特許 7550787 タンジェンシャルフロー濾過により低分子量ヘパリンを得る方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-05

(45)【発行日】2024-09-13

(54)【発明の名称】タンジェンシャルフロー濾過により低分子量ヘパリンを得る方法

(51)【国際特許分類】

   C08B 37/10 20060101AFI20240906BHJP

【ＦＩ】

C08B37/10

【請求項の数】 22

(21)【出願番号】P 2021559706

(86)(22)【出願日】2020-04-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-29

(86)【国際出願番号】 ES2020070263

(87)【国際公開番号】W WO2020216981

(87)【国際公開日】2020-10-29

【審査請求日】2023-02-22

(31)【優先権主張番号】P201930373

(32)【優先日】2019-04-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】ES

(31)【優先権主張番号】202010078241.3

(32)【優先日】2020-01-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】519346804

【氏名又は名称】ラボラトリオス ファーマシューティコス ロヴィ エス．エー．

(74)【代理人】

【識別番号】100133503

【弁理士】

【氏名又は名称】関口 一哉

(72)【発明者】

【氏名】フランコ ロドリゲス，ギレルモ

(72)【発明者】

【氏名】グティエロ アドゥリズ，イボン

【審査官】中村 政彦

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０３９３６８８９（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０５９８５４５４（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０２７３１６８３（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０３２１４５９７（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０３３４２７６１（ＣＮ，Ａ）

【文献】特開２００１－１８７８０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８－５４３９８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許第０５７６７２６９（ＵＳ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０８Ｂ ３７／００

Ａ６１Ｋ ３１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

３．０～５．０ｋＤａの平均分子量分布を有する低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）を得る方法であって、
ａ）０．６～１０ｋＤａのオリゴ糖鎖の分布範囲および最大４％ｗ／ｖのヘパリン濃度を有する粗解重合ヘパリン溶液を提供するステップ、
ｂ）最大２５％ｗ／ｖのヘパリン濃度を達成するために、公称カットオフが１ｋＤａの膜を用いた水相タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による少なくとも１つの濃縮ステップを行うステップ、を含み、
ステップ（ｂ）では、最大１０％ｗ／ｖのヘパリン濃度を達成するためのＴＦＦによる第１の濃縮ステップと、１０％～２５％ｗ／ｖのヘパリン濃度を達成するためのＴＦＦによる第２の濃縮ステップが実行される、方法。

【請求項2】

前記第２の濃縮ステップが、１２％～２２％ｗ／ｖのヘパリン濃度まで実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップ（ａ）の前記ヘパリン溶液を清澄化するステップが実行される、請求項１－２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項4】

少なくとも１つの深層濾過ステップが実行される、請求項１－３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記深層濾過ステップが、１つだけのＴＦＦ濃縮ステップが実行される場合に前記ＴＦＦ濃縮ステップの前に、２つ以上の前記ＴＦＦ濃縮ステップが実行される場合に第１のＴＦＦ濃縮ステップの前に実行される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記深層濾過ステップが、１つだけの前記ＴＦＦ濃縮ステップが実行される場合に前記ＴＦＦ濃縮ステップに続いて実行され、２つ以上のＴＦＦ濃縮ステップが実行される場合に前記第１のＴＦＦ濃縮ステップの前に実行される、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

水による透析濾過の少なくとも１つのステップが実行される、請求項１－６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記透析濾過ステップが、１つだけの前記ＴＦＦ濃縮ステップが実行される場合に前記ＴＦＦ濃縮ステップの前に、２つ以上の前記ＴＦＦ濃縮ステップが実行される場合に前記第１のＴＦＦ濃縮ステップの前に実行される、請求項７に記載のヘパリンを得るための方法。

【請求項9】

Ｈ_２Ｏ_２による処理の少なくとも１つのステップを含む、請求項１－８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記Ｈ_２Ｏ_２処理ステップは、１つだけの前記ＴＦＦ濃縮ステップが実行される場合に前記ＴＦＦ濃縮ステップに続いて実行され、２つ以上のＴＦＦ濃縮ステップが実行される場合に前記第１のＴＦＦ濃縮ステップの前に実行される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記Ｈ_２Ｏ_２処理ステップは、１つだけの前記ＴＦＦ濃縮ステップが実行される場合に前記ＴＦＦ濃縮ステップの前に、２つ以上のＴＦＦ濃縮ステップが実行される場合に前記第１のＴＦＦ濃縮ステップの前に実行される、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

得られた濃縮物を凍結乾燥させるステップが実行される、請求項１－１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記粗解重合ヘパリンが分画沈殿によって得られない、請求項１－１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記方法全体がヘパリンの分画沈殿を除外する、請求項１－１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

得られたＬＭＷＨの分子量（Ｍｗ）が、

という範囲にある、請求項１－１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

粗解重合ヘパリンの分子量（Ｍｗ）が、

という範囲にある、請求項１－１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

得られたＬＭＷＨの分子量（Ｍｗ）が、

という範囲にある、請求項１－１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

粗解重合ヘパリンの分子量（Ｍｗ）が、

という範囲にある、請求項１－１４または１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による濃縮では、０．７～１ｋＤａの膜を用いる、請求項１－１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

０．９～１ｋＤａの膜が用いられる、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

１ｋＤａの膜が用いられる、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）がエノキサパリンナトリウムである、請求項１－２１のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、タンジェンシャルフロー濾過による少なくとも１つの濃縮ステップを含む、特定の分子量分布を有する低分子量ヘパリンを得るための方法に関する。タンジェンシャルフロー濾過濃縮のほかに、本方法は、透析濾過または過酸化水素処理などの他のステップを含み得る。したがって、本発明は、製薬技術の分野に含まれ得る。

【背景技術】

【0002】

ヘパリンは、グリコサミノグリカンファミリーの多糖類であり、ウロン酸（Ｌ－イズロン酸またはＤ－グルクロン酸）とＤ－グルコサミンが交互に結合することで形成される。Ｌ－イズロン酸は、２－Ｏ－硫酸化されてもよく、Ｄ－グルコサミンは、Ｎ－硫酸化および／または６－Ｏ－硫酸化されてもよく、さらに少ない程度でＮ－アセチル化または３－Ｏ－硫酸化されてもよい。ヘパリンは、好ましくは、ナトリウム塩として使用されるが、他のアルカリ金属やアルカリ土類金属の塩としても使用でき、主に抗血栓薬や抗凝固薬として使用される。

【0003】

ヘパリンは、その分子量に応じて未分画ヘパリン（ＵＦＨ）、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）および超低分子量ヘパリン（ＶＬＭＷＨ）に分類され得る。ＬＭＷＨとＶＬＭＷＨは、元のＵＦＨ分子を解重合して得られる。

【0004】

いかなる場合で、ＵＦＨならびに公知の解重合方法（酵素法、亜硝酸法、β－脱重合法など）で得られた様々なＬＭＷＨやＶＬＭＷＨについて、現在の精製プロセスは、それらのオリゴ糖鎖をアルコール（主にメタノールとエタノール）、少ない程度でアセトンなどの他の溶媒で選択的に沈殿させることによって実行される。目的製品に含まれる水溶液の量に対して、数倍の量のアルコールが使用され、さらに一般的に数回の精製が必要であることを考慮すると、産業的な観点から、この精製方法は、その管理、保管およびリサイクルに関して発生するアルコール廃棄物の量という点で問題となる。

【0005】

したがって、廃棄物管理の観点から、アルコールの使用を必要としない他の精製代替手段がより興味深い。目的製品を含む水溶液を、適切な孔径の膜に対いして透析することは、代替手段であるが、大量の水に対して透析するという欠点があり、また、最適化されたラボスケールプロセスを産業スケールにまで拡大することは困難である。

【0006】

先行技術に鑑み、本発明よりはるかに複雑であるにもかかわらず、あるいはアルコール系溶媒の存在を伴うにもかかわらず、エノキサパリンナトリウムを得る方法は、数多く存在する。

【0007】

したがって、特許文献ＣＮ１０３３４２７６１には、アルコール溶媒の存在下で分解製品および低分子量の不純物を除去し製品の分子量および分子量分布を制御するという目的で、それぞれ８ｋＤａと２ｋＤａの膜による２回の連続限外濾過を含むエノキサパリンナトリウムを製造する方法が開示されている。精製された製品を得ると、それを凍結乾燥してエノキサパリンナトリウムを得る。この場合、この特許のプロセスから得られたエノキサパリンナトリウムの構造に収容できる溶媒および水分を除去するために、凍結乾燥が行われる。

【0008】

また、特許文献ＣＮ１０２０５０８８８には、１ｋＤａの膜濃縮ステップおよびその後の凍結乾燥を有するアルコール溶媒の存在下でのエノキサパリンナトリウムの最終精製プロセスが開示され、製品の分子量および分子量分布は、さらに制御される。前の特許と同様に、この特許のプロセスから得られたエノキサパリンナトリウムの構造に収容できる溶媒および水分を除去するために、凍結乾燥が行われる。

【0009】

多糖類の製造および／または精製のための他のプロセスは、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏｓ Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃｏｓ ＲＯＶＩ，Ｓ．Ａ．のＥＳ２１６１６１５Ａ１、ＦｌｅｎｇｓｒｕｄのＵＳ２００９１０５１９４Ａ１、ＨｉｒｓｈのＵＳ５７６７２６９、Ｓｏｌａｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．のＷＯ２０１０／１１１７１０Ａ１、Ｍｉｃｈｏｎ，ＧｒｉｆｆｉｎらのＵＳ２００７／０１５４４９２Ａ１（「粗ブタ腸管粘膜ペプチドグリカンヘパリンからのヘパラン硫酸の単離および特徴付け」Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．（１９９５），２７６，１８３－１９７）、およびＣａｓｕのＵＳ５１１０９１８という先行技術に開示されている。これらのプロセスでは、解重合ヘパリンの分画沈殿が必要である。

【0010】

最も近い先行技術を考えると、注目すべきなのは、以前のすべての文献が、プロセスのある段階または別の段階でアルコールを使用するという欠点を有することであり、これは、環境への関心が高まっている現在では望ましくない。いくつかの文献では、タンジェンシャル濾過ステップの１つに、塩を有する緩衝材が使用されている。しかし、採用した孔径および先行技術文献で示されたパラメータによる分子量の制御は、特定のものではなく、得られたエノキサパリンナトリウムの特定の構造プロファイルを定義することができない。したがって、アルコールを使用しない、ＬＭＷＨを得る簡略された効率的な方法を提供することが望まれ、これにより、連続的に実行できる方式で得られた製品のプロファイルを制御することもできる。

【発明の概要】

【0011】

代替手段として、本発明は、非アルコール性の透析濾過緩衝液を用いるタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を利用し、これは、形成された製品における残留溶媒量を最小限に抑え、したがって、製品の純度プロファイルを向上させるため、先行技術に記載されている方法に比べて大きな利点がある。さらに、本明細書で設計された方法は、構造的な調整を必要とせずに得られた製品のプロファイリングを可能にするように、連続的に実行できる方法を提供する。分画沈殿物による精製を含む製造方法に比べて、この方法は、製造時間が最小限に抑えられ、その結果、コスト削減の改善および生産能力の向上が図られる。

【0012】

本発明のプロセスのいくつかの実施形態では、粗解重合ヘパリンは、ヘパリン解重合プロセスの製品である。いくつかの実施形態では、本発明のプロセスは、解重合ヘパリンの分画沈殿を使用せず、特に、ヘパリンの解重合によって製造された解重合ヘパリンの分画沈殿を使用しない。さらに、本発明では、低分子量ヘパリンが、ａ）ヘパリンを解重合して粗解重合ヘパリンを形成するステップ、およびｂ）粗解重合ヘパリンをＴＦＦ（後述の膜を用いた濃縮および／または透析濾過）により、分画沈殿を使用せずに精製するステップ、という２つの主要なステップで製造される実施形態を考慮している。

【0013】

いくつかの実施形態では、解重合ヘパリンは、エノキサパリンナトリウムまたはベミパリンナトリウム、好ましくはエノキサパリンナトリウムである。

【0014】

本発明のプロセスのいくつかの実施形態では、粗エノキサパリンナトリウム（またはベミパリンナトリウム）は、ヘパリン解重合プロセスの製品である。いくつかの実施形態では、本発明のプロセスは、エノキサパリンナトリウム（またはベミパリンナトリウム）の分画沈殿を使用せず、特に、ヘパリンの解重合によって製造されたエノキサパリンナトリウム（またはベミパリンナトリウム）の分画沈殿を使用しない。さらに、本発明では、エノキサパリンナトリウム（またはベミパリンナトリウム）が、ａ）ヘパリンを解重合して、分画沈殿を使用せずに粗エノキサパリンナトリウム（またはベミパリンナトリウム）を形成するステップ、およびｂ）粗エノキサパリンナトリウム（またはベミパリンナトリウム）をＴＦＦ（後述の膜を用いた濃縮および／または透析濾過）により、分画沈殿を使用せずに精製するステップ、という２つの主要なステップで製造される実施形態を考慮している。

【0015】

いくつかの実施形態では、エノキサパリンの分子量（Ｍｗ）は、以下の範囲内である。

【0016】

いくつかの実施形態では、ベミパリンの分子量（Ｍｗ）は、以下の範囲内である。

【0017】

本発明で採用した方法の実施を可能にするパラメータを制御するために、幅広い分子量の製品への使用を可能にする特定の孔径を有する特定の濾過膜を選択する。利用可能な膜は、一般に、公称カットオフが１ｋＤａ－１０００ｋＤａ（または≦１ｋＤａ）の範囲である。公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）は、膜によって９０％保持される溶質の最小分子量として定義され、かつ異なる分子量の成分の膜保持を評価して決定される（図６）。

【0018】

平均分子量がそれぞれ３６００と４４００ＤａのベミパリンナトリウムまたはエノキサパリンナトリウムなどのＬＭＷＨにおいて、孔径が大きくなると最低分子量のオリゴ糖鎖が失われるため、利用可能な膜の範囲は、公称カットオフが約１ｋＤａ以下のものに限られる。

【0019】

本発明の発明者らは、アルコールまたは他の有機溶媒や塩類で緩衝された媒体を使用せずに、ＴＦＦによる濃縮によって、ＬＭＷＨ、特に、エノキサパリンナトリウムおよびベミパリンナトリウムを得ることを可能にする方法を開発し、これにより、欧州薬局方（最新版）および米国薬局方（最新版）の本製品のモノグラフに記載されているパラメータに従って、先行文献に記載されているものよりも向上の純度、適切な品質属性を有する製品を得る。さらに、製品は、平均分子量プロファイルおよびオリゴ糖鎖分布が薬理学的応用に適している。

【0020】

第１の態様では、本発明は、約３．０～約５．０ｋＤａの平均分子量分布を有する低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）を得る方法に関し、

【0021】

ａ）約０．６～約１０ｋＤａのオリゴ糖鎖の分布範囲および最大約４％ｗ／ｖのヘパリン濃度を有する解重合ヘパリン溶液を提供するステップし、

【0022】

ｂ）約１ｋＤａの公称カットオフ膜を用いた水相タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による濃縮ステップを行って最大約２５％ｗ／ｖのヘパリン濃度を達成するステップ、を含む。

【0023】

好ましくは、ステップａ）の溶液は、水溶液である。

【0024】

ステップａ）におけるヘパリン濃度は、好ましくは約３％～約４％ｗ／ｖ、より好ましくは約３．５％～約４％ｗ／ｖ、さらに好ましくは約４％ｗ／ｖである。

【0025】

好ましくは、タンジェンシャルフロー濾過による濃縮に使用される膜は、約０．７～約１ｋＤａ、より好ましくは約０．９～約１ｋＤａの公称カットオフを有する。特定の実施形態では、約１ｋＤａの公称カットオフを有する。

【0026】

タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）ならびに本発明の方法の残りのステップ（清澄化、深層濾過、透析濾過、Ｈ_２Ｏ_２による処理）は、アルコールや任意のその他の有機溶媒を使用せずに水相で行うことができる。

【0027】

ステップｂ）は、約２５％ｗ／ｖまでの最大ヘパリン濃度を達成するまで、約≦１ｋＤａの公称カットオフ膜、例えば１、２または３を用いた水相タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による少なくとも１つの濃縮ステップを行うことを含み得る。

【0028】

ステップｂ）では、得られたヘパリン濃度は、少なくとも５％ｗ／ｖ、好ましくは少なくとも８％ｗ／ｖであり得る。好ましくは、ステップｂ）において、少なくとも１０％ｗ／ｖ、好ましくは約１０％～約２５％ｗ／ｖ、より好ましくは約１０％～約２２％ｗ／ｖ、さらに好ましくは約１０％～約２０％のヘパリン濃度が得られる。特定の実施形態では、ステップｂ）において、約１０％～約２２％ｗ／ｖのヘパリン濃が得られる。

【0029】

一実施形態では、ステップｂ）において、ＴＦＦによる単一の濃縮ステップを行う。特定の実施形態では、ステップｂ）において、少なくとも１０％ｗ／ｖ、好ましくは約１０％～約２２％ｗ／ｖ、より好ましくは約１２％～約２２％ｗ／ｖのヘパリン濃度が得られるまで、ＴＦＦによる単一の濃縮ステップを行う。

【0030】

本発明の別の実施形態によれば、ステップｂ）において、少なくとも５％ｗ／ｖ、好ましくは少なくとも１０％ｗ／ｖ、より好ましくは約５％～約１５％ｗ／ｖまたは約１０％～約２２％ｗ／ｖのヘパリン濃度が得られるまで、ＴＦＦによる単一の濃縮ステップを行う。

【0031】

追加の実施形態では、本発明のプロセスは、

【0032】

ａ）０．６～１０ｋＤａのオリゴ糖鎖の分布範囲、および約３％～約４％ｗ／ｖ、好ましくは４％ｗ／ｖのヘパリン濃度を有する解重合ヘパリン溶液を提供することと、

【0033】

ｂ）≦１ｋＤａの公称カットオフ膜を用いた水相タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による単一の濃縮ステップを行って最大２５％ｗ／ｖ、好ましくは約１２％～約２２％ｗ／ｖのヘパリン濃度を達成することと、を含む。

【0034】

別の実施形態では、ステップｂ）は、ＴＦＦによる２つの濃縮ステップを含む。

【0035】

好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）において、ＴＦＦによって第１の濃縮を行って約４％～約１０％ｗ／ｖ、好ましくは約５％～約１０％ｗ／ｖのヘパリン濃度を達成し、かつＴＦＦによって第２の濃縮を行って約１０％～約２５％ｗ／ｖのヘパリン濃度を達成する。より好ましい実施形態では、第２の濃縮ステップは、約１２％～約２５％ｗ／ｖ、より好ましくは約１２％～約２２％ｗ／ｖのヘパリン濃度を達成する。

【0036】

別の好ましい実施形態では、ＴＦＦによる濃縮は、約４％ｗ／ｖ～約１２－２２％ｗ／ｖ（または約１０－２５％ｗ／ｖ）で単一のステップで行われる。

【0037】

本発明のプロセスは、清澄化、深層濾過、水による透析濾過、過酸化水素による処理、または凍結乾燥などの１つ以上の追加のステップを含み得る。

【0038】

別の好ましい実施形態では、ステップ（ａ）のヘパリン溶液を清澄化する少なくとも１つのステップが行われる。

【0039】

別の好ましい実施形態では、ＴＦＦ濃縮ステップのいずれか１つの前または後に、少なくとも１つの深層濾過ステップが行われる。例えば、（そのようなステップが１つだけ実行される場合）ＴＦＦ濃縮ステップの前または後、またはステップｂが２つ以上のそのようなステップを含む場合、第１のＴＦＦ濃縮ステップの前または後である。

【0040】

別の好ましい実施形態では、ＴＦＦ濃縮ステップのいずれか１つの前または後に、少なくとも１つの透析濾過ステップが水で行われる。例えば、ＴＦＦ濃縮ステップの前または後、あるいは、ステップｂ）が複数のそのようなステップを含む場合、第１のＴＦＦ濃縮ステップの前または後である。

【0041】

好ましい実施形態では、Ｈ_２Ｏ_２による処理ステップは、ＴＦＦ濃縮ステップの前に行われ、あるいは、ステップｂ）が複数のＴＦＦ濃縮ステップを含む場合、いずれか１つの濃縮ステップの前に行われる。例えば、ステップｂ）が２つのＴＦＦ濃縮ステップを含む場合、Ｈ_２Ｏ_２による処理ステップは、第１の濃縮ステップの前、または第２の濃縮ステップの前に行われ得る。

【0042】

別の好ましい実施形態では、ＴＦＦ濃縮ステップの前、または（ステップｂ）が複数のＴＦＦ濃縮ステップを含む場合）第１のＴＦＦ濃縮ステップの前、または前述のＨ_２Ｏ_２による処理ステップの前に、少なくとも１つの水による透析濾過ステップが行われる。

【0043】

別の好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）で得られた濃縮物を凍結乾燥させるステップが行われる。

【0044】

本発明では、「ＬＭＷＨ」とは、平均分子量が約８０００Ｄａ未満のヘパリンを意味すると理解される。本発明の方法は、製造プロセスに関連する、一般的に低分子量（＜５００Ｄａ）の不純物を除去することを１つの目的とするが、使用可能な膜は、理想的には、オリゴ糖鎖を失わずに低分子量の不純物を除去できるように、ＬＭＷＨの平均分子量よりも低いカットオフを有するため、限られている。好ましくは、採用した膜の公称カットオフは、得られる分子量によって異なるが、≦１ｋＤａである。

【0045】

当業者であれば分かるように、ＴＦＦによる濃縮の様々なステップのうち、好ましくは、膜の洗浄および／または再生に必要なメンテナンスステップは、水、ＮａＯＨまたは任意のその他の製品を使用して、その明細書に従って実行される。

【0046】

本明細書は、本発明の特徴を組み合わせた１つ以上の実施形態を説明している。本発明の範囲は、ここで記載されている実施形態のみに限定されるものではない。本発明は、本文書に開示されている様々な態様や実施形態のすべての組み合わせやサブ組み合わせを含む。本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明、特許請求の範囲および添付図面を参照して明らかになろう。

【図面の簡単な説明】

【0047】

ここで添付され、かつ本明細書の一部を構成する添付図面は、本発明の１つ以上の実施形態を示し、本明細書とともに、本発明の原理の説明にも寄与し、当業者であれば、本発明を再現して使用することができる。以下の図面は、説明のみのために使用され、本発明の全範囲を限定するものではない。

【0048】

【図1】ノーマルフロー濾過とタンジェンシャルフロー濾過の比較模式図である。

【図2】タンジェンシャル濾過プロセスの一般的な模式図である。

【図3】濃縮と透析濾過プロセスの比較図である。

【図4A】および

【図4B】本発明による精製プロセスの模式図である。

【図5A】－

【図5D】平均分子量（図５Ａ）と分子量分布（図５Ｂ：＜２０００ｋＤａ、図５Ｃ：＞８０００ｋＤａ、図５Ｄ：２０００－８０００ｋＤａ）の両方の変化を表す様々なグラフを含み、分子量分布は、第２の濃度では、再生液中の製品の公称濃度の１０％～２０％で直線的である。

【図6】公称カットオフの定義である。

【発明を実施するための形態】

【0049】

本発明において、「タンジェンシャルフロー濾過」または「ＴＦＦ」とは、濾過される溶液がフィルターの表面上を接線方向に通過し、これにより発生する圧力差によって孔径よりも小さい成分を通過させる（透過させる）ことを可能にする濾過技術として理解される。大きな成分は、フィルター上に保持され、かつ供給タンク（保持液）戻される。

【0050】

本発明において、「清澄化」とは、溶液中に存在する懸濁液中の粒子を除去するために行われる濾過、例えば、１－６０ミクロン、好ましくは１－２５ミクロンのフィルターによって行われる濾過として理解される。

【0051】

本発明では、「深層濾過」とは、粒子の保持を援助する多段階ラビリンス濾材を使用する濾過を意味すると理解される。溶解の濁度が減少するように、大きな粒子表面に保持され、かつ細かい粒子が内層に閉じ込められている濾材の内側に向かってそれらの経路に沿って流れがる。特定の実施形態では、濾過は、１－５ミクロン、好ましくは２－４ミクロンのフィルターで行われる。濾過は、水または緩衝液で行うことができる。

【0052】

本発明では、「濃縮」とは、保持された製品が透過液を除去することでその溶液中の濃度を高めるタンジェンシャル濾過ステップとして理解される（図３を参照）。

【0053】

本発明では、「透析濾過」とは、透過液が除去される間、溶液中の保持液の濃度が変化しないように、溶液に同じ水流量の緩衝液が供給されるタンジェンシャル濾過ステップとして理解される（図３を参照）。この場合、ＴＦＦによる濃縮に使用される膜を使用することができ、つまり、公称カットオフが約≦１ｋＤａ、好ましくは約０．７～約１ｋＤａ、より好ましくは約０．９～約１ｋＤａ、さらに好ましくは約１ｋＤａの膜を使用することができる。

【0054】

一実施形態では、ヘパリン（解重合後）は、ヘパリンのナトリウム塩、例えば、エノキサパリンナトリウムまたはベミパリンナトリウムである。

【0055】

粗エノキサパリンナトリウムは、豚の腸管粘膜から得られたヘパリンのベンジルエステルをアルカリ（例えば、ＮａＯＨ）で解重合することで得ることができる。

【0056】

１つの特定の実施形態では、エノキサパリンナトリウムの解重合後に得られる製品は、処理されないエノキサパリンナトリウムを含むことに加えて、ヘパリンのベンジルエステルのアルカリ性媒体中でのケン化に対応する不純物と、破断プロセス中に行われたｐＨ調整に対応する塩とを含有する溶液に相当する。本発明の一実施形態によれば、ＴＦＦプロセスは、処理されないエノキサパリンナトリウム溶液に対して実行され、これによりこの溶液の濃縮は、一方では低分子量の不純物を除去し、他方では過酸化水素による漂白処理を実行するのに適切な濃度に達することを目的として実行される。代替的には、ＴＦＦによる濃縮ステップの前に、Ｈ_２Ｏ_２による漂白処理を行うことが可能である。これらのステップは、粗製品（粗解重合ヘパリン）の分画沈殿を使用せずに実行することができる。

【0057】

代替的には、ＴＦＦによる濃縮ステップの前に、Ｈ_２Ｏ_２による漂白処理を行うことが可能である。

【0058】

さらに、濃縮ステップの前または後に、低分子量不純物を完全に除去するために、透析濾過プロセス（選択可能）を実行できる。このステップの終了に、生成された生理食塩水の不純物を除去し、かつ溶液の平均分子量が監視される低分子量のオリゴ糖鎖の含有量を調整するために、任意で第２の濃縮を行い、最適値に達した後、凍結乾燥して適切な純度のエノキサパリンナトリウムを得る。

【0059】

したがって、１つの特定の実施形態では、本発明のプロセスは、

【0060】

ａ）０．６～１０ｋＤａのオリゴ糖鎖の分布範囲および約４％ｗ／ｖのエノキサパリンナトリウムの濃度を有する解重合ヘパリン溶液を提供することと、

【0061】

ｂ）最大約２５％ｗ／ｖ、最大約１０％ｗ／ｖ、または好ましくは約５％～約１０％ｗ／ｖのヘパリン濃度を得るまで、公称カットオフが１ｋＤａ以下の膜を用いた水相におけるＴＦＦによる濃縮ステップを実行することと、

【0062】

ｃ）任意で、ステップｂ）の前または後に、水（例えば、非緩衝水）を用いて透析濾過ステップを行うことと、

【0063】

ｄ）ステップｂ）の前または後に、Ｈ_２Ｏ_２による処理ステップを行うことと、

【0064】

ｅ）任意で、最大２５％ｗ／ｖ、好ましくは約１２％～約２５％ｗ／ｖのヘパリン濃度を達成するために、１ｋＤａ以下の公称カットオフ膜を用いた水相ＴＦＦによる単一の濃縮ステップを行うことと、

【0065】

ｆ）得られた製品に対して凍結乾燥ステップを行うことと、を含む。

【0066】

特定の実施形態では、本発明のプロセスは、

【0067】

ａ）約０．６～約１０ｋＤａのオリゴ糖鎖の分布範囲および最大４％ｗ／ｖのエノキサパリンナトリウム濃度を有する解重合エノキサパリンナトリウム溶液を提供することと、

【0068】

ｂ）最大約２５％ｗ／ｖ、最大約１０％ｗ／ｖ、または好ましくは約５％～約１０％ｗ／ｖのヘパリン濃度を得るまで、公称カットオフが１ｋＤａ以下の膜を用いた水相におけるＴＦＦによる濃縮ステップを実行することと、

【0069】

ｃ）ステップｂ）で得られた製品に対してＨ_２Ｏ_２による処理ステップを行うことと、

【0070】

ｄ）最大２５％ｗ／ｖ、好ましくは約１２％～約２５％ｗ／ｖのヘパリン濃度を達成するために、１ｋＤａ以下の公称カットオフ膜を用いた水相ＴＦＦによる単一の濃縮ステップを行うことと、

【0071】

ｅ）得られた製品に対して凍結乾燥ステップを行うことと、を含む。

【0072】

好ましくは、本発明のプロセスは、ステップｂ）の前に、清澄化および／または深層濾過ステップを含む。

【0073】

特定の実施形態では、本発明のプロセスは、

【0074】

ａ）約０．６～約１０ｋＤａのオリゴ糖鎖の分布範囲および最大４％ｗ／ｖのエノキサパリンナトリウム濃度を有する解重合エノキサパリンナトリウム溶液を提供することと、

【0075】

ｂ）最大約２５％ｗ／ｖ、最大約１０％ｗ／ｖ、または好ましくは約５％～約１０％ｗ／ｖのヘパリン濃度を得るまで、公称カットオフが１ｋＤａ以下の膜を用いた水相におけるＴＦＦによる濃縮ステップを実行することと、

【0076】

ｃ）ステップｂ）で得られた製品に対して水による透析濾過ステップを行うことと、

【0077】

ｄ）ステップｃ）で得られた製品に対してＨ_２Ｏ_２による処理ステップを行うことと、

【0078】

ｅ）任意で、ステップｄ）で得られた製品に対して深層濾過ステップを行うことと、

【0079】

ｆ）最大２５％ｗ／ｖ、好ましくは約１２％～約２５％ｗ／ｖのヘパリン濃度を達成するために、１ｋＤａ以下の公称カットオフ膜を用いた水相ＴＦＦによる単一の濃縮ステップを行うことと、

【0080】

ｇ）得られた製品に対して凍結乾燥ステップを行うことと、を含む。

【0081】

好ましくは、本発明のプロセスは、ステップｂ）の前に、清澄化および／または深層濾過ステップを含む。

【0082】

特定の実施形態では、本発明のプロセスは、

【0083】

ａ）約０．６～１０ｋＤａのオリゴ糖鎖の分布範囲および最大４％ｗ／ｖのエノキサパリンナトリウム濃度を有する解重合エノキサパリンナトリウム溶液を提供することと、

【0084】

ｂ）最大２５％ｗ／ｖ、好ましくは約５％～約１０％ｗ／ｖのヘパリン濃度を達成するために、１ｋＤａ以下の公称カットオフ膜を用いた水相ＴＦＦによる単一の濃縮ステップを行うことと、

【0085】

ｃ）ステップｂ）で得られた製品に対して深層濾過ステップを行うことと、

【0086】

ｄ）ステップｃ）で得られた製品に対してＨ_２Ｏ_２による処理ステップを行うことと、

【0087】

ｅ）最大２５％ｗ／ｖ、好ましくは約１２％～約２５％ｗ／ｖのヘパリン濃度を達成するために、１ｋＤａ以下の公称カットオフ膜を用いた水相ＴＦＦによる単一の濃縮ステップを行うことと、

【0088】

ｆ）得られた生成物に対して凍結乾燥ステップを行うことと、を含む。

【0089】

好ましくは、本発明のプロセスは、ステップｂ）の前に、清澄化および／または深層濾過ステップを含む。

【0090】

特定の実施形態では、本発明のプロセスは、

【0091】

ａ）約０．６～１０ｋＤａのオリゴ糖鎖の分布範囲および最大４％ｗ／ｖのエノキサパリンナトリウム濃度を有する解重合エノキサパリンナトリウム溶液を提供することと、

【0092】

ｂ）ステップａ）の溶液に対して水による透析濾過ステップを行うことと、

【0093】

ｃ）ステップｃ）で得られた製品に対してＨ_２Ｏ_２による処理ステップを行うことと、

【0094】

ｄ）最大約２５％ｗ／ｖ、好ましくは約５％～約２０％ｗ／ｖのヘパリン濃度を達成するために、１ｋＤａ以下の公称カットオフ膜を用いた水相ＴＦＦによる単一の濃縮ステップを行うことと、

【0095】

ｅ）得られた生成物に対して凍結乾燥ステップを行うことと、を含む。

【0096】

好ましくは、本発明のプロセスは、ステップｂ）の前に、清澄化および／または深層濾過ステップを含む。

【実施例】

【0097】

以下の具体的な例は、本発明の性質を表したためのものである。これらの実施例は、例示のみを目的として含まれ、本明細書で請求された発明の制限として解釈されるものではない。分画沈殿を行わずにヘパリンを解重合することで、粗エノキサパリンナトリウムおよびベミパリンナトリウムを製造した。

【0098】

以下、実施例１、２、３、４および５で使用した出発製品である粗エノキサパリンナトリウムを得るためのプロセスを説明する。ヘパリンナトリウム１０ｇを精製水に溶解し、撹拌下で塩化ベンゼトニウム溶液を加え、ベンゼトニウムヘパリネートを形成する。形成された製品を水で数回洗浄して、過剰な塩化物を除去し、最後に凍結乾燥によって製品を乾燥させる。ベンゼトニウムヘパリネートを塩化メチレンに溶解し、温度を調整する。塩化ベンジルを加えて反応させる。得られた製品は、ヘパリンベンジルエステルである。ヘパリンベンジルエステルを水に溶解し、水酸化ナトリウムを加える。反応終了後、溶液を中和し、得られた製品は、粗エノキサパリンナトリウムである。粗エノキサパリンナトリウムを得た後、後述の実施例を行った。

【実施例1】

【0099】

本発明の方法は、

【0100】

ａ）ヘパリン濃度が４％～１０％ｗ／ｖの製品を得るためのＴＦＦによる第１の濃縮、

【0101】

ｂ）透析濾過およびＨ_２Ｏ_２による処理、

【0102】

ｃ）ヘパリン濃度が１０％～２０％ｗ／ｖの製品を得るためのＴＦＦによる第２の濃縮、という主なステップによって行われる。

【0103】

最初、製品濃度が４０ｇ／Ｌで、オリゴ糖鎖の分布が０．６～１０ｋＤａの粗エノキサパリンナトリウムを出発製品として使用した。この最初の製品は、３．０μｍのＣｌａｒｉｇａｒｄ（登録商標）フィルターで事前に濾過された。ヘパリン解重合プロセスの製品は、粗エノキサパリンナトリウムである。

【0104】

次に、エノキサパリンの濃度を４％～１０％の値に高め、ならびに汚染物質（主に分子量＜０．５ｋＤａの塩や、以前の製造プロセスで製造した他の小さな製品）の濃度を下げるために、第１の濃縮ステップをＴＦＦによって実行した。そのために、公称カットオフが１ｋＤａ以下の再生セルロース膜を使用した。濃縮ステップでは、透過液が別個の容器に流れる前に、３．２５バールの膜間圧力（ＴＭＰ）で約２００５ｇの製品を投入し、システムを合計約１５分間循環させた。

【0105】

濃縮間に、透過液量は、初期の９から最後の４．８ＬＭＨ（Ｌ／ｍ^２／ｈ）（初期流量の５３％）の範囲で、平均流量は、６．２ＬＭＨであった。ＶＣＦ（体積濃度係数）＝１．２６Ｘ（Ｐ１）と、濃縮終了時の透過液体積（Ｐ２）との２つの透過液サンプルを回収した。また、濃縮終了時に保持された材料の量のサンプル（Ｒ１）、ならびに初期供給のサンプルを３．０μｍのフィルターで予備濾過した後（Ｂ１）に採取した。濃度試験の主なデータを表１に示す。

【0106】

続いて、得られた製品を清澄化するために、精製水を用いて透析濾過ステップを行た。透析濾過中、透過液量は、初期の８．４から最後の２．４ＬＭＨ（約２９％）まで連続的に減少し、平均流量は、５．０３ＬＭＨであった。３つの透過液サンプルを回収し、それぞれは、それぞれの透析後の終了での（それぞれＤ１、Ｄ２およびＤ３）であり、材料の量からものは、透析濾過終了に保持された（Ｄ５）である。透析濾過試験を実行する条件を表２に示す。

【0107】

透析濾過後に得られた約０．８Ｌの製品は、続いてＨ_２Ｏ_２と化学反応した。

【0108】

ＴＦＦによる第２の濃縮ステップに進む前に、容器の底に溜まった粒子を除去するために、３．０μｍのＣｌａｒｉｇａｒｄ（登録商標）フィルターを再び使用して、追加の（選択可能な）清澄化ステップを実行した。

【0109】

次に、公称カットオフが１ｋＤａ以下のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）再生セルロース膜も使用して、１０％～２０％ｗ／ｖのエノキサパリンの濃度に達成するために、ＴＦＦによる第２の濃縮ステップを実行した。

【0110】

濃縮中に、透過液量は、初期の３から最後の０．７５ＬＭＨ（２５％）の範囲で、平均流量は、１．５ＬＭＨであった。ＶＣＦ＝１．３４Ｘ（Ｐ３）と、濃縮終了時の透過液体積（Ｐ４）との２つの透過液サンプルを回収した。また、システムを低ＴＭＰ（１．２ｂａｒ）で１０分間実行することで膜を脱分極した後、濃縮後に保持された材料の量のサンプル（Ｒ２）を採取した。

【0111】

以下の表３は、上述のプロセスで採取され欧州薬局方（ＥＰ）で定められた方法に従って分析されたサンプルの分子量を示す。

【0112】

上記表において目的製品のＭＷ分画（２０００Ｄａ未満、２０００～８０００Ｄａおよび８０００Ｄａ以上）の割合に示されるように、第１の濃縮ステップが製品のプロファイルに悪影響を与えない（サンプルＰ１およびＰ２に見られるように、透過液中のどの分画も損失しない）ことが分かる。

【0113】

透析濾過中に採取されたサンプルについては、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３およびＤ５は、以下を示す：

【0114】

－基本的には、透析濾過に沿って、透過液中の最大のＭＷ分画は損失していない。

【0115】

－透過液中の最小と平均ＭＷの分画には損失があるが、最大の損失は、常に最小分画に関連る。

【0116】

－最小分画および中分画の損失率は、それぞれ透析濾過に沿って減少している。

【0117】

－一般的に、（≦１ｋＤａの膜のカットオフに応じて）最小分画および中高分画それぞれの透析濾過に沿って、若干の減少と濃縮が見られる。

【0118】

第２の濃縮ステップ終了時の瞬間的な透過液サンプルＰ３、Ｐ４およびサンプルＲ２の数は、以下を示す：

【0119】

－基本的に、このステップにわたって、透過液中の最高ＭＷ分画は、損失しない。

【0120】

－透過液中の最小および中ＭＷ分画には、損失があるが、最大の損失は、常に最小分画に関連する（透析濾過の場合と同様）。

【0121】

－この第２の濃縮ステップでは、中分画の損失率が増加する（透析濾過の場合と同様）。

【実施例2】

【0122】

本発明の方法は、

【0123】

ａ）ヘパリン濃度が４％～１０％ｗ／ｖの製品を得るためのＴＦＦによる第１の濃縮、

【0124】

ｂ）Ｈ_２Ｏ_２による処理、

【0125】

ｃ）ヘパリン濃度が１０％～２０％ｗ／ｖの最終製品を得るためのＴＦＦによる第２の濃縮、という主なステップによって行われる。

【0126】

約１９３６ｇの出発製品をタンクに移し、ＴＭＰ＝３．２ｂａｒで１０分間、５．１ＬＭＭのクロスフローでシステムを全循環させた。

【0127】

濃縮中、透過液量は、初期の９．６から最後の４．２ＬＭＨ（４４％）の範囲で、平均流量は、６ＬＭＨであった。ＶＣＦ＝１．４３Ｘで瞬間的な透過液のサンプルを回収し（Ｐ５）、濃縮終了後に別の透過液のサンプルを回収し（Ｐ６）、最後に濃縮終了後、フィルターをＴＭＰ＝０．６ｂａｒで１０分間全循環させた後の保持液（Ｒ３）のサンプルを回収した（膜の脱分極）。タンクに移す前に、出発溶液のサンプル（Ｂ２）を採取した。

【0128】

Ｈ_２Ｏ_２で処理した約７９４ｇの製品をタンクに移し、第２の濃縮ステップに進んだ。

【0129】

濃縮中に、透過液量は、初期の５．７から最後の０．９ＬＭＨ（１６．０％）の範囲で、平均流量は、ＬＭＨであった。ＶＣＦ＝１．３３Ｘで１つの瞬間的な透過液のサンプル（Ｐ７）と濃縮終了時に透過液量の別の瞬間的な透過液のサンプル（Ｐ８）を回収した。また、システムを低ＴＭＰ（０．８ｂａｒ）で１０分間実行することで膜を脱分極した後、濃縮終了時の保持液量のサンプル（Ｒ４）を回収した。

【0130】

表４は、上述のプロセスで採取したサンプルの分子量を、欧州薬局方（ＥＰ）で定められた方法に従って分析したものである。

【0131】

上記表の数値が示すように、第１の濃縮ステップは、製品のプロファイルに悪影響を与えない（サンプルＰ１およびＰ２の場合と同様に、透過液、サンプルＰ５およびＰ６中のどの分画も損失しない）ことが分かる。

【0132】

第２の濃縮ステップの終了時の透過液サンプルＰ７、Ｐ８および保持液量サンプルＲ４に関する数値は、以下を示す：

【0133】

－上記ステップでは、透過液中のＭＷの最大分画に損失がない。

【0134】

－透過液中の最小および中ＭＷ分画には損失があるが、最大の損失は、常に最小分画に関連する（第２の透析濾過試験の場合と同様）。

【0135】

－第２の濃縮では、中分画の損失率が増加する（プロセスの場合と同様）。

【0136】

最後に、保持溶液を凍結乾燥させて、乾燥エノキサパリンナトリウムを得る。

【実施例3】

【0137】

本発明の方法は、

【0138】

ａ）ヘパリン濃度が４％～１０％ｗ／ｖの生成物を得るためのＴＦＦによる第１の濃縮、

【0139】

ｂ）深層濾過、

【0140】

ｃ）Ｈ_２Ｏ_２による処理、

【0141】

ｄ）ヘパリン濃度が１０％～２０％ｗ／ｖの最終製品を得るためのＴＦによる第２の濃縮、という主なステップによって行われる。

【0142】

約２０００ｇの出発製品（濁度＞１０００ＮＴＵ）をタンクに移し、かつＴＭＰ＝３．２ｂａｒで１５分間、５．２ＬＭＭのクロスフローでシステムを全循環させた。

【0143】

濃縮中に、透過液量は、初期の９．６から最後の３．９ＬＭＨ（初期流量の４１％）の範囲で、平均流量は、５．８ＬＭＨであった。ＶＣＦ＝１．４３Ｘで透過液サンプルを回収し（Ｐ１’）、もう１つは、濃縮終了時に回収し（Ｐ２’）、さらにフィルターをＴＭＰ＝０．７ｂａｒで１５分間全循環させた後に濃縮終了後の保持液（Ｒ１’）を回収した（膜の脱分極）。また、タンクに移す前に、初期供給（Ｂ１’）のサンプルを採取した。

【0144】

Ｒ１’溶液をＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣＰｒｏ Ｃ０ＳＰデプスフィルターに通し、濁度を０．５７ＮＴＵまで下げ、続いてＨ_２Ｏ_２で処理した。約０．８リットルの製品をＨ_２Ｏ_２で処理した後にタンクに移し、第２の濃縮ステップを行った。

【0145】

この第２の濃縮は、初期公称濃度１０％（それぞれサンプルＲ’３とＰ’３）から最終公称濃度２０％（それぞれサンプルｓＲ’１２とＰ’１２）まで、中間濃度の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８および１９％を経て、保持液と透過液の両方を順次分注して行われた。

【0146】

以下の表５は、上記プロセスで採取され欧州薬局方（ＥＰ）で定められた方法に従って分析されたサンプルの分子量を示す。

【0147】

平均分子量と分子量分布の両方の変化は、第２の濃縮中に、保持液中の製品の公称濃度の１０％から２０％まで直線的であり、これにより保持液の溶液中の製品の濃度の最終値を調整することで、エノキサパリンナトリウムを得るための特定の分子量プロファイルおよびオリゴ糖鎖の分布を定義することができる。この事実について、図５を参照する。最後に、保持溶液を凍結乾燥させて、乾燥エノキサパリンナトリウムを得る。

【実施例4】

【0148】

前述の実施例で得られた製品を分析して、その抗ＦＸａおよび抗ＦＩＩａ活性を決定した。得られた結果は、以下の通りである：

【0149】

この品質属性は、欧州薬局方と米国薬局方の両方でエノキサパリンナトリウムについて定義される範囲を適切に満たす。

【0150】

－抗ＦＸａ活性：９０‐１２５ＩＵ／ｍｇ（乾燥物質）

【0151】

－抗ＦＩＩａ活性：２０．０‐３５．０ＩＵ／ｍｇ（乾燥物質）

【0152】

－比率ＦＸａ／ＦＩＩａ：３．３‐５．３

【実施例5】

【0153】

本発明の方法は、

【0154】

ａ）透析濾過、

【0155】

ｂ）Ｈ_２Ｏ_２による処理、

【0156】

ｃ）ヘパリン濃度が４％～１５％ｗ／ｖの最終製品を得るためのＴＦＦによる濃縮、という主なステップによって行われる。

【0157】

約３０１０ｇの出発製品をタンクに移し、ＴＭＰ＝４．９ｂａｒで１５分間、２．０ＬＭＭのクロスフローでシステムを全循環させた。

【0158】

透析濾過中、透過液量は、初期の１７．７から最後の１３．１ＬＭＨの範囲で、平均流量は、１２．６ＬＭＨで、透析量は、６であった。各透析量のサンプルの後、透過液（ＤＰ１～ＤＰ６）と保持液（ＤＲ１～ＤＲ６）の両方を回収した。透過液をＨ_２Ｏ_２で処理し、約２７２０ｇの処理済み製品をタンクに移した。

【0159】

濃縮中に、透過液量は、初期の１２．７から最後の１．２８ＬＭＨ（８９．９％減少）の範囲で、平均流量は、５．１ＬＭＨであった。濃縮は、４～１５％で行われ、透過液サンプル（ＣＰ１～ＣＰ６）と保持液サンプル（ＣＲ１～ＣＲ６）の両方を１０％から回収した。ＶＣＦ＝１．３３Ｘで１つの瞬間的な透過液のサンプル（Ｐ７）と濃縮終了時に透過液量の別の瞬間的な透過液のサンプル（Ｐ８）を回収した。また、システムを低ＴＭＰ（０．８ｂａｒ）で１０分間実行して膜を脱分極した後、濃縮終了時の保持液量のサンプル（Ｒ４）を回収した。

【0160】

以下の表６は、上記プロセスで採取され欧州薬局方（ＥＰ）で定められた方法に従って分析されたサンプルの分子量を示す。

【0161】

平均分子量と分子量分布の両方の変化は、保持液中の製品の公称濃度１０％から１５％まで直線的であり、これにより保持液の溶液中の製品の濃度の最終値を調整することで、エノキサパリンナトリウムを得るための特定の分子量プロファイルおよびオリゴ糖鎖の分布を定義することができる。保持液を凍結乾燥させて、乾燥エノキサパリンナトリウムを得る。
実施例６

【0162】

前述の実施例で得られた製品を分析して、その抗ＦＸａおよび抗ＦＩＩａ活性を決定した。得られた結果は、以下の通りである：

【0163】

前述の説明や実施例を考慮して、当業者であれば、過度な実験をすることなく、請求された本発明を実現するであろう。上記のことは、本発明の実施形態の製造ための特定のプロセスを説明する前述の実施例を参照することにより、よりよく理解されるであろう。これらの例に対するすべての参照は、説明するためのものに過ぎない。本実施例は、限定するためのものではなく、本発明によって考えられる多くの可能な実施形態の一部の例示に過ぎない。

【0164】

本明細書で使用されるように、「約」という用語は、指定された値の±１０％、±５％または±１％、好ましくは±１０％を意味する。さらに、本文献で指定されるすべての範囲には、特に「約」という用語の定義に従って、範囲の限界とすべての整数および小数の値が含まれている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6】