０ａ－／－のＣＤ１１５＋で濃縮したＢＭＭＰからの培養上清のｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）分析の結果を示す（ｎ＝３）。パネルｈは、野生型、Ｔｌｒ４－／－、およびＣｌｅｃ１０ａ－／－のＢＭＭＰをＨＤＭで指定した時間刺激し、その後、その溶解物をＣｌｅｃ１０ａ抗体を用いた免疫沈降（ＩＰ）に供した結果を示す。イムノブロット分析（ＩＢ）は、リン酸化チロシン（ｐＴｙｒ）またはＣｌｅｃ１０ａに対する抗体を用いて行った。パネルｉは、０．５μＭのＴＡＫ－２４２で事前処理し、ＨＤＭで６時間刺激した野生型またはＣｌｅｃ１０ａ－／－のＣＤ１１５＋で濃縮したＢＭＭＰからの培養上清のｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）分析の結果を示す（ｎ＝３）。パネルｊは、野生型またはＣｌｅｃ１０ａ－／－のＣＤ１１５＋で濃縮したＢＭＭＰをＨＤＭで指定した時間刺激し、その後、リン酸化Ｓｙｋ（ｐＳｙｋ； Ｙ５１９／５２０）またはＳｙｋに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いてイムノブロット（ＩＢ）した結果を示す。パネルｋは、野生型もしくはＹ３ＦのＣｌｅｃ１０ａで、または空のベクター（ＥＶ）でトランスフェクションしたＢＭＭＰをＨＤＭで刺激し、細胞溶解物をＣｌｅｃ１０ａに対するｍＡｂで免疫沈降し、Ｓｙｋ、ＳＨＰ－１またはＣｌｅｃ１０ａに対する抗体でイムノブロットした結果を示す。パネルｌは、野生型とＣｌｅｃ１０ａ－／－のＢＭＭＰをＳｙｋ阻害剤ＩＶで前処理し、指定した時間ＨＤＭで刺激して、細胞溶解物をＣｌｅｃ１０ａの抗体でＩＰし、ｐＳＨＰ－１、ＳＨＰ－１またはＣｌｅｃ１０ａに対する抗体でイムノブロットした結果を示す。矢尻は、目的の分子（黒）、またはＩＰ－Ａｂ（白）の重鎖を示す。＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す（独立両側Ｓｔｕｄｅｎｔ′ｓ ｔ－検定）。データは、平均値±ＳＥＭを示す。
【図3】図３は、Ｃｌｅｃ１０ａがＨＤＭのムチン様タンパク質を認識することを示す。パネルａ～ｄは、マウスＣｌｅｃ１０ａ－ＣＤ３ζレポーター細胞または親レポーター細胞における、ラットＩｇＧ２ａもしくは抗Ｃｌｅｃ１０ａ ｍＡｂ（パネルａおよびｂ）、もしくは、ガラクトース（Ｇａｌ）、グルコース（Ｇｌｃ）もしくはマンノース（Ｍａｎ）（パネルｃ）の存在下もしくは非存在下におけるＨＤＭコートプレートで刺激した後の；またはガラクトシダーゼ（ＧＡＬａｓｅ）もしくはグルコシダーゼ（ＧＬＣａｓｅ）で処理したまたは未処理のＨＤＭコートプレート（パネルｄ）で刺激した後のＧＦＰの発現を示す。パネルｅ～ｉは、Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｆｃまたはコントロールヒト抗体でプルダウン（ＰＤ）したＨＤＭ中のＣｌｅｃ１０ａリガンド（Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌ）（パネルｅ）、Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌのサイズに基づく各分画（パネルｆ）、またはＰＮＧａｓｅ ＦもしくはＮａＯＨの処理前後のＣｌｅｃ１０ａ－Ｌ（パネルｉ）で刺激した後のマウスＣｌｅｃ１０ａ－ＣＤ３ζレポーター細胞またはコントロールレポーター細胞におけるＧＦＰの発現を示す。統計学的分析は、コントロールとして用いたＰＢＳ刺激サンプルを用いて実施した（パネルｆ）。Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌは、ＰＮＧａｓｅ ＦもしくはＮａＯＨでの処理前（パネルｆ～ｈ）または処理後（パネルｈ）にＣｌｅｃ１０ａ－Ｆｃを用いてイムノブロットするか、または、アルシアンブルー有りもしくは無しで銀染色（パネルｇ）した。パネルｊは、Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌのレクチンマイクロアレイ分析を示す。黒の棒は、Ｇａｌβ（１－３）ＧａｌＮＡｃ（Ｔ抗原）に結合するレクチンを示す。ＧａｌＮＡｃは、Ｎ－アセチルガラクトサミンを意味し、ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミンを意味する。パネルｋは、ＨＤＭのＣｌｅｃ１０ａ－Ｌの模式図を示す。Ｔは、Ｔ抗原（Ｇａｌβ（１－３）ＧａｌＮＡｃ）を意味し、Ｔｎは、Ｔｎ抗原（αＧａｌＮＡｃ）を意味し、ＬａｃＮＡｃは、Ｎ－アセチル－Ｄ－ラクトサミン（Ｇａｌβ（１－４）ＧｌｃＮＡｃ）を意味する。＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す（片側ＡＮＯＶＡ検定（パネルｃおよびｆ）または独立両側Ｓｔｕｄｅｎｔ′ｓ ｔ－検定（パネルｂ、ｄおよびｉ））。データは、平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。
【図4】図４は、ヒトＡｓｇｒ１がマウスＣｌｅｃ１０ａの構造的かつ機能的カウンターパートであることを示す。パネルａおよびｂは、ガラクトース、グルコースもしくはマンノースの非存在下（パネルａ）または存在下（パネルｂ）におけるＨＤＭコートプレートで刺激した後のヒトＡｓｇｒ１－ＣＤ３ζレポーター細胞におけるＧＦＰの発現を示す（ｎ＝３）。パネルｃは、マウスＣｌｅｃ１０ａ、ヒトＡｓｇｒ１、およびヒトＣｌｅｃ１０ａの細胞内領域のアミノ酸配列を示す。推定されるｈｅｍＩＴＡＭ配列を下線で示す。パネルｄは、マウスＣｌｅｃ１０ａ－ＦｃでＨＤＭからプルダウンして得られたＣｌｅｃ１０ａリガンドでコートされたプレートで刺激したヒトＡｓｇｒ１－ＣＤ３ζレポーター細胞におけるＧＦＰ発現を示す。パネルｅは、ヒト皮膚の組織切片を抗Ａｓｇｒ１抗体、抗ＣＤ６８ ｍＡｂおよびＤＡＰＩで染色した結果を示す。Ｅは、表皮を意味し、Ｄは、真皮を意味する。スケールバーは、１００μｍである。パネルｆは、ＡＳＧＲ１に特異的なｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡで処理し、１００μｇ／ｍＬのＨＤＭで６時間刺激したヒトＣＤ１４＋単球由来ＭＰの培養上清のｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ （ＣＢＡ）分析の結果を示す（ｎ＝３）。パネルｇは、健常者、乾癬患者、およびアトピー性皮膚炎患者の皮膚におけるＡＳＧＲ１の発現（ＧＳＥ５６６７）と血清ＩｇＥ価との関連を示す。パネルｈは、マウスおよびヒトにおけるＨＤＭへの暴露に際しての皮膚の恒常性維持におけるＣ型レクチン受容体の働きについての仮説モデルを示す。＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す（片側ＡＮＯＶＡ検定（パネルｂ）、独立両側Ｓｔｕｄｅｎｔ′ｓ ｔ－検定（パネルｆ）または両側ピアソン相関検定（パネルｇ））。データは、平均値±ＳＥＭを示す。
【図5】図５は、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスとＮＣ／ＮｇａマウスにおけるＣｌｅｃ１０ａの特徴分析の結果を示す。パネルａは、ＢｉｏＧＰＳ分析に基づくＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの造血細胞と組織における遺伝子発現の結果を示す。これらの遺伝子は、ＮＣ／Ｎｇａマウスにおいてのみナンセンス変異またはフレームシフト変異を示すが、他の１９のマウス系統ではそのような変異は認められないことが明らかとなった。パネルｂ～ｅおよびｉは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＮＣ／Ｎｇａマウス、ＮＣ／Ｎｇａ－Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｃマウスの背側の皮膚（パネルｂ、ｃ、およびｄ）または腹腔（パネルｅおよびｉ）から単離された細胞のフローサイトメトリ分析の結果を示す。細胞は、プロピジウムイオダイド（ＰＩ）、指定されたマーカーに対する抗体、および抗Ｃｌｅｃ１０ａ抗体またはコントロール抗体で染色された。Ｌｉｎｅａｇｅは、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＮＫ１．１、およびＬｙ－６Ｇを示す。影付きのヒストグラムは、アイソタイプコントロール抗体による染色を示す。パネルｆおよびｇは、Ｆｌａｇタグ付きのＣｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｃ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰまたはＦｌａｇタグ付きのＣｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰを発現するＲＡＷ２６４．７の形質転換体について表面分析した結果（パネルｆ）およびフローサイトメトリによるＦｌａｇタグの細胞内発現（パネルｇ）を示す。パネルｈは、ＮＣ／Ｎｇａ Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｔ（Ｔ／Ｔ）、Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｃ（Ｔ／Ｃ）、およびＣｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｃ／Ｃ（Ｃ／Ｃ）マウスの皮膚におけるＣｌｅｃ１０ａのｍＲＮＡの発現を示す。パネルｊは、指定された時点における血清ＩｇＥ価を、Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｔ（Ｔ／Ｔ）、Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｃ（Ｔ／Ｃ）とで比較した結果を示す。＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す（片側ＡＮＯＶＡ検定）。データは、平均値±ＳＥＭを示す。
【図6】図６は、Ｃｌｅｃ１０ａ欠損マウスにおけるＨＤＭ誘発性の皮膚炎の表現型を示す。チリダニ（ＨＤＭ）軟膏を野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＣｌｅｃ１０ａ－／－マウスの背側皮膚に週に２回適用した。パネルａは、指定された時点において回収された皮膚細胞をＰＩ、抗ＣＤ４５抗体、またはマーカー分子に対する抗体で染色した後の、それぞれの細胞集団のフローサイトメトリによる分析結果を示す。各細胞のマーカーは以下の通りであった：好酸球（ＣＤ１１ｂ＋Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ＋）、およびＬｙ－６Ｃｈｉ単球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ－６Ｇ－Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ－Ｌｙ－６Ｃｈｉ）、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）、上皮γδ Ｔ細胞（ＣＤ３ｈｉＴＣＲγδｈｉ）、真皮γδ Ｔ細胞（ＣＤ３ｍｉｄＴＣＲγδｍｉｄ）、ＣＤ１１ｂ＋の従来型樹状細胞（ｃＤＣ）（ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ６４－）、ＭＨＣＩＩ＋マクロファージ（ＭＰ）、モノサイト由来ＤＣ（ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ－ＣＤ６４＋）。パネルｂは、指定した時点における血清Ｉｇ価のＥＬＩＳＡである（ｎ＝５）。パネルｃは、６日目の腋窩リンパ節および鼠径リンパ節からソートされた野生型およびＣｌｅｃ１０ａ－／－型のＣＤ４＋ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）における指定された分子のｍＲＮＡの発現レベルの定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。＊＊はＰ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す（独立両側Ｓｔｕｄｅｎｔ′ｓ ｔ－検定）。データは、平均値±ＳＥＭを示す。
【図7】図７は、野生型およびＣｌｅｃ１０ａ－／－型ＭＰの特性分析の結果を示す。パネルａは、ＨＤＭの局所適用の３時間後のマウス皮膚から得られたＭＰ（ＰＩ－ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋Ｌｉｎｅａｇｅ（ＣＤ３， ＣＤ１９， ＮＫ１．１，およびＬｙ－６Ｇ）－ＥｐＣＡＭ－ＣＤ６４＋）およびＤＣ（ＰＩ－ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋Ｌｉｎｅａｇｅ－ＥｐＣＡＭ－ＣＤ６４－）のソーティングのゲート戦略を示す。パネルｂは、野生型およびＣｌｅｃ１０ａ－／－型マウスに由来するＣＤ１１５＋のＢＭＭＰのソーティングに関するゲート戦略を示す。パネルｃは、野生型およびＣｌｅｃ１０ａ－／－型マウスに由来するＢＭＭＰをＣＤ１１５、Ｃｌｅｃ１０ａ、指定されたＭＰマーカー、およびＴＬＲ４に対する抗体で染色した結果を示す。ＣＤ１１５＋細胞をゲートし、各分子の発現をフローサイトメトリで分析した。影付きのヒストグラムは、アイソタイプコントロール抗体による染色である。パネルｄは、ＨＤＭ刺激後のＣｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｔ（Ｔ／Ｔ）、およびＣｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｃ（Ｔ／Ｃ）マウスに由来するＢＭＭＰの培養上清のｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）分析の結果を示す（ｎ＝３）。パネルｅは、野生型およびＹ３Ｆ変異型のＣｌｅｃ１０ａの細胞内領域のアミノ酸配列を示す。推定ｈｅｍＩＴＡＭ配列は下線を付されている。パネルｆおよびｇは、野生型およびＹ３Ｆ変異型のＣｌｅｃ１０ａをコードするｃＤＮＡまたは空ベクターをトランスフェクトしたＢＭＭＰの細胞表面におけるＣｌｅｃ１０ａの発現を示す。影付きのヒストグラムは、アイソタイプコントロール抗体による染色を示す（パネルｆ）。トランスフェクトされた細胞は、ＨＤＭで刺激され、溶解され、抗Ｃｌｅｃ１０ａ抗体で免疫沈降（ＩＰ）され、抗リン酸化チロシン（ｐＴｙｒ）抗体や抗Ｃｌｅｃ１０ａ抗体を用いてイムノブロットされた（パネルｇ）。矢尻は、目的の分子（黒）およびＩＰに用いた抗体（ＩＰ－Ａｂ）（白）を示す。パネルｈは、１ ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳまたは２００ ｐｇ／ｍＬのＰａｍ２ＣＳＫ４で６時間刺激した後に０．５μＭのＴＡＫ－２４２またはＤＭＳＯで処理されたＣＤ１１５＋のＢＭＭＰから細胞上清のＣＢＡ分析の結果を示す。＊＊はＰ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す（独立両側Ｓｔｕｄｅｎｔ′ｓ ｔ－検定）。データは、平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。
【図8】図８は、Ｃｌｅｃ１０ａ－ＣＤ３ζレポーター細胞とＣｌｅｃ１０ａ－ＦＣキメラタンパク質の確立を示す。パネルａおよびｂは、指定された用量（パネルａ）でＬｅｗｉｓ Ｘでコートされたプレート、およびＬｅｗｉｓ Ｘ（１０μｇ／ｍＬ）またはＬｅｗｉｓ Ｙ（１０μｇ／ｍＬ）でコートされたプレートで刺激した後のＣｌｅｃ１０ａ－ＣＤ３ζレポーター細胞のＧＦＰ発現をフローサイトメトリで分析した結果を示す。パネルｃは、Ｌｅｗｉｓ Ｘ（ＬｅＸ）またはＬｅｗｉｓ Ｙ（ＬｅＹ）でコートされたプレートに結合したＣｌｅｃ１０ａ－ＦｃをＥＬＩＳＡで分析した結果を示す。データは、平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。
【図9】図９は、ヒトＣｌｅｃ１０ａ－ＣＤ３ζレポーター細胞のＨＤＭ刺激の結果とヒトＡＳＧＲ１のノックダウン効率を示す。パネルａおよびｂは、ガラクトース（Ｇａｌ）、グルコース（Ｇｌｃ）、もしくはマンノース（Ｍａｎ）の非存在下（パネルａ）または存在下（パネルｂ）で、ＨＤＭでコートされたプレートで刺激した後のヒトＣｌｅｃ１０ａ－ＣＤ３ζレポーター細胞のＧＦＰ発現を示す。パネルｃは、コントロールｓｉＲＮＡまたはＡＳＧＲ１に特異的なｓｉＲＮＡで処置したヒトＣＤ１４＋単球由来ＭＰの細胞表面のＡｓｇｒ１の発現を示す。影付きのヒストグラムはアイソタイプコントロール抗体による染色を示す。＊＊＊はｐ＜０．００１を表す（片側ＡＮＯＶＡ検定）。データは、平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。
【図10】図１０は、Ｃｌｅｃ１０ａリガンド（Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌ）がＬＰＳ誘導性皮膚炎を改善することを示す図である。パネルａおよびｂは、ＬＰＳをＣｌｅｃ１０ａ－Ｌの存在下もしくは非存在下でＣ５７ＢＬ／６Ｊの野生型（ＷＴ）マウス及びＣｌｅｃ１０ａ－／－マウスの背部皮膚に毎日塗布した後の、５日目における組織と表皮肥厚をそれぞれ示す。パネルｃは、ＬＰＳをＣｌｅｃ１０ａ－Ｌの存在下もしくは非存在下で背部皮膚に塗布した６時間後のＷＴマウスとＣｌｅｃ１０ａ－／－マウスの皮膚の好中球（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ－６Ｇ＋）の数（／ｃｍ２）を示す。＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表す（独立両側Ｓｔｕｄｅｎｔ′ｓ ｔ－検定）。データは、平均値±ＳＥＭを示す。
【発明の具体的な説明】
【0008】
本明細書では、「対象」とは、哺乳動物であり得、例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、およびリス等のペット；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、およびヤギ等の家畜；サル、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、ボノボ、およびヒト等の霊長類を含む。
【0009】
本明細書では、「処置」とは、治療的処置および予防的処置が含まれる意味で用いられる。本明細書では、治療とは、疾患もしくは状態の悪化の抑制、疾患もしくは状態の悪化の遅延、疾患もしくは状態の改善、または疾患もしくは状態の治癒を含む意味で用いられ得る。本明細書では、予防とは、疾患もしくは状態の発症の抑制、または疾患もしくは状態の発症の遅延を含む意味で用いられ得る。
【0010】
本明細書では、「アレルギー」とは、免疫反応に基づく生体に対する全身的または局所的な障害を意味する。アレルギーは、血中抗体による液性免疫反応に基づくアレルギー（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型）と感作リンパ球による細胞性免疫に基づくアレルギー（ＩＶ型）とに大別される。
【0011】
Ｉ型アレルギーは、即時型アレルギーまたはアナフィラキシー型とも呼ばれるアレルギーである。ＩｇＥが関与し、血中や組織中のマスト細胞や好塩気球が細胞表面に有するＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）とＩｇＥが結合し、これにアレルゲンが結合すると、マスト細胞や好塩気球からヒスタミン等の化学伝達物質が放出され、アレルギー反応（例えば、平滑筋収縮、血管透過性亢進、および腺分泌亢進）が引き起こされる。Ｉ型アレルギーとしては、アトピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、じんましん、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、およびアナフィラキシーショックが挙げられる。Ｉ型アレルギーでは、ハウスダスト、ダニ等が、体内に侵入してアレルギー反応を起こすことが知られている（経口、吸入、経皮、および経静脈等の経路で侵入し得る）。
【0012】
ＩＩ型アレルギーは、細胞および組織の抗原等とＩｇＧまたはＩｇＭとが反応し、ここに補体が結合することによって生じる細胞傷害に基づくものである。細胞膜の抗原に結合したＩｇＧに対して、ＩｇＧ Ｆｃ受容体を有するマクロファージやキラー細胞などが結合してその細胞を傷害する抗体依存性細胞性障害（ＡＤＣＣ）もＩＩ型アレルギーに含まれる。ＩＩ型アレルギーとしては、不適合輸血による溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、薬剤性溶血性貧血、願粒球減少症、血小板減少症、およびＧｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ症侯群が挙げられる。ＩＩＩ型アレルギーは、免疫複合体型またはＡｒｔｈｕｓ型とも呼ばれ、可溶性抗原とＩｇＧまたはＩｇＭとの免疫複合体（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｌｅｘ）による組織障害に基づく。ＩＩＩ型アレルギーとしては、血清病、全身性エリテマトーデスおよび関節性リウマチなどの自己免疫疾患、糸球体腎症、過敏性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症が挙げられる。ＩＶ型アレルギーは、遅延型アレルギーとも呼ばれ、感作Ｔ細胞と抗原との反応により、感作Ｔ細胞からサイトカインが放出されて細胞傷害が生じることに基づく。また、キラーＴ細胞によるウイルス感染細胞、腫瘍細胞、移植片に対する障害にも基づくものである。ＩＶ型アレルギーとしては、アレルギー性接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、過敏性肺炎、結核性空洞、癩、サルコイドーシスの類上皮細胞性肉芽腫病変、天然痘発疹、および麻疹発疹が挙げられる。
【0013】
本明細書では、「アシアロ糖タンパク質受容体」とは、タンパク質の糖鎖の最末端のシアル酸が除去され、その内側のガラクトース残基が末端基として露出した糖タンパク質、すなわち、アシアロ糖タンパク質（ＡＧＰ）に結合する受容体である。アシアロ糖タンパク質受容体は、肝細胞表面に存在し、血液中のＡＧＰと結合して血中からＡＧＰを除去する。アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）は、Ｃ型レクチンドメインファミリーメンバーＨ１またはＣＬＥＣ４Ｈ１とも呼ばれる。ヒトのＡＳＧＲ１タンパク質の代表例は、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号ＣＡＧ４６８４９．１で登録されたアミノ酸配列を有するタンパク質で有り得る。本明細書では、「ＡＳＧＲ１」と述べる場合には、ヒトのＡＳＧＲ１のオーソログを含む意味で用いられる。
本明細書では、「Ｃｌｅｃ１０ａ」は、Ｃ型レクチンドメインファミリー１０、メンバーＡとも呼ばれ、糖鎖を認識して宿主の生体防御システムとして機能する分子である。Ｃｌｅｃ１０ａは、ガラクトースまたはＮ－アセチルガラクトサミンと特異的に結合し得る。
本明細書では、「Ｃｌｅｃ１０ａ」は、Ｃ型レクチンドメインファミリー１０、メンバーＡとも呼ばれ、糖鎖を認識して宿主の生体防御システムとして機能する分子である。Ｃｌｅｃ１０ａは、ガラクトースまたはＮ－アセチルガラクトサミンと特異的に結合し得る。
【0014】
本明細書では、「チリダニ」（ｈｏｕｓｅ ｄｕｓｔ ｍｉｔｅ）とは、ヒョウヒダニ属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属）のダニである。チリダニの主な種は、コナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）、ダーマトファゴイデス・ミクロセラス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｍｉｃｒｏｃｅｒａｓ）、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）、およびユーログリファス・メイネイ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ ｍａｙｎｅｉ）である。
【0015】
本明細書では、「抗原」とは、抗体または糖の場合はレクチンが反応し得るエピトープを提供する物質を意味する。糖鎖の文脈において「抗原」は、通常の語義に従って、レクチンが反応し得るエピトープを提供する糖鎖を意味する。従って、糖鎖の文脈において「抗原」と述べた場合には、天然の糖鎖および糖タンパク質において認められるように、レクチンが反応し得るエピトープとして糖鎖を糖鎖の表層に提供することを意味する。
【0016】
本明細書では、「リガンド」とは、受容体が結合する相手の物質をいう。リガンドは、受容体に結合することによって、受容体の下流シグナルを制御し得る。本明細書では、受容体の下流シグナルを正に制御する物質は、「アゴニスト」と呼ばれる。本明細書ではまた、受容体の下流シグナルを負に制御する物質は、「アンタゴニスト」と呼ばれる。
【0017】
本明細書では、「ＧａｌＮＡｃ」とは、Ｎ－アセチルガラクトサミンを意味し、「ＧｌｃＮＡｃ」とは、Ｎ－アセチルグルコサミンを意味する。
【0018】
本発明者らによれば、チリダニによる皮膚炎の発症や悪化に、マウスでは、Ｃｌｅｃ１０ａが関与し、ヒトでは、Ａｓｇｒ１が関与することを明らかにした。発明者らはまた、機能性解析および相同性解析の結果から、ヒトＡｓｇｒ１がマウスのＣｌｅｃ１０ａの本来の構造的機能的カウンターパートであることを明らかにした。発明者らはまた、チリダニには、マウスＣｌｅｃ１０ａおよびヒトＡｓｇｒ１に結合してこれを活性化し、アレルギー発生を抑制する物質（例えば、Ｃｌｅｃ１０ａリガンドまたはＡｓｇｒ１リガンド）が含まれていることを明らかにした。発明者らはさらに、Ｃｌｅｃ１０ａのリガンドが、Ｏ結合型糖鎖、特に、Ｔ抗原（Ｇａｌβ（１－３）ＧａｌＮＡｃ）、Ｔｎ抗原（αＧａｌＮＡｃ）を含み、ＡＳＧＲ１がこれらのいずれにも結合することを明らかにした。本発明者らはまた、Ｃｌｅｃ１０ａのリガンドがＴＬＲ４シグナルを抑制することを明らかにした。
【0019】
Ｔ抗原（Ｇａｌβ（１－３）ＧａｌＮＡｃ）、およびＴｎ抗原（αＧａｌＮＡｃ）はそれぞれ、以下式（Ｉ）に示される模式図の通りの構造を有する糖鎖である。Ａｓｇｒ１が、Ｔ抗原およびＴｎ抗原にそれぞれ結合することは、Ａｓｇｒ１がガラクトースまたはＮ－アセチルガラクトサミンに対して親和性を有することと整合する。
【0020】
【化1】
【0021】
また、Ａｓｇｒ１は、Ｔ抗原、ＬｅＡ、およびＬｅＸからなる群から選択される糖鎖にも結合し、これによりシグナルを細胞内へ伝達する。
【0022】
【化2】
【0023】
糖鎖は、ポリマー性の足場上に提示されていてもよい。例えば、糖鎖は、ポリ乳酸、ポリアクリルアミド、ポリビニル、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリルニトリル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタラート、ナイロン、コラーゲン、ヒドロキシエチルメタクリレート、キトサン、キチン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、およびこれらの共重合体などの生体適合性高分子をバックボーンとして有するポリマー性の足場の側鎖上に連結し、Ｃｌｅｃ１０ａに提示されてもよい。ボリマー性の足場上に提示された糖鎖が、Ｃｌｅｃ１０ａまたはＡｓｇｒ１を活性化させるか否かは、後述するＣＤ３ζレポーター細胞を用いて確認することができる。上記においてそれぞれのポリマーは、投与可能な物性（例えば、粘度、浸透圧等）であれば特に限定されないが、例えば、１ｋＤａ～１００ｋＤａ、５ｋＤａ～５０ｋＤａ、１０ｋＤａ～４０ｋＤａ、または２０～４０ｋＤの重量平均分子量を有する生体適合性高分子をバックボーンとして用いることができる。
【0024】
本発明によれば、アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のマウスカウンターパートであるＣｌｅｃ１０ａにナンセンス変異またはフレームシフト変異を導入すると、ＨＤＭに対する応答が過剰になった。また、Ｃｌｅｃ１０ａのリガンドを含む抽出物（精製物）を調製し、ヒトＡｓｇｒ１－ＣＤ３ζレポーター細胞に接触させると、Ａｓｇｒ１は、濃度依存的にＣｌｅｃ１０ａのリガンドに応答した。また、この活性化は、ガラクトースの系への添加によって濃度依存的に打ち消された。このことから、アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンド）は、チリダニにより誘発されるアレルギーなどのＴＬＲ４シグナルにより誘発される疾患または症状（例えば、炎症およびアレルギー疾患）の処置に用いることができると結論できる。
従って、本発明によれば、アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドを含む、アレルギー疾患を処置することに用いるための組成物が提供される。本発明によれば、アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドを含む、ＴＬＲ４シグナルの活性化により誘発される疾患または症状（例えば、炎症およびアレルギー疾患）の処置に用いるための組成物が提供される。ＴＬＲシグナルは、ＴＬＲ４リガンドにより活性化されうる。ＴＬＲ４リガンドとしては、リポ多糖（ＬＰＳ）およびリポテイコ酸並びにこれらのアナログであるアゴニストが挙げられる。したがって、これらのＴＬＲ４リガンドを含むアレルゲンにより誘発される疾患または症状（例えば、炎症およびアレルギー疾患）の処置に、アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドを用いることができる。したがって、本発明によれば、ＴＬＲ４リガンドを含むアレルゲンにより誘発される疾患または症状を処置することに用いるための組成物であって、アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドを含む組成物が提供される。
従って、本発明によれば、アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドを含む、アレルギー疾患を処置することに用いるための組成物が提供される。本発明によれば、アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドを含む、ＴＬＲ４シグナルの活性化により誘発される疾患または症状（例えば、炎症およびアレルギー疾患）の処置に用いるための組成物が提供される。ＴＬＲシグナルは、ＴＬＲ４リガンドにより活性化されうる。ＴＬＲ４リガンドとしては、リポ多糖（ＬＰＳ）およびリポテイコ酸並びにこれらのアナログであるアゴニストが挙げられる。したがって、これらのＴＬＲ４リガンドを含むアレルゲンにより誘発される疾患または症状（例えば、炎症およびアレルギー疾患）の処置に、アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドを用いることができる。したがって、本発明によれば、ＴＬＲ４リガンドを含むアレルゲンにより誘発される疾患または症状を処置することに用いるための組成物であって、アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドを含む組成物が提供される。
【0025】
アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドとしては、シアル酸が離脱し、末端にＬｅｗｉｓＸを有する糖鎖、および当該糖鎖を有するタンパク質が挙げられる。アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドとしては、シアル酸が離脱し、末端にＴ抗原またはＴｎ抗原を有する糖鎖、および当該糖鎖を有するタンパク質が挙げられる。Ｔ抗原は、Ｇａｌβ（１－３）ＧａｌＮＡｃを意味し、Ｔｎ抗原は、αＧａｌＮＡｃを意味する。アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドとしては、シアル酸が離脱し、末端に、Ｌｅｗｉｓ Ｘ抗原、Ｔ抗原、およびＴｎ抗原からなる群から選択される１、２または全てのＯ結合型糖鎖、または当該糖鎖を有するタンパク質であり得る。ムチン様タンパク質は、上記Ｏ結合型糖鎖を有し、Ｌｅｗｉｓ Ｘ抗原、Ｔ抗原、およびＴｎ抗原からなる群から選択される糖鎖を有する。従って、アシアロ糖タンパク質受容体１のリガンドは、ムチン様タンパク質またはムチンであり得る。アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドとしての前記タンパク質は、ムチン様タンパク質またはムチンであり得る。
【0026】
生体内においては、肝細胞にＡｓｇｒ１が高発現しており、体内で脱シアリル化した老化したタンパク質（アシアロ糖タンパク質）を肝細胞内に取り込んで血中から除去する。従って、このような脱シアリル化した糖タンパク質は、全てアシアロ糖タンパク質受容体１のリガンドとして用い得る。Ａｓｇｒ１は、Ｔ抗原及びＴｎ抗原の少なくともいずれかまたは両方を有する糖鎖に結合し、反応する。従って、Ｔ抗原及びＴｎ抗原の少なくともいずれかまたは両方を有する糖鎖またはこれを有するタンパク質は、全てアシアロ糖タンパク質受容体１のリガンドとして用い得る。また、全てアシアロ糖タンパク質受容体１のリガンドは、アレルゲンを含有する物質（例えば、ＨＤＭ抽出物）をＣｌｅｃ１０ａ（例えば、マウスＣｌｅｃ１０ａまたはヒトＡｓｇｒ１）との結合親和性に基づくアフィニティー精製によっても得ることができる。Ｃｌｅｃ１０ａからのＣｌｅｃ１０ａリガンドの溶出は、例えば、ガラクトースを用いて行うことができる。Ｃｌｅｃ１０ａリガンドの溶出物は生理食塩水で透析してもよい。
【0027】
ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１の細胞外領域と膜貫通領域とＣＤ３ζの細胞内領域を含む融合タンパク質は、アシアロ糖タンパク質受容体１のリガンドの存在下でＣＤ３ζシグナルを下流に伝えた。従って、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１の細胞外領域と膜貫通領域とＣＤ３ζの細胞内領域を含む融合タンパク質は、アレルギー疾患を処置することに用いるための物質を確認することができる。例えば、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１の細胞外領域と膜貫通領域とＣＤ３ζの細胞内領域を含む融合タンパク質を発現する動物細胞であって、ＣＤ３ζシグナルで活性化するプロモーター（例えば、ＮＦＡＴプロモーター）と作動可能に連結したレポーターをコードする遺伝子を有する動物細胞と、化合物を接触させることによって、被検化合物が、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１に結合する化合物であることを確認することができる。また、抑制性ＩＴＡＭを介する制御性シグナリングを指標として、得られた物質がアレルギー疾患を処置することに用いるための物質であることを確認することができる。
また、化合物（ヒトＡｓｇｒ１のリガンドの候補化合物）のアレルギー抑制効果については、例えば、ＬＰＳ誘導性の皮膚炎に対して、化合物を適用して皮膚炎の抑制効果を確認することができる。
このように、本発明では、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１の細胞外領域と膜貫通領域とＣＤ３ζの細胞内領域を含む融合タンパク質、および当該融合タンパク質を発現する動物細胞が提供される。本発明ではまた、当該動物細胞は、ＣＤ３ζシグナルで活性化するプロモーターと作動可能に連結したレポーターをコードする遺伝子を有するものであってもよい。本発明ではさらに、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１の細胞外領域と膜貫通領域とＣＤ３ζの細胞内領域を含む融合タンパク質を発現する動物細胞であって、ＣＤ３ζシグナルで活性化するプロモーターと作動可能に連結したレポーターをコードする遺伝子を有する動物細胞と、化合物を接触させることによって、被検化合物が、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１に結合する化合物であることを確認する方法が提供される。
本発明のある態様では、被検化合物は、アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドを含み得る。本発明のある態様では、被検化合物は、前記リガンドが、Ｔ抗原およびＴｎ抗原からなる群から選択される少なくとも１種の糖鎖であり得る。本発明のある態様では、前記リガンドが、ムチン様タンパク質またはムチンであり得る。本発明のある態様では、前記リガンドが、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１のリガンドであり得る。
本発明のヒトアシアロ糖タンパク質受容体１の細胞外領域と膜貫通領域とＣＤ３ζの細胞内領域を含む融合タンパク質を発現する動物細胞であって、ＣＤ３ζシグナルで活性化するプロモーターと作動可能に連結したレポーターをコードする遺伝子を有する動物細胞は、化合物のスクリーニングに用いることもできる。従って、本発明では、ヒトＡｓｇｒ１リガンドまたはアゴニストのスクリーニング方法であって、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１の細胞外領域と膜貫通領域とＣＤ３ζの細胞内領域を含む融合タンパク質を発現する動物細胞であって、ＣＤ３ζシグナルで活性化するプロモーターと作動可能に連結したレポーターをコードする遺伝子を有する動物細胞と被検化合物とを接触させることを含む、方法が提供される。レポーター活性が認められた場合には、当該被検化合物は、ヒトＡｓｇｒ１リガンドまたはアゴニストの候補であることが示される。
動物細胞は、好ましくは、ヒト細胞であり得る。
また、化合物（ヒトＡｓｇｒ１のリガンドの候補化合物）のアレルギー抑制効果については、例えば、ＬＰＳ誘導性の皮膚炎に対して、化合物を適用して皮膚炎の抑制効果を確認することができる。
このように、本発明では、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１の細胞外領域と膜貫通領域とＣＤ３ζの細胞内領域を含む融合タンパク質、および当該融合タンパク質を発現する動物細胞が提供される。本発明ではまた、当該動物細胞は、ＣＤ３ζシグナルで活性化するプロモーターと作動可能に連結したレポーターをコードする遺伝子を有するものであってもよい。本発明ではさらに、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１の細胞外領域と膜貫通領域とＣＤ３ζの細胞内領域を含む融合タンパク質を発現する動物細胞であって、ＣＤ３ζシグナルで活性化するプロモーターと作動可能に連結したレポーターをコードする遺伝子を有する動物細胞と、化合物を接触させることによって、被検化合物が、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１に結合する化合物であることを確認する方法が提供される。
本発明のある態様では、被検化合物は、アシアロ糖タンパク質受容体１（Ａｓｇｒ１）のリガンドを含み得る。本発明のある態様では、被検化合物は、前記リガンドが、Ｔ抗原およびＴｎ抗原からなる群から選択される少なくとも１種の糖鎖であり得る。本発明のある態様では、前記リガンドが、ムチン様タンパク質またはムチンであり得る。本発明のある態様では、前記リガンドが、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１のリガンドであり得る。
本発明のヒトアシアロ糖タンパク質受容体１の細胞外領域と膜貫通領域とＣＤ３ζの細胞内領域を含む融合タンパク質を発現する動物細胞であって、ＣＤ３ζシグナルで活性化するプロモーターと作動可能に連結したレポーターをコードする遺伝子を有する動物細胞は、化合物のスクリーニングに用いることもできる。従って、本発明では、ヒトＡｓｇｒ１リガンドまたはアゴニストのスクリーニング方法であって、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１の細胞外領域と膜貫通領域とＣＤ３ζの細胞内領域を含む融合タンパク質を発現する動物細胞であって、ＣＤ３ζシグナルで活性化するプロモーターと作動可能に連結したレポーターをコードする遺伝子を有する動物細胞と被検化合物とを接触させることを含む、方法が提供される。レポーター活性が認められた場合には、当該被検化合物は、ヒトＡｓｇｒ１リガンドまたはアゴニストの候補であることが示される。
動物細胞は、好ましくは、ヒト細胞であり得る。
【0028】
本発明の組成物は、パーソナルケア組成物および医薬組成物などの組成物であり得る。
【0029】
医薬組成物としては、例えば、局所投与用の医薬組成物が挙げられ、本発明に用いることができる。局所投与用の医薬組成物は、粘膜適用または体表適用のための医薬組成物であり得、例えば、点眼剤、眼軟膏剤、舌下錠、バッカル錠、トローチ剤、含そう剤、スプレー剤、エアロゾル剤、および吸入剤；液剤、灌注剤、グリセリン剤、酒精剤、水剤、および塗布剤などの溶液製剤；乳剤、懸濁剤、リニメント剤、ローション、スプレー剤、およびリポソーム剤などの分散製剤；軟膏剤、硬膏剤、貼付剤、粘着テープ剤、パスタ剤、パップ剤、クリーム剤、油剤、およびスティック剤などの半固形製剤；並びに、エキス剤（軟エキス剤、乾燥エキス剤）、およびチンキ剤などの浸出製剤が挙げられる。
【0030】
本発明によれば、医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。薬学的に許容可能な賦形剤としては、溶剤、基剤、希釈剤、増量剤、充填剤、および補形剤；溶解補助剤、可溶化剤、緩衝剤、等張化剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、硬化剤、吸収剤、粘着剤、弾性剤、可塑剤、徐放化剤、および噴射剤；抗酸化剤、保存剤、保湿剤、遮光剤、帯電防止剤、芳香剤、着香剤、着色剤、および緩和剤が挙げられる。
【0031】
パーソナルケア組成物としては、例えば、スキンケア、制汗剤、脱臭剤、美容品、化粧品、およびヘアケア製品が挙げられる。パーソナルケア組成物としては、保湿剤、コンディショナー、老化防止剤、美白剤、日焼け止め剤、制汗剤、ひげそり用組成物、ひげそり後用組成物、ファンデーション、リップスティック、口紅、整髪料、シャンプー、洗浄剤、および潤滑剤が挙げられる。パーソナルケア組成物は、パーソナルケア製品に用いられ得る。パーソナルケア製品としては、下着、おむつ、ティッシュ、拭き取り布、マスク、パッチ等が挙げられる。組成物は、有効成分に加えて賦形剤を含んでいてもよい。組成物は、例えば、静脈投与、経皮投与、経口投与、経腸投与、および腹腔内投与などの投与形態に適した剤形にすることができる。皮膚炎の予防および／または治療に関しては、経皮投与により本発明の組成物を投与してもよく、例えば、ゲル、エマルション、クリーム、液体、ペースト、ローション、リポソームクリーム等の形態（例えば、皮膚科学的組成物）であり得る。ある態様では、組成物は、軟膏であり得る。経皮投与の場合には、賦形剤としては、皮膚科学的に許容可能な賦形剤を用いることができ、これに適した剤形を用いることができる。経粘膜投与の場合には、賦形剤としては、粘膜適用上許容可能な賦形剤を用いることができ、これに適した剤形を用いることができる。
【0032】
本発明によれば、アレルギー疾患を処置することに用いるための組成物の製造における、Ａｓｇｒ１リガンドの使用が提供される。
【0033】
本発明によれば、アレルギー疾患をその必要のある対象において処置する方法であって、当該対象にＡｓｇｒ１リガンドの有効量を投与することを含む、方法が提供される。
【0034】
本発明によれば、アレルギー疾患を予防する、またはその発生を抑制する方法であって、
当該対象にＡｓｇｒ１リガンドの有効量を投与することを含む、方法が提供される。
当該対象にＡｓｇｒ１リガンドの有効量を投与することを含む、方法が提供される。
【実施例】
【0035】
方法
（１）皮膚細胞の調製
皮膚細胞は、薄く削った背側皮膚サンプルを挟みでミンチにし、２００ Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩＩ、５０ Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅおよび１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で６０分間インキュベートした。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて更なる解離とホモジェナイズを行った。得られた細胞は、５５μｍナイロンメッシュでろ過し、単一細胞懸濁液として得た。
（１）皮膚細胞の調製
皮膚細胞は、薄く削った背側皮膚サンプルを挟みでミンチにし、２００ Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩＩ、５０ Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅおよび１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で６０分間インキュベートした。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて更なる解離とホモジェナイズを行った。得られた細胞は、５５μｍナイロンメッシュでろ過し、単一細胞懸濁液として得た。
【0036】
（２）フローサイトメトリ
フローサイトメトリとセルソーティングはそれぞれ、ＦＡＣＳ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａおよびＦＡＣＳ Ａｒｉａ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）をデータの分析に用いた。死細胞は、ヨウ化プロピジウム溶液（シグマアルドリッチ、Ｐ４８６４）を用いて染色し、除去した。
フローサイトメトリとセルソーティングはそれぞれ、ＦＡＣＳ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａおよびＦＡＣＳ Ａｒｉａ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）をデータの分析に用いた。死細胞は、ヨウ化プロピジウム溶液（シグマアルドリッチ、Ｐ４８６４）を用いて染色し、除去した。
【0037】
（３）組織学および免疫組織化学染色
組織学的分析に関しては、マウスから採取した背側皮膚サンプルをホルマリン固定し、パラフィン包埋して、４μｍ厚切片を作製した。切片をヘマトキシリン－エオシン染色して光学顕微鏡で分析した。上皮の厚みは、マウス１匹につき５領域で、領域１つにつき５箇所で測定した。
免疫組織化学染色に関しては、マウスから採取した皮膚サンプルをＴｉｓｓｕｅＴｅｋ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ Ｊａｐａｎ）中に包埋し、－８０℃で保存した。免疫組織化学染色においても４μｍ厚の切片を用いた。０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ， ｐＨ７．４）で洗浄し、染みこませて、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ Ｈｉｓｔｏ（Ｎａｃａｌａｉ）を用いて室温で１０分間インキュベートした。その後、切片をＰＢＳ－Ｔで洗浄し、抗Ｃｌｅｃ１０ａ ｍＡｂを用いて４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔで洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６標識抗ラットＩｇＧ ポリクローナル抗体を用いて１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔを用いた洗浄の後に、切片は、ＤＡＰＩを用いて核を染色した。
ヒトの健常皮膚組織は、患者の腫瘍領域の周辺から採取し、ホルマリン固定し、パラフィン包埋して４μｍ厚の切片にした。切片をキシレンで脱パラフィン処理し、エタノールで再水和させて、メタノールを用いて内在性のペルオキシダーゼを遮断した。Ｏｐａｌ ４－Ｃｏｌｏｒ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ ＩＨＣ Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＮＥＬ８２０００１ＫＴ）の製造者マニュアルに従って、切片を抗ＣＤ６９抗体および抗Ａｓｇｒ１抗体を用いて染色した。簡単には、切片を９５℃で１５分間インキュベートし、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ－Ｔ）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ， Ｔ９１４２）で洗浄し、ブロッキング溶液を用いて室温で１０分間処理した。切片を抗ＣＤ６８抗体またはマウスＩｇＧ１抗体を用いて４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳ－Ｔを用いて洗浄し、湿式チャンバー内でＯｐａｌｐｏｌｙｍｅｒ ＨＲＰを用いて室温で３０分間処理した。ＴＢＳ－Ｔを用いた洗浄の後で、切片をＯｐａｌ Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて湿式チャンバー内で室温で１０分間インキュベートし、ＴＢＳ－Ｔで洗浄した。１回目の染色のための抗体は、９５℃で加熱することにより切片から除去した。切片は、その後、１回目の染色と同様に抗Ａｓｇｒ１抗体またはウサギＩｇＧ抗体で染色した。切片は、ｓｐｅｃｔｒａｌ ＤＡＰＩ溶液を用いて核染色した。
組織学的分析に関しては、マウスから採取した背側皮膚サンプルをホルマリン固定し、パラフィン包埋して、４μｍ厚切片を作製した。切片をヘマトキシリン－エオシン染色して光学顕微鏡で分析した。上皮の厚みは、マウス１匹につき５領域で、領域１つにつき５箇所で測定した。
免疫組織化学染色に関しては、マウスから採取した皮膚サンプルをＴｉｓｓｕｅＴｅｋ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ Ｊａｐａｎ）中に包埋し、－８０℃で保存した。免疫組織化学染色においても４μｍ厚の切片を用いた。０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ， ｐＨ７．４）で洗浄し、染みこませて、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ Ｈｉｓｔｏ（Ｎａｃａｌａｉ）を用いて室温で１０分間インキュベートした。その後、切片をＰＢＳ－Ｔで洗浄し、抗Ｃｌｅｃ１０ａ ｍＡｂを用いて４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔで洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６標識抗ラットＩｇＧ ポリクローナル抗体を用いて１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔを用いた洗浄の後に、切片は、ＤＡＰＩを用いて核を染色した。
ヒトの健常皮膚組織は、患者の腫瘍領域の周辺から採取し、ホルマリン固定し、パラフィン包埋して４μｍ厚の切片にした。切片をキシレンで脱パラフィン処理し、エタノールで再水和させて、メタノールを用いて内在性のペルオキシダーゼを遮断した。Ｏｐａｌ ４－Ｃｏｌｏｒ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ ＩＨＣ Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＮＥＬ８２０００１ＫＴ）の製造者マニュアルに従って、切片を抗ＣＤ６９抗体および抗Ａｓｇｒ１抗体を用いて染色した。簡単には、切片を９５℃で１５分間インキュベートし、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ－Ｔ）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ， Ｔ９１４２）で洗浄し、ブロッキング溶液を用いて室温で１０分間処理した。切片を抗ＣＤ６８抗体またはマウスＩｇＧ１抗体を用いて４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳ－Ｔを用いて洗浄し、湿式チャンバー内でＯｐａｌｐｏｌｙｍｅｒ ＨＲＰを用いて室温で３０分間処理した。ＴＢＳ－Ｔを用いた洗浄の後で、切片をＯｐａｌ Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて湿式チャンバー内で室温で１０分間インキュベートし、ＴＢＳ－Ｔで洗浄した。１回目の染色のための抗体は、９５℃で加熱することにより切片から除去した。切片は、その後、１回目の染色と同様に抗Ａｓｇｒ１抗体またはウサギＩｇＧ抗体で染色した。切片は、ｓｐｅｃｔｒａｌ ＤＡＰＩ溶液を用いて核染色した。
【0038】
（４）チリダニ（ＨＤＭ）誘発皮膚炎
最初の誘発（０日目）において、麻酔したマウスの背中の皮膚を電子バリカンを用いて除毛し、残存した毛を毛髪除去クリームを用いて脱毛した。剃った背中の皮膚に対して１００ｍｇのＨＤＭ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）の軟膏（Ｂｉｏｓｔｉｒ， Ｊａｐａｎ）を局所投与した。２回目の誘発からは、ＨＤＭ軟膏投与の２時間前に背側皮膚に対して１５０μＬの４％のドデシル硫酸ナトリウムを適用することにより、皮膚のバリア機能を破壊した。これらの手順は、週２回繰り返された。いくつかの因子（紅斑／出血および瘢痕／乾燥）は、３日目、６日目、１４日目、および２１日目において、製造者指示書（Ｂｉｏｓｔｉｒ）に従い、０（無し）、１（軽度）、２（中度）または３（重度）の評価基準に従ってスコアリングした。ここのスコアの合計を全体の皮膚炎スコアとした。
最初の誘発（０日目）において、麻酔したマウスの背中の皮膚を電子バリカンを用いて除毛し、残存した毛を毛髪除去クリームを用いて脱毛した。剃った背中の皮膚に対して１００ｍｇのＨＤＭ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）の軟膏（Ｂｉｏｓｔｉｒ， Ｊａｐａｎ）を局所投与した。２回目の誘発からは、ＨＤＭ軟膏投与の２時間前に背側皮膚に対して１５０μＬの４％のドデシル硫酸ナトリウムを適用することにより、皮膚のバリア機能を破壊した。これらの手順は、週２回繰り返された。いくつかの因子（紅斑／出血および瘢痕／乾燥）は、３日目、６日目、１４日目、および２１日目において、製造者指示書（Ｂｉｏｓｔｉｒ）に従い、０（無し）、１（軽度）、２（中度）または３（重度）の評価基準に従ってスコアリングした。ここのスコアの合計を全体の皮膚炎スコアとした。
【0039】
（５）ＲＡＷ２６４．７の形質転換体の樹立
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスまたはＮＣ／ＮｇａマウスからＣｌｅｃ１０ａのｃＤＮＡを作製して、Ｆｌａｇタグをコードする配列で標識して、ｐＭＸｓ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰレトロウイルスベクターにサブクローニングした。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ型またはＮＣ／Ｎｇａ型のＣｌｅｃ１０ａを安定的に発現するＲＡＷ２６４．７の形質転換体は、常法に基づいて樹立した。
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスまたはＮＣ／ＮｇａマウスからＣｌｅｃ１０ａのｃＤＮＡを作製して、Ｆｌａｇタグをコードする配列で標識して、ｐＭＸｓ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰレトロウイルスベクターにサブクローニングした。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ型またはＮＣ／Ｎｇａ型のＣｌｅｃ１０ａを安定的に発現するＲＡＷ２６４．７の形質転換体は、常法に基づいて樹立した。
【0040】
（６）ＥＬＩＳＡアッセイ
血清ＩｇＥ抗体は、マウスＩｇＥ（Ｒ３５－７２）に対する捕捉抗体とビオチン化抗マウスＩｇＥ（Ｒ３５－１１８）と、その後のＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＲＰＮ１２３１Ｖ）を用いて測定した。精製マウスＩｇＥ（Ｃ３８－２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を標準として用いた。血清ＩｇＧ１をマウスＩｇＧ１（Ａ８５－３）に対する捕捉抗体とマウスＩｇＧ１に対するＨＲＰ標識抗体とを用いて測定した。精製マウスＩｇＧ１（１０７．３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を標準として用いた。血清ＩｇＧ２ｃは、マウスＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔ（Ｂｅｔｈｙｌ， Ｅ９０－１３６）によって検出した。
血清ＩｇＥ抗体は、マウスＩｇＥ（Ｒ３５－７２）に対する捕捉抗体とビオチン化抗マウスＩｇＥ（Ｒ３５－１１８）と、その後のＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＲＰＮ１２３１Ｖ）を用いて測定した。精製マウスＩｇＥ（Ｃ３８－２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を標準として用いた。血清ＩｇＧ１をマウスＩｇＧ１（Ａ８５－３）に対する捕捉抗体とマウスＩｇＧ１に対するＨＲＰ標識抗体とを用いて測定した。精製マウスＩｇＧ１（１０７．３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を標準として用いた。血清ＩｇＧ２ｃは、マウスＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔ（Ｂｅｔｈｙｌ， Ｅ９０－１３６）によって検出した。
【0041】
（７）骨髄マクロファージ（ＢＭＭＰ）の調製
骨髄細胞を培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ、４３０１６６または４３０１６７）上で、１０ ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および７ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４（Ｗａｋｏ）の存在下で、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０完全培地中で培養した。２日目に７０％の非接着細胞を除去し、ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４を含む新鮮な培地を添加した。５日目に、１００％の非接着細胞をＰＢＳで洗浄することによって除去し、ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４を含む新鮮な培地を添加した。７日目に、全ての非接着細胞をＰＢＳ洗浄により除去して、接着細胞を後の実験に用いた。サイトカインの分泌とＳｙｋのリン酸化の分析に関しては、ＣＤ１１５＋のＢＭＭＰを抗ＣＤ１１５抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）および抗ラットＩｇＧマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて濃縮した。
骨髄細胞を培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ、４３０１６６または４３０１６７）上で、１０ ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および７ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４（Ｗａｋｏ）の存在下で、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０完全培地中で培養した。２日目に７０％の非接着細胞を除去し、ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４を含む新鮮な培地を添加した。５日目に、１００％の非接着細胞をＰＢＳで洗浄することによって除去し、ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４を含む新鮮な培地を添加した。７日目に、全ての非接着細胞をＰＢＳ洗浄により除去して、接着細胞を後の実験に用いた。サイトカインの分泌とＳｙｋのリン酸化の分析に関しては、ＣＤ１１５＋のＢＭＭＰを抗ＣＤ１１５抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）および抗ラットＩｇＧマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて濃縮した。
【0042】
（８）サイトカイン分泌の分析
ＣＤ１１５＋のＢＭＭＰを０．５ μＭのＴＡＫ－２４２（Ｍｅｒｃｋ）存在下または非存在下で、１００ μｇ／ｍＬのＨＤＭ抽出物（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）（ＣＯＳＭＯ ＢＩＯ）、１ｎｇ／ｍＬのリポポリサッカライド、または２００ ｐｇ／ｍＬ Ｐａｍ２ＣＳＫ４で１５分間刺激した。６時間の刺激後に、培養上清を回収し、サイトカインそれぞれの濃度をｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて決定した。
ＣＤ１１５＋のＢＭＭＰを０．５ μＭのＴＡＫ－２４２（Ｍｅｒｃｋ）存在下または非存在下で、１００ μｇ／ｍＬのＨＤＭ抽出物（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）（ＣＯＳＭＯ ＢＩＯ）、１ｎｇ／ｍＬのリポポリサッカライド、または２００ ｐｇ／ｍＬ Ｐａｍ２ＣＳＫ４で１５分間刺激した。６時間の刺激後に、培養上清を回収し、サイトカインそれぞれの濃度をｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて決定した。
【0043】
（９）ｃＤＮＡの合成とリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）
全ＲＮＡを皮膚組織またはフローサイトメトリによってソートされた細胞からＩｓｏｇｅｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）を用いて抽出した。皮膚ＭＰはＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ３－ＣＤ１９－ＮＫ１．１－Ｌｙ－６Ｇ－ＥｐＣＡＭ－ＣＤ６４＋でソートし、ＤＣは、ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ３－ＣＤ１９－ＮＫ１．１－Ｌｙ－６Ｇ－ＥｐＣＡＭ－ＣＤ６４－）でソートした。ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞も取得した。ｃＤＮＡは、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成した。Ｃｌｅｃ１０ａと炎症性サイトカインの遺伝子発現は、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法によってＳＹＢＲ Ｇｒｅｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および特異的プライマーを用いて測定した。Ｇａｐｄｈの発現レベルを標準化データの内部参照として用いた。用いたプライマー配列は以下表１の通りであった。
全ＲＮＡを皮膚組織またはフローサイトメトリによってソートされた細胞からＩｓｏｇｅｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）を用いて抽出した。皮膚ＭＰはＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ３－ＣＤ１９－ＮＫ１．１－Ｌｙ－６Ｇ－ＥｐＣＡＭ－ＣＤ６４＋でソートし、ＤＣは、ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ３－ＣＤ１９－ＮＫ１．１－Ｌｙ－６Ｇ－ＥｐＣＡＭ－ＣＤ６４－）でソートした。ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞も取得した。ｃＤＮＡは、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成した。Ｃｌｅｃ１０ａと炎症性サイトカインの遺伝子発現は、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法によってＳＹＢＲ Ｇｒｅｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および特異的プライマーを用いて測定した。Ｇａｐｄｈの発現レベルを標準化データの内部参照として用いた。用いたプライマー配列は以下表１の通りであった。
【表1】
【0044】
（１０）レトロウイルスによる遺伝子導入
野生型Ｃｌｅｃ１０ａのｃＤＮＡをｐＭＸｓ－ｐｕｒｏ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ （Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）にサブクローニングした。部位特異的Ｃｌｅｃ１０ａ変異体を作製するため、センス鎖のＰＣＲプライマーをフェニルアラニン（ＴＴＣ）をチロシン（ＴＡＣ）の代わりに含むように設計した。得られた変異型ｃＤＮＡは、シークエンシングにより確認した。レトロウイルスは、２９３ＧＰパッケージング細胞を野生型または変異体Ｙ３ＦのｃＤＮＡ、またはＶＳＶ－Ｇ発現ベクターｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇを用いてトランスフェクションすることによって得られた。ＢＭＭＰを、２日目および４日目に、ポリブレン（８μｇ／ｍＬ， Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したウイルス上清を用いて感染させた。遠心後、ウイルスを含む上清を除去して、新鮮なＢＭＭＰ培地に置き換えた。５日目に培地を新鮮なＢＭＭＰ培地に置き換え、７日目に非接着細胞をＰＢＳ洗浄によって除去して、接着細胞を実験に用いた。
野生型Ｃｌｅｃ１０ａのｃＤＮＡをｐＭＸｓ－ｐｕｒｏ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ （Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）にサブクローニングした。部位特異的Ｃｌｅｃ１０ａ変異体を作製するため、センス鎖のＰＣＲプライマーをフェニルアラニン（ＴＴＣ）をチロシン（ＴＡＣ）の代わりに含むように設計した。得られた変異型ｃＤＮＡは、シークエンシングにより確認した。レトロウイルスは、２９３ＧＰパッケージング細胞を野生型または変異体Ｙ３ＦのｃＤＮＡ、またはＶＳＶ－Ｇ発現ベクターｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇを用いてトランスフェクションすることによって得られた。ＢＭＭＰを、２日目および４日目に、ポリブレン（８μｇ／ｍＬ， Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したウイルス上清を用いて感染させた。遠心後、ウイルスを含む上清を除去して、新鮮なＢＭＭＰ培地に置き換えた。５日目に培地を新鮮なＢＭＭＰ培地に置き換え、７日目に非接着細胞をＰＢＳ洗浄によって除去して、接着細胞を実験に用いた。
【0045】
（１１）Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｆｃキメラの調製
マウスＣｌｅｃ１０ａキメラ構築物（Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｆｃ）は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含むｐＭＥ１８Ｓ発現ベクター中にマウスＣｌｅｃ１０ａの細胞外領域を連結させるようにクローニングすることによって作製した。Ｃｌｅｃ１０ａ－ＦｃをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、その後、培地をＧＩＴ ｍｅｄｉｕｍ（ＫＯＨＪＩＮ ＢＩＯ）に置き換えた。Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｆｃは、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｇａｒｏｓｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて培養上清から精製した。
マウスＣｌｅｃ１０ａキメラ構築物（Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｆｃ）は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含むｐＭＥ１８Ｓ発現ベクター中にマウスＣｌｅｃ１０ａの細胞外領域を連結させるようにクローニングすることによって作製した。Ｃｌｅｃ１０ａ－ＦｃをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、その後、培地をＧＩＴ ｍｅｄｉｕｍ（ＫＯＨＪＩＮ ＢＩＯ）に置き換えた。Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｆｃは、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｇａｒｏｓｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて培養上清から精製した。
【0046】
（１２）Ｃｌｅｃ１０ａリガンドの単離
１５０ ｍＭ ＮａＣｌ， ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， １ｍＭ ＣａＣｌ２， および０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む緩衝液に溶解させたＨＤＭ抽出物をＣｌｅｃ１０ａ－Ｆｃを用いてプルダウンアッセイに供した。Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｆｃに結合したリガンドは、３０ ｍＭ ＥＤＴＡまたは２００ ｍＭ ガラクトースを用いて溶出させた。溶出物は、ＰＢＳを外液として用い、ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ（Ｍｅｒｃｋ， ＵＦＣ５０３０２４）を用いて透析し、Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌと命名し、Ｃｌｅｃ１０ａリガンドの一つとして用いた。
１５０ ｍＭ ＮａＣｌ， ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， １ｍＭ ＣａＣｌ２， および０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む緩衝液に溶解させたＨＤＭ抽出物をＣｌｅｃ１０ａ－Ｆｃを用いてプルダウンアッセイに供した。Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｆｃに結合したリガンドは、３０ ｍＭ ＥＤＴＡまたは２００ ｍＭ ガラクトースを用いて溶出させた。溶出物は、ＰＢＳを外液として用い、ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ（Ｍｅｒｃｋ， ＵＦＣ５０３０２４）を用いて透析し、Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌと命名し、Ｃｌｅｃ１０ａリガンドの一つとして用いた。
【0047】
（１３）アルシアンブルー染色と銀染色
Ｃｌｅｃ１０ａリガンドは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって展開させた。電気泳動直後にゲルを脱イオン水と１０％酢酸緩衝液（１０％酢酸および３０％エタノールを含む脱イオン水）で洗浄し、アルシアンブルー溶液（ｐＨ２．５）（Ｗａｋｏ、０１３－１３８０１）を用いて、または用いずに、室温で２時間染色し、その後、３％酢酸緩衝液および１０％酢酸緩衝液で脱染した。ゲルを製造者指示書に従って銀染色した（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
Ｃｌｅｃ１０ａリガンドは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって展開させた。電気泳動直後にゲルを脱イオン水と１０％酢酸緩衝液（１０％酢酸および３０％エタノールを含む脱イオン水）で洗浄し、アルシアンブルー溶液（ｐＨ２．５）（Ｗａｋｏ、０１３－１３８０１）を用いて、または用いずに、室温で２時間染色し、その後、３％酢酸緩衝液および１０％酢酸緩衝液で脱染した。ゲルを製造者指示書に従って銀染色した（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【0048】
（１４）Ｃｌｅｃ１０ａリガンドの分画
Ｃｌｅｃ１０ａリガンドをＳＤＳ－ＰＡＧＥによって展開させ、サイズにしたがって分離する方式でゲルを切り出した。切り出されたゲルを機械的に粉砕し、攪拌しながらＰＢＳ中で一晩インキュベートした。１７，４００ｇで１０分間の遠心後に上清を回収して、ＰＢＳを外液として用い、ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ（Ｍｅｒｃｋ， ＵＦＣ５０３０２４）を用いて透析した。
Ｃｌｅｃ１０ａリガンドをＳＤＳ－ＰＡＧＥによって展開させ、サイズにしたがって分離する方式でゲルを切り出した。切り出されたゲルを機械的に粉砕し、攪拌しながらＰＢＳ中で一晩インキュベートした。１７，４００ｇで１０分間の遠心後に上清を回収して、ＰＢＳを外液として用い、ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ（Ｍｅｒｃｋ， ＵＦＣ５０３０２４）を用いて透析した。
【0049】
（１５）イムノブロット
Ｓｙｋのリン酸化を分析するために、ＢＭＭＰをＨＤＭ抽出物（１００μｇ／ｍＬ）で３７℃で０分、１０分、または３０分間刺激した。刺激したＢＭＭＰを１％ ＮＰ－４０溶解緩衝液で溶解させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。ＰＶＤＦ膜上に電気ブロットによって転写して、抗リン酸化Ｓｙｋ抗体および抗Ｓｙｋ抗体を用いてイムノブロットし、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて検出した。
Ｃｌｅｃ１０ａのチロシンリン酸化を分析するために、ＢＭＭＰをＨＤＭ抽出物（１００μｇ／ｍＬ）で３７℃で０分、１０分、または３０分間刺激した。刺激したＢＭＭＰを１％ ＮＰ－４０溶解緩衝液で溶解させ、抗Ｃｌｅｃ１０ａ ｍＡｂを用いた免疫沈降に供した。免疫沈降物は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって展開し、ＰＶＤＦ膜上に転写され、ＨＲＰ標識抗リン酸化チロシン抗体、または抗Ｃｌｅｃ１０ａ抗体とＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて、イムノブロットした。
Ｃｌｅｃ１０ａとＳｙｋまたはＳＨＰ－１との会合を分析するため、ＢＭＭＰを５ ｍＭのＳｙｋ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＶ（Ｍｅｒｃｋ， ５７４７１４）の存在下、または非存在下で３７℃で３０分間、前処理し、ＨＤＭ抽出物（１００μｇ／ｍＬ）で３７℃で０分、１０分、または３０分間刺激した。０．２％ジギトニン緩衝液で溶解して、抗Ｃｌｅｃ１０ａ ｍＡｂを用いて免疫沈降した。免疫沈降物は、先に記載したようにＰＶＤＦ膜上に転写し、抗Ｓｙｋ抗体、抗ＳＨＰ－１抗体、または抗Ｃｌｅｃ１０ａ抗体を用いてイムノブロットし、その後、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体またはヤギＩｇＧ抗体で検出した。タンパク質は全て、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出した。
Ｃｌｅｃ１０ａリガンドは、ペプチドＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ ＰＲＩＭＴＭ， ＮＺＳ１、Ｎ－Ｚｙｍｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の存在下もしくは非存在下での３７℃で１６時間の前処理、９５℃で５分間の熱変成の後に０．０５ ＭのＮａＯＨの存在下もしくは非存在下での４０℃で１６時間の前処理をして、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜状に転写して、ビオチン化Ｃｌｅｃ１０ａ－ＦｃとＨＲＰ標識ストレプトアビジンを用いてイムノブロットした。
Ｓｙｋのリン酸化を分析するために、ＢＭＭＰをＨＤＭ抽出物（１００μｇ／ｍＬ）で３７℃で０分、１０分、または３０分間刺激した。刺激したＢＭＭＰを１％ ＮＰ－４０溶解緩衝液で溶解させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。ＰＶＤＦ膜上に電気ブロットによって転写して、抗リン酸化Ｓｙｋ抗体および抗Ｓｙｋ抗体を用いてイムノブロットし、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて検出した。
Ｃｌｅｃ１０ａのチロシンリン酸化を分析するために、ＢＭＭＰをＨＤＭ抽出物（１００μｇ／ｍＬ）で３７℃で０分、１０分、または３０分間刺激した。刺激したＢＭＭＰを１％ ＮＰ－４０溶解緩衝液で溶解させ、抗Ｃｌｅｃ１０ａ ｍＡｂを用いた免疫沈降に供した。免疫沈降物は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって展開し、ＰＶＤＦ膜上に転写され、ＨＲＰ標識抗リン酸化チロシン抗体、または抗Ｃｌｅｃ１０ａ抗体とＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて、イムノブロットした。
Ｃｌｅｃ１０ａとＳｙｋまたはＳＨＰ－１との会合を分析するため、ＢＭＭＰを５ ｍＭのＳｙｋ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＶ（Ｍｅｒｃｋ， ５７４７１４）の存在下、または非存在下で３７℃で３０分間、前処理し、ＨＤＭ抽出物（１００μｇ／ｍＬ）で３７℃で０分、１０分、または３０分間刺激した。０．２％ジギトニン緩衝液で溶解して、抗Ｃｌｅｃ１０ａ ｍＡｂを用いて免疫沈降した。免疫沈降物は、先に記載したようにＰＶＤＦ膜上に転写し、抗Ｓｙｋ抗体、抗ＳＨＰ－１抗体、または抗Ｃｌｅｃ１０ａ抗体を用いてイムノブロットし、その後、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体またはヤギＩｇＧ抗体で検出した。タンパク質は全て、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出した。
Ｃｌｅｃ１０ａリガンドは、ペプチドＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ ＰＲＩＭＴＭ， ＮＺＳ１、Ｎ－Ｚｙｍｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の存在下もしくは非存在下での３７℃で１６時間の前処理、９５℃で５分間の熱変成の後に０．０５ ＭのＮａＯＨの存在下もしくは非存在下での４０℃で１６時間の前処理をして、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜状に転写して、ビオチン化Ｃｌｅｃ１０ａ－ＦｃとＨＲＰ標識ストレプトアビジンを用いてイムノブロットした。
【0050】
（１６）レポーター細胞の樹立と刺激
ヒトＣＤ３ζの細胞内領域は、ＬＬ Ｌａｎｉｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）から提供されたベクターから取得した。マウスもしくはヒトＣｌｅｃ１０ａの細胞外領域またはヒトＡｓｇｒ１の細胞外領域は、ｐＭＸｓ－ｐｕｒｏ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ中にサブクローニングした。２Ｂ４－ＮＦＡＴ－ＧＦＰレポーター細胞は、Ｈ． Ａｒａｓｅ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｓａｋａ）から提供された。マウスまたはヒトＣｌｅｃ１０ａを安定発現する２Ｂ４－ＮＦＡＴ－ＧＦＰレポーター細胞は、以前記載された通りに作製した。レポーター細胞は、抗Ｃｌｅｃ１０ａ ｍＡｂ、Ｌｅｗｉｓ Ｘ（ＧｌｙｃｏＴｅｃｈ）、Ｌｅｗｅｓ Ｙ（ＧｌｙｃｏＴｅｃｈ）、ガラクトース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、グルコース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）もしくはマンノース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下または非存在下で１８時間インキュベートした。レポーター細胞はまた、ガラクトシダーゼ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、５７０４－ＧＨまたは５５４９－ＧＨ）、もしくはグルコシダーゼ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、８３２９－ＧＨ）、Ｃｌｅｃ１０ａリガンド被覆プレート、またはサイズ分画されたＣｌｅｃ１０ａリガンドで処理された、または未処理のＨＤＭ抽出物被覆プレート上で、培養された。ＮＦＡＴ－ＧＦＰの活性化は、フローサイトメトリによってモニターされた。
ヒトＣＤ３ζの細胞内領域は、ＬＬ Ｌａｎｉｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）から提供されたベクターから取得した。マウスもしくはヒトＣｌｅｃ１０ａの細胞外領域またはヒトＡｓｇｒ１の細胞外領域は、ｐＭＸｓ－ｐｕｒｏ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ中にサブクローニングした。２Ｂ４－ＮＦＡＴ－ＧＦＰレポーター細胞は、Ｈ． Ａｒａｓｅ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｓａｋａ）から提供された。マウスまたはヒトＣｌｅｃ１０ａを安定発現する２Ｂ４－ＮＦＡＴ－ＧＦＰレポーター細胞は、以前記載された通りに作製した。レポーター細胞は、抗Ｃｌｅｃ１０ａ ｍＡｂ、Ｌｅｗｉｓ Ｘ（ＧｌｙｃｏＴｅｃｈ）、Ｌｅｗｅｓ Ｙ（ＧｌｙｃｏＴｅｃｈ）、ガラクトース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、グルコース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）もしくはマンノース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下または非存在下で１８時間インキュベートした。レポーター細胞はまた、ガラクトシダーゼ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、５７０４－ＧＨまたは５５４９－ＧＨ）、もしくはグルコシダーゼ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、８３２９－ＧＨ）、Ｃｌｅｃ１０ａリガンド被覆プレート、またはサイズ分画されたＣｌｅｃ１０ａリガンドで処理された、または未処理のＨＤＭ抽出物被覆プレート上で、培養された。ＮＦＡＴ－ＧＦＰの活性化は、フローサイトメトリによってモニターされた。
【0051】
（１７）レクチンマイクロアレイ分析
レクチンマイクロアレイは、従前の方法に従い、非接触マイクロアレイプリントロボット（ＭｉｃｒｏＳｙｓ４０００； Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を用いて作製した。サンプルをＣｙ３ Ｍｏｎｏ－Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅ（ＧＥ）で蛍光標識し、過剰なＣｙ３をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５の脱塩カラム（ＧＥ）を用いて除去した。２．７ ｍＭ ＫＣｌ， １ ｍＭ ＣａＣｌ２， １ ｍＭ ＭｎＣｌ２， および１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むプローブ溶液（２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ ７．５， １４０ ｍＭ ＮａＣｌ）（ＴＢＳ）で１０倍に希釈した後に、Ｃｙ３標識サンプルをレクチンマイクロアレイに適用し、２０℃で一晩インキュベートした。プローブ溶液で洗浄し、蛍光像をｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ－ｆｉｅｌｄ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｃａｎｎｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｓｃａｎ ２００、Ｒｅｘｘａｍ Ｃｏ． Ｌｔｄ．）を用いて取得した。３連スポットのレクチンシグナルを各タンパク質サンプルについて平均して、９６のレクチンの平均値に対して正規化した。レクチンのリストは、表２に示される通りであった。
レクチンマイクロアレイは、従前の方法に従い、非接触マイクロアレイプリントロボット（ＭｉｃｒｏＳｙｓ４０００； Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を用いて作製した。サンプルをＣｙ３ Ｍｏｎｏ－Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅ（ＧＥ）で蛍光標識し、過剰なＣｙ３をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５の脱塩カラム（ＧＥ）を用いて除去した。２．７ ｍＭ ＫＣｌ， １ ｍＭ ＣａＣｌ２， １ ｍＭ ＭｎＣｌ２， および１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むプローブ溶液（２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ ７．５， １４０ ｍＭ ＮａＣｌ）（ＴＢＳ）で１０倍に希釈した後に、Ｃｙ３標識サンプルをレクチンマイクロアレイに適用し、２０℃で一晩インキュベートした。プローブ溶液で洗浄し、蛍光像をｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ－ｆｉｅｌｄ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｃａｎｎｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｓｃａｎ ２００、Ｒｅｘｘａｍ Ｃｏ． Ｌｔｄ．）を用いて取得した。３連スポットのレクチンシグナルを各タンパク質サンプルについて平均して、９６のレクチンの平均値に対して正規化した。レクチンのリストは、表２に示される通りであった。
【0052】
【表2】
２ 特異性のデータは、フロンタルアフィニティークロマトグラフィーおよび糖コンジュゲートマイクロアレイによって得られた。
３ 略語：ＪＯＭ（Ｊ－ＯＩＬ ＭＩＬＬＳ， ＩＮＣ）、Ｖｅｃｔｏｒ（ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ（ＳＥＩＫＡＧＡＫＵ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）、ＥＹ（ＥＹ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ， ＩＮＣ）、ＡＩＳＴ（産業技術総合研究所）
【0053】
（１８）糖コンジュゲートマイクロアレイ分析
９８種の糖コンジュゲートを含む糖コンジュゲートマイクロアレイ（表３）を従前の方法に従い、非接触マイクロアレイプリントロボット（ＭｉｃｒｏＳｙｓ４０００； Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を用いて作製した。Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｆｃ（１０ μｇ／ｍＬ）をＣｙ３標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ， Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－１６５－０９８）（１ μｇ／ｍＬ）を事前に複合体形成をさせ、糖コンジュゲートマイクロアレイ（８０μＬ／ウェル）と２０℃で一晩インキュベートした。
９８種の糖コンジュゲートを含む糖コンジュゲートマイクロアレイ（表３）を従前の方法に従い、非接触マイクロアレイプリントロボット（ＭｉｃｒｏＳｙｓ４０００； Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を用いて作製した。Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｆｃ（１０ μｇ／ｍＬ）をＣｙ３標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ， Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－１６５－０９８）（１ μｇ／ｍＬ）を事前に複合体形成をさせ、糖コンジュゲートマイクロアレイ（８０μＬ／ウェル）と２０℃で一晩インキュベートした。
【0054】
【表3】
【0055】
（１９）ヒトＡｓｇｒ１のノックダウン
ＣＤ１４＋の単球を抗ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０５０－２０１）を用いて末梢血単核球から濃縮し、ＧＭ－ＣＳＦ存在下で２日間培養した。ＡＳＧＲ１に対して特異的なｓｉＲＮＡ（ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ Ａｃｃｅｌｌ ｓｉＲＮＡ， Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）または対照ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ送達剤との混合物で処理した。その後、１００μｇ／ｍＬのＨＤＭ抽出物で単球を６時間刺激した。培養上清中の各種サイトカインの濃度をｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて決定した。
ＣＤ１４＋の単球を抗ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０５０－２０１）を用いて末梢血単核球から濃縮し、ＧＭ－ＣＳＦ存在下で２日間培養した。ＡＳＧＲ１に対して特異的なｓｉＲＮＡ（ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ Ａｃｃｅｌｌ ｓｉＲＮＡ， Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）または対照ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ送達剤との混合物で処理した。その後、１００μｇ／ｍＬのＨＤＭ抽出物で単球を６時間刺激した。培養上清中の各種サイトカインの濃度をｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて決定した。
【0056】
（２０）ヒト皮膚遺伝子発現のデータ
ヒトの皮膚およびアトピー性皮膚炎の病理学的状態におけるヒトＡＳＧＲ１の発現を分析するために、公開されたマイクロアレイデータ（ＧＳＥ５６６７）を用いた。
ヒトの皮膚およびアトピー性皮膚炎の病理学的状態におけるヒトＡＳＧＲ１の発現を分析するために、公開されたマイクロアレイデータ（ＧＳＥ５６６７）を用いた。
【0057】
（２１）統計学的解析
統計学的解析は、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ′ｓ ｔ－検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５）、事後テューキー・クラマー検定とＡＮＯＶＡ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５）、またはピアソン相関検定（両側、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５）を用いて行った。
統計学的解析は、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ′ｓ ｔ－検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５）、事後テューキー・クラマー検定とＡＮＯＶＡ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５）、またはピアソン相関検定（両側、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５）を用いて行った。
【0058】
実施例１：アトピー性皮膚炎モデルマウスのエクソーム解析
本実施例では、アトピー性皮膚炎のモデルマウスであるＮＣ／Ｎｇａマウスのエクソーム解析を実施して、アトピー性皮膚炎の原因遺伝子を特定した。
本実施例では、アトピー性皮膚炎のモデルマウスであるＮＣ／Ｎｇａマウスのエクソーム解析を実施して、アトピー性皮膚炎の原因遺伝子を特定した。
【0059】
ＮＣ／Ｎｇａマウスは、チャールズリバー、ジャパンから購入した。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ， Ｖｅｎｌｏ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、マウスＤＮＡの抽出に適した条件下でＮＣ／Ｎｇａマウスから得られた血液からＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡのエクソーム解析は、以下の通り実施した。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐ ｋｉｔ （ｐｏｓｔ－ｐｏｏｌ ｖｅｒｓｉｏｎ ４； Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）とＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｍｏｕｓｅ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ Ｋｉｔ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、その製造者マニュアルにしたがってＤＮＡライブラリを得た。得られたＤＮＡライブラリをエマルションＰＣＲ （ＳＯＬｉＤ ＥＺ Ｂｅａｄ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ ｋｉｔ； Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）に供して、ビーズ上にクローン性のＤＮＡ断片を生成させ、その後、ビーズエンリッチメントに供した（ＳＯＬｉＤ ＥＺ Ｂｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｋｉｔ； Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）。得られたビーズは、ＳＯＬｉＤ ５５００ｘｌ シークエンサー上で、単一末端の６０ｂｐのリードとしてシークエンスした。得られたリードは、マウス参照ゲノム（ＮＣＢＩ３７／ｍｍ９）に対してＬｉｆｅＳｃｏｐｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．５．１ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｆｉｅｓ）を用いてアラインメントして、ＢＡＭファイルを得た。バリアントコールをＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｓｉ Ｔｏｏｌｋｉｔ， Ｐｉｃａｒｄ （ｈｔｔｐ：／／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄ）に記載されたプロトコルに従ってＳＡＭｔｏｏｌを用いて実施し、参照ゲノム上で固有の位置にマップされたリードのみを分析に用いた。変異箇所は、ＡＮＮＯＶＥＲソフトウェアを用いてアノテーションした。ＮＣ／Ｎｇａ以外の近交系マウスにおける遺伝的変動は、ＮＣＢＩｍ３７アッセンブリに従って付番されたリリースＲＥＬ－１２１１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ｄａｔａ／ｍｏｕｓｅ－ｇｅｎｏｍｅｓ－ｐｒｏｊｅｃｔ）およびＭｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｗｅｂｓｉｔｅ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏｒｇ／）から取得された。シークエンスは、ＡＢＩ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。用いたプライマーは表４の通りであった。
【0060】
【表4】
【0061】
ＮＣ／Ｎｇａマウスのゲノムのエキソン領域には、参照ゲノムに対して７０，７７２個の変異が同定された。ＧＡＴＫ出力により得られた低品質の値を伴う変異を取り除き、６４，５１８個の変異を得た。ＡＮＮＯＶＥＲソフトウェアを用いてナンセンス変異およびフレームシフト変異を含む機能喪失変異を選択した。そして、３５のナンセンス変異と４８のフレームシフト変異（ストップコドンが誘発される）が同定された。これらの８３遺伝子のそれぞれについて４３遺伝子中の４６の変異について更なるシークエンスバリデーションのために選択した。
【0062】
また、４６の変異のうち、２４がシークエンスによって確認された。結果は表５に示される通りであった。
【0063】
【表5】
【0064】
１７の近交系マウス系統と２の日本のペットマウスに存在する変異を除外し、７遺伝子中の７つの変異に着目した。（表５の太字参照）。造血細胞における発現の観点から、ＢｉｏＧＰＳデータベースの情報に基づいて、７つの遺伝子からＣｌｅｃ１０ａを選択した（図５のパネルａ参照）。ＮＣ／ＮｇａマウスのＣｌｅｃ１０ａは、ＮＭ＿０１０７６９の塩基配列における７０６番目のＣがＴになるナンセンス変異（すなわち、Ｑ２３６Ｘ）であった。
【0065】
実施例２：Ｃｌｅｃ１０ａの発現解析と機能解析
Ｃｌｅｃ１０ａは、ＩＩ型のＣ型レクチン受容体ファミリーの一員であり、外来および内在性抗原の末端のガラクトース部分を検知する。ＮＣ／ＮｇａマウスにおけるＣｌｅｃ１０ａのｃ．７０６Ｃ＞Ｔは、Ｃ型レクチン様ドメインのコード領域に存在する（図１のパネルａおよびｂ）。フローサイトメトリによる分析から、Ｃｌｅｃ１０ａが、皮膚ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋リニエージ－ＥｐＣＡＭ－細胞においては、マクロファージ（ＭＰ）（ＣＤ６４＋ＭｅｒＴＫ＋）、従来型の樹状細胞（ｃＤＣ）（ＣＤ６４－ＭｅｒＴＫ－）、および単核球由来ＤＣ（ＣＤ６４－ＭｅｒＴＫｌｏ）の細胞表面、並びにＣ５７ＢＬ／６Ｊの腹腔のマクロファージ上に発現していることが明らかとなった（ＮＣ／Ｎｇａマウスの腹腔には発現していなかった）（図１のパネルｃ、図５のパネルｂ，ｅ参照）。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮膚の非造血細胞（ＣＤ４５－）、ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ－細胞、ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋（Ｌｉｎ， ＥｐＣＡＭ）＋細胞、および好中球（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ－６Ｇ＋）では、Ｃｌｅｃ１０ａの発現は認められなかった（図５のパネルｃ，ｄ参照）。免疫組織化学染色によっても同様の結果が得られ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮膚細胞においてはＣｌｅｃ１０ａの発現が認められたが、ＮＣ／Ｎｇａマウスではその発現は認められなかった（図１のパネルｄ）。
Ｃｌｅｃ１０ａは、ＩＩ型のＣ型レクチン受容体ファミリーの一員であり、外来および内在性抗原の末端のガラクトース部分を検知する。ＮＣ／ＮｇａマウスにおけるＣｌｅｃ１０ａのｃ．７０６Ｃ＞Ｔは、Ｃ型レクチン様ドメインのコード領域に存在する（図１のパネルａおよびｂ）。フローサイトメトリによる分析から、Ｃｌｅｃ１０ａが、皮膚ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋リニエージ－ＥｐＣＡＭ－細胞においては、マクロファージ（ＭＰ）（ＣＤ６４＋ＭｅｒＴＫ＋）、従来型の樹状細胞（ｃＤＣ）（ＣＤ６４－ＭｅｒＴＫ－）、および単核球由来ＤＣ（ＣＤ６４－ＭｅｒＴＫｌｏ）の細胞表面、並びにＣ５７ＢＬ／６Ｊの腹腔のマクロファージ上に発現していることが明らかとなった（ＮＣ／Ｎｇａマウスの腹腔には発現していなかった）（図１のパネルｃ、図５のパネルｂ，ｅ参照）。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮膚の非造血細胞（ＣＤ４５－）、ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ－細胞、ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋（Ｌｉｎ， ＥｐＣＡＭ）＋細胞、および好中球（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ－６Ｇ＋）では、Ｃｌｅｃ１０ａの発現は認められなかった（図５のパネルｃ，ｄ参照）。免疫組織化学染色によっても同様の結果が得られ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮膚細胞においてはＣｌｅｃ１０ａの発現が認められたが、ＮＣ／Ｎｇａマウスではその発現は認められなかった（図１のパネルｄ）。
【0066】
ＮＣ／ＮｇａマウスにおけるＣｌｅｃ１０ａの発現の特徴を更に分析した。具体的には、３′末端にＦｌａｇタグとＩＲＥＳ－ＧＦＰをコードする配列を有するＣｌｅｃ１０ａ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来およびＮＣ／Ｎｇａマウス由来）のｃＤＮＡをＲＡＷ２６４．７マクロファージにトランスフェクションした。Ｆｌａｇタグは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＣｌｅｃ１０ａを発現するマクロファージの細胞表面に発現したが、ＮＣ／Ｎｇａマウス由来のＣｌｅｃ１０ａを発現するマクロファージの細胞表面には発現しなかった。（図５のパネルｆ参照）。しかしながら、ＮＣ／Ｎｇａマウス由来のＣｌｅｃ１０ａを発現するマクロファージにおいては、Ｆｌａｇの細胞内における発現が認められた（図５のパネルｇ参照）。これらの結果は、Ｃｌｅｃ１０ａにおける変異が、細胞表面へのＣｌｅｃ１０ａの輸送に負の影響を与えたことを示唆するものである。
【0067】
次に、このＣｌｅｃ１０ａの変異が、チリダニ（Ｈｏｕｓｅ ｄｕｓｔ ｍｉｔｅ， ＨＤＭ）による皮膚炎に関与しているか否かを確認した。そこで、天然の配列（Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ）の代わりに、Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｃを有する変異体マウス（以下、「ＮＣ／ＮｇａマウスＣｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ＞Ｃ」ということがある）を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて常法に従って作製した（図１のパネルａ参照）。Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｃを有する変異体マウスの皮膚においては、Ｃｌｅｃ１０ａのｍＲＮＡ発現が、Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔを有するマウスと比較して、有意に増加していた（図５のパネルｈ参照）。Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６ＴとＣｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｃをヘテロで有する変異体マウス（Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｃ）では、皮膚および腹腔におけるマクロファージの表面上でのＣｌｅｃ１０ａの発現が回復した（図１のパネルｃ、ｄ、図５のパネルｉ参照）。加えて、紅斑、乾燥、および皮膚厚の増大などのＨＤＭ誘発皮膚炎の症状が変異体マウス（Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｃ）において軽減した（図１のパネルｅ～ｈ）。更に、ＨＤＭ処理６日後における皮膚への好中球の浸潤が、野生型Ｃｌｅｃ１０ａ（Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｔ）を有するＮＣ／Ｎｇａマウスと比較して、変異体マウス（Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／Ｃ）において減少していた（図１のパネルｉ）。これに対して、ＩｇＥの血清レベルは、両者間で同等であった。これらの結果は、Ｃｌｅｃ１０ａ変異体（Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ＞Ｃ）は、ＨＤＭ誘発皮膚炎の原因となること、およびＮＣ／ＮｇａマウスにおいてはＴｈ２応答を増加させないことを示唆する。
【0068】
ＨＤＭ誘発皮膚炎におけるＣｌｅｃ１０ａの細胞表面発現の関与を調べるため、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを背景としてＣｌｅｃ１０ａ欠損マウス（Ｃｌｅｃ１０ａ－／－マウス）を作製した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスとＣｌｅｃ１０ａ欠損マウス（Ｃｌｅｃ１０ａ－／－）の背側の皮膚にＨＤＭを局所で適用した。ＮＣ／Ｎｇａマウスの皮膚において認められたように、Ｃｌｅｃ１０ａ－／－マウスは、ＨＤＭ処理後５～６日目において、野生型マウスと比較して、紅斑、乾燥および皮膚の増強などの皮膚炎の増悪を示した（図２のパネルａ～ｄ参照）。加えて、ＨＤＭ処理後１～３日目には野生型マウスと比較して、Ｃｌｅｃ１０ａ－／－マウスでは、皮膚における好中球の浸潤が増加した（図２のパネルｅ参照）。これに対して、他の骨髄およびリンパ球系列の細胞の数は、野生型とＣｌｅｃ１０ａ－／－マウスと
で同等であった（図６のパネルａ参照）。
で同等であった（図６のパネルａ参照）。
【0069】
ＨＤＭ処理後２週間では、野生型におけるよりもＣｌｅｃ１０ａ－／－マウスにおいて血清ＩｇＧ１レベルが高く、ＩｇＥ価およびＩｇＧ２ｃ価は野生型とＣｌｅｃ１０ａ－／－マウスとで同等であった（図６のパネルｂ参照）。加えて、ＨＤＭ処理した皮膚の流入領域リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）におけるＩｌ４およびＧａｔａ３のＣＤ４＋Ｔ細胞による発現は、野生型とＣｌｅｃ１０ａ－／－マウスとで同等であった（図６のパネルｃ参照）。従って、Ｃｌｅｃ１０ａは、Ｔｈ２応答を縮小させるというよりもむしろ、好中球の浸潤を減少させることによって皮膚炎を抑制すると考えられる。
【0070】
Ｃｌｅｃ１０ａは、皮膚のＭＨＣＩＩ＋のマクロファージ（ＭＰ）および樹状細胞（ＤＣ）に発現するため、ＨＤＭで局所処置した野生型マウスおよびＣｌｅｃ１０ａ－／－マウスの皮膚細胞サンプルからこれらの細胞をソーティングした（図７のパネルａ参照）。Ｉｌ６、Ｃｘｃｌ１、およびＣｘｃｌ２の遺伝子発現レベルは、野生型ＭＰよりもＣｌｅｃ１０ａ－／－ＭＰにおいて高かったが、ＤＣにおいては野生型とＣｌｅｃ１０ａ－／－とでこれらの遺伝子発現レベルは同等であった（図２のパネルｆ参照）。これらの結果は、ＤＣよりもＭＰにおけるＣｌｅｃ１０ａがＨＤＭ誘発皮膚炎の抑制に関与していることを示唆するものである。骨髄マクロファージ（ＢＭＭＰ）を野生型マウスおよびＣｌｅｃ１０ａ－／－ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスからそれぞれ調製して特性解析をした（図７のパネルｂ参照）。ＣＤ１１５＋ＢＭＭＰにおけるＭＰマーカーおよびＴＬＲ４の発現レベルは、野生型マウスおよびＣｌｅｃ１０ａ－／－マウスとで同等であった。インビトロにおけるＨＤＭ刺激の後で、Ｃｌｅｃ１０ａ－／－ ＢＭＭＰは、ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ３およびＴＮＦ－αなどの好中球の化学走性物質を野生型ＢＭＭＰよりも大量に分泌した（図２のパネルｇ参照）。同様に、Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／ＴのＮＣ／ＮｇａマウスのＢＭＭＰは、Ｃｌｅｃ１０ａｃ．７０６Ｔ／ＣのＢＭＭＰよりも大量のサイトカイン産生を示した（図７のパネルｄ参照）。これらの結果から、Ｃｌｅｃ１０ａの細胞表面での発現がＨＤＭによる刺激の後における皮膚ＭＰからの炎症性サイトカインの産生を阻害することが実証された。
【0071】
ＨＤＭ刺激は、野生型のＢＭＭＰにおいて脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）の活性化を引き起こすが、Ｃｌｅｃ１０ａ－／－のＢＭＭＰではＳｙｋの活性化は認められなかった（図２のパネルｊ参照）。更に、ＨＤＭ刺激はＳｙｋとタンパク質チロシンホスファターゼＳＨＰ－１のＣｌｅｃ１０ａへのリクルートを引き起し、このリクルートはＣｌｅｃ１０ａのチロシン残基に依存した（図２のパネルｋ参照）。Ｓｙｋ阻害剤によるＢＭＭＰ処理は、ＨＤＭで誘発されるＳＨＰ－１のＣｌｅｃ１０ａへのリクルートを抑制したが（図２のパネルｌ）、このことは、当該イベントがＳｙｋの活性化に依存していることを示唆する。抑制性ＩＴＡＭを介する制御性シグナリングとも一貫する結果である。
【0072】
実施例３：Ｃｌｅｃ１０ａリガンドの解析
Ｃｌｅｃ１０ａがＨＤＭ中に含まれるグリコシル化タンパク質を認識するかを試験するために、ＣＤ３ζの細胞質部分に融合したＣｌｅｃ１０ａの細胞外部分と膜貫通部分を含むキメラ融合タンパク質を発現するＮＦＡＴ－ＧＦＰレポーター細胞（Ｃｌｅｃ１０ａレポーター細胞）を作製した。マウスＣｌｅｃ１０ａレポーター細胞はＬｅｗｉｓ Ｘ（Ｃｌｅｃ１０ａのオリゴ糖リガンド）に応答してＧＦＰを発現させたが、Ｌｅｗｉｓ Ｙには応答を示さなかった（図８のパネルａおよびｂ参照）。また、マウスＣｌｅｃ１０ａレポーター細胞は、用量依存的にＨＤＭ被覆プレートに応答してＧＦＰを発現させた（図３のパネルａ）。加えて、抗Ｃｌｅｃ１０ａモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはガラクトースを用いたレポーター細胞の前処理は、ＧＦＰの発現を抑制したが、グルコースやマンノースの前処理は、ＧＦＰの発現を抑制しなかった（図３のパネルｂおよびｃ）。更にまた、ガラクトシダーゼを用いたＨＤＭの処理は、レポーター細胞におけるＧＦＰ発現を引き起こすその能力を低下させたが、グルコシダーゼでは、そのような低下は認められなかった（図３のパネルｄ）。これらの結果は、Ｃｌｅｃ１０ａが直接的にＨＤＭのガラクトシル化部分に結合することを示すものである。
Ｃｌｅｃ１０ａがＨＤＭ中に含まれるグリコシル化タンパク質を認識するかを試験するために、ＣＤ３ζの細胞質部分に融合したＣｌｅｃ１０ａの細胞外部分と膜貫通部分を含むキメラ融合タンパク質を発現するＮＦＡＴ－ＧＦＰレポーター細胞（Ｃｌｅｃ１０ａレポーター細胞）を作製した。マウスＣｌｅｃ１０ａレポーター細胞はＬｅｗｉｓ Ｘ（Ｃｌｅｃ１０ａのオリゴ糖リガンド）に応答してＧＦＰを発現させたが、Ｌｅｗｉｓ Ｙには応答を示さなかった（図８のパネルａおよびｂ参照）。また、マウスＣｌｅｃ１０ａレポーター細胞は、用量依存的にＨＤＭ被覆プレートに応答してＧＦＰを発現させた（図３のパネルａ）。加えて、抗Ｃｌｅｃ１０ａモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはガラクトースを用いたレポーター細胞の前処理は、ＧＦＰの発現を抑制したが、グルコースやマンノースの前処理は、ＧＦＰの発現を抑制しなかった（図３のパネルｂおよびｃ）。更にまた、ガラクトシダーゼを用いたＨＤＭの処理は、レポーター細胞におけるＧＦＰ発現を引き起こすその能力を低下させたが、グルコシダーゼでは、そのような低下は認められなかった（図３のパネルｄ）。これらの結果は、Ｃｌｅｃ１０ａが直接的にＨＤＭのガラクトシル化部分に結合することを示すものである。
【0073】
ＨＤＭにおけるＣｌｅｃ１０ａのリガンド（Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌ）の分析のため、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したマウスＣｌｅｃ１０ａの細胞外部分（Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｆｃ）を含むキメラ融合タンパク質を作製したが、この融合タンパク質は、Ｌｅｗｉｓ Ｙには結合せずＬｅｗｉｓ Ｘに結合した（図８のパネルｃ）。Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｆｃを用いてＨＤＭからのプルダウンアッセイによって、分子量約２２５ｋＤａのＣｌｅｃ１０ａ－Ｌが単離されたが、Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌは、マウスＣｌｅｃ１０ａレポーター細胞におけるＧＦＰの発現を誘導することができた（図３のパネルｅおよびｆ参照）。Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌはアルシアンブルーと銀により染色されたが、銀単独では染色されず（図３のパネルｇ参照）、このことは、Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌが高度に糖修飾されたタンパク質であることを示す。Ｏ結合型グリカンを分解するＮａＯＨでの処理は、Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｆｃがエピトープに結合することを阻害し（図３のパネルｈ参照）、また、マウスＣｌｅｃ１０ａレポーター細胞におけるＧＦＰの発現の誘導を阻害した（図３のパネルｉ参照）。これに対して、Ｎ結合型グリカンを分解するＰＮＧａｓｅ ＦはＣｌｅｃ１０ａ－Ｌに対して何らの効果も示さなかった（図３のパネルｈおよびｉ参照）。これらの結果は、Ｃｌｅｃ１０ａがＣｌｅｃ１０ａ－ＬのＯ結合型グリカンを認識することを示唆するものである。また、レクチンマイクロアレイによる分析では、Ｃｌｅｃ１０ａ－ＬがＴ抗原（Ｇａｌβ（１－３）ＧａｌＮＡｃ）およびＴｎ抗原（αＧａｌＮＡｃ）を含むこと、およびムチン型Ｏグリカンに結合するＬａｃＮＡｃエピトープ（Ｇａｌβ（１－４）ＧｌｃＮＡｃ）を有することが示された（図３のパネルｊ、および表６）。
【0074】
【表6】
２ Ｃｏｎｔｒｏｌ １：Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｆｃを用いた緩衝液からのプルダウンアッセイサンプル
３ Ｃｏｎｔｒｏｌ ２：ヒトＩｇＧ１を用いたＨＤＭからのプルダウンアッセイサンプル
【0075】
Ｃｌｅｃ１０ａは、高密度の多価ＴおよびＴｎ抗原を認識するマクルラ・ポミフェラ（Ｍａｃｌｕｒａ ｐｏｍｉｆｅｒａ （ＭＰＡ））のレクチンに最も強く結合した。他方で、ＴおよびＴｎ抗原にＣｌｅｃ１０ａ－Ｆｃが結合することがグリカンマイクロアレイによる分析で明らかとなり（表７参照）、また、Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌがムチン様タンパク質であることが示唆された（図３のパネルｋ参照）。
【0076】
【表7】
【0077】
実施例４：ヒトＡｓｇｒ１とマウスＣｌｅｃ１０ａの関係
ところで、アミノ酸配列の相同性を解析するツールであり、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から提供されるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によると、マウスＣｌｅｃ１０ａとＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）のアミノ酸配列において、最も高い相同性を示したヒトタンパク質は、ヒトＡｓｇｒ１およびＣｌｅｃ１０ａであった（それぞれ、Ｇｅｎｅ ＩＤ： ４３２および１０４６２によりコードされる）。ヒトＡｓｇｒ１レポーター細胞とヒトＣｌｅｃ１０ａレポーター細胞は、ＨＤＭ刺激に応答してＧＦＰを発現したが（図４のパネルａおよび図９のパネルａ参照）、ガラクトースの追加は、Ａｓｇｒ１レポーター細胞においてのみ、ＨＤＭに誘発されるＧＦＰの発現を阻害した（図４のパネルｂおよび図９のパネルｂ参照）。また、ｈｅｍＩＴＡＭ配列（ＹｘｘＬ）は、ヒトＣｌｅｃ１０ａでは見出されず、ヒトＡｓｇｒ１でしか見出すことができなかった（図４のパネルｃ参照）。これらの結果は、マウスにおけるＣｌｅｃ１０ａの機能的構造的なカウンターパートは、ヒトＣｌｅｃ１０ａではなく、むしろヒトＡｓｇｒ１であることを示すものである。ヒトＡｓｇｒ１レポーター細胞は、ＨＤＭにおけるマウスＣｌｅｃ１０ａのリガンド（Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌ）に応答してＧＦＰを発現した（図４のパネルｄ参照）。タンパク質の発現を確認すると、マウスの皮膚におけるＣｌｅｃ１０ａの発現と同様に、ヒトＡｓｇｒ１はヒトの皮膚においてＭＰに発現した（図４のパネルｅ参照）。ｓｉＲＮＡによるヒト単核球由来培養ＭＰにおけるＡｓｇｒ１のノックダウンは、ＨＤＭに対する応答において、炎症性サイトカインの分泌を増強した（図４のパネルｆおよび図９参照）。このことは、ヒトにおいては、Ａｓｇｒ１がＨＤＭ誘発皮膚炎を制御していることを示唆するものである。さらには、転写データ（ＧＳＥ５６６７）によれば、アレルギー性皮膚炎の患者において皮膚のＡｓｇｒ１の発現と、ＨＤＭに対する感受性と関連する血清ＩｇＥレベルとに逆相関が認められた（図４のパネルｇ参照）。これらの結果から、ヒトにおけるＡｓｇｒ１とマウスにおけるＣｌｅｃ１０ａなどのＣ型レクチン受容体がＨＤＭにおけるムチン様タンパク質を認識し、ＨＤＭにより誘発される炎症に対する皮膚の恒常性維持において重要な役割を果たしていることが理解された（図４のパネルｈ参照）。
ところで、アミノ酸配列の相同性を解析するツールであり、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から提供されるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によると、マウスＣｌｅｃ１０ａとＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）のアミノ酸配列において、最も高い相同性を示したヒトタンパク質は、ヒトＡｓｇｒ１およびＣｌｅｃ１０ａであった（それぞれ、Ｇｅｎｅ ＩＤ： ４３２および１０４６２によりコードされる）。ヒトＡｓｇｒ１レポーター細胞とヒトＣｌｅｃ１０ａレポーター細胞は、ＨＤＭ刺激に応答してＧＦＰを発現したが（図４のパネルａおよび図９のパネルａ参照）、ガラクトースの追加は、Ａｓｇｒ１レポーター細胞においてのみ、ＨＤＭに誘発されるＧＦＰの発現を阻害した（図４のパネルｂおよび図９のパネルｂ参照）。また、ｈｅｍＩＴＡＭ配列（ＹｘｘＬ）は、ヒトＣｌｅｃ１０ａでは見出されず、ヒトＡｓｇｒ１でしか見出すことができなかった（図４のパネルｃ参照）。これらの結果は、マウスにおけるＣｌｅｃ１０ａの機能的構造的なカウンターパートは、ヒトＣｌｅｃ１０ａではなく、むしろヒトＡｓｇｒ１であることを示すものである。ヒトＡｓｇｒ１レポーター細胞は、ＨＤＭにおけるマウスＣｌｅｃ１０ａのリガンド（Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌ）に応答してＧＦＰを発現した（図４のパネルｄ参照）。タンパク質の発現を確認すると、マウスの皮膚におけるＣｌｅｃ１０ａの発現と同様に、ヒトＡｓｇｒ１はヒトの皮膚においてＭＰに発現した（図４のパネルｅ参照）。ｓｉＲＮＡによるヒト単核球由来培養ＭＰにおけるＡｓｇｒ１のノックダウンは、ＨＤＭに対する応答において、炎症性サイトカインの分泌を増強した（図４のパネルｆおよび図９参照）。このことは、ヒトにおいては、Ａｓｇｒ１がＨＤＭ誘発皮膚炎を制御していることを示唆するものである。さらには、転写データ（ＧＳＥ５６６７）によれば、アレルギー性皮膚炎の患者において皮膚のＡｓｇｒ１の発現と、ＨＤＭに対する感受性と関連する血清ＩｇＥレベルとに逆相関が認められた（図４のパネルｇ参照）。これらの結果から、ヒトにおけるＡｓｇｒ１とマウスにおけるＣｌｅｃ１０ａなどのＣ型レクチン受容体がＨＤＭにおけるムチン様タンパク質を認識し、ＨＤＭにより誘発される炎症に対する皮膚の恒常性維持において重要な役割を果たしていることが理解された（図４のパネルｈ参照）。
【0078】
実施例５：Ｃｌｅｃ１０ａリガンドによるアレルギー症状の処置
これまでの実施例の結果から、Ｃｌｅｃ１０ａ（ヒトにおいてはＡｓｇｒ１）がＨＤＭ誘発アレルギー症状の制御に関わっており、Ｃｌｅｃ１０ａ（ヒトにおいてはＡｓｇｒ１）に対するリガンド刺激がアレルギー症状の抑制に関与することが示された。本実施例では、Ｃｌｅｃ１０ａに対するリガンドでアレルギー症状を処置し、結果を観察した。
これまでの実施例の結果から、Ｃｌｅｃ１０ａ（ヒトにおいてはＡｓｇｒ１）がＨＤＭ誘発アレルギー症状の制御に関わっており、Ｃｌｅｃ１０ａ（ヒトにおいてはＡｓｇｒ１）に対するリガンド刺激がアレルギー症状の抑制に関与することが示された。本実施例では、Ｃｌｅｃ１０ａに対するリガンドでアレルギー症状を処置し、結果を観察した。
【0079】
最初の誘発（０日目）において、麻酔したマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＪのＷＴ）及びＣｌｅｃ１０ａ－／－マウス）の背中の皮膚を電子バリカンを用いて除毛し、残存した毛を毛髪除去クリームを用いて脱毛した。剃った背中の皮膚に対してテープストリッピングした後、５０μｇのＬＰＳをＣｌｅｃ１０ａ－Ｌの存在下もしくは非存在下で局所投与した。Ｃｌｅｃ１０ａリガンドは、上記（１２）Ｃｌｅｃ１０ａリガンドの単離に記載される通りの方法で取得した。テープストリッピング以降の手順は、毎日繰り返された。これにより、皮膚炎を誘発させた。表皮肥厚の解析は投与後５日目に行い、好中球浸潤の解析は投与後６時間後に行った。この系では、ＴＬＲ４誘導性の皮膚炎が誘発される。
誘発された皮膚炎を観察するため、常法により組織切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った。その後、表皮肥厚と皮膚における好中球の数を計数した。
誘発された皮膚炎を観察するため、常法により組織切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った。その後、表皮肥厚と皮膚における好中球の数を計数した。
【0080】
結果は図１０に示される通りであった。図１０のパネルａに示されるようにＬＰＳで処置した皮膚では、皮膚炎が誘発され、表皮の肥厚が増大する傾向が認められた（中央上の写真）。これに対して、Ｃｌｅｃ１０ａリガンドを投与した野生型マウスでは、表皮肥厚が顕著に低減し（右上の写真）、ＬＰＳによる表皮肥厚増大の効果を抑制した。これに対して、Ｃｌｅｃ１０ａ－／－マウスにおいては、ＬＰＳによる表皮肥厚増大の効果は認められたが、Ｃｌｅｃ１０ａリガンドの投与によっては表皮肥厚増大の効果を抑制することができなかった。図１０のパネルｂでは、表皮肥厚をグラフ化したものである。図１０のパネルｂにおいても、図１０パネルａと同様の結果が示された。皮膚組織に対する好中球の浸潤を常法により観察した。結果は、図１０のパネルｃに示されるように、野生型（ＷＴ）マウスにおいてＬＰＳ処置群において好中球の浸潤が観察されたが、ＬＰＳに加えてＣｌｅｃ１０ａリガンドで処置した群においては好中球浸潤が抑制された。これに対してＣｌｅｃ１０ａ－／－マウスにおいては、好中球浸潤をＣｌｅｃ１０ａリガンドによっては抑制することができなかった。これらの結果から、Ｃｌｅｃ１０ａリガンドは、皮膚炎の抑制効果を示すことが明らかとなった。
ＨＤＭには、ＴＬＲ４リガンドが含まれることが知られており、これによって皮膚炎などの炎症症状やアレルギー症状が誘発されると考えられている。ＨＤＭ刺激においても、Ｃｌｅｃ１０ａにＣｌｅｃ１０ａリガンドが結合し（ヒトにおいてはその機能的カウンターパートであるＡｓｇｒ１にＡｓｇｒ１リガンドが結合し）、ＴＬＲ４シグナルを抑制することが炎症症状やアレルギー症状の軽減効果をもたらすと考えられる。
ＨＤＭには、ＴＬＲ４リガンドが含まれることが知られており、これによって皮膚炎などの炎症症状やアレルギー症状が誘発されると考えられている。ＨＤＭ刺激においても、Ｃｌｅｃ１０ａにＣｌｅｃ１０ａリガンドが結合し（ヒトにおいてはその機能的カウンターパートであるＡｓｇｒ１にＡｓｇｒ１リガンドが結合し）、ＴＬＲ４シグナルを抑制することが炎症症状やアレルギー症状の軽減効果をもたらすと考えられる。
【0081】
実施例６：ヒトＡｓｇｒ１リガンドの検出
図１１では、Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌのレクチンに対する結合プロファイルをレクチンアレイによって決定し、Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌ中のグリカン構造を予測するスキーム（図１１の左上パネル）、および、Ｃｌｅｃ１０ａに対するグリカンの結合プロファイルをグリカンアレイによって決定するスキーム（図１１の右上パネル）が示されている。図１１では、これらの結果を合わせて考察し、５つのグリカン（αＧａｌ、βＧａｌ、Ｔ抗原、ＬｅＡ、およびＬｅＸ）をＣｌｅｃ１０ａのリガンド候補として特定できることを示している。図１１では、Ｇａｌα１－３ＬＮとＧａｌα１－４ＬＮを加えて７つのＣｌｅｃ１０ａのリガンド候補を特定した。
図１１では、Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌのレクチンに対する結合プロファイルをレクチンアレイによって決定し、Ｃｌｅｃ１０ａ－Ｌ中のグリカン構造を予測するスキーム（図１１の左上パネル）、および、Ｃｌｅｃ１０ａに対するグリカンの結合プロファイルをグリカンアレイによって決定するスキーム（図１１の右上パネル）が示されている。図１１では、これらの結果を合わせて考察し、５つのグリカン（αＧａｌ、βＧａｌ、Ｔ抗原、ＬｅＡ、およびＬｅＸ）をＣｌｅｃ１０ａのリガンド候補として特定できることを示している。図１１では、Ｇａｌα１－３ＬＮとＧａｌα１－４ＬＮを加えて７つのＣｌｅｃ１０ａのリガンド候補を特定した。
【0082】
グリカン被覆プレートに対してＣｌｅｃ１０ａを適用するＥＬＩＳＡ系を常法により構築して、各グリカンとＣｌｅｃ１０ａとの結合性を検討した。ＥＬＩＳＡ系においては、ポリマー性足場に複数のグリカンを結合させることによって多価効果が奏されることに期待し、ポリマー性足場にグリカンを結合させ、Ｃｌｅｃ１０ａに提示させた。本実施例では、ポリマー性足場としては、ポリアクリルアミド（重量平均分子量：３０ｋＤａ）を用いた。具体的には、以下のようにポリアクリルアミド側鎖のＯＨ基に対してグリカンを修飾し、これによってグリカンをＣｌｅｃ１０ａに提示した。以下式の通りである。
【0083】
【化3】
【0084】
上記のようにして上記式の「Ｓｕｇａｒ」の位置にグリカンを提示するポリマー性足場（上記式の通り修飾率２０％であった）を、１μｇ／ウェル、０．１μｇ／ウェル、０．０１μｇ／ウェル含む、ＰＢＳ溶液を９６穴プレートに導入し、室温で一晩インキュベートすることによってウェルをグリカンで被覆した後に、非結合のポリマーを洗浄した。その後、１μｇ／μＬのＣｌｅｃ１０ａ－Ｆｃを含む１０％ウシ胎児血清含ＰＢＳ溶液（５０μＬ／ウェル）をグリカン被覆ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後に、非結合のＣｌｅｃ１０ａ－Ｆｃを洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗Ｆｃ抗体でプレート表面に結合したＣｌｅｃ１０ａ－Ｆｃを定量した。陰性対象として、ＬｅＹを導入した上記ポリマーを用いた。
【0085】
【0086】
次いで、これらのリガンドが、Ｃｌｅｃ１０ａを活性化させるかをＣｌｅｃ１０ａ－ＣＤ３ζレポーター細胞を用いて確認した。すると、図１３に示されるように、Ｔ抗原、ＬｅＡ、およびＬｅＸは、用量依存的にＣｌｅｃ１０ａを活性化させ、ＮＦＡＴレポーターの発現を増強した。
【0087】
上記の実験からＣｌｅｃ１０ａを活性化するグリカンが明らかになった。そのうちの一つであるＴ抗原がリポポリサッカライド（ＬＰＳ）に対する皮膚炎症を抑制できるかを検討した。マウスの背中に５０μｇのＬＰＳと２０μｇのＴ抗原を提示するポリマー性足場を毎日皮内注射し、５日目に表皮の厚みを観察した。結果は、図１４に示される通りであった。図１４に示されるように、ＬＰＳによる皮膚の厚みの増加は、Ｔ抗原によって抑制された。また、Ｃｌｅｃ１０ａノックアウトマウスでは、表皮の厚みはＷＴと同等以上であった。ここで、Ｔ抗原による表皮の厚みの抑制の効果はＣｌｅｃ１０ａノックアウトマウスにおいては認められなかったことから、Ｔ抗原による炎症の抑制効果は、Ｃｌｅｃ１０ａを介するものであることが明らかとなった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】