特許 7551512 トランスポゼース活性測定用ベクターセット、キット、トランスポゼース活性測定方法及び細胞分離方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-06

(45)【発行日】2024-09-17

(54)【発明の名称】トランスポゼース活性測定用ベクターセット、キット、トランスポゼース活性測定方法及び細胞分離方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20240909BHJP

   C12Q 1/6897 20180101ALI20240909BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240909BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 Z ZNA

C12Q1/6897 Z

C12Q1/02

【請求項の数】 27

(21)【出願番号】P 2021003669

(22)【出願日】2021-01-13

(65)【公開番号】P2022108587

(43)【公開日】2022-07-26

【審査請求日】2023-02-09

(73)【特許権者】

【識別番号】000003078

【氏名又は名称】株式会社東芝

(74)【代理人】

【識別番号】110001737

【氏名又は名称】弁理士法人スズエ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】野崎 絵美

(72)【発明者】

【氏名】赤星 英一

(72)【発明者】

【氏名】石原 美津子

【審査官】鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】特開２０２０－１４６０１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１９／２１９９４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１０／１４３６９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００６／０１２１５０９（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００－１／７０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

トランスポゼース標的配列、前記トランスポゼース標的配列の下流に連結された第１プロモーター配列、及び前記第１プロモーター配列の下流に連結された第１レポーター遺伝子を含む第１ベクターと、
５’側トランスポゼース認識配列と、３’側トランスポゼース認識配列と、その間に配置された、第１エンハンサー配列とを含む第２ベクターと
を含む、ベクターセット。

【請求項2】

前記トランスポゼース標的配列は、配列番号１の塩基配列を含む請求項１に記載のベクターセット。

【請求項3】

前記第１エンハンサー配列は、配列番号１１の塩基配列を含む請求項１又は２に記載のベクターセット。

【請求項4】

前記第１プロモーター配列は、配列番号３の塩基配列を含む請求項１～３の何れか１項に記載のベクターセット。

【請求項5】

前記第１レポーター遺伝子は、配列番号５の塩基配列を含む、請求項１～４の何れか１項に記載のベクターセット。

【請求項6】

５’側トランスポゼース認識配列及び３’側トランスポゼース認識配列は、配列番号８及び配列番号９の塩基配列をそれぞれ含む、請求項１～５の何れか１項に記載のベクターセット。

【請求項7】

前記第２ベクターは、第２プロモーター配列と、前記第２プロモーター配列の下流に連結された、第２レポーター遺伝子５’側断片及び第２レポーター遺伝子３’側断片とを更に含み、
前記第２レポーター遺伝子５’側断片及び前記第２レポーター遺伝子３’側断片は、第２レポーター遺伝子が二分割された５’側の配列と３’側の配列とをそれぞれ含み、
前記５’側トランスポゼース認識配列と、前記３’側トランスポゼース認識配列と、その間に配置された、前記第１エンハンサー配列とは、前記第２レポーター遺伝子５’側断片及び前記第２レポーター遺伝子３’側断片の間に配置されている、
請求項１～６の何れか１項に記載のベクターセット。

【請求項8】

前記第２レポーター遺伝子は、二分割されていることによって不活性化された状態である、請求項７に記載のベクターセット。

【請求項9】

前記第１レポーター遺伝子及び前記第２レポーター遺伝子は互いに異なる、請求項７又は８に記載のベクターセット。

【請求項10】

前記第２ベクターは、前記第２プロモーター配列の上流に第２エンハンサー配列が連結されている請求項７～９の何れか１項に記載のベクターセット。

【請求項11】

前記第２プロモーター配列は、配列番号２の塩基配列を含む、請求項７～１０の何れか１項に記載のベクターセット。

【請求項12】

前記第２レポーター遺伝子５’側断片は配列番号１２の塩基配列を含み、前記第２レポーター遺伝子３’側断片は配列番号１３の塩基配列を含む、請求項７～１１の何れか１項に記載のベクターセット。

【請求項13】

第１エンハンサー配列、前記第１エンハンサー配列の下流に連結された第１プロモーター配列、及び前記第１プロモーター配列の下流に連結された第１レポーター遺伝子を含む遺伝子発現ユニットのうち、
前記第１プロモーター配列、前記第１レポーター遺伝子の全配列、又は、前記第１レポーター遺伝子を二分割した５’側の配列の何れか一つの配列がトランスポゼース標的配列に置換されている配列を含む第１ベクターと、
５’側トランスポゼース認識配列と、３’側トランスポゼース認識配列と、その間に配置された、前記第１ベクターにおいて前記トランスポゼース標的配列で置換された前記第１プロモーター配列、前記第１レポーター遺伝子の全配列、又は、前記第１レポーター遺伝子を二分割した５’側の配列を含む第２ベクターと
を含む、ベクターセット。

【請求項14】

前記第２ベクターは、第２プロモーター配列と、前記第２プロモーター配列の下流に連結された、第２レポーター遺伝子５’側断片及び第２レポーター遺伝子３’側断片とを更に含み、
前記第２レポーター遺伝子５’側断片及び前記第２レポーター遺伝子３’側断片は、第２レポーター遺伝子を二分割した５’側の配列と３’側の配列とをそれぞれ含み、
前記５’側トランスポゼース認識配列と、３’側トランスポゼース認識配列と、その間に配置され、前記第１ベクターにおいて前記トランスポゼース標的配列で置換された前記第１プロモーター配列、前記第１レポーター遺伝子の全配列、又は、前記第１レポーター遺伝子を二分割した５’側の配列は、前記第２レポーター遺伝子５’側断片及び前記第２レポーター遺伝子３’側断片の間に配置されている、請求項１３に記載のベクターセット。

【請求項15】

前記第２ベクターは、前記第２プロモーター配列の上流に第２エンハンサー配列が連結されている請求項１４に記載のベクターセット。

【請求項16】

請求項１～１５の何れか１項に記載のベクターセットと、
前記第１レポーター遺伝子から発現する第１レポータータンパク質を検出するための試薬と
を含むトランスポゼースの活性を測定するためのキット。

【請求項17】

前記ベクターセットは請求項７～１２の何れか１項のベクターセットであり、
前記第２レポーター遺伝子から発現する第２レポータータンパク質を検出するための試薬を更に含む請求項１６に記載のキット。

【請求項18】

前記ベクターセットは、脂質粒子に内包されている、請求項１６又は１７に記載のキット。

【請求項19】

ベクターセットを用いた細胞内のトランスポゼースの活性を生体外で測定する方法であって、
前記ベクターセットは、請求項１～１５の何れか１項に記載のベクターセットであり、当該方法は、
前記細胞に前記第１ベクター及び前記第２ベクターを導入することと、
前記第１レポーター遺伝子から発現する第１レポータータンパク質を検出することと、
前記第１レポータータンパク質の検出の結果から前記トランスポゼースの活性を評価すること
を含むトランスポゼース活性測定方法。

【請求項20】

前記活性の評価において前記第１レポータータンパク質が発現している場合、トランスポゼースの組込み活性があると評価する、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記導入は前記第１ベクター及び前記第２ベクターを内包した脂質粒子を前記細胞に接触させることにより行われる、請求項１９又は２０に記載の方法。

【請求項22】

前記トランスポゼースは、それをコードする核酸の形態で前記検出の前に前記細胞に導入される、請求項１９～２１の何れか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記ベクターセットが請求項７～１２の何れか１項に記載のベクターセットであり、前記トランスポゼースの活性の評価は、前記第２レポーター遺伝子から発現する第２レポータータンパク質の検出の結果を更に用いて行われる、
請求項１９～２２に記載の方法。

【請求項24】

前記活性の評価において前記第２レポータータンパク質の発現がある場合、トランスポゼースの切り出し活性があると評価する、請求項２３の何れか１項に記載の方法。

【請求項25】

ベクターセットを用いて細胞内のトランスポゼースの活性に基づいて細胞を分離する方法であって、
前記ベクターセットは、請求項１～１５の何れか１項に記載のベクターセットであり、当該方法は、
生体外で前記細胞に前記第１ベクター及び前記第２ベクターを導入することと、
前記第１レポーター遺伝子から発現する第１レポータータンパク質を検出することと、
前記第１レポータータンパク質の検出の結果に基づいて細胞を分離することと
を含む細胞分離方法。

【請求項26】

前記ベクターセットが請求項７～１２の何れか１項に記載のベクターセットであり、前記分離は、前記第２レポーター遺伝子から発現する第２レポータータンパク質の検出の結果に更に基づいて行われる、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記分離において、前記第１レポータータンパク質と前記第２レポータータンパク質とが両方発現する細胞を分離する、請求項２６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の実施形態は、トランスポゼース活性測定用ベクターセット、キット、トランスポゼース活性測定方法及び細胞分離方法に関する。

【背景技術】

【0002】

核酸を細胞のゲノムに組込む技術において、トランスポゼースが用いられている。トランスポゼースは、トランスポゼース認識配列が両端に配置されたＤＮＡ配列を切り出す活性、及び切り出したＤＮＡ配列をゲノム上のトランスポゼース標的配列に挿入する活性を有する酵素である。

【0003】

このような酵素を利用又は製造する際、その酵素が適切に働くか否か、即ち、酵素の活性を要所で確認することが重要である。そのためより簡便にトランスポゼースの活性を確認する方法が求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特開２０２０－１４６０１４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明が解決しようとする課題は、生きた細胞でより簡単かつ正確にトランスポゼースの活性を測定することができるトランスポゼース活性測定用ベクターセット、キット、トランスポゼース活性測定方法及び細胞分離方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

実施形態に係るベクターセットは第１ベクター及び第２ベクターを含む。第１ベクターは、トランスポゼース標的配列、第１プロモーター配列及び第１レポーター遺伝子を含む。第２ベクターは、５’側トランスポゼース認識配列と、３’側トランスポゼース認識配列と、その間に配置された、第１エンハンサー配列とを含む。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】図１は、第１実施形態の第１ベクター及び第２ベクターの一例を示す図である。

【図2】図２は、第１実施形態のトランスポゼース活性測定方法の一例を示すフローチャートである。

【図3】図３は、第１実施形態の導入工程後の各ベクターの挙動の一例を示す図である。

【図4】図４は、第１実施形態の細胞分離方法の一例を示すフローチャートである。

【図5】図５は、第１実施形態の脂質粒子の一例を示す断面図である。

【図6】図６は、第２実施形態の第２ベクターの一例を示す図である。

【図7】図７は、第２実施形態のトランスポゼース活性測定方法の一例を示すフローチャートである。

【図8】図８は、第２実施形態の導入工程後の各ベクターの挙動の一例を示す図である。

【図9】図９は、第２実施形態の細胞分離方法の一例を示すフローチャートである。

【図10】図１０は、第３実施形態の第１ベクター及び第２ベクターの一例を示す図である。

【図11】図１１は、例１で作製したｐＣＭＶ－ＬｕＥｕＣの構成を示す図である。

【図12】図１２は、例２で作製したｐＴＴＡＡ×５－ＥＦ１α－Ｌｕｃの構成を示す図である。

【図13】図１３は、例５の実験結果を示すグラフである。

【図14】図１４は、例５の実験結果を示すグラフである。

【図15】図１５は、例６の実験結果を示すグラフである。

【図16】図１６は、例６の実験結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0008】

以下、実施形態について、添付の図面を参照して説明する。なお、各実施形態において、実質的に同一の構成部位には同一の符号を付し、その説明を一部省略する場合がある。図面は模式的なものであり、各部の厚さと平面寸法との関係、各部の厚さの比率等は現実のものとは異なる場合がある。

【0009】

実施形態によれば、トランスポゼースの活性を測定するためのベクターが提供される。活性測定の対象となるトランスポゼースは、例えば、ＤＮＡ型トランスポゼースである。ＤＮＡ型トランスポゼースは、例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、Ｈｓｍａ、Ｍｉｎｏｓ、Ｔｏｌ１、Ｔｏｌ２、Ｐａｓｓｐｏｒｔ、ｈＡＴ、Ａｃ／Ｄｓ、ＰＩＦ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ３－ＤＲ、Ｈｉｍａｒ１、Ｈｅｒｍｅｓ、Ｔｃ３又はＭｏｓ１等であるが、これらに限定されるものではない。トランスポゼースは、上記のトランスポゼースを改変したものであってもよい。

【0010】

本明細書においてトランスポゼースの活性とは、核酸配列からトランスポゼース認識配列を両端に持つ配列を切り出すための「切り出し活性」、及び切り出した配列をゲノム上のトランスポゼース標的配列に組込むための「組込み活性」を意味する。

【0011】

（第１実施形態）
・トランスポゼース組込み活性測定用ベクター
以下、実施形態に係るトランスポゼース組込み活性測定用ベクター（以下、「第１ベクター」とも称する）について説明する。図１の（ａ）に示すように、第１実施形態に係る第１ベクター１は、トランスポゼース標的配列２（図中、「ＴＰ標的配列」）と、トランスポゼース標的配列２の下流に連結された第１プロモーター配列Ｐ１と、第１プロモーター配列Ｐ１の下流に連結された第１レポーター遺伝子Ｒ１と、第１レポーター遺伝子Ｒ１の下流に連結された第１転写終結配列Ｔ１とを含む。

【0012】

トランスポゼース標的配列２は、トランスポゼースによるＤＮＡ配列の組込みの標的となる配列である。言い換えればトランスポゼースはトランスポゼース標的配列２に切り出したＤＮＡ配列を組込む。トランスポゼース標的配列２は、例えばＴＴＡＡ（Ｔ：チミン、Ａ：アデニン）を複数含む配列であり、例えばこれを５回含む配列であることが好ましい。又はＴＡを複数含む配列も使用することができる。

【0013】

例えば、トランスポゼース標的配列２は以下の表１に示す塩基配列であることが好ましいい。

【0014】

【表1】

【0015】

詳しくは後述するが、第１実施形態においては第１ベクター１の使用時、トランスポゼース標的配列２には第１エンハンサー配列Ｅ１が組込まれ得る。

【0016】

第１プロモーター配列Ｐ１は、トランスポゼース標的配列２に第１エンハンサー配列Ｅ１が組込まれた場合に第１プロモーター配列Ｐ１の下流の遺伝子活性化が促進されるよう、トランスポゼース標的配列２の下流に作動可能に連結されている。

【0017】

本明細書において連結されているとは、２つの配列の間に他の配列を含むことなく連結されている場合、及び２つの配列の間に任意の配列が含まれる場合を含む。任意の配列は例えばスペーサー配列である。スペーサー配列は、トランスポゼース標的配列２、第１プロモーター配列Ｐ１、第１レポーター遺伝子Ｒ１、第１転写終結配列Ｔ１及びそれらの相補配列の配列とは異なり、かつこれらの配列の活性に悪影響を与えない核酸配列である。

【0018】

第１プロモーター配列Ｐ１は、その活性により、下流に連結された遺伝子の転写を開始できる公知のプロモーターの塩基配列であればよい。第１プロモーター配列Ｐ１は、エンハンサーの存在によって遺伝子を発現できるプロモーターであってもよい。又は、第１プロモーター配列Ｐ１は単体では遺伝子発現レベルが低いが、エンハンサーの存在によって遺伝子発現レベルが高くなるプロモーターであってもよい。

【0019】

第１プロモーター配列Ｐ１は、例えばサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、ユビキチン（ＵｂＣ）プロモーター、ヒトポリペプチド鎖伸長因子（ＥＦ１α）プロモーター又はサイトメガロウィルスエンハンサーとチキンβ－アクチンプロモーターのハイブリッド（ＣＡＧ）プロモーター、マウス幹細胞ウィルス（ＭＳＣＶ）プロモーター又はラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーター等であることが好ましい。しかしながら第１プロモーター配列Ｐ１は、プロモーターの機能を有する限りにおいて、上で列挙したものに限定されるものではなくともよく、また上記プロモーターの塩基配列のうち任意の塩基を置換、或いは欠失させたものであってもよい。

【0020】

第１プロモーター配列Ｐ１は、表２に示す塩基配列を有するＣＭＶプロモーター（配列番号２）又は表３に示すヒトポリペプチド鎖伸長因子遺伝子（ＥＦ１α）のプロモーター配列（配列番号３）であることが好ましい。

【0021】

【表2】

【0022】

【表3】

【0023】

第１レポーター遺伝子Ｒ１は、第１プロモーター配列Ｐ１の活性によりその遺伝子発現が調節されるように第１プロモーター配列Ｐ１の下流に作動可能に連結されている。

【0024】

第１レポーター遺伝子Ｒ１は、公知のレポータータンパク質をコードする遺伝子の塩基配列であればよい。第１レポーター遺伝子Ｒ１は、例えば、青色蛍光タンパク質遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子又は赤色蛍光タンパク質遺伝子等の蛍光タンパク質の遺伝子；ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子又はＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ遺伝子等の発光酵素タンパク質の遺伝子；キサンチンオキシダーゼ遺伝子又は一酸化窒素合成酵素遺伝子等の活性酸素生成酵素の遺伝子；或いはβ－ガラクトシダーゼ遺伝子又はクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子等の発色酵素タンパク質の遺伝子等である。しかしながら第１レポーター遺伝子Ｒ１は、レポーターとしての機能を失わない限りにおいては、上で列挙したレポーター遺伝子に限定されるものではなく、また上記のレポーター遺伝子の塩基配列の任意の塩基を置換、或いは欠失させたものであってもよい。

【0025】

例えば、第１レポーター遺伝子Ｒ１として表４に示すホタルルシフェラーゼ遺伝子、又は表５に示すトゲオキヒオドシエビ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ）由来のルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。

【0026】

【表4】

【0027】

【表5】

【0028】

第１転写終結配列Ｔ１は、第１レポーター遺伝子Ｒ１の転写を終結するように第１レポーター遺伝子Ｒ１の下流に作動可能に連結されている。第１転写終結配列Ｔ１は、例えば、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のポリ（Ａ）付加シグナル配列、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナル配列又は人工的に合成されたポリ（Ａ）付加シグナル配列等である。ただし、第１転写終結配列Ｔ１はこれらに限定されるものではなく、転写終結配列としての機能を有する限りにおいては、他の配列、又は上記した転写終結配列の塩基配列を改変したもの等を用いてもよい。

【0029】

表６及び表７に示す塩基配列のウシ成長ホルモン転写終結配列又はＳＶ４０転写終結配列の塩基配列を用いることが好ましい。

【0030】

【表6】

【0031】

【表7】

【0032】

第１ベクター１は、例えば環状の二本鎖ＤＮＡ分子である。第１ベクター１は、例えばプラスミドベクターである。

【0033】

第１ベクター１は、上記の配列の他にも任意の塩基配列を含んでもよい。このような塩基配列は、例えば特定の機能を有する塩基配列であってもよいし、機能を持たない配列であってもよい。機能を有する塩基配列は、例えば、更なるレポーター遺伝子発現ユニット、薬剤耐性遺伝子、複製開始タンパク質発現ユニット及び／又は複製開始配列等である。

【0034】

薬剤耐性遺伝子は、例えば当該ベクターが導入された細胞のスクリーニングに使用することができる。薬剤耐性遺伝子として、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子等を用いることができる。

【0035】

複製開始配列は、複製開始タンパク質が結合し、第１ベクター１の複製を開始させるための配列である。第１ベクター１が複製されると第１レポーター遺伝子Ｒ１から発現するレポータータンパク質量が増大し、より感度よくトランスポゼースの活性を測定することができる。複製開始配列として、例えば、シミアンウィルス４０、エプスタイン・バー・ウィルス、マウス・ポリオーマ・ウィルス、ＣｏｌＥ１等に由来する複製開始配列を用いることができる。

【0036】

複製開始タンパク質は、第１ベクター１が導入される細胞内にもともと存在するものであってもよいし、或いは当該細胞内に第１ベクター１とは別の複製開始タンパク質発現ユニットを含むベクターによって導入されたものであってもよい。複製開始タンパク質は、第１ベクター１内に複製開始タンパク質発現ユニットを設け、そこから発現させてもよい。

【0037】

・第２ベクター
第１ベクター１を用いて行われるトランスポゼース活性測定方法は、上記の何れかの第１ベクター１と、第２ベクターとを含むベクターセットを用いて行われる。第２ベクターについて以下、説明する。

【0038】

図１の（ｂ）に一例を示すように、第２ベクター３はトランスポゼースにより切り出され得る切り出し用配列４を少なくとも含む。切り出し用配列４は、５’側トランスポゼース認識配列（図中、「５’－ＩＲ」）４ａと、３’側トランスポゼース認識配列（図中、「３’－ＩＲ」）４ｂと、これら２つの認識配列の間に配置された第１エンハンサー配列Ｅ１とを含む。

【0039】

これら２つの認識配列は、トランスポゼースが認識して、そこに結合し、切り出し用配列４を切り出すための配列である。５’側トランスポゼース認識配列４ａ及び３’側トランスポゼース認識配列４ｂは、例えば互いに逆向きの同じ配列を含む、逆向き反復配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｒｅｐｅａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ＩＲ）である。認識配列の塩基配列は、活性測定対象のトランスポゼースの種類に従って選択される。トランスポゼースがＰｉｇｇｙＢａｃである場合の５’側トランスポゼース認識配列４ａ及び３’側トランスポゼース認識配列４ｂの一例を以下の表８、表９にそれぞれ示す。

【0040】

【表8】

【0041】

【表9】

【0042】

トランスポゼースがＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙである場合の５’側トランスポゼース認識配列４ａ及び３’側トランスポゼース認識配列４ｂのうち一方の塩基配列の一例を以下の表１０に示す。他方は、例えば、下記配列の逆向き反復配列を含み得る。

【0043】

【表10】

【0044】

第１エンハンサー配列Ｅ１は、第１プロモーター配列Ｐ１の活性化を促進し、その下流に連結された遺伝子の発現を促進することができる公知のエンハンサーであればよい。第１エンハンサー配列Ｅ１は、例えば第１プロモーター配列Ｐ１の種類に従って選択され得る。第１エンハンサー配列Ｅ１として、例えばＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、マウスレトロウイルスロングターミナルリピート（ＭＬＶ ＬＴＲ）エンハンサー等を用いることが好ましい。しかしながら第１エンハンサー配列Ｅ１は、エンハンサーとしての機能を失わない限りにおいては、上で列挙したエンハンサー配列に限定されるものではなく、また上記のエンハンサー配列の任意の塩基を置換、或いは欠失させたものであってもよい。

【0045】

表１１は第１プロモーター配列Ｐ１がＣＭＶプロモーターである場合のエンハンサー配列の塩基配列の一例を示す。

【0046】

【表11】

【0047】

第２ベクター３は、上記の配列の他にも任意の塩基配列を含んでもよい。このような塩基配列は、例えば特定の機能を有する塩基配列であってもよいし、機能を持たない配列であってもよい。機能を有する塩基配列は、例えば、レポーター遺伝子発現ユニット、薬剤耐性遺伝子、複製開始タンパク質発現ユニット及び／又は複製開始配列等である。

【0048】

第２ベクター３は、例えば環状の二本鎖ＤＮＡ分子である。第２ベクター３は、例えばプラスミドベクターである。

【0049】

・トランスポゼース活性測定方法
以下、第１ベクター１及び第２ベクター３を用いて行われるトランスポゼース活性測定方法について説明する。トランスポゼース活性測定方法は、例えば図２に示す次の工程を含む。

【0050】

（Ｓ１）細胞に第１ベクター及び第２ベクターを導入する導入工程、
（Ｓ２）第１レポーター遺伝子から発現する第１レポータータンパク質を検出する第１検出工程、及び
（Ｓ３）第１レポータータンパク質の検出の結果からトランスポゼースの活性を評価する第１評価工程。

【0051】

以下、実施形態の方法の例について詳細に説明する。

【0052】

まず、細胞を用意する。細胞は例えば、ヒト、動物又は植物由来のもの、或いは細菌又は菌類等の微生物由来の細胞であり得る。細胞は、好ましくは動物細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。細胞は、生体外に取り出された細胞であってもよく、例えば、血液等の体液、組織又はバイオプシー等から分離された細胞であってもよい。細胞は、例えば、単離細胞、培養細胞又は株化された細胞であってもよい。或いは、細胞は、生体内の細胞であってもよい。

【0053】

細胞内には活性を測定する対象となるトランスポゼースが存在し得る。トランスポゼースは、例えばそれをコードする核酸、例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡの形態で細胞内に導入され転写翻訳され発現したものであってもよい。又はタンパク質若しくはペプチドの形態で細胞内に導入されたものであってもよい。或いは、予め細胞のゲノム上に組込まれ、発現しているものであってもよい。

【0054】

次に、細胞に第１ベクター１及び第２ベクター３を細胞に導入する（導入工程Ｓ１）。導入工程Ｓ１は、例えば細胞が生体外に取り出された状態の細胞である場合、リポソーム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、カチオン性ポリマー法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法又はソノポレーション法等の公知の方法で行うことができる。

【0055】

特にリポソーム法を用いることが好ましい。リポソーム法は、第１ベクター１及び第２ベクター３をリポソーム（脂質粒子）に内包し、それを含む組成物等を細胞と接触させることで、例えば脂質粒子はエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれ、内包物を細胞内に放出する。脂質粒子の詳細については、後のキットの実施形態において説明する。

【0056】

細胞が生体内の細胞である場合、導入は、第１ベクター１及び第２ベクター３を含む組成物を生体へ注射又は点滴すること等によって行うことができる。組成物は、例えば第１ベクター１及び第２ベクター３を内包する上記脂質粒子を含んでもよい。

【0057】

トランスポゼースを細胞に導入する場合、第１ベクター１及び第２ベクター３の導入と同時に行ってもよいし、どちらかを先に行ってもよい。

【0058】

導入工程Ｓ１の後、例えば図３に示すように、活性を有するトランスポゼースＴＰが第２ベクター３から切り出し用配列４を切り出す（図３の（ａ）部）。次いで、第１ベクター１のトランスポゼース標的配列２に切り出し用配列４を導入する（図３の（ｂ）部）。つまり切り出し用配列４の移転が行われる。その結果、第１エンハンサー配列Ｅ１が第１ベクター１に組込まれ、第１ベクター１に、第１エンハンサー配列Ｅ１と、第１プロモーター配列Ｐ１と、第１レポーター遺伝子Ｒ１とを含む第１遺伝子発現ユニットＵ１が形成される（図３の（ｃ）部）。第１エンハンサー配列Ｅ１は第１レポーター遺伝子Ｒ１の発現を促進する（図３の（ｄ）部）。その結果、第１レポータータンパク質５の発現量が増加する（図３の（ｅ）部）。第１レポータータンパク質５は第１信号６を生じる。

【0059】

第１信号６は、第１レポータータンパク質５の種類に応じて得られる検出可能な信号であり、例えば蛍光、化学発光、生物発光、生物化学発光及び呈色等、或いはタンパク質等の分子の呈示である。

【0060】

第１信号６は、第１レポータータンパク質５自身から発せられるものであるか、又は第１レポータータンパク質５と特定の物質（以下、「第１物質」と記載する）との反応、例えば、酵素反応又は結合等により生じるものである。第１物質は、例えば、第１レポータータンパク質５が酵素である場合、その基質である。例えば、第１レポータータンパク質５がルシフェラーゼである場合、第１物質は、ルシフェリンである。

【0061】

或いは、第１信号６は、第１レポータータンパク質５と特定の物質との反応により生じる物質の存在を検出するための更なる検出試薬（以下、「第２物質」と記載する）に由来する信号であってもよい。

【0062】

次に第１レポータータンパク質５を検出する（第１検出工程Ｓ２）。第１レポータータンパク質５の検出は、例えば第１信号６を検出することにより行われ得る。検出は第１レポータータンパク質５又は第１信号６の種類に応じて選択された何れかの公知の方法を用いて行えばよい。

【0063】

検出は、例えば、生きたままの細胞において行うことができる。しかしながら、細胞から第１レポータータンパク質５を抽出して得られた抽出液において行ってもよい。

【0064】

例えば、上記第１物質及び／又は第２物質を用いる場合、これらの物質は第１検出工程Ｓ２のはじめに細胞に添加され得る。これらの物質は、細胞の培養培地に添加してもよいし、細胞に導入してもよい。或いは、細胞から得られたレポータータンパク質抽出液に添加してもよい。

【0065】

第１レポータータンパク質５が蛍光タンパク質である場合、細胞に励起光を照射することにより蛍光タンパク質から発生する蛍光として第１信号６が得られる。蛍光（第１信号６）は、目視、顕微鏡、フローサイトメーター、イメージ解析ソフト、又はフルオロメーター等により検出することができる。

【0066】

第１レポータータンパク質５がルシフェラーゼである場合、ルシフェリンを添加することにより化学発光として第１信号６が得られる。化学発光（第１信号６）は、目視、顕微鏡、フローサイトメーター、イメージ解析ソフト、又はルミノメーター等により検出することができる。

【0067】

第１レポータータンパク質５がβ－ガラクトシダーゼである場合、５－ブルモー４－クロロー３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（Ｘ－Ｇａｌ）又はｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）等の基質を添加することにより、細胞溶液又は抽出液の吸光度として第１信号６が得られる。吸光度（第１信号６）は、吸光度計、分光光度計又は濁度計等で検出することができる。

【0068】

第１レポータータンパク質５が一酸化窒素合成酵素又はキサンチンオキシダーゼである場合、基質を添加し、発生する活性酸素が第１信号６として得られる。活性酸素（第１信号６）は電子スピン共鳴装置（ＥＳＲ装置）等で検出することができる。

【0069】

第１レポータータンパク質５が重金属結合タンパク質である場合、測定可能な重金属を添加し、レポータータンパク質に結合した重金属が第１信号６として得られる。重金属（第１信号６）は、磁気共鳴イメージング装置、核医学診断装置、ＭＲＩ撮像装置、又はＸ線コンピュータ断層撮影装置により検出することができる。

【0070】

例えば第１信号６の強度は第１レポータータンパク質５の発現量と相関するので、第１信号６の強度の強弱から、第１レポータータンパク質５が発現の強弱を決定することができる。或いは第１レポータータンパク質５を直接定量してもよい。

【0071】

次に、第１レポータータンパク質５の検出の結果からトランスポゼースの活性を評価する（第１評価工程Ｓ３）。

【0072】

例えば、第１レポータータンパク質５が高発現している場合、トランスポゼースＴＰの少なくとも組込み活性が良好であると評価することができる。

【0073】

ここで、「第１レポータータンパク質５が高発現している」は、第１レポータータンパク質５（第１信号６）が検出された場合若しくは閾値以上得られた場合、又は第１レポータータンパク質５の発現量（第１信号６の強度）が増加した場合若しくは増加量が閾値以上であった場合等を含む。「組込み活性が良好である」は、組込み活性を有すること、及び組込み活性が高いことを含む。

【0074】

第１レポータータンパク質５の発現量（第１信号６の強度）の「増加」は、例えば、第１エンハンサー配列Ｅ１が第１ベクター１に組込まれる前の第１レポータータンパク質５の発現量（第１信号６の強度）の値と比較して増加したことをいう。第１エンハンサー配列Ｅ１の組込み前の第１レポータータンパク質５の発現量（第１信号６の強度）の値は、例えばプロモーターの種類によっては０であるか、又は第１エンハンサー配列Ｅ１の組込み後よりも小さな値であり得る。第１エンハンサー配列Ｅ１の組込み前の値は、例えば第１ベクター１を先に細胞に導入し、第２ベクター３及び／又はトランスポゼースＴＰを導入する前に検出を行うことで得ることができる。又は第１ベクター１及び第２ベクター３（必要に応じてトランスポゼースＴＰ）を導入した直後、即ち、トランスポゼースＴＰによる切り出し及び組込みが行われる前に検出して得られた値でもよい。或いは、第１ベクター１が導入され、第２ベクター３及び／又はトランスポゼースＴＰが含まれない細胞において予め第１信号６の強度を測定しておき、その値を比較に用いてもよい。

【0075】

閾値は、例えば、組込み活性を有することが既知であるトランスポゼースＴＰを用いて実施形態の測定方法を実施した際に得られた第１レポータータンパク質５の発現量（第１信号６の強度）の値又はその増加量とすることができる。

【0076】

ある実施形態においては、第１レポータータンパク質５の発現量（第１信号６の強度）からトランスポゼースＴＰの組込み活性の度合いを評価してもよい。組込み活性の度合いとは、検査対象のトランスポゼースＴＰ全体のうち組込み活性を有するものの割合、或いは細胞内で発現した又は細胞内に存在する組込み活性を有するトランスポゼースＴＰの量である。例えば、第１レポータータンパク質５の発現量（第１信号６の強度）が高い程、組込み活性を有するトランスポゼースＴＰの割合又は量が多いと評価することも可能である。

【0077】

反対に、例えば第１レポータータンパク質５が低発現である場合、トランスポゼースＴＰの切り出し活性又は組込み活性の少なくとも一方が不良であると評価することができる。

【0078】

ここで、「第１レポータータンパク質５が低発現である」とは、第１レポータータンパク質５（第１信号６）が検出されない場合若しくは閾値未満であった場合、又は第１レポータータンパク質５の発現量（第１信号６の強度）が増加しなかった場合、増加量が閾値未満であった場合若しくは減少した場合を含む。

【0079】

「活性が不良である」とは、活性が無いこと及び活性が低いことを含む。

【0080】

以上に説明したように、第１評価工程Ｓ３により、トランスポゼースＴＰの活性を評価することができる。少なくとも組込み活性のあるトランスポゼースＴＰを見出すことが可能である。

【0081】

トランスポゼース活性測定方法は、一つの装置を用いて行われてもよい。装置は、例えば、細胞を収容する試料収容部と、試料収容部に収容された細胞に第１ベクター１及び第２ベクター３を含む組成物、必要に応じてトランスポゼースＴＰ、第１検出工程Ｓ２に用いる第１物質及び／又は第２物質等を添加する送液部と、細胞から第１信号６を検出する検出部と、検出部から送られた第１信号６の有無又は強度の情報からトランスポゼースＴＰの組込み活性の有無又は程度を算出するプログラムを備える情報処理部と、情報処理部で算出された結果を出力する出力部とを備える。

【0082】

本方法によれば、核酸及び／又はレポータータンパク質の抽出等を行う必要がないので、簡単な操作で迅速にトランスポゼースＴＰの活性を測定することができる。また、核酸及び／又はレポータータンパク質の抽出等、細胞を壊したり細胞内のタンパク質が変性又は分解されたりするおそれのある工程を行うことなく、生きた細胞でトランスポゼースＴＰの活性を測定することができる。そのため、活性が測定されたトランスポゼースＴＰ及び細胞をインタクトな状態で更なる工程に利用することも可能である。

【0083】

本方法は、例えば、活性の有無又は度合いが不明のトランスポゼースを対象として行われる。例えば、本方法は、例えば自ら合成したトランスポゼース、新規に発見若しくは開発されたトランスポゼース、既存のトランスポゼース、若しくはＤＮＡやＲＮＡの形態のトランスポゼース等を細胞に導入した場合及び／又は細胞で発現させた場合等にそのトランスポゼースの活性を測定するときに用いることができる。例えば、商業的に入手したトランスポゼースの活性の測定、特定のプロセスにおけるトランスポゼースの活性の測定、新規のプロセスにおけるトランスポゼースの活性の測定、又はトランスポゼースを含む製品の品質管理等の用途にも用いることができる。或いは、実験等の一連の工程の一部としてトランスポゼースを用いた導入工程を行う場合に、更に次の工程に進むためにこれらの工程が適切に行われたか否かを確認したい場合にも用いることができる。しかしながら、用途はこれらに限定されるものではない。
・細胞分離方法
更なる実施形態によれば、第１ベクター１を用いる細胞分離方法が提供される。細胞分離方法は、トランスポゼースの活性に基づいて細胞を分離する方法である。

【0084】

細胞分離方法は、図４に示すように、例えば次の工程を含む。

【0085】

（Ｓ１１）第１ベクター及び第２ベクターを細胞に導入する導入工程、
（Ｓ１２）第１レポーター遺伝子から発現する第１レポータータンパク質を検出する第１検出工程、及び
（Ｓ１３）第１レポータータンパク質の検出の結果に基づいて細胞を分離する分離工程。

【0086】

導入工程Ｓ１１及び第１検出工程Ｓ１２は前記トランスポゼース活性測定方法の導入工程Ｓ１及び第１検出工程Ｓ２と同様に行うことができる。

【0087】

細胞分離方法に用いられる第１ベクター１の第１レポーター遺伝子Ｒ１は、細胞毒性が低く、かつ生細胞におけるレポータータンパク質の検出が可能な遺伝子であることが好ましい。

【0088】

分離工程Ｓ１３では、例えば第１検出工程Ｓ１２で第１レポータータンパク質５が高発現している細胞を少なくとも組込み活性が良好なトランスポゼースＴＰを含む細胞として、その他の細胞と分離する。或いは、検出結果から組込み活性の度合いを評価して、組込み活性が特に高い細胞を分離することもまた好ましい。

【0089】

分離は、公知の何れかの手段により行われればよい。例えば、セルソーター等のフローサイトメトリーの技術を用いることができる。或いは、細胞を顕微鏡で観察しながら所望の細胞を手作業で分離してもよい。その場合、細胞を吸引及び吐出できる微細なプローブ等を用いることができる。

【0090】

分離工程Ｓ１３の結果、少なくとも組込み活性が良好なトランスポゼースＴＰを含む細胞を正確且つ容易に分離することができる。また、細胞を生きたままの状態で分離することができるため、分離された細胞を更なる分析等の工程に用いることが可能である。

【0091】

・キット
更なる実施形態によれば、上記トランスポゼース活性測定方法及び細胞分離方法に用いることができるキットも提供される。当該キットは、第１ベクター１及び第２ベクター３を含むベクターセットを少なくとも含む。

【0092】

ベクターセットは、例えば、溶媒に含まれた組成物として提供される。溶媒は、例えば、エンドトキシンフリー水、ＰＢＳ、ＴＥバッファー又はＨＥＰＥＳバッファー等を用いることができる。組成物は、更に賦形剤、安定剤、希釈剤及び／又は補助剤等を含んでもよい。

【0093】

ベクターセットは、脂質粒子に内包された状態でキットに含まれていてもよい。脂質粒子について図５を用いて説明する。図５に示すように、脂質粒子７は中空の球状の脂質膜である。例えば、図５の（ａ）に示すように第１ベクター１と第２ベクター３とは一緒に脂質粒子７に内包されている。又は図５の（ｂ）に示すように第１ベクター１と第２ベクター３とは別々に脂質粒子７に内包されている。

【0094】

脂質粒子７を構成する脂質膜の材料は、例えば、リン脂質又はスフィンゴ脂質、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン又はセレブロシド、或いはこれらの組み合わせ等を含む。特に、脂質粒子７の酸解離定数を調節する１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）及び／又は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むことが好ましい。

【0095】

更に、脂質粒子７の材料は生分解性の脂質（例えば下記式（１－０１）、式（１－０２）及び／又は式（２－０１）の化合物等）、脂質粒子７の凝集を防止する脂質（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）等）、内包物の脂質粒子７からの漏出を防止する成分（例えばコレステロール等）、脂質粒子７の粒径を制御するための成分、脂質粒子７を細胞と融合しやすくするための成分及び／又は内包物を細胞に導入しやすくする成分等を含んでもよい。

【0096】

【化1】

【0097】

脂質粒子７は、単分子膜又は二重膜、三重膜等であってもよい。また、脂質粒子７は、一層の膜からなっていてもよいし、多重層の膜からなっていてもよい。

【0098】

脂質粒子７には、第１ベクター１及び第２ベクター３の他に、必要に応じて更なる成分が内包されていてもよい。更なる成分は、例えば、ｐＨ調整剤及び／又は浸透圧調整剤等である。ｐＨ調整剤は、例えば、クエン酸などの有機酸及びその塩等である。浸透圧調整剤は、糖又はアミノ酸等である。

【0099】

脂質粒子７は、小分子を脂質粒子７に封入する際に用いられる公知の方法、例えば、バンガム法、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法又は凍結融解法等を用いて製造することができる。例えば、脂質粒子７の材料を所望の比率でアルコール等の有機溶媒に含ませて得られた脂質混合物と、ベクター等の内包するべき成分を含む水性緩衝液を用意し、脂質混合物に水性緩衝液を添加する。得られた混合物を撹拌して懸濁することによりベクター等を内包した脂質粒子７が形成される。

【0100】

また、キットは、第１レポータータンパク質５を検出するための試薬を更に含んでもよい。試薬は、例えば、第１検出工程Ｓ２において説明した第１物質及び／又は第２物質である。

【0101】

ベクターセット及び試薬は、個別に又は何れかの成分が組み合わされて容器に含まれて提供される。

【0102】

以上に説明した第１実施形態では、第１レポータータンパク質５（第１信号６）が高発現した場合には、それは切り出し用配列４が第２ベクター３から正常に切り出されたことも意味し得る。したがって、トランスポゼースＴＰが少なくとも組込み活性が良好と評価される場合には、トランスポゼースＴＰが切り出し活性も更に有すると予想することもまた可能である。下記第２実施形態では、組込み活性と同時に切り出し活性を更に正確に測定する方法について説明する。

【0103】

（第２実施形態）
・トランスポゼース切り出し活性測定用ベクターである第２ベクター
第２実施形態において、第２ベクターはトランスポゼースの切り出し活性を測定することができる構成を更に有する。第２実施形態に従う第２ベクター８は、図６の（ａ）に示す通り、第２プロモーター配列Ｐ２と、第２プロモーター配列Ｐ２の下流に連結された、第２レポーター遺伝子５’側断片Ｒ２ａ及び第２レポーター遺伝子３’側断片Ｒ２ｂと、第２レポーター遺伝子５’側断片Ｒ２ａ及び第２レポーター遺伝子３’側断片Ｒ２ｂの間に配置された切り出し用配列４と、第２レポーター遺伝子３’側断片Ｒ２ｂの下流に連結された第２転写終結配列Ｔ２とを含む。第２ベクター８は第１実施形態と同様に第１ベクター１と併用され得る。

【0104】

以下、各配列について説明する。

【0105】

第２プロモーター配列Ｐ２は、その活性により、下流に連結された遺伝子の転写を開始できるように設けられている。第２プロモーター配列Ｐ２として、第１プロモーター配列Ｐ１の説明で挙げられた何れかのプロモーター配列を用いることができる。第２プロモーター配列Ｐ２は、第１プロモーター配列Ｐ１と同じ配列であってもよいし、異なる配列であってもよい。

【0106】

第２レポーター遺伝子５’側断片Ｒ２ａ及び第２レポーター遺伝子３’側断片Ｒ２ｂは、一つのレポーター遺伝子（第２レポーター遺伝子Ｒ２、図示せず）をコードする塩基配列を二分割した５’側の配列及び３’側の配列をそれぞれ含む。

【0107】

第２レポーター遺伝子Ｒ２は、二分割されていることによってそのレポーター活性が不活性化された状態である。第２レポーター遺伝子５’側断片Ｒ２ａ及び第２レポーター遺伝子３’側断片Ｒ２ｂの塩基配列の長さ、即ち、分割位置は、第２レポーター遺伝子Ｒ２の活性が不活性化されるように選択される限り限定されるものではく、２つの配列の長さは、互いに同じであってもよいし、異なっていてもよい。

【0108】

第２レポーター遺伝子Ｒ２として、第１レポーター遺伝子Ｒ１の説明で挙げられた何れかのレポーター遺伝子を用いることができる。第２レポーター遺伝子Ｒ２は、第１レポーター遺伝子Ｒ１と異なるものを選択することが好ましい。例えば、第１レポーター遺伝子Ｒ１と第２レポーター遺伝子Ｒ２とは、基質の発光色が互に異なるルシフェラーゼ遺伝子、又は蛍光色が互いに異なる蛍光タンパク質遺伝子等で有り得る。

【0109】

第２レポーター遺伝子Ｒ２がホタルルシフェラーゼ遺伝子（表４）である場合の第２レポーター遺伝子５’側断片Ｒ２ａ及び第２レポーター遺伝子３’側断片Ｒ２ｂの塩基配列の一例を以下の表１２、１３にそれぞれ示す。

【0110】

【表12】

【0111】

【表13】

【0112】

切り出し用配列４は、第１実施形態で説明したものと同様であり、５’側トランスポゼース認識配列４ａと、３’側トランスポゼース認識配列４ｂと、これら２つの認識配列の間に配置された第１エンハンサー配列Ｅ１とを含む。

【0113】

切り出し用配列４が切り出されて第２レポーター遺伝子５’側断片Ｒ２ａ及び第２レポーター遺伝子３’側断片Ｒ２ｂが連結されて形成される第２レポーター遺伝子Ｒ２配列は、レポーターとしての機能を失わない限りにおいてレポーター遺伝子由来の配列以外の他の配列を含んでもよい。他の配列は、例えば３の倍数の数のヌクレオチドからなる配列であり、且つ０～２０個のアミノ酸をコードする配列であることが好ましい。例えば第２レポーター遺伝子５’側断片Ｒ２ａ及び第２レポーター遺伝子３’側断片Ｒ２ｂの間に、切り出しにより残留した痕跡配列が存在してもよい。痕跡配列はアミノ酸をコードしてもよいが、必ずしもその必要はない。

【0114】

第２転写終結配列Ｔ２は、第２レポーター遺伝子Ｒ２の転写を終結するように第２レポーター遺伝子３’側断片Ｒ２ｂの下流に機能可能に連結されている。第２転写終結配列Ｔ２として、上記第１転写終結配列Ｔ１の説明で挙げられた何れかの転写終結配列を用いることができる。第２転写終結配列Ｔ２は、第１転写終結配列Ｔ１と同じ配列であってもよいし、異なる配列であってもよい。

【0115】

第２ベクター８は、第１実施形態の第２ベクター３と同様に任意の他の塩基配列を含んでもよい。このような塩基配列は、例えば特定の機能を有するレポーター遺伝子発現ユニット、薬剤耐性遺伝子、複製開始タンパク質発現ユニット及び／又は複製開始配列等の塩基配列であってもよいし、機能を持たない配列であってもよい。

【0116】

更なる実施形態において、図６の（ｂ）に示すように、第２ベクター８ｂは第２エンハンサー配列Ｅ２を更に備えてもよい。第２エンハンサー配列Ｅ２は、第２プロモーター配列Ｐ２の活性化を促進し、その下流に連結された遺伝子の発現を促進することができるように、第２プロモーター配列Ｐ２の上流に作動可能に連結されている。第２エンハンサー配列Ｅ２として、第１エンハンサー配列Ｅ１の説明において列挙した何れかのエンハンサーを用いることができる。第２エンハンサー配列Ｅ２は、例えば第２プロモーター配列Ｐ２の種類に従って選択され得る。第２エンハンサー配列Ｅ２は、第１エンハンサー配列Ｅ１と同じ配列であってもよいし、異なる配列であってもよい。

【0117】

例えば、第２プロモーター配列Ｐ２がエンハンサーによって下流に連結された遺伝子の発現を可能にするものである場合、第２エンハンサー配列Ｅ２を用いることが好ましい。しかしながら第２プロモーター配列Ｐ２が、エンハンサーが無くともその下流に連結された遺伝子の発現を可能にする種類のものである場合、第２エンハンサー配列Ｅ２を設ける必要はない。

【0118】

・トランスポゼース活性測定方法
第２実施形態によれば、第１の実施形態に記載した第１ベクター１と第２ベクター８とを含むベクターセットを用いて細胞内のトランスポゼースの活性を測定するための方法が提供される。

【0119】

トランスポゼース活性測定方法は、例えば図７に示す次の工程を含む。

【0120】

（Ｓ２１）細胞に第１ベクター及び第２ベクターを導入する導入工程、
（Ｓ２２）第１レポーター遺伝子から発現する第１レポータータンパク質を検出する第１検出工程、
（Ｓ２３）第２レポーター遺伝子から発現する第２レポータータンパク質を検出する第２検出工程、及び
（Ｓ２４）第１レポータータンパク質の検出の結果及び第２レポータータンパク質の検出の結果からトランスポゼースの活性を評価する第２評価工程。

【0121】

導入工程Ｓ２１は、第２ベクター３の代わりに第２ベクター８を用いることを除いて第１実施形態の導入工程Ｓ１と同様に行うことができる。

【0122】

図８を用いて導入工程Ｓ２１の後の各ベクターの挙動を説明する。まず、活性を有するトランスポゼースＴＰにより第２ベクター８から切り出し用配列４が切り出される（図８の（ａ）部）。次いで、第１ベクター１のトランスポゼース標的配列２に切り出し用配列４が組込まれる（図８の（ｂ）部）。つまり切り出し用配列４の移転が行われる。

【0123】

その後、第２ベクター８においては第２レポーター遺伝子５’側断片Ｒ２ａ及び第２レポーター遺伝子３’側断片Ｒ２ｂが連結されて第２レポーター遺伝子Ｒ２が形成される（図８の（ｃ）部）。その結果、第２ベクター８に、第２プロモーター配列Ｐ２と、第２レポーター遺伝子Ｒ２と、必要に応じて第２エンハンサー配列Ｅ２とを含む第２遺伝子発現ユニットＵ２が形成される。それにより、第２レポーター遺伝子Ｒ２から第２レポータータンパク質９が発現する（図８の（ｄ）部）。第２レポータータンパク質９は第２信号１０を生ずる（図８の（ｅ）部）。

【0124】

一方、第１ベクター１においては第１実施形態と同様に第１エンハンサー配列Ｅ１が組込まれて第１遺伝子発現ユニットＵ１が形成され（図８の（ｆ）部）、第１レポーター遺伝子Ｒ１の発現が促進される（図８の（ｇ）部）。それによって、第１レポータータンパク質５の発現量が増加する。第１レポータータンパク質５は第１信号６を生じる（図８の（ｈ）部）。

【0125】

したがって、トランスポゼースＴＰが切り出し活性及び組込み活性の両方を有する場合、切り出し用配列４に含まれる第１エンハンサー配列Ｅ１が第２ベクター８から第１ベクター１に移転されることで、第２ベクター８からの第２信号１０と、第１ベクター１からの第１信号６が得られる。

【0126】

一方で、トランスポゼースＴＰの切り出し活性が不良の場合、切り出し用配列４が切り出されず、第２レポーター遺伝子Ｒ２が不活性化したままである。そのため、第２レポータータンパク質９は低発現となる。この場合、切り出し用配列４が切り出されないので、トランスポゼースＴＰの組込み活性が良好であるか否かに関わらず、第１レポータータンパク質５は低発現となり得る。

【0127】

また、切り出し活性が良好で、組込み活性が不良なトランスポゼースＴＰでは、第２レポータータンパク質９は高発現するが、第１レポータータンパク質５は低発現となり得る。

【0128】

次に、第１検出工程Ｓ２２を行う。第１検出工程Ｓ２２は、第１実施形態の第１検出工程Ｓ２と同様に行うことができる。

【0129】

次いで、第２レポータータンパク質９を検出する（第２検出工程Ｓ２３）。第２レポータータンパク質９の検出は、例えば第２信号１０を検出することにより行われ得る。検出は第２レポータータンパク質９の種類に応じて選択される、第１検出工程Ｓ２で説明した方法を用いて行えばよい。

【0130】

第１検出工程Ｓ２２及び第２検出工程Ｓ２３は、どちらかを先に行ってもよいし、同時に行ってもよい。同時に行う場合には、第２レポーター遺伝子Ｒ２の発現量が第１レポーター遺伝子Ｒ１の発現量よりも多くなるように第１プロモーター配列Ｐ１及び第２プロモーター配列Ｐ２（必要であれば第１エンハンサー配列Ｅ１及び第２エンハンサー配列Ｅ２）を選択することが好ましい。第２信号１０が第１信号６に埋もれて検出困難になるのを防ぐためである。

【0131】

次に、第１検出工程Ｓ２２及び第２検出工程Ｓ２３の結果からトランスポゼースの切り出し活性及び組込み活性を評価する（第２評価工程Ｓ２４）。

【0132】

組込み活性については、例えば第１評価工程Ｓ３で説明した方法と同様に第１レポータータンパク質５の発現（第１信号６）から決定することができる。

【0133】

一方、第２レポータータンパク質９が高発現している（第２信号１０の強度が高い）場合、トランスポゼースＴＰの切り出し活性が良好であると判断することができる。反対に第２レポータータンパク質９の発現量（第２信号１０の強度）が低い場合は正常な切り出しが行われていないことを示すので切り出し活性が不良であると判断することができる。

【0134】

以上のことから、第１レポータータンパク質５の発現量が高く組込み活性が良好なとき、同時に第２レポータータンパク質９の発現量が高い場合、トランスポゼースＴＰの切り出し活性もまた良好であると判断することができる。このように両活性が良好な場合、分析対象であるトランスポゼースＴＰはゲノムへの核酸の組込み効率が高く、ゲノム編集等の用途に用いるのに好適で有り得る。

【0135】

第１レポータータンパク質５が低発現であり組込み活性が不良なときは、第２レポータータンパク質９の発現量が高ければ切り出し活性は良好であると判断することができる。反対に第２レポータータンパク質９の発現量が低ければ切り出し活性もまた不良であると判断することができる。

【0136】

以上のように、第２ベクター８を用いることによって同じ細胞におけるトランスポゼースＴＰの切り出し活性及び組込み活性について同時に評価することができる。本方法によれば、切り出し活性の測定で切り出された配列を用いて組込み活性を測定する。これは遺伝子組込みにおけるトランスポゼースの作用機序に即している。したがって本方法によれば、切り出し活性及び組込み活性を別々に測定するよりも正確なトランスポゼースの活性の測定が可能である。

【0137】

・細胞分離方法
第２実施形態の第１ベクター１及び第２ベクター８は、細胞分離方法にも用いることができる。細胞分離方法は、例えば図９に示すように次の工程を含む。

【0138】

（Ｓ３１）第１ベクター１及び第２ベクターを細胞に導入する導入工程、
（Ｓ３２）第１レポーター遺伝子から発現する第１レポータータンパク質を検出する第１検出工程、
（Ｓ３２）第２レポーター遺伝子から発現する第２レポータータンパク質を検出する第２検出工程、及び
（Ｓ３４）第１レポータータンパク質の検出の結果及び第２レポータータンパク質の検出の結果に基づいて細胞を分離する分離工程。

【0139】

導入工程Ｓ３１、第１検出工程Ｓ３２及び第２検出工程Ｓ３３は前記トランスポゼース活性測定方法の導入工程Ｓ２１、第１検出工程Ｓ２２及び第２検出工程Ｓ２３と同様に行うことができる。

【0140】

分離工程Ｓ３４では、例えば第１レポータータンパク質５の発現量及び／又は第２レポータータンパク質９の発現量を基準に所望の細胞を分離する。特に第１レポータータンパク質５及び第２レポータータンパク質９の両方が高発現している細胞を他の細胞と分離することが好ましい。その結果、切り出し活性及び組込み活性が良好なトランスポゼースＴＰを含む細胞が得られる。或いは、検出結果から各活性の度合いを評価して、両活性が特に高い細胞を分離することもまた好ましい。

【0141】

この方法によれば、両活性が良好なトランスポゼースＴＰを含む細胞が容易に得られる。そのため、例えばこの細胞を使用したゲノム編集細胞の製造効率が向上し得る。

【0142】

第２実施形態の第１ベクター１及び第２ベクター８は、第１実施形態と同様のキットとしても提供され得る。このキットは、第２レポーター遺伝子Ｒ２から発現する第２レポータータンパク質９を検出するための試薬を更に含んでもよい。

【0143】

（第３実施形態）
第１実施形態及び第２実施形態においては、トランスポゼースＴＰにより第１エンハンサー配列Ｅ１を第２ベクター３，８の切り出し用配列４から第１ベクター１へと移転させる例を示した。しかしながら、移転させる配列は第１エンハンサー配列Ｅ１に限定されるものではない。例えば、移転の前後で第１レポータータンパク質５の発現量（第１信号６の強度）が変化すれば、いずれの配列を移転させてもトランスポゼースＴＰの活性の評価が可能である。第３実施形態においては、第１実施形態のベクターセットにおいて、移転させる配列が第１エンハンサー配列Ｅ１以外からも選択される例について説明する。

【0144】

移転させる配列は、第１実施形態で説明した第１ベクター１の塩基配列の中から選択される、第１レポーター遺伝子Ｒ１の発現に関与する配列である。第１レポーター遺伝子Ｒ１の発現に関与する配列は、例えば第１遺伝子発現ユニットＵ１に含まれる配列の中から選択され、例えば第１エンハンサー配列Ｅ１、第１プロモーター配列Ｐ１又は第１レポーター遺伝子Ｒ１の全配列又はその一部の配列である。

【0145】

第１レポーター遺伝子Ｒ１の発現に関与する配列は、約５０～約９０００塩基の長さを有する塩基配列とすることが好ましく、約５０～約２０００塩基の長さを有する塩基配列であることがより好ましい。

【0146】

第３実施形態に係る第１ベクター１は、第１レポーター遺伝子Ｒ１の発現に関与する配列として選択された配列（例えば第１遺伝子発現ユニットＵ１を構成するＥ１、Ｐ１、Ｒ１のいずれかもしくはそれらの一部）が、トランスポゼース標的配列２に置換されている配列を含む。言い換えれば第１レポーター遺伝子Ｒ１の発現に関与する配列に代えてトランスポゼース標的配列２が配置されている構成を有する。また、第３実施形態に係る第２ベクター３は、切り出し用配列４の５’側トランスポゼース認識配列４ａと３’側トランスポゼース認識配列４ｂとの間に第１レポーター遺伝子Ｒ１の発現に関与する配列として選択された配列（例えば第１遺伝子発現ユニットＵ１を構成するＥ１、第１プロモーター配列Ｐ１、第１レポーター遺伝子Ｒ１のいずれか又はそれらの一部）が配置された構成を有する。

【0147】

第３実施形態に係るベクターセットの一例を図１０に示す。
図１０の（ａ）は、第１レポーター遺伝子Ｒ１の発現に関与する配列として選択した配列が第１プロモーター配列Ｐ１である例を示す。この場合、第１ベクター１ｂは、移転後に形成される第１遺伝子発現ユニットＵ１において第１プロモーター配列Ｐ１が配置されるべき領域にトランスポゼース標的配列２を備える。第２ベクター３ｂは切り出し用配列４の５’側トランスポゼース認識配列４ａと３’側トランスポゼース認識配列４ｂとの間に第１プロモーター配列Ｐ１を備える。

【0148】

図１０の（ｂ）は、第１レポーター遺伝子Ｒ１の発現に関与する配列として選択した配列が第１レポーター遺伝子Ｒ１の一部の配列である例を示す。この場合、第１ベクター１ｃは移転後に形成される第１遺伝子発現ユニットＵ１において第１レポーター遺伝子Ｒ１が配置されるべき領域の一部にトランスポゼース標的配列２を備える。第２ベクター３ｃは切り出し用配列４の５’側トランスポゼース認識配列４ａと３’側トランスポゼース認識配列４ｂとの間に第１レポーター遺伝子Ｒ１の一部を備える。

【0149】

第３実施形態に係る第２ベクターは、第２実施形態に係る第２ベクター８と同様の構成を有してもよい。そのような第２ベクターは、例えば図６の（ａ）又は図６の（ｂ）に示す第２ベクター８又は８ｂの第１エンハンサー配列Ｅ１に代えて、第１レポーター遺伝子Ｒ１の発現に関与する配列として選択された配列を含む。

【0150】

以上に移転させる配列として第１エンハンサー配列Ｅ１以外の配列を選択する例を示したが、好ましくは移転させる配列は第１エンハンサー配列Ｅ１である。例えば第１プロモーター配列Ｐ１又は第１レポーター遺伝子Ｒ１を選択した際には、移転前には基本的に第１ベクター１から第１レポータータンパク質５は発現しない。しかしながら第１エンハンサー配列Ｅ１を用いる場合、移転前であっても第１レポータータンパク質５が発現し得、それを検出することで第１ベクター１の細胞内への導入を分析前に確認することができる。そのため、第１エンハンサー配列Ｅ１を用いる第１実施形態及び第２実施形態が、第３実施形態よりも好ましい場合もある。

【0151】

第３実施形態のベクターセットは、第１実施形態及び第２実施形態と同様のキット、トランスポゼース活性測定方法及び細胞分離方法に用いることができる。

【0152】

［例］
以下に、実施形態のベクターセットを製造し使用した例について記載する。

【0153】

例１ トランスポゼース切り出し活性測定用ベクターの作製
まず、ｐｉｇｇｙＢａｃの認識配列である５’ＩＲ（配列番号８）と３’ＩＲ（配列番号９）との間にマルチクローニング配列を配置した、表１４に示す人工ＤＮＡ（配列番号１４）を合成した（ＢＥＸ製）。

【0154】

【表14】

【0155】

次にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター配列（配列番号２）とホタル由来のホタルルシフェラーゼ遺伝子（配列番号４）とウシ成長ホルモン転写終結配列（配列番号６）とを含むホタルルシフェラーゼ発現ユニットが組込まれたベクター（ｐＣＭＶ－Ｌｕｃ）を用意し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子が２領域に分割されるよう、間に上記人工ＤＮＡ（配列番号１４）を組込んだ。ホタルルシフェラーゼ遺伝子は５’側領域（配列番号１２）と３’側領域（配列番号１３）とに分割した。それによって、下記表１５に示すベクター：ｐＣＭＶ－ＬｕＩＲｕＣ（配列番号１５）を得た。

【表15-1】

【表15-2】

【表15-3】

【0156】

次に、ｐＣＭＶ－ＬｕＩＲｕＣに挿入した人工ＤＮＡのマルチクローニング配列内に、エンハンサー配列（配列番号１１）を組込んだ。このエンハンサー配列は、例２で説明するトランスポゼース組込み活性用ベクターのルシフェラーゼ遺伝子の転写量を増大させる働きがある。その結果、図１１に示すトランスポゼース切り出し活性測定用ベクター：ｐＣＭＶ－ＬｕＥｕＣ（表１６，配列番号１６）を得た。

【表16-1】

【表16-2】

【表16-3】

【0157】

例２ トランスポゼース組込み活性測定用ベクターの作製
まず、ヒトポリペプチド鎖伸長因子遺伝子（ＥＦ１α）のプロモーター配列（配列番号３）とトゲオキヒオドシエビ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ）由来のルシフェラーゼ（以下、「ＯＧルシフェラーゼ」と称する）の遺伝子（配列番号５）とウシ成長ホルモン転写終結配列（配列番号６）とを含むルシフェラーゼ発現ユニットが組込まれたベクター（ｐＥＦ１α－Ｌｕｃ）を用意した。ｐＥＦ１α－ＬｕｃのＥＦ１αプロモーター上流領域に、ｐｉｇｇｙＢａｃのターゲット配列であるＴＴＡＡを５回繰り返した人工ＤＮＡ（配列番号１４）を組込んだ。その結果、図１２に示すトランスポゼース組込み活性測定用ベクター：ｐＴＴＡＡ×５－ＥＦ１α－Ｌｕｃ（表１７，配列番号１７）が得られた。

【表17-1】

【表17-2】

【0158】

例３ ｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡの作製
ｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡは、ｐＧＥＭ－ＧＬ－ＰＢ４（ＢＥＸ社製）を鋳型として合成した。合成にはＣＵＧＡ（登録商標）７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（ニッポンジーン）を用いた。これを精製して得られたＲＮＡ（表１８，配列番号１８）の５’非翻訳領域（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ：ＵＴＲ）と３’－ＵＴＲに、それぞれＣａｐ構造とｐｏｌｙ（Ａ）構造を付加してｍＲＮＡ化した。

【0159】

【表18】

【0160】

Ｃａｐ構造とｐｏｌｙ（Ａ）構造の付加は、ｍＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ ｍＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）で行った。上記実験の操作は、それぞれのキットのプロトコルに従った。

【0161】

例４ ＨｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡの作製
ＨｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡは、ｐＧＥＭ－ＧＬ－ＴＳ－ＨｙＰＢ（ＢＥＸ社製）を鋳型として合成した。合成にはＣＵＧＡ（登録商標）７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（ニッポンジーン）を用いた。これを精製して得られたＲＮＡ（表１９，配列番号１９）の５’非翻訳領域（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ：ＵＴＲ）と３’－ＵＴＲに、それぞれＣａｐ構造とｐｏｌｙ（Ａ）構造を付加してｍＲＮＡ化した。

【0162】

【表19】

【0163】

Ｃａｐ構造とｐｏｌｙ（Ａ）構造の付加は、ｍＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ ｍＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）で行った。上記実験の操作は、それぞれのキットのプロトコルに従った。

【0164】

例５ ｐＣＭＶ－ＬｕＥｕＣとｐＴＴＡＡ×５－ＥＦ１α－ＬｕｃによるｐｉｇｇｙＢａｃ活性の測定
ＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニーバイオテク製）で培養したヒトＴ細胞性白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ、ＡＴＣＣ（登録商標）製）を遠心で回収した後、９６ウェルプレートに５．０×１０^５細胞／ウェルになるように播種した。例１で作製したトランスポゼース切り出し活性測定用ベクター（ｐＣＭＶ－ＬｕＥｕＣ）と例２で作製したトランスポゼース組込み活性測定用ベクター（ｐＴＴＡＡ×５－ＥＦ１α－Ｌｕｃ）と例３で作製したｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡとをカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子に内包し、各ベクター及びｍＲＮＡが表２０に示す添加量となるように脂質ナノ粒子をウェルに添加した。その後、培養プレートをインキュベーターに収容し、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気で培養した。

【0165】

【表20】

【0166】

脂質ナノ粒子の添加から４８時間後、培養プレートをインキュベーターから取り出し、培養液５０μＬを９６ウェルプレートに回収して、ＯＮＥ－Ｇｌｏ^ＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）およびＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）を用いて、ホタルルシフェラーゼ遺伝子から発現するホタルルシフェラーゼ及びＯＧルシフェラーゼ遺伝子から発現するＯＧルシフェラーゼの発光強度をルミノメーター（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ２００ＰＲＯ、テカン製）で測定した。測定は、キット及びルミノメーターに添付のマニュアルに従って行った。

【0167】

図１３にホタルルシフェラーゼの発光測定の結果を示す。ｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡを導入しなかったＪｕｒｋａｔでは１０ＲＬＵの強度が得られたのに対して、ｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡとｐＣＭＶ－ＬｕＥｕＣとを共導入したＪｕｒｋａｔでは２７０ＲＬＵと２７倍の高い発光強度が測定された。

【0168】

図１４にＯＧルシフェラーゼの発行測定の結果を示す。ｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡを導入しなかったＪｕｒｋａｔでは２２０ＲＬＵの強度が得られたのに対して、ｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡとｐＴＴＡＡ×５－ＥＦ１α－Ｌｕｃを共導入したＪｕｒｋａｔでは６０８ＲＬＵと２．８倍の高い発光強度が測定された。

【0169】

図１３の結果から、ｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡから発現されたｐｉｇｇｙＢａｃが、ｐＣＭＶ－ＬｕＥｕＣの５’ＩＲおよび３’ＩＲに挟まれた領域を切り出し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子が形成されてホタルルシフェラーゼが発現したことが示された。また、図１４の結果から、ｐｉｇｇｙＢａｃによってｐＣＭＶ－ＬｕＥｕＣから切り出された領域が、ｐＴＴＡＡ×５－ＥＦ１α－Ｌｕｃのプロモーター配列の上流領域にあるＴＴＡＡを５回繰り返した配列内に組込まれて、エンハンサーがＥＦ１αプロモーターを活性化してＯＧルシフェラーゼの発現強度が増大したことが示された。したがって、ｐＣＭＶ－ＬｕＥｕＣとｐＴＴＡＡ×５－ＥＦ１α－Ｌｕｃとが、トランスポゼースｐｉｇｇｙＢａｃの切り出し活性及び組込み活性をそれぞれ測定するためのベクターとして有効に機能することが明らかとなった。

【0170】

例６ ｐＣＭＶ－ＬｕＥｕＣとｐＴＴＡＡ×５－ＥＦ１α－ＬｕｃによるｐｉｇｇｙＢａｃ活性およびＨｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ活性の測定
ＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニーバイオテク製）で培養したヒトＴ細胞性白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ、ＡＴＣＣ（登録商標）製）を遠心で回収した後、９６ウェルプレートに２．０×１０^５細胞／ウェルになるように播種した。例１で作製したトランスポゼース切り出し活性測定用ベクター（ｐＣＭＶ－ＬｕＥｕＣ）と例２で作製したトランスポゼース組込み活性測定用ベクター（ｐＴＴＡＡ×５－ＥＦ１α－Ｌｕｃ）と例３で作製したｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡと例４で作製したＨｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡとをカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子に内包し、各ベクター及びｍＲＮＡが表２１に示す添加量となるように脂質ナノ粒子をウェルに添加した。その後、培養プレートをインキュベーターに収容し、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気で培養した。

【0171】

【表21】

【0172】

脂質ナノ粒子の添加から４８時間後、培養プレートをインキュベーターから取り出し、培養液５０μＬを９６ウェルプレートに回収して、ＯＮＥ－Ｇｌｏ^ＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）およびＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）を用いて、ホタルルシフェラーゼ遺伝子から発現するホタルルシフェラーゼ及びＯＧルシフェラーゼ遺伝子から発現するＯＧルシフェラーゼの発光強度をルミノメーター（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ２００ＰＲＯ、テカン製）で測定した。測定は、キット及びルミノメーターに添付のマニュアルに従って行った。

【0173】

図１５にホタルルシフェラーゼの発光測定の結果を示す。ｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡとｐＣＭＶ－ＬｕＥｕＣとを共導入したＪｕｒｋａｔでは２０ＲＬＵの強度が得られたのに対して、ＨｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃとｐＣＭＶ－ＬｕＥｕＣとを共導入したＪｕｒｋａｔでは１１１ＲＬＵと５倍の高い発光強度が測定された。

【0174】

図１６にＯＧルシフェラーゼの発行測定の結果を示す。ｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡとｐＴＴＡＡ×５－ＥＦ１α－Ｌｕｃとを共導入したＪｕｒｋａｔでは３４９ＲＬＵの強度が得られたのに対して、ＨｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃとｐＴＴＡＡ×５－ＥＦ１α－Ｌｕｃとを共導入したＪｕｒｋａｔでは９１４ＲＬＵと３倍の高い発光強度が測定された。

【0175】

図１５の結果から、ｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡから発現されたｐｉｇｇｙＢａｃと比べて、ＨｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡから発現されたＨｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃを共導入したＪｕｒｋａｔで、より多くのホタルルシフェラーゼが発現したことが示された。また、図１６の結果から、ｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡから発現されたｐｉｇｇｙＢａｃと比べて、ＨｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡから発現されたＨｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃを共導入したＪｕｒｋａｔで、ＯＧルシフェラーゼの発現強度の増大がより大きくなったことが示された。したがって、ｐＣＭＶ－ＬｕＥｕＣとｐＴＴＡＡ×５－ＥＦ１α－Ｌｕｃとが、トランスポゼースｐｉｇｇｙＢａｃの切り出し活性及び組込み活性をそれぞれ測定するためのベクターとして有効に機能することが明らかとなった。

【0176】

本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
トランスポゼース標的配列、前記トランスポゼース標的配列の下流に連結された第１プロモーター配列、及び前記第１プロモーター配列の下流に連結された第１レポーター遺伝子を含む第１ベクターと、
５’側トランスポゼース認識配列と、３’側トランスポゼース認識配列と、その間に配置された、第１エンハンサー配列とを含む第２ベクターと
を含む、ベクターセット。
［２］
前記トランスポゼース標的配列は、配列番号１の塩基配列を含む［１］のベクターセット。
［３］
前記第１エンハンサー配列は、配列番号１１の塩基配列を含む［１］又は［２］のベクターセット。
［４］
前記第１プロモーター配列は、配列番号３の塩基配列を含む［１］～［３］の何れか１つのベクターセット。
［５］
前記第１レポーター遺伝子は、配列番号５の塩基配列を含む、［１］～［４］の何れか１つのベクターセット。
［６］
５’側トランスポゼース認識配列及び３’側トランスポゼース認識配列は、配列番号８及び配列番号９の塩基配列をそれぞれ含む、［１］～［５］の何れか１つのベクターセット。
［７］
前記第２ベクターは、第２プロモーター配列と、前記第２プロモーター配列の下流に連結された、第２レポーター遺伝子５’側断片及び第２レポーター遺伝子３’側断片とを更に含み、
前記第２レポーター遺伝子５’側断片及び前記第２レポーター遺伝子３’側断片は、第２レポーター遺伝子が二分割された５’側の配列と３’側の配列とをそれぞれ含み、
前記５’側トランスポゼース認識配列と、前記３’側トランスポゼース認識配列と、その間に配置された、前記第１エンハンサー配列とは、前記第２レポーター遺伝子５’側断片及び前記第２レポーター遺伝子３’側断片の間に配置されている、
［１］～［６］の何れか１つのベクターセット。
［８］
前記第２レポーター遺伝子は、二分割されていることによって不活性化された状態である、［７］のベクターセット。
［９］
前記第１レポーター遺伝子及び前記第２レポーター遺伝子は互いに異なる、［７］又は［８］のベクターセット。
［１０］
前記第２ベクターは、前記第２プロモーター配列の上流に第２エンハンサー配列が連結されている［７］～［９］の何れか１つのベクターセット。
［１１］
前記第２プロモーター配列は、配列番号２の塩基配列を含む、［７］～［１０］の何れか１つのベクターセット。
［１２］
前記第２レポーター遺伝子５’側断片は配列番号１２の塩基配列を含み、前記第２レポーター遺伝子３’側断片は配列番号１３の塩基配列を含む、［７］～［１１］の何れか１つのベクターセット。
［１３］
第１エンハンサー配列、前記第１エンハンサー配列の下流に連結された第１プロモーター配列、及び前記第１プロモーター配列の下流に連結された第１レポーター遺伝子を含む遺伝子発現ユニットのうち、前記第１レポーター遺伝子の発現に関与する配列がトランスポゼース標的配列に置換されている配列を含む第１ベクターと、
５’側トランスポゼース認識配列と、３’側トランスポゼース認識配列と、その間に配置された、前記第１レポーター遺伝子の発現に関与する前記配列を含む第２ベクターと
を含む、ベクターセット。
［１４］
前記第２ベクターは、第２プロモーター配列と、前記第２プロモーター配列の下流に連結された、第２レポーター遺伝子５’側断片及び第２レポーター遺伝子３’側断片とを更に含み、
前記第２レポーター遺伝子５’側断片及び前記第２レポーター遺伝子３’側断片は、第２レポーター遺伝子を二分割した５’側の配列と３’側の配列とをそれぞれ含み、
前記５’側トランスポゼース認識配列と、３’側トランスポゼース認識配列と、その間に配置された、前記第１レポーター遺伝子の発現に関与する前記配列は、前記第２レポーター遺伝子５’側断片及び前記第２レポーター遺伝子３’側断片の間に配置されている、［１３］のベクターセット。
［１５］
前記第２ベクターは、前記第２プロモーター配列の上流に第２エンハンサー配列が連結されている［１４］のベクターセット。
［１６］
［１］～［１５］の何れか１つのベクターセットと、
前記第１レポーター遺伝子から発現する第１レポータータンパク質を検出するための試薬と
を含むトランスポゼースの活性を測定するためのキット。
［１７］
前記ベクターセットは［７］～［１２］の何れか１つのベクターセットであり、
前記第２レポーター遺伝子から発現する第２レポータータンパク質を検出するための試薬を更に含む［１６］のキット。
［１８］
前記ベクターセットは、脂質粒子に内包されている、［１６］又は［１７］のキット。
［１９］
ベクターセットを用いた細胞内のトランスポゼースの活性の測定方法であって、
前記ベクターセットは、［１］～［１５］の何れか１つのベクターセットであり、
当該方法は、
前記細胞に前記第１ベクター及び前記第２ベクターを導入することと、
前記第１レポーター遺伝子から発現する第１レポータータンパク質を検出することと、
前記第１レポータータンパク質の検出の結果から前記トランスポゼースの活性を評価すること
を含むトランスポゼース活性測定方法。
［２０］
前記活性の評価において前記第１レポータータンパク質が発現している場合、トランスポゼースの組込み活性があると評価する、［１９］の方法。
［２１］
前記導入は前記第１ベクター及び前記第２ベクターを内包した脂質粒子を前記細胞に接触させることにより行われる、［１９］又は［２０］の方法。
［２２］
前記トランスポゼースは、それをコードする核酸の形態で前記検出の前に前記細胞に導入される、［１９］～［２１］の何れか１つの方法。
［２３］
前記ベクターセットが［７］～［１２］の何れか１つのベクターセットであり、前記トランスポゼースの活性の評価は、前記第２レポーター遺伝子から発現する第２レポータータンパク質の検出の結果を更に用いて行われる、
［１９］～［２２］の方法。
［２４］
前記活性の評価において前記第２レポータータンパク質の発現がある場合、トランスポゼースの切り出し活性があると評価する、［１９］～［２３］の何れか１つの方法。
［２５］
ベクターセットを用いて細胞内のトランスポゼースの活性に基づいて細胞を分離する方法であって、
前記ベクターセットは、［１］～［１５］の何れか１つのベクターセットであり、
当該方法は、
前記細胞に前記第１ベクター及び前記第２ベクターを導入することと、
前記第１レポーター遺伝子から発現する第１レポータータンパク質を検出することと、
前記第１レポータータンパク質の検出の結果に基づいて細胞を分離することと
を含む細胞分離方法。
［２６］
前記ベクターセットが［７］～［１２］の何れか１つのベクターセットであり、前記分離は、前記第２レポーター遺伝子から発現する第２レポータータンパク質の検出の結果に更に基づいて行われる、［２５］の方法。
［２７］
前記分離において、前記第１レポータータンパク質と前記第２レポータータンパク質とが両方発現する細胞を分離する、［２６］の方法。

【符号の説明】

【0177】

１、１ｂ、１ｃ…第１ベクター、２…トランスポゼース標的配列、
３、３ｂ、３ｃ、８、８ｂ…第２ベクター、４…切り出し用配列、
４ａ…５’側トランスポゼース認識配列、
４ｂ…３’側トランスポゼース認識配列、
５…第１レポータータンパク質、６…第１信号、７…脂質粒子、
９…第２レポータータンパク質、１０…第２信号、
Ｅ１…第１エンハンサー配列、Ｅ２…第２エンハンサー配列、
Ｐ１…第１プロモーター配列、Ｐ２…第２プロモーター配列、
Ｒ１…第１レポーター遺伝子、Ｒ２…第２レポーター遺伝子、
Ｒ２ａ…第２レポーター遺伝子５’側断片、
Ｒ２ｂ…第２レポーター遺伝子３’側断片、ＴＰ…トランスポゼース、
Ｔ１…第１転写終結配列、Ｔ２…第２転写終結配列、
Ｕ１…第１遺伝子発現ユニット、Ｕ２…第２遺伝子発現ユニット。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

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