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特許7551134プライマー及びこれを用いた二本鎖ＤＮＡの製造装置並びに二本鎖ＤＮＡの製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-06
(45)【発行日】2024-09-17
(54)【発明の名称】プライマー及びこれを用いた二本鎖ＤＮＡの製造装置並びに二本鎖ＤＮＡの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6876 20180101AFI20240909BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240909BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240909BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6876 Z
C12M1/00
C12N15/11 Z
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2021535463
(86)(22)【出願日】2020-07-31
(86)【国際出願番号】 JP2020029442
(87)【国際公開番号】W WO2021020562
(87)【国際公開日】2021-02-04
【審査請求日】2023-03-15
(31)【優先権主張番号】P 2019140852
(32)【優先日】2019-07-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】503360115
【氏名又は名称】国立研究開発法人科学技術振興機構
(74)【代理人】
【識別番号】110001612
【氏名又は名称】弁理士法人きさらぎ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】阿部 洋
(72)【発明者】
【氏名】阿部 奈保子
(72)【発明者】
【氏名】中本 航介
(72)【発明者】
【氏名】村瀬 裕貴
(72)【発明者】
【氏名】木村 康明
【審査官】斉藤 貴子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００９／１１３７０９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】SANEYOSHI, H. et al.，Synthesis and Characterization of Cell-Permeable Oligonucleotides Bearing Reduction-Activated Protecting Groups on the Internucleotide Linkages，Bioconjugate Chemistry，2016年，Vol. 27，P. 2149-2156
【文献】WU, L. et al.，Synthesis of Site-Specifically Phosphate-Caged siRNAs and Evaluation of Their RNAi Activity and Stability，Chem. Eur. J.，2014年，Vol. 20，P. 12114 - 12122
【文献】MAIER, T. and PFLEIDERER, W.，Nucleotides: Part LXXV New Types of Fluorescence Labeling of 2'-deoxycytidine，Helvetica Chimica Acta，2009年，Vol. 92，P. 2722-2736
【文献】村瀬裕貴 ほか，ゲノム合成のためのDNAアセンブリ法の開発，日本化学会春季年会講演予稿集，2020年03月05日，Vol. 100th，Page. ROMBUNNO.1E6-59
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ
Ｃ１２Ｎ
Ｃ１２Ｍ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸の増幅に使用されるプライマーであって、下記式（１）で示される構造を有することを特徴とするプライマー。【化1】
（ここで、Ｂは塩基を示し、Ｒ１は下記式（４Ａ）で示される光分解性保護基であるか、又は下記式（２Ｂ）で示される還元剤分解性保護基を示し、Ｒ２は水素又はヒドロキシル基を示す。＊は隣接するヌクレオチドの糖との結合手を意味する。）
【化2】
（ここで、Ｒ ３ は炭素数１～２０のアルキル基を示す。＊はリン酸の酸素（Ｏ）との結合手を意味する。）
【化3】
（ここで、Ａ ２ は炭素数１～３のアルキレン基を示し、炭素数１～２０の分岐鎖を有していてもよい。＊はリン酸の酸素（Ｏ）との結合手を意味する。）
【請求項2】
前記Ｒ３がｔｅｒｔ－ブチル基又はアダマンチル基であることを特徴とする請求項１に記載のプライマー。
【請求項3】
前記Ｒ１が下記式（３Ａ）で示される２－ニトロベンジル基であることを特徴とする請求項１に記載のプライマー。【化4】
【請求項4】
前記Ｒ１が下記式（３Ｂ）で示される４－ニトロベンジル基であることを特徴とする請求項１に記載のプライマー。【化5】
【請求項5】
前記式（１）で示される構造が配列中に２つ以上連続することを特徴とする請求項１に記載のプライマー。
【請求項6】
請求項１～５のいずれかに記載したプライマーを用いて接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造するための二本鎖ＤＮＡの製造装置であって、鋳型となるテンプレートＤＮＡのアンチセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するフォワードプライマーと、
前記テンプレートＤＮＡのセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するリバースプライマーと、
前記テンプレートＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を複数サイクル行い、前記フォワードプライマーが伸長したフォワード側伸長鎖と、前記リバースプライマーが伸長したリバース側伸長鎖とを生成し、前記フォワード側伸長鎖と前記リバース側伸長鎖とをアニーリングして３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡを生成する増幅手段と、
前記Ｒ１を脱保護する脱保護手段と、
を備えることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの製造装置。
【請求項7】
請求項１～５のいずれかに記載したプライマーを用いて接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造するための二本鎖ＤＮＡの製造方法であって、鋳型となるテンプレートＤＮＡのアンチセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するフォワードプライマーと、前記テンプレートＤＮＡのセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するリバースプライマーと、を準備する準備工程と、
前記テンプレートＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を複数サイクル行い、前記フォワードプライマーが伸長したフォワード側伸長鎖と、前記リバースプライマーが伸長したリバース側伸長鎖とを生成し、前記フォワード側伸長鎖と前記リバース側伸長鎖とをアニーリングして３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡを生成する増幅工程と、
前記Ｒ１を脱保護する脱保護工程と、
を備えることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの製造方法。
【請求項8】
前記Ｒ１が前記式（４Ａ）で示される光分解性保護基であり、脱保護工程は光照射により前記Ｒ１を脱保護することを特徴とする請求項７に記載の二本鎖ＤＮＡの製造方法。
【請求項9】
前記Ｒ１が前記式（２Ｂ）で示される還元剤分解性保護基であり、脱保護工程は還元剤により前記Ｒ１を脱保護することを特徴とする請求項７に記載の二本鎖ＤＮＡの製造方法。
【請求項10】
前記プライマーは、前記式（１）で示される構造が配列中に２つ以上連続することを特徴とする請求項７に記載の二本鎖ＤＮＡの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、プライマー及びこれを用いた二本鎖ＤＮＡの製造装置並びに二本鎖ＤＮＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
分子生物学などの分野では、遺伝子組み換えや形質転換などを行うために、標的ＤＮＡをホストに組み込んだベクターが用いられている。一般に、標的ＤＮＡは、量が少ない場合はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅して使用される。ＰＣＲでは、標的ＤＮＡ配列を含むテンプレートＤＮＡを使用し、これに相補的に結合するプライマーを用いて熱変性とアニーリングを複数サイクル繰り返すことでテンプレートＤＮＡを増幅している。
【0003】
ＰＣＲで増幅されたテンプレートＤＮＡの増幅産物は、そのままでは平滑末端であり、これをプラスミドＤＮＡなどのホストＤＮＡと結合（ライゲーション）させるための処理をする必要がある。一般に、そのような処理として、特定の配列を切断する制限酵素を使用するが、この方法では、結合できるＤＮＡが制限酵素の切断部位の配列に依存するため、汎用性に乏しいという問題がある。
【0004】
制限酵素を用いない方法として、増幅産物の３’末端及び５’末端を接着末端（粘着末端、突出末端などともいう）とし、ホスト側も同様に接着末端を形成して両者をライゲーションしてベクターを構築する技術がある。例えば、近年では、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ法、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法、ＳＬｉＣＥ法などが知られている。これらの方法では、いずれも二本鎖ＤＮＡ断片末端に１５ｂｐ程度の相同配列を持たせ、二本鎖中の片側の鎖をエキソヌクレアーゼ活性で消化し、接着末端を生じさせたのちに連結する。なお、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ法ではｉｎ ｖｉｔｒｏでＴａｑ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを用いて連結し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法では大腸菌内の修復システムを利用して連結する。
【0005】
これらの方法では、酵素であるエキソヌクレアーゼを使用するため、コストがかかるほか、反応条件等によって部位特異性に劣ることがあり、定量的な接着末端形成が困難であるため、連結反応の効率が低いという問題があった。このため、酵素を使用しないシームレスクローニング法が求められていた。
【0006】
そこで、化学的手法により接着末端を有するＤＮＡを調製する方法が開発され、そのためのＰＣＲ用のプライマーとして、特許文献１に記載されたものが知られている。この文献のプライマーは、非相補ＤＮＡ部分の塩基配列中の３’末端に相当する塩基が保護基で修飾されている。この保護基は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製の進行を停止させる機能を有しており、光照射処理やアルカリ処理などによって被修飾塩基から脱離しうる。また、本文献では、保護基（置換基）を生体分子に導入するための置換基導入剤を用いて塩基に保護基をプライマーの塩基に導入している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】国際公開第２００９／１１３７０９号（請求項１、請求項２など）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
特許文献１では、保護基の部分でＤＮＡ複製の進行が停止するが、塩基の部分で保護基によりポリメラーゼ活性を阻害するため、停止効率が低く、その結果、完全に伸長したものができてしまうことがあった。また、例えばＤＮＡでは塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミンの４種類あるが、特許文献１では塩基に保護基を導入しているため、塩基の種類に応じた方法で保護基を導入する必要があり、プライマーの製造に手間やコストがかかっていた。
【0009】
本発明の目的は、停止効率が高く、かつ安価に製造することが可能なプライマーを提供することにある。また、本発明の他の目的は、このようなプライマーを用いた、接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造装置及び二本鎖ＤＮＡの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意研究を重ねた。その結果、ヌクレオシドの糖の部分に分解性保護基を導入したプライマーを開発した。そして、その保護基を分解することで接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを作製できることを見出し、本発明を完成させた。
【0011】
すなわち、本発明は、核酸の増幅に使用されるプライマーであって、下記式（１）で示される構造を有することを特徴とするプライマーである。
（ここで、Ｂは塩基を示し、Ｒ１は分解性保護基を示し、Ｒ２は水素又はヒドロキシル基を示す。＊は隣接するヌクレオチドの糖との結合手を意味する。）
【化1】
【0012】
この場合において、前記Ｒ１が下記式（２Ａ）で示される光分解性保護基であることが好ましい。
（ここで、Ａ１は炭素数１～３のアルキレン基を示し、炭素数１～２０の分岐鎖を有していてもよい。＊はリン酸の酸素（Ｏ）との結合手を意味する。）
【化2】
【0013】
さらにこの場合において、前記Ｒ１が下記式（４Ａ）で示される光分解性保護基であることが好ましい。
（ここで、Ｒ３は炭素数１～２０のアルキル基を示す。）
【化3】
【0014】
上記の場合において、前記Ｒ３がｔｅｒｔ－ブチル基又はアダマンチル基であることがより好ましい。特に、Ｒ３がｔｅｒｔ－ブチル基であることが好適である。
【0015】
さらに、前記Ｒ１が下記式（３Ａ）で示される２－ニトロベンジル基であることが好ましい。
【化4】
【0016】
あるいはまた、前記Ｒ１が下記式（２Ｂ）で示される還元剤分解性保護基であることが好ましい。
（ここで、Ａ２は炭素数１～３のアルキレン基を示し、炭素数１～２０の分岐鎖を有していてもよい。＊はリン酸の酸素（Ｏ）との結合手を意味する。）
【化5】
【0017】
この場合において、前記Ｒ１が下記式（３Ｂ）で示される４－ニトロベンジル基であることが好ましい。
【化6】
【0018】
前記式（１）で示される構造が配列中に２つ以上連続することが好ましい。
【0019】
また、本発明は、上記のいずれかに記載したプライマーを用いて接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造するための二本鎖ＤＮＡの製造装置であって、鋳型となるテンプレートＤＮＡのアンチセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するフォワードプライマーと、前記テンプレートＤＮＡのセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するリバースプライマーと、前記テンプレートＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を複数サイクル行い、前記フォワードプライマーが伸長したフォワード側伸長鎖と、前記リバースプライマーが伸長したリバース側伸長鎖とを生成し、前記フォワード側伸長鎖と前記リバース側伸長鎖とをアニーリングして３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡを生成する増幅手段と、前記Ｒ１を脱保護する脱保護手段と、を備えることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの製造装置である。
【0020】
さらに、本発明は、上記のいずれかに記載したプライマーを用いて接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造するための二本鎖ＤＮＡの製造方法であって、鋳型となるテンプレートＤＮＡのアンチセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するフォワードプライマーと、前記テンプレートＤＮＡのセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するリバースプライマーと、を準備する準備工程と、前記テンプレートＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を複数サイクル行い、前記フォワードプライマーが伸長したフォワード側伸長鎖と、前記リバースプライマーが伸長したリバース側伸長鎖とを生成し、前記フォワード側伸長鎖と前記リバース側伸長鎖とをアニーリングして３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡを生成する増幅工程と、前記Ｒ１を脱保護する脱保護工程と、を備えることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの製造方法である。
【0021】
この場合において、前記Ｒ１が前記式（２Ａ）で示される光分解性保護基であり、脱保護工程は光照射により前記Ｒ１を脱保護することが好ましい。
【0022】
あるいは、前記Ｒ１が前記式（２Ｂ）で示される還元剤分解性保護基であり、脱保護工程は還元剤により前記Ｒ１を脱保護することが好ましい。
【0023】
また、前記プライマーは、前記式（１）で示される構造が配列中に２つ以上連続することが好ましい。
【発明の効果】
【0024】
本発明によれば、脱保護効率が高く、かつ安価に製造することが可能なプライマーを提供することが可能となる。また、本発明によれば、このようなプライマーを用いた、接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造装置及び二本鎖ＤＮＡの製造方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造方法及び製造装置を示す模式図である。
【図2】オリゴヌクレオチドｐＡｃＧＦＰ＿Ｆｗ２合成時における、脱保護後（ａ）と精製後（ｂ）のクロマトグラムである。
【図3】鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした鎖伸長反応の停止を示す図である。
【図4】ＰＣＲ反応のアガロースゲル電気泳動分析を示す図である。
【図5】ＰＣＲ断片の連結反応の模式図である。
【図6】Ｔ＊＊を含むオリゴヌクレオチドを用いた接着末端の作成実験を示す図である。
【図7】Ｎａ２Ｓ２Ｏ４を用いた１Ｔの脱保護反応の実験結果を示す図である。
【図8】Ｎａ２Ｓ２Ｏ４を用いた２Ｔの脱保護反応の実験結果を示す図である。
【図9】リン酸修飾基中の置換基Ｒをより嵩高くした実験の概要を示す図である。
【図10】修飾オリゴヌクレオチドの熱サイクル条件における安定性試験の結果を示す図である。
【図11】修飾プライマーがＰＣＲ条件において安定（分解耐性）であることを示す実験の結果を示す図である。
【図12】ｔＢｕタイプ修飾プライマーの脱保護反応の逆相ＨＰＬＣ分析の実験結果を示す図である。
【図13】ＰＣＲ産物の試験管内での連結反応（Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ）の実験悔過を示す図である。
【図14】鎖伸長停止ケージドアナログ（配列ＴＴ、ｔＢｕタイプ）を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした鎖伸長反応の停止を示す図である。
【図15】鎖伸長停止ケージドアナログ（配列ＴＴ、アダマンチルタイプ）を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした鎖伸長反応の停止を示す図である。
【図16】鎖伸長停止ケージドアナログ（配列ＡＡ及びＴＡ、ｔＢｕタイプ）を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした鎖伸長反応の停止を示す図である。
【図17】鎖伸長停止ケージドアナログ（配列ＣＣ及びＧＣ、ｔＢｕタイプ）を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした鎖伸長反応の停止を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0026】
１．プライマー
以下、本発明のプライマーについて説明する。本発明のプライマーは、核酸の増幅に使用されるプライマーであって、下記式（１）で示される構造を有する。
（ここで、Ｂは塩基を示し、Ｒ１は分解性保護基を示し、Ｒ２は水素又はヒドロキシル基を示す。＊は隣接するヌクレオチドの糖との結合手を意味する。）。なお、結合手＊のうち、式（１）の３’側の結合手は、３’側において隣接するヌクレオチドの糖の５’炭素に結合し、５’側 の結合手は、５’側において隣接するヌクレオチドの糖の３’炭素に結合する。また、ＤＮＡプライマーの場合は、Ｒ２は水素、ＲＮＡプライマーの場合は、Ｒ１はヒドロキシル基である。
以下、本発明のプライマーについて説明する。本発明のプライマーは、核酸の増幅に使用されるプライマーであって、下記式（１）で示される構造を有する。
【化7】
【0027】
Ｂは塩基であり、具体的には、ＤＮＡプライマーの場合はアデニン、グアニン、シトシン、チミンから選択され、ＲＮＡプライマーの場合はアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルから選択される。
【0028】
Ｒ１の分解性保護基とは、何らかの処理により分解する保護基（置換基）を意味する。ここでいう処理としては、光照射処理、還元処理、アルカリ処理、酸処理、酸化処理、脱シリル化処理、熱処理、エステラーゼ処理、ホスファターゼ処理などを挙げることができる。ポリメラーゼは核酸のリン酸基の負電荷をより強く認識しているため、特許文献１のように塩基に保護基を導入するよりも、式（１）のようにリン酸基を保護基でマスクするほうが、ポリメラーゼの停止効率をより高めることができると推測される。
【0029】
（１）光分解性保護基
処理が光照射である場合、Ｒ１が下記式（２Ａ）で示される光分解性保護基であることが好ましい。
（ここで、Ａ１は炭素数１～３のアルキレン基を示し、炭素数１～３の分岐鎖、あるいは炭素数１～２０の分岐鎖を有していてもよい。＊はリン酸の酸素（Ｏ）との結合手を意味する。）
処理が光照射である場合、Ｒ１が下記式（２Ａ）で示される光分解性保護基であることが好ましい。
【化8】
【0030】
炭素数１～３のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基を挙げることができる。炭素数１～２０の分岐鎖としては、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基などを挙げることができる。
【0031】
Ｒ１としては、下記式（４Ａ）で示される光分解性保護基であることが好ましい。
（ここで、Ｒ３は炭素数１～２０のアルキル基を示す。）
特に、Ｒ３は、ｔｅｒｔ－ブチル基やアダマンチル基のような嵩高いものが好ましい。後述する実施例で示すように、Ｒ３が嵩高いほど、修飾部位の化学的安定性と複製反応の阻害効果が高い。したがって、Ｒ３は炭素数が３以上であり、４以上であることが好ましく、７以上であることがより好ましく、１０以上であることが特に好ましい。実施例に記載の置換基（Ｒ３がメチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、アダマンチル基）では、化学的安定性の低い順に、メチル基＜ｔｅｒｔ－ブチル基＜アダマンチル基となる。
【化9】
特に、Ｒ３は、ｔｅｒｔ－ブチル基やアダマンチル基のような嵩高いものが好ましい。後述する実施例で示すように、Ｒ３が嵩高いほど、修飾部位の化学的安定性と複製反応の阻害効果が高い。したがって、Ｒ３は炭素数が３以上であり、４以上であることが好ましく、７以上であることがより好ましく、１０以上であることが特に好ましい。実施例に記載の置換基（Ｒ３がメチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、アダマンチル基）では、化学的安定性の低い順に、メチル基＜ｔｅｒｔ－ブチル基＜アダマンチル基となる。
【0032】
Ｒ１としては、下記式（３Ａ）で示される２－ニトロベンジル基を挙げることができる。
【化10】
【0033】
（２）還元剤分解性保護基
処理が還元処理の場合、Ｒ１が下記式（２Ｂ）で示される還元剤分解性保護基であることが好ましい。
（ここで、Ａ２は炭素数１～３のアルキレン基を示し、炭素数１～２０の分岐鎖を有していてもよい。＊はリン酸の酸素（Ｏ）との結合手を意味する。）
炭素数１～３のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基を挙げることができる。炭素数１～２０の分岐鎖としては、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基などを挙げることができる。
処理が還元処理の場合、Ｒ１が下記式（２Ｂ）で示される還元剤分解性保護基であることが好ましい。
【化11】
（ここで、Ａ２は炭素数１～３のアルキレン基を示し、炭素数１～２０の分岐鎖を有していてもよい。＊はリン酸の酸素（Ｏ）との結合手を意味する。）
炭素数１～３のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基を挙げることができる。炭素数１～２０の分岐鎖としては、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基などを挙げることができる。
【0034】
Ｒ１としては、下記式（３Ｂ）で示される４－ニトロベンジル基を挙げることができる。
【化12】
【0035】
（３）その他の分解性保護基
アルカリ処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、イソブチリル基、ベンゾイル基、アセトキシメチル基などを挙げることができる。酸処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、トリチル基を挙げることができる。酸化処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、アリルオキシメチル基、ジメトキシベンジルオキシメチル基、トリメトキシベンジルオキシメチル基などを挙げることができる。脱シリル化処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、ｔ－ブチルジメトキシシリルオキシメチル基、ｔ－ブチルジフェニルシリルオキシメチル基などを挙げることができる。熱処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、イソシアネート基を挙げることができる。エステラーゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、アセトキシメチル基を挙げることができる。ホスファターゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、リン酸メチル基を挙げることができる。
アルカリ処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、イソブチリル基、ベンゾイル基、アセトキシメチル基などを挙げることができる。酸処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、トリチル基を挙げることができる。酸化処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、アリルオキシメチル基、ジメトキシベンジルオキシメチル基、トリメトキシベンジルオキシメチル基などを挙げることができる。脱シリル化処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、ｔ－ブチルジメトキシシリルオキシメチル基、ｔ－ブチルジフェニルシリルオキシメチル基などを挙げることができる。熱処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、イソシアネート基を挙げることができる。エステラーゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、アセトキシメチル基を挙げることができる。ホスファターゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、リン酸メチル基を挙げることができる。
【0036】
本発明のプライマーは、特にＰＣＲで好適に使用される一本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＲＮＡであり、上記式（１）で示される構造を分子内に有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。プライマーの塩基対の数は、標的ＤＮＡなどの配列等に応じて適宜設定することができるが、一般にオリゴヌクレオチドでは例えば２０塩基対以下、ポリヌクレオチドでは例えば２０塩基対超である。ポリヌクレオチドの塩基対の数の上限としては特に制限はないが、一般的に使用されるプライマーとしては例えば４０塩基対以下が好ましい。また、オリゴヌクレオチドの塩基対の数の下限としては、プライマーとして使用できる長さであれば特に制限はないが、一般的に使用されるプライマーとしては例えば５塩基対以上が好ましい。
【0037】
プライマーにおいては、前記式（１）で示される構造が配列中に１つのみ存在するよりも、この構造が２つ以上連続することが好ましい。式（１）の構造が配列中に１つのみの場合は、その構造部分でＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの複製が停止しなかった場合は接着末端の形成ができなくなる。しかしながら、式（１）の構造が２つ以上連続することで、ＤＮＡの複製が確率的により停止しやすくなり、接着末端形成の効率が高くなる。
【0038】
２．プライマーの製造方法
本発明のプライマーは、上記式（１）の構造を有する修飾ヌクレオチド（以下、「ヌクレオチド誘導体」ということがある）を合成し、これに非修飾のヌクレオチドをホスホロアミダイト法などの固相合成法で連結することで製造することができる。
本発明のプライマーは、上記式（１）の構造を有する修飾ヌクレオチド（以下、「ヌクレオチド誘導体」ということがある）を合成し、これに非修飾のヌクレオチドをホスホロアミダイト法などの固相合成法で連結することで製造することができる。
【0039】
プライマーの合成方法の概要としては、まずヌクレオシドの５’ヒドロキシル基を保護し、３’ヒドロキシル基にＮ，Ｎ－ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィンを反応させる。次に、ニトロベンジルアルコールを反応させて分解性保護基を導入する。その後、ホスホロアミダイトなどを反応させ、固相合成法で非修飾のヌクレオチドを連結させてプライマーを合成する。以下、実施例に掲載したプライマーの具体的な製造方法について詳細に説明する。
【0040】
（ａ）還元剤分解性保護基を有するヌクレオシド誘導体（※式（１）において、Ｒ１が式（２Ｂ）、Ｒ２が水素の化合物）及びプライマーの合成
【化13】
【0041】
上記の合成スキ－ムに沿って説明する。以下で説明する合成スキ－ムにおいて、数字は化合物の番号を表す。まず、デオキシリボヌクレオシド（下記スキ－ムではチミジン）を出発物質として用意する。これに４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴｒＣｌ）、ピリジンを加え、リボースの５’ヒドロキシル基に４，４’－ジメトキシトリチルクロリド基を結合させる（化合物２４）。次に、Ｎ，Ｎ－ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィンを、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に添加し、デオキシリボースの３’ヒドロキシル基にホスホロアミダイトを結合させる（化合物２５）。次に、４－ニトロベンジルアルコールを反応混合物に加え、次いで５－（メチルチオ）－１Ｈ－テトラゾールを添加して化合物２６を得る。その後は常法により、所望の配列となるようにヌクレオチドを固相合成してプライマーを合成する。
【0042】
３．接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造方法及び製造装置
つぎに、接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造方法及び製造装置について説明する。本発明の二本鎖ＤＮＡの製造装置は、本発明のプライマーを用いて接着末端を有するための装置である。また、本発明の二本鎖ＤＮＡの製造方法は、標的ＤＮＡ配列を含むテンプレートＤＮＡを使用し、本発明のプライマーを用いて接着末端を有する方法である。以下、図１を参照して説明する。なお、本実施形態では、プライマーにおいて、式（１）の構造が連続して２つ存在するものを使用しているが、式（１）が１つのみの場合も同様の方法・装置を使用することができる。
つぎに、接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造方法及び製造装置について説明する。本発明の二本鎖ＤＮＡの製造装置は、本発明のプライマーを用いて接着末端を有するための装置である。また、本発明の二本鎖ＤＮＡの製造方法は、標的ＤＮＡ配列を含むテンプレートＤＮＡを使用し、本発明のプライマーを用いて接着末端を有する方法である。以下、図１を参照して説明する。なお、本実施形態では、プライマーにおいて、式（１）の構造が連続して２つ存在するものを使用しているが、式（１）が１つのみの場合も同様の方法・装置を使用することができる。
【0043】
まず、試薬としてフォワードプライマーとリバースプライマーを含むＰＣＲ増幅用プライマーセットを準備する（準備工程）。フォワードプライマーは、テンプレートＤＮＡのアンチセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ式（１）で示される構造を有する。また、リバースプライマーは、テンプレートＤＮＡのセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ式（１）で示される構造を有する。
【0044】
図の（ａ）に示すように、フォワードプライマーとリバースプライマーは、増幅したい標的ＤＮＡ配列を挟むように配列を決定する。また、プライマーにおける式（１）の分解性保護基を有するヌクレオチドの位置は、目的とする接着末端の配列（図の（ｃ））において、３’陥没側における最も３’末端側のヌクレオチドの３’側に隣接する位置に相補的な位置となるように設計する。式（１）の構造が２つ以上連続している場合は、式（１）の構造のヌクレオチドのうち最も３’側に位置するヌクレオチドが上記の位置となるようにする。その他の試薬としては、ＰＣＲに使用するポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼなど）、バッファー、ｄＮＴＰなどである。
【0045】
次に、ＰＣＲ装置（増幅手段）を用いてテンプレートＤＮＡの配列を増幅する（増幅工程）。ＰＣＲ装置は、テンプレートＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を複数サイクル行い、フォワードプライマーが伸長したフォワード側伸長鎖と、リバースプライマーが伸長したリバース側伸長鎖とを生成し、フォワード側伸長鎖とリバース側伸長鎖とをアニーリングして３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡ（図の（ｂ））を生成する。
【0046】
ＰＣＲでは、熱変性、アニーリング、伸長反応を繰り返して、テンプレートＤＮＡの配列を増幅する。ＰＣＲの条件にもよるが、熱変性は約９５℃、１～３分間、アニーリングはプライマーのＴｍ±５℃、伸長反応は１～１０分間で行う。ＰＣＲのサイクル数は特に制限はないが、一般に２４～４０サイクル程度である。
【0047】
図のように、ＰＣＲ増幅産物には３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡが含まれる。これは、プライマーを鋳型として相補鎖が合成される際に、式（１）の分解性保護基がポリメラーゼ反応を阻害し、反応を停止させるためである。
【0048】
その後、図の（ｃ）に示すように、所定の処理によりＲ１を脱保護し、５’末端が突出した接着末端を形成する（脱保護工程）。所定の処理は、Ｒ１を脱保護するための処理であり、上記の光照射処理、還元処理などを挙げることができる。
【0049】
以下、脱保護メカニズムについて説明する。下記式に示すように、所定の処理を施すと、式（１）の分解性保護基Ｒ１がヌクレオチドのリン酸から脱離する。
【化14】
【0050】
光照射処理としては、例えば、光源装置（脱保護手段）により３００～４００ｎｍの波長の光を１～３０分間照射する方法を挙げることができる。また、還元処理としては、例えば、亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）などの還元剤を用い、例えば７０～８０℃、１～３０分間処理する方法を挙げることができる。これにより、プライマーの式（１）のヌクレオシドの分解性保護基が脱保護され、５’突出末端（３’陥没末端）を有する二本鎖ＤＮＡを合成することができる。その他の処理についても同様に、分解性保護基を脱保護する装置（脱保護装置）を使用して脱保護を行う。
【0051】
本発明では、制限酵素などによらずに自由自在に接着末端を設計することができるため、所望の配列を有するＤＮＡを自由に連結することができる。例えば、標的ＤＮＡとベクターの両方の配列を設計し、脱保護処理により両者に共通の接着末端を形成させてライゲーションを行って組換えＤＮＡを調製し、これをクローニングやライブラリーの作成、大量発現系の構築などに使用することができる。また、接着末端を有する複数のゲノム配列を連結することで、試験管内でゲノムビルドアップ反応を行うことができる。あるいは、平滑末端の状態で細胞内に二本鎖ＤＮＡを導入し、細胞内で脱保護処理を行うことで、細胞内でゲノムビルドアップ反応を行うこともできる。
【実施例】
【0052】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、これらは本発明の目的を限定するものではない。また、以下の実施例において「％」表示は特に規定しない限り質量基準（質量パ－セント）である。
【0053】
１．鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊
（１）鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチドの合成
鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチド（表１）は、ホスホロアミダイト法に基づき核酸自動合成機（ＮＲ－２Ａ ７ＭＸ、日本テクノサービス社製）により合成した。鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊のアミダイト化合物（化１３）は、既報（Ｗｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１４，２０，１２１１４－１２１２２）に従い合成した。５’末端のリン酸化には、市販のアミダイト試薬５’－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社製）を用いた。合成後のオリゴヌクレオチドは定法に従い脱保護したのち、逆相ＨＰＬＣにより精製した［システム，日立ハイテクサイエンス社製 ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ； カラム，ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ Ｉ．Ｄ．）；溶離液Ａ，５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ ７．０）；溶離液Ｂ，アセトニトリル；グラジエント条件、０～６０％ 溶離液Ｂ／２０分；溶離液量，３ｍＬ／分；波長２６０ｎｍの吸光度により検出］（図２）。
（１）鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチドの合成
鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチド（表１）は、ホスホロアミダイト法に基づき核酸自動合成機（ＮＲ－２Ａ ７ＭＸ、日本テクノサービス社製）により合成した。鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊のアミダイト化合物（化１３）は、既報（Ｗｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１４，２０，１２１１４－１２１２２）に従い合成した。５’末端のリン酸化には、市販のアミダイト試薬５’－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社製）を用いた。合成後のオリゴヌクレオチドは定法に従い脱保護したのち、逆相ＨＰＬＣにより精製した［システム，日立ハイテクサイエンス社製 ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ； カラム，ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ Ｉ．Ｄ．）；溶離液Ａ，５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ ７．０）；溶離液Ｂ，アセトニトリル；グラジエント条件、０～６０％ 溶離液Ｂ／２０分；溶離液量，３ｍＬ／分；波長２６０ｎｍの吸光度により検出］（図２）。
【化15】
【0054】
下記表に、合成した鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチド配列を示す。ｐは５’末端の水酸基がリン酸化されていることを示す。
【表1】
【0055】
図２は、オリゴヌクレオチドｐＡｃＧＦＰ＿Ｆｗ２合成時における、脱保護後（ａ）と精製後（ｂ）のクロマトグラムを示す図である。精製前のクロマトグラム（ａ）に示す１４．１分付近のピークが目的物に由来するピークである。これを分取して精製した（ｂ）。
【0056】
（２）鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした複製反応
Ｑ５（登録商標） Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標） ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標） Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から購入した。Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはプロメガ社から購入した。酵素反応の反応液［１μＭ Ｐｒｉｍｅｒ（５’ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣ ３’），１μＭ Ｔｅｍｐｌａｔｅ（０Ｔ，１Ｔ又は２Ｔ，表１），０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，０．０２ ｕｎｉｔｓ／μＬ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む］は各酵素に添付の緩衝液を用い、推奨条件に従い作成した。反応液をアプライドバイオシステムズ ２７２０サーマルサイクラーにて９５℃で１分、５５℃で３０秒、次いで７２℃で１０，３０又は６０分間加熱した。加熱後の反応液１０μＬに２×ホルムアミドローディング溶液１０μＬを加え、９０℃で３分間加熱した後、７．５Ｍ尿素を含む２０％変性ＰＡＧＥにより解析した（図３）。泳動後のゲルに含まれるオリゴヌクレオチド鎖をプライマー鎖の５’末に修飾したフルオレセイン基由来の蛍光に基づきＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋イメージングシステムにて検出した。
Ｑ５（登録商標） Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標） ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標） Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から購入した。Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはプロメガ社から購入した。酵素反応の反応液［１μＭ Ｐｒｉｍｅｒ（５’ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣ ３’），１μＭ Ｔｅｍｐｌａｔｅ（０Ｔ，１Ｔ又は２Ｔ，表１），０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，０．０２ ｕｎｉｔｓ／μＬ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む］は各酵素に添付の緩衝液を用い、推奨条件に従い作成した。反応液をアプライドバイオシステムズ ２７２０サーマルサイクラーにて９５℃で１分、５５℃で３０秒、次いで７２℃で１０，３０又は６０分間加熱した。加熱後の反応液１０μＬに２×ホルムアミドローディング溶液１０μＬを加え、９０℃で３分間加熱した後、７．５Ｍ尿素を含む２０％変性ＰＡＧＥにより解析した（図３）。泳動後のゲルに含まれるオリゴヌクレオチド鎖をプライマー鎖の５’末に修飾したフルオレセイン基由来の蛍光に基づきＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋イメージングシステムにて検出した。
【0057】
図３は、鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした鎖伸長反応の停止を示す図である。（ａ）は用いたオリゴヌクレオチドの配列。（ｂ）～（ｅ）は市販の耐熱性ポリメラーゼを用いた鎖伸長反応の変性ＰＡＧＥ解析結果、（ｆ）はＰｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、２Ｔを鋳型にした反応のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分子量解析結果を示す。下パネルは原料（Ｐｒｉｍｅｒ）の解析結果（コントロール実験）を示す。
【0058】
図３（ｆ）に示した鎖伸長産物の分子量解析は次のとおり行った。前述の条件にてＰｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む２Ｔを鋳型にした酵素反応を作成し、９５℃で１分、５５℃で３０秒、次いで７２℃で４０分間加熱した。反応液（５０μＬ）をＴＥ飽和フェノールとクロロホルムの等量混合液で抽出し、酢酸アンモニウム塩存在下アルコール沈殿し、ＤＮＡを回収した。質量分析計ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用い、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分子量解析を行った。
【0059】
（３）鎖伸長停止による接着末端形成を利用したクローニング反応
図５はＰＣＲ断片の連結反応の模式図である。この図に示す方法でＰＣＲ断片の連結を行った。まず、ベクター側断片（５．３ｋｂ）は以下のようにして調製した（図４（ａ））。反応液［０．５μＭ ｐＥＴ２１ｄ＿Ｆｗ２， ０．５μＭ ｐＥＴ２１ｄ＿Ｒｅｖ２， ０．８ｎｇ／μＬ ｐＥＴ２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ），２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８ ａｔ ２５℃），１０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，２ｍＭ ＭｇＳＯ４，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００， ０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ，０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，０．０２Ｕ／μＬ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ］をアプライドバイオシステムズ ＭｉｎｉＡｍｐ Ｐｌｕｓサーマルサイクラーにて以下の加熱条件に付した［（９５℃，１５秒→５０℃，３０秒→７２℃，７．５分間）／サイクル×３０サイクル］。
図５はＰＣＲ断片の連結反応の模式図である。この図に示す方法でＰＣＲ断片の連結を行った。まず、ベクター側断片（５．３ｋｂ）は以下のようにして調製した（図４（ａ））。反応液［０．５μＭ ｐＥＴ２１ｄ＿Ｆｗ２， ０．５μＭ ｐＥＴ２１ｄ＿Ｒｅｖ２， ０．８ｎｇ／μＬ ｐＥＴ２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ），２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８ ａｔ ２５℃），１０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，２ｍＭ ＭｇＳＯ４，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００， ０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ，０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，０．０２Ｕ／μＬ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ］をアプライドバイオシステムズ ＭｉｎｉＡｍｐ Ｐｌｕｓサーマルサイクラーにて以下の加熱条件に付した［（９５℃，１５秒→５０℃，３０秒→７２℃，７．５分間）／サイクル×３０サイクル］。
【0060】
インサート側断片（０．７５ｋｂ）は以下のようにして調製した（図４（ｂ））。反応液［０．５μＭ ｐＡｃＧＦＰ１＿Ｆｗ２， ０．５μＭ ｐＡｃＧＦＰ１＿Ｒｅｖ２， ０．８ｎｇ／μＬ ｐＡｃＧＦＰ１（Ｔａｋａｒａ）， ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８ ａｔ ２５℃），１０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４， ２ｍＭ ＭｇＳＯ４， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００， ０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ， ０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ， ０．０２Ｕ／μＬ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ］をアプライドバイオシステムズ ＭｉｎｉＡｍｐ Ｐｌｕｓサーマルサイクラーにて以下の加熱条件に付した［（９５℃，１５秒→５５℃，１５秒→７２℃，１分間）／サイクル×３０サイクル］。
【0061】
ＰＣＲ反応後の反応液（５０μＬ）にそれぞれＴＥ飽和フェノール（ナカライテスク）とクロロホルムの等量混合液（１００μＬ）を加え、激しく混和したのち遠心（１４，０００×ｇ，３分間）し，水層を分離した。同様にクロロホルム（１００μＬ）で反応液を抽出したのち、水層に３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）５μＬとイソプロピルアルコール６０μＬを加えた。－３０℃で１時間冷却した後、遠心（２０，０００×ｇ，２０分間）し、ＤＮＡをペレットとして回収した。ＰＣＲ反応の鋳型プラスミドＤＮＡを分解するため、２種の反応産物をそれぞれ制限酵素ＤｐｎＩ（Ｔｏｙｏｂｏ）と３７℃で１時間反応させた（０．８Ｕ／μＬ ＤｐｎＩ ｉｎ ３３ｍＭ Ｔｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．９），１０ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２， ６６ｍＭ ＫＯＡｃ，０．５ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，反応液量２０μＬ）。反応液に水８０μＬを添加し、ＴＥ飽和フェノールとクロロホルムの等量混合液（１００μＬ）を加え、激しく混和したのち遠心（１４，０００×ｇ，３分間）し、水層を分離した。同様にクロロホルム（１００μＬ）で反応液を抽出したのち、３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）１０μＬとイソプロピルアルコール１１０μＬを加えた。－３０℃で１時間冷却した後、遠心（２０，０００×ｇ，２０分間）し、ＤＮＡをペレットとして回収した。ＤＮＡペレットを水に溶解しアガロースゲル電気泳動（ＧｅｌＲｅｄ（和光純薬工業）を含む０．８％ Ａｇａｒｏｓｅ Ｓ（和光純薬工業））により分析し、ＤＮＡサイズマーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ Ｐｕｒｐｌｅ １ ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のバンド強度と比較することで含まれる目的ＤＮＡの濃度を算出した［ベクターＤＮＡ断片（５μＬ）、１３ｎｇ／μＬ；インサートＤＮＡ断片（５０μＬ），２３ｎｇ／μＬ］。
【0062】
べクターＤＮＡ断片（２６．５ｎｇ）とインサート断片（２６．５ｎｇ）の混合液５μＬを９６穴マルチウェルプレートのウェルに加え、光照射装置ＭＡＸ－３０５（朝日分光）により波長３６５ｎｍの光を約４ｍＷ／ｃｍ２で１０分間照射した。同溶液を大腸菌コンピテントセル溶液２５μＬ（ＮＥＢ ５－ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に添加し形質転換した。これをアンピシリンナトリウム（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し３７℃で一晩培養した。生じたコロニー４７６個から２０個を選択しコロニーＰＣＲを行い、ベクターへの目的インサートの挿入の有無を判別した。ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動により解析し、２０クローンのうち目的連結反応産物は１８個含まれることが分かった（ＰＣＲプライマー， ５’ ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡ ＣＴＡＴＡＧＧＧ ３’， ５’ ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ ３’；コロニー陽性率９０％）。連結反応産物１０クローンについて、これを含む菌体を液体培養し、プラスミドＤＮＡを抽出した。２種のプライマー配列（５’ ＧＧＴＧＡＴＧＴＣＧＧＣＧＡＴＡＴＡＧＧ ３’， ５’ ＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧＴＴＣＣＴ ３’）を用い、ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３５００ｘＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒにより得られたプラスミドＤＮＡの配列を解析した。４か所のプライマーＤＮＡ由来部位、これらのうちの２か所のオーバーラップ部位、及びこれらに挟まれた範囲の塩基配列を解析した結果、１０クローンすべてで設計どおりの配列を含み、変異は観察されなかった。
【0063】
図４は、ＰＣＲ反応のアガロースゲル電気泳動分析を示す図である。Ｌａｎｅ１，サイズマーカー；ｌａｎｅ２，反応液を示す。（ａ）ベクター側断片の調製。（ｂ）インサート側断片の調製である。
【0064】
２．還元条件で脱保護されるアナログ（Ｔ＊＊）
（１）還元条件で脱保護されるアナログ（Ｔ＊＊）の合成
以下に還元条件で脱保護されるアナログ（還元脱保護アナログ）の合成スキームを示す。以下、この合成スキームに従って、還元脱保護アナログの合成手順を説明する。
（１）還元条件で脱保護されるアナログ（Ｔ＊＊）の合成
以下に還元条件で脱保護されるアナログ（還元脱保護アナログ）の合成スキームを示す。以下、この合成スキームに従って、還元脱保護アナログの合成手順を説明する。
【化16】
【0065】
３－Ｏ－［２－（４－ニトロベンジルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニル］－５－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２－デオキシ－チミジン（化合物２６）の合成
ＴＨＦ（７ｍＬ）中の化合物２４（０．５０ｇ、１．３２ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（２００μＬ、１．４５ｍｍｏｌ）の混合物に、室温でＮ，Ｎ－ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（０．３９ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を加えた。反応が完了するまで、生じた混合物を室温で２５分間撹拌した（化合物２５）。次の工程を精製せずに続けた。４－ニトロベンジルアルコール（０．２２ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、次いで５－（メチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（０．１７ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を加えた。反応は室温で２０分後に完了した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３、Ｈ２Ｏ、及びブラインで洗浄した。蒸発後、混合物を中性フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中２％トリエチルアミン／ＥｔＯＡｃ＝２：１～１：１）で精製して化合物２６（０．４６ｇ、０．５６ｍｍｏｌ、４２％）を得た。
ＴＨＦ（７ｍＬ）中の化合物２４（０．５０ｇ、１．３２ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（２００μＬ、１．４５ｍｍｏｌ）の混合物に、室温でＮ，Ｎ－ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（０．３９ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を加えた。反応が完了するまで、生じた混合物を室温で２５分間撹拌した（化合物２５）。次の工程を精製せずに続けた。４－ニトロベンジルアルコール（０．２２ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、次いで５－（メチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（０．１７ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を加えた。反応は室温で２０分後に完了した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３、Ｈ２Ｏ、及びブラインで洗浄した。蒸発後、混合物を中性フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中２％トリエチルアミン／ＥｔＯＡｃ＝２：１～１：１）で精製して化合物２６（０．４６ｇ、０．５６ｍｍｏｌ、４２％）を得た。
【0066】
（２）オリゴヌクレオチドの合成
合成した切断アナログＴ＊＊のアミダイトは終濃度５０ ｍＭのアセトニトリル溶液とし、ホスホロアミダイト法に基づきＤＮＡ合成機を用いてＤＮＡオリゴマーを合成した。脱保護は定法に従って行い、逆相ＨＰＬＣ ［日立ハイテクサイエンス社製 ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ；カラム，ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ）］により精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて構造を確認した。合成したＤＮＡの配列を以下の表に示す。
合成した切断アナログＴ＊＊のアミダイトは終濃度５０ ｍＭのアセトニトリル溶液とし、ホスホロアミダイト法に基づきＤＮＡ合成機を用いてＤＮＡオリゴマーを合成した。脱保護は定法に従って行い、逆相ＨＰＬＣ ［日立ハイテクサイエンス社製 ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ；カラム，ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ）］により精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて構造を確認した。合成したＤＮＡの配列を以下の表に示す。
【表2】
【0067】
（３）プライマー伸長実験
Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から購入した。Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはプロメガ社から購入した。酵素反応の反応液［１μＭ Ｐｒｉｍｅｒ （５’ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣ ３’），１μＭ Ｔｅｍｐｌａｔｅ（０Ｔ，１Ｔ又は２Ｔ，表２），０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，０．０２ｕｎｉｔｓ／μＬ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む］は各酵素に添付の緩衝液を用い、推奨条件に従い作成した。反応液をアプライドバイオシステムズ２７２０サーマルサイクラーにて９５℃で１分、５５℃で３０秒、次いで７２℃で１０、３０又は６０分間加熱した。加熱後の反応液９μＬに２×ホルムアミドローディング溶液９μＬを加え、９０℃で３分間加熱した後、７．５Ｍ尿素を含む２０％変性ＰＡＧＥにより解析した（図６）。泳動後のゲルに含まれるオリゴヌクレオチド鎖をプライマー鎖の５’末に修飾したフルオレセイン基由来の蛍光に基づきＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋イメージングシステムにて検出した。
Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から購入した。Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはプロメガ社から購入した。酵素反応の反応液［１μＭ Ｐｒｉｍｅｒ （５’ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣ ３’），１μＭ Ｔｅｍｐｌａｔｅ（０Ｔ，１Ｔ又は２Ｔ，表２），０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，０．０２ｕｎｉｔｓ／μＬ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む］は各酵素に添付の緩衝液を用い、推奨条件に従い作成した。反応液をアプライドバイオシステムズ２７２０サーマルサイクラーにて９５℃で１分、５５℃で３０秒、次いで７２℃で１０、３０又は６０分間加熱した。加熱後の反応液９μＬに２×ホルムアミドローディング溶液９μＬを加え、９０℃で３分間加熱した後、７．５Ｍ尿素を含む２０％変性ＰＡＧＥにより解析した（図６）。泳動後のゲルに含まれるオリゴヌクレオチド鎖をプライマー鎖の５’末に修飾したフルオレセイン基由来の蛍光に基づきＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋イメージングシステムにて検出した。
【0068】
（４）Ｔ＊＊を１つ含むオリゴヌクレオチド（１Ｔ）の脱保護反応
オリゴヌクレオチド（５’－ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ＊＊ＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴ－３’，１０μＭ）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４を終濃度１ｍＭとなるように加え、室温で３０分間静置した。その後、脱保護反応の進行を逆相ＨＰＬＣ［日立ハイテクサイエンス社製 ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ；カラム，ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８ （２５０×１０ｍｍ）］により解析した（図７）。
オリゴヌクレオチド（５’－ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ＊＊ＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴ－３’，１０μＭ）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４を終濃度１ｍＭとなるように加え、室温で３０分間静置した。その後、脱保護反応の進行を逆相ＨＰＬＣ［日立ハイテクサイエンス社製 ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ；カラム，ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８ （２５０×１０ｍｍ）］により解析した（図７）。
【0069】
（５）Ｔ＊＊を２つ含むオリゴヌクレオチド（２Ｔ）の脱保護反応
オリゴヌクレオチド（５’－ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ＊＊Ｔ＊＊ＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴ－３’，１０μＭ）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４を終濃度１０ｍＭとなるように加え、室温で３０分間静置した。その後、脱保護反応の進行を逆相ＨＰＬＣ［日立ハイテクサイエンス社製 ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ；カラム，ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ）］により解析した（図８）。
オリゴヌクレオチド（５’－ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ＊＊Ｔ＊＊ＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴ－３’，１０μＭ）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４を終濃度１０ｍＭとなるように加え、室温で３０分間静置した。その後、脱保護反応の進行を逆相ＨＰＬＣ［日立ハイテクサイエンス社製 ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ；カラム，ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ）］により解析した（図８）。
【0070】
３．リン酸修飾基中の置換基Ｒをより嵩高くした実験
以下、ＰＣＲ停止プライマーにおいてリン酸修飾基中の置換基Ｒをより嵩高くしたとき、修飾部位の化学的安定性及び複製反応阻害効果を評価した。図９は、この実験の概要を示す図である。
以下、ＰＣＲ停止プライマーにおいてリン酸修飾基中の置換基Ｒをより嵩高くしたとき、修飾部位の化学的安定性及び複製反応阻害効果を評価した。図９は、この実験の概要を示す図である。
【0071】
（１）アミダイト試薬 （ｄＴ，Ｒ＝Ｍｅ，ｔＢｕ，ａｄａｍａｎｔｙｌ）の合成
置換基Ｒをより嵩高くし、複製反応阻害効果、化学的安定性向上を目指した。
（１－１）メチル型ｄＴホスホロアミダイトの合成
参照）Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１４，２０，１２１１４－１２１２２
５’－ＤＭＴｒ－チミジン（３４３ｍｇ，０．６３ｍｇ）の懸濁液に光保護アミダイト試薬（３００ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）と１Ｈ－テトラゾール（５３ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１．７ｍＬ）中、アルゴン下、０℃で添加し、室温で４時間撹拌した。この混合物をシリカゲルカラム（３％ＴＥＡを含むＣＨ２Ｃｌ２／ＡｃＯＥｔ＝３／１）に直接アプライして粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３％ＴＥＡを含むＨｅｘ／ＡｃＯＥｔ＝３／１）で精製し、Ｍｅアナログアミダイト（３０９ｍｇ、５８％）を得た。
３１Ｐ－ＮＭＲ（１５９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １４８．８，１４７．８，１４７．７；ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．８６３．３３９２［Ｍ＋Ｎａ］＋、ｆｏｕｎｄ ８６３．３４１５。
置換基Ｒをより嵩高くし、複製反応阻害効果、化学的安定性向上を目指した。
（１－１）メチル型ｄＴホスホロアミダイトの合成
【化17】
５’－ＤＭＴｒ－チミジン（３４３ｍｇ，０．６３ｍｇ）の懸濁液に光保護アミダイト試薬（３００ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）と１Ｈ－テトラゾール（５３ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１．７ｍＬ）中、アルゴン下、０℃で添加し、室温で４時間撹拌した。この混合物をシリカゲルカラム（３％ＴＥＡを含むＣＨ２Ｃｌ２／ＡｃＯＥｔ＝３／１）に直接アプライして粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３％ＴＥＡを含むＨｅｘ／ＡｃＯＥｔ＝３／１）で精製し、Ｍｅアナログアミダイト（３０９ｍｇ、５８％）を得た。
３１Ｐ－ＮＭＲ（１５９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １４８．８，１４７．８，１４７．７；ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．８６３．３３９２［Ｍ＋Ｎａ］＋、ｆｏｕｎｄ ８６３．３４１５。
【0072】
（１－２）アダマンチル型ｄＴホスホロアミダイトの合成
ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中の５’－ＤＭＴｒ－チミジン（２５８ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）の溶液にＤＩＰＥＡ（１０７μＬ，０．６１ｍｍｏｌ）とビス（ジイソプロピルアミノ）－Ｃｌ－ホスフィン（１６３ｍｇ，０．６１ｍｍｏｌ）をアルゴン下、０℃で加え、室温で２時間撹拌した。次いで、上記反応混合物に２－ニトロ－α－アダマンチルベンジルアルコール（１５０ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）と１Ｈ－テトラゾール（５０ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応混合物に１Ｈ－テトラゾール（５０ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）を加え、更に１時間撹拌した。Ｈ２Ｏを加えた後、反応混合物をＡｃＯＥｔで抽出し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、蒸発させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．５％ ＴＥＡを含むＨｅｘ／ＡｃＯＥｔ＝１／１）で粗生成物を精製し、Ａｄアナログアミダイト（１６９ｍｇ、３７％）を得た。
３１Ｐ－ＮＭＲ（１５９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １５３．１，１５１．９，１５０．２，１４８．１；ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．９８３．４３３１［Ｍ＋Ｎａ］＋、ｆｏｕｎｄ ９８３．４３３６。
【化18】
３１Ｐ－ＮＭＲ（１５９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １５３．１，１５１．９，１５０．２，１４８．１；ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．９８３．４３３１［Ｍ＋Ｎａ］＋、ｆｏｕｎｄ ９８３．４３３６。
【0073】
（１－３）ｔＢｕ置換アナログの４種類の塩基（Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）のアミダイト試薬合成スキーム（まとめ）
以下に、４種類の塩基を用いた場合におけるアミダイト試薬の合成スキームの概要を示す。
以下に、４種類の塩基を用いた場合におけるアミダイト試薬の合成スキームの概要を示す。
【化19】
【0074】
（１－４）Ｐａｃ－ｄＡホスホロアミダイトの合成
５’－ＤＭＴｒ－Ｐａｃ－ｄＡ（２．０ｇ，２．９ｍｍｏｌ）の懸濁液に光保護アミダイト試薬（２．６ｇ，５．８ｍｍｏｌ）と５（メチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（１．０ｇ，８．７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（７．５ｍＬ）中でアルゴン下、０℃で加え、室温で６時間撹拌した。溶液をＡｃＯＥｔ（２００ｍＬ）に注ぎ、水（２００ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水（２００ ｍＬ）、食塩水（２００ ｍＬ）で洗浄した。硫酸ナトリウム上で有機相を乾燥し、濾過し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＡｃＯＥｔ＝２／１、１％ ＴＥＡ含有）で精製し、ｔ－Ｂｕ ｄＴアナログアミダイト（１．１ｇ、３７％）を得た。
ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．１０４８．４３５０［Ｍ＋Ｎａ］＋、ｆｏｕｎｄ １０４８．４４３７。
【化20】
ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．１０４８．４３５０［Ｍ＋Ｎａ］＋、ｆｏｕｎｄ １０４８．４４３７。
【0075】
（１－５）ｄＴホスホロアミダイトの合成
５’－ＤＭＴｒ－Ｐａｃ－ｄＡ（１．５ｇ，２．８ｍｍｏｌ）の懸濁液に光保護アミダイト試薬（２．４ｇ，５．５ｍｍｏｌ）と５－（メチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（０．６４ｇ，５．５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中にアルゴン下、０℃で添加し、室温で７時間撹拌した。溶液をＡｃＯＥｔ（２００ｍＬ）に注ぎ、水（２００ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水（２００ｍＬ）、食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＡｃＯＥｔ＝２／１、１％ ＴＥＡを含む）で精製し、ｔ－Ｂｕ ｄＡアナログアミダイト（２．０ｇ、８１％）を得た。
ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．９０５．２２６７［Ｍ＋Ｎａ］＋、ｆｏｕｎｄ ９０５．３９７８。
【化21】
ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．９０５．２２６７［Ｍ＋Ｎａ］＋、ｆｏｕｎｄ ９０５．３９７８。
【0076】
（１－６）Ｐａｃ－ｄＧホスホロアミダイトの合成
５’－ＤＭＴｒ－Ｐａｃ－ｄＧ（２．０ｇ，２．８ｍｍｏｌ）の懸濁液に光保護アミダイト試薬（２．５ｇ，５．７ｍｍｏｌ）と５－（メチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（０．９９ｇ，８．５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（７．５ｍＬ）中でアルゴン下、０℃で加え、室温で６時間撹拌した。溶液をＡｃＯＥｔ（２００ｍＬ）に注ぎ、水（２００ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水（２００ｍＬ）、食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＡｃＯＥｔ＝２／１で１％ ＴＥＡを含む、ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ＝４０／１）で精製し、ｔ－Ｂｕ ｄＧアナログアミダイト（１．２ｇ，４１％）を得た。
ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ （ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．１１４３．５６７８［Ｍ＋ＴＥＡ］＋、ｆｏｕｎｄ １１４３．５８６７。
【化22】
ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ （ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．１１４３．５６７８［Ｍ＋ＴＥＡ］＋、ｆｏｕｎｄ １１４３．５８６７。
【0077】
（１－７）Ａｃ－ｄＣホスホロアミダイトの合成
５’－ＤＭＴｒ－Ａｃ－ｄＣ（１．８ｇ，３．２ｍｍｏｌ）の懸濁液に光保護アミダイト試薬（２．８ｇ，６．３ｍｍｏｌ）と５（メチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（０．７３ｍｇ，６．３ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（８．０ｍＬ）中にアルゴン下、０℃で加え、室温で６時間撹拌した。溶液をＡｃＯＥｔ（２００ｍＬ）に注ぎ、水（２００ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水（２００ｍＬ）、食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＡｃＯＥｔ＝１／１、１％ ＴＥＡ含有）で精製し、ｔ－Ｂｕ ｄＣアナログアミダイト（２．１ｇ、７４％）を得た。
ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．１０１１．５３５５ ［Ｍ＋ＴＥＡ］＋、ｆｏｕｎｄ １０１１．５５０３。
【化23】
ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．１０１１．５３５５ ［Ｍ＋ＴＥＡ］＋、ｆｏｕｎｄ １０１１．５５０３。
【0078】
（２）修飾オリゴヌクレオチドの熱サイクル条件（ＰＣＲ条件）における安定性（分解耐性）試験
（反応条件）
１０μＭ ｏｌｉｇｏ（Ｍｅ１Ｔ ｏｒ ｔＢｕ１Ｔ） ｉｎ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１０ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＳＯ４，ｐＨ８．８．本組成の溶液を熱サイクル条件［（９５℃，１分→５０℃，３０秒→７２℃，３分）×３０ｃｙｃｌｅｓ］に付したのち、逆相ＨＰＬＣにて分析した。
（反応条件）
１０μＭ ｏｌｉｇｏ（Ｍｅ１Ｔ ｏｒ ｔＢｕ１Ｔ） ｉｎ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１０ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＳＯ４，ｐＨ８．８．本組成の溶液を熱サイクル条件［（９５℃，１分→５０℃，３０秒→７２℃，３分）×３０ｃｙｃｌｅｓ］に付したのち、逆相ＨＰＬＣにて分析した。
【0079】
（分析条件）
システム；日立ハイテクサイエンス社製ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ
カラム；ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ）
移動相；Ａ液，５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（ＴＥＡＡ， ｐＨ７．０）
Ｂ液，アセトニトリル
（Ｂ液含量を２０分かけて０％から６０％へと増加させた（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ））
移動相流量；１ｍＬ／分
検出波長；２６０ｎｍ
システム；日立ハイテクサイエンス社製ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ
カラム；ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ）
移動相；Ａ液，５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（ＴＥＡＡ， ｐＨ７．０）
Ｂ液，アセトニトリル
（Ｂ液含量を２０分かけて０％から６０％へと増加させた（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ））
移動相流量；１ｍＬ／分
検出波長；２６０ｎｍ
【0080】
（結果）
オリゴヌクレオチドＭｅ１Ｔを熱サイクルに付した後には、約５０％の基質において修飾基の脱離が見られた（図１０の（ｄ）：観察されたピークが修飾を含まない同配列オリゴヌクレオチドの溶出時間と一致することを確認した）。それに対し、ｔＢｕ１Ｔの場合は熱サイクルに付しても保護基の脱離は観察されなかった（図１０の（ｅ））。したがって、Ｍｅ，ｔＢｕタイプ修飾の安定性を比較した結果、後者の優位性が示された。
オリゴヌクレオチドＭｅ１Ｔを熱サイクルに付した後には、約５０％の基質において修飾基の脱離が見られた（図１０の（ｄ）：観察されたピークが修飾を含まない同配列オリゴヌクレオチドの溶出時間と一致することを確認した）。それに対し、ｔＢｕ１Ｔの場合は熱サイクルに付しても保護基の脱離は観察されなかった（図１０の（ｅ））。したがって、Ｍｅ，ｔＢｕタイプ修飾の安定性を比較した結果、後者の優位性が示された。
【0081】
（３）修飾プライマーがＰＣＲ条件において安定（分解耐性）であることを示す実験（ｔＢｕアナログ導入数１，２，３の比較）
（反応条件）
１０μＭ ｏｌｉｇｏ（ｔＢｕ１Ｔ，ｔＢｕ２Ｔ ｏｒ ｔＢｕ３Ｔ） ｉｎ ２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，１０ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＳＯ４，ｐＨ８．８。本組成の溶液を熱サイクル条件［（９５℃，１ｍｉｎ→５０℃，３０ｓｅｃ→７２℃，３ｍｉｎ）×３０ｃｙｃｌｅｓ］に付したのち、逆相ＨＰＬＣにて分析した。
（反応条件）
１０μＭ ｏｌｉｇｏ（ｔＢｕ１Ｔ，ｔＢｕ２Ｔ ｏｒ ｔＢｕ３Ｔ） ｉｎ ２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，１０ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＳＯ４，ｐＨ８．８。本組成の溶液を熱サイクル条件［（９５℃，１ｍｉｎ→５０℃，３０ｓｅｃ→７２℃，３ｍｉｎ）×３０ｃｙｃｌｅｓ］に付したのち、逆相ＨＰＬＣにて分析した。
【0082】
（分析条件）
システム；日立ハイテクサイエンス社製ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ
カラム；ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ）
移動相；Ａ液，５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（ＴＥＡＡ，ｐＨ７．０）
Ｂ液，アセトニトリル
（Ｂ液含量を２０分かけて０％から６０％へと増加させた（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ））
移動相流量；１ｍＬ／分
検出波長；２６０ｎｍ
システム；日立ハイテクサイエンス社製ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ
カラム；ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ）
移動相；Ａ液，５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（ＴＥＡＡ，ｐＨ７．０）
Ｂ液，アセトニトリル
（Ｂ液含量を２０分かけて０％から６０％へと増加させた（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ））
移動相流量；１ｍＬ／分
検出波長；２６０ｎｍ
【0083】
（結果）
図１１に示すように、修飾の導入数を２個、３個に増加させても本条件では保護基の脱離は見られなかった。
図１１に示すように、修飾の導入数を２個、３個に増加させても本条件では保護基の脱離は見られなかった。
【0084】
（４）ｔＢｕタイプ修飾プライマーの脱保護反応の逆相ＨＰＬＣ分析
（脱保護反応条件）
光照射（図１２の（ｂ））；１０μＭ ｏｌｉｇｏ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
溶液に対し３６５ｎｍ光（４ｍＷ／ｃｍ２）を１０分間照射
還元反応（図１２の（ｃ））；５μＭ ｏｌｉｇｏ，１０ｍＭ Ｎａ２Ｓ２Ｏ４，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
溶液を２５℃で３０分間インキュベート
（脱保護反応条件）
光照射（図１２の（ｂ））；１０μＭ ｏｌｉｇｏ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
溶液に対し３６５ｎｍ光（４ｍＷ／ｃｍ２）を１０分間照射
還元反応（図１２の（ｃ））；５μＭ ｏｌｉｇｏ，１０ｍＭ Ｎａ２Ｓ２Ｏ４，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
溶液を２５℃で３０分間インキュベート
【0085】
（分析条件）
システム；日立ハイテクサイエンス社製ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ
カラム；ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ）
移動相；Ａ液，５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（ＴＥＡＡ，ｐＨ７．０）
Ｂ液，アセトニトリル
（Ｂ液含量を２０分かけて０％から６０％へと増加させた（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ））
移動相流量；１ｍＬ／分
検出波長；２６０ｎｍ
システム；日立ハイテクサイエンス社製ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ
カラム；ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ）
移動相；Ａ液，５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（ＴＥＡＡ，ｐＨ７．０）
Ｂ液，アセトニトリル
（Ｂ液含量を２０分かけて０％から６０％へと増加させた（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ））
移動相流量；１ｍＬ／分
検出波長；２６０ｎｍ
【0086】
以下の還元条件でも同様に脱保護が可能であることを確認済みである。
・１０μＭ ｏｌｉｇｏ，１０ｍＭ Ｂ２（ＯＨ）４，５０ｍＭ ＮａＯＨ，３０％ ＥｔＯＨ／ｗａｔｅｒ；２５℃，２ｈｏｕｒｓ
・１０μＭ ｏｌｉｇｏ，１．５ｍＭ ＴｉＣｌ３，２０ｍＭ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）；２５℃，２ｈｏｕｒｓ
・１０μＭ ｏｌｉｇｏ，１０ｍＭ Ｂ２（ＯＨ）４，５０ｍＭ ＮａＯＨ，３０％ ＥｔＯＨ／ｗａｔｅｒ；２５℃，２ｈｏｕｒｓ
・１０μＭ ｏｌｉｇｏ，１．５ｍＭ ＴｉＣｌ３，２０ｍＭ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）；２５℃，２ｈｏｕｒｓ
【0087】
図１２に示すように、３６５ｎｍ光照射、及び亜ジチオン酸ナトリウムによる還元反応の両者で定量的な反応進行を確認した。
【0088】
（５）ＰＣＲ産物の試験管内での連結反応（Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ）
図１３中に記載の熱耐性ポリメラーゼを使用し、ＰＣＲ反応により二本鎖ＤＮＡ断片を調製した。１．０ｋｂ断片の調製に用いた鋳型はｐＥＴ２１プラスミドＤＮＡ、プライマー配列は以下の２本である。
下線部Ｔ（Ｔ）はリン酸部にＭｅ、ｔＢｕ型修飾基を含むことを示す。ｐは５’末端がリン酸化されていることを示す。
Ｆｗ（２１－ｎｔ），５’ ＣＧＣＣＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＧ ３’
Ｒｅｖ（３８－ｎｔ），５’ ｐＡＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＴＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＴＡＧＡＧ ３’
０．７４ｋｂ断片の調製に用いた鋳型はｐＡｃＧＦＰ１プラスミドＤＮＡ、プライマー配列は以下の２本である。
下線部Ｔ（Ｔ）はリン酸部にＭｅ、ｔＢｕ型修飾基を含むことを示す。ｐは５’末端がリン酸化されていることを示す。
Ｆｗ（３５－ｎｔ），５’ ｐＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＣＣ ３’
Ｒｅｖ（３４－ｎｔ），５’ ＧＣＡＡＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＡＴＣＣＡＴ ３’
図１３中に記載の熱耐性ポリメラーゼを使用し、ＰＣＲ反応により二本鎖ＤＮＡ断片を調製した。１．０ｋｂ断片の調製に用いた鋳型はｐＥＴ２１プラスミドＤＮＡ、プライマー配列は以下の２本である。
下線部Ｔ（Ｔ）はリン酸部にＭｅ、ｔＢｕ型修飾基を含むことを示す。ｐは５’末端がリン酸化されていることを示す。
Ｆｗ（２１－ｎｔ），５’ ＣＧＣＣＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＧ ３’
Ｒｅｖ（３８－ｎｔ），５’ ｐＡＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＴＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＴＡＧＡＧ ３’
０．７４ｋｂ断片の調製に用いた鋳型はｐＡｃＧＦＰ１プラスミドＤＮＡ、プライマー配列は以下の２本である。
下線部Ｔ（Ｔ）はリン酸部にＭｅ、ｔＢｕ型修飾基を含むことを示す。ｐは５’末端がリン酸化されていることを示す。
Ｆｗ（３５－ｎｔ），５’ ｐＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＣＣ ３’
Ｒｅｖ（３４－ｎｔ），５’ ＧＣＡＡＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＡＴＣＣＡＴ ３’
【0089】
図中に記載の市販の耐熱性ポリメラーゼを使用し、推奨条件に従いＰＣＲ反応を実施し、１．０ｋｂ断片及び０．７４ｋｂ断片をそれぞれ調製した。反応の進行はアガロースゲル電気泳動（ＧｅｌＲｅｄ（和光純薬工業）を含む１．５％ Ａｇａｒｏｓｅ Ｓ（和光純薬工業））にて確認した。ＰＣＲ反応後、反応液２００μＬにＴＥ飽和フェノール（ナカライテスク）とクロロホルムの等量混合液２００μＬを加え、激しく混和したのち遠心（２０，０００×ｇ，１分間）、水層を分離した。同様にクロロホルム２００μＬで反応液を抽出したのち，３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）２０μＬとイソプロピルアルコール２２０μＬを加えた。－３０℃で１時間冷却した後、遠心（２０，０００×ｇ，２０分間）することでＤＮＡを回収した。目的とするＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動（ＧｅｌＲｅｄ（和光純薬工業）を含む１．５％ Ａｇａｒｏｓｅ Ｓ（和光純薬工業））により精製した。切り出したゲル片からＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてＤＮＡを抽出した。
【0090】
このようにして調製した１．０ｋｂ断片と０．７４ｋｂ断片をＴａｑ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その効率をアガロースゲル電気泳動で評価した。最初にリン酸部の保護基を除去するために、ＤＮＡ溶液（５μＬ；２４ｎＭ １．０ｋｂ断片，２４ｎＭ ０．７４ｋｂ断片，１ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５））に３６５－ｎｍ光を４ｍＷ／ｃｍ２の強度で５分間照射した。次いで、この２つのＤＮＡ断片を含む溶液にＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。反応液組成は以下のとおりである。２．８ｎＭ １．０ｋｂ断片，２．８ｎＭ ０．７４ｋｂ断片，１．６Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２５ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ，１０ｍＭ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ，１ｍＭ ＮＡＤ １， １０ｍＭ ＤＴＴ， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，ｐＨ７．６．反応液に水８０μＬを加え、全量を約１００μＬとし、ＴＥ飽和フェノール（ナカライテスク）とクロロホルムの等量混合液１００μＬを加え、激しく混和したのち遠心（２０，０００×ｇ，１分間）、水層を分離した。同様にクロロホルム１００μＬで反応液を抽出したのち、３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）１０μＬとイソプロピルアルコール１１０μＬ，２０ｍｇ／ｍＬ グリコーゲン １μＬを加えた。－３０℃で１５分間冷却した後、遠心（２０，０００×ｇ，２０分間）することでＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動（１．５％ Ａｇａｒｏｓｅ Ｓ（和光純薬工業））により泳動した。泳動後のゲルをＧｅｌＲｅｄ水溶液で染色し、バンドを可視化した（ＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋システム）。
【0091】
図に示すように、Ｍｅ，ｔＢｕプライマーの比較を行い、後者でより高い連結効率が得られることを確認した。
【0092】
（６）鎖伸長停止ケージドアナログを含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした複製反応
上記「（２）鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした複製反応」と同様に、複製反応の実験を行った。
酵素反応の反応液［１μＭ Ｐｒｉｍｅｒ（５’ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣ ３’），１μＭ Ｔｅｍｐｌａｔｅ（各図に配列及び構造記載），０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，０．０２ ｕｎｉｔｓ／μＬ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む］は各酵素に添付の緩衝液を用い、推奨条件に従い作成した。反応液をアプライドバイオシステムズ ２７２０サーマルサイクラーにて９５℃で１分、５５℃で３０秒、次いで７２℃で３０分間加熱した。加熱後の反応液１０μＬに２×ホルムアミドローディング溶液１０μＬを加え、９０℃で３分間加熱した後、７．５Ｍ尿素を含む２０％変性ＰＡＧＥにより解析した（図１４～図１７）。泳動後のゲルに含まれるオリゴヌクレオチド鎖をプライマー鎖の５’末に修飾したフルオレセイン基由来の蛍光に基づきＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋イメージングシステムにて検出した。
上記「（２）鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした複製反応」と同様に、複製反応の実験を行った。
酵素反応の反応液［１μＭ Ｐｒｉｍｅｒ（５’ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣ ３’），１μＭ Ｔｅｍｐｌａｔｅ（各図に配列及び構造記載），０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，０．０２ ｕｎｉｔｓ／μＬ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む］は各酵素に添付の緩衝液を用い、推奨条件に従い作成した。反応液をアプライドバイオシステムズ ２７２０サーマルサイクラーにて９５℃で１分、５５℃で３０秒、次いで７２℃で３０分間加熱した。加熱後の反応液１０μＬに２×ホルムアミドローディング溶液１０μＬを加え、９０℃で３分間加熱した後、７．５Ｍ尿素を含む２０％変性ＰＡＧＥにより解析した（図１４～図１７）。泳動後のゲルに含まれるオリゴヌクレオチド鎖をプライマー鎖の５’末に修飾したフルオレセイン基由来の蛍光に基づきＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋イメージングシステムにて検出した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
