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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-03
(45)【発行日】2024-09-11
(54)【発明の名称】網膜症の診断および処置のための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240904BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240904BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240904BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240904BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240904BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240904BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20240904BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240904BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240904BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/864 100Z
C07K14/705
A61K48/00
A61P27/02
A61P27/06
A61K31/7088
A61K38/17
【請求項の数】
41
(21)【出願番号】P 2021552829
(86)(22)【出願日】2020-03-04
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-11
(86)【国際出願番号】 US2020020977
(87)【国際公開番号】W WO2020180981
(87)【国際公開日】2020-09-10
【審査請求日】2023-03-06
(31)【優先権主張番号】62/813,272
(32)【優先日】2019-03-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】507189666
【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100137626
【弁理士】
【氏名又は名称】田代 玄
(72)【発明者】
【氏名】ケイ ジェレミー
(72)【発明者】
【氏名】レイ トーマス
【審査官】藤澤 雅樹
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５３０２５３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５１８２７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００９／００１１０４０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Frontiers in Neuroscience，2017年，Vol.11, No.175，pp.1-15
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
Ｃ０７Ｋ １４／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１を含むクラムス（Ｃｒｕｍｂｓ）１－Ｂ（ＣＲＢ１－Ｂ）アイソフォームをコードするポリヌクレオチド配列と、網膜細胞においてアイソフォームを発現することができ、かつ前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている異種プロモーターとを含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項2】
ＣＲＢ１－Ｂアイソフォームをコードする配列が、配列番号２である、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項3】
請求項１または２のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項4】
クラムス１－Ｂ（ＣＲＢ１－Ｂ）アイソフォームをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、ＣＲＢ１－Ｂアイソフォームが、Ｎ末端からＣ末端に向けて、２つのＥＧＦドメイン、ｌａｍＧドメイン、ＥＧＦドメイン、ｌａｍＧドメイン、ＥＧＦドメイン、ｌａｍＧドメイン、および４つのＥＧＦドメインを含む細胞外ポリペプチドに連結されたＮ末端シグナルペプチドを含み；細胞外ポリペプチドのＣ末端は、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むＣ末端ドメインに連結されている、組換えベクター。
【請求項5】
ポリヌクレオチドが、網膜細胞においてアイソフォームを発現することができる異種プロモーターに作動可能に連結されている、請求項４に記載の組換えベクター。
【請求項6】
網膜細胞が、光受容細胞、網膜色素上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞、および／または神経節細胞からなる群から選択される、請求項１～３または５のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチドまたは組換えベクター。
【請求項7】
網膜細胞が、光受容細胞を含む、請求項６に記載の単離ポリヌクレオチドまたは組換えベクター。
【請求項8】
プロモーターが、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、およびニワトリβ－アクチン（ＣＢＡプロモーター）からなる群から選択される、請求項１～３または５～７のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチドまたは組換えベクター。
【請求項9】
細胞外ポリペプチドが、ＣＲＢ１－Ａアイソフォームの９番目のＥＧＦドメインのＮ末端から、ＣＲＢ１－Ａアイソフォームの１６番目のＥＧＦドメインのＣ末端まで伸びている、請求項４または５に記載の組換えベクター。
【請求項10】
Ｃ末端ドメインが、ＶＳＳＬＳＦＹＶＳＬＬＦＷＱＮＬＦＱＬＬＳＹＬＩＬＲＭＮＤＥＰＶＶＥＷＧＥＱＥＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む、請求項４、５または９のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項11】
ウイルスベクターである、請求項３～１０のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項12】
ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項１１に記載の組換えベクター。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチドまたは組換えベクターから作製された単離ポリペプチド。
【請求項14】
請求項１もしくは２に記載の単離ポリヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項15】
請求項３～１０のいずれか１項に記載の組換えベクターおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項16】
請求項１１または１２に記載の組換えベクターおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項17】
１×１０6ＤＲＰ／ｍｌ～１×１０14ＤＲＰ／ｍｌの濃度でウイルスベクターを含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項18】
ＣＲＢ１－Ａ、ＣＲＢ１－Ａ２、ＣＲＢ１－Ｃ、またはそれらの組み合わせをコードする第２のベクターをさらに含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項19】
対象における眼障害を処置する方法に使用するための、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項20】
それを必要とする対象において視力喪失の進行を低減するか、または視力機能を維持する方法に使用するための、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項21】
対象が眼障害を有する、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項22】
眼障害が網膜症を含む、請求項１９または２１に記載の医薬組成物。
【請求項23】
対象が、ＣＲＢ１の１種または複数の対立遺伝子に変異を有する、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項24】
網膜症が、常染色体劣性重症早期発症網膜変性（レーバー先天性黒内障）、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性症、Ｘ連鎖網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性症、萎縮性加齢性黄斑変性症、新生血管ＡＭＤ、糖尿病性黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞性黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎、緑内障、および後部ブドウ膜炎からなる群から選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項25】
硝子体内投与される、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項26】
網膜下投与される、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項27】
局所投与される、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項28】
方法が、対象の視覚機能をモニタリングすることをさらに含み、対象の視覚機能は、医薬組成物の投与後に維持され、低下しない、請求項１９～２７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項29】
視覚機能が、マイクロペリメトリー、暗順応ペリメトリー、視覚可動性の評価、視力、ＥＲＧ、または読み取り評価によって評価される、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項30】
対象の眼障害を処置するためのキットであって、請求項１もしくは２に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項３～１２のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求項１３に記載の単離ポリペプチド、または請求項１４～１８のいずれか１項に記載の医薬組成物と、前記単離ポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記単離ポリペプチド、または前記医薬組成物を対象に送達するためのデバイスと、使用説明書とを含む、キット。
【請求項31】
送達が、網膜下送達を含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項32】
送達が、硝子体内送達を含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項33】
送達が、局所送達を含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項34】
対象における視力喪失の進行を低減するか、もしくは視力喪失を低減するか、または視力機能を維持するためのキットであって、請求項１もしくは２に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項３～１２のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求項１３に記載の単離ポリペプチド、または請求項１４～１８のいずれか１項に記載の医薬組成物と、前記単離ポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記単離ポリペプチド、または前記医薬組成物を対象に送達するためのデバイスと、使用説明書とを含む、キット。
【請求項35】
請求項３～１２のいずれか１項に記載の組換えベクター、およびＣＲＢ１－Ａ、ＣＲＢ１－Ａ２、またはＣＲＢ１－Ｃをコードする第２のベクター、および使用説明書を含むキット。
【請求項36】
単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチドまたは医薬組成物を対象の眼に送達するためのシステムであって、治療有効量の請求項１もしくは２に記載のポリヌクレオチド、請求項３～１２のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求項１３に記載の単離ポリペプチド、または請求項１４～１８のいずれか１項に記載の医薬組成物、および対象に送達するためのデバイスを含む、システム。
【請求項37】
組換えベクターが送達される、請求項３６に記載のシステム。
【請求項38】
送達が、網膜下送達を含む、請求項３６または３７に記載のシステム。
【請求項39】
送達が、硝子体内送達を含む、請求項３６または３７に記載のシステム。
【請求項40】
デバイスが細径カニューレおよびシリンジを含み、細径カニューレが２７～４５ゲージである、請求項３６～３９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項41】
送達が、局所送達を含む、請求項３６または３７に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月４日出願の米国仮特許出願第６２／８１３，２７２号の優先権の利益を主張し、この仮特許出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦政府支援研究に関する声明
本発明は、国立衛生研究所により授与された連邦政府助成金番号Ｆ３２ＥＹ０２６３４４に基づく政府の支援によってなされたものである。政府は、本発明にある特定の権利を有する。
配列表
配列表がこの出願に付属しており、２０２０年３月４日に作成されたサイズ３４２ＫＢの「２０２０－０３－０４＿１５５５５４．００５３１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられた配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出される。配列表は、本出願とともにＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年３月４日出願の米国仮特許出願第６２／８１３，２７２号の優先権の利益を主張し、この仮特許出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦政府支援研究に関する声明
本発明は、国立衛生研究所により授与された連邦政府助成金番号Ｆ３２ＥＹ０２６３４４に基づく政府の支援によってなされたものである。政府は、本発明にある特定の権利を有する。
配列表
配列表がこの出願に付属しており、２０２０年３月４日に作成されたサイズ３４２ＫＢの「２０２０－０３－０４＿１５５５５４．００５３１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられた配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出される。配列表は、本出願とともにＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
ＣＲＢ１遺伝子の機能喪失型変異は、広範囲の網膜変性疾患を引き起こす。遺伝子治療の最近の進歩により、単一遺伝子失明性疾患における視力喪失の進行を止めるための新しい可能性が開かれている。ＣＲＢ１疾患がそのような治療法の有力な候補となるためには、インビボで網膜におけるＣＲＢ１タンパク質の正常かつ病理生物学的（ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）機能を理解することが不可欠である。ＣＲＢ１機能の一般的なモデルは、このことが外境界膜（ＯＬＭ）の構造的完全性に必要であると仮定している。ＣＲＢ１タンパク質（大きな細胞外ドメインを有する細胞表面分子）は、光受容体とミュラーグリアとを連結するＯＬＭ細胞間接着に局在している。ＣＲＢ１機能の喪失は、ＯＬＭ接着を弱め、最終的に光受容体の死を引き起こす構造的欠陥につながると考えられている。このモデルによると、ＣＲＢ１遺伝子の置換は有望な治療戦略である、すなわち、接着を回復すると、ＯＬＭの完全性が向上し、それによって光受容体の死が緩徐するか、さらには停止することが期待される。効果的な遺伝子置換戦略を設計するには、現在不明な２つの極めて重要な情報を知ることが重要である。第１に、どの細胞型でＣＲＢ１を置換するべきであるか？置換は、ＯＬＭ接合部のグリア側または光受容体側、－あるいはその両方において必要であるか？第２に、ＣＲＢ分子のどのスプライスバリアントを置換に使用するべきであるか？ＣＲＢ１は、いくつかの代替ｍＲＮＡアイソフォームをコードすることが知られている；さらに、ヒトトランスクリプトームの真の複雑さは驚くほど難解なままであるため、説明されていない追加のアイソフォームがまだ存在する場合がある。遺伝子治療ベクターに含めるために選択することができるｃＤＮＡ種は１つだけであるため、成熟網膜に再導入した場合に変性を停止するのにどのアイソフォームが最も効果的であるかを確立することが極めて重要である。
【発明の概要】
【0003】
一態様では、本開示は、配列番号１を含むクラムス（Ｃｒｕｍｂｓ）１－Ｂ（ＣＲＢ１－Ｂ）アイソフォームをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、網膜細胞においてアイソフォームを発現することができる異種プロモーターに作動可能に連結された、単離ポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、本開示は、単離ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
別の態様では、本開示は、クラムス１－Ｂ（ＣＲＢ１－Ｂ）アイソフォームをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、ＣＲＢ１－Ｂアイソフォームが、Ｎ末端からＣ末端に向けて、２つのＥＧＦドメイン、ｌａｍＧドメイン、ＥＧＦドメイン、ｌａｍＧドメイン、ＥＧＦドメイン、ｌａｍＧドメイン、および４つのＥＧＦドメインを含む細胞外ポリペプチドに連結されたＮ末端シグナルペプチドを含み、細胞外ポリペプチドのＣ末端は、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むＣ末端ドメインに連結されている、組換えベクターを提供する。
別の態様では、本開示は、クラムス１－Ｂ（ＣＲＢ１－Ｂ）アイソフォームをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、ＣＲＢ１－Ｂアイソフォームが、Ｎ末端からＣ末端に向けて、２つのＥＧＦドメイン、ｌａｍＧドメイン、ＥＧＦドメイン、ｌａｍＧドメイン、ＥＧＦドメイン、ｌａｍＧドメイン、および４つのＥＧＦドメインを含む細胞外ポリペプチドに連結されたＮ末端シグナルペプチドを含み、細胞外ポリペプチドのＣ末端は、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むＣ末端ドメインに連結されている、組換えベクターを提供する。
【0004】
さらなる態様では、本開示は、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチドまたは組換えベクターから作製された単離ポリペプチドを提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチドまたは組換えベクターと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、対象における眼障害を処置する方法であって、本明細書に記載の治療有効量のポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物を対象に投与することを含み、それにより眼障害が対象において処置される、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチドまたは組換えベクターと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、対象における眼障害を処置する方法であって、本明細書に記載の治療有効量のポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物を対象に投与することを含み、それにより眼障害が対象において処置される、方法を提供する。
【0005】
さらに別の態様では、本開示は、それを必要とする対象において視力喪失の進行を低減するか、または視力機能を維持する方法であって、本明細書に記載の治療有効量のポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物を対象に投与することを含み、それにより視力喪失が低減される、方法を提供する。
さらに別の実施形態では、本開示は、対象において眼障害を処置するためのキットであって、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物、単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物を対象に送達するためのデバイス、および使用説明書を含む、キットを提供する。
さらに別の実施形態では、本開示は、対象において眼障害を処置するためのキットであって、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物、単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物を対象に送達するためのデバイス、および使用説明書を含む、キットを提供する。
【0006】
さらなる態様では、本開示は、対象における視力喪失の進行を低減するか、もしくは視力喪失を低減するか、または視力機能を維持するためのキットであって、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物、および単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物を対象に送達するためのデバイス、および使用説明書を含む、キットを提供する。
別の態様では、本開示は、単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物を対象の眼に送達するためのシステムであって、本明細書に記載の治療有効量の単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物、および対象に送達するためのデバイスを含む、システムを提供する。
別の態様では、本開示は、単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物を対象の眼に送達するためのシステムであって、本明細書に記載の治療有効量の単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物、および対象に送達するためのデバイスを含む、システムを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】高いアイソフォーム多様性を呈する細胞表面受容体を同定するために本明細書で使用される戦略を示す。（Ａ）ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑの遺伝子を選択するためのスクリーニング戦略。ＥＧＦ、Ｉｇ、および接着ＧＰＣＲファミリーのメンバーを、１）網膜および皮質からのＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して、神経発生の間の発現；および２）ＵＣＳＣ Ｇｅｎｅｓ公開データベースと比較したＲＮＡ－ｓｅｑリードアラインメントに基づく、注釈のない転写物の多様性について試験した。選択的スプライシング、新規エクソン、新規転写開始部位（アスタリスク）などの注釈のないイベントの強力なエビデンスを示す３０の遺伝子を、完全長転写物の標的化シークエンシング用に選択した（Ｂ、Ｃ）。（Ｂ）ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑワークフロー。完全長リードの同定を可能にするために、ｃＤＮＡには５’タグを付けている。既知のエクソンをタイリングする赤色のビオチン化捕捉プローブ。インタクトなｃＤＮＡが豊富なシークエンシングライブラリーを取得するために、２ラウンドの増幅およびサイズ選択を使用した。（Ｃ）各ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑ実験の完全長リードのサイズ分布。マウスの網膜転写物を、Ｐ１、Ｐ６、Ｐ１０および成体で分析した；皮質データは成体マウスからのものである。リードの大部分は、標的化遺伝子のｃＤＮＡの予想サイズ範囲内にある。破線は、リード長分布の四分位数を示す。
【図2】ＩｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑによって明らかにされたｍＲＮＡアイソフォーム多様性を示す。（Ａ）ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑバイオインフォマティクスパイプラインの完了後に各遺伝子についてカタログ化されたアイソフォームの総数。（Ｂ）ＰａｃＢｉｏ ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータセットのアイソフォーム数を公開データベース（ＲｅｆＳｅｑ、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｅｓ）と比較するＵｐＳｅｔプロット。共通部分は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑアイソフォームの５３．９％がＰａｃＢｉｏデータセットで検出されたことを示す（２５５ ＲｅｆＳｅｑアイソフォーム、左から４列目および６列目）。ＵＣＳＣ遺伝子の場合、このデータベース中で注釈付きアイソフォームの７２．３％がＰａｃＢｉｏデータセットで検出された（１０２個のＵＣＳＣアイソフォーム、５列目および６列目）。（Ｃ）各遺伝子についてカタログ化されたアイソフォームの総数（右Ｙ切片）、および各アイソフォームによって表される各遺伝子の総リードの割合（ドット）を示すローレンツプロット。曲線は累積関数であり、アイソフォームは総遺伝子リードの最高（左）から最低（右）の割合で順番に表示されている。図１０Ｄも参照のこと。（Ｄ）シャノン多様度指数を使用して、各遺伝子の相対的多様性を比較した。より高いシャノン指数は、より多いアイソフォーム数とアイソフォーム発現のパリティの両方を反映している。（Ｅ）データセット全体内の遺伝子（色）およびアイソフォーム（ネストされた長方形）の相対的存在量を示すツリープロット。長方形のサイズは、総リード数に比例する。最も豊富なアイソフォームはＣｒｂ１に属していた；最も豊富な遺伝子はＮｒｃａｍであった。（Ｆ、Ｇ）単一遺伝子レベルで適用される教師なしクラスタリングは、特定の配列要素を共有する関連するアイソフォームのファミリーを識別する。一例としてＰｔｐｒｄ遺伝子を示す。Ｐｔｐｒｄアイソフォームのサブセットを、５グループにクラスタリングする（Ｆ、下）。これらは３つの変数に基づいて異なっている：５’ＵＴＲの長さ；３’ＵＴＲの長さ；可変エクソンクラスターのスプライシング（Ｆ、上）。同じ群が主成分プロット（Ｇ）内で分離する。
【図3】転写物の多様性が豊富なタンパク質多様性に寄与することを実証する。（Ａ）ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータセット内の各遺伝子の転写物およびＯＲＦの総数。ＯＲＦの数は、典型的には、ほとんどの遺伝子にわたる同様の線の勾配で示されるように、転写物数に対応する。少数の遺伝子は、転写アイソフォームよりもはるかに少ないＯＲＦを呈する（急勾配）。（Ｂ）図２Ｃと同様のアイソフォームＯＲＦ分布のローレンツプロット。多くの予測されるタンパク質アイソフォーム（ドット）は、遺伝子発現全体に寄与すると予想される。（図１１Ａ、Ｂも参照のこと）。（Ｃ）各遺伝子の固有の予測ＯＲＦのシャノン多様度指数。トランスシナプス結合タンパク質をコードする遺伝子は、赤色で強調表示されている。（Ｄ）データセット内の予測ＯＲＦの相対的存在量を示すツリープロット。ほとんどの遺伝子では、全体的な発現は多くのＯＲＦアイソフォームにわたって分布している。Ａにおいて急勾配の遺伝子（Ｃｎｔｎ４など）は、転写ツリープロット（図２Ｅ）と比較してここで違いを示している。（Ｅ）細胞表面タンパク質を濃縮するために使用されるプロテオミクス技術の概略。（Ｆ）ビオチン標識およびストレプトアビジン濃縮細胞表面タンパク質からのクマシー染色タンパク質ゲル。溶出レーン（Ｅ）は、総溶解物投入（Ｉ）と比較して高分子量タンパク質の濃縮を示している。７５ｋＤａ～２５０ｋＤａのバンドを質量分析用に切り出した。（Ｇ）ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースに存在しない、質量分析によって発見された注釈のないペプチドの数を示すプロット。そのようなペプチドは、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑによって存在すると予測されていなかった場合、検出されなかったであろう。
【図4】モジュラー選択的スプライシングによって推進されるＭｅｇｆ１１のアイソフォーム多様性を実証する。（Ａ）ＭＥＧＦ１１タンパク質の概略図であり、ドメインの特徴がエクソンの境界にどのように対応するかを示している。ほとんどの細胞外ドメインエクソンは、個々のＥＧＦまたはＥＧＦ－ラミニン（Ｌａｍ）リピートをコードする。ＥＧＦ－Ｌａｍドメインを短縮化するスプライシング（例えば、エクソン１４のスキッピング）は、インタクトなＥＧＦドメインを残してモジュール性を維持すると予測される。カノニカルな（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）シグナル伝達モチーフをコードする細胞内ドメインエクソンが注目される：＋、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＹｘｘＬ／Ｉｘ(6-8)ＹｘｘＬ／Ｉ）；－、免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＩ／Ｖ／Ｌ）。ＴＭは膜貫通ドメイン；ＥＭＩはエミリン－相同性ドメインを示す。（Ｂ）組み合わせたＰａｃＢｉｏデータセットから生成されたＭｅｇｆ１１ ｓａｓｈｉｍｉプロット。最もばらつきのあるエクソンクラスター（１３～１７および１９～２３）が示されている。これらのクラスター内のエクソンは、クラスター内の任意の下流エクソンとスプライシングすることができる。線の幅は、アイソフォームデータベースのスプライシングイベントの頻度に対応している。Ｃ）Ｍｅｇｆ１１アイソフォーム全体にわたるエクソン使用の相関。高いピアソン相関値（赤）は、最小限のスプライシングを示すエクソン間の短い距離、例えば１～８および１７～１９で見られる。長距離の相関はほとんどなく、ほとんどのスプライシングが確率論的であることを示唆している。長距離の強い負の相関は、選択的転写停止部位の下流にあるエクソン（アスタリスク）の自明なケースでのみ観察される。（Ｄ）１０個の最も豊富なＭｅｇｆ１１アイソフォームの予測されるタンパク質構造。選択的スプライシングによって、タンパク質の細胞外部分のＥＧＦおよびＥＧＦ－Ｌａｍドメインの数および同一性が変化し、５つの異なる細胞質ドメインが産生される。アイソフォーム８は、選択的転写停止部位（Ｃ、エクソン８ｂ）の結果であり、分泌されたアイソフォームをコードすると予測される。＊エクソン１９～２０をスプライシングすると、フレームシフトおよび早期停止コドンが生じる。＊＊イントロン２４の保持により、フレームシフトおよび早期停止コドンが生じる。（Ｅ）示されたスプライスジャンクション（赤）を標的とするプローブを使用した、Ｐ１０マウス網膜断面のＢａｓｅＳｃｏｐｅ インサイチュハイブリダイゼーション。構成的ジャンクション（２～３、左上）は、４つの細胞型において完全なＭｅｇｆ１１発現パターンを示している：ＯＮおよびＯＦＦスターバーストアマクリン細胞（青色矢印）、水平細胞（赤色矢印）、および未確認アマクリン細胞（黒色矢印）。カルビンジン（緑色）は、スターバーストおよび水平細胞を示す。各ジャンクションプローブの染色強度は、シークエンシングデータにおけるジャンクション頻度と一致している（Ｓａｓｈｉｍｉプロット、Ｂを参照のこと）。すべてのジャンクションは、スターバーストおよび水平集団のすべての個々の細胞によって表される。スケールバー＝１０μｍ。
【図5】Ｃｒｂ１－Ｂが、マウスおよびヒトの網膜において最も豊富なＣｒｂ１アイソフォームであることを実証する。（Ａ、Ｂ）マウス網膜（Ａ）および皮質（Ｂ）からの最も豊富なＣｒｂ１アイソフォームの転写マップ。Ａはカノニカルなアイソフォームである；Ａ２はＡのマイナーなスプライスバリアントである。これらのアイソフォームは網膜と皮質の間で共有されるが、Ｃｏｒｔｅｘ１、Ｃｏｒｔｅｘ２、およびＣｒｂ１－Ｂは組織特異的である。対応するエクソンカバレッジ（紺色）およびｓａｓｈｉｍｉプロット（赤色の線）は、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータセットから生成された。Ｃｒｂ１－Ｂアイソフォーム（Ａ）に関連するリードの頻度に注意すること。（Ｃ）クロマチンアクセシビリティのアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ；ＧＳＥ１０２０９２、ＧＳＥ８３３１２）では、Ｃｒｂ１－ＡおよびＣｒｂ１－Ｂアイソフォームの有望なプロモーターを同定する。色付きバーは、推定されるＡ（緑色）およびＢ（青色）プロモーターの位置を示す。Ａ～Ｃのマップは互いにアラインされている。Ｃｒｂ１－Ａプロモーターは、発生の間はよりオープンであるが、成熟網膜においてアクセス可能なままである。Ｃｒｂ１－Ｂプロモーターはオープンであり、成熟桿体と両方のタイプの錐体において活性があると推定される。ＥＮＣＯＤＥプロジェクトからのＤＮａｓｅ Ｉ高感受性データによって、Ａアイソフォームおよびより短い皮質アイソフォーム（ｃｏｒｔｅｘ１および２；上部の灰色のバー）の発現と一致する前頭皮質の明確なクロマチン環境が明らかになる。（Ｄ）ＰａｃＢｉｏデータセットから定量化された、マウス発生全体にわたる上位３種のＣｒｂ１アイソフォームの網膜発現。ＡアイソフォームはＰ１で優勢であるが、Ｃｒｂ１－ＢはＰ６で最も豊富になる。データは、各時点での総Ｃｒｂ１リード計数に正規化された（Ｐ１＝９２３リード、Ｐ６＝６，１２７リード、Ｐ１０＝１４，００７リード、成体＝１０，９７５リード）。（Ｅ）ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑによって同定された、最も豊富なヒト網膜ＣＲＢ１アイソフォームの転写マップ。ＡおよびＢアイソフォームはマウス（Ａ）に対し高い相同性がある。ＣＲＢ１－Ｃは、推定される分泌型タンパク質をコードする；ＣＲＢ１－Ｃは、マウスデータセットでも同定されたが、マウスでの相対的存在量はＡおよびＢよりもはるかに少なかった。Ｃｒｂ１－Ａ２はヒトデータセットでは検出されなかったことに注意すべきである。エクソンカバレッジ（紺色）およびｓａｓｈｉｍｉプロット（赤色の線）は、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータから生成された。（Ｆ）ヒト周辺（ｐｅｒ．）および黄斑（ｍａｃ．）網膜のＡＴＡＣ－ｓｅｑ（ＧＳＥ９９２８７）は、ＣＲＢ１－Ａ（緑色のバー）およびＣＲＢ１－Ｂ（青色のバー）の推定プロモーターに対応するオープンな調節部位を示す。２つの生物学的複製を示す。Ｅ、Ｆのマップは互いにアラインされている。（Ｇ）成人のヒト網膜ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータセットから定量化された上位３種のヒトＣＲＢ１アイソフォームの発現。（Ｈ、Ｉ）ショートリードＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用した上位３種のマウス（Ｈ）またはヒト（Ｉ）ＣＲＢ１アイソフォームの定量化。マウスデータセット（ＧＳＥ１０１９８６）では、ＰａｃＢｉｏデータ（Ｄ）で観察された各アイソフォームの発生調節が確認される。ヒトデータセット（ＧＳＥ９４４３７）では、ＣＲＢ１－Ｂが成人の網膜内で優性アイソフォームであることが確認される。線（Ｉ）は、同じドナーから得られた測定値を示す。統計（Ｉ）：Ｔｕｋｅｙの事後比較を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ。＊＊＊＊Ｐ＜１×１０-7。＊＊＊Ｐ＝１．６×１０-6（上）；Ｐ＝６．６×１０-6（下）。エラーバーは、９５％信頼区間（Ｈ）またはＳ．Ｄ．（Ｉ）。
【図6】ＣＲＢ１－Ｂが、光受容体によって発現することを実証する。（Ａ）ＣＲＢ１－ＡおよびＣＲＢ１－Ｂタンパク質アイソフォームのドメイン構造。緑色、Ａ特有の領域；青色、Ｂ特有の領域。各アイソフォームは、シグナルペプチドをコードすると予測されるＮ末端、および膜貫通（ＴＭ）および細胞内ドメインをコードすると予測されるＣ末端に固有の配列を有する。（Ｂ）固有のＣＲＢ１－Ｂ配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント（Ａの青色）Ｎ末端領域とＣ末端領域の両方が、脊椎動物種全体で高度に保存されている。Ｎ末端領域はシグナルペプチド（左）を含み、Ｃ末端領域は膜貫通ドメイン（右）を含む。示されている配列は以下のとおりである：配列番号８７はコンセンサスシグナルペプチドであり、配列番号８８はコンセンサス膜貫通ドメインであり、配列番号８９はホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）シグナルペプチドであり、配列番号３はホモ・サピエンス膜貫通ドメインであり、配列番号９０はボス・トーラス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）シグナルペプチドであり、配列番号９１はボス・トーラス膜貫通ドメインであり、配列番号９２はムース・ムースクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）シグナルペプチドであり、配列番号９３はムース・ムースクルス膜貫通ドメインであり、配列番号９４はラトゥス・ノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）シグナルペプチドであり、配列番号９５はラトゥス・ノルベギクス膜貫通ドメインであり、配列番号９６はダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）シグナルペプチドであり、配列番号９７はダニオ・レリオ膜貫通ドメインである。（Ｃ）網膜溶解物におけるＣＲＢ１－Ｂタンパク質発現を検証するウエスタンブロット。ＣＲＢ１－Ｂ抗体が、固有のＣＲＢ１－Ｂ Ｃ末端に対して生成された。変異マウス（Ｃｒｂ１delB対立遺伝子；図７Ａを参照のこと）におけるＣｒｂ１－Ｂの第１エクソンの欠失は、抗体の特異性を実証し、転写レベルで予測されるように、Ｃｒｂ１－Ｂ固有の第１および最終エクソンが主に一緒に使用されることを実証する（図５Ａ）。光受容体タンパク質ＡＢＣＡ４を、負荷対照（ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用する。（Ｄ）可溶性（Ｓ）および膜結合（Ｍ）タンパク質画分に分離された網膜溶解物におけるウエスタンブロット。ＣＲＢ１－Ｂは、膜画分で検出される。負荷対照：膜画分、ＡＢＣＡ４；可溶性画分、ホスデューシン。（Ｅ）ＣＲＢ１が発現している外網膜領域の解剖学的構造を示す概略図。左、光受容体核を描いた顕微鏡写真；内節（黒色）；および外節（茶色）。外境界膜（ＯＬＭ）は、内節層から核層を分離する。右、ＯＬＭの解剖学的構造概略図。ＯＬＭは、光受容体（灰色）とミュラー細胞（青色）の間の接合部（赤い点）からなる。これらの接合部は、各細胞型の特定の細胞内ドメイン、すなわちグリア頂端膜および光受容体内節で選択的に形成される。ＣＲＢ１－Ａはミュラー細胞（Ｆ、Ｇ）によって発現し、ＯＬＭ接合部に選択的に局在化する49。ＣＲＢ１－Ｂは、内節および外節を含む光受容体全体に発現している（Ｆ～Ｈ）。図１４も参照のこと。（Ｆ）ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータにおけるＣｒｂ１アイソフォームのマッピング48。＞９０，０００の細胞の遺伝子プロファイルから生成されたヒートマップであり、Ｃｒｂ１アイソフォームおよび網膜細胞型マーカー遺伝子の正規化された発現を示す。教師なしクラスタリングを使用して、Ｃｒｂ１アイソフォームと共発現する遺伝子を定義した。Ｃｒｂ１－Ｂは、既知の錐体および桿体光受容体遺伝子とクラスタリングし、Ｃｒｂ１－Ａは、既知のミュラーグリア遺伝子とクラスタリングする。（Ｇ）アイソフォーム特異的プローブ（赤色）を使用したＰ２０マウス網膜のＢａｓｅＳｃｏｐｅ インサイチュハイブリダイゼーション。青色、Ｈｏｅｓｃｈｓｔ核対比染色。Ｃｒｂ１－Ａプローブはエクソン１－２ジャンクションを標的とし、これはＣｒｂ１－Ａ２およびＣｒｂ１－Ｃでも使用される（図５Ａを参照）。シグナルは、ミュラー細胞体が存在する中央ＩＮＬに、主に限定されている（左）。Ｃｒｂ１－Ｂプローブは、その固有の５’エクソンとエクソン６との間のジャンクションを標的とした（図５Ａ）。シグナルは、ＯＮＬ内の光受容体に限定される。略語ＯＮＬ＝外顆粒層；ＩＮＬ＝内顆粒層；ＧＣＬ＝神経節細胞層。スケールバー、１００μｍ。（Ｈ）桿体光受容体内のＣＲＢ１－Ｂの細胞内局在を、マウスの外網膜を通る連続１０μｍの接線方向切片のウエスタンブロッティングによって評価した。各レーンは、上部に図案で示されている光受容体の細胞内区画に対応している。ロドプシン（Ｒｈｏ、中央）は外節マーカーであり；ＧＡＰＤＨ（下）は外節から除外されているが、細胞の残りの部分全体に存在している。ＣＲＢ１－Ｂタンパク質（上）はすべての区画に存在する；発現は、外節および内節に対応するレーンで最も強くなっている。
【図7】外境界膜の完全性にＣｒｂ１アイソフォームが必要であることを実証する。（Ａ）マウス変異対立遺伝子に関連する遺伝子病変を示すＣｒｂ１遺伝子座の概略図。以前に研究された変異体：Ｃｒｂ１ex1は、Ｃｒｂ１－Ｂアイソフォームに影響を与えないエクソン１の標的化欠失を示す；Ｃｒｂ１rd8は、エクソン９の点変異を示す。この研究のために生成された変異対立遺伝子：Ｃｒｂ１delBは、第１のＣｒｂ１－Ｂエクソンおよびそのプロモーター領域のＣＲＩＳＰＲ媒介欠失を示し、Ｃｒｂ１－Ａアイソフォームはインタクトに残っている；Ｃｒｂ１nullは、すべてのＣｒｂ１アイソフォームで使用される連続したエクソンの大規模なＣＲＩＳＰＲ媒介欠失を示す。新しい対立遺伝子の記録については、図１５Ａも参照のこと。（Ｂ、Ｃ）電子顕微鏡によるＯＬＭ接合部の評価。Ｂ：光受容体の内節を取り巻くＯＬＭ接合部（赤色）の位置を示す概略図。Ｃ：野生型マウスからの電子顕微鏡写真。すべての内節は、ミュラー細胞とともにＯＬＭ接合部を形成する。ＩＳは、内節を示す。赤色の矢じりは、光受容体－グリア接合部を示す。青色の矢じりは、グリア－グリア接合部を示す。（Ｄ、Ｅ）Ｃｒｂ１変異体におけるＯＬＭ破壊表現型。Ｄ：対照（野生型）マウスの電子顕微鏡写真。ＯＬＭ（赤い矢印）は、外顆粒層（ＯＮＬ）をＩＳ層から分割する。Ｃｒｂ１変異体（Ｅ）では、ＯＬＭのギャップにより、核が内節層に浸透する。矢印は、ＯＬＭ接合部を欠く領域を示している。この画像はＣｒｂ１delB/null変異体からのものであるが、ｎｕｌｌ、ｄｅｌＢ、およびｒｄ８変異体で観察されたＯＬＭ表現型を表す（図１５Ｄ～Ｆ）。（Ｆ～Ｉ）Ｃｒｂ１変異体のＯＬＭギャップの高倍率表示であって、ＯＬＭ接合部（アスタリスク）を欠く内節を示している。各対立遺伝子の組み合わせにおいて、ミュラー接触を欠く光受容体が観察された。赤色と青色の矢じりは、Ｃと同様である。（Ｊ）ＯＬＭギャップ頻度（ｇａｐ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）の定量化。野生型またはＣｒｂ１null/+ヘテロ接合体ではギャップは観察されなかった。ＯＬＭ破壊の頻度は、ｒｄ８、ｎｕｌｌ、およびｄｅｌＢ／ｎｕｌｌ変異体において類似しており、それらのうちの後者はＣｒｂ１－Ｂを欠いているが、それでもＣｒｂ１－Ａを発現する。統計、Ｔｕｋｅｙの事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ。ｎｕｌｌ、ｒｄ８、およびｄｅｌＢ／ｎｕｌｌはすべて、野生型およびヘテロ接合体対照とは有意に異なっていた（それぞれのＰ値： ０．０１４；０．００５；０．０１９）が、互いに有意差はなかった（ｒｄ８対ｎｕｌｌ Ｐ＝０．９９１；ｒｄ８対ｄｅｌＢ／ｎｕｌｌ Ｐ＝０．７８４；ｎｕｌｌ対ｄｅｌＢ／ｎｕｌｌ Ｐ＝０．９６７）。ギャップサイズの定量化については、図１５Ｆも参照のこと。スケールバーは、２μｍ Ｃ、Ｄ（バーはＥにも適用される）；１μｍ Ｇ（バーはＦにも適用される）、Ｈ、Ｉである。
【図8】すべてのＣｒｂ１アイソフォームのアブレーションによって網膜変性が引き起こされることを実証する。（Ａ）Ｐ１００でのＣｒｂ１変異マウスにおける網膜組織学。示された遺伝子型のホモ接合変異体、および野生型対照について、下半球を通る薄いプラスチック切片が示されている。矢印は、光受容体核を含むＯＮＬ層を示す。光受容体喪失の大きな焦点領域は、網膜剥離を伴うＣｒｂ１null網膜において明らかである。最も激しく変性するパッチの外側領域は、ＯＮＬの薄化を示す。Ｃｒｂ１delBおよびＣｒｂ１rd8変異体は、ＯＮＬ細胞の明らかな喪失を示していない。ＯＮＨは、視神経乳頭を示す。（Ｂ）網膜組織学の高倍率表示であり、ＯＮＨより４５０μｍ劣っている。２つの異なるＣｒｂ１null動物からの画像を、限局性変性の変動性を強調するために示す。軽度のｎｕｌｌの場合でも、年齢が一致したＣｒｂ１rd8よりも核が少ない、より薄いＯＮＬ（オレンジ色の線）を有する。ｎｕｌｌ変異体では、外節長さ（青色の線）も短縮する。（Ｃ、Ｄ）は、Ｐ１００でのＯＮＬ細胞数の定量化を示す。Ｃ：網膜切片全体に均一に分布した１００μｍのビン内のＯＮＬ核の計数を示すスパイダープロット（例：Ｂ）。左、下側。Ｃｒｂ１delBスパイダープロットについては、図１５を参照のこと。Ｄ：８つのビンすべてにおいて計数された総ＯＮＬ核。統計（Ｃ）：Ｓｉｄａｋ事後検定を伴う２元配置ＡＮＯＶＡ。Ｐ値はＷＴ対ｎｕｌｌの比較を指す；ｒｄ８は、どの位置でもＷＴと有意差はなかった。＊Ｐ＝０．０１５；＊＊Ｐ＝０．００７、Ｐ＝０．００４；＊＊＊＊Ｐ＜１×１０-7。統計（Ｄ）：Ｔｕｋｅｙの事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ。Ｃｒｂ１nullは、他のすべての群とは有意差があった。すべての比較で＊＊＊＊Ｐ＜１×１０-5。他のＣｒｂ１変異体はどれもＷＴと、または互いに異ならなかった。サンプルサイズを、グラフ（Ｄ）のドットで示す。
【図9】捕捉されたｃＤＮＡのＰａｃＢｉｏシークエンシングを示す。（Ａ）パイロットｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑ実験のＰａｃＢｉｏリードサイズ分布のヒストグラムであり、この実験では、ＰＣＲ増幅後の第２のサイズ選択は実行されなかった（ワークフロー、図１Ｂを参照のこと）。プロファイルは、このサイズ選択が長い転写物の濃縮に必要であることを実証している。点線は四分位範囲を表す。ＦＬＮＣは、Ｉｓｏ－Ｓｅｑソフトウェアによってコールされる完全長の非キメラリードを示す。（Ｂ）実験ごとのオンターゲットリードのパーセンテージであって、これは他のすべてのリードに対する我々の標的化遺伝子に対応する高品質（ＨＱ）リードの数として計算される。ＨＱリードは、Ｉｓｏ－Ｓｅｑソフトウェアによってコールされる。（Ｃ）個々のｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑ実験および結合データセットからのシークエンシング統計。（Ｄ、Ｅ）ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォーム５’のバリデーションは、ＣＡＧＥによって終了する。成体マウスの網膜からの３つの独立したＣＡＧＥ－ｓｅｑ複製を、成体マウスの網膜ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームにマッピングした。Ｄ：ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームの第１のエクソンでのＣＡＧＥリードカバレッジを示す箱ひげ図。カバレッジは広範囲であり、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑ ５’末端部の精度を支持する。箱はＩＱＲを表し、水平線は中央値を表し、ひげは１．５＊ＩＱＲに等しくなる。Ｅ：ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームにマッピングされたＣＡＧＥリードの５’－３’軸に沿った位置。ＣＡＧＥカバレッジは、転写物の５’末端部に限定されていた。
【図10】ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑカタログにおけるアイソフォームの長さおよび存在量を示す。（Ａ）ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータセット内の「ｇｒｏｕｎｄ－ｔｒｕｔｈ」アイソフォームの数を、ＣｕｆｆｌｉｎｋｓまたはＳｔｒｉｎｇｔｉｅによって網膜および皮質のＲＮＡ－ｓｅｑデータセットから計算で予測されたものと比較するＵｐＳｅｔプロット。これらの２つのプログラムによってアセンブルされたよりもはるかに多くのアイソフォームが、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑによって検出された。それにもかかわらず、予測されたアイソフォームのうちの少数のみがロングリードシークエンシングによってバリデーションされた：Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓによって予測された１８６のアイソフォーム（３列目＋５列目）が、ＰａｃＢｉｏデータセットで検出され（またはＣｕｆｆｌｉｎｋｓアイソフォームの３８％）、Ｓｔｒｉｎｇｔｉｅによって予測された１７０のアイソフォーム（４列目＋５列目）が検出された（またはＳｔｒｉｎｇｔｉｅアイソフォームの１７．７％）。（Ｂ）ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームにマッピングされたＲＮＡ－ｓｅｑリードの数を示す箱ひげ図。２つのクラスのアイソフォームを比較する：ＲＮＡ－ｓｅｑデータ内のすべてのエクソンジャンクションがバリデーションされたもの（完全）と、１００％はバリデーションされていないもの（部分的）である。後者の群のリード計数は低く、すべてのジャンクションのバリデーションに失敗したことは、少なくとも部分的には、これらの特定のアイソフォームの低い発現レベルおよび／または不十分なＲＮＡ－ｓｅｑリードカバレッジに起因する場合があることを示唆している。箱はＩＱＲを表し、水平線は中央値を表し、ひげは１．５＊ＩＱＲに等しくなる。赤色のバーは、平均の９５％信頼区間を示す。（Ｃ）全体的なアイソフォーム計数に対する非カノニカルなスプライスジャンクションを含むアイソフォームの寄与。曲線は、すべてのアイソフォームの存在量のランク順（赤色）と、非カノニカルなスプライスジャンクションを含むアイソフォームのみの同じランク順（青色）を示す。非カノニカルなジャンクションは、総アイソフォームの少数を占めている。各遺伝子から最も少量のアイソフォームを連続的に除去する（つまり、Ｘ軸に沿って移動する）と、非カノニカルなジャンクションを使用するアイソフォームの同様の割合が得られ、これらの一部が豊富に発現していることが示唆される。（Ｄ）各遺伝子の総リード計数の上位５０％（Ｄ）または７５％（Ｅ）を占めるアイソフォームの数を示すプロット（図２Ｃを参照のこと）。これらのプロットは、厳格な存在量カットオフがあっても、多くのアイソフォームが存在し、全体的な遺伝子発現に寄与することを示している。（Ｅ、Ｆ）アイソフォームの長さは大幅に異なる。このことは、各遺伝子のアイソフォームの長さを示すドットプロット（Ｆ）、および各遺伝子のアイソフォーム全体で使用されるエクソンの数を示す箱ひげ図によって示される。箱はＩＱＲを表し、水平線は中央値を表し、ひげは１．５＊ＩＱＲに等しくなる。（Ｇ）すべてのアイソフォームのｔ－ＳＮＥプロット。ほとんどのアイソフォームをそれぞれの遺伝子ファミリーに分離して、アイソフォームの類似性を比較するためのクラスタリングアルゴリズムの有効性をバリデーションする。プロットの中央にあるアイソフォームで十分に分離されていないものは、一般に、同じ遺伝子の他のアイソフォームとのクラスタリングを妨げる大きなゲノム要素（つまり、保持されたイントロン）を含んでいる。アイソフォームの拡張は、配列組成の有意な変動を示唆している。プロットを、１，０００回の反復およびパープレキシティ＝３５により生成した。
【図11】コーディングおよび非コーディングアイソフォームのバリエーションを示す。（Ａ、Ｂ）各遺伝子の総リード計数の上位５０％（Ａ）または７５％（Ｂ）を占める固有の予測ＯＲＦの数を示すプロット（図３Ｂを参照のこと）。（Ｃ）イントロンの保持は、ここでＶｌｄｌｒ遺伝子によって例示されているように、タンパク質をコードしないアイソフォームの多様性の主な原因である。上位２０の最も豊富なＶｌｄｌｒアイソフォームが示されている。黒色の太いバーは、エクソンを示す。広範囲にわたるコンビナトリアルイントロンの保持に注意すべきである。アスタリスクは、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォーム（つまり、ポリアデニル化転写物内）で検出されたイントロンを示す。イントロンの保持により、高度な転写物の多様性が生じるが、ＯＲＦの多様性は高くならない。保持されたイントロンはすべて、時期尚早の終止コドンを導入する。（Ｄ）非コーディング転写物の多様性は、ここでＣｎｔｎ４によって例示されているように、遺伝子の５’ＵＴＲ領域のバリエーションから生じる可能性がある。図は、上位２０の最も豊富なＣｎｔｎ４アイソフォームの５’末端部を示している。選択的転写開始部位および５’ＵＴＲ内のエクソンの使用法の差異に注意すべきである。（Ｅ）ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータセット内に存在する予測トリプシンペプチド産物の数（左のバー）と比較した、ＵｎｉＰｒｏｔＫｂデータベース内の我々の３０遺伝子によってコードされた固有のトリプシンペプチド産物の数（右のバー）。
【図12】ＰａｃＢｉｏシークエンシングによって明らかにされたＭｅｇｆ１１のアイソフォーム多様性を示す。（Ａ）Ｍｅｇｆ１１ＲＴ－ＰＣＲ産物のＤＮＡ電気泳動ゲル画像。プライマーは、それぞれエクソン２５または選択的エクソン２３にプライマーを配置することにより、２つの異なるＭｅｇｆ１１バリアント（長および短と表示）を増幅するように設計された。ＰＣＲを、網膜（長）または皮質（短）ｃＤＮＡで実行した。ＲＴ－ＰＣＲ産物のサイズの拡張は、さまざまなサイズの多数のＭｅｇｆ１１アイソフォームを容易に増幅することができることを示している。（Ｂ）ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑおよびＰＣＲデータセットからのＭｅｇｆ１１アイソフォーム存在量のローレンツプロットプロファイル。すべてのデータセットは、多くのアイソフォームが全体的なＭｅｇｆ１１発現に寄与することを示唆している。ＰＣＲデータセット曲線の右方向へのシフトは、おそらくＰＣＲ誘発バイアスが原因で、最も豊富なアイソフォームの過剰表現を示唆している。（Ｃ）Ｍｅｇｆ１１の長い形式および短い形式（上）ならびに３つの異なるＰａｃＢｉｏシークエンシングデータセットからの対応するエクソンカバレッジ（青色）およびｓａｓｈｉｍｉプロット（赤色）を示す転写マップ。ＰＣＲ１データセットはＭｅｇｆ１１の長い形式のＰＣＲ産物をシークエンシングすることによって生成され、ＰＣＲ２データセットは短い形式のＰＣＲ産物をシークエンシングすることによって生成された。これらを、３０遺伝子のｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑ実験からのＭｅｇｆ１１リードと比較する。３つの実験はすべて、Ｍｅｇｆ１１転写物の広範な選択的スプライシングを明らかにしている。ｓａｓｈｉｍｉプロットは、異なるデータセット間で顕著な類似性を示している。
【図13】Ｃｒｂ１－Ｂアイソフォームが、さまざまな脊椎動物種にわたって発現していることを実証する。（Ａ）公的に入手可能なＲＮＡ－ｓｅｑデータ（ウシ、ＧＥＳ５９９１１；ラット、ＧＳＥ８４９３２；ゼブラフィッシュ、ＧＳＥ１０１５４４）に基づく、ウシ、ラット、およびゼブラフィッシュの網膜におけるＣｒｂ１アイソフォームの定量化。Ｃｒｂ１－Ｂは、少なくともすべての種においてＣｒｂ１－Ａと同じくらい豊富であり、ラットおよびゼブラフィッシュにおいてより豊富である。Ｃｒｂ１－Ａ２は、ウシの網膜でもゼブラフィッシュの網膜でも検出されなかった。エラーバーは、９５％信頼区間を表す。（Ｂ）マウス網膜におけるＣｒｂ１アイソフォームの定量的（ｑ）ＲＴ－ＰＣＲ分析により、ＰａｃＢｉｏおよびショートリードＲＮＡ－ｓｅｑを使用して同定された発現パターンが確認される（図５）。Ｃｒｂ１－ＡはＰ１で最も豊富であり、Ｃｒｂ１－Ｂは成体期に最も豊富である。ＰＣＲプライマーを、示されたアイソフォームによって発現するスプライスジャンクションにまたがるように設計した。データを、ｐａｎ－Ｃｒｂ１プライマーから得られた値に正規化した。Ｎ＝各年齢で３匹の動物。（Ｃ）ｐａｎ－Ｃｒｂ１プライマー（ｐａｎ）、またはＣｒｂ１－Ｂスプライスジャンクションを標的とするプライマー（Ｂ）を使用した、マウス網膜および皮質からのｃＤＮＡのＲＴ－ＰＣＲ。Ｃｒｂ１－Ｂバンドは、マウス皮質では検出されない。Ｐａｎ－Ｃｒｂ１プライマーは、両方の組織にバンドを生成する。Ｎ＝３匹のマウス。Ｌは、はしご型を示す。
【図14】Ｃｒｂ１アイソフォームの細胞型特異的発現を示す。（Ａ）Ｃｒｂ１エクソンのピアソン相関は、Ｃｒｂ１－Ｂに固有のエクソン（５ｃおよび１１ｂ）には、Ｃｒｂ１－Ａアイソフォームに固有のエクソン（１～５および１２）と負の相関があることを実証する。固有のＣｒｂ１－Ｂエクソン（５ｃと１１ｂ）には強く正の相関があり、主に一緒に使用されることを示唆している。（Ｂ）単離錐体（上）および桿体（下）光受容体のバルクＲＮＡ－ｓｅｑからのＣｒｂ１アイソフォームの定量化（データセット：ＧＳＥ７４６６０）。Ｃｒｂ１－Ｂは、光受容体で発現する唯一のアイソフォームである。エラーバーは、９５％信頼区間を表す。（Ｃ）Ｋ５６２細胞で発現したＣＲＢ１アイソフォームは、原形質膜に移動する。画像は、ＹＦＰでＣ末端にタグ付けされたＣＲＢ１－ＡおよびＣＲＢ１－Ｂ構造体の自然蛍光を示す。（Ｄ）単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータにおけるＣｒｂ１アイソフォームのマッピング31。ジッタープロットは、個々の細胞内の相対的転写物発現計数を示す。各点は、１つの細胞を表し、注釈付き細胞型によって色分けされている。Ｃｒｂ１－Ａは、ミュラーグリアによって発現するが、Ｃｒｂ１－Ｂは、桿体および錐体光受容体によって発現する。比較のために、ミュラーグリア（Ａｑｐ４）、桿体（Ｇｎａｔ１）、錐体（Ｇｎａｔ２）、双極細胞（Ｐｃｐ２）の細胞型特異的マーカーを示す。
【図15】Ｃｒｂ１変異マウスおよびＯＬＭ表現型を示す。（Ａ）サンガーシークエンシングによって検証されたＣｒｂ１nullおよびＣｒｂ１delB対立遺伝子内の欠失の位置。赤色のテキストは、欠失ゲノム断片のサイズを示す。Ｃｒｂ１null対立遺伝子を含むゲノム領域は配列番号９８（上位４つの配列）であり、Ｃｒｂ１delB対立遺伝子を含むゲノム領域は配列番号９９（５、７、および８番目の配列）である。Ｃｒｂ１delB欠失を示す配列は、配列番号１００（６番目の配列）である。（Ｂ）ＣＲＢ１－Ｂタンパク質がＣｒｂ１null変異マウスにおいて排除されていることを確認する。網膜溶解物のウエスタンブロットを、図６Ｃのように実行した。ＡＢＣＡ４は、負荷対照を示す。（Ｃ）Ｐ１００でのＣｒｂ１delB/delBマウスにおける光受容体喪失の欠如を示すスパイダープロット。灰色は、野生型対照を示す。（Ｄ、Ｅ）Ｃｒｂ１nullおよびＣｒｂ１rd8変異体におけるＯＬＭ破壊を示す代表的な電子顕微鏡写真。画像の縮尺は、図７Ｄ、Ｅと同様である。矢印は、ＯＬＭ接合部を欠く領域を示している。解剖学的障害は、ｒｄ８について以前に報告されたもの36、およびＣｒｂ１－Ｂを欠いているがＣｒｂ１－Ａのコピーを１つ保持しているＣｒｂ１delB/nullマウスで観察されたものと類似している（図７）。スケールバーは５μｍである。（Ｆ）種々の対立遺伝子の組み合わせを有するＣｒｂ１変異体のＯＬＭギャップサイズ。ＯＬＭギャップのサイズは、種々の変異体間で有意差はなかった。統計、一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｆ＝２．１９；Ｐ＝０．０９５）。
【図16】ＣＲＢ１－Ｂアイソフォームのポリペプチド配列（配列番号１）を示しており、ＥＧＦドメインは灰色で強調表示されており（残基２４～６５、６８～１０９、３０３～３３４、５１６～５５０、７７３～８０２、８０４～８３９、８４１～８７６および９２４～９６０）およびラミニンＧドメインが赤色で強調表示されている（残基１４１～２７６、３７０～４８７、および６０７～７３２）。タンパク質ドメインの概略図を配列の下に示す。
【発明を実施するための形態】
【0008】
遺伝子置換は、Ｃｒｂ１遺伝子の機能喪失型変異によって引き起こされる広範囲の網膜変性疾患に対する有望な治療戦略である。しかし、効果的な遺伝子置換戦略を設計するには、この遺伝子を置換する必要のある細胞型と、提供する適切なＣｒｂ１アイソフォームの両方を同定しなければならない。
Ｃｒｂ１は、進化的に保存されたクラムス遺伝子ファミリーのメンバーであり、頂底（ａｐｉｃｏ－ｂａｓａｌ）上皮極性を媒介する細胞表面タンパク質をコードする33。特に、遺伝子のマウスバージョンをＣｒｂ１と呼び、遺伝子のヒトバージョンをＣＲＢ１と呼ぶことは標準的な慣行と考えられている。しかし、本出願では、専門用語Ｃｒｂ１およびＣＲＢ１は、遺伝子を指すために交換可能に使用され、遺伝子が由来する種を示すために必ずしも使用されるわけではない。
Ｃｒｂ１は、進化的に保存されたクラムス遺伝子ファミリーのメンバーであり、頂底（ａｐｉｃｏ－ｂａｓａｌ）上皮極性を媒介する細胞表面タンパク質をコードする33。特に、遺伝子のマウスバージョンをＣｒｂ１と呼び、遺伝子のヒトバージョンをＣＲＢ１と呼ぶことは標準的な慣行と考えられている。しかし、本出願では、専門用語Ｃｒｂ１およびＣＲＢ１は、遺伝子を指すために交換可能に使用され、遺伝子が由来する種を示すために必ずしも使用されるわけではない。
【0009】
網膜では、ＣＲＢ１は外境界膜（ＯＬＭ）に局在しており、これは、光受容体とミュラーグリアとして知られる隣接するグリア細胞との間の構造的に重要な接合部のセットである26。ＯＬＭ接合部は、各細胞型内のまさにその細胞内ドメインで形成され、これらの細胞間接触の確立における高度な分子特異性を示唆している34。ヒトＣＲＢ１における機能喪失型変異は一連の網膜変性疾患を引き起こすため35、ＯＬＭ接合部でのＣＲＢ１の機能を理解することに大きな関心が寄せられている。ＯＬＭの完全性の喪失が疾患の病因に関与している可能性があることが提案されている26、36。それでも、マウスでの研究は、このモデルの説得力のある支持をまだ提供していない。例えば、マウスでは、既知のＣｒｂ１アイソフォームの欠失は、ＯＬＭを破壊することも、重大な光受容体の変性を引き起こすこともない37。
【0010】
本出願において、本発明者らは、カノニカルなアイソフォームよりも－マウスおよびヒトの網膜の両方において－はるかに豊富な新しいＣｒｂ１アイソフォームを同定する。マウスモデルを使用して、本発明者らは、この新しいアイソフォームがＯＬＭの完全性に必要であり、その除去が、ヒト変性疾患を適切に表現型コピーするために必要であることを示している。これらの結果により、ＣＲＢ１疾患の遺伝学および病理生物学の一般的なモデルの大幅な改訂が必要とされる。注目すべきことに、本発明者らは、網膜変性遺伝子Ｃｒｂ１の主要なアイソフォームが以前は看過されていたことを発見した。このアイソフォームであるＣｒｂ１－Ｂは、ＣＲＢ１疾患において影響を受けた細胞である光受容体によって発現する唯一のアイソフォームである。マウスモデルを使用して、本発明者らは、光受容体－グリア接合部におけるこのアイソフォームの機能を同定し、このアイソフォームの喪失が光受容体の死を加速することを実証する。
【0011】
本発明は、主要なアイソフォームＣｒｂ１－Ｂが、トランスで提示される場合、光受容体機能を保持するのに十分であり、その使用により視力を維持し、視力喪失を低減することが可能になることを実証する。具体的には、網膜光受容細胞へのＣｒｂ１－Ｂアイソフォームの導入は、光受容体機能を維持し、光受容体機能の喪失を低減するのに十分である。
アイソフォーム注釈：
ほとんどの遺伝子は、複数のｍＲＮＡアイソフォームを生成する。本明細書で使用される場合、「アイソフォーム」という用語は、同じ遺伝子座から産生されるが、それらの転写開始部位（ＴＳＳ）、タンパク質コードＤＮＡ配列（ＣＤＳ）および／または非翻訳領域（ＵＴＲ）が異なるｍＲＮＡを説明するために使用される。選択的アイソフォーム（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｉｓｏｆｏｒｍｓ）は、選択的スプライシング、イントロン保持、選択的転写開始／停止部位などのメカニズムによって産生される。選択的アイソフォームは、タンパク質をコードする能力が異なることが多く1~4、その結果、遺伝子機能が変化することがある。これらのメカニズムは、選択的アイソフォームの使用が特に普及している中枢神経系（ＣＮＳ）において特に一般的である1、5。さらに、アイソフォーム発現の調節不全は、いくつかの神経障害に関係している9-11。
アイソフォーム注釈：
ほとんどの遺伝子は、複数のｍＲＮＡアイソフォームを生成する。本明細書で使用される場合、「アイソフォーム」という用語は、同じ遺伝子座から産生されるが、それらの転写開始部位（ＴＳＳ）、タンパク質コードＤＮＡ配列（ＣＤＳ）および／または非翻訳領域（ＵＴＲ）が異なるｍＲＮＡを説明するために使用される。選択的アイソフォーム（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｉｓｏｆｏｒｍｓ）は、選択的スプライシング、イントロン保持、選択的転写開始／停止部位などのメカニズムによって産生される。選択的アイソフォームは、タンパク質をコードする能力が異なることが多く1~4、その結果、遺伝子機能が変化することがある。これらのメカニズムは、選択的アイソフォームの使用が特に普及している中枢神経系（ＣＮＳ）において特に一般的である1、5。さらに、アイソフォーム発現の調節不全は、いくつかの神経障害に関係している9-11。
【0012】
アイソフォームの多様性が明らかに重要であるにもかかわらず、ＣＮＳ ｍＲＮＡアイソフォームの数および同一性に関する情報は、－主要なトランスクリプトーム注釈データベース内であっても、驚くほど不足している12。ＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）は、選択的スプライシングに関する新しい情報の爆発的増加をもたらした。しかし、典型的なＲＮＡ－ｓｅｑのリード長は２００ｂｐ未満であるため、この方法では数千塩基転写物の完全長配列を解決することはできない。したがって、ＲＮＡ－ｓｅｑのみに依存することにより、任意の所与の遺伝子によって産生されるアイソフォームの数、またはそれらの完全長配列を決定することは不可能である。信頼できる完全長の転写物の注釈がない場合、遺伝子実験の設計および解釈は非常に困難になる。例えば、転写配列が知られていない限り、「ノックアウト」マウス対立遺伝子がすべてのアイソフォームの発現を完全に排除するように適切に設計されていることを確認することは困難である。注釈のないアイソフォームは、変異がヒトの遺伝病の病理にどのようにつながるかを理解する上でも問題になる可能性がある。隠れたアイソフォームは、特徴付けされていないタンパク質コード配列または新規の発現パターンを有する場合があり、これにより、疾患関連変異の分子的および細胞的結果が誤って解釈される可能性がある。したがって、包括的なアイソフォーム配列情報の欠如は、正常な遺伝子機能と遺伝子機能不全の表現型の結果の両方を理解する上で依然として主要な障害となっている12。
【0013】
本出願において、本発明者らは、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ （ＰａｃＢｉｏ）のロングリードシークエンシング技術を活用して、ＣＮＳ細胞表面分子の包括的なカタログを生成する戦略を考案した。ロングリードシークエンシングは、完全長転写物の同定に理想的であるが、利用可能なシークエンシング深度は、アイソフォームの多様性の全範囲を明らかにするのに十分ではない27~30。この制限を克服するために、本発明者らは、標的化ｃＤＮＡが既知のエクソンに対するビオチン化プローブでプルダウンされる、ショートリードシークエンシングからの戦略を採用した31、32。このアプローチにより、ロングリードカバレッジが大幅に改善され、標的化遺伝子によってコードされるアイソフォームの予想外に豊富な多様性が明らかになった。これらの複雑なデータセットを理解するために、本発明者らは、アイソフォームの分類および比較のための、ならびにショートリードＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用したそれらの発現パターンを決定するためのバイオインフォマティクスツールを開発した。これらの方法を使用して、本発明者らは、網膜症の処置に大きな可能性を提供する新規のＣｒｂ１アイソフォームを同定することができた。
【0014】
組成物
ｉ．ポリヌクレオチド配列、ベクターおよび単離タンパク質
眼障害に対する遺伝子治療プロトコルは、局所発現のために、眼の細胞（例えば、網膜の細胞）へのポリヌクレオチドまたはベクターの局所的送達を必要とする。これらの疾患の処置標的となる細胞には、とりわけ、眼の１種または複数の細胞（例えば、光受容体、眼球ニューロンなど）を含んでもよい。本開示のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、組成物、方法、システムおよびキットは、少なくとも部分的に、Ｃｒｂ１１Ｂと呼ばれる遺伝子Ｃｒｂ１のある特定の未知のアイソフォームが網膜光受容体においてのみ発現するという発見に基づく。Ｃｒｂ１－Ｂアイソフォームは、例えば、以下を含む多くの理由のために、Ｃｒｂ１遺伝子置換療法の魅力的な候補であることが本発明者らによって見出された：（ｉ）サイズ；（ｉｉ）網膜光受容体におけるそれらの局所的発現－網膜ジストロフィーにおいて変性する細胞型；（ｉｉｉ）固有のプロモーター、および固有の第１および最終コーディングエクソンの存在により、Ｃｒｂ１－Ｂアイソフォームは他のアイソフォームと機能的に区別される；（ｉｖ）網膜における他のＣｒｂ１アイソフォームよりも発現が増加しており（例えば、Ｃｒｂ１－Ｂは約１０倍高く発現している）、置換して視力を救援するそれらの機能が最も重要であり得ることを示唆している。例で実証されているように、ＣＲＢ１－Ｂは網膜光受容体で発現する大部分のアイソフォームであり、他のアイソフォームは他の網膜細胞型で発現する（例えば、ＣＲＢ１－Ａはミュラー細胞で発現することが見出される）。したがって、対象の光受容体内でのＣＲＢ１－Ｂタンパク質のトランス発現は、それ自体で、光受容体機能を保持し、対象の視力を維持するのに十分である。
ｉ．ポリヌクレオチド配列、ベクターおよび単離タンパク質
眼障害に対する遺伝子治療プロトコルは、局所発現のために、眼の細胞（例えば、網膜の細胞）へのポリヌクレオチドまたはベクターの局所的送達を必要とする。これらの疾患の処置標的となる細胞には、とりわけ、眼の１種または複数の細胞（例えば、光受容体、眼球ニューロンなど）を含んでもよい。本開示のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、組成物、方法、システムおよびキットは、少なくとも部分的に、Ｃｒｂ１１Ｂと呼ばれる遺伝子Ｃｒｂ１のある特定の未知のアイソフォームが網膜光受容体においてのみ発現するという発見に基づく。Ｃｒｂ１－Ｂアイソフォームは、例えば、以下を含む多くの理由のために、Ｃｒｂ１遺伝子置換療法の魅力的な候補であることが本発明者らによって見出された：（ｉ）サイズ；（ｉｉ）網膜光受容体におけるそれらの局所的発現－網膜ジストロフィーにおいて変性する細胞型；（ｉｉｉ）固有のプロモーター、および固有の第１および最終コーディングエクソンの存在により、Ｃｒｂ１－Ｂアイソフォームは他のアイソフォームと機能的に区別される；（ｉｖ）網膜における他のＣｒｂ１アイソフォームよりも発現が増加しており（例えば、Ｃｒｂ１－Ｂは約１０倍高く発現している）、置換して視力を救援するそれらの機能が最も重要であり得ることを示唆している。例で実証されているように、ＣＲＢ１－Ｂは網膜光受容体で発現する大部分のアイソフォームであり、他のアイソフォームは他の網膜細胞型で発現する（例えば、ＣＲＢ１－Ａはミュラー細胞で発現することが見出される）。したがって、対象の光受容体内でのＣＲＢ１－Ｂタンパク質のトランス発現は、それ自体で、光受容体機能を保持し、対象の視力を維持するのに十分である。
【0015】
一実施形態では、本技術は、配列番号１（ヒトＣＲＢ１－Ｂタンパク質）を含むクラムス１－Ｂ（ＣＲＢ１－Ｂ）アイソフォームをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、網膜細胞においてアイソフォームを発現することができる異種プロモーターに作動可能に連結された、単離ポリヌクレオチドを提供する。ＣＲＢ１－Ｂアイソフォームは、光受容細胞において、主に内節および外節内で特異的に発現する。この局在化は、ＯＬＭ内のミュラー細胞の頂端に局在化されたＣＲＢ１－Ａとは著しく対照的である（図６Ｅを参照のこと）。一実施形態では、ＣＲＢ１－Ｂアイソフォームをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２である。
【0016】
他の実施形態では、本技術は、ヒトクラムス１遺伝子の他のアイソフォームをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、ポリヌクレオチド配列（配列番号４）は、配列番号５（ヒトＣＲＢ１－Ａタンパク質）を含むクラムス１－Ａ（ＣＲＢ１－Ａ）アイソフォームをコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列（配列番号６）は、配列番号７（ヒトＣＲＢ１－Ｃタンパク質）を含むクラムス１－Ｃ（ＣＲＢ１－Ｃ）アイソフォームをコードする。
【0017】
さらなる実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、マウスクラムス１遺伝子のアイソフォームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチド配列（配列番号８）は、配列番号９（マウスＣＲＢ１－Ａタンパク質）を含むクラムス１－Ａ（ＣＲＢ１－Ａ）アイソフォームをコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列（配列番号１０）は、配列番号１１（マウスＣＲＢ１－Ｂタンパク質）を含むクラムス１－Ｂ（ＣＲＢ１－Ｂ）アイソフォームをコードする。さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列（配列番号１２）は、配列番号１３（マウスＣＲＢ１－Ｃタンパク質）を含むクラムス１－Ｃ（ＣＲＢ１－Ｃ）アイソフォームをコードする。なおさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、クラムス１－Ａ２（ＣＲＢ１－Ａ２）タンパク質をコードする。
【0018】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、または多本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、あるいは他の天然の、化学的にもしくは生化学的に修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基が含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（典型的に、ＲＮＡもしくはＤＮＡに見られることがある）、または修飾もしくは置換された糖またはリン酸基を含むことができる。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホルアミデートなどの合成サブユニットのポリマーを含み得、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデート（Ｐ－ＮＨ2）または混合ホスホルアミデート－ホスホジエステルオリゴマーであり得る。加えて、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成して適切な条件下で鎖をアニーリングすることによるか、または適切なプライマーを用いたＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖をデノボ合成することにより、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から得ることができる。本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列は、目的のＣＲＢ１アイソフォームをコードするｃＤＮＡとして提供される。
【0019】
本明細書で使用される場合、「治療」剤（例えば、治療用ポリペプチド、核酸、または導入遺伝子）は、上記の例示的な臨床結果などの有益なまたは所望の臨床結果を提供するものである。したがって、治療剤は、本明細書に記載の処置に使用することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｃｒｂ１アイソフォームを含む。好ましい実施形態では、Ｃｒｂ１アイソフォームはＣｒｂ１－Ｂである。別の実施形態では、アイソフォームは、Ｃｒｂ１－Ａ、Ｃｒｂ１－Ａ２、Ｃｒｂ１－Ｂ、Ｃｒｂ１－Ｃおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0020】
「異種」とは、それが比較される、またはそれが導入されるもしくは組み込まれる実体の残りのものとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる細胞型に導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（そして、発現する場合、異種ポリペプチドをコードすることができる）。同様に、ウイルスベクターに組み込まれる細胞配列（例えば、遺伝子またはその一部）は、そのベクターに対する異種ヌクレオチド配列である。「導入遺伝子」という用語は、細胞に導入され、ＲＮＡに転写され、任意に、適切な条件下で翻訳されおよび／または発現することができるポリヌクレオチドを指す。態様では、導入遺伝子は、それが導入された細胞に所望の特性を付与するか、別様に、所望の治療的または診断的結果をもたらす。別の態様では、導入遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡなどの、ＲＮＡ干渉を媒介する分子に転写され得る。本発明で使用するための導入遺伝子は、Ｃｒｂ１のアイソフォーム、好ましくはＣｒｂ１－Ｂである。
【0021】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、物質がその元の環境（例えば、それが天然に存在している場合は自然環境）から除去されることを意味する。例えば、生きている微生物に存在している天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、天然系に共存する物質の一部またはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが単離される。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そのようなベクターまたは組成物はその自然環境の一部ではないという点でさらに単離され得る。
したがって、本開示の別の態様において、Ｃｒｂ１アイソフォームを含み、ＣＲＢ１－Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、それからなる、またはそれから本質的になる組換えベクターを提供する。
したがって、本開示の別の態様において、Ｃｒｂ１アイソフォームを含み、ＣＲＢ１－Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、それからなる、またはそれから本質的になる組換えベクターを提供する。
【0022】
「ベクター」または「組換えベクター」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるべき核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。ベクターは、それが連結されている別の核酸を伝搬することができる核酸分子であり得、「発現ベクター」という用語を含む。ベクターはまた、その任意の医薬組成物（例えば、本明細書で提供される組換えベクターおよび薬学的に許容される担体／賦形剤）を含む。ベクターという用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。発現ベクターを含むベクターは、本明細書に記載のＣＲＢ１－Ｂアイソフォームをコードするヌクレオチド配列と、ベクターの適切な伝搬およびコードされたポリペプチドの発現に必要な異種配列を含む。異種配列（すなわち、ポリペプチドとは異なる種からの配列）は、ポリペプチドの発現を可能にする異種プロモーターまたは異種転写調節領域を含むことができる。本明細書で使用される場合、「異種プロモーター」、「プロモーター」、「プロモーター領域」、または「プロモーター配列」という用語は、一般に、遺伝子の転写調節領域を指し、これは、本明細書に記載のポリヌクレオチドの５’または３’側、またはポリヌクレオチドのコード領域内、またはポリヌクレオチドのイントロン内に見出すことができる。典型的には、プロモーターは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始できるＤＮＡ調節領域である。典型的な５’プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって境界が定められ、上流（５’方向）に伸びて、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基または要素を含む。プロモーター配列内には、転写開始部位、およびＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。網膜細胞においてＣＲＢ１－Ｂを発現することができる任意のプロモーターは、本発明の実施において使用されることが企図されている。
【0023】
いくつかの実施形態では、組換えベクターは、クラムス１－Ｂ（ＣＲＢ１－Ｂ）アイソフォームをコードするポリヌクレオチドを含み、ＣＲＢ１－Ｂアイソフォームは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、２つのＥＧＦドメイン、ｌａｍＧドメイン、ＥＧＦドメイン、ｌａｍＧドメイン、ＥＧＦドメイン、ｌａｍＧドメイン、および４つのＥＧＦドメイン（これらのドメインに注釈が付けられたＣＲＢ１－Ｂタンパク質配列については図１６を参照のこと）を含むか、またはそれからなる細胞外ポリペプチドに連結されたＮ末端シグナルペプチドを含み；細胞外ポリペプチドのＣ末端は、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むＣ末端ドメインに連結されている。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、網膜細胞においてアイソフォームを発現することができる異種プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、細胞外ポリペプチドは、ＣＲＢ１－Ａアイソフォームの９番目のＥＧＦドメインのＮ末端から、ＣＲＢ１－Ａアイソフォームの１６番目のＥＧＦドメインのＣ末端まで伸びている。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ドメインは、ＶＳＳＬＳＦＹＶＳＬＬＦＷＱＮＬＦＱＬＬＳＹＬＩＬＲＭＮＤＥＰＶＶＥＷＧＥＱＥＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む。
【0024】
本明細書で使用される場合、「ＥＧＦドメイン」（「ＥＧＦ様ドメイン」とも呼ばれる）という用語は、進化的に保存されたタンパク質ドメインであり、その名称は、それが最初に記載された上皮成長因子に由来する。ＥＧＦ様ドメインのほとんどの発生は、膜結合タンパク質の細胞外ドメインに、または分泌されることが知られているタンパク質に見出される。ＥＧＦ様ドメインの主な構造は、二本鎖のβシートとそれに続く短いＣ末端の二本鎖のβシートへのループである。ＥＧＦ様ドメインは、タンパク質内の多数のタンデムコピーで頻繁に生じ、典型的には一緒に折りたたまれて単一の線形ソレノイドドメインブロックを形成する。好適なＥＧＦドメインには、これらに限定されないが、ヒトＣＲＢ１－Ｂアイソフォーム内に見出されるＥＧＦドメインである配列番号１４～２０および配列番号５２が含まれる。
【0025】
本明細書で使用される場合、「ラミニン球状（Ｇ）ドメイン」および「ｌａｍＧドメイン」という用語は、ラミニンタンパク質ファミリーの種々のメンバーならびに多数の他の細胞外タンパク質に見出されるドメインを指すために交換可能に使用される。好適なｌａｍＧドメインには、これらに限定されないが、ヒトＣＲＢ１－Ｂアイソフォーム内に見出されるｌａｍＧドメインである配列番号２１～２３が含まれる。
「Ｎ末端シグナルペプチド」（一般に「シグナルペプチド」、「シグナル配列」、または「リーダーペプチド」とも呼ばれる）という用語は、細胞の分泌経路内でタンパク質を標的とすることによりタンパク質の細胞局在化を導くタンパク質のＮ末端に存在する短いペプチドを指す。「細胞外ポリペプチド」という用語は、細胞外空間の細胞の外側（すなわち、原形質膜の外側）に局在するポリペプチドまたはその一部を指す。
「Ｎ末端シグナルペプチド」（一般に「シグナルペプチド」、「シグナル配列」、または「リーダーペプチド」とも呼ばれる）という用語は、細胞の分泌経路内でタンパク質を標的とすることによりタンパク質の細胞局在化を導くタンパク質のＮ末端に存在する短いペプチドを指す。「細胞外ポリペプチド」という用語は、細胞外空間の細胞の外側（すなわち、原形質膜の外側）に局在するポリペプチドまたはその一部を指す。
【0026】
したがって、本開示の別の態様は、Ｃｒｂ１－Ａ、Ｃｒｂ１－Ａ２、Ｃｒｂ１－Ｂ、Ｃｒｂ１－Ｃおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣｒｂ１アイソフォームを含むポリヌクレオチドを含む、それからなる、またはそれから本質的になる組換えベクターを提供する。一実施形態では、Ｃｒｂ１アイソフォームは、Ｃｒｂ１－Ａを含む。別の実施形態では、Ｃｒｂ１アイソフォームは、Ｃｒｂ１－Ａ２を含む。別の実施形態では、Ｃｒｂ１アイソフォームは、Ｃｒｂ１－Ｂを含む。さらに別の実施形態では、Ｃｒｂ１アイソフォームは、Ｃｒｂ１－Ｃを含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターを含む。本明細書で使用されるウイルスベクターという用語はまた、細胞（例えば、細胞株）内でのウイルスベクターの発現によって産生されるウイルスベクターを含有するウイルス粒子を含み、細胞は、ウイルス粒子（すなわち、ビリオン）を含有するウイルスベクターを産生する。ウイルス粒子は、それが導入される細胞において目的のアイソフォームをコードし、発現させることができるウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを含む。したがって、「ウイルスベクター」という用語は、宿主細胞、好ましくは網膜細胞において目的のアイソフォームを発現することができるウイルスベクターを含有する成熟ウイルス粒子を含む。ウイルスベクターの宿主細胞、好ましくは網膜細胞への導入または形質導入によって、宿主細胞内のコードされたＣＲＢ１－Ｂアイソフォームの発現が可能になる。ウイルスベクターをビリオン（すなわち、粒子）にパッケージングする方法は、当技術分野において既知である。好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。レトロウイルス、レンチウイルス、ＨＳＶベクター、またはセムリキ－フォレスト－ウイルスベクターおよびアデノウイルスを含む他の遺伝子送達ベクターも使用することができ、本発明の一部であると考えられることが理解される。ＡＡＶベクターの利点は、それらが一般に１ｍｌあたり約１０14のウイルス粒子の力価に濃縮され得ることであり、これは、患者においてより多くの標的細胞、例えば網膜細胞を形質導入する可能性を有するベクターのレベルである。さらに、ＡＡＶ系ベクターは良好に確立された安全性の記録を有し、標的細胞ゲノムに有意なレベルで統合されないため、有害な遺伝子の挿入活性化または必要な遺伝子の非活性化の可能性が回避される。したがって、ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターを含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、網膜において発現するプロモーター配列の制御下にある。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１種または複数の網膜細胞型におけるポリヌクレオチドの発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、光受容細胞、網膜色素上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞、および／または神経節細胞からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、網膜細胞は、光受容細胞を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、とりわけ、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、およびニワトリβ－アクチン（ＣＢＡプロモーター）からなる群から選択される。
【0029】
例えば、一実施形態では、ＣＲＢ１－Ｂをコードする単離ポリヌクレオチドまたは組換えベクターの標的細胞は、網膜の光受容細胞である。別の例では、単離ポリヌクレオチドまたは組換えベクターは、ＣＲＢ１－Ａをコードし、標的細胞はミュラー細胞である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のベクターを組み合わせて使用してもよく、あるベクターは、ＣＲＢ１－Ｂアイソフォームをコードし、１つまたは複数のその他のベクターは、その他のＣｒｂアイソフォームのうちの１つ、例えば、ＣＲＢ１－Ａ、ＣＲＢ１－Ａ２、またはＣＲＢ－Ｃをコードする。
「組換えウイルスベクター」は、１つまたは複数の異種配列（すなわち、ウイルス起源ではない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを指す。組換えＡＡＶベクターの場合、組換え核酸は少なくとも１つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、２つのＩＴＲに隣接している。
「組換えウイルスベクター」は、１つまたは複数の異種配列（すなわち、ウイルス起源ではない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを指す。組換えＡＡＶベクターの場合、組換え核酸は少なくとも１つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、２つのＩＴＲに隣接している。
【0030】
「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は、少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する１つまたは複数の異種配列（すなわち、ＡＡＶ起源ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。このようなｒＡＡＶベクターは、好適なヘルパーウイルスに感染した（または好適なヘルパー機能を発現している）宿主細胞中に存在し、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわちＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現している場合、このようなｒＡＡＶベクターを複製して感染性ウイルス粒子にパッケージングすることができる。ｒＡＡＶベクターがより大きなポリヌクレオチドに（例えば、染色体に、またはクローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの別のベクターに）組み込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは「プロベクター」と呼ばれることがあり、これは、ＡＡＶパッケージング機能および好適なヘルパー機能の存在下での複製およびキャプシド形成によって「救援され」得る。ｒＡＡＶベクターは、プラスミド、直鎖人工染色体、脂質と複合体化されたもの、リポソーム内にカプセル化されたもの、ウイルス粒子、例えば、ＡＡＶ粒子にキャプシド化されたものを含むがこれらに限定されない、複数の形態のいずれかであり得る。ｒＡＡＶベクターをＡＡＶウイルスキャプシドにパッケージングして、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生成することができる。ＡＡＶを作製するための方法およびキットが当技術分野において既知であり、例えば、限定されものではないが、ＡｄＥａｓｙクローニングシステム（例えば、ＱＢｉｏｇｅｎｅ ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）がある。対応するベクターおよびヘルパーベクターは、当技術分野で広く知られている（Nicklin S A, Baker A H, Curr Gene Ther., 2002, 2: 273-93; Mah et al., Clin Pharmacokinet., 2002, 41: 901-11）。
【0031】
「ｒＡＡＶウイルス」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質およびキャプシド化されたｒＡＡＶベクターゲノムで構成されるウイルス粒子を指す。
いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つまたは２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する導入遺伝子を含む。核酸は、ＡＡＶ粒子内にキャプシド化されている。ＡＡＶベクターはまた、キャプシドタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、転写の方向に作動可能に連結された目的の成分のコード配列（例えば、Ｃｒｂ１－Ａ、Ｃｒｂ１－Ａ２、Ｃｒｂ１－Ｂ、Ｃｒｂ１－Ｃ、好ましくはＣｒｂ１－Ｂ）、制御配列、例えば転写開始および終結配列を含み、それにより発現カセットを形成する。
いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つまたは２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する導入遺伝子を含む。核酸は、ＡＡＶ粒子内にキャプシド化されている。ＡＡＶベクターはまた、キャプシドタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、転写の方向に作動可能に連結された目的の成分のコード配列（例えば、Ｃｒｂ１－Ａ、Ｃｒｂ１－Ａ２、Ｃｒｂ１－Ｂ、Ｃｒｂ１－Ｃ、好ましくはＣｒｂ１－Ｂ）、制御配列、例えば転写開始および終結配列を含み、それにより発現カセットを形成する。
【0032】
いくつかの実施形態では、発現カセットは、少なくとも１つの機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列によって５’および３’末端部に隣接している。「機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列」とは、ＩＴＲ配列が、ＡＡＶビリオンの救援、複製、およびパッケージングを目的とするものとして機能することを意味する。Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32；Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40；およびPechan i., Gene Ther., 2009, 16:10-16を参照のこと、これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示のいくつかの態様を実施するために、組換えベクターは、キャプシド形成に必須のＡＡＶの配列の少なくともすべて、およびｒＡＡＶによる感染のための物理的構造を含む。本開示のベクターで使用するためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく（例えば、Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801に記載されているように）、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって変更される場合があり、またはＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来する場合がある。４０を超えるＡＡＶの血清型が現在知られており、新しい血清型および既存の血清型のバリアントが引き続き同定されている。Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6;Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6；およびBossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810を参照のこと。
【0033】
任意のＡＡＶ血清型の使用は、本開示の範囲内であると考えられる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型に由来するベクターであり、例えば、限定されないが、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ ＩＴＲ、ＡＡＶ ＤＪ ＩＴＲ、ヤギＡＡＶ ＩＴＲ、ウシＡＡＶ ＩＴＲ、またはマウスＡＡＶ ＩＴＲ、などである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ中の核酸には、ＡＡＶ ＩＴＲのうちの１つのＩＴＲが含まれ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９（Aschauer et al., 2013）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶなどである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ中の核酸には、ＡＡＶ２ ＩＴＲが含まれる。いくつかの実施形態では、ベクターは、スタッファー核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態では、スタッファー核酸は、プロモーターと、ＣＲＢ１－Ｂアイソフォームをコードする核酸との間に位置し得る。
【0034】
例えばトランスフェクション、安定な細胞株産生、および感染性ハイブリッドウイルス産生システムなどの、ｒＡＡＶベクターを含むウイルスベクターの産生のための多くの方法が当技術分野において既知である。それらのシステムの一部には、例えば、アデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド（Conway, J E et al., (1997) J. Virology 71(11):8780-8789）、およびバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。ｒＡＡＶウイルス粒子の産生のためのｒＡＡＶ産生培養にはすべて；１）好適な宿主細胞であって、例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、または２９３細胞などのヒト由来細胞株、またはバキュロウイルス産生システムの場合はＳＦ－９などの昆虫由来細胞株を含む宿主細胞；２）好適なヘルパーウイルス機能であって、野生型または変異型アデノウイルス（温度感受性アデノウイルスなど）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミド構築物によって提供されるヘルパーウイルス機能；３）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子および遺伝子産物；４）少なくとも１つのＡＡＶＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子（治療用導入遺伝子など）；ならびに５）ｒＡＡＶ産生を支持するための好適な培地および培地成分が必要である。当技術分野において既知の好適な培地を、ｒＡＡＶベクターの産生に使用することができる。これらの培地には、限定されるものではないが、Ｈｙｃｌｏｎｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨによって製造された培地、例えば改良イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）など、特に組換えＡＡＶベクターの産生に使用するためのカスタム培地配合物に関して、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５６６，１１８号に記載されているようなカスタム配合物、および米国特許第６，７２３，５５１号に記載されているＳｆ－９００ＩＩ ＳＦＭ培地が含まれる。
【0035】
本開示によるベクターは、当技術分野で既知である方法を使用して産生することができる。例えば、米国特許第６，５６６，１１８号；同第６，９８９，２６４号；および同第６，９９５，００６号を参照のこと。本発明を実施するに際して、ｒＡＡＶ粒子を産生するための宿主細胞には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物および酵母が含まれる。宿主細胞はまた、ＡＡＶベクターゲノムが安定して維持されている宿主細胞または産生細胞において、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が安定して維持されているパッケージング細胞であり得る。例示的なパッケージングおよび産生細胞は、２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞に由来する。ＡＡＶベクターは、当技術分野で既知である標準的な技術を使用して精製および配合される。
【0036】
いくつかの実施形態では、本開示によるベクターは、以下に提供される例示的なトリプルトランスフェクション（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法などのトリプルトランスフェクション法によって産生され得る。要約すると、ヘルパーアデノウイルスプラスミドとともに、ｒｅｐ遺伝子およびキャプシド遺伝子を含有するプラスミドを（例えば、リン酸カルシウム法を使用して）細胞株（例えば、ＨＥＫ－２９３細胞）にトランスフェクトすることができ、ウイルスを収集することができ、精製してもよい。
【0037】
いくつかの実施形態では、ベクターは、以下に提供される例示的な産生細胞株法などの産生細胞株法によって産生され得る（（Martin et al., (2013)に参照されている）Human Gene Therapy Methods 24:253-26もまた参照のこと）。要約すると、細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞株）を、ｒｅｐ遺伝子、キャプシド遺伝子、およびプロモーター－導入遺伝子配列を含むプラスミドで安定にトランスフェクトすることができる。細胞株をスクリーニングして、ベクター産生のためのリードクローンを選択し、次にこれを産生バイオリアクターに拡大し、ベクター産生を開始するためのヘルパーとしてアデノウイルス（例えば、野生型アデノウイルス）に感染させることができる。続いて、ウイルスを採取することができ、アデノウイルスを不活化（例えば、熱によって）および／または除去することができ、ベクターを精製することができる。
ウイルス力価に関して使用される「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム等価物」、または「ゲノムコピー」という用語は、感染性または機能性に関係なく、組換えＡＡＶ ＤＮＡゲノムを含むビリオンの数を指す。特定のベクター調製物中のゲノム粒子の数は、例えば、Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039;Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278に記載されるような手順により測定され得る。
ウイルス力価に関して使用される「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム等価物」、または「ゲノムコピー」という用語は、感染性または機能性に関係なく、組換えＡＡＶ ＤＮＡゲノムを含むビリオンの数を指す。特定のベクター調製物中のゲノム粒子の数は、例えば、Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039;Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278に記載されるような手順により測定され得る。
【0038】
本明細書で使用される「ベクターゲノム（ｖｇ）」という用語は、ベクター、例えばウイルスベクターのポリヌクレオチド配列のセットを含む１つまたは複数のポリヌクレオチドを指し得る。ベクターゲノムは、ウイルス粒子にキャプシド化されていてもよい。特定のウイルスベクターに応じて、ベクターゲノムは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、または一本鎖ＲＮＡ、もしくは二本鎖ＲＮＡを含み得る。ベクターゲノムは、特定のウイルスベクターに関連する内因性配列および／または組換え技術を介して特定のウイルスベクターに挿入された任意の異種配列を含み得る。例えば、組換えＡＡＶベクターゲノムは、プロモーター、スタッファー、目的の配列（例えば、ＲＮＡｉ）、およびポリアデニル化配列に隣接する少なくとも１つのＩＴＲ配列を含み得る。完全なベクターゲノムは、ベクターのポリヌクレオチド配列の完全なセットを含み得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの核酸力価は、ｖｇ／ｍＬに関して測定され得る。別の実施形態では、例えば、ＡＡＶベクターの使用において、ウイルス力価は、成熟したエンベロープＡＡＶ粒子が完全に形成されていないＡＡＶ粒子から計数されるので、ＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）に関して測定され得る。この力価を測定するのに好適な方法は、当技術分野において既知である（例えば、定量的ＰＣＲ）。
【0039】
プロモーター
いくつかの実施形態では、本開示の核酸（ポリヌクレオチド）（例えば、Ｃｒｂ１アイソフォームＢ、および他の実施形態において、Ｃｒｂ１アイソフォームＡ、Ａ２および／またはＣ）は、プロモーターに作動可能に連結されている。プロモーターは、構成的、誘導的、または抑制可能なプロモーターであり得る。好ましくは、プロモーターは、標的細胞内のポリヌクレオチドにコードされているアイソフォームを発現することができる。例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよびＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Niwa et al., Gene, 1991, 108(2):193-9）および伸長因子１－αプロモーター（ＥＦ１－α）プロモーター（Kim et al., Gene, 1990, 91(2):217-23 and Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示の核酸（ポリヌクレオチド）（例えば、Ｃｒｂ１アイソフォームＢ、および他の実施形態において、Ｃｒｂ１アイソフォームＡ、Ａ２および／またはＣ）は、プロモーターに作動可能に連結されている。プロモーターは、構成的、誘導的、または抑制可能なプロモーターであり得る。好ましくは、プロモーターは、標的細胞内のポリヌクレオチドにコードされているアイソフォームを発現することができる。例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよびＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Niwa et al., Gene, 1991, 108(2):193-9）および伸長因子１－αプロモーター（ＥＦ１－α）プロモーター（Kim et al., Gene, 1990, 91(2):217-23 and Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0040】
本明細書で使用される場合、プロモーターは、第２のポリヌクレオチド配列と機能的関係に置かれる場合、「作動可能に接続される」か、または「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターがポリヌクレオチドに接続されている場合、プロモーターは、ポリヌクレオチドコード配列の転写に影響を及ぼし得るように、ポリヌクレオチドに作動可能に接続されている。種々の実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも１０のプロモーターに作動可能に連結され得る。
【0041】
有利には、プロモーターは、網膜細胞における遺伝子発現を駆動する組織特異的プロモーターである。多数の網膜特異的プロモーターが、当技術分野において既知である。例えば、ヒトロドプシンキナーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ６０１１）に由来するロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター（配列番号２４）は、桿体および錐体光受容細胞、ならびにＷＥＲＩ Ｒｂ－１などの網膜細胞株で特異的に発現を駆動することが示されている（Khani, S. C., et al. (2007) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48(9):3954-61）。本明細書で使用される場合、「ロドプシンキナーゼプロモーター」は、Khani, S. C., et al. (2007) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48(9):3954-61およびYoung, J. E., et al. (2003) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44(9):4076-85、に記載されている配列などの、光受容体特異的発現を駆動するのに十分なプロモーター配列全体またはプロモーター配列の断片を指すことがある。いくつかの実施形態では、ＲＫプロモーターは、転写開始部位に対して－１１２～＋１８０の範囲にわたる。
【0042】
オプシンプロモーターおよびその誘導体もまた、網膜特異的遺伝子発現を駆動するために一般的に使用されている。例えば、最小プロモーターはマウスオプシン遺伝子（配列番号２５）に由来し、光受容体における強力な発現を駆動することが示されている（Pawlyk, B. S., et al. (2005) Invest Ophthalmol Vis Sci, 46 (9), 3039-45）。したがって、いくつかの実施形態では、プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーターまたはオプシンプロモーターである。
【0043】
あるいは、プロモーターは、組織特異的ではない構成的プロモーターであり得る。高レベルの遺伝子発現が望ましい場合、そのようなプロモーターの使用は有利であり得る。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（配列番号２６）は、強力な構成的プロモーターとして十分に特徴付けられているため、哺乳動物細胞を遺伝子操作するために使用されるベクターに一般的に含まれている（Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)）。一般的に使用される構成的プロモーターの別の例は、「ＣＡＧプロモーター」としても知られているニワトリβ－アクチンプロモーター（配列番号２７）である（定義を参照のこと；Miyazaki, J., et al. (1989) Gene 79(2):269-77)）。ＣＡＧプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント、プロモーター、ニワトリベータアクチン遺伝子の第１のエクソンと第１のイントロン、およびウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターを組み合わせて形成された強力な合成プロモーターである。したがって、いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはニワトリβ－アクチン（ＣＡＧプロモーター）である。６９５０２４１２本明細書で使用されるように、「ＣＡＧプロモーター」という用語は、「ＣＢＡプロモーター」と交換可能に使用され得る。
【0044】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターに連結されたヒトβ－グルクロニダーゼプロモーターまたはサイトメガロウイルスエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＢＡプロモーターに作動可能に連結された本開示の異種導入遺伝子をコードする核酸を含む組換えベクターを提供する。例示的なプロモーターおよび説明は、例えば、U.S. PG Pub. 20140335054に見出すことができる。
【0045】
構成的プロモーターの例としては、限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーとともに）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーとともに）［例えば、Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)を参照のこと］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が挙げられる。
【0046】
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度などの環境因子もしくは特定の生理学的状態の存在、例えば急性期、細胞の特定の分化状態によって、または複製細胞のみにおいて調節され得る。誘導性プロモーターおよび誘導系には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを含むがこれらに限定されない、さまざまな商業的供給源から入手可能である。他の多くの系が記載されており、当業者によって容易に選択され得る。外因的に供給されるプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）によって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)）、テトラサイクリン抑制系（Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)）、テトラサイクリン誘導系（Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)、Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)もまた参照のこと）、ＲＵ４８６誘導系（Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)およびWang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)）およびラパマイシン誘導系（Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)）が挙げられる。さらにこれに関連して有用であり得る他の種類の誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって、または複製細胞のみにおいて調節されるものである。
【0047】
網膜細胞で発現することができるＡＡＶベクターで使用するのに好適なプロモーターは、例えば、「Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates, and humans」、Juttner et. al, bioRxiv 434720;doi: doi.org/10.1101/434720 (Oct. 2018)におけるＴａｂｌｅ Ｓ１を参照のこと、現在Nature Neuroscience doi: 10.1038/s41593-019-0431-2にて公開されており、参照により全体が組み込まれている、に見られるように、当技術分野において既知である。
【0048】
別の実施形態では、導入遺伝子のためのネイティブプロモーターまたはその断片を使用する。導入遺伝子の発現がネイティブ発現を模倣することが望まれる場合、ネイティブプロモーターを使用することができる。導入遺伝子の発現を、時間的または発生的に、または組織特異的に、または特定の転写刺激に応答して調節しなければならない場合、ネイティブプロモーターを使用することができる。さらなる実施形態では、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはコザックコンセンサス配列などの他のネイティブ発現制御エレメントもまた、ネイティブ発現を模倣するために使用され得る。
【0049】
いくつかの態様では、本開示は、ＣＲＢ１－Ｂアイソフォーム（例えば、配列番号１）を含むか、またはそれからなる単離ポリペプチドを提供する。好適には、単離ポリペプチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはベクターから発現することがある。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用され、最小長に限定されない。アミノ酸残基のそのようなポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含有することができ、これらに限定されないが、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、および多量体を含む。完全長タンパク質およびその断片の両方が定義に包含される。これらの用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、そのタンパク質が所望の活性を維持する限り、ネイティブ配列に対する欠失、付加、および置換（一般に本質的に保存的）などの改変を含むタンパク質を指す。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるように意図的であっても、タンパク質を産生する宿主の変異またはＰＣＲ増幅に起因する誤差によるように偶発的なものであってもよい。
【0050】
ポリヌクレオチド配列の「実質的な同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、本明細書に記載の目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。あるいは、パーセント同一性は、９５％から１００％までの任意の整数であり得る。一実施形態では、配列同一性は、少なくとも９５％、あるいは少なくとも９９％である。より好ましい実施形態には、本明細書に記載のプログラム；好ましくは、記載のように標準パラメータを使用するＢＬＡＳＴを使用する参照配列と比較して、少なくとも：９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が含まれる。これらの値を適切に調整して、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置決めなどを考慮に入れることにより、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定することができる。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の目的のためのアミノ酸配列の「実質的な同一性」という用語は、少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは９９％または１００％のポリペプチド配列同一性を意味する。ポリペプチドの好ましいパーセント同一性は、９５％から１００％までの任意の整数であり得る。より好ましい実施形態には、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が含まれる。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の目的のためのアミノ酸配列の「実質的な同一性」という用語は、少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは９９％または１００％のポリペプチド配列同一性を意味する。ポリペプチドの好ましいパーセント同一性は、９５％から１００％までの任意の整数であり得る。より好ましい実施形態には、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が含まれる。
【0051】
ｉｉｉ．医薬組成物
本開示は医薬組成物をさらに提供する。医薬組成物は、ＣＲＢ１アイソフォームをコードする単離ポリヌクレオチド、ＣＲＢ１アイソフォーム、好ましくは本明細書に記載のＣＲＢ１－Ｂアイソフォームをコードする組換えベクター、および薬学的に許容される担体を含むか、またはそれらからなり得る。一例では、医薬組成物は、ＣＲＢ１－Ｂアイソフォームをコードするウイルスベクターを含み得る。医薬組成物は、約１×１０6 ＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）／ｍｌ～約１×１０14 ＤＲＰ／ｍｌの濃度で、ウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶウイルスベクターを含むことができる。ＣＲＢ１－Ａ、ＣＲＢ１－Ａ２、ＣＲＢ１－Ｃ、またはそれらの組み合わせをコードする第２のベクターをさらに含む、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
本開示は医薬組成物をさらに提供する。医薬組成物は、ＣＲＢ１アイソフォームをコードする単離ポリヌクレオチド、ＣＲＢ１アイソフォーム、好ましくは本明細書に記載のＣＲＢ１－Ｂアイソフォームをコードする組換えベクター、および薬学的に許容される担体を含むか、またはそれらからなり得る。一例では、医薬組成物は、ＣＲＢ１－Ｂアイソフォームをコードするウイルスベクターを含み得る。医薬組成物は、約１×１０6 ＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）／ｍｌ～約１×１０14 ＤＲＰ／ｍｌの濃度で、ウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶウイルスベクターを含むことができる。ＣＲＢ１－Ａ、ＣＲＢ１－Ａ２、ＣＲＢ１－Ｃ、またはそれらの組み合わせをコードする第２のベクターをさらに含む、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
【0052】
本開示によるベクターはさらに、医薬組成物の形態であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、緩衝液および／または薬学的に許容される賦形剤および／または薬学的に許容される担体をさらに含み得る。当技術分野で周知であるように、薬学的に許容される賦形剤および／または担体は、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質であり、液体溶液もしくは懸濁液として、エマルジョンとして、または使用前に液体に溶解または懸濁するのに好適な固体形態として供給することができる。薬学的に許容される担体は、所望の投与経路に基づいて選択することができる。例えば、賦形剤は、形態または稠度を与えるか、または希釈剤として作用することができる。好適な賦形剤としては、安定剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、封入剤、ｐＨ緩衝物質、および緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。そのような賦形剤には、過度の毒性なしに投与することができる、眼への直接送達に好適な任意の医薬品が含まれる。好適には、薬学的に許容される担体は、投与前にウイルスベクターのウイルス粒子の完全性を維持するのを助け、例えば、好適なｐＨ平衡溶液を提供する。薬学的に許容される賦形剤には、ソルビトール、種々のＴＷＥＥＮ化合物のいずれか、および水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩としては、例えば、鉱酸塩、例として塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；有機酸の塩、例として酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など、挙げることができる。薬学的に許容される賦形剤の詳細な考察は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub. Co., N.J. 1991)において入手可能である。組成物は、投与前に従来の周知の滅菌技術（例えば、濾過、滅菌剤の添加など）によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近似させるのに必要とされる薬学的に許容される追加の物質、例としてｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有してもよい。
【0053】
眼への送達に関連するいくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体としては、例えば減菌液体、例えば、水、および石油、動物、植物または合成由来のものを含む油、例として、ピーナッツ油、大豆油、鉱油などが挙げられる。生理食塩水ならびにデキストロース水溶液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグリセロール溶液も、特に注射用溶液のために、液体担体として用いることができる。追加の成分、例えば、防腐剤、緩衝液、等張剤、抗酸化剤および安定剤、非イオン性湿潤または清澄剤、増粘剤なども使用することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、網膜下注射による投与のために製剤化される。したがって、これらの組成物は、生理食塩水、リンゲルの平衡塩類溶液（ｐＨ７．４）などの薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせることができる。必須ではないが、組成物を、正確な量の投与に好適な単位剤形で任意に供給してもよい。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、網膜下注射による投与のために製剤化される。したがって、これらの組成物は、生理食塩水、リンゲルの平衡塩類溶液（ｐＨ７．４）などの薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせることができる。必須ではないが、組成物を、正確な量の投与に好適な単位剤形で任意に供給してもよい。
【0054】
他の実施形態では、本開示の医薬組成物は、眼への局所投与のために製剤化される。そのような実施形態では、従来の眼内送達試薬を使用することができる。例えば、局所眼内送達のための本開示の医薬組成物は、上記のような生理食塩水、角膜浸透促進剤、不溶性粒子、ワセリンまたは他のゲルベースの軟膏、眼への滴下注入時に粘度が増加するポリマー、または粘膜付着性ポリマーを含み得る。好ましくは、眼内送達試薬は、粘度効果を通じて、または角膜上皮を覆うムチン層との物理化学的相互作用を確立することによって、角膜浸透を増加させるか、またはｓｉＲＮＡの前眼部保持を延長する。
【0055】
処置方法
本開示はさらに、本開示によるポリヌクレオチド、ベクター、および医薬組成物を使用して、対象における眼障害を処置および／または予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、処置の方法は、そのような眼障害のための遺伝子治療プロトコルであり、網膜の細胞への本開示によるポリヌクレオチドまたはベクターの局所的送達を必要とする。そのような実施形態において処置標的となる細胞は、網膜の光受容細胞または神経感覚網膜の下にあるＲＰＥ細胞のいずれかである。したがって、一実施形態では、本開示によるポリヌクレオチドおよびベクターの送達は、網膜とＲＰＥとの間の網膜下腔への注射によって達成される。したがって、本開示の一態様は、対象における眼障害を処置および／または予防する方法であって、本開示による治療有効量のポリヌクレオチド、組換えベクター、または医薬組成物を対象に投与することを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、それにより眼障害が対象において処置される、方法を提供する。好ましくは、ポリヌクレオチドまたは組換えベクターまたはそれを含む医薬組成物は、本明細書に記載のＣＲＢ１－Ｂアイソフォームをコードする。
本開示はさらに、本開示によるポリヌクレオチド、ベクター、および医薬組成物を使用して、対象における眼障害を処置および／または予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、処置の方法は、そのような眼障害のための遺伝子治療プロトコルであり、網膜の細胞への本開示によるポリヌクレオチドまたはベクターの局所的送達を必要とする。そのような実施形態において処置標的となる細胞は、網膜の光受容細胞または神経感覚網膜の下にあるＲＰＥ細胞のいずれかである。したがって、一実施形態では、本開示によるポリヌクレオチドおよびベクターの送達は、網膜とＲＰＥとの間の網膜下腔への注射によって達成される。したがって、本開示の一態様は、対象における眼障害を処置および／または予防する方法であって、本開示による治療有効量のポリヌクレオチド、組換えベクター、または医薬組成物を対象に投与することを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、それにより眼障害が対象において処置される、方法を提供する。好ましくは、ポリヌクレオチドまたは組換えベクターまたはそれを含む医薬組成物は、本明細書に記載のＣＲＢ１－Ｂアイソフォームをコードする。
【0056】
本開示は、それを必要とする対象において視力喪失の進行を低減するか、または視力機能を維持する方法を提供する。この方法は、本明細書に記載の治療有効量の単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物を対象に投与することを含み、それにより視力喪失の進行が低減される。いくつかの実施形態では、視力喪失は、処置が開始されたときの視力レベルと同様のレベルに維持され、例えば、視力は、処置の開始時の視力の約１０％以内に維持される。いかなる理論に拘束されるものではないが、処置を必要とする対象の網膜内の光受容細胞におけるＣＲＢ１－Ｂのトランス発現のレベルの維持によって、光受容細胞の死を減少させ、かつ光受容体－グリア接合部を維持することが可能になり、対象の視力が維持される場合がある。いくつかの実施形態では、単離ポリヌクレオチド、組換えベクターまたは医薬組成物は、硝子体内、網膜下、または局所的に投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象の視覚機能をモニタリングすることをさらに含むことができ、対象の視覚機能は、投与後に維持され、低下しない。視覚機能をモニタリングする方法は、当技術分野において既知であり（以下でさらに説明する）、例えば、対象の視力をモニタリングすることが含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象の視覚機能をモニタリングすることをさらに含むことができ、対象の視覚機能は、投与後に維持され、低下しない。視覚機能をモニタリングする方法は、当技術分野において既知であり（以下でさらに説明する）、例えば、対象の視力をモニタリングすることが含まれる。
【0057】
いくつかの例では、光受容体－グリア接合部でのこのアイソフォームの機能は、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物による処置後に維持される。「投与する」という用語は、単離ポリペプチド、ベクター、または医薬組成物を、対象の網膜内の１つまたは複数の細胞に送達する方法を包含する。好ましい実施形態では、アイソフォームはＣＲＢ１－Ｂであり、１つまたは複数の細胞は網膜内の光受容細胞である。本開示による単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を対象に送達するための好適な技術は、遺伝子銃、エレクトロポレーション、ナノ粒子、ウイルス粒子による形質導入、マイクロカプセル化、遺伝子編集などによるもの、または非経口および経腸投与経路によるものなどの当技術分野において既知の多数の方法を含み得る。好適な非経口投与経路としては、例えば、組織周囲および組織内投与（例えば、網膜内注射もしくは網膜下注射）；新生血管形成部位もしくはその近接した領域への直接（例えば、局所）適用、例えば、カテーテルまたは他の留置デバイス（例えば、角膜ペレットもしくは座薬、点眼器、または多孔性、非多孔性、もしくはゼラチン状の材料を含むインプラント）によるものが挙げられる。好適な留置デバイスには、米国特許第５，９０２，５９８号および同第６，３７５，９７２号に記載の眼用インプラント、ならびに米国特許第６，３３１，３１３号に記載の生分解性眼用インプラントが含まれ、それらの全開示は参照により本明細書に組み込まれる。このような眼用インプラントは、Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ． （Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、Ｍａｓｓ．）およびＯｃｕｌｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． （Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。ある特定の実施形態では、非経口投与経路は、眼内投与を含む。本開示による単離ポリヌクレオチド、ベクターおよび医薬組成物の眼内投与は、投与経路により、単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物が眼に入ることが可能になる限り、眼への注射または直接（例えば、局所）投与によって達成され得ることが理解される。上記の眼への局所投与経路に加えて、好適な眼内投与経路には、硝子体内、網膜内、網膜下、テノン嚢下、眼窩周囲および眼窩後、角膜横断および強膜横断投与が含まれる。そのような眼内投与経路は当業者の範囲内である；例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Acheampong A A et al, 2002, supra;およびBennett et al. (1996), Hum. Gene Ther. 7: 1763-1769 およびAmbati J et al., 2002, Progress in Retinal and Eye Res. 21: 145-151を参照のこと。
【0058】
本明細書で使用される場合、「局所的に」という用語は、眼の表面への適用を意味する。
いくつかの実施形態では、本開示による単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を、網膜下送達を介して対象に投与する。網膜下送達の方法は、当技術分野において既知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／１０５６９０を参照のこと。要約すると、本開示によるベクターを黄斑および中心窩の網膜下に送達するための一般的な方法は、以下の簡単な概要によって説明することができる。この例は、単に本方法のある特定の機能を説明することを意味するものであり、限定することを意味するものではない。
いくつかの実施形態では、本開示による単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を、網膜下送達を介して対象に投与する。網膜下送達の方法は、当技術分野において既知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／１０５６９０を参照のこと。要約すると、本開示によるベクターを黄斑および中心窩の網膜下に送達するための一般的な方法は、以下の簡単な概要によって説明することができる。この例は、単に本方法のある特定の機能を説明することを意味するものであり、限定することを意味するものではない。
【0059】
一般に、それらは、手術顕微鏡を使用した直接観察下で眼内（網膜下）に注射された組成物の形態で送達することができる。この手順は、硝子体切除に続いて、細いカニューレを使用して、１つまたは複数の小さな網膜切開を介して網膜下腔にベクター懸濁液を注射することを含み得る。
【0060】
要約すると、注入カニューレを所定位置に縫合して、手術全体にわたって（例えば、生理食塩水の）注入によって正常な球体容積を維持することができる。硝子体切除は、適切な孔径（例えば、２０～２７ゲージ）のカニューレを使用して実行され、除去される硝子体ゲルの量は、注入カニューレからの生理食塩水または他の等張液の注入によって置き換えられる。硝子体切除が有利に実行されるのは、（１）その皮質（後部硝子体膜）の除去によりカニューレによる網膜の貫通が容易になり；（２）除去および流体（生理食塩水など）との置換により、ベクターの眼内注射に対応する空隙が生じ、（３）制御された除去により、網膜裂孔および予想外の網膜剥離の可能性が低下する、ためである。
【0061】
いくつかの実施形態では、本開示による単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物は、適切な孔径（例えば、２７～４５ゲージ）のカニューレを利用することによって、中心網膜の外側の網膜下腔に直接注射され、したがって、網膜下腔にブレブが生じる。他の実施形態では、本開示による単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物の網膜下注射の前に、中心網膜の外側の網膜下腔に少量（例えば、約０．１～約０．５ｍｌ）の適切な流体（生理食塩水またはリンゲル液など）の網膜下注射を行う。網膜下腔へのこの最初の注射は、網膜下腔内に最初の流体ブレブを確立し、最初のブレブの位置で局所的な網膜剥離を引き起こす。この最初の流体ブレブにより（ベクターおよび／または医薬組成物送達の前に注射面を画定することによって）、単離ポリヌクレオチド、ベクター、および／または医薬組成物の網膜下腔への標的化送達が容易になる可能性があり、脈絡膜への単離ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または医薬組成物の投与の可能性、ならびに硝子体腔への単離ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または医薬組成物の注射または逆流の可能性を最小限に抑えることができる。いくつかの実施形態では、この最初の流体ブレブには、１つまたは複数の単離ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または医薬組成物および／または１つまたは複数の追加の治療剤を含む流体を、同じかまたは追加の細径カニューレを使用して、これらの流体を最初の流体ブレブに直接投与することによって、さらに注射することができる。
【0062】
本開示による単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物、および／または最初の少量の流体の眼内投与を、シリンジに取り付けられた細径カニューレ（例えば、２７～４５ゲージ）を使用して実行することができる。いくつかの実施形態では、このシリンジのプランジャーは、機械化されたデバイスによって、例としてフットペダルの踏み込みなどによって、駆動され得る。細径カニューレは、強膜切開を通って、硝子体腔を横断して、網膜で、標的とされる網膜の領域（ただし、中心網膜の外側）に従って各対象において事前に決定された部位に進められる。直接視覚化の下、単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物懸濁液を、神経感覚網膜下に機械的に注射し、自己密封式非拡張網膜切開による局所的網膜剥離を引き起こす。上記のように、単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を、網膜下腔に直接注射して中心網膜の外側にブレブを作出するか、または単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を中心網膜の外側の最初のブレブに注射して、それを拡大する（そして網膜剥離の領域を拡大する）。いくつかの実施形態では、本開示による単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物の注射の後、ブレブに別の流体を注射する。
【0063】
理論に拘束されることを望むものではないが、網膜下注射の速度および位置は、黄斑、中心窩および／または下にあるＲＰＥ細胞に損傷を与え得る局所的剪断力をもたらす可能性がある。網膜下注射は、剪断力を最小化または回避する速度で実行することができる。いくつかの実施形態では、本開示による単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を、約１５～１７分にわたって注射する。いくつかの実施形態では、ベクターを、約１７～２０分にわたって注射する。いくつかの実施形態では、単離ポリヌクレオチド、ベクター、および／または医薬組成物を、約２０～２２分にわたって注射する。いくつかの実施形態では、単離ポリヌクレオチド、ベクター、および／または医薬組成物を、約３５～約６５μｌ／分の速度で注射する。いくつかの実施形態では、単離ポリヌクレオチド、ベクター、および／または医薬組成物を、約３５μｌ／分の速度で注射する。いくつかの実施形態では、単離ポリヌクレオチド、ベクター、および／または医薬組成物を、約４０μｌ／分の速度で注射する。いくつかの実施形態では、単離ポリヌクレオチド、ベクター、および／または医薬組成物を、約４５μｌ／分の速度で注射する。いくつかの実施形態では、単離ポリヌクレオチド、ベクター、および／または医薬組成物を、約５００分の速度で注射する。いくつかの実施形態では、単離ポリヌクレオチド、ベクター、および／または医薬組成物を、約５５μｌ／分の速度で注射する。いくつかの実施形態では、単離ポリヌクレオチド、ベクター、および／または医薬組成物を、約６０μｌ／分の速度で注射する。いくつかの実施形態では、単離ポリヌクレオチド、ベクター、および／または医薬組成物を、約６５μｌ／分の速度で注射する。当業者は、ブレブの注射の速度および時間は、例えば、ベクターおよび／または医薬組成物の体積、または中心網膜の細胞にアクセスするのに十分な網膜剥離が生じるのに必要なブレブのサイズ、単離ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または医薬組成物を送達するために使用されるカニューレのサイズ、および本発明のカニューレの位置を安全に維持する能力によって導かれることを認識するであろう。
【0064】
本開示のいくつかの実施形態では、網膜の網膜下腔に注射される（溶液中または本明細書で提供される医薬組成物中の）単離ポリヌクレオチドまたはベクターの体積は、約１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、５μｌ、６μｌ、７μｌ、８μｌ、９μｌ、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、もしくは１ｍＬのいずれか１つより大きいか、またはそれらの間の任意の量である。
【0065】
いくつかの実施形態では、方法は、本開示による有効量の単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物の眼への投与（例えば、網膜下および／または硝子体内投与による）を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターが医薬組成物に使用され、組成物のウイルス力価は、少なくとも約５×１０12、６×１０12、７×１０12、８×１０12、９×１０12、１０×１０12、１１×１０12、１５×１０12、２０×１０12、２５×１０12、３０×１０12、または５０×１０12ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態では、組成物のウイルス力価は、約５×１０12～６×１０12、６×１０12～７×１０12、７×１０12～８×１０12、８×１０12～９×１０12、９×１０12～１０×１０12、１０×１０12～１１×１０12、１１×１０12～１５×１０12、１５×１０12～２０×１０12、２０×１０12～２５×１０12、２５×１０12～３０×１０12、３０×１０12～５０×１０12、または５０×１０12～１００×１０12ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態では、組成物のウイルス力価は、約５×１０12～１０×１０12、１０×１０12～２５×１０12、または２５×１０12～５０×１０12ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態では、組成物のウイルス力価は、少なくとも約５×１０9、６×１０9、７×１０9、８×１０9、９×１０9、１０×１０9、１１×１０9、１５×１０9、２０×１０9、２５×１０9、３０×１０9、または５０×１０9形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態では、組成物のウイルス力価は、約５×１０9～６×１０9、６×１０9～７×１０9、７×１０9～８×１０9、８×１０9～９×１０9、９×１０9～１０×１０9、１０×１０9～１１×１０9、１１×１０9～１５×１０9、１５×１０9～２０×１０9、２０×１０9～２５×１０9、２５×１０9～３０×１０9、３０×１０9～５０×１０9または５０×１０9～１００×１０9形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態では、組成物のウイルス力価は、約５×１０9～１０×１０9、１０×１０9～１５×１０9、１５×１０9～２５×１０9、または２５×１０9～５０×１０9形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態では、組成物のウイルス力価は、少なくとも約５×１０10、６×１０10、７×１０10、８×１０10、９×１０10、１０×１０10、１１×１０10、１５×１０10、２０×１０10、２５×１０10、３０×１０10、４０×１０10、または５０×１０10感染単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態では、組成物のウイルス力価は、少なくとも約５×１０10～６×１０10、６×１０10～７×１０10、７×１０10～８×１０10、８×１０10～９×１０10、９×１０10～１０×１０10、１０×１０10～１１×１０10、１１×１０10～１５×１０10、１５×１０10～２０×１０10、２０×１０10～２５×１０10、２５×１０10～３０×１０10、３０×１０10～４０×１０10、４０×１０10～５０×１０10、または５０×１０10～１００×１０10感染単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態では、組成物のウイルス力価は、少なくとも約５×１０10～１０×１０10、１０×１０10～１５×１０10、１５×１０10～２５×１０10、または２５×１０10～５０×１０10感染単位／ｍＬのいずれかである。
【0066】
１つまたは複数（例えば、２、３、またはそれ以上）のブレブを形成することができる。一般に、本発明の方法およびシステムによって形成された１つまたは複数のブレブの総量は、典型的なヒト対象における眼の流体量、例えば、約４ｍｌを超えることはできない。個々のブレブの総量は、中心網膜の細胞型を露出させ、最適な操作に対する十分な依存性のブレブを形成するのに十分なサイズの網膜剥離を促進するために、少なくとも約０．３ｍｌまたは少なくとも約０．５ｍｌであり得る。当業者は、本発明の方法およびシステムに従ってブレブを形成する際に、眼構造に対する損傷を回避するために適切な眼圧を維持しなければならないことを理解するであろう。個々のブレブのサイズは、例えば、約０．５～約１．２ｍｌ、約０．８～約１．２ｍｌ、約０．９～約１．２ｍｌ、約０．９～約１．０ｍｌ、約１．０～約２．０ｍｌ、約１．０～約３．０ｍｌであり得る。したがって、一例では、合計３ｍｌの単離ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または医薬組成物懸濁液を注射するために、それぞれ約１ｍｌの３つのブレブを確立することができる。組み合わせたすべてのブレブの総量は、例えば、約０．５～約３．０ｍｌ、約０．８～約３．０ｍｌ、約０．９～約３．０ｍｌ、約１．０～約３．０ｍｌ、約０．５～約１．５ｍｌ、約０．５～約１．２ｍｌ、約０．９～約３．０ｍｌ、約０．９～約２．０ｍｌ、約０．９～約１．０ｍｌであり得る。
【0067】
ブレブの元の位置の縁の外側の標的網膜の領域（例えば、中心網膜）に安全かつ効率的に形質導入するために、ブレブを操作して、形質導入のためにブレブを標的領域に再配置することができる。ブレブの操作は、ブレブの体積によって生じるブレブの依存性、ブレブを含有する眼の再配置、１つまたは複数のブレブを含有する１つまたは２つの眼を有するヒトの頭の再配置によって、および／または流体－空気交換によって生じる可能性がある。この領域は典型的には網膜下注射による剥離に抵抗するため、これは中心網膜に特に関係がある。いくつかの実施形態では、流体－空気交換を利用してブレブを再配置する；注入カニューレからの流体を、例えば網膜の表面に空気を吹き付けることによって、空気により一時的に置き換える。空気の体積が網膜の表面から硝子体腔液を押しのけると、硝子体腔内の流体がカニューレから流出する場合がある。硝子体腔液からの圧力が一時的に不足すると、ブレブが移動し、眼の依存部分に引き寄せられる。眼球を適切に配置することにより、網膜下ベクターのブレブおよび／または医薬組成物の位置が操作されて、隣接する領域（例えば、黄斑および／または中心窩）に関与する。場合によっては、流体と空気の交換を使用しなくても、ブレブの質量は、ブレブを引き寄せるのに十分である。対象の頭の位置を変更することによって、所望の位置へのブレブの移動をさらに容易にして、ブレブを眼の所望の位置に引き寄せることができる。ブレブの所望の構成が達成されると、流体を硝子体腔に戻す。流体は、適切な流体、例えば、未処理生理食塩水である。一般に、網膜下ベクターおよび／または医薬組成物を、網膜切開術に対する網膜復位術なしでおよび眼内タンポナーデなしでインサイチュで放置してもよく、網膜は、約４８時間以内に自発的に再付着する。
【0068】
本明細書で使用される「ブレブ」という用語は、眼の網膜下腔内の流体空隙を指す。本発明のブレブは、単一の空隙への流体の単一の注射、同じ空隙への１または複数の流体の複数回の注射、または複数の空隙への複数回の注射によって作出することができ、これは、再配置されると、網膜下腔の所望の部分にわたって治療効果を達成するのに有用な総流体空隙を作出する。
【0069】
治療用ポリペプチド（例えば、ＣＲＢ１－Ｂ）を含むベクターにより眼細胞（例えば、ＲＰＥおよび／または例えば黄斑および／または中心窩の光受容細胞）を安全かつ効果的に形質導入することによって、形質導入された細胞が、眼障害を処置するのに十分な量の治療用ポリペプチドＣＲＢ１－ＢまたはＲＮＡ配列を産生する、本発明の方法を使用して、眼障害を有する個体；例えばヒトを処置することができる。
処置の目的に応じて、本開示による有効量の単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物を投与する。例えば、低いパーセンテージの形質導入により所望の治療効果を達成することができるウイルスベクターの使用において、処置の目的は、したがって一般に、このレベルの形質導入を満たすか、または超えることである。場合によっては、このレベルの形質導入は、標的細胞の約１～５％のみの形質導入によって、いくつかの実施形態では、所望の組織型の細胞の少なくとも約２０％、いくつかの実施形態では、少なくとも約５０％、いくつかの実施形態では、少なくとも約８０％、いくつかの実施形態では、少なくとも約９５％、いくつかの実施形態では、所望の組織型の細胞の少なくとも約９９％の形質導入によって達成することができる。単離ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または医薬組成物を、同じ手順の間、または数日、数週間、数か月、もしくは数年間隔のいずれかで、１回または複数の網膜下注射によって投与することができる。いくつかの実施形態では、複数のベクターを使用してヒトを処置することができる。例えば、一実施形態では、それぞれが異なるＣＲＢ１アイソフォームまたは他の網膜治療剤をコードする複数のベクターを使用することができる。例えば、ＣＲＢ１－Ｂをコードするベクターを使用して、単独で、または網膜内のミュラー細胞を標的にすることができるＣＲＢ１－ＡおよびＣＲＢ１－Ａ２から選択されるＣＲＢ１アイソフォームをコードする第２のベクターと組み合わせて、網膜内の光受容細胞を標的にすることができる。
処置の目的に応じて、本開示による有効量の単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物を投与する。例えば、低いパーセンテージの形質導入により所望の治療効果を達成することができるウイルスベクターの使用において、処置の目的は、したがって一般に、このレベルの形質導入を満たすか、または超えることである。場合によっては、このレベルの形質導入は、標的細胞の約１～５％のみの形質導入によって、いくつかの実施形態では、所望の組織型の細胞の少なくとも約２０％、いくつかの実施形態では、少なくとも約５０％、いくつかの実施形態では、少なくとも約８０％、いくつかの実施形態では、少なくとも約９５％、いくつかの実施形態では、所望の組織型の細胞の少なくとも約９９％の形質導入によって達成することができる。単離ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または医薬組成物を、同じ手順の間、または数日、数週間、数か月、もしくは数年間隔のいずれかで、１回または複数の網膜下注射によって投与することができる。いくつかの実施形態では、複数のベクターを使用してヒトを処置することができる。例えば、一実施形態では、それぞれが異なるＣＲＢ１アイソフォームまたは他の網膜治療剤をコードする複数のベクターを使用することができる。例えば、ＣＲＢ１－Ｂをコードするベクターを使用して、単独で、または網膜内のミュラー細胞を標的にすることができるＣＲＢ１－ＡおよびＣＲＢ１－Ａ２から選択されるＣＲＢ１アイソフォームをコードする第２のベクターと組み合わせて、網膜内の光受容細胞を標的にすることができる。
【0070】
いくつかの実施形態では、本開示による有効量の単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物の網膜への投与によって、投与部位にまたはそれに近接して光受容細胞を形質導入する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターが使用される場合、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または１００％のいずれかより多い光受容細胞に単離ポリヌクレオチドまたはベクターを組み込み、ＣＲＢ１アイソフォームを発現させる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターが使用される場合、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または１００％のいずれかより多い光受容細胞に単離ポリヌクレオチドまたはベクターを組み込み、ＣＲＢ１アイソフォームを発現させ、形質導入する。いくつかの実施形態では、約５％～約１００％、約１０％～約５０％、約１０％～約３０％、約２５％～約７５％、約２５％～約５０％、または約３０％～約５０％の光受容細胞が標的とされる（例えば、ウイルスベクターにより形質導入される）。ベクターを含むＡＡＶウイルス粒子によって形質導入された、または医薬組成物で標的化された光受容細胞を同定する方法は、当技術分野において既知であり、例えば、免疫組織化学またはポリヌクレオチドもしくはベクター内のマーカーの使用を含み、例として、増強された緑色蛍光タンパク質を使用して、ベクターまたは医薬組成物の組み込みまたは形質導入を検出することができる。
【0071】
本開示のいくつかの実施形態では、方法は、眼障害を有する個体；例えば眼障害を有するヒトを処置するための本開示による有効量の単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を、哺乳動物の網膜下（例えば、網膜下腔）に投与することを含む。いくつかの実施形態では、単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を、光受容細胞におけるポリヌクレオチドの発現が可能になるように、網膜下の１つまたは複数の位置に注射する。いくつかの実施形態では、単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を、網膜下の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の位置または１０を超える位置のいずれかに注射する。
【0072】
いくつかの実施形態では、本開示による単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を、同時にまたは連続して２つ以上の位置に投与する。いくつかの実施形態では、単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物の複数回注射は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、９時間、１２時間、または２４時間以下の間隔である。
【0073】
他の実施形態では、本開示による単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を、対象に硝子体内投与してもよい。硝子体内注射の一般的な方法は、以下の簡単な概要によって説明することができる。この例は、単に本方法のある特定の機能を説明することを意味するものであり、限定することを意味するものではない。硝子体内注射の手順は、当技術分野において既知である（例えば、Peyman, G. A., et al. (2009) Retina 29(7):875-912およびFagan, X. J. and Al-Qureshi, S. (2013) Clin. Experiment. Ophthalmol. 41(5):500-7を参照のこと）。
【0074】
要約すると、硝子体内注射の対象を、瞳孔拡張、眼の滅菌、および麻酔薬の投与による手順のために用意することができる。瞳孔拡張のために当技術分野において既知である任意の好適な散瞳剤を使用してもよい。処置前に適切な瞳孔拡張を確認することがある。滅菌は、滅菌アイトリートメント、例えば、ポビドンヨード（ＢＥＴＡＤＩＮＥ（商標））などのヨウ化物含有溶液を適用することによって達成することができる。類似の溶液を使用して、まぶた、まつげ、および任意の他の近くの組織（皮膚など）を洗浄することもできる。リドカインまたはプロパラカインなどの任意の好適な麻酔薬を、任意の好適な濃度で使用することができる。麻酔薬は、局所点滴、ゲルまたはゼリー、および麻酔薬の結膜下適用を含むがこれらに限定されない、当技術分野において既知の任意の方法によって投与することができる。
【0075】
注射の前に、滅菌開瞼器を使用して、まつげをその領域から取り除くことができる。注射部位は、シリンジで印をつけることができる。患者のレンズに基づいて、注射部位を選択することができる。例えば、注射部位は、偽水晶体または無水晶体の患者では輪部（ｌｉｍｕｓ）から３～３．５ｍｍ、有水晶体の患者では輪部から３．５～４ｍｍであってもよい。患者は注射部位と反対方向を見ていてもよい。
【0076】
いくつかの実施形態では、方法は、本開示による有効量の単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物の眼への投与（例えば、網膜下および／または硝子体内投与による）を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターが医薬組成物で投与され、組成物のウイルス力価は、少なくとも約５×１０12、６×１０12、７×１０12、８×１０12、９×１０12、１０×１０12、１１×１０12、１５×１０12、２０×１０12、２５×１０12、３０×１０12、または５０×１０12ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態では、ベクターおよび／または医薬組成物のウイルス力価は、約５×１０12～６×１０12、６×１０12～７×１０12、７×１０12～８×１０12、８×１０12～９×１０12、９×１０12～１０×１０12、１０×１０12～１１×１０12、１１×１０12～１５×１０12、１５×１０12～２０×１０12、２０×１０12～２５×１０12、２５×１０12～３０×１０12、３０×１０12～５０×１０12、または５０×１０12～１００×１０12ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態では、組成物のウイルス力価は、約５×１０9～１０×１０9、１０×１０9～１５×１０9、１５×１０9～２５×１０9、または２５×１０9～５０×１０9形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態では、組成物のウイルス力価は、少なくとも約５×１０10、６×１０10、７×１０10、８×１０10、９×１０10、１０×１０10、１１×１０10、１５×１０10、２０×１０10、２５×１０10、３０×１０10、４０×１０10、または５０×１０10感染単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態では、組成物のウイルス力価は、少なくとも約５×１０10～６×１０10、６×１０10～７×１０10、７×１０10～８×１０10、８×１０10～９×１０10、９×１０10～１０×１０10、１０×１０10～１１×１０10、１１×１０10～１５×１０10、１５×１０10～２０×１０10、２０×１０10～２５×１０10、２５×１０10～３０×１０10、３０×１０10～４０×１０10、４０×１０10～５０×１０10、または５０×１０10～１００×１０10感染単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態では、組成物のウイルス力価は、約５×１０12～１０×１０12、１０×１０12～２５×１０12、または２５×１０12～５０×１０12ゲノムコピー／ｍＬの少なくとも約５×１０10～１０×１０10、１０×１０10～１５×１０10、１５×１０10～２５×１０10、または２５×１０10～５０×１０10感染単位／ｍＬのいずれかである。
【0077】
いくつかの実施形態では、方法は、本開示による有効量のベクターの、個体（例えば、ヒト）の眼への（例えば、網膜下および／または硝子体内投与による）投与を含む。いくつかの実施形態では、個体に投与されるベクターおよび／または医薬組成物の用量は、体重１ｋｇあたり少なくとも約１×１０8～約１×１０13ゲノムコピーのいずれかである。いくつかの実施形態では、個体に投与されるベクターおよび／または医薬組成物の用量は、体重１ｋｇあたり約１×１０8～約１×１０13ゲノムコピーのいずれかである。
【0078】
注射の間、針は強膜に対して垂直に挿入され、眼の中心を指すことがある。針は、先端が網膜下腔ではなく硝子体で終わるように挿入することができる。注射のために当技術分野において既知の任意の好適な体積を使用してもよい。注射後、抗生物質などの滅菌剤で眼を処置してもよい。眼をすすいで、余分な滅菌剤を除去してもよい。
【0079】
本開示の他の実施形態は、本開示によるベクターまたは医薬組成物の送達の有効性を決定するための手段を提供する。本開示によるベクターまたは医薬組成物の網膜下または硝子体内注射による送達の有効性は、本明細書に記載のいくつかの基準によってモニタリングすることができる。例えば、本発明の方法を使用する対象における処置後、本明細書に記載されているものを含む１つまたは複数の臨床パラメータによって、例えば、病状の１つもしくは複数の徴候または症状の進行の改善および／または安定化および／または遅延について、対象を評価することができる。そのような試験の例は、当技術分野において既知であり、客観的および主観的（例えば、対象が報告した）測定が挙げられる。例えば、対象の視覚機能に対する処置の有効性を測定するために、以下のうちの１つまたは複数を評価することができる：対象の主観的な視力の質または中心視機能の改善（例えば、流暢に読む、顔を認識する対象の能力の改善）、対象の視覚可動性（例えば、迷路をナビゲートするのに必要な時間の短縮）、視力（例えば、対象のＬｏｇ ＭＡＲスコアの改善）、マイクロペリメトリー（例えば、対象のｄＢスコアの改善）、暗順応視野検査（例えば、対象のｄＢスコアの改善）、ファインマトリックスマッピング（例えば、対象のｄＢスコアの改善）、ゴールドマン視野検査（例えば、スコトマトース領域（すなわち、失明の領域）のサイズ縮小、およびより小さな標的を解像する能力の改善）、フリッカー感度（例えば、ヘルツの改善）、自家蛍光、ならびに電気生理学的測定（例えば、ＥＲＧの改善）。いくつかの実施形態では、視覚機能は、対象の視覚可動性によって測定される。いくつかの実施形態では、視覚機能は、対象の視力によって測定される。いくつかの実施形態では、視覚機能は、マイクロペリメトリーによって測定される。いくつかの実施形態では、視覚機能は、暗順応視野検査によって測定される。いくつかの実施形態では、視覚機能は、ＥＲＧによって測定される。いくつかの実施形態では、視覚機能は、対象の主観的な視力の質によって測定される。
【0080】
進行性の視覚機能変性をもたらす疾患の場合、対象を若年時に処置すると、疾患の進行が緩徐または停止をもたらすだけでなく、後天性弱視による視覚機能の喪失を改善または予防する場合がある。弱視には２つのタイプがあり得る。出生から生後数か月まで完全な暗闇に保たれている非ヒト霊長類および子猫の研究では、網膜から機能シグナルが送られているにもかかわらず、その後光にさらされた場合でも、動物は機能的に不可逆的に盲目である。この失明は、皮質の神経接続および「教育」が、刺激の停止により出生から発生的に停止しているために生じる。この機能を復元することができるかどうかは不明である。網膜変性の疾患の場合、正常な視覚野回路は、変性が重大な機能不全を引き起こす時点まで、最初は「学習」されたか、発生上適切であった。機能不全の眼におけるシグナル伝達に関する視覚刺激の喪失によって、「後天性」または「学習」機能不全（「後天性弱視」）が生じ、脳がシグナルを解釈したり、その眼を「使用」したりすることができなくなる。「後天性弱視」のこれらの症例では、弱視眼の遺伝子治療の結果として網膜からのシグナル伝達が改善され、進行の緩徐または病状の安定化に加えて、より正常な機能の獲得がさらにもたらされ得るかどうかは不明である。いくつかの実施形態では、処置されるヒトは３０歳未満である。いくつかの実施形態では、処置されるヒトは２０歳未満である。いくつかの実施形態では、処置されるヒトは１８歳未満である。いくつかの実施形態では、処置されるヒトは１５歳未満である。いくつかの実施形態では、処置されるヒトは１４歳未満である。いくつかの実施形態では、処置されるヒトは１３歳未満である。いくつかの実施形態では、処置されるヒトは１２歳未満である。いくつかの実施形態では、処置されるヒトは１０歳未満である。いくつかの実施形態では、処置されるヒトは８歳未満である。いくつかの実施形態では、処置されるヒトは６歳未満である。
【0081】
一部の眼障害では、あるタイプの細胞の機能を改善すると別のタイプの細胞の機能が改善される「ナース細胞」現象がある。例えば、本開示の単離ポリヌクレオチド、ベクター、および／または医薬組成物による中心網膜の網膜色素上皮（ＲＰＥ）の形質導入によって、次に、桿体の機能が改善されることがあり、次いで、桿体機能の改善によって、錐体機能の改善がもたらされる。したがって、ある細胞型を処置すると、別の細胞型の機能の改善がもたらされることがある。
本開示による特定の単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物の選択は、個々のヒトの病歴および状態の特徴ならびに処置される個体を含むがこれらに限定されない複数の異なる要因に依存する。そのような特徴の評価および適切な治療レジメンの設計は、最終的には処方する医師の責任である。
本開示による特定の単離ポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物の選択は、個々のヒトの病歴および状態の特徴ならびに処置される個体を含むがこれらに限定されない複数の異なる要因に依存する。そのような特徴の評価および適切な治療レジメンの設計は、最終的には処方する医師の責任である。
【0082】
本明細書で使用される場合、「個体」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指す。本開示の「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例として飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびにげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、両生類、爬虫類などを含む。いくつかの実施形態では、個体または対象はヒトを含む。ある特定の実施形態では、対象は、眼障害に罹患している、または罹患するリスクがあるヒトを含む。
【0083】
いくつかの実施形態では、処置を受けるべき対象は、遺伝的眼障害を有するが、臨床的徴候または症状がまだ明らかになっていない。いくつかの実施形態では、処置を受けるべきヒトは、眼障害を有する。いくつかの実施形態では、処置を受けるべきヒトは、眼障害の１つまたは複数の徴候または症状を示している。いくつかの実施形態では、処置を受けるべき対象は、ｃｒｂ１遺伝子の一方または両方の対立遺伝子に変異を有する。
「対立遺伝子」は、染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態のうちの１つを指す。対立遺伝子の長さは１ヌクレオチドと同じくらい短い場合があるが、多くの場合それよりも長い。本明細書で使用される場合、「変異」は、遺伝子のＤＮＡ配列の変化を指し、その結果、配列は、ほとんどの人に見られるものとは異なる。変異は、１つもしくは複数のヌクレオチドの置換、１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入、または１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失を含み得る。
「対立遺伝子」は、染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態のうちの１つを指す。対立遺伝子の長さは１ヌクレオチドと同じくらい短い場合があるが、多くの場合それよりも長い。本明細書で使用される場合、「変異」は、遺伝子のＤＮＡ配列の変化を指し、その結果、配列は、ほとんどの人に見られるものとは異なる。変異は、１つもしくは複数のヌクレオチドの置換、１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入、または１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失を含み得る。
【0084】
いくつかの実施形態では、眼障害は網膜症を含む。本明細書で使用される場合、「網膜症」という用語は、眼の網膜に対する任意の損傷を指す。この用語は、多くの場合、網膜血管疾患、または異常な血流によって引き起こされる網膜に対する損傷を指す。本発明のシステムおよび方法によって処置され得る眼障害または網膜症の非限定的な例としては：常染色体劣性重症早期発症網膜変性（レーバー先天性黒内障）、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性症、Ｘ連鎖網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性症、萎縮性加齢性黄斑変性症、新生血管ＡＭＤ、糖尿病性黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞性黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎、緑内障、後部ブドウ膜炎、コロイデレミア、およびレーバー遺伝性視神経症が挙げられる。
【0085】
本開示による単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物は、単独で、または眼障害を処置するための１つもしくは複数の追加の治療剤と組み合わせて使用することができる。連続投与間の間隔は、少なくとも（あるいは、より少ない）数分、数時間、または数日単位であり得る。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加の治療剤は、網膜下または硝子体に投与され得る（例えば、硝子体内投与を介して）。追加の治療剤の非限定的な例としては、ポリペプチド神経栄養因子（例えば、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ）、ポリペプチド抗血管新生因子（例えば、ｓＦｌｔ、アンギオスタチン、エンドスタチン）、抗血管新生性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム）、例えば、ＶＥＧＦに対する抗血管新生性核酸、抗血管新生性モルフォリノ、例えば、ＶＥＧＦに対する抗血管新生性モルフォリノ、抗血管新生抗体および／または抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片）、例えば、ＶＥＧＦに対する抗血管新生抗体および／または抗体断片が挙げられる。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加の治療剤は、網膜下または硝子体に投与され得る（例えば、硝子体内投与を介して）。追加の治療剤の非限定的な例としては、ポリペプチド神経栄養因子（例えば、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ）、ポリペプチド抗血管新生因子（例えば、ｓＦｌｔ、アンギオスタチン、エンドスタチン）、抗血管新生性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム）、例えば、ＶＥＧＦに対する抗血管新生性核酸、抗血管新生性モルフォリノ、例えば、ＶＥＧＦに対する抗血管新生性モルフォリノ、抗血管新生抗体および／または抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片）、例えば、ＶＥＧＦに対する抗血管新生抗体および／または抗体断片が挙げられる。
【0086】
別の実施形態では、使用される治療剤は、細胞喪失を回復するために眼の網膜で使用される幹細胞療法の使用であり得る。組み合わせて使用するのに好適な幹細胞は当技術分野において既知であり、網膜光受容細胞に分化することができる前駆幹細胞を投与することが含まれる。
上記の態様および実施形態のうちのいくつかの実施形態では、本開示による本明細書に記載の単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物は、定位送達によって送達される。いくつかの実施形態では、本開示による単離ポリヌクレオチド、単離ポリペプチド、ベクターおよび／または医薬組成物は、対流増強送達によって送達される。いくつかの実施形態では、本開示による単離ポリヌクレオチド、単離ポリペプチド、ベクターおよび／または医薬組成物は、ＣＥＤ送達システムを使用して投与される。いくつかの実施形態では、カニューレは、逆流防止カニューレまたは段付きカニューレである。いくつかの実施形態では、ＣＥＤ送達システムは、カニューレおよび／またはポンプを含む。いくつかの実施形態では、本開示による単離ポリヌクレオチド、単離ポリペプチド、ベクターおよび／または医薬組成物は、ＣＥＤ送達システムを使用して投与される。いくつかの実施形態では、ポンプは手動ポンプである。いくつかの実施形態では、ポンプは浸透圧ポンプである。いくつかの実施形態では、ポンプは注入ポンプである。
上記の態様および実施形態のうちのいくつかの実施形態では、本開示による本明細書に記載の単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物は、定位送達によって送達される。いくつかの実施形態では、本開示による単離ポリヌクレオチド、単離ポリペプチド、ベクターおよび／または医薬組成物は、対流増強送達によって送達される。いくつかの実施形態では、本開示による単離ポリヌクレオチド、単離ポリペプチド、ベクターおよび／または医薬組成物は、ＣＥＤ送達システムを使用して投与される。いくつかの実施形態では、カニューレは、逆流防止カニューレまたは段付きカニューレである。いくつかの実施形態では、ＣＥＤ送達システムは、カニューレおよび／またはポンプを含む。いくつかの実施形態では、本開示による単離ポリヌクレオチド、単離ポリペプチド、ベクターおよび／または医薬組成物は、ＣＥＤ送達システムを使用して投与される。いくつかの実施形態では、ポンプは手動ポンプである。いくつかの実施形態では、ポンプは浸透圧ポンプである。いくつかの実施形態では、ポンプは注入ポンプである。
【0087】
「有効量」または「治療有効量」は、臨床結果（例えば、症状の改善、臨床エンドポイントの達成など）を含む有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な量である。有効量を、１回または複数回の投与で投与することができる。病状の点から、有効量は、疾患の改善、安定化、または発症遅延に十分な量である。
本明細書で使用される場合、「処置」、「処置すること」、「治療」、および／または「治療レジメン」は交換可能に使用され、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチを指す。本開示の目的では、有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能か検出不可能かを問わず、症状の軽減、疾患の程度の低下、安定化した（例えば、悪化しない）病状、疾患の拡大（例えば、光受容体および視力のさらなる喪失）の予防、疾患進行の遅延または緩徐、病状の改善または緩和、および寛解（部分寛解であろうと、完全寛解であろうと）を含むが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けていない場合に予期される視力喪失と比較して視力の延長も意味することができる。
本明細書で使用される場合、「処置」、「処置すること」、「治療」、および／または「治療レジメン」は交換可能に使用され、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチを指す。本開示の目的では、有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能か検出不可能かを問わず、症状の軽減、疾患の程度の低下、安定化した（例えば、悪化しない）病状、疾患の拡大（例えば、光受容体および視力のさらなる喪失）の予防、疾患進行の遅延または緩徐、病状の改善または緩和、および寛解（部分寛解であろうと、完全寛解であろうと）を含むが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けていない場合に予期される視力喪失と比較して視力の延長も意味することができる。
【0088】
本明細書で使用される場合、「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）処置」または「予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置」という用語は、個体が障害を有することまたは障害を有するリスクがあることが分かっているかまたは疑われるが、その障害の症状をまったくまたは最小限にしか示していない場合の処置を指す。予防処置を受ける個体は、発症前に処置され得る。いくつかの実施形態では、遺伝性の遺伝的眼疾患を有する対象は、眼疾患の徴候および／または症状を示す前に処置され得る。
【0089】
本明細書で使用される「中心網膜」という用語は、外黄斑および／または内黄斑および／または中心窩を指す。本明細書で使用される「中心網膜細胞型」という用語は、例えば、ＲＰＥおよび光受容細胞などの中心網膜の細胞型を指す。
「黄斑」という用語は、周辺網膜と比較して相対濃度がより高い光受容細胞、特に桿体および錐体を含有する、霊長類の中心網膜の領域を指す。本明細書で使用される「外黄斑」という用語は、「周辺黄斑」と呼ばれることもある。本明細書で使用される「内黄斑」という用語は、「中心黄斑」と呼ばれることもある。
「中心窩」という用語は、周辺網膜および黄斑と比較した場合に相対濃度がより高い光受容細胞、特に錐体を含有する、直径がおよそ０．５ｍｍ以下の霊長類の中心網膜内の小領域を指す。
本明細書で使用される「網膜下腔」という用語は、網膜内の光受容細胞と網膜色素上皮細胞との間の位置を指す。網膜下腔は、任意の網膜下液注射前などの潜在的空隙であり得る。網膜下腔には、潜在的空隙に注射される流体が含まれている場合もある。この場合、流体は「網膜下腔と接触している」。「網膜下腔と接触している」細胞には、ＲＰＥおよび光受容細胞などの、網膜下腔に隣接する細胞が含まれる。
「黄斑」という用語は、周辺網膜と比較して相対濃度がより高い光受容細胞、特に桿体および錐体を含有する、霊長類の中心網膜の領域を指す。本明細書で使用される「外黄斑」という用語は、「周辺黄斑」と呼ばれることもある。本明細書で使用される「内黄斑」という用語は、「中心黄斑」と呼ばれることもある。
「中心窩」という用語は、周辺網膜および黄斑と比較した場合に相対濃度がより高い光受容細胞、特に錐体を含有する、直径がおよそ０．５ｍｍ以下の霊長類の中心網膜内の小領域を指す。
本明細書で使用される「網膜下腔」という用語は、網膜内の光受容細胞と網膜色素上皮細胞との間の位置を指す。網膜下腔は、任意の網膜下液注射前などの潜在的空隙であり得る。網膜下腔には、潜在的空隙に注射される流体が含まれている場合もある。この場合、流体は「網膜下腔と接触している」。「網膜下腔と接触している」細胞には、ＲＰＥおよび光受容細胞などの、網膜下腔に隣接する細胞が含まれる。
【0090】
システムおよびキット：
本開示による単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物は、本明細書で提供される本開示の方法の１つで使用するように設計されたシステム内に含まれ得る。そのような態様では、システムは、本明細書で提供される治療有効量のベクター、およびベクターを対象に送達するためのデバイスを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。
いくつかの実施形態では、システムは、本開示によるベクターを、個体の眼に網膜下送達するために設計されている。他の実施形態では、システムは、本開示によるベクターを、個体の眼に硝子体内送達するために設計されている。さらに他の実施形態では、システムは、本開示によるベクターを、個体の眼に局所送達するために設計されている。
本開示による単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物は、本明細書で提供される本開示の方法の１つで使用するように設計されたシステム内に含まれ得る。そのような態様では、システムは、本明細書で提供される治療有効量のベクター、およびベクターを対象に送達するためのデバイスを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。
いくつかの実施形態では、システムは、本開示によるベクターを、個体の眼に網膜下送達するために設計されている。他の実施形態では、システムは、本開示によるベクターを、個体の眼に硝子体内送達するために設計されている。さらに他の実施形態では、システムは、本開示によるベクターを、個体の眼に局所送達するために設計されている。
【0091】
一般に、本開示によるベクターの硝子体内または網膜下送達の場合、システムは、２７～４５ゲージである細径カニューレと、１本または複数の（例えば、１、２、３、４またはそれ以上の）シリンジと、本開示の方法での使用に好適な１または複数（例えば、１、２、３、４またはそれ以上）の流体とを含む。細径カニューレは、網膜下腔に注射されるベクターおよび／または他の流体の網膜下注射に好適である。いくつかの実施形態では、カニューレは、２７～４５ゲージである。いくつかの実施形態では、細径カニューレは、３５～４１ゲージである。いくつかの実施形態では、細径カニューレは、４０または４１ゲージである。いくつかの実施形態では、細径カニューレは、４１ゲージである。カニューレは、任意の好適なタイプのカニューレであってもよく、例えば、ｄｅ－Ｊｕａｎ（商標）カニューレまたはＥａｇｌｅ（商標）カニューレであってもよい。
【0092】
シリンジは、任意の好適なシリンジであってもよいが、ただし、流体送達のためのカニューレへの接続が可能であることを条件とする。いくつかの実施形態では、シリンジは、Ａｃｃｕｒｕｓ（商標）システムシリンジである。いくつかの実施形態では、システムは、１本のシリンジを有する。いくつかの実施形態では、システムは、２本のシリンジを有する。いくつかの実施形態では、システムは、３本のシリンジを有する。いくつかの実施形態では、システムは、４本またはそれ以上のシリンジを有する。
システムは、例えばフットペダルによって作動させることができる、自動インジェクションポンプをさらに含んでもよい。
システムは、例えばフットペダルによって作動させることができる、自動インジェクションポンプをさらに含んでもよい。
【0093】
本開示の方法での使用に好適な流体としては、本明細書に記載するもの、例えば、本明細書に記載の１つまたは複数の有効量のベクターを各々が含む１つまたは複数の流体、最初のブレブを形成するための１つまたは複数の流体（例えば、生理食塩水または他の適切な流体）、および１つまたは複数の治療剤を含む１つまたは複数の流体が挙げられる。
本開示の方法での使用に好適な流体としては、本明細書に記載するもの、例えば、本明細書に記載の１つまたは複数の有効量のベクターを各々が含む１つまたは複数の流体、最初のブレブを形成するための１つまたは複数の流体（例えば、生理食塩水または他の適切な流体）、および１つまたは複数の治療剤を含む１つまたは複数の流体が挙げられる。
本開示の方法での使用に好適な流体としては、本明細書に記載するもの、例えば、本明細書に記載の１つまたは複数の有効量のベクターを各々が含む１つまたは複数の流体、最初のブレブを形成するための１つまたは複数の流体（例えば、生理食塩水または他の適切な流体）、および１つまたは複数の治療剤を含む１つまたは複数の流体が挙げられる。
【0094】
いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、約０．８ｍｌよりも大きい。いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、少なくとも約０．９ｍｌである。いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、少なくとも約１．０ｍｌである。いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、少なくとも約１．５ｍｌである。いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、少なくとも約２．０ｍｌである。いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、約０．８～約３．０ｍｌよりも大きい。いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、約０．８～約２．５ｍｌよりも大きい。いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、約０．８～約２．０ｍｌよりも大きい。いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、約０．８～約１．５ｍｌよりも大きい。いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、約０．８～約１．０ｍｌよりも大きい。いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、約０．９～約３．０ｍｌである。いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、約０．９～約２．５ｍｌである。いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、約０．９～約２．０ｍｌである。いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、約０．９～約１．５ｍｌである。いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、約０．９～約１．０ｍｌである。いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、約１．０～約３．０ｍｌである。いくつかの実施形態では、有効量のベクターを含む流体の体積は、約１．０～約２．０ｍｌである。
【0095】
最初のブレブを形成するための流体は、例えば、約０．１～約０．５ｍｌであり得る。いくつかの実施形態では、システム内のすべての流体の総体積は、約０．５～約３．０ｍｌである。
いくつかの実施形態では、システムは、単一の流体（例えば、有効量のベクターを含む流体）を含む。いくつかの実施形態では、システムは２つの流体を含む。いくつかの実施形態では、システムは３つの流体を含む。いくつかの実施形態では、システムは４つまたはそれ以上の流体を含む。
いくつかの実施形態では、システムは、単一の流体（例えば、有効量のベクターを含む流体）を含む。いくつかの実施形態では、システムは２つの流体を含む。いくつかの実施形態では、システムは３つの流体を含む。いくつかの実施形態では、システムは４つまたはそれ以上の流体を含む。
【0096】
本開示のシステムは、さらにキットにパッケージングすることができ、キットは、使用説明書をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、本開示によるベクターの送達のためのデバイスをさらに含む。いくつかの実施形態では、送達は、網膜下送達を含む。他の実施形態では、送達は、局所送達を含む。さらに他の実施形態では、送達は、硝子体内送達を含む。いくつかの実施形態では、使用説明書は、本明細書に記載する方法のうちの１つに従う説明書を含む。いくつかの実施形態では、使用説明書は、本開示によるベクターの網膜下、硝子体内および／または局所送達のための説明書を含む。
別の実施形態では、本開示は、対象の眼障害を処置するためのキットであって、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物、および単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、または単離ポリペプチド、または医薬組成物を対象に送達するためのデバイス、および使用説明書を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態では、送達用のデバイスは、網膜下送達用に設計されている。別の実施形態では、送達用のデバイスは、硝子体内送達用に設計されている。さらなる実施形態では、送達用のデバイスは、局所送達用に設計されている。
別の実施形態では、本開示は、対象の眼障害を処置するためのキットであって、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物、および単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、または単離ポリペプチド、または医薬組成物を対象に送達するためのデバイス、および使用説明書を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態では、送達用のデバイスは、網膜下送達用に設計されている。別の実施形態では、送達用のデバイスは、硝子体内送達用に設計されている。さらなる実施形態では、送達用のデバイスは、局所送達用に設計されている。
【0097】
別の態様では、本開示は、対象における視力喪失の進行を低減するか、もしくは視力喪失を低減するか、または視力機能を維持するためのキットであって、単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物、および単離ポリヌクレオチド、組換えベクター、単離ポリペプチド、または医薬組成物を対象に送達するためのデバイス、および使用説明書を含む、キットを提供する。好ましい実施形態では、キットは、ＣＲＢ１－Ｂをコードする第１のベクター、およびＣＲＢ１－Ａ、ＣＲＢ１－Ａ２、またはＣＲＢ１－Ｃをコードする第２のベクター、および使用説明書を含む。
【0098】
本明細書に記載のキットは、単一の単位投薬量または複数投薬量形態でパッケージングすることができる。キットの内容物は、一般に、減菌かつ実質的に等張の溶液として製剤化される。
本開示のさらに別の態様は、本明細書に開示および図示されるすべてを提供する。
本開示の原理の理解を促進する目的で、ここで、好ましい実施形態を参照し、特定の言語を使用してそれを説明する。それにもかかわらず、本開示の範囲の限定はそれによって意図されておらず、本明細書に示される開示のそのような変更およびさらなる修正は、本開示が関連する当業者に典型的に起こるように企図されることが理解されるであろう。
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書では、その冠詞の文法的対象の１つまたは１つ超（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用する。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、少なくとも１つの要素を意味し、１つ超の要素を含むことができる。
「約（ａｂｏｕｔ）」は、所与の値が所望の結果に影響を与えることなく端点の「わずかに上」または「わずかに下」になり得ることを提供することにより、数値範囲の端点に柔軟性を提供するために使用される。
本開示のさらに別の態様は、本明細書に開示および図示されるすべてを提供する。
本開示の原理の理解を促進する目的で、ここで、好ましい実施形態を参照し、特定の言語を使用してそれを説明する。それにもかかわらず、本開示の範囲の限定はそれによって意図されておらず、本明細書に示される開示のそのような変更およびさらなる修正は、本開示が関連する当業者に典型的に起こるように企図されることが理解されるであろう。
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書では、その冠詞の文法的対象の１つまたは１つ超（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用する。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、少なくとも１つの要素を意味し、１つ超の要素を含むことができる。
「約（ａｂｏｕｔ）」は、所与の値が所望の結果に影響を与えることなく端点の「わずかに上」または「わずかに下」になり得ることを提供することにより、数値範囲の端点に柔軟性を提供するために使用される。
【0099】
本明細書における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語、およびそれらの変形の使用は、その後に列挙される要素およびその均等物、ならびに追加の要素を包含することを意味する。ある特定の要素を「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」として列挙される実施形態はまた、それらのある特定の要素「から本質的になる」およびそれら「からなる」と企図される。本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙された項目の１つまたは複数のありとあらゆる可能な組み合わせ、ならびに代替（「または」）で解釈される場合、組み合わせの欠如を指し、それらを包含する。
【0100】
本明細書で使用される場合、移行句である「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」（および文法的変形）は、列挙された材料またはステップ、および特許請求される発明の「基本的および新規の特性に実質的に影響を及ぼさない」材料またはステップを包含すると解釈されるべきである。In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976)を参照のこと（オリジナルの強調）；ＭＰＥＰ第２１１１．０３条も参照のこと。したがって、本明細書で使用される「から本質的になる」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されるべきではない。
【0101】
さらに、本開示はまた、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の特徴または特徴の組み合わせを除外または省略できることを企図している。例えば、複合体が成分Ａ、ＢおよびＣを含むと明細書で述べられている場合、Ａ、ＢもしくはＣのいずれか、またはそれらの組み合わせを省略し、単独でまたは任意の組み合わせで放棄できることが特に意図されている。
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に特に明記しない限り、単にその範囲内に含まれるそれぞれ別個の値を各々示すのを省略した方法として機能することを意図しているにすぎず、それぞれ別個の値は、あたかも本明細書に各々列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。例えば、濃度範囲が１％～５０％と記載されている場合、２％～４０％、１０％～３０％、または１％～３％などの値は、本明細書に明示的に列挙されることを意図している。これらは、具体的に意図されたものの単なる例であり、列挙された最低値と最高値との間の、およびそれらを含む数値のすべての可能な組み合わせが、本開示において明示的に記載されると考えるべきである。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に特に明記しない限り、単にその範囲内に含まれるそれぞれ別個の値を各々示すのを省略した方法として機能することを意図しているにすぎず、それぞれ別個の値は、あたかも本明細書に各々列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。例えば、濃度範囲が１％～５０％と記載されている場合、２％～４０％、１０％～３０％、または１％～３％などの値は、本明細書に明示的に列挙されることを意図している。これらは、具体的に意図されたものの単なる例であり、列挙された最低値と最高値との間の、およびそれらを含む数値のすべての可能な組み合わせが、本開示において明示的に記載されると考えるべきである。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0102】
本発明の概念から逸脱することなく、すでに説明したもの以外の多くの追加の修正が可能であることは当業者には明らかであるはずである。本開示を解釈する際に、すべての用語は、文脈と一致する最大限広範な手法で解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の変形形態は、非排他的な手法で要素、構成成分、またはステップを指すものとして解釈されるべきであり、したがって言及された要素、構成成分、またはステップは、明示的に言及されていない他の要素、構成成分、またはステップと組み合わせることができる。ある特定の要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」として言及される実施形態はまた、それらの要素「から本質的になる」およびそれらの要素「からなる」と企図される。「から本質的になる」および「からなる」という用語は、ＭＰＥＰおよび関連する連邦巡回区控訴裁判所（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｃｉｒｃｕｉｔ）の解釈に沿って解釈されるべきである。「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲を、明記された材料またはステップおよび特許請求された発明の基本的かつ新規な特性に実質的に影響を与えないものに限定する。「からなる」は、請求項に明記されていない、いかなる要素、ステップ、または成分をも除外する限定用語（ｃｌｏｓｅｄ ｔｅｒｍ）である。例えば、「からなる」配列に関しては、配列番号に列挙されている配列を指し、その一部としてその配列番号を含み得るより大きな配列を指す。
【0103】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。抵触する場合には、定義を含めて、本明細書が優先する。
本発明の他の特徴および利点は、その好ましい実施形態の説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができ、好適な方法および材料を以下に説明する。加えて、材料、方法、および例は例示にすぎず、限定することを意図したものではない。
本発明の他の特徴および利点は、その好ましい実施形態の説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができ、好適な方法および材料を以下に説明する。加えて、材料、方法、および例は例示にすぎず、限定することを意図したものではない。
【実施例】
【0104】
細胞表面タンパク質をコードする遺伝子は神経系の発生を制御し、神経障害に関与している。これらの遺伝子によって選択的ｍＲＮＡアイソフォームが産生されるが、これらは特徴付けが不十分なままであり、疾患に関連する変異がどのように病理を引き起こすかについての理解が妨げられている。ここでは、個々の遺伝子によってコードされた完全な完全長のアイソフォームポートフォリオを明らかにするための戦略を導入する。この戦略を使用して、神経細胞表面分子の多様性をカタログ化し、網膜および脳で発現する数千の注釈のないアイソフォームを同定する。質量分析により、インビボで細胞表面上に新たに発見されたタンパク質の発現を確認する。注目すべきことに、我々は、網膜変性遺伝子ＣＲＢ１の主要なアイソフォームが以前は看過されていたことを発見している。このアイソフォームは、ＣＲＢ１疾患において影響を受けた細胞である光受容体によって発現する唯一のアイソフォームである。マウスモデルを使用して、我々は、光受容体－グリア接合部におけるこのアイソフォームの機能を同定し、このアイソフォームの喪失が光受容体の死を加速することを実証する。
【0105】
材料および方法
供給源および試薬
抗体、プライマー、データセット、動物系統など、この研究で使用されたすべての主要な試薬は、主要な供給源の表に列挙されている（表１）。
供給源および試薬
抗体、プライマー、データセット、動物系統など、この研究で使用されたすべての主要な試薬は、主要な供給源の表に列挙されている（表１）。
【0106】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【表1-10】
【表1-11】
【表1-12】
【表1-13】
【0107】
動物
この研究でのマウスの使用は、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。すべての実験手順は、国立衛生研究所の実験動物の管理および使用に関するガイド（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に概説されているガイドラインに従った。マウスを１２時間の明暗サイクルで飼育し、餌および水を自由に摂取させた。
この研究でのマウスの使用は、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。すべての実験手順は、国立衛生研究所の実験動物の管理および使用に関するガイド（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に概説されているガイドラインに従った。マウスを１２時間の明暗サイクルで飼育し、餌および水を自由に摂取させた。
【0108】
ノックアウトマウスの生成
Ｃｒｂ１delBを生成するために、ＣＲＩＳＰＲガイドを、ゲノム座標ｃｈｒ１：１３９，２５６，４８６および１３９，２５４，８３７を標的とするように設計し、注射前にゲノムＤＮＡでインビトロにてバリデーションした。Ｃ５７Ｂｌ６Ｊ／ＳＪＬ Ｆ１ハイブリッドマウス系統を注射に使用した；両方の系統はＣｒｂ１遺伝子座で野生型である（つまり、ｒｄ８を有していない）。対立遺伝子を区別するためにＰＣＲプライマーを使用してファウンダーをジェノタイピングした（プライマー配列については表１を参照のこと）。ゲノム欠失のある２つのファウンダー系統が維持された。１つは欠失１３９，２５４，８３６～１３９，２５６，４８８（Δ１，６５２ｂｐ）プラス２つの追加のシトシンを有し、もう１つは１３９，２５４，８３６～１３９，２５６，４８８（Δ１，６５２ｂｐ）を有していた。両方の対立遺伝子は、Ｃｒｂ１－Ｂの第１のエクソン全体とプロモーター領域を効果的に削除し、現在、表現型的に識別不能である。Ｃｒｂ１nullを生成するために、ＣＲＩＳＰＲガイドを、ゲノム座標ｃｈｒ１：１３９，２５６，４８６～１３９，２４３，４０７を標的とするように設計し、注射前にゲノムＤＮＡでインビトロにてバリデーションした。Ｃ５７Ｂｌ６Ｊ／ＳＪＬ Ｆ１ハイブリッドマウス系統を注射に使用し、対立遺伝子を区別するためにＰＣＲプライマー（表１）を使用してファウンダーをジェノタイピングした。ゲノム欠失のある２つのファウンダー系統が維持された。１つは欠失ｃｈｒ１：１３９，２５６，８４４～１３９，２４３，４１１（Δ１３，４３３ｂｐ）を有し、もう１つは１３９，２５７，１９４～１３９，２４３，４１１（Δ１３，７８３ｂｐ）を有していた。両方の対立遺伝子は、Ｃｒｂ１－Ａのエクソン６およびエクソン７の一部に加えて、Ｃｒｂ１－Ｂの第１のエクソン全体とプロモーター領域を効果的に削除する。この削除により、エクソン７スプライスアクセプターが排除され、エクソン７が完全に除外されると予測される。エクソン５～８（Ｃｒｂ１－Ａにおけるように）および４～８（Ｃｒｂ１－Ａ２におけるように）をスプライシングすると、フレームシフトが生じる。エクソン６以降のＣｒｂ１－Ｃ固有の保持されたイントロンも完全に削除される。ファウンダー動物を、分析前に少なくとも２世代についてＣ５７Ｂｌ６Ｊマウスと戻し交配し、ジェノタイピングを行ってＳＪＬバックグラウンドからのｒｄ１変異を有していないことを確認した。この研究で生成された動物は、非営利使用のために研究団体に提供される。
Ｃｒｂ１delBを生成するために、ＣＲＩＳＰＲガイドを、ゲノム座標ｃｈｒ１：１３９，２５６，４８６および１３９，２５４，８３７を標的とするように設計し、注射前にゲノムＤＮＡでインビトロにてバリデーションした。Ｃ５７Ｂｌ６Ｊ／ＳＪＬ Ｆ１ハイブリッドマウス系統を注射に使用した；両方の系統はＣｒｂ１遺伝子座で野生型である（つまり、ｒｄ８を有していない）。対立遺伝子を区別するためにＰＣＲプライマーを使用してファウンダーをジェノタイピングした（プライマー配列については表１を参照のこと）。ゲノム欠失のある２つのファウンダー系統が維持された。１つは欠失１３９，２５４，８３６～１３９，２５６，４８８（Δ１，６５２ｂｐ）プラス２つの追加のシトシンを有し、もう１つは１３９，２５４，８３６～１３９，２５６，４８８（Δ１，６５２ｂｐ）を有していた。両方の対立遺伝子は、Ｃｒｂ１－Ｂの第１のエクソン全体とプロモーター領域を効果的に削除し、現在、表現型的に識別不能である。Ｃｒｂ１nullを生成するために、ＣＲＩＳＰＲガイドを、ゲノム座標ｃｈｒ１：１３９，２５６，４８６～１３９，２４３，４０７を標的とするように設計し、注射前にゲノムＤＮＡでインビトロにてバリデーションした。Ｃ５７Ｂｌ６Ｊ／ＳＪＬ Ｆ１ハイブリッドマウス系統を注射に使用し、対立遺伝子を区別するためにＰＣＲプライマー（表１）を使用してファウンダーをジェノタイピングした。ゲノム欠失のある２つのファウンダー系統が維持された。１つは欠失ｃｈｒ１：１３９，２５６，８４４～１３９，２４３，４１１（Δ１３，４３３ｂｐ）を有し、もう１つは１３９，２５７，１９４～１３９，２４３，４１１（Δ１３，７８３ｂｐ）を有していた。両方の対立遺伝子は、Ｃｒｂ１－Ａのエクソン６およびエクソン７の一部に加えて、Ｃｒｂ１－Ｂの第１のエクソン全体とプロモーター領域を効果的に削除する。この削除により、エクソン７スプライスアクセプターが排除され、エクソン７が完全に除外されると予測される。エクソン５～８（Ｃｒｂ１－Ａにおけるように）および４～８（Ｃｒｂ１－Ａ２におけるように）をスプライシングすると、フレームシフトが生じる。エクソン６以降のＣｒｂ１－Ｃ固有の保持されたイントロンも完全に削除される。ファウンダー動物を、分析前に少なくとも２世代についてＣ５７Ｂｌ６Ｊマウスと戻し交配し、ジェノタイピングを行ってＳＪＬバックグラウンドからのｒｄ１変異を有していないことを確認した。この研究で生成された動物は、非営利使用のために研究団体に提供される。
【0109】
ヒト網膜組織
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄプロトコル番号ＰＲＯ－０００５０８１０の下でＢｉｏＳｉｇｈｔ（Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）によって配布されたヒトドナーの眼を、Ｍｉｒａｃｌｅｓ ｉｎ Ｓｉｇｈｔ（Ｗｉｎｓｔｏｎ Ｓａｌｅｍ、ＮＣ）から入手した。死後のヒトドナーの眼を摘出し、解剖までＰＢＳ中の氷上に保存した。網膜を後極から解剖で取り出し、ＲＮＡの単離に進んだ。網膜疾患の病歴を有するドナーを、研究から除外した。
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄプロトコル番号ＰＲＯ－０００５０８１０の下でＢｉｏＳｉｇｈｔ（Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）によって配布されたヒトドナーの眼を、Ｍｉｒａｃｌｅｓ ｉｎ Ｓｉｇｈｔ（Ｗｉｎｓｔｏｎ Ｓａｌｅｍ、ＮＣ）から入手した。死後のヒトドナーの眼を摘出し、解剖までＰＢＳ中の氷上に保存した。網膜を後極から解剖で取り出し、ＲＮＡの単離に進んだ。網膜疾患の病歴を有するドナーを、研究から除外した。
【0110】
ＣＲＢ１－Ｂ抗体
Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｕｓｔｏｍ抗体サービス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＣＲＢ１－Ｂ特異的抗体を生成した。抗原は、ＣＲＢ１－Ｂの最終１６アミノ酸（ＲＭＮＤＥＰＶＶＥＷＧＡＱＥＮＹ；配列番号５３）であり、タンパク質レベルでこのアイソフォームに排他的であると予測されている。抗体は、最初の接種とそれに続く３回の追加免疫を伴う９０日間のプロトコルに従ってウサギにおいて作製された。抗体をアフィニティー精製して、Ｃｒｂ１delBノックアウト対照を用いたウエスタンブロットによってバリデーションした。ＣＲＢ１－Ｂは、予測サイズの１１０ｋＤａよりも大きい約１５０ｋＤａのバンドを生成する。ＰＮＧａｓｅ Ｆの添加によりバンドサイズ（示されていない）が低下したため、実験サイズ対予測サイズのこの不一致は、グリコシル化などの翻訳後修飾が原因である可能性がある。この研究で生成された抗体は、非営利使用のために研究団体に提供される。
Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｕｓｔｏｍ抗体サービス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＣＲＢ１－Ｂ特異的抗体を生成した。抗原は、ＣＲＢ１－Ｂの最終１６アミノ酸（ＲＭＮＤＥＰＶＶＥＷＧＡＱＥＮＹ；配列番号５３）であり、タンパク質レベルでこのアイソフォームに排他的であると予測されている。抗体は、最初の接種とそれに続く３回の追加免疫を伴う９０日間のプロトコルに従ってウサギにおいて作製された。抗体をアフィニティー精製して、Ｃｒｂ１delBノックアウト対照を用いたウエスタンブロットによってバリデーションした。ＣＲＢ１－Ｂは、予測サイズの１１０ｋＤａよりも大きい約１５０ｋＤａのバンドを生成する。ＰＮＧａｓｅ Ｆの添加によりバンドサイズ（示されていない）が低下したため、実験サイズ対予測サイズのこの不一致は、グリコシル化などの翻訳後修飾が原因である可能性がある。この研究で生成された抗体は、非営利使用のために研究団体に提供される。
【0111】
ＲＮＡ抽出
ＰａｃＢｉｏシークエンシング実験およびｑＲＴ－ＰＣＲには、Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスを使用した。マウスをイソフルランまたは低温麻酔（新生児のみ）で麻酔した後、断頭した。眼を摘出して網膜を解剖で取り出すか、頭蓋骨から脳を解剖して大脳皮質を取り出した。全ＲＮＡは、Ｔｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＡＭ９７３８）を製造元のプロトコルに従って使用して単離した。Ｔｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔで組織を、機械的に均質化した後、クロロホルムで相分離し、イソプロパノール沈殿させた。ＲＮＡサンプルは－８０℃で保存した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して、ＲＩＮ数を計算した。９を超えるＲＩＮ値のみをシークエンシングに使用した。
ＰａｃＢｉｏシークエンシング実験およびｑＲＴ－ＰＣＲには、Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスを使用した。マウスをイソフルランまたは低温麻酔（新生児のみ）で麻酔した後、断頭した。眼を摘出して網膜を解剖で取り出すか、頭蓋骨から脳を解剖して大脳皮質を取り出した。全ＲＮＡは、Ｔｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＡＭ９７３８）を製造元のプロトコルに従って使用して単離した。Ｔｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔで組織を、機械的に均質化した後、クロロホルムで相分離し、イソプロパノール沈殿させた。ＲＮＡサンプルは－８０℃で保存した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して、ＲＩＮ数を計算した。９を超えるＲＩＮ値のみをシークエンシングに使用した。
【0112】
マウスサンプル用のＰａｃＢｉｏライブラリーの調製
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＳＭＡＲＴｅｒ ｃＤＮＡキットを製造元のプロトコルに従って使用して、逆転写を行った。ｃＤＮＡをＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼで１２サイクル増幅した後、サイズを選択した（４．５～１０Ｋｂ）。捕捉のために、１ｕｇのｃＤＮＡを変性させ、ＤＴＴプライマーおよびＣｌｏｎｔｅｃｈプライマーでブロックし、ＮｉｍｂｌｅｇｅｎのＳｅｑＣａｐ ＥＺ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（≦２００Ｍｂ）カスタムベイツと４７°Ｃで２０時間混合した。非特異的結合を最小限に抑えるために、ビオチン化（Ｂｉｏｔｙｎａｙｌａｔｅｄ）ｃＤＮＡをストレプトアビジンビーズでプルダウンし、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄した。標的化ｃＤＮＡライブラリーを、ＴａｋａｒａＬＡＴａｑで１１サイクル増幅した。ＳＭＲＴ ｂｅｌｌライブラリーを構築し、追加のサイズ選択（４．５～１０Ｋｂ）を実行した後、ポリメラーゼをＰ６－Ｃ４ケミストリー（ＲＳＩＩ）に結合させた。ライブラリーを、８０ｐＭ（ＲＳＩＩ）でＭａｇＢｅａｄローディングを使用してＳＭＲＴセル上にロードした。ＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｌライブラリーの場合、ポリメラーゼバージョン２．０を使用して、シークエンシングプライマーバージョン２．１をアニーリングさせ、結合させた。結合した複合体を、ＰＢ Ａｍｐｕｒｅビーズで洗浄し、１２０分の事前伸長を伴う６ｐＭでの拡散によってロードした。
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＳＭＡＲＴｅｒ ｃＤＮＡキットを製造元のプロトコルに従って使用して、逆転写を行った。ｃＤＮＡをＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼで１２サイクル増幅した後、サイズを選択した（４．５～１０Ｋｂ）。捕捉のために、１ｕｇのｃＤＮＡを変性させ、ＤＴＴプライマーおよびＣｌｏｎｔｅｃｈプライマーでブロックし、ＮｉｍｂｌｅｇｅｎのＳｅｑＣａｐ ＥＺ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（≦２００Ｍｂ）カスタムベイツと４７°Ｃで２０時間混合した。非特異的結合を最小限に抑えるために、ビオチン化（Ｂｉｏｔｙｎａｙｌａｔｅｄ）ｃＤＮＡをストレプトアビジンビーズでプルダウンし、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄した。標的化ｃＤＮＡライブラリーを、ＴａｋａｒａＬＡＴａｑで１１サイクル増幅した。ＳＭＲＴ ｂｅｌｌライブラリーを構築し、追加のサイズ選択（４．５～１０Ｋｂ）を実行した後、ポリメラーゼをＰ６－Ｃ４ケミストリー（ＲＳＩＩ）に結合させた。ライブラリーを、８０ｐＭ（ＲＳＩＩ）でＭａｇＢｅａｄローディングを使用してＳＭＲＴセル上にロードした。ＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｌライブラリーの場合、ポリメラーゼバージョン２．０を使用して、シークエンシングプライマーバージョン２．１をアニーリングさせ、結合させた。結合した複合体を、ＰＢ Ａｍｐｕｒｅビーズで洗浄し、１２０分の事前伸長を伴う６ｐＭでの拡散によってロードした。
【0113】
ヒト網膜用のＰａｃＢｉｏライブラリー調製
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＳＭＡＲＴｅｒ ｃＤＮＡキットを製造元のプロトコルに従って使用して、逆転写を行った。Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒ ＧＸＬポリメラーゼを使用してｃＤＮＡを１４サイクル増幅した後、Ｂｌｕｅ Ｐｉｐｐｉｎのサイズを選択した（４．５～１０Ｋｂ）。捕捉には、１ｕｇの変性ｃＤＮＡを使用し、Ｔｗｉｓｔカスタムプローブとともに７０℃で２０時間インキュベートした。非特異的結合を低下させるために、ビオチン化されたｃＤＮＡをストレプトアビジンビーズでプルダウンし、Ｔｗｉｓｔハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄した。標的化ｃＤＮＡライブラリーを、ＴａｋａｒａＬＡＴａｑで１１サイクル増幅して、ライブラリー調製用に６５０ｎｇの濃縮ｃＤＮＡを得た。エキソヌクレアーゼ後ＳＭＲＴｂｅｌｌ鋳型調製キット１．０をライブラリー調製に使用し、続いてＢｌｕｅ Ｐｉｐｐｉｎサイズを選択した（４Ｋｂ～５０ＫＢ）サイズ選択後、１２０ｎｇのＤＮＡが得られた。ポリメラーゼバージョン２．０を使用して、シークエンシングプライマーバージョン３．０をアニーリングさせ、結合させた。結合した複合体を、ＰＢ Ａｍｐｕｒｅビーズで洗浄し、６ｐＭでの拡散によってＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｌ機器にロードした。
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＳＭＡＲＴｅｒ ｃＤＮＡキットを製造元のプロトコルに従って使用して、逆転写を行った。Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒ ＧＸＬポリメラーゼを使用してｃＤＮＡを１４サイクル増幅した後、Ｂｌｕｅ Ｐｉｐｐｉｎのサイズを選択した（４．５～１０Ｋｂ）。捕捉には、１ｕｇの変性ｃＤＮＡを使用し、Ｔｗｉｓｔカスタムプローブとともに７０℃で２０時間インキュベートした。非特異的結合を低下させるために、ビオチン化されたｃＤＮＡをストレプトアビジンビーズでプルダウンし、Ｔｗｉｓｔハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄した。標的化ｃＤＮＡライブラリーを、ＴａｋａｒａＬＡＴａｑで１１サイクル増幅して、ライブラリー調製用に６５０ｎｇの濃縮ｃＤＮＡを得た。エキソヌクレアーゼ後ＳＭＲＴｂｅｌｌ鋳型調製キット１．０をライブラリー調製に使用し、続いてＢｌｕｅ Ｐｉｐｐｉｎサイズを選択した（４Ｋｂ～５０ＫＢ）サイズ選択後、１２０ｎｇのＤＮＡが得られた。ポリメラーゼバージョン２．０を使用して、シークエンシングプライマーバージョン３．０をアニーリングさせ、結合させた。結合した複合体を、ＰＢ Ａｍｐｕｒｅビーズで洗浄し、６ｐＭでの拡散によってＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｌ機器にロードした。
【0114】
ＰａｃＢｉｏ生データの処理
Ｉｓｏ－Ｓｅｑソフトウェアを、生ＰａｃＢｉｏデータの最初の後処理に使用した。ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑ実験の場合、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴｏｏｌｓ．ｓｈを、パラメータ－－ｍｉｎＦｕｌｌＰａｓｓｅｓ １ －－ｍｉｎＰｒｅｄｉｃｔｅｄＡｃｃｕｒａｃｙ ８０ －－ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ／ｓｍｒｔａｎａｌｙｓｉｓ／ｃｕｒｒｅｎｔ／ａｎａｌｙｓｉｓ／ｅｔｃ／ａｌｇｏｒｉｔｈｍ＿ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ／２０１４－０９／を用いて使用して、ＰａｃＢｉｏ生リードから挿入のリードを生成した。挿入完全長のリードから、ｐｂｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ．ｐｙ ｃｌａｓｓｉｆｙを、パラメータ－－ｍｉｎ＿ｓｅｑ＿ｌｅｎ ５００を用いて使用し、３’プライマーに先行するポリＡテールに加えて５’および３’Ｃｌｏｎｔｅｃｈプライマーの存在を伴って、非キメラリード（ＦＬＮＣリード）を生成した。Ｍｅｇｆ１１ ＰＣＲ産物のシークエンシングでは、完全長リードが、Ｍｅｇｆ１１特有のプライマー配列（５’ＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＴＡＴＡＧＧＡ（配列番号５４）；Ｍｅｇｆ１１ロングの場合は３’配列ＣＴＧＧＣＴＧＣＡＴＴＧＣＡＴＴＧＧ（配列番号５５）、Ｍｅｇｆ１１ショートの場合はＧＧＴＧＴＣＣＡＡＴＡＡＡＧＴＣ（配列番号５６））の存在によって区別されることを除いて、パラメータは同じであった。
Ｉｓｏ－Ｓｅｑソフトウェアを、生ＰａｃＢｉｏデータの最初の後処理に使用した。ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑ実験の場合、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴｏｏｌｓ．ｓｈを、パラメータ－－ｍｉｎＦｕｌｌＰａｓｓｅｓ １ －－ｍｉｎＰｒｅｄｉｃｔｅｄＡｃｃｕｒａｃｙ ８０ －－ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ／ｓｍｒｔａｎａｌｙｓｉｓ／ｃｕｒｒｅｎｔ／ａｎａｌｙｓｉｓ／ｅｔｃ／ａｌｇｏｒｉｔｈｍ＿ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ／２０１４－０９／を用いて使用して、ＰａｃＢｉｏ生リードから挿入のリードを生成した。挿入完全長のリードから、ｐｂｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ．ｐｙ ｃｌａｓｓｉｆｙを、パラメータ－－ｍｉｎ＿ｓｅｑ＿ｌｅｎ ５００を用いて使用し、３’プライマーに先行するポリＡテールに加えて５’および３’Ｃｌｏｎｔｅｃｈプライマーの存在を伴って、非キメラリード（ＦＬＮＣリード）を生成した。Ｍｅｇｆ１１ ＰＣＲ産物のシークエンシングでは、完全長リードが、Ｍｅｇｆ１１特有のプライマー配列（５’ＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＴＡＴＡＧＧＡ（配列番号５４）；Ｍｅｇｆ１１ロングの場合は３’配列ＣＴＧＧＣＴＧＣＡＴＴＧＣＡＴＴＧＧ（配列番号５５）、Ｍｅｇｆ１１ショートの場合はＧＧＴＧＴＣＣＡＡＴＡＡＡＧＴＣ（配列番号５６））の存在によって区別されることを除いて、パラメータは同じであった。
【0115】
アイソフォームレベルのクラスタリング
ＦＬＮＣリードのアイソフォームへのクラスタリングを、２つの部分：１）コンセンサスアイソフォームを生成するために使用される、アイソフォームレベルのクラスタリングアルゴリズムＩＣＥ（誤り訂正のための反復クラスタリング）、および２）コンセンサスアイソフォームを研磨するために使用されるＱｕｉｖｅｒからなるＴｏＦＵを使用して実行した。転写アイソフォームを、ＴｏＦＵ＿ｗｒａｐ ｓｃｒｉｐｔを、パラメータ－－ｂｉｎ＿ｍａｎｕａｌ 「（０，４，６，９，３０）」－－ｑｕｉｖｅｒ－－ｈｑ＿ｑｕｉｖｅｒ＿ｍｉｎ＿ａｃｃｕｒａｃｙ ０．９９（Ｍｅｇｆ１１ ＰＣＲデータの場合は０．９８）を用いて使用して生成した。これにより、補正後の精度が≧９９％（Ｍｅｇｆ１１ ＰＣＲデータの場合は≧９８％）の高品質の完全長転写物が生成された。ＧＭＡＰ（バージョン１．３．３ｂ）を使用して、アラインメント精度（０．８５）およびカバレッジ（０．９９）のデフォルト値を用いて、アイソフォームをマウスゲノムｍｍ１０にアラインさせた。５’の末端長に基づく過剰クラスタリング（ｏｖｅｒ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）を防ぐために、まったく同じエクソン構造を共有するすべての転写物を折りたたむことにより、冗長なクラスターを除去した。短縮化ｍＲＮＡがアイソフォーム数の増加に与え得る影響を最小限に抑えるため、アイソフォームを定義するために、クラスタリングする必要がある２つ以上の独立した完全長リードのしきい値を設定した。
ＦＬＮＣリードのアイソフォームへのクラスタリングを、２つの部分：１）コンセンサスアイソフォームを生成するために使用される、アイソフォームレベルのクラスタリングアルゴリズムＩＣＥ（誤り訂正のための反復クラスタリング）、および２）コンセンサスアイソフォームを研磨するために使用されるＱｕｉｖｅｒからなるＴｏＦＵを使用して実行した。転写アイソフォームを、ＴｏＦＵ＿ｗｒａｐ ｓｃｒｉｐｔを、パラメータ－－ｂｉｎ＿ｍａｎｕａｌ 「（０，４，６，９，３０）」－－ｑｕｉｖｅｒ－－ｈｑ＿ｑｕｉｖｅｒ＿ｍｉｎ＿ａｃｃｕｒａｃｙ ０．９９（Ｍｅｇｆ１１ ＰＣＲデータの場合は０．９８）を用いて使用して生成した。これにより、補正後の精度が≧９９％（Ｍｅｇｆ１１ ＰＣＲデータの場合は≧９８％）の高品質の完全長転写物が生成された。ＧＭＡＰ（バージョン１．３．３ｂ）を使用して、アラインメント精度（０．８５）およびカバレッジ（０．９９）のデフォルト値を用いて、アイソフォームをマウスゲノムｍｍ１０にアラインさせた。５’の末端長に基づく過剰クラスタリング（ｏｖｅｒ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）を防ぐために、まったく同じエクソン構造を共有するすべての転写物を折りたたむことにより、冗長なクラスターを除去した。短縮化ｍＲＮＡがアイソフォーム数の増加に与え得る影響を最小限に抑えるため、アイソフォームを定義するために、クラスタリングする必要がある２つ以上の独立した完全長リードのしきい値を設定した。
【0116】
アイソフォームカタログ全体を生成するために、Ｉｓｏ－Ｓｅｑ（バージョン３）のクラスター関数を、デフォルトのパラメータを用いて使用して、完全データセット（すべての時点、網膜および皮質）を分析した。各実験からの最高品質の完全長リード（≧９９％の精度またはＱＶ≧２０）のみがこの分析に渡された。Ｉｓｏ－Ｓｅｑの結論として、３０遺伝子の８，２８７個のアイソフォームが同定された。アイソフォームの細分化の過剰クラスタリング（ｏｖｅｒｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）をさらに低減させるために、ＨＱリードをゲノム（マウスの場合はｍｍ１０、ヒトの場合はｈｇ１９）Ｃｕｐｃａｋｅ ＴｏＦＵ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／Ｍａｇｄｏｌｌ／ｃＤＮＡ＿Ｃｕｐｃａｋｅ）にマッピングした。
【0117】
最後に、ＩｓｏＰｏｐｓソフトウェアを使用して、推定されるスプリアス（ｓｐｕｒｉｏｕｓ）アイソフォームの追加フィルタリングを実行した。このフィルタリングの目的は、ゲノムＤＮＡ内のｃＤＮＡ短縮またはポリＡミスプライミングから生じるアーティファクトを除去することであった。フィルタリング方法の詳細は、ソフトウェアパッケージを説明するセクションで以下に提供されている。これらのフィルターを適用すると、４，１１６個のアイソフォームの最終カタログが得られた。非カノニカルなジャンクションを含有するアイソフォームは非常に豊富であるため、除外しなかった；しかし、それらが除外されたとしても、全体的なアイソフォーム数はわずかに減少するだけである（図１０Ｃ）。
最終アイソフォームカタログには、アイソフォームの数だけでなく、各アイソフォームについて取得された完全長のリードの数も明記されていた。我々の分析のうちの一部について、これらのリード計数を報告した（例えば、図２Ｃ、Ｅ；図３Ｂ、Ｄ）。これらのデータは、特定の遺伝子の全体的な発現がそのアイソフォームポートフォリオ全体にどのように分布しているかを理解するのに役立つ。ＰａｃＢｉｏデータが独立したショートリードＲＮＡ－ｓｅｑデータによって支持されていない限り、特定のアイソフォームの発現レベルについて結論を出すことは回避した（例：図５Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）。
最終アイソフォームカタログには、アイソフォームの数だけでなく、各アイソフォームについて取得された完全長のリードの数も明記されていた。我々の分析のうちの一部について、これらのリード計数を報告した（例えば、図２Ｃ、Ｅ；図３Ｂ、Ｄ）。これらのデータは、特定の遺伝子の全体的な発現がそのアイソフォームポートフォリオ全体にどのように分布しているかを理解するのに役立つ。ＰａｃＢｉｏデータが独立したショートリードＲＮＡ－ｓｅｑデータによって支持されていない限り、特定のアイソフォームの発現レベルについて結論を出すことは回避した（例：図５Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）。
【0118】
ＩｓｏＰｏｐｓ Ｒパッケージ
ＰａｃＢｉｏトランスクリプトーム配列出力の簡便な分析および表示のためのＲソフトウェアのパッケージを開発した。ＩｓｏＰｏｐｓ Ｒパッケージにより、ユーザーは、この研究で説明した分析の多くを、自身のロングリードデータに対して実行することができる。
ＰａｃＢｉｏトランスクリプトーム配列出力の簡便な分析および表示のためのＲソフトウェアのパッケージを開発した。ＩｓｏＰｏｐｓ Ｒパッケージにより、ユーザーは、この研究で説明した分析の多くを、自身のロングリードデータに対して実行することができる。
【0119】
パッケージは以下の機能を提供する。第１に、パッケージにより、短縮およびスプリアスアイソフォームのフィルタリングが可能になり、下流分析が容易になる。第２に、パッケージにより、エクソン使用のマップを表示して、ユーザーがアイソフォームの違いを視覚的に比較できるようにする。第３に、パッケージにより、個々の遺伝子内およびデータセット全体のアイソフォームの発現レベルをまとめたプロットを生成する。これらには、ツリープロット（図２Ｅ）と、クラゲプロット（ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ ｐｌｏｔ）と呼ばれるローレンツプロットの変形（図２Ｃ）が含まれる。第４に、パッケージにより、同様のアイソフォームをクラスタリングし、デンドログラムおよび３次元ＰＣＡプロットなどの種々の次元削減プロットにデータを表示する。第５に、パッケージにより、遺伝子のアイソフォームの長さの分布または各アイソフォームで使用されるエクソンの数などの要約統計量を提供する。最後に、パッケージにより、相互相関を実行し、ユーザーは、ある特定のエクソンが同じ転写物に一緒に現れる傾向があるかどうか求めることができる。これらの機能に関連する方法を以下に説明する。
【0120】
フィルタリング
ＩｓｏＰｏｐｓアイソフォームフィルタリングプロセスは、３ステップからなる：第１に、ｎ個未満のエクソンを含有する転写物を除去する。我々の研究では、我々のデータセット内の遺伝子にそのような短いアイソフォームはないと予想したため、ｎを４に設定した。エクソン数を定量化するために、エクソン注釈を参照せず、代わりに、非連続（ｎｏｎ－ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）ゲノムセグメントの数（またはジャンクションの数に１を加えた数）を各アイソフォームのエクソン数として定義した。これらの配列は典型的には単一の「エクソン」にマッピングされるため、このフィルタリングステップにより、ゲノムポリＡのミスプライミングから生じるほとんどのスプリアス転写物が除去された。
ＩｓｏＰｏｐｓアイソフォームフィルタリングプロセスは、３ステップからなる：第１に、ｎ個未満のエクソンを含有する転写物を除去する。我々の研究では、我々のデータセット内の遺伝子にそのような短いアイソフォームはないと予想したため、ｎを４に設定した。エクソン数を定量化するために、エクソン注釈を参照せず、代わりに、非連続（ｎｏｎ－ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）ゲノムセグメントの数（またはジャンクションの数に１を加えた数）を各アイソフォームのエクソン数として定義した。これらの配列は典型的には単一の「エクソン」にマッピングされるため、このフィルタリングステップにより、ゲノムポリＡのミスプライミングから生じるほとんどのスプリアス転写物が除去された。
【0121】
第２に、短縮アーティファクトをフィルタリングで除去した。短縮化アイソフォームを同定するために、潜在的に価値のある固有の転写物を破棄せずに、可能な限り徹底的にフィルタリングするように設計されたアルゴリズムを開発した。特に、すべての固有のスプライシングイベントを保持し、固有の転写開始部位（ＴＳＳ）および転写終了部位（ＴＴＳ）を適度に許容したいと考えた。アルゴリズムは、アイソフォームペアＡおよびＢのエクソン境界のセット（アクセプターとドナーのスプライス部位の座標）を比較し、以下の２つの規則を適用する。規則１：Ｂにおけるすべてのエクソン境界がＡにおけるエクソン境界の連続サブセットを形成する場合、ＢはＡの短縮化である。イントロンが保持された転写物のフィルタリングを回避するために、サブセットが連続的である必要があった。規則２：以下の３つの条件すべてが満たされる場合、ＢはＡの短縮化である。１）ＢのＴＳＳはＡのエクソン内にある；２）ＢのＴＴＳは、Ａ内か、または遺伝子の３’側のほとんどのエクソン内／外側のいずれかにみられる；３）Ｂの内部エクソン境界（つまり、Ｂの５’および３’側のほとんどのエクソン境界を除外する）は、Ａの連続サブセットである。
第３に、これらの非常に少量のアイソフォームが実験的または生物学的ノイズを構成する可能性があるという仮定の下で、各遺伝子のアイソフォームのうちの最も少量の５％をフィルタリングで除去した。
第３に、これらの非常に少量のアイソフォームが実験的または生物学的ノイズを構成する可能性があるという仮定の下で、各遺伝子のアイソフォームのうちの最も少量の５％をフィルタリングで除去した。
【0122】
ピアソン相関
この機能により、アイソフォーム間でのエクソンの共起の分析が可能になる。所与の遺伝子の各アイソフォームを、そのｃＤＮＡ配列内でコールされたエクソンを表す一連のバイナリ値でラベル付けした。エクソンコールは、転写物内の各エクソンの最初の３０ｂｐまたは最後の３０ｂｐのいずれかの完全一致を検索することによって決定された。エクソンの定義は、ＰａｃＢｉｏアイソフォームＧＦＦファイルに由来していた。アイソフォームを、完全長のリード計数によって重み付けした後、エクソンコール間のペアワイズピアソン相関を計算した。
この機能により、アイソフォーム間でのエクソンの共起の分析が可能になる。所与の遺伝子の各アイソフォームを、そのｃＤＮＡ配列内でコールされたエクソンを表す一連のバイナリ値でラベル付けした。エクソンコールは、転写物内の各エクソンの最初の３０ｂｐまたは最後の３０ｂｐのいずれかの完全一致を検索することによって決定された。エクソンの定義は、ＰａｃＢｉｏアイソフォームＧＦＦファイルに由来していた。アイソフォームを、完全長のリード計数によって重み付けした後、エクソンコール間のペアワイズピアソン相関を計算した。
【0123】
Ｋ－ｍｅｒベクトル化
ＩｓｏＰｏｐｓにより、アイソフォーム間の配列の差異を定量化することができる。アイソフォーム間の相対的な差異を定量化するために、各アイソフォームのｃＤＮＡ配列（またはそれらの予測されるＯＲＦアミノ酸配列）のベクトル化間のユークリッド距離を計算した。ｔｅｘｔ２ｖｅｃ Ｒパッケージを使用して、各アイソフォームのベクトルを生成し、ベクトル内の各要素は、ある特定のｋ－ｍｅｒ（配列断片）がアイソフォーム内に出現する回数に等しい。ｋ＝６を選択して、アイソフォーム内のすべての可能な６－ｍｅｒを計数し、過剰な計算リソースを必要とせずにアイソフォーム間のｋ－ｍｅｒ計数の一意性を最大化した。次に、ｋ－ｍｅｒ計数の各アイソフォームのベクトルを合計して１に正規化したため、これらのベクトルから計算されたアイソフォームの距離は、転写物間の長さの差異によって支配されない。
ＩｓｏＰｏｐｓにより、アイソフォーム間の配列の差異を定量化することができる。アイソフォーム間の相対的な差異を定量化するために、各アイソフォームのｃＤＮＡ配列（またはそれらの予測されるＯＲＦアミノ酸配列）のベクトル化間のユークリッド距離を計算した。ｔｅｘｔ２ｖｅｃ Ｒパッケージを使用して、各アイソフォームのベクトルを生成し、ベクトル内の各要素は、ある特定のｋ－ｍｅｒ（配列断片）がアイソフォーム内に出現する回数に等しい。ｋ＝６を選択して、アイソフォーム内のすべての可能な６－ｍｅｒを計数し、過剰な計算リソースを必要とせずにアイソフォーム間のｋ－ｍｅｒ計数の一意性を最大化した。次に、ｋ－ｍｅｒ計数の各アイソフォームのベクトルを合計して１に正規化したため、これらのベクトルから計算されたアイソフォームの距離は、転写物間の長さの差異によって支配されない。
【0124】
アイソフォームクラスタリング
アイソフォームをクラスタリングするために、アイソフォームのｋ－ｍｅｒ計数ベクトル化間のペアワイズユークリッド距離を計算した。次に、デフォルト設定および「ｃｏｍｐｌｅｔｅ」の凝集法を使用して、Ｒベースアルゴリズムｈｃｌｕｓｔを使用して階層型凝集クラスタリングを実行した。クラスタリングのデンドログラムプロットを、ｄｅｎｄｅｘｔｅｎｄ Ｒパッケージによって生成した。
アイソフォームをクラスタリングするために、アイソフォームのｋ－ｍｅｒ計数ベクトル化間のペアワイズユークリッド距離を計算した。次に、デフォルト設定および「ｃｏｍｐｌｅｔｅ」の凝集法を使用して、Ｒベースアルゴリズムｈｃｌｕｓｔを使用して階層型凝集クラスタリングを実行した。クラスタリングのデンドログラムプロットを、ｄｅｎｄｅｘｔｅｎｄ Ｒパッケージによって生成した。
【0125】
次元削減
ＰＣＡおよびｔ－ＳＮＥを、ｋ－ｍｅｒ計数のベクトル化で直接実行した。デフォルト設定で、ＰＣＡにＲベースアルゴリズムｐｒｃｏｍｐを使用した。ｔ－ＳＮＥの場合、Ｒｔｓｎｅパッケージのｅｘａｃｔ ｔ－ＳＮＥアルゴリズム（ｔｈｅｔａ＝０、ｍａｘｉｍｕｍ ｉｔｅｒａｔｉｏｎｓ＝１０００、ｐｅｒｐｌｅｘｉｔｙ＝３５）を実行し、これには、データ前処理のためのＰＣＡのラウンドが含まれる。ｔ－ＳＮＥの結果は、アルゴリズムによって出力されたものと同じ次元数でプロットされる（つまり、３Ｄ ｔ－ＳＮＥプロットはｎｄｉｍ＝３で生成された）。
ＰＣＡおよびｔ－ＳＮＥを、ｋ－ｍｅｒ計数のベクトル化で直接実行した。デフォルト設定で、ＰＣＡにＲベースアルゴリズムｐｒｃｏｍｐを使用した。ｔ－ＳＮＥの場合、Ｒｔｓｎｅパッケージのｅｘａｃｔ ｔ－ＳＮＥアルゴリズム（ｔｈｅｔａ＝０、ｍａｘｉｍｕｍ ｉｔｅｒａｔｉｏｎｓ＝１０００、ｐｅｒｐｌｅｘｉｔｙ＝３５）を実行し、これには、データ前処理のためのＰＣＡのラウンドが含まれる。ｔ－ＳＮＥの結果は、アルゴリズムによって出力されたものと同じ次元数でプロットされる（つまり、３Ｄ ｔ－ＳＮＥプロットはｎｄｉｍ＝３で生成された）。
【0126】
ローレンツ（クラゲ）プロット
累積パーセント存在量を、各遺伝子のアイソフォームについて独立して計算した。まず、完全長のリード計数を遺伝子全体で正規化し、「存在パーセント」とラベル付けした。次に、所与の遺伝子のアイソフォームを、存在パーセントの降順でランク付けした。最後に、降順での存在パーセントの部分和を介して、各アイソフォームの累積パーセント存在量を計算した。次に、アイソフォームをｙ軸に沿ってこの順序でプロットし、ｘ軸に沿った累積パーセント存在量に従って配置した。
ＯＲＦ予測
Ｓｑａｎｔｉ67を、ＰａｃＢｉｏアイソフォームのＯＲＦ予測およびゲノム修正に使用した。
累積パーセント存在量を、各遺伝子のアイソフォームについて独立して計算した。まず、完全長のリード計数を遺伝子全体で正規化し、「存在パーセント」とラベル付けした。次に、所与の遺伝子のアイソフォームを、存在パーセントの降順でランク付けした。最後に、降順での存在パーセントの部分和を介して、各アイソフォームの累積パーセント存在量を計算した。次に、アイソフォームをｙ軸に沿ってこの順序でプロットし、ｘ軸に沿った累積パーセント存在量に従って配置した。
ＯＲＦ予測
Ｓｑａｎｔｉ67を、ＰａｃＢｉｏアイソフォームのＯＲＦ予測およびゲノム修正に使用した。
【0127】
ＲＮＡ－ｓｅｑ分析
ＲＮＡ－ｓｅｑ ｆａｓｔｑファイルをＮＣＢＩ ＧＥＯからダウンロードし、Ｈｉｓａｔ２（バージョン２．１．０）を使用して、参照ビルドｍｍ１０（マウス用）、ｈｇ１９（ヒト用）、ｂｏｓＴａｕ８（ウシ）、ｄａｎＲｅｒ１１（ゼブラフィッシュ）、およびｒｎ６（ラット）にデータをマッピングした。データセットＧＳＥ１０１９８６およびＧＳＥ７４６６０を、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（バージョン２．２．１）により定量化した。データセットＧＳＥ９４４３７、ＧＳＥ１０１５４４、ＧＥＳ４９９１１、およびＧＳＥ８４９３２を、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅ（バージョン１．３．３ｂ）を使用して定量化した。アイソフォーム定量分析のすべての参照注釈を、３０遺伝子のそれぞれについて上位３つの最も豊富なアイソフォームを使用して、Ｉｓｏ－ＳｅｑＧＦＦ出力とマージされた対応する参照ＧＴＦファイルから生成した。
ＲＮＡ－ｓｅｑ ｆａｓｔｑファイルをＮＣＢＩ ＧＥＯからダウンロードし、Ｈｉｓａｔ２（バージョン２．１．０）を使用して、参照ビルドｍｍ１０（マウス用）、ｈｇ１９（ヒト用）、ｂｏｓＴａｕ８（ウシ）、ｄａｎＲｅｒ１１（ゼブラフィッシュ）、およびｒｎ６（ラット）にデータをマッピングした。データセットＧＳＥ１０１９８６およびＧＳＥ７４６６０を、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（バージョン２．２．１）により定量化した。データセットＧＳＥ９４４３７、ＧＳＥ１０１５４４、ＧＥＳ４９９１１、およびＧＳＥ８４９３２を、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅ（バージョン１．３．３ｂ）を使用して定量化した。アイソフォーム定量分析のすべての参照注釈を、３０遺伝子のそれぞれについて上位３つの最も豊富なアイソフォームを使用して、Ｉｓｏ－ＳｅｑＧＦＦ出力とマージされた対応する参照ＧＴＦファイルから生成した。
【0128】
ＲＮＡ－ｓｅｑデータからのアイソフォーム予測
アイソフォームの計算予測を、参照アセンブリなしでＣｕｆｆｌｉｎｋｓ（バージョン２．２．１）またはＳｔｒｉｎｇｔｉｅ（バージョン１．３．３ｂ）を使用して、ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットＧＳＥ１０１９８６およびＧＳＥ７９４１６で実行した。得られたアセンブリを、Ｃｕｆｆｍｅｒｇｅを使用してマージして、最終参照アセンブリを作出した。データセット間のアイソフォームマッチングを、Ｓｑａｎｔｉを使用して実行した。アイソフォームは、Ｓｑａｎｔｉによって「ｆｕｌｌ－ｓｐｌｉｃｅ ｍａｔｃｈ」として識別された場合、一致と考えられた。他のすべてのアイソフォームは、不一致と考えられた。
アイソフォームの計算予測を、参照アセンブリなしでＣｕｆｆｌｉｎｋｓ（バージョン２．２．１）またはＳｔｒｉｎｇｔｉｅ（バージョン１．３．３ｂ）を使用して、ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットＧＳＥ１０１９８６およびＧＳＥ７９４１６で実行した。得られたアセンブリを、Ｃｕｆｆｍｅｒｇｅを使用してマージして、最終参照アセンブリを作出した。データセット間のアイソフォームマッチングを、Ｓｑａｎｔｉを使用して実行した。アイソフォームは、Ｓｑａｎｔｉによって「ｆｕｌｌ－ｓｐｌｉｃｅ ｍａｔｃｈ」として識別された場合、一致と考えられた。他のすべてのアイソフォームは、不一致と考えられた。
【0129】
ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームと他のデータベースとのマッチング
Ｓｑａｎｔｉを、公開データベースのアイソフォームのバリデーション、およびＣｕｆｆｌｉｎｋｓ／Ｓｔｒｉｎｇｔｉｅの予測アイソフォームデータベースのバリデーションに使用した。参照ＧＴＦ（計算アセンブリ、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑまたはＵＣＳＣ Ｇｅｎｅｓのいずれかから）を入力として使用して、バリデーションを実行した。アイソフォームを、参照に対して「ｆｕｌｌ－ｓｐｌｉｃｅ＿ｍａｔｃｈ」であるかどうかをバリデーションした。他のすべてのアイソフォームは、別個のものと考えられた。
Ｓｑａｎｔｉを、公開データベースのアイソフォームのバリデーション、およびＣｕｆｆｌｉｎｋｓ／Ｓｔｒｉｎｇｔｉｅの予測アイソフォームデータベースのバリデーションに使用した。参照ＧＴＦ（計算アセンブリ、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑまたはＵＣＳＣ Ｇｅｎｅｓのいずれかから）を入力として使用して、バリデーションを実行した。アイソフォームを、参照に対して「ｆｕｌｌ－ｓｐｌｉｃｅ＿ｍａｔｃｈ」であるかどうかをバリデーションした。他のすべてのアイソフォームは、別個のものと考えられた。
【0130】
ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームのスプライスジャンクションおよび５’末端部のバリデーション
ＲＮＡ－ｓｅｑデータによるＰａｃＢｉｏアイソフォームのジャンクションカバレッジを、Ｓｑａｎｔｉソフトウェアを使用して評価した。Ｓｑａｎｔｉのジャンクション入力ファイルを、ＳＴＡＲ（ＳＴＡＲ＿２．６．０ａ）を使用して、マウス網膜および皮質ＲＮＡ－ｓｅｑデータ（ＧＳＥ１０１９８６およびＧＳＥ７９４１６）を、ＰａｃＢｉｏＧＦＦ出力を使用して作成されたカスタムインデックスを用いて、ｍｍ１０ゲノムにマッピングすることによって生成した。ジャンクションを、カノニカル（ＧＴ－ＡＧ、ＧＣ－ＡＧ、およびＡＴ－ＡＣ）または非カノニカル（他のすべての組み合わせ）のいずれかに分類した。
成体マウスの網膜からのＣＡＧＥ ＲＮＡ－ｓｅｑデータ（ＤＲＡ００２４１０；サンプルＳｈａｍ１、Ｓｈａｍ２、およびＳｈａｍ３）を、Ｈｉｓａｔ２を使用してゲノム（ｍｍ１０）にアラインさせた。ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームのエクソン１でのリードカバレッジを、ＢｅｄＴｏｏｌｓ（バージョン２．２９．２）を使用して決定した。正規化アイソフォーム長全体にわたるＣＡＧＥデータカバレッジを、Ｑｕａｌｉｍａｐ（バージョン２．２．１）を使用して実行した。
ＲＮＡ－ｓｅｑデータによるＰａｃＢｉｏアイソフォームのジャンクションカバレッジを、Ｓｑａｎｔｉソフトウェアを使用して評価した。Ｓｑａｎｔｉのジャンクション入力ファイルを、ＳＴＡＲ（ＳＴＡＲ＿２．６．０ａ）を使用して、マウス網膜および皮質ＲＮＡ－ｓｅｑデータ（ＧＳＥ１０１９８６およびＧＳＥ７９４１６）を、ＰａｃＢｉｏＧＦＦ出力を使用して作成されたカスタムインデックスを用いて、ｍｍ１０ゲノムにマッピングすることによって生成した。ジャンクションを、カノニカル（ＧＴ－ＡＧ、ＧＣ－ＡＧ、およびＡＴ－ＡＣ）または非カノニカル（他のすべての組み合わせ）のいずれかに分類した。
成体マウスの網膜からのＣＡＧＥ ＲＮＡ－ｓｅｑデータ（ＤＲＡ００２４１０；サンプルＳｈａｍ１、Ｓｈａｍ２、およびＳｈａｍ３）を、Ｈｉｓａｔ２を使用してゲノム（ｍｍ１０）にアラインさせた。ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームのエクソン１でのリードカバレッジを、ＢｅｄＴｏｏｌｓ（バージョン２．２９．２）を使用して決定した。正規化アイソフォーム長全体にわたるＣＡＧＥデータカバレッジを、Ｑｕａｌｉｍａｐ（バージョン２．２．１）を使用して実行した。
【0131】
クロマチンアクセシビリティ
公的に入手可能なＡＴＡＣ－ｓｅｑデータを使用して、マウスおよびヒトの網膜におけるクロマチンのアクセシビリティ（すなわち、推定プロモーター部位）を評価した68~70。ＥＮＣＯＤＥプロジェクトからのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性データを、マウス皮質の評価に使用した71。すべての生ｆａｓｔｑファイルをＳＲＡからダウンロードしたか、またはアラインされたｂａｍファイルをＥＮＣＯＤＥデータポータルからダウンロードした。リードを、ｆａｓｔｑｃ（バージョン０．１１．３）およびｔｒｉｍ ｇａｌｏｒｅ（バージョン０．４．１）を使用してトリミングし、ｂｏｗｔｉｅ２（バージョン２．２．５）を使用してｍｍ９またはｈｇ１９ゲノムのいずれかにマッピングした。アラインされたｂａｍファイルを、品質（＞ Ｑ３０）でフィルタリングし、ミトコンドリア領域およびブラックリスト登録領域を除去した。ファイルを、ｄｅｅｐｔｏｏｌｓ（バージョン３．１．０）を使用してｂｉｇｗｉｇに変換し、ＩＧＶ（バージョン２．４．１６）で視覚化した。同じ実験のすべてのトラックを、グループスケーリングする（ｇｒｏｕｐ ｓｃａｌｅｄ）。
公的に入手可能なＡＴＡＣ－ｓｅｑデータを使用して、マウスおよびヒトの網膜におけるクロマチンのアクセシビリティ（すなわち、推定プロモーター部位）を評価した68~70。ＥＮＣＯＤＥプロジェクトからのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性データを、マウス皮質の評価に使用した71。すべての生ｆａｓｔｑファイルをＳＲＡからダウンロードしたか、またはアラインされたｂａｍファイルをＥＮＣＯＤＥデータポータルからダウンロードした。リードを、ｆａｓｔｑｃ（バージョン０．１１．３）およびｔｒｉｍ ｇａｌｏｒｅ（バージョン０．４．１）を使用してトリミングし、ｂｏｗｔｉｅ２（バージョン２．２．５）を使用してｍｍ９またはｈｇ１９ゲノムのいずれかにマッピングした。アラインされたｂａｍファイルを、品質（＞ Ｑ３０）でフィルタリングし、ミトコンドリア領域およびブラックリスト登録領域を除去した。ファイルを、ｄｅｅｐｔｏｏｌｓ（バージョン３．１．０）を使用してｂｉｇｗｉｇに変換し、ＩＧＶ（バージョン２．４．１６）で視覚化した。同じ実験のすべてのトラックを、グループスケーリングする（ｇｒｏｕｐ ｓｃａｌｅｄ）。
【0132】
シャノン多様度指数
シャノン指数を、ＲパッケージＶｅｇａｎ（https://github.com/vegandevs/vegan）を使用して以下の等式に従って計算した。
Ｈ’＝－Σ ｐi ｌｎ ｐi
（式中、ｐiは遺伝子中で見出されたアイソフォームの割合（ｐi＝ｎi／Ｎ）、ｎiはアイソフォームｉのリード数、Ｎは遺伝子のリード総数である）。
シャノン指数を、ＲパッケージＶｅｇａｎ（https://github.com/vegandevs/vegan）を使用して以下の等式に従って計算した。
Ｈ’＝－Σ ｐi ｌｎ ｐi
（式中、ｐiは遺伝子中で見出されたアイソフォームの割合（ｐi＝ｎi／Ｎ）、ｎiはアイソフォームｉのリード数、Ｎは遺伝子のリード総数である）。
【0133】
ｓａｓｈｉｍｉプロット
ｓａｓｈｉｍｉプロットを、ＰａｃＢｉｏで生成されたＧＦＦファイルを用いてＧｖｉｚ（バージョン１．２４．０）を使用して生成した。ＧＭＡＰ（バージョン２０１４－０９－３０）を使用して、ＰａｃＢｉｏ ＦＬＮＣ．ｆａｓｔｑ（≧８５％の精度）ファイルをゲノム（ｍｍ１０、ｈｇ１９）にマッピングすることによって、プロットのリードを生成した。我々の最終データセットのようにフィルタリングで除去されていなかったＦＬＮＣリードのエラー率は比較的高かったため、また発現は遺伝子によって異なっていたため、最小ジャンクションカバレッジはプロットごとに変動した。最小ジャンクションカバレッジは、Ｃｒｂ１マウス網膜で６０、Ｃｒｂ１皮質で４、ヒトＣＲＢ１で１１、Ｍｅｇｆ１１で４に設定された。
ｓａｓｈｉｍｉプロットを、ＰａｃＢｉｏで生成されたＧＦＦファイルを用いてＧｖｉｚ（バージョン１．２４．０）を使用して生成した。ＧＭＡＰ（バージョン２０１４－０９－３０）を使用して、ＰａｃＢｉｏ ＦＬＮＣ．ｆａｓｔｑ（≧８５％の精度）ファイルをゲノム（ｍｍ１０、ｈｇ１９）にマッピングすることによって、プロットのリードを生成した。我々の最終データセットのようにフィルタリングで除去されていなかったＦＬＮＣリードのエラー率は比較的高かったため、また発現は遺伝子によって異なっていたため、最小ジャンクションカバレッジはプロットごとに変動した。最小ジャンクションカバレッジは、Ｃｒｂ１マウス網膜で６０、Ｃｒｂ１皮質で４、ヒトＣＲＢ１で１１、Ｍｅｇｆ１１で４に設定された。
【0134】
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ
マウス網膜発生をプロファイリングする生ｓｃＲＮＡｓｅｑデータ48を、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ（ｖ３．０、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して、カスタムｍｍ１０マウスゲノム／トランスクリプトームにアラインさせた。ｍｍ１０参照ゲノムおよびトランスクリプトームを、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓからダウンロードし、ＧＴＦファイルを修正して優性Ｃｒｂ１アイソフォーム（Ｃｒｂ１－ＡおよびＣｒｂ１－Ｂ）を独立遺伝子として同定した。ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ ｃｏｕｎｔ関数は、単一遺伝子に一意にマッピングされるアラインメントのみを考慮するため、出力ファイルは、独立した３’エクソン内にマップされるか、最も遠位の最終共有エクソンからこれらにスプライシングされるリードのみを報告する。
その後、データを、以前に報告されたとおりに正確に分析した48。この新しい分析の各細胞のバーコードを、元の原稿の分類に基づいて細胞型に割り当てた。Ｍｏｎｏｃｌｅ（ｖ３．０）72、73およびカスタム Ｒ ｓｃｒｉｐｔｓを、データの視覚化およびプロットに使用した。
マウス網膜発生をプロファイリングする生ｓｃＲＮＡｓｅｑデータ48を、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ（ｖ３．０、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して、カスタムｍｍ１０マウスゲノム／トランスクリプトームにアラインさせた。ｍｍ１０参照ゲノムおよびトランスクリプトームを、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓからダウンロードし、ＧＴＦファイルを修正して優性Ｃｒｂ１アイソフォーム（Ｃｒｂ１－ＡおよびＣｒｂ１－Ｂ）を独立遺伝子として同定した。ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ ｃｏｕｎｔ関数は、単一遺伝子に一意にマッピングされるアラインメントのみを考慮するため、出力ファイルは、独立した３’エクソン内にマップされるか、最も遠位の最終共有エクソンからこれらにスプライシングされるリードのみを報告する。
その後、データを、以前に報告されたとおりに正確に分析した48。この新しい分析の各細胞のバーコードを、元の原稿の分類に基づいて細胞型に割り当てた。Ｍｏｎｏｃｌｅ（ｖ３．０）72、73およびカスタム Ｒ ｓｃｒｉｐｔｓを、データの視覚化およびプロットに使用した。
【0135】
ＢａｓｅＳｃｏｐｅ インサイチュハイブリダイゼーション
眼を摘出し、網膜を眼盃（ｅｙｅｃｕｐ）から解剖で取り出し、ＰＢＳで洗浄し、４％ホルムアルデヒドを補充したＰＢＳで室温にて２４時間固定した。網膜を、３０％スクロースを補充したＰＢＳ中で４度にて一晩浸透圧平衡によって凍結保護した。網膜を組織凍結培地に包埋し、ドライアイスで冷却した２－メチルブタンで瞬間冷凍した。網膜の接線方向切片を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｉｃｒｏｍ ＨＭ ５５０クリオスタットで１８μｍに切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライドに接着させた。
プローブを、種々のスプライシングイベントを検出するためにスプライスジャンクションに対して設計した（配列については表１を参照のこと）。Ｒｅｄ検出キットを使用して、プローブ検出を実行した。ＢａｓｅＳｃｏｐｅ インサイチュハイブリダイゼーションを、わずかな変更を加えた製造元のプロトコルに従って実行した。固定凍結網膜を６０℃のオーブンで１時間焼き、その後、以下の例外を除いて、標準の固定凍結前処理条件で進めた：前処理２でのインキュベーションを２分に短縮し、前処理３を室温で１３分に短縮した。ＢａｓｅＳｃｏｐｅプローブを組織に加え、４０℃で２時間ハイブリダイズさせた。スライドを洗浄緩衝液で洗浄し、ＲｅｄＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘ検出キットを使用してプローブを検出した。一次抗体と一晩インキュベートすることによりプローブを検出した後、免疫染色を実行した。Ｍｅｇｆ１１ ＢａｓｅＳｃｏｐｅの場合、α－カルビンジン抗体を使用してスターバーストアマクリン細胞および水平細胞を標識化した。組織をＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体を適用して室温で１時間インキュベートした。スライドをもう一度洗浄し、カバーガラスを取り付けた。
眼を摘出し、網膜を眼盃（ｅｙｅｃｕｐ）から解剖で取り出し、ＰＢＳで洗浄し、４％ホルムアルデヒドを補充したＰＢＳで室温にて２４時間固定した。網膜を、３０％スクロースを補充したＰＢＳ中で４度にて一晩浸透圧平衡によって凍結保護した。網膜を組織凍結培地に包埋し、ドライアイスで冷却した２－メチルブタンで瞬間冷凍した。網膜の接線方向切片を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｉｃｒｏｍ ＨＭ ５５０クリオスタットで１８μｍに切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライドに接着させた。
プローブを、種々のスプライシングイベントを検出するためにスプライスジャンクションに対して設計した（配列については表１を参照のこと）。Ｒｅｄ検出キットを使用して、プローブ検出を実行した。ＢａｓｅＳｃｏｐｅ インサイチュハイブリダイゼーションを、わずかな変更を加えた製造元のプロトコルに従って実行した。固定凍結網膜を６０℃のオーブンで１時間焼き、その後、以下の例外を除いて、標準の固定凍結前処理条件で進めた：前処理２でのインキュベーションを２分に短縮し、前処理３を室温で１３分に短縮した。ＢａｓｅＳｃｏｐｅプローブを組織に加え、４０℃で２時間ハイブリダイズさせた。スライドを洗浄緩衝液で洗浄し、ＲｅｄＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘ検出キットを使用してプローブを検出した。一次抗体と一晩インキュベートすることによりプローブを検出した後、免疫染色を実行した。Ｍｅｇｆ１１ ＢａｓｅＳｃｏｐｅの場合、α－カルビンジン抗体を使用してスターバーストアマクリン細胞および水平細胞を標識化した。組織をＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体を適用して室温で１時間インキュベートした。スライドをもう一度洗浄し、カバーガラスを取り付けた。
【0136】
Ｋ５６２細胞におけるＣＲＢ１アイソフォームの発現
タグ付きＣＲＢ１構築物を、ＣＲＢ１－ＡおよびＣＲＢ１－ＢのＣ末端にＹＦＰをインフレームでクローニングすることによって構築した。タグ付き構築物を、ｐＣＡＧ－ＹＦＰプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ番号１１１８０）にクローン化させた。
タグ付きＣＲＢ１構築物を、ＣＲＢ１－ＡおよびＣＲＢ１－ＢのＣ末端にＹＦＰをインフレームでクローニングすることによって構築した。タグ付き構築物を、ｐＣＡＧ－ＹＦＰプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ番号１１１８０）にクローン化させた。
【0137】
Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４３（商標））を、ＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣによりバリデーションし、ＡＴＣＣによりマイコプラズマ試験を行った。細胞を、１０ｃｍ細胞培養皿内の１０％ウシ増殖血清、４．５ｇ／Ｌ Ｄ－グルコース、２．０ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞は、２～３日ごとに継代された後、２００万細胞／ｍｌに達した。Ｋ５６２ヌクレオフェクションマニュアルの指示に従って、Ａｍａｘａ（登録商標）ＣｅｌｌＬｉｎｅＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）キットＶを使用して、細胞をトランスフェクトした。具体的には、１００万個の細胞のアリコートを、エッペンドルフチューブ内で室温にて５分間２００×ｇで遠心分離することによりペレット化した。上清は完全になり、細胞ペレットを、サンプルあたり１００ｕｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）溶液に懸濁した。２ｕｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＡＧ：Ｃｒｂ１Ａ－ＹＦＰ、ｐＣＡＧ：Ｃｒｂ１Ｂ－ＹＦＰ、またはｐＣＡＧ：ＹＦＰ）を添加し、浮遊細胞と穏やかに混合した。細胞とＤＮＡの混合物をキュベット内でトランスフェクトし、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）キュベットホルダーに挿入し、プログラムＴ－０１６によりトランスフェクトした。プログラムが完了した後、キュベットをホルダーから取り出し、すぐに５００ｕｌの事前に平衡化した培養培地を添加した。次に、これらのトランスフェクトされた細胞を分割し、２４ウェルガラス底皿（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の２つのウェルに移した。トランスフェクションの２４時間後に、倒立共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）により細胞の画像化した。
【0138】
網膜薄切片化および電子顕微鏡
マウスをイソフルランで麻酔した後、断頭した。上網膜に、方向を追跡するために低温焼灼で印をつけた。眼を摘出し、Ｇｌｕｔ緩衝液（４０ｍＭ ＭＯＰＳ、０．００５％ＣａＣｌ2、２％ホルムアルデヒド、Ｈ2Ｏ中２％グルタルアルデヒド）中、室温にて一晩固定した。背腹軸は解剖時に印が付けられ、その後、薄切片で上網膜と下網膜を識別できるようになった。埋め込みの準備ができるまで４℃で保存するために、眼をＰＢＳを含有する未使用チューブに移した。
薄切片の場合、角膜を眼盃から除去し、眼盃を０．１％カコジル酸緩衝液中の２％四酸化オスミウムに浸した。次に、眼盃を脱水し、Ｅｐｏｎ８１２樹脂に埋め込んだ。０．５μｍの半薄切片を、上網膜から下網膜まで視神経乳頭を通って切断した。切片を１％メチレンブルーで対比染色しＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１明視野顕微鏡で画像化した。
電子顕微鏡検査のために、組織を、記載のように処理し、画像化した74。要約すると、遠位周辺網膜をトリミングし、Ｌｅｉｃａ ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅで６５～７５μｍの切片を準備した。切片は、各網膜の上片側切断および下片側切断により別々に準備し、２％酢酸ウラニル＋３．５％クエン酸鉛の溶液で対比染色した。Ｏｒｉｕｓ１０００カメラを装備したＪＥＭ－１４００電子顕微鏡で、イメージングを実行した。
マウスをイソフルランで麻酔した後、断頭した。上網膜に、方向を追跡するために低温焼灼で印をつけた。眼を摘出し、Ｇｌｕｔ緩衝液（４０ｍＭ ＭＯＰＳ、０．００５％ＣａＣｌ2、２％ホルムアルデヒド、Ｈ2Ｏ中２％グルタルアルデヒド）中、室温にて一晩固定した。背腹軸は解剖時に印が付けられ、その後、薄切片で上網膜と下網膜を識別できるようになった。埋め込みの準備ができるまで４℃で保存するために、眼をＰＢＳを含有する未使用チューブに移した。
薄切片の場合、角膜を眼盃から除去し、眼盃を０．１％カコジル酸緩衝液中の２％四酸化オスミウムに浸した。次に、眼盃を脱水し、Ｅｐｏｎ８１２樹脂に埋め込んだ。０．５μｍの半薄切片を、上網膜から下網膜まで視神経乳頭を通って切断した。切片を１％メチレンブルーで対比染色しＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１明視野顕微鏡で画像化した。
電子顕微鏡検査のために、組織を、記載のように処理し、画像化した74。要約すると、遠位周辺網膜をトリミングし、Ｌｅｉｃａ ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅで６５～７５μｍの切片を準備した。切片は、各網膜の上片側切断および下片側切断により別々に準備し、２％酢酸ウラニル＋３．５％クエン酸鉛の溶液で対比染色した。Ｏｒｉｕｓ１０００カメラを装備したＪＥＭ－１４００電子顕微鏡で、イメージングを実行した。
【0139】
網膜核計数
網膜の半薄切片を、６０倍オイル対物レンズ（ｏｉｌ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１明視野顕微鏡でタイルスキャンし、ｃｅｌｌＳｅｎｓソフトウェアで繋ぎ合わせた。Ｆｉｊｉソフトウェア75を使用して、上網膜と下網膜の両方について、視神経乳頭から周辺へ、セグメント化された線を引いた。５００μｍの間隔で、外顆粒層をカプセル化する１００μｍの４つのボックスが描かれ、ボックスの中心が視神経乳頭から５００μｍの係数になった。網膜の各半球に対して、４つのボックスを作成した。ＩｍａｇｅＪの計数機能を使用して、各ボックスによってカプセル化された核の総数を、各位置で計数した。計数を各位置にわたって平均してプロットし、同様に各網膜の８つの測定値すべての総計数もプロットした。
電子顕微鏡によるＯＬＭ接合部の評価
１つの網膜半切片の約９０％を含む（切片化中に遠位周辺網膜がトリミングされた）各切片を、電子顕微鏡でＯＬＭギャップについて評価した。各潜在的ギャップが画像化され、その後、画像化された光受容体の内節上の電子密度の高いＯＬＭ接合部の存在を評価することにより、ギャップをオフラインで確認した。切片ごとのギャップの数を、Ｆｉｊｉソフトウェアを使用して、各ギャップのサイズとともに定量化した。どちらの遺伝子型もＯＬＭギャップを示さなかったため、定量化および統計のために、野生型およびｎｕｌｌ／＋ヘテロ接合対照をグループ化した。
網膜の半薄切片を、６０倍オイル対物レンズ（ｏｉｌ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１明視野顕微鏡でタイルスキャンし、ｃｅｌｌＳｅｎｓソフトウェアで繋ぎ合わせた。Ｆｉｊｉソフトウェア75を使用して、上網膜と下網膜の両方について、視神経乳頭から周辺へ、セグメント化された線を引いた。５００μｍの間隔で、外顆粒層をカプセル化する１００μｍの４つのボックスが描かれ、ボックスの中心が視神経乳頭から５００μｍの係数になった。網膜の各半球に対して、４つのボックスを作成した。ＩｍａｇｅＪの計数機能を使用して、各ボックスによってカプセル化された核の総数を、各位置で計数した。計数を各位置にわたって平均してプロットし、同様に各網膜の８つの測定値すべての総計数もプロットした。
電子顕微鏡によるＯＬＭ接合部の評価
１つの網膜半切片の約９０％を含む（切片化中に遠位周辺網膜がトリミングされた）各切片を、電子顕微鏡でＯＬＭギャップについて評価した。各潜在的ギャップが画像化され、その後、画像化された光受容体の内節上の電子密度の高いＯＬＭ接合部の存在を評価することにより、ギャップをオフラインで確認した。切片ごとのギャップの数を、Ｆｉｊｉソフトウェアを使用して、各ギャップのサイズとともに定量化した。どちらの遺伝子型もＯＬＭギャップを示さなかったため、定量化および統計のために、野生型およびｎｕｌｌ／＋ヘテロ接合対照をグループ化した。
【0140】
ウエスタンブロッティングによる網膜連続切片化
連続切片化を、記載のように50、51実行した。要約すると、マウスをイソフルランで麻酔した後、断頭した。眼を摘出し、氷冷リンゲル液中で解剖して取り出した。網膜パンチ（直径２ｍｍ）を、視神経乳頭に隣接して配置された外科用トレフィン（ｔｒｅｐｈｉｎｅ）で眼盃から切断し、光受容体層を上に向けてＰＶＤＦ膜に転写し、プラスチックスペーサー（約２４０μｍ）で分離された２つのガラススライドの間に平らに取り付け、ドライアイスで凍結させた。網膜の表面をクリオスタットの切断面に合わせ、不均一な縁部をトリミングした。切片化の端点（それぞれ光受容体または内網膜）に応じて、１０μｍまたは２０μｍの連続する接線方向切片を収集した。
連続切片化を、記載のように50、51実行した。要約すると、マウスをイソフルランで麻酔した後、断頭した。眼を摘出し、氷冷リンゲル液中で解剖して取り出した。網膜パンチ（直径２ｍｍ）を、視神経乳頭に隣接して配置された外科用トレフィン（ｔｒｅｐｈｉｎｅ）で眼盃から切断し、光受容体層を上に向けてＰＶＤＦ膜に転写し、プラスチックスペーサー（約２４０μｍ）で分離された２つのガラススライドの間に平らに取り付け、ドライアイスで凍結させた。網膜の表面をクリオスタットの切断面に合わせ、不均一な縁部をトリミングした。切片化の端点（それぞれ光受容体または内網膜）に応じて、１０μｍまたは２０μｍの連続する接線方向切片を収集した。
【0141】
プロテオミクス
網膜トリプシン細胞外ドメイン抽出
幼若Ｐ１４マウスをイソフルランで麻酔した後、断頭した。眼を摘出し、リンゲル液（１５４ｍＭ ＮａＣｌ、５．６ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２．２ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭグルコース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）中で眼盃から解剖で取り出した。網膜を、５μｇのトリプシン／ｌｙｓ－ｃを含有する１００μｌのリンゲル液中に入れた。網膜を含む溶液を、周期的に穏やかに混合しながら、室温で１０分間インキュベートした。次に内容物を３００×Ｇで１．５分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。尿素をタンパク質混合物に８Ｍまで添加し、次に５０℃でインキュベートした。１時間のインキュベーション後、ＤＴＴを最終濃度が１０ｍＭになるように添加し、５０℃で１５分間インキュベートした。３．２５μｌの２０ｍＭヨードアセトアミドを添加してペプチドをアルキル化し、暗所で室温にて３０分間インキュベートした。ＤＴＴを、５０ｍＭの最終濃度まで添加することにより反応をクエンチした。混合物を、約２７０μｌの重炭酸アンモニウムで１：３に希釈した。混合物を、３７℃で、１μｇのトリプシン／ｌｙｓ－ｃを添加することにより一晩さらに消化した。
網膜トリプシン細胞外ドメイン抽出
幼若Ｐ１４マウスをイソフルランで麻酔した後、断頭した。眼を摘出し、リンゲル液（１５４ｍＭ ＮａＣｌ、５．６ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２．２ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭグルコース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）中で眼盃から解剖で取り出した。網膜を、５μｇのトリプシン／ｌｙｓ－ｃを含有する１００μｌのリンゲル液中に入れた。網膜を含む溶液を、周期的に穏やかに混合しながら、室温で１０分間インキュベートした。次に内容物を３００×Ｇで１．５分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。尿素をタンパク質混合物に８Ｍまで添加し、次に５０℃でインキュベートした。１時間のインキュベーション後、ＤＴＴを最終濃度が１０ｍＭになるように添加し、５０℃で１５分間インキュベートした。３．２５μｌの２０ｍＭヨードアセトアミドを添加してペプチドをアルキル化し、暗所で室温にて３０分間インキュベートした。ＤＴＴを、５０ｍＭの最終濃度まで添加することにより反応をクエンチした。混合物を、約２７０μｌの重炭酸アンモニウムで１：３に希釈した。混合物を、３７℃で、１μｇのトリプシン／ｌｙｓ－ｃを添加することにより一晩さらに消化した。
【0142】
細胞表面タンパク質の標識化およびプルダウン
膜タンパク質の細胞表面標識化を、記載されているプロトコルに基づいて実行した76。マウスをイソフルランで麻酔した後、断頭した。眼を摘出し、網膜を眼盃から解剖で取り出して氷冷ＨＢＳＳ中に入れた。網膜をＨＢＳＳで洗浄した後、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ＿ＮＨＳ－ＳＳ－Ｂｉｏｔｉｎ（ＨＢＳＳ中０．５ｍｇ／ｍｌ）を補充したＨＢＳＳ中で４５分間氷上にてインキュベートした。次に、網膜をＨＢＳＳ＋１００μＭリジンで３回洗浄し、残りの反応性エステルをクエンチした。次に、網膜を、４００μｌ（２００μｌ／網膜）溶解緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に収集した。超音波処理装置で短いパルスを使用して、網膜を均質化した。溶解物を２１，０００×Ｇで２０分間、４℃で遠心分離し、可溶性画分を収集した。免疫沈降では、７５μｇのタンパク質溶解物を、１００μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標））と混合し、回転させながら室温でインキュベートした。ストレプトアビジン／ビオチン複合体を、磁石を使用して隔離し、溶解緩衝液で洗浄した。タンパク質を、溶出緩衝液（０．１％ＳＤＳ １００ｍＭ ＤＴＴを含むＰＢＳ）と５０°Ｃで３０分間インキュベートすることにより、ビーズから溶出させた。実験サンプル（入力、ビオチン濃縮、および非ビオチン標識陰性対照）を４×ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル緩衝液と混合し、ヒートブロック上で９０℃にて１０分間インキュベートした。次に、サンプルを、４～１５％のｍｉｎｉ ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ未染色タンパク質ゲルにロードした。電気泳動を、スタッキングゲルを介して６５Ｖで実施し、次に色素フロントがゲルの下端に達するまで１００Ｖに調整した。
膜タンパク質の細胞表面標識化を、記載されているプロトコルに基づいて実行した76。マウスをイソフルランで麻酔した後、断頭した。眼を摘出し、網膜を眼盃から解剖で取り出して氷冷ＨＢＳＳ中に入れた。網膜をＨＢＳＳで洗浄した後、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ＿ＮＨＳ－ＳＳ－Ｂｉｏｔｉｎ（ＨＢＳＳ中０．５ｍｇ／ｍｌ）を補充したＨＢＳＳ中で４５分間氷上にてインキュベートした。次に、網膜をＨＢＳＳ＋１００μＭリジンで３回洗浄し、残りの反応性エステルをクエンチした。次に、網膜を、４００μｌ（２００μｌ／網膜）溶解緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に収集した。超音波処理装置で短いパルスを使用して、網膜を均質化した。溶解物を２１，０００×Ｇで２０分間、４℃で遠心分離し、可溶性画分を収集した。免疫沈降では、７５μｇのタンパク質溶解物を、１００μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標））と混合し、回転させながら室温でインキュベートした。ストレプトアビジン／ビオチン複合体を、磁石を使用して隔離し、溶解緩衝液で洗浄した。タンパク質を、溶出緩衝液（０．１％ＳＤＳ １００ｍＭ ＤＴＴを含むＰＢＳ）と５０°Ｃで３０分間インキュベートすることにより、ビーズから溶出させた。実験サンプル（入力、ビオチン濃縮、および非ビオチン標識陰性対照）を４×ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル緩衝液と混合し、ヒートブロック上で９０℃にて１０分間インキュベートした。次に、サンプルを、４～１５％のｍｉｎｉ ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ未染色タンパク質ゲルにロードした。電気泳動を、スタッキングゲルを介して６５Ｖで実施し、次に色素フロントがゲルの下端に達するまで１００Ｖに調整した。
【0143】
ゲル内トリプシン消化
電気泳動後、ゲルをＨ2Ｏで２回洗浄し、５０％メタノール、７％酢酸で２０分間固定し、コロイド状クマシー系ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２４５９０）で３０分間染色した。ゲルを揺り動かしながら４℃で２時間、蒸留水により脱色した。タンパク質バンドを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈイメージャー上で画像化した。きれいなカミソリ刃を使用して、７５～２５０ｋＤａのバンドを切り出し、約１×１ｍｍの小片に切断し、０．５ｍｌのシリコーン処理（低保持）遠心チューブに収集した。ゲル片を、２００μｌの脱色溶液（５０ｍＭ重炭酸アンモニウム、５０：５０アセトニトリル：水中のＮＨ4ＨＣＯ3）を用いて３７℃にて３０分間振とうしながら脱色した。溶液を除去し、２００μｌの脱色溶液と交換し、振とうしながら３７℃で３０分間再度インキュベートした。溶液をゲル片から除去し、ペプチドを、６０℃で１５分間、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．８）中の２０μｌの２０ｍＭ ＤＴＴで還元した。５０μｌのアルキル化緩衝液（５０ｍＭヨードアセトアミドを含む重炭酸アンモニウム緩衝液）を添加することによりシステインをアルキル化し、暗所で室温で１時間インキュベートした。アルキル化緩衝液をチューブから取り出し、２００μｌの脱色緩衝液と交換した。サンプルを振とうしながら３７℃で３０分間インキュベートし、緩衝液を除去し、脱色緩衝液で再度洗浄した。ゲル片を７５μｌのアセトニトリルで脱水し、室温で１５分間インキュベートした。アセトニトリルをチューブから取り出し、収縮したゲル片を１５分間乾燥させた。トリプシン／ｌｙｓ－ｃ（２５μｌの重炭酸アンモニウム緩衝液中５ｎｇ／μｌ）をゲル片に添加し、室温で１時間インキュベートした。追加の２５μｌの重炭酸アンモニウム緩衝液をチューブに添加し、３７℃で一晩インキュベートした。蒸留水でサンプル量を１２５μｌにし、トリプシン処理ペプチドを含有する液体をきれいなシリコーン処理０．５ｍｌチューブ内に入れた。
電気泳動後、ゲルをＨ2Ｏで２回洗浄し、５０％メタノール、７％酢酸で２０分間固定し、コロイド状クマシー系ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２４５９０）で３０分間染色した。ゲルを揺り動かしながら４℃で２時間、蒸留水により脱色した。タンパク質バンドを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈイメージャー上で画像化した。きれいなカミソリ刃を使用して、７５～２５０ｋＤａのバンドを切り出し、約１×１ｍｍの小片に切断し、０．５ｍｌのシリコーン処理（低保持）遠心チューブに収集した。ゲル片を、２００μｌの脱色溶液（５０ｍＭ重炭酸アンモニウム、５０：５０アセトニトリル：水中のＮＨ4ＨＣＯ3）を用いて３７℃にて３０分間振とうしながら脱色した。溶液を除去し、２００μｌの脱色溶液と交換し、振とうしながら３７℃で３０分間再度インキュベートした。溶液をゲル片から除去し、ペプチドを、６０℃で１５分間、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．８）中の２０μｌの２０ｍＭ ＤＴＴで還元した。５０μｌのアルキル化緩衝液（５０ｍＭヨードアセトアミドを含む重炭酸アンモニウム緩衝液）を添加することによりシステインをアルキル化し、暗所で室温で１時間インキュベートした。アルキル化緩衝液をチューブから取り出し、２００μｌの脱色緩衝液と交換した。サンプルを振とうしながら３７℃で３０分間インキュベートし、緩衝液を除去し、脱色緩衝液で再度洗浄した。ゲル片を７５μｌのアセトニトリルで脱水し、室温で１５分間インキュベートした。アセトニトリルをチューブから取り出し、収縮したゲル片を１５分間乾燥させた。トリプシン／ｌｙｓ－ｃ（２５μｌの重炭酸アンモニウム緩衝液中５ｎｇ／μｌ）をゲル片に添加し、室温で１時間インキュベートした。追加の２５μｌの重炭酸アンモニウム緩衝液をチューブに添加し、３７℃で一晩インキュベートした。蒸留水でサンプル量を１２５μｌにし、トリプシン処理ペプチドを含有する液体をきれいなシリコーン処理０．５ｍｌチューブ内に入れた。
【0144】
質量分析用ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑペプチドライブラリーの生成
Ｓｑａｎｔｉソフトウェアを網膜サンプルからのＩｓｏ－ｓｅｑ出力で使用して、アイソフォームのＯＲＦおよびアミノ酸配列を予測した。アミノ酸配列を、デフォルト設定でＰｙｔｈｏｎプログラムｔｒｙｐｓｉｎを使用してインシリコでトリプシン化した。リジンまたはアルギニンがプロリンの直前にある場合、リジンまたはアルギニンを削除しないプロリン規則に従った。
Ｓｑａｎｔｉソフトウェアを網膜サンプルからのＩｓｏ－ｓｅｑ出力で使用して、アイソフォームのＯＲＦおよびアミノ酸配列を予測した。アミノ酸配列を、デフォルト設定でＰｙｔｈｏｎプログラムｔｒｙｐｓｉｎを使用してインシリコでトリプシン化した。リジンまたはアルギニンがプロリンの直前にある場合、リジンまたはアルギニンを削除しないプロリン規則に従った。
【0145】
網膜サンプルの質量分析
トリプシン消化物の２μｌアリコートを、Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２ ＨＤＭＳ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）に接続されたｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムを使用してＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。ペプチドを、最初に１８０μｍ×２０ｍｍ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８カラムにトラップした（９９．９％水、０．１％ギ酸中で５μｌ／分の流速で３分間）。次に、１．７μｍのＣ１８ ＢＥＨ樹脂（Ｗａｔｅｒｓ）を充填した７５μｍ×１５０ｍｍのカラムで、０．１％ギ酸を含む６～３０％のアセトニトリル勾配を使用して、０．３μｌ／分の流速で３５℃にて９０分間ペプチド分離を実行した。溶出したペプチドを、３．０ｋＶの電圧で１０μｍのＰｉｃｏＴｉｐエミッター（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してＳｙｎａｐｔ Ｇ２のイオン源にスプレーした。
トリプシン消化物の２μｌアリコートを、Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２ ＨＤＭＳ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）に接続されたｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムを使用してＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。ペプチドを、最初に１８０μｍ×２０ｍｍ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８カラムにトラップした（９９．９％水、０．１％ギ酸中で５μｌ／分の流速で３分間）。次に、１．７μｍのＣ１８ ＢＥＨ樹脂（Ｗａｔｅｒｓ）を充填した７５μｍ×１５０ｍｍのカラムで、０．１％ギ酸を含む６～３０％のアセトニトリル勾配を使用して、０．３μｌ／分の流速で３５℃にて９０分間ペプチド分離を実行した。溶出したペプチドを、３．０ｋＶの電圧で１０μｍのＰｉｃｏＴｉｐエミッター（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してＳｙｎａｐｔ Ｇ２のイオン源にスプレーした。
【0146】
各サンプルを、ペプチドの定量と同定を同時に行うためのイオン移動度ワークフローを使用して、データ非依存的分析（ＨＤＭＳＥ）にかけた。すべてのＨＤＭＳＥ実行にわたる個々のペプチドの堅牢なピーク検出およびアラインメントのために、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩソフトウェアを使用して、同じ質量／保持時間機能を表すイオンクロマトグラフィーピークの自動アラインメントを実行した。イオン機能へのペプチド割り当てを実行するために、ＰＬＧＳ ２．５．１（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して検索可能なファイルを生成し、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓに組み込まれたＩｄｅｎｔｉｔｙＥ検索エンジンに送信した。ペプチドの同定のために、上記のＩｓｏ－Ｓｅｑカスタムデータベースを検索した。新規ペプチドを同定するために、同定されたすべてのペプチドをＵｎｉＰｒｏｔＫｂマウスデータベースと相互参照した。タンパク質およびペプチドの誤検出率を、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｐｈｅｔソフトウェア（Ｓｃａｆｆｏｌｄ ４．４）およびデコイデータベース－リバースマウスＵｎｉＰｒｏｔ２０１６データベースを使用して決定した。タンパク質およびペプチドのＦＤＲはそれぞれ１％および５％未満であった。新たに発見されたペプチドを、翻訳後修飾を含む既知のペプチドと区別するために、Ｓ、Ｔ、およびＹでのリン酸化；Ｅでのグルタミル化；Ｋでのアセチル化；ＤおよびＥでのメチル化など、最も一般的なタンパク質修飾を使用して追加のデータベース検索を行った。潜在的な誤認は発見されなかった。
【0147】
ウエスタンブロッティング
同腹仔ＷＴおよびＣｒｂ１変異マウスの網膜を短時間超音波処理し、ＰＢＳ中に２％ＳＤＳを含有する溶解緩衝液４００μｌとプロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅ；Ｒｏｃｈｅ）中でボルテックスした。溶解物を２０，０００×ｇで２２℃にて１０分間遠心を行い、上清を収集し、総タンパク質濃度をＤＣタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で決定した。溶解緩衝液を使用して、総タンパク質濃度によって溶解物を正規化するように体積を調整してから、４００ｍＭ ＤＴＴを含有する４×ＳＤＳ－ＰＡＧＥ緩衝液を添加し、溶解物を９０℃で１０分間加熱した。それぞれ１５μｇの総タンパク質を含有する等体積の溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、タンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に転写した。膜をＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（ＬｉＣｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でブロックし、適切な一次抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０または８００コンジュゲート二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートした。タンパク質バンドを、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ赤外線イメージングシステム（ＬｉＣｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって画像化した。
同腹仔ＷＴおよびＣｒｂ１変異マウスの網膜を短時間超音波処理し、ＰＢＳ中に２％ＳＤＳを含有する溶解緩衝液４００μｌとプロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅ；Ｒｏｃｈｅ）中でボルテックスした。溶解物を２０，０００×ｇで２２℃にて１０分間遠心を行い、上清を収集し、総タンパク質濃度をＤＣタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で決定した。溶解緩衝液を使用して、総タンパク質濃度によって溶解物を正規化するように体積を調整してから、４００ｍＭ ＤＴＴを含有する４×ＳＤＳ－ＰＡＧＥ緩衝液を添加し、溶解物を９０℃で１０分間加熱した。それぞれ１５μｇの総タンパク質を含有する等体積の溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、タンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に転写した。膜をＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（ＬｉＣｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でブロックし、適切な一次抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０または８００コンジュゲート二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートした。タンパク質バンドを、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ赤外線イメージングシステム（ＬｉＣｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって画像化した。
【0148】
可溶性タンパク質と不溶性タンパク質を分離するために、マウスの網膜を短時間超音波処理し、氷上の３００μｌの水で低浸透圧ショックを与えた。溶解した網膜懸濁液を２０，０００×ｇで、４℃にて２０分間遠心させ、得られた上清を収集し、ペレットを水で１回すすいだ。ペレットと上清を、２％ＳＤＳ、１×ＰＢＳ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅ；Ｒｏｃｈｅ）を含有する最終体積４００μＬの溶解緩衝液中で再構成した。これらの溶解物の等体積アリコートを、上記のウエスタンブロッティングで使用した。
【0149】
データ入手可能性
ロングリードシークエンシングデータは、ＮＣＢＩ ＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔリポジトリ（アクセッション番号ＰＲＪＮＡ５４７８００）で入手可能である。表２は、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータセット内のＣｒｂ１のすべてのアイソフォームの配列、ゲノム位置、およびリード番号を明記する。
質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子ＰＸＤ０１７２９０（ＤＯＩ：１０．６０１９／ＰＸＤ０１７２９０）でＰＲＩＤＥパートナーリポジトリを介してＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍに寄託されている。
コード入手可能性
ＩｓｏＰｏｐｓコードは、ＧＮＵ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｕｂｌｉｃ Ｌｉｃｅｎｓｅ ｖ３．０の下で許諾されている、kellycochran.github.io/IsoPops/index.htmlで入手可能である。
ロングリードシークエンシングデータは、ＮＣＢＩ ＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔリポジトリ（アクセッション番号ＰＲＪＮＡ５４７８００）で入手可能である。表２は、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータセット内のＣｒｂ１のすべてのアイソフォームの配列、ゲノム位置、およびリード番号を明記する。
質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子ＰＸＤ０１７２９０（ＤＯＩ：１０．６０１９／ＰＸＤ０１７２９０）でＰＲＩＤＥパートナーリポジトリを介してＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍに寄託されている。
コード入手可能性
ＩｓｏＰｏｐｓコードは、ＧＮＵ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｕｂｌｉｃ Ｌｉｃｅｎｓｅ ｖ３．０の下で許諾されている、kellycochran.github.io/IsoPops/index.htmlで入手可能である。
【0150】
【表2】
ロングリードキャプチャーシークエンシングを介してアイソフォームをカタログ化するためのワークフロー
ＣＮＳ細胞表面分子のアイソフォーム多様性をカタログ化するために、最初にマウスの網膜および脳からのＲＮＡ－ｓｅｑデータを手動でスクリーニングし38、39、実質的な注釈のないｍＲＮＡの多様性を示した遺伝子を同定した。上皮成長因子（ＥＧＦ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）、および接着Ｇタンパク質共役型受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体に焦点を当て、それはこれらの遺伝子が細胞間認識において多くの既知の役割を果たしているからである。スクリーニングされた各遺伝子（ｎ＝４０２）について、ＣＮＳ発生の間に発現したかどうか、発現した場合は、ＲＮＡ－ｓｅｑリードが注釈のないエクソンまたはスプライスジャンクションの存在を支持しているかどうかを評価した（図１Ａ）。遺伝子の約１５％（６０／４０２）が、注釈のない複数の機能の強力なエビデンスを示していることが分かった。これらの遺伝子を、ロングリードシークエンシングの候補として選択した。
【0151】
これらの遺伝子の転写物を包括的に同定するために、候補遺伝子リストにあるような、大きく（＞４ｋｂ）かつ中程度に発現するｃＤＮＡのＰａｃＢｉｏシークエンシング深度を改善する方法を開発した。以前のＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアプローチ31、32、40を採用して、ロングリードＰａｃＢｉｏプラットフォームでタンパク質をコードするｃＤＮＡの特徴付けが可能になったため、この戦略をロングリードキャプチャーシークエンシング（ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑ）と呼ぶ。ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑ（図１Ｂ、Ｃ）では、ビオチン化プローブは、捕捉された転写物のプールが特定のアイソフォームに偏らないように、スプライスジャンクションを通過せずに既知のエクソンをタイル表示するように設計されている。これらのプローブを使用して、短縮ｃＤＮＡをフィルタリングするためにサイズ選択されたライブラリーからｃＤＮＡをプルダウンする。パイロット実験では、短めの断片がシークエンシング出力を支配する傾向があるため15、サイズ選択が完全長リードを取得するために不可欠であることが分かった（図９Ａ）。
【0152】
ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑを実装するために、最初に、同様の長さ（４～８ｋｂ）のｃＤＮＡをコードすると予測された６０種類候補の初期リストを３０種類までフィルタリングした。最終的な標的リストには、軸索ガイダンス、シナプス形成、およびニューロンとグリアの相互作用に関与する遺伝子が含まれていた；また、遺伝性の光受容体変性に関与している網膜疾患遺伝子Ｃｒｂ１も含まれていた。標的遺伝子の一部は多くのアイソフォーム（Ｎｒｘｎ１、Ｎｒｘｎ３）を生成することが知られていたが、ほとんどの場合、アイソフォーム多様性は以前に特徴付けられていなかった。捕捉されたｃＤＮＡがＰａｃＢｉｏプラットフォーム上でシークエンシングされた場合、実験ごとに約１３２，０００の完全長リードが生成された（図９Ｃ）。これらのリードは、標的化遺伝子が強く濃縮されており（図９Ｂ）、リードの大部分は標的とされた長さの範囲内であった（図１Ｃ）。したがって、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑでは、他のロングリードデータセットでは過小評価されている、より大きなｃＤＮＡの高深度完全長カバレッジ（ｄｅｅｐ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｃｏｖｅｒａｇｅ）を実現することができる。
【0153】
ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑによって生成された包括的なアイソフォームカタログ
発生全体およびＣＮＳ領域全体にわたる３０遺伝子すべてのアイソフォームをカタログ化するために、マウスの網膜および脳におけるさまざまな時点でｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑを実行した（図１Ｃ；図９Ｃ）。アイソフォームの数、およびそれぞれを含むリードは、ＰａｃＢｉｏ Ｉｓｏ－Ｓｅｑソフトウェアと、アイソフォーム集団の分析用に開発したカスタムソフトウェア（IsoPops; https://github.com/kellycochran/IsoPops）とを一緒に使用して決定した。この処理パイプラインの後、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑカタログには３０種類の標的化遺伝子の４，１１６個のアイソフォームが含まれており（図２Ａ、Ｂ；表２；）－これは、公開データベースで現在この遺伝子セットに注釈が付けられているアイソフォームの数よりもおよそ１桁多かった（図２Ｂ）。また、これは、一般的なショートリードトランスクリプトームアセンブリソフトウェアによって予測されたアイソフォームの数よりもはるかに多かった（図１０Ａ）。ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームの９％のみが、調査したデータベースのいずれにも出現し、それらのほとんどが新規であることを示唆している。
発生全体およびＣＮＳ領域全体にわたる３０遺伝子すべてのアイソフォームをカタログ化するために、マウスの網膜および脳におけるさまざまな時点でｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑを実行した（図１Ｃ；図９Ｃ）。アイソフォームの数、およびそれぞれを含むリードは、ＰａｃＢｉｏ Ｉｓｏ－Ｓｅｑソフトウェアと、アイソフォーム集団の分析用に開発したカスタムソフトウェア（IsoPops; https://github.com/kellycochran/IsoPops）とを一緒に使用して決定した。この処理パイプラインの後、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑカタログには３０種類の標的化遺伝子の４，１１６個のアイソフォームが含まれており（図２Ａ、Ｂ；表２；）－これは、公開データベースで現在この遺伝子セットに注釈が付けられているアイソフォームの数よりもおよそ１桁多かった（図２Ｂ）。また、これは、一般的なショートリードトランスクリプトームアセンブリソフトウェアによって予測されたアイソフォームの数よりもはるかに多かった（図１０Ａ）。ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームの９％のみが、調査したデータベースのいずれにも出現し、それらのほとんどが新規であることを示唆している。
【0154】
これらの新規アイソフォームが本物であることを確認するために、独立したデータセットを使用して、それらの転写開始部位およびエクソンジャンクションをバリデーションした。開始部位を、５’ｃａｐ41に関連する配列を同定するためのショートリード法である遺伝子発現のキャップ分析（ＣＡＧＥ）を使用して同定した。成体マウス網膜42からのＣＡＧＥ－ｓｅｑリードは、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑによって同定された転写開始部位の９７．５％を裏付けた（１０５１／１０７８成体網膜アイソフォームは５’末端部でＣＡＧＥ－ｓｅｑカバレッジを有していた；図９Ｄ）。さらに、ＣＡＧＥ－ｓｅｑリードはｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームの５’末端部に選択的にマッピングされ（図９Ｄ、Ｅ）、転写開始部位注釈の精度をさらに支持する。スプライスジャンクションをバリデーションするために、最初に、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑエクソンジャンクションの大部分（９８．９％）がカノニカルなスプライス部位（ｎ＝８０，５９０ジャンクション）で生じたことを検証した。次に、網膜と脳からのショートリードデータセットに、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑエクソンジャンクションが存在するかどうかを試験した38、39。ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑジャンクションの大部分（９８．１％）（ｎ＝７９，０２０）は、これらのショートリードデータセットによって裏付けられ、それらの有効性を独立して確認した。これには、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームの７１％の完全なジャンクションカバレッジが含まれていた（ｎ＝２，９２５）。完全なカバレッジを示さなかったアイソフォームの量が大幅に少ないため、発現レベルが低いことにより、未確認のジャンクションはＲＮＡ－ｓｅｑデータに存在しない可能性がある（図１０Ｂ）。この解釈と一致して、未確認のジャンクションはＲＴ－ＰＣＲ産物のシークエンシングによって検出することができ、ＲＮＡ－ｓｅｑ検出しきい値を単に下回っていたことを示唆している（Ｍｅｇｆ１１遺伝子にＲＮＡ－ｓｅｑジャンクションがない場合は、ＲＴ－ＰＣＲによってｎ＝９／１２が検出された）。総合すると、これらの分析により、我々のｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームカタログの有効性が強く支持される。
【0155】
ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑによる効率的なアイソフォーム検出
アイソフォーム検出の精度および感度を精査するために、我々のｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータを、Ｎｒｘｎ１およびＮｒｘｎ３遺伝子のアイソフォーム多様性をカタログ化した以前のロングリードシークエンシング研究と比較した。これらの研究では、ＰＣＲを使用してＮｒｘｎ転写物のαおよびβクラスのアイソフォームライブラリーを生成し、ＰａｃＢｉｏシークエンシングを使用して特徴付けした15、16。我々が特定したＮｒｘｎ１およびＮｒｘｎ３アイソフォームの総数は、ライブラリーの調製方法およびバイオインフォマティクスのワークフローが根本的に異なるにもかかわらず、以前の研究（図２Ａ）と規模が類似していた。選択的スプライス部位（ＡＳ）１－ＡＳ４でのエクソン使用のパターンも同様であった（データは示していない）。例えば、Ｎｒｘｎ３エクソン２４が常にエクソン２５ａにスプライシングする、以前の研究で同定された決定論的ＡＳ４スプライシングイベントを、我々のデータにおいて確認した（ｎ＝７６エクソン２４含有アイソフォーム、すべてエクソン２５にスプライシングしている）。これらの知見は、我々のＮｒｘｎ１および３アイソフォームカタログが、過去の研究によって生成されたものとほぼ一致することを示唆している。それでも、以前のカタログには記載されていなかったニューレキシン遺伝子の新機能を見出すことができた。我々の方法はＰＣＲプライマー配置によりバイアスがなかったため、カノニカルなαまたはβ転写物の開始／終了部位を含まないアイソフォームが見出された。例えば、Ｎｒｘｎ３αのリードの６４％には、５’ＵＴＲを長くする注釈付きのα転写開始部位の上流に、明確な第１のエクソンが含まれていた。さらに、１６の異なるＮｒｘｎ３αアイソフォームによって使用される、膜貫通ドメインの上流のｍＲＮＡを短縮化する７つの新規転写終結部位が同定された（データは示していない）。これらの新しい部位の７つすべてが、ＲＮＡ－ｓｅｑデータからのジャンクションカバレッジで裏付けられた。総合すると、これらの知見は、高効率でアイソフォーム多様性を回復する上での、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑの有用性を実証している。
アイソフォーム検出の精度および感度を精査するために、我々のｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータを、Ｎｒｘｎ１およびＮｒｘｎ３遺伝子のアイソフォーム多様性をカタログ化した以前のロングリードシークエンシング研究と比較した。これらの研究では、ＰＣＲを使用してＮｒｘｎ転写物のαおよびβクラスのアイソフォームライブラリーを生成し、ＰａｃＢｉｏシークエンシングを使用して特徴付けした15、16。我々が特定したＮｒｘｎ１およびＮｒｘｎ３アイソフォームの総数は、ライブラリーの調製方法およびバイオインフォマティクスのワークフローが根本的に異なるにもかかわらず、以前の研究（図２Ａ）と規模が類似していた。選択的スプライス部位（ＡＳ）１－ＡＳ４でのエクソン使用のパターンも同様であった（データは示していない）。例えば、Ｎｒｘｎ３エクソン２４が常にエクソン２５ａにスプライシングする、以前の研究で同定された決定論的ＡＳ４スプライシングイベントを、我々のデータにおいて確認した（ｎ＝７６エクソン２４含有アイソフォーム、すべてエクソン２５にスプライシングしている）。これらの知見は、我々のＮｒｘｎ１および３アイソフォームカタログが、過去の研究によって生成されたものとほぼ一致することを示唆している。それでも、以前のカタログには記載されていなかったニューレキシン遺伝子の新機能を見出すことができた。我々の方法はＰＣＲプライマー配置によりバイアスがなかったため、カノニカルなαまたはβ転写物の開始／終了部位を含まないアイソフォームが見出された。例えば、Ｎｒｘｎ３αのリードの６４％には、５’ＵＴＲを長くする注釈付きのα転写開始部位の上流に、明確な第１のエクソンが含まれていた。さらに、１６の異なるＮｒｘｎ３αアイソフォームによって使用される、膜貫通ドメインの上流のｍＲＮＡを短縮化する７つの新規転写終結部位が同定された（データは示していない）。これらの新しい部位の７つすべてが、ＲＮＡ－ｓｅｑデータからのジャンクションカバレッジで裏付けられた。総合すると、これらの知見は、高効率でアイソフォーム多様性を回復する上での、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑの有用性を実証している。
【0156】
多くのアイソフォームは、全体的な遺伝子発現に寄与している。
我々のｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータセットで同定されたアイソフォームの数が多いことを考慮して、次に、アイソフォーム多様性が遺伝子機能に影響を与えるためにどの程度位置付けられているかを調べた。多様性が機能的に重要であるためには、２つの条件を満たす必要がある：１）個々の遺伝子の複数のアイソフォームを意味のあるレベルで発現させなければならない；かつ、２）アイソフォームの配列は、機能の違いをコードする程度に異なっている必要がある。アイソフォームの発現レベルを調査するために、各遺伝子の全体的な発現がアイソフォームポートフォリオ全体にどのように分布しているかを評価した（図２Ｃ、Ｅ、図１０Ｄ）。一部の遺伝子－例えば、ＥｇｆｌａｍおよびＣｒｂ１－は、少数のアイソフォームにおいて優勢であった。しかし、アイソフォームの数が最も多い遺伝子の場合、発現レベルはアイソフォーム全体ではるかに均等に分布していた（図２Ｃ、Ｅ）。シャノン多様度指数43を使用して、発現したｍＲＮＡ種の多様性に基づいて遺伝子をランク付けした。広範な多様性を生み出すことが知られているＮｒｎｘ３は、最高位の遺伝子であった。しかし、ラトロフィリンおよびプロテインチロシンホスファターゼ受容体（ＰＴＰＲ）ファミリーの他のいくつかの遺伝子は、ほぼ同じ高得点であった（図２Ｄ）。したがって、Ｎｒｘｎ３は、多数のアイソフォームを表現するという点で決して固有ではない。我々は、データセット内の遺伝子については、多様なアイソフォームの多くがかなりのレベルで発現していると結論付けている。
我々のｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータセットで同定されたアイソフォームの数が多いことを考慮して、次に、アイソフォーム多様性が遺伝子機能に影響を与えるためにどの程度位置付けられているかを調べた。多様性が機能的に重要であるためには、２つの条件を満たす必要がある：１）個々の遺伝子の複数のアイソフォームを意味のあるレベルで発現させなければならない；かつ、２）アイソフォームの配列は、機能の違いをコードする程度に異なっている必要がある。アイソフォームの発現レベルを調査するために、各遺伝子の全体的な発現がアイソフォームポートフォリオ全体にどのように分布しているかを評価した（図２Ｃ、Ｅ、図１０Ｄ）。一部の遺伝子－例えば、ＥｇｆｌａｍおよびＣｒｂ１－は、少数のアイソフォームにおいて優勢であった。しかし、アイソフォームの数が最も多い遺伝子の場合、発現レベルはアイソフォーム全体ではるかに均等に分布していた（図２Ｃ、Ｅ）。シャノン多様度指数43を使用して、発現したｍＲＮＡ種の多様性に基づいて遺伝子をランク付けした。広範な多様性を生み出すことが知られているＮｒｎｘ３は、最高位の遺伝子であった。しかし、ラトロフィリンおよびプロテインチロシンホスファターゼ受容体（ＰＴＰＲ）ファミリーの他のいくつかの遺伝子は、ほぼ同じ高得点であった（図２Ｄ）。したがって、Ｎｒｘｎ３は、多数のアイソフォームを表現するという点で決して固有ではない。我々は、データセット内の遺伝子については、多様なアイソフォームの多くがかなりのレベルで発現していると結論付けている。
【0157】
ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームの予測される機能的多様性
次に、我々のデータセット内の各遺伝子のアイソフォーム間の配列の差異の程度を調査した。３０遺伝子のほとんどは、エクソンの長さおよび数が大きく異なるアイソフォームをコードしており（図１０Ｅ、Ｆ）、機能の多様性が大きい可能性を示唆している。機能的に分岐する可能性が最も高いアイソフォームを同定するために、教師なしクラスタリング法を使用して、配列の類似性に基づいてアイソフォームをグループ化した（図２Ｆ、Ｇ；図１０Ｇ）。ほとんどの遺伝子について、アイソフォームを、代替ｍＲＮＡ要素間で同様の選択を行った関連するアイソフォームの別個のグループにクラスタリングした（図２Ｆ、Ｇ）。したがって、主要な配列の差異は、個々の遺伝子のアイソフォームポートフォリオ内に存在しており、これは、関連するアイソフォームのファミリーによる特定のエクソン配列の包含に起因する可能性がある。
次に、我々のデータセット内の各遺伝子のアイソフォーム間の配列の差異の程度を調査した。３０遺伝子のほとんどは、エクソンの長さおよび数が大きく異なるアイソフォームをコードしており（図１０Ｅ、Ｆ）、機能の多様性が大きい可能性を示唆している。機能的に分岐する可能性が最も高いアイソフォームを同定するために、教師なしクラスタリング法を使用して、配列の類似性に基づいてアイソフォームをグループ化した（図２Ｆ、Ｇ；図１０Ｇ）。ほとんどの遺伝子について、アイソフォームを、代替ｍＲＮＡ要素間で同様の選択を行った関連するアイソフォームの別個のグループにクラスタリングした（図２Ｆ、Ｇ）。したがって、主要な配列の差異は、個々の遺伝子のアイソフォームポートフォリオ内に存在しており、これは、関連するアイソフォームのファミリーによる特定のエクソン配列の包含に起因する可能性がある。
【0158】
これらの配列の差異によって、タンパク質の産出が多様化されるかどうかを知るために、予測されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ；表２）を分析した。データセット内の４，１１６個のアイソフォームの半分以上に、固有のＯＲＦが含まれていることが分かった（２，２４７；５４．６％）。遺伝子の小さなサブセットにはｍＲＮＡ発現の大きな多様性があったが、ＯＲＦ発現の同等の多様性はなかった（図３Ａ）；これは主に、５’ＵＴＲの変動または組織的なイントロン保持によるものであった（図１１Ｃ、Ｄ）。しかし、全体として、アイソフォームの数と予測されるＯＲＦの数との間には強い相関関係があった（図３Ａ）。多様な発現ＯＲＦの量は遺伝子によって異なる；しかし、ｍＲＮＡと同様に、この予測された多様なタンパク質の大部分は、かなりのレベルで発現していた（図３Ｂ～Ｄ；図１１Ａ、Ｂ）。注目すべきことに、ＯＲＦの多様性が最も高い遺伝子は、特定のタイプの細胞表面タンパク質をコードする傾向があった。シャノン多様性指数の上位の遺伝子はすべて、シナプス間接着分子をコードしている（図３Ｃ）。この結果は、ｍＲＮＡ多様性の主な機能が、シナプス接続の形成または安定性に影響を与えるように配置されたタンパク質バリアントの生成であることを示している。
【0159】
ｍＲＮＡ多様性がタンパク質配列に有意な影響を与えるかどうかを判断するために、個々の遺伝子の予測されるタンパク質産生を調べた。多くの場合、予測されるタンパク質は、十分に特徴付けされた特徴または機能ドメインを含む点で実質的に異なる。この現象は、網膜発生の間の細胞間認識に関与する膜貫通型ＥＧＦリピートタンパク質をコードするＭｅｇｆ１１遺伝子によって例示されている44。Ｍｅｇｆ１１は、広範な選択的スプライシングの対象となる：２６個のタンパク質をコードするエクソンのうち、２１個が選択的スプライシングされる（８１％）。実際、３つの独立したロングリードシークエンシング実験で同定された２３４個のＭｅｇｆ１１アイソフォーム内の、１０個の構成的スプライスジャンクションのみを記録した（図４Ａ、Ｂ；図１２）。予測されるタンパク質の検査により、このような広範なスプライシングの潜在的な理由が明らかになった：細胞外ドメインを含むＥＧＦリピートのほとんどは、個々のエクソンによってコードされているため、選択的スプライシングによってモジュラー方式で展開される（図４Ａ～Ｄ）。細胞内ドメインエクソンも、ショウジョウバエのホモログであるＤｒａｐｅｒ45の状況と同様に、ＩＴＡＭまたはＩＴＩＭシグナル伝達モチーフの使用においてモジュール性の可能性を示した（図４Ａ～Ｄ）。このモジュラー構成の結果として、予測されたＭＥＧＦ１１タンパク質は、含まれるＥＧＦリピートの数および／または同一性に実質的な変動を示した（図４Ｄ）。最も変化しやすいＥＧＦリピートはエクソン１４－１６ｂによってコードされていた（図４Ｂ）；しかし、ほとんどのＥＧＦリピートは別の使用法の対象であった。ＢａｓｅＳｃｏｐｅ（商標）インサイチュハイブリダイゼーション46、47を使用して、最も変化しやすいエクソンジャンクションのそれぞれが、インビボで網膜ニューロンによって発現することを確認した（図４Ｅ）。注目すべきことに、個々のＭｅｇｆ１１発現細胞は、試験したすべてのエクソンジャンクションを使用することが分かり、個々のニューロン内でも広範なＭｅｇｆ１１のアイソフォーム多様性が存在することが示唆された（図４Ｅ）。したがって、昆虫Ｄｓｃａｍ１と同様に、Ｍｅｇｆ１１は、モジュラー細胞外ドメイン機能の選択的スプライシングを使用して、異なる細胞表面分子をコードするアイソフォームの大きなファミリーを作出する。完全なｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータセットの我々の分析とともに、これらの知見は、アイソフォーム多様性が、インビボで神経細胞表面のプロテオームを多様化するのに役立つことを強く示唆している。
【0160】
ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑによって予測される細胞表面タンパク質は、発生中の網膜内で発現する
新規のｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームがタンパク質に翻訳されるかどうかを決定するために、発生中の網膜から得られた細胞表面タンパク質サンプルに対して質量分析を実行した。細胞表面タンパク質を、細胞外エピトープを開裂またはビオチン化する細胞不透過性試薬を使用して捕捉した（図３Ｅ、Ｆ）。捕捉されたペプチドのいずれかが新規タンパク質アイソフォームに由来するかどうかを知るために、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑカタログ内のアイソフォームに由来する可能性のあるトリプシンペプチド産物のデータベースを生成した。タンパク質の同定には、未処理の質量分析データを参照ペプチドデータベースと比較する必要があるため、これは不可欠であった。この新しい予測ペプチドデータベースの生成時に、ほとんどのプロテオミクス実験で典型的に使用されるＵｎｉＰｒｏｔマウスリファレンスデータベースよりも、我々の３０遺伝子の推定ペプチドが約２５％多いことが分かった（図１１Ｅ）。追加の推定ペプチドは、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑによって予測された新規タンパク質領域を表している。
新規のｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームがタンパク質に翻訳されるかどうかを決定するために、発生中の網膜から得られた細胞表面タンパク質サンプルに対して質量分析を実行した。細胞表面タンパク質を、細胞外エピトープを開裂またはビオチン化する細胞不透過性試薬を使用して捕捉した（図３Ｅ、Ｆ）。捕捉されたペプチドのいずれかが新規タンパク質アイソフォームに由来するかどうかを知るために、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑカタログ内のアイソフォームに由来する可能性のあるトリプシンペプチド産物のデータベースを生成した。タンパク質の同定には、未処理の質量分析データを参照ペプチドデータベースと比較する必要があるため、これは不可欠であった。この新しい予測ペプチドデータベースの生成時に、ほとんどのプロテオミクス実験で典型的に使用されるＵｎｉＰｒｏｔマウスリファレンスデータベースよりも、我々の３０遺伝子の推定ペプチドが約２５％多いことが分かった（図１１Ｅ）。追加の推定ペプチドは、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑによって予測された新規タンパク質領域を表している。
【0161】
この新しいデータベースを参照として使用すると、２８種類の遺伝子に対応する合計６８６種類のペプチドが見出された。これらのペプチドのうち３５種類は、ＵｎｉＰｒｏｔ標準リファレンスには存在せず、我々の新しいリファレンスデータベースにのみ存在していた（図３Ｇ）。この画分は、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームカタログから予測された、典型的な質量分析実験では検出されなかったであろう新規ペプチドを表している。３０遺伝子のうち１４個で新規ペプチドが見出され、新規エクソン配列、スプライスジャンクション、およびスプライスアクセプター部位をバリデーションした（データは示していない）。これらの知見は、予測されたタンパク質の少なくとも一部が、インビボで網膜細胞の表面に発現していることを実証している。したがって、ここで説明するｍＲＮＡ多様性は、網膜細胞表面プロテオームの多様性に寄与する。
【0162】
ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータベースで最も豊富な転写物は、Ｃｒｂ１の新規アイソフォームである。
新たに発見されたアイソフォームが遺伝子機能への洞察を提供することができるかどうかを調査するために、我々は周知の網膜疾患遺伝子であるＣｒｂ１に焦点を当てた。我々のＣｒｂ１カタログには１５種類のアイソフォームが含まれており、そのうちのいくつかは組織特異的であり、かつ発生的に調節されていた（図５Ａ、Ｂ；図１３Ｂ、Ｃ）。成熟した網膜では、Ｃｒｂ１の発現は単一のアイソフォームによって支配されていたが、以前のほぼすべてのＣｒｂ１研究の対象となったアイソフォームではなかった。代わりに、優勢なアイソフォームは、固有の５’および３’エクソン（図５Ａ、Ｄ；図１４Ａ）ならびに新規５’エクソンのすぐ上流にある固有のプロモーター部位（図５Ｃ）を有する網膜特異的バリアントであった。このアイソフォームをＣｒｂ１－Ｂと名付け、これをカノニカルなＣｒｂ１－Ａアイソフォームと区別した。
新たに発見されたアイソフォームが遺伝子機能への洞察を提供することができるかどうかを調査するために、我々は周知の網膜疾患遺伝子であるＣｒｂ１に焦点を当てた。我々のＣｒｂ１カタログには１５種類のアイソフォームが含まれており、そのうちのいくつかは組織特異的であり、かつ発生的に調節されていた（図５Ａ、Ｂ；図１３Ｂ、Ｃ）。成熟した網膜では、Ｃｒｂ１の発現は単一のアイソフォームによって支配されていたが、以前のほぼすべてのＣｒｂ１研究の対象となったアイソフォームではなかった。代わりに、優勢なアイソフォームは、固有の５’および３’エクソン（図５Ａ、Ｄ；図１４Ａ）ならびに新規５’エクソンのすぐ上流にある固有のプロモーター部位（図５Ｃ）を有する網膜特異的バリアントであった。このアイソフォームをＣｒｂ１－Ｂと名付け、これをカノニカルなＣｒｂ１－Ａアイソフォームと区別した。
【0163】
Ｃｒｂ１－Ｂは、我々のデータセット内の４，１１６個のアイソフォームの中で最も豊富であったが（図２Ｄ）、主要なゲノムデータベース（ＲｅｆＳｅｑ、ＧＥＮＣＯＤＥ、またはＵＣＳＣ）では注釈が付けられていなかった。また、我々の知る限り、それは文献に記録されていなかった。ＣＲＢ１－Ｂはまた、ヒト網膜ｃＤＮＡから生成されたｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータセットによって示されるように、ヒト網膜において最も豊富なアイソフォームでもある（図５Ｅ、Ｇ）。３番目のバリアントであるＣＲＢ１－Ｃも、－マウスよりもはるかに高い－中程度のレベルでヒト網膜に発現したが、それでもＣＲＢ１－Ｂほど豊富ではなかった（図５Ｅ、Ｇ）。マウスにおけるように、ＡＴＡＣ－ｓｅｑデータによって、ヒト網膜における推定Ｂアイソフォームプロモーターが明らかになった（図５Ｃ、Ｆ）。ショートリードデータセットを使用して、マウスおよびヒトの知見を裏付け、次にそれらを他のいくつかの脊椎動物種に拡張した（図５Ｈ、Ｉ；図１３Ａ）。総合すると、これらの結果は、重要な疾患遺伝子の主要な網膜アイソフォームが以前は看過されていたことを実証している。脊椎動物種の範囲全体で、ＣＲＢ１－Ｂは網膜の主要なＣＲＢ１アイソフォームである。
【0164】
Ｃｒｂ１－ＡおよびＣｒｂ１－Ｂは、異なる細胞型で発現する細胞表面タンパク質をコードする
Ｃｒｂ１－Ｂは、ＣＲＢ１－Ａと有意な細胞外ドメインの重複を共有する膜貫通タンパク質をコードすると予測されているが、完全に異なる細胞内ドメインである（図６Ａ、Ｂ）。したがって、このタンパク質が発現しているかどうか、発現している場合は、タンパク質がどこに局在しているかを求めた。ＣＲＢ１－Ｂ細胞内ドメインに対して産生された抗体を用いたウエスタンブロッティングは、タンパク質がインビボで存在することを実証した（図６Ｃ）。さらに、Ｃｒｂ１－Ｂプロモーターおよび５’エクソンを欠くように操作されたマウスでは細胞内ドメインの発現がなかったため（図６Ｃ；マウスの設計については図７Ａを参照のこと）、タンパク質は、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑによって予測された構成で存在する（図６Ａ）。ＣＲＢ１－Ｂは膜貫通タンパク質であるという考えと一致して、ＣＲＢ１－Ｂは網膜溶解物の可溶性画分ではなく、膜画分で検出された（図６Ｄ）。さらに、異種細胞内で発現した場合、ＣＲＢ１－Ｂは、ＣＲＢ１－Ａに非常に類似した方法で原形質膜に輸送された（図１４Ｃ）。これらのデータは、両方の主要なＣＲＢ１アイソフォームが細胞表面に局在することを示唆している。
Ｃｒｂ１－Ｂは、ＣＲＢ１－Ａと有意な細胞外ドメインの重複を共有する膜貫通タンパク質をコードすると予測されているが、完全に異なる細胞内ドメインである（図６Ａ、Ｂ）。したがって、このタンパク質が発現しているかどうか、発現している場合は、タンパク質がどこに局在しているかを求めた。ＣＲＢ１－Ｂ細胞内ドメインに対して産生された抗体を用いたウエスタンブロッティングは、タンパク質がインビボで存在することを実証した（図６Ｃ）。さらに、Ｃｒｂ１－Ｂプロモーターおよび５’エクソンを欠くように操作されたマウスでは細胞内ドメインの発現がなかったため（図６Ｃ；マウスの設計については図７Ａを参照のこと）、タンパク質は、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑによって予測された構成で存在する（図６Ａ）。ＣＲＢ１－Ｂは膜貫通タンパク質であるという考えと一致して、ＣＲＢ１－Ｂは網膜溶解物の可溶性画分ではなく、膜画分で検出された（図６Ｄ）。さらに、異種細胞内で発現した場合、ＣＲＢ１－Ｂは、ＣＲＢ１－Ａに非常に類似した方法で原形質膜に輸送された（図１４Ｃ）。これらのデータは、両方の主要なＣＲＢ１アイソフォームが細胞表面に局在することを示唆している。
【0165】
Ｃｒｂ１－ＡおよびＣｒｂ１－Ｂの発現パターンを決定するために、単一細胞（ｓｃ）－ＲＮＡ－ｓｅｑデータセット内のｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームの発現を評価する戦略を開発した。この戦略を、発生中のマウス網膜からのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータに適用して48、各アイソフォームの異なる発現パターンを見出した。Ｃｒｂ１－Ａは、主にミュラーグリアによって発現し（図６Ｅ、Ｆ；図１４Ｄ）、このことは、以前の免疫組織化学的研究と一致している37、49。対照的に、Ｃｒｂ１－Ｂは、桿体および錐体光受容体によって発現した（図６Ｅ、Ｆ；図１４Ｂ、Ｄ）。これらの細胞型特異的発現パターンを、２つの独立した方法を使用してバリデーションした：第１に、桿体および錐体からのＡＴＡＣ－ｓｅｑデータは、光受容体がＣｒｂ１－Ｂプロモーターを選択的に使用することを示した（図５Ｃ）。第２に、ＢａｓｅＳｃｏｐｅ染色により、２つのアイソフォームの相互に排他的な発現が確認され、Ｃｒｂ１－Ａはミュラー細胞に局在し、Ｃｒｂ１－Ｂは光受容体に局在していた（図６Ｇ）。
【0166】
ＣＲＢ１－Ｂタンパク質の局在を調べるために、最初に免疫組織化学を試みたが、抗体が好適でないことが分かった。したがって、網膜の連続接線方向凍結切片化とウエスタンブロッティングとを組み合わせた手法に目を向けた50、51。各接線方向切片には、代表的なタンパク質マーカーで認識できる細胞および細胞内構造の特定のサブセットが含まれている（図６Ｈ）。このアプローチでは、主に内節および外節内の光受容体層におけるＣＲＢ１－Ｂの発現を確認した。この局在化は、このアイソフォームに特異的な抗体を使用して37、49、ＯＬＭ内（図６Ｅ）のミュラー細胞の頂端に局在化されたＣＲＢ１－Ａとは著しく対照的である。
【0167】
ＣＲＢ１－Ｂは、外境界膜の完全性に必要である
次に、ＣＲＢ１－Ｂアイソフォームの機能を調査した。主要なＣＲＢ１アイソフォームを発現する２つの細胞型である、光受容体およびミュラーグリア（図６Ｆ、Ｇ）は、ＯＬＭを形成する特殊な細胞間接合に関与する（図６Ｅ；図７Ｂ、Ｃ）。ＣＲＢ１疾患の変性病変は、これらの接合部の破壊に起因する場合があることが示唆されているが、マウスの研究では、ＣＲＢ１が実際にＯＬＭの完全性に必要かどうかを明らかにすることができていない。２つの既存のＣｒｂ１変異系統は、ＯＬＭ表現型が対立している。ｒｄ８として知られるＣｒｂ１点変異を有するマウスは、散発的なＯＬＭ破壊を示す36が、ここではＣｒｂ１ex1と表記するＣｒｂ１「ノックアウト」対立遺伝子は、ＯＬＭ接合部を妨害することができない37。我々のｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータは、これら２つの対立遺伝子の重要な違いを明らかにした：ｒｄ８はＣｒｂ１－ＡとＣｒｂ１－Ｂの両方のアイソフォームに影響を与えるが、「ノックアウト」ｅｘ１対立遺伝子はＣｒｂ１－Ｂをインタクトで残す（図７Ａ）。したがって、Ｃｒｂ１－Ｂは、ＯＬＭでの光受容体－ミュラー接合部の完全性に重要な役割を果たしていると仮定した。この仮説を試験するために、２つの新しい変異対立遺伝子を生成した（図７Ａ；図１５Ａ、Ｂ）。第１のＣｒｂ１delBは、Ｃｒｂ１－Ａを含む他のアイソフォームを保持しながら、Ｃｒｂ１－Ｂを消滅させる。第２のＣｒｂ１nullは、すべてのＣｒｂ１アイソフォームを破壊するように設計された大きな削除である。
次に、ＣＲＢ１－Ｂアイソフォームの機能を調査した。主要なＣＲＢ１アイソフォームを発現する２つの細胞型である、光受容体およびミュラーグリア（図６Ｆ、Ｇ）は、ＯＬＭを形成する特殊な細胞間接合に関与する（図６Ｅ；図７Ｂ、Ｃ）。ＣＲＢ１疾患の変性病変は、これらの接合部の破壊に起因する場合があることが示唆されているが、マウスの研究では、ＣＲＢ１が実際にＯＬＭの完全性に必要かどうかを明らかにすることができていない。２つの既存のＣｒｂ１変異系統は、ＯＬＭ表現型が対立している。ｒｄ８として知られるＣｒｂ１点変異を有するマウスは、散発的なＯＬＭ破壊を示す36が、ここではＣｒｂ１ex1と表記するＣｒｂ１「ノックアウト」対立遺伝子は、ＯＬＭ接合部を妨害することができない37。我々のｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータは、これら２つの対立遺伝子の重要な違いを明らかにした：ｒｄ８はＣｒｂ１－ＡとＣｒｂ１－Ｂの両方のアイソフォームに影響を与えるが、「ノックアウト」ｅｘ１対立遺伝子はＣｒｂ１－Ｂをインタクトで残す（図７Ａ）。したがって、Ｃｒｂ１－Ｂは、ＯＬＭでの光受容体－ミュラー接合部の完全性に重要な役割を果たしていると仮定した。この仮説を試験するために、２つの新しい変異対立遺伝子を生成した（図７Ａ；図１５Ａ、Ｂ）。第１のＣｒｂ１delBは、Ｃｒｂ１－Ａを含む他のアイソフォームを保持しながら、Ｃｒｂ１－Ｂを消滅させる。第２のＣｒｂ１nullは、すべてのＣｒｂ１アイソフォームを破壊するように設計された大きな削除である。
【0168】
電子顕微鏡を使用してＯＬＭの完全性を評価すると、Ｃｒｂ１null変異体がＯＬＭで破壊を呈し、それによって光受容体核が内節層に侵入し、外網膜の構造を妨害することが分かった（図７Ｂ～Ｅ；図１５Ｄ）。破壊された領域内では、光受容体の内節は、頂端ミュラープロセスとの特徴的な電子密度の高い接合部を欠いており、光受容体－ミュラー接触の破壊によりＯＬＭギャップが生じたことを示している（図７Ｆ）。以前に報告されたように、同様の表現型がＣｒｂ１rd8変異体でも観察された36（図７Ｆ、Ｇ、Ｊ；図１５Ｄ～Ｆ）。ＯＬＭ表現型への各アイソフォームの寄与を調査するために、Ｃｒｂ１nullおよびＣｒｂ１delB対立遺伝子の種々の組み合わせを有するマウスを調べた。Ｃｒｂ１－Ｂを欠いているがＣｒｂ１－Ａの２つのコピーを保持しているＣｒｂ１delB/delBマウスでは、ＯＬＭ表現型は依然として明らかであったが、ｒｄ８またはｎｕｌｌホモ接合体における場合よりも弱かった（図７Ｈ、Ｊ）。対照的に、ＯＬＭ表現型は、Ｃｒｂ１delB/nullマウスのｒｄ８およびｎｕｌｌ変異体と同等であり、Ｃｒｂ１－Ｂを欠いているが、Ｃｒｂ１－Ａのコピーを１つ保持している（図７Ｅ、Ｊ；図１５Ｆ）。これらの知見は、ＯＬＭ接合部の完全性には両方のＣｒｂ１アイソフォームが必要であることを示しているが、Ｃｒｂ１－Ａが存在している場合でも、深刻なＯＬＭ破壊が生じる可能性があることを考えると、Ｃｒｂ１－Ｂの役割は特に重要である。
【0169】
すべてのＣｒｂ１アイソフォームを欠くマウスの網膜変性
最後に、ＣＲＢ１アイソフォームへの洞察を使用してＣＲＢ１変性疾患の動物モデルを改善できるかどうかを求めた。光受容体の変性は、既存のＣｒｂ１機能喪失マウスには存在しないか、非常に遅いため、ヒトの変性表現型のモデルとしては不十分である36、37、52。Ｃｒｂ１－Ｂなど、以前は注釈が付けられていなかったＣｒｂ１アイソフォームが、これらの軽度の表現型の説明に役立つ可能性があるという仮説を立てた。この可能性と一致して、既存のＣｒｂ１変異対立遺伝子のいずれもがすべてのＣｒｂ１アイソフォームを完全に排除するわけではないことに気づいた（図７Ａ）。光受容体の変性に対する新しいＣｒｂ１アイソフォームの寄与を試験するために、新しく生成されたＣｒｂ１delB系統およびＣｒｂ１null系統を利用した（図７Ａ）。若い成体マウス（Ｐ１００）の光受容体数の分析により、Ｃｒｂ１－ＡとＣｒｂ１－Ｂの両方のアイソフォームが光受容体の生存に必要であることが明らかになった。Ｃｒｂ１delB変異体は、以前に報告されたＣｒｂ１ex1変異体37と同様に、正常な光受容体数を有していた（図８Ａ、Ｄ；図１５Ｃ）。したがって、いずれかの主要なアイソフォームを単独で除去しても、変性効果は最小限に抑えられる。対照的に、Ｃｒｂ１nullマウスのすべてのアイソフォームの削除によって、顕著な光受容体変性が生じた（図８Ａ～Ｄ）。したがって、有意に細胞が喪失するには、Ｃｒｂ１－ＡとＣｒｂ１－Ｂの両方が不全であることが必要である。Ｃｒｂ１rd8変異体のＰ１００ではまだ変性は見られず（図８Ｂ～Ｄ）、これは、有意な変性には約２年かかるという以前の報告と一致している36、52、53。総合すると、これらの遺伝子実験は、－新規Ｃｒｂ１－Ｂアイソフォームを含む、複数のＣｒｂ１アイソフォームが、光受容体の生存に寄与するという結論を支持する。したがって、ヒトの疾患のモデリングは、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームカタログによって導出される変異対立遺伝子の合理的な設計によって達成することができる。
最後に、ＣＲＢ１アイソフォームへの洞察を使用してＣＲＢ１変性疾患の動物モデルを改善できるかどうかを求めた。光受容体の変性は、既存のＣｒｂ１機能喪失マウスには存在しないか、非常に遅いため、ヒトの変性表現型のモデルとしては不十分である36、37、52。Ｃｒｂ１－Ｂなど、以前は注釈が付けられていなかったＣｒｂ１アイソフォームが、これらの軽度の表現型の説明に役立つ可能性があるという仮説を立てた。この可能性と一致して、既存のＣｒｂ１変異対立遺伝子のいずれもがすべてのＣｒｂ１アイソフォームを完全に排除するわけではないことに気づいた（図７Ａ）。光受容体の変性に対する新しいＣｒｂ１アイソフォームの寄与を試験するために、新しく生成されたＣｒｂ１delB系統およびＣｒｂ１null系統を利用した（図７Ａ）。若い成体マウス（Ｐ１００）の光受容体数の分析により、Ｃｒｂ１－ＡとＣｒｂ１－Ｂの両方のアイソフォームが光受容体の生存に必要であることが明らかになった。Ｃｒｂ１delB変異体は、以前に報告されたＣｒｂ１ex1変異体37と同様に、正常な光受容体数を有していた（図８Ａ、Ｄ；図１５Ｃ）。したがって、いずれかの主要なアイソフォームを単独で除去しても、変性効果は最小限に抑えられる。対照的に、Ｃｒｂ１nullマウスのすべてのアイソフォームの削除によって、顕著な光受容体変性が生じた（図８Ａ～Ｄ）。したがって、有意に細胞が喪失するには、Ｃｒｂ１－ＡとＣｒｂ１－Ｂの両方が不全であることが必要である。Ｃｒｂ１rd8変異体のＰ１００ではまだ変性は見られず（図８Ｂ～Ｄ）、これは、有意な変性には約２年かかるという以前の報告と一致している36、52、53。総合すると、これらの遺伝子実験は、－新規Ｃｒｂ１－Ｂアイソフォームを含む、複数のＣｒｂ１アイソフォームが、光受容体の生存に寄与するという結論を支持する。したがって、ヒトの疾患のモデリングは、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームカタログによって導出される変異対立遺伝子の合理的な設計によって達成することができる。
【0170】
考察
シークエンシング技術の最近の進歩にもかかわらず、ＣＮＳトランスクリプトームの真の多様性は驚くほど難解なままである12。ほとんどの遺伝子について、完全なアイソフォームポートフォリオの小さなサブセットのみが記録されている。ここでは、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑが前例のないレベルの詳細でアイソフォーム多様性を明らかにできることを示す。ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑは、正確かつ効率的であり、存在量の少ないアイソフォームであっても完全長配列を明らかにする程度の深度を備えている。ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータの解釈を容易にするために、アイソフォームカタログを分析および視覚化するためのコンパニオンＲソフトウェアパッケージを提供している。これらの新しいツールを発生中の神経系に適用することで、細胞表面タンパク質をコードする多種多様なアイソフォームを発見し、そのほとんどは新規であった。多くは、機能的タンパク質ドメインを変化させると予測された。さらに、我々のデータセット全体で最も豊富なアイソフォームであるＣｒｂ１疾患遺伝子の新規アイソフォームは、カノニカルなアイソフォームとは異なる発現パターンと機能を有し、それにより疾患関連機能を備えていることが分かった。したがって、ＣＲＢ１は、包括的な完全長アイソフォーム同定の意義がある顕著な例として機能する。ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑを適用して、多くの異なるＣＮＳ領域および細胞型の完全長アイソフォームカタログを生成することができることを提案し、これは、ＣＮＳ遺伝子の機能および機能不全に対する多くの新しい洞察を引き出す可能性が高いアプローチである。
シークエンシング技術の最近の進歩にもかかわらず、ＣＮＳトランスクリプトームの真の多様性は驚くほど難解なままである12。ほとんどの遺伝子について、完全なアイソフォームポートフォリオの小さなサブセットのみが記録されている。ここでは、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑが前例のないレベルの詳細でアイソフォーム多様性を明らかにできることを示す。ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑは、正確かつ効率的であり、存在量の少ないアイソフォームであっても完全長配列を明らかにする程度の深度を備えている。ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータの解釈を容易にするために、アイソフォームカタログを分析および視覚化するためのコンパニオンＲソフトウェアパッケージを提供している。これらの新しいツールを発生中の神経系に適用することで、細胞表面タンパク質をコードする多種多様なアイソフォームを発見し、そのほとんどは新規であった。多くは、機能的タンパク質ドメインを変化させると予測された。さらに、我々のデータセット全体で最も豊富なアイソフォームであるＣｒｂ１疾患遺伝子の新規アイソフォームは、カノニカルなアイソフォームとは異なる発現パターンと機能を有し、それにより疾患関連機能を備えていることが分かった。したがって、ＣＲＢ１は、包括的な完全長アイソフォーム同定の意義がある顕著な例として機能する。ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑを適用して、多くの異なるＣＮＳ領域および細胞型の完全長アイソフォームカタログを生成することができることを提案し、これは、ＣＮＳ遺伝子の機能および機能不全に対する多くの新しい洞察を引き出す可能性が高いアプローチである。
【0171】
アイソフォームの同定には、かなりのシークエンシング深度が必要である。ショートリードＲＮＡ－ｓｅｑを使用しても、転写物の最も少量の４４％では１％のリードしか得られないことを考えると、完全なアイソフォームポートフォリオは最も豊富な遺伝子についてのみ検出可能である可能性がある31、54。標的化ＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアプローチを使用して、少量の転写物のショートリード検出が改善されてきた31、55。ここでは、タンパク質をコードするｍＲＮＡのロングリードシークエンシングにこの戦略を適用して、ｃＤＮＡサイズおよび発現レベルのために既存のＰａｃＢｉｏトランスクリプトームではほとんど表現されない遺伝子グループの深い完全長カバレッジを取得した。アイソフォームの存在量の分布（図２Ｃ）から、最も少量のアイソフォームのみが検出を免れたことが明らかである。我々のライブラリー調製プロトコルのサイズ選択ステップを考えると、４．５ｋｂ未満の一部のアイソフォームも検出を回避している場合がある（図１Ｂ）。このような理由によって、直近のアイソフォームをすべて検出したわけではないと思われる。しかし、長い転写物を濃縮した場合でも、依然としてより短いリードの大きなサンプルを取得し（図１０Ｅ）、Ｃｒｂ１－Ｂ（３．０ｋｂ）を含む多くのより小さなアイソフォームを同定した。したがって、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑカタログには、ある特定の短いおよび／またはまれな転写物が欠けている場合があるが、標的化組織で発現しているアイソフォームのほとんどが検出されたと結論付ける。並列シークエンシング用に３０遺伝子を標的にすることでこの深度を達成したが、現在は高スループットのＰａｃＢｉｏ機器が利用可能であり；これらによって、アイソフォームカバレッジを犠牲にすることなく、実質的により多くの標的化遺伝子を並行してシークエンシングすることが可能になるはずである。
【0172】
我々の結果は、トランスクリプトーム注釈におけるｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑの多くの利用可能性を示唆している。特に刺激的なユースケースの１つは、細胞型特有のアイソフォーム発現パターンの同定である。ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑデータを、単一細胞データを含む既存のショートリードＲＮＡ－ｓｅｑデータセットと統合して、アイソフォーム発現の時間および場所を明らかにできることを示す。現在のところ、この発現マッピングは、ほとんどの単一細胞ライブラリー調製法に固有の３’バイアスのため、３’末端部が異なるアイソフォームに最適である。将来的には、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ法を改良して深度およびカバレッジが改善されるため、他のタイプのアイソフォームをこの方法でマッピングに適するようになると予想している。この方法では、神経系の細胞タイプごとにｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑカタログを生成する必要はなく；むしろ、細胞型特異的アイソフォームの発現を、異なるタイプのシークエンシングデータを組み合わせることによって生物情報学的に決定することができる。
【0173】
任意の所与の遺伝子によっていくつのｍＲＮＡアイソフォームが産生されるか？我々のデータセット内の３０遺伝子の場合、ＲｅｆＳｅｑアイソフォーム数の中央値は１１．５であり、５１を超える遺伝子はなかった。対照的に、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑカタログのアイソフォーム数の中央値は５０であったが、最も多様な遺伝子であるＮｒｘｎ３は９００近くを有していた。全体として、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑアイソフォームの数は、参照トランスクリプトームで注釈付けされた数をほぼ１桁上回った（図２Ｂ）。対照的に、長鎖非コーディングＲＮＡの以前のＣａｐｔｕｒｅＳｅｑ研究では、２倍以上のアイソフォームしか見出されなかった40。したがって、ほとんどの遺伝子が複数のアイソフォームを生成することが広く認識されているにもかかわらず、細胞表面分子について我々が明らかにした多様性の規模は、依然として驚くべきものであった。我々の３０遺伝子は、転写物の多様性のエビデンスを示したために選択されたことを考えると、おそらく平均的な遺伝子よりも多くのアイソフォームを有する（図１Ａ）。そのような多様性が他の遺伝子クラスおよび他の組織に典型的であるかどうかは、－おそらくｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑ方法のより広範な適用を通じて、まだ決定されていない。
【0174】
細胞表面タンパク質の広範な多様性が、精密なニューロン接続の形成に関与している可能性があるのではないかと長い間考えられてきた5、8、56。しかし、最近、多数の細胞表面手がかりの必要性が疑問視されている57。この見方では、広範な多様性は、Ｄｓｃａｍ１およびクラスタリングされたプロトカドヘリンによって媒介される自己認識と非自己認識の間など、ある特定の選択された状況でのみ必要とされる58、59。ここでは、広範なアイソフォーム多様性が多くの細胞表面受容体遺伝子に広がっていること、および個々のニューロンがある特定の遺伝子のアイソフォームを多数発現している可能性が高いことを示している（例えば、Ｍｅｇｆ１１；図４Ｅ）。したがって、「多数の手がかり」モデルの分子的前提条件が整っている。驚くべきことに、タンパク質の多様性が最も予測される遺伝子は、シナプス間細胞接着分子としての共通の機能を共有している（図３Ｃ）。これらの遺伝子の多くは、シナプス形成において既知の役割を果たしている19、60、61。したがって、これらの多様な分子手がかりは、シナプス接続の精度に影響を与えるために正確に正しい場所に配置されている可能性がある。本明細書で記載されたアイソフォームがシナプス特異性においてどの程度機能するかを知ることは興味深い。
【0175】
Ｄｓｃａｍ１アイソフォーム多様性の顕著な特徴は、結合特異性を改変するためのＩｇリピートのモジュラー展開である。細胞外ドメインモチーフのモジュラースワッピングの可能性が同等に高い他の遺伝子は、これまでに同定されていなかった。ここでは、網膜発生の間に同型の細胞間反発を媒介する認識分子であるＭｅｇｆ１１44が、ＥＧＦ様リピートの広範なモジュラー使用を通じて細胞外ドメインを多様化することを示す。選択的スプライシングによるモジュラーＥＧＦリピートスワッピングの現象は、小規模ではあるが、ネトリン－Ｇタンパク質で以前に観察されている62。したがって、多くのＥＧＦリピート遺伝子が同様のモジュラー戦略を使用して細胞表面タンパク質の大きなファミリーを生成し得ることが可能である。
【0176】
我々のＣＲＢ１の研究は、個々の遺伝子の完全なアイソフォーム産生を記録することの価値と重要性を示している。ＣＲＢ１は、レーバー先天性黒内障、網膜色素変性症、黄斑ジストロフィーなどの遺伝性網膜変性疾患の主要な原因遺伝子である63~65。そのため、マウスＣｒｂ１とヒトＣＲＢ１の両方が集中的に研究されてきた。それにもかかわらず、成熟ヒト網膜の主要なＣＲＢ１アイソフォームであるＣＲＢ１－Ｂは、これまで検出が回避されてきた。ＣＲＢ１－Ｂは、その５’および３’エクソンが、ＣＲＢ１－Ａと区別する転写物の唯一の部分であるため、看過されている場合がある。ショートリードシークエンシングでは、これら２つの離間したエクソンが同じ転写物で典型的に一緒に使用されていることを判断するのは困難である。対照的に、ｌｒＣａｐｔｕｒｅＳｅｑは、最も豊富な網膜ＣＲＢ１アイソフォームが、これらの従来と異なる５’および３’エクソンを含む新規バリアントであることを明確に示した。
【0177】
Ｃｒｂ１－ＡおよびＣｒｂ１－Ｂは、それらの別個の５’および３’末端部（図６Ａ）のために、それらに別個の機能を与える可能性が高い重要な点において異なっている。それらの５’エクソンは、異なる細胞型－ミュラーグリアのＣｒｂ１－Ａと光受容体のＣｒｂ１－Ｂ－において発現を駆動する異なるプロモーターを有するが、３’エクソンは異なる細胞内ドメインをコードしている。ＣＲＢ１－Ａ細胞内ドメインは、ショウジョウバエクラムスの他の脊椎動物ホモログと同様に、クラムス複合体として知られる極性タンパク質との相互作用を媒介する２つの高度に保存されたモチーフを含有している66。これらのモチーフは、クラムスホモログを頂端接合部に局在化し、上皮の構造的完全性および頂底極性を維持するために必要とされる33。ＣＲＢ１－Ｂはこれらの保存されたモチーフを欠いており、ＣＲＢ１－ＡとＣＲＢ１－Ｂとが異なる細胞内相互作用パートナーを介して異なる細胞型で機能するモデルを示唆している。
【0178】
我々の知見は、ＣＲＢ１およびクラムス複合体がミュラーグリアと光受容体との間のＯＬＭ接合部の完全性に必要であると仮定しており、これは、ＣＲＢ１疾患の一般的なモデルに影響を及ぼす26。このモデルの主な課題は、ＣＲＢ１－Ａを欠くＣｒｂ１ex1変異体37におけるＯＬＭ表現型の欠如または光受容体変性であった（図７Ａ）。この変異マウスはｎｕｌｌ対立遺伝子であると考えられていたため、その弱い表現型は、ＣＲＢ１がマウスの光受容体の生存に重要でない可能性があることを示唆していた26。ここでは、ＣＲＢ１がＯＬＭの完全性および光受容体の生存に実際に必要であることを示しているが、メカニズムには光受容体特異的ＣＲＢ１－Ｂアイソフォームが決定的に関与している。さらに、２つのアイソフォーム間の遺伝的相互作用を示し、Ｃｒｂ１ex1変異系統では不明瞭であったＣＲＢ１－ＡのＯＬＭの完全性および生存促進機能を明らかにする。我々は、グリアにおけるＣＲＢ１－Ａと光受容体におけるＣＲＢ１－Ｂの協調作用によって、おそらくそれぞれの細胞型における接合タンパク質複合体の集合または維持を通じて、ＯＬＭの完全性および光受容体の健康が制御されることを提案する。
Ｃｒｂ１－ＡおよびＣｒｂ１－Ｂ機能の協調という概念は、両方のアイソフォームに影響を与える点変異であるＣｒｂ１rd8（図７Ａ）がＣｒｂ１ex1よりも多くの変性を呈するという事実によってさらに支持されている36、37、53。しかし、ＡとＢの両方のアイソフォームが両方の変異体で影響を受けている場合でも、Ｃｒｂ１rd8はＣｒｂ１nullよりも明らかに重症度が低くなっている（図８）。この違いの考えられる理由の１つは、Ｃｒｂ１rd8がｍＲＮＡまたはタンパク質ｎｕｌｌ53ではない場合があるということである。別の可能性は、Ｃｒｂ１rd8の影響を受けないため、Ｃｒｂ１－Ｃアイソフォームが代償的な役割を果たす場合があるということである（図７Ａ）。いずれにせよ、我々の結果は、完全なアイソフォームカタログが利用可能になると、マウス疾患モデルの設計が大幅に強化されることを示している。
Ｃｒｂ１－ＡおよびＣｒｂ１－Ｂ機能の協調という概念は、両方のアイソフォームに影響を与える点変異であるＣｒｂ１rd8（図７Ａ）がＣｒｂ１ex1よりも多くの変性を呈するという事実によってさらに支持されている36、37、53。しかし、ＡとＢの両方のアイソフォームが両方の変異体で影響を受けている場合でも、Ｃｒｂ１rd8はＣｒｂ１nullよりも明らかに重症度が低くなっている（図８）。この違いの考えられる理由の１つは、Ｃｒｂ１rd8がｍＲＮＡまたはタンパク質ｎｕｌｌ53ではない場合があるということである。別の可能性は、Ｃｒｂ１rd8の影響を受けないため、Ｃｒｂ１－Ｃアイソフォームが代償的な役割を果たす場合があるということである（図７Ａ）。いずれにせよ、我々の結果は、完全なアイソフォームカタログが利用可能になると、マウス疾患モデルの設計が大幅に強化されることを示している。
【0179】
全体として、我々の研究は、完全かつ正確な完全長のアイソフォームカタログを構築することの価値を強調している。このような情報が不足していると、重要な遺伝子機能が看過され、遺伝子実験および疾患の表現型についての誤解を招く可能性がある。ディープロングリードキャプチャーシークエンシングによって提供されるトランスクリプトームの「グラウンドトゥルース」は、トランスクリプトーム注釈ツールボックスへの重要な追加であり、これにより、幅広い正常および疾患プロセスに寄与する特定のｍＲＮＡアイソフォームの発見が可能になると期待されている。
【0180】
参考文献
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図11-4】
【図12-1】
【図12-2】
【図13-1】
【図13-2】
【図14-1】
【図14-2】
【図14-3】
【図14-4】
【図15-1】
【図15-2】
【図15-3】
【図16】
【配列表】