特許 7546950 バクテリオファージ、青枯病防除剤および青枯病防除方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-30

(45)【発行日】2024-09-09

(54)【発明の名称】バクテリオファージ、青枯病防除剤および青枯病防除方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/00 20060101AFI20240902BHJP

   A01N 63/40 20200101ALI20240902BHJP

   A01P 3/00 20060101ALI20240902BHJP

   A01P 1/00 20060101ALI20240902BHJP

   C12N 7/02 20060101ALN20240902BHJP

【ＦＩ】

C12N7/00

A01N63/40

A01P3/00

A01P1/00

C12N7/02

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2022539891

(86)(22)【出願日】2020-07-30

(86)【国際出願番号】 JP2020029188

(87)【国際公開番号】W WO2022024286

(87)【国際公開日】2022-02-03

【審査請求日】2023-01-24

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-03185

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】591100448

【氏名又は名称】パネフリ工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000590

【氏名又は名称】弁理士法人 小野国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】原島 俊明

(72)【発明者】

【氏名】中野 和真

(72)【発明者】

【氏名】狩俣 徹

【審査官】北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】JOURNAL OF BACTERIOLOGY，2011年，Vol.193, No.19, p.5300-5313

【文献】Applied and Environmental Microbiology，2012年，Vol.78, No.3, p.889-891

【文献】Archives of Virology，2019年，Vol.164, p.2339-2343

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ ７／００－７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

バクテリオファージＲＫＰ１８０（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１８５）。

【請求項2】

請求項１に記載のバクテリオファージを有効成分とすることを特徴とする青枯病防除剤。

【請求項3】

請求項２記載の青枯病防除剤を植物または植物生長媒体に投与することを特徴とする植物の青枯病防除方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バクテリオファージ、青枯病防除剤および青枯病防除方法に関する。

【背景技術】

【0002】

青枯病菌（Ralstonia solanacearum）はナス科植物等の２００種以上の植物に感染し、青枯病を引き起こす。青枯病が進行すると、青枯病菌に感染した植物は枯死してしまう。

【0003】

これまで青枯病の対策に使用されてきた主な化学農薬は、劇物であるクロロピクリン又は臭化メチルである。

【0004】

しかし、有効散布量の増大、環境汚染、オゾン層破壊、健康への影響及び残留農薬等の問題から、化学農薬に代わる安全な代替農薬及び防除技術の開発が望まれている。

【0005】

これまで化学農薬に代わる安全な代替農薬及び防除技術としては、例えば、バクテリオファージを用いる技術（特許文献１～３）が知られているが、これらは限られた種類の青枯病菌に効果があるものであり、より幅広い種類の青枯病菌に効果のあるものが要望されていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】特開２００７－２５２３５１号公報

【文献】特開２０１８－２４５８９号公報

【文献】国際公開番号ＷＯ２０１７／１０４３４７号パンフレット

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

従って、本発明の課題は、より幅広い種類の青枯病菌に効果のあるバクテリオファージおよびそれを用いた青枯病防除方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、特定の遺伝子を有するバクテリオファージが幅広い青枯病菌に感染することを見出し、本発明を完成させた。

【0009】

すなわち、本発明は、lysozyme融合型のDarBをコードする遺伝子を有し、
endolysin、前記DarBおよびRz/Rz1の３つのlytic enzymeをコードする遺伝子を有し、
CsrAをコードする遺伝子を有し、
２つのtail fiber proteinをコードする遺伝子を有し、
青枯病菌に感染すること、を特徴とするバクテリオファージである。

【0010】

また、本発明は、上記バクテリオファージを有効成分とすることを特徴とする青枯病防除剤である。

【0011】

更に、本発明は、上記青枯病防除剤を植物または植物生長媒体に投与することを特徴とする植物の青枯病防除方法である。

【発明の効果】

【0012】

本発明のバクテリオファージは、幅広い種類の青枯病菌に感染するため、青枯病の防除に有効である。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は本発明のバクテリオファージＲＫＰ１８０の外観の一例を示す（図中のバーの長さは２０ｎｍである）。

【図2】図２はＲＫＰ１８０の全ゲノム配列に基づく系統樹（Maximum Likelihood）を示す。

【図3】図３はＲＫＰ１８０のlarge terminaseのアミノ酸配列に基づく系統樹（Maximum Likelihood）を示す。

【図4】図４はＲＫＰ１８０の遺伝子地図を示す。

【図5】図５はＲＫＰ１８０とその近縁株の遺伝子地図を示す。

【図6】図６はＲＫＰ１８０と近縁株のＧＰ４とＢｃｅｐ２２の全ゲノムの相同性比較図を示す。

【図7】図７はＲＫＰ１８０とＧＰ４のDarB遺伝子産物の機能ドメインを示す。

【図8】図８はＲＫＰ１８０とＧＰ４のendolysinのアライメントを示す。

【図9】図９はＲＫＰ１８０の１感染サイクルを示す（ｍｅａｎ±ＳＤ（Ｎ＝３））。

【図10】図１０はＲＫＰ１８０の青枯病に対する防除効果の様子を示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明のバクテリオファージは、lysozyme融合型のDarBをコードする遺伝子を有し、endolysin、前記DarBおよびRz/Rz1の３つのlytic enzymeをコードする遺伝子を有し、CsrAをコードする遺伝子を有し、２つのtail fiber proteinをコードする遺伝子を有し、青枯病菌に感染するものである。

【0015】

上記lysozyme（リゾチーム）融合型DarBをコードする遺伝子は、通常のDarをコードする遺伝子とは異なり、lysozymeが融合したDarBタンパク質をコードするものである。lysozymeは溶菌活性を持ち、殺菌作用を有する。DarBはＤＮＡメチラーゼドメインとヘリカーゼドメインを有し、宿主菌の制限機構（restriction）から自身のDNAを守る防御機能を有する（以下、「DarB」を「制限機構防御遺伝子DarB」等と言うこともある）。多くの場合、lysozymeとDarBタンパク質は別々の遺伝子によってコードされるが、本発明のバクテリオファージのDarBはこれら２つが融合した稀なDarBである。このlysozymeが融合したlysozyme融合型DarBタンパク質によって本発明のバクテリオファージは宿主菌の制限機構をすり抜け、効率的に宿主内で自身の遺伝情報を複製し、効率的に宿主菌を溶菌し、効率的に増殖することができる。このような融合遺伝子としては、例えば、Burkholderia virus BcepIL02のgp70(YP_002922742.1)、Burkholderia virus Bcep22のgp75(NP_944303.1)、 Burkholderia virus DC1 のgp65（YP_006589997.1）、配列番号１に記載の塩基配列の４４，００８～５７，５４３番目（ＯＲＦ６６）のもの等が挙げられる。これらlysozyme融合型DarBをコードする遺伝子の中でも配列番号１に記載の塩基配列の４４，００８～５７，５４３番目（ＯＲＦ６６）のものが好ましい。

【0016】

なお、本発明においては、DarBが上記性質を維持しているのであれば、上記lysozyme融合型DarBをコードする遺伝子と、５０％以上、好ましくは５５％以上の配列相同性（identity）があるものであってもlysozyme融合型DarBをコードする遺伝子に含まれる。

【0017】

上記３つのlytic enzyme（溶菌酵素）をコードする遺伝子とは、endolysin、上記DarB、Rz/Rz1である。lytic enzymeを複数有することで溶菌効率が高まり、本発明のバクテリオファージの溶菌効率が上がる。endolysinをコードする遺伝子は、N-acetylmuramidase activityを有するlysozyme様溶菌酵素活性をもつ。このような遺伝子としては、例えば、Ralstonia phage GP4のORF65（AXG67760.1 ）、Cupriavidus oxalaticus WP_063238227.1、Cupriavidus taiwanensis WP_115662684.1、Ralstonia mannitolilytica WP_115075602.1、配列番号１に記載の塩基配列の５８,７６２～５９，３５５番目（ＯＲＦ６９）のもの等が挙げられる。これらendolysinをコードする遺伝子の中でも配列番号１に記載の塩基配列の５８,７６２～５９，３５５番目（ＯＲＦ６９）のものが好ましい。

【0018】

なお、本発明においては、endolysinの上記性質が維持されるのであれば、上記遺伝子と、５０％以上、好ましくは８０％以上の配列相同性（identity）があるものもendolysinをコードする遺伝子に含まれる。

【0019】

上記３つのlytic enzymeをコードする遺伝子のうちDarB遺伝子は、上記したlysozyme融合型DarBをコードする遺伝子である。

【0020】

上記３つのlytic enzymeをコードする遺伝子のうちRz/Rz1遺伝子は細菌の外膜を分解するspaninタンパク質をコードする。Rz遺伝子とRz1遺伝子は重複し、Rz1タンパク質をコードするRz1遺伝子はRz遺伝子内に異なるリーディングフレームで存在する。Rzのような遺伝子としては、例えば、Ralstonia phage GP4のORF61（AXG67756.1）、Burkholderia virus Bcep22のgp80（NP_944308.1）、Burkholderia virus DC1のgp72（YP_006590002.1）、Paraburkholderia hospitaのWP_090835650.1、配列番号１に記載の塩基配列の６１，１１４～６１，６４７番目（ＯＲＦ７４）のもの等が挙げられる。これらRzをコードする遺伝子の中でも配列番号１に記載の塩基配列の６１，１１４～６１，６４７番目（ＯＲＦ７４）のものが好ましい。なお、本発明においては、Rzの上記性質が維持されるのであれば、上記遺伝子と、３０％以上、好ましくは９０％以上の配列相同性（identity）があるものもRzをコードする遺伝子に含まれる。

【0021】

また、上記Rz1のような遺伝子としては、例えば、Pseudomonas phage Epa38のQIQ65891.1、Pseudomonos phage vB_PaeS_S218のASZ72374.1、Pseudomonas sp.31R17のCRM53430.1、Burkholderia virus DC1のgp73（YP_006590003.1）、Burkholderia virus Bcep22のgp81（YP_009173772.1）、配列番号１に記載の塩基配列の６１，３５２～６１，５９７番目（ＯＲＦ７５）のもの等が挙げられる。これらRz1をコードする遺伝子の中でも配列番号１に記載の塩基配列の６１，３５２～６１，５９７番目（ＯＲＦ７５）のものが好ましい。なお、本発明においては、Rz1の上記性質が維持されるのであれば、上記遺伝子と、３０％以上、好ましくは４５％以上の配列相同性（identity）があるものもRz1をコードする遺伝子に含まれる。

【0022】

上記３つのlytic enzymeをコードする遺伝子それぞれを持つバクテリオファージは数多く知られているが、８０％以上の配列相同性のある上記３つのlytic enzymeの全てを有するバクテリオファージは既知のデータベースの中には存在しない。本発明のバクテリオファージは、３つのlytic enzymeを全て有することで、効率的に溶菌すると考えられる。

【0023】

上記CsrAをコードする遺伝子は、バイオフィルム形成を抑制するCsrAをコードする遺伝子である。このような遺伝子としては、例えば、Ralstonia phage GP4のORF4（AXG67699.1 ）、Burkholderia sp. BDU8のWP_066491652.1、Caballeronia zhejiangensisのCsrA（WP_034473805.1）、Burkholderia virus DC1のgp46（YP_006589976.1）、 Burkholderia virus BcepIL02のgp49(YP_002922721.1)、Burkholderia virus Bcep22のgp54(NP_944283.1)、配列番号１に記載の塩基配列の２８,３５１～２８,５４８番目（ＯＲＦ４７）のもの等が挙げられる。これらＣｓｒＡをコードする遺伝子の中でも配列番号１に記載の塩基配列の２８,３５１～２８,５４８番目（ＯＲＦ４７）のものが好ましい。なお、本発明においては、CsrAの上記性質が維持されるのであれば、これらの遺伝子と、５０％以上、好ましくは９５％以上の配列相同性（identity）があるものもCsrAをコードする遺伝子に含まれる。

【0024】

上記tail fiber proteinをコードする遺伝子は、C末側に宿主認識・結合に関わるreceptor binding domainを有するtail fiber proteinをコードする遺伝子である。このような遺伝子としては、例えば、Ralstonia phage GP4のgp75（AXG67770.1）、gp76（AXG67771.1）、gp77（AXG67770.1）、Ralstonia phage RSJ5のgp36（YP_009218128.1）、Burkholderia virus DC1 gp56（YP_006589986.1）、gp57（YP_006589987.1）、gp59（YP_006589989.1）、gp60（YP_006589990.1）、Burkholderia virus Bcep22のgp64（NP_944293.2）、gp65（NP_944294.2）、gp66（NP_944295.2）、Burkholderia virus Bcepmiglのgp60（YP_007236806.1）、gp61（YP_007236807.1）、gp62（YP_007236808.1）、Burkholderia virus BcepIL02のgp58（YP_002922730.1）、gp59（YP_002922731.1）、gp61（YP_002922733.1）、gp62（YP_002922734.1）、配列番号１に記載の塩基配列の３６,００１～３７,３２０番目（ＯＲＦ５８）、配列番号１に記載の塩基配列の３７，４０６～３８，２７８番目（ＯＲＦ５９）のもの等が挙げられる。本発明においては、これらtail fiber proteinをコードする遺伝子の１種または２種でもよいが、配列番号１に記載の塩基配列の３６,００１～３７,３２０番目（ＯＲＦ５８）と３７，４０６～３８，２７８番目（ＯＲＦ５９）の異なる２つが好ましい。なお、本発明においては、tail fiber proteinの上記性質が維持されるのであれば、これらの遺伝子と、１０％以上、好ましくは８５％以上の配列相同性（identity）があるものもtail fiber proteinをコードする遺伝子に含まれる。本発明のバクテリオファージは２つの異なるtail fiber proteinをコードする遺伝子を有することにより宿主域が広い。

【0025】

上記したとおり、３つのlytic enzymeであるendolysin、DarBおよびRz/Rz1をコードする遺伝子を有し、宿主菌の制限機構の防御遺伝子であるlysozyme融合型DarBをコードする遺伝子を有し、広い宿主域とするための２つのtail fiber proteinをコードする遺伝子を有する本発明のバクテリオファージは、効率的な溶菌サイクルで幅広い種類の青枯病菌に感染する。また、バイオフィルム形成を抑制するCsrAをコードする遺伝子を有することで、より強い防除性を発揮する。

【0026】

本発明のバクテリオファージが感染する青枯病菌は、ナス科、ショウガ科、シソ科植物等の２００種以上の植物から見出されるものであれば特に限定されないが、少なくとも、MAFF107624株、MAFF211266株、MAFF211270株、MAFF211543株、MAFF301859株、MAFF311644株、MAFF730103株、MAFF730131株、MAFF302745株、MAFF311632株、MAFF211536株、MAFF331041株、MAFF730139株、MAFF211280株、MAFF211533株、MAFF211468株、MAFF211516株、MAFF311101株、MAFF311102株、MAFF211479株、MAFF211471株、MAFF211483株、MAFF211484株、MAFF211486株、MAFF211272株、MAFF211276株、MAFF211278株、MAFF211490株、MAFF211492株、MAFF211497株、MAFF211476株、MAFF211414株、MAFF211429株およびMAFF301558株の全て、更には本発明者らが採取した70種類以上の青枯病菌に感染する。なお、MAFFの番号がついている青枯病菌は、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構農業生物資源ジーンバンクから入手可能なものである。

【0027】

なお、ここで感染とは、本発明のバクテリオファージの存在下で、青枯病菌の生育する寒天培地上で溶菌斑（プラーク）を形成する状態、または液体培地中で溶菌する状態のことをいう。

【0028】

上記した本発明のバクテリオファージは、公知のバクテリオファージの中から、上記した遺伝子を全て有し、青枯病菌に感染するものを常法に従ってスクリーニングすることによって得ることができる。

【0029】

また、本発明のバクテリオファージは、上記遺伝子を有するものであればよい。そのため、本発明のバクテリオファージは、どのような群、目、科に属していてもかまわないが、好ましくは第１群、カウドウイルス目、ポドウイルス科に属するものである。

【0030】

本発明のバクテリオファージは、頭部の径が４０～９０ｎｍ、好ましくは７０～８０ｎｍで、尾部の長さが５～３０ｎｍ、好ましくは１５～２５ｎｍで、幅が５～２０ｎｍ、好ましくは９～１５ｎｍである。

【0031】

本発明のバクテリオファージのゲノムは２本鎖である。

【0032】

本発明のバクテリオファージのゲノムサイズは、特に限定されないが、例えば、６,０００～２８０,０００ｂｐ、好ましくは５０，０００～７０，０００ｂｐ、より好ましくは６１,０００～６３,０００ｂｐである。なお、このゲノムサイズは全ゲノム塩基配列の値である。

【0033】

本発明のバクテリオファージのＧＣ含量は、特に限定されないが、例えば、５５～７５％であり、好ましくは６０～７０％、より好ましくは６３～６６％である。なお、このＧＣ含量は全ゲノム塩基配列から算出された値である。

【0034】

本発明のバクテリオファージがコードする遺伝子数は、特に限定されないが、例えば、１０～３３０個であり、好ましくは６０～８０個であり、より好ましくは７６個である。この７６個の遺伝子には、７５個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と１個のｔＲＮＡが含まれる。

【0035】

本発明のバクテリオファージのゲノムDNAは、制限酵素Hind III処理により５つ以上の断片となることが好ましく、６００ｂｐ以上の断片が５つ以上となることがより好ましく、６００ｂｐ以上の断片が５つとなることが特に好ましい。制限酵素Hind IIIで処理する条件は、３５～４０℃で、１２～２４時間である。

【0036】

更に、本発明のバクテリオファージは、例えば、tRNA-Ser、lysogenic repressor（ORF9）、等の遺伝子等を有していてもよい。

【0037】

以上説明した本発明のバクテリオファージの好ましいものとしては、本発明者らが見出したＲＫＰ１８０が挙げられる。このＲＫＰ１８０は、ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１８５として、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（住所：〒２９２－０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に２０２０年３月２７日付で国際寄託されている。

【0038】

なお、本発明のバクテリオファージには、上記性質を維持したまま、改変、変異等をしたものも含まれる。

【0039】

本発明のバクテリオファージは、幅広い青枯病菌に感染できることから、これを有効成分とすることにより青枯病防除剤とすることができる。

【0040】

なお、ここで防除とは、青枯病菌の植物への感染の抑止と軽減、青枯病の発病抑止と軽減、青枯病の感染拡大の抑止と軽減、青枯病菌の駆除のことをいう。

【0041】

この青枯病防除剤における、本発明のバクテリオファージの含有量は、防除の目的に合わせて適宜設定すれば良いが、例えば、本発明のバクテリオファージを力価で１０^３～１０^１２ｐｆｕ／ｍＬ、好ましくは１０^５～１０^１１ｐｆｕ／ｍＬ含有させればよい。

【0042】

また、この青枯病防除剤には、有効成分である本発明のバクテリオファージだけでもよいが、更に、薬学的、農学的に許容されるタンパク質安定剤など、他の物質や組成物等を含有させてもよい。

【0043】

上記した青枯病防除剤は、植物または植物生長媒体に投与することにより、植物の青枯病を防除することができる。植物としては、例えば、ナス科のトマトやナス、ピーマン、タバコ、シソ科のシソやエゴマ、ショウガ科のショウガやウコン、クルクマ等が挙げられる。また、植物生長媒体としては、土壌、有機物を含むマットなどの固形媒体、また養液を含む液体等が挙げられる。これら植物または植物生長媒体に青枯病防除剤を投与する方法や条件は、特に限定されないが、例えば、植物体や植物生長媒体への散布や投下、植物体への注入等である。

【実施例】

【0044】

以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。

【0045】

実 施 例 １
バクテリオファージの分離：
土壌を水に懸濁した後、静置し、上清を得た。この上清を０．２５μｍのフィルターで濾過し、濾液を青枯病菌を宿主としたプラークアッセイに供試した。生じたプラークを単離することでバクテリオファージＲＫＰ１８０を得た。

【0046】

実 施 例 ２
バクテリオファージＲＫＰ１８０の解析：
（１）電子顕微鏡解析
４Ｘ１０^１０ｐｆｕ／ｍLのファージ懸濁液を１％uranyl acetateで染色し、電子顕微鏡（JEM-1400Pus、日本電子社製）で撮影した。
（２）ゲノムサイズの決定
フェノール・クロロホルム抽出によってファージ粒子からゲノムDNAを精製した。精製したゲノムDNAに対して０．３％アガロース（Agarose 1200 Standard Type、ピーエイチジャパン社製）を用いて、Mupid-2plus電気泳動装置（Mupid社製）でアガロースゲル電気泳動法を実施した。

【0047】

サイズマーカーのバンドを参照したところ、ＲＫＰ１８０のゲノムサイズは４８，５００ｂｐ以上であった。

【0048】

（３）ゲノム構造の決定
上記で精製したゲノムDNAを１本鎖DNA分解酵素（S1 Nuclease、プロメガ社製）およびDNA分解酵素（Recombinant DNase I、タカラバイオ社製）、RNA分解酵素（RNase A、タカラバイオ社製）で処理し、上記方法で電気泳動を実施した。

【0049】

ＲＫＰ１８０のDNAは１本鎖DNA分解酵素およびRNA分解酵素では分解されなかったが、DNA分解酵素で分解されたことから、ＲＫＰ１８０のゲノムは２本鎖DNAであることが明らかになった。

【0050】

ＲＫＰ１８０のゲノムDNAは、制限酵素Hind IIIを用い、３７℃で１６時間の処理により６００ｂｐ以上の５つの断片となることが分かった。

【0051】

（４）ゲノム解析
ＲＫＰ１８０のゲノムDNAのショットガン配列決定を、PacBio RS II (PACIFIC BIOSCIENCES社製)で行った。決定した塩基配列のアセンブリをRS_HGAP Assembly 2.3.0で行った。最近縁株を算出するための全ゲノム配列の相同性検索はBLASTNで行なった。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はMiGAP ver2.23 (ライフサイエンス統合データベースセンター)におけるMetaGeneAnnotator 1.0および、tRNAscan-SE 1.23、BLAST 2.2.18、RNAmmer 1.2で同定し、COGおよびRefseq、TrEMBL、nrデータベースに対してBLASTPおよびPSI-BLASTを用いてホモロジー検索を行った。ホモロジー検索では、類似性のカットオフとして、E-valueが1e-4未満とした。ＯＲＦのドメイン検索はBLASTPおよびInterPro 78.1を使用した。アミノ酸配列のアライメントはClustal2.1を使用した。遺伝子地図はMiGAPで得られたデータを使用し、作成した。全ゲノム配列およびlarge terminaseのアミノ酸配列の系統樹はMEGA7.0.26のClustalWで相同性比較し、Maximum Likelihood法で作成した。特許文献 特願2018-24589号公報のRalstonia phage RSB2（AB597179.1）及びRalstonia phage GP4（MH638294.1）、Burkholderia phage Bcep22（AY349011.3）のゲノム配列をNCBIより取得し、RSB2及びGP4、Bcep22も上記の方法で、MiGAPによるアノテーションを実行した。

【0052】

ＲＫＰ１８０のゲノムは直鎖状２本鎖DNAであった。そのゲノムサイズは６１，６９６ｂｐで、ＧＣ含量は６４．６％であった。ＲＫＰ１８０の全ゲノムを上記したように決定したものを配列番号１に示した。PacBio RS IIを用いたショットガン配列決定法および全塩基配列に基づく系統解析から、ＲＫＰ１８０ゲノムはカウドウイルス(Caudovirales)目ポドウイルス（podovirus）科Bcep22様ウイルス (Bcep22-like virus)属に属すことが示され、電子顕微鏡解析の結果と一致した（図１、下記参照）。BLASTNによるホモロジー検索では、最近縁株は既知のRalstonia phage GP4株（被覆率７７％、相同性９７％、表１、図２）、次いで、Burkholderia cenocepacia phage BcepIL02 株（被覆率２０％、相同性７８％）、Burkholderia phage DC1 株（被覆率２１％、相同性７８％）、Burkholderia cepacia phage Bcep22 株（被覆率２２％、相同性７８％）、Burkholderia phage BcepMigl株（被覆率２１％、相同性７８％）と近縁であった。（表１、図２）。

【0053】

【表1】

【0054】

また、large terminaseのアミノ酸配列に基づく系統解析から、ＲＫＰ１８０のゲノムDNA は末端重複配列[terminal redundancy ; TR]の環状順列[circular permuted ; CP]構造を有する系統群に分類された（図３）。

【0055】

図４に示すようにＲＫＰ１８０のゲノムは計７６個の遺伝子からなり、７５個のＯＲＦと１個のtRNAがコードされていた。各遺伝子の機能と産物の一覧を表2に示した。

【0056】

【表2】

【0057】

MiGAPを用いてゲノムの主要な遺伝子地図を表記し、ＲＫＰ１８０と公知のRalstonia phage GP4株とBurkholderia cepacia phage Bcep22株を比較した（図５）。また、比較ゲノムソフトLAGANを用いて、全塩基配列も比較した（図６）。

【0058】

ゲノム構造はRalstonia phage GP4株とBurkholderia cepacia phage Bcep22株に類似していた（図５、６）。

【0059】

ＲＫＰ１８０ゲノムの特徴は、lysozymeが融合型した制限機構防御遺伝子であるDarB遺伝子を有し、３つの溶菌酵素、DarBとendolysinとRz/Rz1をコードする遺伝子を有し、バイオフィルム形成阻害タンパク質CsrAをコードする遺伝子を有し、異なる２つのtail fiber proteinをコードする遺伝子を有することである。

【0060】

さらに、ＲＫＰ１８０のゲノム構造はGP4のゲノム構造と良く似ている一方で、DarB遺伝子（ＯＲＦ６６）、２つの溶菌酵素遺伝子（ＯＲＦ６９とＯＲＦ７５）、１つの尾部繊維遺伝子（ＯＲＦ５９）よってコードされるタンパク質についてはGP4のホモログと相同性の低いことが特徴である（図６～８）。

【0061】

ＲＫＰ１８０のORF66はlysozyme様溶菌酵素とDarB[defence against restriction]とが融合した融合タンパク質をコードする（図７）。この融合タンパク質と相同なものはBurkholderia virus BcepIL02の DarB-like antirestriction protein（被覆率９０％、相同性６８％）、Burkholderia virus DC1のsoluble lytic transglycosylase/helicase/methylase protein（被覆率８９％、相同性６８％）、 Burkholderia virus Bcep22のDarB-like antirestriction protein （被覆率９７％、相同性６７％）であった（表３）。

【0062】

一方で、最近縁種であるRasltonia phage GP4株のDarB-like antirestriction protein
とは被覆率５３％、相同性９３％と低い相同性であった(表３)。これは、lysozyme様ドメインが保存されているものの、宿主菌の制限機構に対して防御するDarBドメイン中のメチラーゼドメインとヘリケースドメインが不完全なためで、相同領域が限定されているためだった（表４、図６、７、文献１（Gill JJ, Summer EJ, Russell WK, Cologna SM, Carlile TM, Fuller AC, Kitsopoulos K, Mebane LM, Parkinson BN, Sullivan D, Carmody LA, Gonzalez CF, LiPuma JJ, Young R. 2011. Genomes and characterization of phages Bcep22 and BcepIL02, founders of a novel phage type in Burkholderia cenocepacia. J Bacteriol 193:5300-5313.））。

【0063】

【表3】

【0064】

【表4】

【0065】

ＲＫＰ１８０のＯＲＦ６９には、溶菌酵素であるＮ－アセチルムラミダーゼ活性を持つendolysin[DUF3380 domain-containing protein]がコードされていた（文献２（Rodriguez-Rubio L, Gerstmans H, Thorpe S, Mesnage S, Lavigne R, Briers Y. 2016. DUF3380 Domain from a Salmonella Phage Endolysin Shows Potent N-Acetylmuramidase Activity. Appl Environ Microbiol 82:4975-4981.）、文献３（Love MJ, Bhandari D, Dobson RCJ, Billington C. 2018. Potential for Bacteriophage Endolysins to Supplement or Replace Antibiotics in Food Production and Clinical Care. Antibiotics (Basel) 7：17））。BLASTPによるホモロジー検索では、GP4株のＯＲＦ６５(AXG67760.1)と最も相同性が高く(被覆率１００％、相同性８２％、表５)、N末側（１－１００ａａ）の領域の相同性は９６％（被覆率１００％）と高かったが、C末側（１０１－１９７ａａ）の相同性は６８％（被覆率１００％）と、N末端側より相同性が低かった（表６、図８）。

【0066】

【表5】

【0067】

【表6】

【0068】

ＲＫＰ１８０ではＯＲＦ７４にRz、ORF75にRz1というspanin溶菌酵素がコードされていた。Rz1はRz遺伝子内に異なるリーディングフレームで存在し、多くのファージがRzとRz1の両方を有する（文献１）。

【0069】

ＲＫＰ１８０と最近縁株であるGP4はRzを有し、ＲＫＰ１８０のＯＲＦ７４とGP4のRz-like lysisタンパク質との間の相同性は９３％（被覆率１００％）と、高い相同性を示したが（表７）、Rz1を有していない（文献４ （Wang R, Cong Y, Mi Z, Fan H, Shi T, Liu H, Tong Y. 2019. Characterization and complete genome sequence analysis of phage GP4, a novel lytic Bcep22-like podovirus. Arch Virol 164:2339-2343.)）。一方、近縁株であるBurkholderia virus DC1とBurkholderia virus Bcep22はRzとRz1の両方のホモログを有しているが、ＲＫＰ１８０のＯＲＦ７４（Rz）とＯＲＦ７５（Rz１）とはそれぞれDC１では４９％（被覆率８５％）と５７％（被覆率８６％）、Bcep22では４６％（被覆率１００％）と５６％（被覆率８６％）であり、いずれも相同性が低かった（表７、８）。

【0070】

【表7】

【0071】

【表8】

【0072】

上記３つの溶菌酵素の機能によりＲＫＰ１８０は効率良く宿主菌を溶菌し、感染サイクルが効率的になっていると考えられる。また、これら溶菌酵素の違いによりＲＫＰ１８０は最近縁株であるGP4と異なる特徴の感染サイクルを有すると考えられる（下記参照、文献４）。

【0073】

ＲＫＰ１８０のＯＲＦ４７には、CsrA[carbon storage regulator]タンパク質がコードされていることが分かった（表９）。CsrAはバイオフィルム形成を抑制する遺伝子である（文献５（Lynch KH, Stothard P, Dennis JJ. 2012. Characterization of DC1, a Broad-Host-Range Bcep22-Like Podovirus. Appl Environ Microbiol 78:889-891.））。大腸菌においてCsrAの発現はバイオフィルム形成を抑制し、また運動性の増加によってバイオフィルムの発達を阻害する（文献６（Lu TK, Collins JJ. 2009. Engineered bacteriophage targeting gene networks as adjuvants for antibiotic therapy. Proc Natl Acad Sci U S A 106:4629-4634.）、文献７（Jackson DW, Suzuki K, Oakford L, Simecka JW, Hart ME, Romeo T. 2002. Biofilm Formation and Dispersal under the Influence of the Global Regulator CsrA of Escherichia coli. J Bacteriol 184:290-301.））。さらに、近縁のBurkholderia Bcep22 group phageでは、バイオフィルム形成阻害への関連性が示唆されている（文献５）。また、青枯病は青枯病菌によるバイオフィルム形成が原因で起き、青枯病菌はCsrAによって制御されることが知られているバイオフィルム形成や運動性に関与する遺伝子を有する（文献８（Clough SJ, Lee KE, Schell MA, Denny TP. 1997. A two-component system in Ralstonia (Pseudomonas) solanacearum modulates production of PhcA-regulated virulence factors in response to 3-hydroxypalmitic acid methyl ester. J Bacteriol 179:3639-3648.）、文献９（Brown DG, Allen C. 2004. Ralstonia solanacearum genes induced during growth in tomato: an inside view of bacterial wilt. Molecular Microbiology 53:1641-1660.）、文献１０（Hikichi Y, Mori Y, Ishikawa S, Hayashi K, Ohnishi K, Kiba A, Kai K. 2017. Regulation Involved in Colonization of Intercellular Spaces of Host Plants in Ralstonia solanacearum. Front Plant Sci 8：967.））。

【0074】

以上のことから、CsrAを有するＲＫＰ１８０によって青枯病菌によるバイオフィルム形成が阻害されるとともに青枯病菌が溶菌され、その結果、ＲＫＰ１８０による高い防除効果が期待される。Ralstonia phageの中ではGP4のみが相同遺伝子を有しているが、防除効果を確認できているRalstonia phageはＲＫＰ１８０のみである。

【0075】

【表9】

【0076】

ＲＫＰ１８０のＯＲＦ５８とＯＲＦ５９には、異なる２つの尾部繊維タンパク質[tail fiber protein]がコードされていた（表１０、表１１）。尾部繊維タンパク質は宿主菌の表層に存在するレセプター分子と特異的に結合し、この特異性がバクテリオファージの宿主特異性、すなわち宿主域を決定する（文献１、１１（Bartual SG, Otero JM, Garcia-Doval C, Llamas-Saiz AL, Kahn R, Fox GC, van Raaij MJ. 2010. Structure of the bacteriophage T4 long tail fiber receptor-binding tip. Proc Natl Acad Sci U S A 107:20287-20292.））。

【0077】

ＲＫＰ１８０のＯＲＦ５８はRalstonia phage GP4のＯＲＦ７６の尾部繊維タンパク質（AXG67771.1）と最も相同であった（被覆率１００％、相同性９９％）（表１０）。

【0078】

【表10】

【0079】

また、ＲＫＰ１８０のＯＲＦ５９はRalstonia phage GP4のＯＲＦ７５（AXG67770.1）と最も相同であった（被覆率１００％、相同性８５％）（表１１）。InterPro 78.1を用いてドメイン検索したところ、ＯＲＦ５９のC末端側１０９～２８０アミノ酸領域がReceptor-binding domain of short tail fibre protein gp12 SUPERFAMILY(SSF88874)として同定された。このドメインは、T4ファージの短尾部繊維gp12 （short tail fiber)の宿主認識部位である（文献１、１２（Leiman PG, Arisaka F, Raaij ML, Kostyuchenko VA, Aksyuk AA, Kanamaru S, Rossmann MG. 2010. Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers. Virology J 7:355.）。このＲＫＰ１８０のＯＲＦ５９の宿主認識部位ドメインに相当するアミノ酸１０９～２８０の領域を使ってBLASTPによるホモロジー検索を行うと、Burkholderia virus DC1の尾部繊維タンパク質の相同部位と最も相同（被覆率１００％、相同性８５％）で、Ralstonia phage GP4では相同性が７７％と低かった （被覆率１００％、表１２）。これらのことから、ＯＲＦ５９ホモログの宿主認識部位の配列の違いがRalstonia phage のＲＫＰ１８０とGP4の宿主域の違いに起因すると考えられる。

【0080】

【表11】

【0081】

【表12】

【0082】

（４）まとめ
以上の結果より、バクテリオファージＲＫＰ１８０は以下の性質を有することが分かった。
・ＲＫＰ１８０のゲノムは２本鎖ＤＮＡで、末端重複配列[terminal redundancy;TR]の環状順列[circular permuted;CP]構造である。
・Caudovirales目podovirus科に属する。
・ゲノムサイズは、６１，６９６ｂｐ
・ＧＣ含量は６４．５８％
・７６個の遺伝子（７５個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と１個のtRNA）がコードされている。
・公知のBurkholderia cenocepacia に感染するバクテリオファージ (podovirus科Bcep22 virus属)と類似
・最近縁株は既知のRalstonia phage GP4株であった（被覆率７７％、相同性９７％）。
・制限機構防御遺伝子DarBを有する。
・３つの溶菌酵素、DarB、endolysin、Rz/Rz1をコードする遺伝子を有する。
・バイオフィルム形成阻害CsrA遺伝子を有する。
・異なる２つの尾部繊維タンパク質[tail fiber protein]をコードする遺伝子を有する。

【0083】

実 施 例 ３
青枯病菌の分離：
（１）発病株からの分離
発病株の茎を切断し、菌泥を回収した。その菌泥を滅菌水で適当に希釈し、改変SMSA培地に塗布し、生じたコロニーをCPG寒天培地（１Ｌ当たりペプトン１０ｇ、カザミノ酸１ｇ、グルコース５ｇ、寒天１７g）に分離した。

【0084】

（２）土壌からの分離
土壌と水をよく混合し、静置後、上清を分離した。分離した上清を水で適当に希釈し、その希釈液を改変SMSA培地に塗布した。生じたコロニーはCPG寒天培地に分離した。
＜改変SMSA培地（１L当たり）＞
ペプトン 10g
グルコース 5g
カザミノ酸 1g
寒天 17g
バシトラシン(10 mg/mL) 2.5mL
ポリミキシンB硫酸塩(50mg/mL) 2mL
クロラムフェニコール(10 mg/mL) 0.5mL
ぺニシリンGカリウム塩(1mg/mL) 0.5mL
クリスタルバイオレット(1mg/mL) 5mL
テトラゾリウムクロライド(10mg/mL) 5mL

【0085】

（３）結果
上記した方法によって１圃場から１株の青枯病菌を分離し、ナス科、ショウガ科、シソ科などを宿主とする計７０株以上の青枯病菌株を分離した。

【0086】

実 施 例 ４
ＲＫＰ１８０の宿主域の検討：
（１）感染の有無
感染の有無はプラークアッセイまたはスポットテストによって調べた。

【0087】

（２）プラークアッセイ
青枯病菌をCPG培地（１Ｌ当たりペプトン１０ｇ、カザミノ酸１ｇ、グルコース５ｇ）で２８℃、一晩培養した。菌培養液をCPG培地でＯＤ６００が０．２５となるよう調整した。ファージ液の段階希釈液を調整し、前記菌培養液と混合した。２８℃で３０分間静置後、トップアガー（１Ｌ当たりペプトン３ｇ、カザミノ酸０．３ｇ、グルコース１．７ｇ、寒天５ｇ）３ｍｌと上記の菌／ファージ混合液を混ぜ、CPG寒天培地に重層した。２８℃で一晩培養し、感染の有無をプラークの有無で確認した。

【0088】

（３）スポットテスト
青枯病菌をCPG培地で２８℃、一晩培養した。菌培養液をCPG培地でＯＤ６００が０．２５となるよう調整した。この菌液２５０μＬとトップアガー３ｍｌを混合し、CPG寒天培地に重層した。トップアガーが固まった後、ファージ液をスポットし、溶菌斑（プラーク）の有無を観察し、感染の有無を調べた。

【0089】

（４）結果
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構農業生物資源ジーンバンク（茨城県つくば市）から入手可能な表１３に記載の３４株を含む自然界から分離したナス科、ショウガ科、シソ科などを宿主とする計１００株以上の青枯病菌株全てに感染することが分かった。

【0090】

【表13】

【0091】

実 施 例 ５
ワンステップ増殖法によるＲＫＰ１８０の感染サイクルの評価
CPG培地でＯＤ６６０が０．１３となるまで培養した青枯病菌MAFF730103株の培養液９９０μLとＲＫＰ１８０ファージ液（７Ｘ１０^８ｐｆｕ／ｍL）１０μLを混合した後、室温で静置し、菌とファージを吸着させた。１０分後、５，０００Ｘｇで１０分間遠心し、上清を回収した後、プラークアッセイを行い、吸着したファージ数を求めた。沈殿物は１ｍLのCPG培地に再懸濁し、５０μLを２４，９５０μLのCPG培地に添加し、２８℃で振盪培養した。振盪開始後から１６０分間、１０分毎に１０μLを採取し、９９０μLのCPG培地に混和し、再吸着を防いだ。この混和液または必要に応じ段階希釈した希釈液の１００μLと、ＯＤ６６０が０．２２～０．２４になるよう調整したMAFF730103株の培養液２５０μLとを混合し、全量を直ちにトップアガーに加え、撹拌後CPG培地に重層した。生じたプラーク数を計測し、力価を求めた。各時間の力価と吸着したファージ数から宿主菌１細胞から生じるファージ数（バーストサイズ）を算出した。その結果を図９に図示し、表１４にまとめた。

【0092】

【表14】

【0093】

以上から、ＲＫＰ１８０の潜伏時間は８０分で１感染サイクルが１５０分であることが分かった。これは、最近縁種でRalstonia phageであるGP4より短い感染サイクルで、更にバーストサイズも１６２±８ｐｆｕと大きかった（文献５）。この効率の良い感染サイクルは、上記ゲノム解析の結果から、制限機構防御遺伝子DarBと３つの溶菌酵素（前記DarB、endolysin、Rz/Rz1）をコードする遺伝子を有するためと考えられる。

【0094】

実 施 例 ６
ＲＫＰ１８０の防除効果の検討
大玉種世界一のセル苗（各試験区２４株）を３Ｘ１０^９ｐｆｕ／ｍLのファージ液に２分間浸漬した。対照区は無処理とした。翌日、ポットに定植するとともに、ＯＤ６６０＝０．１（約１Ｘ１０^８ｃｆｕ／ｍL相当）に調整した青枯病菌MAFF730131株の菌液５ｍＬを株元に灌注し、３３日間観察した（図１０）。

【0095】

菌接種後３３日目でファージ無処理区では２４株中２１株が発病し枯死し、健全株は３株のみだった。一方、ＲＫＰ１８０処理区では２４株中８株の枯死に止まり、健全株は１６であった。すなわち、ＲＫＰ１８０処理によって健全株数が約５倍に改善され、防除価６２となり、ＲＫＰ１８０の防除効果が認められた。

【0096】

実 施 例 ７
青枯病防除剤の調製：
実施例１で分離したバクテリオファージＲＫＰ１８０を、３Ｘ１０^９ｐｆｕ／ｍＬの力価に調整して青枯病防除剤とした。

【産業上の利用可能性】

【0097】

本発明のバクテリオファージは、青枯病の防除に利用できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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