特許 7549148 細胞内の腫瘍誘発タンパク質をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片と癌細胞透過性ペプチドの融合タンパク質及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-02

(45)【発行日】2024-09-10

(54)【発明の名称】細胞内の腫瘍誘発タンパク質をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片と癌細胞透過性ペプチドの融合タンパク質及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20240903BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20240903BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240903BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240903BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20240903BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20240903BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240903BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N15/85 Z

C07K19/00

C07K16/18

C07K7/08

C12N1/21

C12N5/10

A61P35/00

A61K47/64

A61K47/65

A61K39/395 E

A61K39/395 T

【請求項の数】 13

(21)【出願番号】P 2023533207

(86)(22)【出願日】2021-08-12

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-30

(86)【国際出願番号】 KR2021010749

(87)【国際公開番号】W WO2022035262

(87)【国際公開日】2022-02-17

【審査請求日】2023-02-08

(31)【優先権主張番号】10-2020-0101760

(32)【優先日】2020-08-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】523044378

【氏名又は名称】ナイベック カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＮＩＢＥＣ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(72)【発明者】

【氏名】チョン ジョンピョン

(72)【発明者】

【氏名】パク ユンジョン

(72)【発明者】

【氏名】イ ジュヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム ドクイル

(72)【発明者】

【氏名】チョン エギュン

【審査官】山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／１２６２４０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】韓国公開特許第１０－２０２０－００２６１２１（ＫＲ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１０／００４８６７６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０１６－１６４１５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】Ki Jung Lim，A Cancer Specific Cell-Penetrating Peptide, BR2, for the Efficient Delivery of an scFv into Cancer Cells，PLoS ONE，2013年，e66084.，pp.1-11

【文献】The Prostate，2011年，Vol.71，pp.241-253

【文献】Ziqing Duan，"Cell-penetrating peptide conjugates to enhance the antitumor effect of paclitaxel on drug-resistant lung cancer，Drug Deliv.，2017年，pp.752-64

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－９０

Ｃ１２Ｎ ５／００－２８

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｑ

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）細胞内の腫瘍誘発タンパク質又は腫瘍誘発突然変異タンパク質をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片と、（ｉｉ）癌細胞透過機能性ペプチドとが連結されている融合タンパク質であって、
前記抗体又はその単一鎖可変断片は、配列番号１乃至配列番号３で構成された群から選ばれ、
前記癌細胞透過機能性ペプチドは、配列番号８６乃至配列番号８９で構成された群から選ばれ、
前記癌細胞透過機能性ペプチドは、前記抗体又はその単一鎖可変断片のＣ－末端にリンカーを介して連結されたことを特徴とする、融合タンパク質。

【請求項2】

前記細胞内の腫瘍誘発タンパク質又は腫瘍誘発突然変異タンパク質は、ＫＲＡＳ又はアンドロゲン受容体である、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記リンカーは、ＧＧＧＧＳ又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳであることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記融合タンパク質は、配列番号１乃至配列番号３で構成された群から選ばれるいずれか一つの単一鎖可変断片のリシン又はシステイン残基に、配列番号８６乃至配列番号８９で構成された群から選ばれるいずれか一つの癌細胞透過機能性ペプチドがリンカーを介して連結されたことを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

前記リンカーは、ＣＧＧＧＧＧ又はＣＧＧＧＧＧＳＳＧＧＧＧＧであることを特徴とする、請求項４に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

前記融合タンパク質は、配列番号２０乃至配列番号２３、配列番号２８乃至配列番号３１、配列番号６８乃至配列番号６９、配列番号８０乃至配列番号８３、及び配列番号９０乃至配列番号９３のうちいずれか一つのアミノ酸配列で表示されることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸。

【請求項8】

請求項７に記載の核酸が導入されている組換えベクター。

【請求項9】

請求項８に記載の組換えベクターが導入されている組換え細胞。

【請求項10】

前記組換え細胞は、大腸菌又は哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項９に記載の組換え細胞。

【請求項11】

次の段階を含む請求項１に記載の融合タンパク質を製造する方法：
（ａ）請求項９に記載の組換え細胞を培養し、請求項１に記載の融合タンパク質を発現させる段階；及び
（ｂ）前記発現された融合タンパク質を回収する段階。

【請求項12】

請求項１～６のいずれか１項に記載の融合タンパク質を有効成分として含む腫瘍治療用薬学的組成物。

【請求項13】

前記腫瘍は、非小細胞肺癌、大腸癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌、乳癌、結腸癌、肝癌、脳腫瘍、皮膚癌、黒色腫、大腸癌、前立腺癌及び血液癌で構成された群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項１２に記載の腫瘍治療用薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞内の腫瘍誘発タンパク質をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片と癌細胞透過性ペプチドの融合タンパク質及びその用途に関し、より詳細には、細胞内の腫瘍誘発タンパク質であるＫＲＡＳの突然変異をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片に癌細胞透過性ペプチドが遺伝子発現法又は化学的結合法によって連結されている融合タンパク質及びその腫瘍治療用途に関する。

【背景技術】

【0002】

腫瘍は、腫瘍誘発経路が活性化されたり、腫瘍抑制経路が抑制されることによって、正常細胞の遺伝子が変形して発生する（１）。多様な腫瘍誘発因子のうちＲＡＳ突然変異タンパク質は、最も広く知られている腫瘍誘発因子であって、全体の癌患者の約３０％で表れる。ＲＡＳ突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）タンパク質は、ＧＴＰと結合し、活性化された状態で維持されながら腫瘍細胞の増殖と成長を誘発する。ＲＡＳは、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳの三つの分類に分けることができ、ＫＲＡＳ突然変異は、非小細胞肺癌（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ－ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）に主に表れ、ＨＲＡＳ突然変異は、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）で表れ、ＮＲＡＳ突然変異は、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）、肝細胞性癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、血液癌（ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）で主に表れる（２）。ＫＲＡＳ遺伝子突然変異は、ＲＡＳ突然変異によって誘発された癌のうち８６％を占めており、膵臓癌の９８％以上、直腸癌の５３％以上、肺腺癌の３０％以上で発生するものとして知られている（３）。

【0003】

ＫＲＡＳ突然変異は、ＥＧＦＲ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をターゲットとするイレッサ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、タルセバ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）などの抗ＥＧＦＲ治療剤の耐性メカニズムに深く関与するものとして知られている。ＥＧＦＲ抑制抗癌剤を使用したときにも、ＥＧＦＲの下位概念であるＫＲＡＳが突然変異によって継続的に活性化された状態では全く効果を見ることができない。実際に、大腸癌で抗ＥＧＦＲ単一クローン（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）治療抗体を投与するためには、ＫＲＡＳ突然変異のない患者であるか否かを判別した後で投与が可能である。

【0004】

抗癌治療の一つの手段として抗体薬物が多く研究されており、その例として、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）は、Ｈｅｒ２タンパク質に対するモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であって、乳癌治療剤として使用されており、（４）リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）は、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体であって、Ｂ細胞悪性リンパ腫（Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｌｙｍｐｈｏｍａ）治療剤として使用されている（５）。抗体は、ターゲットに対する阻害効果には優れるが、大きい分子量によって細胞膜を通過できないので、細胞の内部に抗体のターゲットがある場合には抗体による阻害効果を得ることが困難である。

【0005】

前立腺癌は、全世界で３番目によく見られる男性癌であって、米国の場合、発生率が最も高い男性癌として、肺癌に次いで２番目に高い癌特異死亡率を示す（７）。局所前立腺癌の場合は、手術又は放射線治療で完治を期待できるが、進行性、転移性前立腺癌の場合は、標準的な治療法として化学的去勢法が主に施行されている。前立腺癌が男性ホルモン依存性癌であることが証明されて以来、人為的な去勢法は、進行性或いは転移性前立腺癌の１次治療として確立され、多様な形態の前立腺癌に対する去勢治療が臨床で使用されている（８）。転移性前立腺癌において、去勢法は、疾患の進行及びこれに伴う症状の緩和などの効果を示すが、去勢法を１８ヶ月以上施行する場合、７５％の患者のみが持続的に治療に反応を示すと知られている。去勢法は、初期には比較的良い反応を示すが、時間の経過と共に、各前立腺癌細胞が男性ホルモンの遮断によって枯死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）されず、これ以上ホルモン治療に反応しない去勢抵抗性前立腺癌（ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ、ＣＲＰＣ）に転換される（９）。

【0006】

ＣＲＰＣとは、血中テストステロンが去勢レベルに減少している状態で、アンドロゲン受容体を通じて作用を示す全ての薬剤を中断した後にも、前立腺特異抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ、ＰＳＡ）の減少を示しておらず、意味のあるＰＳＡの上昇又は放射線学的進行を示す場合と定義される。ＣＲＰＣを治療なしで放置した場合は、平均生存期間が１２ヶ月未満で、各種治療による転移性前立腺癌患者の平均生存期間が３年以内であって、局所浸潤性疾患の場合は、平均生存期間が４．５年に過ぎない（１０）。

【0007】

ＣＲＰＣでのアンドロゲン受容体（ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＡＲ）は、ＡＲ過剰発現、突然変異、過敏感性、腫瘍内でのアンドロゲン合成などの多様なメカニズムによって再活性化されるものとして知られている（１１）。

【0008】

ＦＤＡで承認したＣＲＰＣ治療剤としてのアビラテロン（Ａｂｉｒａｔｅｒｏｎｅ）はアンドロゲン合成阻害剤であって、２世代アンドロゲン受容体拮抗剤であるエンザルタミド（ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅ）（ＭＤＶ３１００）は、アンドロゲン受容体がアンドロゲンと結合することを完全に阻害し、アンドロゲン受容体が核内に移動しながらターゲット遺伝子と結合することを抑制する。アビラテロン又はエンザルタミドの治療後に再発するほとんどの各前立腺癌は、ＰＳＡが陽性であり、アンドロゲン受容体が再活性化されるので、アビラテロン又はエンザルタミドに抵抗性のあるＣＲＰＣ患者には、新しいアンドロゲン受容体阻害治療法が必要である（１２）。ステロイド受容体スーパーファミリの一つであるアンドロゲン受容体は、リガンド依存的転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）であって、アンドロゲンによって影響を受ける遺伝子の発現を調節する。転写因子がターゲット遺伝子に接近するために、転写因子が核内に入り込むことが必ず必要であるので、転写因子を細胞質内にのみ維持できるなら転写機能を防止することができる。よって、アンドロゲン受容体の核内への移動を調節することが最も重要な段階である。アンドロゲンに敏感な細胞は、アンドロゲンがないと細胞質にあるが、アンドロゲンがあると核内に移動しながらターゲット遺伝子を活性化させる。しかし、ＣＲＰＣ細胞は、アンドロゲンがなくても、アンドロゲン受容体が核内に継続して留まっているので、ターゲット遺伝子を継続して活性化させるようになる（１３）。したがって、アンドロゲン受容体の核内への移動を抑制できるものであれば、ＣＲＰＣ腫瘍で効果的な治療として使用され得る。

【0009】

ＫＲＡＳやアンドロゲン受容体などの腫瘍誘発タンパク質は、ヒトの癌発生に重要な役割をするものとして知られているが、これらをターゲットとする抗体治療剤は、未だに臨床的に使用されていない。その理由は、細胞内に分布するＲＡＳ、アンドロゲン受容体に対する抗体が、大きい分子量によって細胞膜を通過できないためである。抗体より小さい単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、抗体に比べて分子量が小さく、免疫拒否反応を誘発するＦｃ部分がないので、一般的な抗体に対する代案になり得るものとして知られている。しかし、ｓｃＦｖ自体も、分子量が２５ｋＤａ以上になり、低分子薬物のように細胞膜を自由に通過しにくいので、期待した通りの大きな阻害効果を得ることは困難である。

【0010】

そこで、本発明者等は、前記従来技術の問題を解決するために鋭意努力した結果、細胞内の腫瘍誘発タンパク質に対する抗体又はその単一鎖可変断片を、癌組織透過が可能になるように癌細胞透過機能性ペプチドと融合させようとした。融合方法として遺伝子発現法又は化学的結合法を使用し、このように製作された細胞透過性の融合タンパク質が、細胞内で腫瘍誘発タンパク質が多く発現される癌細胞の増殖と成長を効果的に抑制できることを試験管内及び動物実験を通じて確認することによって本発明を完成した。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【文献】Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｃｈｅｎ ＹＨ，Ｌｕ Ｑ．Ｐｒｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ：ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ．２０１０ Ａｐｒ；６（４）：５８７－６０３．

【0012】

【文献】Ｃｏｘ ＡＤ，Ｆｅｓｉｋ ＳＷ，Ｋｉｍｍｅｌｍａｎ ＡＣ，Ｌｕｏ Ｊ，Ｄｅｒ ＣＪ．Ｄｒｕｇｇｉｎｇ ｔｈｅ ｕｎｄｒｕｇｇａｂｌｅ ＲＡＳ：ｍｉｓｓｉｏｎ ｐｏｓｓｉｂｌｅ？ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１４；１３：８２８－５１．

【0013】

【文献】ＲＡＳ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ：ｗｅａｖｉｎｇ ａ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｗｅｂ．Ｐｙｌａｙｅｖａ－Ｇｕｐｔａ Ｙ，Ｇｒａｂｏｃｋａ Ｅ，Ｂａｒ－Ｓａｇｉ Ｄ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２０１１ Ｏｃｔ １３；１１（１１）：７６１－７４．

【0014】

【文献】Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ） ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅｄｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｂａｙｏｕｄｈ Ｌ，Ａｆｒｉｔ Ｍ，Ｄａｌｄｏｕｌ Ｏ，Ｚａｒｒａｄ Ｍ，Ｂｏｕｓｓｅｎ Ｈ．Ｔｕｎｉｓ Ｍｅｄ．２０１２ Ｊａｎ；９０（１）：６－１２．

【0015】

【文献】Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｏｆｌａｚｏｇｌｕ Ｅ，Ａｕｄｏｌｙ ＬＰ．ＭＡｂｓ．２０１０ Ｊａｎ－Ｆｅｂ；２（１）：１４－９．

【0016】

【文献】Ｄｅｍａｒｅｓｔ ＳＪ，Ｇｌａｓｅｒ ＳＭ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｒｉｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．２００８；１１（５）：６７５－６８７．

【0017】

【文献】Ｊｅｍａｌ Ａ，Ｃｌｅｇｇ ＬＸ，Ｗａｒｄ Ｅ，Ｒｉｅｓ ＬＡ，Ｗｕ Ｘ，Ｊａｍｉｓｏｎ ＰＭ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｐｏｒｔ ｔｏ ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ，１９７５－２００１，ｗｉｔｈ ａ ｓｐｅｃｉａｌ ｆｅａｔｕｒｅ ｒｅｇａｒｄｉｎｇ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ２００４；１０１：３－２７．

【0018】

【文献】Ｙａｇｏｄａ Ａ，Ｐｅｔｒｙｌａｋ Ｄ．Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ １９９３；７１：１０９８．

【0019】

【文献】Ｒｉｎｉ ＢＩ，Ｓｍａｌｌ ＥＪ．Ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｕｒｒ Ｔｒｅａｔ Ｏｐｔ Ｏｎｃｏｌ ２００２；３：４３７－４６．

【0020】

【文献】Ｓｅｌｌａ Ａ，Ｙａｒｏｍ Ｎ，Ｚｉｓｍａｎ Ａ，Ｋｏｖｅｌ Ｓ．Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，ｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ ａｎｄ ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｆｔｅｒ ｉｎｉｔｉａｌ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ－ｂａｓｅｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｉｎｃａｓｔｒａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２００９；７６：４４２．

【0021】

【文献】Ｃｈｅｎ ＣＤ，Ｗｅｌｓｂｉｅ ＤＳ，Ｔｒａｎ Ｃ，Ｂａｅｋ ＳＨ，Ｃｈｅｎ Ｒ，Ｖｅｓｓｅｌｌａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００４；１０：３３－９．

【0022】

【文献】Ｂｏｕｄａｄｉ Ｋ，Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ ＥＳ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｏｎｃｏｌ ２０１６；１０：１－９．

【0023】

【文献】Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍ，Ｌｅ ＫＨ，Ｓａｔｏ Ｍ、Ｉｌａｇａｎ Ｒ，Ｉｙｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３；６３：４５５２－６０．

【0024】

【文献】Ｌａｒｓ Ｋｏｂｅｒ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ Ｚｅｈｅ，Ｊｕｅｒｇｅｎ Ｂｏｄｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１１０，Ｎｏ．４，Ａｐｒｉｌ，２０１３，Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0025】

本発明の目的は、腫瘍治療効果が著しく改善された融合タンパク質を提供することにある。

【0026】

本発明の他の目的は、前記融合タンパク質を有効成分として含む腫瘍治療用薬学的組成物を提供することにある。

【0027】

本発明の更に他の目的は、前記融合タンパク質を投与する段階を含む腫瘍の予防又は治療方法を提供することにある。

【0028】

本発明の更に他の目的は、腫瘍の予防又は治療のための前記融合タンパク質の用途を提供することにある。

【0029】

本発明の更に他の目的は、腫瘍の治療のための薬剤の製造において前記融合タンパク質の使用を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0030】

前記目的を達成するために、本発明は、（ｉ）細胞内の腫瘍誘発タンパク質又は腫瘍誘発突然変異タンパク質をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片と、（ｉｉ）癌細胞透過機能性ペプチドとが連結されている融合タンパク質を提供する。

【0031】

また、本発明は、前記融合タンパク質をコードする核酸を提供する。

【0032】

また、本発明は、前記核酸が導入されている組換えベクターを提供する。

【0033】

また、本発明は、前記組換えベクターが導入されている組換え細胞を提供する。

【0034】

また、本発明は、次の段階を含む前記融合タンパク質の製造方法を提供する：

【0035】

（ａ）前記組換え細胞を培養し、第１項の融合タンパク質を発現させる段階；及び

【0036】

（ｂ）前記発現された融合タンパク質を回収する段階。

【0037】

また、本発明は、前記融合タンパク質を有効成分として含む腫瘍治療用薬学的組成物を提供する。

【0038】

また、本発明は、前記融合タンパク質を投与する段階を含む腫瘍の予防又は治療方法を提供する。

【0039】

また、本発明は、腫瘍の予防又は治療のための前記融合タンパク質の用途を提供する。

【0040】

また、本発明は、腫瘍の治療のための薬剤の製造において前記融合タンパク質の使用を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】本発明の概要を示す模式図である。

【0042】

【図2】癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異抗体及びｓｃＦｖの発現ベクターを示す図である。

【0043】

【図3】発現及び精製された癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異抗体及びｓｃＦｖのＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット結果を示す図である。

【0044】

【図4】化学的結合法で製作した癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異抗体及びｓｃＦｖのＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット結果を示す図である。

【0045】

【図5】癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異抗体及びｓｃＦｖによる癌細胞特異的死滅効果を確認した結果を示す図である。

【0046】

【図6】ＧＧＧＧＳリンカーで連結された配列番号２０－２３による活性型（Ａｃｔｉｖｅ）ＫＲＡＳ（突然変異（ｍｕｔａｎｔ）ＫＲＡＳ）のウェスタンブロット結果を示す図である。

【0047】

【図7】ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカーで連結された配列番号９０－９３による活性型ＫＲＡＳ（突然変異ＫＲＡＳ）のウェスタンブロット結果を示す図である。

【0048】

【図8】配列番号２０－２３の癌細胞透過能を確認した結果を示す図である。

【0049】

【図9】腫瘍異種移植片（Ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）動物モデルにおける癌組織で分布を評価した結果を示す図である。

【0050】

【図10】腫瘍異種移植片動物モデルにおける癌組織での蛍光強度を示す図である。

【0051】

【図11】配列番号２及び配列番号２３の腫瘍抑制効果を示す図である。

【0052】

【図12】Ｈ３５８によって形成された腫瘍のボリューム変化と犠牲時の癌組織写真を示す図である。

【0053】

【図13】化学的結合によって製造された配列番号８０－８３による活性型ＫＲＡＳ（突然変異ＫＲＡＳ）のウェスタンブロット結果を示す図である。

【0054】

【図14】化学的結合によって製造された配列番号８０－８３による癌細胞特異的死滅効果を確認した結果を示す図である。

【0055】

【図15】化学的結合法によって製造された配列番号８０－８３の癌細胞透過能を確認した結果を示す図である。

【0056】

【図16】腫瘍異種移植片動物モデルにおける癌組織で分布を評価した結果を示す図である。

【0057】

【図17】腫瘍異種移植片動物モデルにおける癌組織での蛍光強度を示す図である。

【0058】

【図18】配列番号３及び配列番号８３の腫瘍抑制効果を示す図である。

【0059】

【図19】Ｈ３５８によって形成された腫瘍のボリューム変化と犠牲時の癌組織写真を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0060】

他の方式で定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で熟練した専門家によって通常的に理解されるのと同一の意味を有する。一般に、本明細書で使用された命名法及び以下で記述する実験方法は、本技術分野でよく知られており、通常的に使用されるものである。

【0061】

本発明では、腫瘍治療効果のある細胞内の腫瘍誘発タンパク質又はこれらの突然変異をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片が癌細胞に到逹したときにも、これらが腫瘍細胞に十分に作用できないという点に着眼し、癌細胞透過機能性ペプチドと連結されている融合タンパク質を製作した。融合タンパク質を製作するために、細胞内の腫瘍誘発タンパク質又は腫瘍誘発突然変異タンパク質をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片のＮ－末端又はＣ－末端にリンカーを導入し、これに癌細胞透過機能性ペプチドを連結したが、このような融合タンパク質は、遺伝子発現法又は化学的結合法の二つの相違する方法で製作した。このように製作した融合タンパク質を用いて癌細胞死滅実験で癌細胞透過機能性ペプチドが導入された融合タンパク質は、細胞内の腫瘍誘発タンパク質又は腫瘍誘発突然変異タンパク質をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片を単独で処理した場合に比べて、癌細胞特異的に著しく優れた効果を発揮することを確認した。

【0062】

したがって、本発明は、一観点において、（ｉ）細胞内の腫瘍誘発タンパク質又は腫瘍誘発突然変異タンパク質をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片と、（ｉｉ）癌細胞透過機能性ペプチドとが連結されている融合タンパク質に関する。

【0063】

本発明において、前記細胞内の腫瘍誘発タンパク質又は腫瘍誘発突然変異タンパク質は、ＫＲＡＳ又はアンドロゲン受容体であることを特徴とすることができるが、これに限定されない。

【0064】

本発明において、前記抗体又はその単一鎖可変断片は、配列番号１乃至配列番号３で構成された群から選ばれることを特徴とすることができるが、これに限定されない。

【0065】

一様態として、前記単一鎖断片は、ＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖであって、下記の配列番号１で表示され得る。

【0066】

配列番号１：
ＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＥＷＩＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＨＰＧＮＧＧＴＮＹＮＥＮＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＤＤＳＡＶＹＦＣＡＳＧＮＤＧＳＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳGＧＧＧＳＧＫＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＥＬＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＤＱＫＩＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＶＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＹＮＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＧＳＥＮＬＹＦＱＧＧＳＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＧＧＳＧＧＳＨＨＨＨＨＨ

【0067】

ここで、ＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡはシグナルペプチドで、その次のアミノ酸配列は Ｖ_Ｈ（Ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）領域で、ＧＧＧＧＳＧＫＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳはリンカーで、その次のアミノ酸配列はＶ_Ｌ（Ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）領域である。シグナルペプチドは、ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳのように公知となった配列に取り替えて使用することができる。

【0068】

他の様態として、前記単一鎖断片は、ＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖであって、下記の配列番号２で表示され得る。

【0069】

配列番号２：
ＭＡＱＶＫＬＱＥＳＧＰＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥＷＩＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＨＰＧＮＧＧＴＮＹＮＥＮＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＤＤＳＡＶＹＦＣＡＳＧＮＤＧＳＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＥＬＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＤＱＫＩＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＶＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＹＮＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＬＥＨＨＨＨＨＨ

【0070】

ここで、ＭＡＱＶＫＬＱＥＳＧＰＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＬＩはシグナルペプチドで、その次のアミノ酸配列はＶ_Ｈ（Ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）領域で、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳはリンカーで、その次のアミノ酸配列はＶ_Ｌ（Ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）領域である。

【0071】

他の様態として、前記単一鎖断片は、ＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖであって、配列番号３で表示され得る。

【0072】

配列番号３：
ＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＥＷＩＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＨＰＧＮＧＧＴＮＹＮＥＮＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＤＤＳＡＶＹＦＣＡＳＧＮＤＧＳＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＫＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＥＬＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＤＱＫＩＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＶＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＹＮＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＣＬＥＩＫＲＧＳＥＮＬＹＦＱＧＧＳＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＧＧＳＧＧＳＨＨＨＨＨＨ

【0073】

配列番号３は配列番号１と同一であり、Ｖ_Ｌの後にシステイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）を導入した。

【0074】

本発明において、前記癌細胞透過機能性ペプチドは、ＣＣＰＰ１（Ｈ４Ｋ）、ＣＣＰＰ２（Ｈ４Ｐ）、ＣＣＰＰ３（ＬＭＷＰ）及びＣＣＰＰ４（ｈＢＤ３－３）で構成された群から選ばれることを特徴とすることができるが、これに限定されない。前記癌細胞透過機能性ペプチドは、配列番号８６乃至配列番号８９で構成された群から選ばれることを特徴とすることができるが、これに限定されない。

【0075】

本発明において、前記癌細胞透過機能性ペプチドは、前記抗体又はその単一鎖可変断片のＮ－末端又はＣ－末端にリンカーを介して連結されたことを特徴とすることができる。

【0076】

本発明において、前記リンカーは、前記癌細胞透過機能性ペプチドと、前記抗体又はその単一鎖可変断片とが連結されるとき、それぞれが機能的構造を形成できるように空間を付与するためのものであって、アミノ酸ＧとＳの適切な組み合わせによるペプチドリンカーが好ましく、Ｇは３個から２０個まで含み、Ｓは１個から５個まで含むことがさらに好ましいが、これに限定されなく、前記リンカーは、ＧＧＧＧＳ又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳであることが最も好ましい。

【0077】

本発明において、前記リンカーと癌細胞透過機能性ペプチドとが連結されている場合、これは、配列番号４から配列番号１１のアミノ酸配列で表示されることを特徴とすることができるが、これに限定されない。この場合、配列番号４乃至７のうちいずれか一つのアミノ酸配列で表示される融合ペプチドは、単一鎖可変断片のＣ末端に連結されることが好ましく、配列番号８乃至１１のうちいずれか一つのアミノ酸配列で表示される融合ペプチドは、単一鎖可変断片のＮ末端に連結されることが好ましい。他の様態として、前記配列番号４乃至１１のうちいずれか一つのアミノ酸配列で表示される融合ペプチドは、抗体の単一鎖断片の重鎖と軽鎖とを連結するリンカーにさらに結合され得る。一方、配列番号４乃至１１のうちいずれか一つのアミノ酸配列で表示される融合ペプチドが抗体に連結される場合、これは、Ｆｃ領域に存在する糖構造に連結されることが好ましい。

【0078】

本発明において、前記抗体又はその単一鎖可変断片と癌細胞透過機能性ペプチドは、化学的結合法で連結されることを特徴とすることができる。この場合、前記融合タンパク質は、配列番号６８乃至配列番号８３のうちいずれか一つのアミノ酸配列で表示されることを特徴とすることができるが、これに限定されない。

【0079】

本発明において、前記融合タンパク質は、配列番号１乃至配列番号３で構成された群から選ばれるいずれか一つの単一鎖可変断片のリシン又はシステイン残基に配列番号８６乃至配列番号８９で構成された群から選ばれるいずれか一つの癌細胞透過機能性ペプチドがリンカーを介して連結されたことを特徴とすることができる。

【0080】

本発明において、前記リンカーは、ＣＧＧＧＧＧ又はＣＧＧＧＧＧＳＳＧＧＧＧＧであることを特徴とすることができる。

【0081】

本発明において、前記抗体又はその単一鎖可変断片と癌細胞透過機能性ペプチドは、遺伝子発現法で連結されて発現されることを特徴とすることができる。この場合、前記融合タンパク質は大腸菌で発現可能であり、配列番号１２乃至配列番号２７のうちいずれか一つのアミノ酸配列で表示されることを特徴とすることができるが、これに限定されない。また、前記融合タンパク質は、哺乳動物細胞で発現可能であり、配列番号２８乃至配列番号５９及び配列番号９０乃至配列番号９３のうちいずれか一つのアミノ酸配列で表示されることを特徴とすることができるが、これに限定されない。

【0082】

例えば、前記ＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする単一鎖可変断片（配列番号１乃至配列番号３のうちいずれか一つ）のＮ末端に癌細胞透過能を有するペプチドとリンカーとを連結したり、Ｃ末端に癌細胞透過能を有するペプチドとリンカーとを連結して使用することができる。これによる多様な様態は、実施例の表２乃至表５に具体的に記載されている。

【0083】

本発明において、前記融合タンパク質は、配列番号１２乃至配列番号５９、配列番号６８乃至配列番号８３、及び配列番号９０乃至配列番号９３のうちいずれか一つのアミノ酸配列で表示されることを特徴とすることができる。

【0084】

本発明において、前記融合タンパク質は、遺伝子発現法又は化学的結合法で製造できるが、その製造方法がこれに限定されることはない。

【0085】

遺伝子発現法で融合タンパク質を製造する場合、（ｉ）細胞内の腫瘍誘発タンパク質又は腫瘍誘発突然変異タンパク質をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片と、（ｉｉ）癌細胞透過機能性ペプチドとが共に発現されるベクターを用いることができる。この場合、前記抗体又はその単一鎖可変断片と前記癌細胞透過機能性ペプチドとの間にリンカー配列をさらに含んで発現させることができる。ｐＥＴベクター、ｐｃＤＮＡ３．４、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１－ＴＯＰＯ、ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯ、ｐＳｅｃＴａｇベクターなどを用いることができるが、これに限定されない。本発明では、大腸菌での発現のためにｐＥＴベクターを使用し、哺乳動物細胞での発現のためにｐｃＤＮＡ３．１－ＴＯＰＯ、ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯベクターを使用した。

【0086】

したがって、本発明は、更に他の観点において、前記融合タンパク質をコードする核酸に関する。

【0087】

また、本発明は、前記核酸が導入されている組換えベクターに関する。

【0088】

また、本発明は、前記組換えベクターが導入されている組換え細胞に関する。

【0089】

本発明において、前記組換え細胞は、大腸菌又は哺乳動物細胞であることを特徴とすることができるが、これに限定されない。

【0090】

本発明で使用可能な好ましい哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｉａｎ ｃｅｌｌ）、ヒト胎児腎細胞株（ＨＥＫ２９３：ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）などを含むことができるが、これに限定されない。

【0091】

また、本発明は、前記融合タンパク質を製造する方法に関するものであって、前記方法は、（ａ）前記組換え細胞を培養し、第１項の融合タンパク質を発現させる段階；及び（ｂ）前記発現された融合タンパク質を回収する段階；を含む。

【0092】

一方、本発明では、細胞内の腫瘍誘発タンパク質又は腫瘍誘発突然変異タンパク質をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片を遺伝子で発現させて精製した後、これに化学的結合法で癌細胞透過機能性ペプチドを導入することもできる。

【0093】

癌細胞透過機能性ペプチドは、リンカーとクロスリンカー（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）によって前記抗体又は単一鎖可変断片に連結され得る。リンカーは、機能的構造を形成できるように空間を付与できるものであればいずれも使用可能である。例えば、前記リンカーは、天然及び／又は合成起源のペプチド性リンカーであり得る。天然及び／又は合成起源のペプチド性リンカーは、１個乃至５０個のアミノ酸からなるアミノ酸鎖で構成可能であり、ヒンジ機能を有するポリペプチドのように、天然発生ポリペプチドの反復的なアミノ酸配列を含むことができる。更に他の様態として、前記ペプチド性リンカーアミノ酸配列は、グリシン、グルタミン、及び／又はセリン残基が豊富になるように指定された合成リンカーアミノ酸配列であり得る。これらの残基は、例えば、５個以下のアミノ酸の小さい反復単位で配列されてもよく、前記小さい反復単位は、マルチマー単位を形成するように繰り返されて配列されてもよい。マルチマー単位のアミノ－及び／又はカルボキシ－末端で、６個以下の追加的な任意の天然発生アミノ酸が添加され得る。その他の合成ペプチド性リンカーは、１０回乃至２０回繰り返される単一アミノ酸構成であってもよく、アミノ－及び／又はカルボキシ－末端に６個以下の追加的な任意の天然発生アミノ酸が添加された構成であってもよい。一方、前記リンカーは、アミノ酸が化学的に変形した形態であってもよく、例えば、ブロッキンググループ（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）としてＦｍｏｃ－（９－フルオレニルメトキシカルボニル）が結合されたＦｍｏｃ－６－アミノヘキサン酸の形態で使用され得るが、これに限定されない。

【0094】

本発明に係る一部の様態として、癌細胞透過機能性ペプチドとリンカーとが結合された融合ペプチドは、配列番号６０乃至配列番号６７のうちいずれか一つのアミノ酸配列で表示され得る。この場合、癌細胞透過機能性ペプチドのＮ末端に位置したシステインのスルフヒドリル基は、配列番号１のリンカー部分にあるリシンのアミン基又は立体構造で露出した部分にあるリシンのアミン基に連結され得る。

【0095】

この場合、使用可能なクロスリンカーは、１，４－ビス－マレイミドブタン（１，４－ｂｉｓ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔａｎｅ、ＢＭＢ）、１，１１－ビス－マレイミドテトラエチレングリコール（１，１１－ｂｉｓ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ、ＢＭ［ＰＥＯ］４）、１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（１－ｅｔｈｙｌ－３－［３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＥＤＣ）、スクシンイミジル－４－［Ｎ－マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシ－［６－アミドカプロエート］］（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－４－［Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙ－［６－ａｍｉｄｏｃａｐｒｏａｔｅ］］、ＳＭＣＣ）及びそのスルホン化塩（ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル６－［３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］ヘキサノエート］（ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ ６－［３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）－ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ、ＳＰＤＰ）及びそのスルホン化塩（ｓｕｌｆｏ－ＳＰＤＰ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ－Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ、ＭＢＳ）及びそのスルホン化塩（ｓｕｌｆｏ－ＭＢＳ）、スクシンイミジル［４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート］（ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ［４－（ｐ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔｙｒａｔｅ］、ＳＭＰＢ）及びそのスルホン化塩（ｓｕｌｆｏ－ＳＭＰＢ）などがあるが、これに限定されない。

【0096】

一方、配列番号３のＣ末端のシステインのスルフヒドリル基を還元させた後、配列番号６０乃至配列番号６７のうちいずれか一つのアミノ酸配列で表示される融合ペプチドのＮ末端に位置したシステインのスルフヒドリルと連結できるクロスリンカーは、トリス２－カルボキシエチルホスフィン（ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ、ＴＣＥＰ）、５，５０ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）（５，５０－ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ－（２－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ、ＤＴＮＢ）などがあるが、これに限定されない。

【0097】

本発明において、前記化学的結合法を用いて融合タンパク質を製造する方法は、下記の段階を含む：

【0098】

（ａ）細胞内の腫瘍誘発タンパク質又は腫瘍誘発突然変異タンパク質をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片のリンカー部位又は露出した部分に存在するリシンのアミン基をクロスリンカーで活性化する段階；

【0099】

（ｂ）癌細胞透過機能性ペプチドを、クロスリンカーで活性化された前記抗体又は単一鎖可変断片に連結する段階；及び

【0100】

（ｃ）前記抗体又は単一鎖可変断片と癌細胞透過機能性ペプチドとが連結されている融合タンパク質を精製する段階。

【0101】

代案的に、前記方法において、（ａ）段階は、細胞内の腫瘍誘発タンパク質又は腫瘍誘発突然変異タンパク質をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片のシステイン残基のスルフヒドリル基を還元させる段階であり得る。

【0102】

前記化学的結合法によって生成される融合タンパク質は、配列番号６８乃至配列番号８３のうちいずれか一つのアミノ酸配列で表示され得るが、これに限定されない。

【0103】

本発明に係る様態として、前記融合タンパク質は、細胞内の腫瘍誘発タンパク質又は腫瘍誘発突然変異タンパク質をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片のリシン又はシステイン残基と癌細胞透過機能性ペプチドとがクロスリンカーによって連結されることを特徴とすることができる。

【0104】

好ましくは、前記融合タンパク質は、配列番号１乃至配列番号３で構成された群から選ばれるいずれか一つの単一鎖可変断片のリシン又はシステイン残基と、配列番号６０乃至配列番号６７で構成された群から選ばれるいずれか一つの融合ペプチドとがクロスリンカーによって化学的に結合することを特徴とすることができる。

【0105】

ここで、前記残基がリシンである場合、前記クロスリンカーは、１，４－ビス－マレイミドブタン（１，４－ｂｉｓ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔａｎｅ、ＢＭＢ）、１，１１－ビス－マレイミドテトラエチレングリコール（１，１１－ｂｉｓ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ、ＢＭ［ＰＥＯ］４）、１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（１－ｅｔｈｙｌ－３－［３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＥＤＣ）、スクシンイミジル－４－［Ｎ－マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシ－［６－アミドカプロエート］］（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－４－［Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙ－［６－ａｍｉｄｏｃａｐｒｏａｔｅ］］、ＳＭＣＣ）及びそのスルホン化塩（ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル６－［３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］ヘキサノエート］（ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ ６－［３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）－ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ、ＳＰＤＰ）及びそのスルホン化塩（ｓｕｌｆｏ－ＳＰＤＰ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ－Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ、ＭＢＳ）及びそのスルホン化塩（ｓｕｌｆｏ－ＭＢＳ）、スクシンイミジル［４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート］（ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ［４－（ｐ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔｙｒａｔｅ］、ＳＭＰＢ）及びそのスルホン化塩（ｓｕｌｆｏ－ＳＭＰＢ）で構成された群から選ばれることを特徴とすることができる。

【0106】

一方、前記残基がシステインである場合、前記クロスリンカーは、トリス２－カルボキシエチルホスフィン（ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ、ＴＣＥＰ）、５，５０ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）（５，５０－ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ－（２－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ、ＤＴＮＢ）であることを特徴とすることができる。

【0107】

本発明に係るＫＲＡＳ突然変異タンパク質は、癌細胞の成長を加速化し、腫瘍発生の重要な因子として知られているが、細胞膜の内側に存在するので、ＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体又は単一鎖可変断片による阻害効果が大きくない。しかし、癌細胞透過能ペプチドを導入した後、ＫＲＡＳ突然変異に対する抗体又は単一鎖可変断片による腫瘍増殖抑制効果を確認したとき、試験管内の実験及び動物実験結果のいずれにおいても、該当の癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体又は単一鎖可変断片は、腫瘍細胞の増殖を著しく抑制する効果を有することを確認した。

【0108】

したがって、本発明は、他の観点において、前記融合タンパク質を有効成分として含む腫瘍治療用薬学的組成物に関する。

【0109】

本発明において、前記腫瘍は、非小細胞肺癌、大腸癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌、乳癌、結腸癌、肝癌、脳腫瘍、皮膚癌、黒色腫、大腸癌、前立腺癌及び血液癌で構成された群から選ばれる１種以上であることを特徴とすることができるが、これに限定されない。

【0110】

本発明において、前記薬学的組成物は、注射剤、経口投与用製剤、水溶液、懸濁液、乳濁液などの液剤（例えば、注射用）、カプセル、顆粒、錠剤及び粘膜投与製剤で構成された群から選ばれるいずれか一つの剤形に製剤化されることを特徴とすることができるが、これに限定されない。これらの製剤は、当分野で製剤化に使用される通常の方法又はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（最新版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡに開示されている方法で製造可能であり、各疾患又は成分によって多様な製剤に製剤化され得る。

【0111】

一方、本発明の薬学的組成物は、前記癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体又は単一鎖可変断片以外に、薬剤学的に許容可能な担体を１種以上さらに含むことができる。薬剤学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分のうち１成分以上を混合して使用することができる。

【0112】

本発明の薬学的組成物は、必要によって薬剤学的に許容可能な補助剤をさらに含有することを特徴とすることができる。前記補助剤は、賦形剤、希釈剤、分散剤、緩衝剤、抗菌性保存剤、静菌剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤、酸化防止剤、増粘剤及び粘度改質剤で構成された群から選ばれる一つ以上であり得るが、これに限定されない。

【0113】

本発明に係る薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与又は非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内又は局所に適用）することができ、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによって、その範囲が専門家の所見によって多様に変更されて使用され得る。

【0114】

本発明の一実施様態として、前記ペプチドの１回投与量は、１μｇ／ｋｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５μｇ／ｋｇ乃至５０ｍｇ／ｋｇで、１日１回又は週に１回～３回投与することを特徴とすることができるが、投与量と投与間隔はこれに限定されない。

【0115】

本発明は、更に他の観点において、前記融合タンパク質を投与する段階を含む腫瘍の予防又は治療方法に関する。

【0116】

本発明は、更に他の観点において、腫瘍の予防又は治療のための前記融合タンパク質の用途に関する。

【0117】

本発明は、更に他の観点において、腫瘍の治療のための薬剤の製造において前記融合タンパク質の使用に関する。

【実施例】

【0118】

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎなく、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。

【0119】

実施例１：癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異をターゲットとするｓｃＦｖのタンパク質発現法による製作

【0120】

実施例１－１：大腸菌で癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異をターゲットとするｓｃＦｖの発現

【0121】

ＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖ、癌細胞透過能ペプチドが導入されたＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖ発現ベクターをそれぞれ特異的なプライマーを用いてＰＣＲ方法で製作した。本発明で使用されたＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖは、配列番号１乃至配列番号３のうちいずれか一つである。

【0122】

ＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖ（配列番号１）：
ＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＥＷＩＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＨＰＧＮＧＧＴＮＹＮＥＮＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＤＤＳＡＶＹＦＣＡＳＧＮＤＧＳＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＫＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＥＬＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＤＱＫＩＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＶＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＹＮＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＧＳＥＮＬＹＦＱＧＧＳＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＧＧＳＧＧＳＨＨＨＨＨＨ

【0123】

ＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖ（配列番号２）：
ＭＡＱＶＫＬＱＥＳＧＰＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥＷＩＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＨＰＧＮＧＧＴＮＹＮＥＮＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＤＤＳＡＶＹＦＣＡＳＧＮＤＧＳＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＥＬＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＤＱＫＩＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＶＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＹＮＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＬＥＨＨＨＨＨＨ

【0124】

ＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖ（配列番号３）：
ＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＥＷＩＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＨＰＧＮＧＧＴＮＹＮＥＮＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＤＤＳＡＶＹＦＣＡＳＧＮＤＧＳＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＫＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＥＬＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＤＱＫＩＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＶＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＹＮＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＣＬＥＩＫＲＧＳＥＮＬＹＦＱＧＧＳＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＧＧＳＧＧＳＨＨＨＨＨＨ

【0125】

ｐＥＴ ２１ａ（＋）ＤＮＡは、Ｎｄｅ ＩとＸｈｏ Ｉで切断し、ｐＭＸ ＤＮＡもＮｄｅ ＩとＸｈｏ Ｉで切断し、７６７ ｂｐのＫｒａｓ ｓｃＦｖ遺伝子断片をアガロース電気溶出（ａｇａｒｏｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏ ｅｌｕｔｉｏｎ）方法で回収した。これをｐＥＴ ２１ａ（＋）ベクターに挿入するために、ＰＣＲを通じて遺伝子を増幅させた。ＰＣＲプライマーとしては、正方向プライマー（５'－ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＣＡＴＧＧＧＴＴＴＧＧＡＣ－３'）及び逆方向プライマー（５'－ＡＧＣＣＣＧＡＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＡＡＧＴＧＴＴＴＴＴＡＧＡＧＴＴＧ－３'）を用いた。それぞれの切断されたベクターとインサートを０．５μｇと１．０μｇの比率で混合し、トリス－ＨＣｌ ５００ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １００ｍＭ、ＤＴＴ ２００ｍＭ、ＡＴＰ １０ｍＭ組成のライゲーション緩衝溶液でＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用し、４℃で１６時間～１８時間にわたって反応させた。

【0126】

組み換えられＤＮＡ溶液を大腸菌ＤＨ５ａに形質転換させ、ＬＢ＋Ａｍｐ固体培地に塗抹し、形質転換体を選別した。

【0127】

それぞれのプラスミドで形質転換された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ^ＴＭ２（ＤＥ３）Ｓｉｎｇｌｅｓ^ＴＭ（Ｎｏｖａｇｅｎ）菌株の単一コロニーを１０μｇ／ｍｌの濃度のアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抗生剤が含まれている２０ｍｌのＬＢに接種し、３７℃で一晩培養した。培養液の１ｍｌを、同じ濃度の抗生剤が入っている新しい２００ｍｌのＬＢに希釈させた。ＫＲＡＳ ｓｃＦｖの発現は、ＯＤ６００での細胞の密度０．８値でＩＰＴＧの最終濃度が１ｍＭになるように入れ、一晩培養させることによって誘導された。各細胞は、遠心分離法を通じて収穫し、１０ｍｌの溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に混ぜて解いた。細胞の超音波粉砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）後、４℃の条件で１０分間の遠心分離を通じてタンパク質をｔｏｔａｌ（全体）、ｓｏｌｕｂｌｅ（水溶性）、ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ（不水溶性）部分に分け、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて分析した（Ｓ.Ｉ．Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｆｏｌｄｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｂｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＲＮＡ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ３（２００８）ｅ２６７７）。

【0128】

分離されたＫＲＡＳ ｓｃＦｖは、ニッケルクロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ^ＴＭ ｅｘｃｅｌ Ｋｉｔ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって分離及び精製された。次に、［５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ］条件のバッファーでニッケルカラムを予め濡らして均等にした後、同じバッファー条件のタンパク質水溶液を適用させた。２０ｍＭのイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）が含まれている上記のバッファーを用いて洗浄を行った後、イミダゾールを５０ｍＭから５００ｍＭまで漸進的に増加させたバッファーを用いてタンパク質を分離した。分離されたタンパク質を集め、脱塩カラム（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ）（ＰＤ－１０ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて透析した。

【0129】

本発明で使用したリンカーと癌細胞透過機能性ペプチド配列は、次の表１に示す通りである。

【0130】

【表1】

【0131】

大腸菌で発現される癌細胞透過機能性ペプチドとＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖとが連結された融合タンパク質のアミノ酸配列は、次の表２に示す通りである。

【0132】

【表2】

【0133】

図３（Ａ）は、精製された配列番号１、２、３のＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体又は単一鎖可変断片のＳＤＳ－ＰＡＧＥとウェスタンブロット結果を示す。

【0134】

実施例１－２：動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ）で癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異をターゲットとするｓｃＦｖの発現

【0135】

動物細胞で使用するＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖ、癌細胞透過能ペプチドが導入されたＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖ発現ベクターを、それぞれ特異的なプライマーを用いてＰＣＲ方法で製作した。

【0136】

動物細胞の発現のためにｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯベクターにクローニングされた癌細胞透過機能性ペプチドとＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖとが連結された融合タンパク質のアミノ酸配列は、次の表３に示す通りである。

【0137】

【表3】

【0138】

動物細胞の発現のために、ｐｃＤＮＡ３．１－ＴＯＰＯベクターにクローニングされた癌細胞透過機能性ペプチドとＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖとが連結された融合タンパク質のアミノ酸配列は、次の表４に示す通りである。

【0139】

【表4】

【0140】

動物細胞の発現のために、ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯベクターにクローニングされた癌細胞透過機能性ペプチドとＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖとが連結された融合タンパク質のアミノ酸配列は、次の表５に示す通りである。

【0141】

【表5】

【0142】

ｐｃＤＮＡ３．１－ＴＯＰＯ又はｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯをＥｃｏＲ ＩとＢａｍＨ Ｉで切断し、９００ｂｐ～９６０ｂｐのＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖ遺伝子断片をアガロース電気溶出（ａｇａｒｏｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏ ｅｌｕｔｉｏｎ）方法で回収した。これをｐｃＤＮＡ３．１－ＴＯＰＯ及びｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯベクターに挿入するために、ＰＣＲを通じて遺伝子を増幅させると同時に、ＢａｍＨ ＩとＥｃｏＲ Ｉ制限酵素サイトを合成した。それぞれの切断されたベクターとインサートを４μｌと４μｌの比率で混合し、トリス－ＨＣｌ ５００ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １００ｍＭ、ＤＴＴ ２００ｍＭ、ＡＴＰ １０ｍＭ組成のライゲーション緩衝溶液でＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用し、４℃で１６時間～１８時間にわたって反応させた。

【0143】

本発明者等は、製造されたベクターをチャイニーズハムスター卵巣細胞株Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ－Ｓとヒト胎児腎細胞株Ｅｘｐｉ－２９３Ｆに形質転換させた。チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）から提供を受け、ＥｘｐｉＣＨＯ発現培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）で培養した。

【0144】

その後、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞株（３×１０^８ｃｅｌｌｓ）を２５０ｍＬのディスポーザブル三角フラスコ（ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ ｆｌａｓｋ）に５０ｍＬの培養液に添加した。５０μｇのプラスミドが入っている２ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに、１．８４ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ試薬（Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃ Ａ２０１３０）１６０μＬを混合し、常温で５分間停止反応させた後、準備されたチャイニーズハムスター卵巣細胞に均一に点滴し、１８時間にわたって３７℃、８％のＣＯ_２恒温器で培養した後、ＥｘｐｉＣＨＯエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）３００μＬとＥｘｐｉＣＨＯフィード（Ｆｅｅｄ）１２ｍＬを追加して５日間培養した。

【0145】

ヒト胎児腎細胞株Ｅｘｐｉ－２９３Ｆは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）から提供を受け、Ｅｘｐｉ２９３発現培地（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）で培養した。その後、Ｅｘｐｉ－２９３Ｆ細胞株（１．５０×１０^７ｃｅｌｌｓ）を、２５０ｍＬのディスポーザブル三角フラスコに５０ｍＬの培養液に添加した。５０μｇのプラスミドが入っている３ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに、２．８ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃ Ａ１４５２５）１６０μＬを混合し、常温で２０分間停止反応させた後、準備されたヒト胎児腎細胞に均一に点滴し、１８時間にわたって３７℃、８％のＣＯ_２恒温器で培養した。その後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３形質導入エンハンサー（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）１３００μＬとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３形質導入エンハンサー２３ｍＬを追加して３日間培養した。

【0146】

形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）してから６日後に培養培地を収集し、除菌後にＦＰＬＣを使用して精製した。カラムは、ニッケルクロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ^ＴＭ ｅｘｃｅｌ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して分離・精製され、次の［２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４］条件のバッファーでニッケルカラムを予め濡らして均等にした後、培地を適用させた。２５ｍＭのイミダゾールが含まれている上記のバッファーを用いて洗浄を行った後、イミダゾールを１２５ｍＭに増加させ、タンパク質を分離した。分離されたタンパク質を集め、脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）を通じてイミダゾールを除去して保管した。

【0147】

図３（Ｂ）は、ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯ、図３Ｃは、ｐｃＤＮＡ３．１－ＴＯＰＯで発現されて精製された癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体又は単一鎖可変断片のＳＤＳ－ＰＡＧＥとウェスタンブロット結果を示す。

【0148】

実施例２：癌細胞透過能ペプチドと抗ＫＲＡＳ突然変異単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の化学的結合による製作

【0149】

実施例２－１：細胞透過性ペプチドの合成

【0150】

化学的結合法に使用される癌細胞透過機能性ペプチドとリンカーのアミノ酸配列は、表６に示す通りである。

【0151】

【表6】

【0152】

アミノ酸及び合成に必要な試薬は、ＧＬ ｂｉｏｃｈｅｍとＳｉｇｍａ－Ａｌｄｉｒｉｃｈから購入した。ペプチドは、反応容器を用いてＣ末端からＦ－ｍｏｃ固体相化学合成方法で合成した。すなわち、ブロッキンググループとしてＦｍｏｃ－（９－フルオレニルメトキシカルボニル）が結合されたリンクアミドＭＢＨＡレジン（０．６７８ｍｍｏｌ／ｇ、１００メッシュ～２００メッシュ）を使用して合成し、反応容器に１ｇのリンクアミドＭＢＨＡレジンを入れた後、ＤＭＦでレジンをスウェリング（ｓｗｅｌｌｉｎｇ）させた後、Ｆｍｏｃ－グループの除去のために２０％のピぺリジン／ＤＭＦ溶液を使用した。Ｃ末端から配列通りに０．５Ｍのアミノ酸溶液（溶媒：ジメチルホルムアミド、ＤＭＦ）、１．０Ｍ ＤＩＰＥＡ（溶媒：ジメチルホルムアミド＆ｎ－メチルピロリドン、ＤＭＦ＆ＮＭＰ）、０．５Ｍ ＨＢＴＵ（溶媒：ジメチルホルムアミド、ＤＭＦ）をそれぞれ５、１０、５当量ずつ入れ、窒素気流化で１時間～２時間にわたって反応させた。前記脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）とカップリング段階が終了する度に、ＤＭＦとメタノールで３回洗浄する過程を経た。最後のアミノ酸をカップリングさせた後にも脱保護を行い、Ｆｍｏｃ－グループを除去した。

【0153】

合成の確認には、ニンヒドリンテスト（ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ ｔｅｓｔ）方法を用い、テストを経て合成が完了したレジンは、真空乾燥させた後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）クリーベイジカクテル（ｃｌｅａｖａｇｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ）をレジン１ｇ当たり１０ｍｌの比率で入れて３時間振った後、フィルタリングを通じてレジンとペプチドが溶けているカクテルを分離した。フィルターでろ過された溶液をコールドエーテル（ｃｏｌｄ ｅｔｈｅｒ）に入れたり、ペプチドが溶けているＴＦＡカクテル溶液に過量のコールドエーテルを直接入れ、ペプチドを固体相に結晶化させ、これを遠心分離した。このとき、エーテルで多数回の洗浄と遠心分離過程を経てＴＦＡカクテルを完全に除去した。このようにして得られたペプチドを真空乾燥した。

【0154】

合成されたペプチドは、高性能液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）によって分離・精製した。直径４．６ｍｍのＣ_１８カラムを用いて流速１ｍｌ／ｍｉｎで０．１％のＴＦＡ／Ｈ_２Ｏと０．１％のＴＦＡ／アセトニトリルを５％から４５％に変化させながら４０分間流す方法で分析し、このとき、紫外線検出器の波長は２２０ｎｍにした。精製は、直径５０ｍｍのカラムを用いて流速５０ｍｌ／ｍｉｎで同じ溶媒と検出波長の条件で実施した。精製されたペプチドの分子量を質量分析法（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を通じて確認した。

【0155】

実施例２－２：ＫＲＡＳ突然変異をターゲットとするｓｃＦｖのリンカー部分に癌細胞透過能を有するペプチドの化学結合及び精製

【0156】

配列番号１の１．０２ｍｇ ＫＲＡＳ ｓｃＦｖを１ｍＬ ＰＢＳバッファー（ｐＨ８．３）に溶解した。２．１２ｍｇ ＳＰＤＰ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、２１８５７）を１２０μＬ ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に溶解した。ＫＲＡＳ ｓｃＦｖ溶液に４０μＬ ＳＰＤＰ溶液を添加し、１時間にわたって遮光させて反応することを３回繰り返した。又は、２ｍｇ ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－［Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、２２３２２）をＰＢＳに溶解した。ＫＲＡＳ ｓｃＦｖ溶液に４０μＬ ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ溶液を添加し、１時間にわたって遮光させて反応することを３回繰り返した。

【0157】

反応が終決すると、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して脱塩を行い、３．５ｍＬのピリジルジチオール活性（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）ＫＲＡＳ ｓｃＦｖを収得した。その後、３次精製水３００μＬに２．５ｍｇ Ｃｙｓ－Ｇ５－Ｈ４Ｋ（配列番号６０）、Ｃｙｓ－Ｇ５－Ｈ４Ｐ（配列番号６１）、Ｃｙｓ－Ｇ５－ＬＭＷＰ（配列番号６２）、Ｃｙｓ－Ｇ５－ｈＢＤ３－３（配列番号６３）、Ｃｙｓ－Ｇ５Ｓ２Ｇ５－Ｈ４Ｋ（配列番号６４）、Ｃｙｓ－Ｇ５Ｓ２Ｇ５－Ｈ４Ｐ（配列番号６５）、Ｃｙｓ－Ｇ５Ｓ２Ｇ５－ＬＭＷＰ（配列番号６６）、Ｃｙｓ－Ｇ５Ｓ２Ｇ５－ｈＢＤ３－３（配列番号６７）溶液をそれぞれ混合し、１Ｍのトリスバッファー（ｐＨ＝９）を使用してｐＨ８．３に調整した。遮光後、４℃で混合しながら一晩反応させた。ＦＰＬＣ（Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でヘパリンカラム（ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）（ＨｉＴｒａｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、癌細胞透過能を有するペプチドが結合されたＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖを精製した。

【0158】

配列番号１の１．０２ｍｇ ｓｃＦｖを１ｍＬ ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）に溶解した。２．９８ｍｇ Ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ｃａｔａｌｏｇ ２２３２２）を３００μＬの３次精製水に溶解した。ｓｃＦｖ溶液に１００μＬのＳｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ溶液を添加し、３０分間遮光させて反応することを３回繰り返した。反応が終決すると、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－０８５１－０１）を使用して脱塩を行い、３．５ｍＬのマレイミド活性（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）ｓｃＦｖを収得した。その後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ８．３）３００μＬに２．５ｍｇ Ｃｙｓ－Ｇ５－Ｈ４Ｋ（配列番号６０）、Ｃｙｓ－Ｇ５－Ｈ４Ｐ（配列番号６１）、Ｃｙｓ－Ｇ５－ＬＭＷＰ（配列番号６２）、Ｃｙｓ－Ｇ５－ｈＢＤ３－３（配列番号６３）、Ｃｙｓ－Ｇ５Ｓ２Ｇ５－Ｈ４Ｋ（配列番号６４）、Ｃｙｓ－Ｇ５Ｓ２Ｇ５－Ｈ４Ｐ（配列番号６５）、Ｃｙｓ－Ｇ５Ｓ２Ｇ５－ＬＭＷＰ（配列番号６６）、Ｃｙｓ－Ｇ５Ｓ２Ｇ５－ｈＢＤ３－３（配列番号６７）溶液をそれぞれ混合し、これをｐＨ７．０～７．５に調整した。遮光後、４℃で混合しながら一晩反応させた。ＦＰＬＣ（Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でヘパリンカラム（ＨｉＴｒａｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、癌細胞透過能を有するペプチドが結合されたｓｃＦｖを精製した。

【0159】

図４は、化学的結合方法で製造された癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体又は単一鎖可変断片のＳＤＳ－ＰＡＧＥとウェスタンブロットを示す。

【0160】

配列番号１のＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖの分子量が約３０ｋＤａ、癌細胞透過能ペプチドが結合されたＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖの分子量が約３２ｋＤａと測定された。また、ウェスタンブロットでＫＲＡＳ抗体と結合されたバンドの分子量も、配列番号１のｓｃＦｖの場合は３０ｋＤａ、癌細胞透過能ペプチドが結合された場合は約３２ｋＤａと測定され、ｓｃＦｖにペプチドが結合されていることを確認した。

【0161】

実施例２－３：ＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖのＣ末端部分への癌細胞透過能ペプチドの化学結合及び精製

【0162】

配列番号３のＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖと、２０モル当量（ｍｏｌａｒ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）とを常温で３時間にわたって反応させ、遊離チオール（Ｆｒｅｅ ｔｈｉｏｌ）基を形成した。ＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖ溶液に１００モル当量の５，５０－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を加えながら常温で１時間にわたって反応させ、遊離チオール基に結合した。ＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖと結合していない過量のＤＴＮＢは、ＦＰＬＣ（Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でヘパリンカラム（ＨｉＴｒａｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して除去した。その後、ＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖ－ＤＴＮＢ結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）は、１０モル当量の癌細胞透過能ペプチド（配列番号６０～６７）と常温で１時間にわたって反応させた。ＦＰＬＣ（Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でヘパリンカラム（ＨｉＴｒａｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、癌細胞透過能ペプチドが結合されたＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖを精製した。

【0163】

化学的結合法によって生成された癌細胞透過機能性ペプチドとＫＲＡＳ突然変異ｓｃＦｖとが連結された融合タンパク質のアミノ酸配列は、表７に示す通りである。

【0164】

【表7】

【0165】

実施例３：ＫＲＡＳ突然変異の発現程度が異なる癌細胞に対する抑制能確認

【0166】

本発明に係る癌細胞透過能のＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体及びｓｃＦｖの癌細胞特異的増殖抑制程度を確認するために、９６－ウェルにＨ３５８（ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＫＲＡＳ ｍｕｔａｎｔ）、ヒト皮膚線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）（正常細胞）を５×１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで分注した後、ＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ）で２４時間培養した。各ｓｃＦｖ（配列番号１、２８－３５）は、５μＭの濃度で処理した。細胞毒性は、ＣＣＫ－８（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８、ＣＫ０４、Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂ．）を用いて測定した。それぞれの融合体を処理してから４８時間後に培地を除去し、新しいＲＰＭＩ培地１６４０にＣＣＫ－８溶液を１００μｌずつ分注した。１時間３０分後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。

【0167】

その結果、図５に示すように、配列番号２８～３１、６８、６９は、Ｈ３５８細胞で１００～５００ｎＭのＩＣ５０（細胞の５０％が死滅する濃度）を示しており、配列番号１は、５μＭの濃度でもＩＣ５０を算出できなかった。これは、配列番号１の場合は、癌細胞を透過できないので癌細胞死滅の効果を示さなかったが、配列番号２８～３１、６８、６９の場合は、癌細胞透過機能性を有するので細胞毒性を示したと見なされる。正常細胞であるヒト皮膚線維芽細胞では、全ての濃度で８０％以上の細胞生存率を示した。これは、癌細胞透過機能性ＫＲＡＳ突然変異をターゲットとするｓｃＦｖ融合体が癌細胞特異的に細胞毒性を有することを意味する。

【0168】

実施例４：癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体及びｓｃＦｖによる活性型ＫＲＡＳ（突然変異ＫＲＡＳ）の発現阻害能評価

【0169】

Ｈ３５８細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－５８０７）１．０×１０^６個をシーディングし、２４時間にわたってＲＰＭＩ培地１６４０（１Ｘ）（Ｇｉｂｃｏ、２２４００－０８９）で培養した後、再び１６時間にわたって飢餓（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）させた。ＥＧＦ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ．２３６－ＥＧ）５０ｎｇ／ｍＬを１０分間処理し、各変異体（ｖａｒｉａｎｔ）を１μＭずつ処理した。その後、これを３７度で２４時間培養した。２４時間経過後、培地を除去し、ＤＰＢＳで洗浄した後、細胞を収得し、１５００ｒｐｍで３分間遠心分離した。１ｘ溶解バッファー（１Ｘ Ｌｙｓｉｓ／Ｂｉｎｄｉｎｇ／Ｗａｃｈ ｂｕｆｆｅｒ、１１５２４Ｓ）を１５０μＬ加えて混合した後、氷で５分間反応した。１６，０００ｒｐｍ及び４度で１５分間遠心分離し、上澄み液を分離した。ＢＣＡアッセイでタンパク質の濃度を測定（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２２７）した。１ｘ溶解バッファー４００μＬで洗浄し、遠心分離を６０００ｘｇで１５秒間２回行った。

【0170】

突然変異ＫＲＡＳを分離するために、活性型ＧＴＰａｓｅキット（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１１８６０Ｓ）を使用し、ＧＳＴ－Ｒａｆ１－ＲＢＤを８０μｇ入れ、５００μｇのタンパク質をスピンカップに分注した。４度で１時間反応し、６０００ｘｇで１５秒間遠心分離した後、新しいチューブにカラムを移し、１ｘ溶解バッファー４００μＬを加えた。６０００ｘｇで１５秒間遠心分離した後、新しいチューブにカラムを移し、２ｘＳＤＳバッファー（５Ｘ ＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ ２００μｌ、水３００μｌ混合）５０μＬを分注した後で２分間反応した。６０００ｘｇで２分間遠心分離した後、１００度で７分間加熱した。１１％のＳＤＳ－ＰＡＧＥでタンパク質（タンパク質の積載容量（ｌｏａｄｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）２０μｌ／ｌａｎｅ）を電気泳動で分離し、これをニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移した。ＫＲＡＳの下位信号であるＥＲＫ１／２を測定するために、タンパク質は、３０μｇずつ１１％のＳＤＳ－ＰＡＧＥで電気泳動し、ニトロセルロース膜に移した。Ｔ－ＴＢＳに溶かした５％のスキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）で１時間ブロッキングし、１次抗体をＴ－ＴＢＳに１：１０００で希釈し、４℃で反転（ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ）させながら一晩反応させた。Ｔ－ＴＢＳで１０分間３回ずつ洗浄し、２次抗体をＴ－ＴＢＳに１：３０００で希釈し、常温で反転させながら１時間にわたって反応させた。Ｔ－ＴＢＳで１０分間３回ずつ洗浄した後、ＥＣＬ基板（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ、３４５８０）で化学発光を行い、アマシャムイメージャー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ）６８０（ＧＥ）で確認した。使用された抗体の情報は、下記の表８に示す通りである。

【0171】

【表8】

【0172】

配列番号２０～２３の場合は、ＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体及びｓｃＦｖと細胞透過機能性ペプチドとの間のリンカーがＧＧＧＧＳで、配列番号９０～９３の場合は、リンカーがＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである。

【0173】

その結果、図６に示すように、配列番号２０～２３のいずれにおいても、ＥＧＦのみを処理したときに比べて活性型ＫＲＡＳが減少した。また、ＫＲＡＳの下位信号であるｐＥＲＫ１／２も、配列番号２０～２３によって減少したことが分かった。

【0174】

図７に示すように、配列番号９０～９３のいずれにおいても、ＥＧＦのみを処理したときに比べて活性型ＫＲＡＳが減少した。また、ＫＲＡＳの下位信号であるｐＥＲＫ１／２は、配列番号９１、９２によって減少したことが分かった。

【0175】

実施例５：癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体及びｓｃＦｖの細胞透過能評価

【0176】

癌細胞透過能を試験するために、Ｈ３５８細胞を１×１０^５で分注し、４８時間後、配列番号２０～２３をそれぞれ５００ｎＭで加えて３０分間培養した。４％のパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定し、０．１％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）－Ｘ１００で１０分間透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）した後、２％のＢＳＡでブロッキングした。細胞内にあるＫＲＡＳは、抗ＲＡＳ抗体（ａｎｔｉ－ＲＡＳ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｏｒｉｇｅｎｅ、ｃｓｔ５３２７０）で１：１０００の比率で反応させ、抗ウサギ（ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２７０３４）で１：２０００で２次反応した。配列番号２０～２３は、Ｖ５－タグ抗体（Ｔａｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｏｒｉｇｅｎｅ、ｃｓｔ １３２０２）で１：１０００の比率で反応させ、抗マウス（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ、Ａ２８１８０）で１：１０００の比率で反応させた。細胞核は、０．１μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｒ３７６０６）で染色した。細胞内に透過された配列番号２０～２３を共焦点示差走査顕微鏡で測定した。

【0177】

その結果、図８に示すように、配列番号２を除いては、配列番号２０－２３は、いずれも細胞内に透過されたことが分かった。また、癌細胞内に存在するＫＲＡＳと共局在（ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）していることが分かった。よって、配列番号２０～２３は、細胞内に透過され、細胞内に存在するＫＲＡＳに結合できることが分かった。

【0178】

実施例６：癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体及びｓｃＦｖの腫瘍異種移植片動物モデルにおける癌組織で分布評価

【0179】

５～６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅ）（５～６ ｗｅｅｋｓ ｏｌｄ；Ｊａｐａｎ ＳＬＣ Ｉｎｃ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）の大腿部に、Ｈ３５８細胞１×１０^６とマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）１００μＬとを混合したものを移植し、１００ｍｍ^３サイズの腫瘍が形成されるようにした。Ｃｙ５．５で標識した配列番号２と配列番号２３、Ｃｙ５．５をマウス当たり２０μｇの用量でそれぞれ腹腔に注射し、２４時間後に各主要臓器と癌組織に分布する蛍光を観察した。

【0180】

その結果、図９に示すように、配列番号２３は、注射してから２４時間後に癌組織に主に分布し、一部は腎臓で排泄されることが分かった。

【0181】

また、図１０に示すように、蛍光強度を測定したとき、配列番号２３の場合は、癌組織で蛍光強度が最も高いことが分かった。

【0182】

実施例７：癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体及びｓｃＦｖの腫瘍異種移植片動物モデルにおける腫瘍抑制評価

【0183】

５～６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（５～６ ｗｅｅｋｓ ｏｌｄ；Ｊａｐａｎ ＳＬＣ Ｉｎｃ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）の大腿部に、Ｈ３５８細胞１×１０^６とマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）１００μＬとを混合したものを移植し、１００ｍｍ^３サイズの腫瘍が形成されるようにした。配列番号２及び配列番号２３は、１ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれ腹腔に１週間に２回ずつ３０日間注射した。３～４日間隔で腫瘍のサイズをバーニアキャリパーで測定し、３０日目にマウスを犠牲させ、腫瘍を摘出した後、摘出された腫瘍を写真で観察した。

【0184】

その結果、図１１及び図１２に示すように、配列番号２は腫瘍抑制効果を示さなかったが、配列番号２３は腫瘍抑制効果に優れていた。これは、癌組織に透過された配列番号２３が、腫瘍細胞の増殖を効果的に抑制することを証明する。

【0185】

実施例８：化学的結合法によって製造された配列番号８０～８３の融合タンパク質の効果

【0186】

実施例８－１：癌細胞透過能のＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体及びｓｃＦｖによる活性型ＫＲＡＳ（突然変異ＫＲＡＳ）の発現阻害能評価

【0187】

Ｈ３５８細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－５８０７）１．０×１０^６個をシーディングし、２４時間にわたってＲＰＭＩ培地１６４０（１Ｘ）（Ｇｉｂｃｏ、２２４００－０８９）で培養した後、再び１６時間にわたって飢餓（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）させた。ＥＧＦ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ．２３６－ＥＧ）５０ｎｇ／ｍＬを１０分間処理し、各変異体を１μＭずつ処理した。これを３７度で２４時間培養した。２４時間経過後に培地を除去し、ＤＰＢＳで洗浄した後、細胞を収得し、１５００ｒｐｍで３分間遠心分離した。１ｘ溶解バッファー（１Ｘ Ｌｙｓｉｓ／Ｂｉｎｄｉｎｇ／Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ、１１５２４Ｓ）を１５０μＬ加えて混合した後、氷で５分間反応した。１６，０００ｒｐｍ、４度で１５分間遠心分離し、上澄み液を分離した。ＢＣＡアッセイでタンパク質の濃度を測定（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２２７）した。１ｘ溶解バッファー４００μＬで洗浄し、遠心分離を６０００ｘｇで１５秒間２回行った。

【0188】

突然変異ＫＲＡＳを分離するために、活性型ＧＴＰａｓｅキット（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１１８６０Ｓ）を使用してＧＳＴ－Ｒａｆ１－ＲＢＤ ８０μｇを入れ、５００μｇのタンパク質をスピンカップに分注した。４度で１時間反応し、６０００ｘｇで１５秒間遠心分離した後、新しいチューブにカラムを移し、１ｘ溶解バッファー４００μＬを加えた。６０００ｘｇで１５秒間遠心分離した後、新しいチューブにカラムを移し、２ｘ ＳＤＳバッファー（５Ｘ ＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ ２００μｌと水３００μｌの混合）５０μＬを分注した後で２分間反応した。６０００ｘｇで２分間遠心分離した後、１００度で７分間加熱した。１１％のＳＤＳ－ＰＡＧＥでタンパク質（タンパク質の積載容量（ｌｏａｄｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）２０μｌ／ｌａｎｅ）を電気泳動で分離し、ニトロセルロース膜に移した。ＫＲＡＳの下位信号であるＥＲＫ１／２を測定するために、タンパク質は、３０μｇずつ１１％のＳＤＳ－ＰＡＧＥで電気泳動し、ニトロセルロース膜に移した。Ｔ－ＴＢＳに溶かした５％のスキムミルクで１時間ブロッキングし、１次抗体をＴ－ＴＢＳに１：１０００で希釈し、４℃で反転させながら一晩反応させた。Ｔ－ＴＢＳで１０分間３回ずつ洗浄し、２次抗体をＴ－ＴＢＳに１：３０００で希釈し、常温で反転させながら１時間にわたって反応させた。Ｔ－ＴＢＳで１０分間３回ずつ洗浄した後、ＥＣＬ基板（Ｔｈｅｒｍｏ、３４５８０）で化学発光を行い、アマシャムイメージャー６８０（ＧＥ）で確認した。使用された抗体の情報は、下記の表に示す通りである。

【0189】

【表9】

使用された抗体

【0190】

配列番号８０～８３は、ＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体及びｓｃＦｖに細胞透過機能のペプチドを化学的結合で連結したものである。その結果、図１３に示すように、配列番号８０～８３のいずれにおいても、ＥＧＦのみを処理したときに比べて活性型ＫＲＡＳが減少した。また、ＫＲＡＳの下位信号であるｐＥＲＫ１／２も、配列番号８０～８３によって減少したことが分かった。

【0191】

実施例８－２：癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体及びｓｃＦｖのＫＲＡＳ突然変異の発現程度が異なる癌細胞に対する抑制能確認

【0192】

本発明に係る癌細胞透過能のＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体及びｓｃＦｖの癌細胞特異的増殖抑制程度を確認するために、９６－ウェルにＨ３５８（ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＫＲＡＳ ｍｕｔａｎｔ）、ヒト皮膚線維芽細胞（正常細胞）を５×１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで分注した後、ＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ）で２４時間培養した。各ｓｃＦｖ（配列番号３、８０－８３）は、０から５μＭの濃度で処理した。細胞毒性は、ＣＣＫ－８（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８，ＣＫ０４，Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂ．）を用いて測定した。それぞれの融合体を処理した後、４８時間後に培地を除去し、新しいＲＰＭＩ培地１６４０にＣＣＫ－８溶液を１００μｌずつ分注した。１時間３０分後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。

【0193】

その結果、図１４に示すように、配列番号８０～８３は、Ｈ３５８細胞で３１３～１２５０ｎＭのＩＣ５０（細胞の５０％が死滅する濃度）を示しており、配列番号３は、５μＭの濃度でもＩＣ５０を算出できなかった。これは、配列番号３の場合は、癌細胞を透過できないので癌細胞死滅の効果を示さなかったが、配列番号８０－８３の場合は、癌細胞透過機能性を有するので細胞毒性を示したことが分かる。正常細胞であるヒト皮膚線維芽細胞では、全ての濃度で８０％以上の細胞生存率を示した。これは、癌細胞透過機能性ＫＲＡＳ突然変異をターゲットとするｓｃＦｖ融合体が癌細胞特異的に細胞毒性を有することを意味する。

【0194】

実施例８－３：癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体及びｓｃＦｖの細胞透過能評価

【0195】

癌細胞透過能を試験するために、Ｈ３５８細胞を１×１０^５で分注し、４８時間後に配列番号８０～８３をそれぞれ５００ｎＭで加え、３０分間培養した。４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．１％のトリトン－Ｘ１００で１０分間透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）した後、２％のＢＳＡでブロッキングした。細胞内にあるＫＲＡＳは、抗ＲＡＳ抗体（Ｏｒｉｇｅｎｅ、ｃｓｔ５３２７０）で１：１０００の比率で反応させ、抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２７０３４）で１：２０００で２次反応させた。配列番号８０－８３は、Ｖ５－タグ抗体（Ｏｒｉｇｅｎｅ、ｃｓｔ １３２０２）で１：１０００の比率で反応させ、抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ、Ａ２８１８０）で１：１０００の比率で反応させた。細胞核は、０．１μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｒ３７６０６）で染色した。細胞内に透過された配列番号８０～８３を共焦点示差走査顕微鏡で測定した。

【0196】

その結果、図１５に示すように、配列番号３を除いて、配列番号８０～８３は、いずれも細胞内に透過されたことが分かった。また、癌細胞内に存在するＫＲＡＳと共局在（ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）していることが分かった。よって、配列番号８０～８３は、細胞内に透過され、細胞内に存在するＫＲＡＳに結合できることが分かった。

【0197】

実施例８－４：癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体及びｓｃＦｖの腫瘍異種移植片動物モデルにおける癌組織で分布評価

【0198】

５～６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（５～６ ｗｅｅｋｓ ｏｌｄ；Ｊａｐａｎ ＳＬＣ Ｉｎｃ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）の大腿部に、Ｈ３５８細胞１×１０^６とマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）１００μＬとを混合したものを移植し、１００ｍｍ^３サイズの腫瘍が形成されるようにした。Ｃｙ５．５で標識した配列番号３と配列番号８３、Ｃｙ５．５をマウス当たり２０μｇの用量でそれぞれ腹腔に注射し、２４時間後に各主要臓器と癌組織に分布する蛍光を観察した。

【0199】

その結果、図１６に示すように、配列番号８３は、注射してから２４時間後に癌組織に主に分布し、一部は腎臓で排泄されることが分かった。

【0200】

また、図１７に示すように、蛍光強度を測定したとき、配列番号８３の場合は、癌組織で蛍光強度が最も高いことが分かった。

【0201】

実施例８－５：癌細胞透過能を有するＫＲＡＳ突然変異をターゲットとする抗体及びｓｃＦｖの腫瘍異種移植片動物モデルにおける腫瘍抑制評価

【0202】

５～６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（５～６ ｗｅｅｋｓ ｏｌｄ；Ｊａｐａｎ ＳＬＣ Ｉｎｃ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）の大腿部に、Ｈ３５８細胞１×１０^６とマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）１００μＬとを混合したものを移植し、１００ｍｍ^３サイズの腫瘍が形成されるようにした。配列番号３及び配列番号８３を１ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれ腹腔に１週間に２回ずつ３０日間注射した。３～４日間隔で腫瘍のサイズをバーニアキャリパーで測定し、３０日目にマウスを犠牲させ、腫瘍を摘出した後、摘出された腫瘍を写真で観察した。

【0203】

その結果、図１８及び図１９に示すように、配列番号３は腫瘍抑制効果を示さなかったが、配列番号８３は腫瘍抑制効果に優れていた。これは、癌組織に透過された配列番号８３が、腫瘍細胞の増殖を効果的に抑制することを証明する。

【0204】

以上では、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は好ましい実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の各請求項とそれらの等価物によって定義されると言えるだろう。

【産業上の利用可能性】

【0205】

本発明では、腫瘍の発病に重要な要因として作用する細胞内の腫瘍誘発タンパク質又はこれらの突然変異に結合し、その機能を阻害する細胞内の腫瘍誘発タンパク質又は腫瘍誘発突然変異タンパク質をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片を活用し、その癌細胞接近性を強化させるために癌細胞透過機能性ペプチドを連結した。このように製作された融合タンパク質は、効果的に腫瘍細胞に浸透し、細胞内の腫瘍誘発タンパク質又は腫瘍誘発突然変異タンパク質をターゲットとする抗体又はその単一鎖可変断片の抗腫瘍又は抗癌効果を極大化できるという長所を有する。

【配列表フリーテキスト】

【0206】

【図1】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

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