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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-05
(45)【発行日】2024-09-13
(54)【発明の名称】新規のリボ核酸、及びそれを基にする薬剤学的組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/117 20100101AFI20240906BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240906BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240906BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240906BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240906BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20240906BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240906BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240906BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240906BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240906BHJP
【ＦＩ】
C12N15/117 Z ZNA
C07K16/28
A61K31/7105
A61K31/713
A61K39/00 Z
A61K39/39
A61K39/395 U
A61P31/04
A61P31/12
A61P35/00
【請求項の数】
7
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023091537
(22)【出願日】2023-06-02
(62)【分割の表示】P 2021578257の分割
【原出願日】2020-07-01
(65)【公開番号】P2023110031
(43)【公開日】2023-08-08
【審査請求日】2023-06-23
(31)【優先権主張番号】10-2019-0079470
(32)【優先日】2019-07-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2019-0153760
(32)【優先日】2019-11-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0037711
(32)【優先日】2020-03-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】522002261
【氏名又は名称】エヌエー ヴァクシン インスティテュート
(74)【代理人】
【識別番号】110000671
【氏名又は名称】ＩＢＣ一番町弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】キム，ドン ホ
(72)【発明者】
【氏名】カン，ミュン ソ
【審査官】小田 浩代
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／０８３９６２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Kabilova TO. et al.，Antiproliferative and interferon-inducing activities of unique short double- stranded RNA，Dokl Biochem Biophys，2011年，Vol. 436，pp. 8-11
【文献】Marques JT. et al.，A structural basis for discriminating between self and nonself double-stranded RNAs in mammalian cells，Nat Biotechnol，2006年，Vol. 24，pp. 559-565
【文献】Shinagawa T. et al.，Generation of Ski-knockdown mice by expressing a long double-strand RNA from an RNA polymerase II promoter，Genes Dev，Vol. 17，2003年，pp. 1340-1345
【文献】Zharkov MI. et al，Molecular Mechanism of the Antiproliferative Activity of Short Immunostimulating dsRNA，Front Oncol，2019年12月20日，Vol. 9:1454
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の（３０）及び（３１）のヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ）から選択される１又は複数のヘテロ構造リボ核酸である、ヘテロ構造リボ核酸、またはこのＲＮａｓｅ Ｔ１による分解物：
（３０）配列番号３０の塩基配列と、配列番号６１の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸、
（３１）配列番号３１の塩基配列と、配列番号６２の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸。
【請求項2】
請求項１に記載のｈｓＲＮＡ、またはこのＲＮａｓｅ Ｔ１による分解物を含む薬剤学的組成物。
【請求項3】
前記薬剤学的組成物は、ウイルス感染またはバクテリア感染、または癌を予防または治療するためのものであり、追加のアジュバントまたは免疫源をさらに含むものである、請求項２に記載の薬剤学的組成物。
【請求項4】
前記薬剤学的組成物は、癌を予防または治療するためのものであり、前記癌は、皮膚癌、乳癌、肺癌、大腸癌及び膵臓癌を含むものである、請求項３に記載の薬剤学的組成物。
【請求項5】
前記薬剤学的組成物は、ＯＸ－４０抗体またはＰＤ－１抗体を含むことを特徴とする請求項４に記載の薬剤学的組成物。
【請求項6】
活性成分として、請求項１に記載のｈｓＲＮＡを含み、前記ｈｓＲＮＡは長さが均質である、薬剤学的作用剤。
【請求項7】
活性成分として、請求項１に記載のｈｓＲＮＡを含む、癌治療作用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、長さ非均質性、高い毒性、及び活性の非一貫性のようなPoly（Ｉ：Ｃ）の問
題点を克服した新規のリボ核酸に関する。具体的には、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのいず
れもの任意の特定配列と、特定の定められた長さとを有し、真ん中に位置し、その両側３
’末端に、一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）オーバーハングが連結された非ホモポリマー状
二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む、いわゆる、ヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ：he
tero structured ＲＮＡ）に関する。前記ｄＲＮＡは、完全相補性を有し、ＴＬＲ３リガ
ンドとして作用する一方、ｓｓＲＮＡ配列は、望ましくは、ＴＬＲ７類似リガンドとして
特徴づけられる。前記ヘテロ構造リボ核酸は、長さが高度に均質であり、高い先天免疫活
性及び安定性を有する。
題点を克服した新規のリボ核酸に関する。具体的には、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのいず
れもの任意の特定配列と、特定の定められた長さとを有し、真ん中に位置し、その両側３
’末端に、一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）オーバーハングが連結された非ホモポリマー状
二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む、いわゆる、ヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ：he
tero structured ＲＮＡ）に関する。前記ｄＲＮＡは、完全相補性を有し、ＴＬＲ３リガ
ンドとして作用する一方、ｓｓＲＮＡ配列は、望ましくは、ＴＬＲ７類似リガンドとして
特徴づけられる。前記ヘテロ構造リボ核酸は、長さが高度に均質であり、高い先天免疫活
性及び安定性を有する。
【0002】
前述の開示されたヘテロ構造リボ核酸及び二本鎖リボ核酸は、副作用がほとんどない薬
剤学的作用剤であり、それにより、ウイルス感染または細菌感染、及び癌の予防及び治療
のための組成物の活性成分として有用である。
剤学的作用剤であり、それにより、ウイルス感染または細菌感染、及び癌の予防及び治療
のための組成物の活性成分として有用である。
【背景技術】
【0003】
Ａ）先天免疫活性剤としてのＴＬＲ３リガンド
ＴＬＲ３は、樹枝状細胞（ＤＣ：dendritic cell）上、Ｂ細胞上、単核細胞由来大食細
胞上、及び多くの腫瘍組織上のエンドソーム（endosome）区画で正常に発現され、ｄｓＲ
ＮＡを感知する。該ｄｓＲＮＡは、ウイルス、またはウイルス感染された異常な細胞に由
来しうる。ＴＬＲ３がｄｓＲＮＡを認識すれば、第Ｉ型インターフェロンと炎症誘発性サ
イトカイン（proinflammatory cytokines）との分泌を刺激し、また、抗原エピトープが
ＭＨＣ－１分子上にローディングされ、ナイーブＴ細胞に提供されるように、ＤＣが成熟
した抗原提示細胞（ＡＰＣ）に活性化されるように刺激する。ＴＬＲ３によるＤＣの活性
化は、微生物病原体に対する先天免疫反応及び適応免疫反応の誘導に寄与するだけではな
く、ＣＤ８＋ Ｔ細胞と自然殺害（ＮＫ）細胞とを活性化させる（非特許文献１）。イン
ビトロでＴＬＲ３を誘導することができるｄｓＲＮＡの最小長さは、４５ｍｅｒであると
知られている。試験管内内で培養された樹枝状前駆細胞を、前記ｄｓＲＮＡと、ＦＬＴ３
リガンドまたはＧＭ－ＣＳＦとで処理した細胞を対象に、分析が行われたとしても、それ
らの生体内機能寄与は、今のところ明確に理解されていない(非特許文献１)。
ＴＬＲ３は、樹枝状細胞（ＤＣ：dendritic cell）上、Ｂ細胞上、単核細胞由来大食細
胞上、及び多くの腫瘍組織上のエンドソーム（endosome）区画で正常に発現され、ｄｓＲ
ＮＡを感知する。該ｄｓＲＮＡは、ウイルス、またはウイルス感染された異常な細胞に由
来しうる。ＴＬＲ３がｄｓＲＮＡを認識すれば、第Ｉ型インターフェロンと炎症誘発性サ
イトカイン（proinflammatory cytokines）との分泌を刺激し、また、抗原エピトープが
ＭＨＣ－１分子上にローディングされ、ナイーブＴ細胞に提供されるように、ＤＣが成熟
した抗原提示細胞（ＡＰＣ）に活性化されるように刺激する。ＴＬＲ３によるＤＣの活性
化は、微生物病原体に対する先天免疫反応及び適応免疫反応の誘導に寄与するだけではな
く、ＣＤ８＋ Ｔ細胞と自然殺害（ＮＫ）細胞とを活性化させる（非特許文献１）。イン
ビトロでＴＬＲ３を誘導することができるｄｓＲＮＡの最小長さは、４５ｍｅｒであると
知られている。試験管内内で培養された樹枝状前駆細胞を、前記ｄｓＲＮＡと、ＦＬＴ３
リガンドまたはＧＭ－ＣＳＦとで処理した細胞を対象に、分析が行われたとしても、それ
らの生体内機能寄与は、今のところ明確に理解されていない(非特許文献１)。
【0004】
ｄｓＲＮＡ類似体であるPoly（Ｉ：Ｃ）を、感染及び腫瘍に適用した報告がある（特許
文献１－１４）。Poly（Ｉ：Ｃ）が、ＤＣ、ＮＫ及びＣＴＬ（cytotoxic lymphocyte）を
刺激し、腫瘍の成長を停止させる（非特許文献２）。しかし、長さのはなはだしい不均質
性から内在的に発生する、Poly（Ｉ：Ｃ）の高い毒性及び均一ではない活性により、Poly
（Ｉ：Ｃ）の臨床分野に適用することが制限されてきた。Poly（Ｉ：Ｃ）は、長さによ
って異なる細胞反応を示すが、さらに短い形態は、ＴＬＲ３を活性化させ、さらに長い形
態は、それぞれＴＬＲ３とＭＤＡ５との活性を介して先天免疫を活性化させる（非特許文
献１）。
文献１－１４）。Poly（Ｉ：Ｃ）が、ＤＣ、ＮＫ及びＣＴＬ（cytotoxic lymphocyte）を
刺激し、腫瘍の成長を停止させる（非特許文献２）。しかし、長さのはなはだしい不均質
性から内在的に発生する、Poly（Ｉ：Ｃ）の高い毒性及び均一ではない活性により、Poly
（Ｉ：Ｃ）の臨床分野に適用することが制限されてきた。Poly（Ｉ：Ｃ）は、長さによ
って異なる細胞反応を示すが、さらに短い形態は、ＴＬＲ３を活性化させ、さらに長い形
態は、それぞれＴＬＲ３とＭＤＡ５との活性を介して先天免疫を活性化させる（非特許文
献１）。
【0005】
Ｂ）先天免疫において、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８リガンドの役割を行うｓｓＲＮＡ
グアノシン（Ｇ）及びウリジン（Ｕ）を含む（望ましくは、「ＧＵＵ」が反復される配
列を有する）ｓｓＲＮＡは、ＤＣ及び大食細胞を刺激し、それは、ＮＦ－κＢ活性化、サ
イトカイン分泌及び先天免疫において、ＭＹＤ８８及びＴＲＡＦ６を介する炎症反応によ
って媒介される。ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、エンドソームの膜上に存在し、ｓｓＲＮＡを
認識する。ＴＬＲ７は、グアノシン及びウリジンを含むｓｓＲＮＡに係わる二重受容体で
あるが、結合第１部位は、小さいリガンド(すなわち、Ｇ)を優先して感知し、結合第２部
位は、ｓｓＲＮＡのウリジン部分を認識する。
グアノシン（Ｇ）及びウリジン（Ｕ）を含む（望ましくは、「ＧＵＵ」が反復される配
列を有する）ｓｓＲＮＡは、ＤＣ及び大食細胞を刺激し、それは、ＮＦ－κＢ活性化、サ
イトカイン分泌及び先天免疫において、ＭＹＤ８８及びＴＲＡＦ６を介する炎症反応によ
って媒介される。ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、エンドソームの膜上に存在し、ｓｓＲＮＡを
認識する。ＴＬＲ７は、グアノシン及びウリジンを含むｓｓＲＮＡに係わる二重受容体で
あるが、結合第１部位は、小さいリガンド(すなわち、Ｇ)を優先して感知し、結合第２部
位は、ｓｓＲＮＡのウリジン部分を認識する。
【0006】
Ｃ）Poly（Ｉ：Ｃ）系ｄｓＲＮＡの極端な長さ非均質性、及び毒性
生体内外において、ＤＣを活性化させるｄｓＲＮＡ長を正確に定義する必要がある。い
くつかのリボ核酸誘導体が、ワクチンアジュバント候補物質として提示されたが（特許文
献１－１８）、その生産の内在的限界により、同一性及び均質性を保証することができな
い。そのような点のために、Poly（Ｉ：Ｃ）系ｄｓＲＮＡは、機能及び安全性において、
はなはだしい非均質性を示し、その適用が制限される（特許文献１－１４）。前記Poly（
Ｉ：Ｃ）系物質の製造過程と、それによる問題点は、以下の通りある。
生体内外において、ＤＣを活性化させるｄｓＲＮＡ長を正確に定義する必要がある。い
くつかのリボ核酸誘導体が、ワクチンアジュバント候補物質として提示されたが（特許文
献１－１８）、その生産の内在的限界により、同一性及び均質性を保証することができな
い。そのような点のために、Poly（Ｉ：Ｃ）系ｄｓＲＮＡは、機能及び安全性において、
はなはだしい非均質性を示し、その適用が制限される（特許文献１－１４）。前記Poly（
Ｉ：Ｃ）系物質の製造過程と、それによる問題点は、以下の通りある。
【0007】
Poly（Ｉ：Ｃ）は、合成ｄｓＲＮＡ類似体であり、イノシンホモポリマー鎖（inosine
homopolymer）Poly（Ｉ）とシチジルホモポリマー鎖（cytidyl homopolymer）Poly（Ｃ）
とによって構成され、それらは、相補的に互いに結合し、非天然ｄｓＲＮＡを形成する。
各鎖は、ポリヌクレオチドリン酸化酵素（ＰＮＰａｓｅ：polynucleotide phosphorylase
）を利用し、末端に位置した塩基に、新たな塩基を追加する方式で酵素的に別途に合成さ
れるために、生成されたホモポリマーの長さが非常に多様である。さらに、長いホモポリ
マー配列（例：平均４００ｂａｓｅ Poly（Ｉ））に相補的な長いホモポリマー（例：平
均４００base Poly（Ｃ））を対応させ、アニーリング（annealing）させれば、上部鎖(
すなわち、Poly（Ｉ））は、その相補的下部鎖（すなわち、Poly（Ｃ））に沿い、どこに
でも結合し（鎖滑り（chain slippage））、両鎖の３’末端または５’末端のどこにも一
本鎖領域を不可避に生成する。さらには、その領域に前記相補的鎖が再び結合すれば、数
十ないし数百ｋｂｐ以上のきわめて多用な長さを作る（鎖延長（chain extension））。
それだけではなく、鎖延長後、不特定位置に、不特定個数のニック（nick）が存在する。
従って、該ニックが存在する位置を認識して切断するＲＮａｓｅ Ｔ１を処理すれば、長
さがランダムに短くなる（図８Ｃ）参照）。
homopolymer）Poly（Ｉ）とシチジルホモポリマー鎖（cytidyl homopolymer）Poly（Ｃ）
とによって構成され、それらは、相補的に互いに結合し、非天然ｄｓＲＮＡを形成する。
各鎖は、ポリヌクレオチドリン酸化酵素（ＰＮＰａｓｅ：polynucleotide phosphorylase
）を利用し、末端に位置した塩基に、新たな塩基を追加する方式で酵素的に別途に合成さ
れるために、生成されたホモポリマーの長さが非常に多様である。さらに、長いホモポリ
マー配列（例：平均４００ｂａｓｅ Poly（Ｉ））に相補的な長いホモポリマー（例：平
均４００base Poly（Ｃ））を対応させ、アニーリング（annealing）させれば、上部鎖(
すなわち、Poly（Ｉ））は、その相補的下部鎖（すなわち、Poly（Ｃ））に沿い、どこに
でも結合し（鎖滑り（chain slippage））、両鎖の３’末端または５’末端のどこにも一
本鎖領域を不可避に生成する。さらには、その領域に前記相補的鎖が再び結合すれば、数
十ないし数百ｋｂｐ以上のきわめて多用な長さを作る（鎖延長（chain extension））。
それだけではなく、鎖延長後、不特定位置に、不特定個数のニック（nick）が存在する。
従って、該ニックが存在する位置を認識して切断するＲＮａｓｅ Ｔ１を処理すれば、長
さがランダムに短くなる（図８Ｃ）参照）。
【0008】
Poly（Ｉ：Ｃ）－Ｌ－リシン－メチルセルロース（Poly（Ｉ：Ｃ）－ＬＣ）は、Poly（
Ｉ：Ｃ）誘導体のうち一つであり、血清内において、ＲＮａｓｅによる分解には、あまり
敏感ではないが、製造方式は、Poly（Ｉ：Ｃ）と本質的に同一である。従って、長さが一
定ではない（特許文献１－１４）。Poly（Ｉ：Ｃ）－ＬＣは、ＩＦＮ－γ分泌を誘導し、
ＣＴＬ反応及び抗原特異抗体を増大させる。Poly（Ｉ：Ｃ）－ＬＣは、多少緩和された毒
性を有する。他のPoly（Ｉ：Ｃ）誘導体であるＰＩＫＡも、長さが一定ではないPoly（Ｉ
：Ｃ）の形態を有する（非特許文献３及び非特許文献４）。
Ｉ：Ｃ）誘導体のうち一つであり、血清内において、ＲＮａｓｅによる分解には、あまり
敏感ではないが、製造方式は、Poly（Ｉ：Ｃ）と本質的に同一である。従って、長さが一
定ではない（特許文献１－１４）。Poly（Ｉ：Ｃ）－ＬＣは、ＩＦＮ－γ分泌を誘導し、
ＣＴＬ反応及び抗原特異抗体を増大させる。Poly（Ｉ：Ｃ）－ＬＣは、多少緩和された毒
性を有する。他のPoly（Ｉ：Ｃ）誘導体であるＰＩＫＡも、長さが一定ではないPoly（Ｉ
：Ｃ）の形態を有する（非特許文献３及び非特許文献４）。
【0009】
Poly（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、Poly（Ｉ）とPoly（Ｃ）とによって構成され、Poly（Ｃ）の
うちＵは、１２Ｃごとに付加され、規則的に分散された不一致を有する不完全なｄｓＲＮ
Ａを形成する。多重ニックにより、Poly（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、Poly（Ｉ：Ｃ）に比べ、Ｒ
Ｎａｓｅ Ｔ１による分解にさらに敏感であり、さらに短い半減期を有し、さらに少ない
副作用を有し、Ｍｙｄ８８よりもＴＲＡＦにさらに高い選択性を有する。それにもかかわ
らず、長さは、依然としてきわめて非均質的である。
うちＵは、１２Ｃごとに付加され、規則的に分散された不一致を有する不完全なｄｓＲＮ
Ａを形成する。多重ニックにより、Poly（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、Poly（Ｉ：Ｃ）に比べ、Ｒ
Ｎａｓｅ Ｔ１による分解にさらに敏感であり、さらに短い半減期を有し、さらに少ない
副作用を有し、Ｍｙｄ８８よりもＴＲＡＦにさらに高い選択性を有する。それにもかかわ
らず、長さは、依然としてきわめて非均質的である。
【0010】
Poly（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、カナダとアルゼンチンとにおいて、ヒトに使用するように承
認され、２０００年には、ヨーロッパ連合において、慢性疲労症侯群（ＣＦＳ）治療のた
めの希少疾病用医薬品（orphan drug）として許可されたが、米国ＦＤＡの承認は、なさ
れていない。それら以外にも、Poly（Ｉ：Ｃ）の合成は、Poly（Ｉ：Ｃ）よりもさらに均
一な長さを有するように改善されたが、長さ多様性問題は、依然として残っている。Poly
（Ｉ：Ｃ）（１００ないし４００）を例に挙げれば、短鎖（例：Poly（Ｉ）１００につい
て平均１０８base）を長鎖（例：Poly（Ｃ）４００について平均３４４base）に相補結合
させるものが採用される。該方法により、平均長が４００ｂｐに近接するｄｓＲＮＡが製
造されたが、長さ範囲は、００ないし２，０００baseと非常に広い。短いホモポリマー配
列（例：Poly（Ｉ）１００）が、長いホモポリマー（例：Poly（Ｃ）４００）に相補的に
結合し、鎖滑りと鎖延長とが生じることを防ぐことができなかった。要約すれば、Poly（
Ｉ：Ｃ）系ｄｓＲＮＡ類似体は、一定長を有することができず、ｄｓＲＮＡ内部の不特定
位置に、不特定個数のニックが存在しており、ＲＮａｓｅ Ｔ１に対する安定性が非常に
低い（特許文献３、非特許文献２、非特許文献５）。
認され、２０００年には、ヨーロッパ連合において、慢性疲労症侯群（ＣＦＳ）治療のた
めの希少疾病用医薬品（orphan drug）として許可されたが、米国ＦＤＡの承認は、なさ
れていない。それら以外にも、Poly（Ｉ：Ｃ）の合成は、Poly（Ｉ：Ｃ）よりもさらに均
一な長さを有するように改善されたが、長さ多様性問題は、依然として残っている。Poly
（Ｉ：Ｃ）（１００ないし４００）を例に挙げれば、短鎖（例：Poly（Ｉ）１００につい
て平均１０８base）を長鎖（例：Poly（Ｃ）４００について平均３４４base）に相補結合
させるものが採用される。該方法により、平均長が４００ｂｐに近接するｄｓＲＮＡが製
造されたが、長さ範囲は、００ないし２，０００baseと非常に広い。短いホモポリマー配
列（例：Poly（Ｉ）１００）が、長いホモポリマー（例：Poly（Ｃ）４００）に相補的に
結合し、鎖滑りと鎖延長とが生じることを防ぐことができなかった。要約すれば、Poly（
Ｉ：Ｃ）系ｄｓＲＮＡ類似体は、一定長を有することができず、ｄｓＲＮＡ内部の不特定
位置に、不特定個数のニックが存在しており、ＲＮａｓｅ Ｔ１に対する安定性が非常に
低い（特許文献３、非特許文献２、非特許文献５）。
【0011】
Ｄ）癌微細環境における、ＯＸ４０分子とＰＤ－１分子との役割
先天免疫反応及び適応免疫反応は、いずれも腫瘍の成長と制御とに関与する（非特許文
献７）。免疫機能が腫瘍微細環境（ＴＭＥ）において、一般的に抑制されている。Ｔ細胞
抑制受容体に係わる拮抗剤、またはＴ細胞受容体に係わる刺激剤を使用するさまざまな方
法がＴ細胞活性を増進させるためにテストされた（非特許文献８）。
先天免疫反応及び適応免疫反応は、いずれも腫瘍の成長と制御とに関与する（非特許文
献７）。免疫機能が腫瘍微細環境（ＴＭＥ）において、一般的に抑制されている。Ｔ細胞
抑制受容体に係わる拮抗剤、またはＴ細胞受容体に係わる刺激剤を使用するさまざまな方
法がＴ細胞活性を増進させるためにテストされた（非特許文献８）。
【0012】
腫瘍懐死因子受容体スーパーファミリーであるＯＸ４０は、ナイーブＴ細胞においては
、発現されないが、抗原に露出された後、活性化されたＴ細胞において誘導される（ＴＣ
Ｒ）（非特許文献９）。それだけではなく、ＯＸ４０は、活性Ｂ細胞、活性樹枝状細胞、
活性好酸球、自然殺害Ｔ（ＮＫＴ）細胞及びＮＫ細胞記憶Ｔ細胞、並びに調節Ｔ細胞で一
般的に発現される（非特許文献９）。ＯＸ４０に結合するＯＸ４０リガンドであるＯＸ４
０Ｌは、主に、抗原提示細胞で発現される。ＯＸ４０-ＯＸ４０Ｌ相互作用は、ＣＤ４細
胞及びＣＤ８ Ｔ細胞に共同刺激し、細胞増殖、生存、エフェクタ機能及び移動を向上さ
せる。また、ＯＸ４０は、記憶Ｔ細胞の発達及び機能を誘導し、免疫抑制環境を克服させ
る。
、発現されないが、抗原に露出された後、活性化されたＴ細胞において誘導される（ＴＣ
Ｒ）（非特許文献９）。それだけではなく、ＯＸ４０は、活性Ｂ細胞、活性樹枝状細胞、
活性好酸球、自然殺害Ｔ（ＮＫＴ）細胞及びＮＫ細胞記憶Ｔ細胞、並びに調節Ｔ細胞で一
般的に発現される（非特許文献９）。ＯＸ４０に結合するＯＸ４０リガンドであるＯＸ４
０Ｌは、主に、抗原提示細胞で発現される。ＯＸ４０-ＯＸ４０Ｌ相互作用は、ＣＤ４細
胞及びＣＤ８ Ｔ細胞に共同刺激し、細胞増殖、生存、エフェクタ機能及び移動を向上さ
せる。また、ＯＸ４０は、記憶Ｔ細胞の発達及び機能を誘導し、免疫抑制環境を克服させ
る。
【0013】
樹枝状細胞のような抗原提示細胞が成熟されれば、Ｂ７ファミリー（例：ＣＤ８０及び
ＣＤ８６）及びＯＸ４０Ｌは、ＡＰＣの表面において増大し、Ｔ細胞免疫反応及び記憶分
化を決定するのに一助となる（非特許文献１０）。
ＣＤ８６）及びＯＸ４０Ｌは、ＡＰＣの表面において増大し、Ｔ細胞免疫反応及び記憶分
化を決定するのに一助となる（非特許文献１０）。
【0014】
ＯＸ４０：ＯＸ４０Ｌ結合連繋（相互作用）は、三重価受容体（trimer）を形成し、さ
らに高次的なクラスタリング（clustering）及び後続信号伝達を誘導する（非特許文献１
１）。マウスＯＸ４０刺激ラット（rat）由来抗体（anti－ｍＯＸ４０rat agonist Ａｂ
）は、マウスモデルにおいて、腫瘍拒否反応を誘導することができる（非特許文献１２、
非特許文献１３）。ヒトＯＸ４０刺激マウス由来抗体（anti－ｈＯＸ４０ mouse agonist
Ａｂ）も、癌患者において、癌免疫の機能を増進させると示された（非特許文献１４）
。ＯＸ４０：ＯＸ４０Ｌ相互作用は、移植片対宿主疾病（例：臓器移植拒否反応）、喘息
／アトピー、脳脊髄炎、リウマチ性関節炎、大腸カタル／炎症性腸疾患、非肥満糖尿病マ
ウスの糖尿病及び粥状動脈硬化症、ループス、炎症性疾病及び自家免疫疾病、並びに障害
において、免疫反応とも係わっている（非特許文献１５）。
らに高次的なクラスタリング（clustering）及び後続信号伝達を誘導する（非特許文献１
１）。マウスＯＸ４０刺激ラット（rat）由来抗体（anti－ｍＯＸ４０rat agonist Ａｂ
）は、マウスモデルにおいて、腫瘍拒否反応を誘導することができる（非特許文献１２、
非特許文献１３）。ヒトＯＸ４０刺激マウス由来抗体（anti－ｈＯＸ４０ mouse agonist
Ａｂ）も、癌患者において、癌免疫の機能を増進させると示された（非特許文献１４）
。ＯＸ４０：ＯＸ４０Ｌ相互作用は、移植片対宿主疾病（例：臓器移植拒否反応）、喘息
／アトピー、脳脊髄炎、リウマチ性関節炎、大腸カタル／炎症性腸疾患、非肥満糖尿病マ
ウスの糖尿病及び粥状動脈硬化症、ループス、炎症性疾病及び自家免疫疾病、並びに障害
において、免疫反応とも係わっている（非特許文献１５）。
【0015】
ＰＤ－Ｌ１は、多くの癌において、過発現され、折々、好ましくない予後と関連性があ
る（非特許文献１６、非特許文献１７）。興味深いこととして、腫瘍浸潤性Ｔリンパ球の
ほとんどは、正常組織及び末梢血液Ｔリンパ球とは対照的に、ＰＤ－１を発現する。Ｔ細
胞において、ＰＤ－１の上向き調節が、免疫抑制性腫瘍微細環境を構成することができる
（非特許文献１８）。本質的には、腫瘍浸潤性Ｔ細胞上のＰＤ－１と、腫瘍細胞上のＰＤ
－Ｌ１との相互作用は、Ｔ細胞機能を弱化させる（非特許文献１９、非特許文献２０）。
従って、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１（または、ＰＤ－Ｌ２）相互作用の阻害は、免疫抑制性Ｔ
ＭＥを破壊してしまう。しかし、最適の治療のためには、そのようなＰＤ－１受容体とリ
ガンドとの相互作用遮断以外にも、さらなる免疫増強療法の開発が必要である。
る（非特許文献１６、非特許文献１７）。興味深いこととして、腫瘍浸潤性Ｔリンパ球の
ほとんどは、正常組織及び末梢血液Ｔリンパ球とは対照的に、ＰＤ－１を発現する。Ｔ細
胞において、ＰＤ－１の上向き調節が、免疫抑制性腫瘍微細環境を構成することができる
（非特許文献１８）。本質的には、腫瘍浸潤性Ｔ細胞上のＰＤ－１と、腫瘍細胞上のＰＤ
－Ｌ１との相互作用は、Ｔ細胞機能を弱化させる（非特許文献１９、非特許文献２０）。
従って、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１（または、ＰＤ－Ｌ２）相互作用の阻害は、免疫抑制性Ｔ
ＭＥを破壊してしまう。しかし、最適の治療のためには、そのようなＰＤ－１受容体とリ
ガンドとの相互作用遮断以外にも、さらなる免疫増強療法の開発が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0016】
【文献】Double-stranded ribonucleic acid for adjuvants; US 20150307884 A1
【文献】Adjuvant compositions; WO 2003028656 A2: shorter form of Poly(I:C)
【文献】Clinical method for the immunomodulatory and vaccine adjuvant use of poly-ICLC and other dsRNAs; US 7834064 B2
【文献】dsRNAs as influenza virus vaccine adjuvants or immuno-stimulants; US 20070224219 A1
【文献】Process for the maturation of dendritic cells and a vaccine; US 7981673 B2
【文献】Topically active compositions of mismatched dsRNAs; US 5712257 A
【文献】Treatment of hepatitis with mismatched dsRNA; US 5906980 A
【文献】Double-stranded PolyC: Poly (G/I) RNA for immunostimulation and cancer treatment; EP 3083962 A1
【文献】Methods and formulations to achieve tumor targeted double stranded ribonucleic acid mediated cell death; WO 2014165296 A1
【文献】Polyinosinic acid-polycytidylic acid-based adjuvant; US 20070160632 A1
【文献】In-situ cancer autovaccination with intra tumoral stabilized dsRNA viral mimic; US 20090088401 A1
【文献】Novel nucleic acid having adjuvant activity and use thereof; WO 2012014945 A
【文献】Improved treatment of cancer using tlr3 agonists in combination with another therapeutic agent; WO 2009130301 A1
【文献】Double-Stranded Ribonucleic Acid Conjugates And Their Use; US 20170107517 A1
【文献】Double-stranded ribonucleic acids with rugged physico-chemical structure and highly specific biologic activity; WO 2010047835 A2
【文献】Immunization strategy to prevent H1N1 infection; EP 2477652 A4
【非特許文献】
【0017】
【文献】Jelinek I et al., (2011) J Immunol 186 (4):2422-9
【文献】Mian MF et al., (2013) J Leukoc Biol 94 (5):1025-36
【文献】Zhang Y et al., (2016) Virology 489:165-72
【文献】Lau YF et al., (2010) Virology 406 (1):80-7
【文献】Nakano T et al., (2018) Biosci Biotechnol Biochem 82 (11):1889-1901
【文献】Matsumoto M et al., (2015) 6:6280
【文献】Vesely MD et al., (2011) Annu Rev Immunol 29: 235-271
【文献】Mellman I et al., (2011) Nature 480: 480-489
【文献】Sugamura K et al., (2004) Nat Rev Immunol 4: 420-431
【文献】Soroosh P et al., (2006) J Immunol 176: 5975-5987
【文献】Compaan DM et al., (2006) Structure 14: 1321-1330
【文献】Weinberg AD et al., (2000) J Immunol 164: 2160-2169
【文献】Piconese S et al., (2008) J Exp Med 205: 825-839
【文献】Curti BD et al., (2013) Cancer Res 73: 7189-7198
【文献】Croft M et al., (2009) Immunol Rev 229(1): 173-191
【文献】Okazaki T et al., Intern. Immun 2007 19 (7): 813
【文献】Thompson RH et al., Cancer Res 2006, 66 (7): 3381
【文献】Ahmadzadeh M et al., Blood. 2009 Aug 20;114(8):1537-44
【文献】Sharpe et al., Nat Rev 2002
【文献】Keir ME et al., 2008 Annu. Rev. Immunol. 26: 677
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
１）Poly（Ｉ：Ｃ）型リボ核酸基盤アジュバントが有する極端な長さの非均質性克服
薬学的組成物は、一貫した再現性及び均質性を有さなければならない。ｄｓＲＮＡ類似
体であるPoly（Ｉ：Ｃ）と、その誘導体との適用を、臨床用途において制限する最大の理
由は、極端な長さの非均質性を含め、生産時の再現性不足、予測不可能な薬物動態、一貫
性ない効能（非特許文献３、非特許文献６）及び関節痛、発熱、紅斑及び耐毒素類似ショ
ック（特許文献１５及び１７）のような症状を起こす深刻な毒性のためである。これまで
、ｄｓＲＮＡ類似体は、Poly（Ｉ：Ｃ）、Poly（Ｉ：Ｃ）－ＬＣ及びPoly（Ｉ：Ｃ１２Ｕ
）を含み、いずれも２本の相補的ホモポリマー鎖によって構成される。結果として、それ
ら誘導体の長さは、特定の長さとして定義されえず、きわめて多様である。
薬学的組成物は、一貫した再現性及び均質性を有さなければならない。ｄｓＲＮＡ類似
体であるPoly（Ｉ：Ｃ）と、その誘導体との適用を、臨床用途において制限する最大の理
由は、極端な長さの非均質性を含め、生産時の再現性不足、予測不可能な薬物動態、一貫
性ない効能（非特許文献３、非特許文献６）及び関節痛、発熱、紅斑及び耐毒素類似ショ
ック（特許文献１５及び１７）のような症状を起こす深刻な毒性のためである。これまで
、ｄｓＲＮＡ類似体は、Poly（Ｉ：Ｃ）、Poly（Ｉ：Ｃ）－ＬＣ及びPoly（Ｉ：Ｃ１２Ｕ
）を含み、いずれも２本の相補的ホモポリマー鎖によって構成される。結果として、それ
ら誘導体の長さは、特定の長さとして定義されえず、きわめて多様である。
【0019】
本発明は、Poly（Ｉ：Ｃ）が有する極端な長さの非均質性及び毒性、並びに量産製造時
の問題点を解決することができる新規のｈｓＲＮＡを提供するものである。本発明のｈｓ
ＲＮＡは、必要により、ＲＮａｓｅ Ｔ１を処理し、ｓｓＲＮＡ領域を除去し、ｄｓＲＮ
Ａ部位のみを選択的に抽出することができる。また、本発明のｈｓＲＮＡは、正確な全体
長、ｓｓＲＮＡの正確な長さ及び位置、並びにｄｓＲＮＡの正確な長さと位置とを特定す
ることができる特長点を有し、そのような特性により、既存のPoly（Ｉ：Ｃ）及びその誘
導体の問題を克服することができるのである。
の問題点を解決することができる新規のｈｓＲＮＡを提供するものである。本発明のｈｓ
ＲＮＡは、必要により、ＲＮａｓｅ Ｔ１を処理し、ｓｓＲＮＡ領域を除去し、ｄｓＲＮ
Ａ部位のみを選択的に抽出することができる。また、本発明のｈｓＲＮＡは、正確な全体
長、ｓｓＲＮＡの正確な長さ及び位置、並びにｄｓＲＮＡの正確な長さと位置とを特定す
ることができる特長点を有し、そのような特性により、既存のPoly（Ｉ：Ｃ）及びその誘
導体の問題を克服することができるのである。
【0020】
２）ワクチンにおいて抗原の必要な抗原用量の低減
本発明は、要求される抗原量を低減させながら、さらに力強い防御免疫を誘導すること
ができるｈｓＲＮＡとｄｓＲＮＡとを提供するものである。現在使用される季節性の三価
ワクチンまたは四価ワクチンの場合、効果的な予防免疫のために予測される１つのウイル
スごとに、ワクチン抗原１回当り最小１５μｇを必要とする。大量の抗原が毎年必要であ
るために、ワクチン供給不足に係わる潜在的リスクが存在する。ＦＬＵＡＤに対し、ＭＦ
５９（スクアレン水中油エマルジョン）アジュバントが６５歳以上の者を対象に米国で承
認された。依然として効能を毀損させずに、抗原量を実質的に低減させることができる承
認されたオズバント添加ワクチンはない。
本発明は、要求される抗原量を低減させながら、さらに力強い防御免疫を誘導すること
ができるｈｓＲＮＡとｄｓＲＮＡとを提供するものである。現在使用される季節性の三価
ワクチンまたは四価ワクチンの場合、効果的な予防免疫のために予測される１つのウイル
スごとに、ワクチン抗原１回当り最小１５μｇを必要とする。大量の抗原が毎年必要であ
るために、ワクチン供給不足に係わる潜在的リスクが存在する。ＦＬＵＡＤに対し、ＭＦ
５９（スクアレン水中油エマルジョン）アジュバントが６５歳以上の者を対象に米国で承
認された。依然として効能を毀損させずに、抗原量を実質的に低減させることができる承
認されたオズバント添加ワクチンはない。
【0021】
３）抗癌効能が増強された癌ワクチン組成物の提供
本発明は、生体内において、樹枝状細胞を、一貫性あって強力に活性化させ、原発性癌
だけではなく、遠隔転移癌の予防または治療を行うｈｓＲＮＡと、ＯＸ４０抗体及び／ま
たはＰＤ－１抗体とを含む癌ワクチン組成物を提供する。
本発明は、生体内において、樹枝状細胞を、一貫性あって強力に活性化させ、原発性癌
だけではなく、遠隔転移癌の予防または治療を行うｈｓＲＮＡと、ＯＸ４０抗体及び／ま
たはＰＤ－１抗体とを含む癌ワクチン組成物を提供する。
【0022】
本発明のｈｓＲＮＡは、癌細胞の死滅を促進させ、癌細胞から、癌連関抗原（ＴＡＡ）
の放出を促進する。そのようにして、ＯＸ４０アゴニストに対する抗体、またはPＰＤ－
１に対する抗体と組み合わされたｈｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、ＴＡＡ依存的免疫反応
を誘発したり、はなはだしくは、相乗作用したりして、癌細胞を破砕（lyse）したりもす
る。
の放出を促進する。そのようにして、ＯＸ４０アゴニストに対する抗体、またはPＰＤ－
１に対する抗体と組み合わされたｈｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、ＴＡＡ依存的免疫反応
を誘発したり、はなはだしくは、相乗作用したりして、癌細胞を破砕（lyse）したりもす
る。
【課題を解決するための手段】
【0023】
１）本発明は、双方向合成を介し、高度の長さ均質性と安定性とを備えたリボ核酸を提
供する
本発明は、特異的長さ、完璧な塩基ペアリング、及び室温において、高い安定性を有す
る高度に均質的なｈｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡに係わるものである。
供する
本発明は、特異的長さ、完璧な塩基ペアリング、及び室温において、高い安定性を有す
る高度に均質的なｈｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡに係わるものである。
【0024】
本発明のｈｓＲＮＡを製造する方法は、次の通りである。標的ＲＮＡの転写を指示する
ことができるＤＮＡ切片が、両５’末端において、Ｔ７プロモーターによって結合され（
flank）、任意のプラスミドベクターに挿入される。必要であるならば、ＴＬＲ７リガン
ド配列、または任意の長さ、及び任意の配列を有した断片が、Ｔ７プロモーター配列の５
’末端に付加されうる。
ことができるＤＮＡ切片が、両５’末端において、Ｔ７プロモーターによって結合され（
flank）、任意のプラスミドベクターに挿入される。必要であるならば、ＴＬＲ７リガン
ド配列、または任意の長さ、及び任意の配列を有した断片が、Ｔ７プロモーター配列の５
’末端に付加されうる。
【0025】
前記ＤＮＡ切片を、Ｔ７ポリメラーゼによるインビトロ転写（ＩＶＴ）ためのテンプレ
ートのためにＰＣＲで増幅した。双方向ＩＶＴは、ＩＶＴの間、ほとんど同一のモル比で
完璧な相補性を有したヘテロポリマーｓｓＲＮＡの上部鎖と下部鎖とを生成し、室温にお
いて、自発的に高度に純粋なｈｓＲＮＡを形成する。前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮ
Ｓは、蛋白質をコーディングしなかったり、選択的に蛋白質をコーディングしたりするこ
とができる。一具現例において、前記ｓｓＲＮＡは、ランダム配列であるか、あるいはＧ
ＵＵ反復配列を含みうるが、それに制限されるものではなく、ｓｓＲＮＡは、ＲＮａｓｅ
Ｔ１処理により、選択的に除去されうる。
ートのためにＰＣＲで増幅した。双方向ＩＶＴは、ＩＶＴの間、ほとんど同一のモル比で
完璧な相補性を有したヘテロポリマーｓｓＲＮＡの上部鎖と下部鎖とを生成し、室温にお
いて、自発的に高度に純粋なｈｓＲＮＡを形成する。前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮ
Ｓは、蛋白質をコーディングしなかったり、選択的に蛋白質をコーディングしたりするこ
とができる。一具現例において、前記ｓｓＲＮＡは、ランダム配列であるか、あるいはＧ
ＵＵ反復配列を含みうるが、それに制限されるものではなく、ｓｓＲＮＡは、ＲＮａｓｅ
Ｔ１処理により、選択的に除去されうる。
【0026】
これまで、生体内において、ＤＣ及び免疫系を活性化させるための最小及び最適の長さ
を有するｄｓＲＮＡは、１つの塩基対長さほど違いのあるｄｓＲＮＡの合成において、技
術的困難さによって完全に理解されていない。対照的に、本発明の方法は、生体内外にお
いて、ＴＬＲ３活性化またはＴＬＲ７活性化に要求される最適の免疫活性化を示すリボ核
酸の正確な数の長さまたは構造を指定することができる。
を有するｄｓＲＮＡは、１つの塩基対長さほど違いのあるｄｓＲＮＡの合成において、技
術的困難さによって完全に理解されていない。対照的に、本発明の方法は、生体内外にお
いて、ＴＬＲ３活性化またはＴＬＲ７活性化に要求される最適の免疫活性化を示すリボ核
酸の正確な数の長さまたは構造を指定することができる。
【0027】
２）本発明は、感染に対するワクチン抗原必要使用量を低減させることができるリボ核
酸を含む感染予防及び感染治療のワクチン組成物を提供する
本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡを含むウイルス感染または細菌感染の
予防用または治療用の薬剤学的組成物を提供する。
酸を含む感染予防及び感染治療のワクチン組成物を提供する
本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡを含むウイルス感染または細菌感染の
予防用または治療用の薬剤学的組成物を提供する。
【0028】
負電荷を強く帯びるリボ核酸は、多くの大型抗原を効果的に受容し、ＶＬＰ（virus-li
ke particle）に匹敵するほどのナノ複合体を作ることができる。適切な剤形に抗原をカ
プセル化させたナノ複合体は、樹枝状細胞または大食細胞に捕獲され、Ｂ細胞及びＴ細胞
において抗原が提示されることを効果的に誘導する。本発明の、感染予防及び感染治療の
ワクチン組成物は、病原体のタンパク質、組み換えタンパク質、サブユニット（subunit
）、スプリット（split）タンパク質抗原、糖蛋白質、ペプチド、多糖類、脂質多糖類、
ポリヌクレオチド、及びそれらの組み合わせからなる群のうちから選択されたものでもあ
るが、それらに制限されるものではない。
ke particle）に匹敵するほどのナノ複合体を作ることができる。適切な剤形に抗原をカ
プセル化させたナノ複合体は、樹枝状細胞または大食細胞に捕獲され、Ｂ細胞及びＴ細胞
において抗原が提示されることを効果的に誘導する。本発明の、感染予防及び感染治療の
ワクチン組成物は、病原体のタンパク質、組み換えタンパク質、サブユニット（subunit
）、スプリット（split）タンパク質抗原、糖蛋白質、ペプチド、多糖類、脂質多糖類、
ポリヌクレオチド、及びそれらの組み合わせからなる群のうちから選択されたものでもあ
るが、それらに制限されるものではない。
【0029】
３）本発明の前記リボ核酸アジュバントを含む抗癌ワクチン組成物、及び本発明の前記
リボ核酸と、下記のような抗体とを含む疾病予防用または癌治療用の薬学組成物を提供す
る
本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡを含む疾病予防用または癌治療用の薬
剤学的組成物、及びＯＸ４０抗体またはＰＤ－１抗体をさらに含む癌予防用または癌治療
用の薬学組成物を提供する。
リボ核酸と、下記のような抗体とを含む疾病予防用または癌治療用の薬学組成物を提供す
る
本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡを含む疾病予防用または癌治療用の薬
剤学的組成物、及びＯＸ４０抗体またはＰＤ－１抗体をさらに含む癌予防用または癌治療
用の薬学組成物を提供する。
【発明の効果】
【0030】
本発明のｈｓＲＮＡは、Poly（Ｉ：Ｃ）が有する極端な長さの多様性と、組成の非均質
性とを克服し、特定の長さと配列とによって特定されうる長所を提供する。さらには、ｈ
ｓＲＮＡからｓｓＲＮＡオーバーハングを除去することにより、高度に均質的なｄｓＲＮ
Ａを得ることができる。また、前記ｈｓＲＮＡからｓｓＲＮＡオーバーハングを除去する
場合、本願発明の前記ｈｓＲＮＡは、相補的な配列を有し、改善された免疫反応を誘導す
るｄｓＲＮＡとして製造されうる。
性とを克服し、特定の長さと配列とによって特定されうる長所を提供する。さらには、ｈ
ｓＲＮＡからｓｓＲＮＡオーバーハングを除去することにより、高度に均質的なｄｓＲＮ
Ａを得ることができる。また、前記ｈｓＲＮＡからｓｓＲＮＡオーバーハングを除去する
場合、本願発明の前記ｈｓＲＮＡは、相補的な配列を有し、改善された免疫反応を誘導す
るｄｓＲＮＡとして製造されうる。
【0031】
また、本発明のｈｓＲＮＡと複合体となった抗原は、抗原提示細胞内部に伝達され、Ｔ
細胞及びＢ細胞に抗原を効率的に提示することができる。さらには、本発明の、ｈｓＲＮ
ＡまたはｄｓＲＮＡは、必要抗原量を低減させることができ、ウイルス感染または細菌感
染と、癌とに対する防御免疫効果を誘導することができる。
細胞及びＢ細胞に抗原を効率的に提示することができる。さらには、本発明の、ｈｓＲＮ
ＡまたはｄｓＲＮＡは、必要抗原量を低減させることができ、ウイルス感染または細菌感
染と、癌とに対する防御免疫効果を誘導することができる。
【0032】
結果として、本発明のリボ核酸アジュバントは、（１）抗原に対する適応免疫を強化さ
せ、（２）ワクチンの必要抗原量を低減させ、（３）抗原特異的なＴｈ１極性化された交
差防御反応を向上させ、（４）抗原なしに単独で使用する場合、先天免疫を強化させる活
性を示す。
せ、（２）ワクチンの必要抗原量を低減させ、（３）抗原特異的なＴｈ１極性化された交
差防御反応を向上させ、（４）抗原なしに単独で使用する場合、先天免疫を強化させる活
性を示す。
【0033】
また、本発明の、ｈｓＲＮＡを単独で含むか、あるいはｈｓＲＮＡ、及びＯＸ４０抗体
またはＰＤ－１抗体を含む癌ワクチン組成物は、原発性癌及び遠隔性癌のいずれに対する
抗癌効能も示す。また、本発明の癌ワクチン組成物は、ＰＤ－１抗体のような免疫チェッ
クポイント抑制剤を単独で処理する場合に反応しない不応性癌を反応性癌に転換させるこ
とができる。
またはＰＤ－１抗体を含む癌ワクチン組成物は、原発性癌及び遠隔性癌のいずれに対する
抗癌効能も示す。また、本発明の癌ワクチン組成物は、ＰＤ－１抗体のような免疫チェッ
クポイント抑制剤を単独で処理する場合に反応しない不応性癌を反応性癌に転換させるこ
とができる。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1】図１は、ＤＣを活性化させるリボ核酸基盤物質に係わる生体内（in vivo）活性検証の結果を示す（実施例１）。図１は、ネクストアジュバント（ＮＡと略され、ＮＶＴ、ＶＰ１、ＶＰ１０ともされる）が、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定した、ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣ細胞において、補助刺激因子（ＣＤ４０、ＣＤ８６）及びＭＨＣIIの発現が増大することを示す。ＮＡ １０μｇは、Poly（Ｉ：Ｃ）１００μｇに比べ、すぐれていた。図１は、ＮＡが、Poly（Ｉ：Ｃ）と比べ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－αの分泌をさらに強く誘導することを示す。図１は、ＮＡが、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ－４）及びＴｈ１７サイトカイン（ＩＬ－１７Ａ）ではなく、Ｔｈ１細胞マーカーＴ－ｂｅｔ、及びＴｈ１細胞サイトカインであるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）ｍＲＮＡを誘導することを示すｑＲＴ－ＰＣＲ結果である。各データは、三種の独立した分析の平均値である。
【図2】図２は、本発明の、ｈｓＲＮＡ長による生体内ＤＣの活性を示す（実施例２）。図２Ａは、人工配列（Backbone Group １）で製造したｈｓＲＮＡシリーズ１の試験管内合成結果であり、それぞれ１４０塩基長ｈｓＲＮＡ（ＮＡ１００１）、１９０塩基長（ＮＡ１５０１）、２４０塩基長（ＮＡ２００１）、３４０塩基長（ＮＡ３００１）、４４０塩基長（ＮＡ４００１）、５４０塩基長（ＮＡ５００１）、６４０塩基長（ＮＡ６００１）及び８４０塩基長（ＮＡ８００１）を示す。図２Ｂは、トマト配列（Backbone Group ２）に由来するｈｓＲＮＡシリーズ２の試験管内合成結果であり、それぞれ１４０塩基長（ＮＡ１００２）、１９０塩基長（ＮＡ１５０２）、２４０塩基長（ＮＡ２００２）、３４０塩基長（ＮＡ３００２）、４４０塩基長（ＮＡ４００２）、５４０塩基長（ＮＡ５００２）、６４０塩基長（ＮＡ６００２）、７４０塩基長（ＮＡ７００２）及び８４０塩基長（ＮＡ８００２）を示す。図２Ｃは、図２Ａに表示されたｈｓＲＮＡそれぞれに係わる、５μｇ注射時に示されるＣＤ４０及びＣＤ８６の表面発現のＭＦＩを示している。各データは、３回の独立した分析の平均値である。図２Ｄは、図２Ｂに表示されたｈｓＲＮＡそれぞれにつき、５μｇ注射時に示されるＣＤ４０及びＣＤ８６の表面発現のＭＦＩを示している。各データは、３回の独立した分析の平均値である。
【図3】図３は、本発明のｈｓＲＮＡの先天免疫活性指標及び免疫反応結果を示す（実施例３）。図３Ａは、本発明のｈｓＲＮＡ（Ｒ１ないしＲ１１、ＶＰ１０、表２参照）を製造した後、長さを確認するために、１％アガロースゲルで電気泳動させた図である。図３Ｂは、ＨＥＫ ２９３において、図３ＡのｈｓＲＮＡの一次的共移入（cotransfection）に反応したＩＦＮ－β増大、及びＩＦＮ－βプロモーター駆動ルシフェラーゼを示す。図３Ｃは、ｈｓＲＮＡが錯化されたオブアルブミン（ＯＶＡ）をマウス筋肉内注射し、血清における、Anti－ＯＶＡ ＩｇＧ１（Ｔｈ２極性化）、及び Anti－ＯＶＡ ＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１極性化）を誘導したところを示す。本発明のＮＡＲ７（Ｒ７）が、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ１０より、Ｔｈ１（ＩｇＧ２ａ）反応及びＴｈ２（ＩｇＧ１）反応を強化させた。
【図4】図４は、本発明のｈｓＲＮＡのうち一つであるＮＡ（ＮＶＴ）の物理化学的特性を示す（実施例４）。図４Ａは、 ＲＮａｓｅ Ｔ１を処理し、大きさ均質性を示すものと共に、ＮＡ長がＨＰＬＣ分析において、単一に一定であることを示し、それは、ｄｓＲＮＡ部位が良好に保存されるところを示す。図４Ｂは、前記ｄｓＲＮＡが４５℃で１５０日以上安定しているところを示す。図４Ｃは、ＮＡが、１００％子牛血清（Serum）で１０分未満の短い半減期を有するところを示す。図４Ｄは、ＮＡと複合体を形成した抗原である場合、有効期間が長いことを示す。
【図5】図５は、本発明の、ｈｓＲＮＡとｄｓＲＮＡとを皮下（ｓ．ｃ．）注射した後、先天免疫活性指標の様相を示す（実施例５）。図５Ａは、ｈｓＲＮＡ（ＮＶＴ４－Ｔ１）は、ｄｓＲＮＡ（ＮＶＴ４＋Ｔ１）よりもさらに低い抗炎症性サイトカイン反応（proinflammatory cytokine response）を誘導するところを示す。ＮＶＴ４（ＮＶＴ ＩＶ、ＶＰ２０と同一である；表２参照）が本研究に使用された。図５Ｂは、ｈｓＲＮＡの皮下注射が２４時間経過後、さらに高いＤＣを活性化（ＣＤ８６誘導）を刺激することを示す。図５Ｃは、２４時間と４８時間とが経た後、ドレインリンパ節（ｄＬＮ）における免疫細胞プロファイルを示す。４８時間経過時、ｄｓＲＮＡがｈｓＲＮＡに比べ、免疫活性度が高いところを示している。図５Ｄは、ｄｓＲＮＡがｈｓＲＮＡに比べ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β及びＩＬ－６を高く誘導するところを示す。それは、ｄｓＲＮＡがさらに強く先天免疫を誘導する一方、ｈｓＲＮＡは、安全性に有利な物質であるところを示唆する。
【図6】図６は、ＮＡ（ＮＶＴ）が錯化されたＯＶＡワクチンが他のアジュバントに比べ、Ｔｈ１極性化免疫反応をさらに強く誘導するところを示す（実施例６）。図６Ａは、ＢａｌＢ／ｃマウスに、アジュバントが錯化されているか、あるいは錯化されていないワクチンを、０日及び１４日、２回にわたって筋肉内にそれぞれプライミングとブースティングとを行ったところを示す。２１日目、末梢血液と脾臓細胞とを抽出し、流式細胞分析をＩｇＧ定量を実施した。図６Ｂ及び図６Ｃは、ＮＡ（ＮＶＴ）が、Ｔｈ１反応（ＩｇＧ２ｃ）は、他のアジュバントより高く活性化させ、脾臓において、ＩＦＮ－γを分泌するＣＤ８ Ｔ細胞とＣＤ４Ｔ細胞との数を増加させるが、Ｔｈ２免疫反応（ＩｇＧ２）ではないことを示す。
【図7】図７は、先天免疫性誘導と適応免疫誘導とにおいて、ＮＡ（ＮＶＴ）とＮＶＴ＋ＳＥ（スクアレンエマルジョン）（ＮＶＴII）との比較を示す（実施例７）。図７Ａは、ＮＶＴとＮＶＴIIとの筋肉内注射を介する活性検証方法である。図７Ｂは、注射後２４時間目、ＮＶＴ及びＰＢＳ（リン酸緩衝塩水）に対しし、ＮＶＴIIが鼠蹊部リンパ節（ｉＬＮ）でＤＣ活性を誘導するところを示す。図７Ｃは、ＮＶＴとＮＶＴIIとが、いずれも血清において、中和抗体を誘導するが、ＮＶＴよりＮＶＴIIが２倍以上強く誘導した結果を示す。
【図8】図８は、本発明のｈｓＲＮＡの構造を示す（実施例８）。真ん中にあるヘテロポリマー性ｄｓＲＮＳは、３’末端において、それぞれｓｓＲＮＡ オーバーハングによって結合されている。ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡは、いずれも単一塩基の違いによって合成されうる。図８Ａは、前記ｈｓＲＮＡの模式図である。ｈｓＲＮＡの真ん中にあるヘテロポリマー性ｄｓＲＮＡは、任意の長さと、完全な相補性を有する任意の配列とを有する。ｄｓＲＮＡの両側３’末端にある２個のｓｓＲＮＡ オーバーハングは、潜在的ＴＬＲ７／８リガンドとして作用することができる相補性のない、任意の特定長を有する。ｄｓＲＮＡは、人工配列でもあり、自然配列でもあるが、タンパク質を暗号化しない。ｄｓＲＮＡにＲＮａｓｅIIIを処理すれば、平均して、２０ないし２５ｂｐのｄｓＲＮＡ切片に切断する。ｄｓＲＮＡには、作用せず、ｓｓＲＮＡオーバーハングにだけ作用するＲＮＡｓｅ Ｔ１を処理すれば、ｓｓＲＮＡオーバーハングは、完全に分解される。本発明は、長さ（＞１００ｂｐ）のｄｓＲＮＡを、インビトロで、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素を利用し、ＤＮＡの両鎖に由来した二種の相補的ｓｓＲＮＡを、類似したモル比で大量合成することができるという利点を提供する。本発明において、ｓｓＲＮＡオーバーハングは、単純なオーバーハングではなく、特定ＴＬＲ７／８リガンドとして作用することができる特定の長さ及び配列（ＴＬＲ７リガンド配列であるＧＵを多数含む配列）によってなることを特徴とする。さらには、ｓｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡの末端が分解されることを防止する機能を有することができる。１つのテンプレートＤＮＡからの双方向転写は、ほとんど同一モル比でもって、２個の相補的な上端ｓｓＲＮＡ及び下端ｓｓＲＮＡを生成する。ＩＶＴの間、２本の鎖は、その後、自発的アニーリングを行い、真ん中に完璧なｄｓＲＮＡを有し、両３’末端に２個のｓｓＲＮＡ オーバーハングを有したｈｓＲＮＡを形成する。特に重要には、前記２個のｓｓＲＮＡ オーバーハングは、互いに相補的ではないように設計され、塩基対形成（base pairing）または鎖延長が防止される。図８Ｂは、ｈｓＲＮＡを、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅIII及びＲＮＡｓｅIII＋ＲＮａｓｅ Ｔ１で消化させた結果物を示す。ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡをいずれも分解することができるＲＮａｓｅ Ａを処理すれば、全てのＲＮＡが分解され（分解された）。ｄｓＲＮＡを、２０ないし２５ｂｐ長さに切断するＲＮａｓｅIIIを処理する場合、２５ｂｐほどの長さを有する切片のバンドが最も多く示された。ＲＮａｓｅIIIは、提供されたｈｓＲＮＡ（ＮＶＴ４）の ｓｓＲＮＡオーバーハング（それぞれ５１，５８base）を切断しない。従って、ｓｓＲＮＡオーバーハングは、分解されずに残り、それらは、およそ25bp重なる。ＲＮａｓｅIII及びＲＮＡｓｅ Ｔ１を同時に処理すれば、前記ｓｓＲＮＡ切片（５１，５８base）が完全に分解されて消え、２５ｂｐのバンドだけが鮮明に示される。図８Ｃは、ＮＡ（５３３base ｈｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ部位４２４ｂｐ）を、ＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅ Ｔ１とで処理する前、及びその処理後、アガロースゲルで分離したものであり、特定の長さに一定の結果物が示されるところを示す図である。ＩＶＴ後、残存するＤＮＡテンプレートは、ＤＮａｓｅＩを処理し、除去（除去され）、ｈｓＲＮＡだけ残る。ＲＮａｓｅ Ｔ１で、ｈｓＲＮＡに存在するｓｓＲＮＡオーバーハングが除去されれば、ｄｓＲＮＡ部位だけ残る。もしｄｓＲＮＡ部位内部にニックが１個以上存在すれば、ＲＮａｓｅ Ｔ１がそのニック部位を切断し、２以上のｄｓＲＮＡ切片を生成する。対照的に、ゲルにおける単一バンドは、前記ｄｓＲＮＡ部位及びｓｓＲＮＡ オーバーハングにニックがないということを証明している。図８Ｄ）他発明の競争薬物であるPoly（Ｉ：Ｃ）が、極端な長さ多様性により、非均質性を有するところを示し、そのような点は、製造段階から生じるものであり、製造後、分画を終えた後にも克服することができない（非特許文献２）。図８Ｅ）他発明の競争薬物であるPoly（Ｉ：Ｃ）の基本構造を示したものであり、特定の長さではない平均長だけでもって表示されうる。例えば、平均およそ３８９baseであるホモポリマーPolyＩと、平均３４４base PolyＣとをそれぞれ合成し、互いに相補的にアニーリングさせ、ｄｓＲＮＡが製造される。しかし、予測することができない非特定部位に、相補結合が発生する鎖滑り（ランダム部位塩基対形成）が生じるために、予測することができない位置に多用な間隙を有する複数のニック（nick）の形成は、不可避である。さらには、前記ランダム部位塩基対形成は、５’末端または３’末端に係わりなく、両側位置に、Poly（Ｉ）とPoly（Ｃ）との特定することができない塩基ストレッチを生成してしまい、そこに、相補的鎖が再び結合し、鎖延長が生じてしまう。従って、その長さが数百kilobase以上に延長される（非特許文献２）（非特許文献５）。さらに、ＰＮＰａｓｅが、Poly（Ｉ：Ｃ）の製造過程に使用されるために、リン酸基（Ｐ）が５’末端に常時付着し、それにより、収率は、低い（非特許文献２及び非特許文献５）。対照的に、本発明のｈｓＲＮＡは、対照的に、Poly（Ｉ：Ｃ）とその誘導体とにある、鎖延長を防止する互いに相補的配列を有さない特定長を有する両側３’末端にだけあるｓｓＲＮＡテイルのオーバーハングにより、隣接するｄｓＲＮＡを形成するように設計されうる。
【図9】図９は、本発明のＮＡ（ＮＶＴ）に錯化された不活化インフルエンザ全ワクチン（ｉＰＲ８+ＮＶＴ）またはＮＡ（ＮＶＴ）に錯化されていない不活化インフルエンザ全ワクチン（ｉＰＲ８）またはＮＶＴ単独を、鼻腔（ｉ．ｎ．）内に投与した後の免疫反応を示した （実施例９）。図９Ａは、試験方法を図式化した図である。図９Ｂは、ＮＶＴ、ｉＰＲ８及びｉＰＲ８+ＮＶＴ処理群のマウスからの肺胞洗浄液において、肺胞大食細胞、好中球、自然殺害細胞のプロファイルを示す。図９Ｃは、２４時間経過後、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－αの際立った増加を示す。図９Ｄは、７日目に、縦隔洞リンパ節（ｍＬＮ）において、ＧＣＢ（germinal center Ｂ）細胞とＴＦＨ（follicular helper Ｔ cell）の増加を示す。図９Ｅは、ｉＰＲ８＋ＮＶ群において、２１日が経た後、血清Anti－ｉＰＲ８ ＩｇＧが増加することを示す。図９Ｆは、２１日目、鼻腔洗浄液におけるＩｇＡ増加を示す。
【図10】図１０は、本発明のｈｓＲＮＡであるＮＡ（ＮＶＴ）による商業的インフルエンザワクチン（４ＩＶ（Vaxigrip））の効能及び抗原容量節減に対する本発明のアジュバントの効果に係わる（実施例１０）。図１０Ａは、試験方法を図式化した図である。図１０Ｂは、ＮＡ（ＮＶＴ）アジュバントまたはＮＡ＋ＳＥ（ＮＶＴII）アジュバントが、ＩｇＧを誘導するのに必要な抗原使用量をそれぞれ約１／５以下と約１／２５以下とに低下させた。Ｖａｘｉｇｒｉｐ（２０１８／２０１９季節的四価インフルエンザワクチン４ＩＩＶ）がモデル抗原として使用された。図１０Ｃは、ワクチン接種後、１７週まで、ＮＶＴＩ群及びＮＶＴII群において、総ＩｇＧ量が多く維持されるところを示す。図１０Ｄは、中和抗体の量と比例し、１７週目に至るまで、ヘマグルチン阻害力価（ＨＡＩ）が４０以上に高く維持されているところを示す。ＨＡＩ ４０以上は、ワクチン接種された個体の５０％以上が保護される保護相関性（correlate of protection、COP）である。
【図11】図１１は、本発明の、ＮＶＴIIが錯化された脳髄膜炎菌ワクチン（Menactra、Sanofi）に対し、抗体ＩｇＧ誘導を示す（実施例１１）。図１１Ａは、試験方法を図式化した図である。図１１Ｂ及び図１１Ｃは、プライミング以後、それぞれ１４日と２１日とにおいて総錯化された抗原（Menactra）及び抗原Ａ型に対する抗体を示す。
【図12】図１２は、前記ＮＶＴIIアジュバントの免疫原性復元効能を示す（実施例１２）。図１２Ａは、試験方法を図式化した図である。Vaxigripが、３７℃において５週間熱処理し、かつＮＶＴIIまたはＰＢＳで錯化し、その後、ＩｇＧ反応のために、筋肉内ワクチン接種スケジュールを遂行した。図１２Ｂは、ＮＶＴIIがＩｇＧ抗体レベルによって検査されたように、Ｖａｘｉｇｒｉｐの免疫原性を回復させるということを示す。Ｖａｘｉｇｒｉｐ単独は、前記免疫原性を完全に喪失させたことに留意する。図１２Ｃは、ＮＶＴII－媒介されたＩｇＧレベルは、１８週でＩＡＶ Ｈ１Ｎ１及びＩＢＶに対するＨＡＩ力価５０以上において、上昇と相関している。
【図13】図１３は、本発明のリボ核酸単独が、黒色腫成長中止に及ぼす影響を示す（実施例１３）。図１３Ａは、試験方法の図式的図面である。７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０－ＯＶＡ黒色腫細胞を移植した後、６，８，１０日目ＮＡ（ＮＶＴ）を、筋肉内経路に投与した後、腫瘤重量及びマウス生存を測定した。図１３Ｂは、本発明のｈｓＲＮＡが黒色腫成長を顕著に停止させるということを示す。図１３Ｃは、ｈｓＲＮＡが生存率を上昇させるということを示す。
【図15】図１５は、本発明のリボ核酸単独が、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）の成長中止及び転移に及ぼす影響を示す（実施例１５）。図１５Ａは、試験方法を図式化した図である。７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに、４Ｔ１三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）細胞株を、乳腺脂肪組織皮下に移植した。８日目から、２日に１回ずつ総９回にわたり、腫瘍内（ｉ．ｔ．）にＮＡ（ＮＶＴ）リボ核酸を投与し、指定された日に腫瘤重量を測定した。図１５Ｂは、ＮＡ（ＮＶＴ）が原発性乳癌の成長を６０％に中止させることを示す。図１５Ｃは、ＮＶＴ原発性乳癌の肺への転移を抑制するということを示す。
【図16】図１６は、ｈｓＲＮＡが錯化されたＯＶＡ癌抗原ワクチンの腹腔内投与時、黒色腫細胞の転移に対する抑制効果を示す（実施例１6）。図１６Ａは、試験方法を図式化した図である。図１６Ｂは、１８日目に、脾臓及び肝臓の形態を示す図であり、肝臓における大きさ及び転移結節を明確に見ることができる。図１６Ｃは、８日目に脾臓及び肝臓の重量平均を示す。図１６Ｄは、肝臓に転移された腫瘍結節の数を示す。ＮＡ単独またはＮＡ＋ＯＶＡの処理群においては、肝臓への転移が顕著に抑制された。
【図17】図１７は、ｈｓＲＮＡ及びＯＸ４０抗体を含む癌ワクチン組成物が、原発性癌及び遠隔性癌成長に及ぼす抑制効果を示す（実施例１７）。図１７Ａは、試験方法を図式化した図である。黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０ＯＶＡを、７週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウスの左側脇腹に皮下移植した。移植６日後、指示された投与計画（regimen）（すなわち、ＩＲ＋ＮＶＴ＋ＯＸ４０Ａｂ）を２日ごとに４回投与した（原発癌）。１５日目に、同一マウスは、右側脇腹に、Ｂ１６Ｆ１０－Ｏｖａ細胞またはＥＧ７／Ｏｖａ細胞を受け（遠隔癌）、その後、指定された日に腫瘍重量を測定した。図１７Ｂは、照射された癌細胞（ＩＲ：irradiated cancer）＋ＮＶＴ＋ＯＸ４０Ａｂ組成物が、原発癌の成長を相当に抑制したところを示す。図１７Ｃは、ＩＲ cellなしに、ＮＶＴ＋ＯＸ４０Ａｂが、原発黒色腫成長を完全に阻害するということを示す。図１７Ｄ及び図１７Ｅは、ＮＶＴ＋ＯＸ４０Ａｂだけでも、原発癌と同一なＢ１６Ｆ１０／ＯＶＡ遠隔癌と、それと異質的なＥＧ７／ＯＶＡ遠隔癌を完全に阻害することを示す。
【発明を実施するための形態】
【0035】
以下、添付図面を参照し、本発明が属する技術分野において当業者が容易に実施するこ
とができるように、本願の実施態様及び実施例について詳細に説明する。しかし、本願は
、さまざまな形態に具現され、ここで説明する実施態様及び実施例に限定されるものでは
ない。
とができるように、本願の実施態様及び実施例について詳細に説明する。しかし、本願は
、さまざまな形態に具現され、ここで説明する実施態様及び実施例に限定されるものでは
ない。
【0036】
本願明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、それは、特
別に反対となる記載がない限り、他の構成要素を除くものではなく、他の構成要素をさら
に含んでもよいということを意味する。
別に反対となる記載がない限り、他の構成要素を除くものではなく、他の構成要素をさら
に含んでもよいということを意味する。
【0037】
本発明は、その両側３’－末端のｓｓＲＮＡによって隣接された真ん中に位置するｄｓ
ＲＮＡを含み、ｄｓＲＮＡとｓｓＲＮＡとのいずれもが、任意の特定配列を有した特定さ
れた長さを有することができるｈｓＲＮＡ（１４０－１６８２塩基）を提供する。前記ｄ
ｓＲＮＡ２個の完全に相補的なヘテロポリマー鎖によって構成された特定長を有すると定
義される。前記ｓｓＲＮＡテールは、ＴＬＲ７類似リガンドまたはＴＬＲ８類似リガンド
として作用することができ、ＴＬＲ７リガンドとして作用する非相補的Ｇ／Ｕ配列、望ま
しくは、ＧＵＵ反復配列を有することができ、１０base以上、望ましくは、１５ないし８
０base以上、望ましくは、１７ないし７５塩基の長さを有することができる。
ＲＮＡを含み、ｄｓＲＮＡとｓｓＲＮＡとのいずれもが、任意の特定配列を有した特定さ
れた長さを有することができるｈｓＲＮＡ（１４０－１６８２塩基）を提供する。前記ｄ
ｓＲＮＡ２個の完全に相補的なヘテロポリマー鎖によって構成された特定長を有すると定
義される。前記ｓｓＲＮＡテールは、ＴＬＲ７類似リガンドまたはＴＬＲ８類似リガンド
として作用することができ、ＴＬＲ７リガンドとして作用する非相補的Ｇ／Ｕ配列、望ま
しくは、ＧＵＵ反復配列を有することができ、１０base以上、望ましくは、１５ないし８
０base以上、望ましくは、１７ないし７５塩基の長さを有することができる。
【0038】
本発明のヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ）は、目的とする長さに均一に製造され、高
い安定性を有する。
い安定性を有する。
【0039】
前記ｈｓＲＮＡと対照的に、Poly（Ｉ：Ｃ）及びその誘導体は、ホモポリマー鎖間の鎖
滑り及び鎖延長により、特定の構造重量（formula weight）に定義されえない。
滑り及び鎖延長により、特定の構造重量（formula weight）に定義されえない。
【0040】
また、本発明は、下記の段階を含むヘテロ構造リボ核酸の製造方法を提供する：
１）両側５’位置にT7プロモーター配列が添加されたテンプレートＤＮＡ切片を任意
のプラスミドベクターに挿入する段階；
２）T7ＲＮＡ重合酵素を利用し、テンプレートＤＮＡからのＲＮＡの双方向インビトロ
転写（ＩＶＴ）を行い、ほとんど同一のモル比で、２本のヘテロポリマー相補鎖を生成し
、ＩＶＴの間、自発的鎖・鎖アニーリングにより、ｈｓＲＮＡを形成する段階；
３）テンプレートＤＮＡを除去する段階；及び
４）前記hｓＲＮＡを得て精製する段階。
１）両側５’位置にT7プロモーター配列が添加されたテンプレートＤＮＡ切片を任意
のプラスミドベクターに挿入する段階；
２）T7ＲＮＡ重合酵素を利用し、テンプレートＤＮＡからのＲＮＡの双方向インビトロ
転写（ＩＶＴ）を行い、ほとんど同一のモル比で、２本のヘテロポリマー相補鎖を生成し
、ＩＶＴの間、自発的鎖・鎖アニーリングにより、ｈｓＲＮＡを形成する段階；
３）テンプレートＤＮＡを除去する段階；及び
４）前記hｓＲＮＡを得て精製する段階。
【0041】
必要な場合、追加配列が、前記プロモーター配列の５’末端にも添加される。本発明
は、また次のように、他の配列を添加する方法を提供する：
１）前記プロモーター配列の５’末端に、意のＴＬＲ７／８リガンド類似配列を挿入
する段階；及び
２）Ｔ７ポリメラーゼを使用し、テンプレートＤＮＡから双方向ＩＶＴを遂行する段階
であり、ＩＶＴの間、ｓｓＲＮＡの２個の相補的な上端鎖及び下端鎖がほぼ同一モル比に
生成され、続いて、アニーリングされてｈｓＲＮＡを形成する段階。
は、また次のように、他の配列を添加する方法を提供する：
１）前記プロモーター配列の５’末端に、意のＴＬＲ７／８リガンド類似配列を挿入
する段階；及び
２）Ｔ７ポリメラーゼを使用し、テンプレートＤＮＡから双方向ＩＶＴを遂行する段階
であり、ＩＶＴの間、ｓｓＲＮＡの２個の相補的な上端鎖及び下端鎖がほぼ同一モル比に
生成され、続いて、アニーリングされてｈｓＲＮＡを形成する段階。
【0042】
本発明のｈｓＲＮＡは、ＴＬＲ３リガンドとして作用することができ、１４０ないし１
，６８２baseの塩基長を有することができ、望ましくは、２００ないし１，５００base、
さらに望ましくは、３００ないし１，０００base、一層望ましくは、４００ないし９００
base、最も望ましくは、６００ないし９００baseでもあるが、それらに限定されるもので
はない。
，６８２baseの塩基長を有することができ、望ましくは、２００ないし１，５００base、
さらに望ましくは、３００ないし１，０００base、一層望ましくは、４００ないし９００
base、最も望ましくは、６００ないし９００baseでもあるが、それらに限定されるもので
はない。
【0043】
ｈｓＲＮＡの効果は、塩基の長さが長いほど、高い樹枝状細胞活性化レベルを示す傾向
を有する。しかしながら、塩基の長さが長くなるほど、大量製造コストも上昇する。
を有する。しかしながら、塩基の長さが長くなるほど、大量製造コストも上昇する。
【0044】
同様に、本発明のｄｓＲＮＡ部分の塩基長は、１０６ないし１，６４８ｂｐでもあり、
望ましくは、２００ないし１，５００ｂｐ、さらに望ましくは、３００ないし１，０００
ｂｐ、一層望ましくは、４００ないし９００ｂｐ、最も望ましくは、６００ないし９００
baseであるが、それらに限定されるものではない。
望ましくは、２００ないし１，５００ｂｐ、さらに望ましくは、３００ないし１，０００
ｂｐ、一層望ましくは、４００ないし９００ｂｐ、最も望ましくは、６００ないし９００
baseであるが、それらに限定されるものではない。
【0045】
前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡの塩基長は、２０％範囲内において、増減されう
る。
る。
【0046】
本発明は、配列番号６３ないし９３からなる群のうちから選択されるいずれか１つの塩
基配列を含み、ＴＬＲ３リガンドとして作用することを特徴とするｄｓＲＮＡを提供する
。前記ｄｓＲＮＡの塩基長は、１０６、１５６、２０６、３０６、３１９、３９７、４０
６、４２４、４６６、５０６、５８８、６０６、６６４、７０６、７３３、８０６、８２
２、８８５、１，０３２、１，１５３または１，６４８ｂｐであってもよい。
基配列を含み、ＴＬＲ３リガンドとして作用することを特徴とするｄｓＲＮＡを提供する
。前記ｄｓＲＮＡの塩基長は、１０６、１５６、２０６、３０６、３１９、３９７、４０
６、４２４、４６６、５０６、５８８、６０６、６６４、７０６、７３３、８０６、８２
２、８８５、１，０３２、１，１５３または１，６４８ｂｐであってもよい。
【0047】
本発明で使用するリボ核酸の名称と基本情報は、下記表１及び下記表２に示した。表２
に示されているように、本発明において、同一の長さと配列とを有するが、さまざまな名
称で記載されてもいるが、ＮＡ、ＮＶＴ（next adjuvantの略語）、ＶＰ１、ＶＰ１０、
ＶＰ１１がその例である。ただし、ＶＰ１１は、ＶＰ１０ｈｓＲＮＡをＲＮａｓｅ Ｔ１
で処理したｄｓＲＮＡである。また、ＮＶＴIV（ＮＶＴ４）とＶＰ２０は、同一リボ核酸
を意味する。
に示されているように、本発明において、同一の長さと配列とを有するが、さまざまな名
称で記載されてもいるが、ＮＡ、ＮＶＴ（next adjuvantの略語）、ＶＰ１、ＶＰ１０、
ＶＰ１１がその例である。ただし、ＶＰ１１は、ＶＰ１０ｈｓＲＮＡをＲＮａｓｅ Ｔ１
で処理したｄｓＲＮＡである。また、ＮＶＴIV（ＮＶＴ４）とＶＰ２０は、同一リボ核酸
を意味する。
【0048】
本発明は、ｈｓＲＮＡからｓｓＲＮＡを除去することによって得られる均質なｄｓＲＮ
Ａを提供する。
Ａを提供する。
【0049】
前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡは、下記表１に示した配列番号の塩基配列によっ
てなるものでもある。下記表１は、本発明の実施例に記載されたそれぞれのｈｓＲＮＡま
たはｄｓＲＮＡと、配列との対応関係を示したものである。
てなるものでもある。下記表１は、本発明の実施例に記載されたそれぞれのｈｓＲＮＡま
たはｄｓＲＮＡと、配列との対応関係を示したものである。
【0050】
【表1】
【0051】
前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡは、樹枝状細胞、好中球、Ｂ細胞、大食細胞、Ｔ
細胞、肥満細胞及び自然殺害細胞を含む免疫細胞を活性化させることができる。
細胞、肥満細胞及び自然殺害細胞を含む免疫細胞を活性化させることができる。
【0052】
本発明は、真ん中に位置するヘテロポリマーｄｓＲＮＡ、及び両側３’末端の２個ｓｓ
ＲＮＡオーバーハングを含み、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのいずれも、任意の特定配列を
有した任意の定義された長さを有することができる薬剤学的組成物を提供する。
ＲＮＡオーバーハングを含み、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのいずれも、任意の特定配列を
有した任意の定義された長さを有することができる薬剤学的組成物を提供する。
【0053】
本発明は、ｈｓＲＮＡからｓｓＲＮＡを除去することによって得られる均質なｄｓＲＮ
Ａを含む薬剤学的組成物を提供する。前記ｄｓＲＮＡは、配列番号６３ないし９３によっ
てなる群のうちから選択された任意の１つの塩基配列とその相補的配列とを含む。
Ａを含む薬剤学的組成物を提供する。前記ｄｓＲＮＡは、配列番号６３ないし９３によっ
てなる群のうちから選択された任意の１つの塩基配列とその相補的配列とを含む。
【0054】
本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含むワクチンアジュバントを提供する。
【0055】
本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む均質な薬剤学的作用剤を提供する。
【0056】
本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む癌治療的作用剤を提供する。
【0057】
本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む抗癌作用剤を提供する。
【0058】
本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡを含み、及び追加のアジュバントまた
は免疫源をさらに含むことを特徴とする、ウイルス感染または細菌感染、癌または癌関連
疾病の予防用または治療用の薬剤学的組成物を提供する。前記「薬剤学的組成物」は、イ
ンフルエンザウイルスまたは脳髄膜炎球菌のような、ウイルス感染またはバクテリア感染
の予防用または治療用ワクチン組成物を含む。
は免疫源をさらに含むことを特徴とする、ウイルス感染または細菌感染、癌または癌関連
疾病の予防用または治療用の薬剤学的組成物を提供する。前記「薬剤学的組成物」は、イ
ンフルエンザウイルスまたは脳髄膜炎球菌のような、ウイルス感染またはバクテリア感染
の予防用または治療用ワクチン組成物を含む。
【0059】
前記免疫源は、三価季節性インフルエンザワクチン、四価季節性インフルエンザワクチ
ン、不活化インフルエンザワクチン、または脳髄膜炎球菌（Neisseria meningitidisグル
ープＡ，Ｃ，Ｙ及びＷ－１３５）ワクチンでもある。前記免疫源は、同種または異種亜型
のウイルスに対する防御効果を示すことができる。
ン、不活化インフルエンザワクチン、または脳髄膜炎球菌（Neisseria meningitidisグル
ープＡ，Ｃ，Ｙ及びＷ－１３５）ワクチンでもある。前記免疫源は、同種または異種亜型
のウイルスに対する防御効果を示すことができる。
【0060】
前記ウイルス感染または細菌感染の予防用または治療用のワクチン組成物は、前記ｈｓ
ＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡがないワクチン組成物と比べ、免疫源（抗原）の必要使用量
を低減させることができる。前記必要使用量は、例えば、１／２以下、１／３以下、１／
５以下、１／１０以下、１／２５以下、１／５０以下または１／１００以下まで低減され
うる。
ＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡがないワクチン組成物と比べ、免疫源（抗原）の必要使用量
を低減させることができる。前記必要使用量は、例えば、１／２以下、１／３以下、１／
５以下、１／１０以下、１／２５以下、１／５０以下または１／１００以下まで低減され
うる。
【0061】
前記ウイルス感染または細菌感染の予防用または治療用のワクチン組成物は、免疫源の
抗原性を増強させるか、あるいは維持または復元させることができる。
抗原性を増強させるか、あるいは維持または復元させることができる。
【0062】
前記ウイルス感染または細菌感染の予防用または治療用のワクチン組成物は、さらなる
アジュバントを含んでもよい。前記さらなるアジュバントは、水中油エマルジョンアジュ
バント、アルミニウム塩、フロイントアジュバント（Freund adjuvant）及びＤＯＴＡＰ
（１，２－dioleoyl－３－trimethylammonium－propane）からなる群のうちから選択され
る１以上でもあり、前記水中油エマルジョンアジュバントは、スクアレン（squalene）水
中油エマルジョンでもある。
アジュバントを含んでもよい。前記さらなるアジュバントは、水中油エマルジョンアジュ
バント、アルミニウム塩、フロイントアジュバント（Freund adjuvant）及びＤＯＴＡＰ
（１，２－dioleoyl－３－trimethylammonium－propane）からなる群のうちから選択され
る１以上でもあり、前記水中油エマルジョンアジュバントは、スクアレン（squalene）水
中油エマルジョンでもある。
【0063】
本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡを含み、追加のアジュバントまたは免
疫源をさらに含みうることを特徴とする、癌または癌関連疾病を予防したり治療したりす
るための薬剤学的組成物を提供する。「薬剤学的組成物」は、癌を予防したり治療したり
するためのワクチン組成物を含む。
疫源をさらに含みうることを特徴とする、癌または癌関連疾病を予防したり治療したりす
るための薬剤学的組成物を提供する。「薬剤学的組成物」は、癌を予防したり治療したり
するためのワクチン組成物を含む。
【0064】
本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ、及び免疫源を含む、癌を予防したり治療
したりするためのワクチン組成物を提供する。
したりするためのワクチン組成物を提供する。
【0065】
前記免疫源は、ペプチド、全蛋白質抗原、蛋白質 抗原のドメイン、不活性化または生
弱毒化された個体、細胞に由来したもの、不活性化された癌組織、癌細胞質、癌関連抗原
、または免疫決定基（エピトープ）のＤＮＡまたはｍＲＮＡをコーディングする蛋白質か
らなる群のうちから選択されうるが、それらに限定されるものではない。
弱毒化された個体、細胞に由来したもの、不活性化された癌組織、癌細胞質、癌関連抗原
、または免疫決定基（エピトープ）のＤＮＡまたはｍＲＮＡをコーディングする蛋白質か
らなる群のうちから選択されうるが、それらに限定されるものではない。
【0066】
前述の癌予防用または癌治療用のワクチン組成物は、前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲ
ＮＡがないワクチン組成物と比べ、免疫源の必要使用量を低減させることができる。前記
必要使用量は、例えば、1/２倍以下、1/３以下、1/５以下、1/１０以下、1/２５以下、1/
５０以下または1/１００以下まで低減されうる。
ＮＡがないワクチン組成物と比べ、免疫源の必要使用量を低減させることができる。前記
必要使用量は、例えば、1/２倍以下、1/３以下、1/５以下、1/１０以下、1/２５以下、1/
５０以下または1/１００以下まで低減されうる。
【0067】
前述の癌予防用または癌治療用のワクチン組成物は、免疫源の抗原性を増強させたり、
維持または復元させたりすることができる。
維持または復元させたりすることができる。
【0068】
前述の癌予防用または癌治療用のワクチン組成物は、さらなるアジュバントを含んでも
よい。前記さらなるアジュバントは、水中油エマルジョンアジュバント、アルミニウム塩
、フロイントアジュバント、及びＤＯＴＡＰ（１，２－dioleoyl－３－trimethylammoniu
m－propane）からなる群のうちから選択される１以上でもあり、前記水中油エマルジョン
アジュバントは、スクアレン水中油エマルジョンでもある。
よい。前記さらなるアジュバントは、水中油エマルジョンアジュバント、アルミニウム塩
、フロイントアジュバント、及びＤＯＴＡＰ（１，２－dioleoyl－３－trimethylammoniu
m－propane）からなる群のうちから選択される１以上でもあり、前記水中油エマルジョン
アジュバントは、スクアレン水中油エマルジョンでもある。
【0069】
前記癌は、癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞種及び肉腫を含むが、それらに制限される
ものではない。癌のさらに具体的な例としては、扁平細胞癌腫、骨髄腫、皮膚癌、肺癌、
小細胞肺癌、非小細胞肺癌、大腸癌、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫
、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、胃腸管癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リ
ンパ芽細胞性白血病、リンパ球性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、
甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形成膠芽細胞腫、子宮頸部癌、
脳癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌腫、頭頸部癌、またはそれらの転移癌が含
まれるが、それらに制限されるものではない。
ものではない。癌のさらに具体的な例としては、扁平細胞癌腫、骨髄腫、皮膚癌、肺癌、
小細胞肺癌、非小細胞肺癌、大腸癌、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫
、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、胃腸管癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リ
ンパ芽細胞性白血病、リンパ球性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、
甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形成膠芽細胞腫、子宮頸部癌、
脳癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌腫、頭頸部癌、またはそれらの転移癌が含
まれるが、それらに制限されるものではない。
【0070】
前述の癌予防用または癌治療用のワクチン組成物は、癌転移抑制効果を示すことができ
る。
る。
【0071】
本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡ、及びＯＸ４０抗体またはＰＤ－１抗
体を含む癌予防用または癌治療用の薬学組成物を提供する。
体を含む癌予防用または癌治療用の薬学組成物を提供する。
【0072】
前記ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０アゴニスト抗体でもあり、ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１拮
抗剤抗体でもある。また、前記ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０と特異的に結合するモノクロー
ナル抗体、またはその抗原結合性断片でもある。ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１と特異的に結
合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片でもあり。前記ＯＸ４０抗体また
はＰＤ－１抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体またはマウス抗体でもあり、ヒト
不変領域を含んでもよい。前記ヒト不変領域は、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３及びＩｇ
Ｇ４不変領域からなる群のうちから選択され、望ましくは、ＩｇＧ１不変領域またはＩｇ
Ｇ４不変領域である。一実施態様において、前記抗原結合性断片は、Ｆａｂ，Ｆａｂ’－
ＳＨ，Ｆ（ａｂ’）２，ｓｃＦｖ及びＦｖ断片からなる群のうちから選択される。前記Ｐ
Ｄ－１拮抗剤抗体としても使用される特異的ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の例として
は、ペムブロリズマブ（pembrolizumab）、ニボルマブ（nivolumab）、アベルマブ（avel
umab）、ピディルリズマブ（pidilizumab）などを含むあ、それらに制限されるものでは
ない。
抗剤抗体でもある。また、前記ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０と特異的に結合するモノクロー
ナル抗体、またはその抗原結合性断片でもある。ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１と特異的に結
合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片でもあり。前記ＯＸ４０抗体また
はＰＤ－１抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体またはマウス抗体でもあり、ヒト
不変領域を含んでもよい。前記ヒト不変領域は、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３及びＩｇ
Ｇ４不変領域からなる群のうちから選択され、望ましくは、ＩｇＧ１不変領域またはＩｇ
Ｇ４不変領域である。一実施態様において、前記抗原結合性断片は、Ｆａｂ，Ｆａｂ’－
ＳＨ，Ｆ（ａｂ’）２，ｓｃＦｖ及びＦｖ断片からなる群のうちから選択される。前記Ｐ
Ｄ－１拮抗剤抗体としても使用される特異的ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の例として
は、ペムブロリズマブ（pembrolizumab）、ニボルマブ（nivolumab）、アベルマブ（avel
umab）、ピディルリズマブ（pidilizumab）などを含むあ、それらに制限されるものでは
ない。
【0073】
本発明の実施例で使用された４種の異なるバックボーンのベクターに由来するｈｓＲＮ
Ａを表２に列挙した。以下の実施例においては、各ｈｓＲＮＡをそれぞれの名称と称する
。
Ａを表２に列挙した。以下の実施例においては、各ｈｓＲＮＡをそれぞれの名称と称する
。
【0074】
【表2】
【0075】
以下、実施例を介し、本発明についてさらに詳細に説明するが、下記の実施例は、単に
説明の目的のためのものであり、本願発明の範囲を限定するものではない。実施例のほと
んど、全部ではないところにおいて、ＲＮａｓｅ Ｔ１処理されたｄｓＲＮＡ、例えば、
ＮＡ（別称として、ＮＶＴ、ＶＰ１、ＶＰ１０）がテストされた。ＮＡは、別途に、ｈｓ
ＲＮＡとして言及されなければ、ｄｓＲＮＡを示す。
説明の目的のためのものであり、本願発明の範囲を限定するものではない。実施例のほと
んど、全部ではないところにおいて、ＲＮａｓｅ Ｔ１処理されたｄｓＲＮＡ、例えば、
ＮＡ（別称として、ＮＶＴ、ＶＰ１、ＶＰ１０）がテストされた。ＮＡは、別途に、ｈｓ
ＲＮＡとして言及されなければ、ｄｓＲＮＡを示す。
【実施例1】
【0076】
hsＲＮＡ基盤ネクストアジュバントの生体内樹枝状細胞（ＤＣ）活性化
本実施例は、前記ｈｓＲＮＡ基盤ネクストアジュバント（ＮＡと略称する）のＣ５７Ｂ
Ｌ／６マウスの腹腔内投与の生体内先天免疫活性を証明する。（図１）。
本実施例は、前記ｈｓＲＮＡ基盤ネクストアジュバント（ＮＡと略称する）のＣ５７Ｂ
Ｌ／６マウスの腹腔内投与の生体内先天免疫活性を証明する。（図１）。
【0077】
本発明のＮＡの一例（別称して、ＮＶＴまたはＶＰ１０）は、Poly（Ｉ：Ｃ）１００μ
ｇと同等であるか、あるいはそれ以上のレベルに樹枝状細胞マーカー（ＣＤ４０、ＣＤ８
６、ＭＨＣ－II）の分化を誘導した（図１）。前記ＮＡは、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞をＴｈ
１ＣＤ４Ｔ細胞側への偏り（skewness）に係わる１型インターフェロンベータ（ＩＦＮ－
β）及びＩＬ－６及びＩＬ－１２の分泌を誘導した（図１）。また、ＮＡは、Ｔ－ｂｅｔ
（Ｔｈ１細胞マーカー）及びＩＦＮ－γを誘導したが、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ－４）
及びＴｈ１７サイトカイン（ＩＬ－１７Ａ）は、誘導しなかった（図1）。前記ＮＡは、
前記Poly（Ｉ：Ｃ）陽性対照群に比べ、ＤＣを強力に活性化させる。
ｇと同等であるか、あるいはそれ以上のレベルに樹枝状細胞マーカー（ＣＤ４０、ＣＤ８
６、ＭＨＣ－II）の分化を誘導した（図１）。前記ＮＡは、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞をＴｈ
１ＣＤ４Ｔ細胞側への偏り（skewness）に係わる１型インターフェロンベータ（ＩＦＮ－
β）及びＩＬ－６及びＩＬ－１２の分泌を誘導した（図１）。また、ＮＡは、Ｔ－ｂｅｔ
（Ｔｈ１細胞マーカー）及びＩＦＮ－γを誘導したが、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ－４）
及びＴｈ１７サイトカイン（ＩＬ－１７Ａ）は、誘導しなかった（図1）。前記ＮＡは、
前記Poly（Ｉ：Ｃ）陽性対照群に比べ、ＤＣを強力に活性化させる。
【実施例2】
【0078】
生体内ＤＣ活性化は、ｈｓＲＮＡの配列ではない長さに依存する
前記ｈｓＲＮＡは、２個の独立したバックボーンから、ｄｓＲＮＡ領域が１０６－８０
６ｂｐに変わる、さまざまな長さに準備されたが、ｓｓＲＮＡオーバーハングは、本実施
例２において、両末端において、１７塩基で一定し（図２Ａ及び図２Ｂ）、マウスにおい
て、脾臓ＤＣ活性化のために腹腔でテストされた。
前記ｈｓＲＮＡは、２個の独立したバックボーンから、ｄｓＲＮＡ領域が１０６－８０
６ｂｐに変わる、さまざまな長さに準備されたが、ｓｓＲＮＡオーバーハングは、本実施
例２において、両末端において、１７塩基で一定し（図２Ａ及び図２Ｂ）、マウスにおい
て、脾臓ＤＣ活性化のために腹腔でテストされた。
【0079】
【0080】
また、全てのｈｓＲＮＡは、陽性対照群であるPoly（Ｉ：Ｃ）より、さらにすぐれた活
性を示した。
性を示した。
【0081】
全てのｓｓＲＮＡオーバーハングは、各末端において、非相補的１７塩基であり、総３
４塩基であるために、ｈｓＲＮＡからのＤＣ活性化において、違いは、ｄｓＲＮＡ長が長
くなることにより、生じなければならない。従って、前述の約４０６ないし８０６ｂｐの
範囲を有するｄｓＲＮＡが高い活性を示した。
４塩基であるために、ｈｓＲＮＡからのＤＣ活性化において、違いは、ｄｓＲＮＡ長が長
くなることにより、生じなければならない。従って、前述の約４０６ないし８０６ｂｐの
範囲を有するｄｓＲＮＡが高い活性を示した。
【0082】
高い活性を示す５４０ｈｓＲＮＡ（５０６ｂｐ ｄｓＲＮＡ）を多様な濃度（０．５～
２０μｇ）で再検査した結果、１０μｇにおいて、最大活性を示した。前記活性は、生体
内において、Poly（Ｉ：Ｃ）と比較し、１０倍ないし２０倍高い活性を示した。
２０μｇ）で再検査した結果、１０μｇにおいて、最大活性を示した。前記活性は、生体
内において、Poly（Ｉ：Ｃ）と比較し、１０倍ないし２０倍高い活性を示した。
【実施例3】
【0083】
抗原-特異的抗体反応は、ｈｓＲＮＡの長さに依存する
広範囲のさらに多くのＲＮＡ（３５３～１，６８２base）は、実施例２に示された最初
の２つのベクターとは異なる３番目バックボーンベクターに由来する（図３Ａ）。
広範囲のさらに多くのＲＮＡ（３５３～１，６８２base）は、実施例２に示された最初
の２つのベクターとは異なる３番目バックボーンベクターに由来する（図３Ａ）。
【0084】
ＩＦＮ－βプロモーター駆動ベクターと共に、それらＲＮＡをＨＥＫ２９３に共移入（
co-transfection）した後、先天免疫活性化の代理レポーター（surrogate reporter）を
決定した（図３Ｂ）。前記ＩＦＮ－βプロモーター活性は、ｈｓＲＮＡとｄｓＲＮＡとの
長さに比例して増大し、４０６ｂｐないし８０６ｂｐの範囲で最大に達した。注目すべき
こととして、前記活性は、ＲＮＡの特異的配列に独立しており、それは、実施例２と一貫
している。
co-transfection）した後、先天免疫活性化の代理レポーター（surrogate reporter）を
決定した（図３Ｂ）。前記ＩＦＮ－βプロモーター活性は、ｈｓＲＮＡとｄｓＲＮＡとの
長さに比例して増大し、４０６ｂｐないし８０６ｂｐの範囲で最大に達した。注目すべき
こととして、前記活性は、ＲＮＡの特異的配列に独立しており、それは、実施例２と一貫
している。
【0085】
それらのうちいくつか（Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ１０）は、モデル抗原ＯＶＡと複合体化
され、抗ＯＶＡＩｇＧの誘導につき、マウス生体内で試験された。
され、抗ＯＶＡＩｇＧの誘導につき、マウス生体内で試験された。
【0086】
前述のところと一貫し、抗ＯＶＡ ＩｇＧ１、及びＴｈ１媒介された抗ＯＶＡ ＩｇＧ２
の高レベルは、Ｒ５（ｄｓＲＮＡ長６６４ｂｐ）の近傍で観察された（図３Ｃ）。
の高レベルは、Ｒ５（ｄｓＲＮＡ長６６４ｂｐ）の近傍で観察された（図３Ｃ）。
【0087】
総合すれば、ｈｓＲＮＡ（１４０ないし１６８２base）及びｄｓＲＮＡ（１０６ないし
１６４８ｂｐ）は、先天性及び適応反応にすぐれた効果を示した。
１６４８ｂｐ）は、先天性及び適応反応にすぐれた効果を示した。
【0088】
従って、本発明は、前述のところで試験されたそれぞれのｈｓＲＮＡ（１４０ないし１
６８２ｂｐ）から２０％範囲において、短くなったり長くなったりするｈｓＲＮＡ（１１
２～２，０１８base）を請求する。また、本発明は、配列番号６３ないし９３から選択さ
れたそれぞれのｄｓＲＮＡ以外にも、それらの２０％範囲において、短くなったり長くな
ったりするｄｓＲＮＡ（８５～１，９７７ｂｐ）を含む。
６８２ｂｐ）から２０％範囲において、短くなったり長くなったりするｈｓＲＮＡ（１１
２～２，０１８base）を請求する。また、本発明は、配列番号６３ないし９３から選択さ
れたそれぞれのｄｓＲＮＡ以外にも、それらの２０％範囲において、短くなったり長くな
ったりするｄｓＲＮＡ（８５～１，９７７ｂｐ）を含む。
【実施例4】
【0089】
ｈｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡの物理化学的特性分析
ＨＰＬＣ分析及びアガロースゲル電気泳動は、本発明の高度に均質な大きくによってな
るｈｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡを証明し（図４Ａ）、それは、Poly（Ｉ：Ｃ）と対照される
（図８Ｃ）。
ＨＰＬＣ分析及びアガロースゲル電気泳動は、本発明の高度に均質な大きくによってな
るｈｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡを証明し（図４Ａ）、それは、Poly（Ｉ：Ｃ）と対照される
（図８Ｃ）。
【0090】
前記ＮＡは、は、４５℃で１５０日以上安定している（図４Ｂ）、ＲＮＡｓｅが多く存
在する血清が補充された培地においては、非常に短い半減期を有するが（図４Ｃ）、それ
は、ターゲッティングの可能な方式として、ヒットエンドランを反映させるものである。
前記ＮＡに複合体化された抗原は、室温において、延長された時間の間、保存が可能であ
った（図４Ｄ）。
在する血清が補充された培地においては、非常に短い半減期を有するが（図４Ｃ）、それ
は、ターゲッティングの可能な方式として、ヒットエンドランを反映させるものである。
前記ＮＡに複合体化された抗原は、室温において、延長された時間の間、保存が可能であ
った（図４Ｄ）。
【実施例5】
【0091】
ｈｓＲＮＡとｄｓＲＮＡと間の共通及び区別される免疫プロファイリング
（ｉ）ＲＮａｓｅ Ｔ１を処理していないｈｓＲＮＡ（ＮＶＴ４－Ｔ１）、（ii）ＲＮ
ａｓｅ Ｔ１を処理したｄｓＲＮＡ（ＮＶＴ４＋Ｔ１）を、ＢａｌＢ／Ｃマウスに皮下（
ｓ．ｃ．）処理した後、先天性免疫指示子をＮＶＴ４（ＶＰ２０）を使用し、２４，４８
時間が経た後、生体内で比較した。
（ｉ）ＲＮａｓｅ Ｔ１を処理していないｈｓＲＮＡ（ＮＶＴ４－Ｔ１）、（ii）ＲＮ
ａｓｅ Ｔ１を処理したｄｓＲＮＡ（ＮＶＴ４＋Ｔ１）を、ＢａｌＢ／Ｃマウスに皮下（
ｓ．ｃ．）処理した後、先天性免疫指示子をＮＶＴ４（ＶＰ２０）を使用し、２４，４８
時間が経た後、生体内で比較した。
【0092】
ｈｓＲＮＡとｄｓＲＮＡとのいずれも、ＤＣ活性化を強く誘導したが、ｄｓＲＮＡがｈ
ｓＲＮＡに比べ、さらに多くの免疫細胞（特に、Ｂ細胞及び好中球）を増加させ、それは
、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β及びＩＬ－６も、それと比例し、増加と相関す（図５）。総合
すれば、ＲＮＡがさらに強く先天免疫を誘導する。ｈｓＲＮＡが、低いレベルに、好中球
、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αを誘導し、安全性問題に有利であろう。
ｓＲＮＡに比べ、さらに多くの免疫細胞（特に、Ｂ細胞及び好中球）を増加させ、それは
、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β及びＩＬ－６も、それと比例し、増加と相関す（図５）。総合
すれば、ＲＮＡがさらに強く先天免疫を誘導する。ｈｓＲＮＡが、低いレベルに、好中球
、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αを誘導し、安全性問題に有利であろう。
【実施例6】
【0093】
ＮＡと、他のアジュバントとのうちのＴｈ１極性化免疫反応の比較
前記ＯＶＡを、ＮＡ、Ａｌｕｍ、スクアレン（ＳＥ）、ＩＦＡ、Poly（Ｉ：Ｃ）に複合
体化させた後、筋肉に投与し（図６Ａ）、免疫反誘導を比較した。
前記ＯＶＡを、ＮＡ、Ａｌｕｍ、スクアレン（ＳＥ）、ＩＦＡ、Poly（Ｉ：Ｃ）に複合
体化させた後、筋肉に投与し（図６Ａ）、免疫反誘導を比較した。
【0094】
Ｔｈ２免疫反応（ＩｇＧ１）の活性は、類似しているが、他のものよりさらに高いＴｈ
１反応（ＩｇＧ２ｃ）は、ＮＡアジュバントされたＯＶＡから生じた（図６Ｂ）。脾臓に
おいて、ＩＦＮ－γを分泌するさらに多くの脾臓ＣＤ８Ｔ細胞と脾臓ＣＤ４Ｔ細胞が、Ｎ
ＡアジュバントされたＯＶＡワクチンフォーマットに対する反応として増殖した（図６Ｃ
）。鼻腔に投与したときにも、他のアジュバントより、ＮＡが体液（涙、鼻腔及びドレナー
ジ）及び血清において、さらに強力に粘膜ＩｇＡと粘膜ＩｇＧとを誘導した（データは、
示されていない）。
１反応（ＩｇＧ２ｃ）は、ＮＡアジュバントされたＯＶＡから生じた（図６Ｂ）。脾臓に
おいて、ＩＦＮ－γを分泌するさらに多くの脾臓ＣＤ８Ｔ細胞と脾臓ＣＤ４Ｔ細胞が、Ｎ
ＡアジュバントされたＯＶＡワクチンフォーマットに対する反応として増殖した（図６Ｃ
）。鼻腔に投与したときにも、他のアジュバントより、ＮＡが体液（涙、鼻腔及びドレナー
ジ）及び血清において、さらに強力に粘膜ＩｇＡと粘膜ＩｇＧとを誘導した（データは、
示されていない）。
【実施例7】
【0095】
ｈｓＲＮＡと、ｈｓＲＮＡプラス追加アジュバントとの先天性及び抗原特異的な抗体反
応
（ｉ）ＮＶＴ：ｄｓＲＮＡ（ＮＡ）、
（ii）ＮＶＴII：ＮＶＴ（ＮＡ）＋ＳＥ（スクアレンエマルジョン）の２個剤形を準備し
た（図７Ａ）。ＢａｌＢ／Ｃマウスに筋肉内注射した後、ＤＣ活性をフローサイトメトリ
ーによって測定した。鼠蹊部リンパ節（ｉＬＮ）においてＤＣ刺激は、ＮＶＴにおいて、
さらにＮＶＴIIでさらに高かった（図７Ｂ）。
応
（ｉ）ＮＶＴ：ｄｓＲＮＡ（ＮＡ）、
（ii）ＮＶＴII：ＮＶＴ（ＮＡ）＋ＳＥ（スクアレンエマルジョン）の２個剤形を準備し
た（図７Ａ）。ＢａｌＢ／Ｃマウスに筋肉内注射した後、ＤＣ活性をフローサイトメトリ
ーによって測定した。鼠蹊部リンパ節（ｉＬＮ）においてＤＣ刺激は、ＮＶＴにおいて、
さらにＮＶＴIIでさらに高かった（図７Ｂ）。
【0096】
また、（ｉ）ＯＶＡ、（ii）ＯＶＡ＋ＮＶＴ、（iii）ＯＶＡ＋ＮＶＴIIを含む、モデ
ルワクチンを準備し、抗ＯＶＡ ＩｇＧ１（Ｔｈ２反応）及び抗ＯＶＡ ＩｇＧ２ａ（Ｔｈ
１反応）につき、同一マウスで試験した。
ルワクチンを準備し、抗ＯＶＡ ＩｇＧ１（Ｔｈ２反応）及び抗ＯＶＡ ＩｇＧ２ａ（Ｔｈ
１反応）につき、同一マウスで試験した。
【0097】
【実施例8】
【0098】
ｈｓＲＮＡの構造及び長さの均質性
本発明のｈｓＲＮＡは、真ん中に位置するｄｓＲＮＡ、及び両側３’末端において、２
個ｓｓＲＮＡオーバーハングを有する。２つのｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡは、非ホモポリ
マー配列を有し、正確な長さでもって定義され、ホモポリマー媒介の鎖滑り及び鎖延長を
防止することができる。
本発明のｈｓＲＮＡは、真ん中に位置するｄｓＲＮＡ、及び両側３’末端において、２
個ｓｓＲＮＡオーバーハングを有する。２つのｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡは、非ホモポリ
マー配列を有し、正確な長さでもって定義され、ホモポリマー媒介の鎖滑り及び鎖延長を
防止することができる。
【0099】
ｄｓＲＮＡ領域は、任意の特定長と、任意の特定配列とを有し、完全に相補的である。
前記配列は、人工配列でもあり、自然配列でもあるが、タンパク質を暗化しない。前記ｄ
ｓＲＮＡの２つのい３’末端において、前記２つのｓｓＲＮＡは、暫定的ＴＬＲ７／８類
似リガンドとして作用する、任意の特定長と、任意の特定配列とを有する。前記２つのｓ
ｓＲＮＡテールは、相補的ではないために、２つのオーバーハング配列内、及び２つのオ
ーバーハング配列間に塩基対形成が起こらず、内在的に鎖延長を遮断するが、ＴＬＲ７／
８暫定的リガンドに該当する（図８Ａ）。
前記配列は、人工配列でもあり、自然配列でもあるが、タンパク質を暗化しない。前記ｄ
ｓＲＮＡの２つのい３’末端において、前記２つのｓｓＲＮＡは、暫定的ＴＬＲ７／８類
似リガンドとして作用する、任意の特定長と、任意の特定配列とを有する。前記２つのｓ
ｓＲＮＡテールは、相補的ではないために、２つのオーバーハング配列内、及び２つのオ
ーバーハング配列間に塩基対形成が起こらず、内在的に鎖延長を遮断するが、ＴＬＲ７／
８暫定的リガンドに該当する（図８Ａ）。
【0100】
２つの末端において、前記２つのｓｓＲＮＡは、ＲＮａｓｅ Ｔ１処理によって除去さ
れ、ブラント末端ｄｓＲＮＡを生成することができる。真ん中に位置する前記ｄｓＲＮＡ
の存在は、ＲＮａｓｅIII処理によって確認された。前記ｄｓＲＮＡは、短時間、ＲＮａ
ｓｅIIIにより、平均２０ないし２５ｂｐの切片に切断される。前記ｄｓＲＮＡのさらに
長い処理は、１２ｂｐ以下の長さを有する切片を生成する。前述の結果は、多様なＲＮａ
ｓｅの作用方式と一貫する。両側３’末端に、５１baseと５８baseとのｓｓＲＮＡオーバ
ーハングを有するｈｓＲＮＡにＲＮＡｓｅIIIを処理すれば、２０ないし２５ｂｐのｄｓ
ＲＮＡ切片と、約５０baseのｓｓＲＮＡ切片とが確認されると予測される。同一の前記ｈ
ｓＲＮＡに、ＲＮＡｓｅIII及びＲＮＡｓｅＴ１を処理する場合、ｓｓＲＮＡは、分解さ
れ、２０ないし２５ｂｐのｄｓＲＮＡ切片だけが残った。ＲＮａｓｅＡを処理すれば、全
てのＲＮＡが分解された（図８Ｂ）。
れ、ブラント末端ｄｓＲＮＡを生成することができる。真ん中に位置する前記ｄｓＲＮＡ
の存在は、ＲＮａｓｅIII処理によって確認された。前記ｄｓＲＮＡは、短時間、ＲＮａ
ｓｅIIIにより、平均２０ないし２５ｂｐの切片に切断される。前記ｄｓＲＮＡのさらに
長い処理は、１２ｂｐ以下の長さを有する切片を生成する。前述の結果は、多様なＲＮａ
ｓｅの作用方式と一貫する。両側３’末端に、５１baseと５８baseとのｓｓＲＮＡオーバ
ーハングを有するｈｓＲＮＡにＲＮＡｓｅIIIを処理すれば、２０ないし２５ｂｐのｄｓ
ＲＮＡ切片と、約５０baseのｓｓＲＮＡ切片とが確認されると予測される。同一の前記ｈ
ｓＲＮＡに、ＲＮＡｓｅIII及びＲＮＡｓｅＴ１を処理する場合、ｓｓＲＮＡは、分解さ
れ、２０ないし２５ｂｐのｄｓＲＮＡ切片だけが残った。ＲＮａｓｅＡを処理すれば、全
てのＲＮＡが分解された（図８Ｂ）。
【0101】
また、ｈｓＲＮＡにＲＮａｓｅ Ｔ１を処理する場合、前記ｄｓＲＮＡの部位の相補性
及び安全性は、処理前後において、アガロースゲル上の単一から確認された（図８Ｃ）。
及び安全性は、処理前後において、アガロースゲル上の単一から確認された（図８Ｃ）。
【0102】
【0103】
他の具的例として、ポリウリジン（Ｕ）基を含む任意の特定一本鎖（１７base）が、ｄ
ｓＲＮＡの両側に追加されうる。また、ヘアピン構造や回文環構造のような内部ｄｓＲＮ
Ａを形成するように、特定配列を追加し、安定性を有したり、ＴＬＲ７類似リガンドとし
て作用したりするように、一本鎖をデザインすることができる。
ｓＲＮＡの両側に追加されうる。また、ヘアピン構造や回文環構造のような内部ｄｓＲＮ
Ａを形成するように、特定配列を追加し、安定性を有したり、ＴＬＲ７類似リガンドとし
て作用したりするように、一本鎖をデザインすることができる。
【0104】
それと対照的に、競争薬物であるPoly（Ｉ：Ｃ）は、極端な長さ多様性を有し、一定長
に製造されえない。代わりに、それは、内部に特定することができないニックを有し、ｄ
ｓＲＮＡの３’末端のような特定された部位において、ｓｓＲＮＡテールを有さない人工
ホモポリマーｄｓＲＮＡである。Poly（Ｉ：Ｃ）の長さ多様性は、鎖滑りと鎖延長とによ
って引き起こされる。その結果、ｄｓＲＮＡ部位の特定することができない部位に複数ニ
ックが形成され、それらは、ＲＮａｓｅ Ｔ１により、多様な長さに切断される（図８Ｄ
）。さらに、ｄｓＲＮＡを形成する前述の上部鎖及び下部鎖の数は、Poly（Ｉ：Ｃ）内の
制御されない鎖延長によって特定されえない。従って、Poly（Ｉ：Ｃ）は、ＲＮａｓｅ
Ｔ１によって消化されやすい。Poly（Ｉ：Ｃ）の極端的非均質性は、原記事のうち一つに
公開されている（非特許文献２）（図８Ｄ左側）。
に製造されえない。代わりに、それは、内部に特定することができないニックを有し、ｄ
ｓＲＮＡの３’末端のような特定された部位において、ｓｓＲＮＡテールを有さない人工
ホモポリマーｄｓＲＮＡである。Poly（Ｉ：Ｃ）の長さ多様性は、鎖滑りと鎖延長とによ
って引き起こされる。その結果、ｄｓＲＮＡ部位の特定することができない部位に複数ニ
ックが形成され、それらは、ＲＮａｓｅ Ｔ１により、多様な長さに切断される（図８Ｄ
）。さらに、ｄｓＲＮＡを形成する前述の上部鎖及び下部鎖の数は、Poly（Ｉ：Ｃ）内の
制御されない鎖延長によって特定されえない。従って、Poly（Ｉ：Ｃ）は、ＲＮａｓｅ
Ｔ１によって消化されやすい。Poly（Ｉ：Ｃ）の極端的非均質性は、原記事のうち一つに
公開されている（非特許文献２）（図８Ｄ左側）。
【0105】
Poly（Ｉ：Ｃ）－Ｌ（long species）のＲＮＡｓｅIII消化は、Poly（Ｉ：Ｃ）－Ｓ（s
hort species）と類似した小さい種を生成する（図８Ｄ）（非特許文献２）。その極端な
非均質性は、短いPolyＣ（平均１００塩基のＰ１００）を、長いPolyＩ（平均４００塩基
のＰ４００）に、相補的結合を介する鎖延長を低減させることにより、部分的に改善され
る。それにもかかわらず、前記長さは、１００ｂｐから１００ｋｂｐまで多様な範囲にお
いて変わる（非特許文献５）。
hort species）と類似した小さい種を生成する（図８Ｄ）（非特許文献２）。その極端な
非均質性は、短いPolyＣ（平均１００塩基のＰ１００）を、長いPolyＩ（平均４００塩基
のＰ４００）に、相補的結合を介する鎖延長を低減させることにより、部分的に改善され
る。それにもかかわらず、前記長さは、１００ｂｐから１００ｋｂｐまで多様な範囲にお
いて変わる（非特許文献５）。
【0106】
本発明のリボ核酸は、既存発明とは、次の事項において本質的な違いを有する。
【0107】
Poly（Ｉ：Ｃ）と対照的に、本発明のリボ核酸は、１）高い長さ均質性を有し、配列の
非同型重合であり、完全な相補性により、ｄｓＲＮＡにニックを有さず、２）ＴＬＲ３リ
ガンド及びＴＬＲ７類似リガンドとして作用することができる。
非同型重合であり、完全な相補性により、ｄｓＲＮＡにニックを有さず、２）ＴＬＲ３リ
ガンド及びＴＬＲ７類似リガンドとして作用することができる。
【0108】
ｓｉＲＮＡと比較し、本発明のリボ核酸は、１）合成されるｓｉＲＮＡと比較し、製造
過程において本質的違いを有し、２）ｓｉＲＮＡが有する特定遺子を標的阻害する機能を
有さず、３）ｓｉＲＮＡの範囲が２１ないし２５ｂｐと短く、ＴＬＲ３を刺激することが
できないのに反し、本発明のリボ核酸の長さは、４５ｂｐ以上であるので、十分な活性を
示すＴＬＲ３リガンドとして作用することができ（非特許文献１）、４）ｓｉＲＮＡ末端
において、非常に短い３’オーバーハングは、機能がない単純な残存配列に該するが、本
発明のｓｓＲＮＡは、特定長以上（例えば、１７base以上）の特定配列を有し、ＴＬＲ７
／８類似リガンドの役割を行う。ｓｓＲＮＡを有する前記ｈｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡと比
較し、インビトロで低い毒性指標を示した（実施例５）。
過程において本質的違いを有し、２）ｓｉＲＮＡが有する特定遺子を標的阻害する機能を
有さず、３）ｓｉＲＮＡの範囲が２１ないし２５ｂｐと短く、ＴＬＲ３を刺激することが
できないのに反し、本発明のリボ核酸の長さは、４５ｂｐ以上であるので、十分な活性を
示すＴＬＲ３リガンドとして作用することができ（非特許文献１）、４）ｓｉＲＮＡ末端
において、非常に短い３’オーバーハングは、機能がない単純な残存配列に該するが、本
発明のｓｓＲＮＡは、特定長以上（例えば、１７base以上）の特定配列を有し、ＴＬＲ７
／８類似リガンドの役割を行う。ｓｓＲＮＡを有する前記ｈｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡと比
較し、インビトロで低い毒性指標を示した（実施例５）。
【実施例9】
【0109】
鼻腔投与を介するｄｓＲＮＡにアジュバントされた不活化インフルエンザ全ワクチン（
ｉＰＲ８）に対する免疫反応
ＢａｌＢ／ｃマウスに、ＮＡ（ＮＶＴ）をｉＰＲ８と共に投与する場合、２４時間が経
た後、縦隔洞リンパ節において、ｍＤＣ細胞とｒＤＣ細胞との数が増加し、ＤＣ（ＣＤ８
０、ＣＤ８６）が活性化されていて、９６時間後、基底レベルに低下した（データは、示
されていない）。また、ｉＰＲ８と共にＮＶＴを処理すれば、肺胞洗浄液においても、総
細胞、肺胞大食細胞、好中球及び自然殺害細胞が増加し（図９Ｂ）、それは、ＩＬ－６、
ＩＬ－１２及びＴＮＦ－αの増加と比例し、ＮＶＴ単独も、そのような抗炎症性サイトカインの上昇に肯定的効果を示した（図９Ｃ）。そのような先天免疫指標の増加は、ＧＣＢ（germinal center ＢＢ）細胞及びＴＦＨ（follicularhelper Ｔ cell）、並びに血清及び鼻腔洗浄液におけるＩｇＧとＩｇＡとの増加と同伴している（図９Ｄ及び図９Ｅ）。
ｉＰＲ８）に対する免疫反応
ＢａｌＢ／ｃマウスに、ＮＡ（ＮＶＴ）をｉＰＲ８と共に投与する場合、２４時間が経
た後、縦隔洞リンパ節において、ｍＤＣ細胞とｒＤＣ細胞との数が増加し、ＤＣ（ＣＤ８
０、ＣＤ８６）が活性化されていて、９６時間後、基底レベルに低下した（データは、示
されていない）。また、ｉＰＲ８と共にＮＶＴを処理すれば、肺胞洗浄液においても、総
細胞、肺胞大食細胞、好中球及び自然殺害細胞が増加し（図９Ｂ）、それは、ＩＬ－６、
ＩＬ－１２及びＴＮＦ－αの増加と比例し、ＮＶＴ単独も、そのような抗炎症性サイトカインの上昇に肯定的効果を示した（図９Ｃ）。そのような先天免疫指標の増加は、ＧＣＢ（germinal center ＢＢ）細胞及びＴＦＨ（follicularhelper Ｔ cell）、並びに血清及び鼻腔洗浄液におけるＩｇＧとＩｇＡとの増加と同伴している（図９Ｄ及び図９Ｅ）。
【0110】
前記ＮＡ アジュバント単独でも、抗原なしに致死量生ウイルス感染に対する防御効果
を有した。前記ＮＡがマウスに鼻腔に何回か投与された場合、寿命は、平均４日以上延長
され、ウイルス感染（viremia）に係わる死亡率は、約２０％低下した（データは、示さ
れていない）。また、抗原なしに、本発明の前記ＮＡアジュバント単独は、ロバストな免
疫増強作用を示した。
を有した。前記ＮＡがマウスに鼻腔に何回か投与された場合、寿命は、平均４日以上延長
され、ウイルス感染（viremia）に係わる死亡率は、約２０％低下した（データは、示さ
れていない）。また、抗原なしに、本発明の前記ＮＡアジュバント単独は、ロバストな免
疫増強作用を示した。
【実施例10】
【0111】
ｈｓＲＮＡによる商業用インフルエンザスプリットワクチン抗原低減効果
商業的ワクチン抗原において、アジュバント役割を試験した。試験されたワクチンは、
（ｉ）四不活性化インフルエンザワクチン（４ＩＩＶ，Vaxigrip，Sanofi Pasteur）、（
ii）４ＩＩＶ＋ＮＶＴ（ＮＡ）、（iii）４ＩＩＶ＋ＮＶＴII（ＮＡ＋ＳＥ）を含む。メ
スＢａｌｂ／ｃマウスに、２週間隔で、筋肉内（ｉ．ｍ．）へのプライミング及びブースティング後、ＩｇＧレベル及びヘマグルチン化阻害力価（ＨＡＩ）を、プライミング後の１８週にわたって決定した（図１０Ａ）。
商業的ワクチン抗原において、アジュバント役割を試験した。試験されたワクチンは、
（ｉ）四不活性化インフルエンザワクチン（４ＩＩＶ，Vaxigrip，Sanofi Pasteur）、（
ii）４ＩＩＶ＋ＮＶＴ（ＮＡ）、（iii）４ＩＩＶ＋ＮＶＴII（ＮＡ＋ＳＥ）を含む。メ
スＢａｌｂ／ｃマウスに、２週間隔で、筋肉内（ｉ．ｍ．）へのプライミング及びブースティング後、ＩｇＧレベル及びヘマグルチン化阻害力価（ＨＡＩ）を、プライミング後の１８週にわたって決定した（図１０Ａ）。
【0112】
その結果、抗原用量は、非アズバント抗原を単独に接種した場合と比較し、ＮＶＴアズ
バントされたグループにおいては、約１．５レベルであり、ＮＶＴIIアズバントされたグ
ループにおいては、約１／２５に低減された（図１０Ｂ）。そのような効果は、注射後、
最小１７週まで持続した（図１０Ｃ）。本発明のＮＡアジュバントは、抗原用量を節減す
ることができ、必要な免疫を確保するのに必要なワクチン抗原の量を、かなり低減させる
ことができた。
バントされたグループにおいては、約１．５レベルであり、ＮＶＴIIアズバントされたグ
ループにおいては、約１／２５に低減された（図１０Ｂ）。そのような効果は、注射後、
最小１７週まで持続した（図１０Ｃ）。本発明のＮＡアジュバントは、抗原用量を節減す
ることができ、必要な免疫を確保するのに必要なワクチン抗原の量を、かなり低減させる
ことができた。
【0113】
前記結合抗体の増加は、血球凝集阻害能（ＨＡＩ：hema agglutination inhibition）
力が４０以上増大することと密接に関連しており、それは、チャレンジまたは感染された
個体の５０％に十分な防御免疫を提供することができるような、インフルエンザウイルスに対する防御の相関関係（ＣＯＰ：correlate of protection）である。２つのアジュバントがＨＡＩ力価をかなり増大させたとしても、ＮＶＴIIは、インフルエンザＡウイルス（ＩＡＶサブタイプＨ１Ｎ１）及びインフルエンザＢウイルス（ＩＢＶ）のいずれについても、３倍ないし５倍のＨＡＩ力価を特に誘導した（図１０Ｄ）。
力が４０以上増大することと密接に関連しており、それは、チャレンジまたは感染された
個体の５０％に十分な防御免疫を提供することができるような、インフルエンザウイルスに対する防御の相関関係（ＣＯＰ：correlate of protection）である。２つのアジュバントがＨＡＩ力価をかなり増大させたとしても、ＮＶＴIIは、インフルエンザＡウイルス（ＩＡＶサブタイプＨ１Ｎ１）及びインフルエンザＢウイルス（ＩＢＶ）のいずれについても、３倍ないし５倍のＨＡＩ力価を特に誘導した（図１０Ｄ）。
【実施例11】
【0114】
【0115】
メナクトラワクチンは、脳髄膜炎球菌（Meningococcus）であるNeisseria meningitidi
sグループ（Ａ、Ｃ、Ｙ及びＷ－１３５）に対するＣＲＭ１９７接合体ワクチンである。
具体的には、ワクチン抗原は、ジフテリア毒素由来キャリア蛋白質ＣＲＭ１９７に、共有
して連結されている。本発明のＮＶＴIIアジュバントされたメナクトラは、メナクトラ特
異抗体を５倍以上強く誘導した（図１１Ｂ及び図１１Ｃ）。
sグループ（Ａ、Ｃ、Ｙ及びＷ－１３５）に対するＣＲＭ１９７接合体ワクチンである。
具体的には、ワクチン抗原は、ジフテリア毒素由来キャリア蛋白質ＣＲＭ１９７に、共有
して連結されている。本発明のＮＶＴIIアジュバントされたメナクトラは、メナクトラ特
異抗体を５倍以上強く誘導した（図１１Ｂ及び図１１Ｃ）。
【実施例12】
【0116】
ＮＶＴIIの免疫原性復元効果
インフルエンザワクチン（２０１８／２０１９ ＱＩＶ Vaxigrip）を、３７℃で５週間
処理し、免疫原性を消失させた後、ＮＶＴIIとアジュバント化させ、筋肉内（ｉ．ｍ．）
注射した。プライミング１８週まで、指定された時間点において、ＩｇＧ ELISA及びＨＡ
Ｉアッセイを行った（図１２Ａ）。
インフルエンザワクチン（２０１８／２０１９ ＱＩＶ Vaxigrip）を、３７℃で５週間
処理し、免疫原性を消失させた後、ＮＶＴIIとアジュバント化させ、筋肉内（ｉ．ｍ．）
注射した。プライミング１８週まで、指定された時間点において、ＩｇＧ ELISA及びＨＡ
Ｉアッセイを行った（図１２Ａ）。
【0117】
その結果、結合抗体が格段に増加し、免疫原性が復元されたように見えた（図１２Ｂ）
。また、最小１０倍の抗原節減効果があった。１８週目、Ｈ１Ｎ１とＩＢＶとに対するＨ
ＡＩ力価が４０以上に増大したのは、中和抗体の増加と関連がある（図１２Ｃ）。
。また、最小１０倍の抗原節減効果があった。１８週目、Ｈ１Ｎ１とＩＢＶとに対するＨ
ＡＩ力価が４０以上に増大したのは、中和抗体の増加と関連がある（図１２Ｃ）。
【0118】
他の実験において、VaxigripをＮＶＴIIと事前混合し、３７℃で５週間放置すれば、抗
原性が完全に維持され、ＨＡＩ力価も、４０以上に増大した（データは、示されていない
）。
原性が完全に維持され、ＨＡＩ力価も、４０以上に増大した（データは、示されていない
）。
【実施例13】
【0119】
ｈｓＲＮＡのインビボ黒色腫成長に対する抗腫瘍効果
７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０－ＯＶＡ黒色腫細胞を皮下移植し
た後、６日目からＮＡを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）または筋肉内に２日間隔で３回にわたって
投与した（図１３Ａ）。
７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０－ＯＶＡ黒色腫細胞を皮下移植し
た後、６日目からＮＡを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）または筋肉内に２日間隔で３回にわたって
投与した（図１３Ａ）。
【0120】
【実施例14】
【0121】
ｈｓＲＮＡのインビボ大腸癌と肺癌との成長に及ぼす阻害効果
７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＣＴ２６大腸癌とＬＬ／２肺癌とを皮下移植し
た後、２日に１回総８回にわたり、ＮＶＴ単独で、皮下、腫瘍組織内（ｉ．ｔ．）または
筋肉内（ｉ．ｍ．）に投与した。
７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＣＴ２６大腸癌とＬＬ／２肺癌とを皮下移植し
た後、２日に１回総８回にわたり、ＮＶＴ単独で、皮下、腫瘍組織内（ｉ．ｔ．）または
筋肉内（ｉ．ｍ．）に投与した。
【0122】
マウスにおいて、大腸癌と肺癌の成長は、前記ＮＡ処理によって遅延された（図１４）
。
。
【実施例15】
【0123】
ｈｓＲＮＡ単独のインビボ三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）成長と肺転移に対する阻害効果
７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに、４Ｔ１三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）細胞株を、乳
腺脂肪組織皮下移植後、８日目からＮＡ単独で、腫瘍内（ｉ．ｔ．）に、２日間隔で９回
投与した（図１５Ａ）。
７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに、４Ｔ１三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）細胞株を、乳
腺脂肪組織皮下移植後、８日目からＮＡ単独で、腫瘍内（ｉ．ｔ．）に、２日間隔で９回
投与した（図１５Ａ）。
【0124】
【実施例16】
【0125】
インビボｈｓＲＮＡ単独、またはｈｓＲＮＡ-複合体化のＴＡＡワクチンの肝臓に対す
る抗-転移
ワクチン（ｉ）ＰＢＳ，（ii）ＯＶＡ，（iii）ＮＡ，（iv）ＯＶＡ＋ＮＡを、０日に
腹膜内投与した。３日後、同一ワクチンを腹膜内投与した後、脾臓から肝臓への転移程度
を調査した（図１６Ａ）。
る抗-転移
ワクチン（ｉ）ＰＢＳ，（ii）ＯＶＡ，（iii）ＮＡ，（iv）ＯＶＡ＋ＮＡを、０日に
腹膜内投与した。３日後、同一ワクチンを腹膜内投与した後、脾臓から肝臓への転移程度
を調査した（図１６Ａ）。
【0126】
ＮＡ処理された群と、ＯＶＡ＋ＮＡ処理された群とにおいて、転移は、非処理群または
ＯＶＡ単独処理群よりもさらに低かった（図１６Ｂ及び図１６Ｃ）。１８日目、肝
臓への転移は、ＮＡ単独において、約５０％、及びＯＶＡ＋ＮＡ群において、９０％以上
ほど低かった（図１６Ｄ）。生存につき、全てのマウスは、全ての他の群において、１４
日から始まって１８日以内に死亡し、ＯＶＡ＋ＮＡ処理群において、マウスは、２４日か
ら始まって２８日以内に死亡した。
ＯＶＡ単独処理群よりもさらに低かった（図１６Ｂ及び図１６Ｃ）。１８日目、肝
臓への転移は、ＮＡ単独において、約５０％、及びＯＶＡ＋ＮＡ群において、９０％以上
ほど低かった（図１６Ｄ）。生存につき、全てのマウスは、全ての他の群において、１４
日から始まって１８日以内に死亡し、ＯＶＡ＋ＮＡ処理群において、マウスは、２４日か
ら始まって２８日以内に死亡した。
【実施例17】
【0127】
ｈＲＮＡアジュバントされたＯＸ４０抗体複合体の原発性及び遠隔性の黒色腫成長の抑
制効果
Ｂ１６Ｆ１０／ＯＶＡ黒色腫細胞を、７週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウスの左側脇腹に皮
下移植し、腫瘍を移植した後、２日間隔で、４回（６日、８日、１０日及び１２日）原発
癌組織に、癌ワクチン（ｉ）ＰＢＳ，（ii）ＰＤ－１Ａｂ，（iii）ＩＲ細胞（放射線を
照射した癌細胞），（iv）ＩＲ細胞＋ＮＡ＋ＯＸ４０Ａｂをそれぞれ投与した（図１７Ａ
）。各癌の成長は、２２日目まで測定した。
制効果
Ｂ１６Ｆ１０／ＯＶＡ黒色腫細胞を、７週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウスの左側脇腹に皮
下移植し、腫瘍を移植した後、２日間隔で、４回（６日、８日、１０日及び１２日）原発
癌組織に、癌ワクチン（ｉ）ＰＢＳ，（ii）ＰＤ－１Ａｂ，（iii）ＩＲ細胞（放射線を
照射した癌細胞），（iv）ＩＲ細胞＋ＮＡ＋ＯＸ４０Ａｂをそれぞれ投与した（図１７Ａ
）。各癌の成長は、２２日目まで測定した。
【0128】
【0129】
【0130】
１５日目、反側右側腹部に、同種（allogeneic origin）由来の２つの癌（Ｂ１６Ｆ１
０／ＯＶＡ）及びＴ細胞リンパ腫（ＥＧ７／ＯＶＡ））を第２部位に移植した。その後、
それ以上治療用ワクチンを投与せず、１６日間、癌組織の成長程度を測定した。
０／ＯＶＡ）及びＴ細胞リンパ腫（ＥＧ７／ＯＶＡ））を第２部位に移植した。その後、
それ以上治療用ワクチンを投与せず、１６日間、癌組織の成長程度を測定した。
【0131】
その結果、本発明の、ＮＡ＋ＯＸ４０Ａｂ注射された全てのマウスは、第２部位癌にお
いて、ほとんど成長しなかった。対照的に、ＮＡ＋イソタイプ抗体群の全てのマウスは１
１日前に死亡した。従って、腫瘤塊の大きさは、に表示していない（図１７Ｄ及び図１７
Ｅ）。
いて、ほとんど成長しなかった。対照的に、ＮＡ＋イソタイプ抗体群の全てのマウスは１
１日前に死亡した。従って、腫瘤塊の大きさは、に表示していない（図１７Ｄ及び図１７
Ｅ）。
【0132】
以上の結果をまとめれば、原発性黒色腫の成長は、ＩＲと係わりなく、ＮＡ＋ＯＸ４０
抗体により、９０％以上阻害された。さらに、他の部位に移植された遠隔癌は、ＮＡ＋Ｏ
Ｘ４０抗体によってまた中止された。
抗体により、９０％以上阻害された。さらに、他の部位に移植された遠隔癌は、ＮＡ＋Ｏ
Ｘ４０抗体によってまた中止された。
【実施例18】
【0133】
ｈｓＲＮＡアジュバントされたＰＤ－１抗体またはＯＸ４０抗体複合体の原発性及び遠
隔性黒色腫の阻害効果
Ｂ１６Ｆ１０／ＯＶＡ黒色腫細胞を、７週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウスの右側及び左側の
脇腹（flank）に皮下移植した後、癌ワクチン（ｉ）ＰＢＳ，（ii）ＮＡ，（iii）ＮＡ＋
ＯＸ４０抗（ＯＸ４０ Ａｂ）（clone ＯＸ－８６、Rat ＩｇＧ１、InvivoGen）及び（iv
）ＮＡ＋ＰＤ－１抗（ＰＤ－１Ａｂ）（clone ＲＭＰ１－１４、Rat ＩｇＧ２ａ／λ、In
vivoGen）を腫瘍移植した後、２日に１回ずつ４回（６日、８日、１０日及び１２日）、
左側原発性癌組織に腫瘍内投与した。左側脇腹側（ワクチン接種された腫瘍）及び右側（
遠隔腫瘍）において、癌成長を２０日まで測定した（図１８Ａ）。
隔性黒色腫の阻害効果
Ｂ１６Ｆ１０／ＯＶＡ黒色腫細胞を、７週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウスの右側及び左側の
脇腹（flank）に皮下移植した後、癌ワクチン（ｉ）ＰＢＳ，（ii）ＮＡ，（iii）ＮＡ＋
ＯＸ４０抗（ＯＸ４０ Ａｂ）（clone ＯＸ－８６、Rat ＩｇＧ１、InvivoGen）及び（iv
）ＮＡ＋ＰＤ－１抗（ＰＤ－１Ａｂ）（clone ＲＭＰ１－１４、Rat ＩｇＧ２ａ／λ、In
vivoGen）を腫瘍移植した後、２日に１回ずつ４回（６日、８日、１０日及び１２日）、
左側原発性癌組織に腫瘍内投与した。左側脇腹側（ワクチン接種された腫瘍）及び右側（
遠隔腫瘍）において、癌成長を２０日まで測定した（図１８Ａ）。
【0134】
その結果、原発性癌に対するＮＡ＋ＰＤ－１抗体の阻害効果は、ＮＡ＋ＯＸ４０ Ａｂ
のそれと類似しているか、あるいはそれよりすぐれていた。同一結果が、非ワクチン接種
の遠隔腫瘍で観察された（図１８Ｂ及び図１８Ｃ）。
のそれと類似しているか、あるいはそれよりすぐれていた。同一結果が、非ワクチン接種
の遠隔腫瘍で観察された（図１８Ｂ及び図１８Ｃ）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】