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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-05
(45)【発行日】2024-09-13
(54)【発明の名称】一本鎖ＤＮＡの合成方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20240906BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z ZNA
【請求項の数】
27
(21)【出願番号】P 2021534996
(86)(22)【出願日】2019-12-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-17
(86)【国際出願番号】 CN2019128948
(87)【国際公開番号】W WO2020135651
(87)【国際公開日】2020-07-02
【審査請求日】2022-12-27
(31)【優先権主張番号】201811624165.0
(32)【優先日】2018-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】521263157
【氏名又は名称】チャンスー ジェンスクリプト バイオテック カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】イエ，ルーモン
(72)【発明者】
【氏名】スン，ハイエ
(72)【発明者】
【氏名】リ，イーファン
(72)【発明者】
【氏名】ウー，ジョンシーエン
【審査官】中野 あい
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０８０６０１９１（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０３２５５２２７（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０２２９６０６５（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）第１の鎖及びそれに逆相補的な第２の鎖からなる二本鎖ＤＮＡ鋳型分子を得る工程であって、第１の鎖の配列構造が式（Ｉ）に示され、５’左の適応配列－標的一本鎖ＤＮＡ配列－右の適応配列３’ （Ｉ）
ここで、左の適応配列の配列構造は式：ＸｎＴＸｑＸＡに示され、右の適応配列の配列構造は式：ＸＢＸｑ’Ｘｎ－ｍに示され、
式中、Ｘｎはｎ個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、５’ヌクレオチドはＡであり、ｎは４～１０の任意の整数であり、
ＸｑはタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの認識部位配列であり、Ｘｑは標的一本鎖ＤＮＡ配列に存在しておらず、Ｘｑ’はＸｑの逆相補配列であり、ＸＡ、ＸＢはそれぞれ任意の０個～複数個のヌクレオチドであり、かつ、Ｘ ｑＸＡ、ＸＢＸｑ’はそれぞれこのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断部位を構成し、ＸｑＸＡ配列の３’末端及びＸＢＸｑ’配列の５’末端におけるこのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断が許容されるように、Ｘ Ａ 、Ｘ Ｂ はそれぞれ選択され、
Ｘｎ－ｍはＸｎの５’からｎ－ｍ個のヌクレオチドの配列であり、ｍは１～３の整数であり、
Ａはアデニル酸を示し、Ｔはチミジル酸を示す工程と、
（２）二本鎖ＤＮＡ鋳型分子を鋳型とし、フォワードプライマーとリバースプライマーでＰＣＲ増幅を行い、標的一本鎖ＤＮＡ配列を含む第１の鎖及びそれに逆相補的な第２の鎖を含む生成物である二本鎖ＤＮＡ分子を得る工程であって、
前記フォワードプライマーはＸｎＵＸｑＸＡの配列を含み、前記リバースプライマーはＸｎ－ｍ’ＸｑＸＢ’の配列を含み、ここで、Ｘｎ、Ｘｑ、ＸＡ、ＸＢは（１）におけるそれらと同じであり、Ｘｎ－ｍ’は前記Ｘｎ－ｍの逆相補配列であるが、そのうちの３’末端のＴはＵに置き換えられ、ＸＢ’は前記ＸＢの逆相補配列であり、Ｕはウリジル酸である工程と、
（３）生成物である二本鎖ＤＮＡ分子の二本の鎖に含まれるＵをウラシル特異的切除試薬でそれぞれ切断することにより、生成物である二本鎖ＤＮＡ分子の二つの末端に粘着末端を生成する工程と、
（４）リガーゼの存在下で、生成物である二本鎖ＤＮＡ分子の二つの粘着末端を互いに
接続させることにより、第１の鎖がギャップを含む環状二本鎖ＤＮＡを形成する工程と、
（５）工程（４）で得られたギャップを含む環状二本鎖ＤＮＡに対して、生成物である二本鎖ＤＮＡ分子の第１鎖（センス鎖）のギャップを開始点とし、第２の鎖を鋳型とし、ローリングサークル複製を行うことにより、直列に連続される複数の次の式（ＩＩ）に示される配列構造を含むレプリコンを得る工程と、
５’－ＸｎＴＸｑＸＡ－標的一本鎖ＤＮＡ配列－ＸＢＸｑ ’－３’ （ＩＩ）
（６）レプリコンにアニーリングを行うことにより、レプリコンにおける隣接する二つの標的一本鎖ＤＮＡ配列の間にヘアピン構造を形成する工程と、
（７）前記タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼでレプリコンを処理し、隣接する標的一本鎖ＤＮＡ配列の間のＸＢＸｑ’ＸｎＴＸｑＸＡ配列の５’末端と３’末端でそれぞれ切断することにより、複数の標的一本鎖ＤＮＡ配列を放出させる工程と、
を含む、標的一本鎖ＤＮＡの調製方法。
【請求項2】
前記ヘアピン構造はＸ
ｑ
’Ｘ
ｎ
ＴＸ
ｑ
の配列からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼはＡｌｗＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢＣＩＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＦｏｋＩ、ＦａｕＩ、ＨｇａＩから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記ウラシル特異的切除試薬はウラシル特異的切除酵素（ＵＳＥＲＴＭ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記リガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記工程（３）と（４）は同一の反応系で、ウラシル特異的切除試薬とリガーゼの同時存在下で行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ローリングサークル複製は連続複製能を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ＤＮＡポリメラーゼがｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼはＢｓｐＱＩである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
ＸｑＸＡの配列はＧＣＴＣＴＴＣＮであり、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧであり、Ｘ
ＢＸｑ’の配列はＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４ＧＡＡＧＡＧＣであり、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４は独立にＡ、Ｔ、Ｃ又はＧから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
ＮはＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
Ｘ
Ｂ
Ｘ
ｑ
’の配列はＣＣＴＴＧＡＡＧＡＧＣである、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項13】
ｎは６～８である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ｎは８である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ｍは１である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
Ｘｎの配列はＡＡＣＴＡＴＡＣであり、Ｘｎ－ｍの配列はＡＡＣＴＡＴＡである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記標的一本鎖ＤＮＡの長さは１５０～２５００ｎｔである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
二本鎖ＤＮＡ鋳型分子を調製する前に標的一本鎖ＤＮＡ配列に配列分析を行い、標的一本鎖ＤＮＡ配列には切断部位がないタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼを選択することを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
標的ＤＮＡ配列を増幅するためのキットであって、配列が式：ＸｎＴＸｑＸＡに示される左の適応配列、及び配列が式：ＸＢＸｑ’Ｘｎ－ｍに示される右の適応配列を含み、
式中、Ｘｎはｎ個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、５’ヌクレオチドはＡであり、ｎは４～１０の任意の整数であり、
ＸｑはタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの認識部位配列であり、Ｘｑは標的一本鎖ＤＮＡ配列に存在しておらず、Ｘｑ’はＸｑの逆相補配列でありＸＡ、ＸＢはそれぞれ任意の０個～複数個のヌクレオチドであり、かつ、Ｘ ｑＸＡ、ＸＢＸｑ’はそれぞれこのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断部位を構成し、ＸＡの３’末端及びＸＢの５’末端におけるこのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断が許容されるように、Ｘ Ａ 、Ｘ Ｂ はそれぞれ選択され、
Ｘｎ－ｍはＸｎの５’からｎ－ｍ個のヌクレオチドのサブシーケンスであり、ｍは１～３の整数であり、
Ａはアデニル酸を示し、Ｔはチミジル酸を示す、キット。
【請求項20】
ｎは６～８である、請求項１９に記載のキット。
【請求項21】
ｎは８である、請求項１９又は２０に記載のキット。
【請求項22】
ＸｎＵＸｑＸＡの配列を含むフォワードプライマー、及びＸｎ－ｍ’ＸｑＸＢ’の配列を含むリバースプライマーを更に含み、ここで、Ｘｎ、Ｘｑ、ＸＡ、ＸＢは前記適応配列におけるそれらと同じであり、
Ｘｎ－ｍ’は前記Ｘｎ－ｍの逆相補配列であるが、そのうちの３’末端のＴはＵに置き換えられ、ＸＢ’は前記ＸＢの逆相補配列であり、Ｕはウリジル酸であり、
フォワードプライマーとリバースプライマーは標的ＤＮＡ配列を鋳型としてＰＣＲ増幅を行うことを許容する、請求項１９～２１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項23】
一本鎖ＤＮＡを調製するためのキットであって、ポリメラーゼ連鎖反応に適したＤＮＡポリメラーゼと、
ＤＮＡリガーゼと、
ウラシル特異的切除試薬と、
ローリングサークル増幅に適したＤＮＡポリメラーゼと、
タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼと、
請求項１９に記載の左の適応配列と右の適応配列、及び請求項２２に記載のフォワードプライマーとリバースプライマーと、を含む、キット。
【請求項24】
前記ＤＮＡリガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼである、請求項２３に記載のキット。
【請求項25】
前記ウラシル特異的切除試薬はウラシル特異的切除酵素である、請求項２３又は２４に記載のキット。
【請求項26】
前記ローリングサークル増幅に適したＤＮＡポリメラーゼはｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２３～２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項27】
ＤＮＡリガーゼとウラシル特異的切除試薬は同一の容器に入れられる、請求項２３～２６のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は生物工学分野に関し、具体的には、塩基変異のない一本鎖ＤＮＡの調製プロセスに関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子修復と外来機能遺伝子挿入に関して、一本鎖ＤＮＡ鋳型は様々な面で二本鎖ＤＮＡ鋳型に比べて多くの利点があり、例えば、編集効率がより高く、脆弱な哺乳動物細胞に対する細胞毒性がより低く、編集エラー／オフターゲット率がより低い。編集エラー／オフターゲット率がより低いことは、遺伝子治療に対して極めて重要である。
【0003】
しかし、現在、技術が難しく、コストが高く、収量が少ないため、一本鎖ＤＮＡ鋳型が極めて高価であり、この方法により研究するコストが大幅に制限されている。化学合成された一本鎖の長さは２００塩基に制限され、通常のマッチング下流精製方法では、製品に含まれる間違った配列を除去することができない。一本鎖ＤＮＡサンプルを調製するために一般的に使用される方法には、エキソヌクレアーゼ消化法、非対称ＰＣＲ法、及び磁気ビーズ吸着法が含まれている。但し、以上のこれらの方法はいずれも欠点がある。例えば、エキソヌクレアーゼはアンチセンス鎖を消化すると同時に標的バンドを非特異的に分解するため、要求に完全に一致する製品を提供することができない。非対称ＰＣＲ法は低コストの生産方法であるが、その生産効率の配列に対する要求はまだ明確ではなく、その生産効果が制御できず、安定した生産には適していない。ビオチン－ストレプトアビジン磁気ビーズ吸着法は操作が簡単で収量が安定しているが、外国から輸入された高品質の磁気ビーズは高価であり、購入するには長い時間がかかるため、外国製品をコア生産技術とすると、リスクが高いおそれがある。
【発明の概要】
【0004】
純度がより高く、使用量が十分で、価格が低い一本鎖ＤＮＡ鋳型サンプルを開発するために、発明者は、ウラシル特異的切除酵素（ＵＳＥＲ）を介した二本鎖ＤＮＡの自動環化方法、特殊な配列設計により達成された一本鎖ＤＮＡのアニーリング過程における自動折り畳み、標的一本鎖フラグメントを正確に切断できるタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ、及び等温増幅された一本鎖ＤＮＡのローリングサークル複製を組み合わせることにより、汎用で効率的な長い一本鎖ＤＮＡの調製プロセスを開発した。
【0005】
本発明の目的は、このような製品の高価及び低収量の問題を解決するために、用量が高く、純度が高く、配列忠実度が高い一本鎖ＤＮＡの調製プロセスを開発することである。このプロセスにより、２００ｎｔより長い一本鎖ＤＮＡの収量を数μｇから数百μｇに増加させ、ｎｍｏｌレベルに到達させることができ、長さが１３５０ｎｔの一本鎖ＤＮＡの収量を数μｇから数十μｇに増加させることもできる。
【0006】
例として、本発明のフローは以下の工程を含んでもよい。
【0007】
工程一（配列分析フロー）：標的ＤＮＡ配列（例えば長さが１５０～２５００ｎｔの任意のＤＮＡ配列）に生物情報学的分析を行い、配列に含まれるタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの認識切断部位を観察する。一般的に使用されているが標的配列に含まれていないタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓａＩを選択し、標的配列の両側の適応配列とユニバーサルプライマーを設計するためにその酵素切断部位配列を決定する。
【0008】
工程二（プライマー設計フロー）：標的配列の両端にそれぞれ左の適応配列と右の適応
配列を付加し、一斉に遺伝子合成を行う。ここで、左の適応配列は、５’末端から３’末端まで、ホモロジーアーム（少なくとも４個のヌクレオチドであり、好ましくは６～１０個のヌクレオチド、例えば８個のヌクレオチドである）、Ｔヌクレオチド、選択されたタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位、及び任意の１個又は複数個のヌクレオチドの付加配列をこの順で含み、この付加配列は、選択されたタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位と共にこのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断部位を構成する（幾つかの実施形態では、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位とその切断部位が同じであり、この場合に付加配列がない）ため、このタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼはこの付加残基配列の３’末端で切断できる。右の適応配列は、５’末端から３’末端まで、選択されたタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位の逆相補配列及びホモロジーアームをこの順で含み、このホモロジーアームは左の適応配列のホモロジーアームと同じであるが、３’末端に１～３個のヌクレオチドが欠失している。また、前記認識部位の逆相補配列の５’末端に任意の一個又は複数個のヌクレオチドの付加配列があり、この付加配列は、この認識部位の逆相補配列と共にこのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断部位を構成する（幾つかの実施形態では、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位とその切断部位が同じであり、この場合に付加配列がない）。好ましくは、左右の適応配列の長さは１～４個の塩基の差がある。
配列を付加し、一斉に遺伝子合成を行う。ここで、左の適応配列は、５’末端から３’末端まで、ホモロジーアーム（少なくとも４個のヌクレオチドであり、好ましくは６～１０個のヌクレオチド、例えば８個のヌクレオチドである）、Ｔヌクレオチド、選択されたタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位、及び任意の１個又は複数個のヌクレオチドの付加配列をこの順で含み、この付加配列は、選択されたタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位と共にこのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断部位を構成する（幾つかの実施形態では、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位とその切断部位が同じであり、この場合に付加配列がない）ため、このタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼはこの付加残基配列の３’末端で切断できる。右の適応配列は、５’末端から３’末端まで、選択されたタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位の逆相補配列及びホモロジーアームをこの順で含み、このホモロジーアームは左の適応配列のホモロジーアームと同じであるが、３’末端に１～３個のヌクレオチドが欠失している。また、前記認識部位の逆相補配列の５’末端に任意の一個又は複数個のヌクレオチドの付加配列があり、この付加配列は、この認識部位の逆相補配列と共にこのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断部位を構成する（幾つかの実施形態では、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位とその切断部位が同じであり、この場合に付加配列がない）。好ましくは、左右の適応配列の長さは１～４個の塩基の差がある。
【0009】
工程三（鋳型増幅による調製－自動環化）：プライマー配列におけるホモロジーアームに対応する配列の３’に位置するウラシル（Ｕ）修飾をそれぞれ含むフォワードプライマーとリバースプライマーにより、両端に左右の適応配列を含む遺伝子合成フラグメントにＰＣＲ増幅を行い、生成物を精製し、ＵＳＥＲ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）により精製された生成物を消化し、前記ウラシルを切断して粘着末端を生成し、更にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）により二つの粘着末端を接続させ、増幅生成物自体を環化させることにより、ギャップ付ｄｓＤＮＡサイクルをローリングサークル複製用の基質として生成する。
【0010】
鋳型増幅は通常のＰＣＲ操作フローであり、反応系は具体的に使用されるＤＮＡポリメラーゼ及びそのマッチング緩衝液により決定され、ＰＣＲ反応のアニーリング温度は具体的なプライマー配列により決定され、ＰＣＲ反応の延長時間は具体的な鋳型配列の長さにより決定される。
【0011】
ＵＳＥＲ酵素とＴ４ ＤＮＡリガーゼでギャップ付環状二本鎖ＤＮＡを調製する自己環化反応系としては、精製された二本鎖ＤＮＡ鋳型生成物１００ｎｇ、１０ｘ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液１μｌ、ＵＳＥＲ酵素１μｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μｌを添加し、最終総反応系が１０μｌになるまでｄｄＨ２Ｏを補足し、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートし、２０℃で３０ｍｉｎインキュベートし、続いて降温して４℃で保存する。
【0012】
工程四（ローリングサークル複製）：２００μｌのＰＣＲチューブに、工程三で調製されたギャップ付環状ＤＮＡサンプル１００ｎｇに、１０ｘ増幅緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、７５０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ ８．２、２５℃）１０μｌ、ＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）１０．０μｌ、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）１．０μｌ、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）５μｌを添加し、最終総反応系が１００μｌになるまでｄｄＨ２Ｏを補足し、３０℃で４～８時間増幅し、６５℃で１０分間処理し、４℃まで冷却する。
【0013】
工程五（アニーリング－自動折り畳み）：ローリングサークル複製を行ったＰＣＲチューブにＰＣＲを添加し、８０℃で５ｍｉｎ維持し、０．１℃／ｓで６５℃まで降温し、６５℃で５ｍｉｎ維持し、０．１℃／ｓで４２℃まで降温し、４２℃で５ｍｉｎ維持し、３７℃で５ｍｉｎ維持し、０．１℃／ｓで４℃まで降温し、続いて４℃で保存するようにア
ニーリング手順を行うことにより、ヘアピン構造を形成する。
ニーリング手順を行うことにより、ヘアピン構造を形成する。
【0014】
工程六（制限エンドヌクレアーゼ切断－標的フラグメントである長い一本鎖モノマーの放出）：上記反応生成物に１０ｘ制限エンドヌクレアーゼ緩衝液を１５μｌ、前記で選択されたタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼを２μｌ添加し、ｄｄＨ２Ｏを容量１５０μｌになるまで添加し、制限エンドヌクレアーゼの最適な反応温度で６０ｍｉｎ静置し、続いて熱変性により不活性化する。
【0015】
工程七（精製、濃縮）：制限エンドヌクレアーゼ切断生成物は標的フラグメントである一本鎖ＤＮＡ生成物、ヘアピン構造を含み、標的フラグメントが３００ｎｔより大きい場合、他の不明なＤＮＡフラグメントを更に含み、メーカーは実際の生産と使用状況により磁気ビーズ回収又はアガロースゲル電気泳動による切断回収を行い、回収後、凍結乾燥又はイソプロパノール沈殿により濃縮することができる。
【0016】
具体的には、本願は以下の技術方案を提供する。
１．１．（１）第１の鎖及びそれに逆相補的な第２の鎖からなる二本鎖ＤＮＡ鋳型分子を得る工程であって、第１の鎖の配列構造が式（Ｉ）に示され、
５’左の適応配列－標的一本鎖ＤＮＡ配列－右の適応配列３’ （Ｉ）
ここで、
左の適応配列の配列構造は式：ＸｎＴＸｑＸＡに示され、右の適応配列の配列構造は式：ＸＢＸｑ’Ｘｎ－ｍに示され、
式中、Ｘｎはｎ個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、５’ヌクレオチドはＡであり、ｎは４以上の任意の整数であり、
ＸｑはタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの認識部位配列であり、Ｘｑは標的一本鎖ＤＮＡ配列に存在しておらず、Ｘｑ’はＸｑの逆相補配列であり、ＸＡ、ＸＢはそれぞれ任意の０個～複数個のヌクレオチドであり、ＸｑＸＡ、ＸＢＸｑ’はそれぞれこのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断部位を構成し、ＸｑＸＡ配列の３’末端及びＸＢＸｑ’配列の５’末端におけるこのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断が許容され、
Ｘｎ－ｍはＸｎの５’からｎ－ｍ個のヌクレオチドの配列であり、ｍは１～３の整数であり、
Ａはアデニル酸を示し、Ｔはチミジル酸を示す工程と、
（２）二本鎖ＤＮＡ鋳型分子を鋳型とし、フォワードプライマーとリバースプライマーでＰＣＲ増幅を行い、標的一本鎖ＤＮＡ配列を含む第１の鎖及びそれに逆相補的な第２の鎖を含む生成物である二本鎖ＤＮＡ分子を得る工程であって、
前記フォワードプライマーはＸｎＵＸｑＸＡの配列を含み、前記リバースプライマーはＸｎ－ｍ’ＸｑＸＢ’の配列を含み、ここで、Ｘｎ、Ｘｑ、ＸＡ、ＸＢは（１）におけるそれらと同じであり、Ｘｎ－ｍ’は前記Ｘｎ－ｍの逆相補配列であるが、そのうちの３’末端のＴはＵに置き換えられ、ＸＢ’は前記ＸＢの逆相補配列であり、Ｕはウリジル酸である工程と、
（３）生成物である二本鎖ＤＮＡ分子の二本の鎖に含まれるＵをウラシル特異的切除試薬でそれぞれ切断することにより、生成物である二本鎖ＤＮＡ分子の二つの末端に粘着末端を生成する工程と、
（４）リガーゼの存在下で、生成物である二本鎖ＤＮＡ分子の二つの粘着末端を互いに接続させることにより、第１の鎖がギャップを含む環状二本鎖ＤＮＡを形成する工程と、
（５）工程（４）で得られた環状二本鎖ＤＮＡに対して、生成物である二本鎖ＤＮＡ分子の第１の鎖のギャップを開始点とし、第２の鎖を鋳型とし、ローリングサークル複製を行うことにより、直列に連続される複数の次の式（ＩＩ）に示される配列構造を含むレプリコンを得る工程と、
－ＸｎＴＸｑＸＡ－標的一本鎖ＤＮＡ配列－ＸＢＸｑ ’－ （ＩＩ）
（６）レプリコンにアニーリングを行うことにより、レプリコンにおける隣接する二つ
の標的一本鎖ＤＮＡ配列の間にヘアピン構造を形成する工程であって、好ましくは、前記ヘアピン構造はＸｑ’ＸｎＴＸｑの配列からなる工程と、
（７）前記タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼでレプリコンを処理し、隣接する標的一本鎖ＤＮＡ配列の間のＸＢＸｑ’ＸｎＴＸｑＸＡ配列の５’末端と３’末端でそれぞれ切断することにより、複数の標的一本鎖ＤＮＡ配列を放出させる工程と、
を含む、標的一本鎖ＤＮＡの調製方法。
１．１．（１）第１の鎖及びそれに逆相補的な第２の鎖からなる二本鎖ＤＮＡ鋳型分子を得る工程であって、第１の鎖の配列構造が式（Ｉ）に示され、
５’左の適応配列－標的一本鎖ＤＮＡ配列－右の適応配列３’ （Ｉ）
ここで、
左の適応配列の配列構造は式：ＸｎＴＸｑＸＡに示され、右の適応配列の配列構造は式：ＸＢＸｑ’Ｘｎ－ｍに示され、
式中、Ｘｎはｎ個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、５’ヌクレオチドはＡであり、ｎは４以上の任意の整数であり、
ＸｑはタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの認識部位配列であり、Ｘｑは標的一本鎖ＤＮＡ配列に存在しておらず、Ｘｑ’はＸｑの逆相補配列であり、ＸＡ、ＸＢはそれぞれ任意の０個～複数個のヌクレオチドであり、ＸｑＸＡ、ＸＢＸｑ’はそれぞれこのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断部位を構成し、ＸｑＸＡ配列の３’末端及びＸＢＸｑ’配列の５’末端におけるこのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断が許容され、
Ｘｎ－ｍはＸｎの５’からｎ－ｍ個のヌクレオチドの配列であり、ｍは１～３の整数であり、
Ａはアデニル酸を示し、Ｔはチミジル酸を示す工程と、
（２）二本鎖ＤＮＡ鋳型分子を鋳型とし、フォワードプライマーとリバースプライマーでＰＣＲ増幅を行い、標的一本鎖ＤＮＡ配列を含む第１の鎖及びそれに逆相補的な第２の鎖を含む生成物である二本鎖ＤＮＡ分子を得る工程であって、
前記フォワードプライマーはＸｎＵＸｑＸＡの配列を含み、前記リバースプライマーはＸｎ－ｍ’ＸｑＸＢ’の配列を含み、ここで、Ｘｎ、Ｘｑ、ＸＡ、ＸＢは（１）におけるそれらと同じであり、Ｘｎ－ｍ’は前記Ｘｎ－ｍの逆相補配列であるが、そのうちの３’末端のＴはＵに置き換えられ、ＸＢ’は前記ＸＢの逆相補配列であり、Ｕはウリジル酸である工程と、
（３）生成物である二本鎖ＤＮＡ分子の二本の鎖に含まれるＵをウラシル特異的切除試薬でそれぞれ切断することにより、生成物である二本鎖ＤＮＡ分子の二つの末端に粘着末端を生成する工程と、
（４）リガーゼの存在下で、生成物である二本鎖ＤＮＡ分子の二つの粘着末端を互いに接続させることにより、第１の鎖がギャップを含む環状二本鎖ＤＮＡを形成する工程と、
（５）工程（４）で得られた環状二本鎖ＤＮＡに対して、生成物である二本鎖ＤＮＡ分子の第１の鎖のギャップを開始点とし、第２の鎖を鋳型とし、ローリングサークル複製を行うことにより、直列に連続される複数の次の式（ＩＩ）に示される配列構造を含むレプリコンを得る工程と、
－ＸｎＴＸｑＸＡ－標的一本鎖ＤＮＡ配列－ＸＢＸｑ ’－ （ＩＩ）
（６）レプリコンにアニーリングを行うことにより、レプリコンにおける隣接する二つ
の標的一本鎖ＤＮＡ配列の間にヘアピン構造を形成する工程であって、好ましくは、前記ヘアピン構造はＸｑ’ＸｎＴＸｑの配列からなる工程と、
（７）前記タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼでレプリコンを処理し、隣接する標的一本鎖ＤＮＡ配列の間のＸＢＸｑ’ＸｎＴＸｑＸＡ配列の５’末端と３’末端でそれぞれ切断することにより、複数の標的一本鎖ＤＮＡ配列を放出させる工程と、
を含む、標的一本鎖ＤＮＡの調製方法。
【0017】
２．前記タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼはＡｌｗＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢＣＩＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＦｏｋＩ、ＦａｕＩ、ＨｇａＩから選択される、前記１に記載の方法。
【0018】
３．前記ウラシル特異的切除試薬はウラシル特異的切除酵素（ＵＳＥＲＴＭ）である、前記１～２のいずれか一項に記載の方法。
【0019】
４．前記リガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼである、前記１～３のいずれか一項に記載の方法。
【0020】
５．前記工程（３）と（４）は同一の反応系で、ウラシル特異的切除試薬とリガーゼの同時存在下で行われる、前記１～４のいずれか一項に記載の方法。
【0021】
６．ローリングサークル複製は連続複製能を有するＤＮＡポリメラーゼを用い、好ましくはｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる、前記１～５のいずれか一項に記載の方法。
【0022】
７．前記タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼはＢｓｐＱＩである、前記１～６のいずれか一項に記載の方法。
【0023】
８．ＸｑＸＡの配列はＧＣＴＣＴＴＣＮであり、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧであり、好ましくはＡであり、ＸＢＸｑ’の配列はＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４ＧＡＡＧＡＧＣであり、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４は独立にＡ、Ｔ、Ｃ又はＧから選択され、より好ましくは、ＸＢＸｑ’の配列はＣＣＴＴＧＡＡＧＡＧＣである、前記７に記載の方法。
【0024】
９．ｎは６～１０である、前記１～８のいずれか一項に記載の方法。
【0025】
１０．ｎは８である、前記１～９のいずれか一項に記載の方法。
【0026】
１１．ｍは１である、前記１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【0027】
１２．Ｘｎの配列はＡＡＣＴＡＴＡＣであり、Ｘｎ－ｍの配列はＡＡＣＴＡＴＡである、前記１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【0028】
１３．前記標的一本鎖ＤＮＡの長さは１５０～２５００ｎｔである、前記１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【0029】
１４．二本鎖ＤＮＡ鋳型分子を調製する前に標的一本鎖ＤＮＡ配列に配列分析を行い、標的一本鎖ＤＮＡ配列には切断部位がないタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼを選択することを含む、前記１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【0030】
１５．標的ＤＮＡ配列を増幅するためのキットであって、
配列が式：ＸｎＴＸｑＸＡに示される左の適応配列、及び配列が式：ＸＢＸｑ’Ｘｎ－ｍに示される右の適応配列を含み、
式中、Ｘｎはｎ個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、５’ヌクレオチドはＡであり、ｎは４以上の任意の整数であり、好ましくは６～８であり、より好ましくは８であり、
ＸｑはタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの認識部位配列であり、Ｘｑは標的一本鎖ＤＮＡ配列に存在しておらず、Ｘｑ’はＸｑの逆相補配列であり、ＸＡ、ＸＢはそれぞれ任意の０個～複数個のヌクレオチドであり、ＸｑＸＡ、ＸＢＸｑ’はそれぞれこのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断部位を構成し、ＸＡの３’末端及びＸＢの５’末端におけるこのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断が許容され、
Ｘｎ－ｍはＸｎの５’からｎ－ｍ個のヌクレオチドのサブシーケンスであり、ｍは１～３の整数であり、
Ａはアデニル酸を示し、Ｔはチミジル酸を示す、キット。
配列が式：ＸｎＴＸｑＸＡに示される左の適応配列、及び配列が式：ＸＢＸｑ’Ｘｎ－ｍに示される右の適応配列を含み、
式中、Ｘｎはｎ個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、５’ヌクレオチドはＡであり、ｎは４以上の任意の整数であり、好ましくは６～８であり、より好ましくは８であり、
ＸｑはタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの認識部位配列であり、Ｘｑは標的一本鎖ＤＮＡ配列に存在しておらず、Ｘｑ’はＸｑの逆相補配列であり、ＸＡ、ＸＢはそれぞれ任意の０個～複数個のヌクレオチドであり、ＸｑＸＡ、ＸＢＸｑ’はそれぞれこのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断部位を構成し、ＸＡの３’末端及びＸＢの５’末端におけるこのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断が許容され、
Ｘｎ－ｍはＸｎの５’からｎ－ｍ個のヌクレオチドのサブシーケンスであり、ｍは１～３の整数であり、
Ａはアデニル酸を示し、Ｔはチミジル酸を示す、キット。
【0031】
１５．ＸｎＵＸｑＸＡの配列を含むフォワードプライマー、及びＸｎ－ｍ’ＸｑＸＢ’の配列を含むリバースプライマーを更に含み、
ここで、Ｘｎ、Ｘｑ、ＸＡ、ＸＢは前記適応配列におけるそれらと同じであり、
Ｘｎ－ｍ’は前記Ｘｎ－ｍの逆相補配列であるが、そのうちの３’末端のＴはＵに置き換えられ、ＸＢ’は前記ＸＢの逆相補配列であり、Ｕはウリジル酸であり、
フォワードプライマーとリバースプライマーは標的ＤＮＡ配列を鋳型としてＰＣＲ増幅を行うことを許容する、前記１４に記載のキット。
ここで、Ｘｎ、Ｘｑ、ＸＡ、ＸＢは前記適応配列におけるそれらと同じであり、
Ｘｎ－ｍ’は前記Ｘｎ－ｍの逆相補配列であるが、そのうちの３’末端のＴはＵに置き換えられ、ＸＢ’は前記ＸＢの逆相補配列であり、Ｕはウリジル酸であり、
フォワードプライマーとリバースプライマーは標的ＤＮＡ配列を鋳型としてＰＣＲ増幅を行うことを許容する、前記１４に記載のキット。
【0032】
１６．一本鎖ＤＮＡを調製するためのキットであって、
ポリメラーゼ連鎖反応に適したＤＮＡポリメラーゼと、
ＤＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４ ＤＮＡリガーゼと、
ウラシル特異的切除試薬、好ましくはウラシル特異的切除酵素と、
ローリングサークル増幅に適したＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと、
タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼと、を含む、キット。
ポリメラーゼ連鎖反応に適したＤＮＡポリメラーゼと、
ＤＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４ ＤＮＡリガーゼと、
ウラシル特異的切除試薬、好ましくはウラシル特異的切除酵素と、
ローリングサークル増幅に適したＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと、
タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼと、を含む、キット。
【0033】
１７．前記１４に記載の左の適応配列と右の適応配列、及び前記１５に記載のフォ
ワードプライマーとリバースプライマーを更に含む、前記１６に記載のキット。
ワードプライマーとリバースプライマーを更に含む、前記１６に記載のキット。
【0034】
１８．ＤＮＡリガーゼとウラシル特異的切除試薬は同一の容器に入れられる、前記１６又は１７に記載のキット。
【発明の効果】
【0035】
本発明で開発された一本鎖ＤＮＡの調製プロセスは、一連の高品質の一本鎖ＤＮＡ鋳型に係る方法を形成する。ほとんどの操作工程は、等温でインキュベートするという条件で行われるため、このプロセスは生産設備に対しても、スケールアップに対しても高い適応性を有する。また、調製原料は通常のプライマーと酵素製剤であり、輸入された高価なストレプトアビジン修飾磁気ビーズを必要とせず、一本鎖ＤＮＡを大量（数十μｇ）調製する場合、そのコストが大幅に削減される。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】実施例１においてウラシル修飾されたプライマーで合成された両端コネクタ付フラグメントにＰＣＲ増幅を行うことにより得られた生成物のアガロースゲル電気泳動結果である。
【図2】実施例１においてＢｓｐＱＩ制限エンドヌクレアーゼでヘアピン構造を切断した後に放出された標的フラグメントである長い一本鎖モノマーのアガロースゲル電気泳動結果である。
【図3】実施例１においてＢｓｐＱＩ制限エンドヌクレアーゼでヘアピン構造を切断した後に得られた生成物に磁気ビーズ精製を行う前後における生成物のアガロースゲル電気泳動結果である。レーン１は精製前の粗生成物であり、レーン２は磁気ビーズ精製後の生成物である。
【図4】実施例２においてウラシル修飾されたプライマーで合成された両端コネクタ付フラグメントにＰＣＲ増幅を行うことにより得られた生成物のアガロースゲル電気泳動結果である。
【図5】実施例２においてＢｓｐＱＩ制限エンドヌクレアーゼでヘアピン構造を切断した後に放出された標的フラグメントである長い一本鎖モノマーのアガロースゲル電気泳動結果である。
【図6】実施例２においてＢｓｐＱＩ制限エンドヌクレアーゼでヘアピン構造を切断した後に得られた生成物に磁気ビーズ精製を行った後における生成物のアガロースゲル電気泳動結果である。
【図7】実施例３においてウラシル修飾されたプライマーで合成された両端コネクタ付フラグメントにＰＣＲ増幅を行うことにより得られた生成物のアガロースゲル電気泳動結果である。
【図8】実施例３においてＢｓｐＱＩ制限エンドヌクレアーゼでヘアピン構造を切断した後に放出された標的フラグメントである長い一本鎖モノマーのアガロースゲル電気泳動結果である。
【図9】実施例３においてＢｓｐＱＩ制限エンドヌクレアーゼでヘアピン構造を切断した後に得られた生成物に磁気ビーズ精製を行った後における生成物のアガロースゲル電気泳動結果である。
【図10】実施例１で調製された生成物をハイスループットシーケンシング技術（ＮＧＳ）により測定した配列である。
【図11】実施例２で調製された生成物をハイスループットシーケンシング技術（ＮＧＳ）により測定した配列である。
【図12】実施例３で調製された生成物をハイスループットシーケンシング技術（ＮＧＳ）により測定した配列である。
【発明を実施するための形態】
【0037】
本発明で説明された方法をより明らかにするために、以下に図面及び実施例を参照して本発明を更に説明する。
【0038】
実施例１：
本実施例では、このプロセスにより長さが２５３ｎｔの長い一本鎖ＤＮＡを４８μｇ調製し、純度が９１％であり、配列正確度が１００％であった。
テストサンプルは長さが２５３ｎｔのＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）であった。
本実施例では、このプロセスにより長さが２５３ｎｔの長い一本鎖ＤＮＡを４８μｇ調製し、純度が９１％であり、配列正確度が１００％であった。
テストサンプルは長さが２５３ｎｔのＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）であった。
【0039】
本実施例の一本鎖ＤＮＡの調製過程は以下のとおりである。
【0040】
１）工程一（配列分析フロー）：生物情報学的ソフトウェアで分析したところ、配列にＢｓｐＱＩ酵素切断部位が含まれていないため、この酵素を最終切断酵素として選択した。
【0041】
２）工程二（プライマー設計フロー）：標的配列の両端にそれぞれ配列５’－ＡＡＣＴＡＴＡＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）と５’－ＣＣＴＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＡＴＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を付加して遺伝子合成を行い、ＰＣＲ増幅プライマーとしてフォワードプライマーＰｆ：５’－ＡＡＣＴＡＴＡＣＵＧＣＴＣＴＴＣＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）とリバースプライマーＰｒ：５’－ＴＡＴＡＧＴＵＧＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を用い、上記プライマーを合成した。
【0042】
３）工程三（鋳型増幅による調製－自動環化）：ウラシル修飾されたプライマー（Ｐｆ、Ｐｒ）で合成された両端コネクタ付フラグメントに増幅を行った。ＰＣＲ反応系は以下のとおりである。
【0043】
【表1】
【0044】
ＰＣＲ反応手順は以下のとおりである。
【0045】
【表2】
【0046】
ＰＣＲ生成物の電気泳動図は図１に示される。
【0047】
続いてこのＰＣＲ生成物を回収し、自己環化反応を行った。ＵＳＥＲ酵素とＴ４ ＤＮＡリガーゼでギャップ付環状二本鎖ＤＮＡを調製する自己環化反応系は以下のとおりである。
【0048】
【表3】
【0049】
反応条件として、３７℃で３０ｍｉｎ維持し、２０℃で３０ｍｉｎ維持し、４℃まで降温して保存した。
【0050】
４）工程四（ローリングサークル複製）：２００μｌのＰＣＲチューブに、工程三で調製されたギャップ付環状ＤＮＡサンプル１００ｎｇに対して、３０℃で４～８時間インキュベートし、続いて８０℃で２０ｍｉｎ維持して酵素を不活性化することにより、ローリングサークル複製を行った。ローリングサークル複製の反応系は以下のとおりである。
【0051】
【表4】
【0052】
５）工程五（アニーリング－自動折り畳み）：上記ローリングサークル複製生成物に対して、８０℃で５ｍｉｎ維持し、０．１℃／ｓで６５℃まで降温し、６５℃で５ｍｉｎ維持し、０．１℃／ｓで４２℃まで降温し、４２℃で５ｍｉｎ維持し、３７℃で５ｍｉｎ維持し、０．１℃／ｓで４℃まで降温し、続いて４℃で保存するように降温（アニーリング）を行うことにより、設計されたヘアピン構造を生成させた。
【0053】
６）工程六（制限エンドヌクレアーゼ切断－標的フラグメントである長い一本鎖モノマーの放出）：上記反応生成物に１０ｘ制限エンドヌクレアーゼ緩衝液を１５μｌ、前記で選択されたタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼを２μｌ添加し、ｄｄＨ２Ｏを容量１５０μｌになるまで添加し、制限エンドヌクレアーゼの最適な反応温度で６０ｍｉｎ静置し、続いて熱変性により不活性化した。反応粗生成物の電気泳動図は図２に示される。
【0054】
７）工程七（精製、濃縮）：制限エンドヌクレアーゼ切断生成物は標的フラグメントである一本鎖ＤＮＡ生成物、ヘアピン構造を含む。この標的配列の長さが３００ｎｔより短いため、磁気ビーズにより効率よく精製した。精製前後の比較は図３に示される。レーン１は粗生成物であり、レーン２は磁気ビーズ精製後の生成物であり、ヘアピン構造が効果的に除去され、純度が９１％であった。ハイスループットシーケンシング技術（ＮＧＳ）
でシーケンシング検証を行うことにより得られた配列結果は図１０に示され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と一致した。
でシーケンシング検証を行うことにより得られた配列結果は図１０に示され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と一致した。
【0055】
実施例２：
本実施例では、このプロセスにより長さが１３５０ｎｔの長い一本鎖ＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を４０μｇ調製し、純度が９７％であり、配列正確度が１００％であった。
本実施例では、このプロセスにより長さが１３５０ｎｔの長い一本鎖ＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を４０μｇ調製し、純度が９７％であり、配列正確度が１００％であった。
【0056】
テストサンプルは長さが１３５０ｎｔのＤＮＡ配列であった。
本実施例の長い一本鎖ＤＮＡの調製過程は以下のとおりである。
本実施例の長い一本鎖ＤＮＡの調製過程は以下のとおりである。
【0057】
１）工程一（配列分析フロー）：生物情報学的ソフトウェアで分析したところ、配列にＢｓｐＱＩ酵素切断部位が含まれていないため、この酵素を最終切断酵素として選択した。
【0058】
２）工程二（プライマー設計フロー）：標的配列の両端にそれぞれ配列５’－ＡＡＣＴＡＴＡＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡ－３’と５’－ＣＣＴＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＡＴＡ－３’を付加して遺伝子合成を行い、ＰＣＲ増幅プライマーとしてフォワードプライマーＰｆ：５’－ＡＡＣＴＡＴＡＣＵＧＣＴＣＴＴＣＡ－３’とリバースプライマーＰｒ：５’－ＴＡＴＡＧＴＵＧＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧ－３’を用い、プライマー合成を行った。
【0059】
３）工程三（鋳型増幅による調製－自動環化）：ウラシル修飾されたプライマー（Ｐｆ、Ｐｒ）で合成された両端コネクタ付フラグメントに増幅を行った。ＰＣＲ反応系は以下のとおりである。
【0060】
【表5】
【0061】
ＰＣＲ反応手順は以下のとおりである。
【0062】
【表6】
【0063】
ＰＣＲ生成物の電気泳動図は図５に示される。
【0064】
続いてこのＰＣＲ生成物を回収し、自己環化反応を行った。ＵＳＥＲ酵素とＴ４ ＤＮＡリガーゼでギャップ付環状二本鎖ＤＮＡを調製する自己環化反応系は以下のとおりである。
【0065】
【表7】
【0066】
反応条件として、３７℃で３０ｍｉｎ維持し、２０℃で３０ｍｉｎ維持し、４℃まで降温して保存した。
【0067】
４）工程四（ローリングサークル複製）：１．５ｍｌの遠心管に、工程三で調製されたギャップ付環状ＤＮＡサンプル１００ｎｇに対して、３０℃で４～８時間インキュベートし、続いて８０℃で２０ｍｉｎ維持して酵素を不活性化することにより、ローリングサークル複製を行った。ローリングサークル複製の反応系（８ｍｌの反応系）は以下のとおりである。
【0068】
【表8】
【0069】
５）工程五（アニーリング－自動折り畳み）：上記ローリングサークル複製生成物に対して、８０℃で５ｍｉｎ維持し、０．１℃／ｓで６５℃まで降温し、６５℃で５ｍｉｎ維持し、０．１℃／ｓで４２℃まで降温し、４２℃で５ｍｉｎ維持し、３７℃で５ｍｉｎ維持し、０．１℃／ｓで４℃まで降温し、続いて４℃で保存するように降温（アニーリング）を行うことにより、設計されたヘアピン構造を生成させた。
【0070】
６）工程六（制限エンドヌクレアーゼ切断－標的フラグメントである長い一本鎖モノマーの放出）：上記反応生成物に１０ｘ制限エンドヌクレアーゼ緩衝液を１５０μｌ、前記で選択されたタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼを２０μｌ添加し、ｄｄＨ２Ｏを容量１５００μｌになるまで添加し、制限エンドヌクレアーゼの最適な反応温度で６０ｍｉｎ静置し、続いて熱変性により不活性化した。反応粗生成物の電気泳動図は図５に示される。
【0071】
７）工程七（精製、濃縮）：制限エンドヌクレアーゼ切断生成物は標的フラグメントである一本鎖ＤＮＡ生成物、ヘアピン構造を含む。この標的配列の長さが３００ｎｔより長いため、アガロースゲル電気泳動により切断、回収、精製した。精製後の最終生成物の電気泳動図は図６に示される。レーン１は精製後の生成物であり、ヘアピン構造と二本鎖ＤＮＡの汚染がいずれも効果的に除去され、純度が９７％であり、配列正確度が１００％であった。ハイスループットシーケンシング技術（ＮＧＳ）でシーケンシング検証を行うことにより得られた配列結果は図１１に示され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と一致した。
【0072】
実施例３：
本実施例では、このプロセスにより長さが２３５０ｎｔの長い一本鎖ＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を１０μｇ調製し、純度が９３％であり、配列正確度が１００％であった。
本実施例では、このプロセスにより長さが２３５０ｎｔの長い一本鎖ＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を１０μｇ調製し、純度が９３％であり、配列正確度が１００％であった。
【0073】
テストサンプルは長さが２３５０ｎｔのＤＮＡ配列であった。
本実施例の長い一本鎖ＤＮＡの調製過程は以下のとおりである。
本実施例の長い一本鎖ＤＮＡの調製過程は以下のとおりである。
【0074】
１）工程一（配列分析フロー）：生物情報学的ソフトウェアで分析したところ、配列にＢｓｐＱＩ酵素切断部位が含まれていないため、この酵素を最終切断酵素として選択した。
【0075】
２）工程二（プライマー設計フロー）：標的配列の両端にそれぞれ配列５’－ＡＡＣＴＡＴＡＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡ－３’と５’－ＣＣＴＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＡＴＡ－３’を付加して遺伝子合成を行い、ＰＣＲ増幅プライマーとしてフォワードプライマーＰｆ：５’－ＡＡＣＴＡＴＡＣＵＧＣＴＣＴＴＣＡ－３’とリバースプライマーＰｒ：５’－ＴＡＴＡＧＴＵＧＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧ－３’を用い、プライマー合成を行った。
【0076】
３）工程三（鋳型増幅による調製－自動環化）：ウラシル修飾されたプライマー（Ｐｆ、Ｐｒ）で合成された両端コネクタ付フラグメントに増幅を行った。ＰＣＲ反応系は以下のとおりである。
【0077】
【表9】
【0078】
ＰＣＲ反応手順は以下のとおりである。
【0079】
【表10】
【0080】
ＰＣＲ生成物の電気泳動図は図７に示される。
【0081】
続いてこのＰＣＲ生成物を回収し、自己環化反応を行った。ＵＳＥＲ酵素とＴ４ ＤＮＡリガーゼでギャップ付環状二本鎖ＤＮＡを調製する自己環化反応系は以下のとおりである。
【0082】
【表11】
【0083】
反応条件として、３７℃で３０ｍｉｎ維持し、２０℃で３０ｍｉｎ維持し、４℃まで降温して保存した。
【0084】
４）工程四（ローリングサークル複製）：１．５ｍｌの遠心管に、工程三で調製されたギャップ付環状ＤＮＡサンプル１００ｎｇに対して、３０℃で４～８時間インキュベートし、続いて８０℃で２０ｍｉｎ維持して酵素を不活性化することにより、ローリングサークル複製を行った。ローリングサークル複製の反応系（最終反応系は４ｍｌであり、１ｍｌ／管で反応させた）は以下のとおりである。
【0085】
【表12】
【0086】
５）工程五（アニーリング－自動折り畳み）：上記ローリングサークル複製生成物に対して、８０℃で５ｍｉｎ維持し、０．１℃／ｓで６５℃まで降温し、６５℃で５ｍｉｎ維持し、０．１℃／ｓで４２℃まで降温し、４２℃で５ｍｉｎ維持し、３７℃で５ｍｉｎ維持し、０．１℃／ｓで４℃まで降温し、続いて４℃で保存するように降温（アニーリング）を行うことにより、設計されたヘアピン構造を生成させた。
【0087】
６）工程六（制限エンドヌクレアーゼ切断－標的フラグメントである長い一本鎖モノマーの放出）：上記反応生成物に１０ｘ制限エンドヌクレアーゼ緩衝液を１５０μｌ、前記で選択されたタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼを２０μｌ添加し、ｄｄＨ２Ｏを容量１５００μｌになるまで添加し、制限エンドヌクレアーゼの最適な反応温度で６０ｍｉｎ静置し、続いて熱変性により不活性化した。反応粗生成物の電気泳動図は図９に示される。
【0088】
７）工程七（精製、濃縮）：制限エンドヌクレアーゼ切断生成物は標的フラグメントである一本鎖ＤＮＡ生成物におけるヘアピン構造を含む。この標的配列の長さが３００ｎｔより長いため、アガロースゲル電気泳動により切断、回収、精製した。精製後の最終生成物の電気泳動図は図９に示される。レーン１は精製前の粗生成物であり、レーン２は精製後の生成物であり、ヘアピン構造と二本鎖ＤＮＡの汚染がいずれも効果的に除去され、純度が９５％であり、配列正確度が１００％であった。ハイスループットシーケンシング技術（ＮＧＳ）でシーケンシング検証を行うことにより得られた配列結果は図１２に示され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と一致した。
【0089】
上記三つの実施例に示されるように、本方法は、長さが１５０～２５００ｎｔの長い一本鎖ＤＮＡを生産するために用いることができる。この方法は様々な長さの配列に共通であり、機器設備に対する要求が低く、スケールアップが容易である。精製後の長い一本鎖ＤＮＡは、純度が高く、配列忠実度が１００％であり、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集の効率的な遺伝子ノックイン鋳型としての使用に適している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】