▶ 大成建設株式会社の特許一覧 ▶ ケイ・アイ化成株式会社の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-09
(45)【発行日】2024-09-18
(54)【発明の名称】ジオキサン分解菌粉末製剤とその製造方法、及び生分解処理方法
(51)【国際特許分類】
C02F 3/00 20230101AFI20240910BHJP
C02F 3/34 20230101ALI20240910BHJP
C02F 3/10 20230101ALI20240910BHJP
C12N 11/12 20060101ALI20240910BHJP
C12N 11/14 20060101ALI20240910BHJP
C12N 11/02 20060101ALI20240910BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20240910BHJP
【ＦＩ】
C02F3/00 G
C02F3/34 Z
C02F3/10 A
C12N11/12
C12N11/14
C12N11/02
C12N1/20 D
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2021048168
(22)【出願日】2021-03-23
(65)【公開番号】P2022147070
(43)【公開日】2022-10-06
【審査請求日】2023-10-10
【微生物の受託番号】NPMD NITE BP-02032
(73)【特許権者】
【識別番号】000206211
【氏名又は名称】大成建設株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】390034348
【氏名又は名称】ケイ・アイ化成株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100162396
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 泰之
(74)【代理人】
【識別番号】100122954
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷部 善太郎
(74)【代理人】
【識別番号】100194803
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 理弘
(72)【発明者】
【氏名】山本 哲史
(72)【発明者】
【氏名】日下 潤
(72)【発明者】
【氏名】服部 新吾
(72)【発明者】
【氏名】堀内 達也
【審査官】長谷部 智寿
(56)【参考文献】
【文献】特開２００４－２３６５９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１０－２５２７７９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／１８１８０２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／０９７９２１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１７－１７６０６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－１７７０３１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１８－１７０９８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／０８２９０７（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０２Ｆ ３／００
Ｃ０２Ｆ ３／３４
Ｃ０２Ｆ ３／１０
Ｃ１２Ｎ １１／１２
Ｃ１２Ｎ １１／１４
Ｃ１２Ｎ １１／０２
Ｃ１２Ｎ １／２０
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
粉末状の基体に、１，４－ジオキサン分解菌が担持されてなり、前記１，４－ジオキサン分解菌が、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２０３２として寄託されたＮ２３株であり、
前記基体が、公称目開き０．５ｍｍの篩を８０質量％以上通過するセルロースであることを特徴とするジオキサン分解菌粉末製剤。
【請求項2】
水分率が、７重量％以上１３重量％以下であることを特徴とする請求項１に記載のジオキサン分解菌粉末製剤。
【請求項3】
流動層乾燥装置を用いて、流動層中で分散している粉末状の基体に１，４－ジオキサン分解菌を含む懸濁液を噴霧し、ジオキサン分解活性を維持したまま乾燥させる工程を有し、前記１，４－ジオキサン分解菌が、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２０３２として寄託されたＮ２３株であり、
前記基体が、公称目開き０．５ｍｍの篩を８０質量％以上通過するセルロースであることを特徴とするジオキサン分解菌粉末製剤の製造方法。
【請求項4】
請求項１または２に記載のジオキサン分解菌粉末製剤を用いることを特徴とする有機化合物の生分解処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、１，４－ジオキサン分解菌の粉末製剤とその製造方法、及びこの粉末製剤を用いた有機化合物の生分解処理方法に関する。
【背景技術】
【0002】
１，４－ジオキサンは、下記式（１）で表される環状エーテルである。１，４－ジオキサンは、水や有機溶媒との相溶性に優れており、主に有機合成の反応溶剤として使用されている。
【0003】
【化1】
【0004】
２０１０年度の日本国における１，４－ジオキサンの製造・輸入量は、約４５００ｔ／年であり、約３００ｔ／年が環境中へ放出されたと推測される。１，４－ジオキサンは、水溶性であるため、水環境中へ放出されると広域に拡散してしまう。また、揮発性、固体への吸着性、光分解性、加水分解性、生分解性がいずれも低いため、水中からの除去が困難である。１，４－ジオキサンは急性毒性及び慢性毒性を有する上、発がん性も指摘されていることから、１，４－ジオキサンによる水環境の汚染は、人や動植物に悪影響を及ぼすことが懸念されている。そのため、日本国では、水道水質基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）、環境基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）及び排水基準（０．５ｍｇ／Ｌ以下）により、１，４－ジオキサンの規制がなされている。また、非特許文献１には、１，４－ジオキサンを含む産業廃水には、１，４－ジオキサンの他に１，３－ジオキソラン及び２－メチル－１，３－ジオキソランといった環状エーテルが含まれていることが報告されている。特に１，３－ジオキソランは、急性毒性等の毒性が確認されており、１，３－ジオキソランを含む汚染水等は適切に処理しなければならない。
【0005】
低コストかつ安定的に１，４－ジオキサン等の環状エーテルを含む水を処理する方法が求められており、特許文献１、非特許文献２では、１，４－ジオキサン分解菌による１，４－ジオキサン処理が提案されている。１，４－ジオキサン分解菌（以下、分解菌ともいう）は、１，４－ジオキサンを単一炭素源として分解する菌（資化菌）と、テトラヒドロフラン等の特定の基質の存在下にて１，４－ジオキサンを分解できる菌（共代謝菌）の２種類に大別される。資化菌は、さらに１，４－ジオキサン分解酵素の誘導の有無によって、誘導型と構成型に分けられる。誘導型１，４－ジオキサン分解菌は、１，４－ジオキサンなどの誘導物質が存在することで分解酵素の生産・分泌がされるため、１，４－ジオキサン処理に用いる前に予め馴養する必要がある。一方、構成型１，４－ジオキサン分解菌は、常時、分解酵素を生産しているため、馴養することなく、直ちに１，４－ジオキサン処理に用いることができる。
【0006】
１，４－ジオキサンを生分解処理する場合、菌の前準備が簡便であるため、特定の基質を添加する必要がない資化菌を活用することが好ましく、誘導の必要がない構成型１，４－ジオキサン分解菌を用いることがさらに好ましい。しかし、構成型１，４－ジオキサン分解菌は、誘導型１，４－ジオキサン分解菌と比較して１，４－ジオキサン最大比分解速度が低いという問題点があった。
本発明者らは、構成型１，４－ジオキサン分解菌であるPseudonocardia sp.N23（以下、Ｎ２３株ともいう）を報告している。Ｎ２３株は、ジオキサンのみならず、環状エーテル、有機塩素化合物を生分解することができ、また優れた分解能力を有する（特許文献２、３）。そのため、Ｎ２３株は、多様な汚染状況に対して生分解処理が可能であることが期待されている。
本発明者らは、構成型１，４－ジオキサン分解菌であるPseudonocardia sp.N23（以下、Ｎ２３株ともいう）を報告している。Ｎ２３株は、ジオキサンのみならず、環状エーテル、有機塩素化合物を生分解することができ、また優れた分解能力を有する（特許文献２、３）。そのため、Ｎ２３株は、多様な汚染状況に対して生分解処理が可能であることが期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特開２００８－３０６９３９号公報
【文献】特許第６１１７４５０号公報
【文献】特開２０２０－１１０７８８号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】CD. Adams, PA. Scanlan and ND. Secrist: Oxidation and biodegradability enhancement of 1,4-dioxane using hydrogen peroxide and ozone, Environ. Sci. Technol., 28(11), pp.1812-1818, 1994.
【文献】清和成、池道彦：１，４－ジオキサン分解菌を用いた汚染地下水の生物処理・浄化の可能性，用水と廃水，Vol.53, No.7, 2011
【文献】K. Sei, K. Miyagaki, T. Kakinoki, K. Fukugasako, D. Inoue and M. Ike: Isolation and characterization of bacterial strains that have high ability to degrade 1,4-dioxane as a sole carbon and energy source, Biodegradation, 24, 5, pp.665-674, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
Ｎ２３株等のジオキサン分解菌は、活性を有したまま、すなわち、生きたまま取り扱う必要があり、通常、培養液やその濃縮液として取り扱われる。しかし、濃縮液にしても、その殆どは水で重く嵩張るものであり、汚染水を処理する曝気槽に必要量の菌体を供給するためには、大量の培養液または濃縮液が必要であった。そのため、ジオキサン分解菌の取り扱い性の向上が求められていた。
そこで、本発明は、１，４－ジオキサン分解菌の粉末製剤と、その製造方法、及び粉末製剤を用いた生分解処理方法を提供することを課題とする。
そこで、本発明は、１，４－ジオキサン分解菌の粉末製剤と、その製造方法、及び粉末製剤を用いた生分解処理方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
１．粉末状の基体に、１，４－ジオキサン分解菌が担持されてなり、
前記基体が、公称目開き０．５ｍｍの篩を８０質量％以上通過することを特徴とするジオキサン分解菌粉末製剤。
２．前記基体が、無機担体、セルロース、キチン、キトサンのいずれかであることを特徴とする１．に記載のジオキサン分解菌粉末製剤。
３．水分率が、７重量％以上１３重量％以下であることを特徴とする１．または２．に記載のジオキサン分解菌粉末製剤。
４．前記１，４－ジオキサン分解菌が、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ（シュードノカルディア）属であることを特徴とする１．～３．のいずれかに記載のジオキサン分解菌粉末製剤。
５．前記１，４－ジオキサン分解菌が、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２０３２として寄託されたＮ２３株であることを特徴とする１．～４．のいずれかに記載のジオキサン分解菌粉末製剤。
６．流動層乾燥装置を用いて、流動層中で分散している粉末状の基体に１，４－ジオキサン分解菌を含む懸濁液を噴霧し、ジオキサン分解活性を維持したまま乾燥させる工程を有し、
前記基体が、公称目開き０．５ｍｍの篩を８０質量％以上通過することを特徴とするジオキサン分解菌粉末製剤の製造方法。
７．前記基体が、無機担体、セルロース、キチン、キトサンのいずれかであることを特徴とする６．に記載のジオキサン分解菌粉末製剤の製造方法。
８．前記１，４－ジオキサン分解菌が、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ（シュードノカルディア）属であることを特徴とする６．または７．に記載のジオキサン分解菌粉末製剤の製造方法。
９．前記１，４－ジオキサン分解菌が、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２０３２として寄託されたＮ２３株であることを特徴とする６．～８．のいずれかに記載のジオキサン分解菌粉末製剤の製造方法。
１０．１．～５．のいずれかに記載のジオキサン分解菌粉末製剤を用いることを特徴とする有機化合物の生分解処理方法。
前記基体が、公称目開き０．５ｍｍの篩を８０質量％以上通過することを特徴とするジオキサン分解菌粉末製剤。
２．前記基体が、無機担体、セルロース、キチン、キトサンのいずれかであることを特徴とする１．に記載のジオキサン分解菌粉末製剤。
３．水分率が、７重量％以上１３重量％以下であることを特徴とする１．または２．に記載のジオキサン分解菌粉末製剤。
４．前記１，４－ジオキサン分解菌が、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ（シュードノカルディア）属であることを特徴とする１．～３．のいずれかに記載のジオキサン分解菌粉末製剤。
５．前記１，４－ジオキサン分解菌が、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２０３２として寄託されたＮ２３株であることを特徴とする１．～４．のいずれかに記載のジオキサン分解菌粉末製剤。
６．流動層乾燥装置を用いて、流動層中で分散している粉末状の基体に１，４－ジオキサン分解菌を含む懸濁液を噴霧し、ジオキサン分解活性を維持したまま乾燥させる工程を有し、
前記基体が、公称目開き０．５ｍｍの篩を８０質量％以上通過することを特徴とするジオキサン分解菌粉末製剤の製造方法。
７．前記基体が、無機担体、セルロース、キチン、キトサンのいずれかであることを特徴とする６．に記載のジオキサン分解菌粉末製剤の製造方法。
８．前記１，４－ジオキサン分解菌が、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ（シュードノカルディア）属であることを特徴とする６．または７．に記載のジオキサン分解菌粉末製剤の製造方法。
９．前記１，４－ジオキサン分解菌が、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２０３２として寄託されたＮ２３株であることを特徴とする６．～８．のいずれかに記載のジオキサン分解菌粉末製剤の製造方法。
１０．１．～５．のいずれかに記載のジオキサン分解菌粉末製剤を用いることを特徴とする有機化合物の生分解処理方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明の粉末製剤は、粉末状であるため、液体と比較して軽く、取り扱い性に優れている。本発明の粉末製剤は、雑菌が繁殖しにくく、ジオキサン分解菌を優先的に維持することができる。特に、Ｎ２３株の粉末製剤は、１，４－ジオキサンのみならず、環状エーテル、有機塩素化合物の生分解処理に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明のジオキサン分解菌粉末製剤（以下、粉末製剤ともいう）は、粉末状の基体に、１，４－ジオキサン分解菌が担持されてなり、
公称目開き０．５ｍｍの篩を８０質量％以上通過するものであることを特徴とする。
以下、本発明を詳細に説明する。
公称目開き０．５ｍｍの篩を８０質量％以上通過するものであることを特徴とする。
以下、本発明を詳細に説明する。
【0014】
・基体
本発明で使用する基体は、公称目開き０．５ｍｍの篩を８０質量％以上通過するものである。上記条件を満足する基体は、流動層乾燥装置を用いる粉末製剤の製造時に、流動層中で分散（気流に乗って浮かび上がること）でき、均一にジオキサン分解菌を担持することができる。基体は、公称目開き０．２５ｍｍの篩を８０質量％以上通過するものであることが好ましく、公称目開き０．１２５ｍｍの篩を８０質量％以上通過するものであることがより好ましく、公称目開き０．０５３ｍｍの篩を８０質量％以上通過するものであることがさらに好ましい。
本発明で使用する基体は、公称目開き０．５ｍｍの篩を８０質量％以上通過するものである。上記条件を満足する基体は、流動層乾燥装置を用いる粉末製剤の製造時に、流動層中で分散（気流に乗って浮かび上がること）でき、均一にジオキサン分解菌を担持することができる。基体は、公称目開き０．２５ｍｍの篩を８０質量％以上通過するものであることが好ましく、公称目開き０．１２５ｍｍの篩を８０質量％以上通過するものであることがより好ましく、公称目開き０．０５３ｍｍの篩を８０質量％以上通過するものであることがさらに好ましい。
【0015】
基体の比表面積は、１ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。比表面積が１ｍ２／ｇ以上であると、より多くの菌体を担持することができる。基体の比表面積は、２ｍ２／ｇ以上であることがより好ましく、３ｍ２／ｇ以上であることがさらに好ましい。また、基体の比表面積の上限値は、特に制限されない。
【0016】
基体の材質は特に制限されず、活性白土、珪藻土、ゼオライト、ベントナイト、パーライト、バーミキュライト、タルク、クレー、カオリン、珪砂、軽石、活性炭、カーボンブラック、グラファイト等の無機担体、セルロース、キチン、キトサン、米粉、小麦粉、コーンスターチ、澱粉、脱脂粉乳等の有機担体等を用いることができる。これらの中で、無機担体、セルロース、キチン、キトサンが、微生物が炭素源、窒素源として使用することが困難な材質であり、雑菌の繁殖を防ぐことができるため好ましい。
【0017】
・１，４－ジオキサン分解菌
本発明で使用する分解菌としては特に制限されず、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）、シュードノカルディア属（Pseudonocardia sp.）、アフピア属（Afipia sp.）、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium sp.）、メチロサイナス属（Methylosinus sp.）、バークホルデリア属（Burkholderia sp.）、ラルストニア属（Ralstonia sp.）、コルディセプス属（Cordyceps sp.）、キサントバクター属（Xanthobacter sp.）、アシネトバクター属（Acinetobacter sp.）等に属するものを用いることができる。これらの中で、マイコバクテリウム属またはシュードノカルディア属が好ましく、シュードノカルディア属がより好ましい。また、構成型資化菌、誘導型資化菌、共代謝菌のいずれも使用することができるが、誘導物質が不要なため資化菌が好ましく、馴養が不要なため構成型資化菌がより好ましい。
本発明で使用する分解菌としては特に制限されず、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）、シュードノカルディア属（Pseudonocardia sp.）、アフピア属（Afipia sp.）、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium sp.）、メチロサイナス属（Methylosinus sp.）、バークホルデリア属（Burkholderia sp.）、ラルストニア属（Ralstonia sp.）、コルディセプス属（Cordyceps sp.）、キサントバクター属（Xanthobacter sp.）、アシネトバクター属（Acinetobacter sp.）等に属するものを用いることができる。これらの中で、マイコバクテリウム属またはシュードノカルディア属が好ましく、シュードノカルディア属がより好ましい。また、構成型資化菌、誘導型資化菌、共代謝菌のいずれも使用することができるが、誘導物質が不要なため資化菌が好ましく、馴養が不要なため構成型資化菌がより好ましい。
【0018】
具体的には、Pseudonocardia sp. N23、Mycobacterium sp. D11、Pseudonocardia sp. D17、Mycobacterium sp.D6、Pseudonocardia dioxanivorans CB1190、Afipia sp. D1、Mycobacterium sp. PH-06、Pseudonocardia benzenivorans B5、Flavobacterium sp.、Pseudonocardia sp. ENV478、Pseudonocardia tetrahydrofuranoxydans K1、Rhodococcus ruber T1、Rhodococcus ruber T5、Methylosinus trichosporium OB3b、Mycobacterium vaccae JOB5、Burkholderia cepacia G4、Pseudomonas mendocina KR1、Pseudonocardia tetrahydrofuranoxydans K1、Ralstonia pickettii PKO1、Rhodococcus sp. RR1、Acinetobacter Baumannii DD1、Rhodococcus sp. 219、Pseudonocardia antarctica DVS 5a1、Cordyceps sinensis A、Rhodococcus aetherivorans JCM14343等を挙げることができる。これらの中で、構成型資化菌であり、分解能に優れたPseudonocardia sp.N23（Ｎ２３株）が最も好ましい。
【0019】
Ｎ２３株は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２０３２として、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８））に、２０１５年４月１０日付で国際寄託されている。
Ｎ２３株は、グラム染色性が陽性、カタラーゼ反応が陽性である。Ｎ２３株は、これまでに報告されている構成型１，４－ジオキサン分解菌の中で最も高い１，４－ジオキサン最大比分解速度を有し、その値は誘導型１，４－ジオキサン分解菌と同等以上である。また、Ｎ２３株は、１，４－ジオキサンを０．０１７ｍｇ／Ｌ以下の極低濃度まで分解することができ、約５，２００ｍｇ／Ｌという高濃度の１，４－ジオキサンを処理することができる。また、１，４－ジオキサンのみならず、１，３－ジオキソラン、２－メチル－１，３－ジオキソラン、２－クロロメチル－１，３－ジオキソラン、テトラヒドロフラン等の環状エーテル、ジクロロメタン、１，２－ジクロロエタン、クロロエチレン、１，１－ジクロロエチレン、シス－１，２－ジクロロエチレン、１，２－ジクロロプロパン、１，３－ジクロロプロペン、１，１，２－トリクロロエタン、トリクロロエチレン等の有機塩素化合物を分解することができる。
Ｎ２３株は、グラム染色性が陽性、カタラーゼ反応が陽性である。Ｎ２３株は、これまでに報告されている構成型１，４－ジオキサン分解菌の中で最も高い１，４－ジオキサン最大比分解速度を有し、その値は誘導型１，４－ジオキサン分解菌と同等以上である。また、Ｎ２３株は、１，４－ジオキサンを０．０１７ｍｇ／Ｌ以下の極低濃度まで分解することができ、約５，２００ｍｇ／Ｌという高濃度の１，４－ジオキサンを処理することができる。また、１，４－ジオキサンのみならず、１，３－ジオキソラン、２－メチル－１，３－ジオキソラン、２－クロロメチル－１，３－ジオキソラン、テトラヒドロフラン等の環状エーテル、ジクロロメタン、１，２－ジクロロエタン、クロロエチレン、１，１－ジクロロエチレン、シス－１，２－ジクロロエチレン、１，２－ジクロロプロパン、１，３－ジクロロプロペン、１，１，２－トリクロロエタン、トリクロロエチレン等の有機塩素化合物を分解することができる。
【0020】
・粉末製剤の製造方法
本発明の粉末製剤の製造方法は特に制限されず、公知の方法を用いることができる。これらの中で、流動層乾燥装置を用いて製造することが好ましい。具体的には、流動層乾燥装置を用いて、流動層中で分散している粉末状の基体に１，４－ジオキサン分解菌を含む懸濁液を噴霧し、ジオキサン分解活性を維持したまま乾燥させる工程により、製造することが好ましい。この際、粉末状の基体を流動層中で分散しながら高温に加熱して基体を殺菌した後に、懸濁液を噴霧することが好ましい。
本発明の粉末製剤の製造方法は特に制限されず、公知の方法を用いることができる。これらの中で、流動層乾燥装置を用いて製造することが好ましい。具体的には、流動層乾燥装置を用いて、流動層中で分散している粉末状の基体に１，４－ジオキサン分解菌を含む懸濁液を噴霧し、ジオキサン分解活性を維持したまま乾燥させる工程により、製造することが好ましい。この際、粉末状の基体を流動層中で分散しながら高温に加熱して基体を殺菌した後に、懸濁液を噴霧することが好ましい。
【0021】
乾燥は、粉末製剤の水分率が７重量％以上１３重量％以下となるように行うことが好ましい。粉末製剤の水分率がこの範囲内であると、粉末製剤の密度を小さくなり、また、ジオキサン分解活性を維持しながら、単位重量あたりのジオキサン分解菌の含有割合を多くすることができ、さらに、粉末製剤を長期保存した後もジオキサン分解活性を比較的高く維持することができる。粉末製剤の水分率は、８重量％以上１２重量％以下であることがより好ましい。
乾燥温度は特に制限されないが、例えば、入口温度５０℃～９５℃、出口温度２０℃～６０℃であることが好ましい。このような温度条件であれば、熱による菌体の減少を防ぎながらも、乾燥時間を短縮でき、また、所望の水分率を保った粉末製剤を得ることが容易となる。
乾燥温度は特に制限されないが、例えば、入口温度５０℃～９５℃、出口温度２０℃～６０℃であることが好ましい。このような温度条件であれば、熱による菌体の減少を防ぎながらも、乾燥時間を短縮でき、また、所望の水分率を保った粉末製剤を得ることが容易となる。
【0022】
・生分解処理方法
本発明の生分解処理方法は、この粉末製剤を用いることを特徴とする。
生分解処理対象としては、有機化合物を含む地下水、工場排水等の汚染水、不法廃棄サイトの汚染土壌等が挙げられる。なお、汚染土壌を浄化する場合は、土壌を予め水で洗浄し、処理対象である有機化合物を水相に移行させて汚染水として処理することが好ましい。
粉末製剤は、汚染水処理施設の曝気槽に直接投入することもでき、粉末製剤は通過できないが、通水可能な不織布等からなる袋に封入して投入することもできる。さらに、この粉末製剤を用いて小型の培養槽等で分解菌を培養し、その培養液を投入することもできる。
本発明の生分解処理方法は、この粉末製剤を用いることを特徴とする。
生分解処理対象としては、有機化合物を含む地下水、工場排水等の汚染水、不法廃棄サイトの汚染土壌等が挙げられる。なお、汚染土壌を浄化する場合は、土壌を予め水で洗浄し、処理対象である有機化合物を水相に移行させて汚染水として処理することが好ましい。
粉末製剤は、汚染水処理施設の曝気槽に直接投入することもでき、粉末製剤は通過できないが、通水可能な不織布等からなる袋に封入して投入することもできる。さらに、この粉末製剤を用いて小型の培養槽等で分解菌を培養し、その培養液を投入することもできる。
【0023】
生分解処理する有機化合物としては、１，４－ジオキサン分解菌が分解できる有機化合物であれば特に制限されない。例えば、１，４－ジオキサン、１，３－ジオキソラン、２－メチル－１，３－ジオキソラン、テトラヒドロフラン等の環状エーテル、ジクロロメタン、１，２－ジクロロエタン、クロロエチレン、１，１－ジクロロエチレン、シス－１，２－ジクロロエチレン、１，２－ジクロロプロパン、１，３－ジクロロプロペン、１，１，２－トリクロロエタン、トリクロロエチレン等の有機塩素化合物、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４－ブタンジオール等が挙げられる。
【実施例】
【0024】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【0025】
「実験１（Ｄ１７株）」
２ｋＬ培養槽に培地（グリセリン４ｇ／Ｌ、ＣＳＬ：１０ｇ／Ｌ、酵母エキス：２ｇ／Ｌ、消泡剤ＳＩ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ５．５）を１２００Ｌ仕込み、１２１℃で６０分間滅菌した。植菌液として、ＰＣＶ（Ｐａｃｋｅｄ Ｃｅｌｌ Ｖｏｌｕｍｅ）０．５５ｍｌ／１０ｍｌであるPseudonocardia sp.D17（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０１９２７、以下、Ｄ１７株ともいう）培養液５０Ｌを用い、培養温度３０℃、攪拌４０ｒｐｍ、通気量４００Ｌ／ｍｉｎ、内圧０．０５Ｍｐａで７日間培養を実施した。培養終了時のＰＣＶは０．８ｍｌ／１０ｍｌ、ＤＣＷ（Ｄｒｙ Ｃｅｌｌ Ｗｅｉｇｈｔ）は７．２ｇ／Ｌであった。
培養終了後、攪拌、通気、ジャケット冷却を止め、酸・アルカリポットよりエアーを吹込んで内圧０．０５ＭＰａを維持した状態で５時間静置し、培養槽に設置してある目盛り板の２５０Ｌ部分まで上清を抜出した。その後、３０分ほど５０ｒｐｍで攪拌しながらスパージャーよりエアーを流し、沈殿物を均一に分散させてから、目開き０．８５ｍｍ篩を通しながらブロスアウトし、菌体濃縮液（２６０ｋｇ）を得た。元の培養液量を１２００Ｌとすると濃縮倍率は４．６倍であった。
２ｋＬ培養槽に培地（グリセリン４ｇ／Ｌ、ＣＳＬ：１０ｇ／Ｌ、酵母エキス：２ｇ／Ｌ、消泡剤ＳＩ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ５．５）を１２００Ｌ仕込み、１２１℃で６０分間滅菌した。植菌液として、ＰＣＶ（Ｐａｃｋｅｄ Ｃｅｌｌ Ｖｏｌｕｍｅ）０．５５ｍｌ／１０ｍｌであるPseudonocardia sp.D17（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０１９２７、以下、Ｄ１７株ともいう）培養液５０Ｌを用い、培養温度３０℃、攪拌４０ｒｐｍ、通気量４００Ｌ／ｍｉｎ、内圧０．０５Ｍｐａで７日間培養を実施した。培養終了時のＰＣＶは０．８ｍｌ／１０ｍｌ、ＤＣＷ（Ｄｒｙ Ｃｅｌｌ Ｗｅｉｇｈｔ）は７．２ｇ／Ｌであった。
培養終了後、攪拌、通気、ジャケット冷却を止め、酸・アルカリポットよりエアーを吹込んで内圧０．０５ＭＰａを維持した状態で５時間静置し、培養槽に設置してある目盛り板の２５０Ｌ部分まで上清を抜出した。その後、３０分ほど５０ｒｐｍで攪拌しながらスパージャーよりエアーを流し、沈殿物を均一に分散させてから、目開き０．８５ｍｍ篩を通しながらブロスアウトし、菌体濃縮液（２６０ｋｇ）を得た。元の培養液量を１２００Ｌとすると濃縮倍率は４．６倍であった。
【0026】
・凍結乾燥
菌体濃縮液８０ｇに基体（サナス２００２、株式会社サナス製、水溶性デキストリン、公称目開き０．５ｍｍの篩を８０質量％以上通過）１５ｇを加えて、固形分濃度を２００ｇ／ｋｇにして、凍結乾燥用の試料とした。これを冷凍庫（－２０℃）で凍らせた後、凍結乾燥機（ＦＤＵ－２１００、東京理化器機株式会社製）を用いて粉末化し、粉末製剤（凍結）を得た。
・噴霧乾燥
菌体濃縮液９ｋｇに基体（サナス２００２）、１．６２ｋｇを加えて、固形分濃度を２００ｇ／ｋｇにして、噴霧乾燥用の試料とした。噴霧乾燥装置（Ｌ－１２型スプレードライヤー、大川原化工機株式会社製）に噴霧しながら、入口温度：１６５℃、出口温度：６５℃で９０分乾燥を行い、粉末製剤（噴霧）を得た。
・流動層乾燥
流動層乾燥装置（ＦＬＯ－１２０、フロイント産業株式会社製）に、基体としてコーンスターチ（コーンスターチＩＰＹ、日本食品化工株式会社製、公称目開き０．５ｍｍの篩を８０質量％以上通過）を３６ｋｇ投入した。流動層中で基体を分散させながら、菌体濃縮液（３６ｋｇ）を連続的に噴霧、入口温度：６２－８６℃、出口温度：３２－４７℃で８５分乾燥を行い、粉末製剤（流動層乾燥）を得た。
菌体濃縮液８０ｇに基体（サナス２００２、株式会社サナス製、水溶性デキストリン、公称目開き０．５ｍｍの篩を８０質量％以上通過）１５ｇを加えて、固形分濃度を２００ｇ／ｋｇにして、凍結乾燥用の試料とした。これを冷凍庫（－２０℃）で凍らせた後、凍結乾燥機（ＦＤＵ－２１００、東京理化器機株式会社製）を用いて粉末化し、粉末製剤（凍結）を得た。
・噴霧乾燥
菌体濃縮液９ｋｇに基体（サナス２００２）、１．６２ｋｇを加えて、固形分濃度を２００ｇ／ｋｇにして、噴霧乾燥用の試料とした。噴霧乾燥装置（Ｌ－１２型スプレードライヤー、大川原化工機株式会社製）に噴霧しながら、入口温度：１６５℃、出口温度：６５℃で９０分乾燥を行い、粉末製剤（噴霧）を得た。
・流動層乾燥
流動層乾燥装置（ＦＬＯ－１２０、フロイント産業株式会社製）に、基体としてコーンスターチ（コーンスターチＩＰＹ、日本食品化工株式会社製、公称目開き０．５ｍｍの篩を８０質量％以上通過）を３６ｋｇ投入した。流動層中で基体を分散させながら、菌体濃縮液（３６ｋｇ）を連続的に噴霧、入口温度：６２－８６℃、出口温度：３２－４７℃で８５分乾燥を行い、粉末製剤（流動層乾燥）を得た。
【0027】
１，４－ジオキサンを１２０ｍｇ／Ｌ濃度で含む無機塩培地２０ｍＬに、０．２ｇの菌体濃縮液を添加し、３０℃にて回転振盪培養を行った。
また、菌体濃縮液０．２ｇと菌体重量が同一となるように調整した粉末製剤を用いた以外は同様にして、回転浸透培養を行った。
培地をサンプリングし、ヘッドスペースガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ－ＱＰ２０１０ ＰＬＵＳ、ＴＵＲＢＯＭＡＴＲＩＸ ＨＳ４０、株式会社島津製作所製、以下、ＧＣ／ＭＳという。）を用いてジオキサン濃度を測定した。結果を図１に示す。
また、菌体濃縮液０．２ｇと菌体重量が同一となるように調整した粉末製剤を用いた以外は同様にして、回転浸透培養を行った。
培地をサンプリングし、ヘッドスペースガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ－ＱＰ２０１０ ＰＬＵＳ、ＴＵＲＢＯＭＡＴＲＩＸ ＨＳ４０、株式会社島津製作所製、以下、ＧＣ／ＭＳという。）を用いてジオキサン濃度を測定した。結果を図１に示す。
【0028】
全ての粉末製剤が、菌体濃縮液に劣るものの、ジオキサン分解活性を示した。特に、粉末製剤（流動層乾燥）は、５日目までの分解能は他の粉末製剤と同等であったが、５日目以降から他の粉末製剤よりも優れた分解活性を示した。
【0029】
「実験２（Ｎ２３株）」
１０Ｌ容量の培養槽に６Ｌの培地（グリセリン：４ｇ／Ｌ、ＣＳＬ：１０ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、消泡剤ＳＩ０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ５．５）を仕込み、１２１℃で２０分間滅菌した。植菌液として、ＰＣＶ０．３ｍｌ／１０ｍｌのＮ２３株培養液１５０ｍｌを用い、培養温度３０℃、攪拌速度２００ｒｐｍ、通気量２Ｌ／ｍｉｎ、内圧０．０５ＭＰａで７日間培養した。培養終了時のＰＣＶは０．４ｍｌ／１０ｍｌ、ＤＣＷは５．８ｇ／Ｌであった。
培養液４４３６．７ｇを抜出し、６℃の低温室で４時間静置し、上清を破棄して、目開き０．８５ｍｍ篩を通し、Ｎ２３株濃縮液８８７．３ｇを得た。
１０Ｌ容量の培養槽に６Ｌの培地（グリセリン：４ｇ／Ｌ、ＣＳＬ：１０ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、消泡剤ＳＩ０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ５．５）を仕込み、１２１℃で２０分間滅菌した。植菌液として、ＰＣＶ０．３ｍｌ／１０ｍｌのＮ２３株培養液１５０ｍｌを用い、培養温度３０℃、攪拌速度２００ｒｐｍ、通気量２Ｌ／ｍｉｎ、内圧０．０５ＭＰａで７日間培養した。培養終了時のＰＣＶは０．４ｍｌ／１０ｍｌ、ＤＣＷは５．８ｇ／Ｌであった。
培養液４４３６．７ｇを抜出し、６℃の低温室で４時間静置し、上清を破棄して、目開き０．８５ｍｍ篩を通し、Ｎ２３株濃縮液８８７．３ｇを得た。
【0030】
流動層乾燥装置（パルビスミニベッド、ヤマト科学株式会社製）に、下記に示す各基体（いずれも公称目開き０．５ｍｍの篩を８０質量％以上通過）を１５０ｇ投入した。流動層中で基体を分散させながら、Ｎ２３株濃縮液（１５０ｇ）を連続的に噴霧、入口温度：９０－９６℃、出口温度：２０－２５℃で１２０分間乾燥を行い、粉末製剤を得た。
・基体
コーンスターチ（コーンスターチＩＰＹ、日本食品化工株式会社製）
大豆タンパク（ソイプロ、株式会社Ｊ－オイルミルズ製）
セルロース（粉末セルロース、ナカライテスク株式会社製）
珪藻土（ラヂオライト♯３０００、昭和化学工業株式会社製）
活性白土（ナカライテスク株式会社製）
・基体
コーンスターチ（コーンスターチＩＰＹ、日本食品化工株式会社製）
大豆タンパク（ソイプロ、株式会社Ｊ－オイルミルズ製）
セルロース（粉末セルロース、ナカライテスク株式会社製）
珪藻土（ラヂオライト♯３０００、昭和化学工業株式会社製）
活性白土（ナカライテスク株式会社製）
【0031】
１，４－ジオキサンを１２０ｍｇ／Ｌ濃度で含む無機塩培地２０ｍＬに、０．２ｇのＮ２３株濃縮液を添加し、３０℃にて回転振盪培養を行った。
また、Ｎ２３株濃縮液と菌体重量が同一となるように調整した粉末製剤を用いた以外は同様にして、回転浸透培養を行った。
培地をサンプリングし、ＧＣ／ＭＳを用いてジオキサン濃度を測定した。結果を図２に示す。
また、Ｎ２３株濃縮液と菌体重量が同一となるように調整した粉末製剤を用いた以外は同様にして、回転浸透培養を行った。
培地をサンプリングし、ＧＣ／ＭＳを用いてジオキサン濃度を測定した。結果を図２に示す。
【0032】
コーンスターチ、大豆タンパクを基体とする粉末製剤は、１，４－ジオキサン濃度の低減が遅かった。また、８８時間後には雑菌の繁殖が確認できたため、以後のジオキサン濃度測定と培養を中止した。このことから、コーンスターチ、大豆タンパクを基体とする粉末製剤は、雑菌が繁殖しやすく、Ｎ２３株の活動が抑えられることが示唆された。
セルロース、珪藻土、活性白土を基体とする粉末製剤は、ジオキサン分解活性が認められた。珪藻土、活性白土を基体とする粉末製剤は、菌体濃縮液と同等の分解能であったが、セルロースを基体とする粉末製剤は、菌体濃縮液よりも高い分解活性を示した。
セルロース、珪藻土、活性白土を基体とする粉末製剤は、ジオキサン分解活性が認められた。珪藻土、活性白土を基体とする粉末製剤は、菌体濃縮液と同等の分解能であったが、セルロースを基体とする粉末製剤は、菌体濃縮液よりも高い分解活性を示した。
【図1】
【図2】
