(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-05
(45)【発行日】2024-09-13
(54)【発明の名称】抗ＴＩＧＩＴ抗体およびその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240906BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240906BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240906BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240906BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240906BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240906BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20240906BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240906BHJP
A61P 33/00 20060101ALI20240906BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240906BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20240906BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
A61K39/395 U
A61P35/00
A61P37/04
A61P31/00
A61P31/04
A61P31/10
A61P31/12
A61P33/00
C12N15/13
C12P21/08
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2023569839
(86)(22)【出願日】2022-05-10
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-10
(86)【国際出願番号】 KR2022006695
(87)【国際公開番号】W WO2022240159
(87)【国際公開日】2022-11-17
【審査請求日】2023-12-26
(31)【優先権主張番号】10-2021-0060014
(32)【優先日】2021-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】523425120
【氏名又は名称】メディマブバイオ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＤＩＭＡＢＢＩＯ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】＃７２１， ５４， Ｃｈａｎｇｅｏｐ－ｒｏ， Ｓｕｊｅｏｎｇ－ｇｕ， Ｓｅｏｎｇｎａｍ－ｓｉ， Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】カン ユヒ
(72)【発明者】
【氏名】チョ ホンソク
【審査官】小田 浩代
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５１３８１７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５３２３８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３１９８２（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、
配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）、
配列番号７または８のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、
配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および
配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）
を含む、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、
（１）配列番号９の重鎖可変領域および配列番号１５の軽鎖可変領域、
（２）配列番号１０の重鎖可変領域および配列番号１６の軽鎖可変領域、
（３）配列番号１０の重鎖可変領域および配列番号１７の軽鎖可変領域、
（４）配列番号１０の重鎖可変領域および配列番号１８の軽鎖可変領域、
（５）配列番号１０の重鎖可変領域および配列番号１９の軽鎖可変領域、
（６）配列番号１０の重鎖可変領域および配列番号２０の軽鎖可変領域、
（７）配列番号１１の重鎖可変領域および配列番号１６の軽鎖可変領域、
（８）配列番号１１の重鎖可変領域および配列番号１７の軽鎖可変領域、
（９）配列番号１１の重鎖可変領域および配列番号１８の軽鎖可変領域、
（１０）配列番号１１の重鎖可変領域および配列番号１９の軽鎖可変領域、
（１１）配列番号１１の重鎖可変領域および配列番号２０の軽鎖可変領域、
（１２）配列番号１２の重鎖可変領域および配列番号１６の軽鎖可変領域、
（１３）配列番号１２の重鎖可変領域および配列番号１７の軽鎖可変領域、
（１４）配列番号１２の重鎖可変領域および配列番号１８の軽鎖可変領域、
（１５）配列番号１２の重鎖可変領域および配列番号１９の軽鎖可変領域、
（１６）配列番号１２の重鎖可変領域および配列番号２０の軽鎖可変領域、
（１７）配列番号１３の重鎖可変領域および配列番号１６の軽鎖可変領域、
（１８）配列番号１３の重鎖可変領域および配列番号１７の軽鎖可変領域、
（１９）配列番号１３の重鎖可変領域および配列番号１８の軽鎖可変領域、
（２０）配列番号１３の重鎖可変領域および配列番号１９の軽鎖可変領域、
（２１）配列番号１３の重鎖可変領域および配列番号２０の軽鎖可変領域、
（２２）配列番号１４の重鎖可変領域および配列番号１６の軽鎖可変領域、
（２３）配列番号１４の重鎖可変領域および配列番号１７の軽鎖可変領域、
（２４）配列番号１４の重鎖可変領域および配列番号１８の軽鎖可変領域、
（２５）配列番号１４の重鎖可変領域および配列番号１９の軽鎖可変領域、または
（２６）配列番号１４の重鎖可変領域および配列番号２０の軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
ＴＩＧＩＴタンパク質のアミノ酸残基５１－７０領域から選択された一つ以上のアミノ酸に結合する、請求項１に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体は、動物抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項１に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
前記抗原結合断片は、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体のｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２である、請求項１に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
請求項１～５のうちのいずれか一項に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を含む、癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項7】
前記癌は、固形癌または血液癌である、請求項６に記載の癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項8】
ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはこれら全てを標的とする薬物を追加的に含む、請求項６に記載の癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項9】
請求項１～５のうちのいずれか一項に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を含む、免疫増強用薬学組成物。
【請求項10】
ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはこれら全てを標的とする薬物を追加的に含む、請求項９に記載の免疫増強用薬学組成物。
【請求項11】
請求項１～５のうちのいずれか一項に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を含む、感染症の予防または治療用薬学組成物。
【請求項12】
前記感染症は、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫の感染、もしくは感染症によって生じる疾患である、請求項１１に記載の感染症の予防または治療用薬学組成物。
【請求項13】
ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはこれら全てを標的とする薬物を追加的に含む、請求項１１に記載の感染症の予防または治療用薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願との相互引用
本出願は２０２１年５月１０日付大韓民国特許出願第１０－２０２１－００６００１４号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。
本出願は２０２１年５月１０日付大韓民国特許出願第１０－２０２１－００６００１４号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。
【0002】
新規な抗ＴＩＧＩＴ抗体およびその免疫増強、抗癌および免疫関連疾病の予防および／または治療用途に関するものである。
【背景技術】
【0003】
癌免疫療法は体内免疫作用を用いて癌を治療する方法で、化学療法、外科療法、放射線療法に次いで癌の第４治療法と呼ばれる。癌免疫療法は、免疫系を活性化させて腫瘍細胞に対する認識および反応を増加させるメカニズムを必要とする。免疫系活性化は、抗原－特異的反応の開始に重要な抗原－提示細胞および腫瘍細胞破壊を担当するエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）細胞などのような多様な細胞の機能を伴う複雑なメカニズムである。
【0004】
前記エフェクター細胞の代表的な例として細胞毒性Ｔ細胞が挙げられる。
【0005】
一方、ＴＩＧＩＴ（Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ＩＴＩＭ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ） ｄｏｍａｉｎ）はＷＵＣＡＭ、ＶＳＩＧ９またはＶｓｔｍ３とも称され、ＮＫ、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞だけでなく調節Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ；“Ｔｒｅｇ”）でも優先的に発現される共同－抑制受容体である。ＴＩＧＩＴは、細胞内のＩＴＩＭドメイン、膜貫通ドメイン、および免疫グロブリン可変ドメインを含む膜貫通タンパク質である。
【0006】
ＴＩＧＩＴ発現は、腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｕｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＴＩＬ）および感染のような疾病環境で増加される。ＴＩＧＩＴ発現は、ＴＩＧＩＴ陰性細胞と比較して低いエフェクター機能を有するｅｘｈａｕｓｔｅｄ Ｔ細胞の標識になり得る。また、ＴＩＧＩＴを発現するＴｒｅｇ細胞は、ＴＩＧＩＴ陰性Ｔｒｅｇ集団と比較して向上した免疫抑制活性を示す。
【0007】
このような点に基づく時、ＴＩＧＩＴに対して拮抗作用を果たす薬物（例えば、拮抗性抗ＴＩＧＩＴ抗体など）は免疫系活性化を誘導し癌などの疾病状態での免疫反応を増進させて疾病治療に有利な効果を発揮することと期待される。
【発明の概要】
【0008】
ＴＩＧＩＴに結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体およびその医薬用途が提供される。
【0009】
一例は、ＴＩＧＩＴに結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0010】
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、および配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む重鎖相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ；ＣＤＲｓ）または前記重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域；および
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む軽鎖相補性決定領域または前記軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、および配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む重鎖相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ；ＣＤＲｓ）または前記重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域；および
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む軽鎖相補性決定領域または前記軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
【0011】
一具体例で、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号９、１０、１１、１２、１３、または１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
配列番号９、１０、１１、１２、１３、または１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
【0012】
他の例は、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む免疫増強剤または免疫増強用薬学組成物を提供する。
【0013】
他の例は、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む免疫関連疾病の予防および／または治療用薬学組成物を提供する。
【0014】
他の例は、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む抗がん剤または癌の予防および／または治療用薬学組成物を提供する。
【0015】
他の例は、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を免疫増強を必要とする対象に投与する段階を含む免疫増強方法を提供する。
【0016】
他の例は、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を免疫関連疾病の予防および／または治療を必要とする対象に投与する段階を含む免疫関連疾病の予防および／または治療方法を提供する。
【0017】
他の例は、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌の予防および／または治療を必要とする対象に投与する段階を含む、癌の予防および／または治療方法を提供する。
【0018】
他の例は、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の免疫増強用途または免疫増強剤製造のための用途を提供する。
【0019】
他の例は、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の免疫関連疾病の予防および／または治療のための用途または免疫関連疾病の予防および／または治療用薬物の製造のための用途を提供する。
【0020】
他の例は、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の癌の予防および／または治療のための用途または癌の予防および／または治療用薬物の製造のための用途を提供する。
【0021】
一例で、本明細書で提供される薬学組成物、方法、および用途において、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、他の免疫チェックポイントタンパク質、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはこれら全てを標的とする薬物（拮抗剤）と共に併用できる。前記併用可能な薬物は抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体、またはこれら全てであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0022】
他の例は、抗ＴＩＧＩＴ抗体重鎖相補性決定領域、重鎖可変領域または重鎖を暗号化する核酸分子を提供する。
【0023】
他の例は、抗ＴＩＧＩＴ抗体の軽鎖相補性決定領域、軽鎖可変領域または軽鎖を暗号化する核酸分子を提供する。
【0024】
他の例は、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体重鎖相補性決定領域、重鎖可変領域または重鎖を暗号化する核酸分子および抗ＴＩＧＩＴ抗体の軽鎖相補性決定領域、軽鎖可変領域または軽鎖を暗号化する核酸分子を一つのベクターに共に含むか、それぞれ別個のベクターに含む組換えベクターを提供する。前記組換えベクターは、前記核酸分子の発現のための発現ベクターであってもよい。
【0025】
他の例は、前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【0026】
他の例は、前記核酸分子を宿主細胞で発現させる段階を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の生産方法を提供する。前記核酸分子を宿主細胞で発現させる段階は、前記核酸分子またはこれを含む組換えベクターを含む細胞を培養する段階を含むものであってもよい。前記方法は、前記発現させる段階以後に培地から抗体を分離および／または精製する段階を追加的に含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体（７Ａ６）のフローサイトメトリー結果を示すグラフである。
【図2】一実施例によるキメラおよびヒト化抗体の配列のアライメントの結果を示す。
【図3a】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のエピトープマッピング結果を示す。
【図3b】ＴＩＧＩＴタンパク質の３次構造上のエピトープ位置を示す。
【図4】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のヒトｐｒｉｍａｒｙ Ｔ ｃｅｌｌでのＴＩＧＩＴに対する結合度を示すグラフである。
【図5】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のＴＩＧＩＴ－ＰＶＲ遮断効果を示すグラフである。
【図6】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のヒト末梢血液単核球（ＰＢＭＣｓ）でのサイトカイン（ＩＬ－２およびＩＦＮガンマ）生産／分泌効果を示すグラフである。
【図7a】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のＴ細胞でのサイトカイン生産／分泌効果を示すグラフであって、ＣＤ４＋ Ｔ細胞での結果を示す。
【図7b】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のＴ細胞でのサイトカイン生産／分泌効果を示すグラフであって、ＣＤ８＋ Ｔ細胞での結果を示す。
【図8a】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のＴ細胞でのサイトカイン生産／分泌効果を示すグラフであって、ＣＤ４＋ Ｔ細胞でのＩＬ－２濃度を示す。
【図8b】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のＴ細胞でのサイトカイン生産／分泌効果を示すグラフであって、ＣＤ４＋ Ｔ細胞でのＩＦＮガンマ濃度を示す。
【図8c】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のＴ細胞でのサイトカイン生産／分泌効果を示すグラフであって、ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＩＬ－２濃度を示す。
【図8d】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のＴ細胞でのサイトカイン生産／分泌効果を示すグラフであって、ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＩＦＮガンマ濃度を示す。
【図9a】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体の濃度によるＴ細胞でのサイトカイン生産／分泌効果を示すグラフであって、９ａはＣＤ４＋ Ｔ細胞でのＩＬ－２濃度を示す。
【図9b】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体の濃度によるＴ細胞でのサイトカイン生産／分泌効果を示すグラフであって、ＣＤ４＋ Ｔ細胞でのＩＦＮガンマ濃度を示す。
【図9c】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体の濃度によるＴ細胞でのサイトカイン生産／分泌効果を示すグラフであって、ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＩＬ－２濃度を示す。
【図9d】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体の濃度によるＴ細胞でのサイトカイン生産／分泌効果を示すグラフであって、ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＩＦＮガンマ濃度を示す。
【図10a】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のヒトＰＢＭＣでのＴ細胞増殖効果を示すグラフであって、ＣＦＳＥ ａｓｓａｙ結果を示す。
【図10b】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のヒトＰＢＭＣでのＴ細胞増殖効果を示すグラフであって、Ｋｉ６７ ａｓｓａｙ結果を示す。
【図11】Ｔｒｅｇ細胞存在下での一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のＴ細胞増殖効果を示すグラフである。
【図12】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗－ＰＤ１抗体の併用によるＴＩＧＩＴ－ＰＶＲ／ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１複合遮断効果を細胞ベースＮＦＡＴレポーター応答バイオアッセイで分析した結果を示すグラフである。
【図13a】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗－ＰＤ１抗体の併用によるＴＩＧＩＴ－ＰＶＲ／ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１複合遮断効果を比較抗体との併用時と比較して示すグラフであって、抗－ＰＤ１抗体としてペムブロリズマブとの併用結果である。
【図13b】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗－ＰＤ１抗体の併用によるＴＩＧＩＴ－ＰＶＲ／ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１複合遮断効果を比較抗体との併用時と比較して示すグラフであって、ニボルマブとの併用結果である。
【図14a】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体の単独または抗－ＰＤ１抗体との併用時のヒトＴ細胞のサイトカイン生産結果を示すグラフであって、ＣＤ４＋細胞での結果を示す。
【図14b】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体の単独または抗－ＰＤ１抗体との併用時のヒトＴ細胞のサイトカイン生産結果を示すグラフであって、ＣＤ８＋細胞での結果を示す。
【図15】Ａ３７５およびＳＫ－ＯＶ３腫瘍細胞株でのＴＩＧＩＴのリガンドであるＣＤ１５５の発現水準を示すグラフである。
【図16】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のＡ３７５腫瘍（黒色腫）細胞株に対する細胞毒性（細胞死滅率）を示すグラフである。
【図17a】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のＳＫＯＶ－３腫瘍（卵巣癌）細胞株に対する細胞毒性（細胞死滅率）を示すグラフである。
【図17b】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のＳＫＯＶ－３腫瘍（卵巣癌）細胞株に対する細胞毒性（細胞死滅率）を示すグラフである。
【図18】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のＳＫＯＶ－３腫瘍（卵巣癌）細胞株に対する細胞毒性（細胞死滅率）を示すグラフである。
【図19】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体をＮＫ細胞と共培養時のＳＫＯＶ－３腫瘍（卵巣癌）細胞株に対する細胞毒性（細胞死滅率）を示すグラフである。
【図20】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体の結腸癌に対する生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図21】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗－ＰＤ１抗体の併用時の結腸癌に対する生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）抗腫瘍効果を単独処理時と比較して示すグラフである。
【図22】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗－ＰＤ１抗体の併用による腫瘍微細環境（ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；ＴＭＥ）での免疫細胞に対する効果を試験した結果を示す。
【図23】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体の肝癌患者由来異種移植腫瘍に対する生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図24】腫瘍微細環境（ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；ＴＭＥ）でのＴ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔ上のＴＩＧＩＴ発現水準を示すグラフである。
【図25】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体の肝癌患者由来Ｔ細胞でのサイトカイン生産効果を示すグラフである。
【図26】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体の肺癌患者由来Ｔ細胞でのサイトカイン生産効果を示すグラフである。
【図27】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体の結腸癌患者由来Ｔ細胞でのサイトカイン生産効果を示すグラフである。
【図28a】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ－Ｆａｂ断片の中枢記憶Ｔ細胞の活性化（サイトカイン生産）を示すグラフである。
【図28b】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ－Ｆａｂ断片の効果器記憶Ｔ細胞の活性化（サイトカイン生産）を示すグラフである。
【図29】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ－Ｆａｂ断片のＡ３７５腫瘍細胞に対する細胞毒性（細胞死滅率）を示すグラフである。
【図30】Ｔ細胞サブセットでのＴＩＧＩＴ発現水準を示すグラフである。
【図31a】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体処理時のＴｒｅｇｓ、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の残存細胞数を示すグラフである。
【図31b】同上
【図31c】同上
【図31d】同上
【図32】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体処理時のＴｒｅｇｓおよびＮＫ細胞の細胞数を示すグラフである。
【図33】ＮＫ細胞存在下で一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体処理時のＴｒｅｇｓ細胞の残存細胞数を示すグラフである。
【図34a】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のＦｃｇＲＩＩＩＡ遮断有無によるＴ細胞でのサイトカイン生産効果を示すグラフである（３４ａ：ＣＤ４＋ Ｔ細胞）。
【図34b】一実施例による抗ＴＩＧＩＴ抗体のＦｃｇＲＩＩＩＡ遮断有無によるＴ細胞でのサイトカイン生産効果を示すグラフである（３４ｂ：ＣＤ８＋ Ｔ細胞）。
【発明を実施するための形態】
【0028】
本明細書で、ＴＩＧＩＴに結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片、およびこれらの医薬用途が提供される。抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片はＴＩＧＩＴの作用を封鎖して免疫を活性化（ｅ．ｇ．、エフェクターＴ細胞機能強化、Ｔｒｅｇ活性制御、サイトカイン分泌増加など）させる機能を有し、多様な免疫活性化剤および／または免疫治療剤として適用できる。
【0029】
以下、より詳しく説明する。
【0030】
抗体または抗原結合断片
一例は、ＴＩＧＩＴに結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
一例は、ＴＩＧＩＴに結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0031】
抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、
配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）、
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、
配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および
配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）
を含むものであってもよい。
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、
配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）、
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、
配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および
配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）
を含むものであってもよい。
【0032】
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）は、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【0033】
本明細書において、相補性決定領域（ＣＤＲ）はｋａｂａｔ ｓｙｓｔｅｍによるＣＤＲ定義を基準にして決定される。
【0034】
一具体例で、本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片に含むことができる６個のＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３）を下記表１に整理した。
【0035】
【表1】
【0036】
具体例で、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号３のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および
配列番号４（例えば、配列番号７または配列番号８）のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５のＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
配列番号１のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号３のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および
配列番号４（例えば、配列番号７または配列番号８）のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５のＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
【0037】
より具体的に、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号９、１０、１１、１２、１３、または１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
配列番号９、１０、１１、１２、１３、または１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
【0038】
一例で、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むものであってもよい。
【0039】
場合によって（例えば、組換え的に製作時）、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域は、Ｎ末端に適切な信号配列を追加的に含むことができる。
【0040】
本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片に含むことができる重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を下記表２に例示した。
【0041】
【表2】
【0042】
一例で、本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片はＴＩＧＩＴタンパク質、例えば、ヒトＴＩＧＩＴタンパク質（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＰ＿７７６１６０．２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ４９５Ａ１－１）のアミノ酸残基５１－７０領域（ＴＡＱＶＴＱＶＮＷＥＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮ；配列番号３１）の中から選択される一つ以上または２つ以上（例えば、連続して位置する）のアミノ酸に結合するものであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0043】
［ヒトＴＩＧＩＴタンパク質（配列番号３０）］
１ ＭＲＷＣＬＬＬＩＷＡ ＱＧＬＲＱＡＰＬＡＳ ＧＭＭＴＧＴＩＥＴＴ ＧＮＩＳＡＥＫＧＧＳ ＩＩＬＱＣＨＬＳＳＴ ＴＡＱＶＴＱＶＮＷＥ
６１ ＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮ ＡＤＬＧＷＨＩＳＰＳ ＦＫＤＲＶＡＰＧＰＧ ＬＧＬＴＬＱＳＬＴＶ ＮＤＴＧＥＹＦＣＩＹ ＨＴＹＰＤＧＴＹＴＧ
１２１ ＲＩＦＬＥＶＬＥＳＳ ＶＡＥＨＧＡＲＦＱＩ ＰＬＬＧＡＭＡＡＴＬ ＶＶＩＣＴＡＶＩＶＶ ＶＡＬＴＲＫＫＫＡＬ ＲＩＨＳＶＥＧＤＬＲ
１８１ ＲＫＳＡＧＱＥＥＷＳ ＰＳＡＰＳＰＰＧＳＣ ＶＱＡＥＡＡＰＡＧＬ ＣＧＥＱＲＧＥＤＣＡ ＥＬＨＤＹＦＮＶＬＳ ＹＲＳＬＧＮＣＳＦＦ
２４１ ＴＥＴＧ
１ ＭＲＷＣＬＬＬＩＷＡ ＱＧＬＲＱＡＰＬＡＳ ＧＭＭＴＧＴＩＥＴＴ ＧＮＩＳＡＥＫＧＧＳ ＩＩＬＱＣＨＬＳＳＴ ＴＡＱＶＴＱＶＮＷＥ
６１ ＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮ ＡＤＬＧＷＨＩＳＰＳ ＦＫＤＲＶＡＰＧＰＧ ＬＧＬＴＬＱＳＬＴＶ ＮＤＴＧＥＹＦＣＩＹ ＨＴＹＰＤＧＴＹＴＧ
１２１ ＲＩＦＬＥＶＬＥＳＳ ＶＡＥＨＧＡＲＦＱＩ ＰＬＬＧＡＭＡＡＴＬ ＶＶＩＣＴＡＶＩＶＶ ＶＡＬＴＲＫＫＫＡＬ ＲＩＨＳＶＥＧＤＬＲ
１８１ ＲＫＳＡＧＱＥＥＷＳ ＰＳＡＰＳＰＰＧＳＣ ＶＱＡＥＡＡＰＡＧＬ ＣＧＥＱＲＧＥＤＣＡ ＥＬＨＤＹＦＮＶＬＳ ＹＲＳＬＧＮＣＳＦＦ
２４１ ＴＥＴＧ
【0044】
本明細書で「抗体」とは、特定抗原に特異的に結合するタンパク質を総称するものであって、免疫系内で抗原の刺激によって作られるタンパク質またはこれを化学的合成または組換え的に製造したタンパク質であってもよく、その種類は特に制限されない。抗体は、非自然的に生成されたもの、例えば、組換え的または合成的に生成されたものであってもよい。抗体は、動物抗体（例えば、マウス抗体など）、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。
【0045】
本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片で、先に定義した重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲ部位、または重鎖可変領域および軽鎖可変領域を除いた残り部位は全てのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＭ、など）に由来したものであってもよく、例えば、全てのサブタイプの免疫グロブリンのフレームワーク部位、および／または軽鎖定常領域および／または重鎖定常領域に由来したものであってもよい。一例で、本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ抗体はヒトＩｇＧ型抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４形態の抗体であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0046】
完全な抗体（例えば、ＩｇＧ型）は２つの全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および２つの全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖と二硫化結合で連結されている。抗体の定常領域は重鎖定常領域と軽鎖定常領域に分けられ、重鎖定常領域はガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）およびエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域はカッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
【0047】
一例で、本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ抗体は重鎖定常領域としてＩｇＧの定常領域、軽鎖定常領域としてカッパ定常領域を含むことができるが、これに制限されるわけではない。
【0048】
一具体例で、ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）の定常領域は野生型であってもよい。他の具体例で、ＩｇＧの定常領域は、ヒトＩｇＧ１を基準にして、Ｓ２４０Ｄ（２４０番目アミノ酸であるＳがＤに置換される、以下、アミノ酸変異は同一の方式で表現される）、Ａ３３１Ｌ、Ｉ３３３Ｅ、Ｎ２９８Ａ、Ｓ２９９Ａ、Ｅ３３４Ａ、Ｋ３３５Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３６ＡおよびＰ３３０Ｇからなる群より選択された一つ以上の変異を含む変異型であってもよく、例えば、以下の変異を含む変異型であってもよい。
（１）Ｓ２４０Ｄ、Ａ３３１Ｌ、およびＩ３３３Ｅ；
（２）Ｎ２９８Ａ；
（３）Ｓ２９９Ａ、Ｅ３３４Ａ、およびＫ３３５Ａ；または
（４）Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３６ＡおよびＰ３３０Ｇ。
（１）Ｓ２４０Ｄ、Ａ３３１Ｌ、およびＩ３３３Ｅ；
（２）Ｎ２９８Ａ；
（３）Ｓ２９９Ａ、Ｅ３３４Ａ、およびＫ３３５Ａ；または
（４）Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３６ＡおよびＰ３３０Ｇ。
【0049】
用語、「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３とヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖およびその断片を全て含む意味として解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび定常領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびその断片を全て含む意味として解釈される。
【0050】
用語、「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」は抗体の可変部位中の抗原との結合特異性を付与する部位を意味するものであって、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖はそれぞれ３つのＣＤＲを含むことができる（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合することにおいて主な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語、「特異的に結合」または「特異的に認識」は当業者に通常公知されている意味と同一なものであって、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応を行うことを意味する。
【0051】
本明細書に記載された相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ｋａｂａｔ ｓｙｓｔｅｍによるＣＤＲ定義を基準にして決定されたものである。
【0052】
本明細書で抗体は、特別な言及がない限り、抗原結合能を保有する抗体の抗原結合断片を含むものと理解できる。
【0053】
用語、「抗原結合断片」は、抗原が結合できる部分（例えば、本明細書で定義された６つのＣＤＲ）を含む全ての形態のポリペプチドを意味する。例えば、抗体のｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２であってもよいが、これに限定されない。
【0054】
抗原結合断片のうち、Ｆａｂは軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の定常領域および重鎖の一番目定常領域（ＣＨ１）を有する構造で１つの抗原結合部位を有する。
【0055】
Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ－末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点からＦａｂと差がある。
【0056】
Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。Ｆｖは重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体断片で、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は当業界に広く公知されている。
【0057】
二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は一般にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合で連結されるかまたはＣ－末端で直ちに連結されていて二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造を成すことができる。
【0058】
抗原結合断片はタンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、完全抗体をパパインで制限切断するとＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術を通じて製作することができる。
【0059】
用語「ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）」は抗体の重鎖に含まれている領域であって、ＣＨ１およびＣＨ２領域の間に存在し、抗体内抗原結合部位の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供する機能を果たす領域を意味する。
【0060】
本明細書で提供される抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、当業界に広く知られた方法通りに製造できる。例えば、ファージディスプレイ技法を用いて製造できる。または、抗体は、通常の方法によって動物（例えば、マウス）由来のモノクローナル抗体から製造できる。
【0061】
一方、典型的なＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）フォーマットを用いてＴＩＧＩＴの受容体結合ドメインとの結合能に基づいて個別モノクローナル抗体をスクリーニングすることができる。結合体に対して分子的相互作用を検定するための競争的ＥＬＩＳＡ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ）のような機能性分析またはセルベースアッセイ（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）のような機能性分析を通じて阻害活性に対して検定することができる。その後、強い阻害活性に基づいて選択されたモノクローナル抗体メンバーに対してＴＩＧＩＴの受容体結合ドメインに対するそれぞれの親和度（Ｋｄ値）を検定することができる。
【0062】
最終選択された抗体は、抗原結合部位を除いた残り部分がヒトの免疫グロブリン抗体化された抗体だけでなく、ヒト化抗体として製造して使用することができる。ヒト化抗体の製造方法は当業界によく知られている。
【0063】
本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ抗体の抗原結合断片は抗ＴＩＧＩＴ抗体に由来し抗原（ＴＩＧＩＴ）に対する結合力を保有する断片を意味するものであって、抗ＴＩＧＩＴ抗体の６つのＣＤＲを含む任意のポリペプチド、例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－Ｃｋ（カッパ定常領域）、ｓｃＦｖ－Ｃλ（ラムダ定常領域）、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２であってもよいが、これに限定されるのではない。一例で、抗原結合断片はｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖが免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４など）のＦｃ部位と融合された融合ポリペプチド（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）または軽鎖の定常領域（例えば、カッパまたはラムダ）と融合された融合ポリペプチド（ｓｃＦｖ－ＣｋまたはｓｃＦｖ－Ｃλ）であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0064】
本明細書で、抗体（例えば、ＣＤＲ、可変領域、または重鎖／軽鎖、抗原結合断片など）が「特定アミノ酸配列を含む、または特定アミノ酸配列からなるまたは含まれる」とは、アミノ酸配列を必須的に含む場合、およびアミノ酸配列に抗体活性（例えば、抗原親和度、薬理的活性など）に有意な影響がない無意味な変異（例えば、アミノ酸残基の置換、欠失、および／または追加）が導入された場合を全て意味するものであってもよい。
【0065】
本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片はＴＩＧＩＴ（ｅ．ｇ．、ヒトＴＩＧＩＴ）に対する結合親和度（ＫＤ）が、例えば、表面プラスモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）で測定された場合を基準にして、１０ｍＭ以下、５ｍＭ以下、１ｍＭ以下、０．５ｍＭ以下、０．２ｍＭ以下、０．１ｍＭ以下、０．０５ｍＭ以下、０．０１ｍＭ以下、０．００５ｍＭ以下、または０．００１ｍＭ以下であってもよく、例えば、０．０００１ｎＭ～１０ｍＭ、０．０００５ｎＭ～１０ｍＭ、０．００１ｎＭ～１０ｍＭ、０．００５ｎＭ～１０ｍＭ、０．０１ｎＭ～１０ｍＭ、０．０５ｎＭ～１０ｍＭ、０．１ｎＭ～１０ｍＭ、０．５ｎＭ～１０ｍＭ、１ｎＭ～１０ｍＭ、０．０００１ｎＭ～５ｍＭ、０．０００５ｎＭ～５ｍＭ、０．００１ｎＭ～５ｍＭ、０．００５ｎＭ～５ｍＭ、０．０１ｎＭ～５ｍＭ、０．０５ｎＭ～５ｍＭ、０．１ｎＭ～５ｍＭ、０．５ｎＭ～５ｍＭ、１ｎＭ～５ｍＭ、０．０００１ｎＭ～１ｍＭ、０．０００５ｎＭ～１ｍＭ、０．００１ｎＭ～１ｍＭ、０．００５ｎＭ～１ｍＭ、０．０１ｎＭ～１ｍＭ、０．０５ｎＭ～１ｍＭ、０．１ｎＭ～１ｍＭ、０．５ｎＭ～１ｍＭ、１ｎＭ～１ｍＭ、０．０００１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．０００５ｎＭ～０．５ｍＭ、０．００１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．００５ｎＭ～０．５ｍＭ、０．０１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．０５ｎＭ～０．５ｍＭ、０．１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．５ｎＭ～０．５ｍＭ、１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．０００１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．０００５ｎＭ～０．２ｍＭ、０．００１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．００５ｎＭ～０．２ｍＭ、０．０１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．０５ｎＭ～０．２ｍＭ、０．１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．５ｎＭ～０．２ｍＭ、１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．０００１ｎＭ～０．１ｍＭ、０．０００５ｎＭ～０．１ｍＭ、０．００１ｎＭ～０．１ｍＭ、０．００５ｎＭ～０．１ｍＭ、０．０１ｎＭ～０．１ｍＭ、０．０５ｎＭ～０．１ｍＭ、０．１ｎＭ～０．１ｍＭ、０．５ｎＭ～０．１ｍＭ、１ｎＭ～０．１ｍＭ、０．０００１ｎＭ～０．０５ｍＭ、０．０００５ｎＭ～０．０５ｍＭ、０．００１ｎＭ～０．０５ｍＭ、０．００５ｎＭ～０．０５ｍＭ、０．０１ｎＭ～０．０５ｍＭ、０．０５ｎＭ～０．０５ｍＭ、０．１ｎＭ～０．０５ｍＭ、０．５ｎＭ～０．０５ｍＭ、１ｎＭ～０．０５ｍＭ、０．０００１ｎＭ～０．０１ｍＭ、０．０００５ｎＭ～０．０１ｍＭ、０．００１ｎＭ～０．０１ｍＭ、０．００５ｎＭ～０．０１ｍＭ、０．０１ｎＭ～０．０１ｍＭ、０．０５ｎＭ～０．０１ｍＭ、０．１ｎＭ～０．０１ｍＭ、０．５ｎＭ～０．０１ｍＭ、または１ｎＭ～０．０１ｍＭであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0066】
他の例で、先に説明した抗ＴＩＧＩＴ抗体重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、またはこれらの組み合わせ）、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、またはこれらの組み合わせ）、またはこれらの組み合わせ；または重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはこれらの組み合わせを含むポリペプチド分子が提供される。
【0067】
ポリペプチド分子は、抗体の前駆体として抗体製作に使用できるだけでなく、抗体と類似の構造を有するタンパク質骨格体（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ；例えば、ぺプチボディー、ナノボディー、など）、二重特異抗体、多重特異抗体の構成成分（例えば、ＣＤＲまたは可変領域）として含まれてもよい。
【0068】
用語「ぺプチボディー（ｐｅｐｔｉｄｅ＋ａｎｔｉｂｏｄｙ）」はペプチドと抗体のＦｃ部分などの定常部位の全部または一部が融合された融合タンパク質であって、抗体と類似の骨格と機能を有するタンパク質を意味する。ここで、先に説明した１種以上のペプチドが抗原結合部位（重鎖および／または軽鎖ＣＤＲまたは可変領域）として作用できる。
【0069】
用語「ナノボディー」は単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、抗体の単一可変ドメインをモノマー形態で含む抗体断片を意味し、完全な構造の抗体と同様に特定抗原に対して選択的に結合する特性を有する。ナノボディーの分子量は一般に約１２ｋＤａ～約１５ｋＤａ程度で、完全な抗体（二つの重鎖と二つの軽鎖を含む）の一般的な分子量（約１５０ｋＤａ～約１６０ｋＤａ）と比較して非常に小さく、場合によってはＦａｂ断片やｓｃＦｖ断片より小さい。
【0070】
用語「多重結合抗体」（二重結合抗体を含む意味である）は２つまたはそれ以上の異なる抗原を認識および／または結合するか、同一抗原の互いに異なる部位を認識および／または結合する抗体を意味するもので、多重結合抗体のうちの一つの抗原結合部位が先に説明したＴＩＧＩＴに結合するポリペプチド、抗体、または抗原結合断片を含むものであってもよい。
【0071】
本明細書に提供されるＴＩＧＩＴに結合するポリペプチド、抗体、または抗原結合断片は、有用な重合体、標識物質などからなる群より選択された１種以上と接合された接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）形態で使用できる。
【0072】
有用な重合体は、例えば、ポリペプチド、抗体、および／または抗原結合断片の体内半減期を増加させる、タンパク質以外の重合体であってもよく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａまたは４０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ）、デキストラン、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）などからなる群より選択された１種以上の親水性重合体を例示することができるが、これに制限されない。
【0073】
標識物質は、希土類キレート剤、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルアルデヒド、フルオレスカミン、１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム炎標識、オキサレートエステル標識、エクオリン標識、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識、安定な遊離ラジカルなどからなる群より選択された１種以上の蛍光または化学発光性小分子化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ）、放射性同位元素などであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0074】
医薬用途
本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片はＴＩＧＩＴの作用（例えば、ＴＩＧＩＴとそのリガンドであるＣＤ１５５（ＰＶＲ）との相互作用など）を封鎖して免疫を活性化（例えば、エフェクターＴ細胞機能強化、Ｔｒｅｇ活性制御、サイトカイン分泌増加など）させる機能を有する。したがって、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、免疫増強、免疫関連疾病の予防および／または治療、特に癌の予防および／または治療に有用に適用できる。
本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片はＴＩＧＩＴの作用（例えば、ＴＩＧＩＴとそのリガンドであるＣＤ１５５（ＰＶＲ）との相互作用など）を封鎖して免疫を活性化（例えば、エフェクターＴ細胞機能強化、Ｔｒｅｇ活性制御、サイトカイン分泌増加など）させる機能を有する。したがって、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、免疫増強、免疫関連疾病の予防および／または治療、特に癌の予防および／または治療に有用に適用できる。
【0075】
他の例は、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む免疫増強剤または免疫増強用薬学組成物を提供する。
【0076】
他の例は、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む免疫関連疾病の予防および／または治療用薬学組成物を提供する。
【0077】
他の例は、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む抗がん剤または癌の予防および／または治療用薬学組成物を提供する。
【0078】
他の例は、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を免疫増強を必要とする対象に投与する段階を含む免疫増強方法を提供する。免疫増強方法は、投与する段階以前に、免疫増強を必要とする対象を確認する段階を追加的に含むことができる。
【0079】
他の例は、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を免疫関連疾病の予防および／または治療を必要とする対象に投与する段階を含む免疫関連疾病の予防および／または治療方法を提供する。免疫関連疾病の予防および／または治療方法は、投与する段階以前に、免疫関連疾病の予防および／または治療を必要とする対象を確認する段階を追加的に含むことができる。
【0080】
他の例は、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌の予防および／または治療を必要とする対象に投与する段階を含む、癌の予防および／または治療方法を提供する。癌の予防および／または治療方法は、投与する段階以前に、癌の予防および／または治療を必要とする対象を確認する段階を追加的に含むことができる。
【0081】
他の例は、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の免疫増強用途または免疫増強剤製造のための用途を提供する。
【0082】
他の例は、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の免疫関連疾病の予防および／または治療のための用途または免疫関連疾病の予防および／または治療用薬物の製造のための用途を提供する。
【0083】
他の例は、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の癌の予防および／または治療のための用途または癌の予防および／または治療用薬物の製造のための用途を提供する。
【0084】
本明細書で提供される薬学組成物、方法、および用途において、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は他の免疫チェックポイントタンパク質、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはこれら全てを標的とする薬物（拮抗剤）と共に併用できる。具体的に、薬学組成物は抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片に加えて、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはこれら全てを標的とする薬物を追加的に含むことができる。方法は抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片に加えて、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはこれら全てを標的とする薬物を投与する段階を追加的に含むことができる。
【0085】
併用可能な薬物は抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体、またはこれら全てであってもよいが、これに制限されるわけではない。一例で、抗－ＰＤ－１抗体はペムブロリズマブ、ニボルマブなどからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0086】
本明細書で、用語「免疫増強（または免疫強化）」は抗原に対する初期免疫反応を誘導するか既存の免疫反応を増加させることを意味することができ、免疫刺激、免疫強化、免疫活性化などの用語と同等な意味として互換できる。一例で、免疫増強は免疫細胞（エフェクターＴ細胞、例えば、細胞毒性Ｔ細胞；ＣＤ３＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞など）機能強化（活性化）および／または増殖、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制および／または消去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）、免疫タンパク質（例えば、サイトカインなど）生産および／または分泌増加などからなる群より選択された一つ以上を意味することができるが、これに制限されるわけではない。
【0087】
本明細書で、用語「免疫関連疾病」は免疫系の障害および／または不充分な活性によって誘発される全ての疾病を包括するもので、例えば、癌、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患などからなる群より選択された一つ以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0088】
癌は固形癌または血液癌であってもよく、これに制限されないが、扁平上皮細胞癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌など）、腹膜癌、皮膚癌、黒色腫（例えば、皮膚または眼球内黒色腫など）、直腸癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、肝癌、胆管癌、胃癌、膵臓癌、膠芽腫、頚部癌、卵巣癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌（例えば、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌など）、子宮内膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、陰門癌、頭頸部癌、脳癌、骨肉腫などからなる群より選択された一つ以上であってもよい。
【0089】
癌の予防および／または治療効果は癌細胞を除去（死滅）する効果、癌細胞の発生および／または成長を抑制する効果、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、浸湿（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）などによる癌の悪化を抑制する効果などを含む。
【0090】
感染性疾患、自己免疫疾患、および炎症性疾患は先に説明した免疫強化（例えば、免疫細胞（エフェクターＴ細胞、例えば、細胞毒性Ｔ細胞；ＣＤ３＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞など）機能強化（活性化）および／または増殖、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制および／または消去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）、免疫タンパク質（例えば、サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮガンマなど）など）生産および／または分泌増加など）によって治療、緩和、および／または予防可能な全ての感染性疾患、自己免疫疾患、および炎症性疾患のうちから選択されたものであってもよい。例えば、感染性疾患はウイルス、細菌、真菌、寄生虫のように疾病を起こす病原体が生物体（例、人間を含む動物）内に伝播、侵入して発生する疾病を総称するもので、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫などからなる群より選択された一つ以上の病原体の感染または感染による疾病（感染症）であってもよい。自己免疫疾患はリウマチ関節炎、１型糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、ベーチェット症候群、ループス、シェーグレン症候群、重症筋無力症、強皮症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、乾癬、白斑症、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、自己免疫性腎臓炎、自己免疫性膵臓炎、自己免疫性脳炎、サイトカインストームなどからなる群より選択できるが、これに制限されるわけではない。炎症性疾患は炎症（例、慢性炎症または急性炎症）または炎症による疾病を総称するもので、例えば、心臓炎症（例、冠状動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心臓膜炎、心筋炎など）、血管炎症（例、粥状硬化症、血管炎、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、免疫性血小板減少紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、貧血など）、上気道炎症（例、急性鼻咽頭炎、アレルギー鼻炎、副鼻腔炎、咽頭炎、扁桃炎、喉頭炎など）、下気道および／または肺炎症（例、気管支炎、気管支拡張症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺炎、てんかん性肺疾患、結核など）、上部胃腸管炎症（例、胃炎、食道炎など）、下部胃腸管炎症（例、小腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック病、憩室炎、過敏性大腸症候群、虫垂炎、痔瘻など）、肝、胆道および／または膵臓炎症（例、肝炎、脂肪肝、胆管炎、胆嚢炎、膵臓炎、第１型糖尿病など）、腎臓（上部尿路）（例、腎盂腎炎、糸球体腎炎、尿路感染症など）、下部尿路炎症（例、尿路感染症、尿管炎、尿道炎、膀胱炎、前立腺炎／慢性骨盤痛症候群など）、甲状腺および／または副甲状腺炎症（例、甲状腺炎、副甲状腺炎など）、副腎炎症（例、副腎炎など）、生殖器官炎症（例、骨盤内炎症性疾患、卵巣炎、睾丸炎、副睾丸炎など）、骨および／または関節炎症（例、骨関節炎、リウマチ関節炎、骨髄炎、滑膜炎など）、皮膚炎症（例、皮膚：蜂巣炎、丹毒（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ）、癜風、水虫、にきびなど）、筋肉炎症（例、筋炎など）、脳炎症（例、脳炎、大鬱病性障害など）、神経炎症（例、目、耳など多様な部位の神経炎、複合性局所疼痛症候群、ギランバレー症候群など）、目炎症（例、麦粒腫、ぶどう膜炎、結膜炎など）、耳炎症（例、中耳炎、乳様突起炎など）、口腔炎症（例、口内炎、歯周炎、歯肉炎など）、全身性炎症（例、全身性炎症反応症候群（敗血症など）、代謝症候群関連疾患など）、腹膜炎、再かん流傷害、移植拒絶反応、過敏反応などからなる群より選択された一つ以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0091】
本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ抗体、その抗原結合断片、および／またはこれを含む薬学組成物の投与対象は全ての動物または細胞であってもよく、例えば、人間、猿などの霊長類、ラット、マウス、などの齧歯類などを含む哺乳類から選択される動物、または動物に由来する（分離された）細胞、組織、体液（例えば、血清）、またはその培養物であってもよく、例えば、人間または人間から分離された細胞、組織、体液（例えば、血清）であってもよい。
【0092】
薬学的組成物は、有効成分としての抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片に加えて、薬学的に許容可能な担体を追加的に含むことができ、担体はタンパク質薬物の製剤化に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに限定されるのではない。薬学的組成物はまた、薬学組成物製造に通常使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群より選択された１種以上を追加的に含むことができる。
【0093】
抗ＴＩＧＩＴ抗体、その抗原結合断片および／または薬学組成物の投与は、経口または非経口経路を通じて行うことができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与および直臓内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコーティングするか胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。
【0094】
また、抗ＴＩＧＩＴ抗体、その抗原結合断片および／または薬学組成物はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤、注射剤などの形態に剤形化でき、剤形化のために分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。
【0095】
薬学組成物内の有効成分である抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の含有量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方できる。薬学組成物の１日投与量は、有効成分（抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片）を基準にして０．００００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．００００１～５００ｍｇ／ｋｇ、０．００００１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．００００１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．０００１～５００ｍｇ／ｋｇ、０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．０００１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１～５００ｍｇ／ｋｇ、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～５００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．１～５００ｍｇ／ｋｇ、０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、または０．１～５０ｍｇ／ｋｇ範囲であってもよいが、これに制限されるわけではない。１日投与量は単位容量形態で一つの製剤として製剤化されるか、適切に分量して製剤化されるか、多用量容器内に入れて製造できる。また、本明細書で薬学的有効量は有効成分が目的とする薬学的活性を示すことができる有効成分の量を意味するもので、投与量範囲であってもよい。
【0096】
ポリヌクレオチド、発現ベクター、および抗体の製造
他の例は、抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖相補性決定領域、重鎖可変領域または重鎖を暗号化する核酸分子を提供する。
他の例は、抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖相補性決定領域、重鎖可変領域または重鎖を暗号化する核酸分子を提供する。
【0097】
他の例は、抗ＴＩＧＩＴ抗体の軽鎖相補性決定領域、軽鎖可変領域または軽鎖を暗号化する核酸分子を提供する。
【0098】
他の例は、抗ＴＩＧＩＴ抗体重鎖相補性決定領域、重鎖可変領域または重鎖を暗号化する核酸分子および抗ＴＩＧＩＴ抗体の軽鎖相補性決定領域、軽鎖可変領域または軽鎖を暗号化する核酸分子を一つのベクターに共に含むか、それぞれ別個のベクターに含む組換えベクターを提供する。組換えベクターは、核酸分子の発現のための発現ベクターであってもよい。
【0099】
他の例は、組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオファージベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。組換えベクターとして使用できるベクターは、当業界で時々使用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３など）またはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して製作できる。
用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオファージベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。組換えベクターとして使用できるベクターは、当業界で時々使用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３など）またはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して製作できる。
【0100】
組換えベクターで、核酸分子はプロモーターに作動可能に連結できる。用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他のヌクレオチド配列の間の機能的な結合を意味する。調節配列は、「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」されることによって他のヌクレオチド配列の転写および／または解読を調節することができる。
【0101】
組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築できる。発現用ベクターは、当業界で植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するのに使用される通常のものを使用することができる。組換えベクターは、当業界に公知された多様な方法を通じて構築できる。
【0102】
組換えベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主にして構築できる。例えば、使用されるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主にする場合には、転写を行わせることができる強力なプロモーター（例えば、ｐＬλプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位および転写／解読終結配列を含むことが一般的である。真核細胞を宿主にする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製原点はｆ１複製原点、ＳＶ４０複製原点、ｐＭＢ１複製原点、アデノ複製原点、ＡＡＶ複製原点、およびＢＢＶ複製原点などを含むが、これに限定されるのではない。また、哺乳動物細胞のゲノムに由来したプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、およびＨＳＶのｔｋプロモーター）が使用でき、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般に有する。
【0103】
組換え細胞は、組換えベクターを適切な宿主細胞に導入させることによって得られたものであってもよい。宿主細胞は組換えベクターを安定的且つ連続的にクローニングまたは発現させることができる細胞として当業界に公知されたいかなる宿主細胞も用いることができ、原核細胞としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、バチルスサブティリス、バチルスチューリンゲンシスのようなバシラス属菌株、そしてサルモネラティフィムリウム、セラチアマルセッセンス、および多様なシュードモナス種のような臓内菌と菌株などがあり、真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞、例えば、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ） Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ Ｓ、ＣＨＯ ＤＸＢ１１、ＣＨＯ ＧＳ－ＫＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ細胞株などが使用できるが、これに制限されるわけではない。
【0104】
核酸分子またはこれを含む組換えベクターの宿主細胞内への運搬（導入）は、当業界に広く知られた運搬方法を使用することができる。運搬方法は例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２方法または電気穿孔方法などを使用することができ、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポソーム－媒介形質感染法および遺伝子ボンバードメントなどを使用することができるが、これに限定しない。
【0105】
形質転換された宿主細胞を選別する方法は選択標識によって発現される表現型を用いて、当業界に広く知られた方法によって容易に実施することができる。例えば、選択標識が特定抗生剤耐性遺伝子である場合には、抗生剤が含まれている培地で形質転換体を培養することによって形質転換体を容易に選別することができる。
【0106】
他の例は、核酸分子を宿主細胞で発現させる段階を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の生産方法を提供する。核酸分子を宿主細胞で発現させる段階は、核酸分子またはこれを含む組換えベクターを含む細胞を培養する段階を含むものであってもよい。製造方法は、培養する段階以後に、任意に、培養培地から抗体または抗原結合断片を分離および／または精製する段階を追加的に含むことができる。
【0107】
本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片はＴＩＧＩＴの作用を封鎖して免疫を活性化（ｅ．ｇ．、エフェクターＴ細胞機能強化、Ｔｒｅｇ活性制御、サイトカイン分泌増加など）させる機能を有し、多様な免疫活性化剤および／または免疫治療剤として適用できる。
【0108】
以下では実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これは例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするのではない。下記の実施例は発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形できるのは当業者において自明である。
【実施例】
【0109】
実施例１：抗ＴＩＧＩＴ抗体の製作
１．１．抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の生成
５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスにＭＭＢ ｄｅｓｉｇｎｅｄ免疫原（Ａｇ１５８５＿ＩＭＭ）およびヒトＴＩＧＩＴタンパク質（ａａ２２－１３８；ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ４９５Ａ１－１）を１９日間５回連続交差注入して免疫化させた。５匹マウスからリンパ球を収集しこれを集めて精製した後、ＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させた。融合された細胞はＨＡＴ選択的一段階クローニング培地（ＨＡＴ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｅｐ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｅｄｉａ）で増殖させ、得られた１８９６個のハイブリドーマクローンを９６－ウェルプレートに移して培養した。
１．１．抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の生成
５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスにＭＭＢ ｄｅｓｉｇｎｅｄ免疫原（Ａｇ１５８５＿ＩＭＭ）およびヒトＴＩＧＩＴタンパク質（ａａ２２－１３８；ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ４９５Ａ１－１）を１９日間５回連続交差注入して免疫化させた。５匹マウスからリンパ球を収集しこれを集めて精製した後、ＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させた。融合された細胞はＨＡＴ選択的一段階クローニング培地（ＨＡＴ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｅｐ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｅｄｉａ）で増殖させ、得られた１８９６個のハイブリドーマクローンを９６－ウェルプレートに移して培養した。
【0110】
免疫原として使用されたペプチドＡｇ１５８５＿ＩＭＭは親タンパク質内の折りたたみおよび近接性に基づく関連性をよく反映するようにモデリングされたもので、免疫原性タンパク質の潜在力を最大化して全長タンパク質内の対応エピトープに対する完全な活性を有する抗体を作ることに有用であることと期待される。ペプチドＡｇ１５８５＿ＩＭＭはヒトＴＩＧＩＴの５１番目アミノ酸残基（Ｔ）から７０番目アミノ酸残基（Ｎ）までの２０個のアミノ酸を含むように合成した。ペプチドＡｇ１５８５＿ＩＭＭの情報を下記表３に要約した。
【0111】
【表3】
【0112】
上記表３は、モデリングされたＡｇ１５８５＿ＩＭＭの構造的特徴およびＴＩＧＩＴ構造（ＰＤＢ：５Ｖ５２）とアライメントした結果を示す。低いＲＭＳＤスコアはよくアライメントすることを示す。ペプチドは、対応する免疫原配列に基づいて合成した。
【0113】
間接（ｉｎｄｉｒｅｃｔ）ＥＬＩＳＡを用いて、免疫化抗原であるＡｇ１５８５＿ＩＭＭおよび組換えヒトＴＩＧＩＴ（Ｈｉｓ）（ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）に対して効果を有するハイブリドーマ組織培養液の上清液をスクリーニングした。効果を有するクローン（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ）に対してスクリーニング抗原（組換えヒトＴＩＧＩＴ Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、９４６４－ＴＧ））および細胞に対するｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡを追加的に行ってＩｇ分泌および特異性を確認した。ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１細胞株を陰性対照群として使用した。
ＥＬＩＳＡは、以下のような条件下で行った。
－ＥＬＩＳＡプレートは０．１μｇ／ウェルの組換えヒトＴＩＧＩＴ（ｒｈＴＩＧＩＴ）タンパク質をＣａｒｂｏｎａｔｅ Ｃｏａｔｉｎｇバッファー（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎに１００μＬ／ウェル濃度で含むコーティング液で４℃でコーティング。
－ＰＢＳに含まれている３％ スキムミルク粉末で１時間室温で遮断。
－ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎに含まれている二次抗体１：１００００ ヤギ抗マウス／Ｍ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ（１００ｕＬ／ウェル）を１時間処理（３７℃、振盪下）。
－全ての洗浄段階は、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３分間行う。
－ＴＭＢ基質を５０ｕＬ／ウェル濃度で添加、暗条件下に置いて（５～１０ｍｉｎｓ）、同量の１Ｍ ＨＣｌで終了させる。
ＥＬＩＳＡは、以下のような条件下で行った。
－ＥＬＩＳＡプレートは０．１μｇ／ウェルの組換えヒトＴＩＧＩＴ（ｒｈＴＩＧＩＴ）タンパク質をＣａｒｂｏｎａｔｅ Ｃｏａｔｉｎｇバッファー（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎに１００μＬ／ウェル濃度で含むコーティング液で４℃でコーティング。
－ＰＢＳに含まれている３％ スキムミルク粉末で１時間室温で遮断。
－ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎに含まれている二次抗体１：１００００ ヤギ抗マウス／Ｍ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ（１００ｕＬ／ウェル）を１時間処理（３７℃、振盪下）。
－全ての洗浄段階は、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３分間行う。
－ＴＭＢ基質を５０ｕＬ／ウェル濃度で添加、暗条件下に置いて（５～１０ｍｉｎｓ）、同量の１Ｍ ＨＣｌで終了させる。
【0114】
アイソタイピング（ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）によって、ＩｇＭ発現クローンを分離して除去し、ＩｇＧ発現クローンを収集した。
【0115】
収集された陽性クローンをサブクローニングして安定的な発現クローンを確認した。選択されたクローンを含む培養上清液をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムに流しながら溶出させ、バッファーをＰＢＳに交替した。スクリーニング抗原（組換えヒトＴＩＧＩＴ（Ｔ１０３） Ｆｃ キメラタンパク質；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）および陰性対照群抗原（Ｈｉｓペプチド）に対する間接的ＥＬＩＳＡを行って精製された抗体を試験した。
【0116】
収集された陽性クローンのうちの先導抗体として選別されたクローン（７Ａ６）の結合をフローサイトメトリーで測定した。ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）およびヒトＴＩＧＩＴ発現ＣＨＯ－Ｋ１（ＣＨＯ－Ｋ１ ＴＩＧＩＴ）（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｍ００５４２）細胞にトリプシンを処理し、計数し、２×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させ、Ｆｃ ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ５６４２２０）と共に３０分間培養した。培養後、細胞を９６ウェルに入れ、添加された抗体（１点）を段階希釈した（８点、５μｇ／ｍＬから始まって３倍ずつ希釈する）。ＣＨＯ－Ｋ１細胞（陰性対照群）の場合、ＣＨＯ－Ｋ１ ＴＩＧＩＴ細胞に対して行われた滴定での最も高濃度に相当する５μｇ／ｍＬの単一濃度で試験した。３０分培養後、抗マウス ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７抗体（Ｓｉｇｍａ Ａ２１２３６）４μｇ／ｍＬ（遮光下）を使用して抗体結合を測定した。フローサイトメトリーはＡｃｃｕｒｉＣ６ フローサイトメーターを使用して行い、データはＦｌｏｗＪｏで分析した。得られた結果を図１に示した。
【0117】
安定的発現クローンに該当するハイブリドーマ細胞ペレットを溶解させ、ｍＲＮＡを抽出し、重鎖および軽鎖の可変領域ＤＮＡをシーケンシングベクターにクローニングして重鎖および軽鎖ＤＮＡ配列を分析した。マウス抗ＴＩＧＩＴクローン（７Ａ６）の配列を分析した結果を下記の表４に記載した。
【0118】
【表4】
【0119】
１．２．マウス抗ＴＩＧＩＴクローンのヒト化
抗体構造および結合に重要なアミノ酸残基を確認するために、モノクローナル抗体可変領域（ｍＡｂ Ｖ ｒｅｇｉｏｎｓ）のタンパク質構造モデルを分析した。このような情報をヒト抗体構造の仮想（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）設計と共に使用して、７Ａ６のヒト化変異体製造に使用可能な大規模予備配列断片を選別し、ヒトＭＨＣクラスＩＩアレルに対するペプチド結合を分析した。可能な場合、ヒトＭＨＣクラスＩＩに対して有意味な非ヒト生殖細胞系列結合体（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｂｉｎｄｅｒｓ）と確認された配列断片は廃棄した。これによって断片セットが減少し、これら組み合わせを方法で再び分析して、断片の間の接合部が潜在的Ｔ細胞エピトープを含まないことを確認した。有意味なＴ細胞エピトープを含まないか減少した完全な可変領域（Ｖ ｒｅｇｉｏｎ）が生成されるように、選別された配列断片を組み立てて、潜在的Ｔ細胞エピトープ認識を回避するヒト可変領域を設計した（脱免疫化；ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）。
抗体構造および結合に重要なアミノ酸残基を確認するために、モノクローナル抗体可変領域（ｍＡｂ Ｖ ｒｅｇｉｏｎｓ）のタンパク質構造モデルを分析した。このような情報をヒト抗体構造の仮想（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）設計と共に使用して、７Ａ６のヒト化変異体製造に使用可能な大規模予備配列断片を選別し、ヒトＭＨＣクラスＩＩアレルに対するペプチド結合を分析した。可能な場合、ヒトＭＨＣクラスＩＩに対して有意味な非ヒト生殖細胞系列結合体（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｂｉｎｄｅｒｓ）と確認された配列断片は廃棄した。これによって断片セットが減少し、これら組み合わせを方法で再び分析して、断片の間の接合部が潜在的Ｔ細胞エピトープを含まないことを確認した。有意味なＴ細胞エピトープを含まないか減少した完全な可変領域（Ｖ ｒｅｇｉｏｎ）が生成されるように、選別された配列断片を組み立てて、潜在的Ｔ細胞エピトープ認識を回避するヒト可変領域を設計した（脱免疫化；ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）。
【0120】
遺伝子合成および哺乳類細胞での発現に使用するために、５個重鎖（ＶＨ１～ＶＨ５）および５個軽鎖（Ｖκ１～Ｖκ５）配列を選択した。
【0121】
一つのキメラ（ＶＨ０／Ｖκ０）および２５個ヒト化変異体を含む一過性形質導入によって生産された安定したＩｇＧ抗体（‘○’表示）を下記の表５に要約した。
【0122】
【表5】
【0123】
表４の組み合わせの７Ａ６クローンに表５の組み合わせを適用したキメラ抗体（ＶＨ０ｘＶκ０）およびヒト化抗体の配列を表６、表７、および図２に示した。表６、表７、および図２で、Ｋａｂａｔ定義によってアミノ酸配列ナンバリングおよびＣＤＲ部位を決定し、図２にのように決定されたＣＤＲおよび親配列（ＶＨ０またはＶκ０）で変更されたアミノ酸残基を陰影で表示した。
【0124】
【表6】
【0125】
【表7】
【0126】
製作された抗体中で、７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５ ｈＩｇＧ１抗体の重鎖のＦｃ領域に以下の点変異を導入してＦｃ組換え変異体を製作した。
（１）Ｓ２４０Ｄ、Ａ３３１Ｌ、およびＩ３３３Ｅ（ＤＬＥ変異）：７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＤＬＥ；
（２）Ｎ２９８Ａ：７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５ Ｎ２９８Ａ；
（３）Ｓ２９９Ａ、Ｅ３３３４ＡおよびＫ３３５Ａ（ＡＡＡ変異）：７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５ ＡＡＡ；または
（４）Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３６ＡおよびＰ３３０Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ変異）：７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５ ＬＡＬＡＰＧ
（１）Ｓ２４０Ｄ、Ａ３３１Ｌ、およびＩ３３３Ｅ（ＤＬＥ変異）：７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＤＬＥ；
（２）Ｎ２９８Ａ：７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５ Ｎ２９８Ａ；
（３）Ｓ２９９Ａ、Ｅ３３３４ＡおよびＫ３３５Ａ（ＡＡＡ変異）：７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５ ＡＡＡ；または
（４）Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３６ＡおよびＰ３３０Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ変異）：７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５ ＬＡＬＡＰＧ
【0127】
Ｆｃ組換え変異体を含む抗体の重鎖および軽鎖配列を表８に記載した。
【0128】
【表8-1】
【0129】
【表8-2】
【0130】
１．３．キメラおよびヒト化ＩｇＧ１抗体の一過性発現（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
ＶＨ０／Ｖκ０キメラ抗体コーディングＤＮＡおよびヒト化重鎖および軽鎖コーディングＤＮＡの組み合わせ（総２５個ヒト化ペアリング）を６－ウェルプレートでＰＥＩトランスフェクション方法でＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ接着細胞（ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）に一過性トランスフェクションさせた後、７日間培養した。サンプルを収集し、ヒトＩｇＧ１抗体を基準にして、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用してＯｃｔｅｔ ＱＫ３８４上で抗体濃度を測定した。
ＶＨ０／Ｖκ０キメラ抗体コーディングＤＮＡおよびヒト化重鎖および軽鎖コーディングＤＮＡの組み合わせ（総２５個ヒト化ペアリング）を６－ウェルプレートでＰＥＩトランスフェクション方法でＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ接着細胞（ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）に一過性トランスフェクションさせた後、７日間培養した。サンプルを収集し、ヒトＩｇＧ１抗体を基準にして、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用してＯｃｔｅｔ ＱＫ３８４上で抗体濃度を測定した。
【0131】
得られた結果を下記の表９に示した：
【0132】
【表9】
【0133】
上記表９は、キメラ抗体（ＶＨ０／Ｖκ０）および多様な組み合わせのヒト化抗体のＨＥＫ細胞での発現後の上澄み液内のＩｇＧ濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。
【0134】
表９に示されているように、試験された全ての抗体がよく発現し、特にＶＨ５Ｖκ１およびＶＨ５Ｖκ５を除いた全てのヒト化変異体はＶＨ０／Ｖｋ０キメラ抗体よりよく発現した。
【0135】
１．４．キメラおよびヒト化変異体のシングルサイクルカイネティクス分析
ヒトＴＩＧＩＴ抗原に対する全ての変異体の結合を評価しキメラ抗体（ＶＨ０Ｖκ０）に最も近い親和力を有する先導ヒト化ＩｇＧ抗体を選択するために、形質感染した細胞の培養物の上澄み液上でシングルサイクルカイネティクス分析（ｃａｒｔｏｏｎ）を行った。動力学試験は、２５℃でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ２．０．１およびＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．０を実行するＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して行った。
ヒトＴＩＧＩＴ抗原に対する全ての変異体の結合を評価しキメラ抗体（ＶＨ０Ｖκ０）に最も近い親和力を有する先導ヒト化ＩｇＧ抗体を選択するために、形質感染した細胞の培養物の上澄み液上でシングルサイクルカイネティクス分析（ｃａｒｔｏｏｎ）を行った。動力学試験は、２５℃でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ２．０．１およびＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．０を実行するＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して行った。
【0136】
参照表面に対する非特異的結合を減少させるために、１％ ＢＳＡ ｗ／ｖ（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）が補充されたＨＢＳ－Ｐ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）をランニングバッファーとして使用し、リガンドと分析物の希釈にも使用した。ＩｇＧを含む上澄み液をランニングバッファーで１μｇ／ｍＬまで希釈した。各サイクルの開始時に、抗体を抗ヒトセンサチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）上のＦｃ２、Ｆｃ３およびＦｃ４にローディングした。ＩｇＧ抗体を１０μｌ／ｍｉｎ流速でキャプチャーして固定化水準（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ；ＲＬ）が～２０８ＲＵになるようにした。その後、表面が安定化されるように置いた。
【0137】
潜在的質量伝達効果（ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｆｆｅｃｔｓ）を最少化するために４０μｌ／ｍｉｎ流速で注入された組換えヒトＴＩＧＩＴ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を分析物（ａｎａｌｙｔｅ）として使用してシングルサイクルカイネティクスデータを得た。抗原はランニングバッファーに１．２５ｎＭ～１０ｎＭ濃度範囲で２倍ずつ希釈（４つ地点）し、各濃度の間に再生しないようにして使用した。抗原濃度が増加する４個地点のそれぞれの注入に対して２１０秒間のａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅｓをモニタリングし、最後の抗原注入以後、９００秒間のｓｉｎｇｌｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅを測定した。３Ｍ ＭｇＣｌ２の単一注入によってセンサーチップ表面を再生させた。
【0138】
二重参照センサグラムをＬａｎｇｍｕｉｒ（１：１）結合モデルと共に装着し、この時、モデルに対するデータの適合性は実験的に得られた曲線およびフィット曲線（ｆｉｔｔｅｄ ｃｕｒｖｅ；観察および予想）間偏差を説明するＣｈｉ自乗値（Ｃｈｉ ｓｑｕａｒｅ ｖａｌｕｅ）を使用して評価した。フィッティングアルゴリズムはＣｈｉ自乗値を最少化しようとする。１：１モデルフィット曲線から決定された運動定数を表１０に示した。
【0139】
【表10】
【0140】
表１０は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用して測定されたヒトＴＩＧＩＴ抗原に結合するキメラ抗体（ＶＨ０／Ｖκ０）およびヒト化変異体（細胞培養上澄み液で試験）のシングルサイクルカイネティクスのパラメーターを示す。相対ＫＤはヒト化変異体のＫＤを同一実験で分析されたＶＨ０／Ｖκ０キメラ抗体のＫＤで割って計算した。
【0141】
表１０に示されているように、試験された全てのヒト化変異体（抗体）のヒトＴＩＧＩＴに対する結合と関連したＫＤ値はＶＨ０／Ｖｋ０と比較して２．５５倍以内に高く示された。相対的発現水準、ヒト化のパーセンテージ、および相対ＫＤ値（上澄み液に対するＢｉａｃｏｒｅのシングルサイクルカイネティクス分析で得られる）を考慮して、６個ヒト化変異体（ＶＨ２／Ｖκ５、ＶＨ３／Ｖκ４、ＶＨ３／Ｖκ５、ＶＨ４／Ｖκ４、ＶＨ４／Ｖκ５およびＶＨ５／Ｖκ５）を選択して以後熱安定性分析に使用した。
【0142】
１．５．熱安定性評価（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）
本来状態から変性状態にアンフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）される温度から抗体の熱安定性情報を得るために、温度勾配安定性試験（Ｔｈｅｒｍａｌ ｒａｍｐ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）（ＴｍおよびＴａｇｇ）を行った。このようなアンフォールディング過程は狭い温度範囲で発生し、このような転移の中間地点を‘溶融温度’または‘Ｔｍ’という。この時、タンパク質が形態的変化を経るので、Ｓｙｐｒｏ Ｒａｎｇｅ（タンパク質の露出された疎水性領域に結合する）の蛍光を測定して、タンパク質の溶融温度を決定した。
本来状態から変性状態にアンフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）される温度から抗体の熱安定性情報を得るために、温度勾配安定性試験（Ｔｈｅｒｍａｌ ｒａｍｐ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）（ＴｍおよびＴａｇｇ）を行った。このようなアンフォールディング過程は狭い温度範囲で発生し、このような転移の中間地点を‘溶融温度’または‘Ｔｍ’という。この時、タンパク質が形態的変化を経るので、Ｓｙｐｒｏ Ｒａｎｇｅ（タンパク質の露出された疎水性領域に結合する）の蛍光を測定して、タンパク質の溶融温度を決定した。
【0143】
サンプルをＰＢＳで最終試験濃度である０．５ｍｇ／ｍｌまで希釈し、ＳｙｐｒｏＴＭ Ｏｒａｎｇｅ（１６０ｘストック溶液；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２０ｘ溶液の最終濃度で添加した。各サンプル混合物は９μＬずつＵＮｉマイクロキュベットに二回ずつローディングした。サンプルに対して１５～９５℃の温度勾配を実施した（勾配速度が０．３℃／分、励起が４７３ｎｍ）。２５０～７２０ｎｍで全体放出スペクトルを測定し、５１０－６８０ｎｍの間の曲線下面積を使用して転移曲線の変曲点（ＴｏｎｓｅｔおよびＴｍ）を計算した。４７３ｎｍで静的光散乱法（ＳＬＳ）をモニタリングしてタンパク質凝集を検出し、Ｔａｇｇ（凝集開始）は結果ＳＬＳプロファイルから計算した。データ分析はＵＮｃｌｅＴＭ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０（ＡＢＺＥＮＡ）を使用して行った。
【0144】
得られた結果を下記の表１１に示した：
【0145】
【表11】
【0146】
上記表１１は、ＵＮｃｌｅ ｂｉｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｐｌａｔｆｏｒｍを使用して得られた熱安定性数値を示す。表１１に示されているように、試験された全てのヒト化抗体はキメラ抗体と類似の水準の熱安定性を示した。
【0147】
１．６．マルチサイクル動力学的解析を用いたヒト化変異体の親和度測定
キメラ抗体と６個先導ヒト化変異体（ＶＨ２／Ｖκ５、ＶＨ３／Ｖκ４、ＶＨ３／Ｖκ５、ＶＨ４／Ｖκ４、ＶＨ４／Ｖκ５およびＶＨ５／Ｖκ５）のヒトＴＩＧＩＴ抗原に対する結合親和度を測定するために、精製されたタンパク質（抗体）に対するマルチサイクル動力学的解析（ｍｕｌｔｉ－ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。動力学的実験は、２５℃でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ２．０．１およびＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．０を実行するＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して行った。
キメラ抗体と６個先導ヒト化変異体（ＶＨ２／Ｖκ５、ＶＨ３／Ｖκ４、ＶＨ３／Ｖκ５、ＶＨ４／Ｖκ４、ＶＨ４／Ｖκ５およびＶＨ５／Ｖκ５）のヒトＴＩＧＩＴ抗原に対する結合親和度を測定するために、精製されたタンパク質（抗体）に対するマルチサイクル動力学的解析（ｍｕｌｔｉ－ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。動力学的実験は、２５℃でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ２．０．１およびＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．０を実行するＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して行った。
【0148】
１％ ＢＳＡ ｗ／ｖ（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）が補充されたＨＢＳ－Ｐ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）をランニングバッファーとして使用し、リガンドと分析物の希釈にも使用した。精製された先導抗体をランニングバッファーで１μｇ／ｍＬまで希釈し、各サイクルの開始時に、抗ヒト ＩｇＧ ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）上のＦｃ２、Ｆｃ３およびＦｃ４にローディングした。抗体を１０μｌ／分の流速でキャプチャーして固定化水準（ＲＬ）が約１５０ＲＵになるようにした。その後、表面が安定化されるように置いた。
【0149】
潜在的物質移動効果を最少化するために５０μｌ／ｍｉｎ流速で注入された組換えヒトＴＩＧＩＴ（ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｈｉｎａ）を分析物として使用してマルチサイクル動力学的データを得た。抗原（ＴＩＧＩＴ）はランニングバッファーに０．４０６ｎＭ～３０ｎＭ濃度範囲で２倍ずつ希釈（７個地点）した。各濃度の間に再生がないようにして使用した。各濃度で、２４０秒間の会合相をモニタリングし、９００秒間の解離相を測定した。３Ｍ ＭｇＣｌ２を２回注入してサイクルの間にセンサーチップ表面再生を行った。動力学的サイクルにわたって表面と分析物全ての安定性を確認するために、ブランクの多回反復および単一濃度の分析物の反復を動力学的ランにプログラミングした。
【0150】
得られた結果のうちのキメラ抗体（ＶＨ０／Ｖκ０）とＶＨ３／Ｖκ５抗体に対する結果を代表として表１２に示した。
【0151】
【表12】
【0152】
上記表１２は、１：１モデルmodel fitted curveｓから決定されたｋｉｎｅｔｉｃ ｃｏｎｓｔａｎｔｓを示す。表１２に示されているように、ヒトＴＩＧＩＴタンパク質に対する結合親和度（ＫＤ）は、抗体７Ａ６ ＶＨ０／Ｖκ０の場合、７７ｐＭであり、抗体ＶＨ３／Ｖκ５の場合、８６．７ｐＭで、互いに類似の水準を示した。
【0153】
１．７．エピトープマッピング
ペプチド質量フィンガープリント（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｓｓ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）およびＨ／Ｄ交換（ｈｙｄｒｏｇｅｎ／ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ）を通じて抗体のエピトープを確認した。
ペプチド質量フィンガープリント（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｓｓ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）およびＨ／Ｄ交換（ｈｙｄｒｏｇｅｎ／ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ）を通じて抗体のエピトープを確認した。
【0154】
ＴＩＧＩＴおよびＴＩＧＩＴと抗体７Ａ６ Ｖｈ３／Ｖｋ５の混合物で重水素原子の導入（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を検出するために、サンプルのペプチド質量フィンガープリント（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｓｓ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ；ＰＭＦ）を最適化した。タンパク質分解およびクロマトグラフィー中に発生できる重水素原子の逆交換を制限するためのクエンチ（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）条件下でタンパク質サンプルのペプシンタンパク質分解を行った。
【0155】
ＴＩＧＩＴ（配列番号３０；ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＰ＿７７６１６０．２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ４９５Ａ１－１）（１５μＭ、１５０μｌ）溶液およびＴＩＧＩＴとＶｈ３Ｖｋ５の混合物ＴＩＧＩＴ：Ｖｈ３Ｖｋ５＝（１５μＭ：３０μＭ、１５０μｌ）を準備した。タンパク質サンプル４μｌを、交換実験用として標識バッファー（５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４；５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、Ｄ２Ｏ ｐＨ６．６）５６μｌと混合し、対照実験用として平衡化バッファー（５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４；５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）５６μｌと混合した。１５Ｘ希釈された溶液（６０μｌ、ＴＩＧＩＴ：Ｖｈ３Ｖｋ５；１μＭ：２μＭ）を１５秒、６０秒、１８０秒、６００秒、１８００秒、および７２００秒間培養し、クエンチ溶液（５０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４；５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４；ＧｕＣｌ ２．０Ｍ、ＴＣＥＰ ２００ｍＭ、ｐＨ２．３、０℃）５０μｌをタンパク質サンプルに２０秒培養時間添加した。培養後、クエンチングしたタンパク質溶液８０μｌを１５℃で５分間タンパク質分解性ペプシンカラムに直ちに注入した。タンパク質分解後、ＭＳｅ Ｘｅｖｏ－Ｇ２－ＸＳ分析前に、Ｃ１８クロマトグラフィー（ＨＤＸ Ｍａｎａｇｅｒ Ｗａｔｅｒｓ）を使用して生成されたペプシンペプチドを液体クロマトグラフィーで分析した。これら試験は３回繰り返して行った。
【0156】
ＤｙｎａｍＸ３．０ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してＨ／Ｄ交換ペプチドを分析した。重水素水準は高い信頼度および中間信頼度の全ての結果の平均を考慮して決定した。重水素化（ｄｅｕｔｅｒａｔｉｏｎ）水準は実験的同位元素クラスタの重心に基づいて計算した。
【0157】
ＨＤＸ－ＭＳ分析結果で、ＴＩＧＩＴタンパク質を７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５と共にまたは単独で培養時のＴＩＧＩＴ内の重水素導入間相当な差が確認された。重水素導入における主要差は７Ａ６ Ｖｈ３Ｖｋ５のエピトープ領域であるアミノ酸残基５１－７０（ＴＡＱＶＴＱＶＮＷＥＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮ；配列番号３１）で観察された。
【0158】
結果を図３ａおよび図３ｂに示した。図３ａは得られたＨＤＸ－ＭＳ分析結果を示し（ＴＩＧＩＴの５１－７０（ＴＡＱＶＴＱＶＮＷＥＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮ；配列番号３１）部位の重水素導入水準が高く示された）、図３ｂはＴＩＧＩＴリボン構造を模式的に示すもので、上側は平面図（ｔｏｐｖｉｅｗ）、下側は側面図であり、エピトープ部位は矢印で表示されている。
【0159】
１．８．一過性抗体発現および先導ヒト化抗体の精製
７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５重鎖および軽鎖可変領域配列をクローニングベクター構築用側面制限酵素部位と共に合成した。合成配列の重鎖および軽鎖を適切な制限酵素（重鎖：Ｍｌｕ Ｉ ａｎｄ Ｓａｌ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；軽鎖：ＢｓｓＨ ＩＩ ａｎｄ ＢａｍＨ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））で処理し、同一の制限酵素で処理されたヒトのＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクターにライゲーションさせた。重鎖および軽鎖ｃＤＮＡ構造体の全てシーケンシングした。ＣＨＯ細胞で一過性形質導入のためのＤＮＡを準備するためにＧｉｇａ ｐｒｅｐを行った。Ｇｉｇａ ｐｒｅｐはＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭ ＨｉＰｕｒｅ Ｅｘｐｉ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ２１０００９ＸＰ）を使用して行い、Ｇｉｇａｐｒｅｐ ＫｉｔはプラスミドＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉで増幅させた後、アニオン交換クロマトグラフィーを用いて精製するキットである。動物成分含まないおよび血清含まない培地（ＣＤ ＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用してＣＨＯ細胞（Ｅｖｉｔｒｉａ）を培養し、生産された抗体をＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭＳｕＲｅＴＭを使用してＰｒｏｔｅｉｎ Ａ精製法で培養上澄み液から精製した。ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）精製を連続的に実施して９５％以上の純度を達成した。精製された抗体は２８０ｎｍでの吸光度測定およびＳＤＳ－ＰＡＧＥで特性確認した。
７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５重鎖および軽鎖可変領域配列をクローニングベクター構築用側面制限酵素部位と共に合成した。合成配列の重鎖および軽鎖を適切な制限酵素（重鎖：Ｍｌｕ Ｉ ａｎｄ Ｓａｌ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；軽鎖：ＢｓｓＨ ＩＩ ａｎｄ ＢａｍＨ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））で処理し、同一の制限酵素で処理されたヒトのＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクターにライゲーションさせた。重鎖および軽鎖ｃＤＮＡ構造体の全てシーケンシングした。ＣＨＯ細胞で一過性形質導入のためのＤＮＡを準備するためにＧｉｇａ ｐｒｅｐを行った。Ｇｉｇａ ｐｒｅｐはＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭ ＨｉＰｕｒｅ Ｅｘｐｉ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ２１０００９ＸＰ）を使用して行い、Ｇｉｇａｐｒｅｐ ＫｉｔはプラスミドＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉで増幅させた後、アニオン交換クロマトグラフィーを用いて精製するキットである。動物成分含まないおよび血清含まない培地（ＣＤ ＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用してＣＨＯ細胞（Ｅｖｉｔｒｉａ）を培養し、生産された抗体をＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭＳｕＲｅＴＭを使用してＰｒｏｔｅｉｎ Ａ精製法で培養上澄み液から精製した。ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）精製を連続的に実施して９５％以上の純度を達成した。精製された抗体は２８０ｎｍでの吸光度測定およびＳＤＳ－ＰＡＧＥで特性確認した。
【0160】
１．９．ヒト初代Ｔ細胞でのＴＩＧＩＴに対する特異性および結合度
ＡＰＥＸＴＭ抗体標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者指針によって、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＡＦ４８８）と接合させた。磁性ビード（ＥａｓｙＳｅｐＴＭ）を使用してヒトＰＢＭＣｓからＴ細胞を分離し、多様な濃度の標識された抗ＴＩＧＩＴ抗体（抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体；５０、２５０、７５０、１２５０および２５００ｎｇ／ｍｌ）と共に培養した。結合はフローサイトメトリー器（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で測定し、得られたデータはＦｌｏｗｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ｉｎｃ）を使用して分析した。抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合をＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞上で確認した。
ＡＰＥＸＴＭ抗体標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者指針によって、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＡＦ４８８）と接合させた。磁性ビード（ＥａｓｙＳｅｐＴＭ）を使用してヒトＰＢＭＣｓからＴ細胞を分離し、多様な濃度の標識された抗ＴＩＧＩＴ抗体（抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体；５０、２５０、７５０、１２５０および２５００ｎｇ／ｍｌ）と共に培養した。結合はフローサイトメトリー器（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で測定し、得られたデータはＦｌｏｗｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ｉｎｃ）を使用して分析した。抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合をＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞上で確認した。
【0161】
得られた結果を図４に示した。図４に示されているように、試験された抗ＴＩＧＩＴ抗体はｐｒｉｍａｒｙ Ｔ ｃｅｌｌに結合し、（細胞当たりの）ＴＩＧＩＴ分子に対する結合は抗ＴＩＧＩＴ抗体濃度が増加するほど増加した。
【0162】
参照例： 参照抗体（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の準備
下記実施例に比較のために使用された参照抗体（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）をそれぞれ対応する特許に記載された配列情報に基づいて作製するか製造会社から入手した。各抗体の対応特許または製造会社を以下に要約した。
２２Ｇ２（ＢＭＳ）：ＵＳ２０１６／０１７６９６３ Ａ１、
３１Ｃ６（Ｍｅｒｃｋ）：ＷＯ２０１６／０２８６５６ Ａ１、
４．１Ｄ３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）：ＷＯ２０１７／０５３７４８ Ａ２、
ＴＩＧ１（Ａｒｃｕｓ）：ＷＯ２０１７／１５２０８８ Ａ１、
３１３Ｍ３２（Ｍｅｒｅｏ）：ＵＳ２０１６／０３７６３６５ Ａ１、
チラゴルマブ（Ｒｏｃｈｅ）：ＣｒｏｗｎＢｉｏから入手、
１０Ａ７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）：Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓから入手、
ＭＢＳＡ４３：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手、
ペムブロリズマブおよびニボルマブ：ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手。
下記実施例に比較のために使用された参照抗体（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）をそれぞれ対応する特許に記載された配列情報に基づいて作製するか製造会社から入手した。各抗体の対応特許または製造会社を以下に要約した。
２２Ｇ２（ＢＭＳ）：ＵＳ２０１６／０１７６９６３ Ａ１、
３１Ｃ６（Ｍｅｒｃｋ）：ＷＯ２０１６／０２８６５６ Ａ１、
４．１Ｄ３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）：ＷＯ２０１７／０５３７４８ Ａ２、
ＴＩＧ１（Ａｒｃｕｓ）：ＷＯ２０１７／１５２０８８ Ａ１、
３１３Ｍ３２（Ｍｅｒｅｏ）：ＵＳ２０１６／０３７６３６５ Ａ１、
チラゴルマブ（Ｒｏｃｈｅ）：ＣｒｏｗｎＢｉｏから入手、
１０Ａ７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）：Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓから入手、
ＭＢＳＡ４３：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手、
ペムブロリズマブおよびニボルマブ：ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手。
【0163】
実施例２．抗ＴＩＧＩＴ抗体の細胞ベースのレポーターアッセイによる生物学的活性測定
抗ＴＩＧＩＴ抗体のＴＩＧＩＴとそのレセプターであるポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）との相互作用に対する遮断効果（ＴＩＧＩＴ－ＰＶＲ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）を細胞ベースのＮＦＡＴレポーター応答バイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で分析した。ＴＩＧＩＴエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞アッセイバッファー（９０％ ＲＰＭＩ １６４０／１０％ ＦＢＳ）に添加し、ＴＩＧＩＴエフェクター細胞を含む細胞懸濁液を３７℃で１６時間培養した。抗ＴＩＧＩＴ抗体（７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５）または比較抗体をＰＢＳバッファーに準備し、予め－培養された細胞懸濁液に添加した。ＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞と抗体含有混合物に添加し、３７℃で６時間培養した。ＰｒｏｍｅｇａＴＭ ＧｌｏＭａｘ（登録商標）プレートリーダーで発光程度を測定した。曲線フィッテイング用のソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して抗体反応のＥＣ５０値を測定した。
抗ＴＩＧＩＴ抗体のＴＩＧＩＴとそのレセプターであるポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）との相互作用に対する遮断効果（ＴＩＧＩＴ－ＰＶＲ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）を細胞ベースのＮＦＡＴレポーター応答バイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で分析した。ＴＩＧＩＴエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞アッセイバッファー（９０％ ＲＰＭＩ １６４０／１０％ ＦＢＳ）に添加し、ＴＩＧＩＴエフェクター細胞を含む細胞懸濁液を３７℃で１６時間培養した。抗ＴＩＧＩＴ抗体（７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５）または比較抗体をＰＢＳバッファーに準備し、予め－培養された細胞懸濁液に添加した。ＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞と抗体含有混合物に添加し、３７℃で６時間培養した。ＰｒｏｍｅｇａＴＭ ＧｌｏＭａｘ（登録商標）プレートリーダーで発光程度を測定した。曲線フィッテイング用のソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して抗体反応のＥＣ５０値を測定した。
【0164】
得られた結果を図５に示した。図５に示されているように、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５抗体のＴＩＧＩＴ－ＰＶＲ遮断によってＴ細胞活性化信号が増加した。本願の抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５抗体は、ＢＭＳ（２２Ｇ２）、Ａｒｃｕｓ（ＴＩＧ１）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（４．１Ｄ３）、およびＭｅｒｅｏ（３１３Ｍ３２）のような比較抗体と比較して非常に高い効果（非常に低いＥＣ５０数値）を示した。
【0165】
実施例３：抗ＴＩＧＩＴ抗体のサイトカイン生産効果
３．１．ヒトＰＢＭＣおよび腫瘍浸潤リンパ球の準備
末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）は成人（全血白血球コーン、ＮＨＳ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、ＵＫ）から得るか、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＨＣＣ）患者および健康な正常供与者に対して“Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｌｉｖｅｒ ａｎｄ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＵＫ”の適切な倫理検討および事前同意後、本実施例の試験を行った。ＨＣＣ患者から得られた肝組織からＰＢＭＣと肝由来リンパ球を準備した。０．５～１ｃｍの肝臓針生検から肝浸潤リンパ球（Ｌｉｖｅｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）を分離した。その後、組織をＤｏｕｎｃｅ組織粉砕機を使用してダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＧＩＢＣＯ）２～３ｍｌ内で均質化させた。黒色腫、卵巣癌、ＣＲＣ（大腸癌）、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、膵臓癌患者のＰＢＭＣをＣｕｒｅｌｉｎｅ，Ｉｎｃ．から入手した。のように得られた癌患者の肝浸潤リンパ球とＰＢＭＣに対して以下の分析を行った。
３．１．ヒトＰＢＭＣおよび腫瘍浸潤リンパ球の準備
末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）は成人（全血白血球コーン、ＮＨＳ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、ＵＫ）から得るか、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＨＣＣ）患者および健康な正常供与者に対して“Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｌｉｖｅｒ ａｎｄ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＵＫ”の適切な倫理検討および事前同意後、本実施例の試験を行った。ＨＣＣ患者から得られた肝組織からＰＢＭＣと肝由来リンパ球を準備した。０．５～１ｃｍの肝臓針生検から肝浸潤リンパ球（Ｌｉｖｅｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）を分離した。その後、組織をＤｏｕｎｃｅ組織粉砕機を使用してダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＧＩＢＣＯ）２～３ｍｌ内で均質化させた。黒色腫、卵巣癌、ＣＲＣ（大腸癌）、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、膵臓癌患者のＰＢＭＣをＣｕｒｅｌｉｎｅ，Ｉｎｃ．から入手した。のように得られた癌患者の肝浸潤リンパ球とＰＢＭＣに対して以下の分析を行った。
【0166】
３．２．ヒトＰＢＭＣでのサイトカイン生産測定
３．２．１．抗ＴＩＧＩＴ抗体によるヒトＰＢＭＣのサイトカイン分泌増加確認
ＰＢＭＣｓを抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体（２μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）存在下で抗－ＣＤ３抗体と共に培養した。抗ＴＩＧＩＴ抗体を処理していない群を対照群とした。培養後、サンプルを４００ｘｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を取って多重免疫アッセイに使用した。サイトカイン濃度はＢｉｏ－Ｐｌｅｘサイトカインアッセイ（ＩＦＮガンマ、ＩＬ－２を含むヒトサイトカインの分析）で測定した。全ての分析は製造者指針に従って行い、結果はＢｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００ ａｒｒａｙ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して読んだ。
３．２．１．抗ＴＩＧＩＴ抗体によるヒトＰＢＭＣのサイトカイン分泌増加確認
ＰＢＭＣｓを抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体（２μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）存在下で抗－ＣＤ３抗体と共に培養した。抗ＴＩＧＩＴ抗体を処理していない群を対照群とした。培養後、サンプルを４００ｘｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を取って多重免疫アッセイに使用した。サイトカイン濃度はＢｉｏ－Ｐｌｅｘサイトカインアッセイ（ＩＦＮガンマ、ＩＬ－２を含むヒトサイトカインの分析）で測定した。全ての分析は製造者指針に従って行い、結果はＢｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００ ａｒｒａｙ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して読んだ。
【0167】
得られた結果（ＩＦＮガンマおよびＩＬ－２濃度）を図６に示した。図６に示されているように、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体はヒトＰＢＭＣｓでのＴｈ１／Ｔｃ１サイトカイン分泌を有意味な水準で誘発した。本明細書および図面で異なって記載されない限り、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＩｇＧ１を抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６抗体または抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体と表示されている。
【0168】
３．２．２．抗ＴＩＧＩＴ抗体によるヒトＴ細胞でのサイトカイン生産の増加確認
ヒトＴ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞）でのサイトカイン生産を測定した。細胞（５００，０００細胞／反応）を抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５抗体の存在下で抗－ＣＤ３モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ ｎｏ．５５５３３６；０．２μｇ／ｍｌ）および抗－ＣＤ２８モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ ｎｏ ５５５７２５；１μｇ／ｍｌ）と共に培養した。培養後、細胞を４℃で１０分間４００ｘｇでスピンダウンし、Ｔ細胞内のサイトカイン濃度を測定した。このために次の方法で細胞内サイトカインを染色した：細胞をＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ固定死細胞染色溶液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、３０分間氷の上でＣＤ４＋ ａｎｄ ＣＤ８＋ Ｔ細胞表面マーカに対するフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）－接合抗体で標識した。この時使用された抗－ＣＤ３抗体、抗－ＣＤ４抗体、抗－ＣＤ８抗体（以上、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞表面染色に使用される）、抗－ＩＬ－２抗体、抗－ＩＦＮｇ抗体、および抗－ＴＮＦａ抗体は全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手した。
ヒトＴ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞）でのサイトカイン生産を測定した。細胞（５００，０００細胞／反応）を抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５抗体の存在下で抗－ＣＤ３モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ ｎｏ．５５５３３６；０．２μｇ／ｍｌ）および抗－ＣＤ２８モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ ｎｏ ５５５７２５；１μｇ／ｍｌ）と共に培養した。培養後、細胞を４℃で１０分間４００ｘｇでスピンダウンし、Ｔ細胞内のサイトカイン濃度を測定した。このために次の方法で細胞内サイトカインを染色した：細胞をＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ固定死細胞染色溶液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、３０分間氷の上でＣＤ４＋ ａｎｄ ＣＤ８＋ Ｔ細胞表面マーカに対するフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）－接合抗体で標識した。この時使用された抗－ＣＤ３抗体、抗－ＣＤ４抗体、抗－ＣＤ８抗体（以上、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞表面染色に使用される）、抗－ＩＬ－２抗体、抗－ＩＦＮｇ抗体、および抗－ＴＮＦａ抗体は全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手した。
【0169】
ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ａｎｄ Ｄｉｌｕｅｎｔ ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して製造者指針に従って細胞を固定化し浸透化させた（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）。細胞を細胞内ＩＬ－２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαに対するフルオロフォア－接合抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。細胞をフローサイトメトリー器（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析し、データはＦｌｏｗｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【0170】
結果を図７ａ（ＣＤ４＋ Ｔ細胞）および７ｂ（ＣＤ８＋ Ｔ細胞）に示した。図７ａおよび７ｂに示されているように、本願の抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体はＴ細胞内でのＴｈ１／Ｔｃ１サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮガンマ）生産増加させ、これを通じて免疫反応を強化させることを確認した。得られた結果は、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体が強力で容量－依存的なエフェクターＴ細胞機能増進効果を有することを示唆する。
【0171】
３．３．抗ＴＩＧＩＴ抗体と比較抗体間の効能比較
３．３．１．抗ＴＩＧＩＴ抗体の抗－ＰＤ１薬物と比較して増進された免疫強化効果確認
サイトカイン生産に対する抗ＴＩＧＩＴ抗体の免疫学的効果を実施例３．２．２に記載された方法で測定した。比較のために、比較抗体として抗－ＰＤ１抗体であるペムブロリズマブ（‘Ｐｅｍ ａｎａｌｏｇ’と表示）およびニボルマブ（‘Ｎｉｖ ａｎａｌｏｇ’と表示）を使用した。分析は、抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗－ＰＤ１抗体を処理した後、フローサイトメトリーを行って実施した。抗－ＰＤ－１抗体と抗ＴＩＧＩＴ抗体はそれぞれ１０μｇ／ｍｌずつ使用した。
３．３．１．抗ＴＩＧＩＴ抗体の抗－ＰＤ１薬物と比較して増進された免疫強化効果確認
サイトカイン生産に対する抗ＴＩＧＩＴ抗体の免疫学的効果を実施例３．２．２に記載された方法で測定した。比較のために、比較抗体として抗－ＰＤ１抗体であるペムブロリズマブ（‘Ｐｅｍ ａｎａｌｏｇ’と表示）およびニボルマブ（‘Ｎｉｖ ａｎａｌｏｇ’と表示）を使用した。分析は、抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗－ＰＤ１抗体を処理した後、フローサイトメトリーを行って実施した。抗－ＰＤ－１抗体と抗ＴＩＧＩＴ抗体はそれぞれ１０μｇ／ｍｌずつ使用した。
【0172】
得られた結果を図８ａ（ＣＤ４＋ Ｔ細胞でのＩＬ－２濃度）、８ｂ（ＣＤ４＋ Ｔ細胞でのＩＦＮガンマ濃度）、８ｃ（ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＩＬ－２濃度）および８ｄ（ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＩＦＮガンマ濃度）に示した。図８ａ－ｄに示されているように、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体は、ペムブロリズマブまたはニボルマブと比較して、高い水準でＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導した。
【0173】
３．３．２．抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６抗体の抗ＴＩＧＩＴ比較抗体と比較して増進されたＴｈ１／Ｔｃ１サイトカイン生産効果確認
Ｔ細胞を多様な濃度（２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）の抗ＴＩＧＩＴ抗体と共に培養した後、実施例３．２．２に記載された方法でサイトカイン生産を測定した。比較のために使用された抗ＴＩＧＩＴ比較抗体は先に説明した通りである。
Ｔ細胞を多様な濃度（２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）の抗ＴＩＧＩＴ抗体と共に培養した後、実施例３．２．２に記載された方法でサイトカイン生産を測定した。比較のために使用された抗ＴＩＧＩＴ比較抗体は先に説明した通りである。
【0174】
得られた結果を図９ａ（ＣＤ４＋ Ｔ細胞でのＩＬ－２濃度）、９ｂ（ＣＤ４＋ Ｔ細胞でのＩＦＮガンマ濃度）、９ｃ（ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＩＬ－２濃度）および９ｄ（ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＩＦＮガンマ濃度）に示した。図９ａ－ｄに示されているように、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体はＴｈ１／Ｔｃ１ ＩＦＮガンマおよびＩＬ－２サイトカイン生産増加させ、これを通じて免疫反応を強化させることを確認した。抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体は、抗ＴＩＧＩＴ比較抗体と比較して、より強力なサイトカイン生産増加効果を示した。
【0175】
実施例４．抗ＴＩＧＩＴ抗体のＴ細胞増殖効果
４．１．抗ＴＩＧＩＴ抗体のヒトＰＢＭＣでのＴ細胞増殖効果確認
抗ＴＩＧＩＴ抗体（７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＩｇＧ１または７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＩｇＧ４）１０μｇ／ｍｌをプレート結合抗ＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（０．２μｇ／ｍｌ）、ＰＢＭＣｓ（５００，０００細胞／反応）およびＣｙｔｏｓｔｉｍ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共に共培養した。培養後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システム（Ｓａｔｏｒｉｕｓ）上でＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）測定およびフローサイトメトリー器上でＫｉ６７測定をそれぞれ行った。
４．１．抗ＴＩＧＩＴ抗体のヒトＰＢＭＣでのＴ細胞増殖効果確認
抗ＴＩＧＩＴ抗体（７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＩｇＧ１または７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＩｇＧ４）１０μｇ／ｍｌをプレート結合抗ＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（０．２μｇ／ｍｌ）、ＰＢＭＣｓ（５００，０００細胞／反応）およびＣｙｔｏｓｔｉｍ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共に共培養した。培養後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システム（Ｓａｔｏｒｉｕｓ）上でＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）測定およびフローサイトメトリー器上でＫｉ６７測定をそれぞれ行った。
【0176】
得られた結果を図１０ａ（ＣＦＳＥアッセイの結果）および１０ｂ（Ｋｉ６７アッセイの結果）に示した（Ｎｏ Ｓｔｉｍ：ｃｙｔｏｓｔｉｍ ａｃｔｉｖａｔｏｒと抗体全て無処理；対照：抗体無処理）。図１０ａおよび１０ｂに示されているように、本願の抗ＴＩＧＩＴ抗体である７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＩｇＧ１および７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＩｇＧ４は全てＴ細胞の増殖を誘導し、これは抗ＴＩＧＩＴ抗体によって誘導される免疫反応が長期間持続できることを示唆する。
【0177】
４．２．抗ＴＩＧＩＴ抗体のＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖に対するＴ調節細胞抑制遮断効果確認
ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９６－４９５）およびＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＣＤ１２７－ｄｉｍ ｒｅｇ Ｔ細胞単離キッＩＩ（１３０－０９４－７７５）を使用してＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＴｒｅｇｓ（Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ）を分離した。分離されたＣＤ８＋ Ｔ細胞を細胞ｔｒａｃｋｅｒ ｖｉｏｌｅｔ増殖キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、ＣＤ８：Ｔｒｅｇ比率が４：１になるように細胞を播種した。細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ダイなビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で活性化させ、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖκ５抗体１０μｇ／ｍｌを適切なウェルに添加した。３日目に、ビードを洗浄しＩＬ－２（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。７日目に、生／死（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ）、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４に対する表面マーカ抗体（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手）で細胞を染色し、フローサイトメトリー装置（ＣｙｔｏＦｌｅｘ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で分析した。
ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９６－４９５）およびＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＣＤ１２７－ｄｉｍ ｒｅｇ Ｔ細胞単離キッＩＩ（１３０－０９４－７７５）を使用してＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＴｒｅｇｓ（Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ）を分離した。分離されたＣＤ８＋ Ｔ細胞を細胞ｔｒａｃｋｅｒ ｖｉｏｌｅｔ増殖キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、ＣＤ８：Ｔｒｅｇ比率が４：１になるように細胞を播種した。細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ダイなビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で活性化させ、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖκ５抗体１０μｇ／ｍｌを適切なウェルに添加した。３日目に、ビードを洗浄しＩＬ－２（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。７日目に、生／死（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ）、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４に対する表面マーカ抗体（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手）で細胞を染色し、フローサイトメトリー装置（ＣｙｔｏＦｌｅｘ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で分析した。
【0178】
得られた結果を図１１に示した。図１１に示されているように、Ｔｒｅｇｓ添加時、ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖が減少するが、このようなＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖抑制は抗ＴＩＧＩＴ抗体によって遮断された。これは、抗ＴＩＧＩＴ抗体がＴｒｅｇｓ－媒介ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖抑制を遮断することを意味する。
【0179】
実施例５．抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗－ＰＤ１薬物との併用による上昇效果
５．１．細胞ベースのレポーターアッセイを通じた抗ＴＩＧＩＴ／抗－ＰＤ１抗体の生物学的特性評価
抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗－ＰＤ抗体（ペムブロリズマブまたはニボルマブ）の併用による上昇效果を試験した。抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗－ＰＤ抗体のＴＩＧＩＴ－ＰＶＲ／ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１複合遮断効果を細胞ベースＮＦＡＴレポーター応答バイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で分析した。ＰＤ－１＋ＴＩＧＩＴ＋エフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ；１×１０５細胞／反応）を細胞アッセイバッファー（９０％ ＲＰＭＩ １６４０／１０％ ＦＢＳ）に添加し、ＰＤ－１＋ＴＩＧＩＴ＋エフェクター細胞含有細胞懸濁液を３７℃で１６時間培養した。ＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ；４×１０４細胞／反応）を細胞回収培地（９０％ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２、１０％ ＦＢＳ）に添加して準備した。抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体とペムブロリズマブまたはニボルマブの抗体混合物をＰＤ－１＋ＴＩＧＩＴ＋エフェクター細胞（１×１０５細胞／反応）およびＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１（４×１０４細胞／反応）含有細胞懸濁液に入れ、３７℃で６時間培養した。抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗－ＰＤ１抗体のうちの一つのみ単独処理した場合を対照群とした。単独処理時、抗体使用量は０．０２０４８、０．５１２、１．２８、３．２、８、２０（μｇ／ｍｌ）とし、併用処理時には抗ＴＩＧＩＴ抗体の使用量は０．０２０４８、０．５１２、１．２８、３．２、８、２０（μｇ／ｍｌ）、抗－ＰＤ－１抗体（ペムブロリズマブ ｏｒ ニボルマブ）の使用量は０．０２０４８、０．５１２、１．２８、３．２、８、２０（μｇ／ｍｌ）とした。
５．１．細胞ベースのレポーターアッセイを通じた抗ＴＩＧＩＴ／抗－ＰＤ１抗体の生物学的特性評価
抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗－ＰＤ抗体（ペムブロリズマブまたはニボルマブ）の併用による上昇效果を試験した。抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗－ＰＤ抗体のＴＩＧＩＴ－ＰＶＲ／ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１複合遮断効果を細胞ベースＮＦＡＴレポーター応答バイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で分析した。ＰＤ－１＋ＴＩＧＩＴ＋エフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ；１×１０５細胞／反応）を細胞アッセイバッファー（９０％ ＲＰＭＩ １６４０／１０％ ＦＢＳ）に添加し、ＰＤ－１＋ＴＩＧＩＴ＋エフェクター細胞含有細胞懸濁液を３７℃で１６時間培養した。ＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ；４×１０４細胞／反応）を細胞回収培地（９０％ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２、１０％ ＦＢＳ）に添加して準備した。抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体とペムブロリズマブまたはニボルマブの抗体混合物をＰＤ－１＋ＴＩＧＩＴ＋エフェクター細胞（１×１０５細胞／反応）およびＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１（４×１０４細胞／反応）含有細胞懸濁液に入れ、３７℃で６時間培養した。抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗－ＰＤ１抗体のうちの一つのみ単独処理した場合を対照群とした。単独処理時、抗体使用量は０．０２０４８、０．５１２、１．２８、３．２、８、２０（μｇ／ｍｌ）とし、併用処理時には抗ＴＩＧＩＴ抗体の使用量は０．０２０４８、０．５１２、１．２８、３．２、８、２０（μｇ／ｍｌ）、抗－ＰＤ－１抗体（ペムブロリズマブ ｏｒ ニボルマブ）の使用量は０．０２０４８、０．５１２、１．２８、３．２、８、２０（μｇ／ｍｌ）とした。
【0180】
培養後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔを入れ周囲温度（常温）で１０分間培養した。発光程度は、ＰｒｏｍｅｇａＴＭ ＧｌｏＭａｘ（登録商標）プレートリーダーで測定した。ｃｕｒｖｅ ｆｉｔｔｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して抗体反応のＥＣ５０値を決定した。
【0181】
【0182】
５．２．抗－ＰＤ１／比較抗体組み合わせと抗ＴＩＧＩＴ／抗－ＰＤ１抗体との生物学的活性比較
ＴＩＧＩＴ－ＰＶＲ／ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１遮断のための抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗－ＰＤ１抗体の併用効果を細胞ベースＮＦＡＴレポーター応答バイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で分析した。抗ＴＩＧＩＴ抗体（７Ａ６）または抗ＴＩＧＩＴ比較抗体を実施例５．１を参照してペムブロリズマブまたはニボルマブと共培養した。比較のために、比較抗体を細胞混合物と培養し同様な方法で処理した。単独処理時、抗体使用量は０．０１３、０．０３２、０．０８２、０．２０４、０．５１２、１．２８、３．２、８、２０（μｇ／ｍｌ）とし、併用処理時には抗ＴＩＧＩＴ抗体の使用量は０．０１３、０．０３２、０．０８２、０．２０４、０．５１２、１．２８、３．２、８、２０（μｇ／ｍｌ）、抗－ＰＤ－１抗体（ペムブロリズマブ又はニボルマブ）の使用量は０．０１３、０．０３２、０．０８２、０．２０４、０．５１２、１．２８、３．２、８、２０（μｇ／ｍｌ）とした。
得られた結果を図１３ａ（ペムブロリズマブと併用）および１３ｂ（ニボルマブと併用）に示した。図１３ａおよび１３ｂに示されているように、ペムブロリズマブおよびニボルマブと併用した抗ＴＩＧＩＴ抗体は全て抗－ＰＤ１抗体と抗ＴＩＧＩＴ比較抗体が併用された場合と比較して高い上昇効果を示した。
ＴＩＧＩＴ－ＰＶＲ／ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１遮断のための抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗－ＰＤ１抗体の併用効果を細胞ベースＮＦＡＴレポーター応答バイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で分析した。抗ＴＩＧＩＴ抗体（７Ａ６）または抗ＴＩＧＩＴ比較抗体を実施例５．１を参照してペムブロリズマブまたはニボルマブと共培養した。比較のために、比較抗体を細胞混合物と培養し同様な方法で処理した。単独処理時、抗体使用量は０．０１３、０．０３２、０．０８２、０．２０４、０．５１２、１．２８、３．２、８、２０（μｇ／ｍｌ）とし、併用処理時には抗ＴＩＧＩＴ抗体の使用量は０．０１３、０．０３２、０．０８２、０．２０４、０．５１２、１．２８、３．２、８、２０（μｇ／ｍｌ）、抗－ＰＤ－１抗体（ペムブロリズマブ又はニボルマブ）の使用量は０．０１３、０．０３２、０．０８２、０．２０４、０．５１２、１．２８、３．２、８、２０（μｇ／ｍｌ）とした。
得られた結果を図１３ａ（ペムブロリズマブと併用）および１３ｂ（ニボルマブと併用）に示した。図１３ａおよび１３ｂに示されているように、ペムブロリズマブおよびニボルマブと併用した抗ＴＩＧＩＴ抗体は全て抗－ＰＤ１抗体と抗ＴＩＧＩＴ比較抗体が併用された場合と比較して高い上昇効果を示した。
【0183】
５．３．免疫Ｔ細胞に対する抗ＴＩＧＩＴ／抗－ＰＤ１抗体の免疫学的効果
抗ＴＩＧＩＴ／抗－ＰＤ１抗体の併用または単独処理時のヒトＴ細胞のサイトカイン生産を測定した。抗ＴＩＧＩＴ抗体７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５（２μｇ／ｍｌ）をペムブロリズマブ（２μｇ／ｍｌ）またはニボルマブ（２μｇ／ｍｌ）と予め混合し、細胞培養物に添加した。実施例３．２．２を参照して細胞内サイトカイン染色を行った。
抗ＴＩＧＩＴ／抗－ＰＤ１抗体の併用または単独処理時のヒトＴ細胞のサイトカイン生産を測定した。抗ＴＩＧＩＴ抗体７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５（２μｇ／ｍｌ）をペムブロリズマブ（２μｇ／ｍｌ）またはニボルマブ（２μｇ／ｍｌ）と予め混合し、細胞培養物に添加した。実施例３．２．２を参照して細胞内サイトカイン染色を行った。
【0184】
得られた結果を図１４ａ（ＣＤ４＋細胞）および１４ｂ（ＣＤ８＋細胞）に示した。結果から確認されるように、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５抗体と抗－ＰＤ１抗体との併用によってヒト初代Ｔ細胞でのＴｃ１／Ｔｈ１サイトカイン生産による抗－腫瘍活性が強化された。
【0185】
実施例６：抗ＴＩＧＩＴ抗体の腫瘍細胞に対する細胞毒性評価
６．１．腫瘍細胞でのＴＩＧＩＴリガンドであるＰＶＲ（ＣＤ１５５）の発現水準評価
標的になる腫瘍細胞（Ａ３７５およびＳＫ－ＯＶ３細胞）（ＡＴＣＣ）に対して１：２５希釈された抗－ＣＤ１５５ ＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用してＣＤ１５５（ＰＶＲ）染色を行い、フローサイトメトリー器で分析した。
６．１．腫瘍細胞でのＴＩＧＩＴリガンドであるＰＶＲ（ＣＤ１５５）の発現水準評価
標的になる腫瘍細胞（Ａ３７５およびＳＫ－ＯＶ３細胞）（ＡＴＣＣ）に対して１：２５希釈された抗－ＣＤ１５５ ＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用してＣＤ１５５（ＰＶＲ）染色を行い、フローサイトメトリー器で分析した。
【0186】
【0187】
６．２．抗ＴＩＧＩＴ抗体のＡ３７５黒色腫細胞に対する細胞毒性確認
抗ＴＩＧＩＴ抗体（７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５および７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＤＬＥ）１０μｇ／ｍｌをＰＢＭＣ（２５０，０００細胞／反応）およびＣｙｔｏｓｔｉｍ（Ｍｉｌｔｅｎｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の存在下で７２時間Ａ３７５細胞株（メラノーマ）（２．５×１０ｅ４ 細胞／反応）と抗体を共培養してＡ３７５腫瘍細胞に対する細胞毒性を試験した。抗ＴＩＧＩＴ１０Ａ７比較抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を比較例として使用した。また、操作された抗ＴＩＧＩＴ抗体（７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＤＬＥ）に対しても腫瘍細胞に対する死滅能をテストした。腫瘍細胞数はＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システム（Ｓａｔｏｒｉｕｓ）で測定した。
抗ＴＩＧＩＴ抗体（７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５および７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＤＬＥ）１０μｇ／ｍｌをＰＢＭＣ（２５０，０００細胞／反応）およびＣｙｔｏｓｔｉｍ（Ｍｉｌｔｅｎｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の存在下で７２時間Ａ３７５細胞株（メラノーマ）（２．５×１０ｅ４ 細胞／反応）と抗体を共培養してＡ３７５腫瘍細胞に対する細胞毒性を試験した。抗ＴＩＧＩＴ１０Ａ７比較抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を比較例として使用した。また、操作された抗ＴＩＧＩＴ抗体（７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＤＬＥ）に対しても腫瘍細胞に対する死滅能をテストした。腫瘍細胞数はＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システム（Ｓａｔｏｒｉｕｓ）で測定した。
【0188】
【0189】
６．３．抗ＴＩＧＩＴ抗体の卵巣癌細胞に対する細胞死滅能１
ＳＫＯＶ－３腫瘍（卵巣癌）細胞株に対する抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体の細胞死滅能を確認するために、抗ＴＩＧＩＴ抗体（１０μｇ／ｍｌ）または比較抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在または不在下でＳＫＯＶ－３細胞（３５ｋ 細胞／ウェル）をＰＢＭＣｓおよびＣｙｔｏＳｔｉｍ（１／５０）と共に共培養した。エフェクター細胞とターゲット細胞の比率（Ｅ：Ｔ）は６：１とした。比較抗体として抗ＴＩＧＩＴ抗体Ｍｅｒｅｏ／３１３Ｍ３２、ＢＭＳ／２２Ｇ２、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ／４．１Ｄ３、およびＡｒｃｕｓ／ＴＩＧ１を使用した（参照例参考）。得られたデータはＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標生細胞分析システム（Ｓａｔｏｒｉｕｓ）およびＩｎｃｕＣｙｔｅ ｎａｔｉｖｅ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して分析した。
ＳＫＯＶ－３腫瘍（卵巣癌）細胞株に対する抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体の細胞死滅能を確認するために、抗ＴＩＧＩＴ抗体（１０μｇ／ｍｌ）または比較抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在または不在下でＳＫＯＶ－３細胞（３５ｋ 細胞／ウェル）をＰＢＭＣｓおよびＣｙｔｏＳｔｉｍ（１／５０）と共に共培養した。エフェクター細胞とターゲット細胞の比率（Ｅ：Ｔ）は６：１とした。比較抗体として抗ＴＩＧＩＴ抗体Ｍｅｒｅｏ／３１３Ｍ３２、ＢＭＳ／２２Ｇ２、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ／４．１Ｄ３、およびＡｒｃｕｓ／ＴＩＧ１を使用した（参照例参考）。得られたデータはＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標生細胞分析システム（Ｓａｔｏｒｉｕｓ）およびＩｎｃｕＣｙｔｅ ｎａｔｉｖｅ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して分析した。
【0190】
得られた結果を図１７ａ（培養時間による細胞死滅率）および１７ｂ（８４日培養後細胞死滅率）に示した。図１７ａおよび１７ｂに示されるように、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５抗体の腫瘍細胞死滅能増加が観察され、このような腫瘍細胞死滅能は比較抗体と比較して顕著に高く示された。
【0191】
６．４．抗ＴＩＧＩＴ抗体の卵巣癌細胞に対する細胞死滅能２
抗ＴＩＧＩＴ抗体（抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５および７Ａ６ＶＨ４／Ｖｋ４）（それぞれ１０μｇ／ｍｌ）の存在または不在下でＳＫＯＶ－３ｃｅｌｌｓ（３５ｋ細胞／ウェル）を分離されたＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣｙｔｏｓｔｉｍと共に１０８日間共培養して、抗ＴＩＧＩＴ抗体のＳＫＯＶ－３卵巣癌細胞に対する細胞毒性を試験した。エフェクター細胞とターゲット細胞の比率（Ｅ：Ｔ）は３：１として分析した。ペムブロリズマブを同様な方法で処理した群は対照群とした。データはＩｎｃｕＣｙｔｅ ｎａｔｉｖｅ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して分析した。
抗ＴＩＧＩＴ抗体（抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５および７Ａ６ＶＨ４／Ｖｋ４）（それぞれ１０μｇ／ｍｌ）の存在または不在下でＳＫＯＶ－３ｃｅｌｌｓ（３５ｋ細胞／ウェル）を分離されたＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣｙｔｏｓｔｉｍと共に１０８日間共培養して、抗ＴＩＧＩＴ抗体のＳＫＯＶ－３卵巣癌細胞に対する細胞毒性を試験した。エフェクター細胞とターゲット細胞の比率（Ｅ：Ｔ）は３：１として分析した。ペムブロリズマブを同様な方法で処理した群は対照群とした。データはＩｎｃｕＣｙｔｅ ｎａｔｉｖｅ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して分析した。
【0192】
得られた結果を図１８に示した。結果から確認されるように、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ４抗体の腫瘍細胞死滅能増加が観察され、このような腫瘍細胞死滅能はペムブロリズマブと比較して顕著に高く示された。
【0193】
６．５．ＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５（ＰＶＲ）遮断によるＮＫ細胞のＳＫＯＶ３腫瘍細胞に対する細胞毒性増加確認
分離されたＮＫ細胞を４８時間ＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍｌ）を使用するかまたは使用せずに予備刺激を行った。ＮＫ細胞はＮＫ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製のＮＫ細胞単離キット（ｃａｔ．Ｎｏ．１３０－０９２－６５７））を使用して製造者指針に従ってヒト ＰＢＭＣから分離した。培養後、ＮＫ細胞（２５０，０００細胞／反応）を抗ＴＩＧＩＴ抗体（７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５、７Ａ６ ＶＨ４／Ｖｋ４、７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＤＬＥ）（それぞれ１０μｇ／ｍｌ）の存在下でＥ：Ｔを１０：１としてＳＫＯＶ３細胞（２．５×１０ｅ４ 細胞／反応）と共に４８時間共培養した。腫瘍細胞個数はＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システム（Ｓａｔｏｒｉｕｓ）を使用して測定した。
分離されたＮＫ細胞を４８時間ＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍｌ）を使用するかまたは使用せずに予備刺激を行った。ＮＫ細胞はＮＫ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製のＮＫ細胞単離キット（ｃａｔ．Ｎｏ．１３０－０９２－６５７））を使用して製造者指針に従ってヒト ＰＢＭＣから分離した。培養後、ＮＫ細胞（２５０，０００細胞／反応）を抗ＴＩＧＩＴ抗体（７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５、７Ａ６ ＶＨ４／Ｖｋ４、７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＤＬＥ）（それぞれ１０μｇ／ｍｌ）の存在下でＥ：Ｔを１０：１としてＳＫＯＶ３細胞（２．５×１０ｅ４ 細胞／反応）と共に４８時間共培養した。腫瘍細胞個数はＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システム（Ｓａｔｏｒｉｕｓ）を使用して測定した。
【0194】
得られた結果を図１９に示した。結果から確認されるように、試験された全ての抗ＴＩＧＩＴ抗体はＮＫ細胞のＳＫＯＶ３腫瘍細胞死滅能を非常に増加させた。
【0195】
実施例７：生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）抗癌効果試験
７．１．ＭＣ３８結腸癌モデルでの抗ＴＩＧＩＴ抗体の生体内効能試験
ヒトＰＶＲ発現ＭＣ３８（ＭＣ３８－ｈＰＶＲ）腫瘍細胞（ＣｒｏｗｎＢｉｏ）を３７℃および５％ＣＯ２大気条件で１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）が補充されたＤＭＥＭ＋４μｇ／ｍｌピューロマイシン培地に体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）保管した。対数増殖期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）の細胞を収穫し、腫瘍細胞接種前に細胞計数器で定量化した。
７．１．ＭＣ３８結腸癌モデルでの抗ＴＩＧＩＴ抗体の生体内効能試験
ヒトＰＶＲ発現ＭＣ３８（ＭＣ３８－ｈＰＶＲ）腫瘍細胞（ＣｒｏｗｎＢｉｏ）を３７℃および５％ＣＯ２大気条件で１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）が補充されたＤＭＥＭ＋４μｇ／ｍｌピューロマイシン培地に体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）保管した。対数増殖期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）の細胞を収穫し、腫瘍細胞接種前に細胞計数器で定量化した。
【0196】
Ｃ５７ＢＬ６ ｈＴＩＧＩＴ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ マウス（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ）の右側後方脇腹部分に準備された腫瘍細胞溶液（０．１ｍＬのＰＢＳ溶液中の２×１０５腫瘍細胞）を皮下接種し腫瘍を成長させた。腫瘍平均大きさ（体積）が８０－１００ｍｍ３になった時、無作為化（ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）を行った。本試験に総１５匹のマウスを使用し、これらを無作為に３個群に分けた（５匹のマウス／群）。
【0197】
腫瘍細胞接種後、動物の病的状態および死亡率を毎日チェックし、無作為化後、１週に３回ずつ体重増加／減少を測定した。死亡率と観察された臨床的症状を各動物別に毎日記録した。腫瘍大きさ（体積）は無作為化後、１週に３回ずつカリパスを使用して２次元で測定し、下記の数式で計算した。
Ｖ（ｍｍ３）＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２
［Ｖは腫瘍体積（ｍｍ３）、Ｌは腫瘍長さ（腫瘍の長軸長さ）、Ｗは腫瘍広さ（Ｌの垂直のうちの最も長い長さ）］。
Ｖ（ｍｍ３）＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２
［Ｖは腫瘍体積（ｍｍ３）、Ｌは腫瘍長さ（腫瘍の長軸長さ）、Ｗは腫瘍広さ（Ｌの垂直のうちの最も長い長さ）］。
【0198】
投与と腫瘍大きさおよび体重測定は、Ｌａｍｉｎａｒ Ｆｌｏｗ Ｃａｂｉｎｅｔで行った。体重と腫瘍大きさはＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒＴＭ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ３．１．３９９．１９）を用いて測定した。
【0199】
グルーピング直後、抗体またはビヒクル処理を行った。ＰＢＳ溶液をビヒクルとして使用し（対照群；グループ１）、ＣＨＯ細胞で生産された７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５およびチラゴルマブはそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇ容量で処理した（それぞれグループ２およびグループ３）（表１３参照）。
【0200】
【表13】
【0201】
抗体の投与群（グループ２および３該当；２０ｍｇ／ｋｇの容量、ｉ．ｐ．投与）の全ては試験期間中に体重減少が観察されなかった。
【0202】
のように測定されたマウスの腫瘍大きさを図２０に示した。
【0203】
図２０に示されるように、抗体処理後２１日目に、７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体は対照群（ＰＢＳ）と比較して顕著な腫瘍成長抑制効果を示した。試験群間のＭＣ３８腫瘍大きさを適応した日にに対応のないｔ検定で分析すると、対照群と比較して７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体による腫瘍成長抑制効果は９日目（ｐ値、０．０２９）および２１日目（ｐ値、０．００７）に特に顕著に示された。７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体（グループ２）はまた比較抗体であるチラゴルマブ（グループ１）と比較しても優れた抗腫瘍効果を示した（例、２１日目、ｐ値、０．０１３）。
【0204】
腫瘍成長抑制（ΔＴＧＩ）は、Δ阻害の平均％として計算した。
ΔＴＧＩ（Δ阻害の平均％）＝（（平均（Ｃ）－平均（Ｃ０））－（平均（Ｔ）－平均（Ｔ０）））／（平均（Ｃ）－平均（Ｃ０））＊１００％、
［Ｔ：試験群の測定時点の腫瘍大きさ、
Ｔ０：試験群の最初腫瘍大きさ、
Ｃ：対照群の測定時点の腫瘍大きさ、
Ｃ０：対照群の最初腫瘍大きさ。］
ΔＴＧＩ（Δ阻害の平均％）＝（（平均（Ｃ）－平均（Ｃ０））－（平均（Ｔ）－平均（Ｔ０）））／（平均（Ｃ）－平均（Ｃ０））＊１００％、
［Ｔ：試験群の測定時点の腫瘍大きさ、
Ｔ０：試験群の最初腫瘍大きさ、
Ｃ：対照群の測定時点の腫瘍大きさ、
Ｃ０：対照群の最初腫瘍大きさ。］
【0205】
７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体の腫瘍成長抑制（ＴＧＩ）は６７．９％であり、チラゴルマブ（ＴＧＩ＝５５．２％）と比較して上昇した抑制効果を示した。
【0206】
７．２．ＣＴ２６結腸癌モデルでの抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗－ＰＤ１抗体の併用処理による上昇した体内抗癌効能試験
ＣＴ－２６腫瘍細胞（ＣｒｏｗｎＢｉｏ）を３７℃および５％ ＣＯ２大気条件で１０％ ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地に体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）保管した。対数増殖期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）の細胞を収穫し、腫瘍細胞接種前に細胞計数器で定量化した。
ＣＴ－２６腫瘍細胞（ＣｒｏｗｎＢｉｏ）を３７℃および５％ ＣＯ２大気条件で１０％ ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地に体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）保管した。対数増殖期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）の細胞を収穫し、腫瘍細胞接種前に細胞計数器で定量化した。
【0207】
ＢＡＬＢ／ｃ ｈＰＤ－１／ｈＴＩＧＩＴ２重ノックインマウス（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）の右側後方脇腹部分に準備された腫瘍細胞溶液（０．１ｍＬのＰＢＳ溶液中の５×１０５腫瘍細胞）を皮下接種し腫瘍を成長させた。腫瘍接種日を“Ｄａｙ０”とした。腫瘍平均大きさ（体積）が７０－１００ｍｍ３になった時、無作為化（ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）を行った。本試験に総３０匹のマウスを使用し、これらを無作為に５個群に分けた（６匹のマウス／群）。
【0208】
腫瘍細胞接種後、動物の体重を測定した。
【0209】
ＰＢＳ溶液をビヒクルとして使用し（対照群；グループ１）、７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５および７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＤＬＥをそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇ容量で処理（それぞれグループ３およびグループ４）、抗－ＰＤ１抗体Ｋｅｙｔｒｕｄａ（ペムブロリズマブ；Ｍｅｒｃｋ）を５ｍｇ／ｋｇ容量で処理（グループ４）、および７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５ ２０ｍｇ／ｋｇおよびＫｅｙｔｒｕｄａ ５ｍｇ／ｋｇを併用処理（グループ５）した。
【0210】
ビヒクル処理群（対照群）の平均腫瘍変位量（ｔｕｍｏｒ ｂｕｒｄｅｎ）が２５日目に３０００ｍｍ３になった時に試験を終了した（表１４参照）。
【0211】
【表14】
【0212】
ＴＧＩ％は次の数式で計算した： ＴＧＩ（％）＝１００×（１－Ｔ／Ｃ）
（ＴおよびＣはそれぞれ特定日の試験群（Ｔ）および対照群（Ｃ）の平均腫瘍体積（または重量）。
（ＴおよびＣはそれぞれ特定日の試験群（Ｔ）および対照群（Ｃ）の平均腫瘍体積（または重量）。
【0213】
得られた結果を表１５および図２１に示した：
【0214】
【表15】
【0215】
表１５および図２１に示されているように、２５日目に、７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５処理群（グループ３）およびＫｅｙｔｒｕｄａ処理群（グループ２）の両方ともでそれぞれＴＧＩ ５１．４３％と５５．９１％の腫瘍成長減少が観察された。Ｋｅｙｔｒｕｄａと７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５の併用処理群（グループ５）でＴＧＩ ７８．９８％で腫瘍形成遅延および腫瘍成長抑制効果が最も顕著に示された。２５日目の７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５処理群、Ｋｅｙｔｒｕｄａ処理群、およびＫｅｙｔｒｕｄａ＋７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５併用処理群の腫瘍成長抑制効果は、対照群と比較して統計的に有意味に高く示された（ｐ－ｖａｌｕｅ＜０．０５）。７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５処理群（１匹）とＫｅｙｔｒｕｄａ＋７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５併用処理群（２匹）で完全な腫瘍除去が観察された。抗体を処理した全ての試験群で有意味な体重差はなかった。
【0216】
また、腫瘍微細環境（ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；ＴＭＥ）での免疫細胞に対する効果を試験して、その結果を図２２に示した。
【0217】
ＦＡＣＳ分析のために、安楽死させたマウスから収集された腫瘍を切除し、ヒーター付きの弱いＭＡＣＳＴＭＯｃｔｏ解離器（Ｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳＴＭ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｈｅａｔｅｒｓ）および多重組織解離キット１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して単一細胞に解離した。細胞を次の表面マーカ（抗マウス ＣＤ４５ ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗マウス ＣＤ３－ＢＵＶ３９５（ＢＤ）、抗マウス ＣＤ４－ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗マウス ＣＤ８－ＰＥ－ｅＦｌｕｏｒ６１０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗マウス ＣＤ３３５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、生／死－ＡＰＣ－ｅＦ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する蛍光標識された抗体で染色した。追加的に固定化／透過濃縮物及び希釈液キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して細胞固定および透過化させた後、抗マウス Ｆｏｘｐ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色処理した。フローサイトメトリー（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０、ＢＤ）で細胞を分析し、データはｆｌｏｗＪｏ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅで分析した。
【0218】
【0219】
７．３．抗ＴＩＧＩＴ抗体の患者由来腫瘍異種移植（ＰＤＸ）されたヒト化肝癌マウスモデルでの生体内効能試験
三人の供与者（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）の臍帯血から得られたヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＨＳＣ）を移植した免疫欠乏性ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）をｉｎ ｖｉｖｏ分析に使用した。癌患者の切除手術後の手術標本から肝胆管癌ＬＩＸＦＣ ２４７９（Ｃｈａｒｌｅｓ ｒｉｖｅｒ）腫瘍細胞を得た。継代（ｐａｓｓａｇｅ）１の免疫欠乏マウスに腫瘍断片を移植し、安定的な成長パターンが確立されるまで腫瘍異種移植片を継代した。ヌードマウスから連続継代を通じて異種移植片から腫瘍断片を得た。腫瘍を供与者マウスから除去した後、切片（縁長さ３～４ｍｍ）に切断し、１０％ペニシリン／ストレプトマイシンが含有されているＰＢＳに入れた。授与者マウスの一方の脇腹に皮下移植し、これを患者－由来腫瘍異種移植（ＰＤＸ）モデルと称した。
三人の供与者（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）の臍帯血から得られたヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＨＳＣ）を移植した免疫欠乏性ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）をｉｎ ｖｉｖｏ分析に使用した。癌患者の切除手術後の手術標本から肝胆管癌ＬＩＸＦＣ ２４７９（Ｃｈａｒｌｅｓ ｒｉｖｅｒ）腫瘍細胞を得た。継代（ｐａｓｓａｇｅ）１の免疫欠乏マウスに腫瘍断片を移植し、安定的な成長パターンが確立されるまで腫瘍異種移植片を継代した。ヌードマウスから連続継代を通じて異種移植片から腫瘍断片を得た。腫瘍を供与者マウスから除去した後、切片（縁長さ３～４ｍｍ）に切断し、１０％ペニシリン／ストレプトマイシンが含有されているＰＢＳに入れた。授与者マウスの一方の脇腹に皮下移植し、これを患者－由来腫瘍異種移植（ＰＤＸ）モデルと称した。
【0220】
動物をそれぞれ６匹のマウスから構成された二つのグループに分配し、各グループで二匹ずつのマウスに３人の各供与者のＨＳＣで再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ）し、同時に開始時類似グループ腫瘍体積中央値５０－１５０ｍｍ３および体重を保証した。無作為化遂行日を“Ｄａｙ０”とした。対照群としてＰＢＳを使用した（グループ１）。グループ２のマウスは７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５を２０ｍｇ／ｋｇ容量で処理した。試験物質は４週間、毎週２回腹腔内注射を通じて投与し、２８日目に実験が終了するまで腫瘍大きさをモニタリングした。細部事項は下記表１６に示された通りである：
【0221】
【表16】
【0222】
得られた結果（腫瘍大きさ）を図２３に示した。図２３に示されるように、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体は対照群に比べて腫瘍成長を顕著に抑制した。ＴＧＩ評価のために、２８日目に抗ＴＩＧＩＴ抗体処理群と対照群の間で腫瘍大きさを比較した。７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体の腫瘍成長抑制（ΔＴＧＩ）は７６．６％と示され、これは抗体が合成マウスモデルよりヒト癌に対する生理学的関連性が大きいと見なされる肝癌ＰＤＸ腫瘍モデルで相当な抗癌効果を有するのを示す。
【0223】
実施例８：ヒトＰＢＭＣおよび腫瘍浸潤Ｔ細胞での抗ＴＩＧＩＴ抗体の抗腫瘍効能
８．１．腫瘍微細環境（ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；ＴＭＥ）でのＴ細胞サブセット上のＴＩＧＩＴ発現確認
ヒト腫瘍微細環境での抗ＴＩＧＩＴ抗体の潜在的効果を測定するために、ＨＣＣ（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；間細胞癌腫）患者とＨＦＥ（ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ；血色素症）供与者の肝でＴＩＧＩＴ発現を確認した。ＨＦＥ（ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ）は正常的な肝機能を有する免疫学的に健康な状態と見なされる。Ｔ細胞サブセットのＴＩＧＩＴ発現を調査するために、正常供与者およびＨＣＣ癌患者に由来する腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）を準備した（実施例３．１参照）。細胞に対して細胞表面マーカ（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１２７、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ）を染色し（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１２７、およびＣＤ２５抗体はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手、ＴＩＧＩＴ抗体はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手）、フローサイトメトリーおよびＦｌｏｗｊｏソフトウェアで分析した。各Ｔ細胞サブセットでのＴＩＧＩＴの平均蛍光強度（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ；ＭＦＩ）をＦｌｏｗｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
８．１．腫瘍微細環境（ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；ＴＭＥ）でのＴ細胞サブセット上のＴＩＧＩＴ発現確認
ヒト腫瘍微細環境での抗ＴＩＧＩＴ抗体の潜在的効果を測定するために、ＨＣＣ（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；間細胞癌腫）患者とＨＦＥ（ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ；血色素症）供与者の肝でＴＩＧＩＴ発現を確認した。ＨＦＥ（ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ）は正常的な肝機能を有する免疫学的に健康な状態と見なされる。Ｔ細胞サブセットのＴＩＧＩＴ発現を調査するために、正常供与者およびＨＣＣ癌患者に由来する腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）を準備した（実施例３．１参照）。細胞に対して細胞表面マーカ（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１２７、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ）を染色し（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１２７、およびＣＤ２５抗体はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手、ＴＩＧＩＴ抗体はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手）、フローサイトメトリーおよびＦｌｏｗｊｏソフトウェアで分析した。各Ｔ細胞サブセットでのＴＩＧＩＴの平均蛍光強度（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ；ＭＦＩ）をＦｌｏｗｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
【0224】
得られた結果を図２４に示した。図２４に示されるように、ＨＣＣ患者での腫瘍浸潤Ｔ細胞上のＴＩＧＩＴ発現は正常供与者に比べてさらに高く示された。ＴＩＧＩＴは、ＨＣＣ患者の腫瘍浸潤Ｔ細胞において、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞と比較して、Ｔｒｅｇ細胞で最も高い比率で発現した。このような結果は、Ｔｒｅｇ細胞が抗ＴＩＧＩＴ抗体の抑制活性において好ましい標的であることを示唆する。
【0225】
８．２．肝癌患者由来Ｔ細胞でのサイトカイン生産
ＴＩＧＩＴを発現する免疫細胞は癌患者で機能障害を起こし、抗ＴＩＧＩＴ抗体処理によってＨＣＣ患者の免疫反応を回復するか向上させることができるかを試験した。
抗ＴＩＧＩＴ抗体によって媒介されるＴ細胞からのサイトカイン生成を測定するために、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）患者または健康な供与者から得られたヒトＰＢＭＣを抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体（抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６）（１０μｇ／ｍｌ）または同一容量の比較抗体（抗ＴＩＧＩＴ １０Ａ７、２２Ｇ２）存在下で抗－ＣＤ３および抗－ＣＤ２８抗体と共に培養した。細胞内サイトカイン生成を測定した（実施例３．２．２参照）。
ＴＩＧＩＴを発現する免疫細胞は癌患者で機能障害を起こし、抗ＴＩＧＩＴ抗体処理によってＨＣＣ患者の免疫反応を回復するか向上させることができるかを試験した。
抗ＴＩＧＩＴ抗体によって媒介されるＴ細胞からのサイトカイン生成を測定するために、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）患者または健康な供与者から得られたヒトＰＢＭＣを抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体（抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６）（１０μｇ／ｍｌ）または同一容量の比較抗体（抗ＴＩＧＩＴ １０Ａ７、２２Ｇ２）存在下で抗－ＣＤ３および抗－ＣＤ２８抗体と共に培養した。細胞内サイトカイン生成を測定した（実施例３．２．２参照）。
【0226】
得られた結果を図２５に示した。比較抗体である抗ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）および２２Ｇ２（ＢＭＳ）と比較して、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体処理時、ＨＣＣ患者のＰＢＭＣでＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞のサイトカイン生産が高い水準で増加することを確認した。ＩＬ－２およびＩＦＮ－γはＮＫおよびＴ細胞の増殖および死滅活性を増加させて免疫系の核心的機能を有するサイトカインであるので、得られたデータはＨＣＣ患者に対する抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６抗体処理による効能を示す。
【0227】
８．３．肺癌患者のＴ細胞に対する抗ＴＩＧＩＴ抗体の効能
非小細胞肺癌（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＮＳＣＬＣ）患者に由来したヒトＰＢＭＣの免疫細胞での抗ＴＩＧＩＴ抗体処理（それぞれ１０μｇ／ｍｌ）によるサイトカイン生産を試験した（実施例３．２．２参照）。
非小細胞肺癌（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＮＳＣＬＣ）患者に由来したヒトＰＢＭＣの免疫細胞での抗ＴＩＧＩＴ抗体処理（それぞれ１０μｇ／ｍｌ）によるサイトカイン生産を試験した（実施例３．２．２参照）。
【0228】
得られた結果を図２６に示した。比較抗体である抗ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）および２２Ｇ２（ＢＭＳ）と比較して、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体はＮＳＣＬＣ患者のＰＢＭＣ内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞からサイトカイン生成をさらに高い水準で増加させた。このような結果は、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６抗体のＮＳＣＬＣ患者に対する効能を立証する。
【0229】
８．４．大腸癌患者のＴ細胞に対する抗ＴＩＧＩＴ抗体の効能
ＴＩＧＩＴ発現免疫細胞は癌患者で機能障害を起こし、抗ＴＩＧＩＴ抗体処理によって大腸癌患者の免疫反応を回復または向上させることができるか試験した。大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ；ＣＲＣ）患者に由来したヒトＰＢＭＣの免疫細胞での抗ＴＩＧＩＴ抗体処理（それぞれ１０μｇ／ｍｌ）によるサイトカイン生産を試験した（実施例３．２．２参照）。
ＴＩＧＩＴ発現免疫細胞は癌患者で機能障害を起こし、抗ＴＩＧＩＴ抗体処理によって大腸癌患者の免疫反応を回復または向上させることができるか試験した。大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ；ＣＲＣ）患者に由来したヒトＰＢＭＣの免疫細胞での抗ＴＩＧＩＴ抗体処理（それぞれ１０μｇ／ｍｌ）によるサイトカイン生産を試験した（実施例３．２．２参照）。
【0230】
得られた結果を図２７に示した。比較抗体である抗ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）および２２Ｇ２（ＢＭＳ）と比較して、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体は大腸癌患者のＰＢＭＣでＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞からのサイトカイン生産をさらに高い水準で増加させ、このような結果は抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６抗体の大腸癌患者に対する効能を示唆する。
【0231】
実施例９：抗ＴＩＧＩＴＦａｂ断片のＴＩＧＩＴ－ＰＶＲ相互作用遮断を通じたＴ細胞活性化試験
９．１．中枢記憶Ｔ細胞およびエフェクター記憶Ｔ細胞での抗ＴＩＧＩＴ Ｆａｂ断片の免疫学的効果
抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体によるＴＩＧＩＴ／ＰＶＲ経路の特異的遮断効果を検証するために、抗体の抗ＴＩＧＩＴ－Ｆａｂ断片（７Ａ６＿ＶＨ３可変領域および７Ａ６＿ＶＫ５可変領域がジスルフェート結合で連結される）をＨＥＫ２９３細胞で生産し、固定化金属親和性クロマトグラフィーで精製した。抗ＴＩＧＩＴ Ｆａｂ断片は、Ｆｃ－誘導効果なく特異的遮断機能のみを示すために使用した。
９．１．中枢記憶Ｔ細胞およびエフェクター記憶Ｔ細胞での抗ＴＩＧＩＴ Ｆａｂ断片の免疫学的効果
抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体によるＴＩＧＩＴ／ＰＶＲ経路の特異的遮断効果を検証するために、抗体の抗ＴＩＧＩＴ－Ｆａｂ断片（７Ａ６＿ＶＨ３可変領域および７Ａ６＿ＶＫ５可変領域がジスルフェート結合で連結される）をＨＥＫ２９３細胞で生産し、固定化金属親和性クロマトグラフィーで精製した。抗ＴＩＧＩＴ Ｆａｂ断片は、Ｆｃ－誘導効果なく特異的遮断機能のみを示すために使用した。
【0232】
抗ＴＩＧＩＴ Ｆａｂ断片を使用して癌に対する長期間の強力な細胞毒性保護作用を果たすＴＩＧＩＴタンパク質に対する特異的結合を通じた中枢記憶Ｔ細胞［Ｔｃｍ］（図２８ａ）および効果器記憶Ｔ細胞［Ｔｅｍ］（図２８ｂ）の活性化を評価した。具体的に、５００，０００ＰＢＭＣ細胞をａｎｔｉ－ＣＤ３（０．２μｇ／ｍｌ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で活性化させた後、抗ＴＩＧＩＴ Ｆａｂ断片（１０μｇ／ｍｌ）を４８時間処理した。Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ）とＭｏｎｅｎｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに最終濃度１／１０００になるように加えた後、４時間さらに処理した。セントラルメモリーＴ細胞とエフェクターメモリーＴ細胞の染色のために細胞をウォッシュ後、常温で１０分間次の抗体で染色処理した：生／死（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ、６３３又は６３５ｎｍの励起用）、抗ＣＤ３－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ４５ＲＡ－Ｂｒｉｌｌａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＣＲ７－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。染色後にセントラルメモリーＴ細胞およびエフェクターメモリーＴ細胞のサイトカインレベルを以下のように測定した。Ｆｏｘｐ３／転写因子固定化／透過濃縮及び希釈キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して製造者指針に従って細胞を固定化し透化させた（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）。細胞を細胞内ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦａ（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対するフルオロフォア－接合抗体で染色した。細胞をフローサイトメトリー装置（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析し、データはＦｌｏｗｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【0233】
得られた結果を図２８ａ（中枢記憶Ｔ細胞）および２８ｂ（エフェクター記憶Ｔ細胞）に示した。結果に示されるように、抗ＴＩＧＩＴ－Ｆａｂ断片は向上した水準のＴｃｍおよびＴｅｍ活性化を誘導し、これは抗ＴＩＧＩＴ（７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５）抗体が癌で長期間持続する免疫反応を媒介する特異的遮断活性を有するということを立証する。
【0234】
９．２．抗ＴＩＧＩＴ Ｆａｂ断片によって媒介されるＡ３７５腫瘍細胞に対する細胞毒性増加確認
Ａ３７５腫瘍細胞（３５ｋ細胞／ウェル）をＳｙｔｏ－９染料で染色し、抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体から生成されたＦａｂ断片（Ｆａｂ ７Ａ６ ＶＨ０／Ｖｋ０、３ＶＨ３／Ｖｋ５、ＶＨ４／Ｖｋ４）（それぞれ１０μｇ／ｍｌ）の存在下でＰＢＭＣおよびＣｙｔｏＳｔｉｍ（１／５０）と共培養した。腫瘍細胞数は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｌｉｖｅ－Ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｔｏｒｉｕｓ）を使用して測定した。
Ａ３７５腫瘍細胞（３５ｋ細胞／ウェル）をＳｙｔｏ－９染料で染色し、抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体から生成されたＦａｂ断片（Ｆａｂ ７Ａ６ ＶＨ０／Ｖｋ０、３ＶＨ３／Ｖｋ５、ＶＨ４／Ｖｋ４）（それぞれ１０μｇ／ｍｌ）の存在下でＰＢＭＣおよびＣｙｔｏＳｔｉｍ（１／５０）と共培養した。腫瘍細胞数は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｌｉｖｅ－Ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｔｏｒｉｕｓ）を使用して測定した。
【0235】
得られた結果を図２９に示した。試験された全ての抗ＴＩＧＩＴ Ｆａｂ断片ＶＨ０／Ｖｋ０、ＶＨ３／Ｖｋ５およびＶＨ４／Ｖｋ４はＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５（ＰＶＲ）相互作用を遮断し、Ａ３７５腫瘍細胞に対する細胞毒性を増加させた。このような結果は、抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ヒト化抗体がＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５（ＰＶＲ）経路を効果的に遮断し、強化された免疫機能を誘導するということを確認させる。
【0236】
実施例１０．抗ＴＩＧＩＴ抗体の調節Ｔ細胞およびＮＫ細胞の免疫調節効果
１０．１．ＴＩＧＩＴのＴ調節細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ；Ｔｒｅｇｓ）上での高い水準発現確認
健康な供与者のＰＢＭＣでＴ細胞サブセットおよびＴＩＧＩＴタンパク質に対するマーカを染色した（抗ＣＤ３－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、生／死（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ）、抗ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１２７－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ２５－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＴＩＧＩＴ－ＰｅＣｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））。染色後、細胞をスピンダウンさせ、フローサイトメトリーで分析した。
１０．１．ＴＩＧＩＴのＴ調節細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ；Ｔｒｅｇｓ）上での高い水準発現確認
健康な供与者のＰＢＭＣでＴ細胞サブセットおよびＴＩＧＩＴタンパク質に対するマーカを染色した（抗ＣＤ３－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、生／死（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ）、抗ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１２７－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ２５－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＴＩＧＩＴ－ＰｅＣｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））。染色後、細胞をスピンダウンさせ、フローサイトメトリーで分析した。
【0237】
結果を図３０に示した。ＴＩＧＩＴは、非Ｔｒｅｇｓ ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞と比較して、調節Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ；Ｔｒｅｇｓ）でより高い水準で発現した。
【0238】
１０．２．抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体のＴｒｅｇ消去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）活性
抗－ＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗－ＣＤ２８抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体（１０μｇ／ｍｌ）をヒトＰＢＭＣと共培養した。対照群として抗ＴＩＧＩＴ １０Ａ７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を使用した。Ｔｒｅｇｓ、ＣＤ４＋ ＴおよびＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーで評価した。
抗－ＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗－ＣＤ２８抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体（１０μｇ／ｍｌ）をヒトＰＢＭＣと共培養した。対照群として抗ＴＩＧＩＴ １０Ａ７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を使用した。Ｔｒｅｇｓ、ＣＤ４＋ ＴおよびＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーで評価した。
【0239】
得られた結果を図３１ａ（Ｔｒｅｇｓ）、３１ｂ（ＣＤ４＋ Ｔ細胞）、３１ｃ（ＣＤ８＋ Ｔ細胞）、および３１ｄに示した。抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５抗体はＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞比率は変化させないながらＴｒｅｇ細胞を特異的にターゲッティングした。また、抗ＴＩＧＩＴ抗体は対照群抗ＴＩＧＩＴ抗体（１０Ａ７）に比べて高い水準でＴｒｅｇを枯渇させた（図３１ｄ）。
【0240】
１０．３．ＮＫ細胞によって媒介される抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５抗体のＴｒｅｇ消去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）活性確認
ＴｒｅｇおよびＮＫ細胞を抗ＴＩＧＩＴ抗体７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５またはＶＨ３／Ｖｋ５－ＤＬＥ（それぞれ１０μｇ／ｍｌ）の存在または不在下で一晩共に共培養した。翌日、ＴｒｅｇおよびＮＫ細胞の残存細胞数をフローサイトメトリーで測定した。Ｔｒｅｇ細胞はＭｉｌｔｅｎｙｉ ｋｉｔｓ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－ｄｉｍ ｒｅｇ Ｔ細胞単離キットＩＩ、ｃａｔ ｎｏ．１３０－０９４－７７５）を使用し、ＮＫ細胞はＭｉｌｔｅｎｙ ｋｉｔｓ（ＮＫ細胞単離キット、ｃａｔ ｎｏ．１３０－０９２－６５７）を使用して、製造者指針に従ってヒトＰＢＭＣから分離した。
ＴｒｅｇおよびＮＫ細胞を抗ＴＩＧＩＴ抗体７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５またはＶＨ３／Ｖｋ５－ＤＬＥ（それぞれ１０μｇ／ｍｌ）の存在または不在下で一晩共に共培養した。翌日、ＴｒｅｇおよびＮＫ細胞の残存細胞数をフローサイトメトリーで測定した。Ｔｒｅｇ細胞はＭｉｌｔｅｎｙｉ ｋｉｔｓ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－ｄｉｍ ｒｅｇ Ｔ細胞単離キットＩＩ、ｃａｔ ｎｏ．１３０－０９４－７７５）を使用し、ＮＫ細胞はＭｉｌｔｅｎｙ ｋｉｔｓ（ＮＫ細胞単離キット、ｃａｔ ｎｏ．１３０－０９２－６５７）を使用して、製造者指針に従ってヒトＰＢＭＣから分離した。
【0241】
得られた結果を図３２に示した。Ｔｒｅｇ細胞数は抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５抗体およびＶＨ３／Ｖｋ５－ＤＬＥ抗体処理によって減少した反面、ＮＫ細胞数は変わらなかった。このような結果は、試験された抗ＴＩＧＩＴ抗体がＮＫ細胞と共に抗体依存的細胞細胞毒性によってＴｒｅｇを効率的に枯渇させるのを示す。
【0242】
一方、抗ＴＩＧＩＴ抗体によるＮＫ細胞媒介Ｔｒｅｇ消去（枯渇；ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）にＦｃ受容体結合が必要かどうかを試験した。
【0243】
ＴｒｅｇおよびＮＫ細胞を抗ＴＩＧＩＴ抗体７Ａ６ ＶＨ３／Ｖｋ５－ＤＬＥ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で一晩共に共培養した。Ｔｒｅｇ細胞はＭｉｌｔｅｎｙｉ ｋｉｔｓ（ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＣＤ１２７－ｄｉｍ ｒｅｇ Ｔ細胞単離キットＩＩ、ｃａｔ ｎｏ．１３０－０９４－７７５）を使用し、ＮＫ細胞はＭｉｌｔｅｎｙ ｋｉｔｓ（ＮＫ細胞単離キット、ｃａｔ ｎｏ．１３０－０９２－６５７）を使用して、製造者指針に従ってヒトＰＢＭＣから分離した。Ｆｃブロッキング抗体ＣＤ１６およびヒト ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸＴＭ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を処理してＦｃ受容体を遮断した。翌日、ＴｒｅｇおよびＮＫ細胞の残存細胞数をフローサイトメトリーで測定した。
【0244】
得られた結果を図３３に示した。抗ＴＩＧＩＴ抗体はＴｒｅｇｓを有意に減少させ、ブロッキング抗体によってＦｃＲが遮断されるとＴｒｅｇｓ減少が抑制された。このような結果は、抗ＴＩＧＩＴ抗体によるＮＫ細胞媒介Ｔｒｅｇ枯渇にＦｃ受容体結合が必要であるのを示す。
【0245】
１０．４．Ｆｃ－依存的Ｔ細胞活性化
ＦｃｇＲＩＩＩＡを事前遮断させるか事前遮断なくヒトＴ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞）でのサイトカイン生産を測定した。５００，０００ＰＢＭＣ細胞をＦｃｇＲＩＩＩＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ ｎｏ．４２２３０２）抗体と５分間常温でプレインキュベートした。その後、ＰＢＭＣ細胞を抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５（１０μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプ対照抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で０．２μｇ／ｍｌ抗－ＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および１μｇ／ｍｌ抗－ＣＤ２８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）モノクローナル抗体と共に培養した。培養後、細胞を４℃で１０分間４００ｘｇでスピンダウンし、Ｔ細胞内のサイトカイン濃度を測定した。このために、次の方法で細胞内サイトカインを染色した：細胞をＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ固定死細胞染色溶液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、３０分間氷の上でＣＤ４＋ ａｎｄ ＣＤ８＋ Ｔ細胞表面マーカに対するＣＤ３、ＣＤ４、 ａｎｄ ＣＤ８＋フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）転写因子固定化／透過濃縮及び希釈キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して製造者指針に従って細胞を固定化し透化させた（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）。細胞を細胞内ＩＬ－２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とＩＦＮγ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対するフルオロフォア－接合抗体で染色した。細胞をフローサイトメトリー器（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析し、データはＦｌｏｗｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
ＦｃｇＲＩＩＩＡを事前遮断させるか事前遮断なくヒトＴ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞）でのサイトカイン生産を測定した。５００，０００ＰＢＭＣ細胞をＦｃｇＲＩＩＩＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ ｎｏ．４２２３０２）抗体と５分間常温でプレインキュベートした。その後、ＰＢＭＣ細胞を抗ＴＩＧＩＴ ７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５（１０μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプ対照抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で０．２μｇ／ｍｌ抗－ＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および１μｇ／ｍｌ抗－ＣＤ２８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）モノクローナル抗体と共に培養した。培養後、細胞を４℃で１０分間４００ｘｇでスピンダウンし、Ｔ細胞内のサイトカイン濃度を測定した。このために、次の方法で細胞内サイトカインを染色した：細胞をＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ固定死細胞染色溶液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、３０分間氷の上でＣＤ４＋ ａｎｄ ＣＤ８＋ Ｔ細胞表面マーカに対するＣＤ３、ＣＤ４、 ａｎｄ ＣＤ８＋フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）転写因子固定化／透過濃縮及び希釈キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して製造者指針に従って細胞を固定化し透化させた（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）。細胞を細胞内ＩＬ－２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とＩＦＮγ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対するフルオロフォア－接合抗体で染色した。細胞をフローサイトメトリー器（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析し、データはＦｌｏｗｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【0246】
結果を図３４ａ（ＣＤ４＋ Ｔ細胞）および３４ｂ（ＣＤ８＋ Ｔ細胞）に示した。ＦｃｇＲＩＩＩＡ遮断によってＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方ともでサイトカイン生産を有意に減少させ、これは抗ＴＩＧＩＴ抗体がＴ細胞活性化のためのＦｃｇＲ相互作用を必要とし、Ｔｒｅｇを枯渇させるということを示唆する。抗ＴＩＧＩＴ抗体はＦｃｇＲの結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）によってさらに向上したＴ細胞反応を示す。
【0247】
統計処理
統計的有意性はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を使用して、通常の一元ＡＮＯＶＡ、対応あり又は対応無しのスチューデントのｔ検定で評価した。データは、平均±ＳＥＭで表示した。図の凡例に記載したように、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、ｎｓ＝有意性無し。
統計的有意性はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を使用して、通常の一元ＡＮＯＶＡ、対応あり又は対応無しのスチューデントのｔ検定で評価した。データは、平均±ＳＥＭで表示した。図の凡例に記載したように、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、ｎｓ＝有意性無し。
【配列表フリーテキスト】
【0248】
配列番号１： 合成＿ＣＤＲ－Ｈ１
配列番号２： 合成＿ＣＤＲ－Ｈ２
配列番号３： 合成＿ＣＤＲ－Ｈ３
配列番号４： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ１、但しＸはＫ又はＲ
配列番号５： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ２
配列番号６： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ３
配列番号７： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ１
配列番号８： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ１
配列番号９： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１０： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１１： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１２： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１３： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１４： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１５： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号１６： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号１７： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号１８： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号１９： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号２０： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号２１： 合成＿重鎖定常領域
配列番号２２： 合成＿軽鎖定常領域
配列番号２３： 合成＿７Ａ６重鎖可変領域をコードするＤＮＡ
配列番号２４： 合成＿７Ａ６軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ
配列番号２５： 合成＿７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５－ＤＬＥ重鎖
配列番号２６： 合成＿ＶＨ３／Ｖｋ５Ｎ２９８Ａ重鎖
配列番号２７： 合成＿７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５ＡＡＡ重鎖
配列番号２８： 合成＿７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５ＬＡＬＡＰＧ重鎖
配列番号２９： 合成＿７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５変異体の軽鎖
配列番号３０： 合成＿ヒトＴＩＧＩＴ
配列番号３１： 合成＿ヒトＴＩＧＩＴのエピトープ領域
配列番号２： 合成＿ＣＤＲ－Ｈ２
配列番号３： 合成＿ＣＤＲ－Ｈ３
配列番号４： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ１、但しＸはＫ又はＲ
配列番号５： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ２
配列番号６： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ３
配列番号７： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ１
配列番号８： 合成＿ＣＤＲ－Ｌ１
配列番号９： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１０： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１１： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１２： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１３： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１４： 合成＿重鎖可変領域
配列番号１５： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号１６： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号１７： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号１８： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号１９： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号２０： 合成＿軽鎖可変領域
配列番号２１： 合成＿重鎖定常領域
配列番号２２： 合成＿軽鎖定常領域
配列番号２３： 合成＿７Ａ６重鎖可変領域をコードするＤＮＡ
配列番号２４： 合成＿７Ａ６軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ
配列番号２５： 合成＿７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５－ＤＬＥ重鎖
配列番号２６： 合成＿ＶＨ３／Ｖｋ５Ｎ２９８Ａ重鎖
配列番号２７： 合成＿７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５ＡＡＡ重鎖
配列番号２８： 合成＿７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５ＬＡＬＡＰＧ重鎖
配列番号２９： 合成＿７Ａ６ＶＨ３／Ｖｋ５変異体の軽鎖
配列番号３０： 合成＿ヒトＴＩＧＩＴ
配列番号３１： 合成＿ヒトＴＩＧＩＴのエピトープ領域
【図1】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図9d】
【図10a】
【図10b】
【図11】
【図12】
【図13a】
【図13b】
【図14a】
【図14b】
【図15】
【図16】
【図17a】
【図17b】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28a】
【図28b】
【図29】
【図30】
【図31a】
【図31b】
【図31c】
【図31d】
【図32】
【図33】
【図34a】
【図34b】
【配列表】