特許 7547478 ファージ耐性微生物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-30

(45)【発行日】2024-09-09

(54)【発明の名称】ファージ耐性微生物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20240902BHJP

   C12N 7/00 20060101ALN20240902BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20240902BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 C

C12N1/20 A ZNA

C12N7/00

C12N15/31

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2022525452

(86)(22)【出願日】2019-11-27

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-09

(86)【国際出願番号】 IB2019001262

(87)【国際公開番号】W WO2021105733

(87)【国際公開日】2021-06-03

【審査請求日】2022-11-11

(73)【特許権者】

【識別番号】522170504

【氏名又は名称】イノバシオン・イ・デサロージョ・デ・エネルヒーア・アルファ・スステンタブレ・ソシエダ・アノニマ・デ・カピタル・バリアブレ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】クラウディオ・ガリバイ・オリヘル

(72)【発明者】

【氏名】リリアーナ・ドンディエゴ・ロドリゲス

(72)【発明者】

【氏名】ハビエル・アセド・スニーガ

(72)【発明者】

【氏名】イヴァン・アレハンドロ・デ・ラ・ペーニャ・ミレレス

【審査官】北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】特開昭６１－１３２１７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，2003年，Vol.69, No.1, pp.170-176

【文献】Frontiers in Microbiology，2019年04月，Vol.10, Article 850，<doi: 10.3389/fmicb.2019.00850>

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－１／３８

Ｃ１２Ｑ １／００－３／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ファージによる感染に耐性があるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株を生成するための方法であって、前記方法が、
ａ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株のｔｆａＤ遺伝子およびｙｅｊＯ遺伝子に変異を作製することと、
ｂ）前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株を、０．６～５の光学密度（６００ｎｍ）に達するまで成長させることと、
ｃ）１００プラーク形成単位を超える濃度を有するファージの混合物を添加することと、
ｄ）前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株の培養物を、ファージと室温で３０分間～６時間接触させることと、
ｅ）３７℃で１時間～８時間かけて細胞溶解させることと、
ｆ）前記培養物を１時間から２４時間かけて回復させることと、
ｇ）Ｍ９培地を有するプレート内でコロニーを単離することと、
ｈ）ａ）～g）のステップを繰り返すことによって、前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株の耐性を検証することと、を含む、方法。

【請求項2】

ＳｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅおよびＭｙｏｖｉｒｉｄａｅファミリー由来のファージによる感染に耐性があるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株が生成される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ファージλ、φ８０およびＴ４による感染に耐性があるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株が生成される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

ファージ感染に耐性があり、ｔｆａＤ遺伝子およびｙｅｊＯ遺伝子に変異を有する、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株であって、前記変異したｔｆａＤ遺伝子は配列番号３として表されるヌクレオチド配列を有し、前記変異したｙｅｊＯ遺伝子は配列番号７として表されるヌクレオチド配列を有する、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バクテリオファージによる感染に耐性がある遺伝子改変微生物を提供する。本発明はまた、バクテリオファージ感染耐性微生物を作製する方法も提供する。

【背景技術】

【0002】

細菌培養は、バイオテクノロジー産業の中心である。あるプロセスが収益を上げるかどうかは、適切な成長に依存する。したがって、培養条件に対する制御を維持するために、多数の厳密な尺度が採用される。しかし、これらの培養物は、他の微生物による汚染を受けやすいか、またはバクテリオファージまたはファージと呼ばれる多数のウイルスによって感染する可能性がある。

【0003】

ファージ感染の間、ファージは、宿主が完全に破壊され、培養物中の残存する感受性細胞を攻撃する可能性がある数百のウイルス粒子を放出するまで、溶解サイクル中に宿主細胞を認識し、これを攻撃する。本発明より以前は、ファージ感染の驚異は、バイオテクノロジー目的物の細菌培養に影響を与える最も重大な問題の１つであり、産生プロセスにおいて著しい損失を引き起こす。このことにより、バクテリオファージによる感染に耐性がある増強株の生成を可能にする方法を発見する必要性が生じていた。

【0004】

ＵＳ５２４０８４１Ａは、バクテリオファージＱβに耐性があるＥ．ｃｏｌｉ株を生成する方法を記載しており、記載されている。この方法は、対応するウイルスレプリカーゼ遺伝子の特定の領域を単離することからなる。この領域は、その複製のための特定の配列中のウイルスゲノムに結合する機能を有する、ウイルスレプリカーゼのペプチド部分をコードする。単離された後、この部分をＥ．ｃｏｌｉゲノムに導入することができる。ペプチドとして発現すると、その結合部位について、ウイルスの複製および拡散を防止するウイルスレプリカーゼと競合し、宿主に耐性を与える。しかし、この戦略を、Ｅ．ｃｏｌｉに感染する全てのバクテリオファージに適合するためには、ペプチドをＥ．ｃｏｌｉ株中の各ファージに対して生成しなければならず、これは不可能である。

【0005】

Ｈｏｎｇ Ｊ ｅｔ ａｌ．（Ｈｏｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ｏｆ ａ ｎｅｗｌｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ Ｔ５－ｌｉｋｅ ｐｈａｇｅ ＥＰＳ７．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ．Ｖｏｌ ２８９（２）．ｐｐ２０２－２０９．２００８．）は、ビタミンＢ１２の輸送に関与するＥ．ｃｏｌｉ中の膜貫通トランスポーターであるＢｔｕＢタンパク質が、Ｔ５様ファージＥＰＳ７の受容体として機能することを示した。このタンパク質ｂｔｕＢのコード遺伝子の一連の変異を作製することにより、ファージによる感染が遮断され、このことは、この受容体が、ファージの吸着プロセス中に重要な役割を有することを示している。

【0006】

Ｋｎｉｒｅｌ，ＹＡ．ｅｔ ａｌ．（Ｋｎｉｒｅｌ，ＹＡ． ｅｔ ａｌ．Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏ－ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｏ－ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ｐｈａｇｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ４ｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ １９７（５）．ｐｐ９０５－９１２．２０１５）は、ウマ由来の糞便物質から単離されたＥ．ｃｏｌｉ株４ｓの抗原Ｏの合成および構造の変形例を記載する。これらの変異は、バクテリオファージＧ７Ｃに対する耐性を誘導し、Ｅ．ｃｏｌｉ ４ｓと他の様々なバクテリオファージとの相互作用をさらに改変し、宿主細胞に対する耐性および感受性の両方をもたらす。

【0007】

ＷＯ１９９７／０２０９１７Ａ２は、ファージによる感染を妨害するタンパク質をコードする、ＡｂｉＥと呼ばれる遺伝子の使用を記載している。この遺伝子は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株中に天然形態で存在する。この遺伝子を単離し、プラスミドｐＳＲＱ８００にクローニングした。乳製品産業で使用されるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓまたは他の微生物の形質転換は、ファージ９３６、ｃ２およびＰ３３５による感染に対する耐性を与える。

【0008】

ＷＯ２００１／００７５６６Ａ２は、ｐＣＲＢ３３およびｐＣＲＢ６３の２つのプラスミドからなる、ファージによる感染に対する耐性を付与することができる遺伝子系を記載している。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株における形質転換の後、この株は、ファージによる感染に対する耐性を獲得する。プラスミドは、「ｓ」サブユニットと呼ばれる１型メチル化制限系の要素をコードする。両方のプラスミドが、これらの不完全な遺伝的要素を有している。「ｓ」サブユニットの配列中の大きな相同性に起因して、それらは細胞内で組み換えられ、第３のプラスミド（ｐＣＲＢ９６）を産生する。この組換えによって、ファージに対する耐性を付与する「Ｓ」サブユニットの完全なＯＲＦを産生する。

【0009】

ＣＡ２３１１５９８Ａ１は、乳製品産業で使用されるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓおよび他の株においてファージに対する耐性を付与するために必要な方法および要素を記載している。この特許は、プラスミドｐＳＲＱ９００によってコードされるＡｂｉ９００タンパク質の使用を記載している。目的の株においてこのプラスミドによって形質転換されることによって、感染妨害機構によるファージ９３６、ｃ２およびＰ３３５に対する耐性が提供される。

【0010】

Ｄｅｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｄｅｎｅｓ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，８１（１３），ｐｐ４２９５－４３０５（２０１５））は、ファージＬＰ－０４８およびＬＰ－１２５に耐性があるＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｓの株を単離した。配列決定によって、ファージＬＰ－０４８およびＬＰ－１２５の吸着のための２つの鍵となる遺伝子座中の変異を見出した。

【0011】

ファージ耐性株を有することを裏付けるためには、適切なファージ単離が必要である。当該技術分野で既知のファージ単離プロトコルの例としては、（１）（Ｕｃ－Ｍａｓｓ，Ａｕｇｕｓｔｏ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒ ｇｅｎｅ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｌａｍｂｄｏｉｄ ｐｈａｇｅｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ Ｃｏｒ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｓ ＦｈｕＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．，Ｖｏｌ ３２９．ｐｐ４２５－４３３．２００４．）および（２）（Ｋａｍｅｙａｍａ，Ｌｕｉｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ ｌａｍｂｄｏｉｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｗｉｄｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｇｅｉｍｍｕｎｉｔｙ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｕｓ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｎｏｎｌａｍｂｄｏｉｄ ｐｈａｇｅ ｇｒｏｕｐ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ ２６３．ｐｐ１００－１１１．１９９９）が挙げられ、またはＡＴＣＣなどの微生物コレクションから獲得することができる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明より以前は、Ｅ．ｃｏｌｉに感染する様々な種類のファージに対する耐性を付与するためのｔｆａＤ遺伝子およびｙｅｊＯ遺伝子中の変異または欠失に関連する開示はなされていないことに留意することが重要である。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明は、様々なファージによる感染に耐性がある遺伝子改変微生物を生成するための方法を提供する。

【0014】

本発明はまた、様々なファージファミリーによる感染に耐性がある遺伝子改変微生物も提供する。

【0015】

さらに、本発明は、様々な遺伝子中に点変異または欠失を有し、種々のファージファミリーに対する耐性も付与するＥ．ｃｏｌｉ株を提供する。

【0016】

本発明は、ＳｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅおよびＭｙｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのファージに耐性があるＥ．ｃｏｌｉ株を提供する。

【0017】

本発明は、ファージλ、φ８０およびＴ４に耐性があるＥ．ｃｏｌｉ株を提供する。

【0018】

さらに、本発明は、ファージλ、φ８０およびＴ４に耐性があり、野生型株と比較して、それらの速度定数を保持するＥ．ｃｏｌｉ株を提供する。

【0019】

上述の目的は、本発明の特定の態様を強調する。本発明の追加の目的、態様および実施形態は、以下の本発明の詳細な説明に見出される。

【0020】

本発明のより完全な理解およびそれに付随する多くの利点は、以下の詳細な説明と併せて以下の図面を参照することによってよりよく理解されるようになるにつれて容易に得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】Ｍ９寒天培地における、ファージλ、φ８０およびＴ４によって感染した野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２株とＥ．ｃｏｌｉ ＬＣＴ－ＢＦ－０１株との間の差を示す。ＬＣＴ－ＢＦ－０１株は、正常に成長し、一方、野生型株は、細胞溶解の指標である溶解性プラークを示すことが観察された。

【図2】ファージλ、φ８０およびＴ４による感染前後の液体Ｍ９培地におけるＥ．ｃｏｌｉ ＬＣＴ－ＢＦ－０１株および野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２株の成長の差を示す。ＬＣＴ－ＢＦ－０１株は、バクテリオファージによる感染に耐性があり、一方、野生型Ｋ１２株は、溶解する。野生型株（Ｘ）およびＬＣＴ－ＢＦ－０１株（Ｏ）の成長速度。矢印は、培養物がファージ混合物に感染する点を示す。

【図3】野生型ＴｆａＤタンパク質（配列番号２）および変異したＴｆａＤタンパク質（配列番号４）のタンパク質アラインメントを示す。

【図4】野生型ＴｆａＤ遺伝子（配列番号１）および変異したＴｆａＤ遺伝子（配列番号３）のタンパク質アラインメントを示す。

【図5-1】野生型ＹｅｊＯタンパク質（配列番号６）および変異したＹｅｊＯタンパク質（配列番号８）のタンパク質アラインメントを示す。

【図5-2】図５－１の続きである。

【図5-3】図５－２の続きである。

【図6-1】野生型ＹｅｊＯ遺伝子（配列番号５）および変異したＹｅｊＯ遺伝子（配列番号７）のタンパク質アラインメントを示す。

【図6-2】図６－１の続きである。

【図6-3】図６－２の続きである。

【図6-4】図６－３の続きである。

【図6-5】図６－４の続きである。

【図6-6】図６－５の続きである。

【図6-7】図６－６の続きである。

【発明を実施するための形態】

【0022】

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、酵素学、生化学、細胞生物学、分子生物学、および医学分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。

【0023】

本明細書に記載されるものと類似または同等の全ての方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができ、好適な方法および材料は、本明細書に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は、別途指定されない限り、例示的であるのみであり、限定的であることを意図しない。

【0024】

本発明の目的をよりよく理解するために、以下の定義および略語が確立される。

【0025】

「遺伝子（ｇｅｎｅ）」または「遺伝子（ｇｅｎｅｓ）」という用語は、当該技術分野で既知の窒素化合物または窒素塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンで構成される生体分子を指す。遺伝子は、酵素の生物学的合成のために細胞中の情報を伝達する分子である。

【0026】

「遺伝子座」という用語は、染色体上の遺伝子の固定位置を指す。

【0027】

「遺伝子座（ｌｏｃｉ）」という用語は、「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」の複数形、すなわち、染色体上の２つ以上の遺伝子の固定位置を指す。

【0028】

「基質」という用語は、微生物が成長するための、または所望の産物として使用するための炭素源として使用することができる分子を指す。基質の例は、炭水化物、脂質、タンパク質、有機酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、炭化水素などであり得る。

【0029】

「遺伝子の欠失または除去」という用語は、天然の終止コドン以外の遺伝子の任意の領域において、遺伝子を完全にまたは部分的に除去する、リーディングフレームを修飾する、または終止コドンを追加する手順を指し、また、遺伝子の転写および／または削減を防止する領域を追加または除去することを指す。

【0030】

「プラーク形成単位」という用語は、バクテリオファージによって感染した細胞、または培養物からの細胞を感染させたバクテリオファージの数を指す。

【0031】

「ファージ」または「バクテリオファージ」という用語は、細菌に感染することができ、感染サイクル中に細菌の細胞破裂を生じさせることができるウイルスを指す。これらのファージの例は、溶解サイクルまたは溶原性サイクルによるかに関わらず、Ｍ１３、Ｔ４、ラムダ、または細菌の感染を引き起こす当該技術分野に記載される任意の他のウイルスであり得る。ファージの溶解サイクルおよび溶原性サイクルは、本発明の分野に関連する任意の人物によって広く知られている。

【0032】

「バイオマス」という用語は、培養物を構成し、単一の種類の微生物（この場合、産生株および発酵プロセスから生じるその指数関数的成長）に対応する有機物の総量を指す。バイオマスは、６００ｎｍでの光学密度およびｇ／Ｌで表されるサーモスケールでの乾燥重量によって分光光度学的に決定される。

【0033】

「接種材料」という用語は、発酵プロセスを開始する目的の株に対応する初期バイオマス部分を指す。

【0034】

「発酵」という用語は、炭素源の酸化が、酸素を最終電子受容体として有することによって完全なものであってもよく、または不完全なものであってもよい異化代謝を指し、電子供与体および電子受容体として同時に機能する有機化合物が生成され、ＡＴＰが、基質レベルでのリン酸化によって生成される。

【0035】

「培養培地」という用語は、目的の株の成長を可能にするために必要な栄養素を含有する溶液を指す。当該技術分野で既知の培地は、Ｍ９、ＬＢ ２ＹＴ、および目的の株の成長に有用であり得る当該技術分野で報告されている任意の他の培地である。

【0036】

「嫌気条件」という用語は、酸素がリアクタータンクに供給され、究極の電子受容体として機能し、炭素源の酸化が完了する発酵期間を指す。

【0037】

「発現される」という用語は、発酵中に特定の条件で転写される遺伝子または遺伝子のセットを指す。

【0038】

「野生型株」という用語は、その種の元の遺伝物質、すなわち、その遺伝情報が修飾されていないものを保持する生物を指す。

【0039】

「μ」という用語は、培地中の栄養素の濃度、ならびに撹拌および通気などの操作パラメータに依存する、ｈ^－１で表される目的の株の特定の成長速度を指す。

【0040】

「Ｑｓ」という用語は、（ｇ／ｇ＊ｈ）で表される特定の基質の消費、すなわち、特定の期間中にバイオマス単位によって消費される基質の質量を指す。

【0041】

「減衰ファージまたはバクテリオファージ」という用語は、そのゲノムを宿主のゲノムと共に複製することができ、溶原性と呼ばれる状態で細胞死を引き起こさないウイルスを指す。

【0042】

「リアクター」という用語は、制御された方法で、化学反応、生化学反応もしくは生物学的反応が起こり得る好適な材料から構築された物理空間、またはそれらの組み合わせを指す。様々な種類のリアクターを、最先端技術で見出すことができる。例として、連続撹拌タンクリアクター（ＣＳＴＲ）、ピストンフローリアクター、流動層リアクター、充填層リアクター（ＰＢＲ）などのリアクターについて説明する。リアクターの特徴のいくつかは、以下である。ａ）実施中の反応に起因する腐食に対する耐性、ｂ）温度、撹拌、ｐＨ、溶存気体の濃度、圧力などの操作変数を監視し、制御する能力、ｃ）連続、半連続またはバッチであり得る操作モード（リアクターが機能することができる様々な動作モードは、当該技術分野で説明されている）、ｄ）反応を実行する様々な種類の触媒を使用する能力、例えば、触媒を溶解または捕捉または固定化することができる（触媒がリアクター内で反応を実行することができる様々なモードは、当該技術分野で説明されている）。本発明は、遺伝子変化に起因して、ファージによる感染に感受性のある微生物が、ファージによる感染に対する耐性を獲得することを可能にする方法を提供する。

【0043】

より具体的には、本発明は、ファージによる感染に感受性のある微生物を、１つ以上のファージによる感染に対して同時に耐性にすることを可能にする方法を提供する。

【0044】

さらに、本発明は、ファージによる感染に感受性のある微生物を、同じファミリーからの１つ以上のファージによる感染に対して同時に耐性にすることを可能にする方法を提供する。

【0045】

さらに、本発明は、ファージによる感染に感受性のある微生物を、異なるファミリーからの１つ以上のファージによる感染に対して同時に耐性にする方法を提供する。

【0046】

さらに、本発明は、特定の遺伝子中の変異に起因して、１種類以上のファージによる感染に耐えることができる微生物を提供する。

【0047】

さらに、本発明は、遺伝子変化に起因して、１つ以上のファージファミリーによる感染に耐えることができる微生物を提供する。

【0048】

最後に、本発明は、１つ以上のファージファミリーによる感染に耐えることができ、かつ同じ速度定数も保持する微生物を提供する。

【0049】

本発明の別の実施形態において、ファージλによる感染に耐性がある微生物を生成するための方法が提供され、ファージγを、特定の時間、微生物と接触させ、感染させる。その後、特定の時間で、培養物を回復させる。感染から生き残ることができた細菌は、以下のように単離され、生化学的、微生物学的、遺伝的に特性決定される。
Ｉ．Ｍ９培養培地を含有するフラスコにおいて、０．６～５、より具体的には１～３、より具体的には２～２．５の光学密度に達するまで、微生物を成長させる。
ＩＩ．ファージγを培養培地に添加し、ファージの濃度は、少なくとも１００プラーク形成単位、より具体的には少なくとも２５０プラーク形成単位、より具体的には少なくとも５００プラーク形成単位である。
ＩＩＩ．ファージ感染は、室温で、より好ましくは２０～２５℃の範囲の温度で、３０分間～６時間、より具体的には２時間～４時間、より具体的には２．５時間～３．５時間が可能である。
ＩＶ．培養により、３７℃で、より好ましくは３５～３９℃の範囲の温度で、１時間～８時間、より具体的には３時間～６時間、より具体的には４時間～５時間溶解させる。
Ｖ．培養により、１時間～２４時間、より具体的には６時間～２０時間、より具体的には１０時間～１６時間回復させる。回復は、室温、より好ましくは２０～２５℃の範囲の温度であってもよい。
ＶＩ．Ｍ９培地を有するか、または細胞成長に適した他の培地を有するプレート内でコロニーを単離する。
ＶＩＩ．ステップＩ～ＶＩを少なくとも２回繰り返すことによって、コロニーがファージλに耐性であることを検証する。

【0050】

本発明の別の実施形態において、ファージφ８０による感染に耐性がある微生物を生成するための方法が提供され、ファージφ８０を、特定の時間、微生物と接触させ、感染させる。その後、特定の時間中に、培養物を回復させる。感染から生き残ることができた細菌は、以下のように単離され、生化学的、微生物学的、遺伝的に特性決定される。
Ｉ．Ｍ９培養培地を含有するフラスコにおいて、０．６～５、より具体的には１～３、より具体的には２～２．５の光学密度に達するまで、微生物を成長させる。
ＩＩ．ファージφ８０を培養培地に添加し、ファージの濃度は、少なくとも１００プラーク形成単位、より具体的には少なくとも２５０プラーク形成単位、より具体的には少なくとも５００プラーク形成単位である。
ＩＩＩ．ファージ感染は、室温で、より好ましくは２０～２５℃の範囲の温度で、３０分間～６時間、より具体的には２時間～４時間、より具体的には２．５時間～３．５時間が可能である。
ＩＶ．培養により、３７℃で、より好ましくは３５～３９℃の範囲の温度で、１時間～８時間、より具体的には３時間～６時間、より具体的には４時間～５時間溶解させる。
Ｖ．培養により、１時間～２４時間、より具体的には６時間～２０時間、より具体的には１０時間～１６時間回復させる。回復は、室温、より好ましくは２０～２５℃の範囲の温度であってもよい。
ＶＩ．Ｍ９培地を有するか、または細胞成長に適した他の培地を有するプレート内でコロニーを単離する。
ＶＩＩ．ステップＩ～ＶＩを少なくとも２回繰り返すことによって、コロニーがファージφ８０に耐性であることを検証する。

【0051】

本発明の別の実施形態において、ファージＴ４による感染に耐性がある微生物を生成するための方法が提供され、ファージＴ４を、特定の時間、微生物と接触させ、感染させる。その後、特定の時間中に、培養物を回復させる。感染から生き残ることができた細菌は、以下のように単離され、生化学的、微生物学的、遺伝的に特性決定される。
Ｉ．Ｍ９培養培地を含有するフラスコにおいて、０．６～５、より具体的には１～３、より具体的には２～２．５の光学密度に達するまで、微生物を成長させる。
ＩＩ．ファージＴ４を培養培地に添加し、ファージの濃度は、少なくとも１００プラーク形成単位、より具体的には少なくとも２５０プラーク形成単位、より具体的には少なくとも５００プラーク形成単位である。
ＩＩＩ．ファージ感染は、室温で、より好ましくは２０～２５℃の範囲の温度で、３０分間～６時間、より具体的には２時間～４時間、より具体的には２．５時間～３．５時間が可能である。
ＩＶ．培養により、３７℃で、より好ましくは３５～３９℃の範囲の温度で、１時間～８時間、より具体的には３時間～６時間、より具体的には４時間～５時間溶解させる。
Ｖ．培養により、１時間～２４時間、より具体的には６時間～２０時間、より具体的には１０時間～１６時間回復させる。回復は、室温、より好ましくは２０～２５℃の範囲の温度であってもよい。
ＶＩ．Ｍ９培地を有するか、または細胞成長に適した他の培地を有するプレート内でコロニーを単離する。
ＶＩＩ．ステップＩ～ＶＩを少なくとも２回繰り返すことによって、コロニーがファージＴ４に耐性であることを検証する。

【0052】

本発明の別の実施形態において、ｔｆａＤ遺伝子およびｙｅｊＯ遺伝子中に変異を有し、ファージによる感染に耐性でもあるＥ．ｃｏｌｉ由来の細菌を生成するための方法が提供され、ファージを、特定の時間、微生物と接触させ、感染させる。その後、特定の時間中に、培養物を回復させる。感染から生き残ることができた細菌は、以下のように単離され、生化学的、微生物学的、遺伝的に特性決定される。
Ｉ．Ｅ．ｃｏｌｉ株に、ｔｆａＤ遺伝子およびｙｅｊＯ遺伝子中に変異を作製する。
ＩＩ．Ｍ９培養培地を含有するフラスコにおいて、０．６～５、より具体的には１～３、より具体的には２～２．５の光学密度に達するまで、Ｅ．ｃｏｌｉ株をｔｆａＤ変異およびｙｅｊＯ変異と共に成長させる。
ＩＩＩ．ファージλ、φ８０およびＴ４を培養培地に別個に、または混合して添加し、ファージの濃度は、少なくとも１００プラーク形成単位、より具体的には少なくとも２５０プラーク形成単位、より具体的には少なくとも５００プラーク形成単位である。
ＩＶ．ファージ感染は、室温で、より好ましくは２０～２５℃の範囲の温度で、３０分間～６時間、より具体的には２時間～４時間、より具体的には２．５時間～３．５時間が可能である。
Ｖ．培養により、３７℃で、より好ましくは３５～３９℃の範囲の温度で、１時間～８時間、より具体的には３時間～６時間、より具体的には４時間～５時間溶解させる。
ＶＩ．培養により、１時間～２４時間、より具体的には６時間～２０時間、より具体的には１０時間～１６時間回復させる。回復は、室温、より好ましくは２０～２５℃の範囲の温度であってもよい。
ＶＩＩ．Ｍ９培地を有するか、または細胞成長に適した他の培地を有するプレート内でコロニーを単離する。
ＶＩＩＩ．ステップＩ～ＶＩＩを少なくとも２回繰り返すことによって、コロニーがファージλ、φ８０およびＴ４に別個に、または混合した状態で耐性であることを検証する。

【0053】

本発明の上に記述された説明は、本技術分野の任意の当業者がそれを作製し、使用することが可能になるようにそれを作製し、使用する方法およびプロセスを提供し、この実行可能性は特に、元の説明の一部を構成する添付の特許請求の範囲の主題のために提供される。

【0054】

本明細書で使用される場合、「～からなる群から選択される」、「～から選択される」などの語句は、明記された材料の混合物を含む。

【0055】

数値的な境界または範囲が本明細書に記載されている場合、その端点が含まれる。また、数値的な境界または範囲内の全ての値および部分範囲は、明示的に書き出されているかのように具体的に含まれる。

【0056】

上の説明は、当業者が本発明を作製し、使用することを可能にするために提示され、特定の用途およびその要件の文脈において提供される。好ましい実施形態に対する様々な修正は、当業者には容易に明白であり、本明細書で定義される一般的な原理は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、他の実施形態および用途に適用され得る。したがって、本発明は、示される実施形態に限定されることを意図するものではなく、本明細書に開示される原理および特徴と一致する最も広い範囲を付与されるべきである。

【実施例】

【0057】

以下の実施例は、本発明の新規性を明らかにすることを意図している。以下の実施例は、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。本発明の開示、ならびに以下の実施例から、本発明の分野の当業者は、あらゆるやり方で本発明によって保護される枠組みの中にとどまるいくつかの修正を行うことができる。

【0058】

実施例１．ファージλ、φ８０およびＴ４に耐性がある株の生成。
本発明の場合、様々な微生物に感染する様々な環境ファージを単離したが、本発明の方法を例示するために、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌を使用した。

【0059】

様々な培養培地を使用して、細菌をファージと接触させた。培地のいくつかは、ＬＢ寒天培地およびＭ９寒天培地であった（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．（２０１２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。

【0060】

液体Ｍ９培地中の野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２の培養物を調製し、これを６時間～２４時間放置して成長させ、その後に、ファージλ、φ８０およびＴ４の混合物を添加した。感染サイクルを、室温で３０分～６時間とした。その後、培養物を透明化するために、培養物を３０℃で１時間～８時間インキュベートしたが、この瞬間には、細胞のほとんどが死滅している。その後、ファージ耐性細胞の繁殖を可能にするために、インキュベーションを継続した。１時間～２４時間の期間の後、培養物が再び成長し始めることが観察され、これを接種材料として採取し、耐性コロニーを単離した。

【0061】

Ｍ９寒天中に伸ばすことによって、プレートに播種した。３７℃で１６時間インキュベーションした後、ファージ耐性コロニーを観察し、再び感染させるために、これを選択した。

【0062】

選択した候補コロニーを、混釈法によってファージに対してチャレンジ試験した。まず、目的の株由来の液体中で培養物を６時間放置して成長させ、その後、ファージに感染させ、室温で１時間の感染サイクルを起こさせた。その後、感染した細胞を軟らかいＭ９寒天培地中で混合し、３７℃で１６時間インキュベートした。このインキュベーション期間終了時に、耐性株は溶解性プラークを示さず、一方、感受性株は示したことが観察された（図１）。

【0063】

単離されたコロニーに対し、少なくとも５回の感染単離サイクルを行った。感染単離サイクルの後、開始時に行われた遺伝子改変が耐性の原因であったことを検証するために、株を生化学的、微生物学的、遺伝的にレビューした。試験したファージによる感染に耐性があった株は、ＬＣＴ－ＢＦ－０１と命名された。

【0064】

ＬＣＴ－ＢＦ－０１株が、ファージλ、φ８０およびＴ４に耐性があり、液体培地中で成長することを示すために、１４Ｌリアクター中の培養物を、様々な操作条件でＭ９培地を使用して作製した。操作条件を表１に示す。

【表1】

【0065】

リアクターを準備し、１２１℃、圧力１５ｐｓｉｇで滅菌し、滅菌しながらＬＣＴ－ＢＦ－０１株由来のコロニーを播種し、６時間成長させた。その後、ファージλ、φ８０およびＴ４の混合物によって感染させ、リアクター中のその成長、ｐＨ、温度および酸素をさらに監視した。１６時間成長させた後、発酵中のいかなる瞬間にも、培養物が透明化しないことが観察された（図２）。同じ実験を、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２株を用いて行ったが、この株は、感染後に成長を示さなかった（図２）。この実施例では、ＬＣＴ－ＢＦ－０１株が、ファージλ、φ８０およびＴ４に耐性があることが示された。

【0066】

その後、生成した変異を裏付けるために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉｎｉＳｅｑ Ｓｙｓｔｅｍシーケンサーで、細菌配列決定キットを使用し、製造業者（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）の指示に従って、ＬＣＴ－ＢＦ－０１株を配列決定した。表２には、対応する感染プロセス中に変異を受けた遺伝子が示されている。

【表2】

【0067】

ＴｆａＤ野生型遺伝子は、配列番号１として表され、野生型ＴｆａＤタンパク質は、配列番号２として表される。変異したＴｆａＤ遺伝子は、配列番号３として表され、対応する変異したＴｆａＤタンパク質は、配列番号４として表される。

【0068】

ＹｅｊＯ野生型遺伝子は、配列番号５として表され、野生型ＹｅｊＯタンパク質は、配列番号６として表される。変異したＹｅｊＯ遺伝子は、配列番号７として表され、対応する変異したＹｅｊＯタンパク質は、配列番号８として表される。

【0069】

実施例２．ＬＣＴ－ＢＦ－０１株と野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２株の速度パラメータの比較。
好気条件下での速度パラメータを決定するために、１４Ｌリアクター中のＭ９培地中、ＬＣＴ－ＢＦ－０１株および野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２を培養した。培養には２４時間かかり、操作条件は、表３に示される。

【表3】

【0070】

屈折率検出器を備えたＨＰＬＣ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００装置（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、Ｒｅｚｅｘ－ＲＯＡ有機酸Ｈ^＋カラムを使用して、発酵中のグルコースおよび有機酸の濃度を監視した。発酵の結果を表４に示す。

【表4】

【0071】

これらの結果は、本発明で開発された株が、異なるファミリー由来のファージに耐性があり、ＴｆａＤ遺伝子およびＹｅｊＯ遺伝子の変異を有するにもかかわらず、ＷＴと同じ速度定数を有することを示している。

【0072】

上の教示の観点から、本発明に対する多数の修正および変形が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本発明は、本明細書に具体的に記載される以外の方法で実施され得ることを理解されたい。

【0073】

（参考文献）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図6-6】

【図6-7】

【配列表】

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