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特許7553030ジヒドロインドリジノン誘導体を用いたインスリン産生細胞の作製法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-09
(45)【発行日】2024-09-18
(54)【発明の名称】ジヒドロインドリジノン誘導体を用いたインスリン産生細胞の作製法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0735 20100101AFI20240910BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240910BHJP
A61K 35/39 20150101ALI20240910BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20240910BHJP
A61K 38/28 20060101ALI20240910BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240910BHJP
A61P 5/50 20060101ALI20240910BHJP
A61K 31/437 20060101ALN20240910BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240910BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0735
C12N5/10
A61K35/39
A61K35/545
A61K38/28
A61P3/10
A61P5/50
A61K31/437
C12N15/12
【請求項の数】
21
(21)【出願番号】P 2021530701
(86)(22)【出願日】2020-07-07
(86)【国際出願番号】 JP2020026543
(87)【国際公開番号】W WO2021006268
(87)【国際公開日】2021-01-14
【審査請求日】2023-04-07
(31)【優先権主張番号】P 2019126861
(32)【優先日】2019-07-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学
(73)【特許権者】
【識別番号】307010166
【氏名又は名称】第一三共株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100107870
【弁理士】
【氏名又は名称】野村 健一
(74)【代理人】
【識別番号】100098121
【弁理士】
【氏名又は名称】間山 世津子
(72)【発明者】
【氏名】粂 昭苑
(72)【発明者】
【氏名】白木 伸明
(72)【発明者】
【氏名】矢野 辰也
(72)【発明者】
【氏名】木方 俊宏
【審査官】長谷川 莉慧霞
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／１７８３９７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／１４２８８３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００９／１３２０６８（ＷＯ，Ａ２）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／００３１８７９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】NAKASHIMA R. et al.，Neural cells play an inhibitory role in pancreatic differentiation of pluripotent stem cells，Genes to Cells，2015年12月，Vol.20, No.12，pp.1028-1045
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
多能性幹細胞をインスリン産生細胞に分化させることによりインスリン産生細胞を作製する方法であって、多能性幹細胞から誘導された原始腸管細胞、膵臓前駆細胞、および膵内分泌前駆細胞から選択される少なくとも一つの細胞を一般式（Ｉ）【化1】
Ｒ１：水素原子、ハロゲン原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基
Ｒ２：水素原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基
Ｒ３：置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいＣ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、または置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル基
置換基群α：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいフェノキシ基、置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいフェニル基、および置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいベンゾイル基
置換基群β：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
ｎ：０、または１
Ａ：下記式（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかで表される基
【化2】
・および＊：結合手を示し、・は一般式（Ｉ）のアミド基の窒素原子に結合し、＊はＲ３に結合する
Ｒ４：水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、または（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
Ｒ５：水素原子、ハロゲン原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基
Ｙ：ＮまたはＣＨ）]
で表される化合物またはその塩を含む培地で三次元培養する工程を含むことを特徴とするインスリン産生細胞の作製法。
【請求項2】
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジハロゲノ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、置換基群α１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群α１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする請求項１に記載のインスリン産生細胞の作製法。置換基群α１：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、５もしくは６員環非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β１：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
【請求項3】
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジハロゲノ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、置換基群α２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする請求項１に記載のインスリン産生細胞の作製法。置換基群α２：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、５もしくは６員環非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β２：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、およびＣ１－Ｃ６アルコキシ基
置換基群γ２：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
【請求項4】
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ８シクロアルケン－１－イル基、置換基群α３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする請求項１に記載のインスリン産生細胞の作製法。置換基群α３：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ２アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ２アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ２アルコキシＣ１－Ｃ２アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ４アルコキシ基、モルホリン－１－イル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ２アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β３：フッ素原子、塩素原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、およびＣ１－Ｃ４アルコキシ基
置換基群γ３：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４アルキル）カルボニル基、および（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニル基
【請求項5】
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ１が水素原子、塩素原子、またはメチル基であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
【請求項6】
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ２が水素原子、またはメチル基であることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
【請求項7】
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉ）で表される基であって、Ｒ４が水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、または（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基であることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
【請求項8】
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ４が水素原子、メチル基、またはトリフルオロメチル基であることを特徴とする請求項７に記載のインスリン産生細胞の作製法。
【請求項9】
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉｉ）で表される基であって、Ｒ５が水素原子、ハロゲン原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基であることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
【請求項10】
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ５が水素原子、フッ素原子、またはメチル基であることを特徴とする請求項９に記載のインスリン産生細胞の作製法。
【請求項11】
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉｉｉ）で表される基であって、Ｒ５が水素原子、フッ素原子、またはメチル基であることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
【請求項12】
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉｖ）で表される基であることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
【請求項13】
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるｎが１であることを特徴とする請求項１～１２のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
【請求項14】
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３が２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソリル基、１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－４－イル基、またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基であることを特徴とする請求項１～１３のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
【請求項15】
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がフェニル基またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より選択されるいずれか１つの置換基でｍ位またはｐ位が置換されたフェニル基であることを特徴とする請求項１～１３のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
【請求項16】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、以下の化合物群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載のインスリン産生細胞の作製法。【化3】
【請求項17】
多能性幹細胞が、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である請求項１に記載のインスリン産生細胞の作製法。
【請求項18】
三次元培養が低接着性または非接着性の培養容器内で行われることを特徴とする請求項１に記載のインスリン産生細胞の作製法。
【請求項19】
多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化過程が以下の工程１～５を含み、工程３、工程４および工程５からなる群から選択される少なくとも一つの工程において、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を培養することを特徴とする請求項１～１８のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法工程１：多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導する工程、
工程２：胚体内胚葉細胞から原始腸管細胞を誘導する工程、
工程３：原始腸管細胞から膵臓前駆細胞を誘導する工程、
工程４：膵臓前駆細胞から膵内分泌前駆細胞を誘導する工程、および
工程５：膵内分泌前駆細胞からインスリン産生細胞を誘導する工程。
【請求項20】
工程３、工程４および工程５において、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を培養することを特徴とする請求項１９に記載のインスリン産生細胞の作製法。
【請求項21】
工程1において、メチオニン除去培地による前処理をした多能性幹細胞を用いることを特徴とする 請求項１９に記載のインスリン産生細胞の作製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、三次元培養により、多能性幹細胞からインスリン産生細胞を作製する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
糖尿病は、様々な遺伝要因や環境要因を背景として発症し、慢性的な高血糖により腎症などの合併症が惹起された結果、患者のＱＯＬを著しく低下させる重篤な疾患である。現在、世界の糖尿病患者数は４億人を超え、医療経済的にも問題視されている。糖尿病は大きく１型および２型糖尿病に分類されるが、何れの病態においても、インスリン分泌機能を有する膵β細胞の喪失が大きな原因である。１型糖尿病や膵β細胞の喪失が著しい重篤な２型糖尿病の治療法としてはインスリン製剤の投与が一般的な手段となっているが、低血糖などの副作用や頻回の自己注射が必要とされるなど問題点が多い。近年、臓器提供者から単離した膵島細胞の１型糖尿病患者への移植が可能となり、インスリン治療を代替し糖尿病の完全寛解を可能とする治療法として期待されている。しかしながら、膵島ドナーの不足により普及が困難な状況であるため、多能性幹細胞からインスリン産生細胞を大量に作製するための技術の早急な実現化が望まれている。
【0003】
多能性幹細胞からインスリン産生細胞を作製するための技術としては、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から下式に記載の化合物を用いて５段階から７段階の工程を経てインスリン産生細胞へ分化誘導する方法が報告されている（特許文献１、非特許文献１，２，３，４，５）。Ｓｈａｈｊａｌａｌらの方法（特許文献１、非特許文献４）では、ステップワイズに５段階の分化工程を経てヒトｉＰＳ細胞からインスリン産生細胞を作製できる。まず、ｉＰＳ細胞を維持培地中で増殖させた後、ステージ１では、アクチビンＡやＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９２０１を含む培地で数日間培養しＳｏｘ１７陽性の胚体内胚葉細胞へと誘導させる。ステージ２では、胚体内胚葉細胞にＦＧＦ１０やソニックヘッジホッグ阻害剤ＫＡＡＤ－シクロパミンを数日間処置し、Ｆｏｘａ２陽性の原始腸管細胞へと誘導する。更に、ステージ３において、原始腸管細胞をレチノイン酸、ＫＡＡＤ－シクロパミン、ＴＧＦβ受容体キナーゼ阻害剤ＳＢ４３１５４２やＢＭＰシグナル阻害因子Ｎｏｇｇｉｎを含む培地で数日処置し、ＰＤＸ１陽性の膵臓前駆細胞へと分化誘導させる。ステージ４では、膵臓前駆細胞に対してプロテインキナーゼＣ活性化剤インドラクタムＶ、ＴＧＦβ受容体キナーゼ阻害剤であるＡＬＫ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩやＮｏｇｇｉｎで刺激を与え、Ｎｇｎ３陽性の膵内分泌前駆細胞へと誘導する。最終段階のステージ５において、膵内分泌前駆細胞をＧＬＰ－１受容体アゴニストやニコチンアミドを含有する培地で数日間培養することにより、インスリン産生細胞が得られる。
【0004】
【化1】
【0005】
さらに下式に記載される化合物を用いた報告もある。上述の分化培養において使用されるＮｏｇｇｉｎの代わりに低分子阻害剤ＬＤＮ１９３１８９、ＫＡＡＤ－シクロパミンの代わりにＳＡＮＴ－１（非特許文献２、６）やＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎが使用される場合がある（非特許文献５）。また、分化培養最終工程では、ＦｏｒｓｋｏｌｉｎやＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅが分化誘導剤として使用される場合がある（非特許文献５）。その他、ＡＸＬ阻害剤Ｒ４２８が、インスリン産生細胞の機能成熟化を促進すること（非特許文献３）、ＡＫＴ阻害剤ＡＴ７８６７が、ＰＤＸ－１陽性の膵前駆細胞の増殖を促進する化合物として報告されている（非特許文献７）。
【0006】
【化2】
【0007】
多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞を細胞治療に応用するためには、細胞機能の安定性と製造法の効率性が重要である。細胞機能の安定性については、得られたインスリン産生細胞における高グルコースに応答してインスリン分泌する能力やインスリンの分泌動態が、実験毎に再現性良く、一定の能力を示すことであるが、従来の方法で得られた細胞では、製造ロットや細胞株によって、これらの能力が変動し、安定した品質の確保が困難であるとの問題がある。製造法の効率性については、従来の方法では、分化誘導できるインスリン産生細胞の数が少ないことによりコスト効率が悪いという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】国際出願公開第２０１５／１７８３９７号パンフレット
【非特許文献】
【0009】
【文献】Ｋｒｏｏｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｇｌｕｃｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２６： ４４３－４５２， ２００８．
【文献】Ｐａｇｌｉｕｃａ Ｆ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ β ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｃｅｌｌ，１５９：４２８－４３９，２０１４．
【文献】Ｒｅｚａｎｉａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２：１１２２－１１３３，２０１４．
【文献】Ｓｈａｈｊａｌａｌ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ β－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｄｅｆｉｎｅｄ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６：３９４－４０８，２０１４．
【文献】Ｋｕｎｉｓａｄａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８：２７４－２８４，２０１２．
【文献】Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｒ．ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌｓ ｐｌａｙ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，２０：１０２８－１０４５，２０１５．
【文献】Ｋｉｍｕｒａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＡＴ７８６７ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｓ ＰＤＸ１－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４：６１－６８，２０１７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の課題は、従来の技術では困難であった幹細胞からインスリン産生細胞への高い分化の効率性を達成する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩が多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を促進する顕著な効果を有すること、また、それら化合物またはその塩がインスリン産生細胞の製造に有用であることを見出し、本発明を完成させた。一般式（Ｉ）で表される化合物は、既知の分化誘導剤とは全く異なる新規構造を有しており、分化過程の後半のステップにおいて、既知の分化促進化合物や増殖因子に上乗せして更に分化誘導効率を高める効果を発揮する。
【0012】
すなわち、本発明は以下に説明する[１]～[２１]に関する。
[１]
多能性幹細胞をインスリン産生細胞に分化させることによりインスリン産生細胞を作製する方法であって、一般式（Ｉ）
[１]
多能性幹細胞をインスリン産生細胞に分化させることによりインスリン産生細胞を作製する方法であって、一般式（Ｉ）
【0013】
【化3】
Ｒ１：水素原子、ハロゲン原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基
Ｒ２：水素原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基
Ｒ３：置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいＣ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、または置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル基
置換基群α：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいフェノキシ基、置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいフェニル基、および置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいベンゾイル基
置換基群β：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
ｎ：０、または１
Ａ：下記式（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかで表される基
【0014】
【化4】
【0015】
（式中、各置換基は以下のように定義される。
・および＊：結合手を示し、・は一般式（Ｉ）のアミド基の窒素原子に結合し、＊はＲ３に結合する
Ｒ４：水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、または（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
Ｒ５：水素原子、ハロゲン原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基
Ｙ：ＮまたはＣＨ）]
で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を三次元培養する工程を含むことを特徴とするインスリン産生細胞の作製法。
[２]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジハロゲノ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、置換基群α１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群α１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする[１]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
置換基群α１：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、５もしくは６員環非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β１：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
[３]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジハロゲノ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、置換基群α２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする[１]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
置換基群α２：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、５もしくは６員環非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β２：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、およびＣ１－Ｃ６アルコキシ基
置換基群γ２：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
[４]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ８シクロアルケン－１－イル基、置換基群α３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする[１]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
置換基群α３：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ２アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ２アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ２アルコキシＣ１－Ｃ２アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ４アルコキシ基、モルホリン－１－イル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ２アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β３：フッ素原子、塩素原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、およびＣ１－Ｃ４アルコキシ基
置換基群γ３：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４アルキル）カルボニル基、および（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニル基
[５]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ１が水素原子、塩素原子、またはメチル基であることを特徴とする[１]～[４]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[６]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ２が水素原子、またはメチル基であることを特徴とする[１]～[５]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[７]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉ）で表される基であって、Ｒ４が水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、または（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基であることを特徴とする[１]～[６]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[８]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ４が水素原子、メチル基、またはトリフルオロメチル基であることを特徴とする[７]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[９]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉｉ）で表される基であって、Ｒ５が水素原子、ハロゲン原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基であることを特徴とする[１]～[６]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１０]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ５が水素原子、フッ素原子、またはメチル基であることを特徴とする[９]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１１]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉｉｉ）で表される基であって、Ｒ５が水素原子、フッ素原子、またはメチル基であることを特徴とする[１]～[６]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１２]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉｖ）で表される基であることを特徴とする[１]～[６]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１３]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるｎが１であることを特徴とする[１]～[１２]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１４]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３が２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソリル基、１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－４－イル基、またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基であることを特徴とする[１]～[１３]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１５]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がフェニル基またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より選択されるいずれか１つの置換基でｍ位またはｐ位が置換されたフェニル基であることを特徴とする[１]～[１３]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１６]
一般式（Ｉ）で表される化合物が、以下の化合物群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする[１]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
・および＊：結合手を示し、・は一般式（Ｉ）のアミド基の窒素原子に結合し、＊はＲ３に結合する
Ｒ４：水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、または（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
Ｒ５：水素原子、ハロゲン原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基
Ｙ：ＮまたはＣＨ）]
で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を三次元培養する工程を含むことを特徴とするインスリン産生細胞の作製法。
[２]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジハロゲノ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、置換基群α１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群α１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする[１]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
置換基群α１：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、５もしくは６員環非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β１：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
[３]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジハロゲノ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、置換基群α２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする[１]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
置換基群α２：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、５もしくは６員環非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β２：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、およびＣ１－Ｃ６アルコキシ基
置換基群γ２：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
[４]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ８シクロアルケン－１－イル基、置換基群α３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする[１]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
置換基群α３：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ２アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ２アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ２アルコキシＣ１－Ｃ２アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ４アルコキシ基、モルホリン－１－イル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ２アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β３：フッ素原子、塩素原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、およびＣ１－Ｃ４アルコキシ基
置換基群γ３：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４アルキル）カルボニル基、および（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニル基
[５]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ１が水素原子、塩素原子、またはメチル基であることを特徴とする[１]～[４]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[６]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ２が水素原子、またはメチル基であることを特徴とする[１]～[５]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[７]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉ）で表される基であって、Ｒ４が水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、または（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基であることを特徴とする[１]～[６]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[８]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ４が水素原子、メチル基、またはトリフルオロメチル基であることを特徴とする[７]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[９]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉｉ）で表される基であって、Ｒ５が水素原子、ハロゲン原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基であることを特徴とする[１]～[６]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１０]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ５が水素原子、フッ素原子、またはメチル基であることを特徴とする[９]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１１]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉｉｉ）で表される基であって、Ｒ５が水素原子、フッ素原子、またはメチル基であることを特徴とする[１]～[６]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１２]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉｖ）で表される基であることを特徴とする[１]～[６]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１３]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるｎが１であることを特徴とする[１]～[１２]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１４]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３が２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソリル基、１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－４－イル基、またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基であることを特徴とする[１]～[１３]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１５]
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がフェニル基またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より選択されるいずれか１つの置換基でｍ位またはｐ位が置換されたフェニル基であることを特徴とする[１]～[１３]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１６]
一般式（Ｉ）で表される化合物が、以下の化合物群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする[１]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
【0016】
【化5】
多能性幹細胞が、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である[１]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
［１８］
三次元培養が低接着性または非接着性の培養容器内で行われることを特徴とする[１]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１９]
多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化過程が以下の工程１～５を含み、工程３、工程４および工程５からなる群から選択される少なくとも一つの工程において、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を培養することを特徴とする[１]～[１８]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法
工程１：多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導する工程、
工程２：胚体内胚葉細胞から原始腸管細胞を誘導する工程、
工程３：原始腸管細胞から膵臓前駆細胞を誘導する工程、
工程４：膵臓前駆細胞から膵内分泌前駆細胞を誘導する工程、および
工程５：膵内分泌前駆細胞からインスリン産生細胞を誘導する工程。
[２０]
工程３、工程４および工程５において、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を培養することを特徴とする[１９]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
［２１］
工程1において、メチオニン除去培地による前処理をした多能性幹細胞を用いることを特徴とする [１９]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[２２]
[１]～[２１]のいずれか１項に記載の方法で作製された多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞。
[２３]
[１]～[２１]のいずれか１項に記載の方法で作製された多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞を含むインスリン分泌異常又はインスリン分泌不全に起因する疾患の治療薬。
[２４]
インスリン分泌異常又はインスリン分泌不全に起因する疾患が、１型糖尿病又は２型糖尿病である[２３]に記載の治療薬。
【0017】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2019-126861の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【0018】
一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、公知の分化誘導方法と比較し、哺乳類動物由来の多能性幹細胞をインスリン産生細胞へと分化させる際に顕著な効果を有する。したがって、この化合物を使用する本発明の方法は、インスリン産生細胞を効率的に製造することができる。また、本発明の方法は、三次元的に細胞を培養するので、二次元的培養法に比べ、より生体内に近い環境で細胞を培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】β細胞の分化を促進する新規小分子化合物のスクリーニング。ａ）ＳＫ７ ｍＥＳ細胞を使用したβ細胞分化を増強する化合物のスクリーニングのための培養系の概略図。ｂ）β細胞分化促進剤のスクリーニングフローの概要。ｃ）Ｋ－１の化学構造。ｄ）全細胞中のＰｄｘ１－ＧＦＰ＋Ｉｎｓ＋二重陽性細胞の割合に対するＫ－１の効果。ｅ）インスリン１遺伝子発現レベル。ｄ、ｅ）ダネットの多重比較検定で、有意性が＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、または＊＊＊ｐ ＜０．００１として示されている。ｆ）γ－セクレターゼ阻害剤ＬＹ４１１５７５とのＫ－１の相加効果。全細胞数（ＤＡＰＩ＋）に対するＰｄｘ１－ＧＦＰ＋およびインスリン＋二重陽性細胞の割合を計算した。インスリン１ ｍＲＮＡ発現レベルは、Ｈｐｒｔ１発現レベルによって正規化されている。値は３回の実験の平均値±ＳＥＭとして表す。有意性は、片側独立ｔ検定で、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、または＊＊＊ｐ＜０．００１として示されている。
【図2-1】Ｋ－１とその誘導体はヒトｉＰＳ細胞由来β細胞の分化を促進する。ａ）ヒトｉＰＳ細胞株（Ｔｏｅ、ＲＰＣｈｉＰＳ７７１、およびＦｆｌ－０１ｓ０１）を用いたβ細胞分化に対する化合物の有効性を評価するための培養系の概略図。ｂ）Ｔｏｅ ｈｉＰＳ細胞の単層培養におけるＤＭＳＯ対照からの全細胞数中の得られたＩＮＳ＋細胞数の割合における倍率変化。ｃ）ＲＰＣｈｉＰＳＣ７７１ ｉＰＳ細胞を用い、分化プロトコール＃１、スフェア培養下での全細胞中の産生されたＩＮＳ＋ＰＤＸ１＋二重陽性細胞の割合。ｄ）ｉＰＳ由来細胞におけるステージ４の終わり（左）またはステージ５の終わり（右）での分子マーカーの陽性。異なるタイムウィンドウ、即ち、ステージ３（Ｓ３）、ステージ４（Ｓ４）、ステージ５（Ｓ５）、ステージ３＆４（Ｓ３／４）、またはステージ３、４＆５（Ｓ３／４／５）においてＫ－３で処理された。Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０１を使用し、分化プロトコール＃２の下で培養された。ｂ）、ｃ）およびｄ）：有意性は、ダネットの多重比較検定で、有意性が＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、または＊＊＊ｐ＜０．００１として示されている。
【図2-2】Ｋ－１とその誘導体はヒトｉＰＳ細胞由来β細胞の分化を促進する。ｅ）（左）１μＭのＫ－３およびその誘導体または陰性対照で処理したｉＰＳ－β細胞の時間依存的ＧＳＩＳ活性。処理はステージ３および４の間に行った。分化プロトコール＃１の下でスフェア培養を行った。ＲＰＣｈｉＰＳＣ７７１ ｉＰＳ細胞を用いた。測定は、段階的な経時的方法で行った。（右）ステージ３および４の間にＫ－３または陰性対照で処理したｉＰＳ－β細胞のＧＳＩＳ活性をバッチ式で測定した。ｆ）（左）ｉＰＳ－β細胞の時間依存的ＧＳＩＳ活性。ｉＰＳ－β細胞を、ステージ３および４の間に、１μＭのＫ－３、－５、－６および２μＭのＫ－４または陰性対照で処理した。分化プロトコール＃２の下でスフェア培養を行った。Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０１ ｉＰＳ細胞を用いた。測定は、段階的な経時的方法で行った。（右）ステージ３および４の間にＫ－３または陰性対照で処理したｉＰＳ－β細胞のＧＳＩＳ活性をバッチ式で測定した。ｇ）Ｋ－３または陰性対照（ＤＭＳＯ）で処理したｉＰＳ－β細胞の、異なる分泌促進物質（１００ｎＭエキセンディン４、１０μＭグリベンクラミド、および２０ｍＭ ＫＣｌ）に対する応答を試験する。ダネットの多重比較検定で、有意性が＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、または＊＊＊ｐ＜０．００１として示されている。ｅ）左およびｆ）左：有意性は、ダネットの多重比較検定で、有意性が＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、または＊＊＊ｐ＜０．００１として示されている。ｅ）右およびｆ）右およびｇ）：有意性は、片側独立ｔ検定で、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、または＊＊＊ｐ＜０．００１として示されている。
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下に本発明について詳細に説明する。
【0021】
本明細書中では以下に説明する用語を使用する。
【0022】
「ハロゲン原子」：フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子である。
【0023】
「Ｃ１－Ｃ６アルキル基」：炭素数１～６個の直鎖若しくは分枝鎖アルキル基であり、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、２－メチルブチル基、ネオペンチル基、１－エチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、３－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、１－メチルペンチル基、３，３－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、１，１－ジメチルブチル基、または１，２－ジメチルブチル基などである。
【0024】
「アリール基」：炭素数６～１０の単環または２環式芳香族炭素環であって非芳香族ヘテロ環もしくはシクロアルカンと縮合していてもよい。具体的には、例えば、フェニル基、ナフチル基、テトラリニル基、インダニル基、クロマニル基、２，３－ジヒドロベンゾフラニル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシニル基、１，２，３，４－テトラヒドロキノリニル基、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリニル基、インドリニル基、または３，４－ジヒドロ－２Ｈ－１，４－ベンゾオキサジニル基などである。好適にはフェニル基、ナフチル基、または１，３－ベンゾジオキソリル基などである。
【0025】
「Ｃ５－Ｃ１０シクロアルケニル基」：炭素数５～１０の環内に二重結合を１つ有した炭化水素環であり、アルキレン基で架橋されていてもよく、具体的には、例えば、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘプテニル基、シクロオクテニル基、ビシクロ［２．２．１］ヘプテニル基、またはビシクロ［２．２．２］オクテニル基などが挙げられる。
【0026】
「ヘテロシクリル基」：環を構成する原子が炭素以外に窒素、酸素、硫黄から独立して選択される１～４のヘテロ原子によって構成される４～１０員環の基であって、芳香族または非芳香族であってもよく、また非芳香族の場合はアルキレン基によって架橋されていても良い。具体的には、例えば、非芳香族ヘテロシクリル基としてはアゼチジニル基、ピロリジニル基、ピペリジニル基、アゼパニル基、ジアゼパニル基、アゾカニル基、ピペラジニル基、ホモピペラジニル基、モルホリニル基、オキサゼパニル基、チオモルホリニル基、チアゼパニル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロフリル基、ジオキサニル基、ジオキソラニル基、２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル基、２，５－ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプチル基、３－アザビシクロ［３．２．１］オクチル基、８－アザビシクロ［３．２．１］オクチル基、９－アザビシクロ［３．３．１］ノニル基、３，９－ジアザビシクロ［３．３．１］ノニル基、ジヒドロピラニル基、ジヒドロピロリル基、ジヒドロピリジル基、テトラヒドロピリジル基、テトラヒドロピラジル基、３，９－ジアザスピロ［５．５］ウンデカ－３－イル基、１，９－ジアザスピロ［５．５］ウンデカ－９－イル基、１，８－ジアザスピロ［４．５］デカ－８－イル基、または１，４－ジオキサ－８－アザスピロ［４．５］デカ－８－イル基などが挙げられる。芳香族ヘテロシクリル基としてはフリル基、ピロリル基、チエニル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、オキサジアゾリル基、チアジアゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、ピリジル基、ピラジル基、ピリミジル基、ピリダジニル基、トリアジニル基、インドリル基、イソインドリル基、インダゾリル基、プリニル基、キノリル基、イソキノリル基、またはナフチリジニル基などが挙げられる。
【0027】
「Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基」：酸素原子に前記Ｃ１－Ｃ６アルキル基が結合した基であり、具体的には、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、またはイソヘキシルオキシ基などである。
【0028】
「ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基」：前記Ｃ１－Ｃ６アルキル基に１～７個のハロゲン原子が置換した基であり、具体的には、例えば、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、１，１－ジフルオロエチル基、２，２－ジフルオロエチル基、または２，２，２－トリフルオロエチル基などである。
【0029】
「ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基」：前記Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基が１～７個の前記ハロゲン原子で置換された基であり、具体的には、例えば、フルオロメトキシ基、ジフルオロメトキシ基、ジクロロメトキシ基、ジブロモメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、トリクロロメトキシ基、２－フルオロエトキシ基、２－ブロモエトキシ基、２－クロロエトキシ基、２－ヨードエトキシ基、２，２－ジフルオロエトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、２，２，２－トリクロロエトキシ基、ペンタフルオロエトキシ基、３－フルオロプロポキシ基、３－クロロプロポキシ基、４－フルオロブトキシ基、５－フルオロペンチルオキシ基、または６－フルオロヘキシルオキシ基などである。
【0030】
「ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基」：前記Ｃ１－Ｃ６アルキル基に１個のヒドロキシ基が置換した基であり、具体的には、例えば、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、ヒドロキシペンチル基、またはヒドロキシヘキシル基などである。
【0031】
「Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基」：前記Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基に前記Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基が置換した基であり、具体的には、例えば、メトキシメトキシ基、メトキシエトキシ基、メトキシプロポキシ基、エトキシメトキシ基、エトキシエトキシ基、エトキシプロポキシ基、またはプロポキシプロポキシ基などである。
【0032】
「（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基」：カルボニル基に前記Ｃ１－Ｃ６アルキル基が結合した基であり、具体的には、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、またはピバロイル基などが挙げられる。
【0033】
「（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基」：カルボニル基に前記Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基が結合した基であり、具体的には、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ－プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ－ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｓｅｃ－ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、ｎ－ペンチルオキシカルボニル基、イソペンチルオキシカルボニル基、ネオペンチルオキシカルボニル基、ｎ－ヘキシルオキシカルボニル基、またはイソヘキシルオキシカルボニル基などが挙げられる。
【0034】
「（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基」：カルボニルオキシ基に前記Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基が結合した基であり、具体的には、例えば、メトキシカルボニルオキシ基、エトキシカルボニルオキシ基、ｎ－プロポキシカルボニルオキシ基、イソプロポキシカルボニルオキシ基、ｎ－ブトキシカルボニルオキシ基、イソブトキシカルボニルオキシ基、ｓｅｃ－ブトキシカルボニルオキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルオキシ基、ｎ－ペンチルオキシカルボニルオキシ基、イソペンチルオキシカルボニルオキシ基、ネオペンチルオキシカルボニルオキシ基、ｎ－ヘキシルオキシカルボニルオキシ基、またはイソヘキシルオキシカルボニルオキシ基などが挙げられる。
【0035】
「フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基」：前記Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基の任意の位置にフェニル基が置換した基であり、具体的には、例えば、ベンジルオキシ基、１－フェニルエチルオキシ基、２－フェニルエチルオキシ基、１－フェニルプロピルオキシ基、２－フェニルプロピルオキシ基、または３－フェニルプロピルオキシ基などが挙げられる。
【0036】
「１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基」：カルバモイル基、またはカルバモイル基に前記Ｃ１－Ｃ６アルキル基が１つもしくは２つ結合した基であり、具体的には、例えば、カルバモイル基、メチルカルバモイル基、ジメチルカルバモイル基、エチルカルバモイル基、ジエチルカルバモイル基、エチルメチルカルバモイル基、プロピルカルバモイル基、またはジプロピルカルバモイル基などである。
【0037】
「１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基」：前記Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基に前記１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換した基であり、具体的には、例えば、カルバモイルメチルオキシ基、カルバモイルエチルオキシ基、メチルカルバモイルメチルオキシ基、メチルカルバモイルエチルオキシ基、ジメチルカルバモイルメチルオキシ基、ジメチルカルバモイルエチルオキシ基、エチルカルバモイルメチルオキシ基、エチルカルバモイルエチルオキシ基、ジエチルカルバモイルメチルオキシ基、ジエチルカルバモイルエチルオキシ基、エチルメチルカルバモイルメチルオキシ基、エチルメチルカルバモイルエチルオキシ基、プロピルカルバモイルメチルオキシ基、プロピルカルバモイルエチルオキシ基、ジプロピルカルバモイルメチルオキシ基、またはジプロピルカルバモイルエチルオキシ基などである。
【0038】
「１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基」：スルファモイル基に前記Ｃ１－Ｃ６アルキル基が１つもしくは２つ結合した基であり、具体的には、例えばメチルスルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、エチルスルファモイル基、エチルメチルスルファモイル基、ジエチルスルファモイル基、プロピルスルファモイル基、またはジプロピルスルファモイル基などである。
【0039】
「Ｃ１－Ｃ４アルキル基」：炭素数１～４個の直鎖若しくは分枝鎖アルキル基であり、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、またはｔｅｒｔ－ブチル基などである。
【0040】
「Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基」：酸素原子に前記Ｃ１－Ｃ４アルキル基が結合した基であり、具体的には、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、イソブトキシ基、またはｔｅｒｔ－ブトキシ基などである。
【0041】
「Ｃ１－Ｃ２アルキル基」：炭素数１または２個の直鎖アルキル基であり、メチル基およびエチル基である。
【0042】
「ハロゲノＣ１－Ｃ２アルキル基」：前記Ｃ１－Ｃ２アルキル基に１～５個のハロゲン原子が置換した基であり、具体的には、例えば、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、１，１－ジフルオロエチル基、２，２－ジフルオロエチル基、または２，２，２－トリフルオロエチル基などである。
【0043】
「Ｃ１－Ｃ２アルコキシ基」：酸素原子に前記Ｃ１－Ｃ２アルキル基が結合した基であり、具体的には、メトキシ基およびエトキシ基である。
【0044】
「ハロゲノＣ１－Ｃ２アルコキシ基」：前記Ｃ１－Ｃ２アルコキシ基が１～５個の前記ハロゲン原子で置換された基であり、具体的には、例えば、フルオロメトキシ基、ジフルオロメトキシ基、ジクロロメトキシ基、ジブロモメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、トリクロロメトキシ基、２－フルオロエトキシ基、２－ブロモエトキシ基、２－クロロエトキシ基、２－ヨードエトキシ基、２，２－ジフルオロエトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、２，２，２－トリクロロエトキシ基、またはペンタフルオロエトキシ基などである。
【0045】
「ヒドロキシＣ１－Ｃ４アルキル基」：前記Ｃ１－Ｃ４アルキル基に１個のヒドロキシ基が置換した基であり、具体的には、例えば、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、またはヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基などである。
【0046】
「Ｃ１－Ｃ２アルコキシＣ１－Ｃ２アルコキシ基」：前記Ｃ１－Ｃ２アルコキシ基に前記Ｃ１－Ｃ２アルコキシ基が置換した基であり、具体的には、例えば、メトキシメトキシ基、メトキシエトキシ基、エトキシメトキシ基、またはエトキシエトキシ基などである。
【0047】
「（Ｃ１－Ｃ４アルキル）カルボニル基」：カルボニル基に前記Ｃ１－Ｃ４アルキル基が結合した基であり、具体的には、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、またはピバロイル基などが挙げられる。
【0048】
「（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニル基」：カルボニル基に前記Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基が結合した基であり、具体的には、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ－プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ－ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｓｅｃ－ブトキシカルボニル基、またはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基などが挙げられる。
【0049】
「（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニルオキシ基」：カルボニルオキシ基に前記Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基が結合した基であり、具体的には、例えば、メトキシカルボニルオキシ基、エトキシカルボニルオキシ基、ｎ－プロポキシカルボニルオキシ基、イソプロポキシカルボニルオキシ基、ｎ－ブトキシカルボニルオキシ基、イソブトキシカルボニルオキシ基、ｓｅｃ－ブトキシカルボニルオキシ基、またはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルオキシ基などが挙げられる。
【0050】
「フェニルＣ１－Ｃ４アルコキシ基」：前記Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基の任意の位置にフェニル基が置換した基であり、具体的には、例えば、ベンジルオキシ基、１－フェニルエチルオキシ基、２－フェニルエチルオキシ基、１－フェニルプロピルオキシ基、２－フェニルプロピルオキシ基、または３－フェニルプロピルオキシ基などが挙げられる。
【0051】
「１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基」：カルバモイル基、またはカルバモイル基に前記Ｃ１－Ｃ４アルキル基が１つもしくは２つ結合した基であり、具体的には、例えば、カルバモイル基、メチルカルバモイル基、ジメチルカルバモイル基、エチルカルバモイル基、ジエチルカルバモイル基、エチルメチルカルバモイル基、プロピルカルバモイル基、またはジプロピルカルバモイル基などである。
【0052】
「１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ２アルコキシ基」：前記Ｃ１－Ｃ２アルコキシ基に前記１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換した基であり、具体的には、例えば、カルバモイルメチルオキシ基、カルバモイルエチルオキシ基、メチルカルバモイルメチルオキシ基、メチルカルバモイルエチルオキシ基、ジメチルカルバモイルメチルオキシ基、ジメチルカルバモイルエチルオキシ基、エチルカルバモイルメチルオキシ基、エチルカルバモイルエチルオキシ基、ジエチルカルバモイルメチルオキシ基、ジエチルカルバモイルエチルオキシ基、エチルメチルカルバモイルメチルオキシ基、エチルメチルカルバモイルエチルオキシ基、プロピルカルバモイルメチルオキシ基、プロピルカルバモイルエチルオキシ基、ジプロピルカルバモイルメチルオキシ基、またはジプロピルカルバモイルエチルオキシ基などである。
【0053】
「１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されたスルファモイル基」：スルファモイル基に前記Ｃ１－Ｃ４アルキル基が１つもしくは２つ結合した基であり、具体的には、例えばメチルスルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、エチルスルファモイル基、エチルメチルスルファモイル基、ジエチルスルファモイル基、プロピルスルファモイル基、またはジプロピルスルファモイル基などである。
【0054】
「幹細胞」：自己複製能および多分化能を有する細胞であって、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、成体幹細胞などが挙げられる。
【0055】
「多能性幹細胞」：生体の種々の細胞に分化する能力を有する細胞であって、好ましくはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。
【0056】
「インスリン産生細胞」：高血糖などに反応してインスリンを分泌する細胞であって、グルカゴンまたはソマトスタチンなどの他の膵ホルモンに比べてインスリン発現能力が優位に優れている細胞のことである。
【0057】
「三次元培養」：細胞が培養容器に接着しない条件で培養することで、細胞同士の接着により形成されるスフェア（多能性幹細胞では、「胚様体」とも呼ばれる。）の状態で培養することを意味し、本明細書中では、「スフェア培養」と表記する場合もある。
【0058】
＜インスリン細胞の製造法＞
本発明は、多能性幹細胞をインスリン産生細胞に分化させることによりインスリン産生細胞を作製する方法であって、一般式（Ｉ）であらわされる化合物またはその塩を含む培地で細胞を三次元培養する工程を含むことを特徴とするインスリン産生細胞の作製法を提供する。一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩のインスリン産生細胞への分化促進効果は、後述の参考例１や実施例１の方法により確認することができる。
本発明は、多能性幹細胞をインスリン産生細胞に分化させることによりインスリン産生細胞を作製する方法であって、一般式（Ｉ）であらわされる化合物またはその塩を含む培地で細胞を三次元培養する工程を含むことを特徴とするインスリン産生細胞の作製法を提供する。一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩のインスリン産生細胞への分化促進効果は、後述の参考例１や実施例１の方法により確認することができる。
【0059】
対象とする多能性幹細胞は、内胚葉細胞への分化能を有する幹細胞であれば、さまざまな幹細胞を採用できるが、好ましくはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞である。多能性幹細胞の由来は、哺乳動物であれば、さまざまなものを採用することができるが、好ましくは、ヒト、マウス、ラット、イヌやネコなどの愛玩動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどの家畜動物であり、より好ましくはヒトである。
【0060】
多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化過程は、例えば、非特許文献４に記載されるように、５段階に分けられる。すなわち、多能性幹細胞からＳｏｘ１７陽性の胚体内胚葉細胞が誘導されるステージ１、胚体内胚葉細胞からＦｏｘａ２陽性の原始腸管細胞が誘導されるステージ２、原始腸管細胞からＰＤＸ１陽性の膵臓前駆細胞が誘導されるステージ３、膵臓前駆細胞からＮｇｎ３陽性の膵内分泌前駆細胞が誘導されるステージ４、および、膵内分泌前駆細胞から最終的にインスリン産生細胞が誘導されるステージ５である。場合によっては、ステージ１が更に細分化し、中内胚葉細胞の状態となるステージ１－１とその後胚体内胚葉細胞が誘導されるステージ１－２に、ステージ２が更に分化培地中の亜鉛濃度の違いによりステージ２－１とステージ２－２に、ステージ５が更に分化培地中のレチノイン酸濃度の違いによりステージ５－１とステージ５－２に、それぞれ細分化される場合がある。本明細書において、細胞の分化段階の表示にはこれらのステージにより表示する場合がある。
【0061】
これらの培養に用いられる培地としては、通常の細胞培養に用いられる培地であれば特に限定されず、さまざまな培地を用いることができるが、例えばＤＭＥＭ培地、α―ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、ＳｔｅｍＦｉｔ培地（味の素、ＡＫ０３、ＡＫ０３Ｎなど）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ａ１５１７００１）、ＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，８５８５０）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（ｓｔｅｍｇｅｎｔ，０１－０００５）、ＣＭＲＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１１５３００３７）などを採用することができる。培地には、血清を添加しても良く、無血清培地に、ＫＯ―ＳｅｒｕｍやＢ－２７サプリメントのような血清代替物を添加して用いることができる。また、培地には、グルコースなどの糖類、βメルカプトエタノールやビタミンＣなどの抗酸化剤、必須アミノ酸や非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）などの各種アミノ酸類、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋などの各種金属イオン源、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＫＧＦ、ＩＧＦなどの各種成長因子など、通常の細胞培養に用いられる様々な培養補助剤が添加されていても良い。
【0062】
このような分化誘導またはその前処理の培養において、通常の培地組成から、アミノ酸や金属イオンなど、特定の成分の濃度を低減させ、または除去した培地を用いることもできる。例えば、メチオニン除去または低減培地は、多能性幹細胞を短時間（例えば、1時間、５時間、１０時間、２４時間など）の培養処理に用い、処理後の細胞を分化誘導する。また、別の態様においては、亜鉛イオン濃度を低減（例えば、１μM以下、好ましくは０．５μＭ以下）または除去した培地を分化培養工程前半のみ（例えば、ステージ１またはステージ２の少なくとも一部、好ましくはステージ１を含む期間、より好ましくはステージ１のみ、ステージ１～ステージ２の前半部、あるいは、ステージ１～ステージ２の全期間）に用いても良い。このような特定の成分の濃度を調整した培地は、公知の培地組成の情報に基づき、所望の成分を添加しない、または、添加量を低減させることによって作製することができる。また、所望の成分を含有しない培地を入手し、所望の濃度となるように特定の成分を添加することもできる。メチオニン低減または除去培地については例えばＷＯ２０１５／１２５６６２などに基づき作製することができる。実施例において亜鉛除去培地として使用されているＡＫＭ培地については、味の素株式会社バイオ・ファイン研究所から入手した。
【0063】
多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化過程では、各ステージに適したシグナル誘導のための添加剤を含有する培地で培養することによって、分化段階が進行する。以下に、各ステージの培地に用いる添加剤を例示する。このような添加剤は、適切な種類を選択して用いてもよく、該当ステージ用の全ての添加剤を用いても良い。また、前後のステージ用の添加剤を用いても良い。
【0064】
ステージ１では、アクチビン受容体およびＷｎｔシグナルの活性化から選択される少なくとも一つが必要であり、用いる培地の添加剤としては、通常、アクチビン受容体アゴニスト（例えば、アクチビンＡ）、ＷＮＴシグナルの活性化因子（例えば、Ｗｎｔ３ＡのようなＷｎｔタンパク質、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２２１）など）などが用いられる。ステージ１の培養期間は１～４日間であり、好ましくは２～３日間である。ＧＳＫ３β阻害剤は、ステージ１の期間を通じて添加しても良く、ステージ１－１にのみ添加し、その後ステージ１－２ではＧＳＫ３β阻害剤を低減、または含まないステージ１用培地を使用しても良い。ステージ１用培地の例としては、１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ）のアクチビンＡ、および／または、１～１０μＭ（好ましくは３μＭ）のＣＨＩＲ９９０２１を含む培地である。
【0065】
ステージ２では、ＦＧＦ受容体シグナルの活性化が必要であり、用いる培地の添加剤としては、通常、ＦＧＦ受容体アゴニスト（例えば、ＦＧＦ１０、ＫＧＦ）などが用いられる。また、添加剤として、ソニックヘッジホッグ阻害剤（例えば、ＫＡＡＤ－シクロパミン、ＳＡＮＴ－ｌ）を使用することもできる。ステージ２の培養期間は、１～７日間であり、好ましくは２～６日間である。ソニックヘッジホッグ阻害剤は、ステージ２の期間を通じて添加されても良く、ステージ２の前半のみに添加されても良い。ステージ２用培地の例は、５～５００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ）のＦＧＦ１０またはＫＧＦ、および／または、０．０５～５μＭ（好ましくは０．２５μＭ）のＳＡＮＴ１を含む培地である。
【0066】
ステージ３では、レチノイン酸受容体シグナルの活性化、ＢＭＰ受容体シグナルの阻害、ソニックヘッジホッグシグナルの阻害、及びＦＧＦ受容体シグナルの活性化から選択される少なくとも一つが必要であり、用いる培地の添加剤としては、通常、レチノイン酸受容体アゴニスト（例えば、レチノイン酸）、ソニックヘッジホッグ阻害剤（例えば、ＫＡＡＤ－シクロパミン、ＳＡＮＴ－ｌ）、ＢＭＰシグナル阻害因子（例えば、Ｎｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ１９３１８９）、プロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、インドラクタムＶ）などが用いられる。また、添加剤として、ＴＧＦβ受容体キナーゼ阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）を使用することもできる。ステージ３の培養期間は、１～８日間、好ましくは２～６日間である。ステージ３用培地の例としては、０．０５～５μＭ（好ましくは０．１５μＭ）のＳＡＮＴ１、０．１～１０μＭ（好ましくは２μＭ）のレチノイン酸、および、０．０１～１μＭ（好ましくは０．１μＭ）のＬＤＮ１９３１８９のうち少なくとも一つを含む培地、０．０５～５μＭ（好ましくは０．２５μＭ）のＳＡＮＴ１、０．１～１０μＭ（好ましくは２μＭ）のレチノイン酸、５～５００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ）のＫＧＦまたはＦＧＦ１０、および、５～５００ｎＭ（好ましくは５０ｎＭ）のインドラクタムＶのうち少なくとも１つを含む培地などである。
【0067】
ステージ４では、ＢＭＰ受容体シグナルの阻害、ソニックヘッジホッグシグナルの阻害、ＦＧＦ受容体シグナルの活性化、及びレチノイン酸受容体シグナルの活性化から選択される少なくとも一つが必要であり、用いる培地の添加剤としては、通常、ＢＭＰシグナル阻害因子（例えば、Ｎｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ１９３１８９）、ソニックヘッジホッグ阻害剤（例えば、ＳＡＮＴ－ｌ）などが用いられる。また、添加剤として、プロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、インドラクタムＶ）、ＴＧＦβ受容体キナーゼ阻害剤（例えば、ＡＬＫ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ）を使用することもできる。ステージ４の培養期間は、１～７日間、好ましくは２～５日間である。ステージ４用培地の例としては、０．５～５０μＭ（好ましくは５μＭ）のＡＬＫ５阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， ６１６４５２）、０．０１～１０μＭ（好ましくは０．３μＭ）のインドラクタムＶ、および、０．０１～１μＭ（好ましくは０．１μＭ）のＬＤＮ１９３１８９、のうち少なくとも一つを含む培地、０．０５～５μＭ（好ましくは０．２５μＭ）のＳＡＮＴ１、０．０１～１μＭ（好ましくは０．１μＭ）のレチノイン酸、５～５００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ）のＫＧＦ又ＦＧＦ１０、および、１０～１０００ｎＭＭ（好ましくは１００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９のうち少なくとも一つを含む培地、などである。
【0068】
ステージ５では、ＴＧＦβ受容体シグナルの阻害、ＮＯＴＣＨシグナルの阻害、甲状腺ホルモン受容体シグナルの活性化、及びレチノイン酸受容体シグナルの活性化から選択される少なくとも一つが必要であり、用いる培地の添加剤としては、通常、ＴＧＦβ受容体キナーゼ阻害剤（例えば、ＡＬＫ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ）、γ－セクレターゼ阻害剤（例えば、ＤＡＰＴ）、甲状腺ホルモンＴ３、ＥＧＦＲアゴニスト（例えば、ＥＧＦ）、レチノイン酸受容体アゴニスト（例えば、レチノイン酸）、ビタミンＣなどが用いられる。また、添加剤として、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト（例えば、ＧＬＰ－１ペプチド、エキセンジン－４など）、ニコチンアミド、アデニリル酸シクラーゼの活性化剤（例えば、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）、グルココルチコイド受容体アゴニスト（例えば、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）を使用することもできる。ステージ５の培養期間は、５～２０日間、好ましくは７～１５日間である。ステージ５用培地の例としては、５～５００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ）のエキセンディン４および／または１～１００ｎＭ（好ましくは１０ｍＭ）のニコチンアミド、を含む培地、０．５～１００μＭ（好ましくは１０μＭ）のＡＬＫ５阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， ６１６４５２）、０．０１～１μＭ（好ましくは０．１μＭ）のレチノイン酸、１～１００μＭ（好ましくは１０μＭ）のＤＡＰＴ、１～５００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは３３．３ｎｇ／ｍＬ）のＥＧＦ、および、０．１～１０μＭ（好ましくは１μＭ）のＴ３、のうち少なくとも一つを含む培地、前記のレチノイン酸の濃度を低減（例えば、０．０５μＭ以下、好ましくは、０．０２５μＭ）させた培地などである。レチノイン酸の濃度低減培地は、ステージ５の後半において使用するのが好ましい。
【0069】
本発明のインスリン産生細胞の作製法は、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含有する培地中で細胞を三次元培養する工程を含む。三次元培養の方法は当業者が通常用いる手法を適宜採用することができるが、低接着性または非接着性の培養容器を使用した培養法、攪拌培養法、ハンギングドロップ培養法、ハイドロゲルや多孔性スキャフォールドを用いた培養法などを例示することができる。低接着性または非接着性の培養容器としては、通常の培養容器の底面または側面を、細胞接着を阻害するポリマー系試薬等でコーティングして使用しても良く、基材に細胞接着性が低い素材が採用された培養容器を使用することもできる。容器の形状としては、様々なものを使用することができるが、丸底の容器を用いることで、 細胞のスフェア形成を促進することができる。平底容器を採用する場合、シェイカー上で培養することによってスフェア形成を促進することができる。スピナーフラスコや培養リアクタを用いた攪拌培養によっても、スフェア形成を促進することができ、大量培養への適応が可能である。
【0070】
本発明のインスリン産生細胞の作製法では、多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化は、通常、全工程にわたって三次元培養を行うが、一部の工程（例えば、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導する工程、胚体内胚葉細胞から原始腸管細胞を誘導する工程、原始腸管細胞から膵臓前駆細胞を誘導する工程、膵臓前駆細胞から膵内分泌前駆細胞を誘導する工程、または膵内分泌前駆細胞からインスリン産生細胞を誘導する工程のうち一つまたは複数の工程）においてのみ三次元培養を行ってもよい。三次元培養を一部の工程に採用する場合、分化過程の後期（例えば、原始腸管細胞以降）とするのが望ましい。一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、三次元培養が採用される工程の少なくとも一部において添加されればよく、全てに添加される必要は無く、また、三次元培養以外の工程（通常は接着培養）において添加されることを妨げない。
【0071】
一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、インスリン産生細胞への分化過程において、例えば、原始腸管細胞以降の分化段階の三次元培養工程に添加されることによって、インスリン産生細胞への分化を顕著に促進することができる。一般式（Ｉ）で表される化合物は、多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化過程のどの工程において添加してもよいが、好ましくは、多能性幹細胞から誘導された原始腸管細胞、膵臓前駆細胞および／または膵内分泌前駆細胞の培養時に添加する。上記の分化段階においては、ステージ３からステージ５に相当し、いずれかひとつのステージのみに添加しても良く、２つのステージ、または３つすべてのステージで添加しても良いが、ステージ３からステージ５のすべてに添加されることが好ましい。
【0072】
一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、上記の各ステージ用の添加剤の代わりに添加してもよく、また追加して添加されても良い。一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は固体状の化合物をそのまま、もしくは粉末状にして、またはジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に溶解して培地に添加することができる。その添加量は特に限定されないが、多能性幹細胞からインスリン産生細胞へと効率的に分化が進むように当業者によって設定される。本発明のいくつかの実施形態において、一般式（Ｉ）で表される化合物は１ｎｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬ培地中に存在するように添加される。
【0073】
本発明のインスリン産生細胞の作製方法としては、例えば、以下に示す方法が挙げられ、具体的には実施例１に採用されたプロトコール＃１およびプロトコール＃２を例示することができる。以下のプロトコールにおいて、各ステージに用いられる培地は、下に例示されるがこれらに限定されるものではない。
【0074】
［細胞の処理・培養方法］
前処理：多能性幹細胞を未分化維持培地（例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３Ｎ培地（味の素））中１×１０６細胞／ｍＬの濃度で低付着６ウェルプレートに移し、ロータリーシェーカー（９５ ｒｐｍ）上で２４時間以上培養する。以降の培養工程にも、同条件で三次元培養を適用する。分化誘導開始日に、培地を、ＡＫ０３Ｎベースのメチオニン除去培地（ＫＡ０１，味の素）に交換し、細胞を５時間培養する。
ステージ１；多能性幹細胞（前処理されていても良い）を、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ１用培地で１～４日間培養して、胚体内胚葉細胞を誘導する。好ましくは、分化培地１－１またはＭ１－１ ＡＫＭ培地で２４時間培養した後、培地を分化培地１－２またはＭ１－２ ＡＫＭ培地に交換して１～２日間培養する。
ステージ２：胚体内胚葉細胞を含む培養物を、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ２用培地で２～６日間培養し、原始腸管細胞を誘導する。好ましくは、分化培地２、Ｍ２ ＡＫＭ培地またはＳ２培地で２～３日間培養する。別の例としては、亜鉛濃度を低減させたステージ２用培地（例えば、Ｍ２ ＡＫＭ培地）で２日間培養し、その後通常の亜鉛濃度のステージ２用培地（例えば、Ｓ２培地、分化培地２）で２～３日間培養する。
ステージ３：原始腸管細胞を含む培養物を、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ３用培地で２～８日間培養して膵臓前駆細胞を誘導する。好ましくは、分化培地３で５～７日間またはＳ３培地で２～４日間培養する。
ステージ４：膵臓前駆細胞を含む培養物を、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ４用培地で１～７日間培養し、膵内分泌前駆細胞を誘導する。好ましくは分化培地４で２～３日間、または、Ｓ４培地で４～６日間培養する。
ステージ５：膵内分泌前駆細胞を含む培養物を、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ５用培地で５～２０日間培養し、インスリン産生細胞を誘導する。好ましくは、分化培地５で１０～１５日間培養する。別の態様としては、０．１μＭ以上のレチノイン酸を含むステージ５用培地（例えば、Ｓ５－１培地）で３～５日間培養し、その後０．０５μＭ以下の低濃度のレチノイン酸を含むステージ５用培地（例えば、Ｓ５－２培地）で２～４日間培養する。
前処理：多能性幹細胞を未分化維持培地（例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３Ｎ培地（味の素））中１×１０６細胞／ｍＬの濃度で低付着６ウェルプレートに移し、ロータリーシェーカー（９５ ｒｐｍ）上で２４時間以上培養する。以降の培養工程にも、同条件で三次元培養を適用する。分化誘導開始日に、培地を、ＡＫ０３Ｎベースのメチオニン除去培地（ＫＡ０１，味の素）に交換し、細胞を５時間培養する。
ステージ１；多能性幹細胞（前処理されていても良い）を、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ１用培地で１～４日間培養して、胚体内胚葉細胞を誘導する。好ましくは、分化培地１－１またはＭ１－１ ＡＫＭ培地で２４時間培養した後、培地を分化培地１－２またはＭ１－２ ＡＫＭ培地に交換して１～２日間培養する。
ステージ２：胚体内胚葉細胞を含む培養物を、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ２用培地で２～６日間培養し、原始腸管細胞を誘導する。好ましくは、分化培地２、Ｍ２ ＡＫＭ培地またはＳ２培地で２～３日間培養する。別の例としては、亜鉛濃度を低減させたステージ２用培地（例えば、Ｍ２ ＡＫＭ培地）で２日間培養し、その後通常の亜鉛濃度のステージ２用培地（例えば、Ｓ２培地、分化培地２）で２～３日間培養する。
ステージ３：原始腸管細胞を含む培養物を、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ３用培地で２～８日間培養して膵臓前駆細胞を誘導する。好ましくは、分化培地３で５～７日間またはＳ３培地で２～４日間培養する。
ステージ４：膵臓前駆細胞を含む培養物を、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ４用培地で１～７日間培養し、膵内分泌前駆細胞を誘導する。好ましくは分化培地４で２～３日間、または、Ｓ４培地で４～６日間培養する。
ステージ５：膵内分泌前駆細胞を含む培養物を、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ５用培地で５～２０日間培養し、インスリン産生細胞を誘導する。好ましくは、分化培地５で１０～１５日間培養する。別の態様としては、０．１μＭ以上のレチノイン酸を含むステージ５用培地（例えば、Ｓ５－１培地）で３～５日間培養し、その後０．０５μＭ以下の低濃度のレチノイン酸を含むステージ５用培地（例えば、Ｓ５－２培地）で２～４日間培養する。
【0075】
［培地］
ＡＫＭ培地はインスリンおよびＺｎ２＋除去ＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３培地（味の素）である。
（ステージ１用培地例）
分化培地１－１；ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、Ｂ２７サプリメント、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１
分化培地１－２：ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、Ｂ２７サプリメント
Ｍ１－１ ＡＫＭ培地：１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２２１を添加し、１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１および０．５μＭのＺｎを補充したＡＫＭ培地。
Ｍ１－２ ＡＫＭ培地：１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを添加し、１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１および０．５μＭのＺｎを補充したＡＫＭ培地。
（ステージ２用培地例）
分化培地２：ＲＰＭＩ、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、インスリンを除いたＢ２７サプリメント、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０、０．２５μＭのＳＡＮＴ１。
Ｍ２ ＡＫＭ培地：５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１を添加し、０．５μＭのＺｎを補充したＡＫＭ培地。
Ｓ２培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦと４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
（ステージ３用培地例）
分化培地３：ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、０．１５μＭのＳＡＮＴ１、２μＭのレチノイン酸、０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９、Ｂ２７サプリメント。
Ｓ３培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、５０ｎＭのインドラクタムＶ、２μＭのレチノイン酸、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
（ステージ４用培地例）
分化培地４：ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、５μＭのＡＬＫ５阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， ６１６４５２）、０．３μＭのインドラクタムＶ、０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９、Ｂ２７サプリメント
Ｓ４培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、１００ｎＭのレチノイン酸、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣ、１００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９を補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
（ステージ５用培地例）
分化培地５：ＫＯ ＤＭＥＭ／Ｆ１２ 、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、５０ｎｇ／ｍＬのエキセンディン４、１０ｍＭのニコチンアミド、１０μＭのＺｎＳＯ４、１ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システイン、Ｂ２７サプリメント。
Ｓ５－１培地：１０μＭのＡＬＫ５阻害剤、１０μＭのＤＡＰＴ、３３．３ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１００ｎＭのレチノイン酸、１μＭのＴ３、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
Ｓ５－２培地：１０μＭのＡＬＫ５阻害剤、１０μＭのＤＡＰＴ、３３．３ ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、２５ ｎＭのレチノイン酸、１μＭのＴ３を補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
ＡＫＭ培地はインスリンおよびＺｎ２＋除去ＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３培地（味の素）である。
（ステージ１用培地例）
分化培地１－１；ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、Ｂ２７サプリメント、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１
分化培地１－２：ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、Ｂ２７サプリメント
Ｍ１－１ ＡＫＭ培地：１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２２１を添加し、１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１および０．５μＭのＺｎを補充したＡＫＭ培地。
Ｍ１－２ ＡＫＭ培地：１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを添加し、１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１および０．５μＭのＺｎを補充したＡＫＭ培地。
（ステージ２用培地例）
分化培地２：ＲＰＭＩ、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、インスリンを除いたＢ２７サプリメント、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０、０．２５μＭのＳＡＮＴ１。
Ｍ２ ＡＫＭ培地：５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１を添加し、０．５μＭのＺｎを補充したＡＫＭ培地。
Ｓ２培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦと４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
（ステージ３用培地例）
分化培地３：ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、０．１５μＭのＳＡＮＴ１、２μＭのレチノイン酸、０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９、Ｂ２７サプリメント。
Ｓ３培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、５０ｎＭのインドラクタムＶ、２μＭのレチノイン酸、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
（ステージ４用培地例）
分化培地４：ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、５μＭのＡＬＫ５阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， ６１６４５２）、０．３μＭのインドラクタムＶ、０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９、Ｂ２７サプリメント
Ｓ４培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、１００ｎＭのレチノイン酸、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣ、１００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９を補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
（ステージ５用培地例）
分化培地５：ＫＯ ＤＭＥＭ／Ｆ１２ 、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、５０ｎｇ／ｍＬのエキセンディン４、１０ｍＭのニコチンアミド、１０μＭのＺｎＳＯ４、１ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システイン、Ｂ２７サプリメント。
Ｓ５－１培地：１０μＭのＡＬＫ５阻害剤、１０μＭのＤＡＰＴ、３３．３ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１００ｎＭのレチノイン酸、１μＭのＴ３、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
Ｓ５－２培地：１０μＭのＡＬＫ５阻害剤、１０μＭのＤＡＰＴ、３３．３ ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、２５ ｎＭのレチノイン酸、１μＭのＴ３を補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
【0076】
分化速度および細胞機能に対する化合物の有効性を評価する場合、試験化合物および陰性対照（０．０１％ＤＭＳＯ）をステージ３および４の間（５日目～１３日目）に処理し、インスリン、ＮＫＸ６．１、およびＰＤＸ１の陽性に対する効果を確認するために、１４日目および２１日目に免疫細胞化学染色を実施した。ＧＳＩＳは２１日目に実施した。
【0077】
＜化合物＞
本発明における一般式（Ｉ）で表される化合物の好ましい態様について以下に説明する。
本発明における一般式（Ｉ）で表される化合物の好ましい態様について以下に説明する。
【0078】
本発明における置換基Ｒ１としては水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基を挙げることができる。好適には水素原子、塩素原子、臭素原子、またはメチル基であり、より好適には水素原子、塩素原子、またはメチル基である。Ｒ１の置換位置としては任意の位置をとることができ、以下に示す（Ｉ－ｉ）～（Ｉ－ｉｉｉ）をとり得る。
【0079】
【化6】
【0080】
本発明における置換基Ｒ２としては水素原子またはＣ１－Ｃ６アルキル基を挙げることができる。好適には水素原子またはＣ１－Ｃ２アルキル基であり、より好適には水素原子またはメチル基である。
【0081】
本発明における置換基Ｒ３としては置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいＣ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、または置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル基が挙げられる。好適にはナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジハロゲノ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、置換基群α１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群α１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であり、より好適にはナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジハロゲノ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、置換基群α２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基である。さらにより好適にはナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ８シクロアルケン－１－イル基、置換基群α３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であり、特に２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソリル基、１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－４－イル基、またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基が好ましい。さらに特に好適には、フェニル基またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より選択されるいずれか１つの置換基でｍ位またはｐ位が置換されたフェニル基である。各置換基群α～γに関しては以下の通りである。
【0082】
本発明における置換基群αとしてはハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいフェノキシ基、置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいフェニル基、および置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいベンゾイル基が挙げられる。好適には置換基群α１：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、５もしくは６員環非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基であり、より好適には置換基群α２：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１～Ｃ６アルコキシ基、５もしくは６員環非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基である。さらにより好適には置換基群α３：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ２アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ２アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ２アルコキシＣ１－Ｃ２アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ４アルコキシ基、モルホリン－１－イル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ２アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基であり、特に好適にはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、またはフェノキシ基である。
【0083】
本発明における置換基群βとしてはハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基が挙げられる。好適には置換基群β１：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基であり、より好適には置換基群β２：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、およびＣ１－Ｃ６アルコキシ基である。さらにより好適には置換基群β３：フッ素原子、塩素原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、およびＣ１－Ｃ４アルコキシ基であり、特に好適にはメチル基、またはメトキシ基である。
【0084】
本発明における置換基群γとしては置換基群γ２：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基が挙げられる。好適には置換基群γ３：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４アルキル）カルボニル基、および（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニル基であり、より好適にはフッ素原子、塩素原子、メチル基、イソブトキシ基、またはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基である。
【0085】
本発明におけるｎとしては０または１の数値を取り得る。ｎ＝０のとき、一般式（Ｉ）で表される化合物は以下の式（ＩＩ）：
【0086】
【化7】
【0087】
［式中、Ｒ１～Ｒ３は上記と同義を示す］
で表されるジヒドロピロリジノン（ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｒｏｌｉｚｉｎｏｎｅ）構造を有する化合物であり、ｎ＝１のとき、一般式（Ｉ）で表される化合物は以下の式（ＩＩＩ）：
で表されるジヒドロピロリジノン（ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｒｏｌｉｚｉｎｏｎｅ）構造を有する化合物であり、ｎ＝１のとき、一般式（Ｉ）で表される化合物は以下の式（ＩＩＩ）：
【0088】
【化8】
【0089】
［式中、Ｒ１～Ｒ３は上記と同義を示す］
で表されるジヒドロインドリジノン構造を有する化合物である。本発明におけるｎとして好適にはｎ＝１であり、ジヒドロインドリジノン構造を有する化合物がより好ましい。
で表されるジヒドロインドリジノン構造を有する化合物である。本発明におけるｎとして好適にはｎ＝１であり、ジヒドロインドリジノン構造を有する化合物がより好ましい。
【0090】
本発明におけるＡとしては以下の一般式（ｉ）～（ｉｖ）：
【0091】
【化9】
【0092】
［式中、・、＊、Ｒ４、Ｒ５、およびＹは上記と同義を示す］
で表される基である。
で表される基である。
【0093】
Ａが一般式（ｉ）で表される基を有するとき、一般式（Ｉ）で表される化合物は以下の式（ＩＶ）：
【0094】
【化10】
【0095】
［式中、Ｒ１～Ｒ４、およびｎは上記と同義を示す］
で表される化合物である。
で表される化合物である。
【0096】
Ａが一般式（ｉｉ）で表される基を有するとき、一般式（Ｉ）で表される化合物は以下の式（Ｖ）：
【0097】
【化11】
【0098】
［式中、Ｒ１～Ｒ３、Ｒ５、ｎ、およびＹは上記と同義を示す］
で表される化合物である。Ｒ５の置換位置としては任意の位置を取ることができ、以下に示す（Ｖ－ｉ）～（Ｖ－ｉｉｉ）をとり得る。
で表される化合物である。Ｒ５の置換位置としては任意の位置を取ることができ、以下に示す（Ｖ－ｉ）～（Ｖ－ｉｉｉ）をとり得る。
【0099】
【化12】
【0100】
Ａが一般式（ｉｉｉ）で表される基を有するとき、一般式（Ｉ）で表される化合物は以下の式（ＶＩ）：
【0101】
【化13】
【0102】
［式中、Ｒ１～Ｒ３、Ｒ５、およびｎは上記と同義を示す］
で表される化合物である。Ｒ５の置換位置としては任意の位置を取ることができ、以下に示す（ＶＩ－ｉ）～（ＶＩ－ｉｉｉ）をとり得る。
で表される化合物である。Ｒ５の置換位置としては任意の位置を取ることができ、以下に示す（ＶＩ－ｉ）～（ＶＩ－ｉｉｉ）をとり得る。
【0103】
【化14】
【0104】
Ａが一般式（ｉｖ）で表される基を有するとき、一般式（Ｉ）で表される化合物は以下の式（ＶＩＩ）：
【0105】
【化15】
【0106】
［式中、Ｒ１～Ｒ３、およびｎは上記と同義を示す］
で表される化合物である。
で表される化合物である。
【0107】
本発明における置換基Ｒ４としては水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、または（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基が挙げられる。好適には水素原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、またはハロゲノＣ１－Ｃ２アルキル基であり、より好適には水素原子、メチル基、またはトリフルオロメチル基である。
【0108】
本発明における置換基Ｒ５としては水素原子、ハロゲン原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基が挙げられる。好適には水素原子、フッ素原子またはメチル基である。
【0109】
本発明におけるＹとしてはＮまたはＣＨが挙げられ、ＹがＮのとき、Ａにおける（ｉｉ）はピリジン環を表し、ＹがＣＨのとき、Ａにおける（ｉｉ）はベンゼン環を表す。当該Ａの（ｉｉ）におけるＹとしては好適にはＣＨである。
【0110】
一般式（Ｉ）を有する化合物は、好適には、合成例に記載の化合物であり、より好適には、以下の化合物である。
【0111】
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
Ｎ－［５－（４－イソプロポキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
Ｎ－［６－（４－クロロフェニル）－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
Ｎ－［５－（４－イソプロポキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
Ｎ－［６－（４－クロロフェニル）－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
【0112】
なお、その構造式は、順に以下に示すとおりである。
【0113】
【化16】
【0114】
上記の８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド、およびＮ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドは光学活性体を含む。
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドの光学活性体はそれぞれ、
（５Ｒ）－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド、または
（５Ｓ）－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドであり、
Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドの光学活性体はそれぞれ、
（５Ｒ）－Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド、または
（５Ｓ）－Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドである。
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドの光学活性体はそれぞれ、
（５Ｒ）－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド、または
（５Ｓ）－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドであり、
Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドの光学活性体はそれぞれ、
（５Ｒ）－Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド、または
（５Ｓ）－Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドである。
【0115】
なお、その構造式は、順に以下に示すとおりである。
【0116】
【化17】
【0117】
ラセミ化合物からの各光学異性体の分離・分析はキラルカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などにより達成され得る。ＨＰＬＣによる光学異性体の同定は、その保持時間を参考に行われ得るが、その保持時間はカラムの劣化や装置間の再現性などによって影響を受ける場合があるため、好ましくはラセミ化合物または光学異性体の標準試料と分析試料との混合物を分析することによって行われ得る。また、各光学異性体のＨＰＬＣによる測定においては、同一測定条件下では各光学異性体が溶出される順序が変化しないため、特定条件下で相対的に保持時間が短い第一ピークと相対的に保持時間が長い第二ピークによって光学異性体を特徴付ける場合もあり得る。
【0118】
（塩）
「その塩」とは化合物では、酸性基または塩基性基を有する場合に、塩基または酸と反応させることにより、「塩基との塩」または「酸付加塩」にすることができるので、その塩を示す。温血動物（特にヒト）に対する治療の目的で使用する場合、その塩は薬学的に許容される塩が好ましい。また、「その塩」および「薬学的に許容される塩」とは、その水和物も包含する。
「その塩」とは化合物では、酸性基または塩基性基を有する場合に、塩基または酸と反応させることにより、「塩基との塩」または「酸付加塩」にすることができるので、その塩を示す。温血動物（特にヒト）に対する治療の目的で使用する場合、その塩は薬学的に許容される塩が好ましい。また、「その塩」および「薬学的に許容される塩」とは、その水和物も包含する。
【0119】
化合物の「塩基との塩」としては、好適には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；Ｎ－メチルモルホリン塩、トリエチルアミン塩、トリブチルアミン塩、ジイソプロピルエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ－メチルピペリジン塩、ピリジン塩、４－ピロリジノピリジン塩、ピコリン塩のような有機塩基塩類、またはグリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩であり、より好適には、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩である。
【0120】
化合物の「酸付加塩」としては、好適には、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩であり、より好適には、ハロゲン化水素酸塩（特に、塩酸塩）である。
【0121】
（水和物等）
一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、大気中に放置したりまたは再結晶をすることにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となったりする場合があり、本発明には、そのような各種の水和物、溶媒和物および結晶多形の化合物も包含する。
一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、大気中に放置したりまたは再結晶をすることにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となったりする場合があり、本発明には、そのような各種の水和物、溶媒和物および結晶多形の化合物も包含する。
【0122】
（異性体）
一般式（Ｉ）で表される化合物には、置換基の種類によって、互変異性体や幾何異性体が存在しうる。本明細書中、一般式（Ｉ）で表される化合物が異性体の一形態のみで記載されることがあるが、本発明は、それ以外の異性体も包含し、異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
一般式（Ｉ）で表される化合物には、不斉炭素原子や軸不斉を有する場合があり、これに基づく光学異性体が存在しうる。本発明は、光学異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
一般式（Ｉ）で表される化合物には、置換基の種類によって、互変異性体や幾何異性体が存在しうる。本明細書中、一般式（Ｉ）で表される化合物が異性体の一形態のみで記載されることがあるが、本発明は、それ以外の異性体も包含し、異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
一般式（Ｉ）で表される化合物には、不斉炭素原子や軸不斉を有する場合があり、これに基づく光学異性体が存在しうる。本発明は、光学異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
【0123】
（同位体）
一般式（Ｉ）で表される化合物は、ラベル体、すなわち、化合物の１または２以上の原子を同位元素（例えば、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、３５Ｓ等）で置換した化合物も含まれる。
一般式（Ｉ）で表される化合物は、ラベル体、すなわち、化合物の１または２以上の原子を同位元素（例えば、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、３５Ｓ等）で置換した化合物も含まれる。
【0124】
（プロドラッグ）
本発明には、一般式（Ｉ）で表される化合物の薬理学上許容されるプロドラッグも包含する。薬理学上許容されるプロドラッグとは、加溶媒分解によりまたは生理学的条件下で、アミノ基、水酸基、カルボキシ基等に変換されうる基を有する化合物である。プロドラッグを形成する基としては、例えば、Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ，５，２１５７－２１６１（１９８５）に記載の基が挙げられる。
本発明には、一般式（Ｉ）で表される化合物の薬理学上許容されるプロドラッグも包含する。薬理学上許容されるプロドラッグとは、加溶媒分解によりまたは生理学的条件下で、アミノ基、水酸基、カルボキシ基等に変換されうる基を有する化合物である。プロドラッグを形成する基としては、例えば、Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ，５，２１５７－２１６１（１９８５）に記載の基が挙げられる。
【0125】
当該プロドラッグとして、より具体的には、化合物にアミノ基が存在する場合には、そのアミノ基がアシル化、リン酸化された化合物（例えば、そのアミノ基がエイコサノイル化、アラニル化、ペンチルアミノカルボニル化、（５－メチル－２－オキソ－１，３－ジオキソレン－４－イル）メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラニル化、ピロリジルメチル化、ピバロイルオキシメチル化された化合物等である）等を挙げることができる。
【0126】
化合物に水酸基が存在する場合には、その水酸基がアシル化、アルキル化、リン酸化、ホウ酸化された化合物（例えば、その水酸基がアセチル化、パルミトイル化、プロパノイル化、ピバロイル化、サクシニル化、フマリル化、アラニル化、ジメチルアミノメチルカルボニル化された化合物等である。）等を挙げることができる。
【0127】
化合物にカルボキシ基が存在する場合には、そのカルボキシ基がエステル化、アミド化された化合物（例えば、そのカルボキシ基がエチルエステル化、フェニルエステル化、カルボキシメチルエステル化、ジメチルアミノメチルエステル化、ピバロイルオキシメチルエステル化、エトキシカルボニルオキシエチルエステル化、アミド化またはメチルアミド化された化合物等である。）等が挙げられる。
【0128】
（製造方法）
次に、一般式（Ｉ）で表される化合物の代表的な製造方法について説明する。一般式（Ｉ）で表される化合物は種々の製造方法により製造することができ、以下に示す製造方法は一例であり、本発明はこれらに限定して解釈されるべきではない。
次に、一般式（Ｉ）で表される化合物の代表的な製造方法について説明する。一般式（Ｉ）で表される化合物は種々の製造方法により製造することができ、以下に示す製造方法は一例であり、本発明はこれらに限定して解釈されるべきではない。
【0129】
一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩およびそれらの合成中間体は、それらの基本骨格または置換基の種類に基づく特徴を利用し、各種の公知の製造方法を適用して製造することができる。公知の方法としては、例えば、「ＯＲＧＡＮＩＣ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＧＲＯＵＰ ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ」、第２版、ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ，ＩＮＣ．，１９８９年、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．，１９８９年等に記載された方法がある。
【0130】
また、一般式（Ｉ）で表される化合物およびその塩は、以下に記載するＡ～Ｃ法に従って合成することができる。一般式（Ｉ）で表される化合物を合成する際、官能基の種類によっては、当該官能基を原料から中間体へ至る段階で適当な保護基（容易に当該官能基に転化可能な基）で保護しておくことが製造技術上効果的な場合がある。このような保護基としては、例えば、ウッツ（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）およびグリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第３版、１９９９年）に記載の保護基等を挙げることができ、これらの反応条件を適宜選択して用いればよい。一般的に当業者によって合成ルートが設定されると、当該合成ルートに最適な保護基は当業者によって適宜設定される。
【0131】
このような方法では、当該保護基を導入して反応を行なったあと、必要に応じて保護基を除去することにより、所望の化合物を得ることができる。また、一般式（Ｉ）で表される化合物のプロドラッグは、上記保護基と同様、原料から中間体へ至る段階で、特定の基を導入、あるいは得られた化合物を用いてさらに反応を行なうことで製造できる。反応は通常のエステル化、アミド化、脱水等の方法を適用することにより行うことができる。
【0132】
一般式（Ｉ）で表される化合物は公知の方法またはその変法によって合成可能な中間体を用いて製造することができる。特にＡに相当する一般式（ｉｉ）～（ｉｖ）で表される基を含む中間体については市販の原料を用いて公知の方法またはその変法を適用することによって製造することができる。
【0133】
下記Ａ～Ｃ法の各工程で得られる化合物はその化合物とともに形成される塩であってもよい。例えば、塩酸塩もしくは硫酸塩等、またはナトリウム塩もしくはカリウム塩等が挙げられる。
【0134】
下記Ａ～Ｃ法の各工程の反応において使用される溶媒は、反応を阻害せず、出発原料を一部溶解するものであれば特に限定はなく、例えば、下記溶媒群より選択される。溶媒群は、ヘキサン、ペンタン、石油エーテル、シクロヘキサンのような脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類；メチレンクロリド（塩化メチレン）、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテルのようなエーテル類；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンのようなケトン類；酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチルのようなエステル類；アセ卜ニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリルのようなニトリル類；酢酸、プロピオン酸のようなカルボン酸類；メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、１－メチル－１－プロパノール、２－メチル－２－プロパノールのようなアルコール類；ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセ卜アミド、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミドのようなアミド類；ジメチルスルホキシド、スルホランのようなスルホキシド類；水；および、それらの混合物からなる。
【0135】
下記Ａ～Ｃ法の各工程の反応において使用される酸は、反応を阻害しないものであれば特に限定はなく、下記酸群より選択される。酸群は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸のような無機酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、ペンタフルオロプロピオン酸のような有機酸、および、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸のような有機スルホン酸からなる。
【0136】
下記Ａ～Ｃ法の各工程の反応において使用される塩基は、反応を阻害しないものであれば特に限定はなく、下記塩基群より選択される。塩基群は、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウムのようなアルカリ金属炭酸塩；炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムのようなアルカリ金属炭酸水素塩；水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのようなアルカリ金属水酸化物；水酸化カルシウム、水酸化バリウムのようなアルカリ土類金属水酸化物；水素化リチウム、水素化ナトリウム、水素化カリウムのようなアルカリ金属水素化物；リチウムアミド、ナトリウムアミド、カリウムアミドのようなアルカリ金属アミド；リチウムメトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシドのようなアルカリ金属アルコキシド；リチウムジイソプロピルアミドのようなリチウムアルキルアミド；リチウムビストリメチルシリルアミド、ナトリウムビストリメチルシリルアミドのようなシリルアミド； ｎ－ブチルリチウム、ｓｅｃ－ブチルリチウム、ｔｅｒｔ－ブチルリチウムのようなアルキルリチウム；塩化メチルマグネシウム、臭化メチルマグネシウム、ヨウ化メチルマグネシウム、塩化エチルマグネシウム、臭化エチルマグネシウム、塩化イソプロピルマグネシウム、臭化イソプロピルマグネシウム、塩化イソブチルマグネシウムのようなハロゲン化アルキルマグネシウム；および、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－エチルモルホリン、ピリジン、ピコリン、４－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）ピリジン、４－ピロリジノピリジン、２，６－ジ（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－メチルピリジン、キノリン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ－ジエチルアニリン、１，５－ジアザビシクロ［４，３，０］ノナ－５－エン（ＤＢＮ）、１, ４－ジアザビシクロ［２，２，２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、１, ８－ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ）のような有機アミンからなる。
【0137】
下記Ａ～Ｃ法の各工程の反応において、反応温度は、溶媒、出発原料、試薬等により異なり、反応時間は、溶媒、出発原料、試薬、反応温度等により異なる。
【0138】
下記Ａ～Ｃ法の各工程の反応において、反応終了後、各工程の目的化合物は、常法にしたがって反応混合物から単離される。目的化合物は、例えば、（ｉ）必要に応じて触媒等の不溶物を漏去し、（ｉｉ）反応混合物に水および水と混和しない溶媒（例えば、塩化メチレン、ジエチルエーテル、酢酸エチル等）を加えて目的化合物を抽出し、（ｉｉｉ）有機層を水洗して、無水硫酸マグネシウム等の乾燥剤を用いて乾燥させ、（ｉｖ）溶媒を留去することによって得られる。得られた目的化合物は、必要に応じ、常法、例えば、再結晶、再沈澱、蒸留、または、シリカゲルもしくはアルミナなどを用いたカラムクロマトグラフィー（順相および逆相を含む）等により、更に精製することができる。得られた目的化合物は、元素分析、ＮＭＲ、質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ＩＲ分析等の標準的な分析技術によって同定され、その組成または純度を分析することができる。また、各工程の目的化合物は精製することなくそのまま次の反応に使用することもできる。
【0139】
下記Ａ～Ｃ法の各工程において、（Ｒ）または（Ｓ）－フェネチルアミンのような光学活性アミンを用いた分別再結晶、または、光学活性カラムを用いた分離により、光学異性体を分離、精製することができる。
【0140】
以下に一般式（Ｉ）で表される化合物の製造方法について述べる。ただし、製造方法は、下記の方法に何ら限定されるものではない。
【0141】
［Ａ法］
Ａ法は一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する際に合成中間体として用いることのできる化合物（Ａ２）を製造する方法である。化合物（Ａ２）は本法および実施例で例示される合成法の他に公知の方法またはその変法などによっても製造することができる。
Ａ法は一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する際に合成中間体として用いることのできる化合物（Ａ２）を製造する方法である。化合物（Ａ２）は本法および実施例で例示される合成法の他に公知の方法またはその変法などによっても製造することができる。
【0142】
【化18】
【0143】
（工程Ａ－１）チアゾール環形成
工程Ａ－１は化合物（Ａ１）に対して等量もしくは過剰量のハロゲン化剤もしくはブロモトリメチルシラン、およびチオウレアを作用させ、化合物（Ａ２）を製造する工程である。ハロゲン化剤としては塩素、臭素などが挙げられる。反応の溶媒は、反応が進行する限り特に限定はされないが、ジクロロメタン、クロロホルム、エタノール、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、酢酸等が用いられる。反応温度は通常、０～１００℃であり、反応時間は通常、０．５時間～２日間程度である。
工程Ａ－１は化合物（Ａ１）に対して等量もしくは過剰量のハロゲン化剤もしくはブロモトリメチルシラン、およびチオウレアを作用させ、化合物（Ａ２）を製造する工程である。ハロゲン化剤としては塩素、臭素などが挙げられる。反応の溶媒は、反応が進行する限り特に限定はされないが、ジクロロメタン、クロロホルム、エタノール、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、酢酸等が用いられる。反応温度は通常、０～１００℃であり、反応時間は通常、０．５時間～２日間程度である。
【0144】
（Ｂ法）
Ｂ法は一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する際に合成中間体として用いることのできる化合物（Ｂ３）を製造する方法である。以下の図中のＰ１およびＰ２はアミノ基の保護基あるいは水素原子を示し、具体的な保護基としてはＢｏｃ基（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基）、Ｃｂｚ基（ベンジルオキシカルボニル基）、ベンジリデン基、またはジフェニルメチレン基などが挙げられる。Ｐ１がベンジリデン基、ジフェニルメチレン基の場合にはＰ２はＰ１と同一保護基を示す。Ｒ３およびＡはそれらに含まれる置換基上に保護基を有していてもよく、各工程は必要に応じて置換基の保護や保護基の除去を行う工程を含む。
Ｂ法は一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する際に合成中間体として用いることのできる化合物（Ｂ３）を製造する方法である。以下の図中のＰ１およびＰ２はアミノ基の保護基あるいは水素原子を示し、具体的な保護基としてはＢｏｃ基（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基）、Ｃｂｚ基（ベンジルオキシカルボニル基）、ベンジリデン基、またはジフェニルメチレン基などが挙げられる。Ｐ１がベンジリデン基、ジフェニルメチレン基の場合にはＰ２はＰ１と同一保護基を示す。Ｒ３およびＡはそれらに含まれる置換基上に保護基を有していてもよく、各工程は必要に応じて置換基の保護や保護基の除去を行う工程を含む。
【0145】
【化19】
【0146】
（工程Ｂ－１）カップリング反応
工程Ｂ－１は化合物（Ｂ１）のＡ上の置換基Ｘ１に対し、パラジウム触媒存在下、等量もしくは過剰量のボロン酸もしくはボロン酸エステル（Ｒ３－Ｂ（ＯＨ）２またはＲ３－Ｂ（ＯＲ）２、Ｒは任意のアルキル基を示す）を用いる条件（鈴木・宮浦カップリング）；有機スズ試薬（Ｒ３－ＳｎＲ３）を用いる条件（Ｓｔｉｌｌｅカップリング）；または有機亜鉛試薬（Ｒ３－ＺｎＸ；Ｘはハロゲン原子を示す）を用いる条件（根岸カップリング）等により、置換基Ｒ３の導入を行って化合物（Ｂ２）を得る工程である。上記反応では必要により、塩基を加えることができる。パラジウム触媒としては、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド ジクロロメタン錯体（１：１）、クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２´４´６´－トリイソプロピル－１，１´－ビフェニル）［２－（２´－アミノ－１，１´－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム、酢酸パラジウム（ＩＩ）、アセチルアセトンパラジウム（ＩＩ）、またはビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリド等が挙げられる。また、塩基としてはトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）、または１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］－５－ノネン（ＤＢＮ）等の有機塩基、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、リン酸カリウム、またはリン酸ナトリウム等の無機塩基が挙げられる。反応溶媒としては、反応が進行する限り特に限定はされないが、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、１，４－ジオキサン、水、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン、またはこれらの混合物等を挙げることができる。反応温度は通常２０～１５０℃程度である。反応時間は通常１時間～２日程度である。本カップリング反応についてはＡ．ＭｅｉｊｅｒｅおよびＦ．Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈ著、「Ｍｅｔａｌ－Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｒｏｓｓ－Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ（第２版、２００４年）」に記載の方法に準じて行うことができる。
工程Ｂ－１は化合物（Ｂ１）のＡ上の置換基Ｘ１に対し、パラジウム触媒存在下、等量もしくは過剰量のボロン酸もしくはボロン酸エステル（Ｒ３－Ｂ（ＯＨ）２またはＲ３－Ｂ（ＯＲ）２、Ｒは任意のアルキル基を示す）を用いる条件（鈴木・宮浦カップリング）；有機スズ試薬（Ｒ３－ＳｎＲ３）を用いる条件（Ｓｔｉｌｌｅカップリング）；または有機亜鉛試薬（Ｒ３－ＺｎＸ；Ｘはハロゲン原子を示す）を用いる条件（根岸カップリング）等により、置換基Ｒ３の導入を行って化合物（Ｂ２）を得る工程である。上記反応では必要により、塩基を加えることができる。パラジウム触媒としては、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド ジクロロメタン錯体（１：１）、クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２´４´６´－トリイソプロピル－１，１´－ビフェニル）［２－（２´－アミノ－１，１´－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム、酢酸パラジウム（ＩＩ）、アセチルアセトンパラジウム（ＩＩ）、またはビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリド等が挙げられる。また、塩基としてはトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）、または１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］－５－ノネン（ＤＢＮ）等の有機塩基、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、リン酸カリウム、またはリン酸ナトリウム等の無機塩基が挙げられる。反応溶媒としては、反応が進行する限り特に限定はされないが、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、１，４－ジオキサン、水、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン、またはこれらの混合物等を挙げることができる。反応温度は通常２０～１５０℃程度である。反応時間は通常１時間～２日程度である。本カップリング反応についてはＡ．ＭｅｉｊｅｒｅおよびＦ．Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈ著、「Ｍｅｔａｌ－Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｒｏｓｓ－Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ（第２版、２００４年）」に記載の方法に準じて行うことができる。
【0147】
（工程Ｂ－２）脱保護
工程Ｂ－２は化合物（Ｂ２）における保護基Ｐ１およびＰ２を除去して化合物（Ｂ３）を製造する工程である。本工程では必要に応じてＲ３における保護基の脱保護を行うことができる。本反応条件は保護基Ｐ１およびＰ２の種類により変わるが、例えば、Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｗｕｔｓ著、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第３版、１９９９年）」に記載の方法に準じて行うことができる。
工程Ｂ－２は化合物（Ｂ２）における保護基Ｐ１およびＰ２を除去して化合物（Ｂ３）を製造する工程である。本工程では必要に応じてＲ３における保護基の脱保護を行うことができる。本反応条件は保護基Ｐ１およびＰ２の種類により変わるが、例えば、Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｗｕｔｓ著、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第３版、１９９９年）」に記載の方法に準じて行うことができる。
【0148】
（Ｃ法）
Ｃ法は公知の方法またはその変法などを用いて合成可能な化合物（Ｃ１）から一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する方法である。
Ｃ法は公知の方法またはその変法などを用いて合成可能な化合物（Ｃ１）から一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する方法である。
【0149】
【化20】
【0150】
（工程Ｃ－１）アルキル化反応
工程Ｃ－１は化合物（Ｃ１）に対して等量もしくは過剰量のアルキル化剤存在下、塩基で処理することにより置換基Ｒ２を導入し、化合物（Ｃ２）を製造する工程である。アルキル化剤としてはハロゲン化アルキル、メタンスルホン酸アルキルエステルまたはｐ－トルエンスルホン酸アルキルエステル等を用いることができる。塩基としては、カリウムヘキサメチルジシラジド、ナトリウムヘキサメチルジシラジドなどが挙げられる。反応溶媒は、反応が進行する限り特に限定はされないが、テトラヒドロフランが好ましい。反応温度は通常、－７８～０℃である。反応時間は通常、０．５～２４時間である。
工程Ｃ－１は化合物（Ｃ１）に対して等量もしくは過剰量のアルキル化剤存在下、塩基で処理することにより置換基Ｒ２を導入し、化合物（Ｃ２）を製造する工程である。アルキル化剤としてはハロゲン化アルキル、メタンスルホン酸アルキルエステルまたはｐ－トルエンスルホン酸アルキルエステル等を用いることができる。塩基としては、カリウムヘキサメチルジシラジド、ナトリウムヘキサメチルジシラジドなどが挙げられる。反応溶媒は、反応が進行する限り特に限定はされないが、テトラヒドロフランが好ましい。反応温度は通常、－７８～０℃である。反応時間は通常、０．５～２４時間である。
【0151】
（工程Ｃ－２）ハロゲン化およびアルキル化
工程Ｃ－２は化合物（Ｃ１）に対して等量もしくは過剰量のハロゲン化剤を用いてハロゲン化を行った後、アルキル化を行うことによって化合物（Ｃ３）を製造する工程である。ハロゲン化とアルキル化の順番は適宜入れ替えることができる。ハロゲン化剤としては、例えばＮ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドなどが挙げられる。反応溶媒は、反応が進行する限り特に限定はされないが、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミドが好ましい。反応温度は通常０～５０℃程度である。反応時間は通常０．５～２４時間である。アルキル化は工程Ｃ－１と同様の方法で行うことができる。
工程Ｃ－２は化合物（Ｃ１）に対して等量もしくは過剰量のハロゲン化剤を用いてハロゲン化を行った後、アルキル化を行うことによって化合物（Ｃ３）を製造する工程である。ハロゲン化とアルキル化の順番は適宜入れ替えることができる。ハロゲン化剤としては、例えばＮ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドなどが挙げられる。反応溶媒は、反応が進行する限り特に限定はされないが、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミドが好ましい。反応温度は通常０～５０℃程度である。反応時間は通常０．５～２４時間である。アルキル化は工程Ｃ－１と同様の方法で行うことができる。
【0152】
（工程Ｃ－３）カップリング反応
工程Ｃ－３は化合物（Ｃ３）にカップリング反応を行って化合物（Ｃ４）を製造する工程である。工程Ｂ－１と同様の方法で行うことができる。
工程Ｃ－３は化合物（Ｃ３）にカップリング反応を行って化合物（Ｃ４）を製造する工程である。工程Ｂ－１と同様の方法で行うことができる。
【0153】
（工程Ｃ－４）
工程Ｃ－４は化合物（Ｃ２）または化合物（Ｃ５）に対してハロゲン化、またはハロゲン化に続くカップリング反応を行って化合物（Ｃ４）または一般式（Ｉ）で表される化合物を得る工程である。ハロゲン化は工程Ｃ－２、カップリング反応は工程Ｂ－１と同様の方法で行うことができる。
工程Ｃ－４は化合物（Ｃ２）または化合物（Ｃ５）に対してハロゲン化、またはハロゲン化に続くカップリング反応を行って化合物（Ｃ４）または一般式（Ｉ）で表される化合物を得る工程である。ハロゲン化は工程Ｃ－２、カップリング反応は工程Ｂ－１と同様の方法で行うことができる。
【0154】
（工程Ｃ－５）縮合反応
工程（Ｃ－５）は化合物（Ｃ２）または化合物（Ｃ４）のカルボキシ基の保護基を除去してカルボン酸とした後、Ａ法の化合物（Ａ２）またはＢ法の化合物（Ｂ３）を等量もしくは過剰量用いて縮合を行い、化合物（Ｃ５）または一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する工程である。カルボキシ基の脱保護はＴ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｗｕｔｓ著、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第３版、１９９９年）」に記載の方法に準じて行うことができる。縮合反応は化合物（Ｃ２）および化合物（Ｃ４）から得られたカルボン酸に対して塩基存在下、適当なスルホニル化剤または適当な縮合剤を作用させることによって行う。縮合反応では必要に応じて反応を促進する添加剤を加えることができる。スルホニル化剤としては、例えば２，４，６－トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド、ｐ－トルエンスルホニルクロリド、ベンゼンスルホニルクロリドなどが挙げられる。縮合剤としては、例えばＷＳＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド），ＤＣＣ（１，３－ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＭＴ－ＭＭ（４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド）、ＣＤＩ（１、１´－カルボニルジイミダゾール）、ＤＥＰＣ（ジエチルホスホロシアニダート）、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）などが挙げられる。塩基としては、ピリジン、ルチジンなどの芳香族アミン類やトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ＤＭＡＰ（４－ジメチルアミノピリジン）などの３級アミン類などが挙げられる。添加剤の代表的な例として、ＨＯＡｔ（３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－オール）、ＨＯＢｔ（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－オール）、ＨＯＳｕ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）などが挙げられる。反応溶媒は、反応が進行する限り特に限定はされないが、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドが好ましい。反応温度は通常、０～５０℃である。反応時間は通常、０．５～２４時間である。
工程（Ｃ－５）は化合物（Ｃ２）または化合物（Ｃ４）のカルボキシ基の保護基を除去してカルボン酸とした後、Ａ法の化合物（Ａ２）またはＢ法の化合物（Ｂ３）を等量もしくは過剰量用いて縮合を行い、化合物（Ｃ５）または一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する工程である。カルボキシ基の脱保護はＴ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｗｕｔｓ著、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第３版、１９９９年）」に記載の方法に準じて行うことができる。縮合反応は化合物（Ｃ２）および化合物（Ｃ４）から得られたカルボン酸に対して塩基存在下、適当なスルホニル化剤または適当な縮合剤を作用させることによって行う。縮合反応では必要に応じて反応を促進する添加剤を加えることができる。スルホニル化剤としては、例えば２，４，６－トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド、ｐ－トルエンスルホニルクロリド、ベンゼンスルホニルクロリドなどが挙げられる。縮合剤としては、例えばＷＳＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド），ＤＣＣ（１，３－ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＭＴ－ＭＭ（４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド）、ＣＤＩ（１、１´－カルボニルジイミダゾール）、ＤＥＰＣ（ジエチルホスホロシアニダート）、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）などが挙げられる。塩基としては、ピリジン、ルチジンなどの芳香族アミン類やトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ＤＭＡＰ（４－ジメチルアミノピリジン）などの３級アミン類などが挙げられる。添加剤の代表的な例として、ＨＯＡｔ（３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－オール）、ＨＯＢｔ（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－オール）、ＨＯＳｕ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）などが挙げられる。反応溶媒は、反応が進行する限り特に限定はされないが、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドが好ましい。反応温度は通常、０～５０℃である。反応時間は通常、０．５～２４時間である。
【0155】
（工程Ｃ－６）縮合反応
工程（Ｃ－６）は化合物（Ｃ４）のカルボキシ基の保護基を除去した後、アミン誘導体と縮合し、化合物（Ｃ６）を製造する工程である。工程（Ｃ－５）と同様の方法を用いることができる。
工程（Ｃ－６）は化合物（Ｃ４）のカルボキシ基の保護基を除去した後、アミン誘導体と縮合し、化合物（Ｃ６）を製造する工程である。工程（Ｃ－５）と同様の方法を用いることができる。
【0156】
（工程Ｃ－７）カップリング反応
工程（Ｃ－７）は化合物（Ｃ６）に対してカップリング反応を行って一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する工程である。工程（Ｂ－１）と同様の方法を用いて行うことができる。
工程（Ｃ－７）は化合物（Ｃ６）に対してカップリング反応を行って一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する工程である。工程（Ｂ－１）と同様の方法を用いて行うことができる。
【0157】
＜インスリン産生細胞＞
本発明の方法で製造されるインスリン産生細胞は、生体の膵臓β細胞と類似した機能を示すため、糖尿病の治療に有用である。本発明の製法で製造された細胞は、良好なインスリン産生能に加えて、周辺環境の糖レベルが低い状況ではインスリンを分泌量が少なく、糖レベルが高い環境ではインスリン分泌量が増加するという特性を有する。そのため、本発明の製法で製造される細胞は、低血糖のリスクが少なく、安全性が高い治療方法を提供する。
本発明の方法で製造されるインスリン産生細胞は、生体の膵臓β細胞と類似した機能を示すため、糖尿病の治療に有用である。本発明の製法で製造された細胞は、良好なインスリン産生能に加えて、周辺環境の糖レベルが低い状況ではインスリンを分泌量が少なく、糖レベルが高い環境ではインスリン分泌量が増加するという特性を有する。そのため、本発明の製法で製造される細胞は、低血糖のリスクが少なく、安全性が高い治療方法を提供する。
【0158】
本発明の方法で作製された細胞における膵臓β細胞マーカー遺伝子（例えばインスリン、ＮＫＸ６．１、およびＰＤＸ１など）のｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルでの発現を評価することにより、目的細胞であることを確認することができる。また、本発明の方法で作製された細胞のインスリン分泌能力は、以下の実施例１の方法（６）に記載された時間依存的ＧＳＩＳ活性測定により評価することができる。
【0159】
本発明の方法で作製された細胞は、時間依存的ＧＳＩＳ活性測定において、急速な第１相インスリン分泌及び／又は長期持続する第２相インスリン分泌を示すという特性を有する。また、本発明の方法で作製された細胞は、インスリン分泌促進薬（例えば、グリベンクラミドのようなＳＵ剤、エキセンディン４のようなＧＬＰ－１受容体アゴニスト、ＫＣｌなど）による刺激に反応してインスリン分泌増強、ｃ－ペプチド分泌増強などを示す特性を有する。また、機能的成熟化を示すマーカーＮＫＸ６．１の陽性率が高い、細胞当たりのインスリン分泌量が多い、という特性を有する。これらの特性から、本発明の方法で作製されたインスリン産生細胞は、膵β細胞として機能的成熟が増強された細胞であると考えられ、公知の多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞と明確に区別される細胞である。
【0160】
このようなインスリン産生細胞による治療対象は、膵臓β細胞におけるインスリン分泌異常又は分泌不全に起因する疾患の患者であり、具体的には１型糖尿病又は２型糖尿病の患者が例示される。
【0161】
このような細胞を治療に用いる場合、患者の皮下、腹腔内、膵臓内、膵臓表面、またはその周辺へ移植することができる。
【0162】
本発明の方法で製造された細胞は、三次元培養で形成された凝集体（スフェア）として移植してもよく、分散された細胞として移植しても良い。また、一度分散させた細胞を再凝集させた凝集体やシート状に加工して移植することもできる。
【0163】
以下、参考合成例、合成例、参考例、および実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【0164】
参考合成例および合成例のカラムクロマトグラフィーにおける溶出はＴＬＣ（Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、薄層クロマトグラフィー）による観察下に行われた。ＴＬＣ観察においては、ＴＬＣプレートとしてメルク（Ｍｅｒｃｋ）社製のシリカゲル６０Ｆ２５４を、展開溶媒としてはカラムクロマトグラフィーで溶出溶媒として用いられた溶媒を、検出法としてＵＶ検出器を採用した。カラム用シリカゲルは同じくメルク社製のシリカゲルＳＫ－８５（２３０～４００メッシュ）、もしくは富士シリシア化学 Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＮＨ（２００－３５０メッシュ）を用いた。通常のカラムクロマトグラフィーの他に、昭光サイエンティフィック社の自動クロマトグラフィー装置（Ｐｕｒｉｆ－α２もしくはＰｕｒｉｆ－ｅｓｐｏｉｒ２）などを適宜使用した。溶出溶媒はＴＬＣ観察を基に決定した。
【0165】
なお、以下の参考合成例、合成例、参考例、および実施例で用いる略号は、次のような意義を有する。
ｍｇ：ミリグラム，ｇ：グラム，μＬ：マイクロリットル，ｍＬ：ミリリットル，ｍｍｏｌ：ミリモル，ｍＭ：ミリモル濃度，μＭ：マイクロモル濃度，μｍ：マイクロメートル，ｍｍ：ミリメートル，ＭＨｚ：メガヘルツ。
ｍｇ：ミリグラム，ｇ：グラム，μＬ：マイクロリットル，ｍＬ：ミリリットル，ｍｍｏｌ：ミリモル，ｍＭ：ミリモル濃度，μＭ：マイクロモル濃度，μｍ：マイクロメートル，ｍｍ：ミリメートル，ＭＨｚ：メガヘルツ。
【0166】
以下の参考合成例および合成例において、核磁気共鳴（以下、１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルは、テトラメチルシランを標準物質として、ケミカルシフト値をδ値（ｐｐｍ）にて記載した。分裂パターンは一重線をｓ、二重線をｄ、三重線をｔ、四重線をｑ、多重線をｍ、ブロードをｂｒで示した。質量分析（以下、ＭＳ）は、ＥＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、ＥＳＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、もしくはＦＡＢ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）法で行った。
【実施例】
【0167】
参考合成例１
Ｎ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボン酸（１．５１ｇ，８．４３ｍｍｏｌ）、市販の５－ブロモチアゾール－２－アミン（２．６４ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）および３－ヒドロキシトリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン（１．２３ｇ，９．０４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３０ｍＬ）溶液に、１－エチル－３－(３－ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド 塩酸塩（２．４３ｇ，１２．６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．９４ｍＬ，１６．９ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液を１Ｎ塩酸および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／１０％メタノール 酢酸エチル溶液＝３／１－０／１）にて精製し、標記化合物１．８８ｇ（収率６６％）を固体として得た。
Ｎ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボン酸（１．５１ｇ，８．４３ｍｍｏｌ）、市販の５－ブロモチアゾール－２－アミン（２．６４ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）および３－ヒドロキシトリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン（１．２３ｇ，９．０４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３０ｍＬ）溶液に、１－エチル－３－(３－ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド 塩酸塩（２．４３ｇ，１２．６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．９４ｍＬ，１６．９ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液を１Ｎ塩酸および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／１０％メタノール 酢酸エチル溶液＝３／１－０／１）にて精製し、標記化合物１．８８ｇ（収率６６％）を固体として得た。
【0168】
参考合成例２
Ｎ－（４－ブロモフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－ブロモアニリンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物４．６６ｇ（収率８４％）を固体として得た。
Ｎ－（４－ブロモフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－ブロモアニリンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物４．６６ｇ（収率８４％）を固体として得た。
【0169】
参考合成例３
Ｎ－（４－ブロモ－２－フルオロ－フェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－ブロモ－２－フルオロアニリンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物３４５ｍｇ（収率５８％）を固体として得た。
Ｎ－（４－ブロモ－２－フルオロ－フェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－ブロモ－２－フルオロアニリンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物３４５ｍｇ（収率５８％）を固体として得た。
【0170】
参考合成例４
Ｎ－（５－ブロモ－４－メチル－チアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－ブロモ－４－メチル－チアゾール－２－アミンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物２５２ｍｇ（収率２５％）を固体として得た。
Ｎ－（５－ブロモ－４－メチル－チアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－ブロモ－４－メチル－チアゾール－２－アミンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物２５２ｍｇ（収率２５％）を固体として得た。
【0171】
参考合成例５
Ｎ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の２－アミノ－６－ブロモベンゾチアゾールを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物５８５ｍｇ（収率４２％）を固体として得た。
Ｎ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の２－アミノ－６－ブロモベンゾチアゾールを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物５８５ｍｇ（収率４２％）を固体として得た。
【0172】
参考合成例６
Ｎ－（４－ブロモ－２－メチル－フェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－ブロモ－２－メチル－アニリンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物５１５ｍｇ（収率６６％）を固体として得た。
Ｎ－（４－ブロモ－２－メチル－フェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－ブロモ－２－メチル－アニリンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物５１５ｍｇ（収率６６％）を固体として得た。
【0173】
参考合成例７
Ｎ－（５－ブロモ－２－ピリジル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－ブロモピリジン－２－アミンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物４５５ｍｇ（収率５８％）を固体として得た。
Ｎ－（５－ブロモ－２－ピリジル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－ブロモピリジン－２－アミンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物４５５ｍｇ（収率５８％）を固体として得た。
【0174】
参考合成例８
Ｎ－（２－クロロ－１，３－ベンゾチアゾール－６－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の２－クロロ－１，３－ベンゾチアゾール－６－アミンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物６３７ｍｇ（収率７６％）を固体として得た。
Ｎ－（２－クロロ－１，３－ベンゾチアゾール－６－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の２－クロロ－１，３－ベンゾチアゾール－６－アミンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物６３７ｍｇ（収率７６％）を固体として得た。
【0175】
参考合成例９
５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－アミン
ＷＯ２００３０１４０９５記載のＮ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－１，１－ジフェニル－メタンイミン（１．４６ｇ，４．２５ｍｍｏｌ）、市販の４－（トリフルオロメトキシ）フェニルボロン酸（４．３０ｇ，２０．０ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２．９７ｇ，２１．５ｍｍｏｌ）、水（３ｍＬ）および１，４－ジオキサン（１５ｍＬ）の混合物に［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド ジクロロメタン錯体（１：１）（３３８ｍｇ，０．４１４ｍｍｏｌ）を加えて、窒素雰囲気下、１００℃にて４時間攪拌した。反応混合物に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を合わせ、水および飽和食塩水にて洗浄した後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝９／１－３／１）にて精製した。得られた油状物のメタノール（２０ｍＬ）溶液に、１Ｎ塩酸（５ｍＬ，５．０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて５．５時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮し、析出した固体をジクロロメタンにて洗浄し、標記化合物８９７ｍｇ（収率８１％）を固体として得た。
５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－アミン
ＷＯ２００３０１４０９５記載のＮ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－１，１－ジフェニル－メタンイミン（１．４６ｇ，４．２５ｍｍｏｌ）、市販の４－（トリフルオロメトキシ）フェニルボロン酸（４．３０ｇ，２０．０ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２．９７ｇ，２１．５ｍｍｏｌ）、水（３ｍＬ）および１，４－ジオキサン（１５ｍＬ）の混合物に［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド ジクロロメタン錯体（１：１）（３３８ｍｇ，０．４１４ｍｍｏｌ）を加えて、窒素雰囲気下、１００℃にて４時間攪拌した。反応混合物に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を合わせ、水および飽和食塩水にて洗浄した後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝９／１－３／１）にて精製した。得られた油状物のメタノール（２０ｍＬ）溶液に、１Ｎ塩酸（５ｍＬ，５．０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて５．５時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮し、析出した固体をジクロロメタンにて洗浄し、標記化合物８９７ｍｇ（収率８１％）を固体として得た。
【0176】
参考合成例１０
ｔｅｒｔ－ブチル Ｎ－［５－［４－（ジメチルカルバモイル）フェニル］チアゾール－２－イル］カーバメート
市販のｔｅｒｔ－ブチル Ｎ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）カーバメート（５００ｍｇ，１．８９ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン（３０ｍＬ）溶液に、室温にて［４－（ジメチルカルバモイル）フェニル］ボロン酸（５１９ｍｇ，２．６９ｍｍｏｌ）および［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド ジクロロメタン錯体（１：１）（７４ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）を加え攪拌した。反応混合物に炭酸カリウム（７４３ｍｇ，５．３８ｍｍｏｌ）および水（３．０ｍＬ）を加え、アルゴン雰囲気下、１００℃にて４．５時間攪拌した。反応混合物に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を合わせ、水および飽和食塩水にて洗浄した後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝１００／０－９３／７、９０／１０－７０／３０）にて精製し、標記化合物１７２ｍｇ（収率２８％）を固体として得た。
ｔｅｒｔ－ブチル Ｎ－［５－［４－（ジメチルカルバモイル）フェニル］チアゾール－２－イル］カーバメート
市販のｔｅｒｔ－ブチル Ｎ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）カーバメート（５００ｍｇ，１．８９ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン（３０ｍＬ）溶液に、室温にて［４－（ジメチルカルバモイル）フェニル］ボロン酸（５１９ｍｇ，２．６９ｍｍｏｌ）および［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド ジクロロメタン錯体（１：１）（７４ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）を加え攪拌した。反応混合物に炭酸カリウム（７４３ｍｇ，５．３８ｍｍｏｌ）および水（３．０ｍＬ）を加え、アルゴン雰囲気下、１００℃にて４．５時間攪拌した。反応混合物に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を合わせ、水および飽和食塩水にて洗浄した後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝１００／０－９３／７、９０／１０－７０／３０）にて精製し、標記化合物１７２ｍｇ（収率２８％）を固体として得た。
【0177】
参考合成例１１
４－（２－アミノチアゾール－５－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルベンズアミド
参考合成例１０で得られたｔｅｒｔ－ブチル Ｎ－［５－［４－（ジメチルカルバモイル）フェニル］チアゾール－２－イル］カーバメート（１７２ｍｇ、０．４９５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に、室温にてトリフルオロ酢酸（２．０ｍＬ，２６ｍｍｏｌ）を加え、攪拌した後、放置した。反応液を減圧濃縮し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、ジクロロメタンにて抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物１１８ｍｇ（収率９６％）を固体として得た。
４－（２－アミノチアゾール－５－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルベンズアミド
参考合成例１０で得られたｔｅｒｔ－ブチル Ｎ－［５－［４－（ジメチルカルバモイル）フェニル］チアゾール－２－イル］カーバメート（１７２ｍｇ、０．４９５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に、室温にてトリフルオロ酢酸（２．０ｍＬ，２６ｍｍｏｌ）を加え、攪拌した後、放置した。反応液を減圧濃縮し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、ジクロロメタンにて抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物１１８ｍｇ（収率９６％）を固体として得た。
【0178】
参考合成例１２
５－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）チアゾール－２－アミン
市販の１，３－ベンゾジオキソール－５－イルボロン酸を用いて、参考合成例１０の方法に準じて成績体を得た後、参考合成例１１の方法に準じて標記化合物１２３ｍｇ（３１％，２ｓｔｅｐｓ）を固体として得た。
５－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）チアゾール－２－アミン
市販の１，３－ベンゾジオキソール－５－イルボロン酸を用いて、参考合成例１０の方法に準じて成績体を得た後、参考合成例１１の方法に準じて標記化合物１２３ｍｇ（３１％，２ｓｔｅｐｓ）を固体として得た。
【0179】
参考合成例１３
４－（２－アミノチアゾール－５－イル）ベンゾニトリル
市販の４－（２－オキソエチル）ベンゾニトリル（１４２ｍｇ，０９７８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍL）溶液に、氷冷下、臭素（５６μL，１．０９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（０．５６ｍL）溶液を加えた。反応液を室温まで戻した後、３時間攪拌した。氷冷下、反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え中和した後、ジクロロメタンにて抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣のエタノール（３０ｍL）溶液に、チオウレア（１５０ｍｇ，１．９７ｍｍｏｌ）を加え、４．５時間加熱還流下、攪拌した。冷却後、減圧下にて溶媒を留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝９９／１－９５／５）にて精製し、標記化合物８．３ｍｇ（４．２％）を固体として得た。
４－（２－アミノチアゾール－５－イル）ベンゾニトリル
市販の４－（２－オキソエチル）ベンゾニトリル（１４２ｍｇ，０９７８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍL）溶液に、氷冷下、臭素（５６μL，１．０９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（０．５６ｍL）溶液を加えた。反応液を室温まで戻した後、３時間攪拌した。氷冷下、反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え中和した後、ジクロロメタンにて抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣のエタノール（３０ｍL）溶液に、チオウレア（１５０ｍｇ，１．９７ｍｍｏｌ）を加え、４．５時間加熱還流下、攪拌した。冷却後、減圧下にて溶媒を留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝９９／１－９５／５）にて精製し、標記化合物８．３ｍｇ（４．２％）を固体として得た。
【0180】
参考合成例１４
ｔｅｒｔ－ブチル ２－［４－［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）チアゾール－５－イル］フェノキシ］アセテート
市販のｔｅｒｔ－ブチル ２－［４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）フェノキシ］アセテート（２．４ｇ，７．２ｍｍｏｌ）を用いて、参考合成例１０の方法に準じて標記化合物２４８ｍｇ（１１％）を固体として得た。
ｔｅｒｔ－ブチル ２－［４－［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）チアゾール－５－イル］フェノキシ］アセテート
市販のｔｅｒｔ－ブチル ２－［４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）フェノキシ］アセテート（２．４ｇ，７．２ｍｍｏｌ）を用いて、参考合成例１０の方法に準じて標記化合物２４８ｍｇ（１１％）を固体として得た。
【0181】
参考合成例１５
メチル ２－［４－（２－アミノチアゾール－５－イル）フェノキシ］アセテート
参考合成例１４で得られたｔｅｒｔ－ブチル ２－［４－［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）チアゾール－５－イル］フェノキシ］アセテート（１９３ｍｇ，０．４７５ｍｍｏｌ）を用いて、参考合成例１１の方法に準じて固体を得た。得られた固体のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）およびメタノール（３ｍＬ）の混合溶液に、室温にてトリメチルシリルジアゾメタン（０．６Ｍ ヘキサン溶液，１．０ｍL）を加え、６時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、ジクロロメタンにて抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝９９／１－９７／３）にて精製し、標記化合物９２．５ｍｇ（収率７４％）を固体として得た。
メチル ２－［４－（２－アミノチアゾール－５－イル）フェノキシ］アセテート
参考合成例１４で得られたｔｅｒｔ－ブチル ２－［４－［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）チアゾール－５－イル］フェノキシ］アセテート（１９３ｍｇ，０．４７５ｍｍｏｌ）を用いて、参考合成例１１の方法に準じて固体を得た。得られた固体のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）およびメタノール（３ｍＬ）の混合溶液に、室温にてトリメチルシリルジアゾメタン（０．６Ｍ ヘキサン溶液，１．０ｍL）を加え、６時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、ジクロロメタンにて抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝９９／１－９７／３）にて精製し、標記化合物９２．５ｍｇ（収率７４％）を固体として得た。
【0182】
参考合成例１６
メチル ２－［４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］フェノキシ］アセテート
参考合成例１５で得られたメチル ２－［４－（２－アミノチアゾール－５－イル）フェノキシ］アセテートを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物８５．７ｍｇ（収率８９％）を固体として得た。
メチル ２－［４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］フェノキシ］アセテート
参考合成例１５で得られたメチル ２－［４－（２－アミノチアゾール－５－イル）フェノキシ］アセテートを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物８５．７ｍｇ（収率８９％）を固体として得た。
【0183】
参考合成例１７
メチル ２－ブロモ－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート
市販のメチル ８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート（２６１ｍｇ，１．３５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５ｍＬ）溶液に、室温にてＮ－ブロモスクシンイミド（２２８ｍｇ，１．２８ｍｍｏｌ）を加え、４時間攪拌した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝４／１－２／１）にて精製し、標記化合物５６．９ｍｇ（収率１６％）を固体として得た。
メチル ２－ブロモ－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート
市販のメチル ８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート（２６１ｍｇ，１．３５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５ｍＬ）溶液に、室温にてＮ－ブロモスクシンイミド（２２８ｍｇ，１．２８ｍｍｏｌ）を加え、４時間攪拌した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝４／１－２／１）にて精製し、標記化合物５６．９ｍｇ（収率１６％）を固体として得た。
【0184】
参考合成例１８
２－ブロモ－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１７で得られたメチル ２－ブロモ－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート（５６．９ｍｇ，０．２０９ｍｍｏｌ）のエタノール（２ｍＬ）溶液に、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（０．５ｍＬ，０．５０ｍｍｏｌ）を加え、６０℃にて２時間攪拌した。１Ｎ塩酸を用いて酸性とした後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去し、黄色固体（５２．５ｍｇ）を得た。得られた固体（５２．５ｍｍｏｌ）および参考合成例９で得られた５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－アミンを用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物４８．０ｍｇ（収率５５％）を固体として得た。
２－ブロモ－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１７で得られたメチル ２－ブロモ－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート（５６．９ｍｇ，０．２０９ｍｍｏｌ）のエタノール（２ｍＬ）溶液に、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（０．５ｍＬ，０．５０ｍｍｏｌ）を加え、６０℃にて２時間攪拌した。１Ｎ塩酸を用いて酸性とした後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去し、黄色固体（５２．５ｍｇ）を得た。得られた固体（５２．５ｍｍｏｌ）および参考合成例９で得られた５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－アミンを用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物４８．０ｍｇ（収率５５％）を固体として得た。
【0185】
参考合成例１９
Ｎ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－２－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１７で得られたメチル ２－ブロモ－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート（６５．２ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）、市販の２，４，６－トリメチル－１，３，５，２，４，６－トリオキサトリボリナン（０，２０１ｍＬ，１．４４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１７１ｍｇ，１．２４ｍｍｏｌ）の混合物に１，４－ジオキサン（１．５ｍＬ）および水（０．５ｍＬ）を加えた後、［１，１‘－ビス（ジ－ｔｅｒｔ－ブチルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド（１５．６ｍｇ，０．０２４ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、１００℃にて２．５時間攪拌した。反応液に水および１Ｎ塩酸を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣を用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物２３．９ｍｇ（収率２２％）を固体として得た。
Ｎ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－２－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１７で得られたメチル ２－ブロモ－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート（６５．２ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）、市販の２，４，６－トリメチル－１，３，５，２，４，６－トリオキサトリボリナン（０，２０１ｍＬ，１．４４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１７１ｍｇ，１．２４ｍｍｏｌ）の混合物に１，４－ジオキサン（１．５ｍＬ）および水（０．５ｍＬ）を加えた後、［１，１‘－ビス（ジ－ｔｅｒｔ－ブチルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド（１５．６ｍｇ，０．０２４ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、１００℃にて２．５時間攪拌した。反応液に水および１Ｎ塩酸を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣を用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物２３．９ｍｇ（収率２２％）を固体として得た。
【0186】
参考合成例２０
メチル ２－クロロ－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート
市販のＮ－クロロスクシンイミドを用いて、参考合成例１７の方法に準じて標記化合物５６．３ｍｇ（収率５．２％）を固体として得た。
メチル ２－クロロ－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート
市販のＮ－クロロスクシンイミドを用いて、参考合成例１７の方法に準じて標記化合物５６．３ｍｇ（収率５．２％）を固体として得た。
【0187】
参考合成例２１
メチル ５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキシレート
市販のメチル ８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート（９８７ｍｇ，４．８９ｍｍｏｌ）およびヨウ化メチル（１．２７ｍＬ，２０．４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液に、－７８℃において１．０Ｍ カリウム ビス（トリメチルシリル）アミド テトラヒドロフラン溶液（１１．２ｍＬ，１１．２ｍｍｏｌ）を３０分以上かけて滴下した。同温度で１時間攪拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えてクエンチした。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝６／１－１／１）にて精製し、標記化合物５９２ｍｇ（収率５６％）を油状物として得た。
メチル ５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキシレート
市販のメチル ８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート（９８７ｍｇ，４．８９ｍｍｏｌ）およびヨウ化メチル（１．２７ｍＬ，２０．４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液に、－７８℃において１．０Ｍ カリウム ビス（トリメチルシリル）アミド テトラヒドロフラン溶液（１１．２ｍＬ，１１．２ｍｍｏｌ）を３０分以上かけて滴下した。同温度で１時間攪拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えてクエンチした。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝６／１－１／１）にて精製し、標記化合物５９２ｍｇ（収率５６％）を油状物として得た。
【0188】
参考合成例２２
５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボン酸
参考合成例２１で得られたメチル ５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキシレート（６３．０ｍｇ，０．３０４ｍｍｏｌ）のエタノール（１．０ｍＬ）溶液に、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（０．９１ｍＬ，０．９１ｍｍｏｌ）を加え、８０℃にて２時間攪拌した。反応液に１Ｎ塩酸を加えて中和した後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物４８．３ｍｇ（収率８２％）を固体として得た。
５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボン酸
参考合成例２１で得られたメチル ５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキシレート（６３．０ｍｇ，０．３０４ｍｍｏｌ）のエタノール（１．０ｍＬ）溶液に、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（０．９１ｍＬ，０．９１ｍｍｏｌ）を加え、８０℃にて２時間攪拌した。反応液に１Ｎ塩酸を加えて中和した後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物４８．３ｍｇ（収率８２％）を固体として得た。
【0189】
参考合成例２３
Ｎ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例２２で得られた５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボン酸（４７２ｍｇ，２．４４ｍｍｏｌ）を用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物６２８ｍｇ（収率７３％）を固体として得た。
Ｎ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例２２で得られた５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボン酸（４７２ｍｇ，２．４４ｍｍｏｌ）を用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物６２８ｍｇ（収率７３％）を固体として得た。
【0190】
参考合成例２４
Ｎ－（５－ブロモ－４－イソプロピル－チアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－ブロモ－４－イソプロピル－チアゾール－２－アミンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物２８７ｍｇ（収率４３％）を固体として得た。
Ｎ－（５－ブロモ－４－イソプロピル－チアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－ブロモ－４－イソプロピル－チアゾール－２－アミンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物２８７ｍｇ（収率４３％）を固体として得た。
【0191】
参考合成例２５
メチル ５－ブロモ－２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－４－カルボキシレート
市販のメチル ２－アミノ－５－ブロモチアゾール－４－カルボキシレートを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物２１９ｍｇ（収率２９％）をアモルファス状物として得た。
メチル ５－ブロモ－２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－４－カルボキシレート
市販のメチル ２－アミノ－５－ブロモチアゾール－４－カルボキシレートを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物２１９ｍｇ（収率２９％）をアモルファス状物として得た。
【0192】
合成例１
８－オキソ－Ｎ－（５－フェニルチアゾール－２－イル）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボン酸（１．５ｇ，８．４ｍｍｏｌ）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８３， ２６， １１５８－１１６３記載の５－フェニルチアゾール－２－アミン（１．０ｇ，５．７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルピリジン－４－アミン（０．１４ｇ，１．１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．５ｍＬ，１４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液に、室温にて市販の２，４，６－トリイソプロピルスルホニル クロリド（２．５ｇ，８．３ｍｍｏｌ）を加え、３時間攪拌した。反応液にジクロロメタンを加え希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝９９／１－９５／５）にて精製し、標記化合物１．５９ｇ（収率８３％）を固体として得た。
８－オキソ－Ｎ－（５－フェニルチアゾール－２－イル）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボン酸（１．５ｇ，８．４ｍｍｏｌ）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８３， ２６， １１５８－１１６３記載の５－フェニルチアゾール－２－アミン（１．０ｇ，５．７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルピリジン－４－アミン（０．１４ｇ，１．１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．５ｍＬ，１４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液に、室温にて市販の２，４，６－トリイソプロピルスルホニル クロリド（２．５ｇ，８．３ｍｍｏｌ）を加え、３時間攪拌した。反応液にジクロロメタンを加え希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝９９／１－９５／５）にて精製し、標記化合物１．５９ｇ（収率８３％）を固体として得た。
【0193】
合成例２
メチル ４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］ベンゾエート
ＷＯ２０１２１２１１６８記載のメチル ４－（２－アミノチアゾール－５－イル）ベンゾエートを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物１８．４ｇ（収率５４％）を固体として得た。
メチル ４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］ベンゾエート
ＷＯ２０１２１２１１６８記載のメチル ４－（２－アミノチアゾール－５－イル）ベンゾエートを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物１８．４ｇ（収率５４％）を固体として得た。
【0194】
合成例３
Ｎ－［５－［４－（ジメチルカルバモイル）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１１で得られた４－（２－アミノチアゾール－５－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルベンズアミドを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物７．１７ｇ（収率７５％）を固体として得た。
Ｎ－［５－［４－（ジメチルカルバモイル）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１１で得られた４－（２－アミノチアゾール－５－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルベンズアミドを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物７．１７ｇ（収率７５％）を固体として得た。
【0195】
合成例４
Ｎ－［５－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１２で得られた５－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物１３０ｍｇ（収率６２％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１２で得られた５－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物１３０ｍｇ（収率６２％）を固体として得た。
【0196】
合成例５
４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］安息香酸
合成例２で得られたメチル ４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］ベンゾエート（３８３ｍｇ，０．９６９ｍｍｏｌ）のエタノール（３ｍＬ）および水（２ｍＬ）の混合溶液に、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（３．８ｍＬ，３．８ｍｍｏｌ）を加え、５０℃にて４時間攪拌した。反応液に水を加え、１Ｎ塩酸にて中和し、析出した固体をろ取した。得られた固体を水で洗浄した後、乾燥し、標記化合物３２６ｍｇ（収率８８％）を固体として得た。
４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］安息香酸
合成例２で得られたメチル ４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］ベンゾエート（３８３ｍｇ，０．９６９ｍｍｏｌ）のエタノール（３ｍＬ）および水（２ｍＬ）の混合溶液に、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（３．８ｍＬ，３．８ｍｍｏｌ）を加え、５０℃にて４時間攪拌した。反応液に水を加え、１Ｎ塩酸にて中和し、析出した固体をろ取した。得られた固体を水で洗浄した後、乾燥し、標記化合物３２６ｍｇ（収率８８％）を固体として得た。
【0197】
合成例６
Ｎ－［５－（４－カルバモイルフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
合成例５で得られた４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］安息香酸（１７ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）溶液に、室温にて［ジメチルアミノ（トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イロキシ）メチレン］－ジメチル－アンモニウム ヘキサフルオロホスフェート（２５ｍｇ，０．０６７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３９μＬ，０．２２ｍｍｏｌ）および７Ｍアンモニア メタノール溶液（６４μＬ，０．４５ｍｍｏｌ）を加え、１５時間攪拌した。反応液を直接シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／５０％メタノール 酢酸エチル溶液 ＝９５／５－９０／１０）にて精製し、標記化合物４．９ｍｇ（収率２９％）を得た。
Ｎ－［５－（４－カルバモイルフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
合成例５で得られた４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］安息香酸（１７ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）溶液に、室温にて［ジメチルアミノ（トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イロキシ）メチレン］－ジメチル－アンモニウム ヘキサフルオロホスフェート（２５ｍｇ，０．０６７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３９μＬ，０．２２ｍｍｏｌ）および７Ｍアンモニア メタノール溶液（６４μＬ，０．４５ｍｍｏｌ）を加え、１５時間攪拌した。反応液を直接シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／５０％メタノール 酢酸エチル溶液 ＝９５／５－９０／１０）にて精製し、標記化合物４．９ｍｇ（収率２９％）を得た。
【0198】
合成例７
Ｎ－［５－（４－シアノフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１３で得られた４－（２－アミノチアゾール－５－イル）ベンゾニトリルを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物９．０ｍｇ（収率６０％）を得た。
Ｎ－［５－（４－シアノフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１３で得られた４－（２－アミノチアゾール－５－イル）ベンゾニトリルを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物９．０ｍｇ（収率６０％）を得た。
【0199】
合成例８
Ｎ－［５－［４－［２－（ジメチルアミノ）－２－オキソ－エトキシ］フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１６で得られたメチル ２－［４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］フェノキシ］アセテート（８４ｍｇ，０．１９７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（８．０ｍＬ）およびメタノール（３．０ｍＬ）の混合溶液に、室温にて５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（０．２０ｍＬ，１．０ｍｍｏｌ）を加え、攪拌した後、一晩放置した。５Ｎ塩酸にて中和し、減圧下にて溶媒を留去し固体を得た。得られた固体のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）溶液に、室温にてＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５２μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）および２．０Ｍジメチルアミン テトラヒドロフラン溶液（０．５０ｍＬ, １．０ｍｍｏｌ）を加えた後、［ジメチルアミノ（トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イロキシ）メチレン］ジメチルアンモニウム ヘキサフルオロホスフェート（４２ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）を加え、３時間攪拌した。反応液にジクロロメタンを加え希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝９９／１－９５／５）にて精製し、標記化合物３９．１ｍｇ（収率８９％）を固体として得た。
Ｎ－［５－［４－［２－（ジメチルアミノ）－２－オキソ－エトキシ］フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１６で得られたメチル ２－［４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］フェノキシ］アセテート（８４ｍｇ，０．１９７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（８．０ｍＬ）およびメタノール（３．０ｍＬ）の混合溶液に、室温にて５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（０．２０ｍＬ，１．０ｍｍｏｌ）を加え、攪拌した後、一晩放置した。５Ｎ塩酸にて中和し、減圧下にて溶媒を留去し固体を得た。得られた固体のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）溶液に、室温にてＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５２μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）および２．０Ｍジメチルアミン テトラヒドロフラン溶液（０．５０ｍＬ, １．０ｍｍｏｌ）を加えた後、［ジメチルアミノ（トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イロキシ）メチレン］ジメチルアンモニウム ヘキサフルオロホスフェート（４２ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）を加え、３時間攪拌した。反応液にジクロロメタンを加え希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝９９／１－９５／５）にて精製し、標記化合物３９．１ｍｇ（収率８９％）を固体として得た。
【0200】
合成例９
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボン酸（１０９ｍｇ，０．６１ｍｍｏｌ）、参考合成例９で得られた５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－アミン（１２７ｍｇ，０．４８８ｍｍｏｌ）、３－ヒドロキシトリアゾール［４，５－ｂ］ピリジン（１２８ｍｇ，０．９４１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍＬ）溶液に、室温にて１－エチル－３－(３－ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド 塩酸塩（３５２ｍｇ，１．８４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．５３１ｍＬ，３．０５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液をジクロロメタンにて希釈した後、水および飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、ろ過し、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル溶液＝３／１－０／１）にて精製し、標記化合物７４．３ｍｇ（収率２９％）を固体として得た。
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボン酸（１０９ｍｇ，０．６１ｍｍｏｌ）、参考合成例９で得られた５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－アミン（１２７ｍｇ，０．４８８ｍｍｏｌ）、３－ヒドロキシトリアゾール［４，５－ｂ］ピリジン（１２８ｍｇ，０．９４１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍＬ）溶液に、室温にて１－エチル－３－(３－ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド 塩酸塩（３５２ｍｇ，１．８４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．５３１ｍＬ，３．０５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液をジクロロメタンにて希釈した後、水および飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、ろ過し、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル溶液＝３／１－０／１）にて精製し、標記化合物７４．３ｍｇ（収率２９％）を固体として得た。
【0201】
合成例１０
（５Ｒ）－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド および
（５Ｓ）－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
合成例９で得られた８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドを用いてＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ ＣＨＩＲＡＬ ＡＲＴ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ＳＢ（５μｍ） ２５０ｘ３０ｍｍＩ．Ｄ．、流速：３１．８ｍｌ／ｍｉｎ、溶媒：ｎ－ヘキサン／エタノール＝７０／３０）にて光学分割を行った。先に溶出する第一ピークを集めた後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物（４８ｍｇ，光学純度 ９９．９％ｅｅ）を固体として得た。また、後から溶出する第二ピークを集めた後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物（４８ｍｇ，光学純度 ９９．８％ｅｅ）を固体として得た。
（５Ｒ）－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド および
（５Ｓ）－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
合成例９で得られた８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドを用いてＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ ＣＨＩＲＡＬ ＡＲＴ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ＳＢ（５μｍ） ２５０ｘ３０ｍｍＩ．Ｄ．、流速：３１．８ｍｌ／ｍｉｎ、溶媒：ｎ－ヘキサン／エタノール＝７０／３０）にて光学分割を行った。先に溶出する第一ピークを集めた後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物（４８ｍｇ，光学純度 ９９．９％ｅｅ）を固体として得た。また、後から溶出する第二ピークを集めた後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物（４８ｍｇ，光学純度 ９９．８％ｅｅ）を固体として得た。
【0202】
合成例１１
Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１で得られたＮ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド（１３７ｍｇ，０．４０１ｍｍｏｌ）、市販の（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）ボロン酸（３８９ｍｇ，２．０１ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（６７０ｍｇ，２．０６ｍｍｏｌ）の混合物にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）および水（１ｍＬ）を加えた後、クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２´，４´，６´－トリイソプロピル－１，１´－ビフェニル）［２－（２´－アミノ－１，１´－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）（３３．２ｍｇ，０．０４２ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、９０℃にて５時間攪拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝３／１－０／１）にて精製し、標記化合物６３．３ｍｇ（収率３９％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１で得られたＮ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド（１３７ｍｇ，０．４０１ｍｍｏｌ）、市販の（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）ボロン酸（３８９ｍｇ，２．０１ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（６７０ｍｇ，２．０６ｍｍｏｌ）の混合物にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）および水（１ｍＬ）を加えた後、クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２´，４´，６´－トリイソプロピル－１，１´－ビフェニル）［２－（２´－アミノ－１，１´－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）（３３．２ｍｇ，０．０４２ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、９０℃にて５時間攪拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝３／１－０／１）にて精製し、標記化合物６３．３ｍｇ（収率３９％）を固体として得た。
【0203】
合成例１２
Ｎ－［５－（４－クロロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－クロロフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１１．０ｍｇ（収率６．４％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（４－クロロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－クロロフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１１．０ｍｇ（収率６．４％）を固体として得た。
【0204】
合成例１３
Ｎ－［５－（３－クロロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－（３－クロロフェニル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物１５８ｍｇ（収率４８％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（３－クロロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－（３－クロロフェニル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物１５８ｍｇ（収率４８％）を固体として得た。
【0205】
合成例１４
Ｎ－［５－（２－クロロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の２－クロロフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１３．２ｍｇ（収率８．０％）を得た。
Ｎ－［５－（２－クロロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の２－クロロフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１３．２ｍｇ（収率８．０％）を得た。
【0206】
合成例１５
Ｎ－［５－（３－フルオロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－（３－フルオロフェニル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物１２７ｍｇ（収率８７％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（３－フルオロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－（３－フルオロフェニル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物１２７ｍｇ（収率８７％）を固体として得た。
【0207】
合成例１６
Ｎ－［５－（４－フルオロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－（４－フルオロフェニル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物１９８ｍｇ（収率６４％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（４－フルオロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－（４－フルオロフェニル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物１９８ｍｇ（収率６４％）を固体として得た。
【0208】
合成例１７
Ｎ－［５－（２－フルオロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－（２－フルオロフェニル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物１１９ｍｇ（収率８２％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（２－フルオロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－（２－フルオロフェニル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物１１９ｍｇ（収率８２％）を固体として得た。
【0209】
合成例１８
８－オキソ－Ｎ－［５－（ｐ－トリル）チアゾール］－２－イル）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－メチルフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物２４．７ｍｇ（収率１８％）を固体として得た。
８－オキソ－Ｎ－［５－（ｐ－トリル）チアゾール］－２－イル）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－メチルフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物２４．７ｍｇ（収率１８％）を固体として得た。
【0210】
合成例１９
Ｎ－［５－（ｏ－トリル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の２－メチルフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１６．６ｍｇ（収率１１％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（ｏ－トリル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の２－メチルフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１６．６ｍｇ（収率１１％）を固体として得た。
【0211】
合成例２０
Ｎ－［５－（ｍ－トリル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－（ｍ－トリル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物１１５ｍｇ（収率５８％）を得た。
Ｎ－［５－（ｍ－トリル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－（ｍ－トリル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物１１５ｍｇ（収率５８％）を得た。
【0212】
合成例２１
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（トリフルオロメチル）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物３２．９ｍｇ（収率１７％）を得た。
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（トリフルオロメチル）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物３２．９ｍｇ（収率１７％）を得た。
【0213】
合成例２２
Ｎ－［５－［４－（２－メトキシフェニル）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（２－メトキシフェニル）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物３．６ｍｇ（収率１６％）を得た。
Ｎ－［５－［４－（２－メトキシフェニル）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（２－メトキシフェニル）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物３．６ｍｇ（収率１６％）を得た。
【0214】
合成例２３
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（ｐ－トリル）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（ｐ－トリル）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．０ｍｇ（収率４２％）を得た。
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（ｐ－トリル）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（ｐ－トリル）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．０ｍｇ（収率４２％）を得た。
【0215】
合成例２４
Ｎ－［５－（２－ナフチル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４，４，５，５－テトラメチル－２－（２－ナフチル）－１，３，２－ジオキサボロランを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１．６ｍｇ（収率８．２％）を得た。
Ｎ－［５－（２－ナフチル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４，４，５，５－テトラメチル－２－（２－ナフチル）－１，３，２－ジオキサボロランを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１．６ｍｇ（収率８．２％）を得た。
【0216】
合成例２５
８－オキソ－Ｎ－［５－［３－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［３－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．０ｍｇ（収率４３％）を得た。
８－オキソ－Ｎ－［５－［３－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［３－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．０ｍｇ（収率４３％）を得た。
【0217】
合成例２６
Ｎ－［５－（４－メトキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－メトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１９．７ｍｇ（収率１７％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（４－メトキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－メトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１９．７ｍｇ（収率１７％）を固体として得た。
【0218】
合成例２７
Ｎ－［５－（３－メトキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（３－メトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１．９ｍｇ（収率３８％）を得た。
Ｎ－［５－（３－メトキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（３－メトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１．９ｍｇ（収率３８％）を得た。
【0219】
合成例２８
Ｎ－［５－［２－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［２－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物４．２ｍｇ（収率１９％）を得た。
Ｎ－［５－［２－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［２－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物４．２ｍｇ（収率１９％）を得た。
【0220】
合成例２９
Ｎ－［５－［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物８．４ｍｇ（収率３８％）を得た。
Ｎ－［５－［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物８．４ｍｇ（収率３８％）を得た。
【0221】
合成例３０
Ｎ－［５－［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物２．８ｍｇ（収率１２％）を得た。
Ｎ－［５－［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物２．８ｍｇ（収率１２％）を得た。
【0222】
合成例３１
Ｎ－［５－［３－（ヒドロキシメチル）－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［３－（ヒドロキシメチル）－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．１ｍｇ（収率４０％）を得た。
Ｎ－［５－［３－（ヒドロキシメチル）－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［３－（ヒドロキシメチル）－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．１ｍｇ（収率４０％）を得た。
【0223】
合成例３２
Ｎ－［５－（４－ベンジルオキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－ベンジルオキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．６ｍｇ（収率３４％）を得た。
Ｎ－［５－（４－ベンジルオキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－ベンジルオキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．６ｍｇ（収率３４％）を得た。
【0224】
合成例３３
Ｎ－［５－（４－イソプロポキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－イソプロポキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物２９．０ｍｇ（収率２４％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（４－イソプロポキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－イソプロポキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物２９．０ｍｇ（収率２４％）を固体として得た。
【0225】
合成例３４
Ｎ－（４－メチル－５－フェニルチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－メチル－５－フェニルチアゾール－２－アミンを用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物１６０ｍｇ（収率８２％）を得た。
Ｎ－（４－メチル－５－フェニルチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－メチル－５－フェニルチアゾール－２－アミンを用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物１６０ｍｇ（収率８２％）を得た。
【0226】
合成例３５
Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例４で得られたＮ－（５－ブロモ－４－メチルチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド（１０６ｍｇ，０．３００ｍｍｏｌ）、市販の（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）ボロン酸（２９２ｍｇ，１．５０ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（５９６ｍｇ，１．８３ｍｍｏｌ）の混合物にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）および水（１ｍＬ）を加えた後、クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２´，４´，６´－トリイソプロピル－１，１´－ビフェニル）［２－（２´－アミノ－１，１´－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）（２５．０ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、９０℃にて５時間攪拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝３／１－０／１）にて精製した後、得られた固体をジエチルエーテルにて洗浄し、標記化合物６５．０ｍｇ（収率５１％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例４で得られたＮ－（５－ブロモ－４－メチルチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド（１０６ｍｇ，０．３００ｍｍｏｌ）、市販の（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）ボロン酸（２９２ｍｇ，１．５０ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（５９６ｍｇ，１．８３ｍｍｏｌ）の混合物にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）および水（１ｍＬ）を加えた後、クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２´，４´，６´－トリイソプロピル－１，１´－ビフェニル）［２－（２´－アミノ－１，１´－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）（２５．０ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、９０℃にて５時間攪拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝３／１－０／１）にて精製した後、得られた固体をジエチルエーテルにて洗浄し、標記化合物６５．０ｍｇ（収率５１％）を固体として得た。
【0227】
合成例３６
Ｎ－［４－メチル－５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物７２．０ｍｇ（収率４９％）を得た。
Ｎ－［４－メチル－５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物７２．０ｍｇ（収率４９％）を得た。
【0228】
合成例３７
Ｎ－［５－［４－（ヒドロキシメチル）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（ヒドロキシメチル）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物５．３ｍｇ（収率２９％）を得た。
Ｎ－［５－［４－（ヒドロキシメチル）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（ヒドロキシメチル）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物５．３ｍｇ（収率２９％）を得た。
【0229】
合成例３８
Ｎ－［５－［４－（２－メトキシエトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（２－メトキシエトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物０．６ｍｇ（収率２．７％）を得た。
Ｎ－［５－［４－（２－メトキシエトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（２－メトキシエトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物０．６ｍｇ（収率２．７％）を得た。
【0230】
合成例３９
Ｎ－［５－［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．０ｍｇ（収率３５％）を得た。
Ｎ－［５－［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．０ｍｇ（収率３５％）を得た。
【0231】
合成例４０
Ｎ－［５－（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．４ｍｇ（収率４５％）を得た。
Ｎ－［５－（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．４ｍｇ（収率４５％）を得た。
【0232】
合成例４１
Ｎ－［５－（４－モルフォリノフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－［４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）フェニル］モルホリンを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物２７．６ｍｇ（収率２４％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（４－モルフォリノフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－［４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）フェニル］モルホリンを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物２７．６ｍｇ（収率２４％）を固体として得た。
【0233】
合成例４２
Ｎ－［５－［４－（ジメチルスルファモイル）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（ジメチルスルファモイル）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．７ｍｇ（収率４４％）を得た。
Ｎ－［５－［４－（ジメチルスルファモイル）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（ジメチルスルファモイル）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．７ｍｇ（収率４４％）を得た。
【0234】
合成例４３
Ｎ－［５－（４－ベンジルオキシ－３－フルオロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－ベンジルオキシ－３－フルオロフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物６２．８ｍｇ（収率３３％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（４－ベンジルオキシ－３－フルオロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－ベンジルオキシ－３－フルオロフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物６２．８ｍｇ（収率３３％）を固体として得た。
【0235】
合成例４４
Ｎ－［５－（４－ベンジルオキシ－２－フルオロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－ベンジルオキシ－２－フルオロフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．７ｍｇ（収率４２％）を得た。
Ｎ－［５－（４－ベンジルオキシ－２－フルオロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－ベンジルオキシ－２－フルオロフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．７ｍｇ（収率４２％）を得た。
【0236】
合成例４５
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物５３．０ｍｇ（収率２８％）を固体として得た。
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物５３．０ｍｇ（収率２８％）を固体として得た。
【0237】
合成例４６
８－オキソ－Ｎ－［５－（４－フェノキシフェニル）チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－フェノキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物５３．０ｍｇ（収率２９％）を固体として得た。
８－オキソ－Ｎ－［５－（４－フェノキシフェニル）チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－フェノキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物５３．０ｍｇ（収率２９％）を固体として得た。
【0238】
合成例４７
Ｎ－［５－（４－ブロモフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－（４－ブロモフェニル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物７５５ｍｇ（収率５９％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（４－ブロモフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の５－（４－ブロモフェニル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物７５５ｍｇ（収率５９％）を固体として得た。
【0239】
合成例４８
ｔｅｒｔ－ブチル ［４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］フェニル］カーボネート
市販の（４－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルオキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１．０ｍｇ（収率４．３％）得た。
ｔｅｒｔ－ブチル ［４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］フェニル］カーボネート
市販の（４－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルオキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１．０ｍｇ（収率４．３％）得た。
【0240】
合成例４９
Ｎ－［５－（４－イソブトキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－イソブトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物６．５ｍｇ（収率３２％）を得た。
Ｎ－［５－（４－イソブトキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－イソブトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物６．５ｍｇ（収率３２％）を得た。
【0241】
合成例５０
Ｎ－［５－（シクロヘキセン－１－イル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の２－（シクロヘキセン－１－イル）－４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロランを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１３．８ｍｇ（収率１３％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（シクロヘキセン－１－イル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の２－（シクロヘキセン－１－イル）－４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロランを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１３．８ｍｇ（収率１３％）を固体として得た。
【0242】
合成例５１
ｔｅｒｔ－ブチル ４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレート
市販のｔｅｒｔ－ブチル ４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレートを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．７ｍｇ（収率３５％）を得た。
ｔｅｒｔ－ブチル ４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレート
市販のｔｅｒｔ－ブチル ４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレートを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．７ｍｇ（収率３５％）を得た。
【0243】
合成例５２
Ｎ－［５－（５－クロロ－６－イソブトキシ－３－ピリジル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（５－クロロ－６－イソブトキシ－３－ピリジル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物３．２ｍｇ（収率１５％）を得た。
Ｎ－［５－（５－クロロ－６－イソブトキシ－３－ピリジル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（５－クロロ－６－イソブトキシ－３－ピリジル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物３．２ｍｇ（収率１５％）を得た。
【0244】
合成例５３
ｔｅｒｔ－ブチル ３－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］－２，５－ジヒドロピロール－１－カルボキシレート
市販のｔｅｒｔ－ブチル ３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－２，５－ジヒドロピロール－１－カルボキシレートを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．６ｍｇ（収率３５％）を得た。
ｔｅｒｔ－ブチル ３－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］－２，５－ジヒドロピロール－１－カルボキシレート
市販のｔｅｒｔ－ブチル ３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－２，５－ジヒドロピロール－１－カルボキシレートを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．６ｍｇ（収率３５％）を得た。
【0245】
合成例５４
Ｎ－［５－（５－メチル－２－フリル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４，４，５，５－テトラメチル－２－（５－メチル－２－フリル）－１，３，２－ジオキサボロランを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．３ｍｇ（収率４３％）を得た。
Ｎ－［５－（５－メチル－２－フリル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４，４，５，５－テトラメチル－２－（５－メチル－２－フリル）－１，３，２－ジオキサボロランを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．３ｍｇ（収率４３％）を得た。
【0246】
合成例５５
Ｎ－［５－（２，４－ジメチルチアゾール－５－イル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の２，４－ジメチル－５－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）チアゾールを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物３．６ｍｇ（収率１９％）を得た。
Ｎ－［５－（２，４－ジメチルチアゾール－５－イル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の２，４－ジメチル－５－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）チアゾールを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物３．６ｍｇ（収率１９％）を得た。
【0247】
合成例５６
Ｎ－［５－（５－クロロ－２－チエニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（５－クロロ－２－チエニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１．０ｍｇ（収率５．２％）を得た。
Ｎ－［５－（５－クロロ－２－チエニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（５－クロロ－２－チエニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１．０ｍｇ（収率５．２％）を得た。
【0248】
合成例５７
Ｎ－［５－（４－アセチルフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－アセチルフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物６．２ｍｇ（収率３３％）を得た。
Ｎ－［５－（４－アセチルフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－アセチルフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物６．２ｍｇ（収率３３％）を得た。
【0249】
合成例５８
１－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－２，３－ジヒドロピロリジン－３－カルボキサミド
市販の１－オキソ－２，３－ジヒドロピロリジン－３－カルボン酸を用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物７１．９ｍｇ（収率２９％）を固体として得た。
１－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－２，３－ジヒドロピロリジン－３－カルボキサミド
市販の１－オキソ－２，３－ジヒドロピロリジン－３－カルボン酸を用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物７１．９ｍｇ（収率２９％）を固体として得た。
【0250】
合成例５９
８－オキソ－Ｎ－［６－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物５９．５ｍｇ（収率４６％）を固体として得た。
８－オキソ－Ｎ－［６－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物５９．５ｍｇ（収率４６％）を固体として得た。
【0251】
合成例６０
Ｎ－［６－［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１１．２ｍｇ（収率４９％）を得た。
Ｎ－［６－［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１１．２ｍｇ（収率４９％）を得た。
【0252】
合成例６１
Ｎ－［６－（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１２．６ｍｇ（収率５４％）を得た。
Ｎ－［６－（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１２．６ｍｇ（収率５４％）を得た。
【0253】
合成例６２
２－メチル－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１８で得られた２－ブロモ－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド（４２．８ｍｇ，０．０８５６ｍｍｏｌ）、市販の２，４，６－トリメチル－１，３，５，２，４，６－トリオキサトリボリナン（０．１２７ｍＬ，０．９０８ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１８４ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ）の混合物に１，４－ジオキサン（１．５ｍＬ）および水（０．５ｍＬ）を加えた後、クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２´４´６´－トリイソプロピル－１，１´－ビフェニル）［２－（２´－アミノ－１，１´－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）（１５．３ｍｇ，０．０１９ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、１００℃にて４時間攪拌した。原料が残存していたため、再度同様の操作を繰り返し原料の消失を確認した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝９／１－１／１）にて精製し、標記化合物５．６ｍｇ（収率１５％）を固体として得た。
２－メチル－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１８で得られた２－ブロモ－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド（４２．８ｍｇ，０．０８５６ｍｍｏｌ）、市販の２，４，６－トリメチル－１，３，５，２，４，６－トリオキサトリボリナン（０．１２７ｍＬ，０．９０８ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１８４ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ）の混合物に１，４－ジオキサン（１．５ｍＬ）および水（０．５ｍＬ）を加えた後、クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２´４´６´－トリイソプロピル－１，１´－ビフェニル）［２－（２´－アミノ－１，１´－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）（１５．３ｍｇ，０．０１９ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、１００℃にて４時間攪拌した。原料が残存していたため、再度同様の操作を繰り返し原料の消失を確認した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝９／１－１／１）にて精製し、標記化合物５．６ｍｇ（収率１５％）を固体として得た。
【0254】
合成例６３
Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）チアゾール－２－イル］－２－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１９で得られたＮ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－２－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物６．４ｍｇ（収率２２％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）チアゾール－２－イル］－２－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例１９で得られたＮ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－２－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物６．４ｍｇ（収率２２％）を固体として得た。
【0255】
合成例６４
２－クロロ－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例２０で得られたメチル ２－クロロ－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート（６６．２ｍｇ，０．２９１ｍｍｏｌ）のエタノール（１ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（１ｍＬ）混合溶液に、室温にて１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（０．５ｍＬ，０．５ｍｍｏｌ）を加え２時間攪拌した。反応液に水を加えた後、１Ｎ塩酸を加えて酸性とし、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣（カルボン酸化合物６２ｍｇ）を用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物６８．０ｍｇ（収率３７％）を固体として得た。
２－クロロ－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例２０で得られたメチル ２－クロロ－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート（６６．２ｍｇ，０．２９１ｍｍｏｌ）のエタノール（１ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（１ｍＬ）混合溶液に、室温にて１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（０．５ｍＬ，０．５ｍｍｏｌ）を加え２時間攪拌した。反応液に水を加えた後、１Ｎ塩酸を加えて酸性とし、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣（カルボン酸化合物６２ｍｇ）を用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物６８．０ｍｇ（収率３７％）を固体として得た。
【0256】
合成例６５
５－メチル－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－トリフルオロメトキシ］フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例２３で得られたＮ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド（１６８ｍｇ，０．４７５ｍｍｏｌ）、市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸（５８８ｍｇ，２．８６ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（１．０３ｇ，３．１６ｍｍｏｌ）の混合物にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）および水（１ｍＬ）を加えた後、クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２´４´６´－トリイソプロピル－１，１´－ビフェニル）［２－（２´－アミノ－１，１´－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）（３８．６ｍｇ，０．０４９ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、９０℃にて４時間攪拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝３／１－０／１）にて精製し、標記化合物５９．７ｍｇ（収率２９％）を固体として得た。
５－メチル－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－トリフルオロメトキシ］フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例２３で得られたＮ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド（１６８ｍｇ，０．４７５ｍｍｏｌ）、市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸（５８８ｍｇ，２．８６ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（１．０３ｇ，３．１６ｍｍｏｌ）の混合物にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）および水（１ｍＬ）を加えた後、クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２´４´６´－トリイソプロピル－１，１´－ビフェニル）［２－（２´－アミノ－１，１´－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）（３８．６ｍｇ，０．０４９ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、９０℃にて４時間攪拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝３／１－０／１）にて精製し、標記化合物５９．７ｍｇ（収率２９％）を固体として得た。
【0257】
合成例６６
５－メチル－８－オキソ－Ｎ－［５－（ｐ－トリル）チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－メチルフェニルボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物８．６ｍｇ（収率４７％）を得た。
５－メチル－８－オキソ－Ｎ－［５－（ｐ－トリル）チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－メチルフェニルボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物８．６ｍｇ（収率４７％）を得た。
【0258】
合成例６７
５－メチル－Ｎ－［５－（ｍ－トリル）チアゾール－２－イル］－８オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
市販の３－メチルフェニルボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物８．１ｍｇ（収率４４％）を得た。
５－メチル－Ｎ－［５－（ｍ－トリル）チアゾール－２－イル］－８オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
市販の３－メチルフェニルボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物８．１ｍｇ（収率４４％）を得た。
【0259】
合成例６８
Ｎ－［５－（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）チアゾール－２－イル］－５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
市販の（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）ボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物０．６ｍｇ（収率３．０％）を得た。
Ｎ－［５－（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）チアゾール－２－イル］－５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
市販の（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）ボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物０．６ｍｇ（収率３．０％）を得た。
【0260】
合成例６９
Ｎ－［５－（４－イソプロポキシフェニル）チアゾール－２－イル］－５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－イソプロポキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物６．８ｍｇ（収率３３％）を得た。
Ｎ－［５－（４－イソプロポキシフェニル）チアゾール－２－イル］－５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－イソプロポキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物６．８ｍｇ（収率３３％）を得た。
【0261】
合成例７０
５－メチル－Ｎ－［５－［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
市販の［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物８．３ｍｇ（収率３７％）を得た。
５－メチル－Ｎ－［５－［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
市販の［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物８．３ｍｇ（収率３７％）を得た。
【0262】
合成例７１
Ｎ－［５－［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
市販の［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物５．０ｍｇ（収率２１％）を得た。
Ｎ－［５－［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
市販の［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物５．０ｍｇ（収率２１％）を得た。
【0263】
合成例７２
５－メチル－８－オキソ－Ｎ－［５－［３－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
市販の［３－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物７．８ｍｇ（収率３６％）を得た。
５－メチル－８－オキソ－Ｎ－［５－［３－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
市販の［３－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物７．８ｍｇ（収率３６％）を得た。
【0264】
合成例７３
８－オキソ－Ｎ－［４－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例２で得られたＮ－（４－ブロモフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド（１．２１ｇ，３．６２ｍｍｏｌ）および市販の４－（トリフルオロメトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１．２９ｇ（収率８６％）を固体として得た。
８－オキソ－Ｎ－［４－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例２で得られたＮ－（４－ブロモフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド（１．２１ｇ，３．６２ｍｍｏｌ）および市販の４－（トリフルオロメトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１．２９ｇ（収率８６％）を固体として得た。
【0265】
合成例７４
Ｎ－［４－（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）フェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例２で得られたＮ－（４－ブロモフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１０．４ｍｇ（収率５０％）を得た。
Ｎ－［４－（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）フェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例２で得られたＮ－（４－ブロモフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１０．４ｍｇ（収率５０％）を得た。
【0266】
合成例７５
Ｎ－［４－［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例２で得られたＮ－（４－ブロモフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１１．５ｍｇ（収率５８％）を得た。
Ｎ－［４－［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例２で得られたＮ－（４－ブロモフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１１．５ｍｇ（収率５８％）を得た。
【0267】
合成例７６
Ｎ－［４－［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例２で得られたＮ－（４－ブロモフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．０ｍｇ（収率３１％）を得た。
Ｎ－［４－［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例２で得られたＮ－（４－ブロモフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．０ｍｇ（収率３１％）を得た。
【0268】
合成例７７
３－ブロモ－８－オキソ－Ｎ－［４－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
合成例７３で得られた８－オキソ－Ｎ－［４－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド（１５０ｍｇ，０．３６３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液に、室温にてＮ－ブロモスクシイミド（４５．９ｍｇ，０．２５８ｍｍｏｌ）を加え４．５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／１０％メタノール 酢酸エチル溶液＝３／１－１／１）にて精製し、標記化合物９３．６ｍｇ（収率５２％）を固体として得た。
３－ブロモ－８－オキソ－Ｎ－［４－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
合成例７３で得られた８－オキソ－Ｎ－［４－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド（１５０ｍｇ，０．３６３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液に、室温にてＮ－ブロモスクシイミド（４５．９ｍｇ，０．２５８ｍｍｏｌ）を加え４．５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／１０％メタノール 酢酸エチル溶液＝３／１－１／１）にて精製し、標記化合物９３．６ｍｇ（収率５２％）を固体として得た。
【0269】
合成例７８
Ｎ－［２－フルオロ－４－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例３で得られたＮ－（４－ブロモ－２－フルオロ－フェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７３．４ｍｇ（収率９１％）を固体として得た。
Ｎ－［２－フルオロ－４－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例３で得られたＮ－（４－ブロモ－２－フルオロ－フェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７３．４ｍｇ（収率９１％）を固体として得た。
【0270】
合成例７９
Ｎ－［４－［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］－２－フルオロフェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例３で得られたＮ－（４－ブロモ－２－フルオロフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物５．０ｍｇ（収率２１％）を得た。
Ｎ－［４－［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］－２－フルオロフェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例３で得られたＮ－（４－ブロモ－２－フルオロフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物５．０ｍｇ（収率２１％）を得た。
【0271】
合成例８０
Ｎ－［４－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－２－フルオロフェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例３で得られたＮ－（４－ブロモ－２－フルオロフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７５．０ｍｇ（収率８４％）を固体として得た。
Ｎ－［４－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－２－フルオロフェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例３で得られたＮ－（４－ブロモ－２－フルオロフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７５．０ｍｇ（収率８４％）を固体として得た。
【0272】
合成例８１
Ｎ－［２－メチル－４－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例６で得られたＮ－（４－ブロモ－２－メチルフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１８４ｍｇ（収率９２％）を固体として得た。
Ｎ－［２－メチル－４－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例６で得られたＮ－（４－ブロモ－２－メチルフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１８４ｍｇ（収率９２％）を固体として得た。
【0273】
合成例８２
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］－２－ピリジル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例７で得られたＮ－（５－ブロモ－２－ピリジル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物４．０ｍｇ（収率１７％）を得た。
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］－２－ピリジル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例７で得られたＮ－（５－ブロモ－２－ピリジル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物４．０ｍｇ（収率１７％）を得た。
【0274】
合成例８３
８－オキソ－Ｎ－［２－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］－１，３－ベンゾトリアゾール－６－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例８で得られたＮ－（２－クロロ－１，３－ベンゾチアゾール－６－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物８６．８ｍｇ（収率５８％）を固体として得た。
８－オキソ－Ｎ－［２－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］－１，３－ベンゾトリアゾール－６－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例８で得られたＮ－（２－クロロ－１，３－ベンゾチアゾール－６－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物８６．８ｍｇ（収率５８％）を固体として得た。
【0275】
合成例８４
Ｎ－［５－（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
市販の（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１０．４ｍｇ（収率４８％）を得た。
Ｎ－［５－（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
市販の（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１０．４ｍｇ（収率４８％）を得た。
【0276】
合成例８５
Ｎ－［５－（４－ベンジルオキシ－３－フルオロフェニル）－４－メチル－チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－ベンジルオキシ－３－フルオロフェニル）ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１０．４ｍｇ（収率４４％）を得た。
Ｎ－［５－（４－ベンジルオキシ－３－フルオロフェニル）－４－メチル－チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－ベンジルオキシ－３－フルオロフェニル）ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１０．４ｍｇ（収率４４％）を得た。
【0277】
合成例８６
Ｎ－［５－（４－イソブトキシフェニル）－４－メチル－チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－イソブトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１２．２ｍｇ（収率５８％）を得た。
Ｎ－［５－（４－イソブトキシフェニル）－４－メチル－チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（４－イソブトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１２．２ｍｇ（収率５８％）を得た。
【0278】
合成例８７
Ｎ－［５－（５－クロロ－６－イソブトキシ－３－ピリジル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（５－クロロ－６－イソブトキシ－３－ピリジル）ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物６．６ｍｇ（収率２９％）を得た。
Ｎ－［５－（５－クロロ－６－イソブトキシ－３－ピリジル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の（５－クロロ－６－イソブトキシ－３－ピリジル）ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物６．６ｍｇ（収率２９％）を得た。
【0279】
合成例８８
Ｎ－［４－メチル－５－［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１３．２ｍｇ（収率５９％）を得た。
Ｎ－［４－メチル－５－［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１３．２ｍｇ（収率５９％）を得た。
【0280】
合成例８９
Ｎ－［４－メチル－５－［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物７．５ｍｇ（収率３３％）を得た。
Ｎ－［４－メチル－５－［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物７．５ｍｇ（収率３３％）を得た。
【0281】
合成例９０
ｔｅｒｔ－ブチル ４－［４－メチル－２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレート
市販のｔｅｒｔ－ブチル ４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレートを用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１２．８ｍｇ（収率５６％）を得た。
ｔｅｒｔ－ブチル ４－［４－メチル－２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレート
市販のｔｅｒｔ－ブチル ４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレートを用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１２．８ｍｇ（収率５６％）を得た。
【0282】
合成例９１
Ｎ－［５－［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１０．９ｍｇ（収率５２％）を得た。
Ｎ－［５－［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１０．９ｍｇ（収率５２％）を得た。
【0283】
合成例９２
Ｎ－［６－［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１４．０ｍｇ（収率５８％）を得た。
Ｎ－［６－［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１４．０ｍｇ（収率５８％）を得た。
【0284】
合成例９３
Ｎ－［６－（４－クロロフェニル）－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の４－クロロフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物２．８ｍｇ（収率１３％）を得た。
Ｎ－［６－（４－クロロフェニル）－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の４－クロロフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物２．８ｍｇ（収率１３％）を得た。
【0285】
合成例９４
Ｎ－［６－（４－フルオロフェニル）－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の４－フルオロフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１３．０ｍｇ（収率６４％）を得た。
Ｎ－［６－（４－フルオロフェニル）－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の４－フルオロフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１３．０ｍｇ（収率６４％）を得た。
【0286】
合成例９５
Ｎ－［５－（４－ベンゾイルフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－ベンゾイルフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７５．４ｍｇ（収率２８％）を固体として得た。
Ｎ－［５－（４－ベンゾイルフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
市販の４－ベンゾイルフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７５．４ｍｇ（収率２８％）を固体として得た。
【0287】
合成例９６
Ｎ－［４－イソプロピル－５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例２４で得られたＮ－（５－ブロモ－４－イソプロピル－チアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１１２．２ｍｇ（収率６６％）を得た。
Ｎ－［４－イソプロピル－５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
参考合成例２４で得られたＮ－（５－ブロモ－４－イソプロピル－チアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１１２．２ｍｇ（収率６６％）を得た。
【0288】
合成例９７
Ｎ－［５－［１－（２－メチルプロパノイル）－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－４－イル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
合成例５１で得られたｔｅｒｔ－ブチル ４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレート（１３９ｍｇ，０．３１５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３ｍＬ）に、室温にてトリフルオロ酢酸（０．６ｍＬ）を加え、２時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、ジクロロメタンを加えて数回共沸し、油状物（２２６ｍｇ）を得た。得られた油状物（６８ｍｇ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１０ｍＬ）のジクロロメタン溶液（３ｍＬ）に、氷冷下、２－メチルプロパノイル クロリド（０．０３２ｍＬ，０．３０ｍｍｏｌ）を加えて２時間攪拌した。反応液をジクロロメタンにて希釈した後、水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝４／１－１／２）にて精製し、標記化合物５０．３ｍｇ（収率８１％）を固体として得た。
Ｎ－［５－［１－（２－メチルプロパノイル）－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－４－イル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
合成例５１で得られたｔｅｒｔ－ブチル ４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレート（１３９ｍｇ，０．３１５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３ｍＬ）に、室温にてトリフルオロ酢酸（０．６ｍＬ）を加え、２時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、ジクロロメタンを加えて数回共沸し、油状物（２２６ｍｇ）を得た。得られた油状物（６８ｍｇ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１０ｍＬ）のジクロロメタン溶液（３ｍＬ）に、氷冷下、２－メチルプロパノイル クロリド（０．０３２ｍＬ，０．３０ｍｍｏｌ）を加えて２時間攪拌した。反応液をジクロロメタンにて希釈した後、水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝４／１－１／２）にて精製し、標記化合物５０．３ｍｇ（収率８１％）を固体として得た。
【0289】
合成例９８
Ｎ－［５－［１－（イソプロピルカルバモイル）－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－４－イル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
合成例５１で得られたｔｅｒｔ－ブチル ４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレートおよび２－イソシアナートプロパンを用いて、合成例９７の方法に準じて標記化合物３０．６ｍｇ（収率４８％）を固体として得た。
Ｎ－［５－［１－（イソプロピルカルバモイル）－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－４－イル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
合成例５１で得られたｔｅｒｔ－ブチル ４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレートおよび２－イソシアナートプロパンを用いて、合成例９７の方法に準じて標記化合物３０．６ｍｇ（収率４８％）を固体として得た。
【0290】
合成例９９
メチル ２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］－５－［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］チアゾール－４－カルボキシレート
参考合成例２５で得られたメチル ５－ブロモ－２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－４－カルボキシレートおよび市販の［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物４２．３ｍｇ（収率３１％）を得た。
メチル ２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］－５－［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］チアゾール－４－カルボキシレート
参考合成例２５で得られたメチル ５－ブロモ－２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－４－カルボキシレートおよび市販の［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物４２．３ｍｇ（収率３１％）を得た。
【0291】
合成例１００
メチル ５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－４－カルボキシレート
参考合成例２５で得られたメチル ５－ブロモ－２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－４－カルボキシレートおよび市販の（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物４５．８ｍｇ（収率３８％）を得た。
メチル ５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－４－カルボキシレート
参考合成例２５で得られたメチル ５－ブロモ－２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－４－カルボキシレートおよび市販の（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物４５．８ｍｇ（収率３８％）を得た。
【0292】
合成例１０１
（５Ｒ）－Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド および
（５Ｓ）－Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
合成例３５で得られたＮ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよびＹＭＣ ＣＨＩＲＡＬ ＡＲＴ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ＳＣ（１０μｍ） ２５０ｘ１０ｍｍＩ．Ｄ．、流速：２．３ｍｌ／ｍｉｎ、溶媒：ｎ－ヘキサン／エタノール＝４０／６０）にて光学分割を行った。先に溶出する第一ピークを集めた後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物（５３ｍｇ，光学純度 ＞９９％ｅｅ）をアモルファス状物として得た。また、後から溶出する第二ピークを集めた後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物（５３ｍｇ，光学純度 ＞９９％ｅｅ）をアモルファス状物として得た。
（５Ｒ）－Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド および
（５Ｓ）－Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
合成例３５で得られたＮ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよびＹＭＣ ＣＨＩＲＡＬ ＡＲＴ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ＳＣ（１０μｍ） ２５０ｘ１０ｍｍＩ．Ｄ．、流速：２．３ｍｌ／ｍｉｎ、溶媒：ｎ－ヘキサン／エタノール＝４０／６０）にて光学分割を行った。先に溶出する第一ピークを集めた後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物（５３ｍｇ，光学純度 ＞９９％ｅｅ）をアモルファス状物として得た。また、後から溶出する第二ピークを集めた後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物（５３ｍｇ，光学純度 ＞９９％ｅｅ）をアモルファス状物として得た。
【0293】
以下の表に参考合成例および合成例で合成した化合物の構造式および物理化学データを示す。
【0294】
【表1-1】
【0295】
【表1-2】
【0296】
【表1-3】
【0297】
【表2-1】
【0298】
【表2-2】
【0299】
【表2-3】
【0300】
【表2-4】
【0301】
【表2-5】
【0302】
【表2-6】
【0303】
【表2-7】
【0304】
【表2-8】
【0305】
【表2-9】
【0306】
【表2-10】
【0307】
【表2-11】
【0308】
【表2-12】
【0309】
【表2-13】
【0310】
【表2-14】
【0311】
【表2-15】
【0312】
［参考例１］ヒトｉＰＳ細胞からインスリン産生細胞への分化促進効果の評価
ヒトｉＰＳ細胞からインスリン産生細胞への分化促進効果（薬効）の評価系は、公知情報（非特許文献６）を参考に構築した。また、各分化ステージで使用する培地も上記公知情報を参考に作成した（ステージ１～５に対して、各々、非特許文献６記載の分化培地Ａ～Ｅ（Ｍｅｄｉｕｍ Ａ～Ｅ）を使用。ただし、分化培地Ｅに関してはＧＬＰ－１受容体アゴニストおよびニコチンアミドを含んでいないものを使用）。
化合物の薬効を評価するため、陽性コントロールとして合成例１の化合物を使用し、化合物無処置コントロールとして終濃度０．１％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ＳＩＧＭＡ、Ｄ２６５０）を用いた。全ての化合物はＤＭＳＯで溶解させ、培地へ添加後の化合物の終濃度が２μＭおよび１０μＭとなるように２種類の化合物溶液を調製した。以下の評価において、化合物溶液はＤＭＳＯの終濃度０．１％となるように培地に添加した。
まず、非特許文献６の「ヒトｉＰＳ細胞から膵β細胞への分化誘導」の方法に従い、ヒトｉＰＳ細胞Ｔｏｅ株（医薬基盤研究所）から培養７日目の細胞（分化培地Ｃに交換して２日後（ＦＯＸＡ２陽性原始腸管細胞からＰＤＸ１陽性膵前駆細胞への分化過程の細胞）まで誘導し、細胞を回収後、バンバンカー（日本ジェネティクス）を用いて１ｘ１０７細胞／ｍＬ／チューブにて液体窒素中に保存し、評価用細胞ストックを作製した。薬効評価の開始時に本細胞ストックを溶解し、ステージ３用の分化培地Ｃ（ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１９６５０９２）、０．２５μＭ ＳＡＮＴ－１、 ０．１μＭ ＬＤＮ１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－００７４）、１０μＭ ＳＢ４３１５４２, ２μＭ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－００２１）、１％ Ｂ２７ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）に懸濁後、シンセマックスＩＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃５６５６）でコートした９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３３４０）に１ｘ１０５細胞／ウェル播種した。２日間培養後、培地を除去し、化合物あるいはＤＭＳＯのみを添加した新しいステージ３用の分化培地Ｃを１００μＬ／ウェル添加した。２日間培養後、培地を除去し、化合物あるいはＤＭＳＯのみを添加した新しいステージ４用の分化培地Ｄ（ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、 ０．１μＭ ＬＤＮ１９３１８９、５μＭ ＴＧＦ－β ｔｙｐｅ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ６１６４５２）、０．３μＭ （－）－ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ Ｖ （Ｅｎｚｏ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ＡＬＸ－４２０－０１１－Ｃ３００）、１％ Ｂ２７ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を１００μＬ／ウェル添加した。２～３日間培養後、培地を除去し、化合物あるいはＤＭＳＯのみを添加した新しいステージ５用の分化培地Ｅ（ＧＬＰ－１受容体アゴニストおよびニコチンアミド不含；Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ/Ｆ－２０ （Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２６６００１２）、 １％ Ｂ２７ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を２００μＬ／ウェル添加した。２日間培養後、培地を除去し、４％パラホルムアルデヒドりん酸緩衝液（Ｗａｋｏ、１６３－２０１４５）を１５０μＬ／ウェル添加し、３０～６０分間室温に置いて細胞を固定した。１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ、Ｔ８７８７）を含むりん酸緩衝液（ＰＢＳ）（Ｔａｋａｒａ、Ｔ９１８１）で１５分間室温に置いた後、ＰＢＳ－Ｔ（Ｔａｋａｒａ、Ｔ９１８３）で洗浄し、ＰＢＳ－Ｔで希釈した２０％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて室温で１時間ブロッキングを行った。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅを除去後、２０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅで２００倍に希釈したモルモット抗インスリン抗体（アブカム、ａｂ７８４２）を５０μＬ／ウェル添加し、一晩４℃に置いた。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、２０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅで１０００倍に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４８標識抗モルモット抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１１０７５）および６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を添加して２時間室温に置いた。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、細胞の蛍光画像の解析を行った。
ヒトｉＰＳ細胞からインスリン産生細胞への分化促進効果（薬効）の評価系は、公知情報（非特許文献６）を参考に構築した。また、各分化ステージで使用する培地も上記公知情報を参考に作成した（ステージ１～５に対して、各々、非特許文献６記載の分化培地Ａ～Ｅ（Ｍｅｄｉｕｍ Ａ～Ｅ）を使用。ただし、分化培地Ｅに関してはＧＬＰ－１受容体アゴニストおよびニコチンアミドを含んでいないものを使用）。
化合物の薬効を評価するため、陽性コントロールとして合成例１の化合物を使用し、化合物無処置コントロールとして終濃度０．１％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ＳＩＧＭＡ、Ｄ２６５０）を用いた。全ての化合物はＤＭＳＯで溶解させ、培地へ添加後の化合物の終濃度が２μＭおよび１０μＭとなるように２種類の化合物溶液を調製した。以下の評価において、化合物溶液はＤＭＳＯの終濃度０．１％となるように培地に添加した。
まず、非特許文献６の「ヒトｉＰＳ細胞から膵β細胞への分化誘導」の方法に従い、ヒトｉＰＳ細胞Ｔｏｅ株（医薬基盤研究所）から培養７日目の細胞（分化培地Ｃに交換して２日後（ＦＯＸＡ２陽性原始腸管細胞からＰＤＸ１陽性膵前駆細胞への分化過程の細胞）まで誘導し、細胞を回収後、バンバンカー（日本ジェネティクス）を用いて１ｘ１０７細胞／ｍＬ／チューブにて液体窒素中に保存し、評価用細胞ストックを作製した。薬効評価の開始時に本細胞ストックを溶解し、ステージ３用の分化培地Ｃ（ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１９６５０９２）、０．２５μＭ ＳＡＮＴ－１、 ０．１μＭ ＬＤＮ１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－００７４）、１０μＭ ＳＢ４３１５４２, ２μＭ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－００２１）、１％ Ｂ２７ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）に懸濁後、シンセマックスＩＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃５６５６）でコートした９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３３４０）に１ｘ１０５細胞／ウェル播種した。２日間培養後、培地を除去し、化合物あるいはＤＭＳＯのみを添加した新しいステージ３用の分化培地Ｃを１００μＬ／ウェル添加した。２日間培養後、培地を除去し、化合物あるいはＤＭＳＯのみを添加した新しいステージ４用の分化培地Ｄ（ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、 ０．１μＭ ＬＤＮ１９３１８９、５μＭ ＴＧＦ－β ｔｙｐｅ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ６１６４５２）、０．３μＭ （－）－ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ Ｖ （Ｅｎｚｏ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ＡＬＸ－４２０－０１１－Ｃ３００）、１％ Ｂ２７ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を１００μＬ／ウェル添加した。２～３日間培養後、培地を除去し、化合物あるいはＤＭＳＯのみを添加した新しいステージ５用の分化培地Ｅ（ＧＬＰ－１受容体アゴニストおよびニコチンアミド不含；Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ/Ｆ－２０ （Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２６６００１２）、 １％ Ｂ２７ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を２００μＬ／ウェル添加した。２日間培養後、培地を除去し、４％パラホルムアルデヒドりん酸緩衝液（Ｗａｋｏ、１６３－２０１４５）を１５０μＬ／ウェル添加し、３０～６０分間室温に置いて細胞を固定した。１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ、Ｔ８７８７）を含むりん酸緩衝液（ＰＢＳ）（Ｔａｋａｒａ、Ｔ９１８１）で１５分間室温に置いた後、ＰＢＳ－Ｔ（Ｔａｋａｒａ、Ｔ９１８３）で洗浄し、ＰＢＳ－Ｔで希釈した２０％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて室温で１時間ブロッキングを行った。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅを除去後、２０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅで２００倍に希釈したモルモット抗インスリン抗体（アブカム、ａｂ７８４２）を５０μＬ／ウェル添加し、一晩４℃に置いた。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、２０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅで１０００倍に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４８標識抗モルモット抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１１０７５）および６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を添加して２時間室温に置いた。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、細胞の蛍光画像の解析を行った。
【0313】
細胞画像の撮影はハイコンテンツイメージングシステムＯｐｅｒａ ＰｈｅｎｉｘあるいはＯｐｅｒｅｔｔａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて行った。更に、Ｈａｒｍｏｎｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いた解析によりインスリン陽性細胞およびＤＡＰＩ陽性総細胞数を計測し、総細胞数に対するインスリン陽性細胞数の割合（インスリン陽性細胞率）を算出した。陽性コントロールとして合成例１の化合物を使用し、化合物無処置コントロールとして終濃度０．１％のＤＭＳＯを用いた。１０μＭの合成例１の化合物におけるインスリン陽性細胞率（３０例の平均インスリン陽性細胞率、１３％）の化合物無処置コントロール(３０例の平均インスリン陽性細胞率、４．９％)からの増加分を１００％とし、これを基準に各化合物各濃度のインスリン陽性細胞率増加分を百分率（％）に換算し、活性値とした。化合物の一次評価は、陽性コントロールを含めて各化合物は、２μＭおよび１０μＭの２種類の濃度で、複数のウェルを用いて実施した。両濃度における活性値の和を陽性コントロールと比較することにより活性強度を判断した。両濃度における活性値の和が、化合物無処置コントロールに比べて明らかに高いが、陽性コントロールよりも低い場合を＋、陽性コントロールと同等な場合を＋＋、陽性コントロールよりも高い場合を＋＋＋と表記した。活性強度が弱い化合物に関しては、０．４、２、５あるいは１０μＭの濃度で、複数のウェルを用いて再評価を実施し、化合物無処置コントロールに比べて明らかに活性値が高いか、もしくは何れかの濃度での活性値が１５％以上を示し、化合物無処置コントロールと比較したｔ検定によって有意差（Ｐ＜０．０５）を示した化合物を有効と判断した。比較的強い薬効を示した化合物については、濃度依存的効果を調べるため、０．０１～１０μＭの濃度で複数のウェルを用いて二次評価を実施し、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてＥＣ５０（１０μＭの合成例１の化合物の薬効を１００％とした場合に、その５０％に相当する薬効を発揮できる化合物の濃度）を算出した。
【0314】
参考例１の結果を表３および表４に示す。
【0315】
【表3】
【0316】
【表4】
【0317】
参考例１の結果より、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は化合物を添加しない場合と比較し、多能性幹細胞を効率的にインスリン産生細胞に分化させ得ることが分かった。
【0318】
［実施例１］
（Ａ）結果
（１）新規β細胞分化誘導剤のスクリーニング
以前に報告されたように（Ｓａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４； Ｓｈｉｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８）、Ｐｄｘ１プロモーターによって駆動されるＧＦＰレポーター遺伝子を担持するマウスＥＳ細胞株ＳＫ７を、β細胞分化を増強する小分子化合物のスクリーニングのためのアッセイ系の確立のために使用した。
約５５，０００の化合物を用いた一次スクリーニングキャンペーン、続いて有効性の再現性および用量依存性を確認するための反復アッセイの後に、ヒット化合物Ｋ－１（合成例１で合成された化合物）がβ細胞分化を増強する新規化合物として発見された（図１）。Ｋ－１はＰｄｘ１－ＧＦＰ＋インスリン＋二重陽性細胞の比率およびインスリン１の発現を用量依存的に増加させた。Ｋ－１は、γ－セクレターゼ阻害剤ＬＹ４１１５７５によるＰｄｘ１－ＧＦＰ＋Ｉｎｓ＋二重陽性細胞の増加（Ｔｒｅｆｆ ｅｔ ａｌ．， ２００６）を更に亢進した。この結果は、以前に膵臓内分泌分化を促進することが報告されているγ－セクレターゼ阻害とは異なる作用機序によって、Ｋ－１がその効力を示すことを表している。
（Ａ）結果
（１）新規β細胞分化誘導剤のスクリーニング
以前に報告されたように（Ｓａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４； Ｓｈｉｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８）、Ｐｄｘ１プロモーターによって駆動されるＧＦＰレポーター遺伝子を担持するマウスＥＳ細胞株ＳＫ７を、β細胞分化を増強する小分子化合物のスクリーニングのためのアッセイ系の確立のために使用した。
約５５，０００の化合物を用いた一次スクリーニングキャンペーン、続いて有効性の再現性および用量依存性を確認するための反復アッセイの後に、ヒット化合物Ｋ－１（合成例１で合成された化合物）がβ細胞分化を増強する新規化合物として発見された（図１）。Ｋ－１はＰｄｘ１－ＧＦＰ＋インスリン＋二重陽性細胞の比率およびインスリン１の発現を用量依存的に増加させた。Ｋ－１は、γ－セクレターゼ阻害剤ＬＹ４１１５７５によるＰｄｘ１－ＧＦＰ＋Ｉｎｓ＋二重陽性細胞の増加（Ｔｒｅｆｆ ｅｔ ａｌ．， ２００６）を更に亢進した。この結果は、以前に膵臓内分泌分化を促進することが報告されているγ－セクレターゼ阻害とは異なる作用機序によって、Ｋ－１がその効力を示すことを表している。
【0319】
（２）Ｋ－１とその誘導体はヒトｉＰＳ細胞由来β細胞の分化を促進する。
ヒトｉＰＳ細胞のインスリン発現β（ｈｉＰＳ－β）細胞への分化に対する化合物の有効性を、２つの異なる分化プロトコールおよび３つのヒトｉＰＳ細胞株（Ｔｏｅ、ＲＰＣｈｉＰＳＣ７７１、およびＦｆ－Ｉ０１ｓ０１（ＨＬＡホモ接合体患者由来のｉＰＳＣ））を用いて調べた（図２－１ａ）。本発明者は、分化プロトコール＃１の下で単層培養において、ステージ３の後期からステージ５の初期までの間のＫ－１によるＴｏｅ ｉＰＳＣの処理を最初に試験した。それはｉＰＳ－β細胞への強化された分化をもたらした（図２－１ａおよびｂ）。本発明者はまたＫ－３（合成例９で合成された化合物）、Ｋ－４（合成例３３で合成された化合物）、およびＫ－５（合成例１０１ｂで合成された化合物）のような他の誘導体の効果を検査した。Ｋ－３およびＫ－５は、元の化合物であるＫ－１よりも強力な効力を示すことが判明した（図２－１ｂ）。
ヒトｉＰＳ細胞のインスリン発現β（ｈｉＰＳ－β）細胞への分化に対する化合物の有効性を、２つの異なる分化プロトコールおよび３つのヒトｉＰＳ細胞株（Ｔｏｅ、ＲＰＣｈｉＰＳＣ７７１、およびＦｆ－Ｉ０１ｓ０１（ＨＬＡホモ接合体患者由来のｉＰＳＣ））を用いて調べた（図２－１ａ）。本発明者は、分化プロトコール＃１の下で単層培養において、ステージ３の後期からステージ５の初期までの間のＫ－１によるＴｏｅ ｉＰＳＣの処理を最初に試験した。それはｉＰＳ－β細胞への強化された分化をもたらした（図２－１ａおよびｂ）。本発明者はまたＫ－３（合成例９で合成された化合物）、Ｋ－４（合成例３３で合成された化合物）、およびＫ－５（合成例１０１ｂで合成された化合物）のような他の誘導体の効果を検査した。Ｋ－３およびＫ－５は、元の化合物であるＫ－１よりも強力な効力を示すことが判明した（図２－１ｂ）。
【0320】
次に、本発明者が最近確立した他の分化プロトコールを用いてＫ－３の効果を試験した。本発明者は以前、分化前の短期間のメチオニン除去処理が分化の増強をもたらすことを発見した（Ｓｈｉｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。従って、本発明者は、短時間（５時間）のメチオニン除去を組み入れ、分化プロトコール＃１の下でＲＰＣｈｉＰＳ７７１ ｉＰＳＣのスフェア培養を行い、高機能性ｉＰＳ－β細胞を得た（Ｓｈｉｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。Ｋ－３は、０．２５μＭでＩＮＳＵＬＩＮ＋ＰＤＸ１＋二重陽性細胞への分化を増強した（図２－１ｃ）。次に、分化プロトコール＃２を用いた。ここでは、分化前に細胞をメチオニン除去で前処理し、そして亜鉛濃度を調節できる培地を用いて分化を行った。このプロトコールの下で、Ｋ－３はＦｆ－Ｉ０１ｓ０１のＩＮＳＵＬＩＮ＋ＮＫＸ６．１＋、ＮＫＸ６．１＋ＰＤＸ１＋二重陽性、およびＩＮＳＵＬＩＮ＋ＮＫＸ６．１＋ＰＤＸ１＋三重陽性細胞への分化を増強した。これらは、ステージ４の終わりに現れ、その後増加した（図２－１ｄ）。Ｋ－３がステージ３を含むタイムウィンドウに添加された場合、Ｋ－３が分化を最も効果的に増強することを見出した。Ｋ－３はまた特にステージ３から５における処理によりＮＫＸ６．１＋およびＩＮＳＵＬＩＮ＋ＮＫＸ６．１＋二重陽性細胞の生成を促進した（図２－１ｄ）。
【0321】
次いで、プロトコール＃１、ＲｐＣｈｉＰＳＣ７７１のスフェア培養の下で生成されたｉＰＳ－β細胞の機能アッセイを実施した。この機能アッセイでは、Ｋ－３のほか、Ｋ－５、Ｋ－６（合成例４５で合成された化合物）、Ｋ－７（合成例９３で合成された化合物）も使用した。Ｋ－３を含むヒット化合物は、得られたｉＰＳ－β細胞のグルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）の活性を増強し、段階的な経時的測定で、急速な第１相および長期持続する第２相インスリン分泌を示した（図２－２ｅ、左）。ＧＳＩＳ活性を定量するために、従来のバッチアッセイもまた実施した（図２－２ｅ、右）。Ｋ－３は培養プロトコール＃２においても同様の効果を示した（図２－２ｆ）。従って、これは、それらの有効性が培養プロトコールや細胞株の変動性に依存しないことを示している。Ｋ－３によって処理されたｉＰＳ－β細胞は、インスリン分泌促進薬（グリベンクラミド、エキセンディン４、およびＫＣｌ）への刺激によって増強されたｃ－ペプチド分泌を示し（図２－２ｇ）、このことは、化合物が機能的成熟を増強するかまたは細胞のインスリン含有量を増加させることを示す。
【0322】
（Ｂ）方法
（１）ｍＥＳおよびｈｉＰＳ細胞株の培養
ＳＫ７マウスＥＳ細胞株は、Ｐｄｘ１－ＧＦＰ遺伝子を有するトランスジェニックマウス系統から樹立され、以前に記載されているように（Ｓｈｉｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８）、ＭＥＦフィーダー細胞（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で維持された。ＴｏｅヒトｉＰＳ細胞株は、国立バイオメディカルイノベーション研究所（Ｊａｐａｎ）の細胞バンクから入手し、以前に記載されたように（Ｓｈａｈｊａｌａｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）、フィーダーフリー異種条件で維持した。ＲＰＣｈｉＰＳ７７１細胞はリプロセルから購入し、ＦｆＩ－０１ｓ０１細胞はＣｉＲＡから提供された。ＲＰＣｈｉＰＳ７７１細胞およびＦｆｌ－０１ｓ０１細胞を、ｓｙｎｔｈｅｍａｘ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ３５３５ＸＸ１）被覆皿上で、それぞれＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ａ１５１７００１）およびＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３Ｎ（味の素）を使って培養した。
（１）ｍＥＳおよびｈｉＰＳ細胞株の培養
ＳＫ７マウスＥＳ細胞株は、Ｐｄｘ１－ＧＦＰ遺伝子を有するトランスジェニックマウス系統から樹立され、以前に記載されているように（Ｓｈｉｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８）、ＭＥＦフィーダー細胞（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で維持された。ＴｏｅヒトｉＰＳ細胞株は、国立バイオメディカルイノベーション研究所（Ｊａｐａｎ）の細胞バンクから入手し、以前に記載されたように（Ｓｈａｈｊａｌａｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）、フィーダーフリー異種条件で維持した。ＲＰＣｈｉＰＳ７７１細胞はリプロセルから購入し、ＦｆＩ－０１ｓ０１細胞はＣｉＲＡから提供された。ＲＰＣｈｉＰＳ７７１細胞およびＦｆｌ－０１ｓ０１細胞を、ｓｙｎｔｈｅｍａｘ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ３５３５ＸＸ１）被覆皿上で、それぞれＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ａ１５１７００１）およびＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３Ｎ（味の素）を使って培養した。
【0323】
（２）ＳＫ７マウスＥＳ細胞とヒトｉＰＳ細胞の分化
ＳＫ７マウスＥＳ細胞を、基本的に以前の報告（Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）に従って、β細胞に分化させた。手短に言えば、細胞を、ＣｅｌｌＢＩＮＤ ３８４ウェル（ＣＯＲＮＩＮＧ， ３７７０）細胞培養プレートに１ウェルあたり５，０００細胞で、または０．２％ゼラチンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ）に１ウェルあたり２０，０００細胞で、播種した。その後、細胞を培地１で１日目から５日目まで培養した。培地１は、０．１ｍＭのＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ， １１１４０－５０）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｎａｋａｌａｉ， １６９４８－０４）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｎａｋａｌａｉ， ２６２５２－９４）、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１％のインスリン－トランスフェリン－セレンサプリメント（ＩＴＳ：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ４１４０００４５）、０．２５％のＡｌｂｕｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， １１０２００２１）、および１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトアクチビン－Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ３３８－ＡＣ）を添加したＤＭＥＭ高グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， １１９６５０９２）からなる。続いて、１０μＭのレチノイン酸（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ， ０４－００２１）を補充した培地１からなる培地２中で１日間培養した。６日目に培地を培地３に交換し、β細胞への分化を誘導するために１２日目まで培養を続けた。培地３は、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１％のＩＴＳ、０．２５％のＡｌｂｕｍａｘ、および３ｍＭのニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｎ０６３６－５００Ｇ）を添加したＤＭＥＭ低グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， １１８８５０８４）からなる。試験化合物を８日目に添加し、細胞をハイコンテントイメージャーによる分析のために４％パラホルムアルデヒドで固定した。
ＳＫ７マウスＥＳ細胞を、基本的に以前の報告（Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）に従って、β細胞に分化させた。手短に言えば、細胞を、ＣｅｌｌＢＩＮＤ ３８４ウェル（ＣＯＲＮＩＮＧ， ３７７０）細胞培養プレートに１ウェルあたり５，０００細胞で、または０．２％ゼラチンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ）に１ウェルあたり２０，０００細胞で、播種した。その後、細胞を培地１で１日目から５日目まで培養した。培地１は、０．１ｍＭのＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ， １１１４０－５０）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｎａｋａｌａｉ， １６９４８－０４）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｎａｋａｌａｉ， ２６２５２－９４）、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１％のインスリン－トランスフェリン－セレンサプリメント（ＩＴＳ：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ４１４０００４５）、０．２５％のＡｌｂｕｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， １１０２００２１）、および１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトアクチビン－Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ３３８－ＡＣ）を添加したＤＭＥＭ高グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， １１９６５０９２）からなる。続いて、１０μＭのレチノイン酸（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ， ０４－００２１）を補充した培地１からなる培地２中で１日間培養した。６日目に培地を培地３に交換し、β細胞への分化を誘導するために１２日目まで培養を続けた。培地３は、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１％のＩＴＳ、０．２５％のＡｌｂｕｍａｘ、および３ｍＭのニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｎ０６３６－５００Ｇ）を添加したＤＭＥＭ低グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， １１８８５０８４）からなる。試験化合物を８日目に添加し、細胞をハイコンテントイメージャーによる分析のために４％パラホルムアルデヒドで固定した。
【0324】
ＴｏｅヒトｉＰＳ細胞を、ｓｙｎｔｈｅｍａｘ ＩＩで被覆したＣｅｌｌＢＩＮＤ ６ウェル（ＣＯＲＮＩＮＧ， ＣＬＳ３３３５）細胞培養プレートに播種し、以前に記載した方法（Ｓｈａｈｊａｌａｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）によって原始腸管細胞に分化させた。細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， １２５６３０１１）で解離させ、使用するまで１．０～２．０×１０７ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度でＢａｎＢａｎｋｅｒ（Ｎｉｐｐｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）中で凍結保存した。化合物添加の１日前に、細胞を、ステージ３の培地（ＤＭＥＭ高グルコース、０．２５μＭのＳＡＮＴ１（Ｗａｋｏ， １９７－１６３５１）、０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ， ０４－００７４）、１０μＭのＳＢ４３１５４２、２μＭのレチノイン酸、１％のＢ２７無血清サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， １７５０４０４４）中で解凍し、１ウェルあたり１５０，０００細胞でｓｙｎｔｈｅｍａｘ ＩＩで被覆したＣｅｌｌＢＩＮＤ ９６ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ３３４０）細胞培養プレートに播種した。試験化合物または陰性対照（０．０１％ ＤＭＳＯ）を含有するステージ３の培地中で細胞を１日間培養した。試験化合物または陰性対照を含有するステージ４および５の培地中でそれぞれ２日間および１日間さらに細胞を培養した。翌日、細胞をハイコンテントイメージャーで分析のために４％パラホルムアルデヒドで固定した。
【0325】
ＲＰＣｈｉｐＳ７７１細胞を上記のように維持し、プロトコール＃１に従って分化させた。手短に言えば、０日目に、細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔで解離させ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中１×１０６細胞／ｍＬの濃度で低付着６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ， ６５７１８５）に移し、ロータリーシェーカー（９５ ｒｐｍ）上で培養した。１日目に、培地をメチオニン除去培地ＫＡ０１（Ａｊｉｎｏｍｏｔ）に交換し、５時間培養した。培地を分化培地１（ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、Ｂ２７サプリメント、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１）に交換し、細胞を１日間培養した（ステージ１－１）。その後、培地を、ＣＨＩＲ９９０２１を含まない培地１に交換し、２日間培養した（ステージ１－２）。細胞培養を培地２（ＲＰＭＩ、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、インスリンを除いたＢ２７サプリメント、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０、０．２５μＭのＳＡＮＴ１）で２日間（ステージ２）、培地３（ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、０．１５μＭのＳＡＮＴ１、２μＭのレチノイン酸、０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９、Ｂ２７サプリメント）で６日間（ステージ３）、培地４（ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、５μＭのＡＬＫ５阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， ６１６４５２）、０．３μＭのインドラクタムＶ、０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９、Ｂ２７サプリメント）で２日間（ステージ４）、培地５（ＫＯ ＤＭＥＭ／Ｆ１２ 、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、５０ｎｇ／ｍＬのエキセンディン４、１０ｍＭのニコチンアミド、１０μＭのＺｎＳＯ４、１ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システイン、Ｂ２７サプリメント）で１３日間（ステージ５）続けた。分化速度および細胞機能に対する化合物の有効性を評価する場合、試験化合物および陰性対照（０．０１％ ＤＭＳＯ）をステージ３および４の間（６日目～１４日目）に処理し、インスリン陽性に対する効果を確認するために１９日目に免疫染色を行い、２７日目にＧＳＩＳ（Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）アッセイを行った。
【0326】
ＦｆＩ－０１ｓ０１細胞を上記のように維持し、そしてプロトコール＃２に従って分化させた。手短に言えば、細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔで解離させ、ＡＫ０３Ｎ培地（味の素）中１×１０６細胞／ｍＬの濃度で低付着６ウェルプレートに移し、ロータリーシェーカー（９５ ｒｐｍ）上で２４時間培養し、その後、培地を、ＡＫ０３Ｎベースのメチオニン除去培地ＫＡ０１に交換し、細胞を５時間培養した。その後、培地をＭ１－１ ＡＫＭ培地に交換し、細胞を２４時間培養した（ステージ１－１）。細胞をＭ１－２ ＡＫＭ培地で２日間培養し（ステージ１－２）、続いてＭ２ ＡＫＭ培地で２日間培養し（ステージ２－１）、Ｓ２培地で２日間培養し（ステージ２－２）、Ｓ３培地で２日間培養し（ステージ３）、Ｓ４培地で５日間培養し（ステージ４）、Ｓ５－１培地で４日間培養し（ステージ５－１）、Ｓ５－２培地で３日間培養した（ステージ５）。
【0327】
ＡＫＭ培地はインスリンおよびＺｎ２＋除去ＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３培地である。
Ｍ１－１ ＡＫＭ培地：１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２２１を補充したＡＫＭ（１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、０．５μＭのＺｎ）培地。
Ｍ１－２ ＡＫＭ培地：１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを添加したＡＫＭ（１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、Ｚ０．５μＭのＺｎ）培地。
Ｍ２ ＡＫＭ培地：５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１を補充したＡＫＭ（０．５μＭのＺｎ）。
Ｓ２培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦと４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
Ｓ３培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、５０ｎＭのインドラクタムＶ、２μＭのレチノイン酸、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
Ｓ４培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、１００ｎＭのレチノイン酸、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣ、１００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９を補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
Ｓ５－１培地：１０μＭのＡＬＫ５阻害剤、１０μＭのＤＡＰＴ、３３．３ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１００ｎＭのレチノイン酸、１μＭのＴ３、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
Ｓ５－２培地：１０μＭのＡＬＫ５阻害剤、１０μＭのＤＡＰＴ、３３．３ ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、２５ ｎＭのレチノイン酸、１μＭのＴ３を補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
分化速度および細胞機能に対する化合物の有効性を評価する場合、試験化合物および陰性対照（０．０１％ＤＭＳＯ）をステージ３および４の間（５日目～１３日目）に処理し、インスリン、ＮＫＸ６．１、およびＰＤＸ１の陽性に対する効果を確認するために、１４日目（ステージ４終了時）および２１日目（ステージ５終了時）に免疫染色を実施した。ＧＳＩＳアッセイは２１日目に実施した。
Ｍ１－１ ＡＫＭ培地：１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２２１を補充したＡＫＭ（１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、０．５μＭのＺｎ）培地。
Ｍ１－２ ＡＫＭ培地：１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを添加したＡＫＭ（１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、Ｚ０．５μＭのＺｎ）培地。
Ｍ２ ＡＫＭ培地：５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１を補充したＡＫＭ（０．５μＭのＺｎ）。
Ｓ２培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦと４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
Ｓ３培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、５０ｎＭのインドラクタムＶ、２μＭのレチノイン酸、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
Ｓ４培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、１００ｎＭのレチノイン酸、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣ、１００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９を補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
Ｓ５－１培地：１０μＭのＡＬＫ５阻害剤、１０μＭのＤＡＰＴ、３３．３ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１００ｎＭのレチノイン酸、１μＭのＴ３、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
Ｓ５－２培地：１０μＭのＡＬＫ５阻害剤、１０μＭのＤＡＰＴ、３３．３ ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、２５ ｎＭのレチノイン酸、１μＭのＴ３を補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ０３。
分化速度および細胞機能に対する化合物の有効性を評価する場合、試験化合物および陰性対照（０．０１％ＤＭＳＯ）をステージ３および４の間（５日目～１３日目）に処理し、インスリン、ＮＫＸ６．１、およびＰＤＸ１の陽性に対する効果を確認するために、１４日目（ステージ４終了時）および２１日目（ステージ５終了時）に免疫染色を実施した。ＧＳＩＳアッセイは２１日目に実施した。
【0328】
（３)β細胞分化を増強する化合物のスクリーニングおよびハイコンテントイメージングによる定量分析
約５５，０００の化合物からなる化学ライブラリーを、β細胞分化誘導物質についてスクリーニングした。一次スクリーニングに関しては、化合物を２ｍＭの濃度になるようにＤＭＳＯに溶解し、ＳＫ－７マウスＥＳ細胞の分化の過程で、８日目に１：１０００で添加し、１０日目に培地を交換した。細胞を、１２日目にモルモット抗インスリン、ウサギ抗ＧＦＰで免疫染色することによりアッセイした。蛍光画像は、ＯｐｅｒｅｔｔａハイコンテントイメージングシステムおよびＨａｒｍｏｎｙ画像解析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）により定量化した。核はＤＡＰＩ染色により同定され、抗体染色の陽性は核を囲む細胞質領域の蛍光強度により決定された。インスリンおよびＧＦＰの両方が陽性の細胞の数を数え、ＤＡＰＩ陽性総細胞数もしくは陽性エリア面積によって正規化した。４重データの中央値を計算し、スクリーニングヒットを、ＤＭＳＯ対照よりもインスリンおよびＧＦＰ陽性細胞数が増加した状態として定義した。本文に記載されているように、一次ヒット化合物を用量依存性および再現性についてさらに試験した。候補化合物の活性は再合成したものを用いて確認した。選択された候補化合物の活性は、マウスおよびヒトβ細胞分化の両方に対して有効性を有するヒット化合物を選択するために、ＴｏｅヒトｉＰＳ細胞アッセイシステムによってさらに分析された。化合物の添加は上記のようにして行い、有効性は３連の実験においてｑ－ＰＣＲによりｍＲＮＡ発現レベルによって評価した。スクリーニングヒットは、用量依存的に、ＤＭＳＯ対照よりもβ－アクチンと比較して増加したインスリン発現レベルを伴う状態として定義された。
約５５，０００の化合物からなる化学ライブラリーを、β細胞分化誘導物質についてスクリーニングした。一次スクリーニングに関しては、化合物を２ｍＭの濃度になるようにＤＭＳＯに溶解し、ＳＫ－７マウスＥＳ細胞の分化の過程で、８日目に１：１０００で添加し、１０日目に培地を交換した。細胞を、１２日目にモルモット抗インスリン、ウサギ抗ＧＦＰで免疫染色することによりアッセイした。蛍光画像は、ＯｐｅｒｅｔｔａハイコンテントイメージングシステムおよびＨａｒｍｏｎｙ画像解析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）により定量化した。核はＤＡＰＩ染色により同定され、抗体染色の陽性は核を囲む細胞質領域の蛍光強度により決定された。インスリンおよびＧＦＰの両方が陽性の細胞の数を数え、ＤＡＰＩ陽性総細胞数もしくは陽性エリア面積によって正規化した。４重データの中央値を計算し、スクリーニングヒットを、ＤＭＳＯ対照よりもインスリンおよびＧＦＰ陽性細胞数が増加した状態として定義した。本文に記載されているように、一次ヒット化合物を用量依存性および再現性についてさらに試験した。候補化合物の活性は再合成したものを用いて確認した。選択された候補化合物の活性は、マウスおよびヒトβ細胞分化の両方に対して有効性を有するヒット化合物を選択するために、ＴｏｅヒトｉＰＳ細胞アッセイシステムによってさらに分析された。化合物の添加は上記のようにして行い、有効性は３連の実験においてｑ－ＰＣＲによりｍＲＮＡ発現レベルによって評価した。スクリーニングヒットは、用量依存的に、ＤＭＳＯ対照よりもβ－アクチンと比較して増加したインスリン発現レベルを伴う状態として定義された。
【0329】
（４）免疫細胞化学
以下の抗体を使用して、通常のプロトコールと共に免疫細胞化学を実施した：ウサギ抗ＭＡＦＡ（Ａｂｃａｍ； ａｂ２６４０５； １／１００ｘ）、ヤギ抗ＰＤＸ１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ； ＡＦ２４１９； １／１００ｘ）、マウス抗ＮＫＸ６．１（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ； Ｆ６４Ａ６Ｂ４； １／１００ｘ）、モルモット抗ＩＮＳＵＬＩＮ（Ｄａｋｏ； ＩＲ００２； １／１０ｘ）、マウス抗ＩＮＳＵＬＩＮ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ； Ｉ２０１８； １／１０００ｘ）、ウサギ抗Ｃ－ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ； ４５９３； １／１００ｘ）、ウサギ抗ＧＦＰ（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ； ５９８； １／１０００ｘ）、およびマウス抗ＧＬＵＣＡＧＯＮ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ； Ｇ２６５４； １／１０００ｘ）。使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ ４８８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ａ１１０２９， １／１０００ｘ）、Ａｌｅｘａ ４８８結合ロバ抗モルモットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ７０６－５４６－１４８）、ＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ７１１－６０６－１５２）、ＡＦ５６８結合ロバ抗マウスＩｇＧ（ＢＩＯＴＩＵＭ， ２０１０５）、Ａｌｅｘａ ５６８結合ヤギ抗モルモットＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ａ１１０７５， １／１０００ｘ）、Ａｌｅｘａ ５６８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ａ１１０３１、１／１０００ｘ）、Ａｌｅｘａ ５６８結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ａ１１０３６， １／１０００ｘ）、Ａｌｅｘａ ６３３結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ａ２１０７２， １／１０００ｘ）であった。細胞をＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｄ１３０６）で対比染色した。
以下の抗体を使用して、通常のプロトコールと共に免疫細胞化学を実施した：ウサギ抗ＭＡＦＡ（Ａｂｃａｍ； ａｂ２６４０５； １／１００ｘ）、ヤギ抗ＰＤＸ１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ； ＡＦ２４１９； １／１００ｘ）、マウス抗ＮＫＸ６．１（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ； Ｆ６４Ａ６Ｂ４； １／１００ｘ）、モルモット抗ＩＮＳＵＬＩＮ（Ｄａｋｏ； ＩＲ００２； １／１０ｘ）、マウス抗ＩＮＳＵＬＩＮ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ； Ｉ２０１８； １／１０００ｘ）、ウサギ抗Ｃ－ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ； ４５９３； １／１００ｘ）、ウサギ抗ＧＦＰ（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ； ５９８； １／１０００ｘ）、およびマウス抗ＧＬＵＣＡＧＯＮ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ； Ｇ２６５４； １／１０００ｘ）。使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ ４８８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ａ１１０２９， １／１０００ｘ）、Ａｌｅｘａ ４８８結合ロバ抗モルモットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ７０６－５４６－１４８）、ＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ７１１－６０６－１５２）、ＡＦ５６８結合ロバ抗マウスＩｇＧ（ＢＩＯＴＩＵＭ， ２０１０５）、Ａｌｅｘａ ５６８結合ヤギ抗モルモットＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ａ１１０７５， １／１０００ｘ）、Ａｌｅｘａ ５６８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ａ１１０３１、１／１０００ｘ）、Ａｌｅｘａ ５６８結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ａ１１０３６， １／１０００ｘ）、Ａｌｅｘａ ６３３結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ａ２１０７２， １／１０００ｘ）であった。細胞をＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｄ１３０６）で対比染色した。
【0330】
（５）定量的リアルタイムＰＣＲ
マウスＥＳ細胞のｃＤＮＡ調製はＶＩＬＯマスターミックスを使用して行い、リアルタイムＰＣＲ分析はＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙ ＩＤ： ｍｏｕｓｅ Ｈｐｒｔ１， Ｍｍ０３０２４０７５＿ｍ１； ｍｏｕｓｅ ｉｎｓｕｌｉｎ１， Ｍｍ０１９５０２９４＿ｓ１）を用いて製造元の説明書に従って行った。適切な試験試料の混合物の希釈系列を使用することによって作成された各遺伝子についての標準曲線を用いることによって遺伝子発現量を計算した。各遺伝子の発現レベルは、Ｈｐｒｔ１発現レベルで補正した。
マウスＥＳ細胞のｃＤＮＡ調製はＶＩＬＯマスターミックスを使用して行い、リアルタイムＰＣＲ分析はＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙ ＩＤ： ｍｏｕｓｅ Ｈｐｒｔ１， Ｍｍ０３０２４０７５＿ｍ１； ｍｏｕｓｅ ｉｎｓｕｌｉｎ１， Ｍｍ０１９５０２９４＿ｓ１）を用いて製造元の説明書に従って行った。適切な試験試料の混合物の希釈系列を使用することによって作成された各遺伝子についての標準曲線を用いることによって遺伝子発現量を計算した。各遺伝子の発現レベルは、Ｈｐｒｔ１発現レベルで補正した。
【0331】
（６）ヒトｉＰＳ細胞由来β細胞のグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）反応の測定
時間依存的ＧＳＩＳ活性測定は以下のようにして行った。得られたヒトｉＰＳ－β細胞のアリコートを低グルコース（ＬＧ：３ｍＭグルコース）ＨＫＲＢ緩衝液（ＣＯＳＭＯＢＩＯ， ＰＭＣ－ＰＮＩＭＧ）中で１０分間数回洗浄した。細胞を、２４ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、３４１５）中のトランスウェル透過性支持体中のＬＧ－ＨＫＲＢ緩衝液中でさらに３０分間インキュベートし、上清のごく一部をｃ－ペプチド測定（ＬＧ ３０分）用のサンプルとして取った。細胞懸濁液に追加の量のグルコースを添加して最終グルコース濃度を３から２０ｍＭに増加させることによって、高グルコース刺激を開始した。上清のサンプリングを経時的に行い（ＨＧ刺激の開始後１０、３０、６０分；それぞれＨＧ １０分、ＨＧ ３０分、およびＨＧ ６０分）、続いて１００μＭのエキセンディン４および２０ｍＭのＫＣｌを順次添加し、３０分間インキュベートした（それぞれＥｘ４ ３０分およびＫＣｌ ３０分）。
時間依存的ＧＳＩＳ活性測定は以下のようにして行った。得られたヒトｉＰＳ－β細胞のアリコートを低グルコース（ＬＧ：３ｍＭグルコース）ＨＫＲＢ緩衝液（ＣＯＳＭＯＢＩＯ， ＰＭＣ－ＰＮＩＭＧ）中で１０分間数回洗浄した。細胞を、２４ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、３４１５）中のトランスウェル透過性支持体中のＬＧ－ＨＫＲＢ緩衝液中でさらに３０分間インキュベートし、上清のごく一部をｃ－ペプチド測定（ＬＧ ３０分）用のサンプルとして取った。細胞懸濁液に追加の量のグルコースを添加して最終グルコース濃度を３から２０ｍＭに増加させることによって、高グルコース刺激を開始した。上清のサンプリングを経時的に行い（ＨＧ刺激の開始後１０、３０、６０分；それぞれＨＧ １０分、ＨＧ ３０分、およびＨＧ ６０分）、続いて１００μＭのエキセンディン４および２０ｍＭのＫＣｌを順次添加し、３０分間インキュベートした（それぞれＥｘ４ ３０分およびＫＣｌ ３０分）。
【0332】
バッチモードＧＳＩＳアッセイは以下のように実施した。得られたヒトｉＰＳ－β細胞のアリコートを上記のようにＬＧ－ＫＲＢＨで洗浄した後、細胞をＬＧ－ＨＫＲＢ緩衝液中で３０分または１時間インキュベートし、続いてＨＧ－ＨＫＲＢ緩衝液中で同じ時間インキュベートした。いくつかの実験では、細胞を洗浄した後、細胞をいくつかのアリコートに分配し、０．０１％のＤＭＳＯまたは数種類のインスリン分泌促進薬を含有するＨＧ－ＨＫＲＢ緩衝液中で１時間インキュベートした。サンプルのＣ－ペプチド濃度は、ａｌｐｈａＬＩＳＡ Ｃ－ペプチドキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， ＡＬ２９９Ｆ）またはＣ－ペプチドＥＬＩＳＡを用いて測定し、ＧＳＩＳアッセイに用いた細胞のＤＮＡ含有量によって補正した。
【0333】
（７）ＤＮＡ量の測定
ＧＳＩＳアッセイ後に細胞を回収し、そのＤＮＡをＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ， ８０２８４）を用いて精製し、そしてＤＮＡの濃度をＱｕｂｉｔアッセイ（Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｑ３２８５４）を用いて測定した。
ＧＳＩＳアッセイ後に細胞を回収し、そのＤＮＡをＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ， ８０２８４）を用いて精製し、そしてＤＮＡの濃度をＱｕｂｉｔアッセイ（Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｑ３２８５４）を用いて測定した。
【0334】
［参考文献］
Nakashima, R., Morooka, M., Shiraki, N., Sakano, D., Ogaki, S., Kume, K. and Kume, S. (2015). Neural cells play an inhibitory role in pancreatic differentiation of pluripotent stem cells. Genes Cells 1028-1045.
Sakano, D., Shiraki, N., Kikawa, K., Yamazoe, T., Kataoka, M., Umeda, K., Araki, K., Mao, D., Matsumoto, S., Nakagata, N., et al. (2014). VMAT2 identified as a regulator of late-stage β-cell differentiation. Nat. Chem. Biol. 10, 141-8.
Shahjalal, H. M., Shiraki, N., Sakano, D., Kikawa, K., Ogaki, S., Baba, H., Kume, K. and Kume, S. (2014). Generation of insulin-producing β-like cells from human iPS cells in a defined and completely xeno-free culture system. J. Mol. Cell Biol. 0, 1-15.
Shiraki, N., Yoshida, T., Araki, K., Umezawa, A., Higuchi, Y., Goto, H., Kume, K. and Kume, S. (2008). Guided differentiation of embryonic stem cells into Pdx1-expressing regional-specific definitive endoderm. Stem Cells 26, 874-85.
Shiraki, N., Shiraki, Y., Tsuyama, T., Obata, F., Miura, M., Nagae, G., Aburatani, H., Kume, K., Endo, F. and Kume, S. (2014). Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metab. 19, 780-794.
Treff, N. R., Vincent, R. K., Budde, M. L., Browning, V. L., Magliocca, J. F., Kapur, V. and Odorico, J. S. (2006). Differentiation of Embryonic Stem Cells Conditionally Expressing Neurogenin 3. Stem Cells 24, 2529-2537.
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【0335】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
