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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-02
(45)【発行日】2024-09-10
(54)【発明の名称】硫化水素化合物
(51)【国際特許分類】
A61K 33/04 20060101AFI20240903BHJP
A61K 31/095 20060101ALI20240903BHJP
A61K 31/105 20060101ALI20240903BHJP
A61K 31/196 20060101ALI20240903BHJP
A61K 31/197 20060101ALI20240903BHJP
A61K 31/675 20060101ALI20240903BHJP
A61P 15/06 20060101ALI20240903BHJP
G01N 33/49 20060101ALI20240903BHJP
【ＦＩ】
A61K33/04
A61K31/095
A61K31/105
A61K31/196
A61K31/197
A61K31/675 ZNA
A61P15/06
G01N33/49 Z
【請求項の数】
3
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2020032315
(22)【出願日】2020-02-27
(62)【分割の表示】P 2015559562の分割
【原出願日】2014-03-03
(65)【公開番号】P2020114812
(43)【公開日】2020-07-30
【審査請求日】2020-03-30
【審判番号】
【審判請求日】2022-08-05
(31)【優先権主張番号】1303649.6
(32)【優先日】2013-03-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】522315208
【氏名又は名称】ミルザイム セラピューティクス リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100092624
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴田 準一
(74)【代理人】
【識別番号】100114018
【弁理士】
【氏名又は名称】南山 知広
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100108903
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和広
(72)【発明者】
【氏名】アシフ アメド
(72)【発明者】
【氏名】ケーチーン ワン
【合議体】
【審判長】前田 佳与子
【審判官】井上 千弥子
【審判官】田中 耕一郎
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１１／１６１４３６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００６－１５１８６１（ＪＰ，Ａ）
【文献】ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１２年，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．９，ｅ４６２７８
【文献】Ｐｌａｃｅｎｔａ，２０１２年，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．６，ｐｐ．４８７－４９４
【文献】Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１３年２月，Ｖｏｌ．１８２，Ｎｏ．４，ｐｐ．１４４８－１４５８
【文献】Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２０１１年，Ｖｏｌ．３０１，ｐｐ．Ｒ２９７－Ｒ３１２
【文献】Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ＆Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２０１２年，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．１，ｐｐ．１１９－１４０
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
A61K31/00-33/44
ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
子癇前症（ＰＥ）、又はＣＳＥ／Ｈ２Ｓ経路の異常調節若しくは血管新生の欠損に起因する胎児発育不全の治療のための、妊娠被験体においてＨ2Ｓを供与する化合物を含む医薬組成物。
【請求項2】
前記Ｈ2Ｓを供与する化合物が、ＡＣＳ８６、ＤＡＴＳ（ジアリルトリスルフィド）、スルファン硫黄、チオシステイン、ＧＳＨ ハイドロペルスルフィド、ＳＧ１００２、ＡＣＳ６、ＴＢＺ及び４－ヒドロキシフェニルイソチオシアネート、チオグリシン、１－チオバリン又はその塩である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
請求項１又は２に記載の医薬組成物を用いた治療を行う前の被験体の血液、血清又は血漿のサンプルのＨ2Ｓの量を測定すること、及び、治療後に採取されたサンプル中のＨ２Ｓの量と比較すること、を含む、子癇前症、又は、ＣＳＥ／Ｈ２Ｓ経路の異常調節若しくは血管新生の欠損に起因する胎児発育障害の治療を監視するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、子癇前症又は胎児発育障害を治療する方法、及び、その治療を監視する方法に関するものであって、硫化水素（Ｈ2Ｓ）の産物が産生され、又は刺激し、又は提供される。
【背景技術】
【0002】
気体状のシグナル分子、硫化水素（Ｈ2Ｓ）は、血管拡張を促進し1、脈管構造2における血管新生を刺激する。Ｈ2Ｓは抗炎症の特性があり3、また、致命的な低酸素状態又は再灌流障害によって誘導される細胞障害に対しても細胞保護的である4,5。シスタチオニンγーリアーゼ（ＣＳＥ）は、Ｈ2Ｓの内在性の産生を担当する主要な酵素である6。ＣＳＥ阻害剤 ＤＬ－プロパルギルグリシン（ＰＡＧ）の長期的な投与は、ラットにおいて血圧の上昇と血管再構築を導き7、肺高血圧ラットにおいてＣＳＥとＨ2Ｓの両方のレベルが減少する8。ＣＳＥに遺伝的欠損があるマウスは、年齢依存的高血圧、重度高ホモシステイン血症及び内皮機能障害を発症する9。明らかに、Ｈ2Ｓは、健康と疾患に関して多様な役割を有しているが10,11、妊娠が誘導する高血圧において、その役割は知られていない。
【0003】
子癇前症は、全妊娠者の４～７％に影響を与える高血圧症候群であり、世界中の母体及び胎児の罹患率と死亡率の主要な要因である12。それは、タンパク尿及び非タンパク尿子癇前症として分類される。タンパク尿子癇前症の女性は、妊娠２０週後に高血圧やタンパク尿等の典型的な症状を示す一方、非タンパク尿子癇前症の女性は、高血圧と肝臓疾患を罹患する可能性が高い。妊娠の高血圧と比較して、これらの女性のグループは、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）を有している可能性が高い13。子癇前症の正確な病因は知られていないが、異常胎盤14,15及び血管新生因子の不均衡16,17に高い関連性がある。重要なことに、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）及び胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）の内在性阻害因子である可溶性Ｆｌｔ－１（ｓＦｌｔ－１）、並びにトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）コレセプター エンドグリン（Ｅｎｄｏｇｌｉｎ）の切断された産物である可溶性エンドグリン（ｓＥｎｇ）の循環レベルは、子癇前症の臨床症状の発症の数週間前に上昇し18,19、一方でＰｌＧＦは、実質的に症状を発症した妊娠女性の最初の妊娠三半期（ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ）に減少する20-26。内皮機能障害と共に、これらは、重篤な子癇前症の生化学的特徴となっている。いくつかの研究では、妊娠におけるＣＳＥ／Ｈ2Ｓの機能が調べられている。近年、Ｐａｔｅｌらは、シスタチオニンβ－シンターゼ及びＣＳＥの両者が、ヒト子宮内組織及び胎盤に存在することを証明した27、28。胎盤が高度に血管を有する臓器であれば、発明者らは、ＣＳＥ／Ｈ2Ｓ経路の異常調節が、胎盤の奇形及び子癇前症様状態に貢献する可能性があると信じている。
【発明の概要】
【0004】
発明者らは、今、母親の血漿Ｈ2Ｓレベルと、胎盤のＣＳＥ発現が、妊娠齢を一致させたコントロールと比較して、子癇前症を併発した妊娠において、減少することを証明している。子癇前症における循環しているＨ2Ｓの減少の証拠が提供され、それは、内在性Ｈ2Ｓの生成を担当する鍵となる酵素、胎盤ＣＳＥの下方制御を伴っている。妊娠最初の三半期（８～１２週）由来、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）の胎盤移植片のＣＳＥ活性の阻害は、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）産生の著しく減少し、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での栄養芽細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）の侵入が阻害される。妊娠マウスにおけるＣＳＥの阻害は、ＣＳＥ阻害による損なわれた胎児成長を回復させ、循環しているｓＦｌｔ－１とｓＥｎｇレベルの上昇を阻害する、Ｈ2Ｓを産生する化合物、ＧＹＹ４１３７の遅い放出等のような、Ｈ2Ｓ産生の阻害により、高血圧を誘導し、ｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇのレベルを増加させ、そして胎盤の異常形成を引き起こす。これらの発見は、機能が損なわれたＣＳＥ／Ｈ2Ｓ経路は、子癇前症の病因に寄与することを示している。
【0005】
本発明は、子癇前症（ＰＥ）又は胎児発育不全（ＦＧＲ若しくは子宮内胎児発育不全）の治療に使用するための、硫化水素（Ｈ2Ｓ）、妊娠被験体においてＨ2Ｓを生成する化合物若しくはＨ2Ｓ産生を刺激する能力がある化合物を提供する。
【0006】
本発明は、また、子癇前症（ＰＥ）又はＦＧＲを治療する方法を提供するものであって、妊娠試験体に対し、薬学的に有効な量のＨ2Ｓ、被験体においてＨ2Ｓを生成する化合物若しくはＨ2Ｓ産生を誘導する能力がある化合物を投与することを含む。
【0007】
Ｈ2Ｓの添加は、例えば、血管新生を促進することを示し、結果として、胎児に対する血液供給の回復をもたらす。
【0008】
これも、例えば、早期分娩もまた治療されうることを意味している。
【0009】
上述の子癇前症は、高血圧症候群であって、胎児の罹患率（ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）の主要な要因である。加えて、胎児は、妊娠で誘発する高血圧により胎児発育が損なわれうる。この「胎児発育障害」は、低体重児及び後の合併症リスクが上昇した新生児を生み出す。
【0010】
被験体は、一般的には、哺乳類であって、とりわけヒトである。
【0011】
Ｈ2Ｓは、例えば、気体、又はキャリア溶媒中のような、液体として、投与されてもよい。
【0012】
自然発生するＨ2Ｓを供与する化合物が知られている。これらは、ジアリルジスルフィド及びジアリルトリスルフィドへと分解するニンニク由来のアリシンを含む。スルフォラファンはブロッコリーから産生され、エルシンは、ロケット（Ｅｒｕｃａ Ｓａｔｉｖａ）より見出される。これらは、例えば、錠剤又はカプセルの形状として、経口的に提供されてもよい。
【0013】
多くの合成Ｈ2Ｓ化合物が知られている。これらは、カイマンケミカル社のＧＹＹ４１３７（モルフォリン－４－イウム ４ メトキシフェニル（モルフォリノ）フォスフィノジチオレート）を含む。これは、以前、腹腔内注射（ｉｐ）又は静脈内注射（ｉｖ）によってＨ2Ｓ活性を研究するためのラットスタディにおいて使用されている。ローソン試薬（Ｌａｗｅｓｓｏｎ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）が、他のＨ2Ｓ供与体である。
【0014】
ＳＧ１００２（スルファ ジェニックス インク）もまた、Ｈ2Ｓを産生する化合物であり、使用されても良い。米国特許８，３６１，５１４Ｂも参照すること。
【0015】
アネトールトリチオンもまた共通に使用されるＨ2Ｓ供与体である。緩衝液中の硫化ナトリウム（ＩＫ－１００１としてイカリアによって製造される）は、再灌流／障害のための臨床試験で使用されている。他のＨ2Ｓを産生する化合物は、Ｂａｎｎｅｎｂｅｒｇ Ｇ．Ｌ． 及び Ｖｉｅｒａ ＨＬＡ （Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｔｈｅｒ． Ｐａｔｅｎｔｓ （２００９） １９（５） ６６３－６８２）にて開示される。
【0016】
他の化合物は、化合物ＡＤＴ－ＯＨ、ＴＢＺ及び４－ヒドロキシフェニルイソチオシアネートを含む、Ｐｒｅｄｍｏｒｅ Ｂ．Ｌ．らによる論文（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ （２０１２） １７ （１） １１９－１４０）において開示される。
【0017】
化合物は、ＡＣＳ－１４、ＡＣＳ８３、ＡＣＳ ８４、ＡＣＳ ８５、ＡＣＳ ８６（Ｌｅｅ Ｍ， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ （２０１０） ２８５， １７３１８－１７３２８）、）、 ＤＡＴＳ （ジアリルトリスルフィド）、Ｓ－ジクロフェナック、スルファン硫黄（ｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｐｈｕｒ）、チオシステイン、ＧＳＨ ハイドロペルサルファイド（ｈｙｄｒｏｐｅｒｓｕｌｐｈｉｄｅ）、 ＧＹＹ４１３７、ＳＧ１００２、シルデナフィルのＨ2Ｓを供与する誘導体（Ｈ2Ｓ－ｄｏｎａｔｉｎｇ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）（ＡＣＳ６－Ｓｐａｒａｔｏｒｅ Ａら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ， Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ （２０１１） ４， １０９－１２１）、ＡＤＴ－ＯＨ、ＴＢＺ及び４－ヒドロキシフェニルイソチオシアネート、チオグリシン、１－チオリシン、１－チオバリン若しくはその塩であってもよい。
【0018】
他の関係する化合物は、Ｈ2Ｓ－ラタノプロスト、Ｈ2Ｓ－シルデナフィル、Ｈ2Ｓ－サルタン又はＨ2Ｓ－Ｌ－ＤＯＰＡ及びこれらの任意の誘導体を含む。
【0019】
あるいは、Ｈ2Ｓの産生は、例えば、ＣＳＥ産生を誘導すること、又は生体中においてＨ2Ｓを産生する他の酵素を誘導することによって、生体中で誘導されてもよい。例えば、シンバスタチン又はプラバスタチン等のスタチンが、ＣＳＥ産生を上方制御することが見出されている。
【0020】
化合物は、ｉｐ、ｉｖ、経口、例えばペッサリーとして子宮内に、又は筋肉内、を含む任意の最適な方法によって導入されても良い。それらは、１又は数個の薬学的に受容できる担体又は賦刑剤とともに投与されてもよい。一般的な投与量は、１０ｍｍｏｌ／ｋｇ～０．０１ｍｏｌ／ｋｇ、一般的には１０ｍｍｏｌ／ｋｇ～０．１ｍｍｏｌ／ｋｇであってもよい。
【0021】
Ｈ2Ｓ若しくは上述の化合物で治療する前の被験体の血液、血清又は血漿のサンプル中のＨ2Ｓの量を測定すること、及び、治療後に採集されたサンプル中の量に対してそれを比較すること、を含む、子癇前症又は胎児発育障害の治療を監視する方法。早産治療も同様に監視されうる。
【0022】
これは、Ｈ2Ｓの至適レベルが提供されることを確実にするために、被験体となるべき生体中のＨ2Ｓの量を許容する。検出されるＨ2Ｓの量は、例えば、後述されるアッセイ方法等のような一般的に本技術で知られている方法によって検出されてもよい。
【0023】
被験体は、上述の化合物、又は代わりに、抗－胎児発育障害化合物として、他の関連しない抗－ＰＥを用いて治療されていてもよい。
【0024】
本発明は、以下の図に関して、単に例として記載される；
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】子癇前症におけるＣＳＥ発現及びＨ2Ｓレベル。
【図2】ヒト第一三半期胎盤からの血管新生因子放出におけるＣＳＥ阻害効果。
【図3】ＣＳＥは、内皮細胞におけるｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇの放出を調節する。
【図4】Ｈ2Ｓは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ管腔形成の子癇前症血漿誘導阻害を回復する。
【図5】ＣＳＥの阻害は、内在性の循環しているＨ2Ｓを減少し、妊娠マウスにおいて高血圧及び異常胎盤血管新生を促進する。
【図6】Ｈ2Ｓ産生化合物、ＧＹＹ４１３３は、妊娠マウスにおいて、胎児発育を回復し、ＣＳＥ阻害によって誘導されたｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇを阻害する。
【図7】栄養芽細胞侵入におけるＣＳＥの阻害効果。
【図8】Ｈ2Ｓ供与体は、妊娠マウスにおいて胎盤血管新生を回復する。
【発明を実施するための形態】
【0026】
材料と方法
胎盤組織採取及び準備
機関の倫理委員会は、血液及び組織の採取を承認して、書面でのインフォームドコンセントが得られた。我々は、低・高リスククリニック、分娩、出産ユニットにおいて募った、単生児を妊娠した女性由来の血液サンプルを解析した。全ての女性は、登録から出産まで、将来を見越して追跡された。ヒト胎盤組織は、子癇前症を併発した妊娠、及び選択的帝王切開によって出産した非併発妊娠より採取された。胎盤組織のサンプルは、ＲＮＡ抽出のために処理され、同じ患者由来の母親の血漿（ｎ＝１４ ＰＥ 及びｎ＝１４ コントロール）は解析のために使用された。他の患者の胎盤のセットから（ｎ＝５ ＰＥ 及びｎ＝５ コントロール）、免疫組織化学の調査のために採取された。子癇前症とは、少なくとも２回の連続する測定において＞１４０／９０ｍｍＨｇの血圧、及び、母親のタンパク尿が、少なくとも３００ｍｇ／２４時間であるものと定義された。第一三半期の胎盤組織（６－９週妊娠期間）は、選択的な中絶を経験した正常妊娠から回収された。以前記載されたように29、絨毛外植片が準備された。簡潔に述べると、ヒト胎盤絨毛外植片は、ＰＡＧ有り又は無しで２４時間インキュベートされ、回収されて、ｓＦｌｔ－１又はｓＥｎｇ及びＰＩＧＦが解析される溶液が調節された。
胎盤組織採取及び準備
機関の倫理委員会は、血液及び組織の採取を承認して、書面でのインフォームドコンセントが得られた。我々は、低・高リスククリニック、分娩、出産ユニットにおいて募った、単生児を妊娠した女性由来の血液サンプルを解析した。全ての女性は、登録から出産まで、将来を見越して追跡された。ヒト胎盤組織は、子癇前症を併発した妊娠、及び選択的帝王切開によって出産した非併発妊娠より採取された。胎盤組織のサンプルは、ＲＮＡ抽出のために処理され、同じ患者由来の母親の血漿（ｎ＝１４ ＰＥ 及びｎ＝１４ コントロール）は解析のために使用された。他の患者の胎盤のセットから（ｎ＝５ ＰＥ 及びｎ＝５ コントロール）、免疫組織化学の調査のために採取された。子癇前症とは、少なくとも２回の連続する測定において＞１４０／９０ｍｍＨｇの血圧、及び、母親のタンパク尿が、少なくとも３００ｍｇ／２４時間であるものと定義された。第一三半期の胎盤組織（６－９週妊娠期間）は、選択的な中絶を経験した正常妊娠から回収された。以前記載されたように29、絨毛外植片が準備された。簡潔に述べると、ヒト胎盤絨毛外植片は、ＰＡＧ有り又は無しで２４時間インキュベートされ、回収されて、ｓＦｌｔ－１又はｓＥｎｇ及びＰＩＧＦが解析される溶液が調節された。
【0027】
動物実験手順
８～１０週齢のＣ５７／ｂｌａｃｋ６マウスを交配させた。妊娠の初日（Ｅ０．５）は、次の朝の膣栓の存在によって定義された。妊娠マウスは、ランダムに４つのグループに割り当てられた：（ｉ）生理食塩水（溶媒コントロール）、（ｉｉ）２５ｍｇ／ｋｇ ＤＬ－プロパルギルグリシン（ＰＡＧ；シグマ、プール、Ｕ．Ｋ．）、（ｉｉｉ）５０ｍｇ／ｋｇ群ＰＡＧ 及び（ｉｖ）０．２５ｍｇ／ｋｇの遅延放出Ｈ2Ｓ供与体のＧＹＹ４１３７（シグマ）及び５０ｍｇ／ｋｇ ＰＡＧ。マウスは、Ｅ８．５より、生理食塩水又はＰＡＧが腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射された。血圧は、尾部カフ－プレチスモグラフィー（ｔａｉｌ ｃｕｆｆ－ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈｙ）によって測定された。マウスは、Ｅ４．５から隔日に測定するために訓練された。あるいは、マウスは、ケタミン／キシラジン カクテルによって麻酔をされた。頸動脈が単離され、圧力トランスデューダー（ミラー インストルメンツ社、ヒューストン、テキサス、ＵＳＡ）に結合された３－Ｆｒ高適合度マイクロチップカテーテルがカニューレ処理された。血圧は、記録されて、１０分間が平均化された。Ｅ１７．５において、血圧測定及び血液の採取後、該動物は犠牲死させられ、腎臓、肝臓、胎盤が採取された。吸収されていない胎児及び胎盤は、数えられて、重さを測定された。
８～１０週齢のＣ５７／ｂｌａｃｋ６マウスを交配させた。妊娠の初日（Ｅ０．５）は、次の朝の膣栓の存在によって定義された。妊娠マウスは、ランダムに４つのグループに割り当てられた：（ｉ）生理食塩水（溶媒コントロール）、（ｉｉ）２５ｍｇ／ｋｇ ＤＬ－プロパルギルグリシン（ＰＡＧ；シグマ、プール、Ｕ．Ｋ．）、（ｉｉｉ）５０ｍｇ／ｋｇ群ＰＡＧ 及び（ｉｖ）０．２５ｍｇ／ｋｇの遅延放出Ｈ2Ｓ供与体のＧＹＹ４１３７（シグマ）及び５０ｍｇ／ｋｇ ＰＡＧ。マウスは、Ｅ８．５より、生理食塩水又はＰＡＧが腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射された。血圧は、尾部カフ－プレチスモグラフィー（ｔａｉｌ ｃｕｆｆ－ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈｙ）によって測定された。マウスは、Ｅ４．５から隔日に測定するために訓練された。あるいは、マウスは、ケタミン／キシラジン カクテルによって麻酔をされた。頸動脈が単離され、圧力トランスデューダー（ミラー インストルメンツ社、ヒューストン、テキサス、ＵＳＡ）に結合された３－Ｆｒ高適合度マイクロチップカテーテルがカニューレ処理された。血圧は、記録されて、１０分間が平均化された。Ｅ１７．５において、血圧測定及び血液の採取後、該動物は犠牲死させられ、腎臓、肝臓、胎盤が採取された。吸収されていない胎児及び胎盤は、数えられて、重さを測定された。
【0028】
全ての実験は、エジンバラ大学倫理審査委員会によって承認された手順を使用して、英国動物（科学的手順）法、１９８６年、に従って実施された。
【0029】
組織病理学
腎臓、肝臓及び胎盤は、４％パラホルムアルデヒドにて２４時間浸漬固定されて、パラフィン処理された。一連の５μｍ切片でカットされ、ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色の処理がされた。
腎臓、肝臓及び胎盤は、４％パラホルムアルデヒドにて２４時間浸漬固定されて、パラフィン処理された。一連の５μｍ切片でカットされ、ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色の処理がされた。
【0030】
細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、以前の記載と同様に30、単離され、培養された。実験は、ＨＵＶＥＣの第三継代又は第四継代で実施された。
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、以前の記載と同様に30、単離され、培養された。実験は、ＨＵＶＥＣの第三継代又は第四継代で実施された。
【0031】
ＲＮＡ干渉
ヒトＣＳＥ発現を抑制するために、発明者らは、エレクトロポレーション（ヌクレオフェクター、アマクサ）を用いて、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖のトランスフェクションを実施した。コントロール及びＣＳＥ ｓｉＲＮＡは、ユーロジェンテック社（ケルン、ドイツ）によって合成された。ＨＵＶＥＣにおけるＣＳＥのノックダウンは、ウエスタンブロット法を用いて確認された。
ヒトＣＳＥ発現を抑制するために、発明者らは、エレクトロポレーション（ヌクレオフェクター、アマクサ）を用いて、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖のトランスフェクションを実施した。コントロール及びＣＳＥ ｓｉＲＮＡは、ユーロジェンテック社（ケルン、ドイツ）によって合成された。ＨＵＶＥＣにおけるＣＳＥのノックダウンは、ウエスタンブロット法を用いて確認された。
【0032】
アデノウイルス遺伝子移転
以前の記載と同様に31、ヒトＣＳＥをコードした遺伝子組み換え、複製欠損アデノウイルス（ＡｄＣＳＥ）及び空ベクター（ＡｄＥＶ）は、ＣｓＣｌ勾配にて精製され、力価が測定され、使用直前までウイルス保存緩衝液中にて－８０℃にて保存された。ＡｄＣＳＥに対する最適な感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）は、ウサギ抗ＣＳＥ抗体（アバカム社）を用いたウエスタンブロット法にて、２０ＩＦＵ／細胞となるように決定された。ＡｄＥＶが感染したＨＵＶＥＣは、ネガティブコントロールとして使用された。
以前の記載と同様に31、ヒトＣＳＥをコードした遺伝子組み換え、複製欠損アデノウイルス（ＡｄＣＳＥ）及び空ベクター（ＡｄＥＶ）は、ＣｓＣｌ勾配にて精製され、力価が測定され、使用直前までウイルス保存緩衝液中にて－８０℃にて保存された。ＡｄＣＳＥに対する最適な感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）は、ウサギ抗ＣＳＥ抗体（アバカム社）を用いたウエスタンブロット法にて、２０ＩＦＵ／細胞となるように決定された。ＡｄＥＶが感染したＨＵＶＥＣは、ネガティブコントロールとして使用された。
【0033】
酵素結合免疫測定法
ヒト若しくはマウス可溶性Ｆｌｔ－１、可溶性エンドグリン、及びＰｌＧＦに対する酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）キットは、Ｒ＆Ｄシステムズ社より入手され、メーカーの手順書に従って実施された。
ヒト若しくはマウス可溶性Ｆｌｔ－１、可溶性エンドグリン、及びＰｌＧＦに対する酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）キットは、Ｒ＆Ｄシステムズ社より入手され、メーカーの手順書に従って実施された。
【0034】
免疫組織化学
ホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋されたヒト若しくはマウス胎盤組織の一連の３－５μｍ切片は、以前の記載と同様に29、免疫組織化学のために準備された。ビオチン標識イソレクチンＢ４、抗ＣＳＥ（５ｍｇ／ｍＬ）及びアイソタイプコントロールが使用された。染色したものは、ニコン倒立顕微鏡及びイメージプロプラスイメージ解析ソフトウエア（メディア サイバーネティクス）を用いて解析された。
ホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋されたヒト若しくはマウス胎盤組織の一連の３－５μｍ切片は、以前の記載と同様に29、免疫組織化学のために準備された。ビオチン標識イソレクチンＢ４、抗ＣＳＥ（５ｍｇ／ｍＬ）及びアイソタイプコントロールが使用された。染色したものは、ニコン倒立顕微鏡及びイメージプロプラスイメージ解析ソフトウエア（メディア サイバーネティクス）を用いて解析された。
【0035】
リアルタイムポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）
サンプル準備及びリアルタイム定量ＰＣＲは、以前の記載と同様に30、実施された。簡潔に述べると、ＴＲＩｚｏｌ及びＤＮａｓｅ－１消化／精製 ＲＮＡｅａｓｙ カラム（キアゲン）を使用して胎盤組織よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成キット（プロメガ）を用いて逆転写された。三つ組のｃＤＮＡサンプルとスタンダードは、ＣＳＥ特異的プライマー（ＧＣＣ－ＣＡＧ－ＴＴＣ－ＣＧＴ－ＧＡＡ－ＴＣＴ－ＡＡ； ＣＡＴ－ＧＣＴ－ＧＡＡ－ＧＡＧ－ＴＧＣ－ＣＣＴ－ＴＡ）又はβ－アクチン特異的プライマーを用いてＳＹＢＲグリーンを含むＳｅｎｓｉＭｉｘ（クアンタス）で増幅された。ＣＳＥに対する平均閾値サイクル（ＣＴ）は、β－アクチンで規準化され、コントロールに対する相対として表現された。
サンプル準備及びリアルタイム定量ＰＣＲは、以前の記載と同様に30、実施された。簡潔に述べると、ＴＲＩｚｏｌ及びＤＮａｓｅ－１消化／精製 ＲＮＡｅａｓｙ カラム（キアゲン）を使用して胎盤組織よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成キット（プロメガ）を用いて逆転写された。三つ組のｃＤＮＡサンプルとスタンダードは、ＣＳＥ特異的プライマー（ＧＣＣ－ＣＡＧ－ＴＴＣ－ＣＧＴ－ＧＡＡ－ＴＣＴ－ＡＡ； ＣＡＴ－ＧＣＴ－ＧＡＡ－ＧＡＧ－ＴＧＣ－ＣＣＴ－ＴＡ）又はβ－アクチン特異的プライマーを用いてＳＹＢＲグリーンを含むＳｅｎｓｉＭｉｘ（クアンタス）で増幅された。ＣＳＥに対する平均閾値サイクル（ＣＴ）は、β－アクチンで規準化され、コントロールに対する相対として表現された。
【0036】
インビトロ血管新生アッセイ
成長因子が除去されたマトリゲル（ベクトンディッキンソン、ベッドフォード、ＭＡ）上でのＨＵＶＥＣによる毛細血管様構造の自発的な形成は、血管新生の能力を評価するために使用された。ＨＵＶＥＣは、Ｈ2Ｓ供与体（ＮａＨＳ）の有り若しくは無しで、子癇前症を合併した妊娠及び合併していない妊娠から採取された血漿サンプルとともに処理され、３７℃で２４時間インキュベートされた。メーカーの説明書に従い、マトリゲル（１０ｍｇ／ｍＬ）で９６ウェルプレートがコートされた。６時間のインキュベート後、細胞は、ニコン倒立顕微鏡にて観察され、実験結果は、イメージプロ－プラスイメージ解析ソフトウェア（メディア サイバーネティクス）を用いて記録された。
成長因子が除去されたマトリゲル（ベクトンディッキンソン、ベッドフォード、ＭＡ）上でのＨＵＶＥＣによる毛細血管様構造の自発的な形成は、血管新生の能力を評価するために使用された。ＨＵＶＥＣは、Ｈ2Ｓ供与体（ＮａＨＳ）の有り若しくは無しで、子癇前症を合併した妊娠及び合併していない妊娠から採取された血漿サンプルとともに処理され、３７℃で２４時間インキュベートされた。メーカーの説明書に従い、マトリゲル（１０ｍｇ／ｍＬ）で９６ウェルプレートがコートされた。６時間のインキュベート後、細胞は、ニコン倒立顕微鏡にて観察され、実験結果は、イメージプロ－プラスイメージ解析ソフトウェア（メディア サイバーネティクス）を用いて記録された。
【0037】
血漿中のＨ2Ｓの測定
クエン酸塩添加血は、発症無しの妊婦（ｎ＝１４）及び子癇前症発症妊婦（ｎ＝１４）から得られ、また、妊娠中絶前の妊娠マウスから得られた。Ｈ2Ｓレベルは、以前記載されたものに改変したもので32測定した。簡潔に述べると、７５μＬの血漿に、１％（ｗ／ｖ）酢酸亜鉛及び４２５μＬ水とを混ぜ、続いて、タンパク質を除去するために、２５０ｍＬの５０％トリクロロ酢酸を加えた。その後、７．２ｍＭ ＨＣｌ中の２０ｍＭ Ｎ－ジメチル－ｐ－フェニレンジアミン硫酸塩 １３３μＬ及び、１．２ｍＭ ＨＣｌ中の３０μＭ ＦｅＣｌ3 １３３μＬが混合物へと添加された。室温にて１０分間インキュベートされた後、反応混合物は１０，０００ｇにて遠心分離によって沈殿された（２分間）。得られた溶液の吸光度は、９６ウェルプレートにて、分光光度計を用いて６７０ｎｍで測定された。溶液中のＨ2Ｓの濃度は、硫化水素ナトリウムの検量曲線に対して算出された。
クエン酸塩添加血は、発症無しの妊婦（ｎ＝１４）及び子癇前症発症妊婦（ｎ＝１４）から得られ、また、妊娠中絶前の妊娠マウスから得られた。Ｈ2Ｓレベルは、以前記載されたものに改変したもので32測定した。簡潔に述べると、７５μＬの血漿に、１％（ｗ／ｖ）酢酸亜鉛及び４２５μＬ水とを混ぜ、続いて、タンパク質を除去するために、２５０ｍＬの５０％トリクロロ酢酸を加えた。その後、７．２ｍＭ ＨＣｌ中の２０ｍＭ Ｎ－ジメチル－ｐ－フェニレンジアミン硫酸塩 １３３μＬ及び、１．２ｍＭ ＨＣｌ中の３０μＭ ＦｅＣｌ3 １３３μＬが混合物へと添加された。室温にて１０分間インキュベートされた後、反応混合物は１０，０００ｇにて遠心分離によって沈殿された（２分間）。得られた溶液の吸光度は、９６ウェルプレートにて、分光光度計を用いて６７０ｎｍで測定された。溶液中のＨ2Ｓの濃度は、硫化水素ナトリウムの検量曲線に対して算出された。
【0038】
統計解析
データは、平均±ＳＥＭとして表現される。平均間の違いの有意差は、非パラメトリック マン ホイットニー ｔ－テストによって検定された。臨床サンプルにおける変化の統計解析のために、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）が使用され、続いて、適切な方法で、ステューデント－ニューマン－クールズテストが行われた。治療について知らないオブザーバーが当該解析を実施した。統計学的有意差は、ｐ＜０．０５と位置づけられた。
データは、平均±ＳＥＭとして表現される。平均間の違いの有意差は、非パラメトリック マン ホイットニー ｔ－テストによって検定された。臨床サンプルにおける変化の統計解析のために、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）が使用され、続いて、適切な方法で、ステューデント－ニューマン－クールズテストが行われた。治療について知らないオブザーバーが当該解析を実施した。統計学的有意差は、ｐ＜０．０５と位置づけられた。
【0039】
結果
胎盤ＣＳＥ発現は、子癇前症において減少する。
ＣＳＥ／Ｈ2Ｓ活性が、子癇前症において変化するかどうかを調べるために、妊娠週齢を合わせたコントロール妊婦及び、子癇前症を合併した妊婦由来の血漿において、Ｈ2Ｓが測定された。母親の血漿Ｈ2Ｓレベルは、コントロール群と比較して、子癇前症において、有意に減少した（図１Ａ）。定量的リアルタイムＰＣＲは、子癇前症の胎盤において、ＣＳＥのｍＲＮＡ発現が有意に減少することを示し（図１Ｂ）、免疫組織化学染色が、これらのサンプルにおいてＣＳＥの免疫反応性は劇的に減少することを確認し（図１Ｃｉｖ）、これは、胎盤ＣＳＥレベルの変化が母親の循環するＨ2Ｓレベルに影響を与えることを示唆している。ＣＳＥの発現は、絨毛膜絨毛の中心内の栄養芽細胞、内皮細胞及び間葉系細胞にて位置する。後者は、間葉系の起源であるホフバウアー細胞の可能性がある（図１Ｃｉｉｉ）。本研究の患者の臨床的な特徴は、表１に記載される。
胎盤ＣＳＥ発現は、子癇前症において減少する。
ＣＳＥ／Ｈ2Ｓ活性が、子癇前症において変化するかどうかを調べるために、妊娠週齢を合わせたコントロール妊婦及び、子癇前症を合併した妊婦由来の血漿において、Ｈ2Ｓが測定された。母親の血漿Ｈ2Ｓレベルは、コントロール群と比較して、子癇前症において、有意に減少した（図１Ａ）。定量的リアルタイムＰＣＲは、子癇前症の胎盤において、ＣＳＥのｍＲＮＡ発現が有意に減少することを示し（図１Ｂ）、免疫組織化学染色が、これらのサンプルにおいてＣＳＥの免疫反応性は劇的に減少することを確認し（図１Ｃｉｖ）、これは、胎盤ＣＳＥレベルの変化が母親の循環するＨ2Ｓレベルに影響を与えることを示唆している。ＣＳＥの発現は、絨毛膜絨毛の中心内の栄養芽細胞、内皮細胞及び間葉系細胞にて位置する。後者は、間葉系の起源であるホフバウアー細胞の可能性がある（図１Ｃｉｉｉ）。本研究の患者の臨床的な特徴は、表１に記載される。
【0040】
ＣＳＥ活性の阻害は、胎盤外植片におけるＰｌＧＦ放出を減少する。
胎盤で産生される血管新生因子は、胎盤の血管発生を調節において重要である33。胎盤によって産生されるプロ－及び抗－血管新生因子の不均衡29は、子癇前症において広がっている母性の内皮細胞機能障害の説明になるかもしれない34。減少したＣＳＥレベルが胎盤血管新生因子の産生に影響を与えるかどうかを調べるために、２４時間ＣＳＥ阻害剤であるＰＡＧの増加する濃度の存在の下で、第一三半期のヒト胎盤外植片から調整した溶液において、ｓＦｌｔ－１、ｓＥｎｇ及びＰｌＧＦレベルを測定した。ＣＳＥ活性の阻害によって、ｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇのレベルは変化しない一方、ＰｌＧＦ産生は、有意に減少した（図２）。これは、内在性のＨ2Ｓの減少は、胎盤のｓＦｌｔ－１／ＰｌＧＦ比率を変える可能性を示唆しており、それが、子癇前症の病因であることを暗に示している18,29。加えて、第一三半期の栄養芽細胞（ＨＴＲ－８／ＳＶｎｅｏ）をＣＳＥ特異的阻害剤ＰＡＧ（５０μＭ）とインキュベートしたとき、溶媒コントロールと比較して、細胞侵入における有意な減少（ｐ＜０．０１）が観察され（補充図Ｓ１Ａ及びＳ１Ｂ）、ＣＳＥ活性の欠損は、正常な妊娠を確立するために必須の胎盤灌流に影響を与える可能性があることを示唆している。
胎盤で産生される血管新生因子は、胎盤の血管発生を調節において重要である33。胎盤によって産生されるプロ－及び抗－血管新生因子の不均衡29は、子癇前症において広がっている母性の内皮細胞機能障害の説明になるかもしれない34。減少したＣＳＥレベルが胎盤血管新生因子の産生に影響を与えるかどうかを調べるために、２４時間ＣＳＥ阻害剤であるＰＡＧの増加する濃度の存在の下で、第一三半期のヒト胎盤外植片から調整した溶液において、ｓＦｌｔ－１、ｓＥｎｇ及びＰｌＧＦレベルを測定した。ＣＳＥ活性の阻害によって、ｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇのレベルは変化しない一方、ＰｌＧＦ産生は、有意に減少した（図２）。これは、内在性のＨ2Ｓの減少は、胎盤のｓＦｌｔ－１／ＰｌＧＦ比率を変える可能性を示唆しており、それが、子癇前症の病因であることを暗に示している18,29。加えて、第一三半期の栄養芽細胞（ＨＴＲ－８／ＳＶｎｅｏ）をＣＳＥ特異的阻害剤ＰＡＧ（５０μＭ）とインキュベートしたとき、溶媒コントロールと比較して、細胞侵入における有意な減少（ｐ＜０．０１）が観察され（補充図Ｓ１Ａ及びＳ１Ｂ）、ＣＳＥ活性の欠損は、正常な妊娠を確立するために必須の胎盤灌流に影響を与える可能性があることを示唆している。
【0041】
ＣＳＥは内皮細胞においてｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇの放出を調節する
子癇前症の患者において、胎盤は、ｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇ放出の主な源泉であると考えられているが、いくつかの研究は、出産後平均１８ヶ月の子癇前症を罹患していない女性と比較して、子癇前症の既往歴を有する女性において、ｓＦｌｔ－１のレベルがより高く維持されていることを示しており35,36、これは、他の血管新生環境が、そのプロセスに関わっていることを示唆している。ＣＳＥが、内皮細胞においてｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇ放出に影響を与えるかどうかを調べるために、ＨＵＶＥＣのＣＳＥ発現を、ｓｉＲＮＡ又はアデノウイルスにて調整した。ＣＳＥの下方制御は、ｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇ両方の放出を上昇し（図３Ａ、３Ｂ）、一方でＣＳＥの過剰発現は、ＨＵＶＥＣによるｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇの放出を阻害した（図３Ｃ、３Ｄ）。これらのデータは、ＣＳＥ活性の欠損が、子癇前症の病因に寄与しうるコンセプトをさらに支持する。
子癇前症の患者において、胎盤は、ｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇ放出の主な源泉であると考えられているが、いくつかの研究は、出産後平均１８ヶ月の子癇前症を罹患していない女性と比較して、子癇前症の既往歴を有する女性において、ｓＦｌｔ－１のレベルがより高く維持されていることを示しており35,36、これは、他の血管新生環境が、そのプロセスに関わっていることを示唆している。ＣＳＥが、内皮細胞においてｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇ放出に影響を与えるかどうかを調べるために、ＨＵＶＥＣのＣＳＥ発現を、ｓｉＲＮＡ又はアデノウイルスにて調整した。ＣＳＥの下方制御は、ｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇ両方の放出を上昇し（図３Ａ、３Ｂ）、一方でＣＳＥの過剰発現は、ＨＵＶＥＣによるｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇの放出を阻害した（図３Ｃ、３Ｄ）。これらのデータは、ＣＳＥ活性の欠損が、子癇前症の病因に寄与しうるコンセプトをさらに支持する。
【0042】
Ｈ2Ｓは、子癇前症の血漿が誘導するインビトロ管形成阻害を一部回復させる
子癇前症の胎盤から産生される過剰なｓＦｌｔ－１は、インビトロでの内皮細胞管腔形成を阻害し、子癇前症サンプル由来のｓＦｌｔ－１の除去は血管新生を回復することが証明されている29。Ｈ2Ｓが子癇前症の抗血管新生効果を逆行することができるかどうか評価するために、正常血圧又は子癇前症の女性由来の血漿を、Ｈ2Ｓ供与体の ＮａＨＳ １００ｍＭ存在下の成長因子除去マトリゲル上で生育したＨＵＶＥＣに添加して、インビトロ管腔形成アッセイを実施した。以前の発見と一致して、子癇前症の血漿は、正常コントロール血清と比較して、毛細血管ネットワーク形成を阻害した（図４）。さらに重要なことに、Ｈ2Ｓの供与体であるＮａＨＳは、管腔様構造を形成するためのＨＵＶＥＣの能力を一部回復した（図４Ａ、４Ｂ）。
子癇前症の胎盤から産生される過剰なｓＦｌｔ－１は、インビトロでの内皮細胞管腔形成を阻害し、子癇前症サンプル由来のｓＦｌｔ－１の除去は血管新生を回復することが証明されている29。Ｈ2Ｓが子癇前症の抗血管新生効果を逆行することができるかどうか評価するために、正常血圧又は子癇前症の女性由来の血漿を、Ｈ2Ｓ供与体の ＮａＨＳ １００ｍＭ存在下の成長因子除去マトリゲル上で生育したＨＵＶＥＣに添加して、インビトロ管腔形成アッセイを実施した。以前の発見と一致して、子癇前症の血漿は、正常コントロール血清と比較して、毛細血管ネットワーク形成を阻害した（図４）。さらに重要なことに、Ｈ2Ｓの供与体であるＮａＨＳは、管腔様構造を形成するためのＨＵＶＥＣの能力を一部回復した（図４Ａ、４Ｂ）。
【0043】
内在性Ｈ2Ｓの遮断は、妊娠マウスにおいて高血圧及び異常胎盤血管新生を引き起こす。
発明者らは、インビボにおいてＣＳＥの阻害は、妊娠マウスにおいて子癇前症様の症候群を引き起こすと予測した。妊娠Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスの３つの群（５～８／群）は、Ｅ８．５からＥ１６．５まで、溶媒又は２５ｍｇ／ｋｇ ＰＡＧ又は５０ｍｇ／ｋｇ ＰＡＧで毎日処理された。処理８日後、それぞれの処理群の全ての動物から血漿をプールし、プールしたＨ2Ｓのレベルを測定した。ＰＡＧは、投与量依存的に循環しているＨ2Ｓレベルの減少を引き起こした。投与量が高いものは、血漿Ｈ2Ｓレベルを約５０％減少した（図５Ａ）。これらのデータとは反対に、発明らは、高いＰＡＧ投与量処理群において平均血圧が、溶媒コントロールと比較して有意に高いことを見いだした（７４．４０±４．６１ 及び ６４．７４±２．０４）（表２）。タンパク尿のような腎臓の病理上の変化は、発明者らのＰＡＧ処理動物において認められなかったが（表２）、循環している肝臓酵素アスパルギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）のレベルの上昇によって示される肝障害が、ＰＡＧ処理動物において見出された（表２）。これらのデータは、ＣＳＥ活性の欠如が、非タンパク尿の子癇前症を引き起こしうることを示唆する。興味深いことに、ＰＡＧ処理した妊娠マウスの全ての変化は、Ｈ2Ｓを生成する化合物ＧＹＹ４１３７（０．２５ｍｇ／ｋｇ）処理のゆっくりとした放出によって抑制された（表２）。胎盤切片のブラインドの組織学解析は、ラビリンスゾーン（ｌａｂｙｒｉｎｔｈ ｚｏｎｅ）の母性血液領域（ｍａｔｅｒｎａｌ ｂｌｏｏｄ ｓｐａｃｅ）が、溶媒コントロールよりも５０ｍｇ／ｋｇ ＰＡＧ処理動物の方がより大きく出現することを示した（図５Ｂ）。ラビリンスゾーンは、栄養芽細胞及び中胚葉の起源の細胞から成り、一緒になって枝分かれ形態を経て、その結果、母親と胎児との間の栄養分及びガス交換のための広大な表面領域となる。母性血管領域は、栄養芽細胞が並んでいる。胎盤が発生する間、この領域は、連続的によりきれいに分かれるようになる37,38。胎児内皮細胞を際立たせるたせるために、イソレクチンＢ４を使用して39、発明者らは、溶媒処理及び５０ｍｇ／ｋｇ ＰＡＧ処理マウスのラビリンスゾーンの解剖学的な特徴を比較した。コントロールマウスにおいては、ラビリンスは、よく発達した分枝形態を有する組織化された胎児の導管のように観察された。反対に、ＰＡＧ処理した動物の胎盤の胎児の脈管構造は、不規則な分枝形成が観察され（図５Ｃ）、母性の脈管構造が拡張されているように見える。ＰＡＧ処理動物由来の胎盤の形態より、胎盤の血管の欠損は、ＣＳＥ活性の阻害によるものであると示唆される。この欠損も、Ｈ2Ｓ供与体ＧＹＹ４１３７処理によっても回復される（図Ｓ２）。
発明者らは、インビボにおいてＣＳＥの阻害は、妊娠マウスにおいて子癇前症様の症候群を引き起こすと予測した。妊娠Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスの３つの群（５～８／群）は、Ｅ８．５からＥ１６．５まで、溶媒又は２５ｍｇ／ｋｇ ＰＡＧ又は５０ｍｇ／ｋｇ ＰＡＧで毎日処理された。処理８日後、それぞれの処理群の全ての動物から血漿をプールし、プールしたＨ2Ｓのレベルを測定した。ＰＡＧは、投与量依存的に循環しているＨ2Ｓレベルの減少を引き起こした。投与量が高いものは、血漿Ｈ2Ｓレベルを約５０％減少した（図５Ａ）。これらのデータとは反対に、発明らは、高いＰＡＧ投与量処理群において平均血圧が、溶媒コントロールと比較して有意に高いことを見いだした（７４．４０±４．６１ 及び ６４．７４±２．０４）（表２）。タンパク尿のような腎臓の病理上の変化は、発明者らのＰＡＧ処理動物において認められなかったが（表２）、循環している肝臓酵素アスパルギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）のレベルの上昇によって示される肝障害が、ＰＡＧ処理動物において見出された（表２）。これらのデータは、ＣＳＥ活性の欠如が、非タンパク尿の子癇前症を引き起こしうることを示唆する。興味深いことに、ＰＡＧ処理した妊娠マウスの全ての変化は、Ｈ2Ｓを生成する化合物ＧＹＹ４１３７（０．２５ｍｇ／ｋｇ）処理のゆっくりとした放出によって抑制された（表２）。胎盤切片のブラインドの組織学解析は、ラビリンスゾーン（ｌａｂｙｒｉｎｔｈ ｚｏｎｅ）の母性血液領域（ｍａｔｅｒｎａｌ ｂｌｏｏｄ ｓｐａｃｅ）が、溶媒コントロールよりも５０ｍｇ／ｋｇ ＰＡＧ処理動物の方がより大きく出現することを示した（図５Ｂ）。ラビリンスゾーンは、栄養芽細胞及び中胚葉の起源の細胞から成り、一緒になって枝分かれ形態を経て、その結果、母親と胎児との間の栄養分及びガス交換のための広大な表面領域となる。母性血管領域は、栄養芽細胞が並んでいる。胎盤が発生する間、この領域は、連続的によりきれいに分かれるようになる37,38。胎児内皮細胞を際立たせるたせるために、イソレクチンＢ４を使用して39、発明者らは、溶媒処理及び５０ｍｇ／ｋｇ ＰＡＧ処理マウスのラビリンスゾーンの解剖学的な特徴を比較した。コントロールマウスにおいては、ラビリンスは、よく発達した分枝形態を有する組織化された胎児の導管のように観察された。反対に、ＰＡＧ処理した動物の胎盤の胎児の脈管構造は、不規則な分枝形成が観察され（図５Ｃ）、母性の脈管構造が拡張されているように見える。ＰＡＧ処理動物由来の胎盤の形態より、胎盤の血管の欠損は、ＣＳＥ活性の阻害によるものであると示唆される。この欠損も、Ｈ2Ｓ供与体ＧＹＹ４１３７処理によっても回復される（図Ｓ２）。
【0044】
胎児の予後並びにｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇ産生におけるＣＳＥ活性の阻害の効果
胎児の体重は、ＰＡＧの高い投与量を受けたマウスにおいて有意に減少した（図６Ａ）。これは、ＣＳＥ活性の阻害によって誘導される胎盤血管欠損によって説明することができる。０．２５ｍｇ／ｋｇのＧＹＹ４１３７は、ＣＳＥ阻害剤によって障害をうけた胎児の成長を回復させた。（図６Ａ）。さらに、ＧＹＹ４１３７は、５０ｍｇ／ｋｇ ＰＡＧで処理したマウスにおいて（図５Ｂ及び５Ｃ）、ＣＳＥ阻害が誘導されたｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇの血漿レベルを阻害する（図６Ｂ及び６Ｃ）。血漿ＰｌＧＦは、アッセイの検出感度未満であった。これらのデータは、ＣＳＥ活性は母性の血管新生のバランスを変え、Ｈ2Ｓは正常な血管新生状態を回復することを助けることができる。
胎児の体重は、ＰＡＧの高い投与量を受けたマウスにおいて有意に減少した（図６Ａ）。これは、ＣＳＥ活性の阻害によって誘導される胎盤血管欠損によって説明することができる。０．２５ｍｇ／ｋｇのＧＹＹ４１３７は、ＣＳＥ阻害剤によって障害をうけた胎児の成長を回復させた。（図６Ａ）。さらに、ＧＹＹ４１３７は、５０ｍｇ／ｋｇ ＰＡＧで処理したマウスにおいて（図５Ｂ及び５Ｃ）、ＣＳＥ阻害が誘導されたｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇの血漿レベルを阻害する（図６Ｂ及び６Ｃ）。血漿ＰｌＧＦは、アッセイの検出感度未満であった。これらのデータは、ＣＳＥ活性は母性の血管新生のバランスを変え、Ｈ2Ｓは正常な血管新生状態を回復することを助けることができる。
【0045】
考察
ＣＳＥ阻害剤の慢性的な投与は、ラットにおいて、Ｈ2Ｓの減少を誘導し、血圧を上昇させる7。このように、循環するＨ2Ｓレベルの減少は子癇前症における高血圧に寄与しうることはもっともらしい。本研究において、発明者らは、内在性Ｈ2Ｓの産生を担う鍵となる酵素の胎盤ＣＳＥの下方制御を伴う、循環しているＨ2Ｓの減少と、子癇前症とが関連しているという証拠を提供する。さらに、妊娠マウスにおいてＣＳＥの阻害は、高血圧を誘導し、ｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇのレベルを上昇させ、胎盤異常を引き起こす。これは、循環するｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇのレベルを阻害し、ＣＳＥ阻害によって損なわれた胎児の成長を回復する、Ｈ2Ｓの産生化合物であるＧＹＹ４１３７のゆっくりと放出することのような、Ｈ2Ｓ産生の阻害を要因とする。これらの発見は、機能障害があるＣＳＥ／Ｈ2Ｓ経路が、子癇前症の病因に寄与しうることを示す。
ＣＳＥ阻害剤の慢性的な投与は、ラットにおいて、Ｈ2Ｓの減少を誘導し、血圧を上昇させる7。このように、循環するＨ2Ｓレベルの減少は子癇前症における高血圧に寄与しうることはもっともらしい。本研究において、発明者らは、内在性Ｈ2Ｓの産生を担う鍵となる酵素の胎盤ＣＳＥの下方制御を伴う、循環しているＨ2Ｓの減少と、子癇前症とが関連しているという証拠を提供する。さらに、妊娠マウスにおいてＣＳＥの阻害は、高血圧を誘導し、ｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇのレベルを上昇させ、胎盤異常を引き起こす。これは、循環するｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇのレベルを阻害し、ＣＳＥ阻害によって損なわれた胎児の成長を回復する、Ｈ2Ｓの産生化合物であるＧＹＹ４１３７のゆっくりと放出することのような、Ｈ2Ｓ産生の阻害を要因とする。これらの発見は、機能障害があるＣＳＥ／Ｈ2Ｓ経路が、子癇前症の病因に寄与しうることを示す。
【0046】
Ｈ2Ｓは、平滑筋の弛緩を引き起こすＫATPチャネルを通して作用する血管弛緩性因子である1,40。ＣＳＥを遺伝的に欠損したマウスを使用した研究は、この酵素が、血管系及び末梢組織の両方において、Ｈ2Ｓの主要な源であることを証明した9。近年、ＣＳＥ発現が、胎盤及び妊娠した子宮筋層において見いだされ、それは、子宮の収縮性において役割を果たしていることが示された27,28。本研究において、胎盤ＣＳＥレベルは、正常血圧コントロールと比較して、子癇前症患者において劇的に減少していた。近年の研究もまた、子癇前症胎盤のＣＳＥにおいて、同様なパターンを示した41。これらの発見は、ＣＳＥの欠損は、循環するＨ2Ｓの減少を導くことを示唆する。
【0047】
血管新生の不均衡は、全身性炎症の子癇前症における主要な犯人として強調されている42,43。本研究では、ＣＳＥは、内皮細胞において、抗血管新生因子、ｓＦｌｔ－１及びｓＥｎｇのネガティブ制御因子として見いだされ、ＣＳＥの異常調節は、子癇前症の既往歴がある女性において、継続する内皮細胞の機能不全と心血管系疾患のリスク上昇に寄与する可能性を示唆している。加えて、子癇前症におけるＶＥＧＦとＰｌＧＦ活性の減少は、過剰なｓＦｌｔ－１の結果と信じられている16,18。ｓＦｌｔ－１のレベルは、妊娠の第一三半期間中、健常コントロールと同等であるので、この理論は、その後子癇前症を発症する女性において、なぜＰｌＧＦの循環するレベルが妊娠初期において低いかを説明しない44。ＣＳＥ阻害剤による内在性の胎盤Ｈ2Ｓ産生の阻害が、第一三半期の胎盤外植片におけるＰｌＧＦの産生を弱めるという発明者らの発見は、可能性のある説明と、テストすることに対する新しい仮説を提供する：つまり、初期妊娠におけるＰｌＧＦの減少は、Ｈ2Ｓを産生する酵素の欠損又は減少が原因である。さらに、ＣＳＥ活性の阻害は、第一三半期の絨毛外の栄養芽細胞の侵入を消滅させ、ＣＳＥ／Ｈ2Ｓ経路の調整不全は、胎盤のプロ-及び抗-血管新生因子の均衡を変えるだけで無く、母性のらせん動脈の再構築及び胎盤発生を調整不全にする可能性があることを示唆している。
【0048】
妊娠マウスにおいて、ＣＳＥの阻害は、内在性Ｈ2Ｓを減少し、これは、血圧の上昇、並びに、タンパク尿及び非タンパク尿の子癇前症と同様な症候群である糸球体内皮症等の腎臓の病理学的変化の無い肝障害を伴った。しかしながら、他の因子もまた、広範囲の子癇前症に関与していることも示唆される。子癇前症は、絨毛の量、表面領域の損傷並びに胎盤血管新生の減少を含む、胎盤奇形を強く伴っている14,45。ＰＡＧ処理マウスでは、胎児のラビリンスは、分枝形態形成が損なわれることが示されており、これは、内在性のＨ2Ｓが胎盤発生に必要であることを示している。
【0049】
障害性の胎盤灌流、並びに、最適以下の酸素及び栄養の拡散は、変化したパターニング、分枝化及び肥大を有する不適当なラビリンス血管新生の結果として起こることが報告されている46。ＰＡＧ処理によって損なわれた血圧、肝臓機能、及び胎児の体重は、Ｈ2Ｓ産生化合物、ＧＹＹ４１３７のゆっくりとした放出によって回復され、ＣＳＥ阻害剤の効果は、Ｈ2Ｓ産生の阻害に起因するものであることを証明している。これらの結果は、内在性のＨ2Ｓは、胎児の健康状態を支持するための健康的な胎盤血管新生に必要であることを暗示している。
【0050】
臨床的な展望
本研究は、ＣＳＥ／Ｈ2Ｓ経路の異常調節は子癇前症と関連すること、及び、妊娠マウスにおけるＣＳＥ活性の阻害が、高血圧や障害のある胎児の結果を含んだ子癇前症のいくつかの特徴を生み出すことを示している。これらの発見は、Ｈ2Ｓが胎盤の脈管構造発生の重要な調整因子であるという考えを支持するもので有り、その欠損は、子癇前症や胎児の成長制限と関連するものと思われる。
本研究は、ＣＳＥ／Ｈ2Ｓ経路の異常調節は子癇前症と関連すること、及び、妊娠マウスにおけるＣＳＥ活性の阻害が、高血圧や障害のある胎児の結果を含んだ子癇前症のいくつかの特徴を生み出すことを示している。これらの発見は、Ｈ2Ｓが胎盤の脈管構造発生の重要な調整因子であるという考えを支持するもので有り、その欠損は、子癇前症や胎児の成長制限と関連するものと思われる。
【0051】
補足的方法
栄養芽細胞侵入アッセイ
ヒト外絨毛栄養芽細胞（ＥＶＴ）細胞株ＨＴＲ－８／ＳＶｎｅｏは、チャールズ Ｈ．グラハム教授、クイーンズ大学、キングストーン、オンタリオ、カナダ、より親切に提供されたものであった。侵入アッセイは、以前記載と同様の方法に、改変を伴って実施された30。簡潔に述べると、ＰＡＧ有り又は無しで処理されたＨＴＲ－８／ＳＶｎｅｏ（５０，０００）細胞を、マトリゲルをコートした（１ｍｇ／ｍＬ）透過ウェルインサート（８μｍ孔、ファルコン、ＢＤ、ＵＫ）の上のチャンバーに載せ、２４ウェルプレートの中に収容した。細胞は、５０μＭ ＰＡＧの存在又は非存在下（ｎ＝３）で、２４時間、再構築された細胞外マトリックスを通して侵入することが許容された。透過膜の表面の下に位置する栄養芽細胞は氷冷メタノールで固定され、ヘマトキシリンで染色され、ニコン倒立顕微鏡及びイメージプロプラスイメージ解析ソフト（メディア サイバーネティクス）を用いて明視野像が得られた。
栄養芽細胞侵入アッセイ
ヒト外絨毛栄養芽細胞（ＥＶＴ）細胞株ＨＴＲ－８／ＳＶｎｅｏは、チャールズ Ｈ．グラハム教授、クイーンズ大学、キングストーン、オンタリオ、カナダ、より親切に提供されたものであった。侵入アッセイは、以前記載と同様の方法に、改変を伴って実施された30。簡潔に述べると、ＰＡＧ有り又は無しで処理されたＨＴＲ－８／ＳＶｎｅｏ（５０，０００）細胞を、マトリゲルをコートした（１ｍｇ／ｍＬ）透過ウェルインサート（８μｍ孔、ファルコン、ＢＤ、ＵＫ）の上のチャンバーに載せ、２４ウェルプレートの中に収容した。細胞は、５０μＭ ＰＡＧの存在又は非存在下（ｎ＝３）で、２４時間、再構築された細胞外マトリックスを通して侵入することが許容された。透過膜の表面の下に位置する栄養芽細胞は氷冷メタノールで固定され、ヘマトキシリンで染色され、ニコン倒立顕微鏡及びイメージプロプラスイメージ解析ソフト（メディア サイバーネティクス）を用いて明視野像が得られた。
【0052】
免疫組織化学
ホルマリン固定、パラフィン包埋マウス胎盤組織の一連の３～５μｍ切片が、以前記載された方法48に従って、免疫組織化学のために準備された。ビオチン標識化イソレクチンＢ４が使用された。染色したものは、ニコン倒立顕微鏡及びイメージプロプラスイメージ解析ソフト（メディア サイバーネティクス）を使用して解析された。
ホルマリン固定、パラフィン包埋マウス胎盤組織の一連の３～５μｍ切片が、以前記載された方法48に従って、免疫組織化学のために準備された。ビオチン標識化イソレクチンＢ４が使用された。染色したものは、ニコン倒立顕微鏡及びイメージプロプラスイメージ解析ソフト（メディア サイバーネティクス）を使用して解析された。
【0053】
図７ 栄養芽細胞侵入におけるＣＳＥの阻害効果
５０μＭのＰＡＧの存在下におけるＨＴＲ－８／ＳＶｎｅｏ細胞の透過ウェル遊走アッセイが、方法に記載されたものに従い、実施された。（Ａ）遊走したＨＴＲ－８／ＳＶｎｅｏは、ヘマトキシリンで染色し、明視野像が捕らえられた。（Ｂ）細胞数が計数され、結果は、コントロールの割合として表現される（ｎ＝３）。
５０μＭのＰＡＧの存在下におけるＨＴＲ－８／ＳＶｎｅｏ細胞の透過ウェル遊走アッセイが、方法に記載されたものに従い、実施された。（Ａ）遊走したＨＴＲ－８／ＳＶｎｅｏは、ヘマトキシリンで染色し、明視野像が捕らえられた。（Ｂ）細胞数が計数され、結果は、コントロールの割合として表現される（ｎ＝３）。
【0054】
図８ Ｈ2Ｓ供与体は、妊娠マウスにおいて胎盤血管新生を回復する。
（Ａ）ＰＡＧ ５０ｍｇ／ｋｇ、又は（Ｂ）ＰＡＧ ５０ｍｇ／ｋｇ＋ＧＹＹ４１３７注射のいずれかを受けたマウス由来の胎盤組織は切片化され、ヒーモトリコリアル（ｈａｅｍｏｔｒｉｃｈｏｒｉａｌ）ラビリンスゾーンを可視化するためにイソレクチンＢ４で染色された。
（Ａ）ＰＡＧ ５０ｍｇ／ｋｇ、又は（Ｂ）ＰＡＧ ５０ｍｇ／ｋｇ＋ＧＹＹ４１３７注射のいずれかを受けたマウス由来の胎盤組織は切片化され、ヒーモトリコリアル（ｈａｅｍｏｔｒｉｃｈｏｒｉａｌ）ラビリンスゾーンを可視化するためにイソレクチンＢ４で染色された。
【0055】
【表1】
【0056】
【表2】
【0057】
【表3】
【0058】
【表4】
【0059】
【表5】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】