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特許7548946障害および疾患を診断し、薬物の反応を判断するための機械学習システム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-02
(45)【発行日】2024-09-10
(54)【発明の名称】障害および疾患を診断し、薬物の反応を判断するための機械学習システム
(51)【国際特許分類】
G01N 33/84 20060101AFI20240903BHJP
G06N 20/00 20190101ALI20240903BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20240903BHJP
【ＦＩ】
G01N33/84 Z
G06N20/00
G01N33/48 M
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2021571469
(86)(22)【出願日】2020-05-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-08
(86)【国際出願番号】 US2020035331
(87)【国際公開番号】W WO2020247273
(87)【国際公開日】2020-12-10
【審査請求日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】62/856,631
(32)【優先日】2019-06-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】517125100
【氏名又は名称】サンフォード バーンハム プレビス メディカル ディスカバリー インスティテュート
(74)【復代理人】
【識別番号】110003797
【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所
(74)【代理人】
【識別番号】100082072
【弁理士】
【氏名又は名称】清原 義博
(72)【発明者】
【氏名】ペルニア，キャメロン
(72)【発明者】
【氏名】トルヒャー，ヘザー
(72)【発明者】
【氏名】スナイダー，エバン ワイ．
【審査官】海野 佳子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／１０６７１３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１０４５２８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１３２３１１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】欧州特許出願公開第０２８７８６０２（ＥＰ，Ａ１）
【文献】Tobe, et al.，Probing the Lithium-response Pathway in hiPSCs implicates the Phosphoregulatory set-point for a Cytoskeletal Modulator in Bipolar Pathogenesis，PNAS，National Academy of Sciences，2017年05月12日，114(22)，E4462-E4471，https://doi.org/10.1073/pnas.1700111114，ISR/ESR D2
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
分類システムであって、前記分類システムは、ユーザーインターフェースと、
細胞イメージングデバイスと、
１つ以上のプロセッサと、
前記１つ以上のプロセッサに連結され、命令が格納されているコンピュータ可読記憶装置と、を備え、
前記命令は、前記１つ以上のプロセッサによって実行される場合、
ｉ）前記細胞イメージングデバイスから、個体に由来するニューロン培養物のカルシウム動態学的特徴を含む画像データを受け取ることと、
ｉｉ）ニューロンカルシウムデータを使用してトレーニングされた機械学習モデルを通して前記画像データを処理して、前記カルシウム動態学的特徴に基づいて前記個体の疾患状態を判断することと、
ｉｉｉ）前記ユーザーインターフェースに前記判断を提供することと
を含む動作を、前記１つ以上のプロセッサに実行させる、分類システムであり、
ここで、前記判断が、アルツハイマー病、パーキンソン病、リチウム非応答性双極性障害またはリチウム応答性双極性障害についてのものである、分類システム。
【請求項2】
前記動作が、前記機械学習モデルを通して前記画像データを処理し、前記個体が治療に反応するか否かを判断することを含む、請求項１に記載の分類システム。
【請求項3】
前記治療が双極性障害（ＢＰＤ）のための炭酸リチウムを含む、請求項２に記載の分類システム。
【請求項4】
前記判断は、前記個体がリチウム応答性であるかまたはリチウム非応答性であるかを含む、請求項１に記載の分類システム。
【請求項5】
前記ニューロンカルシウムデータがカルシウム動態学的特徴を含む、請求項１に記載の分類システム。
【請求項6】
前記カルシウム動態学的特徴が、基礎カルシウムレベル、ピークカルシウム一時性、およびカルシウム事象頻度を含む、請求項５に記載の分類システム。
【請求項7】
前記カルシウム動態学的特徴が、カルシウム事象流入、カルシウム事象流出、またはカルシウム事象振幅のうちの少なくとも１つを含む、請求項６に記載の分類システム。
【請求項8】
個体スクリーニングのためのコンピュータ実装方法であって、前記方法は、１つ以上のプロセッサによって実行され、そしてｉ）細胞イメージングデバイスから、個体に由来するニューロン培養物のカルシウム動態学的特徴を含む画像データを受け取る工程と、
ｉｉ）ニューロンカルシウムデータを使用してトレーニングされた機械学習モデルを通して前記画像データを処理して、前記カルシウム動態学的特徴に基づいて前記個体の疾患状態を判断する工程と、
ｉｉｉ）ユーザーインターフェースに前記判断を提供する工程と
を含む、方法であり、
ここで、前記判断が、アルツハイマー病、パーキンソン病、リチウム非応答性双極性障害またはリチウム応答性双極性障害についてのものである、方法。
【請求項9】
前記機械学習モデルを通して前記画像データを処理して、前記個体が治療に反応するか否かを判断する工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記機械学習モデルを通して前記画像データを処理して、前記個体の薬物反応性を判断する工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記判断は、前記個体がリチウム応答性であるかまたはリチウム非応答性であるかを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
前記機械学習モデルが、過剰適合を防止し、かつ前記機械学習モデルに過剰バイアスをかけないようにするための勾配ブースト分類子を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項13】
前記ニューロンカルシウムデータがカルシウム動態学的特徴を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項14】
前記カルシウム動態学的特徴が、基礎カルシウムレベル、ピークカルシウム一時性、およびカルシウム事象頻度を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記カルシウム動態学的特徴が、カルシウム事象流入、カルシウム事象流出、またはカルシウム事象振幅のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記ニューロンカルシウムデータの一部は、前記機械学習モデルをトレーニングするために使用され、前記ニューロンカルシウムデータの残りの部分は、トレーニングされた後に前記機械学習モデルをテストするために利用され、ｉ）前記ニューロンカルシウムデータの前記一部は、トレーニング用にデータの７０パーセントを含み、前記ニューロンカルシウムデータの前記残りの部分は、検証用にデータの３０パーセントを含むか、または
ｉｉ）前記ニューロンカルシウムデータの前記一部は、トレーニング用にデータの８０パーセントを含み、前記ニューロンカルシウムデータの前記残りの部分は、検証用にデータの２０パーセントを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項17】
前記画像データが細胞内カルシウムレベルトレースを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項18】
前記ニューロン培養物がコラプシン応答メディエータータンパク質－２（ＣＲＭＰ２）－ノックアウト（ＫＯ）、ＣＲＭＰ２ノックイン（ＫＩ）、およびＷＴ Ｅ１６．５一次海馬ニューロンを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項19】
前記ニューロン培養物は、前記個体からの血液サンプルに由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項20】
前記判断がアルツハイマー病、またはパーキンソン病についてのものである、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年６月３日に出願された米国仮特許出願第６２／８５６，６３１号の利益を主張している。優先権は３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に従って主張されている。上記の特許出願は、本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み込まれる。
この出願は、２０１９年６月３日に出願された米国仮特許出願第６２／８５６，６３１号の利益を主張している。優先権は３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に従って主張されている。上記の特許出願は、本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
背景
機械学習の主題には、それらの複数の明示における学習プロセスのコンピュータモデリングの研究が含まれる。一般に、学習プロセスには、新しい宣言的知識の獲得、指導または実践による運動および認知スキルの活発化（ｄｅｖｉｌｍｅｎｔ）、新しい知識の一般的で効果的な表現への組織化、ならびに観察および実験による新しい事実および理論の発見などのさまざまな側面が含まれる。このような能力をコンピュータに組み込むことは、コンピュータ時代の始まり以来、コンピュータ科学者の目標であった。しかし、この問題を解決することは、人工知能（ＡＩ）において最も困難な目標であり、そして現在も続いている。人間ベースの意思決定とは異なり、機械学習アルゴリズムが組み込まれた意思決定支援システムは、信頼性が高いため、破損がない。履歴データの理解、傾向の同定、季節パターン、異常、出現しているパターンを特定するには時間がかかり、エラーが発生しやすくなる。機械学習アルゴリズムはルールを効率的に学習するため、これらの信号の識別を可能にし、将来の結果に関する正確な予測を提供する。
機械学習の主題には、それらの複数の明示における学習プロセスのコンピュータモデリングの研究が含まれる。一般に、学習プロセスには、新しい宣言的知識の獲得、指導または実践による運動および認知スキルの活発化（ｄｅｖｉｌｍｅｎｔ）、新しい知識の一般的で効果的な表現への組織化、ならびに観察および実験による新しい事実および理論の発見などのさまざまな側面が含まれる。このような能力をコンピュータに組み込むことは、コンピュータ時代の始まり以来、コンピュータ科学者の目標であった。しかし、この問題を解決することは、人工知能（ＡＩ）において最も困難な目標であり、そして現在も続いている。人間ベースの意思決定とは異なり、機械学習アルゴリズムが組み込まれた意思決定支援システムは、信頼性が高いため、破損がない。履歴データの理解、傾向の同定、季節パターン、異常、出現しているパターンを特定するには時間がかかり、エラーが発生しやすくなる。機械学習アルゴリズムはルールを効率的に学習するため、これらの信号の識別を可能にし、将来の結果に関する正確な予測を提供する。
【0003】
要約
最も一般的で、致命的で、かつ社会的に影響力のある精神疾患は、双極性障害（ＢＰＤ）である。ＢＰＤは、成人人口の２．６％が罹患している神経精神疾患である。ＢＰＤは慢性疾患であり、躁病とうつ病の振動エピソードを特徴とし、歴史的に大うつ病性障害とともに気分障害と見なされている。ＢＰＤの遺伝率は約８０％であり、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）はいくつかの染色体領域をＢＰＤと結び付けているが、研究者達は、この疾患を示す単一の遺伝子異常を見つけることができなかった。この分野における現在の理解は、ＢＤは遺伝子変異の合流点として現れる複雑な多遺伝子性疾患である可能性が高いということである。
最も一般的で、致命的で、かつ社会的に影響力のある精神疾患は、双極性障害（ＢＰＤ）である。ＢＰＤは、成人人口の２．６％が罹患している神経精神疾患である。ＢＰＤは慢性疾患であり、躁病とうつ病の振動エピソードを特徴とし、歴史的に大うつ病性障害とともに気分障害と見なされている。ＢＰＤの遺伝率は約８０％であり、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）はいくつかの染色体領域をＢＰＤと結び付けているが、研究者達は、この疾患を示す単一の遺伝子異常を見つけることができなかった。この分野における現在の理解は、ＢＤは遺伝子変異の合流点として現れる複雑な多遺伝子性疾患である可能性が高いということである。
【0004】
アルツハイマー病は、脳細胞を浪費（変性）させて死に至らしめる進行性障害である。アルツハイマー病は認知症の最も一般的な原因である－思考、行動、社会的スキルの継続的な低下により、個人が独立して機能する能力が損なわれる。
【0005】
パーキンソン病は、運動に影響を与える進行性神経系障害である。症状は徐々に始まり、片手のみにおいてかろうじて気付くことができる震えから始まることもある。震えは一般的であるが、障害は一般的にこわばりや動きの鈍化を引き起こす。
【0006】
ＢＰＤは、高い自殺率のために最も致命的な精神疾患であり、その根底にある病状に関してはほとんど知られていない。国立精神衛生研究所（ＮＩＨＭ）は、ＢＰＤ患者の６９％が最初に誤診され、３分の１以上が１０年以上誤診されたままであることを見出した。さらに、ＮＩＨＭによると、ＢＰＤ患者は、効果的な治療オプションを見つける前に、何年にもわたる薬物試験を経験する可能性があり、これは、高い経済的および生活の質のコストがかかる。さらに、世界保健機関（ＷＨＯ）によると、ＢＰＤは、経済的生産性を低下させる世界で６番目に影響力のある疾患である。
【0007】
現在、ＢＰＤを治療するための高い信頼性で安全にまたは予測可能に有効な治療法はない。しかし、組み合わせアプローチを通じて、ヒトの人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来のニューロン、動物モデル、およびヒトの組織を利用して、記載される分類システムの開発により、ＢＰＤの「リチウム応答経路」が特に樹状突起および樹状突起棘の主要な細胞骨格調節因子であるコラプシン応答メディエータータンパク質２（ＣＲＭＰ２）のリン酸化および活性化を支配していることが実証されてきた。さらに、記載される分類システムの開発は、ニューロンのＣＲＭＰ２活性の低下が、疾患を予測する特徴的なパターンに対して扱いやすい、機能低下したニューロンネットワークを作成する過活動ニューロンシグナル伝達を引き起こすことを示す。記載される分類システムは、アルツハイマー病やパーキンソン病などの疾患を診断するためにも利用できる。
【0008】
ＣＲＭＰ２の「不活性：活性」設定値は、ＢＰＤにおいてより高い。リチウム治療は、脊椎の形態と機能とともに活性ＣＲＭＰ２レベルを正常化する。内因性、不在、および構成的に活性なＣＲＭＰ２有するトランスジェニックマウスを比較することにより、ＣＲＭＰ２活性がニューロンのシグナル伝達動態およびタンパク質調節に影響を与えることが示されている。具体的には、ＢＤ様トランスジェニックＣＲＭＰ２ニューロンは、カルシウム活性が極度に活性である一方で、ニューロンネットワークのシグナル伝達が機能低下しており、ＤＳＭ－ＩＶで以前に分類されていたように、ＢＰＤは「気分」よりも「神経発達」の障害であることが暗示されている。さらに、記載される分類システムで採用されているように、ニューロンのカルシウムデータでトレーニングされた機械学習分類子は、個体がＢＰＤを持っているかどうかを首尾よく診断でき、個体がリチウムに臨床的に反応するかどうかを判断できる。まとめると、この研究は、ＢＰＤ病理学における長い間求められていた発見、脳機能全般への洞察、将来の神経精神医学的治療のための新しい標的、およびこれまでで最初のインビトロ診断ＢＰＤアッセイに光を当てる。
【0009】
現在、有効性または安全性が予測可能なＢＰＤの治療法はない。炭酸リチウムは、ＢＰＤ躁病を安定させるための代表的なものであり、リチウム治療（Ｌｉ－Ｒ ＢＰＤ）に反応する患者は約３５％に過ぎないものの、自殺のリスクを減らすことが示されている。区別が非常にはっきりしているため、ＢＤ患者はリチウム応答性またはリチウム非応答性（Ｌｉ－ＮＲ ＢＰＤ）のいずれかに分類され、このことは、Ｌｉ－ＮＲとＬｉ－ＲＢＰＤが病原的に異なる表現型であることを示唆している。何十年もの間、ＢＰＤに対するリチウムの正確な作用機序は、もっともらしい仮説と方向性の多様性を支持する大量の研究にもかかわらず、とらえどころのないものであった
【0010】
記載される分類システムの開発は、リチウムがＢＰＤ挙動を調節するときにＣＲＭＰ２に作用することを示した。ＣＲＭＰ２の標準的な役割は、主に神経突起の成長と軸索輸送を調節することとして理解されてきた。研究によると、多くのＣＲＭＰ２結合パートナーが、アクチン、チューブリン、ダイニン、キネシン－１などの神経突起組織に関連していることが見出されている。ＣＲＭＰ２活性は、主にキナーゼとホスファターゼを介した翻訳後修飾によって調節され、スレオニン－５１４（ＣＲＭＰ２－ｐＴ５１４）においてリン酸化されると不活性になる。正常なＣＮＳの発達と機能におけるＣＲＭＰ２の重要性については、遺伝子を行動変容疾患に結び付ける疫学的証拠はあまり存在していない。
【発明の概要】
【0011】
記載される分類システムは、ＢＰＤを臨床的に正確に診断することができ、最良の薬物治療を予測するために使用することができる。記載される分類システムはまた、新規のＢＰＤ治療法を同定するための機能的スクリーニングプラットフォームとして利用され得る。
【0012】
一態様では、本明細書に開示されるのは、分類システムであって、上記分類システムは、ユーザーインターフェースと、細胞イメージングデバイスと、１つ以上のプロセッサと、１つ以上のプロセッサに連結され、命令が格納されているコンピュータ可読記憶装置と、を備え、上記記憶装置は、１つ以上のプロセッサによって実行される場合、細胞イメージングデバイスから、患者に由来するニューロン培養物のカルシウム動態学的特徴を含む画像データを受け取ることと、ニューロンカルシウムデータを使用してトレーニングされた機械学習モデルを通して画像データを処理して、カルシウム動態学的特徴に基づいて患者の診断を判断することと、ユーザーインターフェースに上記診断を提供すること、を含む動作を、１つ以上のプロセッサに実行させる。いくつかの実施形態では、上記動作が、上記機械学習モデルを通して上記画像データを処理し、上記患者がＢＰＤのための治療に反応するか否かを判断することを含む。いくつかの実施形態では、上記治療は、ＢＰＤのための炭酸リチウムを含む。いくつかの実施形態では、動作が、上記機械学習モデルを通して上記画像データを処理して、患者の薬物応答性を判断することを含む。いくつかの実施形態では、上記診断は、上記患者がリチウム応答性であるかまたはリチウム非応答性であるかを含む。いくつかの実施形態では、上記機械学習モデルは、線形回帰、単純ベイズ、ランダムフォレスト、１対すべて（ｏｎｅ ｖｅｒｓｕｓ ａｌｌ）、サポートベクター分類子モジュール、またはｋ最近傍法（ＫＮＮ）アルゴリズムの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、上記機械学習モデルは、過剰適合を防止し、かつ上記機械学習モデルに過剰バイアスをかけないようにするための勾配ブースト分類子を含む。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータは、インビトロニューロン培養物から取得される。いくつかの実施形態において、上記インビトロニューロン培養物は、ＢＰＤ個体および疾患を有しない健常ヒト対照から単離されたｈｉＰＳＣに由来する。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータは、カルシウム動態学的特徴を含む。いくつかの実施形態において、上記カルシウム動態学的特徴は、基礎カルシウムレベル、ピークカルシウム一時性、およびカルシウム事象頻度を含む。いくつかの実施形態において、カルシウム動態学的特徴は、カルシウム事象流入、カルシウム事象流出、またはカルシウム事象振幅のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、上記機械学習モデルのトレーニングの間にダウンサンプリングが使用される。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータはデータポイントを含み、機械学習モデルのトレーニングは、細胞株および疾患タイプによってデータポイントを分離することを含む。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータの一部は、機械学習モデルをトレーニングするために使用され、上記ニューロンカルシウムデータの残りの部分は、トレーニングされた機械学習モデルをテストするために使用される。いくつかの実施形態では、上記トレーニングされた機械学習をテストすることは、上記ニューロンカルシウムデータの残りの部分から塩化リチウム（ＬｉＣｌ）処理されたデータポイントおよび未処理のデータポイントを引き出すことを含む。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータの一部は、トレーニング用にデータの７０パーセントを含み、上記ニューロンカルシウムデータの残りの部分は、検証用にデータの３０パーセントを含む。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータの一部は、上記トレーニング用にデータの８０パーセントを含み、上記ニューロンカルシウムデータの残りの部分は、検証用のデータの２０パーセントを含む。いくつかの実施形態では、上記細胞イメージングデバイスは、ＩＣ２００キネティック画像サイトメーターを含み、画像データは、ＩＣ２００キネティック画像サイトメーターおよびカルシウム感受性色素Ｆｌｕｏ－４ ＡＭを用いて実行されるカルシウムイメージングによって生成される。いくつかの実施形態では、上記画像データは、細胞内カルシウムレベルのトレースを含む。いくつかの実施形態において、上記ニューロン培養物は、ＣＲＭＰ２ノックアウト（ＫＯ）、ＣＲＭＰ２ノックイン（ＫＩ）、およびＷＴ Ｅ１６．５一次海馬ニューロンを含む。いくつかの実施形態では、ニューロン培養物は、患者からの血液サンプルに由来する。いくつかの実施形態では、診断はＢＰＤについてのものである。いくつかの実施形態では、上記診断は、アルツハイマー病またはパーキンソン病についてのものである。
【0013】
別の態様では、本明細書に開示されるのは、１つ以上のプロセッサに連結され、命令が格納されている非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であって、上記命令は、１つ以上のプロセッサによって実行される場合、患者に由来するニューロン培養物のカルシウム動態学的特徴を含む画像データを受け取ることと、ニューロンカルシウムデータを使用してトレーニングされた機械学習モデルを介して画像データを処理し、カルシウム動態学的特徴に基づいて患者の診断を判断することと、ユーザーインターフェースに上記診断を提供することと、を含む動作を、１つ以上のプロセッサに実行させることを含む。いくつかの実施形態では、上記動作が、機械学習モデルを通して画像データを処理し、患者がＢＰＤの治療に反応するか否かを判断することを含む。いくつかの実施形態では、上記治療は双極性障害（ＢＰＤ）のための炭酸リチウムを含む。いくつかの実施形態では、上記動作は、機械学習モデルを通して画像データを処理して、患者の薬物応答性を判断することを含む。いくつかの実施形態では、上記診断は、患者がリチウム応答性であるかリチウム非応答性であるかを含む。いくつかの実施形態では、上記機械学習モデルは、線形回帰、単純ベイズ、ランダムフォレスト、１対すべて、サポートベクター分類子モジュール、またはＫＮＮアルゴリズムのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、上記機械学習モデルは、過剰適合を防止し、かつ上記機械学習モデルに過度のバイアスをかけないようにするための勾配ブースト分類子を含む。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータは、インビトロニューロン培養物から取得される。いくつかの実施形態において、インビトロニューロン培養物は、ＢＰＤ個体および疾患を有しない健常ヒト対照から単離されたｈｉＰＳＣに由来する。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータは、カルシウム動態学的特徴を含む。いくつかの実施形態において、上記カルシウム動態学的特徴は、基礎カルシウムレベル、ピークカルシウム一時性、およびカルシウム事象頻度を含む。いくつかの実施形態において、上記カルシウム動態学的特徴は、カルシウム事象流入、カルシウム事象流出、またはカルシウム事象振幅のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、上記機械学習モデルのトレーニングの間にダウンサンプリングが利用される。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータはデータポイントを含み、上記機械学習モデルのトレーニングは、細胞株および疾患タイプによってデータポイントを分離することを含む。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータの一部は、上記機械学習モデルをトレーニングするために使用され、上記ニューロンカルシウムデータの残りの部分は、トレーニングされた機械学習モデルをテストするために使用される。いくつかの実施形態では、上記トレーニングされた機械学習をテストすることは、上記ニューロンカルシウムデータの残りの部分からＬｉＣｌで処理されたデータポイントおよび処理されていないデータポイントを引き出すことを含む。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータの一部は、トレーニング用にデータの７０パーセントを含み、上記ニューロンカルシウムデータの残りの部分は、検証用にデータの３０パーセントを含む。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータの一部は、トレーニング用にデータの８０パーセントを含み、上記ニューロンカルシウムデータの残りの部分は、検証用にデータの２０パーセントを含む。いくつかの実施形態では、上記画像データは、ＩＣ２００キネティック画像サイトメーターおよびカルシウム感受性色素Ｆｌｕｏ－４ ＡＭを用いて実行されるカルシウムイメージングを通して生成される。いくつかの実施形態では、上記画像データは、細胞内カルシウムレベルトレースを含む。いくつかの実施形態において、上記ニューロン培養物は、ＣＲＭＰ２－ＫＯ、ＣＲＭＰ２－ＫＩ、およびＷＴ Ｅ１６．５一次海馬ニューロンを含む。いくつかの実施形態では、上記ニューロン培養物は、上記患者からの血液サンプルに由来する。いくつかの実施形態では、上記診断はＢＰＤについてのものである。いくつかの実施形態では、上記診断は、アルツハイマー病またはパーキンソン病についてのものである。
【0014】
別の態様では、本明細書に開示されるのは、患者スクリーニングのためのコンピュータ実装方法であって、上記方法は、細胞イメージングデバイスから、患者に由来するニューロン培養物のカルシウム動態学的特徴を含む画像データを受け取る工程と、ニューロンカルシウムデータを使用してトレーニングされた機械学習モデルを通して画像データを処理して、カルシウム動態学的特徴に基づいて患者の診断を判断する工程と、ユーザーインターフェースに上記診断を提供する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、上記機械学習モデルを通して上記画像データを処理して、上記患者がＢＰＤの治療に反応するかどうかを判断する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記治療は、ＢＰＤ用の炭酸リチウムを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、上記機械学習モデルを介して画像データを処理して、患者の薬物応答性を決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記診断は、患者がリチウム応答性であるかリチウム非応答性であるかを含む。いくつかの実施形態では、上記機械学習モデルは、線形回帰、単純ベイズ、ランダムフォレスト、１対すべて、サポートベクター分類子モジュール、またはＫＮＮアルゴリズムのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、上記機械学習モデルは、過剰適合を防止し、かつ上記機械学習モデルに過度のバイアスをかけないようにするための勾配ブースト分類子を含む。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータは、インビトロニューロン培養物から取得される。いくつかの実施形態において、インビトロニューロン培養物は、ＢＰＤ個体および疾患を有しない健常ヒト対照から単離されたｈｉＰＳＣに由来する。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータは、カルシウム動態学的特徴を含む。いくつかの実施形態において、上記カルシウム動態学的特徴は、基礎カルシウムレベル、ピークカルシウム一時性、およびカルシウム事象頻度を含む。いくつかの実施形態において、上記カルシウム動態学的特徴は、カルシウム事象流入、カルシウム事象流出、またはカルシウム事象振幅のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、上記機械学習モデルのトレーニング中にダウンサンプリングが利用される。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータはデータポイントを含み、上記機械学習モデルのトレーニングは、細胞株および疾患タイプによってデータポイントを分離することを含む。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータの一部は、機械学習モデルをトレーニングするために使用され、上記ニューロンカルシウムデータの残りの部分は、トレーニングされた機械学習モデルをテストするために使用される。いくつかの実施形態では、上記トレーニングされた機械学習をテストすることは、上記ニューロンのカルシウムデータの残りの部分からＬｉＣｌ処理されたデータポイントおよび未処理のデータポイントを引き出すことを含む。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータの一部は、トレーニング用にデータの７０パーセントを含み、上記ニューロンカルシウムデータの残りの部分は、検証用にデータの３０パーセントを含む。いくつかの実施形態では、上記ニューロンカルシウムデータの一部は、トレーニング用のデータの８０パーセントを含み、上記ニューロンカルシウムデータの残りの部分は、検証用のデータの２０パーセントを含む。いくつかの実施形態では、上記細胞イメージングデバイスは、ＩＣ２００キネティック画像サイトメーターを含み、画像データは、ＩＣ２００キネティック画像サイトメーターおよびカルシウム感受性色素Ｆｌｕｏ－４ ＡＭで実行されるカルシウムイメージングを通して生成される。いくつかの実施形態では、上記画像データは、細胞内カルシウムレベルトレースを含む。いくつかの実施形態において、上記ニューロン培養物は、ＣＲＭＰ２－ＫＯ、ＣＲＭＰ２－ＫＩ、およびＷＴ Ｅ１６．５一次海馬ニューロンを含む。いくつかの実施形態では、上記ニューロン培養物は、上記患者からの血液サンプルに由来する。いくつかの実施形態では、上記診断はＢＰＤについてのものである。いくつかの実施形態では、上記診断は、アルツハイマー病またはパーキンソン病に対するものである。
【0015】
いくつかの実施形態において、記載される分類システムは、個体が双極性障害（ＢＰＤ）を有するかどうかを首尾よく診断することができ、個体が双極性障害（ＢＰＤ）治療に臨床的に反応するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態では、ＢＰＤ治療は、気分安定薬、抗精神病薬、抗うつ薬、抗うつ薬－抗精神病薬、抗不安薬、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、個人が双極性障害（ＢＰＤ）を有するかどうかを首尾よく診断することができ、個人が気分安定薬に臨床的に反応するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態において、気分安定剤は、リチウム（例えば、リトビッド）、バルプロ酸（例えば、デパケン）、ジバルプロエックスナトリウム（例えば、デパコート）、カルバマゼピン（例えば、テグレトール、エクエトロ、およびカルバトロール）、ラモトリジン（例えば、ラミクタール）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、個人が双極性障害（ＢＰＤ）を有するかどうかを首尾よく診断することができ、個人が抗精神病薬に臨床的に反応するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態において、抗精神病薬は、オランザピン（例えば、ジプレキサ）、リスペリドン（例えば、リスパダール）、クエチアピン（例えば、セロクエル）、アリピプラゾール（例えば、エビリファイ）、ジプラシドン（例えば、ジオドン）、ルラシドン（例えば、ラツーダ）、アセナピン（例えば、サフリス）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、個人が双極性障害（ＢＰＤ）を有するかどうかを首尾よく診断することができ、個人が抗うつ薬に臨床的に反応するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態において、抗うつ薬は、シタロプラム（例えば、セレクサ）、エスシタロプラム（例えば、レクサプロ）、フルオキセチン（例えば、プロザック、サラフェム、セルフェムラ、およびプロザックウィークリー）、フルボキサミン（例えば、ルボックス）、パロキセチン（例えば、パキシル、パキシルＣＲ、およびペクセバ）、セルトラリン（例えば、ゾロフト）、ボルチオキセチン（例えば、トリンテリックスおよびブリンテリックス）、ビラゾドン（例えば、ビイブリド（Ｖｉｉｂｒｙｄ））からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、個人が双極性障害（ＢＰＤ）を有するかどうかを首尾よく診断することができ、個人が抗うつ薬－抗精神病薬に臨床的に反応するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態において、抗うつ薬－抗精神病薬は、オランザピン／フルオキセチン（例えば、シンビャックス（Ｓｙｍｂｙａｘ））、アミトリプチリン／ペルフェナジン（例えば、デュオビル、エトラフォン、トライアビル（Ｔｒｉａｖｉｌ）、またはトリプタフェン）、アリピプラゾール／セルトラリン（例えば、ＡＳＣ－０１）、フルオキセチン／メリトラセン（例えば、Ｄｅａｎｘｉｔ、Ｐｌａｃｉｄａ、Ｆｒａｎｘｉｔ、Ａｎｘｉｄｒｅｇ、およびＤａｎｘｉｐｒｅｓｓ）、トラニルシプロミン／トリフルオペラジン（例えば、Ｐａｒｓｔｅｌｉｎ、Ｐａｒｍｏｄａｌｉｎ、Ｊａｔｒｏｓｏｍ Ｎ、およびＳｔｅｌａｐａｒ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、個人が双極性障害（ＢＰＤ）を有するかどうかを首尾よく診断することができ、個人が抗不安薬に臨床的に反応するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態において、抗不安薬は、ベンゾジアゼピン（例えば、ジアゼパム、アルプラゾラム、クロナゼパム、およびロラゼパム）、ベータ遮断薬（例えば、アセブトロール（セクトラル）、アテノロール（テノーミン）、ベタキソロール（ケルロン（Ｋｅｒｌｏｎｅ））、ビソプロロール（ゼベタ、ジアック）、カルテオロール（カルトロール）、カルベジロール（コレグ（Ｃｏｒｅｇ））、ラベタロール（ノルモジン、トランデート）、メトプロロール（ロプレッサー、トプロール－ＸＬ）、ナドロール（コルガード）、ネビボロール（ビストリック）、ペンブトロール（レバトール）、ピンドロール（Ｖｉｓｋｅｎ）、プロプラノロール（Ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）（インデラル）、ソタロール（ベタペース）、およびチモロール（ブロカドレン））、ブスピロン（例えば、バスパー）、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）（例えば、パキシル（パロキセチン）、プロザック（フルオキセチン）、ゾロフト（セルトラリン）およびレクサプロ（エシタロプラム））、セロトニン－ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）（例えば、エフェキソール（ベンラファキシン）、サインバルタ（デュロキセチン）、およびプリスティーク（デスベンラファキシン）、および三環式抗うつ薬（例えば、トフラニール（イミプラミン）、エラビル（Ｅｌａｖｉｌ）（アミトリプチリン）、Ｐａｍｅｌｏｒ（ノルトリプチリン）およびアナフラニール（クロミプラミン））からなる群から選択される。
【0016】
いくつかの実施形態において、記載される分類システムは、個体がアルツハイマー病（ＡＤ）を有するかどうかを首尾よく診断することができ、個体がアルツハイマー病（ＡＤ）治療に臨床的に反応するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態において、アルツハイマー病（ＡＤ）治療は、コリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ドネペジル（アリセプト）、リバスチグミン（エクセロン）、およびガランタミン（ラザダイン））、メマンチン（例えば、ナメンダ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0017】
いくつかの実施形態において、記載される分類システムは、個体がパーキンソン病（ＰＤ）を有するかどうかを首尾よく診断することができ、個体がパーキンソン病（ＰＤ）治療に臨床的に反応するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態において、ＰＤ治療は、カルビドパ－レボドパ（例えば、ロドシン）、カルビドパ－レボドパ注入（例えば、デュオパ（Ｄｕｏｐａ））、ドーパミンアゴニスト（例えば、プラミペキソール（ミラペックス）、ロピニロール（レキップ）、ロチゴチン（Ｎｅｕｐｒｏ）、およびアポモルヒネ（アポカイン））、ＭＡＯ Ｂ阻害剤（例えば、セレギリン（ＥｌｄｅｐｒｙｌおよびＺｅｌａｐａｒ）、ラサギリン（Ａｚｉｌｅｃｔ）およびサフィナミド（Ｘａｄａｇｏ））、カテコールＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤（例えば、エンタカポン（Ｃｏｍｔａｎ）およびトルカポン（タスマール））、抗コリン作動薬（例えば、ベンズトロピン（コゲンチン）およびトリヘキシフェニジル）、アマンタジン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0018】
本開示による方法は、本明細書に記載される態様および特徴の任意の組み合わせを含むことができることが理解される。すなわち、本開示による方法は、本明細書で具体的に説明される態様および特徴の組み合わせに限定されず、提供される態様および特徴の任意の組み合わせを含むこともできる。
【0019】
本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。本開示の他の特徴および利点は、この説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
本特許出願は、カラーで実行された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面付きの本特許または本特許出願のコピーは、請求および必要な料金の支払いの際に、庁から提供される。
本願の主題の特徴および利点のより良好な理解は、例示的な実施形態および付随する図面を説明する以下の詳細な説明を参照することによって提供される。
本願の主題の特徴および利点のより良好な理解は、例示的な実施形態および付随する図面を説明する以下の詳細な説明を参照することによって提供される。
【図1】各トランスジェニックＣＲＭＰ２マウス系統が要約する、異なるＢＰＤ状態を説明する図を示す。
【図2】Ａｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの多電極アレイ（ＭＥＡ）ウェルの図を示す。
【図3】自発的ＭＥＡシグナル伝達挙動の代表的なラスタープロットを示す図である。
【図4A】海馬ニューロン培養物のバースト頻度平均のヒストグラムを示す。
【図4B】海馬ニューロン培養物のネットワークバースト持続時間平均のヒストグラムを示す。
【図4C】海馬ニューロン培養物のネットワークバースト平均あたりのスパイク数のヒストグラムを示す。
【図5A】ＷＴ、ＣＲＭＰ２－ＫＯ、およびＣＲＭＰ２－ＫＯマウス一次海馬ニューロンにおけるＣＲＭＰ２タンパク質レベルの代表的なウエスタンブロットおよび定量化を示す。
【図5B】ＷＴ、ＣＲＭＰ２－ＫＯ、およびＣＲＭＰ２－ＫＯマウス一次海馬ニューロンにおけるｐＣＲＭＰ２－Ｔ５１４レベルの代表的なウエスタンブロットを示す。
【図5C】インビトロ培養物から神経突起を単離するための方法の図を示す。
【図5D】神経突起単離複製物から単離された全プロテオームおよび同じ初代海馬培養物からの全ニューロンを含むＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを表すクーマシー染色を示す。
【図5E】核タンパク質Ｆｏｘ－３（ＮｅｕＮ）および核有糸分裂装置（ＮｕＭＡ）の代表的なウエスタンブロットを示す。
【図5F】Ｔｕｊ１で染色された画像化された孤立した神経突起の図および三次元（３Ｄ）再構成を示す。
【図6A】ＷＴ、ＣＲＭＰ２－ＫＯ、およびＣＲＭＰ－ＫＩ一次海馬ニューロンから単離された神経突起のゲル電気泳動（２Ｄ－ＤＩＧＥ）における二次元（２Ｄ）差分による示差的プロテオミクス分析を示す。
【図6B】Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ－ＩＰＡ分析を使用して２Ｄ－ＤＩＧＥによって同定されたタンパク質から構築された偏りのない標準的な経路マップを示す。
【図6C】マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のヒストグラムを示す。
【図6D】ｈｉＰＳＣ由来の神経培養物を用いてＭＥＡを介して測定された、ニューロンネットワークシグナル伝達に対するＭＡＰＫ阻害剤の影響の設計およびタイムラインを詳述する図を示す。
【図6E】ニューロンネットワークシグナル伝達動力学に対するＭＡＰＫ阻害の影響に関する定量化を示す。
【図6F】ニューロンネットワークシグナル伝達動力学に対するＭＡＰＫ阻害の影響に関する定量化を示す。
【図6G】ネットワークバーストごとのスパイクの数を示す。
【図7A】ニューロンのカルシウム機能に対するＣＲＭＰ２の影響を示す。
【図7B】デンシトメトリーを介して測定された、ＣＭＲＭＰ２－ＫＩ、ＷＴ、およびＣＲＭＰ２－ＫＯマウス一次海馬ニューロンにおけるＣａｖ２．２のヒストグラムを示す。
【図7C】ＣＭＲＭＰ２－ＫＩ、ＷＴ、およびＣＲＭＰ２－ＫＯのマウス一次海馬ニューロンにおける活性化カルパインレベルのヒストグラムを示す。
【図7D】マウス初代海馬培養物のＩＣ２００キネティック画像サイトメーターＦｌｏｕ－４ＡＭカルシウムイメージングからの代表的な画像を示す。
【図7E】単一ニューロンのカルシウム動態の例を示す。
【図7F】代表的なカルシウムトレースの例を示す。
【図7G】海馬ニューロンにおけるカルシウム事象頻度のヒストグラムを示す。
【図7H】海馬ニューロンにおける基礎カルシウムレベルのヒストグラムを示す。
【図7I】海馬ニューロンにおけるカルシウム事象中のピークカルシウム一時性レベルのヒストグラムである。
【図8A】Ｆｌｕｏ－４ＡＭカルシウムイメージングの例を示す。
【図8B】Ｆｌｕｏ－４ＡＭカルシウムイメージングの例を示す。
【図8C】Ｆｌｕｏ－４ＡＭカルシウムイメージングの例を示す。
【図8D】ヒトｉＰＳＣ由来の介在ニューロン培養物におけるカルシウム事象頻度のヒストグラムを示す。
【図9A】ニューロンのネットワーク内の同期性を定量化するための方程式を示し、この方程式は、ネットワーク内のニューロンのパーセンテージが同時にカルシウム事象を有することを定量化する。
【図9B】正常なニューロンのインビトロ培養からのネットワークカルシウムシグナル伝達動態の代表的なトレースを示す。
【図9C】同期ニューロンのインビトロ培養からのネットワークカルシウムシグナル伝達動態の代表的なトレースを示す。
【図9D】ＣＲＭＰ２－ＫＯ、ＷＴ、およびＣＲＭＰ２－Ｋｉマウスからの初代海馬ニューロン培養物の平均同期スコアのヒストグラムを示す。
【図9E】ＢＰＤ、疾患を有しない、およびリチウム処理された疾患を有しないヒトニューロンからのｉＰＳＣ由来皮質ニューロン培養物の平均同期スコアのヒストグラムを示す。
【図10A】カルシウム動力学に基づいて、アルツハイマー病およびパーキンソン病が、疾患を有しないものと区別可能であることを示唆するデータの様々なプロットグラフを示す。
【図10B】カルシウム動力学に基づいて、アルツハイマー病およびパーキンソン病が、疾患を有しないものと区別可能であることを示唆するデータの様々なプロットグラフを示す。
【図10C】カルシウム動力学に基づいて、アルツハイマー病およびパーキンソン病が、疾患を有しないものと区別可能であることを示唆するデータの様々なプロットグラフを示す。
【図10D】カルシウム動力学に基づいて、アルツハイマー病およびパーキンソン病が、疾患を有しないものと区別可能であることを示唆するデータの様々なプロットグラフを示す。
【図10E】カルシウム動力学に基づいて、アルツハイマー病およびパーキンソン病が、疾患を有しないものと区別可能であることを示唆するデータの様々なプロットグラフを示す。
【図10F】カルシウム動力学に基づいて、アルツハイマー病およびパーキンソン病が、疾患を有しないものと区別可能であることを示唆するデータの様々なプロットグラフを示す。
【図11】本開示の実施形態によって実施することができる非限定的な例示的なプロセスのフローチャートを示す。
【図12】本開示の方法またはシステムを実施するようにプログラムまたは他の方法で構成することができるコンピュータシステムの非限定的な例を示す。
【図13A】本開示の実施を実行するために使用することができる非限定的な例示的な環境を示す。
【図13B】環境を介して提供され、本開示の実施を実行するために使用できる、非限定的な例示的なアプリケーション提供システムを示す。
【発明を実施するための形態】
【0021】
詳細な説明
本明細書に記載されるのは、特定の実施形態では、分類システムのためのシステムであって、上記システムは、ユーザーインターフェースと、細胞イメージングデバイスと、１つ以上のプロセッサと、１つ以上のプロセッサに連結され、また命令が格納されているコンピュータ可読記憶装置と、を備え、上記命令は、１つ以上のプロセッサによって実行される場合、細胞イメージングデバイスから、患者に由来するニューロン培養物のカルシウム動態学的特徴を含む画像データを受け取ることと、ニューロンカルシウムデータを使用してトレーニングされた機械学習モデルを通して画像データを処理して、カルシウム動態学的特徴に基づいて患者の診断を判断することと、ユーザーインターフェースに上記診断を提供すること、を含む動作を、１つ以上のプロセッサに実行させる、分類システムである。
本明細書に記載されるのは、特定の実施形態では、分類システムのためのシステムであって、上記システムは、ユーザーインターフェースと、細胞イメージングデバイスと、１つ以上のプロセッサと、１つ以上のプロセッサに連結され、また命令が格納されているコンピュータ可読記憶装置と、を備え、上記命令は、１つ以上のプロセッサによって実行される場合、細胞イメージングデバイスから、患者に由来するニューロン培養物のカルシウム動態学的特徴を含む画像データを受け取ることと、ニューロンカルシウムデータを使用してトレーニングされた機械学習モデルを通して画像データを処理して、カルシウム動態学的特徴に基づいて患者の診断を判断することと、ユーザーインターフェースに上記診断を提供すること、を含む動作を、１つ以上のプロセッサに実行させる、分類システムである。
【0022】
１つ以上のプロセッサに連結され、命令が格納されている１つ以上の非一時的コンピュータ可読記憶媒体であって、上記命令は、１つ以上のプロセッサによって実行される場合、細胞イメージングデバイスから、患者に由来するニューロン培養物のカルシウム動態学的特徴を含む画像データを受け取ることと、ニューロンカルシウムデータを使用してトレーニングされた機械学習モデルを介して画像データを処理し、カルシウム動態学的特徴に基づいて患者の診断を判断することと、ユーザーインターフェースに上記診断を提供することとを含む動作を、１つ以上のプロセッサに実行させることを含む。
【0023】
また、本明細書に記載されるのは、特定の実施形態では、患者スクリーニングのためのコンピュータ実装方法であって、上記方法は、細胞イメージングデバイスから、患者に由来するニューロン培養物のカルシウム動態学的特徴を含む画像データを受け取る工程と、ニューロンカルシウムデータを使用してトレーニングされた機械学習モデルを通して画像データを処理して、カルシウム動態学的特徴に基づいて患者の診断を判断する工程と、ユーザーインターフェースに上記診断を提供する工程と、を含む。
【0024】
特定の定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【0025】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形の言及を含む。本明細書における「または」への言及は、特に他のことを明記しない限り、「および／または」を包含することを意図している。
【0026】
本明細書で使用される場合、「リアルタイム」という用語は、システムの処理制限、データおよび画像を正確に取得するために必要な時間、ならびにデータおよび画像の変化率を考慮して、意図的な遅延なしにデータを送信または処理することを指す。いくつかの例では、「リアルタイム」は、本開示の実施形態の構成要素から得られた情報の提示を説明するために使用される。
【0027】
システムの概要
いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、患者のＢＰＤを診断し、ならびに患者がリチウムに臨床的に反応するかどうかを予測することができる、監督付き機械学習分類モデルを含む。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、カルシウムイメージング動態データを利用する。いくつかの実施形態では、画像化動態データは実験室で生成される。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、線形回帰、単純ベイズ、ランダムフォレスト、１対すべて、およびＫＮＮアルゴリズムに基づく（ｂａｓｅｄ ｏｆｆ）５つのモデルを使用する。いくつかの実施形態では、ＫＮＮは最も正確なモデルである。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、ＢＰＤ個体から単離されたヒト人工多能性幹細胞に由来するインビトロ神経培養から取得されたデータを利用する。
いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、患者のＢＰＤを診断し、ならびに患者がリチウムに臨床的に反応するかどうかを予測することができる、監督付き機械学習分類モデルを含む。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、カルシウムイメージング動態データを利用する。いくつかの実施形態では、画像化動態データは実験室で生成される。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、線形回帰、単純ベイズ、ランダムフォレスト、１対すべて、およびＫＮＮアルゴリズムに基づく（ｂａｓｅｄ ｏｆｆ）５つのモデルを使用する。いくつかの実施形態では、ＫＮＮは最も正確なモデルである。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、ＢＰＤ個体から単離されたヒト人工多能性幹細胞に由来するインビトロ神経培養から取得されたデータを利用する。
【0028】
いくつかの実施形態において、記載される分類システムは、基礎カルシウムレベル、ピークカルシウム一時性、カルシウム事象振幅、およびカルシウム事象頻度などのＢＰＤニューロンカルシウム動態特徴を有する機械学習モデルをトレーニングする。いくつかの実施形態では、カルシウム事象流入、およびカルシウム事象流出などの追加のカルシウム動態機能を使用してモデルをトレーニングする。
【0029】
いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、患者由来のニューロン培養物を使用する。いくつかの実施形態では、神経細胞培養物のカルシウム動態が画像化され、特定のカルシウム動態の特徴が分析され、トレーニングされた機械学習モデルで処理される。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、診断分析のための神経培養物を生成するために患者の血液サンプル（対ｉＰＳＣ）を使用する。
【0030】
図１は、各トランスジェニックＣＲＭＰ２マウス系統が以前に公開されたマウス行動に基づいて要約する異なるＢＰＤ状態、および各マウス系統におけるＣＲＭＰ２活性のレベルを説明する図を示す。
【0031】
図２は、Ａｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの多電極アレイ（ＭＥＡ）ウェルの図を示す。図示されるように、１２ウェルプレートの各ウェルは、電極の上端にシードされたニューロンの連続電位を記録するための６４個の電極を備える。拡大図は、ＭＥＡウェル上にシードされた初代海馬培養の１０倍の顕微鏡写真である。
【0032】
図３は、遺伝的に対となっているＣＲＭＰ２－ＫＯおよびＷＴの初代海馬培養物の５分間にわたる自発的ＭＥＡシグナル伝達挙動の代表的なラスタープロットを示す。ＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンはＷＴニューロンよりも少ないシグナル伝達を示す。示されるように、黒いダッシュは単一活動電位（例えば、スパイク）を表し、青色はマルチニューロンネットワークシグナル伝達事象スパイクを表し、紫色は複数のニューロンからの同期スパイクを表す。
【0033】
図４Ａは、海馬ニューロン培養物のバースト頻度平均のヒストグラムを示す。示されるように、バースト頻度は、活動電位活動を評価するために、単一ニューロンの個々のスパイクがどれほどの頻度でバーストにグループ化できるかの尺度である。
【0034】
図４Ｂは、海馬ニューロン培養物のネットワークバースト持続時間平均のヒストグラムを示す。示されるように、ネットワークバースト持続時間は、短い期間内と複数のニューロンにわたって同時に発生するものの両方である、バースト活性の時間の長さの尺度である。
【0035】
図４Ｃは、海馬ニューロン培養物のネットワークバースト平均あたりのスパイク数のヒストグラムを示す。いくつかの実施形態では、ネットワークスパイクの数は、ニューロンネットワークシグナル伝達事象中のスパイクの量である。一元配置分散分析、エラーバーはＳＥＭ、グループあたりｎ＜６００ネットワークバースト、グループあたり分析されたｎ＝２６８の活性ニューロン（＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１）である。
【0036】
図５Ａは、ＷＴ、ＣＲＭＰ２－ＫＯ、およびＣＲＭＰ２－ＫＯマウス一次海馬ニューロンにおける代表的なウエスタンブロットおよびＣＲＭＰ２タンパク質レベルの定量化を示す。いくつかの実施形態では、ＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンは無視できるレベルのＣＲＭＰ２を有するが、ＣＲＭＰ２－ＫＩニューロンはＷＴと同様のレベルを有する。
【0037】
図５Ｂは、ＷＴ、ＣＲＭＰ２－ＫＯ、およびＣＲＭＰ２－ＫＯマウス一次海馬ニューロンにおけるｐＣＲＭＰ２－Ｔ５１４レベルの代表的なウエスタンブロットを示す。ＣＲＭＰ－ＫＯニューロンとＣＲＭＰ２－ＫＩニューロンはどちらも、テアニン－５１４におけるリン酸化型のＣＲＭＰ２を欠いている。
【0038】
図５Ｃは、インビトロ培養物から神経突起を単離するための方法の図を示す。いくつかの実施形態では、３．０μｍの細孔を有するウェルインサートの底部は、神経突起を引き付けてニューロンの細胞体から空間的に分離して成長するラミニン（赤色）でコーティングされている。
【0039】
図５Ｄは、神経突起単離複製物から単離された全プロテオームおよび同じ初代海馬培養物からの全ニューロンを含むＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを表すクーマシー染色を示す。いくつかの実施形態では、ゲルは、神経突起プロテオームがニューロン全体とは異なり、神経突起分離プロトコルが反復可能であることを実証している。
【0040】
図５Ｅは、ＮｅｕＮおよびＮｕＭＡの代表的なウエスタンブロットを示し、核および付随するタンパク質が単離された神経突起から除外されていることを示す。いくつかの実施形態では、ＣＲＭＰ２は、単離された神経突起に存在する。
【0041】
図５Ｆは、Ｔｕｊ１で染色された画像化された単離された神経突起の図および３Ｄ再構成を示す。
【0042】
図６Ａは、ＷＴ、ＣＲＭＰ２－ＫＯ、およびＣＲＭＰ－ＫＩ一次海馬ニューロンから単離された神経突起の２Ｄ－ＤＩＧＥによる示差プロテオミクス分析を示す。いくつかの実施形態では、ＷＴ（Ｃｙ２で染色）、ＣＲＭＰ２－ＫＩ（Ｃｙ３で染色）、およびＣＲＭＰ２－ＫＯ（Ｃｙ５で染色）からの神経突起プロテオームを、分子量、電荷、および各条件下での濃縮度に基づいて分離したタンパク質を用いて、同じゲル中で比較した。いくつかの実施形態では、プロテオームが３つのバックグラウンドすべての間で共有される各プロテオーム領域の画像のオーバーレイでは白色であり、一方、ＣＲＭＰ２活性によって示差的に変化するタンパク質は、どの供給源でその中にあるタンパク質がより豊富であるかに応じて、青色（ＷＴ）、緑色（ＣＲＭＰ２－ＫＩ）、または赤色（ＣＲＭＰ２－ＫＯ）のいずれかに着色する。示差的なタンパク質スポット（白色で囲まれている）が拾い上げられ、質量分析によって同定された。
【0043】
図６Ｂは、ＣＲＭＰ２によって調節される神経突起タンパク質である、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ－ＩＰＡ分析を使用して２Ｄ－ＤＩＧＥによって同定されたタンパク質から構築された偏りのない標準的経路マップを示す。いくつかの実施形態において、カルシウムシグナル伝達は、ＣＲＭＰ２関連神経突起タンパク質によって影響を受ける主要な経路であると予測される。
【0044】
図６Ｃは、デンシトメトリーを介してウエスタンブロットから測定された、ＣＲＭＰ２－ＫＩ、ＷＴ、およびＣＲＭＰ２－ＫＯマウス一次海馬神経突起における、２Ｄ－ＤＩＧＥおよびその後の生物情報分析で同定されたタンパク質であるＭＡＰＫのレベルのヒストグラムを示す。神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）は、ニューロン負荷対照として使用されている。グループあたりのｎは６、一元配置ＡＮＯＶＡ、エラーバーはＳＥＭである（＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【0045】
図６Ｄは、ｈｉＰＳＣ由来の神経培養物を用いてＭＥＡを介して測定された、ニューロンネットワークシグナル伝達に対するＭＡＰＫ阻害剤（ピラゾリルピロール）の影響の設計およびタイムラインを詳述する図を示す。いくつかの実施形態では、グループＡは５ｍＭ ＬｉＣｌで処理され、そのシグナル伝達が７日目に記録され、その後、１０日目にＭＥＡで観察されるまで、３μＭ ピラゾリルピロールで３日間処理される。いくつかの実施形態では、グループＢはビヒクルで処理され、そのシグナル伝達が７日目に記録され、その後、１０日目にＭＥＡで観察されるまで３μＭのピラゾリルピロールで３日間処理される。
【0046】
図６Ｅ－Ｆは、ニューロンネットワークシグナル伝達動力学に対するＭＡＰＫ阻害の影響に関する定量化を示し、ヒストグラムは、バースト頻度、ネットワークバースト持続時間、およびネットワークバーストあたりのスパイク数について、それぞれ、７日目から１０日目までの変化パーセントのものである。一元配置ＡＮＯＶＡ、エラーバーはＳＥＭ、グループあたりｎ＜１５０ネットワークバースト、グループあたりｎ＝８０の活性電極分析（＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【0047】
表１は、チューブリンタンパク質の各形態の定量化を含む。表１には、２Ｄ－ＤＩＧＥおよびその後の質量分析によって同定されたＣＲＭＰ２活性によって影響を受ける５９個の神経突起タンパク質が含まれている。灰色の標識タンパク質はＣＲＭＰ２－ＫＩ対ＷＴ神経突起で上昇し、オレンジ色の標識タンパク質はＣＲＭＰ２－ＫＩ対ＣＲＭＰ２－ＫＯ神経突起で上昇した。いくつかの実施形態において、質量分析を介して同定されたチューブリンタンパク質は、２Ｄ－ＤＩＧＥゲルの同じスポットからのものであるので、それらは同じ倍率変化を共有し、適切な倍率変化を妨げる。
【0048】
【表1】
【0049】
図７Ａは、ニューロンのカルシウム機能に対するＣＲＭＰ２の影響を示す。ＣＭＲＭＰ２－ＫＩ、ＷＴ、およびＣＲＭＰ２－ＫＯマウスの初代海馬神経突起におけるＣａＶ２．２およびカルパインタンパク質レベルのウエスタンブロット。
【0050】
図７Ｂは、デンシトメトリーを介して測定された、ＣＭＲＭＰ２－ＫＩ、ＷＴ、およびＣＲＭＰ２－ＫＯマウスの一次海馬ニューロンにおけるＣａｖ２．２のヒストグラムを示す。
【0051】
図７Ｃは、デンシトメトリーによって測定された、カルパインの８０Ｋｄａバンドに対する７６ＫＤａバンドの比によって決定される、ＣＭＲＭＰ２－ＫＩ、ＷＴ、およびＣＲＭＰ２－ＫＯマウスの一次海馬ニューロンにおける活性化カルパインレベルのヒストグラムを示す。神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）は、ニューロン負荷対照として使用されており、グループあたりｎは６、一元配置分散分析、エラーバーはＳＥＭである（＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【0052】
図７Ｄは、マウス初代海馬培養物のＩＣ２００キネティック画像サイトメーター（Ｖａｌａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）Ｆｌｏｕ－４ＡＭカルシウムイメージング（毎秒３０フレームで３０秒間）からの代表的な画像を示し、各視野は４つの選択された象限を有し（赤色のボックス）、ここで、ニューロンはＩｍａｇｅＪ（黄色の円）でトレースされ、この蛍光強度は、細胞内カルシウムレベルと同等のものとして測定された。
【0053】
図７Ｅは、ＩｍａｇｅＪ分析からの単一ニューロンのカルシウム動態トレース（Ｆｌｏｕ－４ＡＭ強度）の例を示す。複数のカルシウムシグナル伝達現象は、このアプローチ、カルシウム事象中のピークカルシウム一時性、カルシウム事象の頻度、相対的な基礎カルシウムレベル、事象中のカルシウム流入速度、および事象中のカルシウム流出速度から定量化することができる。
【0054】
図７Ｆは、ＣＲＭＰ２ＫＩ（緑色）、ＷＴ（青色）、およびＣＲＭＰ２－ＫＯ（赤色）の海馬ニューロンからの代表的なカルシウムトレースの例を示し、ＣＲＭＰ２活性のレベルは、カルシウム事象の頻度に方向性のある効果を与えるようである。
【0055】
図７Ｇは、海馬ニューロンにおけるカルシウム事象頻度のヒストグラムを示し、ＣＲＭＰ２のレベルを下げると、カルシウム事象の頻度が増加するようである。
【0056】
図７Ｈは、海馬ニューロンにおける基礎カルシウムレベルのヒストグラムを示し、ＣＲＭＰ２のレベルを下げると、ニューロンの静止カルシウムレベルが増加するようである。
【0057】
図７Ｉは、海馬ニューロンにおけるカルシウム事象中のピークカルシウム一時性レベルのヒストグラムを示し、ＣＲＭＰ２のレベルを下げると、事象中の細胞内カルシウムのピークレベルが増加するようである。カルシウムイメージングの場合、グループあたりＮ≧４３１ニューロン。
【0058】
図８Ａ－８Ｃは、１週間、１０ｍＭリチウムのあるなしで処理された、リチウム非応答性ＢＰＤ（Ｌｉ－ＮＲ ＢＰＤ）個体、リチウム応答性ＢＰＤ（Ｌｉ－Ｒ ＢＰＤ）、および疾患を有しない個体からのｉＰＳＣ由来皮質介在ニューロン培養物で実施されたＦｌｕｏ－４ＡＭカルシウムイメージングを示す。ＣＲＭＰ２－ＫＯマウスはＢＰＤのモデルであり、ＣＲＭＰ－ＫＩマウスはリチウム治療のアナログであると想定されているため、ＢＰＤニューロンの動作はＣＲＭＰ２－ＫＯマウスのニューロン（赤色）を反映し、疾患を有しないニューロン（青色）はＷＴマウスのニューロンを反映し、そして疾患を有しない－リチウム処理ニューロン（緑色）は、ＣＲＭＰ２－ＫＩマウスニューロンを要約するはずである。
【0059】
図８Ａは、ヒトｉＰＳＣ由来の介在ニューロン培養物におけるカルシウム事象頻度のヒストグラムを示す。いくつかの実施形態では、ＣＲＭＰ２のレベルの低下（ＢＰＤニューロンはＣＲＭＰ２活性が低下しており、リチウム処理ニューロンはＣＲＭＰ２活性が上昇している）は、カルシウム事象頻度の増加と相関している。
【0060】
図８Ｂは、ヒトｉＰＳＣ由来の介在ニューロン培養物における静止カルシウムレベルのヒストグラムを示す。いくつかの実施形態において、ＣＲＭＰ２のレベルの減少は、ヒトニューロンにおける静止カルシウムレベルの増加と相関している。
【0061】
図８Ｃは、ヒトｉＰＳＣ由来の介在ニューロン培養における事象中のピークカルシウム一時性のヒストグラムを示す。いくつかの実施形態において、ＣＲＭＰ２のレベルの減少は、ピークカルシウム一時性の増加と相関している。一元配置分散分析、エラーバーはＳＥＭ、グループごとに分析されたｎ≦４８０ニューロン（＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１；＊＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【0062】
図８Ｄは、１対すべての「勾配ブースティング」機械学習分類子の図を示す。いくつかの実施形態では、過剰適合に対する親和性が低いため、勾配ブースティング決定木がソートに使用され、トレーニング精度を高めるためにダウンサンプリングが実行された。いくつかの実施形態では、トレーニングされたモデルの受信者動作特性は、＞０．９９の精度を有し、トレーニングに使用される特徴は、カルシウム事象頻度、基礎カルシウムレベル、ピークカルシウム一時性、およびカルシウム事象振幅である。
【0063】
図９Ａは、ニューロンのネットワーク内の同期性を定量化するための方程式を示す。いくつかの実施形態では、方程式は、ネットワーク内のニューロンのパーセンテージが同時にカルシウム事象を有することを定量化する。
【0064】
図９Ｂおよび９Ｃは、それぞれ、正常なニューロンのインビトロ培養物および同期ニューロンのインビトロ培養物からのネットワークカルシウムシグナル伝達動態の代表的なトレースをそれぞれ示す。
【0065】
図９Ｄは、ＣＲＭＰ２－ＫＯ、ＷＴ、およびＣＲＭＰ２－Ｋｉマウスからの初代海馬ニューロン培養物の平均同期スコアのヒストグラムを示す。
【0066】
図９Ｅは、ＢＰＤ、疾患を有しない、およびリチウム処理された疾患を有しないヒトニューロンからのｉＰＳＣ由来皮質ニューロン培養物の平均同期スコアのヒストグラムを示す。
【0067】
図１０Ａ－１０Ｆは、カルシウム動態に基づいて、アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）が、疾患を有しないもの（Ｕｎａｆ）と区別可能であることを示唆するデータの様々なプロットグラフを示す。図１０Ａは２Ｄ特徴空間プロットを示し、図１０Ｂは９８％の精度でのアルツハイマー病（ＡＤ；灰色の点）の分類と９８％の曲線下のアルツハイマー病領域を示すデータの３Ｄ特徴空間プロットを示す。図１０Ｃは２Ｄ特徴空間プロットを示し、図１０Ｄは９７．９％の精度でパーキンソン病（ＰＤ；灰色の点）の分類と９７．８％の曲線下のパーキンソン病領域を示すデータの３Ｄ特徴空間プロットを示す。図１０Ｅは２Ｄ特徴空間プロットを示し、図１０Ｆは、カルシウムシグナル伝達動力学に基づいて（ｂａｓｅｄ ｏｆｆ）、アルツハイマー病（ＡＤ；黒い点）とパーキンソン病（ＰＤ；灰色の点）が区別できる記述された分類システムを通したデータの予備実行からのデータの３Ｄ特徴空間プロットを示す。プロットは、９９％の精度と９９％の曲線下面積を示す。
【0068】
方法論
記載される分類システムの開発は、ＢＰＤ個体からの死後の脳が、不活性ｐＣＲＭＰ２－Ｔ５１４の上昇を含むことを実証した。さらに、人工多能性幹細胞に由来するヒトＢＰＤニューロンは、リチウム治療を用いて正常化できる同様に上昇したｐＣＲＭＰ２－Ｔ５１４をインビトロで示す。マウスにおけるＣＲＭＰ２活性の無効化（ＣＲＭＰ２－ＫＯ）は、ＢＰＤ表現型、特に躁病期をエミュレートする。そして、ＣＲＭＰ２－Ｔ５１４リン酸化（ＣＲＭＰ２－ＫＩ）を妨害するトランスジェニックマウスの使用によるリチウム治療の効果を再現することは、これらの躁病様のＢＰＤ行動を防ぎ、これは、そうするための最初の既知の遺伝的介入である。
記載される分類システムの開発は、ＢＰＤ個体からの死後の脳が、不活性ｐＣＲＭＰ２－Ｔ５１４の上昇を含むことを実証した。さらに、人工多能性幹細胞に由来するヒトＢＰＤニューロンは、リチウム治療を用いて正常化できる同様に上昇したｐＣＲＭＰ２－Ｔ５１４をインビトロで示す。マウスにおけるＣＲＭＰ２活性の無効化（ＣＲＭＰ２－ＫＯ）は、ＢＰＤ表現型、特に躁病期をエミュレートする。そして、ＣＲＭＰ２－Ｔ５１４リン酸化（ＣＲＭＰ２－ＫＩ）を妨害するトランスジェニックマウスの使用によるリチウム治療の効果を再現することは、これらの躁病様のＢＰＤ行動を防ぎ、これは、そうするための最初の既知の遺伝的介入である。
【0069】
ＣＲＭＰ２活性の低下がいかにしてＢＰＤの根底にあるかからの説明は、特に神経突起、樹状突起棘、シナプス、軸索輸送、およびイオンチャネル調節を伴う神経細胞構造およびそれらの機能の変化によって示唆された（Ｔｏｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｂｉｎｇ ｔｈｅ ｌｉｔｈｉｕｍ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｈｉＰＳＣｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｓ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｔ－ｐｏｉｎｔ ｆｏｒ ａ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｉｎ ｂｉｐｏｌａｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ＰＮＡＳ １１４：Ｅ４４６２－Ｅ４４７１ （２０１７）； Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ３Ａ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ５ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｐｓｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２７：１２５４６－１２５５４（２００７）； Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ３Ａ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖｉａ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｃｄｋ５ ａｎｄ ＧＳＫ３ｂｅｔａ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＭＰ２： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ａｘｏｎ ｇｕｉｄａｎｃｅ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １０：１６５－１７９（２００５））。ＣＲＭＰ２の活性型のみが脊椎に存在し、ＣＲＭＰ２－ＫＯマウスの脊椎密度が低下しているという発見と相まって、ＣＲＭＰ２の活性が脊椎の機能、生成、または神経回路網（ニューラルネットワーク）の形成および機能の原因である維持において役割を果たし、そしてＢＰＤ病理学と交差するという仮説が立てられた。
【0070】
１つの研究において、ＣＲＭＰ２を欠くか、またはＢＰＤの様々な状態の信頼できるモデルとして構成的に活性なＣＲＭＰ２を有するトランスジェニックマウスからのニューロンが利用された。さらなるテストとして、ＢＰＤ個体からのｉＰＳＣ由来ニューロンの、疾患を有しない対照に対する比較（図１を参照）。神経突起プロテオミクスを使用して、カルシウムシグナル伝達がＣＲＭＰ２機能にリンクしていることが決定された。ニューロンネットワークの動力学を観察すること、およびニューロンのシグナル伝達データの分類のためのアルゴリズムの開発により、ニューロンのカルシウムの過活性と定量的に機能低下したニューロンネットワークとの間の直感に反する軸が特定された。さらに、このアプローチは、臨床ＢＰＤ診断を強化し、最適な治療戦略を導くために扱いやすい。
【0071】
ＣＲＭＰ２がいかにしてＢＰＤ躁病を媒介するかについてのメカニズムを決定するために、多電極アレイ（ＭＥＡ）を用いるＣＲＭＰ２－ＫＯ一次海馬ニューロン（および遺伝的に対の野生型ニューロン、ＷＴ）におけるニューロンネットワークシグナル伝達を観察することができる（図２を参照）。コンピュータの回路によく似たニューロンネットワークの基本的な目的は、あるニューロンから別のニューロンに中継される情報のバイトとして作用する活動電位の「スパイク」を使用して、それ自体の中で情報を処理および共有することである。ＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンは機能低下したニューロンネットワークを作成するが、ＢＰＤを模倣するＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンネットワークは、野生型対照と比較して不十分なシグナル伝達プロファイルを示した（図３を参照）。ニューロンネットワークの目的がニューロン間で情報を共有することである場合、より機能的なネットワークがより多くの情報をより複雑に、より長期間共有できることが期待される。ＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンは、ＷＴ対照と比較して、「バースト」と呼ばれる複雑なシグナル伝達事象の頻度が低く、ＣＲＭＰ２活性が失われると、ニューロンが他のニューロンと通信する能力が低下することを暗示する（図４Ａを参照）。ＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンが「ネットワークバースト」と呼ばれる複雑なネットワークシグナリング事象を示す場合、持続時間（期間）はＷＴニューロンの持続時間よりも短くなる（図４Ｂを参照）。ＣＲＭＰ２－ＫＯネットワークは、ネットワークシグナリング事象中に通信する情報または「スパイク」も少なくなる。要約すると、ＣＲＭＰ２活性がないため、複雑な情報の通信が減少し、ネットワークシグナリング事象に含まれる情報が短期間で少なくなる（図４Ｃを参照）。記載される分類システムの実装は、認知機能の根底にあるプロセスへの重要な洞察を提供できるため、ＣＲＭＰ２活動の減少がニューロンネットワークおよびＢＰＤの動作の減少にどのようにつながるかについての分子メカニズムへの洞察を提供する。
【0072】
トランスジェニックＣＲＭＰ２マウスからの神経突起の単離
枯渇したＣＲＭＰ２活性を有するニューロン（ＣＲＭＰ２－ＫＯおよびＬｉＲ－ＢＰＤ）は、神経突起の長さおよび樹状突起棘密度が減少している。したがって、ＣＲＭＰ２がこれらの構造の分子機構をどのように調節するか、およびそれらがＢＰＤ病理にどのように関連するかを理解することで、洞察を得ることができる。記載される分類システムの開発は、ＣＲＭＰ２－ＫＯマウスからのＥ１６．５一次海馬ニューロンがウエスタンブロットにおいてＣＲＭＰ２タンパク質を示さなかったのに対し、ＣＲＭＰ２－ＫＩは野生型動物と同様のＣＲＭＰ２レベルを有した（図５Ａを参照）。さらに、ＣＲＭＰ２－ＫＩニューロンはまた、ＣＲＭＰ２－Ｔ５１４においてリン酸化を示さず、これは、ＬｉＲ－ＢＰＤを治療するためのリチウムの作用機序に不可欠であると想定される残基であるが、野生型ニューロンでは予想どおりに見出された（図５Ｂを参照）。
枯渇したＣＲＭＰ２活性を有するニューロン（ＣＲＭＰ２－ＫＯおよびＬｉＲ－ＢＰＤ）は、神経突起の長さおよび樹状突起棘密度が減少している。したがって、ＣＲＭＰ２がこれらの構造の分子機構をどのように調節するか、およびそれらがＢＰＤ病理にどのように関連するかを理解することで、洞察を得ることができる。記載される分類システムの開発は、ＣＲＭＰ２－ＫＯマウスからのＥ１６．５一次海馬ニューロンがウエスタンブロットにおいてＣＲＭＰ２タンパク質を示さなかったのに対し、ＣＲＭＰ２－ＫＩは野生型動物と同様のＣＲＭＰ２レベルを有した（図５Ａを参照）。さらに、ＣＲＭＰ２－ＫＩニューロンはまた、ＣＲＭＰ２－Ｔ５１４においてリン酸化を示さず、これは、ＬｉＲ－ＢＰＤを治療するためのリチウムの作用機序に不可欠であると想定される残基であるが、野生型ニューロンでは予想どおりに見出された（図５Ｂを参照）。
【0073】
神経突起単離プロトコルのための公表された方法を利用して、ＣＲＭＰ２活性が、ＣＲＭＰ２－ＫＯ、ＣＲＭＰ２－ＫＩ、およびＷＴ海馬ニューロンから単離された神経突起のプロテオームにどのように影響するかを調べた（図５Ｃを参照）。野生型ニューロンの神経突起プロテオームは、クーマシー染色タンパク質ゲルを介して、一次海馬ニューロン全体の神経突起プロテオームとは異なっている（図５Ｄを参照）。さらに、神経突起プロテオームは、核有糸分裂アセンブリタンパク質（ＮｕＭＡ）またはニューロン特異的核マーカーＦＯＸ３Ａ／ＮｅｕＮなどの検出可能なレベルの核タンパク質を含まないことが確認された（図５Ｅを参照）。神経突起には核タンパク質は含まれていなかったが、ＣＲＭＰ２の２つの主要なアイソフォームが含まれており、これは、ＣＲＭＰ２によって示差的に調節される任意のタンパク質を観察する能力を暗示する。
【0074】
ＣＲＭＰ２に起因する神経突起プロテオミクスの違いの解明
大規模なプロテオミクスアッセイを実施して、神経突起においてＣＲＭＰ２によって調節される異なるタンパク質および翻訳後修飾（ＰＴＭ）を決定した（図５Ｆを参照）。二次元ゲル内電気泳動（２Ｄ－ＤＩＧＥ）を実施し、それぞれＣｙ２、Ｃｙ３、およびＣｙ５色素で染色されたＣＲＭＰ２－ＫＩ、ＣＲＭＰ２－ＫＯ、およびＷＴの神経突起タンパク質溶解物を比較した。３つのマウスモデルのそれぞれからの全プロテオームは、タンパク質サイズと等電点によって分離された。神経突起のＣＲＭＰ２活性によって示差的に調節されるタンパク質は、蛍光を介して視覚化され、続いて質量スペクトル分析によって同定された（図６Ａを参照）。
大規模なプロテオミクスアッセイを実施して、神経突起においてＣＲＭＰ２によって調節される異なるタンパク質および翻訳後修飾（ＰＴＭ）を決定した（図５Ｆを参照）。二次元ゲル内電気泳動（２Ｄ－ＤＩＧＥ）を実施し、それぞれＣｙ２、Ｃｙ３、およびＣｙ５色素で染色されたＣＲＭＰ２－ＫＩ、ＣＲＭＰ２－ＫＯ、およびＷＴの神経突起タンパク質溶解物を比較した。３つのマウスモデルのそれぞれからの全プロテオームは、タンパク質サイズと等電点によって分離された。神経突起のＣＲＭＰ２活性によって示差的に調節されるタンパク質は、蛍光を介して視覚化され、続いて質量スペクトル分析によって同定された（図６Ａを参照）。
【0075】
神経突起においてＣＲＭＰ２によって示差的に調節されるタンパク質および経路のバイオインフォマティクス分析
５９個のタンパク質が、２Ｄ－ＤＩＧＥを介したＣＲＭＰ２活性によって示差的に調節されることが見出された（図７を参照）。どの経路が神経突起のＣＲＭＰ２によって最も顕著に調節されたかを偏りのないアプローチを用いて決定するために、２Ｄ－ＤＩＧＥの結果をＩｎｇｅｎｕｉｔｙ（インジェヌイティ、創意工夫）ＩＰＡ標準経路分析を用いて分析した。神経突起のＣＲＭＰ２活性によって最も影響を受けると予測される２２の経路のうち、インビトロでのＢＰＤニューロンのカルシウムシグナル伝達異常のさまざまな特徴が同定されているため、最も興味深いのはカルシウムシグナル伝達であった（図６Ｂを参照）。ＣＲＭＰ２は、最もよく知られているのはＣａＶ２．２（５９－６３）である、多くのカルシウムチャネルタンパク質と相互作用することにより、ニューロンのカルシウムシグナル伝達および神経伝達物質の放出に影響を与えることが示されている。軸索ガイダンスシグナル伝達、アクチン細胞骨格シグナル伝達、およびニューロンのセマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｇ）シグナル伝達など、ＣＲＭＰ２によって調節される既知の経路もまた同定された。これらの知見は、プロテオミクスプロファイリングの内部検証として機能する。エフリンシグナル伝達、アクチン細胞骨格シグナル伝達およびｒｈｏシグナル伝達も同定された。これらはすべて、シナプス機能に関連する経路である。興味深いことに、これらの経路は、カルシウムシグナル伝達とともに、すべて構成要素としてＭＡＰＫを含んでいる。
５９個のタンパク質が、２Ｄ－ＤＩＧＥを介したＣＲＭＰ２活性によって示差的に調節されることが見出された（図７を参照）。どの経路が神経突起のＣＲＭＰ２によって最も顕著に調節されたかを偏りのないアプローチを用いて決定するために、２Ｄ－ＤＩＧＥの結果をＩｎｇｅｎｕｉｔｙ（インジェヌイティ、創意工夫）ＩＰＡ標準経路分析を用いて分析した。神経突起のＣＲＭＰ２活性によって最も影響を受けると予測される２２の経路のうち、インビトロでのＢＰＤニューロンのカルシウムシグナル伝達異常のさまざまな特徴が同定されているため、最も興味深いのはカルシウムシグナル伝達であった（図６Ｂを参照）。ＣＲＭＰ２は、最もよく知られているのはＣａＶ２．２（５９－６３）である、多くのカルシウムチャネルタンパク質と相互作用することにより、ニューロンのカルシウムシグナル伝達および神経伝達物質の放出に影響を与えることが示されている。軸索ガイダンスシグナル伝達、アクチン細胞骨格シグナル伝達、およびニューロンのセマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｇ）シグナル伝達など、ＣＲＭＰ２によって調節される既知の経路もまた同定された。これらの知見は、プロテオミクスプロファイリングの内部検証として機能する。エフリンシグナル伝達、アクチン細胞骨格シグナル伝達およびｒｈｏシグナル伝達も同定された。これらはすべて、シナプス機能に関連する経路である。興味深いことに、これらの経路は、カルシウムシグナル伝達とともに、すべて構成要素としてＭＡＰＫを含んでいる。
【0076】
ＭＡＰＫ活性は、ニューロンネットワークシグナル伝達におけるＢＰＤ関連の欠損を調節する
ウエスタンブロッティングを介して、ＭＡＰＫレベルがＣＲＭＰ２－ＫＩ神経突起において増加し、ＣＲＭＰ２－ＫＯ神経突起で減少することを確認した後、４２ＫＤａのＥＲＫ２アイソフォームがＣＲＭＰ２活性によって最も影響を受けると同定された（図６Ｃを参照）。ＭＡＰＫ／ＥＲＫ２シグナル伝達がＣＲＭＰ２の神経機能に対する影響に不可欠であるかどうかをテストするために、ＭＥＡを用いるｈｉＰＳＣ由来の神経培養において、ＥＲＫ２シグナル伝達を、特定の阻害剤であるピラゾリルピロール（ＰＺＰ）を用いて阻害した。ＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンで観察されたのと同じＭＥＡシグナル伝達障害が、ＰＺＰで処理されたヒトニューロンで発生するという仮説が立てられた（図６Ｄを参照）。ＰＺＰへの３日間の曝露で、ニューロン培養はバースト頻度が増加したが、ネットワークバースト持続時間およびネットワークバーストあたりのスパイク数は減少した（図６Ｅ－Ｇを参照）。ＭＥＡニューロンネットワークシグナル伝達におけるこれらの欠陥は、ＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンで観察されたものと同じであった（図３を参照）。ネットワークシグナル伝達に対するＭＡＰＫ経路の影響がＢＰＤ生物学に関連しているかどうかをより正確に決定するために、ｈｉＰＳＣ由来の神経細胞培養物を５ｍＭ ＬｉＣｌで１週間前処理した後、ＰＺＰで処理した（図６Ｄを参照）。リチウムで前処理された培養物はネットワークバースト持続時間およびネットワークバーストあたりのスパイク数が増加したため、リチウムはＭＡＰＫ阻害によって引き起こされたネットワークシグナル伝達の減少を救うようである（図６Ｆ－Ｇを参照）。神経突起プロテオームがＣＲＭＰ２によってどのように調節されているかを観察し、ヒト神経培養においてＭＡＰＫ／ＥＲＫ２シグナル伝達を阻害し、ＢＤ治療用リチウムを用いてシグナル伝達をレスキューすることにより、ＣＲＭＰ２－ＫＯ（ＢＰＤのモデル）マウス培養で観察されたネットワークシグナル伝達異常は再作製された。
ウエスタンブロッティングを介して、ＭＡＰＫレベルがＣＲＭＰ２－ＫＩ神経突起において増加し、ＣＲＭＰ２－ＫＯ神経突起で減少することを確認した後、４２ＫＤａのＥＲＫ２アイソフォームがＣＲＭＰ２活性によって最も影響を受けると同定された（図６Ｃを参照）。ＭＡＰＫ／ＥＲＫ２シグナル伝達がＣＲＭＰ２の神経機能に対する影響に不可欠であるかどうかをテストするために、ＭＥＡを用いるｈｉＰＳＣ由来の神経培養において、ＥＲＫ２シグナル伝達を、特定の阻害剤であるピラゾリルピロール（ＰＺＰ）を用いて阻害した。ＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンで観察されたのと同じＭＥＡシグナル伝達障害が、ＰＺＰで処理されたヒトニューロンで発生するという仮説が立てられた（図６Ｄを参照）。ＰＺＰへの３日間の曝露で、ニューロン培養はバースト頻度が増加したが、ネットワークバースト持続時間およびネットワークバーストあたりのスパイク数は減少した（図６Ｅ－Ｇを参照）。ＭＥＡニューロンネットワークシグナル伝達におけるこれらの欠陥は、ＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンで観察されたものと同じであった（図３を参照）。ネットワークシグナル伝達に対するＭＡＰＫ経路の影響がＢＰＤ生物学に関連しているかどうかをより正確に決定するために、ｈｉＰＳＣ由来の神経細胞培養物を５ｍＭ ＬｉＣｌで１週間前処理した後、ＰＺＰで処理した（図６Ｄを参照）。リチウムで前処理された培養物はネットワークバースト持続時間およびネットワークバーストあたりのスパイク数が増加したため、リチウムはＭＡＰＫ阻害によって引き起こされたネットワークシグナル伝達の減少を救うようである（図６Ｆ－Ｇを参照）。神経突起プロテオームがＣＲＭＰ２によってどのように調節されているかを観察し、ヒト神経培養においてＭＡＰＫ／ＥＲＫ２シグナル伝達を阻害し、ＢＤ治療用リチウムを用いてシグナル伝達をレスキューすることにより、ＣＲＭＰ２－ＫＯ（ＢＰＤのモデル）マウス培養で観察されたネットワークシグナル伝達異常は再作製された。
【0077】
ＣＲＭＰ２は、ニューロンにおけるカルシウムシグナル伝達において様々な役割を果たす。例えば、ＣＲＭＰ２は電位依存性カルシウムチャネルと物理的に相互作用し、特にチャネルＣａｖ２．２を介して神経伝達物質グルタミン酸の放出を部分的に調節する。ＣＲＭＰ２とこれらのカルシウムチャネルとの物理的相互作用は、カルシウム調節プロテアーゼであるカルパイン１によっても調節される。流入するカルシウムが細胞内に突入すると、カルパインが自己活性化事象を起こし、プロテアーゼがＣＲＭＰ２を含む多種多様なタンパク質を切断し、ＣＲＭＰ２がＣａＶ２．２などのカルシウムチャネルと物理的に相互作用、およびこれを調節するのを防ぐ。
【0078】
これらのカルシウム関連プロセスが、ＣＲＭＰ２トランスジェニックマウスの神経突起において影響を受けるかどうかを調べた。いくつかの実施形態では、ＣＲＭＰ２－ＫＩ神経突起はカルシウムチャネルのレベルが増加し、ＣＲＭＰ２－ＫＯはＷＴと比較してレベルが減少するため、ウエスタンブロッティングを介して、ＣＲＭＰ２活性と神経突起におけるＣａＶ２．２の存在量との間に線形相関が観察された（図８Ａ）。いくつかの実施形態では、そのＣＲＭＰ２－ＫＯ神経突起は、活性化カルパイン１の比率が増加していることが見出された。これは、ＷＴ対照と比較して異常に高い細胞内カルシウムレベルを有するＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンによって引き起こされると仮定された。
【0079】
神経突起におけるカルシウム関連タンパク質のこれらの変化が、ＣＲＭＰ２活性によって直接引き起こされるか、またはカルシウム機能の増加を示す代償効果であるかどうかをテストするために、インビトロカルシウムイメージングを実施した。いくつかの実施形態において、カルシウムイメージングは、ＩＣ２００キネティック画像サイトメーター、カルシウム感受性色素Ｆｌｕｏ－４ ＡＭを用いて実施した（図８Ｄを参照）。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、ＣＲＭＰ２－ＫＯ、ＣＲＭＰ２－ＫＩ、およびＷＴＥ１６．５の一次海馬ニューロンを用いてハイスループット方式でカルシウムイメージングを実施する。いくつかの実施形態において、トランスジェニック一次海馬ニューロンを含む実験は、同腹仔からのＷＴニューロンと比較された。いくつかの実施形態では、細胞内カルシウムレベルトレースがＩｍａｇｅＪで生成され、カルシウム事象頻度、静止カルシウムレベル、および個々のニューロンのピークカルシウム一時性などの多種多様なカルシウム動態パラメータの表示を可能にする（図８Ａ－Ｃを参照）。
【0080】
いくつかの実施形態において、分析は、ＣＲＭＰ２活性とニューロンにおけるカルシウム事象の頻度との間の明確な関係を明らかにした（図８Ａ－Ｃを参照のこと）。例えば、、ＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンは、対照と比較して高レベルのカルシウム事象を有した（図８Ｂを参照）。いくつかの実施形態では、ＣＲＭＰ２－ＫＯ一次ニューロンは、ヒトＢＰＤニューロンで以前に報告されたものと同じカルシウム活動亢進表現型を含んでいた。さらに、いくつかの実施形態では、リチウムレスキューＢＰＤをエミュレートするＣＲＭＰ２－ＫＩが対照と比較してカルシウム事象のレベルが低下しているため、カルシウム事象頻度はＣＲＭＰ２活性と線形関係があるようにであった（図８Ｃを参照）。
【0081】
１９９４年にヒトＢＰＤ細胞でこれまでに同定された最初のカルシウム現象の１つは、細胞内静止カルシウムレベルの増加であり、これは、観察された活性化カルパイン１のレベルの増加に基づいて（ｂａｓｅｄ ｏｆｆ）ＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンに存在すると予測される表現型である。いくつかの実施形態では、同じ表現型がＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンに存在するかどうかをチェックした（ＢＰＤに類似）。いくつかの実施形態では、ＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンはまた、対照よりも高い静止細胞内カルシウムレベルを有することが見出されたが、ＣＲＭＰ２－ＫＩニューロンは反対の振る舞いをする（図８Ｆを参照）。前述のように、以前のインビトロ研究では、ＣＲＭＰ２レベルがｃａｖ２．２を介したカルシウムシグナル伝達および神経伝達物質放出に影響を与える可能性があり、ピークカルシウム一時性の上昇と神経伝達物質の増加との間に相関関係があることが示されている。基礎カルシウムレベルと同様に、いくつかの実施形態では、ＣＲＭＰ２－ＫＯ海馬ニューロンは、神経伝達物質放出および興奮毒性の増加に関連する、より高いレベルのピークカルシウム一時性を示すことが見出されたが、ＣＲＭＰ２－ＫＩは、ピークカルシウム一時性の減少を有し、これは、神経伝達物質の放出が少ないことに関連している可能性がある（図８Ｇを参照）。
【0082】
これらの発見はまとめて、ＣＲＭＰ２－ＫＯ系統が、以前にＢＰＤに関連していた広範なカルシウム過活動および興奮毒性表現型を有し、これらの特定の表現型がＣＲＭＰ２活性レベルと線形関係を有することを実証し、ＣＲＭＰ２－ＫＯマウスは、ＢＰＤを行動的に反映するだけでなく、分子的および電気生理学的にも反映することを裏付けする。逆に、リチウム治療に類似したＢＰＤ行動をレスキューするＣＲＭＰ２－ＫＩ変異は、ＣＲＭＰ２－ＫＯとは反対の表現型を有し、レスキューされたＢＰＤ挙動のモデルとして使用できる。
【0083】
さまざまなヒトＢＰＤ状態のカルシウム動態は明確であり、トランスジェニックＣＲＭＰ２ニューロンを反映する
カルシウム動態表現型を検証するために、トランスジェニックマウスニューロンは、ＢＰＤ生物学を示すものとして観察者であった。いくつかの実施形態において、インビトロ皮質介在ニューロン培養物は、Ｌｉ－ＢＰＤ、ＬｉＮＲ－ＢＰＤ、および健常対照を有するヒト患者から生成された。いくつかの実施形態において、カルシウム動態分析のための成熟培養物を生成する分化プロセスが実施された。いくつかの実施形態において、誘導されたニューロンは、Ｍａｐ２（成熟ニューロン細胞骨格要素）、Ｃｕｘ１（上部皮質マーカー）、およびイオンチャネルｖＧｌｕｔを発現した。いくつかの実施形態において、カルシウム動態分析は、リチウムのあるなしで処理された（７日間５ｍＭ）、Ｌｉ－ＢＰＤ、Ｌｉ－ＮＲ ＢＰＤ、疾患を有しない健常対照からのヒトｉＰＳＣ由来神経培養物とともに、（上記のようにマウスニューロンを用いて）実施された。ＢＰＤニューロンはＣＲＭＰ２－ＫＯ培養物と同様の表現型を有し、ＣＲＭＰ２－ＫＩマウスニューロンは疾患を有しないリチウム処理ニューロンと同様のカルシウム動態プロファイルを有し、疾患を有しないニューロンはＷＴマウスニューロンを反映すると仮定された（図１）。
カルシウム動態表現型を検証するために、トランスジェニックマウスニューロンは、ＢＰＤ生物学を示すものとして観察者であった。いくつかの実施形態において、インビトロ皮質介在ニューロン培養物は、Ｌｉ－ＢＰＤ、ＬｉＮＲ－ＢＰＤ、および健常対照を有するヒト患者から生成された。いくつかの実施形態において、カルシウム動態分析のための成熟培養物を生成する分化プロセスが実施された。いくつかの実施形態において、誘導されたニューロンは、Ｍａｐ２（成熟ニューロン細胞骨格要素）、Ｃｕｘ１（上部皮質マーカー）、およびイオンチャネルｖＧｌｕｔを発現した。いくつかの実施形態において、カルシウム動態分析は、リチウムのあるなしで処理された（７日間５ｍＭ）、Ｌｉ－ＢＰＤ、Ｌｉ－ＮＲ ＢＰＤ、疾患を有しない健常対照からのヒトｉＰＳＣ由来神経培養物とともに、（上記のようにマウスニューロンを用いて）実施された。ＢＰＤニューロンはＣＲＭＰ２－ＫＯ培養物と同様の表現型を有し、ＣＲＭＰ２－ＫＩマウスニューロンは疾患を有しないリチウム処理ニューロンと同様のカルシウム動態プロファイルを有し、疾患を有しないニューロンはＷＴマウスニューロンを反映すると仮定された（図１）。
【0084】
仮定されたように、いくつかの実施形態では、マウスニューロンで検出されたカルシウム動態挙動のすべてがヒトアナログで観察され、ここでは、ＢＰＤニューロンは、疾患を有しない対照のそれよりもカルシウム事象頻度によって測定されるのと同じカルシウムシグナル伝達の増加を示したのに対して、疾患を有しないリチウム処理培養物はカルシウム事象頻度が最も低く、これは、トランスジェニックＣＲＭＰ２マウスに示されているように、ヒト神経生物学におけるＣＲＭＰ２活性とカルシウムシグナル伝達の間に方向性のある関係があることを示唆している（図９Ａ）。さらに、いくつかの実施形態では、ヒト培養物の静止カルシウムレベルはマウスニューロンのそれと一致し、ここでは、ＢＰＤニューロンは対照と比較して基底細胞内カルシウムレベルが上昇しているのに対し、リチウム処理された疾患を有しないニューロンは最低の静止カルシウムレベルを有し、ＣＲＭＰ２－ＫＩニューロンのそれと一致した（図９Ｂ）。いくつかの実施形態では、同じ方向性の関係が、ヒト由来の神経培養におけるピークカルシウム一時性レベルで観察され、リチウム処理された疾患を有しないニューロンが最低レベルを示したのに対し、ＢＰＤニューロンは上昇したピークカルシウム一時性レベルを示した（図９Ｃ）。これは、ヒトＢＰＤニューロンがカルシウム活性表現型の増加だけでなく、カルシウム動態が興奮毒性傾向を示す異常な細胞内カルシウム恒常性表現型も有していることを示す。
【0085】
予期しなかったことであり、そして注目すべきことに、いくつかの実施形態において、マウスで分析されたこれらの同じカルシウム動態パラメータは、特に、カルシウム事象頻度、静止カルシウムレベルおよびピークカルシウム一時性の各パラメータについて、ＢＰＤの２つの別個の臨床サブグループ（Ｌｉ－Ｒ対Ｌｉ－ＮＲ）を区別することができ、Ｌｉ－ＢＰＤ個体に見られる異常なレベルは、リチウムで処理した場合の健康レベルのレベルにまで正常化されたが、一方、Ｌｉ－ＮＲＢＰＤレベルに見られる上昇レベルは、決してリチウム曝露を伴う疾患を有しないレベルの変化までは低下せず、対照よりも統計的に有意な増加を維持した（図９Ａ－９Ｃ）。いくつかの実施形態では、リチウム処理は、Ｌｉ－ＮＲ ＢＰＤ培養物における静止カルシウムレベルおよびピークカルシウム一時性に対して統計的影響を及ぼさなかった（図９Ｂ－９Ｃ）。したがって、Ｌｉ－ＲおよびＬｉ－ＮＲ ＢＰＤは、カルシウム動態の上昇において互いに表現型コピーを行うが、リチウム処理に対するそれらの応答は、それらの分子病因が異なることを示す。
【0086】
カルシウム動態によるＢＰＤとリチウム応答性の予測
いくつかの実施形態において、結果は、Ｌｉ－ＮＲ ＢＰＤ、Ｌｉ－Ｒ ＢＰＤ、および疾患を有しないニューロンが、別個のカルシウムシグナル伝達特徴を有することを示した。これらの知見からのＢＰＤおよびリチウム応答性の予測がテストされた。いくつかの実施形態では、トレーニング機能として基礎カルシウムレベル、ピークカルシウム一時性、およびカルシウム事象頻度を有するＫＮＮ機械学習分類子が開発された。いくつかの実施形態では、相関分析は、特徴が独立しておらず、過剰適合を防ぐために５のｋ最近傍値を示したので、ＫＮＮアプローチが利用された。モデルの精度を最適化するために、いくつかの実施形態では、トレーニング中にダウンサンプリングが利用された（ｎ＝１０）。トレーニング後、モデルのＲＯＣは０．９９６であり、これは、１％より下の偽陽性率、９９．７％の検証精度率を意味した（図９Ｄ）。いくつかの実施形態では、モデルがＢＰＤを予測した場合、次に、それらがＬｉ－ＲであるかＬｉ－ＮＲであるかを判断し、１０ニューロンのダウンサンプルサイズで９８．５％の精度および１％より下の偽陽性率（ＲＯＣ＝０．９９３）であった。いくつかの実施形態では、モデルは、患者がＢＰＤを有するかどうかを非常に正確に診断でき、もしそうであれば、それらは、わずか２０個のニューロン（１０個の未処理ニューロンおよび１０個のリチウム処理ニューロン）でリチウムに応答する。いくつかの実施形態では、分類子は、細胞株によってデータポイントを分離し、データの８０％で分類子をトレーニングすることによって、臨床的関連性を有するように設計された。いくつかの実施形態では、予測するとき、モデルは、見えないデータの残りの２０％から、ＬｉＣｌで処理されたデータポイントおよび処理されていないデータポイントを引き出した。いくつかの実施形態では、トレーニングおよび予測のためのデータは、分類されているカルシウム記録からランダムに選択され、この手順は、精度および偽陽性率の統計的推定を得るためにランダムに２０００回繰り返された。
いくつかの実施形態において、結果は、Ｌｉ－ＮＲ ＢＰＤ、Ｌｉ－Ｒ ＢＰＤ、および疾患を有しないニューロンが、別個のカルシウムシグナル伝達特徴を有することを示した。これらの知見からのＢＰＤおよびリチウム応答性の予測がテストされた。いくつかの実施形態では、トレーニング機能として基礎カルシウムレベル、ピークカルシウム一時性、およびカルシウム事象頻度を有するＫＮＮ機械学習分類子が開発された。いくつかの実施形態では、相関分析は、特徴が独立しておらず、過剰適合を防ぐために５のｋ最近傍値を示したので、ＫＮＮアプローチが利用された。モデルの精度を最適化するために、いくつかの実施形態では、トレーニング中にダウンサンプリングが利用された（ｎ＝１０）。トレーニング後、モデルのＲＯＣは０．９９６であり、これは、１％より下の偽陽性率、９９．７％の検証精度率を意味した（図９Ｄ）。いくつかの実施形態では、モデルがＢＰＤを予測した場合、次に、それらがＬｉ－ＲであるかＬｉ－ＮＲであるかを判断し、１０ニューロンのダウンサンプルサイズで９８．５％の精度および１％より下の偽陽性率（ＲＯＣ＝０．９９３）であった。いくつかの実施形態では、モデルは、患者がＢＰＤを有するかどうかを非常に正確に診断でき、もしそうであれば、それらは、わずか２０個のニューロン（１０個の未処理ニューロンおよび１０個のリチウム処理ニューロン）でリチウムに応答する。いくつかの実施形態では、分類子は、細胞株によってデータポイントを分離し、データの８０％で分類子をトレーニングすることによって、臨床的関連性を有するように設計された。いくつかの実施形態では、予測するとき、モデルは、見えないデータの残りの２０％から、ＬｉＣｌで処理されたデータポイントおよび処理されていないデータポイントを引き出した。いくつかの実施形態では、トレーニングおよび予測のためのデータは、分類されているカルシウム記録からランダムに選択され、この手順は、精度および偽陽性率の統計的推定を得るためにランダムに２０００回繰り返された。
【0087】
ＢＰＤおよびＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンは異常なニューロンネットワークカルシウムシグナル伝達の同期を共有する
いくつかの実施形態において、ＭＥＡデータは、主にナトリウムおよびカリウムチャネルによって駆動される活動電位シグナル伝達が、ネットワークシグナル伝達に関するＣＲＭＰ２活性によって影響を受けることを実証する。臨床的にＢＰＤに関連している主なカルシウムシグナル伝達特性の１つはてんかんである。てんかんと発作はＢＰＤに関連する主要な併存疾患の１つであり、２つの状態に関連する強い疫学的歴史がある。不安に対処するためにＢＰＤ患者や他の精神病患者に処方される主なオフターゲット治療薬は、典型的な抗てんかん薬であるバルプロ酸である。いくつかの実施形態では、カルシウムネットワークシグナル伝達に焦点を合わせたカルシウム動態データを調べて、ネットワークの健康状態を測定した。これを定量化するために、いくつかの実施形態では、インビトロでのてんかん表現型を示す、インビトロでのカルシウム事象の同期を定量化するためのアルゴリズムが開発された。いくつかの実施形態では、アルゴリズムは、ネットワーク内のすべてのニューロンおよびそれらのカルシウム事象を考慮し、個々のカルシウム事象を時間ビンに割り当て、各時間ビンの合計計算を実施し、次に、ネットワーク内のニューロンの数に正常化された最高のビン値に基づく（ｂａｓｅｄ ｏｆｆ）同期スコアを提供する（図１０Ａ）。
いくつかの実施形態において、ＭＥＡデータは、主にナトリウムおよびカリウムチャネルによって駆動される活動電位シグナル伝達が、ネットワークシグナル伝達に関するＣＲＭＰ２活性によって影響を受けることを実証する。臨床的にＢＰＤに関連している主なカルシウムシグナル伝達特性の１つはてんかんである。てんかんと発作はＢＰＤに関連する主要な併存疾患の１つであり、２つの状態に関連する強い疫学的歴史がある。不安に対処するためにＢＰＤ患者や他の精神病患者に処方される主なオフターゲット治療薬は、典型的な抗てんかん薬であるバルプロ酸である。いくつかの実施形態では、カルシウムネットワークシグナル伝達に焦点を合わせたカルシウム動態データを調べて、ネットワークの健康状態を測定した。これを定量化するために、いくつかの実施形態では、インビトロでのてんかん表現型を示す、インビトロでのカルシウム事象の同期を定量化するためのアルゴリズムが開発された。いくつかの実施形態では、アルゴリズムは、ネットワーク内のすべてのニューロンおよびそれらのカルシウム事象を考慮し、個々のカルシウム事象を時間ビンに割り当て、各時間ビンの合計計算を実施し、次に、ネットワーク内のニューロンの数に正常化された最高のビン値に基づく（ｂａｓｅｄ ｏｆｆ）同期スコアを提供する（図１０Ａ）。
【0088】
ＷＴマウス海馬ニューロンからの培養物において、カルシウム事象の識別可能なパターンはないように思われるが、同期されたニューロンの小グループを含む（しかし、全培養物に対して合致しているパターンはない）が採用された。ＣＲＭＰ２－ＫＯ初代ニューロン培養では、すべてのニューロンが同じ時間の瞬間にカルシウム事象を起こした時間の経過に伴うカルシウム事象の１００％同期がしばしば観察された（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。この観察可能な差異が定量化され、ＣＲＭＰ２－ＫＯ初代培養物は野生型およびＣＲＭＰ２－ＫＩのそれと比較して統計的に増加したレベルのカルシウム同期を有することが見出された。ＣＲＭＰ２－ＫＩ培養物は野生型培養物よりも統計的に有意に低くはなかったが、ＣＲＭＰ２活性、およびＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンにおけるその欠如は、カルシウムネットワーク動力学に影響を与えるようである（図１０Ｄ）。この現象がヒトのＢＰＤ生物学に当てはまるかどうかを検証するために、ＢＰＤニューロン、健康な疾患を有しないニューロン、およびリチウムで処理された疾患を有しないニューロンのカルシウム同期を定量化した。いくつかの実施形態では、これらのグループは、それぞれ、ＣＲＭＰ２－ＫＯ、ＷＴ、およびＣＲＭＰ２－ＫＩニューロンに最も正確に対応する。いくつかの実施形態では、ＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンで見られるのと同じ、ＢＰＤニューロンの同期スコアの方向性の増加であり、ＢＰＤニューロンは、疾患を有しないニューロンおよびリチウムで処理された疾患を有しないニューロンよりもネットワーク内のカルシウム同期性の上昇レベルが観察された（図１０Ｅ）。いくつかの実施形態において、増加した同期性のレベルは、ＣＲＭＰ２－ＫＯニューロンのレベルほど高くはないが、減少したＣＲＭＰ２活性によって引き起こされる同期表現型は、依然としてヒトＢＰＤ生物学に存在する。
【0089】
いくつかの実施形態では、以前のＭＥＡデータと組み合わせると、このカルシウムネットワーク分析は、ＣＲＭＰ２－ＫＯおよびＢＰＤニューロンにおいて観察されるカルシウムの過度の活動が、どのように機能低下ネットワークに変換されるかの全体図を提供し、ここでは、より少ない情報が中継され、神経回路網のシグナル伝達の健康状態は、てんかんの病状を示している。この神経活動の増加がどのように健康に悪影響を与えるかを伝える生物学的類似性は、心臓の健康における頻脈であり、異常に高い心拍数は全体的な心拍出量を低下させ、患者に不足をもたらす可能性がある。
【0090】
考察
ＢＰＤは、統合失調症（ＳＣＺ）および自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）などの他の多くの多遺伝子性神経障害と同様に、その病態生理学に関してほとんど知られておらず、ここ数十年で臨床的進歩がほとんどない難治性疾患であった。独立したグループが脳特異的ＣＲＭＰ２－ＫＯマウスを生成し、ＳＣＺを彷彿とさせるさまざまな行動および認知表現型を観察し、ＣＲＭＰ２が複数の神経認知機能において強力な役割を果たすという発見をさらに裏付けた。さらに、非活性ｐＣＲＭＰ２－Ｔ５１４：活性ＣＲＭＰ２比は、ＬｉＲ ＢＰＤ患者で独自に上昇し、リチウムはこの比を疾患を有しない個人で観察されるレベルに正常化する。これは、両方とも、ＣＲＭＰ２活性の長期的な喪失により予想される現象である、ＢＰＤ個体における神経突起の短縮と樹状突起棘密度の低下を報告した死後のＢＰＤ脳組織研究と一致している。これは、ＢＰＤの分子リチウム応答経路がＣＲＭＰ２を介して作用し、神経細胞骨格の動力学、特に樹状突起と樹状突起棘の形成、したがって神経ネットワークの発達と機能を変化させることを示唆する。
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ＢＰＤは、統合失調症（ＳＣＺ）および自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）などの他の多くの多遺伝子性神経障害と同様に、その病態生理学に関してほとんど知られておらず、ここ数十年で臨床的進歩がほとんどない難治性疾患であった。独立したグループが脳特異的ＣＲＭＰ２－ＫＯマウスを生成し、ＳＣＺを彷彿とさせるさまざまな行動および認知表現型を観察し、ＣＲＭＰ２が複数の神経認知機能において強力な役割を果たすという発見をさらに裏付けた。さらに、非活性ｐＣＲＭＰ２－Ｔ５１４：活性ＣＲＭＰ２比は、ＬｉＲ ＢＰＤ患者で独自に上昇し、リチウムはこの比を疾患を有しない個人で観察されるレベルに正常化する。これは、両方とも、ＣＲＭＰ２活性の長期的な喪失により予想される現象である、ＢＰＤ個体における神経突起の短縮と樹状突起棘密度の低下を報告した死後のＢＰＤ脳組織研究と一致している。これは、ＢＰＤの分子リチウム応答経路がＣＲＭＰ２を介して作用し、神経細胞骨格の動力学、特に樹状突起と樹状突起棘の形成、したがって神経ネットワークの発達と機能を変化させることを示唆する。
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【0091】
いくつかの実施形態において、トランスジェニックマウスモデル、「ディッシュの中の疾患」ｈｉＰＳＣモデリング、および診療所からの患者データの組み合わせは、ＢＰＤが、ニューロン細胞骨格モジュレーターＣＲＭＰ２の不均衡な調節によって駆動されるネットワーク障害であることを実証する。神経突起におけるＣＲＭＰ２活性によって影響を受けるタンパク質および経路を偏りなく解明することにより、ＢＰＤ分子病因、ニューロン間コミュニケーション、特にカルシウムシグナル伝達に関してこれまで未踏の細胞構造がＣＲＭＰ２活性の喪失により調節不全になる。脊椎におけるＣＲＭＰ２活性の低下がどのように合体して行動および認知機能障害になるかについての考えられる説明は、カルシウムシグナル伝達におけるＣＲＭＰ２の役割によるものである。ＢＰＤのモデルの全体のニューロンの過活動が機能低下したニューロンネットワークにどのようにつながるかの間には、直感に反する並置がある。ＬｉＲ ＢＰＤ患者からＣＲＭＰ２－ＫＯマウスまで、ＣＲＭＰ２活性が低下したニューロンには、過興奮の図を描く電気生理学的特性のプロファイルがある。カルシウム事象の頻度の増加は、既知のＣＲＭＰ２欠損症のマウスニューロンとヒトニューロンの両方で観察された。いくつかの実施形態において、ＣＲＭＰ２は、多くのカルシウムチャネルタンパク質と相互作用することによって、ニューロンのカルシウムシグナル伝達および神経伝達物質の放出に影響を与えることが示されており、最も研究されているのはＣａＶ２．２である。より実際的な注意点として、これらのデータは、トランスジェニックＣＲＭＰ２マウスが、リチウム応答性ＢＰＤの非常に忠実な動物モデルとして利用できるという確固たる証拠を提供する。これは、その行動、プロテオミクス、ニューロン構造、およびシグナル伝達プロファイルの両方が、ヒトＢＰＤでの観察を再現するためである。
【0092】
特定のカルシウム分析パラメータはまた、ＢＰＤの臨床サブグループを区別することができ、個別化医療アプローチと組み合わせると、すべての神経学的障害の診断ツールとして即座に開発することができる。以前の報告では、ＢＰＤ診断の方法としてパッチクランプ法が提案されていたが、パッチクランプ法による診断は、この技術の時間がかかり面倒な性質により、診療所での実現可能性に欠けている。薬物応答性を診断および予測するためのハイスループットカルシウムイメージングは、臨床的に非常に有望である。あらゆる年齢の患者が、定義されたプロトコルで神経培養を生成できる血液サンプルを提供し、その後、カルシウム動態をハイスループットでスクリーニングして、可能な診断に到達するだけでなく、それらの神経生物学のために最も効果的な治療法を特定する可能性がある。。診断の小さな、しかし重要ではない側面は、神経精神医学の分野が歴史的にＢＰＤをどのように見ているかである。ＢＰＤは依然としてＤＳＭ－Ｖにおいてうつ病のような気分障害として分類されているが、このラベルは、同様の生物学に対する表現型の特徴に基づいている（ｂａｓｅｄ ｏｆｆ）。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、ＢＰＤを分類するための新規の分子基盤を提供する。
【0093】
材料および方法
一次組織および細胞の分離
いくつかの実施形態において、一次海馬および皮質組織は、Ｅ１６マウス胚から単離され、氷上でハンクス培地を含む１００ｍｍのディッシュに置かれた。後でのウエスタンブロットまたは免疫共沈降アッセイでの使用のために、皮質組織を液体窒素で凍結した。海馬組織をＨＢＳＳで１回洗浄し、室温で新鮮なＥＢＳＳを含むコニカルに移した。海馬組織は、細胞の集塊が見えなくなるまで、火仕上げしたガラスピペットで滴定を使用して分離した。細胞を数え、それに応じて標的密度でプレーティングした。ＣＲＭＰ２－ＫＯまたはＣＲＭＰ２－ＫＩマウスからの一次ニューロンを必要とするすべての実験では、常に野生型ニューロンが遺伝的に対になった同腹仔から分離されていた。初代神経培養は３７℃、７％ＣＯ２で増殖された。
一次組織および細胞の分離
いくつかの実施形態において、一次海馬および皮質組織は、Ｅ１６マウス胚から単離され、氷上でハンクス培地を含む１００ｍｍのディッシュに置かれた。後でのウエスタンブロットまたは免疫共沈降アッセイでの使用のために、皮質組織を液体窒素で凍結した。海馬組織をＨＢＳＳで１回洗浄し、室温で新鮮なＥＢＳＳを含むコニカルに移した。海馬組織は、細胞の集塊が見えなくなるまで、火仕上げしたガラスピペットで滴定を使用して分離した。細胞を数え、それに応じて標的密度でプレーティングした。ＣＲＭＰ２－ＫＯまたはＣＲＭＰ２－ＫＩマウスからの一次ニューロンを必要とするすべての実験では、常に野生型ニューロンが遺伝的に対になった同腹仔から分離されていた。初代神経培養は３７℃、７％ＣＯ２で増殖された。
【0094】
ヒト人工多能性幹細胞の培養および分化
いくつかの実施形態において、他の定義された媒体には、将来の結果を歪める可能性のあるリチウムが含まれていたので、ｈｉＰＳＣは、２０ｎｇ／μｌの組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｒ＆Ｄ）Ｓｙｓｔｅｍｓ，２３３－ＦＢ）を含むマウス胚性線維芽細胞馴化培地（ＭＥＦ－ＣＭ）において培養された。他のｈｉＰＳＣは、定義されたｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養され、区別できない結果が得られた。幹細胞は、１ｍｌの血清ピペット（Ｆａｌｃｏｎ）を使用して５～７日ごとに機械的に継代し、３７℃で増殖させた。ｈｉＰＳＣは、以前に報告されたように段階的に皮質介在（ｉｎｔｅｒｎ）ニューロンに分化したが、簡単に説明する。ｈｉＰＳＣは、継代の３日後、または細胞が３０～４０％コンフルエントになったとき、培地を神経誘導培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ，１０５６５－０１８）Ｎ２、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ，１７５０２－０４８；１７５０４－０４４）、５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ａ１９３３－５Ｇ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＰＳ－２０）に変更することによって分化させた。培地を交換し、記載されているように毎日小分子を補充した：３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，０４－０００４）２μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，０４－００１０）、μＭ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ－Ｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，５６５７９０－５００ＵＧ）、１０ｎｇ／ｍｌ ｈＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＬＩＦ１０１０）、７日間。ｈＮＳＣを分化培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１１０３０４９）、Ｂ２７、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、３５０５００６１）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＰＳ－２０）に切り替えた。８日目に、付着細胞を１０μｌチップを使用してこすり落とし、小さなセクションを得た。培地にＲＯＣＫＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｏｃｒｉｓ、１２５４）を補充し、細胞を超低付着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３４７１）分化培地で１０日間培養された浮遊ニューロスフェアを作成する。培地は１日おきに交換し、凝集を防ぐために培地を交換するたびにスフェアを攪拌した。１０日間のインキュベーション後、凝集体をアキュターゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＳＣＲ０００５）で３７℃にて１６～２０分間撹拌しながら分離し、カウントして、密度５０，０００～６０，０００細胞／ｃｍ２のマトリゲルコーティングプレートに播種した。細胞は、２０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ、２４８ＢＤ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ、２１２－ＧＤ）、１０μＭ ＤＡＰＴ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，１３１９７）、０．２Ｍ Ｌ－アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，Ａ４４０３）、１ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ３ベータ（Ｒ＆Ｄ，２４３－Ｂ３－００２）および０．５ｍＭ ｄｂＣＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ０６２７）を添加した分化培地で次の１０日間（培地を１日おきに交換）培養した。ｈｉＰＳＣの９０％以上がＴＵＪ１＋細胞になり、それらのうち、事実上すべてがＭＡＰ２＋になり、これらの細胞のほとんどは、以前に記載されたように（２６）、上部皮質ニューロンのマーカーであるＣＵＸ１を共発現した。ニューロンは、カルシウムイメージングの前に少なくともさらに１２週間培養された。ニューロンのサブセットは、カルシウムイメージングの前に分化培地中７日間５ｍＭＬｉＣｌで処理された。
いくつかの実施形態において、他の定義された媒体には、将来の結果を歪める可能性のあるリチウムが含まれていたので、ｈｉＰＳＣは、２０ｎｇ／μｌの組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｒ＆Ｄ）Ｓｙｓｔｅｍｓ，２３３－ＦＢ）を含むマウス胚性線維芽細胞馴化培地（ＭＥＦ－ＣＭ）において培養された。他のｈｉＰＳＣは、定義されたｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養され、区別できない結果が得られた。幹細胞は、１ｍｌの血清ピペット（Ｆａｌｃｏｎ）を使用して５～７日ごとに機械的に継代し、３７℃で増殖させた。ｈｉＰＳＣは、以前に報告されたように段階的に皮質介在（ｉｎｔｅｒｎ）ニューロンに分化したが、簡単に説明する。ｈｉＰＳＣは、継代の３日後、または細胞が３０～４０％コンフルエントになったとき、培地を神経誘導培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ，１０５６５－０１８）Ｎ２、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ，１７５０２－０４８；１７５０４－０４４）、５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ａ１９３３－５Ｇ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＰＳ－２０）に変更することによって分化させた。培地を交換し、記載されているように毎日小分子を補充した：３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，０４－０００４）２μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，０４－００１０）、μＭ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ－Ｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，５６５７９０－５００ＵＧ）、１０ｎｇ／ｍｌ ｈＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＬＩＦ１０１０）、７日間。ｈＮＳＣを分化培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１１０３０４９）、Ｂ２７、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、３５０５００６１）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＰＳ－２０）に切り替えた。８日目に、付着細胞を１０μｌチップを使用してこすり落とし、小さなセクションを得た。培地にＲＯＣＫＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｏｃｒｉｓ、１２５４）を補充し、細胞を超低付着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３４７１）分化培地で１０日間培養された浮遊ニューロスフェアを作成する。培地は１日おきに交換し、凝集を防ぐために培地を交換するたびにスフェアを攪拌した。１０日間のインキュベーション後、凝集体をアキュターゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＳＣＲ０００５）で３７℃にて１６～２０分間撹拌しながら分離し、カウントして、密度５０，０００～６０，０００細胞／ｃｍ２のマトリゲルコーティングプレートに播種した。細胞は、２０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ、２４８ＢＤ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ、２１２－ＧＤ）、１０μＭ ＤＡＰＴ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，１３１９７）、０．２Ｍ Ｌ－アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，Ａ４４０３）、１ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ３ベータ（Ｒ＆Ｄ，２４３－Ｂ３－００２）および０．５ｍＭ ｄｂＣＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ０６２７）を添加した分化培地で次の１０日間（培地を１日おきに交換）培養した。ｈｉＰＳＣの９０％以上がＴＵＪ１＋細胞になり、それらのうち、事実上すべてがＭＡＰ２＋になり、これらの細胞のほとんどは、以前に記載されたように（２６）、上部皮質ニューロンのマーカーであるＣＵＸ１を共発現した。ニューロンは、カルシウムイメージングの前に少なくともさらに１２週間培養された。ニューロンのサブセットは、カルシウムイメージングの前に分化培地中７日間５ｍＭＬｉＣｌで処理された。
【0095】
免疫組織化学
いくつかの実施形態において、付着細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ（Ｗａｋｏ，１６３－２０１４５）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦ）で２０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、３％ＢＳＡ、３％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ，０１７－０００－１２１）、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（Ｓｉｇｍａ、Ｔ９２８４－１００ｍｌ）を含むＰＢＳで１時間または４℃で一晩洗浄した。次に、細胞を一次抗体とともに、５％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ，０１７－０００－１２１）および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（Ｓｉｇｍａ、Ｔ９２８４－１００ｍｌ）を含むＰＢＳ中で１：１００の濃度で４℃にて２時間または一晩インキュベートした。
いくつかの実施形態において、付着細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ（Ｗａｋｏ，１６３－２０１４５）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦ）で２０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、３％ＢＳＡ、３％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ，０１７－０００－１２１）、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（Ｓｉｇｍａ、Ｔ９２８４－１００ｍｌ）を含むＰＢＳで１時間または４℃で一晩洗浄した。次に、細胞を一次抗体とともに、５％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ，０１７－０００－１２１）および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（Ｓｉｇｍａ、Ｔ９２８４－１００ｍｌ）を含むＰＢＳ中で１：１００の濃度で４℃にて２時間または一晩インキュベートした。
【0096】
カルシウムイメージング
いくつかの実施形態において、プレートは、ポリオルニチン（１０μｇ／ｍＬ）で一晩コーティングされ、続いてラミニン（５μｇ／ｍＬ）で一晩コーティングされた。初代海馬細胞（Ｅ１６）を、黒い縁の９６ウェル、透明な底板（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ ６５５０９０）にプレーティングした（２０，０００細胞／ウェル）。細胞は、Ｖａｌａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡにある前に１７日間維持された。Ｆｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆ１４２０１）の５ｍＭストック溶液は、カルシウム指示薬をＤＭＳＯ中のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐ３０００）の２０％ｗ／ｖ溶液に溶解することによって調製した。０．２μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈ３５７０）の染料カクテル、および重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔ２３９７）を含むＴｙｒｏｄｅの溶液中の１：４ Ｆｌｕｏ－４ＡＭストックを各ウェルに添加した。次に細胞を３７℃のインキュベーター中で２０分間インキュベートした。次に、細胞をタイロード液で２回洗浄した。２回目の洗浄後、Ｔｙｒｏｄｅのバッファーを各ウェルに添加し、細胞をもう一度２０分間３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした後、イメージングを行った。次に、ウェルをＩＣ２００キネティック画像サイトメーター（Ｖａｌａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）で３０秒間画像化し、９００枚の画像を生成した。
いくつかの実施形態において、プレートは、ポリオルニチン（１０μｇ／ｍＬ）で一晩コーティングされ、続いてラミニン（５μｇ／ｍＬ）で一晩コーティングされた。初代海馬細胞（Ｅ１６）を、黒い縁の９６ウェル、透明な底板（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ ６５５０９０）にプレーティングした（２０，０００細胞／ウェル）。細胞は、Ｖａｌａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡにある前に１７日間維持された。Ｆｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆ１４２０１）の５ｍＭストック溶液は、カルシウム指示薬をＤＭＳＯ中のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐ３０００）の２０％ｗ／ｖ溶液に溶解することによって調製した。０．２μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈ３５７０）の染料カクテル、および重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔ２３９７）を含むＴｙｒｏｄｅの溶液中の１：４ Ｆｌｕｏ－４ＡＭストックを各ウェルに添加した。次に細胞を３７℃のインキュベーター中で２０分間インキュベートした。次に、細胞をタイロード液で２回洗浄した。２回目の洗浄後、Ｔｙｒｏｄｅのバッファーを各ウェルに添加し、細胞をもう一度２０分間３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした後、イメージングを行った。次に、ウェルをＩＣ２００キネティック画像サイトメーター（Ｖａｌａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）で３０秒間画像化し、９００枚の画像を生成した。
【0097】
いくつかの実施形態において、カルシウムイメージングデータは、盲検化された観察者によってＩｍａｇｅＪにおいて分析および定量化された。ニューロンは、ウェルと複製の間の空間的な違いから生じる可能性のある混乱を制御するために、すべてのウェルの同じ４つの関心領域からのみ観察された。３０秒以内に少なくとも１回発火して消散した個々のニューロンが特定された。カルシウム頻度は、ブラインドの観察者によって識別され、３０秒で割られた個々のニューロンの事象の数を数えることによって計算された。静止カルシウム値は、個々のニューロンの最小カルシウムレベルから培養ディッシュからのバックグラウンド信号を差し引いたものに基づいている。ピークカルシウム一時性レベルは、個々のニューロンの最大カルシウムレベルから培養ディッシュからのバックグラウンドシグナルを差し引いたものに基づいている。カルシウムインジケーターとしてＦｌｕｏ－４－ＡＭを使用しているため、これらのレベルは相対的であり、既知の細胞内カルシウム濃度に固有のものではない。振幅は、各ニューロンの最小値から最大値までのデルタを使用して取得された。
【0098】
いくつかの実施形態では、同期スコアは、この研究で開発されたアルゴリズムを使用して導き出された。強度データセットは、誤ったピークを減らすために５００ｍｓの移動平均に変換された。ピークは、３３ｍｓｓ前後の強度の読み取り値が任意の時点で小さかった場合に同定された。５ポイントのタイムスパンは、ノイズによって生成された人工的なピークを除外した。次に、各ニューロンのピークをフィルタリングし、最大のカルシウム事象の振幅の少なくとも５０％を超えるピークのみをカウントした。培養物全体のピークは８００ｍｓの時間枠でビニングされ、ネットワーク動作、少なくとも２０の活性ニューロンを有する能力であるネットワーク挙動を有する培養物のみが同期スコアを定量化するために使用された。同期スコアは、ニューロンの培養物内でピーク数が最も多いビンをネットワーク内のニューロンの総数で割ることによって割り当てた。
【0099】
マルチ電極アレイ
いくつかの実施形態において、１２ウェルＭＥＡプレート（Ａｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍ７６８－ＧＬ１－３０Ｐｔ２００）を、ポリオルニチン（１０μｇ／ｍＬ）で一晩コーティングし、続いてラミニン（５μｇ／ｍＬ）で一晩コーティングした。５０μＬの液滴中の１２０，０００細胞の細胞溶液を、細胞株ごとに３つのウェルを使用して、電極を含む中央領域に直接配置した。プレートを３７℃で２時間インキュベートして接着させた後、１．５ｍＬの新鮮な培地を適用した。プレートを維持し、１７日後に測定した。ＭＥＡ測定は、Ａｘｉｏｎ Ａｘｉｓソフトウェアｖ．２．３．４を使用して１０分間、ニューラルリアルタイム自発構成を使用して行われ、スパイク閾値は６標準偏差に設定された。データ分析は、Ｎｅｕｒａｌ ＭｅｔｒｉｃｓＴｏｏｌソフトウェアｖ２．２およびＮｅｕｒａｌ Ａｘｉｓ Ｐｌｏｔｔｉｎｇ Ｔｏｏｌｖ１．１．１を使用して実行した。
いくつかの実施形態において、１２ウェルＭＥＡプレート（Ａｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍ７６８－ＧＬ１－３０Ｐｔ２００）を、ポリオルニチン（１０μｇ／ｍＬ）で一晩コーティングし、続いてラミニン（５μｇ／ｍＬ）で一晩コーティングした。５０μＬの液滴中の１２０，０００細胞の細胞溶液を、細胞株ごとに３つのウェルを使用して、電極を含む中央領域に直接配置した。プレートを３７℃で２時間インキュベートして接着させた後、１．５ｍＬの新鮮な培地を適用した。プレートを維持し、１７日後に測定した。ＭＥＡ測定は、Ａｘｉｏｎ Ａｘｉｓソフトウェアｖ．２．３．４を使用して１０分間、ニューラルリアルタイム自発構成を使用して行われ、スパイク閾値は６標準偏差に設定された。データ分析は、Ｎｅｕｒａｌ ＭｅｔｒｉｃｓＴｏｏｌソフトウェアｖ２．２およびＮｅｕｒａｌ Ａｘｉｓ Ｐｌｏｔｔｉｎｇ Ｔｏｏｌｖ１．１．１を使用して実行した。
【0100】
神経突起の分離
いくつかの実施形態において、一次海馬細胞は、トランスウェルインサート、３．０μｍ注入ポリカーボネート膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３４１４）上にプレーティングされた（５００，０００細胞／ウェル）。インサートの下側をラミニン（５μｇ／ｍＬ一晩）でコーティングし、注ぎ口から成長する神経突起を化学誘引して、体細胞（６４）から物理的に分離した。神経突起を単離する前に、細胞を１７日間維持した。インサートをＰＢＳで１回すすいだ。チオベースの溶解緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｍｉｃｓが提供）を使用して神経突起を溶解し、液体窒素で瞬間冷凍して－８０℃で保存した。神経突起溶解物はまた、ＲＩＰＡバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ、８９９０１）およびプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（「Ｈａｌｔ」；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ，１８６１２８０）を使用してウエスタンブロット用に調製した。
いくつかの実施形態において、一次海馬細胞は、トランスウェルインサート、３．０μｍ注入ポリカーボネート膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３４１４）上にプレーティングされた（５００，０００細胞／ウェル）。インサートの下側をラミニン（５μｇ／ｍＬ一晩）でコーティングし、注ぎ口から成長する神経突起を化学誘引して、体細胞（６４）から物理的に分離した。神経突起を単離する前に、細胞を１７日間維持した。インサートをＰＢＳで１回すすいだ。チオベースの溶解緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｍｉｃｓが提供）を使用して神経突起を溶解し、液体窒素で瞬間冷凍して－８０℃で保存した。神経突起溶解物はまた、ＲＩＰＡバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ、８９９０１）およびプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（「Ｈａｌｔ」；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ，１８６１２８０）を使用してウエスタンブロット用に調製した。
【0101】
神経突起プロテオミクス
いくつかの実施形態において、タンパク質溶解物は、２Ｄ－ＤＩＧＥプロテオミクス分析のためにドライアイス上のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｍｉｃｓに送る前に－８０℃で保存された。プロテオミクス分析のためにドライアイス上のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｍｉｃｓに送る前に、タンパク質溶解物を－８０℃で保存した。ＣｙＤｙｅで標識された２Ｄ－ＤＩＧＥサンプルゲルには、グループあたり３０μｇのタンパク質溶解物が必要であった。１．０μｌの希釈Ｃｙ２、Ｃｙ３、またはＣｙ５を野生型、ＣＲＭＰ２－ＫＩおよびＣＲＭＰ２－ＫＯ溶解物にそれぞれ添加し（１ｎｍｏｌ／μｌストックからＤＭＦで１：５希釈）、続いてボルテックス、次に暗所で４℃、３０分間。１．０μｌの１０ｍＭ リジンを各サンプルに加え、ボルテックスし、氷上でさらに１５分間暗所に置いた。Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５で標識したサンプルを混合し、２Ｘ ２－Ｄサンプルバッファー（８Ｍ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、２０ｍｇ／ｍｌ ＤＴＴ、２％ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ、微量のブロモフェノールブルー）を加え、その後、１００μｌのデストリーク溶液および２５０μｌまでの再水和バッファー（７Ｍ 尿素、２Ｍ チオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、２０ｍｇ／ｍｌ ＤＴＴ、１％ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ、微量のブロモフェノールブルー）溶液を加えた。。合わせた溶液をよく混合し、回転させてから、等電点電気泳動ストリップ（ＩＥＦ）ストリップホルダーにロードした。
いくつかの実施形態において、タンパク質溶解物は、２Ｄ－ＤＩＧＥプロテオミクス分析のためにドライアイス上のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｍｉｃｓに送る前に－８０℃で保存された。プロテオミクス分析のためにドライアイス上のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｍｉｃｓに送る前に、タンパク質溶解物を－８０℃で保存した。ＣｙＤｙｅで標識された２Ｄ－ＤＩＧＥサンプルゲルには、グループあたり３０μｇのタンパク質溶解物が必要であった。１．０μｌの希釈Ｃｙ２、Ｃｙ３、またはＣｙ５を野生型、ＣＲＭＰ２－ＫＩおよびＣＲＭＰ２－ＫＯ溶解物にそれぞれ添加し（１ｎｍｏｌ／μｌストックからＤＭＦで１：５希釈）、続いてボルテックス、次に暗所で４℃、３０分間。１．０μｌの１０ｍＭ リジンを各サンプルに加え、ボルテックスし、氷上でさらに１５分間暗所に置いた。Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５で標識したサンプルを混合し、２Ｘ ２－Ｄサンプルバッファー（８Ｍ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、２０ｍｇ／ｍｌ ＤＴＴ、２％ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ、微量のブロモフェノールブルー）を加え、その後、１００μｌのデストリーク溶液および２５０μｌまでの再水和バッファー（７Ｍ 尿素、２Ｍ チオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、２０ｍｇ／ｍｌ ＤＴＴ、１％ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ、微量のブロモフェノールブルー）溶液を加えた。。合わせた溶液をよく混合し、回転させてから、等電点電気泳動ストリップ（ＩＥＦ）ストリップホルダーにロードした。
【0102】
いくつかの実施形態では、標識されたサンプルをｐＨ３－１０のストリップホルダーにロードした後、１ｍｌの鉱油をストリップの上に加えた。提供されたプロトコル（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）に従って、ＩＥＦを暗所にて２０℃で実行した。ＩＥＦが終了したら、ＩＰＧストリップを新しく作成した平衡化バッファー１（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．８、６Ｍ尿素、３０％グリセロール、２％ＳＤＳ、微量のブロモフェノールブルーおよび１０ｍｇ／ｍｌ ＤＴＴを含む）中で、ゆっくりと振とうしながら１５分間インキュベートした。次に、ストリップを作りたての平衡化バッファー２（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．８、６Ｍ尿素、３０％グリセロール、２％ＳＤＳ、微量のブロモフェノールブルー、４５ｍｇ／ｍｌヨードアセトアミドを含む）でゆっくり攪拌しながら１０分間リンスした。次に、ＩＰＧストリップをＳＤＳ－ｇｅｌランニングバッファーで１回リンスした後、ＳＤＳ－Ｇｅｌ（低蛍光ガラスプレートを使用して調製した１２％ＳＤＳ－ｇｅｌ）に移し、０．５％（ｗ／ｖ）アガロース溶液（ＳＤＳ－ゲルランニングバッファー）でシールした。ＳＤＳ－ゲルは１５℃で泳動し、色素フロントがゲルの外に出るまで停止した。
【0103】
いくつかの実施形態において、画像スキャンは、Ｔｙｐｈｏｏｎ ＴＲＩＯ（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロトコルを使用して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの直後に実行された。次に、スキャンした画像をＩｍａｇｅ ＱｕａｎｔＴＬソフトウェア（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分析し、ＤｅＣｙｄｅｒソフトウェアバージョン６．５（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してゲル内分析とクロスゲル分析を行った。タンパク質の示差レベルの比率の変化は、ゲル内のＤｅＣｙｄｅｒソフトウェア分析から得られた。追加の３００μｇの非標識タンパク質を、標識サンプルゲル（上記）と並行してプレップゲルで泳動し、以下に説明する質量分析による同定のために十分な量のタンパク質種を提供した。
【0104】
いくつかの実施形態において、目的のスポットは、ＤｅＣｙｄｅｒソフトウェアによるゲル内分析およびスポットピッキング設計に基づいて、プレップゲルからピックアップされた。ゲルスポットを数回洗浄し、修飾ブタトリプシンプロテアーゼを用いてゲル内で消化した。消化されたトリプシンペプチドは、Ｚｉｐ－ｔｉｐ Ｃ１８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって脱塩された。ペプチドをＺｉｐ－ｔｉｐから０．５μｌのマトリックス溶液（シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸、５０％アセトニトリル中５ｍｇ／ｍｌ、０．１％トリフルオロ酢酸、２５ｍＭ 重炭酸アンモニウム）で溶出し、ＭＡＬＤＩプレートにスポットした。
【0105】
いくつかの実施形態において、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析（ＭＳ）およびＴＯＦ／ＴＯＦ（タンデムＭＳ／ＭＳ）は、５８００質量分析計（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）で実施された。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量スペクトルは、リフレクトロン陽イオンモードで取得され、スペクトルあたり平均２０００回のレーザーショットが得られた。ＴＯＦ／ＴＯＦタンデムＭＳフラグメンテーションスペクトルを各サンプルで取得し、各サンプルに存在する１０個の最も豊富なイオン（トリプシン自己消化ペプチドおよびその他の既知のバックグラウンドイオンを除く）のそれぞれについて、フラグメンテーションスペクトルごとに平均２０００レーザーショットを取得した。
【0106】
いくつかの実施形態において、得られたペプチド質量および関連する断片化スペクトルの両方を、ＭＡＳＣＯＴ検索エンジン（Ｍａｔｒｉｘ ｓｃｉｅｎｃｅ）を備えたＧＰＳエクスプローラーバージョン３．５に提出して、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ非冗長（ＮＣＢＩｎｒ）のデータベースまたはＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースを検索した。タンパク質の分子量や等電点を制限せずに、システインのカルバミドメチル化とメチオニン残基の酸化を変化させ、検索パラメータで１回の切断を逃して、検索を実施した。タンパク質スコアＣ．Ｉ．％またはイオンＣ．Ｉ．％のいずれかが９５を超える候補は有意であると見なされた。
【0107】
ウエスタンブロッティング
いくつかの実施形態において、－８０℃からの解凍後、タンパク質溶解物を氷上で超音波処理し、次いで、チューブを室温で３０分間シェーカー上に保持した。タンパク質濃度アッセイは、Ｂｉｏ－ＲａｄＢＣＡタンパク質アッセイ法を使用して実行した。２５μｌの４ｘ ＬＤＳローディング色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ，ＮＰ０００７）と１０μｌのＤＴＴ（Ａｃｒｏｓ，３２７１９）を６５μｌのサンプルに添加する。通常、４～１２％のＮｕＰａｇｅグラジエントゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ，ＮＰ０３２２ＢＯＸ）のウェルあたり６～１０ｕｇのタンパク質をロードした。ゲルを１６０Ｖで７０分間泳動し、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＮｕＰａｇｅウエスタンブロッティングシステム（ランニングバッファー：ＮＰ０００２；トランスファーバッファー：ＮＰ０００６－０１）を使用して３０Ｖで８０分間トランスファーした。ブロットは、ＴＢＳ（Ｔｉｒｚｍａ Ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ、Ｔ３２５３）とＴｒｉｚｍａ ｂａｓｅ（Ｆｉｓｈｅｒ、ＢＰ１５２－１）、５％脱脂粉乳（Ａｐｅｘ、２０－２４１））で、４℃で１時間または一晩ブロックした。次に、ブロットをＴＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ ２０（Ａｃｒｏｓ、２３３３６－２５００）および５％ＢＳＡ（Ｆｉｓｈｅｒ、ＢＰ１６００－１００）を含むＴＢＳ）で１：５００の１次抗体とともに、４℃または室温で２時間インキュベートした。
いくつかの実施形態において、－８０℃からの解凍後、タンパク質溶解物を氷上で超音波処理し、次いで、チューブを室温で３０分間シェーカー上に保持した。タンパク質濃度アッセイは、Ｂｉｏ－ＲａｄＢＣＡタンパク質アッセイ法を使用して実行した。２５μｌの４ｘ ＬＤＳローディング色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ，ＮＰ０００７）と１０μｌのＤＴＴ（Ａｃｒｏｓ，３２７１９）を６５μｌのサンプルに添加する。通常、４～１２％のＮｕＰａｇｅグラジエントゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ，ＮＰ０３２２ＢＯＸ）のウェルあたり６～１０ｕｇのタンパク質をロードした。ゲルを１６０Ｖで７０分間泳動し、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＮｕＰａｇｅウエスタンブロッティングシステム（ランニングバッファー：ＮＰ０００２；トランスファーバッファー：ＮＰ０００６－０１）を使用して３０Ｖで８０分間トランスファーした。ブロットは、ＴＢＳ（Ｔｉｒｚｍａ Ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ、Ｔ３２５３）とＴｒｉｚｍａ ｂａｓｅ（Ｆｉｓｈｅｒ、ＢＰ１５２－１）、５％脱脂粉乳（Ａｐｅｘ、２０－２４１））で、４℃で１時間または一晩ブロックした。次に、ブロットをＴＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ ２０（Ａｃｒｏｓ、２３３３６－２５００）および５％ＢＳＡ（Ｆｉｓｈｅｒ、ＢＰ１６００－１００）を含むＴＢＳ）で１：５００の１次抗体とともに、４℃または室温で２時間インキュベートした。
【0108】
機械学習分類子
いくつかの実施形態において、モデルをトレーニングするために使用されたデータセットは、以前に記載されたように（ＲＥＦ）、ｈｉＰＳＣ由来介在ニューロン培養物からのカルシウムシグナル伝達動態であった。いくつかの実施形態では、モデルは、９つのｉＰＳＣ細胞株のカルシウムイメージングから抽出された特徴でトレーニングされた。いくつかの実施形態において、特徴は、カルシウム事象頻度、基礎カルシウムレベル、およびピークカルシウム一時性を含んだ。いくつかの実施形態では、特徴変数間の独立性を想定しないので、１対すべての分類子が使用された。いくつかの実施形態では、勾配ブースティング分類子が、過剰適合を防ぎ、分類子に過度のバイアスをかけないようにするために追加された。いくつかの実施形態では、トレーニングおよび予測のために、ダウンサンプリングを使用して精度を最適化した。いくつかの実施形態では、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用してデータセット全体の分類をまとめてパフォーマンスを評価した。いくつかの実施形態では、モデルはデータセットの８０％を使用してトレーニングされ、残りの２０％は予測精度をテストするために分割された。
いくつかの実施形態において、モデルをトレーニングするために使用されたデータセットは、以前に記載されたように（ＲＥＦ）、ｈｉＰＳＣ由来介在ニューロン培養物からのカルシウムシグナル伝達動態であった。いくつかの実施形態では、モデルは、９つのｉＰＳＣ細胞株のカルシウムイメージングから抽出された特徴でトレーニングされた。いくつかの実施形態において、特徴は、カルシウム事象頻度、基礎カルシウムレベル、およびピークカルシウム一時性を含んだ。いくつかの実施形態では、特徴変数間の独立性を想定しないので、１対すべての分類子が使用された。いくつかの実施形態では、勾配ブースティング分類子が、過剰適合を防ぎ、分類子に過度のバイアスをかけないようにするために追加された。いくつかの実施形態では、トレーニングおよび予測のために、ダウンサンプリングを使用して精度を最適化した。いくつかの実施形態では、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用してデータセット全体の分類をまとめてパフォーマンスを評価した。いくつかの実施形態では、モデルはデータセットの８０％を使用してトレーニングされ、残りの２０％は予測精度をテストするために分割された。
【0109】
バイオインフォマティクス
いくつかの実施形態において、神経突起中のどの細胞経路がＣＲＭＰ２活性によって最も影響を受けるかを偏りなく特定するために分析が実施された。いくつかの実施形態では、２Ｄ－ＤＩＧＥの結果がアップロードされ、分析が実行された。いくつかの実施形態では、利用された分析参照セットは知識ベース（遺伝子のみ）であり、含まれる関係は直接的および間接的であり、内因性化学物質が含まれ、すべての分子および／または関係が考慮された。いくつかの実施形態では、標準的な経路マップが分析を介して作成された。いくつかの実施形態では、標準的な経路マップは、分析で計算された最も重要なｐ値によって決定された上位２２の経路に手動でゲート制御された。
いくつかの実施形態において、神経突起中のどの細胞経路がＣＲＭＰ２活性によって最も影響を受けるかを偏りなく特定するために分析が実施された。いくつかの実施形態では、２Ｄ－ＤＩＧＥの結果がアップロードされ、分析が実行された。いくつかの実施形態では、利用された分析参照セットは知識ベース（遺伝子のみ）であり、含まれる関係は直接的および間接的であり、内因性化学物質が含まれ、すべての分子および／または関係が考慮された。いくつかの実施形態では、標準的な経路マップが分析を介して作成された。いくつかの実施形態では、標準的な経路マップは、分析で計算された最も重要なｐ値によって決定された上位２２の経路に手動でゲート制御された。
【0110】
図１１は、例示的なプロセス１１００のフローチャートを示している。例示的なプロセス１１００は、説明された分類システムの様々な要素によって実施することができる。図示のように、例示的なプロセスは、セルラーイメージングデバイス１１０２、処理デバイス１１０４、機械学習モデル１１０６、およびユーザーインターフェース１１０８の間の通信ならびに作業の分離をより詳細に示している。フローチャートは、一般に、どのようにイメージングされるかを示す。データは、ＢＰＤの診断を決定するために処理される。提示を明確にするために、以下の説明は、一般に、図１－１０、および１２－１３Ｂ１の文脈における例示的なプロセス１１００を説明する。しかしながら、プロセス１１００は、例えば、他の任意の適切なシステム、環境、ソフトウェア、およびハードウェア、あるいは必要に応じてシステム、環境、ソフトウェア、およびハードウェアの組み合わせによって実行され得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、プロセス１１００の様々な動作は、並列に、組み合わせて、ループで、または任意の順序で実行することができる。
【0111】
１１１０において、処理装置１１０４は、細胞画像装置１１０２から画像データを受信する。いくつかの実施形態では、画像データは、患者に由来する神経培養物のカルシウム動態学的特徴を含む。いくつかの実施形態では、細胞画像装置１１０２は、ＩＣ２００キネティック画像サイトメーターである。いくつかの実施形態では、画像データは、ＩＣ２００キネティック画像サイトメーターおよびカルシウム感受性色素Ｆｌｕｏ－４ ＡＭで実行されるカルシウムイメージングによって生成される。いくつかの実施形態では、画像データは、細胞内カルシウムレベルのトレースを含む。いくつかの実施形態では、ニューロンのカルシウムデータは、インビトロの神経培養物から取得される。いくつかの実施形態において、インビトロ神経培養物は、ＢＰＤ個体および疾患を有しない健康なヒト対照から単離されたｈｉＰＳＣに由来する。いくつかの実施形態では、ニューロンのカルシウムデータは、カルシウム動態学的特徴を含む。いくつかの実施形態において、カルシウム動態学的特徴は、基礎カルシウムレベル、ピークカルシウム一時性、およびカルシウム事象頻度を含む。いくつかの実施形態において、カルシウム動態学的特徴は、カルシウム事象流入、カルシウム事象流出、またはカルシウム事象振幅のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ニューロン培養物は、患者からの血液サンプルに由来する。
【0112】
１１１２において、処理装置１１０４は、機械学習モデル１１０６を介して画像データを処理する。いくつかの実施形態では、画像データは、機械学習モデル１１０６を介して処理され、患者がＢＰＤの治療に応答するかどうかを決定する。 。いくつかの実施形態では、画像データは、機械学習モデルを介して処理されて、患者の薬物応答性を決定する。いくつかの実施形態では、機械学習モデル１１０６は、線形回帰、単純ベイズ、ランダムフォレスト、１対すべて、サポートベクター分類子モジュール、またはＫＮＮアルゴリズムのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、機械学習モデル１１０６は、機械学習モデル１１０６の過剰適合を防ぎ、機械学習モデル１１０６に過剰バイアスをかけないようにするための勾配ブースティング分類子を含む。いくつかの実施形態では、機械学習モデル１１０６のトレーニング中にダウンサンプリングが使用される。
【0113】
１１１４において、機械学習モデル１１０６は、カルシウム動態学的特徴に基づいて患者の診断を決定する。いくつかの実施形態では、機械学習モデル１１０６は、ニューロンのカルシウムデータを使用してトレーニングされる。いくつかの実施形態では、神経カルシウムデータはデータポイントを含み、機械学習モデル１１０６のトレーニングは、細胞株および疾患タイプによってデータポイントを分離することを含む。いくつかの実施形態では、神経カルシウムデータの一部は、機械学習モデル１１０６をトレーニングするために使用され、神経カルシウムデータの残りの部分は、一度トレーニングされた機械学習モデルをテストするために使用される１１０６。機械学習１１０６は、ニューロンのカルシウムデータの残りの部分からＬｉＣｌで処理されたデータポイントと処理されていないデータポイントを取得することで構成される。いくつかの実施形態では、ニューロンカルシウムデータの一部は、トレーニング用のデータの７０パーセントを含み、ニューロンカルシウムデータの残りの部分は、検証用のデータの３０パーセントを含む。いくつかの実施形態では、ニューロンカルシウムデータの一部は、トレーニング用のデータの８０パーセントを含み、ニューロンカルシウムデータの残りの部分は、検証用のデータの２０パーセントを含む。いくつかの実施形態において、ニューロン培養物は、ＣＲＭＰ２－ＫＯ、ＣＲＭＰ２－ＫＩ、およびＷＴＥ１６．５一次海馬ニューロンを含む。
【0114】
１１１６において、処理装置は、診断がユーザーインターフェース１１０８に提供される。いくつかの実施形態では、治療は、ＢＰＤのための炭酸リチウムを含む。いくつかの実施形態では、診断は、患者がリチウム応答性であるかリチウム非応答性であるかを含む。
【0115】
いくつかの実施形態において、記載される分類システムは、個体が双極性障害（ＢＰＤ）を有するかどうかを首尾よく診断することができ、個体が双極性障害（ＢＰＤ）治療に臨床的に反応するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態では、ＢＰＤ治療は、気分安定薬、抗精神病薬、抗うつ薬、抗うつ薬－抗精神病薬、抗不安薬、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、個人が双極性障害（ＢＰＤ）を有するかどうかを首尾よく診断することができ、個人が気分安定薬に臨床的に反応するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態において、気分安定剤は、リチウム（例えば、リトビッド）、バルプロ酸（例えば、デパケン）、ジバルプロエックスナトリウム（例えば、デパコート）、カルバマゼピン（例えば、テグレトール、エクエトロ、およびカルバトロール）、ラモトリジン（例えば、Ｌａｍｉｃｔａｌ）、ｔｏｐｉｒａｍａｔｅ（Ｔｏｐａｍａｘ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、個人が双極性障害（ＢＰＤ）を有するかどうかを首尾よく診断することができ、個人が抗精神病薬に臨床的に反応するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態において、抗精神病薬は、オランザピン（例えば、ジプレキサ）、リスペリドン（例えば、リスペルダル）、クエチアピン（例えば、セロクエル）、アリピプラゾール（例えば、アビリファイ）、ジプラシドン（例えば、ジオドン）、クロザピン（例えば、クロザリル）、ルラシドン（例えば、ラツダ）、アセナピン（例えば、サフリス）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、個人が双極性障害（ＢＰＤ）を有するかどうかを首尾よく診断することができ、個人が抗うつ薬に臨床的に反応するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態において、抗うつ薬は、シタロプラム（例えば、セレクサ）、エシタロプラム（例えば、レクサプロ）、フルオキセチン（例えば、プロザック、サラフェム、セルフェムラ、およびプロザックウィークリー）、フルボキサミン（例えば、ルボックス）、パロキセチン（例えば、パキシル、パキシルＣＲ、およびペクセバ）、セルトラリン（例えば、ゾロフト）、ボルチオキセチン（例えば、トリンテリックスおよびブリンテリックス）、ビラゾドン（例えば、ビイブリッド）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、個人が双極性障害（ＢＰＤ）を有するかどうかを首尾よく診断することができ、個人が抗うつ薬－抗精神病薬に臨床的に反応するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態において、抗うつ薬－抗精神病薬は、オランザピン／フルオキセチン（例えば、Ｓｙｍｂｙａｘ）、アミトリプチリン／ペルフェナジン（例えば、デュオビル、エトラフォン、トリアビル、またはトリプタフェン）、アリピプラゾール／セルトラリン（例えば、ＡＳＣ－０１）、フルオキセチン／メリトラセン（例えば、Ｄｅａｎｘｉｔ、Ｐｌａｃｉｄａ、Ｆｒａｎｘｉｔ、Ａｎｘｉｄｒｅｇ、およびＤａｎｘｉｐｒｅｓｓ）、トラニルシプロミン／トリフルオペラジン（例えば、Ｐａｒｓｔｅｌｉｎ、Ｐａｒｍｏｄａｌｉｎ、Ｊａｔｒｏｓｏｍ Ｎ、およびＳｔｅｌａｐａｒ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、記載される分類システムは、個人が双極性障害（ＢＰＤ）を有するかどうかを首尾よく診断することができ、個人が抗不安薬に臨床的に反応するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態において、抗不安薬は、ベンゾジアゼピン（例えば、アルプラゾラム、ブロチゾラム、クロルジアゼポキシド、クロバザム、クロナゼパム、クロラゼパム、デモキサゼパム、ジアゼパム、フルマゼニル、フルラゼパム、ハラゼパム、ミダゾラム、ノルダゼパム、メダゼパム）、ニトラゼパム、オキサゼパム、ロラゼパム、プラゼパム、クアゼパム、トリアゾラム、テマゼパム、ロプラゾラム、それらの薬学的に許容される塩、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される）、ベータ遮断薬（例えば、アセブトロール（セクトラル）、アテノロール（テノルミン）、ベタキソロール（ケロン）、ビソプロロール（Ｚｅｂｅｔａ、Ｚｉａｃ）、Ｃａｒｔｅｏｌｏｌ（Ｃａｒｔｒｏｌ）、Ｃａｒｖｅｄｉｌｏｌ（Ｃｏｒｅｇ）、Ｌａｂｅｔａｌｏｌ（Ｎｏｒｍｏｄｙｎｅ、Ｔｒａｎｄａｔｅ）、Ｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌ（Ｌｏｐｒｅｓｓｏｒ、Ｔｏｐｒｏｌ－ＸＬ）、Ｎａｄｏｌｏｌ（Ｃｏｒｇａｒｄ）、Ｎｅｂｉｖｏｌｏｌ（Ｂｙｓｔｏｌｉｃ）、Ｐｅｎｂｕｔｏｌｏｌ（Ｌｅｖａｔｏｌ）、Ｐｉｎｄｏｌｏｌ（Ｖｉｓｋｅｎ）、プロパノロール（インデラル）、ソタロール（ベタパス）、およびチモロール（ブロカドレン））、ブスピロン（例えば、ＢｕＳｐａｒ）、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）（例えば、パキシル（パロキセチン）、プロザック（フルオキセチン）、ゾロフト（セルトラリン）およびＬｅｘａｐｒｏ（ｅｓｃｉｔａｌｏｐｒａｍ））、セロトニン－ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）（例えば、Ｅｆｆｅｘｏｒ（ｖｅｎｌａｆａｘｉｎｅ）、Ｃｙｍｂａｌｔａ（ｄｕｌｏｘｅｔｉｎｅ）、Ｐｒｉｓｔｉｑ（ｄｅｓｖｅｎｌａｆａｘｉｎｅ））、および三環式抗うつ薬（例えば、Ｔｏｆｒａｎｉｌ（イミプラミン）、Ｅｌａｖｉｌ（アミトリプチリン）、Ｐａｍｅｌｏｒ（ノルトリプチリン）、Ａｎａｆｒａｎｉｌ））。いくつかの実施形態において、ＢＰＤ治療は、カルシウムチャネル遮断薬（例えば、ベラパミル、ニモジピン、ジルチアゼム、およびイスラジピン）をさらに含む。
【0116】
いくつかの実施形態において、記載される分類システムは、個体がアルツハイマー病（ＡＤ）を有するかどうかを首尾よく診断することができ、個体がアルツハイマー病（ＡＤ）治療に臨床的に反応するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態において、アルツハイマー病（ＡＤ）治療は、コリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ドネペジル（アリセプト）、リバスチグミン（エクセロン）、およびガランタミン（ラザダイン））、メマンチン（例えば、ナメンダ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0117】
いくつかの実施形態において、記載される分類システムは、個体がパーキンソン病（ＰＤ）を有するかどうかを首尾よく診断することができ、個体がパーキンソン病（ＰＤ）治療に臨床的に反応するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態において、ＰＤ治療は、カルビドパ－レボドパ（例えば、ロドシン）、カルビドパ－レボドパ注入（例えば、デュオパ）、ドーパミンアゴニスト（例えば、プラミペキソール（ミラペックス）、ロピニロール（レキップ）、ロチゴチン（Ｎｅｕｐｒｏ）、およびアポモルヒネ（Ａｐｏｋｙｎ））、ＭＡＯ Ｂ阻害剤（例えば、セレギリン（ＥｌｄｅｐｒｙｌおよびＺｅｌａｐａｒ）、ラサギリン（Ａｚｉｌｅｃｔ）およびサフィナミド（Ｘａｄａｇｏ））、カテコールＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤（例えば、エンタカポン（Ｃｏｍｔａｎ）およびトルカポン（タスマール））、抗コリン作動薬（例えば、ベンズトロピン（コゲンチン）およびトリヘキシフェニジル）、アマンタジン、およびそれらの組み合わせ。
【0118】
処理装置およびプロセッサ
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、またはその使用を含む。さらなる実施形態では、コンピュータは、デバイスの機能を実行する１つ以上のハードウェア中央処理装置（ＣＰＵ）または汎用グラフィックス処理装置（ＧＰＧＰＵ）を含む。さらに別の実施形態では、コンピュータは、実行可能命令を実行するように構成されたオペレーティングシステムを備える。いくつかの実施形態では、コンピュータは、任意選択でコンピュータネットワークに接続されている。さらなる実施形態では、コンピュータは、ワールドワイドウェブにアクセスするように、任意選択でインターネットに接続されている。さらに別の実施形態では、コンピュータは、オプションで、クラウドコンピューティングインフラストラクチャに接続されている。他の実施形態では、コンピュータは、任意選択でイントラネットに接続されている。他の実施形態では、コンピュータは、任意選択でデータ記憶装置に接続される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、またはその使用を含む。さらなる実施形態では、コンピュータは、デバイスの機能を実行する１つ以上のハードウェア中央処理装置（ＣＰＵ）または汎用グラフィックス処理装置（ＧＰＧＰＵ）を含む。さらに別の実施形態では、コンピュータは、実行可能命令を実行するように構成されたオペレーティングシステムを備える。いくつかの実施形態では、コンピュータは、任意選択でコンピュータネットワークに接続されている。さらなる実施形態では、コンピュータは、ワールドワイドウェブにアクセスするように、任意選択でインターネットに接続されている。さらに別の実施形態では、コンピュータは、オプションで、クラウドコンピューティングインフラストラクチャに接続されている。他の実施形態では、コンピュータは、任意選択でイントラネットに接続されている。他の実施形態では、コンピュータは、任意選択でデータ記憶装置に接続される。
【0119】
本明細書の説明によれば、適切なコンピュータには、限定されない例として、サーバーコンピュータ、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、ノートブックコンピュータ、サブノートブックコンピュータ、ネットブックコンピュータ、ネットパッドコンピュータ、ハンドヘルドコンピュータ、インターネットアプライアンス、モバイルスマートフォン、タブレットコンピュータ、および車両が含まれる。当業者は、多くのスマートフォンが本明細書に記載のシステムでの使用に適していることを認識するであろう。当業者はまた、選択されたテレビ、ビデオプレーヤー、およびオプションのコンピュータネットワーク接続を備えたデジタル音楽プレーヤーが、本明細書に記載のシステムでの使用に適していることを認識するであろう。適切なタブレットコンピュータには、当業者に知られている、小冊子、スレート、およびコンバーチブル構成を備えたものが含まれる。
【0120】
いくつかの実施形態では、コンピュータは、実行可能命令を実行するように構成されたオペレーティングシステムを含む。オペレーティングシステムは、たとえば、プログラムやデータを含むソフトウェアであり、デバイスのハードウェアを管理し、アプリケーションを実行するためのサービスを提供する。当業者は、適切なサーバーオペレーティングシステムが、限定されない例として、ＦｒｅｅＢＳＤ、ＯｐｅｎＢＳＤ、ＮｅｔＢＳＤ（登録商標）、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ＭａｃＯＳＸＳｅｒｖｅｒ（登録商標）、Ｏｒａｃｌｅ（登録商標）Ｓｏｌａｒｉｓ（登録商標）、ＷｉｎｄｏｗｓＳｅｒｖｅｒ（登録商標）、およびＮｏｖｅｌｌ（登録商標）ＮｅｔＷａｒｅ（登録商標）。当業者は、適切なパーソナルコンピュータのオペレーティングシステムが、限定されない例として、マイクロソフト（登録商標）ウィンドウズ（登録商標）、アップル（登録商標）、Ｍａｃ ＯＳ Ｘ（登録商標）、ＵＮＳ。 （登録商標）。いくつかの実施形態では、オペレーティングシステムは、クラウドコンピューティングによって提供される。当業者はまた、適切な携帯電話オペレーティングシステムが、限定されない例として、Ｎｏｋｉａ（登録商標）Ｓｙｍｂｉａｎ（登録商標）ＯＳ、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＯＳ（登録商標）、ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎＭｏｔｉｏｎ（登録商標）ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙＯＳ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ（登録商標）Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）、 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）ＷｉｎｄｏｗｓＰｈｏｎｅ（登録商標）ＯＳ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）ＷｉｎｄｏｗｓＭｏｂｉｌｅ（登録商標）ＯＳ、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、およびＰａｌｍ（登録商標）ＷｅｂＯＳ（登録商標）。
【0121】
いくつかの実施形態では、デバイスは、ストレージおよび／またはメモリデバイスを含む。ストレージおよび／またはメモリデバイスは、一時的または永続的にデータまたはプログラムを格納するために使用される１つ以上の物理的装置である。いくつかの実施形態では、デバイスは揮発性メモリであり、記憶された情報を維持するために電力を必要とする。いくつかの実施形態では、デバイスは不揮発性メモリであり、コンピュータに電力が供給されていないときに記憶された情報を保持する。さらなる実施形態では、不揮発性メモリはフラッシュメモリを含む。いくつかの実施形態では、不揮発性メモリは、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）を含む。いくつかの実施形態では、不揮発性メモリは、強誘電体ランダムアクセスメモリ（ＦＲＡＭ（登録商標））を含む。いくつかの実施形態では、不揮発性メモリは、相変化ランダムアクセスメモリ（ＰＲＡＭ）を含む。他の実施形態では、デバイスは、非限定的な例として、コンパクトディスク（ＣＤ）－読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、フラッシュメモリデバイス、磁気ディスクドライブ、磁気テープを含む記憶装置である。ドライブ、光ディスクドライブ、およびクラウドコンピューティングベースのストレージ。さらなる実施形態では、ストレージおよび／またはメモリデバイスは、本明細書に開示されるようなデバイスの組み合わせである。
【0122】
いくつかの実施形態では、コンピュータは、視覚情報をユーザーに送信するためのディスプレイを含む。いくつかの実施形態では、ディスプレイは液晶ディスプレイ（ＬＤＣ）である。さらなる実施形態において、ディスプレイは、薄膜トランジスタ液晶ディスプレイ（ＴＦＴ－ＬＤＣ）である。いくつかの実施形態では、ディスプレイは、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）ディスプレイである。様々なさらなる実施形態において、ＯＬＥＤディスプレイ上には、パッシブマトリックスＯＬＥＤ（ＰＭＯＬＥＤ）またはアクティブマトリックスＯＬＥＤ（ＡＭＯＬＥＤ）ディスプレイがある。いくつかの実施形態では、ディスプレイはプラズマディスプレイである。他の実施形態では、ディスプレイはビデオプロジェクターである。さらに他の実施形態では、ディスプレイは、仮想現実（ＶＲ）または複合現実（ＭＲ）ヘッドセットなどの、コンピュータと通信するヘッドマウントディスプレイである。さらなる実施形態では、適切なＶＲヘッドセットには、非限定的な例として、ＨＴＣ Ｖｉｖｅ、Ｏｃｕｌｕｓ Ｒｉｆｔ、Ｓａｍｉｎｇ Ｇｅｒ ＶＲ、Ｃｏｍｐａｎｙ ＨｏｌｏＬｅｎｓ、Ｒａｚｅｒ ＯＳＶＲ、ＦＯＶＥ ＶＲ、Ｚｅｉｓｓ ＶＲ Ｏｎｅ、Ａｖｅｇａｎｔ Ｇｌｙｆ、Ｆｒｉｅｗｒｙ ＶＲヘッドセットなどが含まれる。さらに別の実施形態では、ディスプレイは、本明細書に開示されるものなどのデバイスの組み合わせである。
【0123】
いくつかの実施形態では、コンピュータは、ユーザーから情報を受信するための入力デバイスを含む。いくつかの実施形態では、入力デバイスはキーボードである。いくつかの実施形態では、入力デバイスは、非限定的な例として、マウス、トラックボール、トラックパッド、ジョイスティック、ゲームコントローラ、またはスタイラスを含むポインティングデバイスである。いくつかの実施形態では、入力デバイスは、タッチスクリーンまたはマルチタッチスクリーンである。他の実施形態では、入力デバイスは、音声または他の音声入力をキャプチャするためのマイクロフォンである。他の実施形態では、入力デバイスは、動きまたは視覚入力をキャプチャするためのビデオカメラまたは他のセンサーである。さらなる実施形態では、入力デバイスは、Ｋｉｎｅｃｔ、Ｌｅａｐモーションなどである。さらに別の実施形態では、入力デバイスは、本明細書に開示されるようなデバイスの組み合わせである。
【0124】
本開示の方法またはシステムを実施するために使用することができるコンピュータシステムが本明細書で提供される。図１２は、本開示の方法またはシステムを実施するようにプログラムまたは他の方法で構成することができるコンピュータシステム１２１０の例を示している。例えば、コンピューティングデバイス１２１０は、受信された画像データに基づいて診断を提供するようにプログラムされるか、そうでなければ構成され得る。
【0125】
図示される実施形態では、コンピューティングデバイス１２１０は、ＣＰＵ（本明細書では「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」でもある）１２１２を含み、これは、任意選択で、シングルコア、マルチコアプロセッサ、または並列処理のための複数のプロセッサである。コンピューティングデバイス１２１０はまた、通信するためのメモリまたはメモリ位置１２１７（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置１２１４（例えば、ハードディスク）、通信インターフェース１２１５（例えば、ネットワークアダプタ）を含む。１つ以上の他のシステム、およびキャッシュ、他のメモリ、データストレージおよび／または電子ディスプレイアダプタなどの周辺デバイス１２１６を備えた。メモリ１２１７、ストレージユニット１２１４、インターフェース１２１５、および周辺機器１２１６は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ１２１２と通信している。ストレージユニット１２１４は、データを格納するためのデータストレージユニット（またはデータリポジトリ）を備える。コンピューティングデバイス１２１０は、通信インターフェース１２１５の助けを借りて、図１２Ａに示され、説明されるネットワーク１２１０などのコンピュータネットワークに任意選択で動作可能に結合される。いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイス１２１０は、ピアツーピアネットワーク内のノードとして構成される。
【0126】
いくつかの実施形態では、ＣＰＵ１２１２は、プログラムまたはソフトウェアで具体化することができる一連の機械可読命令を実行することができる。命令は、メモリ１２１７などのメモリ位置に格納され得る。命令は、ＣＰＵ１２１２に向けられ得、その後、ＣＰＵ１２１２は、本開示の方法を実施するようにＣＰＵ１２１２をプログラムまたは構成することができる。ＣＰＵ１２１２によって実行される動作の例には、フェッチ、デコード、実行、およびライトバックが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＣＰＵ１２１２は、集積回路などの回路の一部である。コンピューティングデバイス１２１０の１つ以上の他の構成要素は、任意選択で回路に含めることができる。いくつかの実施形態では、回路は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）またはＦＰＧＡである。
【0127】
いくつかの実施形態では、ストレージユニット１２１４は、ドライバ、ライブラリ、画像、および保存されたプログラムなどのファイルを格納する。いくつかの実施形態では、ストレージユニット１２１４は、ユーザーデータ、例えば、ユーザープリファレンスおよびユーザープログラムを格納する。いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイス１２１０は、イントラネットまたはインターネットを介して通信しているリモートサーバー上に配置されるなど、外部にある１つ以上の追加のデータストレージユニットを含む。
【0128】
いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイス１２１０は、ネットワークを介して１つ以上のリモートコンピュータシステムと通信する。例えば、コンピューティングデバイス１２１０は、リモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例には、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートまたはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）ＧａｌａｘｙＴａｂなど）、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））が含まれる。など）、またはパーソナルデジタルアシスタント。いくつかの実施形態では、ユーザーは、ネットワークを介してコンピューティングデバイス１２１０にアクセスすることができる。
【0129】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば、メモリ１２１７または電子機器などのコンピューティングデバイス１２１０の電子記憶場所に格納された機械（例えば、コンピュータプロセッサ）実行可能コードによって実施される。ストレージユニット１２１４。いくつかの実施形態では、ＣＰＵ１２１２は、コードを実行するように適合されている。いくつかの実施形態では、機械実行可能または機械可読コードは、ソフトウェアの形で提供される。いくつかの実施形態では、使用中に、コードはＣＰＵ１２１２によって実行される。いくつかの実施形態では、コードは、記憶ユニット１２１４から取り出され、ＣＰＵ１２１２による容易なアクセスのためにメモリ１２１７に記憶される。ユニット１２１４は排除され、機械実行可能命令はメモリ１２１７に記憶される。いくつかの実施形態では、コードは事前にコンパイルされる。いくつかの実施形態では、コードは実行時にコンパイルされる。コードは、コードをプリコンパイル済みまたはコンパイル済みの方法で実行できるように選択できるプログラミング言語で提供できる。
【0130】
いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイス１２１０は、電子ディスプレイ１２２０を含むか、または電子ディスプレイ１２２０と通信することができる。いくつかの実施形態では、電子ディスプレイ１２２０は、ユーザーインターフェース（ＵＩ）１２２５を提供する。
【0131】
図１３Ａは、本開示の実施を実行するために使用することができる例示的な環境１３００を示している。例示的なシステム１３００は、コンピューティングデバイス１３０２、１３０４、１３０６、イメージングデバイス１３０８、バックエンドシステム１３３０、およびネットワーク１３１０を含む。いくつかの実施形態では、ネットワーク１３１０は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、インターネット、またはそれらの組み合わせであり、ウェブサイト、デバイス（例えば、コンピューティングデバイス１３０２、１３０４、および１３０６、およびイメージングデバイス１３０８）、およびバックエンドシステム（例えば、バックエンドシステム１３３０）を接続する。いくつかの実施形態では、ネットワーク１３１０は、インターネット、インターネット、および／またはエクストラネット、あるいはインターネットと通信しているイントラネットおよび／またはエクストラネットを含む。いくつかの実施形態では、ネットワーク１３１０は、電気通信および／またはデータネットワークを含む。いくつかの実施形態では、ネットワーク１３１０は、有線および／または無線通信リンクを介してアクセスすることができる。例えば、モバイルコンピューティングデバイス（例えば、スマートフォンデバイス１３０２およびタブレットデバイス１３０６）は、セルラーネットワークを使用してネットワーク１３１０にアクセスすることができる。
【0132】
いくつかの実施形態では、例示的な環境１３００は、細胞画像検査室内にある。説明された分類システムは、例示的な環境１３００内で使用され得、例えば、機械学習／ＡＩ技術を使用して、画像化デバイス１３０８によって収集された画像データに基づいて患者の診断を決定する。
【0133】
いくつかの例では、ユーザー１２２８は、細胞画像装置１３２８と相互作用する。いくつかの実施形態では、細胞画像装置１３２８を使用して、生細胞、幹細胞、植物、組織スライス、生物全体、および複雑な３Ｄマトリックス。いくつかの実施形態では、細胞画像装置１３２８は、ＩＣ２００キネティック画像サイトメーターである。
【0134】
いくつかの例では、ユーザー１３２２、１３２４、および１３２６は、それぞれのコンピューティングデバイス１３０２、１３０４、および１３０６にインストールされ実行されているＧＵＩまたはアプリケーションを介して、説明された分類システムと対話する。１３０２、１３０４、および１３０６は、ユーザー１３２２、１３２４、および１３２６が対話できるセルラーイメージングラボ内の画面に表示データを提供する。いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイス１３０２、１３０４、１３０６は、図１２に示されるコンピューティングデバイス１２１０と持続的に類似している。コンピューティングデバイス１３０２、１３０４、１３０６はそれぞれ、デスクトップコンピュータ、ラップトップなどの任意の適切なタイプのコンピューティングデバイスを含み得る。コンピュータ、ハンドヘルドコンピュータ、タブレットコンピュータ、パーソナルデジタルアシスタント（ＰＤＡ）、携帯電話、ネットワークアプライアンス、カメラ、スマートフォン、拡張一般パケット無線サービス（ＥＧＰＲＳ）携帯電話、メディアプレーヤー、ナビゲーションデバイス、電子メールデバイス、ゲームコンソール、またはこれらのデバイスの２つ以上または他のデータ処理デバイスの適切な組み合わせ。図示の例では、コンピューティングデバイス１３０２はスマートフォンであり、コンピューティングデバイス１３０４はタブレットコンピューティングデバイスであり、コンピューティングデバイス１２０６はデスクトップコンピューティングデバイスである。簡単にするために、３つのユーザーコンピューティングデバイス１３０２、１３０４、および１３０６が図１３Ａに示されている。しかしながら、本開示の実施は、前述のものなどの適切なコンピューティングデバイスのいずれかを用いて実現することができると考えられる。さらに、本開示の実施は、必要に応じて任意の数のデバイスを使用することができる。
【0135】
図示される例示的な環境１３００では、バックエンドシステム１３３０は、少なくとも１つのサーバーデバイス１３３２および少なくとも１つのデータストア１３３４を含む。いくつかの実施形態では、デバイス１３３２は、図１２に示されるコンピューティングデバイス１２１０と持続的に類似している。いくつかの実施形態では、バックエンドシステム１３３０は、サーバークラスのハードウェアタイプのデバイスを含み得る。いくつかの実施形態では、サーバーデバイス１３３２は、サーバークラスのハードウェアタイプのデバイスである。いくつかの実施形態では、バックエンドシステム１３３０は、ネットワーク１３１０を介してアクセスされるときにシームレスリソースの単一のプールとして機能するクラスター化されたコンピュータおよびコンポーネントを使用するコンピュータシステムを含む。例えば、そのような実装は、データセンター、クラウドコンピューティング、ストレージエリアで使用され得る。ネットワーク（ＳＡＮ）、およびネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）アプリケーション。いくつかの実施形態では、バックエンドシステム１３３０は、仮想マシンを使用して展開される。いくつかの実施形態では、データストア１３３４は、データのコレクションを永続的に格納および管理するためのリポジトリである。説明されている分類システム内で使用できるデータストアの例には、データベースなどのデータリポジトリと、ファイルや電子メールなどのより単純なストアタイプが含まれる。いくつかの実施形態では、データストア１３３４はデータベースを含む。いくつかの実施形態では、データベースは、データベース管理システム（ＤＢＭＳ）によって管理される一連のバイトまたはデータの組織化されたコレクションである。
【0136】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのサーバーシステム１３３２は、ユーザー１３２２、１３２４、１３２６、および１３２８が、それぞれのコンピューティングデバイス１３０２、１３０４、および１３０６とイメージングデバイス１３２８を使用して対話することができる、記載される分類システムによって提供される、上記のような１つ以上のコンピュータ実装サービスをホストする。
【0137】
図１３Ｂは、例示的な環境１３００などの環境を介して提供され、本開示の実施を実行するために使用され得る例示的な分類システム１３４０を示す。図示のように、例示的な分類システム１３４０は、リレーショナルデータベース管理システム（ＲＤＣＭＳ）１３４８によってアクセスされる１つ以上のデータストア１３３４を含むように構成されたバックエンドシステム１３３０を含む。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＳＱＬ Ｓｅｒｖｅｒ、ＩＢＭ ＤＢ２、ＩＢＭ Ｉｎｆｏｒｍｉｘ、ＳＡＰ Ｓｙｂａｓｅ、ＳＡＰ Ｓｙｂａｓｅ、Ｔｅｒａｄａｔａなど。図示のように、例示的なアプリケーションプロビジョニングシステム１３４０は、１つ以上のアプリケーションサーバー１３４６（Ｊａｂサーバー、．ＮＥＴサーバー、ＰＨＰサーバーなど）および１つ以上のＵＩサーバー１３４２（１つ以上）を含むように構成されたバックエンドシステム１３３０を含む。たとえば、Ａｐａｃｈｅ、ＩＩＳ、ＧＷＳなどのＷｅｂサーバー）。ＵＩサーバー１３４２は、オプションで、ネットワーク１３１０を介してＡＰＩ １３４４を介して１つ以上のＷｅｂサービスを公開する。いくつかの実施形態では、例示的なアプリケーションプロビジョニングシステム１３４０は、コンピューティングデバイス１３０２、１３０４、いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイス１３０２、１３０４、１３０６、１３０８は、ユニバーサルシリアルバス（６００）ケーブルなどのケーブルを介してバックエンドシステム１３３０に接続することができる。例えば、セルラーイメージングデバイス１３２８は、キャプチャされた画像をＵＢＳケーブルを介してバックエンドシステム１３３０に提供することができ、診断は、ＵＩサーバー１３４２を介してコンピューティングデバイス１３０２、１３０４、１３０６に提供することができる。
【0138】
非一時的なコンピュータ読み取り可能な記憶媒体
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、オプションでネットワーク化されたコンピュータのオペレーティングシステムによって実行可能な命令を含むプログラムで符号化された１つ以上の非一時的なコンピュータ可読記憶媒体を含む。さらなる実施形態では、コンピュータ可読記憶媒体は、コンピュータの有形の構成要素である。さらに別の実施形態では、コンピュータ可読記憶媒体は、任意選択でコンピュータから取り外し可能である。いくつかの実施形態では、コンピュータ可読記憶媒体は、非限定的な例として、ＣＤ－ＲＯＭ、DVD、フラッシュメモリデバイス、ソリッドステートメモリ、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、クラウドコンピューティングシステムおよびサービスを含む。 、など。場合によっては、プログラムと命令は、メディア上で永続的、実質的に永続的、半永続的、または非一時的にエンコードされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、オプションでネットワーク化されたコンピュータのオペレーティングシステムによって実行可能な命令を含むプログラムで符号化された１つ以上の非一時的なコンピュータ可読記憶媒体を含む。さらなる実施形態では、コンピュータ可読記憶媒体は、コンピュータの有形の構成要素である。さらに別の実施形態では、コンピュータ可読記憶媒体は、任意選択でコンピュータから取り外し可能である。いくつかの実施形態では、コンピュータ可読記憶媒体は、非限定的な例として、ＣＤ－ＲＯＭ、DVD、フラッシュメモリデバイス、ソリッドステートメモリ、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、クラウドコンピューティングシステムおよびサービスを含む。 、など。場合によっては、プログラムと命令は、メディア上で永続的、実質的に永続的、半永続的、または非一時的にエンコードされる。
【0139】
コンピュータプログラム
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、少なくとも１つのコンピュータプログラム、またはその使用を含む。いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムは、特定のタスクを実行するように書かれた、コンピュータのＣＰＵで実行可能な一連の命令を含む。コンピュータ可読命令は、特定のタスクを実行するか、または特定の抽象データ型を実装する、関数、オブジェクト、ＡＰＩ、データ構造などのようなプログラムモジュールとして実装され得る。本明細書で提供される開示に照らして、当業者は、コンピュータプログラムが様々な言語の様々なバージョンで書かれ得ることを認識する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、少なくとも１つのコンピュータプログラム、またはその使用を含む。いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムは、特定のタスクを実行するように書かれた、コンピュータのＣＰＵで実行可能な一連の命令を含む。コンピュータ可読命令は、特定のタスクを実行するか、または特定の抽象データ型を実装する、関数、オブジェクト、ＡＰＩ、データ構造などのようなプログラムモジュールとして実装され得る。本明細書で提供される開示に照らして、当業者は、コンピュータプログラムが様々な言語の様々なバージョンで書かれ得ることを認識する。
【0140】
コンピュータ可読命令の機能は、様々な環境において、必要に応じて組み合わせるか、または分散させることができる。いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムは、命令の１つのシーケンスを含む。いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムは、複数の命令シーケンスを含む。いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムが１つの場所から提供される。他の実施形態では、コンピュータプログラムは、複数の場所から提供される。様々な実施形態では、コンピュータプログラムは、１つ以上のソフトウェアモジュールを含む。様々な実施形態において、コンピュータプログラムは、部分的または全体的に、１つ以上のウェブアプリケーション、１つ以上のモバイルアプリケーション、１つ以上のスタンドアロンアプリケーション、１つ以上のウェブブラウザプラグイン、拡張機能、アドイン、またはアドオン、またはそれらの組み合わせを含む。
【0141】
機械学習
いくつかの実施形態では、機械学習アルゴリズムを使用して、患者の診断を決定する。たとえば、ニューロンのカルシウムデータを使用してトレーニングされた機械学習モデルは、収集された画像データのカルシウム動態の特徴に基づいて診断を決定する。機械学習アルゴリズムの例には、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）、ナイーブベイズ分類、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、深層学習、または分類と回帰のための他の教師なし学習アルゴリズムまたは教師なし学習アルゴリズムが含まれる。機械学習アルゴリズムは、１つ以上のトレーニングデータセットを使用してトレーニングできる（たとえば、ニューロンのカルシウムデータを使用して）。例えば、ニューロンのカルシウムデータを使用して、さまざまなアルゴリズムをトレーニングすることができる。さらに、上記のように、これらのアルゴリズムは、記載される分類システムによって決定されたＢＰＤ診断を使用して、継続的にトレーニング／再トレーニングすることができる。いくつかの実施形態では、機械学習アルゴリズムは、変数間の関係が決定され、重み付けされる回帰モデリングを採用している。
いくつかの実施形態では、機械学習アルゴリズムを使用して、患者の診断を決定する。たとえば、ニューロンのカルシウムデータを使用してトレーニングされた機械学習モデルは、収集された画像データのカルシウム動態の特徴に基づいて診断を決定する。機械学習アルゴリズムの例には、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）、ナイーブベイズ分類、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、深層学習、または分類と回帰のための他の教師なし学習アルゴリズムまたは教師なし学習アルゴリズムが含まれる。機械学習アルゴリズムは、１つ以上のトレーニングデータセットを使用してトレーニングできる（たとえば、ニューロンのカルシウムデータを使用して）。例えば、ニューロンのカルシウムデータを使用して、さまざまなアルゴリズムをトレーニングすることができる。さらに、上記のように、これらのアルゴリズムは、記載される分類システムによって決定されたＢＰＤ診断を使用して、継続的にトレーニング／再トレーニングすることができる。いくつかの実施形態では、機械学習アルゴリズムは、変数間の関係が決定され、重み付けされる回帰モデリングを採用している。
【0142】
ウェブアプリケーション
いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムは、ウェブアプリケーションを含む。本明細書で提供される開示に照らして、当業者は、ウェブアプリケーションが、様々な実施形態において、１つ以上のソフトウェアフレームワークおよび１つ以上のデータベースシステムを利用することを認識するであろう。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、マイクロソフト（登録商標）．ＮＥＴまたはＲｕｂｙ ｏｎ Ｒａｉｌｓ（ＲｏＲ）などのソフトウェアフレームワーク上に作成される。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、非限定的な例として、リレーショナル、非リレーショナル、オブジェクト指向、連想、およびＸＭＬデータベースシステムを含む１つ以上のデータベースシステムを利用する。さらなる実施形態では、適切なリレーショナルデータベースシステムには、非限定的な例として、マイクロソフト（登録商標）ＳＱＬサーバー、ｍｙＳＱＬ（商標）、およびオラクル（登録商標）が含まれる。当業者はまた、様々な実施形態において、ウェブアプリケーションが１つ以上の言語の１つ以上のバージョンで書かれていることを認識するであろう。Ｗｅｂアプリケーションは、１つ以上のマークアップ言語、プレゼンテーション定義言語、クライアント側スクリプト言語、サーバー側コーディング言語、データベースクエリ言語、またはそれらの組み合わせで記述できる。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、ハイパーテキストマークアップ言語（ＨＴＭＬ）、拡張可能ハイパーテキストマークアップ言語（ＸＨＴＸ）、または拡張可能マークアップ言語（ＸＭＬ）などのマークアップ言語である程度書かれている。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、カスケードスタイルシート（ＣＳＳ）などのプレゼンテーション定義言語である程度書かれている。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、非同期ＪａｖａＳｃｒｉｐｔおよびＸＭＬ（ＡＪＡＸ）、Ｆｌａｓｈ（登録商標）ＡｃｔｉｏｎＳｃｒｉｐｔ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ、またはＳｉｌｖｅｒｌｉｇｈｔ（登録商標）などのクライアント側スクリプト言語である程度記述されている。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、Ａｃｔｉｖｅ Ｓｅｒｖｅｒ Ｐａｇｅｓ（ＡＳＰ）、ＣｏｌｄＦｕｓｉｏｎ（登録商標）、Ｐｅｒｌ、Ｊａｖａ（商標）、ＪａｖａＳｅｒｖｅｒ Ｐａｇｅｓ（ＪＳＰ）、Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ Ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ＰＨＰ）、Ｐｙｔｈｏｎ（商標）などのサーバー側コーディング言語である程度記述されている。 、Ｒｕｂｙ、Ｔｃｌ、Ｓｍａｌｌｔａｌｋ、ＷｅｂＤＮＡ（登録商標）、またはＧｒｏｏｖｙ。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、構造化照会言語（ＳＱＬ）などのデータベース照会言語である程度書かれている。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、ＩＢＭ（登録商標）ロータスドミノ（登録商標）などのエンタープライズサーバー製品を統合する。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、メディアプレーヤー要素を含む。様々なさらなる実施形態において、メディアプレーヤー要素は、限定されない例として、Ａｄｏｂｉ（登録商標）Ｆｌａｓｈ（登録商標）、ＨＴＭＬ ５、Ｍｅｐｌｅ（登録商標）クイックタイム（登録商標）、マイクロソフト（登録商標）、 Ｕｎｉｔｙ（登録商標）。
いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムは、ウェブアプリケーションを含む。本明細書で提供される開示に照らして、当業者は、ウェブアプリケーションが、様々な実施形態において、１つ以上のソフトウェアフレームワークおよび１つ以上のデータベースシステムを利用することを認識するであろう。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、マイクロソフト（登録商標）．ＮＥＴまたはＲｕｂｙ ｏｎ Ｒａｉｌｓ（ＲｏＲ）などのソフトウェアフレームワーク上に作成される。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、非限定的な例として、リレーショナル、非リレーショナル、オブジェクト指向、連想、およびＸＭＬデータベースシステムを含む１つ以上のデータベースシステムを利用する。さらなる実施形態では、適切なリレーショナルデータベースシステムには、非限定的な例として、マイクロソフト（登録商標）ＳＱＬサーバー、ｍｙＳＱＬ（商標）、およびオラクル（登録商標）が含まれる。当業者はまた、様々な実施形態において、ウェブアプリケーションが１つ以上の言語の１つ以上のバージョンで書かれていることを認識するであろう。Ｗｅｂアプリケーションは、１つ以上のマークアップ言語、プレゼンテーション定義言語、クライアント側スクリプト言語、サーバー側コーディング言語、データベースクエリ言語、またはそれらの組み合わせで記述できる。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、ハイパーテキストマークアップ言語（ＨＴＭＬ）、拡張可能ハイパーテキストマークアップ言語（ＸＨＴＸ）、または拡張可能マークアップ言語（ＸＭＬ）などのマークアップ言語である程度書かれている。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、カスケードスタイルシート（ＣＳＳ）などのプレゼンテーション定義言語である程度書かれている。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、非同期ＪａｖａＳｃｒｉｐｔおよびＸＭＬ（ＡＪＡＸ）、Ｆｌａｓｈ（登録商標）ＡｃｔｉｏｎＳｃｒｉｐｔ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ、またはＳｉｌｖｅｒｌｉｇｈｔ（登録商標）などのクライアント側スクリプト言語である程度記述されている。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、Ａｃｔｉｖｅ Ｓｅｒｖｅｒ Ｐａｇｅｓ（ＡＳＰ）、ＣｏｌｄＦｕｓｉｏｎ（登録商標）、Ｐｅｒｌ、Ｊａｖａ（商標）、ＪａｖａＳｅｒｖｅｒ Ｐａｇｅｓ（ＪＳＰ）、Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ Ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ＰＨＰ）、Ｐｙｔｈｏｎ（商標）などのサーバー側コーディング言語である程度記述されている。 、Ｒｕｂｙ、Ｔｃｌ、Ｓｍａｌｌｔａｌｋ、ＷｅｂＤＮＡ（登録商標）、またはＧｒｏｏｖｙ。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、構造化照会言語（ＳＱＬ）などのデータベース照会言語である程度書かれている。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、ＩＢＭ（登録商標）ロータスドミノ（登録商標）などのエンタープライズサーバー製品を統合する。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、メディアプレーヤー要素を含む。様々なさらなる実施形態において、メディアプレーヤー要素は、限定されない例として、Ａｄｏｂｉ（登録商標）Ｆｌａｓｈ（登録商標）、ＨＴＭＬ ５、Ｍｅｐｌｅ（登録商標）クイックタイム（登録商標）、マイクロソフト（登録商標）、 Ｕｎｉｔｙ（登録商標）。
【0143】
モバイルアプリ
いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムは、モバイルコンピュータに提供されるモバイルアプリケーションを含む。いくつかの実施形態では、モバイルアプリケーションは、それが製造されるときにモバイルコンピュータに提供される。他の実施形態では、モバイルアプリケーションは、本明細書に記載のコンピュータネットワークを介してモバイルコンピュータに提供される。
いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムは、モバイルコンピュータに提供されるモバイルアプリケーションを含む。いくつかの実施形態では、モバイルアプリケーションは、それが製造されるときにモバイルコンピュータに提供される。他の実施形態では、モバイルアプリケーションは、本明細書に記載のコンピュータネットワークを介してモバイルコンピュータに提供される。
【0144】
本明細書で提供される開示を考慮して、モバイルアプリケーションは、当技術分野で知られているハードウェア、言語、および開発環境を使用して、当業者に知られている技術によって作成される。当業者は、モバイルアプリケーションがいくつかの言語で書かれていることを認識するであろう。適切なプログラミング言語には、非限定的な例として、Ｃ、Ｃ ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ－Ｃ、Ｊａｖａ（商標）、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ、Ｐａｓｃａｌ、Ｏｂｊｅｃｔ Ｐａｓｃａｌ、Ｐｙｔｈｏｎ（商標）、Ｒｕｂｙ、ＶＢ．ＮＥＴ、ＷＭＬ、およびＣＳＳを伴うかもしくは伴わない、ＸＨＴＭＬ／ＨＴＭＬ、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【0145】
適切なモバイルアプリケーション開発環境は、いくつかのソースから入手可能である。市販の開発環境には、限定されない例として、ＡｉｒｐｌａｙＳＤＫ、ａｌｃｈｅＭｏ、Ａｐｐｃｅｌｅｒａｔｏｒ（登録商標）、Ｃｅｌｓｉｕｓ、Ｂｅｄｒｏｃｋ、Ｆｌａｓｈ Ｌｉｔｅ、．ＮＥＴ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ、Ｒｈｏｍｏｂｉｌｅ、およびＷｏｒｋＬｉｇｈｔ ＭｏｂｉｌｅＰｌａｔｆｏｒｍが含まれる。 Ｌａｚａｒｕｓ、ＭｏｂｉＦｌｅｘ、ＭｏＳｙｎｃ、Ｐｈｏｎｅｇａｐなど、他の開発環境も無料で利用できる。また、モバイルデバイスメーカーは、限定されない例として、ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）およびｉＰａｄ（登録商標）（ｉＯＳ）ＳＤＫ、Ａｎｄｒｏｉｄ（商標）ＳＤＫ、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（登録商標）ＳＤＫ、ＢＲＥＷ ＳＤＫ、Ｐａｌｍ（登録商標）ＯＳＳＤＫ、Ｓｙｍｂｉａｎ ＳＤＫ、ｗｅｂＯＳ ＳＤＫ、およびＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）モバイルＳＤＫ。
【0146】
当業者は、限定されない例として、アップル（登録商標）アプリストア、グーグル（登録商標）プレイ、クロムウェブストア、ブラックベリー（登録商標）アプリワールド、Ｐａｌｍデバイス用のアプリストア、ｗｅｂＯＳ用のアプリカタログ、モバイル用のＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）Ｍａｒｋｅｔｐｌａｃｅ、Ｎｏｋｉａ（登録商標）デバイス用のＯｖｉストア、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）アプリ、およびＮｉｎｔｅｎｄｏ（登録商標）ＤＳｉショップを含む、いくつかの商用フォーラムがモバイルアプリケーションの配布に利用可能であることを認識する。
【0147】
スタンドアロンアプリケーション
いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムは、独立したコンピュータプロセスとして実行されるプログラムであり、既存のプロセスへのアドオンではなく、例えば、プラグインではないスタンドアロンアプリケーションを含む。当業者は、スタンドアロンアプリケーションがしばしばコンパイルされることを認識するであろう。コンパイラは、プログラミング言語で記述されたソースコードをアセンブリ言語や機械語などのバイナリオブジェクトコードに変換するコンピュータプログラムである。適切なコンパイル済みプログラミング言語には、非限定的な例として、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ－Ｃ、ＣＯＢＯＬ、Ｄｅｌｐｈｉ、Ｅｉｆｆｅｌ、Ｊａｖａ（商標）、Ｌｉｓｐ、Ｐｙｔｈｏｎ（商標）、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、およびＶｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ（ＶＢ）．ＮＥＴ、またはそれらの組み合わせが含まれる。そのコンパイルは、実行可能プログラムを作成するために、少なくとも部分的に実行されることがよくある。いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムは、１つ以上の実行可能なコンパイルされたアプリケーションを含む。
いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムは、独立したコンピュータプロセスとして実行されるプログラムであり、既存のプロセスへのアドオンではなく、例えば、プラグインではないスタンドアロンアプリケーションを含む。当業者は、スタンドアロンアプリケーションがしばしばコンパイルされることを認識するであろう。コンパイラは、プログラミング言語で記述されたソースコードをアセンブリ言語や機械語などのバイナリオブジェクトコードに変換するコンピュータプログラムである。適切なコンパイル済みプログラミング言語には、非限定的な例として、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ－Ｃ、ＣＯＢＯＬ、Ｄｅｌｐｈｉ、Ｅｉｆｆｅｌ、Ｊａｖａ（商標）、Ｌｉｓｐ、Ｐｙｔｈｏｎ（商標）、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、およびＶｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ（ＶＢ）．ＮＥＴ、またはそれらの組み合わせが含まれる。そのコンパイルは、実行可能プログラムを作成するために、少なくとも部分的に実行されることがよくある。いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムは、１つ以上の実行可能なコンパイルされたアプリケーションを含む。
【0148】
ソフトウェアモジュール
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、ソフトウェア、サーバー、および／またはデータベースモジュール、またはそれらの使用を含む。本明細書で提供される開示を考慮して、ソフトウェアモジュールは、当業者に知られている機械、ソフトウェア、および言語を使用して、当業者に知られている技術によって作成される。本明細書に開示されるソフトウェアモジュールは、多くの方法で実装される。様々な実施形態では、ソフトウェアモジュールは、ファイル、コードのセクション、プログラミングオブジェクト、プログラミング構造、またはそれらの組み合わせを含む。さらに様々な実施形態では、ソフトウェアモジュールは、複数のファイル、コードの複数のセクション、複数のプログラミングオブジェクト、複数のプログラミング構造、またはそれらの組み合わせを含む。様々な実施形態では、１つ以上のソフトウェアモジュールは、非限定的な例として、ウェブアプリケーション、モバイルアプリケーション、およびスタンドアロンアプリケーションを含む。いくつかの実施形態では、ソフトウェアモジュールは、１つのコンピュータプログラムまたはアプリケーション内にある。他の実施形態では、ソフトウェアモジュールは、複数のコンピュータプログラムまたはアプリケーションに含まれる。いくつかの実施形態では、ソフトウェアモジュールは１台のマシンでホストされる。他の実施形態では、ソフトウェアモジュールは複数のマシンでホストされる。さらなる実施形態では、ソフトウェアモジュールは、クラウドコンピューティングプラットフォーム上でホストされる。いくつかの実施形態では、ソフトウェアモジュールは、１つの場所にある１つ以上のマシン上でホストされる。他の実施形態では、ソフトウェアモジュールは、複数の場所にある１つ以上のマシン上でホストされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、ソフトウェア、サーバー、および／またはデータベースモジュール、またはそれらの使用を含む。本明細書で提供される開示を考慮して、ソフトウェアモジュールは、当業者に知られている機械、ソフトウェア、および言語を使用して、当業者に知られている技術によって作成される。本明細書に開示されるソフトウェアモジュールは、多くの方法で実装される。様々な実施形態では、ソフトウェアモジュールは、ファイル、コードのセクション、プログラミングオブジェクト、プログラミング構造、またはそれらの組み合わせを含む。さらに様々な実施形態では、ソフトウェアモジュールは、複数のファイル、コードの複数のセクション、複数のプログラミングオブジェクト、複数のプログラミング構造、またはそれらの組み合わせを含む。様々な実施形態では、１つ以上のソフトウェアモジュールは、非限定的な例として、ウェブアプリケーション、モバイルアプリケーション、およびスタンドアロンアプリケーションを含む。いくつかの実施形態では、ソフトウェアモジュールは、１つのコンピュータプログラムまたはアプリケーション内にある。他の実施形態では、ソフトウェアモジュールは、複数のコンピュータプログラムまたはアプリケーションに含まれる。いくつかの実施形態では、ソフトウェアモジュールは１台のマシンでホストされる。他の実施形態では、ソフトウェアモジュールは複数のマシンでホストされる。さらなる実施形態では、ソフトウェアモジュールは、クラウドコンピューティングプラットフォーム上でホストされる。いくつかの実施形態では、ソフトウェアモジュールは、１つの場所にある１つ以上のマシン上でホストされる。他の実施形態では、ソフトウェアモジュールは、複数の場所にある１つ以上のマシン上でホストされる。
【0149】
データベース
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、１つ以上のデータベース、またはその使用を含む。本明細書で提供される開示を考慮して、当業者は、多くのデータベースが、気象、海事、環境、市民、政府または軍のデータを受信するのに適していることを認識する。様々な実施形態において、適切なデータベースは、非限定的な例として、リレーショナルデータベース、非リレーショナルデータベース、オブジェクト指向データベース、オブジェクトデータベース、エンティティ関係モデルデータベース、連想データベース、およびＸＭＬデータベースを含む。その他の非限定的な例には、ＳＱＬ、ＰｏｓｔｇｒｅＳＱＬ、ＭｙＳＱＬ、Ｏｒａｃｌｅ、ＤＢ２、およびＳｙｂａｓｅが含まれる。いくつかの実施形態では、データベースはインターネットベースである。さらなる実施形態では、データベースはウェブベースである。さらに別の実施形態では、データベースはクラウドコンピューティングベースである。他の実施形態では、データベースは、１つ以上のローカルコンピュータストレージデバイスに基づく。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、１つ以上のデータベース、またはその使用を含む。本明細書で提供される開示を考慮して、当業者は、多くのデータベースが、気象、海事、環境、市民、政府または軍のデータを受信するのに適していることを認識する。様々な実施形態において、適切なデータベースは、非限定的な例として、リレーショナルデータベース、非リレーショナルデータベース、オブジェクト指向データベース、オブジェクトデータベース、エンティティ関係モデルデータベース、連想データベース、およびＸＭＬデータベースを含む。その他の非限定的な例には、ＳＱＬ、ＰｏｓｔｇｒｅＳＱＬ、ＭｙＳＱＬ、Ｏｒａｃｌｅ、ＤＢ２、およびＳｙｂａｓｅが含まれる。いくつかの実施形態では、データベースはインターネットベースである。さらなる実施形態では、データベースはウェブベースである。さらに別の実施形態では、データベースはクラウドコンピューティングベースである。他の実施形態では、データベースは、１つ以上のローカルコンピュータストレージデバイスに基づく。
【0150】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、そのような実施形態が単なる例として提供されることは当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者に今や起こるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替案が、本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図7G】
【図7H】
【図7I】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
