ホーム > 特許ランキング > ＲＥＰＡＩＲＯＮ ＧＭＢＨ
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-02
(45)【発行日】2024-09-10
(54)【発明の名称】多能性幹細胞から機能的心筋へと直接分化させる方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20240903BHJP
A61K 35/34 20150101ALI20240903BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20240903BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240903BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20240903BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240903BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240903BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240903BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240903BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALN20240903BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077 ZNA
A61K35/34
A61K35/545
A61P9/00
C12N5/0735
C12N15/09 Z
C12Q1/02
G01N33/15 Z
G01N33/50 Z
C12Q1/6876 Z
【請求項の数】
18
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2020052526
(22)【出願日】2020-03-24
(62)【分割の表示】P 2016515530の分割
【原出願日】2014-09-19
(65)【公開番号】P2020115866
(43)【公開日】2020-08-06
【審査請求日】2020-04-15
【審判番号】
【審判請求日】2022-09-09
(31)【優先権主張番号】13185344.2
(32)【優先日】2013-09-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】516053796
【氏名又は名称】レパイロン・ゲーエムベーハー
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＰＡＩＲＯＮ ＧＭＢＨ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ツィンマーマン，ウルフラム－ウベルトゥス
(72)【発明者】
【氏名】ティブルシー，マルテ
(72)【発明者】
【氏名】ハドソン，ジェームズ
【合議体】
【審判長】加々美 一恵
【審判官】天野 貴子
【審判官】深草 亜子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１３／０１３２０６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１３／１１１８７５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１３／０５６０７２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１１－５１２８５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００９／００６１４１０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞から臨床応用に適した心筋細胞誘導法を開発－安全・安価・高効率な再生医療の実現化に，京都大学ｉＣｅＭＳウェブサイトでのニュースリリース，２０１２年１０月２６日，ｗｗｗ．ｋｙｏｔｏ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｔａｔｉｃ／ｊａ／ｎｅｗｓ＿ｄａｔａ／ｈ／ｈ１／ｎｅｗｓ６／２０１２／１２１０２６＿１．ｈ
【文献】ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ，２０１２年，Ｖｏｌ．２１， Ｎｏ．９，ｐｐ．１５１３－１５２３
【文献】ＰＬＯＳ ＯＮＥ，２０１１年，Ｖｏｌ．６，Ｉｓｓｕｅ１０，ｅ２６３９７（ｐｐ．１－１１）
【文献】Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８年，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１３８－１４９
【文献】Ｎａｔｕｒｅ，２００８年，Ｖｏｌ．４５３，ｐｐ．５２４－５２８
【文献】心臓，２０１１年，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．１２，ｐｐ．１４９２－１４９５
【文献】Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ，１９８８，ｖｏｌ．２０，ｎｏ．７，ｐｐ．６３５－６４７
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
C12N 1/00-7/18
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
心筋細胞、ＣＤ９０＋間質細胞及びコラーゲンを含む、無血清で生物工学によって作られた心筋（ＢＨＭ）であって、（ｉ）適切な型に培地１mlあたり２．５～６×１０６個の細胞／１mgコラーゲンの比で多能性幹細胞を播種し、次に有効量の（ａ）ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＳＣ－２－Ｐ及び（ｂ）０．５～５０mg/mlのアルブミン、１～１００μg/mlのトランスフェリン、０．１～１０μg/mlのエタノールアミン、０．００３～０．３μg/mlの亜セレン酸ナトリウム、０．４～４０μg/mlのＬ－カルニチンＨＣｌ、０．１～１０μg/mlのヒドロコルチゾン、０．０５～５μl/mlの脂肪酸サプリメント、０．０００１～０．１μg/mlのトリヨード－Ｌ－チロニン（Ｔ３）の最終濃度が得られる無血清サプリメントを含む、基本培地中で培養し、これにより、該多能性幹細胞の中胚葉への分化を誘導する工程；
（ｉｉ）有効量のＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤、ＡＳＣ－２－Ｐ及び工程（ｉ）における無血清サプリメントを含む基本培地中で、工程（ｉ）で得られた細胞を培養し、これにより、該細胞の心臓への分化を誘導する工程；及び
（ｉｉｉ）機械的刺激下で有効量のＡＳＣ－２－Ｐ、ＴＧＦβ１及び工程（ｉ）における無血清サプリメントを含み、かつ、カルシウム濃度が０．５～３mＭに調整された基本培地中で、工程（ｉｉ）で得られた細胞を培養し、これにより、心臓の成熟を促進する工程
を含む方法によって製造され、
ＢＨＭは、さらに
（ａ）２００μNを超える単収縮張力を示し；及び
（ｂ）０．６mMのカルシウムでペーシングされた条件下で４０μNを超える１μMのイソプレナリンへの変力応答を示すことを特徴とする、心筋。
【請求項2】
工程（ｉｉｉ）で細胞を培養する工程が、動的な機械的刺激又は静的伸展下で行われる、請求項１に記載のＢＨＭ。
【請求項3】
工程（ｉｉｉ）の基本培地が、ａ）０．１～１０ng/mlのＴＧＦβ１を含み；及び
ｂ）有効量のＦＧＦ２を含まない、
請求項１又は２に記載のＢＨＭ。
【請求項4】
工程（ｉｉｉ）の基本培地が、０．１～１０ng/mlのＴＧＦβ１を含み、ＢＨＭが、０．２より高い、又は０．３３より高いものの、成人の心臓組織に見られるβ－ＭＨＣ／α－ＭＨＣ比未満であるβ－ＭＨＣ／α－ＭＨＣ比を有する、請求項２に記載のＢＨＭ。
【請求項5】
ＢＨＭが、成人の心臓組織と比較して前駆細胞遺伝子の発現が低いが依然として保持されており、特にはＢＨＭが、成人の心臓組織と比較してＩＳＬ－１の発現が低いが依然として保持されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のＢＨＭ。
【請求項6】
ＢＨＭが、５０％の心筋細胞、そして残りは主にＣＤ９０＋間質細胞を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＢＨＭ。
【請求項7】
工程（ｉ）におけるコラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、及びその混合物からなる群より選択され；及び／又は工程（ｉ）におけるコラーゲンが、ヒト起源、ウシ起源、ブタ起源、又は海洋起源、例えば藻類起源若しくは魚起源であるか、又はコラーゲンが、組替えコラーゲンである、請求項１～５のいずれか一項に記載のＢＨＭ。
【請求項8】
更に、エラスチン、ラミニン、エンタクチン、ナイドジェン、プロテオグリカン、及びフィブロネクチンからなる群より選択される１つ以上の細胞外マトリックス成分を含む、請求項７に記載のＢＨＭ。
【請求項9】
ＢＨＭが、ａ）少なくとも３Ｈｚまでの複数の周波数でペーシングされ得；及び／又は
ｂ）増加した静止長及び静止張力に応答して増加する単収縮張力を示し；及び／又は
ｃ）０．２mMより高いカルシウムＥＣ５０を示し；及び／又は
ｄ）少なくとも６２日間維持され得る、
請求項１～８のいずれか一項に記載のＢＨＭ。
【請求項10】
多能性幹細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び単為発生幹細胞から選択され得；及び／又は多能性幹細胞は、霊長類を起源とする多能性幹細胞である、請求項１～９のいずれか一項に記載のＢＨＭ。
【請求項11】
多能性幹細胞は、ヒトの多能性幹細胞である、請求項１０に記載のＢＨＭ。
【請求項12】
工程（ｉ）の多能性幹細胞の培養時に用いる基本培地が、１～２０ng/mlのＢＭＰ４；及び
０．１～１０ng/mlのＦＧＦ２；及び
１～２０ng/mlのアクチビンＡを含み；及び／又は
工程（ｉ）の基本培地中のＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＳＢ２１６７６３、ＴＷＳ１１９、チデグルシブ、ＳＢ４１５２８６、及びＬＹ２０９０３１４からなる群より選択される、
請求項１～１１のいずれか一項に記載のＢＨＭ。
【請求項13】
工程（ｉｉ）の基本培地におけるＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤が、ＩＷＰ４、ＩＷＰ２、ＩＷＲ－１、ＩＷＰ１、ＩＷＰ３、ＩＷＲ－２、ＩＷＲ－３、ＩＷＲ－４、ＩＷＲ－５、ＸＡＶ９３９、ＤＫＫ１、ケルセチン、ＩＣＧ－００１、ピルビニウム、ＣＣＴ０３１３７４、ｉＣＲＴ－３、５、１４、ＣＰＧ０４９０９０、ＮＣ０４３からなる群より選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＢＨＭ。
【請求項14】
工程（ｉ）、（ｉｉ）及び／又は（ｉｉｉ）に使用される基本培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＳｔｅｍＰｒｏ(登録商標)、イスコフ培地、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、及びＲＰＭＩであり；及び／又は１０～１０００μMのアスコルビン酸又はその塩或いはその誘導体を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＢＨＭ。
【請求項15】
工程（ｉ）、（ｉｉ）及び／又は（ｉｉｉ）における無血清サプリメントが、０．１～１０％のＢ２７(登録商標)又はインスリンを除いたＢ２７(登録商標)を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＢＨＭ。
【請求項16】
播種工程が、工程（ｉ）の培養の１８～３０時間前に行なわれ、及び／又は播種工程に使用される培地が、ＲＯＣＫ阻害剤を更に含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＢＨＭ。
【請求項17】
疾患を処置するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の無血清で生物工学によって作られた心筋（ＢＨＭ）。
【請求項18】
処置が、心臓の修復である、請求項１７に記載のＢＨＭ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［発明の背景］
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は現在、理論的に無限かつ大量のヒト心筋細胞を供給するために広く使用されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。ヒト心筋細胞はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）（非特許文献４）及びヒト人工多能性幹細胞（ｈＩＰＳＣ）（非特許文献５）から誘導され、発生モデル（非特許文献６）、薬物効力及び／又は安全性のスクリーニング（非特許文献７）、肥大モデル化及び再生適用を含む、複数の目的用に実証された用途を有する。更に、最近のｈＩＰＳＣ技術の進展により、遺伝性の遺伝子疾患の表現型を示す心筋細胞をインビトロで発生させることができる（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は現在、理論的に無限かつ大量のヒト心筋細胞を供給するために広く使用されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。ヒト心筋細胞はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）（非特許文献４）及びヒト人工多能性幹細胞（ｈＩＰＳＣ）（非特許文献５）から誘導され、発生モデル（非特許文献６）、薬物効力及び／又は安全性のスクリーニング（非特許文献７）、肥大モデル化及び再生適用を含む、複数の目的用に実証された用途を有する。更に、最近のｈＩＰＳＣ技術の進展により、遺伝性の遺伝子疾患の表現型を示す心筋細胞をインビトロで発生させることができる（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。
【0002】
生検に由来するヒト心筋細胞の低密度な二次元培養により心筋細胞の表現型及び形態の急速な変化が起こり（非特許文献１３）、それは結果をインビボの状況に当てはめることを困難とすることが現在広く認められている。インビボの条件をより良く代表する心筋細胞表現型を得るために、心臓組織培養を使用して、ネイティブの心臓組織と類似した特性を有する構築物が作製された（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９）。
【0003】
組織培養の現在の観念形態は、必要とされる細胞型（単数又は複数）を作製／単離し、それらを培養環境に播種して、その分化を促進し、インビボ様の組織を作製するというものである。それ故、組織培養は、以下の２つの理由から非効率的なプロセスと考えられ得る。１）組織／分化培養物の解離により細胞外環境は破壊され、これにより発生情報（例えば細胞間の相互結合、幾何学的な細胞の配置、細胞と細胞外マトリックスの結合）が破壊されるので、これは環境を再構築するために細胞外マトリックス（ＥＣＭ）産生の非常に大きな増加を必要とする（非特許文献２０）、及び２）解離のプロセスはｈＰＳＣ株間で異なり得、それはかなりの細胞死を導く可能性がある。
【0004】
文献に報告された他のプロトコールは、複数のｈＰＳＣ株において同様な心筋細胞効率を可能とするために、プロトコールの改変を必要とし得る。しかし、本発明者らの結果は、分化プロトコールの変更は、心筋細胞の表現型に大きく影響し得ることを示している（例えば、ドルソモルフィンは、生物工学によって作られた心筋（ＢＨＭ）に大きく影響を及ぼし得ることが示されている）。これにより組織培養された心筋の特性に変化が起こり得、それにより異なる実験条件又は遺伝子疾患モデルの効果が遮蔽され得、それ故、異なる株で異なるプロトコールを使用する場合には注意を払わなければならない。
【0005】
いくつかの近年に公表されたプロトコールは、同じプロトコールを複数の株に使用することを可能とし得、それらはまた、非常に高い純度を有する心筋細胞を産生する。しかし、純粋な心筋細胞は、機能的に組織培養された心筋の形成を促進せず、心筋細胞及び間質細胞の両方が、機能的に組織培養された心筋の形成に必要とされる（非特許文献２１、非特許文献２２）。
【0006】
したがって、上記の欠点を克服することのできる、生物工学によって作られたヒト心筋を作製するための方法が当技術分野において必要とされている。
【0007】
ＢＨＭの持続的な製造を可能とする、強い分化プロトコールの開発は非常に重要な工程である。この研究では１８個を超える独立的な実験において１４０個を超える数のＢＨＭが作製され、どれもが自発的な拍動活動を示した。更に、このプロトコールは、同じプロトコールを使用して複数のｈＰＳＣ株からＢＨＭを作製することを可能とする。更に、全ての解離工程を省略でき、ｈＰＳＣは生物工学によって作られた心筋へと直接分化したので、組織の発生記憶は保持され、あらゆる組織の再現応答は防がれ、ヒト心筋発生のより正確なインビトロモデルを提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【文献】Kehat et al. J Clin Invest 108, 407-414 (2001)
【文献】Takahashi et al. Cell 131, 861-872 (2007)
【文献】Zhang et al., Circ Res 104, e30-41 (2009)
【文献】Thomson et al. Science 282, 1145-1147 (1998)
【文献】Takahashi et al., Cell 131, 861-872 (2007)
【文献】Lian et al. Stem Cells 2012 (2012)
【文献】Schaaf et al. PLoS ONE 6, 20 (2011)
【文献】Carvajal-Vergara, X. et al. Nature 465, 808-812 (2010)
【文献】Itzhaki et al., Nature 471, 225-229 (2011)
【文献】Malan et al. Circ Res (2011)
【文献】Moretti et al., N Engl J Med 363, 1397-1409 (2010)
【文献】Yazawa et al. Nature 471, 230-234 (2010)
【文献】Bird et al. Cardiovasc Res 58, 423-434 (2003)
【文献】Eschenhagen et al. FASEB J 11, 683-694 (1997)
【文献】Zimmermann et al. Biotechnol Bioeng 68, 106-114 (2000)
【文献】Zimmermann et al. Circ Res 90, 223-230 (2002)
【文献】Tulloch et al. Circ Res 109, 47-59 (2011)
【文献】Tiburcy et al. Circ Res 109, 1105-1114 (2011)
【文献】Eschenhagen et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol 303, 11 (2012)
【文献】Hudson et al. Tissue Eng Part A 17, 2279-2289 (2011)
【文献】Naito et al. Circulation 114, I72-78 (2006)
【文献】Hudson et al. Tissue Eng Part A 17, 2279-2289 (2011)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
［発明の要旨］
本発明は、
（ｉ）有効量の（ａ）ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、ＧＳＫ３阻害剤、及び（ｂ）０．５～５０mg/mlのアルブミン、１～１００μg/mlのトランスフェリン、０．１～１０μg/mlのエタノールアミン、０．００３～０．３μg/mlの亜セレン酸ナトリウム、０．４～４０μg/mlのＬ－カルニチンＨＣｌ、０．１～１０μg/mlのヒドロコルチゾン、０．０５～５μl/mlの脂肪酸サプリメント、０．０００１～０．１μg/mlのトリヨード－Ｌ－チロニン（Ｔ３）の最終濃度が得られる無血清サプリメントを含む、基本培地中で多能性幹細胞を培養し、これにより、該多能性幹細胞の中胚葉への分化を誘導する工程；
（ｉｉ）有効量のＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤及び工程（ｉ）に定義される無血清サプリメントを含む基本培地中で、工程（ｉ）で得られた細胞を培養し、これにより、該細胞の心臓への分化を誘導する工程；及び
（ｉｉｉ）機械的刺激下で有効量の工程（ｉ）に定義される無血清サプリメントを含む基本培地中で、工程（ｉｉ）で得られた細胞を培養し、これにより、心臓の成熟を促進する工程
を含む、多能性幹細胞から生物工学によって作られた心筋を作製するための方法に関する。
本発明は、
（ｉ）有効量の（ａ）ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、ＧＳＫ３阻害剤、及び（ｂ）０．５～５０mg/mlのアルブミン、１～１００μg/mlのトランスフェリン、０．１～１０μg/mlのエタノールアミン、０．００３～０．３μg/mlの亜セレン酸ナトリウム、０．４～４０μg/mlのＬ－カルニチンＨＣｌ、０．１～１０μg/mlのヒドロコルチゾン、０．０５～５μl/mlの脂肪酸サプリメント、０．０００１～０．１μg/mlのトリヨード－Ｌ－チロニン（Ｔ３）の最終濃度が得られる無血清サプリメントを含む、基本培地中で多能性幹細胞を培養し、これにより、該多能性幹細胞の中胚葉への分化を誘導する工程；
（ｉｉ）有効量のＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤及び工程（ｉ）に定義される無血清サプリメントを含む基本培地中で、工程（ｉ）で得られた細胞を培養し、これにより、該細胞の心臓への分化を誘導する工程；及び
（ｉｉｉ）機械的刺激下で有効量の工程（ｉ）に定義される無血清サプリメントを含む基本培地中で、工程（ｉｉ）で得られた細胞を培養し、これにより、心臓の成熟を促進する工程
を含む、多能性幹細胞から生物工学によって作られた心筋を作製するための方法に関する。
【0010】
本明細書において開示された方法を実施して、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から誘導された生物工学によって作られた心筋（ＢＨＭ）を、コラーゲンヒドロゲル中でのｈＰＳＣの定方向の組織形成によって作製する。ＢＨＭを形成するために、定方向の無血清誘導プロトコールを使用して、個別の公知の発生段階を経て、多能性、初期中胚葉、心臓前駆細胞、未熟心筋細胞を経て、最終的には５０％の心筋細胞から構成される（残りは主に間質細胞画分である）、より成熟した心臓組織へと組織を進行させて、インビボでの発生を模倣した。本発明者らはそれらの無血清ＢＨＭプロトコールを最適化し、個々のＢＨＭの特性は特定の刺激に高度に依存していることを発見し、したがって、これは、複数の外的刺激が最適なＢＨＭ特性に必要とされることを示している。最後には、増加した静止長、増加したカルシウム濃度、及びβ－アドレナリン作動性刺激に応答して、測定可能な収縮力、ペーシング能及び変力作用を示す、律動的に収縮するＢＨＭが作製された。このＢＨＭプロトコールは改変されることなく、複数のｈＰＳＣ株からＢＨＭを持続的に産生することができた（実施されたあらゆる実験における、あらゆるＢＨＭにおいて）。
【0011】
本データは、本明細書に開示されたＢＨＭプロトコールが、複数の適用のためのヒト心筋を作製するための頑強で無血清で再現性のある方法であることを示唆する。例えば、ＢＨＭがヒト心筋の発生の可能性あるモデルであることも示され、ＢＭＰシグナル伝達の阻害により、収縮強度の低下したより未熟な心臓表現型がもたらされることが示される。
【0012】
したがって、本発明はまた、本発明に係る方法によって作製されたＢＨＭにも関する。
【0013】
インビトロでの薬物毒性スクリーニングモデルにおける本発明に係るＢＨＭの使用が更に考えられる。換言すれば、本発明はまた、本発明に係るＢＨＭをスクリーニングしようとする薬物と接触させる工程を含む、薬物毒性をスクリーニングするための方法にも関する。
【0014】
更に、本発明は、薬理学的候補薬剤による心臓機能の調節を試験するためのインビトロ方法における、本発明に係るＢＨＭの使用に関する。したがって、本発明に係るＢＨＭを薬理学的候補薬剤と接触させる工程を含む、心臓機能調節を試験するための方法も記載される。
【0015】
最後に、本発明はまた、研究ツールとしての本発明に係るＢＨＭの使用、並びに、医薬に使用するための本発明に係るＢＨＭにも関する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1-1】頑強かつ効率的な心臓の分化のための、初期心臓分化の最適化。（Ａ）開発された心臓分化プロトコールの図。
【図1-2】（Ｂ、Ｃ）二次元培養における心臓分化に対するＦＧＦ－２の添加の効果。（Ｄ、Ｅ）ＣＨＩＲが存在する二次元培養における心臓分化に対する様々なＢＭＰ４濃度の効果。（Ｆ、Ｇ）二次元心臓分化プロトコールから個々に各因子を除去した効果、ＩＷＰ４を除く全ての因子を０～３日目から毎日加え、ＩＷＰ４は３～１３日目から２～３日毎に加えられた。
【図1-3】（Ｈ、Ｉ、Ｊ）ｑＰＣＲを使用した混入している細胞型の存在についてのアッセイ。（Ｋ）心筋細胞マーカーについての免疫染色。（Ｌ）心筋細胞についてのフローサイトメトリー（ｎ＝６回の実験）。（Ｍ）間質細胞マーカーについての免疫染色。（Ｎ）間質細胞についてのフローサイトメトリー（ｎ＝６回の実験）。全てのデータは特記しない限りｎ＝３回の実験である。ｑＰＣＲデータ（ＭＥＳＰ－１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、及びＮＥＵＲＯＤ１）をＧＡＰＤＨに対して標準化する。＊は、分散分析とチューキー多重比較事後検定を使用した統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。＊＊は、因子が全く補充されていない試料からの統計学的有意差を示す。＊＊＊は、因子が全く補充されていない、ＢＭＰ４を除く全ての因子が補充された、ＡＣＴ－Ａを除く全ての因子が補充された、及びＩＷＰ－４を除く全ての因子が補充された、試料からの統計学的有意差を示す。
【図2-1】ＢＨＭはｈＰＳＣから直接形成され得る。（Ａ）分化の２２日目のＢＨＭ。（Ｂ）ホールマウント免疫染色。（Ｃ）様々なカルシウム濃度に応答した等尺性単収縮張力（収縮力）、４回の実験に由来するｎ＝７。（Ｄ）多能性マーカー（ＴＲＡ－１－６０／ＯＣＴ４）及び心臓マーカー（α－アクチニン）のフローサイトメトリープロファイル、ｎ＝３～４回の実験。（Ｅ）２２日目の間質細胞マーカーのフローサイトメトリー、ｎ＝３回の実験。
【図2-2】（Ｆ）多能性、中胚葉分化、及び心臓分化についてのマーカーのｑＰＣＲ発現プロファイル；データはＧＡＰＤＨの発現に標準化されている、ｎ＝３回の実験。＊は、分散分析とチューキー多重比較事後検定を使用した－１日目と比較した統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図3-1】ＢＨＭ培養条件の最適化は、異なるパラメーターが異なる刺激に特異的に応答することを明らかとする。（Ａ）ＡＳＣ－２－Ｐの補充は、様々なカルシウム濃度に応答してＢＨＭ、等尺性単収縮張力（収縮力）を向上させる、３回の実験に由来するｎ＝８～９個、＊は、二元配置分散分析とボンフェローニ事後検定を使用して対照と比較した統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。（Ｂ）心筋細胞マーカー及び間質細胞マーカーについてのＡＳＣ－２－Ｐ実験のフローサイトメトリー分析、３回の実験に由来するｎ＝７～８個。（Ｃ）機械的刺激は、様々なカルシウム濃度に応答して、ＢＨＭ機能、等尺性単収縮張力（収縮力）を向上させる、４回の実験に由来するｎ＝９～１１個、＊は、二元配置分散分析とボンフェローニ事後検定を使用して対照と比較した両方の機械的刺激レジメについての統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。（Ｄ）機械的刺激装置。（Ｅ）対照下及び機械的刺激レジメ下のＢＨＭのホールマウント免疫染色。
【図3-2】（Ｆ）心臓成熟中に添加された増殖因子（ＦＧＦ２：１０ng/mL及びＴＧＦｂ１：１ng/mL）は、様々なカルシウム濃度に応答して、ＢＨＭ機能、等尺性単収縮張力（収縮力）を調節する、４回の実験に由来するｎ＝９～１１個。（Ｇ）フローサイトメトリーを使用した増殖因子実験についての心筋細胞の細胞サイズの分析、３回の実験に由来するｎ＝６個、＊は、スチューデントｔ検定を使用して対照と比較した統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。（Ｈ）増殖因子実験のためのβ－ＭＨＣ／α－ＭＨＣ比のｑＰＣＲ発現、ｎ＝３～６回の実験、＊は、分散分析とチューキー多重比較事後検定を使用して対照と比較した統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。（Ｉ）増殖因子実験のためのＡＮＰ及びＳｋ ＡｃｔのｑＰＣＲ発現、ｎ＝３回の実験。（Ｊ）心臓成熟中にカルシウムを１．２mmol/Lに調整することにより、様々なカルシウム濃度に応答してＢＨＭ機能、等尺性単収縮張力（収縮力）は向上する、４回の実験に由来するｎ＝１０～１１個、＊は、二元配置分散分析 ボンフェローニ事後検定を使用して対照と比較した統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。（Ｋ）カルシウム実験のためのＢＨＭの静止張力、４回の実験に由来するｎ＝１０～１１個、（Ｌ）カルシウム実験のためのＢＨＭの弾性率、４回の実験に由来するｎ＝１０～１１個、＊は、分散分析とチューキー多重比較事後検定を使用して対照と比較した統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図4】最適化したプロトコールを使用して作製されたＢＨＭは、インビボ様の特性を示す。（Ａ）ＢＨＭは、様々な速度で電気的にペーシングされ得る。（Ｂ）ＢＨＭは、増加した長さに対して増加した単収縮張力（収縮力）で応答する（フランク・スターリングの機序）。（Ｃ）２２日齢（以前のデータより）及び２９～３０日齢のＢＨＭの単収縮張力（収縮力）の比較、２２日目については４回の実験に由来するｎ＝１１個、２９～３０日目については２回の実験に由来するｎ＝７個。（Ｄ）０．６mMのカルシウムでのペーシング条件下でイソプレナリン（１μmol/L）に対する２２日齢のＢＨＭの変力応答。（Ｅ）０．６mMのカルシウムでのペーシング条件下でイソプレナリン（１μmol/L）に対する２９～３０日齢のＢＨＭの変力応答。（Ｆ）イソプレナリン（１μmol/L）に対する変力応答と年齢との比較、２２日目については４回の実験に由来するｎ＝１１個、２９～３０日目については２回の実験に由来するｎ＝７個、＊は、スチューデントｔ検定を使用した統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図5】ＢＨＭプロトコールを試験した全てのＰＳＣ株において使用することができる。（Ａ、Ｂ、Ｃ）ＨＥＳ３－ＢＨＭのデータ；（Ｄ、Ｅ、Ｆ）ｈＩＰＳ－Ｇ１－ＢＨＭのデータ。（Ａ、Ｄ）様々なカルシウム濃度に応答した等尺性単収縮張力（収縮力）、各株についてｎ＝４個。（Ｂ、Ｅ）ホールマウント免疫染色。（Ｃ、Ｆ）心筋細胞及び間質細胞のフローサイトメトリー分析、１つの株あたりｎ＝３個。
【図6】複数のｈＰＳＣ株の二次元心臓分化。心臓マーカー（α－アクチニン、ＳＩＲＰＡ）及び間質細胞マーカー（ＰＤＧＦＲα、α－ＳＭＡ、Ｉ型コラーゲン）のフローサイトメトリー分析。
【図7】ＢＨＭを、一例としてＢＭＰシグナル伝達阻害を使用した発生プロセスをモデル化するために使用することができる。（Ａ）ＢＨＭ形成の１３日目における複数のマーカーのｑＰＣＲ分析。（Ｂ）α－アクチニン＋細胞にゲートをかけたフローサイトメトリーを使用した細胞周期分析。（Ｃ）１つのＢＨＭあたりの心筋細胞数。（Ｄ）様々なカルシウム濃度に応答した等尺性単収縮張力（収縮力）。＊は、Ａ＋Ｂ）スチューデントｔ検定（ｎ＝３～４個）又はＤ）二元配置分散分析 シダック多重比較事後検定を使用して対照と比較した統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図8-2】（Ｃ）図３に示された実験に使用されたプロトコール－アスコルビン酸の添加。（Ｄ）図３に示された実験に使用されたプロトコール－機械的刺激及び増殖因子。（Ｅ）図３に示された実験に使用されたプロトコール－カルシウムの添加。
【図9】Ｂ２７（登録商標）を置き換えるカスタムメイドなサプリメント。（Ａ）２mMの細胞外カルシウムでの、Ｂ２７（登録商標）又はカスタムメイドなサプリメント（ＣＭＳ、custom-made supplement）を用いて作製されたＢＨＭ（ｈＥＳ２）の収縮力、ｎ＝２／群）。（Ｂ）Ｂ２７（登録商標）又はカスタムメイドなサプリメント（ＣＭＳ）を用いて作製されたＢＨＭにおけるＣＭの総数、ｎ＝２／群。
【図10】心臓成熟期の間にＴＧＦβ－１を培養培地に補充することにより、濃度依存的に（０．３～１０ng/mlで試験；１つの条件あたりｎ＝５～７個のＢＨＭ）ＢＨＭの収縮機能（ＦＯＣ：収縮力）は増強される。
【発明を実施するための形態】
【0017】
［好ましい実施態様の詳細な説明］
（ｉ）有効量の（ａ）ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、ＧＳＫ３阻害剤、及び（ｂ）０．５～５０mg/mlのアルブミン、１～１００μg/mlのトランスフェリン、０．１～１０μg/mlのエタノールアミン、０．００３～０．３μg/mlの亜セレン酸ナトリウム、０．４～４０μg/mlのＬ－カルニチンＨＣｌ、０．１～１０μg/mlのヒドロコルチゾン、０．０５～５μl/mlの脂肪酸サプリメント、０．０００１～０．１μg/mlのトリヨード－Ｌ－チロニン（Ｔ３）の最終濃度が得られる無血清サプリメントを含む、基本培地中で多能性幹細胞を培養し、これにより、該多能性幹細胞の中胚葉への分化を誘導する工程；
（ｉｉ）有効量のＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤及び工程（ｉ）に定義される無血清サプリメントを含む基本培地中で、工程（ｉ）で得られた細胞を培養し、これにより、該細胞の心臓への分化を誘導する工程；及び
（ｉｉｉ）機械的刺激下で有効量の工程（ｉ）におけるような無血清サプリメントを含む基本培地中で、工程（ｉｉ）で得られた細胞を培養し、これにより、心臓の成熟を促進する工程
を含む、多能性幹細胞から生物工学によって作られた心筋を作製するための方法。
（ｉ）有効量の（ａ）ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、ＧＳＫ３阻害剤、及び（ｂ）０．５～５０mg/mlのアルブミン、１～１００μg/mlのトランスフェリン、０．１～１０μg/mlのエタノールアミン、０．００３～０．３μg/mlの亜セレン酸ナトリウム、０．４～４０μg/mlのＬ－カルニチンＨＣｌ、０．１～１０μg/mlのヒドロコルチゾン、０．０５～５μl/mlの脂肪酸サプリメント、０．０００１～０．１μg/mlのトリヨード－Ｌ－チロニン（Ｔ３）の最終濃度が得られる無血清サプリメントを含む、基本培地中で多能性幹細胞を培養し、これにより、該多能性幹細胞の中胚葉への分化を誘導する工程；
（ｉｉ）有効量のＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤及び工程（ｉ）に定義される無血清サプリメントを含む基本培地中で、工程（ｉ）で得られた細胞を培養し、これにより、該細胞の心臓への分化を誘導する工程；及び
（ｉｉｉ）機械的刺激下で有効量の工程（ｉ）におけるような無血清サプリメントを含む基本培地中で、工程（ｉｉ）で得られた細胞を培養し、これにより、心臓の成熟を促進する工程
を含む、多能性幹細胞から生物工学によって作られた心筋を作製するための方法。
【0018】
好ましい実施態様では、多能性幹細胞は、霊長類を起源とする多能性幹細胞であり、より好ましくは多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞である。多能性幹細胞は、生体のあらゆる細胞型へと分化することができる。したがって、ヒト多能性幹細胞は、本物のヒト心臓細胞を得るためのユニークな機会を与える。現在、最も利用されている多能性細胞は胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。ヒトＥＳＣ株はThomson及び共同研究者（Thomson et al., Science 282: 1145-1147 (1998)；その全体が参照により本明細書中に援用される）によって最初に樹立された。ヒトＥＳＣの研究は近年、生体の細胞をＥＳ様細胞へと初期化する新規な技術の開発を可能とした。この技術は、２００６年に、山中及び共同研究者（Takahashi & Yamanaka Cell 126: 663-676 (2006)；その全体が参照により本明細書中に援用される）によって開拓された。得られる人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）は、ＥＳＣと非常に類似した挙動を示し、重要なことには、生体のあらゆる細胞へと分化することもできる。更に、単為発生幹細胞はＢＨＭの作製に適しているようであることも報告された（Didie et al. J Clin Invest. 123, 1285-1298 (2013)；その全体が参照により本明細書中に援用される）。したがって、多能性幹細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び単為発生幹細胞から選択され得る。しかし、本発明の文脈において、該多能性幹細胞は、ヒトの生殖系列上の遺伝子同一性を改変することを含むプロセス、又は工業的若しくは商業的目的のためのヒト胚の使用を含むプロセスを使用して作製されない。
【0019】
工程（ｉ）で使用される基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＳｔｅｍＰｒｏ、イスコフ培地、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、及びＲＰＭＩから選択され得る。好ましくは、工程（ｉ）で使用される基本培地は、ピルビン酸の補充されたＲＰＭＩである。しかし、任意の適切な基本培地を該方法に使用してもよい。基本培地は市販されているか、又は、例えばＡＴＣＣのカタログから公共的に入手可能なレシピに従って調製されてもよい。
【0020】
適切であると考えられれば、基本培地に、非必須アミノ酸を補充してもよい。αＭＥＭを基本培地として使用する場合、基本培地に更に非必須アミノ酸を補充する必要はない。非必須アミノ酸は、複合サプリメントとして市販されている。このようなサプリメントは、例えば、７５０mg/Lのグリシン、８９０mg/LのＬ－アラニン、１３２０mg/LのＬ－アスパラギン、１３３０mg/LのＬ－アスパラギン酸、１４７０mg/LのＬ－グルタミン酸、１１５０mg/LのＬ－プロリン、及び１０５０mg/LのＬ－セリンを含む。
【0021】
上記に示されているように、工程（ｉ）の基本培地は、有効量のＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、及びＧＳＫ３阻害剤を含む。例えば、このような基本培地は、１～２０ng/ml、好ましくは２～１５ng/ml、より好ましくは２．５～１０ng/ml、より好ましくは３～８ng/ml、最も好ましくは４～６ng/ml、更に最も好ましくは約５ng/mlのＢＭＰ４；０．１～１０ng/ml、好ましくは１～９ng/ml、より好ましくは２～８ng/ml、更により好ましくは３～７ng/ml、最も好ましくは４～６ng/ml、更に最も好ましくは約５ng/mlのＦＧＦ２；１～２０ng/ml、好ましくは２．５～１８ng/ml、より好ましくは５～１６ng/ml、更により好ましくは７．５～１４ng/ml、更により好ましくは８～１２ng/ml、最も好ましくは８．５～１０ng/ml、更に最も好ましくは約９ng/mlのアクチビンＡを含む。
【0022】
工程（ｉ）の基本培地中のＧＳＫ３阻害剤は、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＳＢ２１６７６３、ＴＷＳ１１９、チデグルシブ、ＳＢ４１５２８６、及びＬＹ２０９０３１４からなる群より選択され得る。しかし、本発明の方法に適した任意ののＧＳＫ３阻害剤を適用できる。好ましい実施態様では、工程（ｉ）の基本培地中のＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である。
【0023】
有効量のＧＳＫ３阻害剤の濃度は、問題の阻害剤の利用能及び阻害定数によって変動することが当業者によって理解される。本発明の文脈において、本明細書においてＧＳＫ３阻害剤の文脈で使用される「有効量」という用語は、酵素を不活性化する濃度を意味することを意図する。例えば、ＣＨＩＲ９９０２１の場合、工程（ｉ）の基本培地は、０．１～１０μMのＣＨＩＲ９９０２１、好ましくは０．２～９μM、より好ましくは０．３～８μM、更により好ましくは０．４～７μM、更により好ましくは０．５～６μM、より好ましくは０．６～５μM、より好ましくは０．７～４μM、より好ましくは０．８～３μM、最も好ましくは０．９～２μM、更に最も好ましくは約１μMのＣＨＩＲ９９０２１を含む。あらゆる受容体／酵素のアゴニスト又は阻害剤の有効濃度は、それぞれの化合物の利用能及び生物学的活性により変動することが理解される。該方法の工程（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に適用される無血清サプリメントは、０．５～５０mg/mlのアルブミン（好ましくは１～４０mg/ml、より好ましくは２～３０mg/ml、更により好ましくは３～２０mg/ml、最も好ましくは４～１０mg/ml、更に最も好ましくは４．５～７．５mg/ml、例えば約５mg/ml）、１～１００μg/mlのトランスフェリン（好ましくは２～９０μg/ml、より好ましくは３～８０μg/ml、更により好ましくは４～７０μg/ml、更により好ましくは５～６０μg/ml、より好ましくは６～５０μg/ml、より好ましくは７～４０μg/ml、より好ましくは８～３０μg/ml、より好ましくは９～２０μg/ml、例えば約１０μg/ml）、０．１～１０μg/mlのエタノールアミン（好ましくは０．２～９μg/ml、より好ましくは０．３～８μg/ml、更により好ましくは０．４～７μg/ml、更により好ましくは０．５～６μg/ml、より好ましくは０．６～５μg/ml、より好ましくは０．７～４μg/ml、より好ましくは０．８～３μg/ml、より好ましくは１～２．５μg/ml、例えば約２μg/ml）、０．００３～０．３μg/mlの亜セレン酸ナトリウム（好ましくは０．００５～０．２μg/ml、より好ましくは０．０１～０．１μg/ml、更により好ましくは０．０２～０．０５μg/ml、最も好ましくは約０．０３μg/ml、例えば約０．０３２μg/ml）、０．４～４０μg/mlのＬ－カルニチンＨＣｌ（好ましくは０．５～３０μg/ml、より好ましくは１～２０μg/ml、更により好ましくは２～１０μg/ml、最も好ましくは３～５μg/ml、更に最も好ましくは約４μg/ml）、０．１～１０μg/mlのヒドロコルチゾン（好ましくは０．２～９μg/ml、より好ましくは０．３～８μg/ml、更により好ましくは０．４～７μg/ml、更により好ましくは０．５～６μg/ml、より好ましくは０．６～５μg/ml、より好ましくは０．７～４μg/ml、より好ましくは０．８～３μg/ml、より好ましくは０．９～２μg/ml、例えば約１μg/ml）、０．０５～５μl/mlの脂肪酸サプリメント（好ましくは０．１～４μl/ml、より好ましくは０．２～３μl/ml、更により好ましくは０．３～３μl/ml、最も好ましくは０．４～２μl/ml、更に最も好ましくは０．４５～１μl/ml、例えば約０．５μl/ml）、及び０．０００１～０．１μg/mlのトリヨード－Ｌ－チロニン（Ｔ３）（好ましくは０．００１～０．０１μg/ml、より好ましくは０．００２～０．００７５μg/ml、更により好ましくは０．００３～０．００５μg/ml、最も好ましくは約０．００４μg/ml）の最終濃度が得られるように処方される。
【0024】
更に、無血清サプリメントは更に、ビタミンＡ、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－カルニチン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、及びプトレシンからなる群より選択される１つ以上の成分を含み得る。これらの成分は細胞の生存能に貢献する。それぞれの成分の適切な濃度は当業者には公知であるか、又は、慣用の測定を使用して容易に決定することができる。
【0025】
工程（ｉ）において言及された無血清サプリメントは市販もされている。例えば、Ｂ２７（登録商標）サプリメント又はインスリンを除いたＢ２７（登録商標）サプリメントが使用され得る。好ましい実施態様では、上記の方法の工程（ｉ）で使用されるＢ２７（登録商標）サプリメント又はインスリンを除いたＢ２７（登録商標）サプリメントは、０．１～１０％のＢ２７（登録商標）又はインスリンを除いたＢ２７（登録商標）の量で、好ましくは０．５～８％、より好ましくは１～６％、更により好ましくは１．５～４％、最も好ましくは約２％のＢ２７（登録商標）又はインスリンを除いたＢ２７（登録商標）の量で適用される。
【0026】
以下の実施例で示されているように、有効量のアスコルビン酸又はその塩或いはその誘導体を工程（ｉ）の基本培地に含めることが有利であることが判明した。好ましい実施態様では、工程（ｉ）の基本培地は、１０～１０００μM、好ましくは５０～４００μM、より好ましくは１００～３００μM、更により好ましくは１５０～２５０μM、最も好ましくは約２００μMのアスコルビン酸又はその塩或いはその誘導体を含む。アスコルビン酸は、遊離形で送達されても、又は塩として送達されてもよい。アスコルビン酸は活性成分であるので、対イオンが細胞に対して有害な作用を全く及ぼさない限り、アスコルビン酸を細胞に与える、アスコルビン酸の任意の塩又は誘導体が使用され得る。実施例で示されているように、アスコルビン酸の１つの適切な塩又は誘導体はアスコルビン酸－２－リン酸である。
【0027】
工程（ｉ）の長さ、並びにＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、及びＧＳＫ３阻害剤などの因子の濃度は、中胚葉分化の誘導効率をモニタリングすることによって最適化され得る。これは、細胞表面マーカー又は多能性マーカーの発現をモニタリングすることによって、すなわち、（ａ）ＴＲＡ－１－６０及びＯＣＴ４陽性細胞（多能性幹細胞）の減少、並びに（ｂ）ＭＩＸＬ１及びＭｅｓｐ１陽性細胞（中胚葉）の増加によって、成し遂げられ得る（本明細書の図４ｆも参照）。
【0028】
簡潔に言えば、細胞をエタノールを使用して固定し、標準的なプロトコールを使用してブロックし、次いで、ブロック緩衝液中でＴＲＡ－１－６０、ＯＣＴ４、ＭＩＸＬ１及び／又はＭｅｓｐ１（以下の表２参照）に対する一次抗体を用いて４５分間、場合により続いてブロック緩衝液中で二次抗体（一次抗体が蛍光標識されていない場合）及びヘキストを用いて４℃で３０分間（以下の表２参照）、染色する。ＢＤ ＬＳＲＩＩをフローサイトメトリー分析（BD Biosystems）に使用する。生細胞について集団を前方側方散乱プロファイルに基づいてゲートにかける。ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（BD Bioscience）又はCyflologic v1.2.1（Cyflo Ltd）を分析に使用する。中胚葉分化の誘導は、
（ａ）生細胞集団の５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、更により好ましくは２０％未満、最も好ましくは１０％未満、更に最も好ましくは５％未満の細胞がＴＲＡ－１－６０について陽性であり；及び／又は、生細胞集団の５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、更により好ましくは２０％未満、最も好ましくは１０％未満、更に最も好ましくは５％未満の細胞がＯＣＴ４について陽性であり；並びに
（ｂ）生細胞集団の２０％超、好ましくは３０％超、より好ましくは４０％超、更により好ましくは５０％超、最も好ましくは６０％超の細胞がＭＩＸＬ１について陽性であり；並びに／又は、生細胞集団の２０％超、好ましくは３０％超、より好ましくは４０％超、更により好ましくは５０％超、最も好ましくは６０％超の細胞がＭｅｓｐ１について陽性である
場合に示される。
（ａ）生細胞集団の５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、更により好ましくは２０％未満、最も好ましくは１０％未満、更に最も好ましくは５％未満の細胞がＴＲＡ－１－６０について陽性であり；及び／又は、生細胞集団の５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、更により好ましくは２０％未満、最も好ましくは１０％未満、更に最も好ましくは５％未満の細胞がＯＣＴ４について陽性であり；並びに
（ｂ）生細胞集団の２０％超、好ましくは３０％超、より好ましくは４０％超、更により好ましくは５０％超、最も好ましくは６０％超の細胞がＭＩＸＬ１について陽性であり；並びに／又は、生細胞集団の２０％超、好ましくは３０％超、より好ましくは４０％超、更により好ましくは５０％超、最も好ましくは６０％超の細胞がＭｅｓｐ１について陽性である
場合に示される。
【0029】
通常、工程（ｉ）は４８～９６時間行なわれる。好ましくは、工程（ｉ）は６０～８４時間行なわれ、より好ましくは工程（ｉ）は６６～７８時間行なわれる。
【0030】
工程（ｉｉ）に使用される基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＳｔｅｍＰｒｏ、イスコフ培地、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、及びＲＰＭＩから選択され得る。好ましくは、工程（ｉｉ）に使用される基本培地は、ピルビン酸の補充されたＲＰＭＩである。しかし、任意の適切な基本培地を該方法に使用してもよい。
【0031】
適切であると考えられれば、工程（ｉｉ）の基本培地に、非必須アミノ酸を補充してもよい。αＭＥＭを工程（ｉｉ）の基本培地として使用する場合、基本培地に更に非必須アミノ酸を補充する必要はない。非必須アミノ酸は、複合サプリメントとして市販されている。このようなサプリメントは、例えば、７５０mg/Lのグリシン、８９０mg/LのＬ－アラニン、１３２０mg/LのＬ－アスパラギン、１３３０mg/LのＬ－アスパラギン酸、１４７０mg/LのＬ－グルタミン酸、１１５０mg/LのＬ－プロリン、及び１０５０mg/LのＬ－セリンを含む。
【0032】
工程（ｉｉ）の基本培地は、独立して、工程（ｉ）に適用される基本培地から選択され得る。しかし、好ましい実施態様では、工程（ｉ）及び（ｉｉ）の基本培地は同じである。
【0033】
工程（ｉｉ）の基本培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤は、本発明の方法に適切に適用することのできる、どのようなＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤であってもよい。好ましくは、当該Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤は、ＩＷＰ４、ＩＷＰ２、ＩＷＲ－１、ＩＷＰ１、ＩＷＰ３、ＩＷＲ－２、ＩＷＲ－３、ＩＷＲ－４、ＩＷＲ－５、ＸＡＶ９３９、ＤＫＫ１、ケルセチン、ＩＣＧ－００１、ピルビニウム、ＣＣＴ０３１３７４、ｉＣＲＴ－３，５，１４、ＣＰＧ０４９０９０、ＮＣ０４３からなる群より選択される。より好ましくは、当該Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤は、ＩＷＰ４、ＩＷＰ２、ＩＷＲ－１、ＩＷＰ１、ＩＷＰ３、ＩＷＲ－２、ＩＷＲ－３、ＩＷＲ－４、ＩＷＲ－５、ＸＡＶ９３９、ＤＫＫ１からなる群より選択される。以下の実施例に示されているように、工程（ｉｉ）の基本培地中の１つの特に有用なＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤はＩＷＰ４である。
【0034】
工程（ｉｉ）において言及された無血清サプリメントは、上記の工程（ｉ）で定義されたとおりである。工程（ｉ）及び（ｉｉ）に適用される無血清サプリメントは同じであっても同じでなくてもよい。同様に、Ｂ２７（登録商標）サプリメント又はインスリンを除いたＢ２７（登録商標）サプリメントを工程（ｉｉ）に使用することができる。好ましい実施態様では、上記の方法の工程（ｉｉ）に使用されるＢ２７（登録商標）サプリメント又はインスリンを除いたＢ２７（登録商標）サプリメントは、０．１～１０％のＢ２７（登録商標）又はインスリンを除いたＢ２７（登録商標）の量で、好ましくは０．５～８％、より好ましくは１～６％、更により好ましくは１．５～４％、最も好ましくは約２％のＢ２７（登録商標）又はインスリンを除いたＢ２７（登録商標）の量で適用される。
【0035】
有効量のＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤の濃度は、問題の阻害剤の利用能及び阻害定数によって変動することが当業者によって理解される。例えば、ＩＷＰ４の場合、工程（ｉｉ）の基本培地は、０．１～１０μMのＩＷＰ４、好ましくは１～９μM、より好ましくは２～８μM、更により好ましくは３～７μM、更により好ましくは４～６μM、最も好ましくは約５μMのＩＷＰ４を含み得る。あらゆる受容体／酵素のアゴニスト又は阻害剤の有効濃度は、それぞれの化合物の利用能及び生物学的活性により変動することが理解される。
【0036】
以下の実施例で示されているように、有効量のアスコルビン酸又はその塩或いはその誘導体を工程（ｉｉ）の基本培地に含めることが有利であることが判明した。好ましい実施態様では、工程（ｉｉ）の基本培地は、１０～１０００μM、好ましくは５０～４００μM、より好ましくは１００～３００μM、更により好ましくは１５０～２５０μM、最も好ましくは約２００μMのアスコルビン酸又はその塩或いはその誘導体を含む。アスコルビン酸は、遊離形で送達されても、又は塩として送達されてもよい。アスコルビン酸は活性成分であるので、対イオンが細胞に対して有害な作用を全く及ぼさない限り、アスコルビン酸を細胞に与える、アスコルビン酸の任意の塩又は誘導体が使用され得る。実施例で示されているように、工程（ｉｉ）の基本培地に使用するためのアスコルビン酸の１つの適切な塩又は誘導体はアスコルビン酸－２－リン酸である。
【0037】
工程（ｉｉ）の長さ及びＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤などの残りの構成成分の濃度は、細胞の心臓への分化の誘導効率をモニタリングすることによって最適化され得る。これは、分化マーカーの発現をモニタリングすることによって、すなわち、Ｎｋｘ２．５及びアクチニンの増加によって、成し遂げられ得る。
【0038】
簡潔に言えば、細胞をエタノールを使用して固定し、ブロックし、次いで、ブロック緩衝液中でＮｋｘ２．５及び／又はアクチニン（以下の表２参照）に対する一次抗体を用いて４５分間、場合により続いてブロック緩衝液中で二次抗体（一次抗体が蛍光標識されていない場合）及びヘキストを用いて４℃で３０分間（以下の表２参照）、染色する。ＢＤ ＬＳＲＩＩをフローサイトメトリー分析（BD Biosystems）に使用する。生細胞について集団を前方側方散乱プロファイルに基づいてゲートにかける。ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（BD Bioscience）又はCyflologic v1.2.1（Cyflo Ltd）を分析に使用する。心臓への分化の誘導は、生細胞集団の２０％超、好ましくは３０％超、より好ましくは４０％超、更により好ましくは５０％超、最も好ましくは６０％超の細胞がＮｋｘ２．５について陽性であり；及び／又は、生細胞集団の２０％超、好ましくは３０％超、より好ましくは４０％超、更により好ましくは５０％超、最も好ましくは６０％超の細胞がアクチニンについて陽性である場合に示される（本明細書の図４ｄ及び４ｆも参照）。
【0039】
通常、工程（ｉｉ）は８～１２日間行なわれる。好ましくは、工程（ｉｉ）は９～１１日間行なわれ、最も好ましくは工程（ｉｉ）は１０日間行なわれる。
【0040】
工程（ｉｉｉ）に使用される基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＳｔｅｍＰｒｏ、イスコフ培地、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、及びＲＰＭＩから選択され得る。好ましくは、工程（ｉｉｉ）に使用される基本培地は、ピルビン酸の補充されたＲＰＭＩである。しかし、任意の適切な基本培地を該方法に使用してもよい。
【0041】
適切であると考えられれば、工程（ｉｉｉ）の基本培地に、非必須アミノ酸を補充してもよい。αＭＥＭを工程（ｉｉｉ）の基本培地として使用する場合、基本培地に更に非必須アミノ酸を補充する必要はない。非必須アミノ酸は、複合サプリメントとして市販されている。このようなサプリメントは、例えば、７５０mg/Lのグリシン、８９０mg/LのＬ－アラニン、１３２０mg/LのＬ－アスパラギン、１３３０mg/LのＬ－アスパラギン酸、１４７０mg/LのＬ－グルタミン酸、１１５０mg/LのＬ－プロリン、及び１０５０mg/LのＬ－セリンを含む。
【0042】
工程（ｉｉｉ）の基本培地は、独立して、工程（ｉ）及び／又は（ｉｉ）に適用される基本培地から選択され得る。しかし、好ましい実施態様では、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の基本培地は同じである。より好ましくは、工程（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の基本培地は同じである。
【0043】
以下の実施例で示されているように、有効量のアスコルビン酸又はその塩或いはその誘導体を工程（ｉｉｉ）の基本培地に含めることが有利であることが判明した。好ましい実施態様では、工程（ｉｉｉ）の基本培地は、１０～１０００μM、好ましくは５０～４００μM、より好ましくは１００～３００μM、更により好ましくは１５０～２５０μM、最も好ましくは約２００μMのアスコルビン酸又はその塩或いはその誘導体を含む。アスコルビン酸は、遊離形で送達されても、又は塩として送達されてもよい。アスコルビン酸は活性成分であるので、対イオンが細胞に対して有害な作用を全く及ぼさない限り、アスコルビン酸を細胞に与える、アスコルビン酸の任意の塩又は誘導体が使用され得る。実施例で示されているように、工程（ｉｉｉ）の基本培地に使用するためのアスコルビン酸の１つの適切な塩又は誘導体はアスコルビン酸－２－リン酸である。
【0044】
工程（ｉｉｉ）において言及された無血清サプリメントは、上記の工程（ｉ）で定義された無血清サプリメントである。工程（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に適用される無血清サプリメントは同じであっても同じでなくてもよい。同様に、Ｂ２７（登録商標）サプリメント又はインスリンを除いたＢ２７（登録商標）サプリメントを工程（ｉｉｉ）に使用することができる。好ましい実施態様では、上記の方法の工程（ｉｉｉ）に使用されるＢ２７（登録商標）サプリメント又はインスリンを除いたＢ２７（登録商標）サプリメントは、０．１～１０％のＢ２７（登録商標）又はインスリンを除いたＢ２７（登録商標）の量で、好ましくは０．５～８％、より好ましくは１～６％、更により好ましくは１．５～４％、最も好ましくは約２％のＢ２７（登録商標）又はインスリンを除いたＢ２７（登録商標）の量で適用される。
【0045】
工程（ｉｉｉ）の基本培地は更に、有効量のＴＧＦβ１を含む。例えば、工程（ｉｉｉ）の基本培地は、０．１～１０ng/mlのＴＧＦβ１、好ましくは０．２～９ng/ml、より好ましくは０．３～８ng/ml、更により好ましくは０．４～７ng/ml、更により好ましくは０．５～６ng/ml、より好ましくは０．６～５ng/ml、より好ましくは０．７～４ng/ml、より好ましくは０．８～３ng/ml、最も好ましくは０．９～２ng/ml、更に最も好ましくは約１ng/mlのＴＧＦβ１を含み得る。
【0046】
実施例に示されているように、工程（ｉｉｉ）の基本培地が有効量のＦＧＦ２を含まない場合が心臓の成熟にとって有利である。それとは対照的に、カルシウムは心臓の成熟を高めることが示された。したがって、好ましい実施態様では、工程（ｉｉｉ）の基本培地は、０．５～３mMのＣａ２＋、好ましくは０．５～２．７５mMのＣａ２＋、より好ましくは１～２．２５mMのＣａ２＋、更により好ましくは１～１．５mM mMのＣａ２＋、最も好ましくは約１．２mMのＣａ２＋を含む。
【0047】
通常、本発明の方法の工程（ｉｉｉ）は、当技術分野において一般的に公知であるように、機械的刺激下で、例えば伸展装置上で、行なわれる。好ましくは、伸展装置は、静的伸展、相動性伸展、又は動的伸展をＢＨＭにかける。より具体的には、機械的伸展は、弾力的な負荷に対して（ａ）静的、（ｂ）動的、又は（ｃ）柔軟であり得る。好ましくは、工程（ｉｉｉ）の機械的刺激は、動的な機械的刺激又は静的伸展である。より好ましい実施態様では、工程（ｉｉｉ）の機械的刺激は、増張力性収縮（auxotonic contraction）を促進するような、弾力的な負荷に対する動的な機械的刺激である。
【0048】
心臓の成熟が促進されているかどうかを、自発的収縮又は電気刺激収縮についての光学検査によって試験することができる。好ましくは、心臓の成熟は等尺性収縮実験によってモニタリングされ、０．０１mNを超える単収縮力の発生が心臓の成熟についての指標である。
【0049】
簡潔に言えば、収縮実験を、１２０mMのＮａＣｌ、１mMのＭｇＣｌ２、０．２mMのＣａＣｌ２、５．４mMのＫＣｌ、２２．６mMのＮａＨＣＯ３、４．２mMのＮａＨ２ＰＯ４、５．６mMのグルコース、及び０．５６mMのアスコルビン酸を含有するタイロード溶液中、生理的ｐＨを維持するために５％ＣＯ２及び９５％Ｏ２を絶えずバブリングしながら３７℃の浴槽中で行なう。カルシウムを０．２Ｍの塩化カルシウム溶液を使用して調整する。ほぼ胎児の心拍数でペーシングするために、全てのＢＨＭを、２００mAの電流の５ms矩形波のパルスを用いて３Hzで分析する。刺激の周波数を変化させて、適切な力－周波数の応答（ボウディッチの機序）を確認する。ＢＨＭを、最大単収縮力が観察されるまで（力－長さの応答；フランク・スターリングの機序）、１２５μmの間隔で機械的に伸展させる。
【0050】
通常、工程（ｉｉｉ）は少なくとも７２時間行なわれる。工程（ｉｉｉ）の長さに関して特定の上限はないが、該工程は通常、１００日間未満行なわれる。具体的な実施態様では、工程（ｉｉｉ）は４～５０日間、例えば約１５日間行なわれ得る。
【0051】
本発明の方法の工程（ｉ）の前に播種工程があってもよく、該多能性幹細胞は、適切な型に培地１mlあたり、２．５～６×１０６個の細胞／１mg コラーゲンの比で播種される。好ましくは、播種工程は工程（ｉ）の１８～３０時間前に行なわれる。
【0052】
播種工程に使用される培地は通常、０．２～２mg/mlのコラーゲン（好ましくは０．３～１．９mg/ml、より好ましくは０．４～１．８mg/ml、更により好ましくは０．４～１．７mg/ml、更により好ましくは０．５～１．６mg/ml、より好ましくは０．６～１．５mg/ml、より好ましくは０．７～１．４mg/ml、より好ましくは０．８～１．３mg/ml、より好ましくは０．９～１．２mg/ml、例えば約１mg/ml）を含む。コラーゲンは好ましくは医薬等級であり、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、及びその混合物からなる群より選択される。より好ましい実施態様では、該コラーゲンの少なくとも９０％がＩ型コラーゲンである。しかし、該コラーゲンはまた更に、エラスチン、ラミニン、エンタクチン、ナイドジェン、プロテオグリカン、及びフィブロネクチンからなる群より選択される１つ以上の細胞外マトリックス成分を含み得る。通常、コラーゲンの正確な組成は、それが何処から得られたかの起源に依存する。コラーゲンは好ましくはヒト起源であるが、ウシ若しくはブタ起源、又は海洋起源、例えば藻類起源若しくは魚起源も考えられる。或いは、組換えコラーゲンを使用してもよい。
【0053】
適切な細胞密度に達成するために、いくつかの多能性細胞株については、播種工程に使用される培地にＲＯＣＫ阻害剤を補充することが役立ち得る。それ故、好ましい実施態様では、播種工程に使用される培地は更にＲＯＣＫ阻害剤を含む。ＲＯＣＫ阻害剤は、本発明の方法に適切に適用され得る、任意のＲＯＣＫ阻害剤であり得る。好ましくは、該ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２、Ｈ－１１５２Ｐ、チアゾビビン、ファスジル、ヒドロキシファスジル、ＧＳＫ４２９２８６Ａ及びＲＫＩ－１４４７から選択され、好ましくはＹ２７６３２、Ｈ－１１５２Ｐ、チアゾビビン、ファスジル、ヒドロキシファスジルから選択され、より好ましくはＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２又はＨ－１１５２Ｐから選択される。以下の実施例に示されているように、１つの特に有用なＲＯＣＫ阻害剤はＹ２７６３２である。
【0054】
有効量のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、問題の阻害剤の利用能及び阻害定数によって変動することが当業者によって理解される。例えば、Ｙ２７６３２の場合、播種工程に使用される培地は１～５０μM、好ましくは２．５～４０μM、より好ましくは５～３０μM、更により好ましくは７．５～２０μM、最も好ましくは８～１２μM、最も好ましくは約１０μMのＹ２７６３２を含み得る。
【0055】
あらゆる受容体／酵素のアゴニスト又は阻害剤の有効濃度は、それぞれの化合物の利用能及び生物学的活性により変動することが理解される。
【0056】
上記に開示された方法とは別に、本発明は更に、該方法によって作製されたＢＨＭに関する。本発明者らのＢＨＭプロトコールで観察された増加した成熟度にも関わらず、ＢＨＭは依然として比較的未熟な組織であることも注記されるべきである。成人の心臓組織と比較して、ＢＨＭは依然として劣ったβ－ＭＨＣ／α－ＭＨＣ比を有し、前駆細胞遺伝子（例えばＩＳＬ１）の低いが依然として保持された発現を示す。しかし、適切な培養条件下で生物物理学的な刺激と共に長期培養することにより、更に成熟度は高められ得る。これはＢＨＭ系についても該当し得ることを示唆する形態学的な証拠がすでに存在する。
【0057】
本明細書に開示された方法によって得られたＢＨＭは、以下の特徴を示す：ＢＨＭは、少なくとも３Hzまでの複数の周波数でペーシングされ得、０．２mMより高く好ましくは４～８mMの生理学的範囲であるカルシウムＥＣ５０、及び２００μNを超える単収縮張力を示す。単収縮張力は、増加した静止長及び静止張力に応答して増加する。１μMのイソプレナリンに応答して、ＢＨＭは、０．６mMのカルシウムでペーシングされた条件下で４０μNを超える、好ましくは４５μNを超える、より好ましくは５０μNを超える変力応答を示す。簡潔に言えば、全ての収縮実験は、３７℃の浴槽中で、１２０mMのＮａＣｌ、１mMのＭｇＣｌ２、０．２mMのＣａＣｌ２、５．４mMのＫＣｌ、２２．６mMのＮａＨＣＯ３、４．２mMのＮａＨ２ＰＯ４、５．６mMのグルコース、及び０．５６mMのアスコルビン酸を含有するタイロード溶液中生理的ｐＨで行なわれる。カルシウムを、０．２Ｍの塩化カルシウム溶液を使用して調整する。ほぼ胎児の心拍数でペーシングするために、全てのＢＨＭを、２００mAの電流の５ms矩形波のパルスを用いて３Hzで分析する。刺激の周波数を変化させて、適切な力－周波数の応答（ボウディッチの機序）を確認する。ＢＨＭを、最大単収縮力が２mMのカルシウムで観察されるまで（フランク・スターリングの機序）、１２５μmの間隔で機械的に伸展させる。続いて、ＢＨＭを異なるカルシウム濃度（０．２、０．４、０．８、１．２、１．６、２．０、２．４mM）にかけ、単収縮力を記録する。イソプレナリン実験については、カルシウム濃度を０．６mMに調整し、続いて、イソプレナリン濃度を１μMに調整する。
【0058】
本明細書に開示された方法によって得られたＢＨＭの別の特徴は、それがＣＤ９０＋間質細胞を含むことである。ＣＤ９０の発現はフローサイトメトリーを使用して決定され得る。簡潔に言えば、細胞をエタノールを使用して固定し、ブロックし、次いで、ブロック緩衝液中でＣＤ９０（以下の表２参照）に対する一次抗体を用いて４５分間、場合により続いてブロック緩衝液中で二次抗体（一次抗体が蛍光標識されていない場合）及びヘキストを用いて４℃で３０分間（以下の表２参照）、染色する。ＢＤ ＬＳＲＩＩをフローサイトメトリー分析（BD Biosystems）に使用する。生細胞について集団を前方側方散乱プロファイルに基づいてゲートにかける。ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（BD Bioscience）又はCyflologic v1.2.1（Cyflo Ltd）を分析に使用する。
【0059】
ＢＨＭは、無血清環境において成熟を駆動する機序を調べるための良好なモデル系を提供し得、本発明者らはすでに、培養期間の延長により成熟度が増し得ることを示している（本発明者らは、イソプレナリン感度の増大及び組織形態の改善を示した）。機能を消失することなく長期間ＢＨＭを培養できることは（少なくとも６３日間）また、長期間の薬理学的安全性及び効力に関する実験が可能であることを示唆する。したがって、好ましい実施態様では、本明細書に開示された方法によって得られたＢＨＭは少なくとも６３日間維持され得る。
【0060】
分化及びそれに続く組織工学の従来アプローチを使用すると、心臓組織工学への適用のために必要とされる単細胞／小さな凝集塊を得るためには、分化培養物は、広範な消化プロトコールを必要とする。これらの消化プロトコールは、発生中に形成された細胞外環境及び空間的分布を破壊するので、心臓分化プロトコールに対する阻害作用を制御することが困難であり得る。
【0061】
モデルとしてＢＨＭを使用して、本発明者らは、初期発生に影響を及ぼす因子（ＡＳＣ－２－Ｐ、ドルソモルフィン）及び後期発生に影響を及ぼす因子（機械的刺激、ＦＧＦ２、ＴＧＦβ１、及びカルシウム濃度）が、ＢＨＭの機能及び特性に重大な影響を有したことを示した。それ故、本発明者らのＢＨＭプロトコールは、心臓発生だけでなく組織の形成及び特性を支配する発生プロセスの研究における有用なツールであり得る。
【0062】
したがって、本明細書に開示された方法によって得られたＢＨＭは、研究ツールとして適切に使用され得る。例えば、薬物毒性スクリーニングのためのインビトロモデルにおける、本明細書に開示された方法によって得られたＢＨＭの使用が考えられる。換言すれば、本明細書に開示された方法によって得られたＢＨＭをスクリーニングしようとする薬物と接触させる工程を含む、薬物毒性をスクリーニングするための方法が考えられる。或いは、本明細書に開示された方法によって得られたＢＨＭは、薬理学的候補薬剤による心臓機能調節を試験するためのインビトロ法に使用され得る。したがって、本発明に係るＢＨＭを薬理学的候補薬剤と接触させる工程を含む、心臓機能調節を試験するための方法も記載する。
【0063】
最後に、本明細書に開示された方法によって得られたＢＨＭを医薬に使用することができる。単に一例として、本明細書に開示された方法によって得られたＢＨＭは、有利には心臓の修復に使用することができると考えられる。
【0064】
本発明は更に、以下の実施態様によって記載される：
１．（ｉ）有効量の（ａ）ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、ＧＳＫ３阻害剤、及び（ｂ）０．５～５０mg/mlのアルブミン、１～１００μg/mlのトランスフェリン、０．１～１０μg/mlのエタノールアミン、０．００３～０．３μg/mlの亜セレン酸ナトリウム、０．４～４０μg/mlのＬ－カルニチンＨＣｌ、０．１～１０μg/mlのヒドロコルチゾン、０．０５～５μl/mlの脂肪酸サプリメント、０．０００１～０．１μg/mlのトリヨード－Ｌ－チロニン（Ｔ３）の最終濃度が得られる無血清サプリメントを含む、基本培地中で多能性幹細胞を培養し、これにより、該多能性幹細胞の中胚葉への分化を誘導する工程；
（ｉｉ）有効量のＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤及び（ｉ）におけるような無血清サプリメントを含む基本培地中で、工程（ｉ）で得られた細胞を培養し、これにより、該細胞の心臓への分化を誘導する工程；及び
（ｉｉｉ）機械的刺激下で有効量の（ｉ）におけるような無血清サプリメントを含む基本培地中で、工程（ｉｉ）で得られた細胞を培養し、これにより、心臓の成熟を促進する工程
を含む、多能性幹細胞から生物工学によって作られた心筋を作製するための方法。
１．（ｉ）有効量の（ａ）ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、ＧＳＫ３阻害剤、及び（ｂ）０．５～５０mg/mlのアルブミン、１～１００μg/mlのトランスフェリン、０．１～１０μg/mlのエタノールアミン、０．００３～０．３μg/mlの亜セレン酸ナトリウム、０．４～４０μg/mlのＬ－カルニチンＨＣｌ、０．１～１０μg/mlのヒドロコルチゾン、０．０５～５μl/mlの脂肪酸サプリメント、０．０００１～０．１μg/mlのトリヨード－Ｌ－チロニン（Ｔ３）の最終濃度が得られる無血清サプリメントを含む、基本培地中で多能性幹細胞を培養し、これにより、該多能性幹細胞の中胚葉への分化を誘導する工程；
（ｉｉ）有効量のＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤及び（ｉ）におけるような無血清サプリメントを含む基本培地中で、工程（ｉ）で得られた細胞を培養し、これにより、該細胞の心臓への分化を誘導する工程；及び
（ｉｉｉ）機械的刺激下で有効量の（ｉ）におけるような無血清サプリメントを含む基本培地中で、工程（ｉｉ）で得られた細胞を培養し、これにより、心臓の成熟を促進する工程
を含む、多能性幹細胞から生物工学によって作られた心筋を作製するための方法。
【0065】
２．多能性幹細胞が、霊長類を起源とする多能性幹細胞、好ましくはヒト多能性幹細胞である、実施態様１の方法。
【0066】
３．多能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び単為発生幹細胞から選択される、実施態様１又は２の方法。
【0067】
４．工程（ｉ）の基本培地が、１０～１０００μM、好ましくは５０～４００μM、より好ましくは１００～３００μM、更により好ましくは１５０～２５０μM、最も好ましくは約２００μMのアスコルビン酸又はその塩或いはその誘導体を含む、実施態様１～３のいずれか１つの方法。
【0068】
５．アスコルビン酸の塩又は誘導体が、アスコルビン酸－２－リン酸である、実施態様４の方法。
【0069】
６．工程（ｉ）が４８～９６時間行なわれ、好ましくは工程（ｉ）が６０～８４時間行なわれ、最も好ましくは工程（ｉ）が６６～７８時間行なわれる、実施態様１～５のいずれか１つの方法。
【0070】
７．工程（ｉ）の基本培地が、１～２０ng/ml、好ましくは２～１５ng/ml、より好ましくは２．５～１０ng/ml、より好ましくは３～８ng/ml、最も好ましくは４～６ng/ml、更に最も好ましくは約５ng/mlのＢＭＰ４を含む、実施態様１～６のいずれか１つの方法。
【0071】
８．工程（ｉ）の基本培地が、０．１～１０ng/ml、好ましくは１～９ng/ml、より好ましくは２～８ng/ml、更により好ましくは３～７ng/ml、最も好ましくは４～６ng/ml、更に最も好ましくは約５ng/mlのＦＧＦ２を含む、実施態様１～７のいずれか１つの方法。
【0072】
９．工程（ｉ）の基本培地が、１～２０ng/ml、好ましくは２．５～１８ng/ml、より好ましくは５～１６ng/ml、更により好ましくは７．５～１４ng/ml、更により好ましくは８～１２ng/ml、最も好ましくは８．５～１０ng/ml、更に最も好ましくは約９ng/mlのアクチビンＡを含む、実施態様１～８のいずれか１つの方法。
【0073】
１０．工程（ｉ）の基本培地中のＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＳＢ２１６７６３、ＴＷＳ１１９、チデグルシブ、ＳＢ４１５２８６、及びＬＹ２０９０３１４からなる群より選択される、実施態様１～９のいずれか１つの方法。
【0074】
１１．工程（ｉ）の基本培地中のＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、実施態様１０の方法。
【0075】
１２．工程（ｉ）の基本培地が、０．１～１０μMのＣＨＩＲ９９０２１、好ましくは０．２～９μM、より好ましくは０．３～８μM、更により好ましくは０．４～７μM、更により好ましくは０．５～６μM、より好ましくは０．６～５μM、より好ましくは０．７～４μM、より好ましくは０．８～３μM、最も好ましくは０．９～２μM、更に最も好ましくは約１μMのＣＨＩＲ９９０２１を含む、実施態様１１の方法。
【0076】
１３．工程（ｉ）の無血清サプリメントが、０．１～１０％のＢ２７又はインスリンを除いたＢ２７、好ましくは０．５～８％、より好ましくは１～６％、更により好ましくは１．５～４％、最も好ましくは約２％のＢ２７又はインスリンを除いたＢ２７を含む、実施態様１～１２のいずれか１つの方法。
【0077】
１４．工程（ｉ）に使用される基本培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＳｔｅｍＰｒｏ、イスコフ培地、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、及びＲＰＭＩである、実施態様１～１３のいずれか１つの方法。
【0078】
１５．工程（ｉ）に使用される基本培地が、ピルビン酸の補充されたＲＰＭＩである、請求項１４の方法。
【0079】
１６．工程（ｉｉ）の基本培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤が、ＩＷＰ４、ＩＷＰ２、ＩＷＲ－１、ＩＷＰ１、ＩＷＰ３、ＩＷＲ－２、ＩＷＲ－３、ＩＷＲ－４、ＩＷＲ－５、ＸＡＶ９３９、ＤＫＫ１、ケルセチン、ＩＣＧ－００１、ピルビニウム、ＣＣＴ０３１３７４、ｉＣＲＴ－３、５、１４、ＣＰＧ０４９０９０、ＮＣ０４３からなる群より選択され；好ましくは、ＩＷＰ４、ＩＷＰ２、ＩＷＲ－１、ＩＷＰ１、ＩＷＰ３、ＩＷＲ－２、ＩＷＲ－３、ＩＷＲ－４、ＩＷＲ－５、ＸＡＶ９３９、ＤＫＫ１からなる群より選択される、実施態様１～１５のいずれか１つの方法。
【0080】
１７．工程（ｉｉ）の基本培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤が、ＩＷＰ４である、実施態様１６の方法。
【0081】
１８．工程（ｉｉ）の基本培地が、０．１～１０μMのＩＷＰ４、好ましくは１～９μM、より好ましくは２～８μM、更により好ましくは３～７μM、更により好ましくは４～６μM、最も好ましくは約５μMのＩＷＰ４を含む、実施態様１７の方法。
【0082】
１９．工程（ｉｉ）の基本培地が、１０～１０００μM、好ましくは５０～４００μM、より好ましくは１００～３００μM、更により好ましくは１５０～２５０μM、最も好ましくは約２００μMのアスコルビン酸又はその塩或いはその誘導体を含む、実施態様１～１８のいずれか１つの方法。
【0083】
２０．アスコルビン酸の塩又は誘導体が、アスコルビン酸－２－リン酸である、実施態様１９の方法。
【0084】
２１．工程（ｉｉ）が８～１２日間行なわれ、好ましくは工程（ｉｉ）が９～１１日間行なわれ、最も好ましくは工程（ｉｉ）が１０日間行なわれる、実施態様１～２０のいずれか１つの方法。
【0085】
２２．工程（ｉｉ）の無血清サプリメントが、０．１～１０％のＢ２７又はインスリンを除いたＢ２７、好ましくは０．５～８％、より好ましくは１～６％、更により好ましくは１．５～４％、最も好ましくは約２％のＢ２７又はインスリンを除いたＢ２７を含む、実施態様１～２１のいずれか１つの方法。
【0086】
２３．工程（ｉｉ）に使用される基本培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＳｔｅｍＰｒｏ、イスコフ培地、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、及びＲＰＭＩである、実施態様１～２２のいずれか１つの方法。
【0087】
２４．工程（ｉｉ）に使用される基本培地が、ピルビン酸の補充されたＲＰＭＩである、実施態様２３の方法。
【0088】
２５．工程（ｉｉｉ）の基本培地が更に、１０～１０００μM、好ましくは５０～４００μM、より好ましくは１００～３００μM、更により好ましくは１５０～２５０μM、最も好ましくは約２００μMのアスコルビン酸又はその塩或いはその誘導体を含む、実施態様１～２４のいずれか１つの方法。
【0089】
２６．アスコルビン酸の塩又は誘導体が、アスコルビン酸－２－リン酸である、実施態様２５の方法。
【0090】
２７．工程（ｉｉｉ）が少なくとも７２時間行なわれ、好ましくは工程（ｉｉｉ）が１００日間未満行なわれ、より好ましくは工程（ｉｉｉ）が４～５０日間行なわれ、最も好ましくは工程（ｉｉｉ）が約１５日間行なわれる、実施態様１～２６のいずれか１つの方法。
【0091】
２８．工程（ｉｉｉ）の無血清サプリメントが、０．１～１０％のＢ２７又はインスリンを除いたＢ２７、好ましくは０．５～８％、より好ましくは１～６％７、更により好ましくは１．５～４％、最も好ましくは約２％のＢ２７又はインスリンを除いたＢ２７を含む、実施態様１～２７のいずれか１つの方法。
【0092】
２９．工程（ｉｉｉ）に使用される基本培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＳｔｅｍＰｒｏ、イスコフ培地、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、及びＲＰＭＩである、実施態様１～２８のいずれか１つの方法。
【0093】
３０．工程（ｉ）に使用される基本培地が、ピルビン酸の補充されたＲＰＭＩである、実施態様２９の方法。
【0094】
３１．工程（ｉｉｉ）の基本培地が更に、０．１～１０ng/mlのＴＧＦβ１、好ましくは０．２～９ng/ml、より好ましくは０．３～８ng/ml、更により好ましくは０．４～７ng/ml、更により好ましくは０．５～６ng/ml、より好ましくは０．６～５ng/ml、より好ましくは０．７～４ng/ml、より好ましくは０．８～３ng/ml、最も好ましくは０．９～２ng/ml、更に最も好ましくは約１ng/mlのＴＧＦβ１を含む、実施態様１～３０のいずれか１つの方法。
【0095】
３２．工程（ｉｉｉ）の基本培地が、有効量のＦＧＦ２を含まない、実施態様１～３１のいずれか１つの方法。
【0096】
３３．工程（ｉｉｉ）の基本培地が、０．５～３mMのＣａ２＋、好ましくは０．５～２．７５mMのＣａ２＋、より好ましくは１～２．２５mMのＣａ２＋、更により好ましくは１～１．５mMのＣａ２＋、最も好ましくは約１．２mMのＣａ２＋を含む、実施態様１～３２のいずれか１つの方法。
【0097】
３４．工程（ｉｉｉ）の機械的刺激が、動的な機械的刺激又は静的伸展である、実施態様１～３３のいずれか１つの方法。
【0098】
３５．工程（ｉｉｉ）の機械的刺激が、動的な機械的刺激である、実施態様３４の方法。
【0099】
３６．工程（ｉ）の前に播種工程を含み、多能性幹細胞が、適切な型に培地１mlあたり、２．５～６×１０６個の細胞／１mg コラーゲンの比で播種される、実施態様１～３５のいずれか１つの方法。
【0100】
３７．コラーゲンが、Ｉ型コラーゲンである、実施態様３６の方法。
【0101】
３８．前記コラーゲンが、ヒト起源、ブタ起源、又は海洋起源である、実施態様３６～３７のいずれか１つの方法。
【0102】
３９．播種工程に使用される培地が更に、ＲＯＣＫ阻害剤を含む、実施態様３６～３８のいずれか１つの方法。
【0103】
４０．ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ２７６３２、Ｈ－１１５２Ｐ、チアゾビビン、ファスジル、ヒドロキシファスジル、ＧＳＫ４２９２８６Ａ及びＲＫＩ－１４４７から選択され、好ましくはＹ２７６３２、Ｈ－１１５２Ｐ、チアゾビビン、ファスジル、ヒドロキシファスジルから選択され、より好ましくはＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ２７６３２又はＨ－１１５２Ｐであり、最も好ましくはＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ２７６３２である、実施態様３９の方法。
【0104】
４１．播種工程に使用される培地が、１～５０μM、好ましくは２．５～４０μM、より好ましくは５～３０μM、更により好ましくは７．５～２０μM、最も好ましくは８～１２μM、最も好ましくは約１０μMのＹ２７６３２を含む、実施態様４０の方法。
【0105】
４２．播種工程が、工程（ｉ）の１８～３０時間前に行なわれる、実施態様３６～４１のいずれか１つの方法。
【0106】
４３．実施態様１～４２のいずれか１つに係る方法によって作製された生物工学によって作られたヒト心筋（ＢＨＭ）。
【0107】
４４．少なくとも３Hzまでの複数の周波数でペーシングされ得る、実施態様４３のＢＨＭ。
【0108】
４５．増加した静止長及び静止張力に応答して、増加した単収縮張力を示す、実施態様４３又は４４のＢＨＭ。
【0109】
４６．０．２mMより高いカルシウムＥＣ５０を示す、実施態様４３～４５のいずれか１つのＢＨＭ。
【0110】
４７．２００μNを超える単収縮張力を示す、実施態様４３～４６のいずれか１つのＢＨＭ。
【0111】
４８．０．６mMのカルシウムでのペーシング条件下で１μMのイソプレナリンに対して４０μNを超える、好ましくは４５μNを超える、より好ましくは５０μNを超える変力応答を示す、実施態様４３～４７のいずれか１つのＢＨＭ。
【0112】
４９．心筋細胞及びＣＤ９０＋間質細胞を含む、実施態様４３～４８のいずれか１つのＢＨＭ。
【0113】
５０．少なくとも６２日間維持することができる、実施態様４３～４９のいずれか１つのＢＨＭ。
【0114】
５１．薬物毒性スクリーニングのためのインビトロモデルにおける、実施態様４３～５０のいずれか１つに係る生物工学によって作られたヒト心筋（ＢＨＭ）の使用。
【0115】
５２．薬理学的候補薬剤による心臓機能調節を試験するためのインビトロ法における、実施態様４３～５０のいずれか１つに係る生物工学によって作られたヒト心筋（ＢＨＭ）の使用。
【0116】
５３．研究ツールとしての、実施態様４３～５０のいずれか１つに係る生物工学によって作られたヒト心筋（ＢＨＭ）の使用。
【0117】
５４．医薬に使用するための、実施態様４３～５０のいずれか１つに係る生物工学によって作られたヒト心筋（ＢＨＭ）。
【0118】
５５．心臓の修復に使用するための、実施態様４３～５０のいずれか１つに係る生物工学によって作られたヒト心筋（ＢＨＭ）。
【0119】
以下の実施例は、本発明を更に説明するためであって、本発明を制限する意味はない。実施例は様々な技術的特徴を含み、本発明はまた、この例示的な章で提示された技術的特徴の組合せにも関することが理解される。
【実施例】
【0120】
心臓への分化は、初期の心臓の中胚葉への誘導の最適化を必要とする
筋細胞ではない細胞画分又は間質細胞が、工学によって作られた心臓組織の機能にとって必須であることが示されている。この理由から、心筋細胞及び線維芽細胞／間質細胞を持続的に産生する心臓分化プロトコールがまず必要とされた。本発明者らは、以前に公表された無血清の二次元ｈＰＳＣ分化プロトコールに基づいて、収率及びコンシステンシーの両方に関して、その心臓分化プロトコール（図１ａ）を最適化した（Hudson et al. Stem Cells Dev 21, 1513-1523 (2012)）。中胚葉誘導期の間にＷＮＴ活性を安定化させれば、強さ及び効率を増強させることができると考えられた。中胚葉誘導のための代理マーカーとして、ＭＥＳＰ１発現を培養３日目にｑＰＣＲによって分析した；これに続いて、１６日目にα－アクチニン（心筋細胞マーカー）についてフローサイトメトリーを行ない、これは拍動活動の量と非常に良く相関していることが判明した。以前に公表されたプロトコールから新規なプロトコールへの進歩に関する最も重要な工程を図１に要約する。
筋細胞ではない細胞画分又は間質細胞が、工学によって作られた心臓組織の機能にとって必須であることが示されている。この理由から、心筋細胞及び線維芽細胞／間質細胞を持続的に産生する心臓分化プロトコールがまず必要とされた。本発明者らは、以前に公表された無血清の二次元ｈＰＳＣ分化プロトコールに基づいて、収率及びコンシステンシーの両方に関して、その心臓分化プロトコール（図１ａ）を最適化した（Hudson et al. Stem Cells Dev 21, 1513-1523 (2012)）。中胚葉誘導期の間にＷＮＴ活性を安定化させれば、強さ及び効率を増強させることができると考えられた。中胚葉誘導のための代理マーカーとして、ＭＥＳＰ１発現を培養３日目にｑＰＣＲによって分析した；これに続いて、１６日目にα－アクチニン（心筋細胞マーカー）についてフローサイトメトリーを行ない、これは拍動活動の量と非常に良く相関していることが判明した。以前に公表されたプロトコールから新規なプロトコールへの進歩に関する最も重要な工程を図１に要約する。
【0121】
以前のプロトコールでは、最初の３日間はＢＭＰ４及びアクチビン－Ａを用いた心臓の中胚葉への誘導、次いで、ＷＮＴ阻害剤のＩＷＰ４を使用した心臓への特異化を使用していた（Hudson et al Stem Cells Dev 21, 1513-1523 (2012)）。ｈＰＳＣを使用した近年の研究における初期中胚葉形成及びインビボでの発生のためにＦＧＦ２が必要不可欠であることと一致して、分化の最初の３日間の最中に５ng/mlのＦＧＦ２を添加することにより、ＭＥＳＰ１の発現が増加する傾向（図１ｂ）が、続いてα－アクチニンが増加する傾向（図１ｃ）が得られた。しかし、コンシステンシー及び分化を向上させるのを助けるのは強制されたＷＮＴシグナル伝達であり、これは初期中胚葉の誘導におけるその不可欠な役割と一致する。ＷＮＴシグナル伝達を強制するために、古典的ＷＮＴ阻害剤の存在下でさえＷＮＴシグナル伝達を誘導するＧＳＫ３βの小分子阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１を使用した。ＣＨＩＲは、単独で又は図１ｂ、ｃで使用される分化因子と共に、全く拍動活動を誘導することができなかった。ＢＭＰ４濃度を変化させると、ＭＥＳＰ１発現（図１ｄ）及びα－アクチニン発現（図１ｅ）の最適かつ一貫した発現誘導が、５ng/mlのＢＭＰ４濃度で認められた。その後、分化プロトコールから各因子を個々に除去することにより、ＭＥＳＰ１の効率的かつ一貫した誘導（図１ｆ）、続いてα－アクチニンの発現（図１ｇ）におけるその必要性が示された。
【0122】
ＢＨＭを形成するために、間質細胞集団が存在することも重要である。それ故、間質細胞又は他の混入している可能性のある細胞型が最適化された分化プロトコールに存在するかどうかを調べた。非常に低いレベルの混入している可能性のある細胞集団が認められ、ｈＰＳＣ（ＰＯＵ５Ｆ１としても知られるＯＣＴ４）（図１ｈ）、内胚葉（ＳＯＸ１７）（図１ｉ）、神経（ＮＥＵＲＯＤ１）（図１ｊ）、及び初期中胚葉（ＭＥＳＰ１）（データは示されていない）についてｑＰＣＲを使用して分析した。他の条件（全く因子を含まないか又はＩＷＰ４を含まない、データは示されていない）と比較して、ＮＫＸ２－５及びβ－ＭＨＣ（ＭＹＨ７としても知られる）の非常に高い発現が本発明の心臓分化培養物に認められた。更に、心筋細胞（図１ｋ－１）及び異なる間質細胞型（α－平滑筋アクチン陽性細胞（α－ＳＭＡ＋）、Ｉ型コラーゲン陽性細胞（ＣＯＬＩ＋）細胞、及びα－ＳＭＡ＋ＣＯＬＩ＋細胞を含む）の両方が存在していたことが判明した（図１ｍ、ｎ）。要するに、このデータは、本発明の心臓分化プロトコールが心筋細胞を効率的に産生し、残りの細胞は主に間質細胞であり、したがって、組織工学操作適用のために必要とされる細胞組成がもたらされることを示唆する。
【0123】
ＢＨＭの定方向の形成
心臓分化プロトコールの最適化後、ｈＰＳＣから直接ＢＨＭを形成することができるかどうかの仮説を試験した。新規な無血清心臓分化プロトコール（図１）を追加の成熟工程と共に使用し、そこでは、弁輪を型から取り出し、静的伸展装置（緩んだ長さの＋１０％）上の、５ng/mlのＦＧＦ２及び２００μMのアスコルビン酸－２－リン酸（ＡＳＣ－２－Ｐ）を含有する培地中に置いた。このプロトコールはＢＨＭを形成するのに効果的であることが判明した（図２ａ）。ＢＨＭは１３日目までに異なる領域で自発的に収縮し始め、１５～１７日目までに収縮は同期的かつ律動的となり、２２日目の分析まで持続した（データは示されていない）。ＢＨＭにおける心筋細胞は伸展し横紋の付いた形態を有し（図２ｂ）、ＢＨＭは電気的にペーシングでき、カルシウム濃度に対する応答性と共に測定可能な収縮力を有していた（図２ｃ）。
心臓分化プロトコールの最適化後、ｈＰＳＣから直接ＢＨＭを形成することができるかどうかの仮説を試験した。新規な無血清心臓分化プロトコール（図１）を追加の成熟工程と共に使用し、そこでは、弁輪を型から取り出し、静的伸展装置（緩んだ長さの＋１０％）上の、５ng/mlのＦＧＦ２及び２００μMのアスコルビン酸－２－リン酸（ＡＳＣ－２－Ｐ）を含有する培地中に置いた。このプロトコールはＢＨＭを形成するのに効果的であることが判明した（図２ａ）。ＢＨＭは１３日目までに異なる領域で自発的に収縮し始め、１５～１７日目までに収縮は同期的かつ律動的となり、２２日目の分析まで持続した（データは示されていない）。ＢＨＭにおける心筋細胞は伸展し横紋の付いた形態を有し（図２ｂ）、ＢＨＭは電気的にペーシングでき、カルシウム濃度に対する応答性と共に測定可能な収縮力を有していた（図２ｃ）。
【0124】
ＢＨＭの発生は公知の発生経路を辿った。ｈＰＳＣは大部分、３日目までに分化し、これはＴＲＡ－１－６０＋／ＯＣＴ４＋細胞の減少及びＯＣＴ４発現の減少（図２ｄ、ｆ）、並びに、初期中胚葉マーカーであるＭＩＸＬ１及びＭＥＳＰ１の同時発現（図２ｆ）によって示される。α－アクチニン＋細胞（図２ｄ）及び心筋細胞前駆細胞マーカー発現（図２ｆ）は同時に増加しつつ、８日目までにＭＩＸＬ１及びＭＥＳＰ１の発現は無くなる（図２ｆ）。ＴＢＸ５（１３日目にピーク）、ＩＳＬ１（８日目にピーク）及びＮＫＸ２－５（１３日目にピーク）を含む、心発生に関与する複数の転写因子の発現にピークが存在した（図２ｆ）。これに続いて、より成熟した心臓マーカーであるα－ＭＨＣ（ＭＹＨ６としても知られる）、β－ＭＨＣ、ＡＮＰ（ＮＰＰＡとしても知られる）、及びＭＬＣ２ｖ（ＭＹＬ２としても知られる）が発現した（図２ｆ）。興味深いことに、α－ＭＨＣの発現は１３日目にピークに達し、その後、２２日目までにβ－ＭＨＣが大きく増加し、したがって、β－ＭＨＣ／α－ＭＨＣ比は増大した（図２ｆ）。更に、２２日目には内胚葉マーカー及び神経マーカーの発現は殆どなかった（図２ｆ）。要するに、このデータは、ＢＨＭの発生が公知の発生経路を辿っただけでなく、前駆細胞遺伝子発現の低下、増加したβ－ＭＨＣ発現及びβ－ＭＨＣ／α－ＭＨＣ発現比、並びに増加したＭＬＣ２ｖ発現（成熟度を示す、Tiburcy et al. Circ Res 109, 1105-1114（2011）参照）によって示されるように心臓の成熟が起こることも示唆する。更に、２２日目にＢＨＭは３０±６％（ｎ＝４回の実験）の心筋細胞及び高い比率の間質細胞から構成されていることが判明した（図２ｄ）。代表的なフローサイトメトリープロットを図５に示す。
【0125】
ＢＨＭ機能の最適化
図２に概略が示されたＢＨＭプロトコールは、ｈＰＳＣの増殖及び生物工学によって作られた心筋形成の初めての完全に無血清のプロセスを示す一方、本発明者らは、最適化により、より高い機能及びより高いコンシステンシーを有する組織を発生させることができると仮定した。これらの実験のために収縮強度（単収縮張力／収縮力）を第一の機能決定因子として使用した。なぜなら、単収縮張力は、心筋細胞の数及び表現型、線維芽細胞の数及び表現型、組織結合性、ＥＣＭ組成、細胞間結合性、及びＥＣＭ－細胞の結合性を含む、多種多様な心筋特性に依存するからである。第二の因子として、本発明者らは、１）静止張力、なぜならそれは間質細胞の機能及び細胞外マトリックス生物学を反映するため、２）心筋細胞サイズ、薬理学的刺激などの刺激の故に、及び３）細胞組成（心筋細胞：間質細胞）（これは収縮能力の重要な決定因子である）を使用した。変化させたパラメーターを図３に示す。
図２に概略が示されたＢＨＭプロトコールは、ｈＰＳＣの増殖及び生物工学によって作られた心筋形成の初めての完全に無血清のプロセスを示す一方、本発明者らは、最適化により、より高い機能及びより高いコンシステンシーを有する組織を発生させることができると仮定した。これらの実験のために収縮強度（単収縮張力／収縮力）を第一の機能決定因子として使用した。なぜなら、単収縮張力は、心筋細胞の数及び表現型、線維芽細胞の数及び表現型、組織結合性、ＥＣＭ組成、細胞間結合性、及びＥＣＭ－細胞の結合性を含む、多種多様な心筋特性に依存するからである。第二の因子として、本発明者らは、１）静止張力、なぜならそれは間質細胞の機能及び細胞外マトリックス生物学を反映するため、２）心筋細胞サイズ、薬理学的刺激などの刺激の故に、及び３）細胞組成（心筋細胞：間質細胞）（これは収縮能力の重要な決定因子である）を使用した。変化させたパラメーターを図３に示す。
【0126】
ＡＳＣ－２－Ｐは、ＢＨＭの機能を増強する
アスコルビン酸（ビタミンＣ）はコラーゲンの適切な合成において主要な役割を果たし、かつ抗酸化剤である。それ故、初期のＢＨＭ培養の間に０～１３日目に補充されたアスコルビン酸（より安定なＡＳＣ－２－Ｐの形態で）（それは図２で１３～２２日目の間にすでに添加されていた）は、発生中のコラーゲンの重要性があるとすれば、ＢＨＭの機能にプラスの影響を及ぼすだろうと仮定された。ＡＳＣ－２－ＰはＢＨＭの単収縮張力／収縮力を有意に向上させ（図３ａ）、間質細胞画分に変化を全く及ぼすことなく、心筋細胞画分を増加させる傾向を誘導する（図３ｂ）ことが判明した。また、全分化プロトコール中にＡＳＣ－２－Ｐを補充することにより、心臓分化効率を変化させることなく細胞数を有意に増加させることによって、本発明者らの二次元プロトコールの分化は改良されたことが判明した（データは示されていない）。それ故、二次元及びＢＨＭフォーマットの両方において、ＡＳＣ－２－Ｐは、近年の研究（Cao et al. Cell Res 22, 219-236 (2012)）において提案されているように細胞生存率及び／又は前駆細胞増殖を高めたのかもしれない。
アスコルビン酸（ビタミンＣ）はコラーゲンの適切な合成において主要な役割を果たし、かつ抗酸化剤である。それ故、初期のＢＨＭ培養の間に０～１３日目に補充されたアスコルビン酸（より安定なＡＳＣ－２－Ｐの形態で）（それは図２で１３～２２日目の間にすでに添加されていた）は、発生中のコラーゲンの重要性があるとすれば、ＢＨＭの機能にプラスの影響を及ぼすだろうと仮定された。ＡＳＣ－２－ＰはＢＨＭの単収縮張力／収縮力を有意に向上させ（図３ａ）、間質細胞画分に変化を全く及ぼすことなく、心筋細胞画分を増加させる傾向を誘導する（図３ｂ）ことが判明した。また、全分化プロトコール中にＡＳＣ－２－Ｐを補充することにより、心臓分化効率を変化させることなく細胞数を有意に増加させることによって、本発明者らの二次元プロトコールの分化は改良されたことが判明した（データは示されていない）。それ故、二次元及びＢＨＭフォーマットの両方において、ＡＳＣ－２－Ｐは、近年の研究（Cao et al. Cell Res 22, 219-236 (2012)）において提案されているように細胞生存率及び／又は前駆細胞増殖を高めたのかもしれない。
【0127】
ＢＨＭの機能は、機械的刺激レジメに依存する
次に、静的伸展及び動的な機械的刺激がＢＨＭの機能にどのように影響を及ぼすかを評価した。静的伸展及び動的な機械的刺激のために使用される装置を図３ｄに示す。静的伸展及び動的な機械的刺激の両方が、ＢＨＭの単収縮張力／収縮力を有意に増加させ、両方の機械的刺激レジメにより、同じようなＢＨＭ単収縮張力がもたらされた（図３ｃ）。両方の機械的刺激レジメが、ＢＭＨの心筋細胞の形態を改善し、緻密で伸展した横紋筋筋束の形成を引き起こした（図３ｄ）。動的な機械的刺激が静的伸展より好ましかった。なぜなら、それは増張力性収縮を促進するからである（Zimmermann et al, Nat Med 12, 452-458 (2006)）。
次に、静的伸展及び動的な機械的刺激がＢＨＭの機能にどのように影響を及ぼすかを評価した。静的伸展及び動的な機械的刺激のために使用される装置を図３ｄに示す。静的伸展及び動的な機械的刺激の両方が、ＢＨＭの単収縮張力／収縮力を有意に増加させ、両方の機械的刺激レジメにより、同じようなＢＨＭ単収縮張力がもたらされた（図３ｃ）。両方の機械的刺激レジメが、ＢＭＨの心筋細胞の形態を改善し、緻密で伸展した横紋筋筋束の形成を引き起こした（図３ｄ）。動的な機械的刺激が静的伸展より好ましかった。なぜなら、それは増張力性収縮を促進するからである（Zimmermann et al, Nat Med 12, 452-458 (2006)）。
【0128】
心筋細胞の特性は、外的な増殖因子に依存する
ＦＧＦ２を添加した場合には単収縮張力／収縮力は減少する傾向があり、ＴＧＦβ１を添加した場合には単収縮張力は増加する傾向があった（図３ｆ）。それ故、ＦＧＦ２を心臓成熟中に添加した以前の実験では、これは実際には有害なＢＨＭ機能を有するかもしれなかった。ＦＧＦ２及びＴＧＦβ１の両方が、心筋細胞のサイズの増加を誘導したことが判明した（図３ｇ）。ＴＧＦβ１の添加により、より成熟したβ－ＭＨＣ／α－ＭＨＣ発現比が得られた（ヒト心臓＝９）（図３ｈ）一方で、病的肥大マーカーであるＡＮＰ（ＮＰＰＡとしても知られる）は減少した（図３ｉ）。ＦＧＦ２の添加はβ－ＭＨＣ／α－ＭＨＣ発現比を変化させなかったが（図３ｈ）、（変動的に）病的な肥大マーカーのＡＮＰを誘導した（図３ｉ）。要するに、これは、両方の因子が肥大を誘導することを示し、これはインビボの結果と一致する。しかし、ＦＧＦ２は病理学的肥大の誘導因子と考えられ得るが、一方、ＴＧＦβ１は生理学的肥大の誘導因子と考えられ得る。
ＦＧＦ２を添加した場合には単収縮張力／収縮力は減少する傾向があり、ＴＧＦβ１を添加した場合には単収縮張力は増加する傾向があった（図３ｆ）。それ故、ＦＧＦ２を心臓成熟中に添加した以前の実験では、これは実際には有害なＢＨＭ機能を有するかもしれなかった。ＦＧＦ２及びＴＧＦβ１の両方が、心筋細胞のサイズの増加を誘導したことが判明した（図３ｇ）。ＴＧＦβ１の添加により、より成熟したβ－ＭＨＣ／α－ＭＨＣ発現比が得られた（ヒト心臓＝９）（図３ｈ）一方で、病的肥大マーカーであるＡＮＰ（ＮＰＰＡとしても知られる）は減少した（図３ｉ）。ＦＧＦ２の添加はβ－ＭＨＣ／α－ＭＨＣ発現比を変化させなかったが（図３ｈ）、（変動的に）病的な肥大マーカーのＡＮＰを誘導した（図３ｉ）。要するに、これは、両方の因子が肥大を誘導することを示し、これはインビボの結果と一致する。しかし、ＦＧＦ２は病理学的肥大の誘導因子と考えられ得るが、一方、ＴＧＦβ１は生理学的肥大の誘導因子と考えられ得る。
【0129】
さらなる一連の実験では、本発明者らは、心臓成熟期中に漸増するＴＧＦβ－１を培養培地に補充することは、ＢＨＭの収縮機能に影響を及ぼすかどうかを調べた。本発明者らは、濃度依存的なＢＨＭの収縮機能の増強を観察した（図１０）。
【0130】
以前の実験では、本発明者らは、二次元プロトコールと比較して、ＢＨＭ中のα－平滑筋アクチン及びＩ型コラーゲン陽性細胞の大きな減少を認めた（図１ｎ対図２ｅ）。これは、二次元培養及びＢＨＭ培養における筋線維芽細胞／線維芽細胞の分化における僅かな差異の反映であり得る。ｈＰＳＣから得られた二次元培養及びＢＨＭ心臓分化培養物中において心臓線維芽細胞様集団をより均一に検出するために、基準のＣＤ９０（ＴＨＹ１としても知られる）に対する抗体をその後の実験で使用した。
【0131】
細胞外カルシウムを生理学的濃度に調整することにより、ＢＨＭの機能は向上した
ヒト血清中のカルシウム濃度は、それぞれ全カルシウム及びイオン化カルシウムについて、生理学的カルシウム濃度が２．２５～２．７５mM、及び１．０～１．２mMとなるように緊密に調節されている。ＲＰＭＩ培地中のカルシウム濃度は、生理学的カルシウムと比較して極めて低い（０．４２mM）ので、それ故、遊離カルシウム濃度の調整がＢＨＭの成熟及び機能の両方を向上させるかどうかを評価した。カルシウムを（０．２ＭのＣａＣｌ２溶液を使用して）１．２mMに調整すると、ＢＨＭの単収縮張力は大きく増加した（図３ｊ）。更に、静止張力（図３ｋ）及び弾性率（図３ｌ）の増加が観察された。最適な弾性率は、収縮中に心筋細胞によってなされる機械的仕事を高めることが示され、これは収縮力を増加させ得る。増加したカルシウムに応答した増加した弾性率の背景の機序は現在不明である。重要なことには、ｑＰＣＲを使用して評価されたカルシウムハンドリングタンパク質に変化は全くなかったことが注記されるべきである（ＣＡＳＱ２、ＰＬＮ、ＡＴＰ２Ａ２、及びＲＹＲ２、データは示されていない、ｎ＝３回の実験）。
ヒト血清中のカルシウム濃度は、それぞれ全カルシウム及びイオン化カルシウムについて、生理学的カルシウム濃度が２．２５～２．７５mM、及び１．０～１．２mMとなるように緊密に調節されている。ＲＰＭＩ培地中のカルシウム濃度は、生理学的カルシウムと比較して極めて低い（０．４２mM）ので、それ故、遊離カルシウム濃度の調整がＢＨＭの成熟及び機能の両方を向上させるかどうかを評価した。カルシウムを（０．２ＭのＣａＣｌ２溶液を使用して）１．２mMに調整すると、ＢＨＭの単収縮張力は大きく増加した（図３ｊ）。更に、静止張力（図３ｋ）及び弾性率（図３ｌ）の増加が観察された。最適な弾性率は、収縮中に心筋細胞によってなされる機械的仕事を高めることが示され、これは収縮力を増加させ得る。増加したカルシウムに応答した増加した弾性率の背景の機序は現在不明である。重要なことには、ｑＰＣＲを使用して評価されたカルシウムハンドリングタンパク質に変化は全くなかったことが注記されるべきである（ＣＡＳＱ２、ＰＬＮ、ＡＴＰ２Ａ２、及びＲＹＲ２、データは示されていない、ｎ＝３回の実験）。
【0132】
最適化されたプロトコールを使用して作製されたＢＨＭは、インビボ様特性を示す
ＢＨＭは自発的かつ理路整然と収縮し、心臓発生中に観察された拍動周波数の範囲を網羅する、少なくとも３Hzまでの複数の周波数で電気的にペーシングできた（図４ａ）。ＢＨＭはまた、増加した静止長（及び静止張力）に応答して単収縮張力（収縮力）を増加させ、これはフランク・スターリングの機序に一致する（図４ｂ）。培養時間を延長すると、以前のデータと比較してＢＨＭ単収縮張力に変化は全く認められなかったが、０．２から０．７mmol/LへのカルシウムＥＣ５０の増加が観察された（図４ｃ）。また、培養期間延長により、１μMのイソプレナリンに対する変力応答は増加し、このことは、増加が全く観察されなかった従来の培養フォーマットを上回る向上した成熟度を示す（図４ｄ～ｆ）。ホールマウント免疫染色を使用して、ＢＨＭはまた、筋束に存在する間質細胞及び内皮細胞の両方を有することが判明した（データは示されていない）。重要なことには、ＢＨＭ培養物はまた、成熟条件下で長期間（少なくとも６３日目まで）維持することができ、形態学的外見に改善が観察された（データは示されていない）。
ＢＨＭは自発的かつ理路整然と収縮し、心臓発生中に観察された拍動周波数の範囲を網羅する、少なくとも３Hzまでの複数の周波数で電気的にペーシングできた（図４ａ）。ＢＨＭはまた、増加した静止長（及び静止張力）に応答して単収縮張力（収縮力）を増加させ、これはフランク・スターリングの機序に一致する（図４ｂ）。培養時間を延長すると、以前のデータと比較してＢＨＭ単収縮張力に変化は全く認められなかったが、０．２から０．７mmol/LへのカルシウムＥＣ５０の増加が観察された（図４ｃ）。また、培養期間延長により、１μMのイソプレナリンに対する変力応答は増加し、このことは、増加が全く観察されなかった従来の培養フォーマットを上回る向上した成熟度を示す（図４ｄ～ｆ）。ホールマウント免疫染色を使用して、ＢＨＭはまた、筋束に存在する間質細胞及び内皮細胞の両方を有することが判明した（データは示されていない）。重要なことには、ＢＨＭ培養物はまた、成熟条件下で長期間（少なくとも６３日目まで）維持することができ、形態学的外見に改善が観察された（データは示されていない）。
【0133】
改変されていないＢＨＭプロトコールは、複数のヒト多能性幹細胞株に対して効果を発揮する
次に、最適化されたＢＨＭプロトコール（図５）及び二次元プロトコール（図６）は、複数のｈＰＳＣ株に対して効果を発揮することが示された。これらの分析のために、ＨＥＳ２、ＨＥＳ３及びｈＩＰＳ－Ｇ１株（ベクターを含まないCytotune初期化キットを使用して初期化された歯の線維芽細胞）を使用した。二次元プロトコール及びＢＨＭプロトコールの両方について、播種する細胞数の変更又はＲｈｏ結合プロテインキナーゼ阻害剤（１０μM、Ｙ－２７６３２）の使用が、最初の２４時間の播種期後に全ての株において同じような細胞密度を達成するのに必要とされたことが判明したことを注記することは重要である（データは示されていない）。特定の細胞株について必要とされる播種プロトコールを使用する場合、二次元プロトコール及びＢＨＭプロトコールをそうした株のために改変せずに使用することができた。
次に、最適化されたＢＨＭプロトコール（図５）及び二次元プロトコール（図６）は、複数のｈＰＳＣ株に対して効果を発揮することが示された。これらの分析のために、ＨＥＳ２、ＨＥＳ３及びｈＩＰＳ－Ｇ１株（ベクターを含まないCytotune初期化キットを使用して初期化された歯の線維芽細胞）を使用した。二次元プロトコール及びＢＨＭプロトコールの両方について、播種する細胞数の変更又はＲｈｏ結合プロテインキナーゼ阻害剤（１０μM、Ｙ－２７６３２）の使用が、最初の２４時間の播種期後に全ての株において同じような細胞密度を達成するのに必要とされたことが判明したことを注記することは重要である（データは示されていない）。特定の細胞株について必要とされる播種プロトコールを使用する場合、二次元プロトコール及びＢＨＭプロトコールをそうした株のために改変せずに使用することができた。
【0134】
ＨＥＳ３株及びｈＩＰＳ株の両方が、ＨＥＳ２株（図３ｊ）と比較して低い単収縮張力（図５ａ、ｄ）を有するＢＨＭを産生したことが判明した。しかし、ＨＥＳ３及びｈＩＰＳ ＢＨＭの両方が同じような形態を有していた（図５ｂ、ｅ）。ＨＥＳ３ ＢＨＭの心筋細胞画分はＨＥＳ２ ＢＨＭと比較して類似し（図５ｃ）、ｈＩＰＳ ＢＨＭの心筋細胞画分はＨＥＳ２ ＢＨＭと比較して低かった（図５ｆ）。これらの株に由来するＢＨＭにおける低下した機能は、ＨＥＳ２ ＢＨＭ（０．７４±０．１３×１０６個の細胞、３回の実験に由来するｎ＝６）と比較して、ＨＥＳ３ ＢＨＭ（０．５０±０．０３×１０６個の細胞、ｎ＝３）及びｈＩＰＳ ＢＨＭ（０．５５±０．０５×１０６個の細胞、ｎ＝３）におけるより少ない細胞数に起因する可能性が最も高い。それ故、同じ株での異なる処理ではなくむしろ異なる細胞株を評価する場合には、細胞数及び組成の変化によって引き起こされる差を除外するように注意を払わなければならない。
【0135】
発生モデルとしてのＢＨＭにより、ＢＭＰシグナル伝達がヒト心筋細胞の最終分化に必要とされることが判明する
ＢＭＰシグナル伝達の阻害は、効果が様々な遺伝子によって駆動されるＣＲＥを使用して発生中の心臓に限定（又は少なくとも部分的に限定）されている場合でさえ、胚にとって致命的である（総説についてはKruithof et al. Differentiation 84, 89-102 (2012)を参照されたい）。これらの研究では、構造的欠陥、梁柱構造及び壁厚を含む心筋特性、並びに、前駆細胞遺伝子の調節異常及び減少した上皮間葉転換（ＥＭＴ）を含む細胞表現型、を含むＢＭＰシグナル伝達に起因する複数のプロセスが認められた。それ故、全身への影響及び解剖学的な制限を伴うことなく純粋に心筋発生に対するＢＭＰシグナル伝達の効果を決定するために、ＢＨＭは良いモデル系であると考えられた。
ＢＭＰシグナル伝達の阻害は、効果が様々な遺伝子によって駆動されるＣＲＥを使用して発生中の心臓に限定（又は少なくとも部分的に限定）されている場合でさえ、胚にとって致命的である（総説についてはKruithof et al. Differentiation 84, 89-102 (2012)を参照されたい）。これらの研究では、構造的欠陥、梁柱構造及び壁厚を含む心筋特性、並びに、前駆細胞遺伝子の調節異常及び減少した上皮間葉転換（ＥＭＴ）を含む細胞表現型、を含むＢＭＰシグナル伝達に起因する複数のプロセスが認められた。それ故、全身への影響及び解剖学的な制限を伴うことなく純粋に心筋発生に対するＢＭＰシグナル伝達の効果を決定するために、ＢＨＭは良いモデル系であると考えられた。
【0136】
これらの実験では、２μmol/LのＢＭＰ受容体シグナル伝達阻害剤のドルソモルフィンを６日目以降に各培地を交換しながら加えた。１３日目にドルソモルフィンで処置されたＢＨＭはＩＳＬ１をダウンレギュレートすることができなかったが、他のより成熟した心臓マーカーであるＮＫＸ２－５及びα－ＭＨＣの発現は変化しなかった（図７ａ）。ＥＭＴ関連遺伝子を調べると、ＣＤＨ１、ＣＨＤ２、ＳＮＡＩＬ１、又はＴＧＦβ２の発現に変化は全くなかったことが判明し、このことは、ＢＨＭにおいてＥＭＴ又はＥＭＴを調節する因子は、１３日目以後に変化しなかったことを示す（図７ａ）。２２日後にフローサイトメトリーを使用して、ドルソモルフィン処置群において活動的な細胞周期にあるより多くの心筋細胞が存在したことが判明した（図７ｂ）。しかし、ドルソモルフィンでの処置は、心筋細胞数を変化させなかったことが判明した（図７ｃ）。また、ドルソモルフィン処置群において、１つのＢＨＭあたりの総細胞数、並びに心筋細胞（α－アクチニン＋）及び間質細胞（ＣＤ９０＋）の画分は変化しなかったことが判明した（データは示されていない）。これらの類似性にも関わらず、ドルソモルフィン処置ＢＨＭでは対照群の４７％まで単収縮張力／収縮力の大きな減少があった（図７ｄ）。興味深いことに、ドルソモルフィン処置ＢＨＭでは、イソプレナリンに対するＢＨＭ応答性の変化も、心筋細胞のサイズの変化もなかった（データは示されていない）。
【0137】
増加した細胞周期の活動は、増加した心筋細胞数及び低下した単収縮張力をもたらさなかったので、酸素濃度がＢＨＭにおける心筋細胞数を制限し得るかどうかを計算した。これが事実であったかどうかを決定するために、数学的にモデル化された酸素拡散プロファイルは、文献に報告されたモデル及び異なるＢＨＭ条件のパラメーター（細胞数、心筋細胞画分及びサイズ）に基づいた。心筋細胞数が１２５％まで増加したとしても、対照ＢＨＭについてのパラメーターを使用した場合、低酸素領域は存在しなかったことが判明した（データは示されていない）。
【0138】
まとめると、本データは、ドルソモルフィンを使用したＢＭＰ阻害により、増加した増殖状態がもたらされることを示唆し、これはマウスのインビボでの実験と一致する結果である。しかし、心筋細胞数は全く増加せず、このことは、アポトーシスが増加しているか又は心筋細胞が２つ核を有するかのいずれかであることを示す。機序に関わらず、ＢＭＰシグナル伝達の阻害により、より弱い収縮力（及びまた、１つの心筋細胞あたりより低い力）及び劣った心筋組織を生じる組織表現型に再現性が得られた。
【0139】
Ｂ２７（登録商標）に置き換わるカスタムメイドなサプリメント
ＢＨＭは、標準的なＢＨＭプロトコールに従って無血清条件下で未分化ｈＥＳＣから作製された。標準的なプロトコールは、Ｂ２７（登録商標）サプリメントを含む。この実験ではＢ２７（登録商標）サプリメントは、規定のカスタムメイドなサプリメント（ＣＭＳ、表４）によって置き換えられた。
ＢＨＭは、標準的なＢＨＭプロトコールに従って無血清条件下で未分化ｈＥＳＣから作製された。標準的なプロトコールは、Ｂ２７（登録商標）サプリメントを含む。この実験ではＢ２７（登録商標）サプリメントは、規定のカスタムメイドなサプリメント（ＣＭＳ、表４）によって置き換えられた。
【0140】
結果は、Ｂ２７（登録商標）をＣＭＳによって置き換えることができることを示す。力は類似し、またＢＨＭ内に作製された心筋細胞の数も同等である（図９）。
【0141】
［結論］
Ｉ型コラーゲンヒドロゲルにおけるＰＳＣの定方向の分化を使用して、本出願は、無血清条件下でＢＨＭの構築を誘導することが可能であることを示す。ＢＨＭは、薬理学的研究、発生プロセスの研究、心臓成熟プロセス、及びまた可能性ある再生適用を含む、複数の適用を有する。
Ｉ型コラーゲンヒドロゲルにおけるＰＳＣの定方向の分化を使用して、本出願は、無血清条件下でＢＨＭの構築を誘導することが可能であることを示す。ＢＨＭは、薬理学的研究、発生プロセスの研究、心臓成熟プロセス、及びまた可能性ある再生適用を含む、複数の適用を有する。
【0142】
これらの実施例では、新規に開発されたプロトコールの強さは、分化のための複数の培養フォーマット及び複数の株を使用することによって示された。しかし、実験間の分化効率は一貫していたが、異なる試薬のバッチを使用した場合には効率が変化したことが注記される。それ故、インビトロ及び可能性ある治療適用の両方のための、一貫しかつ定まった特性を有するＢＨＭを作製するために、厳密な試薬の品質管理を確立することが賢明である。
【0143】
［方法］
ＰＳＣ培養
ＨＥＳ２－ＲＯＳＡ２６－ＲＦＰ（Irion et al. Nat Biotechnol 25, 1477-1482 (2007)）細胞をGordon Kellerから入手し、ＨＥＳ３細胞をEmbryonic Stem Cell International（ESI、シンガポール）から入手した。ｈＩＰＳを、製造業者の説明書に従ってCytotune初期化キット（Applied Biosystems）を使用してヒト歯肉の生検材料から得られた線維芽細胞から作製した。
ＰＳＣ培養
ＨＥＳ２－ＲＯＳＡ２６－ＲＦＰ（Irion et al. Nat Biotechnol 25, 1477-1482 (2007)）細胞をGordon Kellerから入手し、ＨＥＳ３細胞をEmbryonic Stem Cell International（ESI、シンガポール）から入手した。ｈＩＰＳを、製造業者の説明書に従ってCytotune初期化キット（Applied Biosystems）を使用してヒト歯肉の生検材料から得られた線維芽細胞から作製した。
【0144】
ＩＰＳ作製用に、ウイルスによる形質導入から６日後、線維芽細胞を、線維芽細胞用培地（高グルコースのＤＭＥＭ、２mmol/Lのグルタミン、１０％ＦＢＳ（ＰＡＡ）、１００IU/mlのペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシン、特に指示されない限りは全てGibco製）中の放射線照射されたマウス胚性線維芽細胞上に蒔いた。翌日、培地を、ＰＳＣ培地（２０％ノックアウト血清代替品（ＫＳＲ、Gibco）、２mmol/Lのグルタミン、１００IU/mlのペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシン、１％非必須アミノ酸（Gibco）、及び１０ng/mlのＦＧＦ２（Miltenyi Biotec）の補充されたノックアウトＤＭＥＭ（Gibco））と交換した。出現したｉＰＳコロニーを機械で拾い上げ、１mg/mlのコラゲナーゼＮＢ６（Cresent Chemical Company）を使用して週１回継代培養することによって増殖させた。
【0145】
実験用に、ｈＰＳＣは、ＰＳＣ培地中で放射線照射されたヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）上で適合させかつ培養された単細胞であり、毎日培地を交換し３分間のＴｒｙｐＬＥ（Gibco）による処理を使用して週１回継代培養を行なった（Ellerstrom et al., Stem Cells 25, 1690-1696 (2007)）。特性決定又は分化実験の前に、ｈＰＳＣを、ＰＢＳ（Gibco）でコーティングされたプレート中の１：３０マトリゲル（Millipore）上に、ＨＥＳ２については２．５×１０４個の細胞／cm2で、又はＨＥＳ３及びｈＩＰＳ株については５×１０４個の細胞／cm2で蒔き、ＦＧＦ－２を除いたＰＳＣ培地と１０ng/mLのＦＧＦ２を含むＨＦＦ馴らし培地（ＨＦＦ－ＣＭ、５日目のコンフルエントな放射線照射されたＨＦＦ培養液から収集）との１：１中で３日間培養した。ｈＩＰＳ株も１０μmol/LのＹ－２７６３２（Stemgent）を受けた。３分間のＴｒｙｐＬＥによる処理を使用して継代培養することによって実験用にｈＰＳＣを収集し、その後、適切なフォーマット中で培養した。
【0146】
多能性幹細胞株を試験キット（Lonza）を使用してマイコプラズマについて定期的に試験し、標準的なアッセイを使用して特性を決定した。多能性マーカーをＰＣＲ（内因性ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ）、ｑＰＣＲ（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＲＥＸ１、ＤＮＭＴ３Ｂ）及び免疫染色（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ－１－６０）を介して評価した（Chan et al. Nat Biotechnol 27, 1033-1037 (2009)）。ＯＣＴ４プロモーターの脱メチル化を、バイサルファイトシーケンシング法を介して確認した（Freberg et al. Mol Biol Cell 18, 1543-1553 (2007)）。核型分析を使用して、遺伝子異常があるかどうかを決定した（Campos et al. J Vis Exp 4 (2009)）。多能性を、４～６×１０６個の細胞の側腹部への注射を介したＳＣＩＤマウスにおける奇形腫の形成を介して確認した。
【0147】
分化用培地
その後、分化実験用に、ｈＰＳＣを１mmol/Lのピルビン酸ナトリウム、１００IUのペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシン及び２％のＢ２７サプリメント（ＳＦ培地、全てGibco製）及び示されている様々な因子の補充されたＲＰＭＩ １６４０中で培養した。この研究に使用された因子としては、Ｌ－アスコルビン酸２リン酸セスキマグネシウム塩水和物（Sigma）、ＢＭＰ４（R&D Systems）、アクチビンＡ（R&D Systems）、ＦＧＦ２（Miltenyi Biotec）、ドルソモルフィン（Stemgent）、ＣＨＩＲ９９０２１（Stemgent）、ＩＷＰ４（Stemgent）、及びＴＧＦβ１（Peprotech）が挙げられる。
その後、分化実験用に、ｈＰＳＣを１mmol/Lのピルビン酸ナトリウム、１００IUのペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシン及び２％のＢ２７サプリメント（ＳＦ培地、全てGibco製）及び示されている様々な因子の補充されたＲＰＭＩ １６４０中で培養した。この研究に使用された因子としては、Ｌ－アスコルビン酸２リン酸セスキマグネシウム塩水和物（Sigma）、ＢＭＰ４（R&D Systems）、アクチビンＡ（R&D Systems）、ＦＧＦ２（Miltenyi Biotec）、ドルソモルフィン（Stemgent）、ＣＨＩＲ９９０２１（Stemgent）、ＩＷＰ４（Stemgent）、及びＴＧＦβ１（Peprotech）が挙げられる。
【0148】
二次元の心臓への分化
心臓への分化をＨＥＳ２株で最適化した。ＨＥＳ２ ｈＰＳＣを、１：３０のマトリゲル／ＰＢＳでコーティングされたプレート上に５×１０４個の細胞／cm2（ＨＥＳ３株及びｈＩＰＳ株については１×１０５個の細胞／cm2）で蒔き、ＦＧＦ－２を除いたＰＳＣ培地と１０ng/mlのＦＧＦ２を含むＨＦＦ馴らし培地（ＨＦＦ－ＣＭ、５日目のコンフルエントな放射線照射されたＨＦＦ培養液から収集）との１：１中で培養した。ｈＩＰＳ株については、１０μMのＹ－２７６３２をこの培地に加えた。１日後、細胞をＲＰＭＩ培地で濯ぎ、その後、各図で示されているように２４ウェルプレートの各ウェル中の０．５mlの培地を用いて分化させた。各図のプロトコールの詳細が図８に概説されている。
心臓への分化をＨＥＳ２株で最適化した。ＨＥＳ２ ｈＰＳＣを、１：３０のマトリゲル／ＰＢＳでコーティングされたプレート上に５×１０４個の細胞／cm2（ＨＥＳ３株及びｈＩＰＳ株については１×１０５個の細胞／cm2）で蒔き、ＦＧＦ－２を除いたＰＳＣ培地と１０ng/mlのＦＧＦ２を含むＨＦＦ馴らし培地（ＨＦＦ－ＣＭ、５日目のコンフルエントな放射線照射されたＨＦＦ培養液から収集）との１：１中で培養した。ｈＩＰＳ株については、１０μMのＹ－２７６３２をこの培地に加えた。１日後、細胞をＲＰＭＩ培地で濯ぎ、その後、各図で示されているように２４ウェルプレートの各ウェル中の０．５mlの培地を用いて分化させた。各図のプロトコールの詳細が図８に概説されている。
【0149】
ＢＨＭの形成
ＢＨＭの形成をＨＥＳ２株で最適化した。ＨＥＳ２ ｈＰＳＣを１：１で、ＦＧＦ－２を除いたＰＳＣ培地及び１０ng/mlのＦＧＦ２を含むＨＦＦ馴らし培地（ＨＦＦ－ＣＭ、５日目のコンフルエントな放射線照射されたＨＦＦ培養液から収集）に懸濁し、Ｉ型コラーゲンヒドロゲルと混合した。ＨＥＳ３株及びｈＩＰＳ株については、１０μMのＹ－２７６３２も培地に加えた。Ｉ型コラーゲンマトリックスを、酸に溶かしたウシＩ型コラーゲン（Devro）と、等容量の２×ＤＭＥＭ（Gibco）を用いて製剤化し、０．１Ｍの水酸化ナトリウムを使用して中和した。ｈＰＳＣ／Ｉ型コラーゲンマトリックスを製剤化して、１mg/mlのＩ型コラーゲン最終濃度、及び１７０μlあたり５×１０５個のｈＰＳＣとした。ＨＥＳ３株及びｈＩＰＳ株については、１７０μlあたり１×１０６個及び０．５×１０６個の細胞をそれぞれ使用した。各々のＢＨＭのために、ｈＰＳＣ／Ｉ型コラーゲンマトリックス １７０μlをピペットで、ポリ（ジメチルシロキサン）（Sylgard, Dow Corning）を使用して製造された環状の型（内径＝４mm、外径＝１０mm）に入れた。３７℃のインキュベーター中で１０分間培養した後、コラーゲンはゲル化し、１つのＢＨＭあたり、１：１のヒト包皮線維芽細胞－１０ng/mlのＦＧＦ２を含む馴らし培地 １．２５mlを加えた。翌日、ＢＨＭをＲＰＭＩ培地で濯ぎ、その後、１つのＢＨＭあたり培地 １．２５mlを用いて、各図に示されているように分化させた。１３日目にＢＨＭを、示されているように機械的刺激装置に移した。各図のプロトコールの詳細は図８に概説されている。
ＢＨＭの形成をＨＥＳ２株で最適化した。ＨＥＳ２ ｈＰＳＣを１：１で、ＦＧＦ－２を除いたＰＳＣ培地及び１０ng/mlのＦＧＦ２を含むＨＦＦ馴らし培地（ＨＦＦ－ＣＭ、５日目のコンフルエントな放射線照射されたＨＦＦ培養液から収集）に懸濁し、Ｉ型コラーゲンヒドロゲルと混合した。ＨＥＳ３株及びｈＩＰＳ株については、１０μMのＹ－２７６３２も培地に加えた。Ｉ型コラーゲンマトリックスを、酸に溶かしたウシＩ型コラーゲン（Devro）と、等容量の２×ＤＭＥＭ（Gibco）を用いて製剤化し、０．１Ｍの水酸化ナトリウムを使用して中和した。ｈＰＳＣ／Ｉ型コラーゲンマトリックスを製剤化して、１mg/mlのＩ型コラーゲン最終濃度、及び１７０μlあたり５×１０５個のｈＰＳＣとした。ＨＥＳ３株及びｈＩＰＳ株については、１７０μlあたり１×１０６個及び０．５×１０６個の細胞をそれぞれ使用した。各々のＢＨＭのために、ｈＰＳＣ／Ｉ型コラーゲンマトリックス １７０μlをピペットで、ポリ（ジメチルシロキサン）（Sylgard, Dow Corning）を使用して製造された環状の型（内径＝４mm、外径＝１０mm）に入れた。３７℃のインキュベーター中で１０分間培養した後、コラーゲンはゲル化し、１つのＢＨＭあたり、１：１のヒト包皮線維芽細胞－１０ng/mlのＦＧＦ２を含む馴らし培地 １．２５mlを加えた。翌日、ＢＨＭをＲＰＭＩ培地で濯ぎ、その後、１つのＢＨＭあたり培地 １．２５mlを用いて、各図に示されているように分化させた。１３日目にＢＨＭを、示されているように機械的刺激装置に移した。各図のプロトコールの詳細は図８に概説されている。
【0150】
細胞の解離
二次元培養物をＰＢＳで濯ぎ、次いで、ＰＢＳ中の１mg/ml Ｉ型コラゲナーゼ（Sigma）＋２０％ウシ胎児血清（FBS, Applied Biosystems）中で１時間インキュベートすることによって解離した。その後、細胞をチューブに収集し、ＰＢＳで濯ぎ、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Applied Biosystems）と共に５分間インキュベートし、その後、ＦＢＳを含有する培地で濯いだ。
二次元培養物をＰＢＳで濯ぎ、次いで、ＰＢＳ中の１mg/ml Ｉ型コラゲナーゼ（Sigma）＋２０％ウシ胎児血清（FBS, Applied Biosystems）中で１時間インキュベートすることによって解離した。その後、細胞をチューブに収集し、ＰＢＳで濯ぎ、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Applied Biosystems）と共に５分間インキュベートし、その後、ＦＢＳを含有する培地で濯いだ。
【0151】
最初のＢＨＭ消化プロトコールについては、ＢＨＭを、ＰＢＳ中０．０２５mg/mlのリベラーゼＴＭ（Roche）、３０mMの２，３－ブタンジオンモノオキシム中で３７℃で６０分間、解離した。細胞表面マーカーを保存するために、ＢＨＭを、二次元消化と同じプロトコールを使用して解離した。
【0152】
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
細胞、ＢＨＭ、又はヒト心臓生検材料を収集し、製造業者の説明書（Applied Biosystems）に従ってトリゾールを使用してＲＮＡ抽出するまで－８０℃で保存した。その後、ＲＮＡ １μgをＤＮＡｓｅ（Roche）で処理し、その後、ハイキャパシティｃＤＮＡ逆転写キット（Applied Biosystems）を使用してｃＤＮＡ合成を行なった。
細胞、ＢＨＭ、又はヒト心臓生検材料を収集し、製造業者の説明書（Applied Biosystems）に従ってトリゾールを使用してＲＮＡ抽出するまで－８０℃で保存した。その後、ＲＮＡ １μgをＤＮＡｓｅ（Roche）で処理し、その後、ハイキャパシティｃＤＮＡ逆転写キット（Applied Biosystems）を使用してｃＤＮＡ合成を行なった。
【0153】
ｑＰＣＲを３８４ウェルフォーマットＡＢ７９００ＨＴ（Applied Biosystems）でFast SYBR Greenマスターミックス（Applied Biosystems）を使用して行なった。本発明者らの全ての実験において条件間で一貫して発現していることを見出したハウスキーピング遺伝子としてのＧＡＰＤＨを使用して、遺伝子発現を２－ΔＣｔ又は２－ΔΔＣｔを使用して標準化した。プライマーの詳細を以下の表１に示す。
【0154】
【表1】
【0155】
免疫染色
１mmol/Lのピルビン酸ナトリウム、１００IU/mlのペニシリン及び１００μg/mlのストレプトマイシンの補充されたＲＰＭＩ１６４０中２０％ＦＢＳ（Gibco）中で２４時間、消化された心臓分化細胞を、０．１％のゼラチンでコーティングされたスライドガラス上に蒔いた。その後、細胞を室温でHistofix（Roti）で１０分間固定した。その後、細胞を、ＰＢＳ（ブロック緩衝液）中の５％ＦＢＳ、１％ウシ血清アルブミン（Sigma）及び０．５％Triton X-100（Sigma）中で３０分間ブロックした。その後、細胞をブロック緩衝液中の一次抗体で９０分間染色し、その後、ブロック緩衝液中の二次抗体及びヘキストで室温で６０分間染色した（表２）。染色された細胞をZeiss 710共焦点顕微鏡を使用して画像撮影した。
１mmol/Lのピルビン酸ナトリウム、１００IU/mlのペニシリン及び１００μg/mlのストレプトマイシンの補充されたＲＰＭＩ１６４０中２０％ＦＢＳ（Gibco）中で２４時間、消化された心臓分化細胞を、０．１％のゼラチンでコーティングされたスライドガラス上に蒔いた。その後、細胞を室温でHistofix（Roti）で１０分間固定した。その後、細胞を、ＰＢＳ（ブロック緩衝液）中の５％ＦＢＳ、１％ウシ血清アルブミン（Sigma）及び０．５％Triton X-100（Sigma）中で３０分間ブロックした。その後、細胞をブロック緩衝液中の一次抗体で９０分間染色し、その後、ブロック緩衝液中の二次抗体及びヘキストで室温で６０分間染色した（表２）。染色された細胞をZeiss 710共焦点顕微鏡を使用して画像撮影した。
【0156】
【表2】
【0157】
ホールマウント免疫染色
ＢＨＭを４℃で２～４時間Histofix中で固定した。その後、ＢＨＭを一次抗体で２～３日間染色し、その後、二次抗体及びファロイジン５４６／ヘキストで４℃で２～３日間染色した（表２）。染色されたＢＨＭをZeiss 710共焦点顕微鏡を使用して画像撮影した。
ＢＨＭを４℃で２～４時間Histofix中で固定した。その後、ＢＨＭを一次抗体で２～３日間染色し、その後、二次抗体及びファロイジン５４６／ヘキストで４℃で２～３日間染色した（表２）。染色されたＢＨＭをZeiss 710共焦点顕微鏡を使用して画像撮影した。
【0158】
フローサイトメトリー
細胞を生きたままで染色するか、又は、室温で１０分間Histofixを使用するか又はエタノールを使用して固定した。細胞を、細胞表面マーカー（ＴＲＡ－１－６０を除く）についてＰＢＳ（膜ブロック緩衝液）中の５％ＦＢＳ中で染色し、内部マーカーについてはブロック緩衝液中で染色した。その後、細胞をブロック緩衝液中の一次抗体で４５分間染色し、その後、ブロック緩衝液中の二次抗体及びヘキストで４℃で３０分間染色した（表２）。ＢＤ ＬＳＲＩＩをフローサイトメトリー分析（BD Biosystems）のために使用した。生細胞集団を前方側方散乱プロファイルに基づいてゲートにかけ；固定された細胞集団をヘキスト染色に基づいてゲートにかけた。BD FACSDivaソフトウェア（BD Biosystems）又はCyflologic v1.2.1（Cyflo Ltd）を分析に使用した。
細胞を生きたままで染色するか、又は、室温で１０分間Histofixを使用するか又はエタノールを使用して固定した。細胞を、細胞表面マーカー（ＴＲＡ－１－６０を除く）についてＰＢＳ（膜ブロック緩衝液）中の５％ＦＢＳ中で染色し、内部マーカーについてはブロック緩衝液中で染色した。その後、細胞をブロック緩衝液中の一次抗体で４５分間染色し、その後、ブロック緩衝液中の二次抗体及びヘキストで４℃で３０分間染色した（表２）。ＢＤ ＬＳＲＩＩをフローサイトメトリー分析（BD Biosystems）のために使用した。生細胞集団を前方側方散乱プロファイルに基づいてゲートにかけ；固定された細胞集団をヘキスト染色に基づいてゲートにかけた。BD FACSDivaソフトウェア（BD Biosystems）又はCyflologic v1.2.1（Cyflo Ltd）を分析に使用した。
【0159】
収縮の測定
収縮実験を、３７℃の浴槽中で、１２０mMのＮａＣｌ、１mMのＭｇＣｌ２、０．２mMのＣａＣｌ２、５．４mMのＫＣｌ、２２．６mMのＮａＨＣＯ３、４．２mMのＮａＨ２ＰＯ４、５．６mMのグルコース、及び０．５６mMのアスコルビン酸を含有するタイロード溶液中で生理的ｐＨを維持するために５％ＣＯ２／９５％Ｏ２を絶えずバブリングして、行なう。カルシウムを０．２Ｍの塩化カルシウム溶液を使用して調整した。ほぼ胎児の心拍数でペーシングするために、全てのＢＨＭを、２００mAの５ms矩形波のパルスを用いて３Hzでまず分析した。ＢＨＭをＬｍａｘまで、すなわち、組織長が最大となるまで１２５μmの間隔で機械的に伸展させ、単収縮張力／収縮力を、最大変力活性のカルシウム濃度（２mmol/L；フランク－スターリング機序）の存在下で記録した。続いて、ＢＨＭを異なるカルシウム濃度（０．２、０．４、０．８、１．２、１．６、２．０、２．４mM）にかけ、単収縮力を記録した。イソプレナリン実験については、カルシウム濃度を０．６mMに調整し、続いてイソプレナリン濃度を１μMに調整した。
収縮実験を、３７℃の浴槽中で、１２０mMのＮａＣｌ、１mMのＭｇＣｌ２、０．２mMのＣａＣｌ２、５．４mMのＫＣｌ、２２．６mMのＮａＨＣＯ３、４．２mMのＮａＨ２ＰＯ４、５．６mMのグルコース、及び０．５６mMのアスコルビン酸を含有するタイロード溶液中で生理的ｐＨを維持するために５％ＣＯ２／９５％Ｏ２を絶えずバブリングして、行なう。カルシウムを０．２Ｍの塩化カルシウム溶液を使用して調整した。ほぼ胎児の心拍数でペーシングするために、全てのＢＨＭを、２００mAの５ms矩形波のパルスを用いて３Hzでまず分析した。ＢＨＭをＬｍａｘまで、すなわち、組織長が最大となるまで１２５μmの間隔で機械的に伸展させ、単収縮張力／収縮力を、最大変力活性のカルシウム濃度（２mmol/L；フランク－スターリング機序）の存在下で記録した。続いて、ＢＨＭを異なるカルシウム濃度（０．２、０．４、０．８、１．２、１．６、２．０、２．４mM）にかけ、単収縮力を記録した。イソプレナリン実験については、カルシウム濃度を０．６mMに調整し、続いてイソプレナリン濃度を１μMに調整した。
【0160】
酸素拡散プロファイル
酸素拡散プロファイルを、酸素消費量の濃度依存性を用いる、シリンダー拡散の偽定常状態の近似の数値解析を使用して作成した（式１）。文献（Brown et al. Biotechnol Bioeng 97, 962-075 (2007)）からのパラメーター及び以前の実験で決定されたパラメーターを使用した（表３）。数値解析及びプロッティングを、ソルバーｂｖｐ４ｃ及び特異項のオプションを用いる、ＭＡＴＬＡＢ Ｖ１２（Mahworks）を使用して行なった。
酸素拡散プロファイルを、酸素消費量の濃度依存性を用いる、シリンダー拡散の偽定常状態の近似の数値解析を使用して作成した（式１）。文献（Brown et al. Biotechnol Bioeng 97, 962-075 (2007)）からのパラメーター及び以前の実験で決定されたパラメーターを使用した（表３）。数値解析及びプロッティングを、ソルバーｂｖｐ４ｃ及び特異項のオプションを用いる、ＭＡＴＬＡＢ Ｖ１２（Mahworks）を使用して行なった。
【0161】
【数1】
【0162】
ＣＯ２－半径位置の関数としての酸素濃度、ｒ－シリンダー中の半径位置、ＤＯ２－酸素拡散定数、Ｖｍａｘ－心筋細胞による最大酸素発生速度、ρ心筋細胞－心筋細胞の密度、α－酸素濃度に対する酸素発生速度依存性に関する定数
【0163】
【表3】
【0164】
統計分析
全てのデータを平均値±標準誤差として示す。各データセットについて適切な統計分析を、グラフパッドプリズム又はマイクロソフトエクセルを使用して図の説明文に示されているように使用した。
全てのデータを平均値±標準誤差として示す。各データセットについて適切な統計分析を、グラフパッドプリズム又はマイクロソフトエクセルを使用して図の説明文に示されているように使用した。
【0165】
Ｂ２７（登録商標）に置き換わるカスタムメイドなサプリメント
【0166】
【表4】
【0167】
［参考文献のリスト］
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【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図9】
【図10】
【配列表】