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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-30
(45)【発行日】2024-09-09
(54)【発明の名称】ヒトＩＬ－１５変異体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240902BHJP
C07K 14/54 20060101ALI20240902BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240902BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240902BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240902BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240902BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240902BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240902BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240902BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240902BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20240902BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240902BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240902BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240902BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240902BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C07K14/54 ZNA
C07K14/705
C07K16/28
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K38/20
A61K47/68
A61K48/00
A61K35/12
C12N15/62 Z
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2022570565
(86)(22)【出願日】2021-05-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-21
(86)【国際出願番号】 CN2021094167
(87)【国際公開番号】W WO2021233260
(87)【国際公開日】2021-11-25
【審査請求日】2023-01-16
(31)【優先権主張番号】202010417427.7
(32)【優先日】2020-05-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202110483653.X
(32)【優先日】2021-04-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】523079059
【氏名又は名称】山▲東▼先声生物制▲薬▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｓｉｍｃｅｒｅ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｒｏａｄ，Ｙａｎｔａｉ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ，Ｙａｎｔａｉ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２６４００６，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100115255
【弁理士】
【氏名又は名称】辻丸 光一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100201732
【弁理士】
【氏名又は名称】松縄 正登
(74)【代理人】
【識別番号】100154081
【弁理士】
【氏名又は名称】伊佐治 創
(74)【代理人】
【識別番号】100227019
【弁理士】
【氏名又は名称】安 修央
(72)【発明者】
【氏名】トン、チン
(72)【発明者】
【氏名】ルー、シーチアン
(72)【発明者】
【氏名】劉 楊
(72)【発明者】
【氏名】曹 卓暁
(72)【発明者】
【氏名】唐 任宏
(72)【発明者】
【氏名】レン、チンション
【審査官】大西 隆史
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／１６５４５３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１９－５３３４４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０７９７３８５４（ＣＮ，Ａ）
【文献】QUEMENER, Agnes et al.，Journal of Cell Science，2020年03月，Vol. 133, No. 5，pp. 1-13，DOI: 10.1242/jcs.236802
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
Ａ６１Ｋ ３８／００－５１／１２
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）野生型ＩＬ－１５のＡｓｐ８、Ｈｉｓ１０５、Ｖａｌ３またはＩｌｅ６に対応する１つ以上のアミノ酸残基に変異を含む、ＩＬ－１５変異ポリペプチド（２）ＩＬ－１５変異ポリペプチドに融合した免疫グロブリン分子またはその一部、および
（３）ＩＬ－１５変異ポリペプチドに融合したＩＬ－１５Ｒα
のドメインを含み、
前記ＩＬ－１５変異体のアミノ酸配列が、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５または配列番号４７に示す通りであり、
前記ポリペプチドが、
（イ）野生型ＩＬ－１５の増殖／発現より低いヒトＣＤ８ ＋ Ｔ細胞の増殖／発現を媒介し、および／または
（ロ）野生型ＩＬ－１５の増殖／発現より低いヒトＮＫ細胞の増殖／発現を媒介する、
活性を有し、
前記野生型ＩＬ－１５が配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、
前記ＩＬ－１５変異ポリペプチドが、リンカーペプチドを用いて免疫グロブリン分子またはその一部に融合し、もしくは、
前記ＩＬ－１５変異ポリペプチドが、リンカーペプチドを用いてＩＬ－１５Ｒαに融合するかまたはＩＬ－１５Ｒαと非共有結合する、タンパク質。
【請求項2】
前記変異がＡｓｐ８Ｓｅｒ（Ｄ８Ｓ）、Ａｓｐ８Ｇｌｙ（Ｄ８Ｇ）、Ａｓｐ８Ｇｌｕ（Ｄ８Ｅ）、Ａｓｐ８Ｇｌｎ（Ｄ８Ｑ）、Ａｓｐ８Ａｒｇ（Ｄ８Ｒ）、Ａｓｐ８Ｖａｌ（Ｄ８Ｖ）、Ａｓｐ８Ｉｌｅ（Ｄ８Ｉ）、Ａｓｐ８Ｌｅｕ（Ｄ８Ｌ）、Ａｓｐ８Ｔｈｒ（Ｄ８Ｔ）、Ｈｉｓ１０５Ｌｙｓ（Ｈ１０５Ｋ）、Ｈｉｓ１０５Ａｓｎ（Ｈ１０５Ｎ）、Ｖａｌ３Ｌｅｕ（Ｖ３Ｌ）、Ｉｌｅ６Ａｓｐ（Ｉ６Ｄ）、および／またはＩｌｅ６Ｐｒｏ（Ｉ６Ｐ）の群のアミノ酸置換から選択される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項3】
前記タンパク質の個々のドメインがＮ末端からＣ末端に（１）抗体分子または前記免疫グロブリンＦｃ領域、前記ＩＬ－１５Ｒα、および前記ＩＬ－１５変異ポリペプチド、
（２）抗体分子または前記免疫グロブリンＦｃ領域、前記ＩＬ－１５変異ポリペプチド、および前記ＩＬ－１５Ｒα、
（３）前記ＩＬ－１５変異ポリペプチド、前記ＩＬ－１５Ｒα、および抗体分子または前記免疫グロブリンＦｃ領域、または
（４）前記ＩＬ－１５Ｒα、前記ＩＬ－１５変異ポリペプチド、および抗体分子または前記免疫グロブリンＦｃ領域、
の順に連結している、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項4】
（１）免疫グロブリン重鎖、（２）免疫グロブリン軽鎖、
（３）ＩＬ－１５Ｒα、および
（４）ＩＬ－１５変異ポリペプチド
を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項5】
（１）免疫グロブリンＦｃ領域、（２）ＩＬ－１５Ｒα、および
（３）ＩＬ－１５変異ポリペプチド、
を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項6】
前記免疫グロブリンが抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗原結合断片から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項7】
前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体または前記抗原結合断片が１．８×１０－９ Ｍ以下の酸解離定数（ＫＤ）でヒトプログラム死配位子１（ＰＤ－Ｌ１）に結合し、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体が９．４×１０－１０ Ｍ以下の酸解離定数（ＫＤ）でカニクイザルプログラム死配位子１（ＰＤ－Ｌ１）に結合し、サルＰＤ－Ｌ１に結合してもしなくてもよく、または
マウスＰＤ－Ｌ１に結合してもしなくてもよい、
請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする単離核酸分子。
【請求項9】
請求項８に記載の単離核酸分子を含む、発現ベクターまたは宿主細胞。
【請求項10】
請求項１～７のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項８に記載の単離核酸分子、請求項９に記載の発現ベクターまたは宿主細胞、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項11】
個体における疾患の予防および／または治療のための医薬の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項８に記載の単離核酸分子、請求項９に記載の発現ベクターまたは宿主細胞、または請求項１０に記載の医薬組成物の使用である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は２０２１年５月１７日に出願されたＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０９４１６７号であり、これは２０２０年５月１８日に出願された中国特許出願第２０２０１０４１７４２７７号明細書および２０２１年４月３０日に出願された中国特許出願第２０２１１０４８３６５３号明細書を基礎とする優先権を主張するものであり、全ての目的のためにその開示の全てをここに取り込む。
【0002】
本発明は、ヒトＩＬ－１５変異体、それをコードする核酸、融合タンパク質およびＩＬ－１５変異体および複合変異を含む医薬組成物、ならびに腫瘍を治療するための医薬組成物の関連する使用に関する。
【背景技術】
【0003】
インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）は、１９９４年にサル腎皮内細胞株ＣＶ－１／ＥＢＮＡの培養上清を検出する際にグラブスタインによって発見され、命名された重要な可溶性サイトカインである。ＩＬ－１５は、単球／マクロファージ、リンパ球、上皮細胞などの様々な細胞および組織において発現される。
【0004】
ＩＬ－１５の生物学的活性
ＩＬ－１５媒介シグナル伝達経路
ＩＬ－１５媒介シグナル伝達経路
【0005】
インターロイキン１５受容体（ＩＬ１５Ｒ）：ＩＬ１５Ｒは、造血因子スーパーファミリーに属し、α、β（ＣＤ１２２としても知られる）、およびγ（ＣＤ１３２、共通γ鎖、γｃとしても知られる）の３つのサブユニットから構成される。ＩＬ２およびＩＬ１５はβ鎖受容体を共有する。ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５およびＩＬ２１はγ鎖受容体を共有する。ＩＬ２およびＩＬ１５に対する受容体はβ鎖およびγｃ鎖を共有するが、ＩＬ２およびＩＬ１５はそれぞれの特異的α受容体鎖を有する。ヒトＩＬ１５Ｒαは、Ｉ型膜貫通タンパク質である。ＩＬ２ＲαおよびＩＬ１５Ｒαのいずれも保存タンパク質結合モチーフ（ｓｕｓｈｉドメイン）を有する。ＩＬ１５はＩＬ１５Ｒα（Ｋｄ～１０－１１Ｍ）に対して高親和性を示すが、その結合はシグナルを伝達しない。ＩＬ１５はＩＬ１５βγヘテロ二量体（Ｋｄ～１０－９Ｍ）に対して中程度の親和性を示し、それらの結合はシグナルを伝達することができ、ＩＬ１５およびＩＬ１５αβγヘテロ三量体の親和性はＩＬ１５βγヘテロ二量体（Ｋｄ～１０－９Ｍ）の親和性と同様であり、それらの結合はシグナルを伝達することができる。ＩＬ２およびＩＬ１５の受容体はβ鎖およびγ鎖を共有するので、ＩＬ２は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を促進するなど、ＩＬ１５と同様の多くの生物学的機能を有する。
【0006】
ＩＬ１５の受容体への結合：ＩＬ１５Ｒαは、主にＤＣおよび単球において発現される。ほとんどの場合、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαは、トランス提示形態で受容体に結合する。すなわち、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒａが同じ細胞内で発現された後、ＩＬ－１５は膜表面に輸送される前に細胞内で高い親和性でＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインに結合し、次いで、その反応性細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の膜表面上のβγヘテロ二量体複合体またはαβγヘテロ三量体複合体に結合する。βおよびγ受容体はそれぞれ下流側のＪａｋ１およびＪａｋ３を活性化し、ＳＴＡＴ－３およびＳＴＡＴ－５の活性化をもたらし、カスケードを活性化し、特異的遺伝子発現を誘導することができる。ＩＬ１５が自己分泌型のエフェクター細胞に作用すると、ＩＬ１５はシス型のＩＬ１５受容体と相互作用し、下流のシグナルを活性化してエフェクター機能を生成することができる。
【0007】
ＩＬ－１５の免疫調節効果
【0008】
ＩＬ－１５は広範な免疫調節効果を有し、様々な免疫細胞の活性、増殖および機能の調節に関与する。（１）Ｔ細胞に対する調節効果：ＩＬ－１５はＴ細胞の活性化および増殖を促進し、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の産生を促進し、また、ｉｎ ｖｉｖｏでメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の個数を維持するのに重要な役割を果たす。Ｔｒｅｇ細胞の存在下であっても、ＩＬ－１５はＣＤ８＋Ｔ細胞の機能および個数を十分に維持することができる。（２）ＮＫ細胞に対する調節効果：ＩＬ－１５はＮＫ細胞の活性化および増殖において重要な役割を果たし、ＮＫ細胞のＡＤＣＣ殺傷能力を向上することができる。（３）他の免疫細胞に対する調節効果：ＩＬ－１５はまた、ＤＣおよびマクロファージの機能的成熟において重要な役割を果たす。ＩＬ－１５はＤＣによる共刺激因子およびＩＦＮ－γの発現を促進し、ＤＣの活性を向上してＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化することができる。さらに、ＩＬ－１５は好中球増殖を促進することができる。
【0009】
ＩＬ－１５の抗腫瘍効果
ＩＬ－１５は複数の免疫細胞を増殖および活性化するその能力に基づいて抗腫瘍効果を実現し、臨床研究において優れた抗腫瘍効果を実証した。しかし、野生型ＩＬ－１５の半減期が短く、分子サイズが小さく、腎クリアランスが高いため、１日に数回皮下注射することは極めて不便である。したがって、野生型組換えＩＬ－１５単独の使用もまた、腫瘍治療において制限される。Ｔ細胞およびＮＫ細胞増殖に対するＩＬ－１５の活性を低下させると、その毒性を低下させながらＩＬ－１５の半減期を増加させることができることがわかる。さらに、ＩＬ－１５および腫瘍関連抗原を標的とする抗体から構成される融合タンパク質はＩＬ－１５の特異性を増加させ、腫瘍微小環境中のＩＬ－１５の濃度を増加させ、ＩＬ－１５の毒性を減少させることができる。したがって、活性が低下したＩＬ－１５変異体を開発することは腫瘍の治療におけるＩＬ－１５の用量応答関係を向上し、ＩＬ－１５の臨床的抗腫瘍適用を拡大する可能性を有し、これは社会的および経済的に非常に重要である。
ＩＬ－１５は複数の免疫細胞を増殖および活性化するその能力に基づいて抗腫瘍効果を実現し、臨床研究において優れた抗腫瘍効果を実証した。しかし、野生型ＩＬ－１５の半減期が短く、分子サイズが小さく、腎クリアランスが高いため、１日に数回皮下注射することは極めて不便である。したがって、野生型組換えＩＬ－１５単独の使用もまた、腫瘍治療において制限される。Ｔ細胞およびＮＫ細胞増殖に対するＩＬ－１５の活性を低下させると、その毒性を低下させながらＩＬ－１５の半減期を増加させることができることがわかる。さらに、ＩＬ－１５および腫瘍関連抗原を標的とする抗体から構成される融合タンパク質はＩＬ－１５の特異性を増加させ、腫瘍微小環境中のＩＬ－１５の濃度を増加させ、ＩＬ－１５の毒性を減少させることができる。したがって、活性が低下したＩＬ－１５変異体を開発することは腫瘍の治療におけるＩＬ－１５の用量応答関係を向上し、ＩＬ－１５の臨床的抗腫瘍適用を拡大する可能性を有し、これは社会的および経済的に非常に重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、ＩＬ－１５変異体、前記変異体をコードする核酸、融合タンパク質および前記変異体を含む医薬組成物、ならびに腫瘍細胞を死滅させるためのそれらの機能、ならびに腫瘍を治療するためのそれらの使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
第１の態様において、本発明は野生型ＩＬ－１５のＶａｌ３、Ｉｌｅ６、Ａｓｐ８、またはＨｉｓ１０５に対応する１つ以上のアミノ酸残基に変異を含む、ＩＬ－１５変異ポリペプチドを提供する。
【0012】
第２の態様において、本発明はＩＬ－１５変異体を含み、野生型ＩＬ－１５のＶａｌ３、Ｉｌｅ６、Ａｓｐ８、またはＨｉｓ１０５に対応する１つ以上のアミノ酸残基に変異を含むポリペプチドを提供する。
【0013】
一実施形態において、前記ＩＬ－１５変異ポリペプチドは少なくともＶａｌ３、Ｉｌｅ６、Ａｓｐ８、またはＨｉｓ１０５における２、３、または４個のアミノ酸残基に変異を含む。
【0014】
一実施形態において、前記変異は置換、挿入または欠失である。
【0015】
特定の実施形態において、前記変異はＶａｌ３Ｌｅｕ（Ｖ３Ｌ）、Ｉｌｅ６Ａｓｐ（Ｉ６Ｄ）、Ｉｌｅ６Ｐｒｏ（Ｉ６Ｐ）、Ａｓｐ８Ｇｌｕ（Ｄ８Ｅ）、Ａｓｐ８Ｇｌｎ（Ｄ８Ｑ）、Ａｓｐ８Ａｒｇ（Ｄ８Ｒ）、Ａｓｐ８Ｓｅｒ（Ｄ８Ｓ）、Ａｓｐ８Ｖａｌ（Ｄ８Ｖ）、Ａｓｐ８Ｇｌｙ（Ｄ８Ｇ）、Ａｓｐ８Ｉｌｅ（Ｄ８Ｉ）、Ａｓｐ８Ｌｅｕ（Ｄ８Ｌ）、Ａｓｐ８Ｔｈｒ（Ｄ８Ｔ）、Ｈｉｓ１０５Ａｓｎ（Ｈ１０５Ｎ）、および／またはＨｉｓ１０５Ｌｙｓ（Ｈ１０５Ｋ）の群のアミノ酸置換から選択される。
【0016】
特定の実施形態において、前記ＩＬ－１５変異ポリペプチドは（１）Ａｓｐ８Ｇｌｕ、（２）Ａｓｐ８Ｇｌｎ、（３）Ａｓｐ８Ａｒｇ、（４）Ａｓｐ８Ｓｅｒ、（５）Ａｓｐ８Ｖａｌ、（６）Ｖａｌ３Ｌｅｕ、（７）Ｉｌｅ６Ａｓｐ、（８）Ｈｉｓ１０５Ｌｙｓ、（９）Ｈｉｓ１０５Ａｓｎ、（１０）Ａｓｐ８Ｇｌｙ、（１１）Ａｓｐ８Ｉｌｅ、（１２）Ａｓｐ８Ｌｅｕ、（１３）Ｉｌｅ６Ｐｒｏ、（１４）Ａｓｐ８Ｔｈｒ、（１５）Ａｓｐ８ＧｌｕおよびＶａｌ３Ｌｅｕ、（１６）Ａｓｐ８ＧｌｕおよびＩｌｅ６Ａｓｐ、（１７）Ｖａｌ３ＬｅｕおよびＩｌｅ６Ａｓｐ、（１８）Ｉｌｅ６ＡｓｐおよびＨｉｓ１０５Ｌｙｓ、（１９）Ａｓｐ８ＳｅｒおよびＨｉｓ１０５Ｌｙｓ、（２０）Ａｓｐ８ＳｅｒおよびＨｉｓ１０５Ａｓｎ、または（２１）Ｖａｌ３Ｌｅｕ、Ｉｌｅ６ＡｓｐおよびＨｉｓ１０５Ｌｙｓの変異または変異の組合せをを含む。
【0017】
特定の実施形態において、前記ＩＬ－１５変異体はヒト野生型ＩＬ－１５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0018】
特定の実施形態において、前記ＩＬ－１５変異体のアミノ酸配列は配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５または配列番号４７に示す通りである。
【0019】
特定の実施形態において、前記ＩＬ－１５変異ポリペプチドまたは前記ＩＬ－１５変異体を含むポリペプチドは（１）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を媒介する、（２）ヒトＮＫ細胞の増殖を媒介する、および／または（３）腫瘍増殖を抑制する活性を有する。
【0020】
特定の実施形態において、前記ＩＬ－１５変異ポリペプチドまたは前記ＩＬ－１５変異体を含むポリペプチドは野生型ＩＬ－１５を含むポリペプチドよりも低いＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖／拡大を媒介する活性を有する。
【0021】
特定の実施形態において、前記野生型ＩＬ－１５は配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。
【0022】
第３の態様において、本発明は前記ＩＬ－１５変異ポリペプチドまたは前記ＩＬ－１５変異体を含むポリペプチドを含み、ＩＬ－１５変異体に融合した免疫グロブリン分子またはその一部、および／またはＩＬ－１５変異体に融合したＩＬ－１５Ｒαをさらに含むタンパク質を提供する。
【0023】
一実施形態において、前記免疫グロブリン分子は抗体または抗原結合断片であり、前記免疫グロブリン分子の一部は免疫グロブリンＦｃ領域である。
【0024】
一実施形態において、前記抗体または前記抗原結合断片は(１)キメラ抗体またはその断片、(２)ヒト化抗体もしくはその断片、または（３）完全ヒト化抗体もしくはその断片から選択される。
【0025】
特定の実施形態において、前記抗体または前記抗原結合断片はＦ（ａｂ）2、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、ナノボディおよび抗体最小限認識ユニットのうちの１つ以上から選択される。
【0026】
特定の実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤのいずれか１つのＦｃ領域から選択され、好ましくはヒトまたはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体の定常領域を含む配列であり、好ましくは前記免疫グロブリンＦｃ領域は配列番号７３に示すアミノ酸配列を有する。
【0027】
別の実施形態において、前記ＩＬ－１５変異体はリンカーペプチドを用いてもしくは用いずに免疫グロブリン分子またはその一部に融合する、もしくは、前記ＩＬ－１５変異体はリンカーペプチドを用いてもしくは用いずにＩＬ－１５Ｒαに融合し、好ましくはリンカーペプチドを使用し、好ましくは配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、または配列番号７１に示すリンカーペプチドを使用する。
【0028】
別の実施形態において、前記ＩＬ－１５変異体はＩＬ－１５Ｒαに融合され、それから免疫グロブリン分子又はその一部にリンカーペプチドを用いてもしくは用いずに融合され、好ましくは、リンカーペプチドを使用し、好ましくは、配列番号６５、配列番号６９、または配列番号７１に示すリンカーペプチドを使用する。
【0029】
特定の実施形態において、個々のドメインはＮ末端からＣ末端に
(１)前記免疫グロブリンタンパク質分子またはその一部、前記ＩＬ－１５Ｒα、および前記ＩＬ－１５変異体、
(２)前記免疫グロブリン分子またはその一部、前記ＩＬ－１５変異体、および前記ＩＬ－１５Ｒα、
(３)前記ＩＬ－１５変異体、前記ＩＬ－１５Ｒα、および前記免疫グロブリン分子またはその一部、
(４)前記ＩＬ－１５Ｒα、前記ＩＬ－１５変異体、および前記免疫グロブリン分子またはその一部、
(５)前記ＩＬ－１５変異体および前記免疫グロブリン分子またはその一部、
(６)前記免疫グロブリン分子またはその一部、および前記ＩＬ－１５Ｒα、
(７)前記ＩＬ－１５Ｒαおよび前記免疫グロブリン分子またはその一部、
(８)前記ＩＬ－１５変異体および前記ＩＬ－１５Ｒα、または
（９）前記ＩＬ－１５Ｒαおよび前記ＩＬ－１５変異体
の順に連結する。
(１)前記免疫グロブリンタンパク質分子またはその一部、前記ＩＬ－１５Ｒα、および前記ＩＬ－１５変異体、
(２)前記免疫グロブリン分子またはその一部、前記ＩＬ－１５変異体、および前記ＩＬ－１５Ｒα、
(３)前記ＩＬ－１５変異体、前記ＩＬ－１５Ｒα、および前記免疫グロブリン分子またはその一部、
(４)前記ＩＬ－１５Ｒα、前記ＩＬ－１５変異体、および前記免疫グロブリン分子またはその一部、
(５)前記ＩＬ－１５変異体および前記免疫グロブリン分子またはその一部、
(６)前記免疫グロブリン分子またはその一部、および前記ＩＬ－１５Ｒα、
(７)前記ＩＬ－１５Ｒαおよび前記免疫グロブリン分子またはその一部、
(８)前記ＩＬ－１５変異体および前記ＩＬ－１５Ｒα、または
（９）前記ＩＬ－１５Ｒαおよび前記ＩＬ－１５変異体
の順に連結する。
【0030】
別の実施形態において、前記ＩＬ－１５Ｒαまたは前記ＩＬ－１５変異体が前記免疫グロブリン分子に融合する際、前記ＩＬ－１５Ｒαまたは前記ＩＬ－１５変異体は免疫グロブリン分子の重鎖の可変領域のＮ末端または免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端に融合し、前記ＩＬ－１５Ｒαまたは前記ＩＬ－１５変異体が前記免疫グロブリンＦｃ領域に融合する際、前記ＩＬ－１５Ｒαまたは前記ＩＬ－１５変異体は免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端に融合する。
【0031】
第４の態様において、本発明は
（１）免疫グロブリン重鎖、
（２）免疫グロブリン軽鎖、
（３）ＩＬ－１５Ｒα、および
（４）第１または第２の態様に記載のＩＬ－１５変異ポリペプチド
を含むタンパク質または抗体融合構築物／複合体を提供する。
（１）免疫グロブリン重鎖、
（２）免疫グロブリン軽鎖、
（３）ＩＬ－１５Ｒα、および
（４）第１または第２の態様に記載のＩＬ－１５変異ポリペプチド
を含むタンパク質または抗体融合構築物／複合体を提供する。
【0032】
一実施形態において、前記ＩＬ－１５Ｒαはリンカーペプチドを用いてもしくは用いずに前記免疫グロブリン重鎖の可変領域のＮ末端または免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端に融合する。
【0033】
一実施形態において、前記ＩＬ－１５変異ポリペプチドは前記ＩＬ－１５Ｒαに非共有結合的に連結する、もしくは、前記ＩＬ－１５変異体はリンカーペプチドを用いてもしくは用いずに前記ＩＬ－１５Ｒαの他端に融合する。
【0034】
特定の実施形態において、前記タンパク質は（１）～（４）から構成される単量体を含むホモ二量体である。
【0035】
第５の態様において、本発明は
（１）免疫グロブリンＦｃ領域、
（２）ＩＬ－１５Ｒα、および
（３）第１または第２の態様に記載のＩＬ－１５変異ポリペプチド
を含むタンパク質またはＦｃ融合構築物を提供する。
（１）免疫グロブリンＦｃ領域、
（２）ＩＬ－１５Ｒα、および
（３）第１または第２の態様に記載のＩＬ－１５変異ポリペプチド
を含むタンパク質またはＦｃ融合構築物を提供する。
【0036】
一実施形態において、前記ＩＬ－１５Ｒαはリンカーペプチドを用いてもしくは用いずに前記ＩＬ－１５変異ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し、次いで、リンカーペプチドを用いてもしくは用いずに免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端に融合する。
【0037】
特定の実施形態において、タンパク質は（１）～（３）から構成される単量体を含むホモ二量体である。
【0038】
別の好ましい実施形態において、免疫グロブリンは抗ＰＤ－Ｌ１抗体から選択され、好ましくは、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体はテセントリク、ＫＮ－０３５、または７９４－ｈ１－７１である。
【0039】
特定の実施形態において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号９９および配列番号１００に示す配列を有するか、または配列番号９９および配列番号１００に示す配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上の同一性を有する配列を有する、または前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号９７および配列番号９８に示す配列を有するか、または配列番号９７および配列番号９８に示す配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上の同一性を有する配列を有する。
【0040】
別の好ましい実施形態において、前記ＩＬ－１５ＲαはＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉから選択され、好ましくは前記ＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉは配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、または配列番号５５に示すアミノ酸配列を有する。
【0041】
第６の態様において、本発明はＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、好ましくは、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号９９および配列番号１００に示す配列、または配列番号９９および配列番号１００に示す配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有する配列を有する抗体または抗原結合断片を提供する。
【0042】
特定の実施形態において、前記抗体または前記抗原結合断片は１．８×１０－９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でヒトプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に結合し、前記抗体または前記抗原結合断片は９．４×１０－１０Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でカニクイザルプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に結合し、前記抗体または前記抗原結合断片は、任意に、サルＰＤ－Ｌ１に結合してもしなくてもよく、前記抗体または前記抗原結合断片は、任意に、マウスＰＤ－Ｌ１に結合してもしなくてもよい。
【0043】
特定の実施形態において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＰＤ－Ｌ１またはそのエピトープに競合的に結合し、
（１）組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質およびＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に特異的に結合し、
（２）ＰＤ－１タンパク質へのＰＤ－Ｌ１の結合を遮断し、
（３）細胞表面に発現したＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１の結合を阻害し、
（４）Ｔ細胞活性を増強し、または／および
（５）腫瘍増殖を阻害する
活性を有する。
（１）組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質およびＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に特異的に結合し、
（２）ＰＤ－１タンパク質へのＰＤ－Ｌ１の結合を遮断し、
（３）細胞表面に発現したＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１の結合を阻害し、
（４）Ｔ細胞活性を増強し、または／および
（５）腫瘍増殖を阻害する
活性を有する。
【0044】
好ましい態様において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤのいずれか１つに由来する定常領域を含み、好ましくは、ヒトまたはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体の定常領域を含む塩基配列である。
【0045】
別の好ましい実施形態において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＦ（ａｂ）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、および二重特異性抗体のうちの１つ以上から選択される。
【0046】
第７の態様では、本発明は前記第１～第６の態様のいずれか１つに記載のポリペプチド、タンパク質、抗原または抗原結合断片をコードする単離核酸分子を提供する。
【0047】
第８の態様において、本発明は第７の態様の単離核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【0048】
第９の態様において、本発明は第７の態様の単離核酸分子または第８の態様の発現ベクターを含み、好ましくは、真核細胞または原核細胞であり、より好ましくは、哺乳動物、酵母、昆虫、大腸菌および／または枯草菌に由来し、より好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から選択される、宿主細胞を提供する。
【0049】
第１０の態様において、本発明は第９の態様の宿主細胞を適切な条件下で培養する工程と、ポリペプチドまたはタンパク質を単離する工程とを含む、ポリペプチドまたはタンパク質を調製する方法を提供する。
【0050】
第１１の態様において、本発明は前記第１～第６の態様のいずれか１つに記載のポリペプチド、タンパク質、抗原または抗原結合断片、前記第７の態様の単離核酸分子、前記第８の態様の発現ベクター、前記第９の態様の宿主細胞、または前記第１０の態様の方法によって調製された生成物、および薬学的に許容される担体を含み、好ましくは、追加抗腫瘍剤をさらに含む、医薬組成物を提供する。
【0051】
第１２の態様において、本発明は個体における疾患の予防および／または治療のための医薬の製造における、前記第１～第６の態様のいずれか１つのポリペプチド、タンパク質、抗原、または抗原結合断片、前記第７の態様の単離核酸分子、前記第８の態様の発現ベクター、第９の態様の宿主細胞、第１０の態様の方法によって調製された生成物、または第１１の態様の医薬組成物の使用を提供し、前記疾患は好ましくは腫瘍である。
【0052】
第１３の態様において、本発明はそれを必要とする患者に、前記第１～第６の態様のいずれか１つのポリペプチド、タンパク質、抗原または抗原結合断片、前記第７の態様の単離核酸分子、前記第８の態様の発現ベクター、前記第９の態様の宿主細胞、前記第１０の態様の方法によって調製された生成物、または前記第１１の態様の医薬組成物を投与する工程含む個体における疾患を予防および／または治療する方法を提供し、前記疾患は好ましくは腫瘍である。
【0053】
用語と定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。本明細書で明示的に定義される用語について、そのような用語の意味は、本明細書で定義される通りであるものとする。
特に明記しない限り、本明細書で使用される用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。本明細書で明示的に定義される用語について、そのような用語の意味は、本明細書で定義される通りであるものとする。
【0054】
本明細書において、「ＩＬ－１５」、「ＩＬ１５」または「インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）」はＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を活性化し、これらの細胞の増殖および生存を媒介する多面的サイトカインを指す。さらに、ＩＬ－１５は、ＣＤ８＋記憶Ｔ細胞を活性化、維持および拡大することができる。本発明による「ＩＬ－１５」または「ＩＬ－１５ペプチド断片」または「ＩＬ－１５ポリペプチド」は、任意のＩＬ－１５（インターロイキン１５）またはその変異体、例えばヒトＩＬ－１５または非ヒト哺乳動物ＩＬ－１５または非哺乳動物ＩＬ－１５であり得る。非ヒト哺乳動物は、例えば、ブタ、ウサギ、サル、オランウータン、マウスなどであり、非哺乳動物は、例えば、ニワトリなどである。好ましくは、ヒトインターロイキン１５成熟分子であり、データベースＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、Ｌｏｇｉｎ ＩＤ Ｐ４０９３３、４９－１６２ａａを参照されたい。
【0055】
本明細書において、「ＩＬ－１５野生型」または「野生型ＩＬ－１５」は、天然源または非ヒト哺乳動物ＩＬ－１５または非哺乳動物ＩＬ－１５由来のヒトＩＬ－１５を指し、それはまた、当技術分野で一般的に使用されているＩＬ－１５ポリペプチドを指し得る。
【0056】
本明細書において、「ＩＬ－１５変異体」はＩＬ－１５受容体に対する親和性が増加もしくは減少しているか、またはＴ細胞もしくはＮＫ細胞増殖における活性が増加もしくは減少している、および特定の細胞株を刺激する際にサイトカイン放出する変異体分子を指し、前記変異体分子は１つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失によって得られる。
【0057】
本明細書において、「ＩＬ－１５Ｒα」は、ヒトＩＬ－１５Ｒαまたは非ヒト哺乳動物ＩＬ－１５Ｒαまたは非哺乳動物ＩＬ－１５Ｒαなどの任意の種のＩＬ－１５Ｒαまたはその機能的断片を指し得る。非ヒト哺乳動物は、例えば、ブタ、ウサギ、サル、オランウータン、マウスなどであり、非哺乳動物は、例えば、ニワトリなどである。好ましくは、ヒトＩＬ－１５Ｒαであり、好ましくはＩＬ－１５ＲαＥＣＤと呼ばれるヒトインターロイキン１５受容体α細胞外ドメイン断片であり、好ましくはＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉであり、詳細については表１を参照されたい。
【0058】
本明細書において、「ＩＬ－１５Ｒα変異体」はＩＬ１５などのリガンド分子に結合する能力を有するＩＬ－１５Ｒα上の１つ以上のアミノ酸欠失、挿入または置換変異によって形成される機能的変異体を指し、好ましくはヒトＩＬ１５Ｒα分子であり、より好ましくは短縮型のヒトＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメイン断片、すなわち、細胞外ドメイン断片のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸欠失変異によって得られるヒトインターロイキン１５受容体α活性を有する分子であり、好ましくは６５～１２０個のアミノ酸が保持された欠失変異型であり、より好ましくはＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉなどの６５～１０２個のアミノ酸が保持された短縮型の欠失変異であり、より好ましくはＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉであり、好ましくはＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉであり、詳細については表３（表３－１～表３－３）を参照されたい。
【0059】
本明細書において、「免疫グロブリンＦｃ領域」は免疫グロブリン鎖の定常領域、特に免疫グロブリン重鎖の定常領域のカルボキシル末端またはその一部を指し、これは抗原結合活性を有さず、抗体分子がエフェクター分子および細胞と相互作用する部位である。本発明の「免疫グロブリンＦｃ領域」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物に由来する任意のＦｃまたはその変異体であり得る。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域と組み合わせて重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４の２つ以上のドメインを含み得る。Ｆｃは、異なる種、好ましくはヒト免疫グロブリンに由来し得る。重鎖定常領域のアミノ酸配列によれば、免疫グロブリンは、主に５つのタイプの免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）を含む異なるクラスに分けることができる。これらのいくつかは、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、ＩｇＧ－４、ＩｇＡ－１およびＩｇＡ－２などのサブクラス（アイソタイプ）にさらに分けることができる。「Ｆｃ領域」は、好ましくは少なくとも１つの免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。より好ましくは、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよび免疫グロブリンヒンジ領域を含み、ヒンジ領域の開始アミノ酸位置を変更することができる。
【0060】
本明細書において、「Ｆｃ変異体」という用語はＦｃ上の適切な部位での１つ以上のアミノ酸置換、挿入または欠失変異によって引き起こされるＦｃ構造または機能の変化を指す。「Ｆｃ変異体間の相互作用」は変異によって設計されたＦｃ変異体間で形成される空隙充填効果、静電誘導、水素結合、疎水性相互作用などを指す。Ｆｃ変異体間の相互作用は、安定なヘテロ二量体タンパク質の形成に寄与する。好ましい変異誘発設計は、「Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ」形態のものである。
【0061】
Ｆｃ変異体の変異設計技術は二重特異性抗体またはヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を調製するために、当技術分野で広く使用されている。代表例はＣａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｏｌ． ９ ｎｏ． ７ ｐｐ． ６１７－６２１， １９９６）によって提案された「Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ」形態、静電誘導（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ Ｓｔｅｅｒｉｎｇ）（米国特許出願公開第２０１００２８６３７４号明細書）を用いてＡｍｇｅｎの技術者によって形成されたＦｃ含有ヘテロ二量体形態、Ｊｏｎａｔｈａｎ ＨＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｐ．１－８、２０１０）によって提案されＩｇＧ／ＩｇＡ鎖交換によって形成されたヘテロ二量体形態（ＳＥＥＤ ｂｏｄｉｅｓ）、Ｇｅｎｍａｂ’ｓ ＤｕｏＢｏｄｙ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００７．３１７（５８４４））プラットフォーム技術によって形成されたバイスペシフィック分子、Ｘｅｎｃｏｒ社の技術者によって構造計算およびＦｃアミノ酸変異を組み込み、変化作用様式を組み込むことによって形成されたヘテロ二量体タンパク質形態（ｍＡｂｓ ３：６，５４６－５５７；Ｎｏｖｅｍｂｅｒ／Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１１）、Ａｌｐｈａｍａｂ社の電荷回線網（中国特許出願第２０１１１０４５９１００７号明細書）に基づくＦｃ形質転換方法によって得られたヘテロ二量体タンパク質形態、ヘテロ二量体機能性タンパク質の遺伝子工学を実現するためのＦｃアミノ酸変化または機能的形質転換に基づく他の方法が挙げられる。本発明のＦｃ変異体断片におけるＫｎｏｂ／Ｈｏｌｅ構造は、２つのＦｃ断片のそれぞれの変異を指し、変異後に「Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ」の形態で組み合わせることができるＣａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．の「Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ」モデルを使用してＦｃ領域における部位変異工学を実施するすることが好ましく、その結果、第１のＦｃ変異体および第２のＦｃ変異体を「Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ」の形態で組み合わせて、ヘテロ二量体を形成することができる。特定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリンＦｃ領域の選択は、当業者の範囲内である。ヒト抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のＦｃ領域が好ましく、ヒト抗体ＩｇＧ１のＦｃ領域がより好ましい。第１のＦｃ変異体または第２のＦｃ変異体の一方を無作為に選択してノブ変異を施し、他方にホール変異を施す。
【0062】
本明細書において、「抗体（Ａｂ）」は標的抗原に特異的に結合するか、または抗体のポリクローナル、モノクローナル、遺伝子操作および他の修飾形態（キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体、異種結合抗体（例えば、二重特異性、三重特異性および四重特異性抗体、ダイアボディ、トリボディおよびテトラボディ、ならびに抗体接合体を含むが、これらに限定されない）および抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（aｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧおよびｓｃＦｖ断片を含む）を含むが、これらに限定されない）を含む免疫反応性を有する免疫グロブリン分子を指す。さらに、別段の定義がない限り、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は標的タンパク質に特異的に結合することができるインタクトな抗体分子ならびに不完全な抗体断片（例えば、インタクトな抗体のＦｃ断片を欠く（動物循環からより迅速に洗浄される）ためにＦｃ媒介性エフェクター機能を欠くＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片）を含むことが意図される（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６、１９８３を参照されたい。その含有量は参照により本明細書に組み込まれる）。
【0063】
本明細書において、「ヒト化抗体」は、そのアミノ酸配列がヒト抗体の配列との相同性を増加させるように改変されている、遺伝子操作された非ヒト抗体を指す。典型的にはヒト化抗体のＣＤＲ領域の全部または一部が非ヒト抗体（ドナー抗体）に由来し、非ＣＤＲ領域（例えば、可変ＦＲおよび／または定常領域）の全部または一部はヒト免疫グロブリン（受容体抗体）に由来する。ヒト化抗体は一般に、抗原特異性、親和性、反応性、免疫細胞活性を増加させる能力、免疫応答を増強する能力などを含むが、これらに限定されない、ドナー抗体の期待される特性を保持するか、または部分的に保持する。
【0064】
「抗体接合体」は、直接またはリンカーを介してのいずれかでの抗体分子の別の分子への化学結合によって形成されるカプレット／接合体を指す。例えば、薬物分子が別の分子である抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）が記載されている。
【0065】
「モノクローナル抗体」は単一クローン（任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む）に由来する抗体を指すが、抗体の産生方法は限定されない。
【0066】
本明細書において、「融合タンパク質」は２つ以上の遺伝子のコード領域を遺伝子組換え法、化学的方法または他の適切な方法によって連結し、同じ調節配列の制御下で組換え遺伝子を発現させることによって得られるタンパク質生成物を指す。本発明の融合タンパク質において、２つ以上の遺伝子のコード領域は、ペプチドリンカーまたはリンカーペプチドをコードする配列によって、１つまたはいくつかの位置で融合され得る。ペプチドリンカーまたはリンカーペプチドもまた、本発明の融合タンパク質を構築するために使用され得る。本発明の「融合タンパク質」は抗体／Ｆｃ融合タンパク質構築物／複合体、または非共有結合手段によって形成される抗体／Ｆｃ融合タンパク質構築物／複合体の成分をさらに含み、例えば、本発明に記載される融合タンパク質は、以下の構造として示すことができる：
（１）２つの単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質。前記単量体は抗体重鎖、抗体軽鎖、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを含み、例えば、前記抗体重鎖ＦｃはＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉに融合し、前記抗体軽鎖およびＩＬ－１５－ＷＴ（野生型）またはＩＬ－１５変異体と共発現して、その結果、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉは非共有結合を形成する
（２）２つの単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質。前記単量体は抗体重鎖、抗体軽鎖、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを含み、例えば、前記抗体重鎖ＦｃはＩＬ－１５ＲαｓｕｓｈｉおよびＩＬ－１５－ＷＴ（野生型）またはＩＬ－１５変異体とリンカーによって融合および連続して発現し、前記抗体軽鎖と共発現する
（３）２つの単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質。前記単量体はＦｃ、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを含み、例えば、ＩＬ－１５－ＷＴまたはＩＬ－１５変異体はリンカーによってＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉに連結し、次いでＩＬ１５ＲαｓｕｓｈｉはリンカーによってＦｃに連結する、または
（４）２つの単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質。前記単量体はＦｃ、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを含み、例えば、ＩＬ１５ＲαｓｕｓｈｉはリンカーによってＩＬ－１５－ＷＴまたはＩＬ－１５変異体に連結し、次いで、ＩＬ－１５はリンカーによってＦｃに連結する。
（１）２つの単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質。前記単量体は抗体重鎖、抗体軽鎖、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを含み、例えば、前記抗体重鎖ＦｃはＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉに融合し、前記抗体軽鎖およびＩＬ－１５－ＷＴ（野生型）またはＩＬ－１５変異体と共発現して、その結果、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉは非共有結合を形成する
（２）２つの単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質。前記単量体は抗体重鎖、抗体軽鎖、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを含み、例えば、前記抗体重鎖ＦｃはＩＬ－１５ＲαｓｕｓｈｉおよびＩＬ－１５－ＷＴ（野生型）またはＩＬ－１５変異体とリンカーによって融合および連続して発現し、前記抗体軽鎖と共発現する
（３）２つの単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質。前記単量体はＦｃ、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを含み、例えば、ＩＬ－１５－ＷＴまたはＩＬ－１５変異体はリンカーによってＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉに連結し、次いでＩＬ１５ＲαｓｕｓｈｉはリンカーによってＦｃに連結する、または
（４）２つの単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質。前記単量体はＦｃ、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを含み、例えば、ＩＬ１５ＲαｓｕｓｈｉはリンカーによってＩＬ－１５－ＷＴまたはＩＬ－１５変異体に連結し、次いで、ＩＬ－１５はリンカーによってＦｃに連結する。
【0067】
本明細書において、「ペプチドリンカー／リンカーペプチド／リンカー」はタンパク質の正しいフォールディングおよび安定性を確実にするために、ＩＬ－１５を別のタンパク質分子またはタンパク質断片と連結するために本発明で使用されるペプチドを指す。前記別の分子としてはＩＬ－１５Ｒα、Ｆｃ、Ｆｃ変異体、抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の「リンカー」は好ましくは（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは０、１、２、３、４、５またはそれ以上であり得、好ましくはｎは２～４であり、または好ましくはＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱである。リンカー配列が短すぎる場合は２つのタンパク質の高次構造のフォールディングに影響を及ぼして互いに干渉する可能性があり、リンカー配列が長すぎる場合はリンカー配列自体が新しい抗原であるため、免疫原性の問題を伴うと考えられる。
【0068】
本明細書において、「ヘテロ二量体タンパク質」は、２つの異なる単量体タンパク質を組み合わせることによって形成されるタンパク質を指す。本発明において、２つの異なる単量体タンパク質はそれぞれ、Ｆｃ断片またはＦｃ変異体断片を含有し、Ｆｃ断片またはＦｃ変異体断片の相互作用によってヘテロ二量体タンパク質を形成する。
【0069】
本明細書において、「ホモ二量体タンパク質」は、２つの同一の単量体タンパク質を組み合わせることによって形成されるタンパク質を指す。本発明において、２つの同一の単量体タンパク質はそれぞれ、Ｆｃ断片またはＦｃ変異体断片を含有し、Ｆｃ断片またはＦｃ変異体断片の相互作用によってホモ二量体タンパク質を形成する。
【0070】
本発明におけるヘテロ二量体タンパク質またはホモ二量体タンパク質を構成する「単量体タンパク質」は、融合タンパク質であっても非融合タンパク質であってもよい。
【0071】
本明細書において、「ＰＤ－Ｌ１」はＣＤ２７９（分化クラスター２７９）としても知られるプログラム細胞死リガンド－１を指し、これは重要な免疫抑制分子である。ＰＤ－Ｌ１は、好ましくはヒトＰＤ－Ｌ１である。
【0072】
本明細書において、「抗プログラム細胞死リガンド－１抗体」、「プログラム細胞死リガンド－１抗体」、「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」、「ＰＤ－Ｌ１抗体」、「抗ＰＤ－Ｌ１抗体部分」および／または「抗ＰＤ－Ｌ１抗体断片」などは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子の少なくとも一部（例えば、重鎖または軽鎖またはリガンド結合部分の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク領域またはその任意の部分を含むがこれに限定されない）を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子を指す。前記ＰＤ－Ｌ１抗体はまた、抗体のＣＤＲに構造および溶媒接近性が類似するＢＣ、ＤＥおよびＦＧ構造ループを含む抗体様タンパク質足場（第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）など）を含む。１０Ｆｎ３ドメインの三次構造はＩｇＧの重鎖可変領域の三次構造に類似しており、当業者は、１０Ｆｎ３のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの残基を、前記ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体由来のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２またはＣＤＲ－Ｈ３領域の残基と置き換えることによって、例えば、前記ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体のＣＤＲをフィブロネクチン足場に移植することができる。
【0073】
本明細書において、「共発現」は、細胞内での複数の遺伝子の共同発現およびそれらの生成物の同時出現を指す。これらの遺伝子は共存し、制御下で個々にまたは共同して発現され得る。本発明において、２つの遺伝子は、好ましくは１つの真核細胞において共発現される。共発現によって得られる遺伝子発現生成物は複合体の効率的かつ単純な形成に有利であり、本発明では、ヘテロ二量体タンパク質またはホモ二量体タンパク質の形成に有利である。
【0074】
本明細書において、「配列同一性パーセント（％）」は配列をアラインメントし、必要であれば隙間を導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後の、参照配列のアミノ酸（または核酸）残基と同一である候補配列のアミノ酸（または核酸）残基のパーセンテージを指す（例えば、最適なアラインメントのために候補配列および参照配列の一方または両方に隙間を導入することができ、比較目的のために非相同配列を無視することができる）。配列同一性パーセントを決定する目的でのアラインメントは当業者に周知の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを行うために必要な任意のアルゴリズムを含むアラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。例えば、候補配列と比較するためにアラインメントされた参照配列は、候補配列が候補配列の全長または候補配列の連続するアミノ酸（または核酸）残基の選択された部分に対して５０％～１００％の配列同一性を示すことを示してもよい。比較目的のためにアラインメトされた候補配列の長さは、例えば、参照配列の長さの少なくとも３０％（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％）であり得る。候補配列中の位置が参照配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基によって占められる場合、分子は、その位置で同一である。
【0075】
本明細書において、「特異的結合」は、例えば、抗体またはその抗原結合断片によって特異的に認識されるタンパク質および他の生体分子の不均一な集団における抗原の存在を判定する結合反応を指す。抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、１００ｎＭ未満のＫＤで抗原に結合する。例えば、抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は最大１００ｎＭ（例えば、１ｐＭ～１００ｎＭ）のＫＤで抗原に結合する。特定の抗原またはそのエピトープに対して特異的結合を示さない抗体またはその抗原結合断片はその特定の抗原またはそのエピトープに対して１００ｎＭを超える（例えば、５００ｎＭ、１μＭ、１００μＭ、５００μＭまたは１ｍＭを超える）ＫＤを示す。様々なイムノアッセイ法を用いて、特異的タンパク質または炭水化物に対する特異的免疫応答を示す抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質または炭水化物に対する特異的免疫応答を示す抗体を選択するために日常的に使用される。特定の免疫反応性を判定するために使用できるイムノアッセイの方法と条件について説明しているＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＡＬａｂｏｒｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８）ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９９）を参照されたい。
【0076】
本明細書において、「ベクター」はＤＮＡベクター（例えば、プラスミド）、ＲＮＡベクター、ウイルス、または他の適切なレプリコン（例えば、ウイルスベクター）などの核酸ベクターを含む。外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドを原核細胞または真核細胞に送達するために、様々なベクターが開発されている。本発明の発現ベクターは、例えば、タンパク質を発現するための、および／または哺乳動物細胞のゲノムにこれらのポリヌクレオチド配列を組み込むための、ポリヌクレオチド配列およびさらなる配列要素を含有する。本発明の抗体および抗体断片を発現させるために使用することができる特定のベクターは、遺伝子転写を指令する調節配列（プロモーター領域およびエンハンサー領域など）を含有するプラスミドを含む。抗体および抗体断片を発現するための他の有用なベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を増強するか、または遺伝子転写によって産生されるｍＲＮＡの安定性もしくは核出力を向上するポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列要素には、例えば、５’および３’非翻訳領域、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、および発現ベクターによって運ばれる遺伝子の有効な転写を指令するためのポリアデニル化シグナル部位が含まれる。本発明の発現ベクターはまた、そのようなベクターを含有する細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含有してもよい。適切なマーカーの例としては、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシンまたはノウルセオトリシンなどの抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられる。
【0077】
本明細書において、「対象」および「患者」は本明細書に記載されるように、癌または感染性疾患などの特定の疾患または状態の治療を受ける生物を指す。対象および患者の例としては、細胞増殖性障害、例えば癌または感染性疾患などの疾患または状態の治療を受けている、例えばヒト、霊長類、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、ネコ、イヌ、モルモット、ウシ科のメンバー（例えば家畜牛、バイソン、バッファロー、エルク、ヤクなど）、ヒツジおよびウマなどの哺乳動物が挙げられる。
【0078】
本明細書において、「治療」は外科的または治療的処置を指し、その目的は細胞増殖性障害（例えば、癌または感染性疾患）の進行などの、治療の対象における望ましくない生理学的変化または病変の進行を予防、軽減（低減）することである。有益なまたは所望の臨床転帰には検出可能であるかまたは検出不可能であるかにかかわらず症状の軽減、疾患重症度の低減、疾患状態の安定化（すなわち、悪化なし）、疾患進行の遅延または寛解、疾患状態の改善または緩和、および、緩解（部分的であるか完全であるかにかかわらず）が含まれるが、これに限定されない。治療される対象は、疾患または条件に既に罹患している対象、および疾患または条件に罹患しやすい対象、または疾患または疾患を予防しようとする対象を含む。軽減、低減、緩和、寛解、緩解などの用語を指す場合、その意味には、消失、消失、および非発生も含まれる。
【0079】
本明細書において、「免疫障害」は例えば、病的炎症、炎症性障害および自己免疫障害または疾患を含む。「免疫障害」はまた、感染、持続感染、ならびに増殖性障害、例えば、癌、腫瘍、および血管新生を指す。「癌性障害」は例えば、癌、癌細胞、腫瘍、血管新生、および前癌状態、例えば異形成を含む。
【0080】
本明細書において、「医薬組成物」は、本明細書に記載される化合物の１つ以上、またはその生理学的／薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグと、他の化学成分、ならびに生理学的／薬学的に許容される担体および賦形剤などの他の成分とを含む混合物を指す。医薬組成物の目的は生物への投与を容易にし、活性成分の吸収を促進してその生物学的活性を発揮することである。
【0081】
本明細書において、「サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＥＣ」は、試験されるｃｖｎ成分の分子サイズに従って分離するのための液体クロマトグラフィー技術を指す。クロマトグラフィーカラム充填剤の表面には、異なるサイズの細孔が分布している。サンプルがクロマトグラフィーカラムに入った後、サンプル中の異なる成分が、それらの分子サイズに従って対応する細孔サイズの細孔に入る。全ての空隙サイズより大きい分子は充填剤粒子に入ることができず、短い保持時間でクロマトグラフィープロセス中に保持されず、全ての空隙サイズより小さい分子はクロマトグラフィーカラムにおいてより長い保持時間で充填剤の表面上の全ての空隙サイズの細孔に自由に入ることができ、その結果、より長い保持時間が得られ、他の分子は分子サイズに従って順番に溶出される。
【0082】
「任意の」または「任意に」はその後に記載される事象または環境が起こり得るが、必ずしも起こらないことを意味し、その記載は事象または環境が起こるまたは起こらない場合を含む。例えば、「任意に１～３個の抗体重鎖可変領域を含む」は、抗体重鎖可変領域が存在し得るが存在する必要はないことを意味し、抗体重鎖可変領域が存在する場合、それらのうちの１、２または３個が存在し得る。
【0083】
本発明に記載の組換えＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換する工程は、当業者に周知の従来技術を用いて実施することができる。得られた形質転換体を従来の方法によって培養して、本発明の遺伝子によってコードされるポリペプチドを発現することができる。使用する宿主細胞にしたがって、培養に使用される培地は、様々な従来の培地から選択することができる。宿主細胞は、宿主細胞の増殖に適した条件下で培養される。
【図面の簡単な説明】
【0084】
本発明の前述および他の態様は、以下の詳細な説明および本発明の図面によって明確に示される。本明細書の図面は本発明のいくつかの好ましい実施形態を例示することを意図しているが、本発明は開示された特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。
【0085】
【図5】図５は、ＩＬ－１５融合タンパク質の２つの構造を示す。 Ａ：ＩＬ－１５野生型または変異体とＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを共発現し、非共有結合によって構築する。 Ｂ：ＩＬ－１５野生型または変異体とＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを融合し、リンカーによってタンデムに構築して発現させる。 Ｃ：ＩＬ－１５野生型または変異体をリンカーによってＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉに連結し、次いで、ＩＬ－１５ＲαｓｕｓｈｉとＦｃを融合し、リンカーによってタンデムに構築して発現させる。 Ｄ：ＩＬ－１５ＲαｓｕｓｈｉをリンカーによってＩＬ－１５野生型または変異体に連結し、次いで、ＩＬ－１５野生型または変異体とＦｃを融合し、リンカーによってタンデムに構築して発現させる。
【図6】図６Ａ～６Ｄは、ＩＬ１５変異体がＭｏ７ｅ細胞増殖を促進することを示す。融合タンパク質の構造は図５Ａに示す通りであり、テセントリクはＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉに融合され、ＩＬ１５変異体はＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉにリンカーによって連結せずに非共有結合的に連結される。
【図7】図７Ａ～７Ｎは、ＩＬ－１５変異体がＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を誘導することを示す。 図７Ａ：融合タンパク質の構造は図５Ａに示す通りであり、テセントリクはＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉに融合され、ＩＬ１５変異体はＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉにリンカー連結せずに非共有結合的に連結される。 図７Ｂ～７Ｇおよび７Ｍ～７Ｎ：融合タンパク質の構造は図５Ｂに示す通りであり、自己開発ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体をＩＬ－１５ＲαｓｕｓｈｉとＩＬ１５変異体に融合し、ＩＬ１５変異体とＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉとをリンカーにより連結してタンデム発現させる。薬物０は、タンパク質を反応系に添加しないネガティブコントロールを表す。 図７Ｈ～７Ｋ：融合タンパク質の構造は図５Ｄに示す通りであり、ＩＬ－１５ＲαｓｕｓｈｉをリンカーによってＩＬ－１５野生型または変異体に連結し、次いで、ＩＬ－１５野生型または変異体とＦｃを融合し、リンカーによってタンデムに構築して発現させる。 図７Ｌ：融合タンパク質は図５Ｃに示す通りであり、ＩＬ－１５野生型または変異体は、はじめにリンカーによってＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉに連結し、次いで、ＩＬ－１５ＲαｓｕｓｈｉとＦｃを融合し、リンカーによってタンデムに構築して発現させる。
【図8】図８Ａ～８Ｍは、ＩＬ－１５変異体がＮＫ細胞増殖を誘導することを示す。 図８Ａ：融合タンパク質の構造は図５Ａに示す通りであり、テセントリクをＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉに融合し、ＩＬ１５変異体をリンカー連結せずにＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉに非共有結合的に連結する。 図８Ｂ～８Ｆおよび８Ｌ～８Ｍ：融合タンパク質の構造は図５Ｂに示す通りであり、自己開発ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体をＩＬ－１５ＲαｓｕｓｈｉとＩＬ１５変異体に融合し、ＩＬ１５変異体をリンカーによりＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉと連結してタンデム発現させる。薬物０は、タンパク質を反応系に添加しないネガティブコントロールを表す。 図８Ｇ～８Ｊ：融合タンパク質の構造は図５Ｄに示す通りであり、ＩＬ－１５ＲαｓｕｓｈｉをリンカーによってＩＬ－１５野生型または変異体に連結し、次いで、ＩＬ－１５野生型または変異体とＦｃを融合し、リンカーによってタンデムに構築して発現させる。 図８Ｋ：融合タンパク質は図５Ｃに示す通りであり、ＩＬ－１５野生型または変異体をリンカーによってＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉに連結し、次いで、ＩＬ－１５ＲαｓｕｓｈｉとＦｃを融合し、リンカーによってタンデムに構築して発現させる。
【発明を実施するための形態】
【0086】
以下、具体的な実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明し、本発明の利点および特徴を以下の説明により明らかにする。実施例において特定の条件が示されていない場合、それは、従来の条件または製造業者によって推奨される条件に従って実施される。製造業者の指示なしに使用される試薬または器具は、市場から購入することができる従来の製品である。
【0087】
本発明の実施例は、例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の技術的解決策の詳細および形態は本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく修正または置き換えることができ、これらの修正および置き換えはすべて、本発明の保護範囲内に入ることを当業者は理解されたい。
【0088】
実施例１ 抗体のヒト化
第１に、古典的な「ＣＤＲ移植」を用いることによって抗体をヒト化し、すなわち、最も高い配列相同性を有するヒト抗体を選択して抗体フレームワーク領域（ＦＲ）を提供し、Ｋａｂａｔ命名法に基づく標的抗体の抗原結合断片相補性決定領域（ＣＤＲ）を前者に移植してヒト化抗体を形成した。第２に、抗体の活性および親和性をより良好に維持するために、抗体構造に基づくモデリング分析にＭＯＥソフトウェアを使用した１）。ＶＨ－ＶＬインターフェースに位置し、ＣＤＲと近いまたは抗体のフレームワーク領域のＣＤＲと直接相互作用するアミノ酸残基を、復帰突然変異のために選択したが、そのようなアミノ酸残基は、ＣＤＲの立体構造を維持するためにより重要であった２）。免疫原性を考慮して、タンパク質に埋め込まれたアミノ酸を、復帰突然変異のために可能な限り選択した３）。抗体の安定性および発現レベルを考慮すると、分子エネルギー還元変異が好ましかった。マウスＰＤ－Ｌ１抗体と同等またはより良好な親和性、抗体特性、および活性機能を有するヒト化抗体を、異なる変異を含むヒト化抗体とヒトＰＤ－Ｌ１および表面上にＰＤ－Ｌ１を発現する細胞との結合親和性を検出することによってスクリーニングした。
第１に、古典的な「ＣＤＲ移植」を用いることによって抗体をヒト化し、すなわち、最も高い配列相同性を有するヒト抗体を選択して抗体フレームワーク領域（ＦＲ）を提供し、Ｋａｂａｔ命名法に基づく標的抗体の抗原結合断片相補性決定領域（ＣＤＲ）を前者に移植してヒト化抗体を形成した。第２に、抗体の活性および親和性をより良好に維持するために、抗体構造に基づくモデリング分析にＭＯＥソフトウェアを使用した１）。ＶＨ－ＶＬインターフェースに位置し、ＣＤＲと近いまたは抗体のフレームワーク領域のＣＤＲと直接相互作用するアミノ酸残基を、復帰突然変異のために選択したが、そのようなアミノ酸残基は、ＣＤＲの立体構造を維持するためにより重要であった２）。免疫原性を考慮して、タンパク質に埋め込まれたアミノ酸を、復帰突然変異のために可能な限り選択した３）。抗体の安定性および発現レベルを考慮すると、分子エネルギー還元変異が好ましかった。マウスＰＤ－Ｌ１抗体と同等またはより良好な親和性、抗体特性、および活性機能を有するヒト化抗体を、異なる変異を含むヒト化抗体とヒトＰＤ－Ｌ１および表面上にＰＤ－Ｌ１を発現する細胞との結合親和性を検出することによってスクリーニングした。
【0089】
これらのうち、マウスＰＤ－Ｌ１抗体（ＰＤＬ１－７９４）のヒト化後の好ましい候補抗体分子（７９４－ｈ１－７１）の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列情報を以下の表１に示す。
【0090】
［表１］マウスおよびヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖および軽鎖可変領域の特異配列情報
【0091】
実施例２ ヒト化抗体の発現および精製
２．１ ヒト化抗体の発現
２．１ ヒト化抗体の発現
【0092】
トランスフェクションの前日に、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ社、Ａ２９１２７）を、新鮮なＥｘｐｉＣＨＯ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ２９１００－０１）に、２．５×１０６～４×１０６細胞／ｍＬの密度で播種し、振盪機上で一晩培養した。トランスフェクション当日に、一晩培養したＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞懸濁液を計数したところ、細胞生存率は９５％を超え、細胞密度は、７×１０６～１０×１０６生細胞／ｍＬであった。所望の細胞懸濁液を、ＥｘｐｉＣＨＯ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ２９１００－０１）で６×１０６細胞／ｍＬの密度に希釈し、振盪機上に置いてさらに使用した。調製したヒト化抗体発現用プラスミドを培地で希釈し、遠心管で穏やかに振盪してよく混合し、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ－ＤＮＡ希釈剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１２３０９－０１９）を加え、遠心管を穏やかに振盪してよく混合した後、室温で１～５分間静置した。上記プラスミド複合体を、トランスフェクトする細胞懸濁液にゆっくりと滴下し、滴下中にフラスコを振盪した。トランスフェクション後、細胞を振盪機上で一晩培養した。トランスフェクション後１日目の細胞に、細胞体積０．６％のＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ２９１２９）および細胞体積１６％のＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ２９１２９）を添加し、添加中にフラスコを穏やかに振盪し、細胞を振盪機に移して４日間培養した。トランスフェクション後５日目に、トランスフェクトした細胞に細胞体積１６％のＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ２９１２９）を添加し、添加中にフラスコを穏やかに振盪した。トランスフェクション後１２日目に、９，０００ｇの培養培地を採取し、１０分間遠心分離した後、上清を回収した。
【0093】
２．２ ヒト化抗体の精製
【0094】
実施例２．１で回収した細胞培養物の上清を高速で遠心分離し、０．４５μｍ＋０．２２μｍのフィルター膜を通過させた。精製の第一段階は、アフィニティークロマトグラフィーを用いて行った。クロマトグラフィー媒体はＦｃと相互作用するプロテインＡ充填剤Ｍｂａｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ社、１７５４３８０３）とし、平衡化緩衝液はＰＢＳ（２．５ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．４０８ｇ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４、８．７６ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）とした。カラムを４倍カラム容量のＰＢＳでバランシングした後、細胞上清を充填し、カラムと合わせ、カラム上のサンプルの保持時間が５分以上になるように流速を制御した。サンプルを装填した後、Ａ２８０ＵＶ吸光度がベースラインに低下するまで、カラムをＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄した。次いで、カラムを２０ｍＭのＰＢ＋１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）のカラム容量で２回洗浄した。次いで、Ａ２８０ＵＶ吸光度および導電率がベースラインに達するまで、カラムをＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄した。最後に、カラムを２０ｍＭクエン酸（ｐＨ３．４）の溶出緩衝液で洗浄し、溶出ピークをＡ２８０ＵＶ吸収ピークに基づいて収集した。回収した溶出サンプルを１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和した。
【0095】
実施例３ ＫＤアッセイにより分析したヒトおよびカニクイザルＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質への抗体の結合
ヒトおよびカニクイザルＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓタンパク質に対するＰＤ－Ｌ１抗体の結合親和性を決定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用した。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｇｅｎｗａｙ社、ＣａｔＧＷＢ－２０Ａ７０５）をＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＣａｔＢＲ－１００５－３０）上に２５℃で固定化した。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃを、ｐＨ５．０のacetate（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＢＲ－１００３－５１）で２０μｇ／ｍＬに希釈した。固定化にはアミン系固定化法を用いた。あるいは、市販のプロテインＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、カタログ番号：２９１２７５５６）チップを検出に使用することができる。抗原に対する抗体の親和性を、２５℃でのマルチサイクルカイネティクスを用いて判定した。各サイクルにおいて、試験される抗体をまず固定ＣＭ５チップ上に捕捉し、次いで組換えヒトＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓタンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ社、カタログ番号：３１５）およびカニクイザルＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、カタログ番号：９０２５１－Ｃ０８Ｈ）を注入し、最後にｐＨ１．５のグリシン（ＨＵＳＨＩ社、カタログ番号：６２０１１５１６）を再生のために使用した。移動相は、流速３０μＬ／分および結合時間は３００秒にて、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、カタログ番号：ＢＲ－１００６－６９）とした。再生のための流量および時間は、３０μＬ／分および３０秒とした。実験データは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン３．０）を用いて、１：１結合モデルで解析し、抗体および抗原の平衡解離定数（ＫＤ）をフィッティングし、会合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）を決定した。
ヒトおよびカニクイザルＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓタンパク質に対するＰＤ－Ｌ１抗体の結合親和性を決定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用した。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｇｅｎｗａｙ社、ＣａｔＧＷＢ－２０Ａ７０５）をＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＣａｔＢＲ－１００５－３０）上に２５℃で固定化した。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃを、ｐＨ５．０のacetate（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＢＲ－１００３－５１）で２０μｇ／ｍＬに希釈した。固定化にはアミン系固定化法を用いた。あるいは、市販のプロテインＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、カタログ番号：２９１２７５５６）チップを検出に使用することができる。抗原に対する抗体の親和性を、２５℃でのマルチサイクルカイネティクスを用いて判定した。各サイクルにおいて、試験される抗体をまず固定ＣＭ５チップ上に捕捉し、次いで組換えヒトＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓタンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ社、カタログ番号：３１５）およびカニクイザルＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、カタログ番号：９０２５１－Ｃ０８Ｈ）を注入し、最後にｐＨ１．５のグリシン（ＨＵＳＨＩ社、カタログ番号：６２０１１５１６）を再生のために使用した。移動相は、流速３０μＬ／分および結合時間は３００秒にて、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、カタログ番号：ＢＲ－１００６－６９）とした。再生のための流量および時間は、３０μＬ／分および３０秒とした。実験データは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン３．０）を用いて、１：１結合モデルで解析し、抗体および抗原の平衡解離定数（ＫＤ）をフィッティングし、会合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）を決定した。
【0096】
以下の表２に示すように、結果から試験したＰＤ－Ｌ１抗体がヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質およびカニクイザルＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質との結合に対してｎＭレベルまたはより高い親和性を示すことが分かる。
【0097】
［表２］ Ｂｉａｃｏｒｅによるヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体の結合親和性（ＫＤ）の結果
【0098】
実施例４ ＩＣ５０アッセイにより分析された抗体によるＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の相互作用の遮断
ＰＤ－Ｌ１タンパク質のＰＤ－１タンパク質への結合を遮断する抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＩＣ５０を、競合ＥＬＩＳＡによって判定した。ヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、カタログ番号：１００８４－Ｈ０５Ｈ）を炭酸緩衝液で希釈し、最終濃度１μｇ／ｍＬで９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加した。３％ＢＳＡを含むＰＢＳにてブロッキングし、勾配希釈した抗ＰＤ－Ｌ１抗体（４０ｎＭ～０．０２ｎM）およびヒトＰＤ－１－Ｈｉｓ組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、カタログ番号：１０３７７－Ｈ０８Ｈ）と共インキュベートした後、ＨＲＰ標識抗Ｈｉｓタグ抗体（ＭＢＬ、カタログ番号：Ｄ２９１－７）およびＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号：３４０２９）を添加して発色し、１Ｍ硫酸で終止した後にＯＤ値（二波長４５０ｎｍ－６３０ｎｍ）を読み取った。試験した抗体の競合的結合曲線は抗体濃度をＯＤ値に一致させることによって描くことができ、ＩＣ５０値を計算することができた。図１は、ヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質に対する抗ＰＤ－Ｌ１抗体の競合結合曲線を示す。結果は、試験した抗体（７９４－ｈ１－７１）がヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質とヒトＰＤ－１タンパク質との間の相互作用を０．８４８８ｎＭのＩＣ５０で効果的に遮断することができ、ポジティブコントロールであるテセントリク（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ社、ロット：Ｈ１７２）のＩＣ５０は０．８４８６ｎＭである。
ＰＤ－Ｌ１タンパク質のＰＤ－１タンパク質への結合を遮断する抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＩＣ５０を、競合ＥＬＩＳＡによって判定した。ヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、カタログ番号：１００８４－Ｈ０５Ｈ）を炭酸緩衝液で希釈し、最終濃度１μｇ／ｍＬで９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加した。３％ＢＳＡを含むＰＢＳにてブロッキングし、勾配希釈した抗ＰＤ－Ｌ１抗体（４０ｎＭ～０．０２ｎM）およびヒトＰＤ－１－Ｈｉｓ組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、カタログ番号：１０３７７－Ｈ０８Ｈ）と共インキュベートした後、ＨＲＰ標識抗Ｈｉｓタグ抗体（ＭＢＬ、カタログ番号：Ｄ２９１－７）およびＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号：３４０２９）を添加して発色し、１Ｍ硫酸で終止した後にＯＤ値（二波長４５０ｎｍ－６３０ｎｍ）を読み取った。試験した抗体の競合的結合曲線は抗体濃度をＯＤ値に一致させることによって描くことができ、ＩＣ５０値を計算することができた。図１は、ヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質に対する抗ＰＤ－Ｌ１抗体の競合結合曲線を示す。結果は、試験した抗体（７９４－ｈ１－７１）がヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質とヒトＰＤ－１タンパク質との間の相互作用を０．８４８８ｎＭのＩＣ５０で効果的に遮断することができ、ポジティブコントロールであるテセントリク（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ社、ロット：Ｈ１７２）のＩＣ５０は０．８４８６ｎＭである。
【0099】
実施例５ ＦＡＣＳアッセイによって検出された細胞表面上のＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－Ｌ１抗体のＥＣ５０
勾配濃度（抗体濃度：１００００ｎｇ／ｍＬ～０．１ｎｇ／ｍＬ）で検出される抗体を、細胞表面上にＰＤ－Ｌ１が高発現するＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｙｏｎｇｓｈａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、１０５細胞／ウェル）と共に、３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、希釈した（１：２５０）抗ヒトＩｇＧ ＰＥ蛍光抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：１２－４９９８－８）を上記培養物に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。産生された蛍光抗体は、検出したい抗体のＦｃセグメントと特異的に結合した。細胞表面上に高度に発現されたＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合する検出される抗体の能力を、ＦＡＣＳによってＰＥ蛍光強度のレベルを検出することによって分析した。図２の結果は７９４－ｈ１－７１抗体のＥＣ５０が３８．４４ｎｇ／ｍＬであることを示し、これは、この実験におけるポジティブコントロールであるアベルマブ（ＥＣ５０は約７２ｎｇ／ｍＬである）のものと類似する。アッセイは、細胞表面上のＰＤ－Ｌ１標的に対する７９４－ｈ１－７１抗体の用量依存的結合能を定量的に確認する。平均蛍光強度倍率（ＭＦＩ倍率）＝実験群のＭＦＩ値／薬剤（抗体）を添加しないコントロール群のＭＦＩ値。
勾配濃度（抗体濃度：１００００ｎｇ／ｍＬ～０．１ｎｇ／ｍＬ）で検出される抗体を、細胞表面上にＰＤ－Ｌ１が高発現するＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｙｏｎｇｓｈａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、１０５細胞／ウェル）と共に、３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、希釈した（１：２５０）抗ヒトＩｇＧ ＰＥ蛍光抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：１２－４９９８－８）を上記培養物に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。産生された蛍光抗体は、検出したい抗体のＦｃセグメントと特異的に結合した。細胞表面上に高度に発現されたＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合する検出される抗体の能力を、ＦＡＣＳによってＰＥ蛍光強度のレベルを検出することによって分析した。図２の結果は７９４－ｈ１－７１抗体のＥＣ５０が３８．４４ｎｇ／ｍＬであることを示し、これは、この実験におけるポジティブコントロールであるアベルマブ（ＥＣ５０は約７２ｎｇ／ｍＬである）のものと類似する。アッセイは、細胞表面上のＰＤ－Ｌ１標的に対する７９４－ｈ１－７１抗体の用量依存的結合能を定量的に確認する。平均蛍光強度倍率（ＭＦＩ倍率）＝実験群のＭＦＩ値／薬剤（抗体）を添加しないコントロール群のＭＦＩ値。
【0100】
実施例６ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１－ＮＦＡＴレポーター遺伝子により分析された抗ＰＤ－Ｌ１抗体によるＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１の結合およびシグナル伝達の阻害
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１タンパク質相互作用およびそのシグナル伝達経路に対するＰＤ－Ｌ１抗体の拮抗作用を、ＰＤ－１で安定的にトランスフェクトされたジャーカット細胞株（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、カタログ番号：００６１２）およびＰＤ－Ｌ１で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号：Ｍ００６１３）を用いて比較した。阻害シグナル伝達経路が阻害されると、ＮＦＡＴ制御発光レポーター遺伝子の発現が増強され、それに伴って発光シグナル値が増加した。ＰＤ－Ｌ１に対する抗体のブロッキング効果は、発光読み取り値の強度（相対発光量、ＲＬＵ）によって反映された。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１タンパク質相互作用およびそのシグナル伝達経路に対するＰＤ－Ｌ１抗体の拮抗作用を、ＰＤ－１で安定的にトランスフェクトされたジャーカット細胞株（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、カタログ番号：００６１２）およびＰＤ－Ｌ１で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号：Ｍ００６１３）を用いて比較した。阻害シグナル伝達経路が阻害されると、ＮＦＡＴ制御発光レポーター遺伝子の発現が増強され、それに伴って発光シグナル値が増加した。ＰＤ－Ｌ１に対する抗体のブロッキング効果は、発光読み取り値の強度（相対発光量、ＲＬＵ）によって反映された。
【0101】
ＰＤ－Ｌ１を安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株を、４０，０００細胞／ウェル（１００μｌ／ウェル）の密度で９６ウェルホワイトボトムプレートに播種し、インキュベーター内で一晩培養した。翌日、プレート内の培養培地を廃棄し、試験されるＰＤ－１（１６，０００細胞／ウェル）およびＰＤ－Ｌ１抗体（勾配希釈、各用量を３回）で安定してトランスフェクトされた細胞株を、１００μｌ／ウェルのインキュベーション容量および６時間のインキュベーション時間で、共インキュベーションのために添加した。インキュベーションが完了したら、等しい体積（１００μｌ）の発光検出試薬をプレートに加え、値を読み取った。検出値に従い、各抗体のＥＣ５０値を得るために、グラフパッドを用いて４パラメーター分析を行うことにより回帰曲線を作成した。図３は、抗体７９４－ｈ１－７１（１６６．２ｎｇ／ｍＬ）のＥＣ５０がポジティブコントロールであるアベルマブ（１８４．３ｎｇ／ｍＬ）のＥＣ５０と類似していたことを示す。このアッセイは抗体（７９４－ｈ１－７１）が細胞表面上のＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用に対して用量依存的阻害能を示し、それによってジャーカット細胞におけるレポーター遺伝子の活性が用量依存的に増強することを定量的に確認する。
【0102】
実施例７ ＥＬＩＳＡ法により検出された混合リンパ球反応においてＴ細胞により分泌されたＩＦＮ－γ
ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体によって増強されたＴ細胞活性を、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって判定した。ＣＤ４＋単球を健常ヒトドナー１の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、組換えヒト顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、カタログ番号：３００－０３）および組換えヒトインターロイキン４（ｒｈ ＩＬ－４、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、カタログ番号：２００－０４）を用いてインビトロで樹状細胞（ＤＣ）への分化を誘導した。培養６日目にＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｌ４５１６）を添加してＤＣを刺激して成熟させた。７日目に、ドナー１由来のＤＣを、健常ドナー２（ＤＣ：ＣＤ４＋が１：１０）、試験される抗体、ネガティブコントロール抗体（抗Ｈｅｌ、Ｂｉｏｉｎｔｒｏｎ社が合成）およびポジティブコントロール抗体、およびアベルマブ（抗体濃度：７ｎＭ～０．２８ｎＭ）のＰＢＭＣから濃縮したＣＤ４＋Ｔ細胞と４日間共培養した。４日後、細胞培養上清を回収し、上清中のＩＦＮ－γの含有量をＥＬＩＳＡにより検出した。図４に示すように、抗Ｈｅｌモノクローナル抗体（ネガティブコントロール群）と比較して、７９４－ｈ１－７１およびポジティブコントロール抗体であるアベルマブはＭＬＲ試験においてＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌能を有意に高め、ＰＤ－Ｌ１抗体の薬物濃度の低下に伴い、ＩＦＮ－γ分泌を増加させる活性も低下する。このことから、抗体（７９４－ｈ１－７１）は用量依存的にＴ細胞機能を増強することが示唆された（Ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。
ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体によって増強されたＴ細胞活性を、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって判定した。ＣＤ４＋単球を健常ヒトドナー１の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、組換えヒト顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、カタログ番号：３００－０３）および組換えヒトインターロイキン４（ｒｈ ＩＬ－４、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、カタログ番号：２００－０４）を用いてインビトロで樹状細胞（ＤＣ）への分化を誘導した。培養６日目にＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｌ４５１６）を添加してＤＣを刺激して成熟させた。７日目に、ドナー１由来のＤＣを、健常ドナー２（ＤＣ：ＣＤ４＋が１：１０）、試験される抗体、ネガティブコントロール抗体（抗Ｈｅｌ、Ｂｉｏｉｎｔｒｏｎ社が合成）およびポジティブコントロール抗体、およびアベルマブ（抗体濃度：７ｎＭ～０．２８ｎＭ）のＰＢＭＣから濃縮したＣＤ４＋Ｔ細胞と４日間共培養した。４日後、細胞培養上清を回収し、上清中のＩＦＮ－γの含有量をＥＬＩＳＡにより検出した。図４に示すように、抗Ｈｅｌモノクローナル抗体（ネガティブコントロール群）と比較して、７９４－ｈ１－７１およびポジティブコントロール抗体であるアベルマブはＭＬＲ試験においてＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌能を有意に高め、ＰＤ－Ｌ１抗体の薬物濃度の低下に伴い、ＩＦＮ－γ分泌を増加させる活性も低下する。このことから、抗体（７９４－ｈ１－７１）は用量依存的にＴ細胞機能を増強することが示唆された（Ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。
【0103】
実施例８ ＩＬ－１５融合タンパク質の構築
ＭＯＥソフトウェアを用いて、ヒトＩＬ－１５とそれに対応する受容体βγ鎖（それぞれ、Ｄ８、Ｖ３、Ｉ６、およびＨ１０５）との相互作用のための重要なアミノ酸部位をシミュレートした。ＭＯＥソフトウェアのシミュレーションは、以下のＩＬ－１５変異体配列を設計し、合成した。アミノ酸配列の詳細を表３に示し、コード核酸配列の詳細を表４（表４－１～表４－１１）に示す。
ＭＯＥソフトウェアを用いて、ヒトＩＬ－１５とそれに対応する受容体βγ鎖（それぞれ、Ｄ８、Ｖ３、Ｉ６、およびＨ１０５）との相互作用のための重要なアミノ酸部位をシミュレートした。ＭＯＥソフトウェアのシミュレーションは、以下のＩＬ－１５変異体配列を設計し、合成した。アミノ酸配列の詳細を表３に示し、コード核酸配列の詳細を表４（表４－１～表４－１１）に示す。
【0104】
ＩＬ－１５融合タンパク質（抗体／Ｆｃ融合構築物／複合体）を４つの様式で構築した：
（１）図５Ａに示す構造：ＩＬ－１５融合タンパク質は２つの単量体を含有するホモ二量体であり、前単量体は抗体重鎖、抗体軽鎖、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを含み、ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉは抗体重鎖のＦｃ末端に融合し、モノクローナル抗体およびＩＬ－１５－ＷＴ（野生型）またはＩＬ－１５変異体の軽鎖と共発現して、ＩＬ－１５をＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉに非共有結合する。
（２）図５Ｂに示す構造：ＩＬ－１５融合タンパク質は２つの単量体を含有するホモ二量体であり、前記単量体は抗体重鎖、抗体軽鎖、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを含み、抗体重鎖のＦｃ末端、ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉ、およびＩＬ－１５－ＷＴまたはＩＬ－１５変異体は、リンカーによって連続的にタンデムで融合して発現し、抗体軽鎖と共発現する。
（３）図５Ｃ（Ｖ５として定義される）に示す構造：前記ＩＬ－１５融合タンパク質は２つの単量体を含有するホモ二量体であり、前記単量体はＦｃ、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを含み、前記ＩＬ－１５－ＷＴまたはＩＬ－１５変異体はリンカーによってＩＬ１５－Ｒαｓｕｓｈｉに連結し、次いで、前記ＩＬ１５－ＲαｓｕｓｈｉはリンカーによってＦｃに連結する。
（４）図５Ｄ（Ｖ９として定義される）に示す構造：前記ＩＬ－１５融合タンパク質は２つの単量体を含有するホモ二量体であり、前記単量体はＦｃ、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを含み、前記ＩＬ１５－ＲαｓｕｓｈｉはリンカーによってＩＬ－１５－ＷＴまたはＩＬ－１５変異体に連結し、次いで、前記ＩＬ－１５はリンカーによってＦｃに連結する。
（１）図５Ａに示す構造：ＩＬ－１５融合タンパク質は２つの単量体を含有するホモ二量体であり、前単量体は抗体重鎖、抗体軽鎖、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを含み、ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉは抗体重鎖のＦｃ末端に融合し、モノクローナル抗体およびＩＬ－１５－ＷＴ（野生型）またはＩＬ－１５変異体の軽鎖と共発現して、ＩＬ－１５をＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉに非共有結合する。
（２）図５Ｂに示す構造：ＩＬ－１５融合タンパク質は２つの単量体を含有するホモ二量体であり、前記単量体は抗体重鎖、抗体軽鎖、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを含み、抗体重鎖のＦｃ末端、ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉ、およびＩＬ－１５－ＷＴまたはＩＬ－１５変異体は、リンカーによって連続的にタンデムで融合して発現し、抗体軽鎖と共発現する。
（３）図５Ｃ（Ｖ５として定義される）に示す構造：前記ＩＬ－１５融合タンパク質は２つの単量体を含有するホモ二量体であり、前記単量体はＦｃ、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを含み、前記ＩＬ－１５－ＷＴまたはＩＬ－１５変異体はリンカーによってＩＬ１５－Ｒαｓｕｓｈｉに連結し、次いで、前記ＩＬ１５－ＲαｓｕｓｈｉはリンカーによってＦｃに連結する。
（４）図５Ｄ（Ｖ９として定義される）に示す構造：前記ＩＬ－１５融合タンパク質は２つの単量体を含有するホモ二量体であり、前記単量体はＦｃ、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉを含み、前記ＩＬ１５－ＲαｓｕｓｈｉはリンカーによってＩＬ－１５－ＷＴまたはＩＬ－１５変異体に連結し、次いで、前記ＩＬ－１５はリンカーによってＦｃに連結する。
【0105】
ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１５融合タンパク質の命名規則は以下の通りである。「抗体頭字語－ＩＬ－１５（野生型／変異体）－融合タンパク質構築様式」。例えば、「Ｔ－ＩＬ１５－ｘｘ－１」の場合、「Ｔ」はテセントリクを示し、「ＩＬ１５－ｘｘ」はＩＬ１５－ＷＴまたはＩＬ１５変異体を示し、「１」は図５Ａに示す構造様式を示す。例えば、「７９４ＩＬ１５－ｘｘ－２」の場合、「７９４」は７９４－ｈ１－７１モノクローナル抗体を示し、「ＩＬ１５－ｘｘ」はＩＬ１５－ＷＴまたはＩＬ１５変異体を示し、「２」は図５Ｂに示す構造様式を示す。
【0106】
様々なＩＬ－１５融合タンパク質の設計を表５（表５－１～表５－２）および表６に示す。上記４つの構築様式に従って、融合タンパク質をコードする核酸配列を、それぞれｐＴＴ５プラスミド中に構築した。
【0107】
［表３－１］ ＩＬ－１５融合タンパク質のアミノ酸配列情報
【0108】
［表３－２］
【0109】
［表３－３］
【0110】
［表３－４］
【0111】
［表３－５］
【0112】
注：ＩＬ－１５変異体融合タンパク質の命名規則は以下の通りである。例えば、「Ｔ－ＩＬ１５－ｘｘ－１」の場合、「Ｔ」はテセントリクを示し、「ＩＬ１５－ｘｘ」はＩＬ１５－ＷＴまたはＩＬ１５変異体を示し、「１」は図５Ａに示す構造様式を示す。例えば、「７９４－ＩＬ１５－ｘｘ－２」の場合、「７９４」は７９４－ｈ１－７１ｍＡｂを示し、「ＩＬ１５－ｘｘ」はＩＬ１５－ＷＴまたはＩＬ１５変異体を示し、「２」は図５Ｂに示す構造様式を示す。
【0113】
［表４－１］ ＩＬ－１５融合タンパク質をコードする核酸の配列情報
【0114】
［表４－２］
【0115】
［表４－３］
【0116】
［表４－４］
【0117】
［表４－５］
【0118】
［表４－６］
【0119】
［表４－７］
【0120】
［表４－８］
【0121】
［表４－９］
【0122】
［表４－１０］
【0123】
［表４－１１］
【0124】
［表５－１］ ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ－１５融合タンパク質の分子組成
【0125】
［表５－２］
【0126】
注：ＩＬ－１５変異体融合タンパク質の命名規則は以下の通りである。例えば、「Ｔ－ＩＬ１５－ｘｘ－１」の場合、「Ｔ」はテセントリクを示し、「ＩＬ１５－ｘｘ」はＩＬ１５－ＷＴまたはＩＬ１５変異体を示し、「１」は図５Ａに示す構造様式を示す。例えば、「７９４－ＩＬ１５－ｘｘ－２」の場合、「７９４」は７９４－ｈ１－７１ｍＡｂを示し、「ＩＬ１５－ｘｘ」はＩＬ１５－ＷＴまたはＩＬ１５変異体を示し、「２」は図５Ｂに示す構造様式を示す。
【0127】
［表６］ ＩＬ－１５－Ｆｃ融合タンパク質の分子組成
【0128】
実施例９ ＩＬ－１５融合タンパク質の発現
ＥｘｐｉＣＨＯ発現系を用いて、一過性タンパク質発現を行った。宿主細胞、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（カタログ番号：Ａ２９１２７）、ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：Ａ２９１０００１）を適切な密度に希釈し、振盪機（１００ｒｐｍ、３７℃、８％のＣＯ２）上に置き、トランスフェクションの準備をした。融合タンパク質をコードする核酸配列を運ぶベクターをＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ（カタログ番号：１２３０９０１９）培地に０．５～１．０μｇ／ｍＬの最終ベクター濃度となるように添加した。ＤＮＡを含むＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ培地に適量のＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬（カタログ番号：Ａ２９１２９）を加えてＤＮＡ－ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬複合体を形成し、これを室温で１～５分間静置した後、トランスフェクションする細胞懸濁液にゆっくりと滴下した。トランスフェクション後１日目に、一定量のＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（カタログ番号：Ａ２９１２９）およびＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄ（カタログ番号：Ａ２９１２９）を懸濁液に添加し、それを３２℃に冷却して培養を継続した。トランスフェクション後４～６日目に、一定量のＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄ（カタログ番号：Ａ２９１２９）をさらに添加した。トランスフェクション後１０～１２日目に、上清を５０００ｇで３０分間の遠心分離によって回収した。
ＥｘｐｉＣＨＯ発現系を用いて、一過性タンパク質発現を行った。宿主細胞、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（カタログ番号：Ａ２９１２７）、ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：Ａ２９１０００１）を適切な密度に希釈し、振盪機（１００ｒｐｍ、３７℃、８％のＣＯ２）上に置き、トランスフェクションの準備をした。融合タンパク質をコードする核酸配列を運ぶベクターをＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ（カタログ番号：１２３０９０１９）培地に０．５～１．０μｇ／ｍＬの最終ベクター濃度となるように添加した。ＤＮＡを含むＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ培地に適量のＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬（カタログ番号：Ａ２９１２９）を加えてＤＮＡ－ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬複合体を形成し、これを室温で１～５分間静置した後、トランスフェクションする細胞懸濁液にゆっくりと滴下した。トランスフェクション後１日目に、一定量のＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（カタログ番号：Ａ２９１２９）およびＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄ（カタログ番号：Ａ２９１２９）を懸濁液に添加し、それを３２℃に冷却して培養を継続した。トランスフェクション後４～６日目に、一定量のＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄ（カタログ番号：Ａ２９１２９）をさらに添加した。トランスフェクション後１０～１２日目に、上清を５０００ｇで３０分間の遠心分離によって回収した。
【0129】
実施例１０ ＩＬ－１５融合タンパク質の精製
変異体融合タンパク質を磁気ビーズによって精製した。適切な量の磁性ビーズ懸濁液（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号：ＮＯ．Ｌ００６９５）を発酵上清に添加し、回転ミキサー中で２時間インキュベートして、磁性ビーズに結合したＩＬ－１５融合タンパク質を確保した。上清を廃棄した後、ビーズをＰＢＳで３回洗浄した。ＩＬ－１５融合タンパク質をｐＨ３．０のクエン酸塩で溶出し、１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌで中和した。ＩＬ－１５融合タンパク質の濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅによって測定した。
変異体融合タンパク質を磁気ビーズによって精製した。適切な量の磁性ビーズ懸濁液（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号：ＮＯ．Ｌ００６９５）を発酵上清に添加し、回転ミキサー中で２時間インキュベートして、磁性ビーズに結合したＩＬ－１５融合タンパク質を確保した。上清を廃棄した後、ビーズをＰＢＳで３回洗浄した。ＩＬ－１５融合タンパク質をｐＨ３．０のクエン酸塩で溶出し、１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌで中和した。ＩＬ－１５融合タンパク質の濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅによって測定した。
【0130】
実施例１１ サイズ排除クロマトグラフィーによって測定されるＩＬ－１５融合タンパク質の純度
本発明のＩＬ－１５変異体融合タンパク質の純度は、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨ社、０００８５４１）およびプレカラムＴｓｋｇｅｌ ｇｕａｒｄ ｃｏｌｕｍｎＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社、０００８５４３）を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定した。移動相（５０ｍＭのＰＢ、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．８）を使用して、１ｍＬ／分の流速でクロマトグラフィーカラムを平衡化した。紫外線検出波長は２８０ｎｍであった。結果を表７に示す。
本発明のＩＬ－１５変異体融合タンパク質の純度は、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨ社、０００８５４１）およびプレカラムＴｓｋｇｅｌ ｇｕａｒｄ ｃｏｌｕｍｎＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社、０００８５４３）を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定した。移動相（５０ｍＭのＰＢ、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．８）を使用して、１ｍＬ／分の流速でクロマトグラフィーカラムを平衡化した。紫外線検出波長は２８０ｎｍであった。結果を表７に示す。
【0131】
［表７］ サイズ排除クロマトグラフィーによって測定されるＩＬ－１５融合タンパク質の純度
【0132】
実施例１２ ＩＬ－１５変異体融合タンパク質により誘導されたＭｏ７ｅ細胞の増殖アッセイ
Ｍｏ７ｅは、細胞増殖活性に対するＩＬ－１５の効果を検討するために使用することができるヒト巨核球性白血病細胞株（Ｃｏｂｉｏｅｒ社、ＣＢＰ６０７９１）である。ＩＬ－１５変異体融合タンパク質を、１６４０～１０％のＦＢＳ（ＲＰＭＩ１６４０、Ｇｉｂｃｏ社、７２４０００４７；ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社、１００９９１４１）で勾配濃度（最終濃度：１０００００ｐＭ～１．２８ｐＭ、５倍希釈）に希釈した。Ｍｏ７ｅ細胞を１６４０～１０％のＦＢＳで１０５細胞／ｍＬに希釈した。変異培地５０μｌおよびＭｏ７ｅ細胞懸濁液５０μｌを９６ウェルＵ底プレートに加え、混合し、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。７２時間後、培養プレートを取り出し、１００μｌのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ発光細胞生存検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｇ７５７１）を加えて、細胞増殖能に比例する蛍光強度を検出した。
Ｍｏ７ｅは、細胞増殖活性に対するＩＬ－１５の効果を検討するために使用することができるヒト巨核球性白血病細胞株（Ｃｏｂｉｏｅｒ社、ＣＢＰ６０７９１）である。ＩＬ－１５変異体融合タンパク質を、１６４０～１０％のＦＢＳ（ＲＰＭＩ１６４０、Ｇｉｂｃｏ社、７２４０００４７；ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社、１００９９１４１）で勾配濃度（最終濃度：１０００００ｐＭ～１．２８ｐＭ、５倍希釈）に希釈した。Ｍｏ７ｅ細胞を１６４０～１０％のＦＢＳで１０５細胞／ｍＬに希釈した。変異培地５０μｌおよびＭｏ７ｅ細胞懸濁液５０μｌを９６ウェルＵ底プレートに加え、混合し、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。７２時間後、培養プレートを取り出し、１００μｌのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ発光細胞生存検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｇ７５７１）を加えて、細胞増殖能に比例する蛍光強度を検出した。
【0133】
結果を図６Ａ～６Ｄに示す。Ｔ－ＩＬ１５－７－１、Ｔ－ＩＬ１５－８－１およびＴ－ＩＬ１５－９－１変異体はＴ－ＩＬ１５－ＷＴ－１と比較して有意に活性が低く、Ｔ－ＩＬ１５－７－１のＥＣ５０は５７３５ｐＭで、Ｔ－ＩＬ１５－ＷＴ－１のＥＣ５０は１３３．３ｐＭである（図６Ａ）。Ｔ－ＩＬ１５－１０－１、Ｔ－ＩＬ１５－１１－１およびＴ－ＩＬ１５－２６－１変異体はＴ－ＩＬ１５－ＷＴ－１と比較して有意に活性が低く、Ｔ－ＩＬ１５－１０－１のＥＣ５０は２８０７６ｐＭ、Ｔ－ＩＬ１５－２６－１のＥＣ５０は２９０．９ｐＭ、およびＴ－ＩＬ１５－ＷＴ－１のＥＣ５０は１４３．３ｐＭである（図６Ｂ）。Ｔ－ＩＬ１５－２９－１およびＴ－ＩＬ１５－４２－１変異体はＴ－ＩＬ１５－ＷＴ－１と比較して活性の低く、それぞれＥＣ５０が２８５．２ｐＭおよび１９４．５ｐＭであり、Ｔ－ＩＬ１５－４３－１変異体はＴ－ＩＬ１５－ＷＴ－１と比較して活性が高く、Ｔ－ＩＬ１５－４３－１変異体のＥＣ５０は１０３．２ｐＭでＴ－ＩＬ１５－ＷＴ－１のＥＣ５０は１５０．７ｐＭである（図６Ｃ）。Ｔ－ＩＬ１５－ｃｏｍ１－１およびＴ－ＩＬ１５－ｃｏｍ２－１を組み合わせた変異体はＴ－ＩＬ１５－ＷＴ－１と比較して活性が低く、テセントリクコントロールがＭｏ７ｅ細胞増殖に対して効果を有さず、すなわち、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＭｏ７ｅ細胞に対して増殖誘導活性を有さず（図６Ｄ）、細胞増殖活性に対する効果はＩＬ－１５によって生じる。
【0134】
実施例１３ ＩＬ１５変異体融合タンパク質によって誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞増殖
ヒトＰＢＭＣ（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社、ロット：１９１１１５０１２３）におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激することに対するＩＬ－１５変異体融合タンパク質の効果を検出するために、Ｋｉ６７を増殖マーカーとして本実施例において使用し、ヒトＰＢＭＣをＩＬ－１５変異体融合タンパク質で３日間異なる濃度で刺激した後のＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖割合を検出した。まず、ヒトＰＢＭＣを、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号：１００９９１４１）および１％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号：１５１４０１２２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号：７２４０００４７）に懸濁した。細胞密度を２×１０６細胞／ｍＬに調整した後、細胞懸濁液を９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号：３７９９）に１００μｌ／ウェルで添加した。次いで、ＩＬ－１５変異体融合タンパク質を５００ｎＭから４倍勾配で希釈し、計１１の勾配とし、その後、各濃度の１００μｌ／ウェルのサンプルを、ヒトＰＢＭＣでコーティングされた９６ウェルＵ底プレートに添加し、均等に混合し、インキュベーター中で５％のＣＯ２および３７℃で３日間培養した。培養細胞を、ＬＩＶＥ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号：Ｌ３４９６４）およびＣＤ３－ＡＦ７００（ＢＤ社、カタログ番号：５５７９４３）、ＣＤ８－ＦＩＴＣ（ＢＤ社、カタログ番号：５５５３６６）、およびＡＰＣ－Ｋｉ６７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号：３５０５１４）抗体で染色し、次いでフローサイトメトリーを用いて、異なる濃度のＩＬ－１５変異融合タンパク質で刺激したＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＫｉ６７＋細胞の割合を検出した。図７Ａ～７Ｎは、ヒトＰＢＭＣを勾配希釈したＴ－ＩＬ１５－７－１、Ｔ－ＩＬ１５－８－１、Ｔ－ＩＬ１５－９－１、Ｔ－ＩＬ１５－１０－１、Ｔ－ＩＬ１５－１１－１、Ｔ－ＩＬ１５－２６－１、Ｔ－ＩＬ１５－２９－１、Ｔ－ＩＬ１５－４２－１、Ｔ－ＩＬ１５－４３－１、７９４－ＩＬ１５－７－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ１－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ３－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ４－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ５－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ６－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ７－２、Ｖ９－ＩＬ１５－６１、Ｖ９－ＩＬ１５－６２、Ｖ９－ＩＬ１５－６３、Ｖ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６、７９４－ＩＬ１５－６５－２、７９４－ＩＬ１５－６４－２、Ｖ５－ＩＬ１５－ＷＴおよびＰ２２３３９で３日間刺激した後のＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖割合、ならびに、各変異体によって刺激された増殖のＥＣ５０値を示す。これらの中で、Ｔ－ＩＬ１５－８－１、Ｔ－ＩＬ１５－９－１およびＴ－ＩＬ１５－１１－１は、プラットフォームに到達しないＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖能力に対する効果を有意に低下させるため、曲線をフィットしてＥＣ５０を計算することができず、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ４－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ５－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ６－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ７－２、Ｖ９－ＩＬ１５－６１、Ｖ９－ＩＬ１５－６２、Ｖ９－ＩＬ１５－６３、Ｖ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６および７９４－ＩＬ１５－６５－２は、プラットフォームに到達しないため、ＥＣ５０値が正確にフィットしないが、結果はこれらの変異体の組合せが、７９４－ＩＬ１５－ＷＴ－２またはＰ２２３３９と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖能力に対する効果を有意に低下させることを示す。Ｔ－ＩＬ１５－ＷＴ－１および７９４－ＩＬ１５－ＷＴ－２は野生型ＩＬ－１５コントロールであり、Ｐ２２３３９は変異体ＩＬ－１５コントロールであり、７９４－ｈ１－７１モノクローナル抗体は抗ＰＤ－Ｌ１抗体コントロールであり、薬物０はタンパク質を添加しないネガティブコントロールである。野生型ＩＬ－１５コントロールと比較して、ＩＬ１５変異体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に対する効果が弱い。７９４－ｈ１－７１ｍＡｂコントロール群はＣＤ８＋Ｔ細胞増殖に対して効果を有さず、すなわち、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＣＤ８＋Ｔ細胞に対して増殖誘導活性を有さず（図７Ｂ）、細胞増殖活性に対する効果はＩＬ－１５によって生じる。
ヒトＰＢＭＣ（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社、ロット：１９１１１５０１２３）におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激することに対するＩＬ－１５変異体融合タンパク質の効果を検出するために、Ｋｉ６７を増殖マーカーとして本実施例において使用し、ヒトＰＢＭＣをＩＬ－１５変異体融合タンパク質で３日間異なる濃度で刺激した後のＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖割合を検出した。まず、ヒトＰＢＭＣを、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号：１００９９１４１）および１％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号：１５１４０１２２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号：７２４０００４７）に懸濁した。細胞密度を２×１０６細胞／ｍＬに調整した後、細胞懸濁液を９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号：３７９９）に１００μｌ／ウェルで添加した。次いで、ＩＬ－１５変異体融合タンパク質を５００ｎＭから４倍勾配で希釈し、計１１の勾配とし、その後、各濃度の１００μｌ／ウェルのサンプルを、ヒトＰＢＭＣでコーティングされた９６ウェルＵ底プレートに添加し、均等に混合し、インキュベーター中で５％のＣＯ２および３７℃で３日間培養した。培養細胞を、ＬＩＶＥ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号：Ｌ３４９６４）およびＣＤ３－ＡＦ７００（ＢＤ社、カタログ番号：５５７９４３）、ＣＤ８－ＦＩＴＣ（ＢＤ社、カタログ番号：５５５３６６）、およびＡＰＣ－Ｋｉ６７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号：３５０５１４）抗体で染色し、次いでフローサイトメトリーを用いて、異なる濃度のＩＬ－１５変異融合タンパク質で刺激したＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＫｉ６７＋細胞の割合を検出した。図７Ａ～７Ｎは、ヒトＰＢＭＣを勾配希釈したＴ－ＩＬ１５－７－１、Ｔ－ＩＬ１５－８－１、Ｔ－ＩＬ１５－９－１、Ｔ－ＩＬ１５－１０－１、Ｔ－ＩＬ１５－１１－１、Ｔ－ＩＬ１５－２６－１、Ｔ－ＩＬ１５－２９－１、Ｔ－ＩＬ１５－４２－１、Ｔ－ＩＬ１５－４３－１、７９４－ＩＬ１５－７－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ１－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ３－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ４－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ５－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ６－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ７－２、Ｖ９－ＩＬ１５－６１、Ｖ９－ＩＬ１５－６２、Ｖ９－ＩＬ１５－６３、Ｖ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６、７９４－ＩＬ１５－６５－２、７９４－ＩＬ１５－６４－２、Ｖ５－ＩＬ１５－ＷＴおよびＰ２２３３９で３日間刺激した後のＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖割合、ならびに、各変異体によって刺激された増殖のＥＣ５０値を示す。これらの中で、Ｔ－ＩＬ１５－８－１、Ｔ－ＩＬ１５－９－１およびＴ－ＩＬ１５－１１－１は、プラットフォームに到達しないＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖能力に対する効果を有意に低下させるため、曲線をフィットしてＥＣ５０を計算することができず、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ４－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ５－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ６－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ７－２、Ｖ９－ＩＬ１５－６１、Ｖ９－ＩＬ１５－６２、Ｖ９－ＩＬ１５－６３、Ｖ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６および７９４－ＩＬ１５－６５－２は、プラットフォームに到達しないため、ＥＣ５０値が正確にフィットしないが、結果はこれらの変異体の組合せが、７９４－ＩＬ１５－ＷＴ－２またはＰ２２３３９と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖能力に対する効果を有意に低下させることを示す。Ｔ－ＩＬ１５－ＷＴ－１および７９４－ＩＬ１５－ＷＴ－２は野生型ＩＬ－１５コントロールであり、Ｐ２２３３９は変異体ＩＬ－１５コントロールであり、７９４－ｈ１－７１モノクローナル抗体は抗ＰＤ－Ｌ１抗体コントロールであり、薬物０はタンパク質を添加しないネガティブコントロールである。野生型ＩＬ－１５コントロールと比較して、ＩＬ１５変異体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に対する効果が弱い。７９４－ｈ１－７１ｍＡｂコントロール群はＣＤ８＋Ｔ細胞増殖に対して効果を有さず、すなわち、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＣＤ８＋Ｔ細胞に対して増殖誘導活性を有さず（図７Ｂ）、細胞増殖活性に対する効果はＩＬ－１５によって生じる。
【0135】
実施例１４ ＩＬ１５変異融合タンパク質によって誘導されるＮＫ細胞増殖
ヒトＰＢＭＣ（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社、ロット：１９１１１５０１２３）におけるＮＫ細胞の増殖を刺激することに対するＩＬ－１５変異体融合タンパク質の効果を検出するために、Ｋｉ６７を、増殖マーカーとして本実施例において使用し、ヒトＰＢＭＣをＩＬ－１５変異体融合タンパク質で３日間異なる濃度で刺激した後のＮＫ細胞の増殖割合を検出した。まず、ヒトＰＢＭＣを、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号：１００９９１４１）および１％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号：１５１４０１２２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号：７２４０００４７）に懸濁した。細胞密度を２×１０６細胞／ｍＬに調整した後、細胞懸濁液を９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号：３７９９）に１００μｌ／ウェルで添加した。次に、ＩＬ－１５変異体融合タンパク質を５００ｎＭから４倍の勾配で希釈し、計１１の勾配とし、その後、各濃度の１００μｌ／ウェルのサンプルを、ヒトＰＢＭＣをコーティングした９６ウェルＵ底プレートに添加し、均等に混合し、インキュベーター中で５％のＣＯ２および３７℃で３日間培養した。培養細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号：Ｌ３４９６４）およびＣＤ３－ＡＦ７００（ＢＤ社、カタログ番号：５５７９４３）、ＣＤ５６－ＰＥ（ＢＤ社、カタログ番号：５５５５１６）、およびＡＰＣ－Ｋｉ６７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号：３５０５１４）抗体で染色し、次いでＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを使用して、異なる濃度のＩＬ－１５変異融合タンパク質で刺激したＮＫ細胞中のＫｉ６７＋細胞の割合を検出した。図８Ａ～８Ｍは、ヒトＰＢＭＣを勾配希釈したＴ－ＩＬ１５－７－１、Ｔ－ＩＬ１５－８－１、Ｔ－ＩＬ１５－９－１、Ｔ－ＩＬ１５－１０－１、Ｔ－ＩＬ１５－１１－１、Ｔ－ＩＬ１５－２６－１、Ｔ－ＩＬ１５－２９－１、Ｔ－ＩＬ１５－４２－１、Ｔ－ＩＬ１５－４３－１、７９４－ＩＬ１５－７－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ１－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ４－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ５－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ６－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ７－２、Ｖ９－ＩＬ１５－６１、Ｖ９－ＩＬ１５－６２、Ｖ９－ＩＬ１５－６３、Ｖ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６、７９４－ＩＬ１５－６５－２、７９４－ＩＬ１５－６４－２、Ｖ５－ＩＬ１５－ＷＴおよびＰ２２３３９で３日間刺激した後のＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）の増殖割合、ならびに、各変異体によって刺激された増殖のＥＣ５０値を示す。これらの中で、Ｔ－ＩＬ１５－８－１、Ｔ－ＩＬ１５－９－１、Ｔ－ＩＬ１５－１１－１、Ｖ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６、Ｖ９－ＩＬ１５－６２およびＶ９－ＩＬ１５－６３は、プラットフォームに到達しないＮＫ細胞の増殖能に対する効果を有意に低下させるため、ＥＣ５０値が正確にフィットしないが、これらの変異体の組合せはＴ－ＩＬ１５－ＷＴ－１またはＰ２２３３９コントロール群と比較して、ＮＫ細胞の増殖活性に対する効果を有意に低下させることを示す。Ｔ－ＩＬ１５－ＷＴ－１および７９４－ＩＬ１５－ＷＴ－２は野生型ＩＬ－１５コントロールであり、Ｐ２２３３９は変異体ＩＬ－１５コントロールであり、７９４－ｈ１－７１モノクローナル抗体は抗ＰＤ－Ｌ１抗体コントロールであり、薬物０はタンパク質を添加しないネガティブコントロールである。野生型ＩＬ－１５コントロールと比較して、ＩＬ－１５変異体は、ＮＫ細胞の増殖に対する効果が弱い。７９４－ｈ１－７１ｍＡｂコントロール群はＮＫ細胞増殖に対して効果を有さず、すなわち、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＮＫ細胞に対する増殖誘導活性を有さず（図８Ｂ）、細胞増殖活性に対する効果はＩＬ－１５によって生じる。
ヒトＰＢＭＣ（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社、ロット：１９１１１５０１２３）におけるＮＫ細胞の増殖を刺激することに対するＩＬ－１５変異体融合タンパク質の効果を検出するために、Ｋｉ６７を、増殖マーカーとして本実施例において使用し、ヒトＰＢＭＣをＩＬ－１５変異体融合タンパク質で３日間異なる濃度で刺激した後のＮＫ細胞の増殖割合を検出した。まず、ヒトＰＢＭＣを、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号：１００９９１４１）および１％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号：１５１４０１２２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号：７２４０００４７）に懸濁した。細胞密度を２×１０６細胞／ｍＬに調整した後、細胞懸濁液を９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号：３７９９）に１００μｌ／ウェルで添加した。次に、ＩＬ－１５変異体融合タンパク質を５００ｎＭから４倍の勾配で希釈し、計１１の勾配とし、その後、各濃度の１００μｌ／ウェルのサンプルを、ヒトＰＢＭＣをコーティングした９６ウェルＵ底プレートに添加し、均等に混合し、インキュベーター中で５％のＣＯ２および３７℃で３日間培養した。培養細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号：Ｌ３４９６４）およびＣＤ３－ＡＦ７００（ＢＤ社、カタログ番号：５５７９４３）、ＣＤ５６－ＰＥ（ＢＤ社、カタログ番号：５５５５１６）、およびＡＰＣ－Ｋｉ６７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号：３５０５１４）抗体で染色し、次いでＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを使用して、異なる濃度のＩＬ－１５変異融合タンパク質で刺激したＮＫ細胞中のＫｉ６７＋細胞の割合を検出した。図８Ａ～８Ｍは、ヒトＰＢＭＣを勾配希釈したＴ－ＩＬ１５－７－１、Ｔ－ＩＬ１５－８－１、Ｔ－ＩＬ１５－９－１、Ｔ－ＩＬ１５－１０－１、Ｔ－ＩＬ１５－１１－１、Ｔ－ＩＬ１５－２６－１、Ｔ－ＩＬ１５－２９－１、Ｔ－ＩＬ１５－４２－１、Ｔ－ＩＬ１５－４３－１、７９４－ＩＬ１５－７－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ１－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ４－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ５－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ６－２、７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ７－２、Ｖ９－ＩＬ１５－６１、Ｖ９－ＩＬ１５－６２、Ｖ９－ＩＬ１５－６３、Ｖ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６、７９４－ＩＬ１５－６５－２、７９４－ＩＬ１５－６４－２、Ｖ５－ＩＬ１５－ＷＴおよびＰ２２３３９で３日間刺激した後のＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）の増殖割合、ならびに、各変異体によって刺激された増殖のＥＣ５０値を示す。これらの中で、Ｔ－ＩＬ１５－８－１、Ｔ－ＩＬ１５－９－１、Ｔ－ＩＬ１５－１１－１、Ｖ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６、Ｖ９－ＩＬ１５－６２およびＶ９－ＩＬ１５－６３は、プラットフォームに到達しないＮＫ細胞の増殖能に対する効果を有意に低下させるため、ＥＣ５０値が正確にフィットしないが、これらの変異体の組合せはＴ－ＩＬ１５－ＷＴ－１またはＰ２２３３９コントロール群と比較して、ＮＫ細胞の増殖活性に対する効果を有意に低下させることを示す。Ｔ－ＩＬ１５－ＷＴ－１および７９４－ＩＬ１５－ＷＴ－２は野生型ＩＬ－１５コントロールであり、Ｐ２２３３９は変異体ＩＬ－１５コントロールであり、７９４－ｈ１－７１モノクローナル抗体は抗ＰＤ－Ｌ１抗体コントロールであり、薬物０はタンパク質を添加しないネガティブコントロールである。野生型ＩＬ－１５コントロールと比較して、ＩＬ－１５変異体は、ＮＫ細胞の増殖に対する効果が弱い。７９４－ｈ１－７１ｍＡｂコントロール群はＮＫ細胞増殖に対して効果を有さず、すなわち、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＮＫ細胞に対する増殖誘導活性を有さず（図８Ｂ）、細胞増殖活性に対する効果はＩＬ－１５によって生じる。
【0136】
実施例１５ マウスにおけるヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体－Ｉｌ１５二機能性Ｍ分子／融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ薬学的有効性
ヒト黒色腫Ａ３７５細胞（Ｂｅｉｎａ Ｂｉｏ社；ＢＮＣＣ１００２６６）を５×１０６細胞／１００μＬでＮＰＧマウスの右背中に皮下接種した。Ａ３７５を接種した翌日、凍結保存したＰＢＭＣ（ＡＬＬＣＥＬＬ社、図 ＰＢ００５Ｆ－Ｃ）を蘇生し、ＮＰＧマウス（５～６週齢、雌；Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌｓｔａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入）に尾静脈を介して５×１０６細胞／２００μｌの用量で注射した。ＰＢＭＣ接種の６日後、４０μｌの血液を採取してｈＣＤ４５＋細胞の割合を検出した。腫瘍が約８０ｍｍ３に成長した後、体重、ｈＣＤ４５＋細胞の割合、および腫瘍体積が大きすぎるか小さすぎるマウスは除外した。腫瘍体積に応じて、マウスをＰＢＳ群、テセントリク群（１０ｍｇ／ｋｇ）、７９４－ＩＬ１５－ＷＴ－２群（１ｍｇ／ｋｇ）および７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ６－２群（４ｍｇ／ｋｇ）を含む４群に無作為に分け、各郡８匹、合計３２匹のマウスを用いた。７９４－ＩＬ１５－ＷＴ－２群（１ｍｇ／ｋｇ）および７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ６－２群（４ｍｇ／ｋｇ）において合計１用量の薬剤を週１回腹腔内投与し、ＰＢＳ群およびテセントリク群（１０ｍｇ／ｋｇ）において合計５用量の薬剤を週２回投与した。腫瘍体積を週３回測定し、データを記録した。腫瘍体積（長径×短径２／２）および腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩＴＶ（％）、ＴＧＩＴＶ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００％を計算した。Ｔｉは処置ｉ日目の処置群の平均腫瘍体積を示し、Ｔ０は処置０日目の処置群の平均腫瘍体積を示し、Ｖｉは処置ｉ日目の溶媒コントロール群の平均腫瘍体積を示し、Ｖ０は処置０日目の溶媒コントロール群の平均腫瘍体積を示す。群投与１４日目、薬剤投与群はいずれも腫瘍体積に対して、統計学的に有意な差が認められる有意な阻害効果を有し（Ｐ＜０．０５）、７９４－ＩＬ１５－ＷＴ－２群および７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ６－２群はテセントリク群と比較して腫瘍体積に対して有意な阻害効果を有した（Ｐ＜０．０５）。図９Ａ～９Ｃおよび表８を参照のこと。
ヒト黒色腫Ａ３７５細胞（Ｂｅｉｎａ Ｂｉｏ社；ＢＮＣＣ１００２６６）を５×１０６細胞／１００μＬでＮＰＧマウスの右背中に皮下接種した。Ａ３７５を接種した翌日、凍結保存したＰＢＭＣ（ＡＬＬＣＥＬＬ社、図 ＰＢ００５Ｆ－Ｃ）を蘇生し、ＮＰＧマウス（５～６週齢、雌；Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌｓｔａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入）に尾静脈を介して５×１０６細胞／２００μｌの用量で注射した。ＰＢＭＣ接種の６日後、４０μｌの血液を採取してｈＣＤ４５＋細胞の割合を検出した。腫瘍が約８０ｍｍ３に成長した後、体重、ｈＣＤ４５＋細胞の割合、および腫瘍体積が大きすぎるか小さすぎるマウスは除外した。腫瘍体積に応じて、マウスをＰＢＳ群、テセントリク群（１０ｍｇ／ｋｇ）、７９４－ＩＬ１５－ＷＴ－２群（１ｍｇ／ｋｇ）および７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ６－２群（４ｍｇ／ｋｇ）を含む４群に無作為に分け、各郡８匹、合計３２匹のマウスを用いた。７９４－ＩＬ１５－ＷＴ－２群（１ｍｇ／ｋｇ）および７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ６－２群（４ｍｇ／ｋｇ）において合計１用量の薬剤を週１回腹腔内投与し、ＰＢＳ群およびテセントリク群（１０ｍｇ／ｋｇ）において合計５用量の薬剤を週２回投与した。腫瘍体積を週３回測定し、データを記録した。腫瘍体積（長径×短径２／２）および腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩＴＶ（％）、ＴＧＩＴＶ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００％を計算した。Ｔｉは処置ｉ日目の処置群の平均腫瘍体積を示し、Ｔ０は処置０日目の処置群の平均腫瘍体積を示し、Ｖｉは処置ｉ日目の溶媒コントロール群の平均腫瘍体積を示し、Ｖ０は処置０日目の溶媒コントロール群の平均腫瘍体積を示す。群投与１４日目、薬剤投与群はいずれも腫瘍体積に対して、統計学的に有意な差が認められる有意な阻害効果を有し（Ｐ＜０．０５）、７９４－ＩＬ１５－ＷＴ－２群および７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ６－２群はテセントリク群と比較して腫瘍体積に対して有意な阻害効果を有した（Ｐ＜０．０５）。図９Ａ～９Ｃおよび表８を参照のこと。
【0137】
［表８］ 免疫再構成ＮＰＧマウスにおけるＡ３７５腫瘍体積に対する試験薬剤の効果
【0138】
注：ａ：平均±標準誤差、ｂ：群投与１４日目の薬剤投与群と媒体コントロール群（ＰＢＳ）間の腫瘍体積の統計比較、二元配置分散解析、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０００１、ｃ：群投与１４日目の薬剤投与群とテセントリク（陽性薬剤）群間の腫瘍体積の統計比較、二元配置分散解析、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０００１。
【0139】
上記の結果は、７９４－ＩＬ１５－ＷＴ－２および７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ６－２（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＬ１５二機能性分子／融合タンパク質）の両方が皮下異種移植Ａ３７５腫瘍の増殖に対して有意な阻害効果を有することを示し（Ｐ＜０．０００１）、７９４－ＩＬ１５－ＷＴ－２および７９４－ＩＬ１５－ｃｏｍ６－２群はテセントリク群と比較して、腫瘍体積に対して有意差が認められる強い阻害効果を有する（Ｐ＜０．０５）。
【0140】
実施例１６ マウスにおけるＩＬ１５－Ｆｃ融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ薬学的有効性
ヒト黒色腫Ａ３７５細胞（Ｂｅｉｎａ Ｂｉｏ社；ＢＮＣＣ１００２６６）を５×１０６細胞／１００μＬでＮＰＧマウスの右背中に皮下接種した。Ａ３７５を接種した翌日、凍結保存したＰＢＭＣ（ＡＬＬＣＥＬＬ社、図ＰＢ００５Ｆ－Ｃ）を蘇生し、ＮＰＧマウス（５～６週齢、雌；Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌｓｔａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入）に尾静脈を介して５×１０６細胞／２００μｌの用量で注射した。ＰＢＭＣ接種の６日後、４０μｌの血液を採取してｈＣＤ４５＋細胞の割合を検出した。腫瘍が約６９ｍｍ３に成長した後、体重、ｈＣＤ４５＋細胞の割合、および腫瘍体積が大きすぎるか小さすぎるマウスは除外した。腫瘍体積に応じて、マウスをＰＢＳ群、ＡＬＴ８０３群（０．２ｍｇ／ｋｇ）、Ｖ９－ＩＬ１５－６１群（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｖ９－ＩＬ１５－６１群（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｖ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６群（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｖ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６群（５ｍｇ／ｋｇ）およびＶ５－ＩＬ１５－ＷＴ群（２ｍｇ／ｋｇ）を含む７群に無作為に分け、各群８匹の、合計５６匹のマウスを用いた。薬剤は、群に応じて合計３回、週１回腹腔内投与された。腫瘍体積を週３回測定し、データを記録した。腫瘍体積（長径×短い径２／２）および腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩＴＶ（％）、ＴＧＩＴＶ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００％を計算した。Ｔｉは処置ｉ日目の処置群の平均腫瘍体積を示し、Ｔ０は処置０日目の処置群の平均腫瘍体積を示し、Ｖｉは処置ｉ日目の溶媒コントロール群の平均腫瘍体積を示し、Ｖ０は処置０日目の溶媒コントロール群の平均腫瘍体積を示す。群投与２１日目、薬剤投与群はいずれも、ＰＢＳコントロール群と比較して、腫瘍体積に対して統計的に有意な差が認められる有意な阻害効果を有し（Ｐ＜０．０５）、ＡＬＴ８０３（ポジティブ薬剤）群およびＶ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６群は腫瘍体積に対して同様の阻害効果を有した（Ｐ＞０．０５）。図１０Ａ～－１０Ｃおよび表９を参照のこと。
ヒト黒色腫Ａ３７５細胞（Ｂｅｉｎａ Ｂｉｏ社；ＢＮＣＣ１００２６６）を５×１０６細胞／１００μＬでＮＰＧマウスの右背中に皮下接種した。Ａ３７５を接種した翌日、凍結保存したＰＢＭＣ（ＡＬＬＣＥＬＬ社、図ＰＢ００５Ｆ－Ｃ）を蘇生し、ＮＰＧマウス（５～６週齢、雌；Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌｓｔａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入）に尾静脈を介して５×１０６細胞／２００μｌの用量で注射した。ＰＢＭＣ接種の６日後、４０μｌの血液を採取してｈＣＤ４５＋細胞の割合を検出した。腫瘍が約６９ｍｍ３に成長した後、体重、ｈＣＤ４５＋細胞の割合、および腫瘍体積が大きすぎるか小さすぎるマウスは除外した。腫瘍体積に応じて、マウスをＰＢＳ群、ＡＬＴ８０３群（０．２ｍｇ／ｋｇ）、Ｖ９－ＩＬ１５－６１群（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｖ９－ＩＬ１５－６１群（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｖ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６群（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｖ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６群（５ｍｇ／ｋｇ）およびＶ５－ＩＬ１５－ＷＴ群（２ｍｇ／ｋｇ）を含む７群に無作為に分け、各群８匹の、合計５６匹のマウスを用いた。薬剤は、群に応じて合計３回、週１回腹腔内投与された。腫瘍体積を週３回測定し、データを記録した。腫瘍体積（長径×短い径２／２）および腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩＴＶ（％）、ＴＧＩＴＶ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００％を計算した。Ｔｉは処置ｉ日目の処置群の平均腫瘍体積を示し、Ｔ０は処置０日目の処置群の平均腫瘍体積を示し、Ｖｉは処置ｉ日目の溶媒コントロール群の平均腫瘍体積を示し、Ｖ０は処置０日目の溶媒コントロール群の平均腫瘍体積を示す。群投与２１日目、薬剤投与群はいずれも、ＰＢＳコントロール群と比較して、腫瘍体積に対して統計的に有意な差が認められる有意な阻害効果を有し（Ｐ＜０．０５）、ＡＬＴ８０３（ポジティブ薬剤）群およびＶ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６群は腫瘍体積に対して同様の阻害効果を有した（Ｐ＞０．０５）。図１０Ａ～－１０Ｃおよび表９を参照のこと。
【0141】
［表９］ 免疫再構成ＮＰＧマウスにおけるＡ３７５腫瘍体積に対する試験薬剤の効果
【0142】
注：ａ：平均±標準誤差、ｂ：群投与１４日目の薬物投与群と溶媒コントロール群（ＰＢＳ）との間の腫瘍体積の統計比較、二元配置分散分析、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０００１、ｃ：２１日目の腫瘍体積を、外れ値を同定することによって分析し、Ｖ９－ＩＬ１５ｃｏｍ５６ｍｐｋ群における１つのデータが異常に大きかったので、除外した。
【0143】
実験動物は、投与中、良好な活動状態および摂食状態にある。投与後、ＡＬＴ８０３およびＶ５－ＩＬ１５－ＷＴ群のマウスは体重が有意に減少し、死亡に至るマウスもおり、これは、マウスがこの用量および頻度でＡＬＴ８０３およびＶ５－ＩＬ１５－ＷＴに対して不耐性であることを示す。動物はＶ９－ＩＬ１５－６１（５ｍｐｋ）群およびＶ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６（１ｍｐｋ）群において死亡するが、貧血などのＧＶＨＤ条件は死亡前に観察される。マウスの死亡はＧＶＨＤによって引き起こされ、薬剤とは無関係であると推測される。図１０Ｄ、表１０、および表１１を参照のこと。
【0144】
［表１０］ 免疫構成Ａ３７５腫瘍のＮＰＧマウスの体重に対する試験薬剤の効果
【0145】
注：ａ：平均±標準誤差、ｂ：群投与２１日目の薬物投与群と溶媒コントロール群との体重の統計比較、二元配置分散分析。
【0146】
［表１１］ 免疫構成Ａ３７５腫瘍のＮＰＧマウスの生存に対する試験薬剤の効果
【0147】
注記：ａ：平均±標準誤差、ｂ：群投与後に死亡したマウス、１は１匹のマウスがその日に死亡したことを表し、０は１匹のマウスがその日に死亡したが、死亡前に貧血、黄疸および他の症状が観察されたことを表す。
【0148】
上記の結果は、ＩＬ１５－Ｆｃ融合タンパク質（Ｖ９－ＩＬ１５－６１およびＶ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６の両方）が皮下異種移植されたヒト免疫再構成Ａ３７５腫瘍の増殖に対して有意な阻害効果を有することを示す。Ｖ９－ＩＬ１５－ｃｏｍ６（５ｍｇ／ｋｇ）はポジティブコントロール抗体ＡＬＴ８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ）と比較して、同等のレベルのＴＧＩ（腫瘍増殖阻害率）を示すが、より良好な安全性を示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図7G】
【図7H】
【図7I】
【図7J】
【図7K】
【図7L】
【図7M】
【図7N】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図8G】
【図8H】
【図8I】
【図8J】
【図8K】
【図8L】
【図8M】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【配列表】