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特許7547511新規Ｌ－チロシン排出タンパク質変異体及びそれを用いてＬ－チロシンを生産する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-30
(45)【発行日】2024-09-09
(54)【発明の名称】新規Ｌ－チロシン排出タンパク質変異体及びそれを用いてＬ－チロシンを生産する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20240902BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240902BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240902BHJP
C12P 13/22 20060101ALI20240902BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20240902BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12N15/31
C12N15/63 Z
C12P13/22 B
C07K14/195
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2022572662
(86)(22)【出願日】2021-05-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-30
(86)【国際出願番号】 KR2021006621
(87)【国際公開番号】W WO2021242032
(87)【国際公開日】2021-12-02
【審査請求日】2022-11-25
(31)【優先権主張番号】10-2020-0063778
(32)【優先日】2020-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【微生物の受託番号】KCCM KCCM12708P
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】513178894
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】キム， ヒョン ア
(72)【発明者】
【氏名】キム， ヒジュン
(72)【発明者】
【氏名】チョン， ム ヨン
(72)【発明者】
【氏名】ソ， チャン イル
(72)【発明者】
【氏名】ソン， ギュヒョン
【審査官】鳥居 敬司
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／１６４３４８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００３／０４４１９２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】WP_050478745.1, drug/metabolite DMT transporter permease [Herbaspirillum rhizosphaerae]. [online]，2，2017年，<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/913733518?sat=48&satkey=55716412>
【文献】Jetzabel Garcia-Parra, Alba Dalmases et al.，Poly (ADP-ribose) polymerase inhibition enhances trastuzumab antitumour activity in HER2 overexpress，European Journal of Cancer，ScienceDirect，2014年08月12日，volume 50, issue 15，pp.2725-2734
【文献】International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2007年，Vol.57, p.2284-2288
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ １／００－１／３８
Ｃ１２Ｐ １３／００－１３／２４
Ｃ０７Ｋ １４／００－１４／８２５
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号５２のアミノ酸配列においてＮ末端から７９番目のアミノ酸がアラニン又はグリシンに置換されたタンパク質変異体、それをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む、Ｌ－チロシン生産能が増加した微生物であって、前記微生物がコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に属する微生物である、Ｌ－チロシン生産能が増加した微生物。
【請求項2】
配列番号５２のアミノ酸配列においてＮ末端から７９番目のアミノ酸がアラニン又はグリシンに置換されたタンパク質変異体、それをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含み、Ｌ－チロシン生産能が増加した微生物を培地で培養するステップを含む、Ｌ－チロシン生産方法であって、前記微生物がコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に属する微生物である、Ｌ－チロシン生産方法。
【請求項3】
生産されたチロシンを回収するステップをさらに含む、請求項２に記載のＬ－チロシン生産方法。
【請求項4】
配列番号５２のアミノ酸配列においてＮ末端から７９番目のアミノ酸がアラニン又はグリシンに置換された、Ｌ－チロシン排出活性を有するタンパク質変異体。
【請求項5】
請求項４に記載のＬ－チロシン排出活性を有するタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、Ｌ－チロシン排出活性を有する新規なタンパク質変異体、前記タンパク質変異体を含むＬ－チロシンを生産する微生物、及び前記微生物を用いてＬ－チロシンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－チロシンは、アミノ酸の一つであり、薬品原料や食品添加剤、動物飼料、栄養剤などの重要素材として用いられる。前記Ｌ－チロシン及びその他の有用物質を生産すべく、高効率生産微生物及び発酵工程技術の開発のために様々な研究が行われている。
【0003】
微生物のＬ－チロシン生産過程は、ペントースリン酸回路の中間体であるＥ４Ｐ（Erythrose-4-Phosphate）と、解糖過程（glycolysis）の中間体であるＰＥＰ（Phosphoenolpyruvate）の重合反応により生成されるＤＡＨＰ（3-Deoxy-D-arobino-heptulosonate-7-phosphate）から始まる。その後、ＤＡＨＰは、芳香族共通生合成経路でコリスミ酸（chorismate）からプレフェン酸（prephenate）を経て、Ｌ－チロシン生合成経路で最終的にＬ－チロシンに変換される。
【0004】
一方、特定アミノ酸排出遺伝子の発現は、微生物における当該アミノ酸の生産性向上をもたらした。コリネバクテリウム属微生物のＬ－リシン排出遺伝子（ｌｙｓＥ）の発現強化は、リシンの生産性を向上させた（特許文献１）。また、大腸菌におけるｒｈｔＣ遺伝子の強化は、Ｌ－トレオニン（L-threonine）に対する耐性を向上させると共に、Ｌ－ホモセリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－ロイシンの生産性を向上させた（特許文献２）。大腸菌において機能が知られていない遺伝子であるｙａｈＮ遺伝子、ｙｅａＳ遺伝子、ｙｆｉＫ遺伝子及びｙｇｇＡ遺伝子を強化することにより、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－リシン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－プロリン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－バリン及びＬ－イソロイシンの生産性が向上するという特許（特許文献３）も開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】米国特許第６８５８４０６号明細書
【文献】欧州特許出願公開第１０１３７６５号明細書
【文献】欧州特許第１０１６７１０号明細書
【文献】韓国登録特許第１０－０６２００９２号公報
【文献】韓国登録特許第１０－１７８３１７０号公報
【文献】韓国登録特許第１０－１６３２６４２号公報
【文献】韓国登録特許第１０－０９２４０６５号公報
【文献】国際公開第２０１９／１６４３４８号
【非特許文献】
【0006】
【文献】FEMS Microbiol Lett 275 (2007) 312-318
【文献】J Ind Microbiol Biotechnol. 2015 May;42(5):787-97
【文献】Karlin及びAltschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)
【文献】Methods Enzymol., 183, 63, 1990
【文献】http://www.ncbi.nlm.nih.gov
【文献】J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
【文献】F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York
【文献】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【文献】DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix
【文献】Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 103-110 (2007)
【文献】Appl. Environ. Microbiol. 63, 761-762 (1997)
【文献】Appl Environ Microbiol 59 791, 1993
【文献】Nature biotechnol 14 620, 1996
【文献】Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
現在、Ｌ－チロシンに特異性を示す排出タンパク質は報告されていない。芳香族アミノ酸の排出タンパク質として大腸菌のｙｄｄＧ遺伝子が知られているが、Ｌ－チロシンやＬ－トリプトファンよりＬ－フェニルアラニンに高い特異性を示す（非特許文献１）。また、Ｌ－アミノ酸発酵の生産菌株として主に用いられるコリネバクテリウム属微生物においては、Ｌ－チロシン又は芳香族アミノ酸排出遺伝子が全く報告されていない（非特許文献２）。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本出願は、配列番号５２のアミノ酸配列においてＮ末端から７９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質変異体、それをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0009】
本出願は、前記タンパク質変異体、それをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含み、Ｌ－チロシンを生産する微生物を提供する。
【0010】
本出願は、前記微生物を培養するステップを含むＬ－チロシン生産方法を提供する。
【0011】
本出願は、前記タンパク質変異体、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター及び前記微生物の少なくとも１つを含むＬ－チロシン生産用組成物を提供する。
特定の態様では例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
配列番号５２のアミノ酸配列においてＮ末端から７９番目のアミノ酸がアラニン又はグリシンに置換されたタンパク質変異体、それをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含み、Ｌ－チロシンを生産する微生物。
（項目２）
前記微生物は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物である、項目１に記載のＬ－チロシンを生産する微生物。
（項目３）
配列番号５２のアミノ酸配列においてＮ末端から７９番目のアミノ酸がアラニン又はグリシンに置換されたタンパク質変異体、それをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含み、Ｌ－チロシンを生産する微生物を培地で培養するステップを含む、Ｌ－チロシン生産方法。
（項目４）
生産されたチロシンを回収するステップをさらに含む、項目３に記載のＬ－チロシン生産方法。
（項目５）
前記微生物は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物である、項目３に記載のＬ－チロシン生産方法。
（項目６）
配列番号５２のアミノ酸配列においてＮ末端から７９番目のアミノ酸がアラニン又はグリシンに置換された、Ｌ－チロシン排出活性を有するタンパク質変異体。
（項目７）
項目６に記載のＬ－チロシン排出活性を有するタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド。
特定の態様では例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
配列番号５２のアミノ酸配列においてＮ末端から７９番目のアミノ酸がアラニン又はグリシンに置換されたタンパク質変異体、それをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含み、Ｌ－チロシンを生産する微生物。
（項目２）
前記微生物は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物である、項目１に記載のＬ－チロシンを生産する微生物。
（項目３）
配列番号５２のアミノ酸配列においてＮ末端から７９番目のアミノ酸がアラニン又はグリシンに置換されたタンパク質変異体、それをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含み、Ｌ－チロシンを生産する微生物を培地で培養するステップを含む、Ｌ－チロシン生産方法。
（項目４）
生産されたチロシンを回収するステップをさらに含む、項目３に記載のＬ－チロシン生産方法。
（項目５）
前記微生物は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物である、項目３に記載のＬ－チロシン生産方法。
（項目６）
配列番号５２のアミノ酸配列においてＮ末端から７９番目のアミノ酸がアラニン又はグリシンに置換された、Ｌ－チロシン排出活性を有するタンパク質変異体。
（項目７）
項目６に記載のＬ－チロシン排出活性を有するタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【0012】
本出願のタンパク質変異体を発現する微生物は、それを発現しない親株に比べて、Ｌ－チロシン生産量が画期的に向上するので、Ｌ－チロシンを効果的に生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。
【0014】
また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本出願に含まれることが意図されている。
【0015】
さらに、本明細書全体にわたって多くの論文及び特許文献が参照されており、その引用が示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体が本明細書に参照として組み込まれており、それにより本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【0016】
本出願の一態様は、配列番号５２のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、Ｌ－チロシン排出活性を有するタンパク質変異体を提供する。
【0017】
前記タンパク質変異体は、配列番号５２のアミノ酸配列のＮ末端から７９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、Ｌ－チロシン排出活性を有するタンパク質変異体であってもよい。
【0018】
本出願における「Ｌ－チロシン（L-Tyrosine）」は、２０個のα－アミノ酸の一つであり、極性アミノ酸（polar amino acid）又は芳香族アミノ酸に分類される。チロシンは、医薬品やフラボノイド、アルカノイドなどの前駆体として用いられる商業的に重要なアミノ酸である。
【0019】
本出願における「Ｌ－チロシン排出活性を有するタンパク質」とは、特異的にＬ－チロシンを細胞外に排出する活性を有するタンパク質を意味する。
【0020】
本出願のＬ－チロシン排出活性を有するタンパク質変異体は、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ（Herbaspirillum rhizosphaerae）由来のＬ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質に由来するものであるが、これに限定されるものではない。
【0021】
ここで、「ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ（Herbaspirillum rhizosphaerae）」とは、ヘルバスピリラム属に属するグラム陰性バクテリアであって、韓国内では鬱陵島などで分離された菌株であり、土壌内の根圏（rhizosphere）から分離される。
【0022】
前記ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ（Herbaspirillum rhizosphaerae）由来のＬ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質は、例えば配列番号５２のアミノ酸配列を含むタンパク質であるが、配列番号５２のアミノ酸配列と同じ活性を有し、配列番号５２の７９番目の位置に相当する配列が野生型でない、本出願の他のアミノ酸に置換されてＬ－チロシン排出能を有する配列は、７９番目の位置に相当する残基のアミノ酸変異が生じた対象タンパク質であり、その由来がいかなるものであっても本出願に含まれることは言うまでもない。配列番号５２のアミノ酸配列を含むタンパク質は、配列番号５２のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号５２のアミノ酸配列からなるタンパク質と混用される。
【0023】
具体的には、本出願のＬ－チロシン排出活性を有するタンパク質は、配列番号５２のアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体であってもよい。
【0024】
配列番号５２のアミノ酸配列を含むタンパク質は、Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質であり、本出願において、前記タンパク質の７９番目の位置に相当するアミノ酸を変異させた変異体がＬ－チロシン排出活性を有することを見出した。
【0025】
本出願において、配列番号５２のアミノ酸を含むタンパク質は、本出願の変異を導入できるタンパク質の代表的な例であり、配列番号５２のアミノ酸配列の前後への無意味な配列付加、自然に発生する突然変異、又はその非表現突然変異（silent mutation）を除外するものではなく、配列番号５２のアミノ酸配列を含むタンパク質と同一又は相当する活性を有するものであれば、本出願の変異を導入できるタンパク質に含まれる。
【0026】
例えば、本出願において、変異を導入できるタンパク質は、配列番号５２のアミノ酸配列、又はそれと８０％、９０％、９５％もしくは９７％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。また、このような相同性又は同一性を有して前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願の変異対象となるタンパク質に含まれることは言うまでもない。
【0027】
すなわち、本出願に「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はポリペプチド」、「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチド」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本出願に用いられることは言うまでもない。例えば、「配列番号５２のアミノ酸配列からなるタンパク質」は、それと同一又は相当する活性を有するものであれば、「配列番号５２のアミノ酸配列を含むタンパク質」に含まれることは言うまでもない。
【0028】
本出願における「変異体（variant）」とは、少なくとも１つのアミノ酸の保存的置換（conservative substitution）及び／又は改変（modification）により上記列挙した配列（the recited sequence）とは異なるが、前記タンパク質の機能（functions）又は特性（properties）が維持されるタンパク質を意味する。変異体は、数個のアミノ酸置換、欠失又は付加により識別される配列（identified sequence）とは異なる。このような変異体は、一般に前記タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸を改変し、その改変したタンパク質の特性を評価することにより識別することができる。すなわち、変異体の能力は、本来のタンパク質（native protein）より向上するか、変わらないか又は低下する。また、一部の変異体には、Ｎ末端リーダー配列や膜貫通ドメイン（transmembrane domain）などの少なくとも１つの部分が除去された変異体も含まれる。他の変異体には、成熟タンパク質（mature protein）のＮ及び／又はＣ末端から一部分が除去された変異体も含まれる。前記「変異体」には、変異型、改変、変異したタンパク質、変異型ポリペプチド、変異などの用語（英語表現では、modification、modified protein、modified polypeptide、mutant、mutein、divergent、variantなど）が用いられるが、変異を意味する用語であればいかなるものでもよい。本出願の目的上、前記変異体は、天然の野生型又は非改変タンパク質に比べて変異したタンパク質の活性が上昇したものであるが、これらに限定されるものではない。
【0029】
本出願における「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。前記変異体は、少なくとも１つの生物学的活性を依然として有する状態で、例えば少なくとも１つの保存的置換を有する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。
【0030】
例えば、電荷を帯びた側鎖（electrically charged amino acid）を有するアミノ酸のうち正に電荷した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ、負に電荷した（酸性）アミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられ、電荷を帯びていない側鎖（uncharged side chain）を有するアミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。
【0031】
また、変異体は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は付加を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時に（co-translationally）又は翻訳後に（post-translationally）タンパク質の移転（transfer）に関与するタンパク質のＮ末端のシグナル（又はリーダー）配列に結合されてもよい。また、前記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製又は合成できるように、他の配列又はリンカーに結合されてもよい。
【0032】
本出願において提供するＬ－チロシン排出活性を有するタンパク質変異体は、前述したタンパク質の特異的位置又はそれに相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、タンパク質のＬ－チロシン排出活性が変異前のタンパク質に比べて１００％を超える変異体を意味する。
【0033】
本出願における「他のアミノ酸への置換」は、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸であればいかなるものでもよい。すなわち、配列番号５２のアミノ酸配列のＮ末端から７９番目のアミノ酸であるロイシンが「ロイシン以外のアミノ酸」に置換されたものを、「配列番号５２のアミノ酸配列のＮ末端から７９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された」ものと表現する。なお、本出願における「特定アミノ酸が置換された」とは、他のアミノ酸に置換されたと表記していなくても、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されたことを意味することは言うまでもない。
【0034】
本出願のタンパク質変異体は、配列番号５２のアミノ酸配列のＮ末端から７９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異体であるが、これに限定されるものではない。
【0035】
具体的には、本出願のタンパク質変異体は、配列番号５２のアミノ酸配列のＮ末端から７９番目のアミノ酸がアラニン、グリシン、イソロイシン、メチオニン、セリン、プロリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、アルギニン又はトリプトファンに置換された変異体であるが、これらに限定されるものではない。
【0036】
具体的には、本出願のタンパク質変異体は、配列番号５２のアミノ酸配列のＮ末端から７９番目のアミノ酸がアラニン、グリシン、イソロイシン、メチオニン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、アルギニン又はトリプトファンに置換された変異体である。より具体的には、本出願のタンパク質変異体は、配列番号５２のアミノ酸配列のＮ末端から７９番目のアミノ酸がアラニン又はグリシンに置換された変異体である。しかし、これらに限定されるものではない。
【0037】
このような本出願のタンパク質変異体は、変異前のタンパク質より強化されたＬ－チロシン排出能を有する。
【0038】
本出願の配列番号５２のアミノ酸配列のＮ末端から７９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質変異体には、配列番号５２のアミノ酸配列のＮもしくはＣ末端又は中間のアミノ酸の欠失／付加／挿入などにより、７９番目ではない他の位置で表されるものであっても、配列番号５２のアミノ酸配列のＮ末端から７９番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質変異体が含まれることは言うまでもない。
【0039】
また、本出願におけるＬ－チロシン排出活性を有するタンパク質として、配列番号５２のＮ末端から７９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質変異体を記載したが、本出願のＬ－チロシン排出活性を有するタンパク質変異体は、配列番号５２の変異体に限定されるものではなく、その他配列番号５２のアミノ酸配列と同じ活性又はＬ－チロシン排出活性を有する任意のアミノ酸配列において「配列番号５２のアミノ酸配列のＮ末端から７９番目の位置に相当するアミノ酸」が他のアミノ酸に置換されてＬ－チロシン排出活性を有する変異体も、本出願のタンパク質変異体に含まれることは言うまでもない。
【0040】
任意のアミノ酸配列における「配列番号５２のアミノ酸配列のＮ末端から７９番目の位置に相当するアミノ酸」は、当該技術分野で公知の様々な配列アラインメント（alignment）方法により確認することができる。
【0041】
本出願の配列番号５２のアミノ酸配列のＮ末端から７９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質変異体は、配列番号５２のアミノ酸配列、又はそれと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５２のアミノ酸配列のＮ末端から７９番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質であってもよい。
【0042】
本出願のタンパク質変異体は、配列番号１、配列番号２、配列番号７７～８５のいずれかのアミノ酸配列を含むものであってもよい。具体的には、配列番号１、配列番号２、配列番号７７～８５のいずれかのアミノ酸配列から必須に構成される（consisting essentially of）ものであってもよく、より具体的には、配列番号１、配列番号２、配列番号７７～８５のいずれかのアミノ酸配列からなるものであってもよい。一実施例において、本出願のタンパク質変異体は、配列番号１、配列番号２及び配列番号７７～８３のいずれかのアミノ酸配列からなるものであり、他の実施例において、本出願のタンパク質変異体は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列からなるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0043】
本出願のタンパク質変異体は、配列番号１、配列番号２、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４及び配列番号８５のいずれかのアミノ酸配列を含むものであってもよい。本出願のタンパク質変異体は、配列番号１、配列番号２、配列番号７７～８３のいずれかの配列を含むものであってもよい。本出願のタンパク質変異体は、配列番号１又は２のアミノ酸配列を含むものであってもよい。しかし、これらに限定されるものではない。
【0044】
一方、本出願のタンパク質変異体は、前述した配列番号のアミノ酸配列から必須に構成されるものであるか、前述した配列番号のアミノ酸配列からなるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0045】
また、前記タンパク質変異体は、配列番号１、配列番号２、配列番号７７～８５のいずれかのアミノ酸配列において７９番目のアミノ酸は固定され、それと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。さらに、そのような相同性又は同一性を有して前記変異体に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、７９番目の位置以外に、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。
【0046】
相同性（homology）及び同一性（identity）とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が関連する程度を意味し、百分率で表すことができる。
【0047】
相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。
【0048】
保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上ハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドがコドンの代わりに縮退コドンを有するようにするものであってもよい。
【0049】
前記ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の相同性又は同一性は、例えば文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［参照：非特許文献３］やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：非特許文献４）を用いて決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸというプログラムが開発されている（参照：非特許文献５）。また、任意のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献６、７）で決定されてもよい。
【0050】
本出願の他の態様は、前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0051】
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を意味し、より具体的には前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
【0052】
本出願のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドは、Ｌ－チロシン排出能を有するタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。
【0053】
本出願における変異対象となるタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ｗｅｘ遺伝子であり、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来のものであり、具体的には配列番号５２のアミノ酸配列をコードする塩基配列であるが、これらに限定されるものではない。
【0054】
本出願のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は前記タンパク質変異体を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、アミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。具体的には、配列番号５２のアミノ酸配列において７９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。
【0055】
例えば、本出願のポリヌクレオチドは、本出願のタンパク質変異体、具体的には配列番号１、配列番号２、配列番号７７～８５のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質、又はそれと相同性もしくは同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であるが、これらに限定されるものではない。前記相同性もしくは同一性については前述した通りである。
【0056】
また、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、配列番号５２のアミノ酸配列の７９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質変異体をコードする配列であればいかなるものでもよい。
【0057】
前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（例えば、非特許文献６）に具体的に記載されている。例えば、相同性の高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。しかし、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
【0058】
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つのポリヌクレオチドが相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられる。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似するポリヌクレオチド配列だけでなく、全配列に相補的な単離されたポリヌクレオチド断片が含まれてもよい。
【0059】
具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
【0060】
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（非特許文献８参照）。
【0061】
本出願のさらに他の態様は、前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0062】
本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
【0063】
本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
【0064】
例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、染色体内で標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異したポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
【0065】
本出願のさらに他の態様は、前記タンパク質変異体、それをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含み、Ｌ－チロシンを生産する微生物を提供する。
【0066】
前記Ｌ－チロシンを生産する微生物は、野生型の配列番号５２を含む微生物に比べて、前記タンパク質変異体、それをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含み、Ｌ－チロシン生産能が向上した微生物であってもよい。
【0067】
前記タンパク質変異体、それをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物は、Ｌ－チロシン生産能が付与された微生物であるが、これに限定されるものではない。
【0068】
本出願における「Ｌ－チロシンを生産する微生物」又は「Ｌ－チロシン生産能を有する微生物」とは、自然にチロシン生産能を有する微生物、又はチロシン生産能のない親株にチロシン生産能が付与された微生物を意味する。
【0069】
前記微生物は、培地中の炭素源からＬ－チロシンを野生型や非改変微生物と比較して過剰量で生産する微生物であってもよい。また、前記Ｌ－チロシンを生産する微生物は、組換え微生物であってもよい。具体的には、前記微生物は、Ｌ－チロシンを生産するものであれば、その種類が特に限定されるものではなく、エンテロバクター（Enterbacter）属、エシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物である。より具体的には、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属又はエシェリキア（Escherichia）属に属する微生物である。さらに具体的には、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物であり、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であるが、これらに限定されるものではない。
【0070】
一層具体的には、エシェリキア属（Escherichia）微生物は、大腸菌（Escherichia coli）であり、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であるが、Ｌ－チロシン排出活性を有するタンパク質が導入又は強化されてＬ－チロシン生産量を増加させる、エシェリキア属又はコリネバクテリウム属に属する微生物であればいかなるものでもよい。
【0071】
本出願のタンパク質変異体、それをコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含み、Ｌ－チロシンを生産する微生物は、本出願のタンパク質変異体を発現する微生物であってもよい。
【0072】
本出願における、タンパク質が「発現するように／する」とは、標的タンパク質が微生物に導入されるか、微生物で発現するように改変された状態を意味する。前記標的タンパク質が微生物中に存在するタンパク質の場合、内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が強化された状態を意味する。
【0073】
本出願のタンパク質変異体を発現する微生物は、タンパク質変異体を発現するように改変された微生物であってもよい。よって、本出願のさらに他の態様は、本出願のタンパク質変異体を発現する微生物の製造方法を提供する。
【0074】
本出願の目的上、「標的タンパク質」は、前述したＬ－チロシン排出活性を有するタンパク質変異体であってもよい。
【0075】
具体的には、「タンパク質の導入」とは、微生物が本来持っていなかった特定タンパク質の活性が現れるようにすること、又は当該タンパク質の内在性活性もしくは改変前の活性に比べて向上した活性が現れるようにすることを意味する。例えば、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドが微生物中の染色体に導入されることや、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが微生物に導入されてその活性が現れることであってもよい。また、「活性の強化」とは、微生物が有する特定タンパク質の内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することを意味する。「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して微生物の形質が変化する場合に、形質変化の前に親株が本来有していた特定タンパク質の活性を意味する。
【0076】
具体的には、本出願の活性強化は、前記タンパク質変異体をコードする遺伝子の細胞内のコピー数を増加する方法、前記タンパク質変異体をコードする遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、前記Ｌ－チロシン排出活性を有するタンパク質変異体をコードする遺伝子の発現調節配列を活性が強力な配列に置換する方法、染色体上のＬ－チロシン排出活性を有する天然タンパク質をコードする遺伝子を前記タンパク質変異体をコードする遺伝子に代替する方法、前記タンパク質変異体の活性が強化されるように前記タンパク質をコードする遺伝子に変異をさらに導入する方法、及び微生物にタンパク質変異体を導入する方法からなる群から選択される少なくとも１つの方法で行われるが、これらに限定されるものではない。
【0077】
前記遺伝子のコピー数を増加する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体に挿入されることにより行われる。具体的には、本出願のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターが宿主細胞内に導入されることにより行われる。あるいは、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターが宿主細胞の染色体に導入されることにより行われる。前記ポリヌクレオチドの染色体への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができる。
【0078】
次に、ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、前記発現調節配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より強い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれる。
【0079】
前記ポリヌクレオチド発現単位の上流には、本来のプロモーターに代えて強力なプロモーターが連結されるが、これに限定されるものではない。公知の強力なプロモーターの例としては、ｃｊ１～ｃｊ７プロモーター（特許文献４）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（特許文献５）、Ｏ２プロモーター（特許文献６）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0080】
また、染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より高い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。
【0081】
このようなタンパク質活性の導入及び強化とは、対応するタンパク質の活性又は濃度が野生型や非改変の微生物菌株におけるタンパク質の活性又は濃度に比べて、一般に少なくとも１％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％又は５００％、最大で１０００％又は２０００％まで増加することを意味するが、これらに限定されるものではない。
【0082】
本出願における「非改変菌株」とは、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、天然菌株自体、又は自然要因もしくは人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する前の菌株を意味する。前記「非改変菌株」は、「非変異菌株」、「改変前の菌株」、「改変前の微生物」、「非変異微生物」、「非改変微生物」又は「基準微生物」と混用される。一実施例において、前記非改変微生物は、本出願のＬ－チロシン排出活性を有するタンパク質変異体を含まない菌株であってもよい。
【0083】
本出願の微生物は、チロシン生産能を有する天然の微生物自体であってもよく、チロシン生産機序に関する遺伝子の活性を強化又は不活性することによりチロシン生産能が向上した微生物であってもよく、外部遺伝子の活性を導入又は強化することによりチロシン生産能が向上した微生物であってもよい。
【0084】
本出願の微生物にＬ－チロシン生産能を付与又は向上させるために、Ｅ４Ｐ（Erythrose-4-Phosphate）などの前駆体の持続的な供給、エネルギーの効率的な利用のための改変、生合成経路における側枝経路の遮断による生合成の増加、用いるＡＴＰを少なくする改変などを用いることができる。
【0085】
具体的には、本出願において、前記Ｌ－チロシン排出活性を有するタンパク質変異体が発現するように改変された、Ｌ－チロシンを生産する微生物の親株は、Ｌ－チロシンを生産する微生物であれば特に限定されるものではない。Ｌ－チロシンを生産する微生物は、Ｌ－チロシン生合成経路を強化するために、競合経路の遺伝子、Ｌ－チロシンオペロンの芳香族経路のオペレーター、Ｌ－チロシン流入遺伝子、Ｌ－チロシン流入及び分解遺伝子の活性を弱化又は不活性化させ、かつ／又はＬ－チロシンオペロンの活性を調節する微生物であってもよい。
【0086】
微生物の改変として、例えば芳香族アミノ酸流入タンパク質の活性を内在性活性より弱化又は除去させること（例えば、ａｒｏＰ活性弱化／除去）や、フィードバック調節に関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ｔｙｒＡ、ａｒｏＧ）に変異を導入してフィードバックを解除することが挙げられる。また、前駆体供給に関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ｔｋｔ遺伝子）の発現を強化することが挙げられる。さらに、競合経路の遺伝子（例えば、ｐｈｅＡ）の活性を内在性活性より弱化又は除去させたり、変更する（例えば、Ｌ－トリプトファンの濃度に依存して変更する）ことが挙げられる。しかし、これらに限定されるものではない。
【0087】
本出願のさらに他の態様は、本出願のＬ－チロシン排出活性を有するタンパク質変異体を発現する微生物を培地で培養するステップを含む、Ｌ－チロシンの生産方法を提供する。
【0088】
前記タンパク質変異体、タンパク質の発現、及び微生物については前述した通りである。
【0089】
本出願における「培養」とは、前記微生物を適宜調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び流加培養であるが、これらに限定されるものではない。
【0090】
本出願における「培地」とは、前記微生物を培養するために必要な栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質や発育因子などを供給する。具体的には、本出願の微生物の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられるものであればいかなるものでもよく、好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願の微生物を培養することができる。
【0091】
本出願における前記炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、具体的にはグルコースや殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【0092】
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【0093】
前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができ、それ以外に、アミノ酸、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを用いることができる。これらの構成成分又は前駆体は、培地に回分式又は連続式で添加することができる。しかし、これらに限定されるものではない。
【0094】
本出願において、微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方法で添加することにより、培地のｐＨを調整することができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。さらに、培地の好気状態を維持するために、培地中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。
【0095】
培地の温度は、２０℃～５０℃、具体的には３０℃～３７℃であるが、これらに限定されるものではない。培養期間は、有用物質の所望の生成量が得られるまで続けられ、具体的には１０時間～１００時間であるが、これらに限定されるものではない。
【0096】
前記生産方法は、前記培養における培地又は前記微生物からＬ－チロシンを回収するステップをさらに含んでもよい。
【0097】
前記チロシンを回収するステップにおいては、本出願の微生物の培養方法、例えば回分、連続、流加培養法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて培地から目的とするＬ－チロシンを回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、結晶化、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ及びそれらの組み合わせを用いることができるが、上記例に限定されるものではない。
【0098】
前記生産方法は、さらなる精製工程を含んでもよい。前記精製工程においては、当該技術分野で公知の好適な方法により、回収したＬ－チロシンを精製することができる。
【0099】
本出願のさらに他の態様は、前記タンパク質変異体、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、及び前記タンパク質変異体を発現する微生物の少なくとも１つを含むＬ－チロシン生産用組成物を提供する。
【0100】
本出願のさらに他の態様は、前記タンパク質変異体、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、及び前記タンパク質変異体を発現する微生物の少なくとも１つのＬ－チロシン生産用途を提供する。
【0101】
タンパク質変異体、それをコードするポリヌクレオチド、それを含むベクター、及び微生物については前述した通りである。
【0102】
本出願の組成物は、前記タンパク質変異体、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、又は前記タンパク質変異体を発現する微生物を用いてＬ－チロシンを生産するものであれば、いかなるものをさらなる構成として含んでもよい。例えば、微生物発酵用組成物に通常用いられる任意の好適な賦形剤又は培地の構成成分をさらに含んでもよい。しかし、これらに限定されるものではない。
【0103】
本明細書において、特に断らない限り、「含む」、「有する」、「含有する」などの表現は、明示した整数（integer）又は整数の集合を含むことを意味するが、他の整数又は整数の集合を排除するものではないと解されるべきである。
【実施例】
【0104】
以下、実施例を挙げて本出願を詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示するものにすぎず、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。
【0105】
参考例１：Ｌ－チロシン生産菌株の作製
野生型のコリネバクテリウム・グルタミカムは、Ｌ－チロシンを生産する能力を有するが、培養液に排出するほどの過剰量は生産しない。本出願の目的に応じてＬ－チロシン生産能を向上させる遺伝形質を確認するために、野生型菌株よりＬ－チロシン生産能が向上した菌株を活用した。よって、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９菌株において、Ｌ－チロシンを生産する上で必要な遺伝子を強化することにより、Ｌ－チロシン生産菌株を作製した。
野生型のコリネバクテリウム・グルタミカムは、Ｌ－チロシンを生産する能力を有するが、培養液に排出するほどの過剰量は生産しない。本出願の目的に応じてＬ－チロシン生産能を向上させる遺伝形質を確認するために、野生型菌株よりＬ－チロシン生産能が向上した菌株を活用した。よって、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９菌株において、Ｌ－チロシンを生産する上で必要な遺伝子を強化することにより、Ｌ－チロシン生産菌株を作製した。
【0106】
まず、Ｌ－チロシンの前駆体であるＥ４Ｐ（Erythrose-4-Phosphate）の円滑な供給のために、ｔｋｔ遺伝子を過剰発現させた。それと同時に、Ｌ－チロシンを細胞の内部に流入させる芳香族アミノ酸流入遺伝子であるａｒｏＰを欠損させた。
【0107】
上記遺伝子操作のために、まずｔｋｔ遺伝子を代替挿入するａｒｏＰの下流（Downstream）領域及び上流（Upstream）領域を得た。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３と配列番号４のプライマーを用いて、ａｒｏＰの下流（Downstream）領域をＰＣＲにより得て、配列番号５と配列番号６のプライマーを用いて、ａｒｏＰの上流（Upstream）領域の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。ポリメラーゼとしてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0108】
また、ｔｋｔプロモーターを含むｔｋｔ遺伝子を確保するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７と配列番号８のプライマーを用いて、ｔｋｔプロモーターを含むｔｋｔ遺伝子断片をＰＣＲにより得た。ポリメラーゼとしてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１５０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0109】
増幅されたａｒｏＰプロモーターの上流領域及び下流領域、ｔｋｔプロモーターを含むｔｋｔ遺伝子断片、並びにＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＺ（特許文献７）は、ギブソンアセンブリ（非特許文献９）方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－ΔａｒｏＰ：：Ｐｎ－ｔｋｔと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0110】
前述した各ベクターを作製するために用いたプライマー配列を表１に示す。
【0111】
【表1】
【0112】
作製したｐＤＺ－ΔａｒｏＰ：：Ｐｎ－ｔｋｔベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９菌株にエレクトロポレーションで形質転換し、その後２次交差過程を経て、ａｒｏＰ遺伝子を欠損させると共に、ｔｋｔプロモーターを含むｔｋｔ遺伝子を挿入した菌株を得た。当該遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する、配列番号９と配列番号１０のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認し、それをＣＭ０６－０００１と命名した。
【0113】
【表2】
【0114】
Ｌ－チロシン経路を強化するために、既存のコリネバクテリウム・グルタミカムが有する、Ｌ－チロシンによりフィードバック調節されるｔｙｒＡ遺伝子を、強いプロモーターであるｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来のフィードバック調節されない変異型ｔｙｒＡに置換した。大腸菌由来ｔｙｒＡタンパク質は、５３番目のメチオニン（Methionine）がイソロイシン（Isoleucine）に、３５４番目のアラニン（Alanine）がバリン（Valine）に変異するとフィードバックが解除されることが知られており、その形態（配列番号１１）を用いた（非特許文献１０）。
【0115】
上記遺伝子操作のために、まずｔｙｒＡ遺伝子を置換挿入するｔｙｒＡの上流（Upstream）及び下流（Downstream）領域を得た。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２と配列番号１３のプライマーを用いて、ｔｙｒＡの上流（Upstream）領域をＰＣＲにより得て、配列番号１４と配列番号１５のプライマーを用いて、ｔｙｒＡの下流（Downstream）領域の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。ポリメラーゼとしてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0116】
また、ｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来変異ｔｙｒＡ遺伝子を確保するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１６と配列番号１７のプライマーを用いて、ｇａｐＡプロモーター断片をＰＣＲにより得て、大腸菌由来変異ｔｙｒＡの合成ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１８と配列番号１９のプライマーを用いて、大腸菌由来変異ｔｙｒＡ遺伝子断片をＰＣＲにより得た。
【0117】
ポリメラーゼとしてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0118】
増幅されたｔｙｒＡの上流領域及び下流領域、ｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来変異ｔｙｒＡ遺伝子断片、並びにＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＺは、ギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0119】
前述した各ベクターを作製するために用いたプライマー配列を表３に示す。
【0120】
【表3】
【0121】
作製したｐＤＺ－ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍベクターをＣＭ０６－０００１菌株にエレクトロポレーションで形質転換し、その後２次交差過程を経て、ｔｙｒＡ遺伝子を欠損させると共に、ｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来変異ｔｙｒＡ遺伝子を挿入した菌株を得た。当該遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する、配列番号２０と配列番号２１のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認し、それをＣＭ０６－０００２と命名した。
【0122】
【表4】
【0123】
Ｌ－チロシン生産を増加させるために、芳香族共通生合成経路の最初の段階のａｒｏＧ遺伝子を、大腸菌由来フィードバック調節解除変異型ａｒｏＧに強いプロモーターを追加することにより強化した。大腸菌由来ａｒｏＧタンパク質は、１５０番目のプロリン（Proline）がロイシン（Leucine）に置換されるとフィードバックが解除されることが知られており、その形態（配列番号２２）を用いた（非特許文献１１）。
【0124】
このような遺伝子操作のために、まずａｒｏＧ遺伝子を追加挿入する上流（Upstream）領域及び下流（Downstream）領域を得た。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２３と配列番号２４のプライマーを用いて、ＢＢＤ２９＿１４４７０遺伝子の上流（Upstream）領域をＰＣＲにより得て、配列番号２５と配列番号２６のプライマーを用いて、下流（Downstream）領域の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。ポリメラーゼとしてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0125】
増幅された変異型ａｒｏＧを追加挿入する上流領域及び下流領域、ＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＺは、ギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－ΔＢＢＤ２９＿１４４７０と命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0126】
また、ｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来変異型ａｒｏＧ遺伝子を確保するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２７と配列番号２８のプライマーを用いて、ｇａｐＡプロモーター断片をＰＣＲにより得て、大腸菌由来フィードバック解除変異型ａｒｏＧの合成ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２９と配列番号３０のプライマーを用いて、変異型ａｒｏＧ遺伝子断片をＰＣＲにより得た。ポリメラーゼとしてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0127】
増幅されたｇａｐＡプロモーターを含む変異型ａｒｏＧ遺伝子断片、及びＳｃａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＺ－ΔＢＢＤ２９＿１４４７０は、ギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－ΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0128】
前述した各ベクターを作製するために用いたプライマー配列を表５に示す。
【0129】
【表5】
【0130】
作製したｐＤＺ－ΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍベクターをＣＭ０６－０００２菌株にエレクトロポレーションで形質転換し、その後２次交差過程を経て、ｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来フィードバック解除変異型ａｒｏＧ遺伝子を挿入した菌株を得た。当該遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する、配列番号３１と配列番号３２のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認し、それをＣＭ０６－０００３と命名した。
【0131】
【表6】
【0132】
芳香族共通生産経路を強化する場合、増加したコリスメートｐｏｏｌにおける競合経路であるＬ－フェニルアラニンの生産を最小限に抑えると、Ｌ－チロシンとＬ－トリプトファンの生産が最も増加するものと予想される。しかし、競合経路のｐｈｅＡ遺伝子を欠損させると、Ｌ－フェニルアラニン生産が不可能になり、Ｌ－フェニルアラニンに対する要求が付加されるので、低い濃度が維持されると共に、菌体の成長に影響がないように、Ｌ－トリプトファン調節機序を用いることとした。
【0133】
Ｌ－トリプトファンは、培養の際に常時低い濃度が維持されると共に、菌体の成長には支障がなく、精巧に調節されるものと予測される。公知の文献においても、Ｌ－トリプトファンの生産は、Ｌ－トリプトファン濃度に応じて抑制因子と促進因子が同時に調節されることが知られている（非特許文献１２）。
【0134】
よって、Ｌ－トリプトファンの調節機序をＬ－フェニルアラニン生産遺伝子ｐｈｅＡに適用し、Ｌ－トリプトファン濃度に応じてｐｈｅＡ遺伝子が調節されるようにした。
【0135】
ｐｈｅＡの遺伝子がｔｒｐＥのプロモーターに調節されるようにするために、挿入する領域の上流（Upstream）領域、及びｔｒｐＥのプロモーター領域と挿入する領域の下流（Downstream）領域を得た。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３と配列番号３４のプライマーを用いて、挿入する領域の上流（Upstream）領域をＰＣＲにより得て、配列番号３５と配列番号３６のプライマーを用いて、ｔｒｐＥのプロモーター領域をＰＣＲにより得て、配列番号３７と配列番号３８のプライマーを用いて、挿入する領域の下流（Downstream）領域の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。ポリメラーゼとしてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0136】
増幅された挿入する領域の上流領域及び下流領域、ｔｒｐＥプロモーター領域、ＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＺは、ギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－ΔＰｐｈｅＡ：：ＰｔｒｐＥと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0137】
作製したｐＤＺ－ΔＰｐｈｅＡ：：ＰｔｒｐＥベクターをＣＭ０６－０００３菌株にエレクトロポレーションで形質転換し、その後２次交差過程を経て、ｐｈｅＡの遺伝子がｔｒｐＥのプロモーターで調節されるようにした菌株を得た。当該プロモーターを挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する、配列番号３９と配列番号４０のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより、当該遺伝的操作を確認した。ｐｈｅＡの遺伝子の前にｔｒｐＥのプロモーターを挿入した菌株をＣＭ０６－０００５と命名した。
【0138】
前記ベクターを作製するために用いたプライマー配列を表７に示す。
【0139】
【表7】
【0140】
Ｌ－チロシンの生産はＰＥＰとＥ４Ｐを前駆物質として開始されるので、ｎｏｎ－ＰＴＳ（Phosphotransferase system）を用いると、ＰＥＰ供給をより円滑に行うことができ、高い生産が期待される（非特許文献１３）。よって、菌株であるＰＴＳ遺伝子であるｐｔｓＧを除去し、ｎｏｎ－ＰＴＳ遺伝子であるＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ １０９８８由来のｇｌｆを導入した。
【0141】
ｐｔｓＧを欠損させてｇｌｆを挿入するために、まずＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ由来ｇｌｆ遺伝子を挿入する上流（Upstream）領域及び下流（Downstream）領域を得た。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号４１と配列番号４２のプライマーを用いて、ｐｔｓＧの上流（Upstream）領域をＰＣＲにより得て、配列番号４３と配列番号４４のプライマーを用いて、ｐｔｓＧの下流（Downstream）領域の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。ポリメラーゼとしてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0142】
また、公知のｃｊ７プロモーター（配列番号４５，特許文献４）を含むｇｌｆ遺伝子を確保するために、合成ｃｊ７プロモーターＤＮＡを鋳型とし、配列番号４６と配列番号４７のプライマーを用いて、ｃｊ７プロモーター断片をＰＣＲにより得て、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ１０９８８の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号４８と配列番号４９のプライマーを用いて、ｇｌｆ遺伝子断片をＰＣＲにより得た。ポリメラーゼとしてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0143】
増幅されたｐｔｓＧの上流及び下流遺伝子断片、ｃｊ７プロモーターを含むｇｌｆ遺伝子断片、並びにＳｃａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＺは、ギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－ΔｐｔｓＧ：：ｐｃｊ７－ｇｌｆと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0144】
本参考例に用いたプライマーの配列を表８に示す。
【0145】
【表8】
【0146】
作製したｐＤＺ－ΔｐｔｓＧ：：ｐｃｊ７－ｇｌｆベクターをＣＭ０６－０００５菌株にエレクトロポレーションで形質転換し、その後２次交差過程を経て、ｃｊ７プロモーターを含むＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ由来ｇｌｆ遺伝子を挿入した菌株を得た。当該遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する、配列番号５０と配列番号５１のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認し、それをＣＭ０６－００１０と命名した。
【0147】
【表9】
【0148】
参考例２：Ｌ－チロシン生産菌株の生産能の評価
参考例１で作製した菌株のＬ－チロシン生産能を確認するために、次の方法で培養して評価した。種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振盪培養した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－チロシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファンの生産量を測定した。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース３０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，酵母抽出物５ｇ，ビオチン９００μｇ，チアミン塩酸塩４５００μｇ，パントテン酸カルシウム４５００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
参考例１で作製した菌株のＬ－チロシン生産能を確認するために、次の方法で培養して評価した。種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振盪培養した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－チロシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファンの生産量を測定した。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース３０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，酵母抽出物５ｇ，ビオチン９００μｇ，チアミン塩酸塩４５００μｇ，パントテン酸カルシウム４５００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
【0149】
【表10】
【0150】
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、ＣＭ０６－０００１、ＣＭ０６－０００２、ＣＭ０６－０００３、ＣＭ０６－０００５、ＣＭ０６－００１０における培養物中のＬ－チロシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン生産の結果は、表１０の通りである。
【0151】
野生型菌株において芳香族アミノ酸流入遺伝子を欠損させ、前駆体であるＥ４Ｐ供給を強化した菌株ＣＭ０６－０００１では、Ｌ－チロシンが生産されず、その菌株においてさらにｔｙｒＡフィードバック制限を解除したＣＭ０６－０００２でも、Ｌ－チロシンが検出されなかった。
【0152】
ＣＭ０６－０００２菌株においてさらにａｒｏＧのフィードバック制限を解除して芳香族共通生産経路を強化したＣＭ０６－０００３菌株では、Ｌ－チロシン、Ｌ－フェニルアラニンの生産が確認された。Ｌ－チロシン、Ｌ－フェニルアラニンは以前の菌株に比べて生産が大幅に増加したが、Ｌ－トリプトファンには大きな変化がなかった。Ｌ－フェニルアラニン経路がＬ－トリプトファン濃度により調節されるようにしたＣＭ０６－０００５菌株では、５．３７％の収率でＬ－チロシンが生産された。ＣＭ０６－０００５のＬ－チロシン生産量は、親株であるＣＭ０６－０００３に比べて２８３％向上した。これらの結果から、ｐｈｅＡがＬ－トリプトファン濃度により調節されるようにすると、Ｌ－チロシン生産が大幅に増加することが確認された。
【0153】
また、予想の通り、ＰＴＳ菌株であるＣＭ０６－０００５に比べてＰＥＰ供給を円滑にしたｎｏｎ－ＰＴＳ菌株であるＣＭ０６－００１０では、Ｌ－チロシン生産の増加が確認された。ＣＭ０６－００１０菌株では、向上した７．０６％の収率でＬ－チロシンが生産された。
【実施例1】
【0154】
Ｌ－チロシン生産菌株にＬ－トリプトファン排出タンパク質を導入した菌株の作製
参考例１で作製したＬ－チロシン生産菌株ＣＭ０６－００１０菌株にＬ－トリプトファン新規排出タンパク質（特許文献８）を導入し、チロシン排出能を確認した。
参考例１で作製したＬ－チロシン生産菌株ＣＭ０６－００１０菌株にＬ－トリプトファン新規排出タンパク質（特許文献８）を導入し、チロシン排出能を確認した。
【0155】
Ｌ－トリプトファン新規排出タンパク質は、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の膜タンパク質であり、配列番号５２で表されるアミノ酸配列を有する。特許文献８に用いられた形質転換用ベクターはｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ｈｒｈであり、同じベクターをＬ－チロシン生産菌株ＣＭ０６－００１０菌株にエレクトロポレーション（非特許文献１４）で形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上でトランスポゾン遺伝子の間に１コピーのＰｇａｐＡ－Ｈｒｈ遺伝子を挿入した菌株を得た。前記ＰｇａｐＡ－Ｈｒｈ遺伝子が発現するタンパク質をＷｅｘと命名し、当該遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する、配列番号５３と配列番号５４のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより、当該遺伝的操作を確認した。
【0156】
【表11】
【0157】
このようにして得られた菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＭ０６－０１１１と命名した
【実施例2】
【0158】
Ｌ－トリプトファン排出タンパク質Ｗｅｘを導入したＬ－チロシン生産菌株の生産能の評価
実施例１で作製した菌株のＬ－チロシン生産能を確認するために、参考例２の方法及び培地の組成を用いて菌株を培養した。
実施例１で作製した菌株のＬ－チロシン生産能を確認するために、参考例２の方法及び培地の組成を用いて菌株を培養した。
【0159】
【表12】
【0160】
Ｌ－チロシン生産菌株であるＣＭ０６－００１０、ＣＭ０６－０１１１における培養物中のＬ－チロシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン生産の結果は、表１２の通りである。
【0161】
Ｌ－トリプトファン排出Ｗｅｘ膜タンパク質を導入した菌株では、Ｌ－チロシン排出能が示されず、Ｌ－トリプトファンも極少量であり、増加したか否かを確認することができなかった。よって、Ｗｅｘ膜タンパク質に変異を導入し、Ｌ－チロシンに対する基質特異性を付与した。
【実施例3】
【0162】
Ｌ－チロシン生産菌株中のＷｅｘ配列の７９番目のアミノ酸であるロイシン（Leucine）の他のアミノ酸への置換
Ｗｅｘ膜タンパク質にＬ－チロシンに対する基質特異性を付与するために、７９番目のアミノ酸であるロイシン（以下、７９番目のロイシン又は７９番目という）を他のアミノ酸に置換することにより、Ｌ－チロシンを排出する変異型を探索した。ロイシン以外の他のアミノ酸に変異を与えるために、実施例１で用いたｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ｈｒｈを鋳型とし、Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行った。Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓは、次の方法で行った。
Ｗｅｘ膜タンパク質にＬ－チロシンに対する基質特異性を付与するために、７９番目のアミノ酸であるロイシン（以下、７９番目のロイシン又は７９番目という）を他のアミノ酸に置換することにより、Ｌ－チロシンを排出する変異型を探索した。ロイシン以外の他のアミノ酸に変異を与えるために、実施例１で用いたｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ｈｒｈを鋳型とし、Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行った。Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓは、次の方法で行った。
【0163】
【表13】
【0164】
【表14】
【0165】
Ｗｅｘのアミノ酸配列の７９番目のアミノ酸であるロイシンを他のアミノ酸であるアラニン（Ａ）（配列番号１）、グリシン（Ｇ）（配列番号２）、イソロイシン（Ｉ）（配列番号７７）、メチオニン（Ｍ）（配列番号７８）、トレオニン（Ｔ）（配列番号７９）、チロシン（Ｙ）（配列番号８０）、アスパラギン（Ｎ）（配列番号８１）、アルギニン（Ｒ）（配列番号８２）、トリプトファン（Ｗ）（配列番号８３）、セリン（Ｓ）（配列番号８４）、プロリン（Ｐ）（配列番号８５）に置換するために、表１５に示す各ｍｕｔａｇｅｎｉｃ ｐｒｉｍｅｒセットを用いて、表１４のＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅを作製し、表１５のｃｙｃｌｅでＰＣＲを行った。ＰＣＲ終了後に、ＤｐｎＩ制限酵素１μｌを添加し、次いで３７℃で１時間処理した。ＤｐｎＩで処理したＤＮＡ ３μｌ ＤＨ５ａ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌにｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎし、ｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－ｗｅｘ変異型プラスミドを確保した。シーケンシングにより、表１５に示す各変異型に置換されたことが確認された。
【0166】
【表15-1】
【表15-2】
【0167】
表１５のように作製したｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－ｗｅｘ Ｌ７９Ａ、ｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－ｗｅｘ Ｌ７９Ｉ、ｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－ｗｅｘ Ｌ７９Ｇ、ｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－ｗｅｘ Ｌ７９Ｍ、ｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－ｗｅｘ Ｌ７９Ｓ、ｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－ｗｅｘ Ｌ７９Ｐ、ｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－ｗｅｘ Ｌ７９Ｔ、ｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－ｗｅｘ Ｌ７９Ｙ、ｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－ｗｅｘ Ｌ７９Ｎ、ｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－ｗｅｘ Ｌ７９Ｗ、ｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－ｗｅｘ Ｌ７９Ｒベクターを実施例２で作製したＣＭ０６－０１１１にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上で変異型ｗｅｘ遺伝子を挿入した１９種の菌株を得た。当該遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する、配列番号５３と配列番号５４のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより、当該遺伝的操作を確認した。
【0168】
このようにして得られた形質転換菌株をそれぞれＣＭ０６－０１１２（ｗｅｘ Ｌ７９Ａ）、ＣＭ０６－０１１４（ｗｅｘ Ｌ７９Ｉ）、ＣＭ０６－０１１５（ｗｅｘ Ｌ７９Ｇ）、ＣＭ０６－０１１７（ｗｅｘ Ｌ７９Ｍ）、ＣＭ０６－０１１８（ｗｅｘ Ｌ７９Ｓ）、ＣＭ０６－０１１９（ｗｅｘ Ｌ７９Ｐ）、ＣＭ０６－０１２０（ｗｅｘ Ｌ７９Ｔ）、ＣＭ０６－０１２１（ｗｅｘ Ｌ７９Ｙ）、ＣＭ０６－０１２４（ｗｅｘ Ｌ７９Ｎ）、ＣＭ０６－０１２８（ｗｅｘ Ｌ７９Ｗ）、ＣＭ０６－０１２９（ｗｅｘ Ｌ７９Ｒ）と命名した。
【0169】
ＣＭ０６－０１１２（ｗｅｘ Ｌ７９Ａ）、ＣＭ０６－０１１４（ｗｅｘ Ｌ７９Ｉ）、ＣＭ０６－０１１５（ｗｅｘ Ｌ７９Ｇ）、ＣＭ０６－０１１７（ｗｅｘ Ｌ７９Ｍ）、ＣＭ０６－０１１８（ｗｅｘ Ｌ７９Ｓ）、ＣＭ０６－０１１９（ｗｅｘ Ｌ７９Ｐ）、ＣＭ０６－０１２０（ｗｅｘ Ｌ７９Ｔ）、ＣＭ０６－０１２１（ｗｅｘ Ｌ７９Ｙ）、ＣＭ０６－０１２４（ｗｅｘ Ｌ７９Ｎ）、ＣＭ０６－０１２８（ｗｅｘ Ｌ７９Ｗ）、ＣＭ０６－０１２９（ｗｅｘ Ｌ７９Ｒ）菌株のチロシン生産量を確認するために、実施例２と同様に培養した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－チロシンの生産量を測定した。
【0170】
【表16-1】
【表16-2】
【0171】
Ｗｅｘ膜タンパク質の野生型を導入した菌株は効果がわずかであったのに対して、Ｗｅｘ Ｌ７９Ａ変異を導入したＣＭ０６－０１１２菌株はフラスコ培養におけるＬ－チロシン濃度が２．９２ｇ／Ｌであり、対照群ＣＭ０６－０１１１に比べて収率が約２．５％ｐ向上することが確認された。また、Ｗｅｘ Ｌ７９Ｇ変異を導入したＣＭ０６－０１１５菌株も２．４％ｐ向上することが確認されたので、Ｗｅｘ Ｌ７９Ａ変異とＬ７９Ｇ変異はＬ－チロシンを特異的に排出することが確認された。
【0172】
ＣＭ０６－０１１２菌株は、２０２０年４月２７日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ１２７０８Ｐとして国際寄託した。
【0173】
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【配列表】