特許 7549665 Ｌ－分枝鎖アミノ酸生産能が強化された微生物及びそれを用いてＬ－分枝鎖アミノ酸を生産する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-03

(45)【発行日】2024-09-11

(54)【発明の名称】Ｌ－分枝鎖アミノ酸生産能が強化された微生物及びそれを用いてＬ－分枝鎖アミノ酸を生産する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20240904BHJP

   C12N 15/77 20060101ALI20240904BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240904BHJP

   C12P 13/06 20060101ALI20240904BHJP

   C12P 13/08 20060101ALI20240904BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20240904BHJP

   C07K 14/34 20060101ALI20240904BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21 ZNA

C12N15/77 Z

C12N15/113 Z

C12P13/06 C

C12P13/06 B

C12P13/08 D

C12N15/31

C07K14/34

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2022543795

(86)(22)【出願日】2021-05-20

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-23

(86)【国際出願番号】 KR2021006262

(87)【国際公開番号】W WO2021235855

(87)【国際公開日】2021-11-25

【審査請求日】2022-07-19

(31)【優先権主張番号】10-2020-0061175

(32)【優先日】2020-05-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12704P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12705P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12706P

(73)【特許権者】

【識別番号】513178894

【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(74)【代理人】

【識別番号】100125081

【弁理士】

【氏名又は名称】小合 宗一

(72)【発明者】

【氏名】ユン、ビョン フン

(72)【発明者】

【氏名】キム、ソン ヒェ

(72)【発明者】

【氏名】チャン、ジン スク

(72)【発明者】

【氏名】キム、ジュ－ヨン

(72)【発明者】

【氏名】チェ、ソン ヒョン

(72)【発明者】

【氏名】キム、キョンリム

(72)【発明者】

【氏名】キム、ジュ ウン

(72)【発明者】

【氏名】キム、ヒョン ジュン

【審査官】上條 のぶよ

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１７－５２３７８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５２８０７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５０２５８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１１０８８５３６４（ＣＮ，Ａ）

【文献】J. Microbiol. Biotechnol.，2016年，Vol.26, No.5，p.807-822

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ １５／７７

Ｃ１２Ｎ １５／１１３

Ｃ１２Ｐ １３／０６

Ｃ１２Ｐ １３／０８

Ｃ１２Ｎ １５／３１

Ｃ０７Ｋ １４／３４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

酢酸代謝調節因子Ａ（regulator of acetate metabolism A）のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含むＬ－分枝鎖アミノ酸生産微生物であって、
前記微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムであり、
前記ポリヌクレオチドは、配列番号３～５から選択されるいずれかのヌクレオチド配列を含む、
微生物。

【請求項2】

前記微生物が、さらに該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された酢酸代謝調節因子Ａ遺伝子を含む、
請求項１に記載の微生物。

【請求項3】

請求項１に記載の微生物を培地で培養するステップを含む、
Ｌ－分枝鎖アミノ酸を生産する方法。

【請求項4】

前記培地又は微生物からＬ－分枝鎖アミノ酸を回収又は分離するステップをさらに含む、
請求項３に記載の方法。

【請求項5】

酢酸代謝調節因子Ａのプロモーター活性を有し、且つ、配列番号３～５から選択されるいずれかのヌクレオチド配列を含む、
ポリヌクレオチド。

【請求項6】

Ｌ－分枝鎖アミノ酸を製造するための請求項５記載のポリヌクレオチドの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、酢酸代謝調節因子Ａ（regulators of acetate metabolism A）の活性が強化されたＬ－分枝鎖アミノ酸生産微生物及びそれを用いたＬ－分枝鎖アミノ酸生産方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｌ－アミノ酸は、タンパク質の基本構成単位であり、薬品原料や食品添加剤、動物飼料、栄養剤、殺虫剤、殺菌剤などの重要素材として用いられる。特に、分枝鎖アミノ酸（Branched Chain Amino Acids, BCAA）とは、必須アミノ酸であるＬ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシンを総称するものであり、前記分枝鎖アミノ酸は、抗酸化効果及び筋肉細胞のタンパク質合成作用を直接促進する効果があることが知られている。

【0003】

一方、微生物を用いた分枝鎖アミノ酸の生産は、主にエシェリキア属微生物又はコリネバクテリウム属微生物により行われ、ピルビン酸から様々な段階を経て２－ケトイソカプロン酸（2-ketoisocaproate）を前駆体として生合成されることが知られている（特許文献１，２，３）。しかし、前記微生物によるＬ－分枝鎖アミノ酸の生産には、工業的な大量生産が容易でないという問題がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】米国特許第１０３１６２９７号明細書

【文献】米国特許第１０５２６５８６号明細書

【文献】米国特許第１００７２２７８号明細書

【文献】米国特許第７６６２９４３号明細書

【文献】米国特許第１０５８４３３８号明細書

【文献】米国特許第１０２７３４９１号明細書

【文献】韓国登録特許第１０－１１１７０２２号公報

【文献】韓国登録特許第１０－０９２４０６５号公報

【文献】国際公開第２００８／０３３００１号

【非特許文献】

【0005】

【文献】Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16

【文献】Sambrook et al. Molecular Cloning 2012

【文献】"Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)

【文献】Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444

【文献】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277

【文献】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453

【文献】Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)

【文献】Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)

【文献】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994

【文献】[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073

【文献】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482

【文献】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)

【文献】Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745

【文献】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8

【文献】van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999

【文献】Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories

【文献】Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

こうした背景の下、本発明者らは、微生物を用いたＬ－分枝鎖アミノ酸生産能を向上させるために鋭意努力した結果、微生物の酢酸代謝調節因子Ａ（regulators of acetate metabolism A, 以下、ＲａｍＡ）の発現を強化すると、分枝鎖アミノ酸生産能が大幅に向上することを確認し、本出願を完成するに至った。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本出願は、酢酸代謝調節因子Ａ（regulators of acetate metabolism A）の活性が強化されたＬ－分枝鎖アミノ酸生産微生物を提供することを目的とする。

【0008】

また、本出願は、配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列の３４番目、３６番目、３７番目、４１番目及び４３番目のヌクレオチドから選択される少なくとも１つの位置に相当する位置において、他のヌクレオチドへの置換を有し、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含むＬ－分枝鎖アミノ酸生産微生物を提供することを目的とする。

【0009】

さらに、本出願は、前記微生物を培地で培養するステップを含む、Ｌ－分枝鎖アミノ酸を生産する方法を提供することを目的とする。

【0010】

さらに、本出願は、配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列の３４番目、３６番目、３７番目、４１番目及び４３番目のヌクレオチドから選択される少なくとも１つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを提供することを目的とする。

【発明の効果】

【0011】

本出願のポリヌクレオチドを含む、Ｌ－分枝鎖アミノ酸を生産する微生物を培養すると、Ｌ－分枝鎖アミノ酸を高効率で生産することができる。

【0012】

また、本出願により製造されたアミノ酸は、動物飼料又は動物飼料添加剤だけでなく、ヒトの食品又は食品添加剤、医薬品など、様々な製品に応用することができる。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、本出願をより詳細に説明する。なお、本出願で開示される一態様の説明及び実施形態は、共通事項について他の態様の説明及び実施例にも適用される。また、本出願の詳細な説明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。さらに、以下の具体的な説明に本出願が限定されるものではない。

【0014】

また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本出願に含まれることが意図されている。

【0015】

本出願の一態様は、酢酸代謝調節因子Ａ（regulators of acetate metabolism A）の活性が強化されたＬ－分枝鎖アミノ酸生産微生物を提供する。

【0016】

本出願における「酢酸代謝調節因子Ａ（regulators of acetate metabolism A）」とは、本出願の標的タンパク質であって、酢酸代謝に関する調節タンパク質（regulatory protein）を意味し、ｒａｍＡ遺伝子によりコードされる。

【0017】

本出願において、前記酢酸代謝調節因子Ａは、その発現が強化され、その発現強化によりＬ－分枝鎖アミノ酸生産能の向上がもたらされる。

【0018】

本出願における、酢酸代謝調節因子Ａ活性の「強化」とは、酢酸代謝調節因子Ａの活性を内在性活性に比べて向上させることを意味する。前記強化は、活性化（activation）、上方調節（up-regulation）、過剰発現（overexpression）、増加（increase）などと混用される。ここで、活性化、強化、上方調節、過剰発現、増加には、本来なかった活性を示すようになることや、内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することが全て含まれる。前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する場合に、形質変化の前に親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用される。ポリペプチドの活性が内在性活性に比べて「強化」、「上方調節」、「過剰発現」又は「増加」するとは、形質変化の前に親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性及び／又は濃度（発現量）に比べて向上及び／又は増加することを意味する。

【0019】

前記強化は、外来ポリペプチドの導入により達成してもよく、内在性ポリペプチドの活性強化及び／又は濃度（発現量）増加により達成してもよい。前記酢酸代謝調節因子Ａの活性が強化されたか否かは、当該ポリペプチドの活性、発現量又は当該ポリペプチドから生産される産物の量の向上／増加により確認することができる。

【0020】

前記酢酸代謝調節因子Ａの活性の強化には、当該分野で周知の様々な方法を適用することができ、標的ポリペプチドの活性を改変前の微生物より強化できるものであれば、いかなるものでもよい。具体的には、分子生物学における通常の方法であって、当該技術分野における通常の知識を有する者に周知の遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を用いたものであるが、これらに限定されるものではない（例えば、非特許文献１、２など）。

【0021】

具体的には、本出願の酢酸代謝調節因子Ａ活性の強化は、１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させること、２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列をポリペプチドの発現を向上させる配列に置換すること、もしくは変異を導入すること、３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドン又は５’ＵＴＲ領域をコードする塩基配列を改変すること、４）ポリペプチドの活性が強化されるように前記ポリペプチドのアミノ酸配列を改変すること、５）ポリペプチドの活性が強化されるように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を改変すること（例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように改変されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列を改変すること）、６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチド又はそれをコードする外来ポリヌクレオチドを導入すること、７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化すること、８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部分を選択して改変すること、もしくは化学的に修飾すること、又は９）前記１）～８）から選択される２つ以上の組み合わせにより行われるが、特にこれらに限定されるものではない。

【0022】

より具体的には、前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させることは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターを宿主細胞内に導入することにより行われる。あるいは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞の染色体に１コピー又は２コピー以上導入することにより行われてもよい。前記染色体への導入は、宿主細胞の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターを宿主細胞内に導入することにより行われるが、これに限定されるものではない。前記ベクターについては後述する。

【0023】

前記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列（又は発現調節領域）をポリペプチドの発現を向上させる配列に置換すること、もしくは変異を導入することは、例えば前記発現調節領域の活性がさらに強化されるように、欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、遺伝子の発現調節配列をポリペプチドの発現を向上させる配列に置換することにより行われる。前記発現調節領域には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列、エンハンサーなどが含まれる。上記方法は、具体的には、本来のプロモーターに代えて強力な異種プロモーターを連結するものであるが、これに限定されるものではない。

【0024】

公知の強力なプロモーターの例としては、ＣＪ１～ＣＪ７プロモーター（特許文献４）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（特許文献５）、Ｏ２プロモーター（特許文献６）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0025】

前記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドン又は５’ＵＴＲ領域をコードする塩基配列を改変することは、例えば内在性開始コドンに比べてポリペプチドの発現率が高い他の開始コドンをコードする塩基配列に置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。

【0026】

前記４）及び５）のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を改変することは、ポリペプチドの活性が強化されるように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より高い活性を有するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列、又は活性が増加するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列に置換することにより行われるが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記置換は、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行われるが、これに限定されるものではない。ここで、用いられるベクターは、染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーについては後述する。

【0027】

前記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドを導入することは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することにより行われる。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すものであれば、その由来や配列が限定されるものではない。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前述したように導入したポリヌクレオチドが発現することにより、ポリペプチドが生成されてその活性が増加する。

【0028】

前記７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化することは、宿主細胞内で転写又は翻訳が増加するように、内在ポリヌクレオチドのコドンを最適化するか、宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるように、外来ポリヌクレオチドのコドンを最適化することにより行われる。

【0029】

前記８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部分を選択して改変すること、もしくは化学的に修飾することは、例えば分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が保存されているデータベースと比較し、配列の類似性の程度に応じて鋳型タンパク質候補を決定し、それを基に構造を確認し、改変又は化学的に修飾する露出部分を選択して改変又は修飾することにより行われる。

【0030】

このような酢酸代謝調節因子Ａ活性の強化は、対応するポリペプチドの活性又は濃度（発現量）が野生型や改変前の微生物菌株で発現する酢酸代謝調節因子Ａの活性又は濃度に比べて増加するか、当該ポリペプチドから生産される産物の量が増加することにより行われるが、これらに限定されるものではない。

【0031】

より具体的には、本出願における「遺伝子発現調節配列」とは、「遺伝子発現調節領域」ともいい、標的遺伝子を発現させることができるように、それに作動可能に連結された配列を意味し、本出願の変異型ポリヌクレオチドが含まれる。前述したように、本出願の遺伝子発現調節配列とは、遺伝子の転写を行うためのプロモーター、エンハンサーなどを意味し、それ以外にも、転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節するＤＮＡなどがさらに含まれる概念である。

【0032】

本出願の一具体例として、前記遺伝子発現調節配列はプロモーターであるが、これに限定されるものではない。

【0033】

本出願の一具体例として、プロモーターに変異を導入するか、活性が強いプロモーターに置換することにより酢酸代謝調節因子Ａの発現が強化されるが、これらに限定されるものではない。

【0034】

本出願における「プロモーター」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始活性を有し、ポリメラーゼ（polymerase）に対する結合部位を含む、コード領域の上流（upstream）の翻訳されないヌクレオチド配列、すなわちポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始させるＤＮＡ領域を意味する。前記プロモーターは、ｍＲＮＡ転写開始部位の５’部位に位置する。

【0035】

本出願における「作動可能に連結された（operatively linked）」とは、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドが標的遺伝子の転写を開始及び媒介するように、前記遺伝子配列と機能的に連結されていることを意味する。作動可能な連結は当該技術分野で公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当該技術分野の切断及び連結酵素などを用いて作製することができるが、これらに限定されるものではない。

【0036】

本出願における前記標的遺伝子とは、微生物において発現を調節しようとする標的タンパク質をコードする遺伝子を意味し、具体的には、前記遺伝子は、酢酸代謝調節因子Ａ（regulators of acetate metabolism A）をコードする遺伝子であるが、これに限定されるものではない。より具体的には、前記遺伝子はｒａｍＡ遺伝子であるが、これに限定されるものではない。

【0037】

また、前記ｒａｍＡ遺伝子は、内在性遺伝子又は外来遺伝子であってもよく、活性調節のための変異を含むものであってもよい。前記ｒａｍＡ遺伝子の配列は、米国国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋなどの公知のデータベースから当業者が容易に入手することができる。

【0038】

本出願の他の態様は、配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列の３４番目、３６番目、３７番目、４１番目及び４３番目のヌクレオチドから選択される少なくとも１つの位置に相当する位置において、他のヌクレオチドへの置換を有し、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含むＬ－分枝鎖アミノ酸生産微生物を提供する。

【0039】

本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ鎖を意味する。

【0040】

前記「プロモーター」の説明を考慮すると、本出願における「プロモーター活性を有するポリヌクレオチド」は、「変異型ポリヌクレオチド」、「変異型プロモーター」、「変異型ｒａｍＡプロモーター」などと混用され、本明細書においてはこれらの用語が全て用いられる。

【0041】

ここで、前記「変異」とは、遺伝的又は非遺伝的に安定した表現型の変化を意味し、本明細書において「突然変異」と混用される。

【0042】

具体的には、本出願の変異型ポリヌクレオチドは、変異を含まないポリヌクレオチドに比べて変異した（向上した）プロモーター活性を有する。よって、本出願の変異型ポリヌクレオチドと作動可能に連結された標的遺伝子であるｒａｍＡ遺伝子の発現、及び前記ｒａｍＡ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を調節する（向上させる）ことができ、さらに標的遺伝子以外の他の遺伝子の発現を調節することができる。

【0043】

本出願の目的上、前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチドとは、アミノ酸、具体的には分枝鎖アミノ酸、より具体的にはロイシン、バリン、イソロイシンを含むアミノ酸の生産又は生産量の増加に関与するタンパク質の発現を増加させることのできるポリヌクレオチドを意味するが、これらに限定されるものではない。

【0044】

本出願における「配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列」とは、酢酸代謝調節因子Ａ（regulators of acetate metabolism A: RamA）をコードする遺伝子のプロモーター配列を意味する。

【0045】

本出願の前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、自然由来の配列でないプロモーター活性を有する変異型ポリヌクレオチドであり、作動可能に連結される標的タンパク質の発現を配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列より増大させることができる。

【0046】

具体的には、本出願の変異型ポリヌクレオチドは、配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列、すなわちｒａｍＡ遺伝子のプロモーター配列が変異したものであってもよく、前記配列の３４番目、３６番目、３７番目、４１番目及び４３番目のヌクレオチドから選択される少なくとも１つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたものであってもよい。

【0047】

より具体的には、本出願の変異型ポリヌクレオチドは、配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列の３４番目のヌクレオチドがＴに置換されるか、３６番目のヌクレオチドがＴに置換されるか、３７番目のヌクレオチドがＧに置換されるか、４１番目のヌクレオチドがＴに置換されるか、４３番目のヌクレオチドがＡに置換されるか、又はそれらの組み合わせを含むが、上記例に限定されるものではない。前記変異により、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号３～５から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなる（consist of）ものであってもよい。

【0048】

一具体例として、本出願の変異型ポリヌクレオチドは、配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列の３４番目のヌクレオチドがＴに置換され、３６番目のヌクレオチドがＴに置換され、かつ３７番目のヌクレオチドがＧに置換されたものであってもよい。ここで、本出願の変異型ポリヌクレオチドは、配列番号５からなるものであってもよい。

【0049】

他の具体例として、本出願の変異型ポリヌクレオチドは、配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列の４１番目のヌクレオチドがＴに置換され、かつ４３番目のヌクレオチドがＡに置換されたものであってもよい。ここで、本出願の変異型ポリヌクレオチドは、配列番号４からなるものであってもよい。

【0050】

さらに他の具体例として、本出願の変異型ポリヌクレオチドは、配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列の３４番目のヌクレオチドがＴに置換され、３６番目のヌクレオチドがＴに置換され、３７番目のヌクレオチドがＧに置換され、４１番目のヌクレオチドがＴに置換され、かつ４３番目のヌクレオチドがＡに置換されたものであってもよい。ここで、本出願の変異型ポリヌクレオチドは、配列番号３からなるものであってもよい。

【0051】

本出願のＬ－分枝鎖アミノ酸生産微生物は、配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列の３４番目のヌクレオチドがＴに置換されるか、３６番目のヌクレオチドがＴに置換されるか、３７番目のヌクレオチドがＧに置換されるか、４１番目のヌクレオチドがＴに置換されるか、４３番目のヌクレオチドがＡに置換されるか、又はそれらの組み合わせを有し、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含む微生物であってもよい。

【0052】

具体的には、本出願のＬ－分枝鎖アミノ酸生産微生物は、配列番号３～５から選択されるいずれかのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８０％以上１００％未満の配列相同性を有するヌクレオチド配列からなる、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含む微生物であってもよい。本出願の変異型ポリヌクレオチドに関する詳細な内容については後述する。

【0053】

本出願における「分枝鎖アミノ酸」とは、側鎖に分岐アルキル基を有するアミノ酸を意味し、バリン、ロイシン及びイソロイシンが含まれるものである。具体的には、本出願における前記分枝鎖アミノ酸は、Ｌ－分枝鎖アミノ酸であり、前記Ｌ－分枝鎖アミノ酸は、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン及びＬ－イソロイシンであるが、これらに限定されるものではない。

【0054】

本出願における、「分枝鎖アミノ酸を生産する微生物」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱下又は強化された微生物であって、目的とする分枝鎖アミノ酸の生産のために遺伝的変異を起こすか、活性を強化した微生物であってもよい。本出願における前記「Ｌ－分枝鎖アミノ酸を生産する微生物」は、「分枝鎖アミノ酸を生産できる微生物」、「分枝鎖アミノ酸生産能を有する微生物」と混用される。

【0055】

本出願の目的上、前記微生物は、本出願の変異型ポリヌクレオチドを含み、分枝鎖アミノ酸を生産する微生物であればいかなるものでもよい。具体的には、前記分枝鎖アミノ酸を生産する微生物は、前記変異型ポリヌクレオチドを含み、目的とする分枝鎖アミノ酸生産能が向上したことを特徴とする微生物であってもよい。具体的には、本出願における、分枝鎖アミノ酸を生産する微生物、又は分枝鎖アミノ酸生産能を有する微生物は、分枝鎖アミノ酸生合成経路中の遺伝子の一部が強化もしくは弱下された微生物、又は分枝鎖アミノ酸分解経路中の遺伝子の一部が強化もしくは弱下された微生物であるが、これらに限定されるものではない。

【0056】

一具体例として、本出願における、分枝鎖アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、本出願の変異型ポリヌクレオチドを含むか、又は本出願のポリヌクレオチドをコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されることにより、向上した分枝鎖アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を意味する。前記「向上した分枝鎖アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物」とは、形質転換前の親株又は非改変微生物に比べて分枝鎖アミノ酸生産能が向上した微生物を意味する。前記「非改変微生物」とは、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、天然菌株自体、本出願のポリヌクレオチドを含まない微生物、又は本出願のポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されていない微生物を意味する。

【0057】

具体的には、前記コリネバクテリウム属微生物には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）などが含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。

【0058】

本出願のベクターには、好適な宿主内で標的ポリペプチドを発現させることができるように、遺伝物質を保有する人為的ＤＮＡ分子であり、具体的には標的遺伝子を発現させることのできる、好適な発現調節領域に作動可能に連結された前記標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ産物が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製又は機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい。

【0059】

本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。

【0060】

例えば、細胞内の染色体挿入用ベクターにより、標的ポリヌクレオチドを染色体に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え（homologous recombination）により行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面ポリペプチドの発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。

【0061】

本出願における「形質転換」とは、標的ポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞又は微生物に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドを発現／機能させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するか、機能するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入される。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現するが、これに限定されるものではない。

【0062】

本出願のさらに他の態様は、前記微生物を培地で培養するステップを含む、Ｌ－分枝鎖アミノ酸を生産する方法を提供する。

【0063】

また、前記Ｌ－分枝鎖アミノ酸を生産する方法は、標的物質を前記培地又は微生物から回収又は分離するステップをさらに含んでもよい。

【0064】

前記「ポリヌクレオチド」、「コリネバクテリウム属微生物」、「ベクター」及び「Ｌ－分枝鎖アミノ酸」については前述した通りである。

【0065】

本出願における「培養」とは、本出願の微生物を適宜調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び／又は流加培養であるが、これらに限定されるものではない。

【0066】

本出願における「培地」とは、本出願の微生物を培養するために必要な栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質や発育因子などを供給する。具体的には、本出願のコリネバクテリウム属微生物の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられるものであればいかなるものでもよく、好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願の微生物を培養することができる。

【0067】

具体的には、コリネバクテリウム属微生物の培養培地は、非特許文献３に開示されている。

【0068】

本出願における炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、具体的にはグルコースや殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。

【0069】

窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。

【0070】

リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができ、それ以外に、アミノ酸、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを用いることができる。これらの構成成分又は前駆体は、培地に回分式又は連続式で添加することができる。しかし、これらに限定されるものではない。

【0071】

また、本出願の微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方法で添加することにより、培地のｐＨを調整することができる。さらに、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。さらに、培地の好気状態を維持するために、培地中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。

【0072】

本出願の培養において、培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃に維持し、約１０～１６０時間培養するが、これらに限定されるものではない。

【0073】

本出願の培養により生産されたＬ－分枝鎖アミノ酸は、培地中に分泌されるか、又は細胞内に残留する。

【0074】

本出願のＬ－分枝鎖アミノ酸生産方法は、本出願の微生物を準備するステップ、前記菌株を培養するための培地を準備するステップ、又はそれらの組み合わせ（任意の順序，in any order）を、例えば前記培養するステップの前にさらに含んでもよい。

【0075】

本出願のＬ－分枝鎖アミノ酸生産方法は、前述したように培養した培地（培養培地）又は本出願の微生物からＬ－分枝鎖アミノ酸を回収するステップをさらに含んでもよい。前記回収するステップは、前記培養するステップの後にさらに含んでもよい。

【0076】

前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば回分、連続、流加培養方法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて目的とするＬ－分枝鎖アミノ酸を回収（collect）するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＳＭＢ又はそれらの組み合わせが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするＬ－分枝鎖アミノ酸を回収することができる。

【0077】

また、本出願のＬ－分枝鎖アミノ酸生産方法は、精製ステップをさらに含んでもよい。前記精製は、当該技術分野で公知の好適な方法により行うことができる。例えば、本出願のＬ－分枝鎖アミノ酸生産方法が回収ステップと精製ステップの両方を含む場合、前記回収ステップと前記精製ステップは、順序に関係なく連続的又は非継続的に行ってもよく、同時に又は１つのステップとして統合して行ってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0078】

本出願の一態様は、配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列の３４番目、３６番目、３７番目、４１番目及び４３番目のヌクレオチドから選択される少なくとも１つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを提供する。

【0079】

前記「ポリヌクレオチド」及び「プロモーター」については前述した通りである。

【0080】

また、本出願の変異型ポリヌクレオチド配列は、従来公知の突然変異誘発法、例えば方向性進化法（direct evolution）や部位特異的突然変異誘発法（site-directed mutagenesis）などにより改変してもよい。

【0081】

よって、本出願の変異型ポリヌクレオチドには、配列番号３のヌクレオチド配列に対して、３４番目の配列はＴに固定され、３６番目の配列はＴに固定され、３７番目の配列はＧに固定され、４１番目の配列はＴに固定され、４３番目の配列はＡに固定され、それ以外の配列とは少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性（homology）又は同一性（identity）を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが含まれてもよい。

【0082】

また、本出願の変異型ポリヌクレオチドには、配列番号４のヌクレオチド配列に対して、４１番目の配列はＴに固定され、４３番目の配列はＡに固定され、それ以外の配列とは少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性（homology）又は同一性（identity）を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが含まれてもよい。

【0083】

さらに、本出願の変異型ポリヌクレオチドには、配列番号５のヌクレオチド配列に対して、３４番目の配列はＴに固定され、３６番目の配列はＴに固定され、３７番目の配列はＧに固定され、それ以外の配列とは少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性（homology）又は同一性（identity）を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが含まれてもよい。

【0084】

ここで、相同性又は同一性を有するヌクレオチド配列は、上記範疇のうち１００％の同一性を有する配列を除くものであってもよく、１００％未満の同一性を有する配列であってもよい。

【0085】

前記配列と相同性を有する配列であって、実質的に配列番号３～５から選択されるいずれかのヌクレオチド配列と同一又は相当する生物学的活性を有するポリヌクレオチド配列であれば、３４番目、３６番目、３７番目、４１番目又は４３番目の位置以外の一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたポリヌクレオチド配列を有するものも本出願に含まれることは言うまでもない。

【0086】

本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が類似する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。

【0087】

保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全部又は一部分とハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションには、ポリヌクレオチドにおいて一般のコドン又はコドン縮退を考慮したコドンを有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることは言うまでもない。

【0088】

任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献４のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献５）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献６）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献８、９及び１０を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。

【0089】

ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献１１に開示されているように、非特許文献６などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献１２に開示されているように、非特許文献１３の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含んでもよい。

【0090】

また、本出願の変異型ポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は前記ポリヌクレオチドを発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、ポリヌクレオチド配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。さらに、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記塩基配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、配列番号１のポリヌクレオチド配列において少なくとも１つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換され、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（例えば、非特許文献２）に具体的に記載されている。例えば、相同性（homology）もしくは同一性（identity）の高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性もしくは同一性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性もしくは同一性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。

【0091】

ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。

【0092】

具体的には、相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。

【0093】

ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（非特許文献１４参照）。

【0094】

特に、前記変異型ポリヌクレオチドは、配列番号３～５から選択されるいずれかのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８０％以上１００％未満の配列相同性を有するヌクレオチド配列からなる（consist of）という表現は、前記ポリヌクレオチドをプロモーターとして標的遺伝子に連結して用いる場合に、制限酵素の使用のように標的遺伝子に連結する過程中に発生し得るヌクレオチドの追加、削除及び／又は変異などを排除するものではない。

【0095】

例えば、配列番号３～５から選択されるいずれかの配列番号で表されるヌクレオチド配列からなる、プロモーター活性を有する前記ポリヌクレオチドには、配列番号３～５から選択されるいずれかのヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチド配列も含まれる。

【0096】

本出願の変異型ポリヌクレオチドを含む微生物は、バリン、ロイシン又はイソロイシンを含む分枝鎖アミノ酸の生産量の増加を特徴とする。これは、野生型コリネバクテリウム属菌株が分枝鎖アミノ酸を極微量しか生産できないか、生産できないのに対して、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドにより分枝鎖アミノ酸生産量を増加させることができるということに意義がある。

【0097】

実施例
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。

【実施例1】

【0098】

人工変異法による、バリン生産能が向上した変異株の選択
実施例１－１．ＵＶ照射による人工突然変異の誘発
代表的な分枝鎖アミノ酸であるバリンの生産能が向上した変異株を選択するために、寒天を含む栄養培地にバリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ（特許文献７）を塗抹し、３０℃で３６時間培養した。このようにして得られた数百個のコロニーに室温でＵＶを照射し、菌株のゲノムにランダム突然変異を誘発した。

【0099】

実施例１－２．突然変異誘発菌株の発酵力価評価及び菌株の選択
親株として用いたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに比べてＬ－バリンの生産能が向上した変異株を選択するために、ランダム突然変異を誘発した菌株を対象に発酵力価実験を行った。各コロニーを栄養培地で継代培養し、その後生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。その後、ＨＰＬＣを用いてＬ－バリンの濃度を分析した。分析したＬ－バリンの濃度を表１に示す。
栄養培地（ｐＨ７．２）
グルコース１０ｇ，肉汁５ｇ，ポリペプトン１０ｇ，塩化ナトリウム２．５ｇ，酵母エキス５ｇ，寒天２０ｇ，尿素２ｇ（蒸留水１リットル中）
生産培地（ｐＨ７．０）
グルコース１００ｇ，硫酸アンモニウム４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）５ｇ，尿素３ｇ，リン酸水素二カリウム１ｇ，硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド３ｍｇ，炭酸カルシウム３０ｇ（蒸留水１リットル中）

【0100】

【表1】

【0101】

対照群であるＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株に比べてバリン生産量が最も多く増加したＡ７菌株を選択した（表１参照）。

【実施例2】

【0102】

遺伝子シーケンシングによる変異の確認
バリン生産能が向上した前記Ａ７菌株の主要遺伝子をシーケンシングし、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株及びコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７野生型菌株と比較した。その結果、前記Ａ７菌株は、酢酸代謝調節因子Ａ（regulators of acetate metabolism A, RamA）のプロモーター位置に変異を含むことが確認された。

【0103】

具体的には、Ａ７菌株は、前記ｒａｍＡ遺伝子のプロモーター領域（配列番号１）に変異を含む配列番号２の塩基配列を有することが確認された。

【0104】

以下の実施例においては、前記ｒａｍＡ遺伝子のプロモーター領域の特定位置に挿入した変異による効果と、ｒａｍＡ遺伝子のプロモーターの改良及び置換によるＲａｍＡ発現強化がコリネバクテリウム属微生物における分枝鎖アミノ酸であるバリン、イソロイシン、ロイシンの生成量に及ぼす影響を確認する。

【実施例3】

【0105】

変異を導入した菌株の作製及びバリン生産能の確認
実施例３－１．コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株へのプロモーター変異の導入及びＬ－バリン生産能の評価
配列番号２で表されるｒａｍＡ遺伝子プロモーター変異型ポリヌクレオチドをコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに挿入するために、ターゲット変異を含むベクターを作製した。具体的には、前記Ａ７菌株のゲノム（genomic）ＤＮＡをＧ－ｓｐｉｎ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出ミニキット（Intron社, Cat. No 17045）を用いて、キットのプロトコルに従って抽出した。前記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１５０秒間の重合を２５サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。配列番号９及び１０を用いて、１１１４ｂｐのＰＣＲ産物（以下、「変異導入断片１」という）を得た。

【0106】

前述したように得られた変異導入断片１を制限酵素ＸｂａＩ（New England Biolabs, Beverly, MA）で処理し、その後同じ制限酵素で処理したｐＤＺベクター（特許文献８及び９）とＴ４リガーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）を用いてライゲーションした。前述したように作製した遺伝子を大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、その後それをカナマイシン含有ＬＢ培地から選択し、ＤＮＡ－ｓｐｉｎプラスミドＤＮＡ精製キット（iNtRON社）によりＤＮＡを得て、変異導入断片１を含むベクターｐＤＺ－Ｐｍ－ｒａｍＡを作製した。

【0107】

【表2】

【0108】

前記ｐＤＺ－Ｐｍ－ｒａｍＡを染色体上での相同組換えによりコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに形質転換した（非特許文献１５）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（Kanamycin）２５ｍｇ／ｌを含有する培地から選択した。その後、２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、配列番号９及び１０を用いたＰＣＲにより、染色体上でｒａｍＡ上流領域内（配列番号１）プロモーターに変異が挿入された菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－Ｐｍ－ｒａｍＡと命名した。

【0109】

バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１ＰとＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－Ｐｍ－ｒａｍＡのバリン生成能を比較するために、フラスコ評価を行った。各菌株を栄養培地で継代培養し、その後生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。その後、ＨＰＬＣを用いてＬ－バリンの濃度を分析した。分析したＬ－バリンの濃度を表３に示す。
栄養培地（ｐＨ７．２）
グルコース１０ｇ，肉汁５ｇ，ポリペプトン１０ｇ，塩化ナトリウム２．５ｇ，酵母エキス５ｇ，寒天２０ｇ，尿素２ｇ（蒸留水１リットル中）
生産培地（ｐＨ７．０）
グルコース１００ｇ，硫酸アンモニウム４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）５ｇ，尿素３ｇ，リン酸水素二カリウム１ｇ，硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド３ｍｇ，炭酸カルシウム３０ｇ（蒸留水１リットル中）

【0110】

【表3】

【0111】

その結果、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－Ｐｍ－ｒａｍＡ菌株のＬ－バリン生産能は、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐに対して約２３％増加することが確認された。

【0112】

実施例３－２．コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株においてプロモーターを改良及び置換した菌株の作製、並びに作製した菌株のＬ－バリン生産能の評価
実施例３－１の結果から分かるように、ｒａｍＡ遺伝子プロモーター変異によりバリン生産能が向上することが確認されたので、さらにｒａｍＡ発現を増加させるために、配列番号２の変異型プロモーターに基づいて、ｒａｍＡプロモーターの改良又は置換のためのベクターを作製した。

【0113】

変異を含むベクターを作製するために、５’末端と３’末端にｘｂａＩ制限酵素部位を有するように表４のプライマー３（配列番号１１）～プライマー１０（配列番号１８）を合成した。

【0114】

改良されたｒａｍＡプロモーターをＰｍ１、Ｐｍ２、Ｐｍ３－ｒａｍＡと命名し、Ｐｍ１－ｒａｍＡの作製のために、配列番号１１と配列番号１３のプライマー対、及び配列番号１２と配列番号１４のプライマー対を用い、Ｐｍ２－ｒａｍＡの作製のために、配列番号１１と配列番号１５のプライマー対、及び配列番号１２と配列番号１４のプライマー対を用いた。また、Ｐｍ３－ｒａｍＡの作製のために、配列番号１１と配列番号１７のプライマー対、及び配列番号１２と配列番号１８からなるプライマー対を用いた。

【0115】

前述した各プライマーを用いて、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムの染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ［非特許文献１６］を行った。

【0116】

ここで、ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。

【0117】

次に、前述したように作製してｘｂａＩ制限酵素で処理したｐＤＺ－Ｐｍ－ｒａｍＡベクターに、前述したように得られたＰＣＲ産物をフュージョンクローニングした。フュージョンクローニングは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Clontech）を用いて行った。大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより前記標的遺伝子が挿入されたプラスミドで形質転換されたコロニーを選択し、その後プラスミド抽出法によりプラスミドを得て、最終的にｐＤＺ－Ｐｍ１－ｒａｍＡ、ｐＤＺ－Ｐｍ２－ｒａｍＡ、ｐＤＺ－Ｐｍ３－ｒａｍＡと命名した。

【0118】

【表4-1】

【0119】

【表4-2】

【0120】

また、これとは別に、ｒａｍＡプロモーターを強いプロモーターであるＰｃｊ７に置換するために、５’末端と３’末端にｘｂａＩ制限酵素部位を有するように表４のプライマー１１（配列番号１９）～プライマー１６（配列番号２４）を合成した。

【0121】

配列番号１９と配列番号２０のプライマー対、配列番号２１と配列番号２２のプライマー対、及び配列番号２３と配列番号２４のプライマー対を用いて、前述した変異ベクターの作製（実施例３－１）と同様の方法でｐＤＺ－Ｐｃｊ７－ｒａｍＡベクターを作製した。

【0122】

前記ｐＤＺ－Ｐｍ１－ｒａｍＡ、ｐＤＺ－Ｐｍ２－ｒａｍＡ、ｐＤＺ－Ｐｍ３－ｒａｍＡ、ｐＤＺ－Ｐｃｊ７－ｒａｍＡを染色体上での相同組換えによりコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに形質転換した（非特許文献１５）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（Kanamycin）２５ｍｇ／ｌを含有する培地から選択した。その後、２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、配列番号９及び１０のプライマーを用いたＰＣＲにより、染色体上でｒａｍＡプロモーターが改良された菌株、及びＰｃｊ７プロモーターに置換された菌株を確認した。

【0123】

前記組換え菌株のうち、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－Ｐｍ１－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－Ｐｍ２－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－Ｐｍ３－ｒａｍＡをそれぞれＣＡ０８－１５１８、ＣＡ０８－１５１９、ＣＡ０８－１５２０と命名し、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean CultureCenter of Microorganisms, KCCM）に２０２０年４月２７日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２７０４Ｐ、ＫＣＣＭ１２７０５Ｐ、ＫＣＣＭ１２７０６Ｐとして寄託した。

【0124】

また、前記Ｐｃｊ７プロモーターに置換した菌株をＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－Ｐｃｊ７－ｒａｍＡと命名した。その後、実施例３－１と同様に、バリン生産能の評価を行った。その結果を表５に示す。

【0125】

【表5】

【0126】

表５の結果から、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株より改良されたプロモーターを含むＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－Ｐｍ１－ｒａｍＡ（ＣＡ０８－１５１８）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－Ｐｍ２－ｒａｍＡ（ＣＡ０８－１５１９）及びＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－Ｐｍ３－ｒａｍＡ（ＣＡ０８－１５２０）菌株において、それぞれ約２７％、２３％、１９％のＬ－バリン生産増加率が確認され、強いプロモーターに置換されたＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－Ｐｃｊ７－ｒａｍＡ菌株と同等又はそれ以上のＬ－バリン生産能を示すことが確認された。

【0127】

実施例３－３：コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖ菌株においてｒａｍＡ遺伝子プロモーターを改良及び置換した菌株の作製、並びに作製した菌株のＬ－バリン生産能の評価
Ｌ－バリンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株においてもＬ－バリン生産能の向上効果があることを確認するために、野生株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７に１種の変異［ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）；非特許文献１７］を導入することにより、Ｌ－バリン生産能が向上した菌株を作製した。

【0128】

具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型であるＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡをＧ－ｓｐｉｎ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出ミニキット（Intron社, Cat. No 17045）を用いて、キットのプロトコルに従って抽出した。前記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行った。ｉｌｖＮ遺伝子にＡ４２Ｖ変異を導入するベクターを作製するために、配列番号２５と配列番号２６のプライマー対、及び配列番号２７と配列番号２８のプライマー対を用いて、遺伝子断片Ａ、Ｂをそれぞれ得た。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃の重合を２５サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。

【0129】

その結果、断片Ａ、Ｂのどちらも５３７ｂｐのポリヌクレオチドが得られた。前記２つの断片を鋳型とし、配列番号２５及び２６を用いてオーバーラップ（Overlapping）ＰＣＲを行うことにより、１０４４ｂｐのＰＣＲ産物（以下、「変異導入断片２」という）が得られた。

【0130】

前述したように得られた変異導入断片２を制限酵素ＸｂａＩ（New England Biolabs, Beverly, MA）で処理し、その後同じ制限酵素で処理したｐＤＺベクターとＴ４リガーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）を用いてライゲーションした。前述したように作製した遺伝子を大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、その後それをカナマイシン含有ＬＢ培地から選択し、ＤＮＡ－ｓｐｉｎプラスミドＤＮＡ精製キット（iNtRON社）によりＤＮＡを得た。前記ｉｌｖＮ遺伝子のＡ４２Ｖ変異導入を目的とするベクターをｐＤＺ－ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）と命名した。

【0131】

【表6】

【0132】

その後、前記ｐＤＺ－ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）を染色体上での相同組換えにより、野生型であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７に形質転換した（非特許文献１５）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／ｌを含有する培地から選択した。その後、２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、配列番号２５及び２６を用いたＰＣＲにより遺伝子断片を増幅し、次いで遺伝子配列分析により変異挿入菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖと命名した。

【0133】

最後に、前記コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖを対象に、実施例３－１、３－２と同様にそれぞれのベクターを形質転換させた菌株を作製し、それぞれコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖ－Ｐｍ１－ｒａｍＡ、ＣＪ７Ｖ－Ｐｍ２－ｒａｍＡ、ＣＪ７Ｖ－Ｐｍ３－ｒａｍＡ及びＣＪ７Ｖ－Ｐｃｊ７－ｒａｍＡと命名した。作製した菌株のＬ－バリン生産能を比較するために、実施例３－１と同様に培養してＬ－バリンの濃度を分析した。分析したＬ－バリンの濃度を表７に示す。

【0134】

【表7】

【0135】

表７に示すように、改良されたプロモーターを含むＣＪ７Ｖ－Ｐｍ１－ｒａｍＡ、ＣＪ７Ｖ－Ｐｍ２－ｒａｍＡ及びＣＪ７Ｖ－Ｐｍ３－ｒａｍＡ菌株において、それぞれ約２３％、１８％、１４％のＬ－バリン生産増加率が確認され、強いプロモーターに置換された菌株であるＣＪ７Ｖ－Ｐｃｊ７－ｒａｍＡと同等又はそれ以上のＬ－バリン生産能を示すことが確認された。

【0136】

実施例３－４：コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ８Ｖ菌株においてｒａｍＡ遺伝子プロモーターを改良及び置換した菌株の作製、並びに作製した菌株のＬ－バリン生産能の評価
Ｌ－バリンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株においてもＬ－バリン生産能の向上効果があることを確認するために、実施例３－３と同様に野生株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９に１種の変異［ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）］を導入することにより、Ｌ－バリン生産能を有するようになった変異株を作製し、前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ８Ｖと命名した。

【0137】

最後に、前記コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ８Ｖを対象に、実施例３－１、３－２と同様にそれぞれのベクターを形質転換させた菌株を作製し、それぞれコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ８Ｖ－Ｐｍ１－ｒａｍＡ、ＣＪ８Ｖ－Ｐｍ２－ｒａｍＡ、ＣＪ８Ｖ－Ｐｍ３－ｒａｍＡ及びＣＪ８Ｖ－Ｐｃｊ７－ｒａｍＡと命名した。作製した菌株のＬ－バリン生産能を比較するために、実施例３－１と同様に培養してＬ－バリンの濃度を分析した。分析したＬ－バリンの濃度を表８に示す。

【0138】

【表8】

【0139】

表８に示すように、ＣＪ８Ｖ菌株より改良されたプロモーターを含むＣＪ８Ｖ－Ｐｍ１－ｒａｍＡ、ＣＪ８Ｖ－Ｐｍ２－ｒａｍＡ及びＣＪ８Ｖ－Ｐｍ３－ｒａｍＡ菌株において、それぞれ約２１％、１６％、１０％のＬ－バリン生産増加率が確認され、強いプロモーターに置換されたＣＪ８Ｖ－Ｐｃｊ７－ｒａｍＡ菌株と同等又はそれ以上のＬ－バリン生産能を示すことが確認された。

【実施例4】

【0140】

Ｌ－ロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１６６１Ｐ、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ菌株におけるプロモーター変異導入株の作製及びＬ－ロイシン生産能の評価
前記ｐＤＺ－Ｐｍ１－ｒａｍＡ、ｐＤＺ－Ｐｍ２－ｒａｍＡ、ｐＤＺ－Ｐｍ３－ｒａｍＡ、ｐＤＺ－Ｐｃｊ７－ｒａｍＡを染色体上での相同組換えによりコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１６６１Ｐ、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐに形質転換した（非特許文献１５）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（Kanamycin）２５ｍｇ／ｌを含有する培地から選択した。その後、２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、配列番号９及び１０を用いたＰＣＲにより、染色体上でｒａｍＡプロモーターが改良された菌株、及びＰｃｊ７に置換された菌株を確認し、前記組換え菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１６６１Ｐ－Ｐｍ１－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ Ｐｍ２－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ－Ｐｍ３－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ－Ｐｃｊ７－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ－Ｐｍ１－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ Ｐｍ２－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ－Ｐｍ３－ｒａｍＡ及びＫＣＣＭ１１６６２Ｐ－Ｐｃｊ７－ｒａｍＡと命名した。

【0141】

作製した菌株を次の方法で培養し、ロイシン生産能を比較した。

【0142】

各菌株を栄養培地で継代培養し、その後生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。その後、ＨＰＬＣを用いてＬ－ロイシンの濃度を分析した。分析したＬ－ロイシンの濃度を表９に示す。
＜栄養培地（ｐＨ７．２）＞
グルコース１０ｇ，肉汁５ｇ，ポリペプトン１０ｇ，塩化ナトリウム２．５ｇ，酵母エキス５ｇ，寒天２０ｇ，尿素２ｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース５０ｇ，硫酸アンモニウム２０ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）２０ｇ，リン酸水素二カリウム１ｇ，硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １ｍｇ，炭酸カルシウム１５ｇ（蒸留水１リットル中）

【0143】

【表9】

【0144】

その結果、改良されたプロモーターを含むＫＣＣＭ１１６６１Ｐ－Ｐｍ１－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ Ｐｍ２－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ－Ｐｍ３－ｒａｍＡ菌株は、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐよりそれぞれ１１％、７％、１１％のＬ－ロイシン生産増加率が確認され、強いプロモーターに置換されたＫＣＣＭ１１６６１Ｐ－Ｐｃｊ７－ｒａｍＡ菌株と同等のＬ－ロイシン生産能を示すことが確認された。

【0145】

また、改良されたプロモーターを含むＫＣＣＭ１１６６２Ｐ－Ｐｍ１－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ Ｐｍ２－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ－Ｐｍ３－ｒａｍＡ菌株は、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐよりそれぞれ１０％、６％、１０％のＬ－ロイシン生産増加率が確認され、強いプロモーターに置換されたＫＣＣＭ１１６６２Ｐ－Ｐｃｊ７－ｒａｍＡ菌株と同等のＬ－ロイシン生産能を示すことが確認された。

【実施例5】

【0146】

Ｌ－イソロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ菌株においてｒａｍＡ遺伝子プロモーターを改良及び置換した菌株の作製、並びにＬ－イソロイシン生産能の評価
Ｌ－イソロイシンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株においてもＬ－イソロイシン生産能の向上効果があることを確認するために、Ｌ－イソロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ菌株を対象に、実施例３－１、３－２と同様にそれぞれのベクターを形質転換させた菌株を作製し、それぞれコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ－Ｐｍ－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ－Ｐｍ１－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ－Ｐｍ２－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ－Ｐｍ３－ｒａｍＡ及びＫＣＣＭ１１２４８Ｐ－Ｐｃｊ７－ｒａｍＡと命名した。前記ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ－Ｐｍ－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ－Ｐｍ１－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ－Ｐｍ２－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ－Ｐｍ３－ｒａｍＡ及びＫＣＣＭ１１２４８Ｐ－Ｐｃｊ７－ｒａｍＡ菌株を次の方法で培養してイソロイシン生産能を評価した。

【0147】

種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，要素１．５ｇ，ＫＨ_２ＰＯ_４４ｇ，Ｋ_２ＨＰＯ_４ ８ｇ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４１２．５ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ_２ＰＯ_４ １ｇ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ_３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中）

【0148】

培養終了後に、ＨＰＬＣを用いてＬ－イソロイシンの濃度を測定した。測定したＬ－イソロイシン濃度を表１０に示す。

【0149】

【表10】

【0150】

その結果、改良されたプロモーターを含むＫＣＣＭ１１２４８Ｐ－Ｐｍ１－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ－Ｐｍ２－ｒａｍＡ、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ－Ｐｍ３－ｒａｍＡ菌株は、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐよりそれぞれ３９％、３２％、１８％のＬ－イソロイシン生産増加率が確認され、強いプロモーターに置換されたＫＣＣＭ１１２４８Ｐ－Ｐｃｊ７－ｒａｍＡ菌株と同等又はそれ以上のＬ－イソロイシン生産能を示すことが確認された。

【0151】

以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

【0152】

【0153】

【0154】

【配列表】

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