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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-09
(45)【発行日】2024-09-18
(54)【発明の名称】糖尿病治療のためのペプチド断片
(51)【国際特許分類】
A61K 38/16 20060101AFI20240910BHJP
A61K 38/04 20060101ALI20240910BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240910BHJP
A61K 51/02 20060101ALI20240910BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20240910BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240910BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240910BHJP
A61P 5/50 20060101ALI20240910BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240910BHJP
C07K 7/04 20060101ALI20240910BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20240910BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20240910BHJP
C07K 14/315 20060101ALI20240910BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240910BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240910BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240910BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240910BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240910BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20240910BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240910BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20240910BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240910BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240910BHJP
A61K 48/00 20060101ALN20240910BHJP
【ＦＩ】
A61K38/16
A61K38/04
A61K45/00
A61K51/02 200
A61P1/18
A61P3/00
A61P3/10
A61P5/50
A61P43/00 121
C07K7/04
C07K7/06 ZNA
C07K7/08
C07K14/315
C07K19/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N9/10
C12N15/11 Z
C12N15/54
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
A61K48/00
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021524174
(86)(22)【出願日】2019-11-07
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-28
(86)【国際出願番号】 EP2019080563
(87)【国際公開番号】W WO2020094797
(87)【国際公開日】2020-05-14
【審査請求日】2022-11-02
(31)【優先権主張番号】18204862.9
(32)【優先日】2018-11-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】519358380
【氏名又は名称】フォリクム エービー
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】アレンフォール，ジャン
(72)【発明者】
【氏名】エクブラッド，マリア
(72)【発明者】
【氏名】ダナー，ポントス
【審査官】愛清 哲
(56)【参考文献】
【文献】特表平１０－５０５７５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００４／０１５３９０（ＷＯ，Ａ２）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／１４３６０５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／３１７６２０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／２０２８７０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】FEBS Letters，1998年，Vol. 429，pp. 269-273
【文献】Histol Histopathol，2008年，Vol. 23，pp. 157-166
【文献】Molecular Vision，2016年，Vol. 22，pp. 436-445
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
Ａ６１Ｋ ５１／００－５１／１２
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
Ｃ０７Ｋ ７／００－ ７／６６
Ｃ０７Ｋ １４／００－１４／８２５
Ｃ１２Ｎ １／００－ １／３８
Ｃ１２Ｎ ５／００－ ５／２８
Ｃ１２Ｎ ９／９９－ ９／９９
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）アミノ酸配列ＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７６）を含むペプチドであって、但し８５個以下のアミノ酸残基を含み、
かつＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１３６）、ＫＣＬＡＥＣＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１４１）、ＫＰＬＡＥＤＩＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１４４）、ＫＰＬＡＥＩＳＤＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１４５）、ＫＰＬＡＥＩＧＤＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１４６）、ＫＰＬＡＥＧＤＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１４７）、ＫＰＬＡＥＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１４８）、ＫＰＬＡＥＩＤＧＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１５０）、ＫＰＬＡＥＩＧＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１５２）、又はＫＧＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１５３）でない、ペプチド、
ｂ）発現時にａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｃ）ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター、又は
ｄ）ｂ）のポリヌクレオチド、若しくはｃ）のベクターを含む細胞
を含む、薬剤。
【請求項2】
前記ペプチドが、８０個以下の、７５個以下などの、７０個以下などの、６５個以下などの、６０個以下などの、５５個以下などの、５０個以下などの、５５個以下などの、４０個以下などのアミノ酸、３５個以下などの、３０個以下などの、２８個以下などの、２６個以下などの、２４個以下などの、２２個以下などの、２０個以下などの、１９個以下などの、１８個以下などの、１７個以下などの、１６個以下などの、１５個以下などの、１４個以下などの、１３個以下などの、１２個以下などの、１１個以下などの、１０個以下などのアミノ酸を含む、請求項１に記載の薬剤。
【請求項3】
前記ペプチドが、ＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７１）、ＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７５）、ＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７４）、ＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７３）、ＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７２）、及びＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の薬剤。
【請求項4】
前記ペプチドが、ＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７１）、ＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７０）、ＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７２）、ＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７３）、ＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７４）、ＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７５）、及びＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７６）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の薬剤。
【請求項5】
前記ペプチドが、ＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７１）、ＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７２）、ＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７３）、ＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７４）、及びＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７５）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の薬剤。
【請求項6】
前記ペプチドが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、単糖、フルオロフォア、クロモフォア、放射性化合物、及び細胞透過ペプチドからなる群から選択される部分などの、部分にコンジュゲートされる、請求項１～５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項7】
前記ペプチドが、グリコシル化される又はペグ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化及び／又はアルキル化によりなど、さらに修飾される、請求項１～６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項8】
前記ペプチドが、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）若しくはプロテインＡなどの、別のポリペプチドに融合される、又はオリゴヒスチジンタグなどの、タグに融合される、請求項１～７のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項9】
前記ペプチドが、環状である、請求項１～８のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項10】
検出可能な部分をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項11】
個体における膵臓の疾患、障害又は損傷の診断のための診断組成物の調製のための、請求項１～１０のいずれかに記載の薬剤の使用。
【請求項12】
請求項１～１０に記載の薬剤を含む組成物。
【請求項13】
ヒトなどの哺乳動物における糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、栄養障害関連糖尿病、グルコース調節及び膵臓内分泌の障害、インスリン抵抗性症候群、グルコース耐性障害、高血糖症、高インスリン血症、又はそれらの任意の組み合わせの治療における使用するための請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記糖尿病が、１型糖尿病、２型糖尿病、栄養障害関連糖尿病、特定糖尿病、及び不特定糖尿病からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用のための請求項１２に記載の組成物。
【請求項15】
前記薬剤又は組成物が、インスリン、グルカゴン様ペペプチド－１（ＧＬＰ－１）、スルホニル尿素、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）阻害剤、α－グルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン、メグリチニド及びナトリウムグルコース共輸送体－２（ＳＧＬＴ２）阻害剤からなる群から選択される有効成分などの、第２の又はさらなる有効成分を含む、請求項１３又は１４に記載の使用のための請求項１２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本開示は、糖尿病及び関連障害の治療に有用なペプチドに関する。
本開示は、糖尿病及び関連障害の治療に有用なペプチドに関する。
【背景技術】
【0002】
背景
膵臓のランゲルハンス島のβ細胞によって産生されるペプチドホルモンのインスリンは、血糖値の増加に応答して放出される。そのため、グルコースは、標的組織、例えば、脂肪組織、骨格筋及び肝臓の細胞膜に位置するグルコーストランスポーターのインスリン依存刺激によって血液から取り除かれる。インスリンは、膜結合型インスリン受容体（ＩＲ）に結合すること、及びそれを活性化すること、それにより、グルコース及び脂質の代謝などの複数の生物学的プロセスを調節する細胞内シグナル伝達事象のカスケードを開始することによりその生物学的効果を発揮する。
膵臓のランゲルハンス島のβ細胞によって産生されるペプチドホルモンのインスリンは、血糖値の増加に応答して放出される。そのため、グルコースは、標的組織、例えば、脂肪組織、骨格筋及び肝臓の細胞膜に位置するグルコーストランスポーターのインスリン依存刺激によって血液から取り除かれる。インスリンは、膜結合型インスリン受容体（ＩＲ）に結合すること、及びそれを活性化すること、それにより、グルコース及び脂質の代謝などの複数の生物学的プロセスを調節する細胞内シグナル伝達事象のカスケードを開始することによりその生物学的効果を発揮する。
【0003】
現在、１型糖尿病と２型糖尿病の両方の糖尿病の治療は主に、インスリン治療に依存している。インスリン治療への補充物は、長時間作用型グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体アゴニスト、すなわち、ＧＬＰ－１と同じ受容体に作用する誘導体である。ＧＬＰ－１は、インスリン分泌を刺激する代謝ホルモンである。グルコース依存的に膵臓からのインスリン分泌を増加させることに加え、ＧＬＰ－１は、α細胞とβ細胞の両方でインスリン感受性を増加させること；β細胞の質量とインスリン発現、翻訳後修飾、及び分泌を増加させること；並びに膵臓からのグルカゴン分泌を減少させることが知られている。血漿グルコースレベルを低下させる目的でインスリン治療への補充として使用される他の薬物は、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、メトホルミン、ＳＧＬＴ－２阻害剤及びスルホニル尿素を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
体重の増加並びに癌及び低血糖のリスクの増加などのいくつかの欠点は、インスリンの長期使用に関連付けられている。そのため、インスリン抵抗性及び高血糖に対処することにより糖尿病を治療するだけでなく、関連付けられ結果として生じる合併症を低減することが可能な新規の非インスリン化合物に対する需要が当技術分野で高まっている。
【課題を解決するための手段】
【0005】
グルコース代謝を回復させ、かつ糖尿病及び関連障害を治療できる新規化合物の同定はそのため、非常に関連性が高い。複数のアプローチが、いずれも当業者には明らかではないが、企図され得る。
【0006】
本発明者らは、β細胞増殖を刺激し、糖毒性状態により誘導されるアポトーシスからβ細胞を救出し、かつラットＩＮＳ－１ β細胞及び単離されたマウス膵島からのインスリン分泌を刺激する能力を有するペプチドを発見した。さらに、本発明者らは、グルコース負荷試験において、このペプチドが生体内で血漿グルコースレベルを低下させ、かつ糖尿病１型モデルのＢＢ ｌｙｐ／ｌｙｐラットにおいて糖尿病疾患の発症を遅らせることを発見した。したがって、本開示のペプチドは、内分泌、栄養及び代謝の疾患並びに障害の治療における使用に適している。
【発明の効果】
【0007】
一態様では、本開示は、ペプチド若しくはペプチド類似体を含むか又はそれらからなる薬剤に関し、ペプチド又はペプチド類似体は、一般式：
Ｘ１ＬＸ２ＹＧＩＫ（配列番号１７７）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ又はＧであり；
Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
但し、Ｘ２がＴの場合は、ペプチド又はペプチド類似体は２５個以下のアミノ酸を含み；かつ
Ｘ１がＥであり、Ｘ２がＳである場合は、ペプチド又はペプチド類似体は、８５個以下のアミノ酸残基を含む）
のアミノ酸配列を含む。
Ｘ１ＬＸ２ＹＧＩＫ（配列番号１７７）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ又はＧであり；
Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
但し、Ｘ２がＴの場合は、ペプチド又はペプチド類似体は２５個以下のアミノ酸を含み；かつ
Ｘ１がＥであり、Ｘ２がＳである場合は、ペプチド又はペプチド類似体は、８５個以下のアミノ酸残基を含む）
のアミノ酸配列を含む。
【0008】
一態様では、本開示は、アミノ酸配列ＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号４）、ＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号８）、ＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１３）、及びＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１９）、ＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２６）、ＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号３４）を含むか、又はそれらからなるペプチド又はペプチド類似体を含む薬剤に関する。
【0009】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の薬剤を含む組成物に関する。
【0010】
一態様では、本開示は、発現時に本明細書に記載のペプチド又はペプチド類似体をコードするポリヌクレオチドに関する。
【0011】
一態様では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【0012】
一態様では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞に関する。
【0013】
一態様では、本開示は、医薬として使用するための、本明細書に記載の薬剤、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組成物に関する。
【0014】
一態様では、本開示は、哺乳動物における内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療で使用するための
ａ）（ｉ）一般式：
Ｘ１ＬＸ２ＹＧＩＫ（配列番号１７７）
（式中、
Ｘ１０は、Ｅ又はＧであり；
Ｘ１２は、Ｓ又はＴであり；
但し、Ｘ１２がＴの場合は、ペプチド又はペプチド類似体は２５個以下のアミノ酸残基を含む）
のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド：
（ｉｉ）一般式：
Ｚ１Ｚ２ＳＺ３Ｚ４ＹＧＬＲ（配列番号１７８）
（式中、
Ｚ１は、Ｄ又はＧであり；
Ｚ２は、Ｉ又はＧであり；
Ｚ３は、Ｖ又はＬであり；
Ｚ４は、Ｖ又はＡである）
のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド；並びに
（ｉｉｉ）ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬ（配列番号３）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧ（配列番号６）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹ（配列番号１０）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶ（配列番号１５）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶ（配列番号２１）及びＶＤＴＹＤＧＤＩＳ（配列番号２８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド、
からなる群から選択されるペプチド又はペプチド類似体；
ｂ）発現時にａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター；又は
ｄ）ｂ）のポリヌクレオチド、又はｃ）のベクターを含む細胞
を含む薬剤に関する。
ａ）（ｉ）一般式：
Ｘ１ＬＸ２ＹＧＩＫ（配列番号１７７）
（式中、
Ｘ１０は、Ｅ又はＧであり；
Ｘ１２は、Ｓ又はＴであり；
但し、Ｘ１２がＴの場合は、ペプチド又はペプチド類似体は２５個以下のアミノ酸残基を含む）
のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド：
（ｉｉ）一般式：
Ｚ１Ｚ２ＳＺ３Ｚ４ＹＧＬＲ（配列番号１７８）
（式中、
Ｚ１は、Ｄ又はＧであり；
Ｚ２は、Ｉ又はＧであり；
Ｚ３は、Ｖ又はＬであり；
Ｚ４は、Ｖ又はＡである）
のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド；並びに
（ｉｉｉ）ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬ（配列番号３）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧ（配列番号６）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹ（配列番号１０）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶ（配列番号１５）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶ（配列番号２１）及びＶＤＴＹＤＧＤＩＳ（配列番号２８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド、
からなる群から選択されるペプチド又はペプチド類似体；
ｂ）発現時にａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター；又は
ｄ）ｂ）のポリヌクレオチド、又はｃ）のベクターを含む細胞
を含む薬剤に関する。
【0015】
一態様では、本開示は、内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患を治療する方法であって、それを必要とする個体に、本明細書に記載の治療有効量の薬剤、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を投与することを含む、方法に関する。
【0016】
一態様では、本開示は、内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療用の医薬の製造のための、本明細書に記載の薬剤、組成物、ポリヌクレオチド、又は細胞の使用に関する。
【0017】
一態様では、本開示は、糖尿病の発症を遅延させる方法であって、それを必要とする個体に、本明細書に記載の治療有効量の薬剤、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を投与することを含む、方法に関する。
【0018】
一態様では、本開示は、血糖値を減少させる方法であって、それを必要とする個体に、本明細書に記載の治療有効量の薬剤、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を投与することを含む、方法に関する。
【0019】
一態様では、本開示は、ベータ細胞の形態を改善するための方法、例えば、インビトロ法であって、それを必要とする個体に、本明細書に記載の治療有効量の薬剤、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を投与することを含む、方法に関する。
【0020】
一態様では、本開示は、ベータ細胞の生存率を向上させるための方法であって、それを必要とする個体に、本明細書に記載の治療有効量の薬剤、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を投与することを含む、方法に関する。
【0021】
一態様では、本開示は、個体における膵臓の疾患、障害又は損傷の診断のための診断用組成物の調製のための、本明細書に記載の薬剤の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】ＦＯＬ－００５及びＦＯＬ－０１４はβ細胞の増殖を誘導した。溶液中の漸増濃度のＦＯＬ－００５の添加は、４８時間後にＩＮＳ－１細胞の増殖の増加を誘導した（図１Ａ）。ＦＯＬ－００５でコートし、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックしたウェルは、ＢＳＡのみでコートした対照（ｃｔｒｌ）ウェルと比較してより多くのβ細胞の増殖を誘導した（図１Ｂ）。ＦＯＬ－０１４で事前コートし、ＢＳＡでブロックしたウェルは、ＢＳＡのみでコートしたウェルと比較してより多くの増殖を誘導した（図１Ｃ）。データを、相対的な非刺激対照（ｃｔｒｌ）細胞に対する１分あたりの数（ＣＰＭ）として提示する。平均±ＳＤを、各グループの１０～１２の異なる観測について提示する。
【図2】ＦＯＬ－００５は糖毒性に対してβ細胞を保護した。２０ｍＭグルコース中で４８時間インキュベートしたＩＮＳ－１細胞は、５ｍＭグルコースとインキュベートした細胞と比較して、より多くのアポトーシス細胞（アネキシンＶ陽性）を示した。２０ｍＭグルコースとインキュベートした細胞へのＦＯＬ－００５の添加は、２０ｍＭグルコースのみと比較してアポトーシス細胞のレベルを低下させた（図２Ａ）。カスパーゼ－３活性により測定したアポトーシスは、５ｍＭグルコースと比較して、２０ｍＭにてＩＮＳ－１細胞中で増加した。ＦＯＬ－００５の添加は、糖毒性誘導カスパーゼ－３活性の割合を低下させた（図２Ｂ）。平均±ＳＤを、各グループの４～８の異なる観測について提示する。
【図3】ＦＯＬ－００５刺激後に、小島及びβ細胞からのインスリン分泌が増加した。ＦＯＬ－００５は、β細胞及び小島のインスリン分泌を刺激した。ＩＮＳ－１細胞からのインスリン放出は、非刺激対照（ｃｔｒｌ）及びスクランブル対照ペプチド（ＦＯＬ－０１５）と比較して、ＦＯＬ－００５（６μＭ）刺激後に非グルコース含有培地中で増加した（図３Ａ）。ＦＯＬ－００５は、低い（５ｍＭ）と高い（２０ｍＭ）グルコースの両方でＩＮＳ－１からのインスリン放出を刺激した（図３Ｂ）。ＦＯＬ－００５（６μＭ）又はＧＬＰ－１（１００ｎＭ）で刺激した単離マウス膵島は、非刺激対照小島と比較してより多くのインスリンを分泌した（図３Ｃ）。平均±ＳＤを、各グループの５～６の異なる観測について提示する。
【図4】ＦＯＬ－０１４刺激後に、小島及びβ細胞からのインスリン分泌が増加した。ＦＯＬ－０１４は、β細胞及び膵島からのインスリン分泌を刺激した。ＦＯＬ－０１４（６μＭ）で刺激したＩＮＳ－１細胞は、非刺激対照細胞と比較してインスリンをより多く分泌した（図４Ａ）。ＦＯＬ－０１４（６μＭ）で刺激した単離マウス膵島は、対照膵島に比べてより多くのインスリンを分泌した（図４Ｂ）。ＧＬＰ－１（１００ｎＭ）又はＦＯＬ－０１４（０.６μＭ）の添加は、インスリン分泌に影響を及ぼさなかった。平均±ＳＤを、各グループの５～６の異なる観測について示す。
【図5】ＦＯＬ－０１４がインスリン分泌に及ぼす効果は用量依存的であった。ＦＯＬ－０１４の用量を増加させることによるＩＮＳ－１細胞の刺激は、試験した全ての濃度についてインスリン分泌の有意な増加をもたらした。インスリン分泌は、０.６ｎＭ～６０ｎＭの範囲のＦＯＬ－０１４の存在下で直線的に増加した。より高い濃度は、インスリン分泌にあまり顕著な効果をもたらすように見えなかった。さらに、ＦＯＬ－０１４に誘導されるインスリン分泌は、１００ｎＭのＧＬＰ－１の効果と同等であった。バーは、平均値と平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図6】ＦＯＬ－０１４のインスリン分泌に対する効果は、グルコース濃度依存的であった。未処理ＩＮＳ－１細胞又はＦＯＬ－０１４曝露ＩＮＳ－１細胞からのインスリン分泌を、グルコース濃度を増加させて測定した。グルコースレベル５.５ｍＭ以上では、インスリン分泌は、未処理の対照細胞と比較して、ＦＯＬ－０１４処理細胞において顕著に高かった。バーは、平均値と平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を意味する。
【図7】天然型ＧＬＰ－１と共に投与したＦＯＬ－００５及びＦＯＬ－０１４は、インスリン分泌に対して相加効果を誘発した。ＩＮＳ－１細胞からのインスリン放出を、それぞれＦＯＬ－００５及びＦＯＬ－０１４とのＧＬＰ－１の併用処理（全３種のペプチドを１００ｎＭの濃度で）後に測定し、各ペプチド単独の効果と比較した。ＧＬＰ－１とＦＯＬ－０１４の組み合わせは、各ペプチド単独と比較してインスリン分泌を有意に増加させた。ＦＯＬ－００５とＧＬＰ－１の組み合わせについても増加が観察された。バーは、平均値と平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図8】ＦＯＬ－０１４は、膵島でのインスリン及びグルカゴンの分泌に影響を与えた。ＦＯＬ－０１４の２つの異なる濃度を試験し、グルコースの低い（２.８ｍＭ）（Ａ、Ｃ）及び高い（１６.７ｍＭ）（Ｂ、Ｄ）濃度で、単離マウス小島に対する１００ｎＭのＧＬＰ－１の効果と比較した。低グルコース試料では、ＦＯＬ－０１４の存在は、インスリン分泌を増加させなかったが、対照及びＧＬＰ－１と比較してグルカゴン分泌を低下させた。高グルコース試料では、６００ｎＭのＦＯＬ－０１４及びＧＬＰ－１はインスリン分泌を顕著に増加させたが、６μＭのＦＯＬ－０１４は増加させず（Ｂ）、ＧＬＰ－１及び両方の濃度のＦＯＬ－０１４はグルカゴン分泌を効率的に低下させた（Ｄ）。バーは、平均値と平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を意味する。
【図9】ＦＯＬ－０１４は、グルコース注入後にインビボで血漿グルコースレベルを低下させた。腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を野生型Ｃ５７ｂｌ／６マウスで行った。２００ｎｍｏｌ／ｋｇで投与したＦＯＬ－０１４は、１５分、３０分及び４５分の時点で対照と比較して血漿グルコースレベルを有意に低下させた（Ｐ＝０.００２７）。３０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量で、ＦＯＬ－０１４は、グルコース注入後４５分の時点で、有意な効果でグルコースレベルを低下させた。点線は、平均の非空腹時グルコースレベルに対応する。データは、平均値と平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。統計分析を、スチューデントｔ検定を用いて行った。
【図10】ＦＯＬ－０１４は、ＢＢ ｌｙｐ／ｌｙｐラットにおける１型糖尿病の発症を遅らせた。ＦＯＬ－０１４で処置したＢＢ ｌｙｐ／ｌｙｐラットは、血漿グルコースが１１.１ｍｍｏｌ／ｌ未満と定義される糖尿病の発症において有意な遅延を示した。各ラットの糖尿病発症年齢は、（Ａ）未処置群と処置群の間に有意な差を有する（Ａ）に示した。１型糖尿病を発症する動物の割合は、グループ間で有意な差を有する（Ｂ）に示した。（Ａ）のエラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図11】ＦＯＬ－００５又はＦＯＬ－０１４に由来するペプチド類似体のインスリン分泌に対する効果。新規ペプチド類似体を、高グルコース（１６.７ｍＭ）条件下でインスリン分泌を誘導するそれらの能力について、２つの別々のＩＮＳ－１細胞株（Ａ及びＢ）で試験した。効果を、天然のＧＬＰ－１、ＦＯＬ－００５及びＦＯＬ－０１４の効果並びに高グルコース単独の効果と比較した。高グルコース対照の平均を下回るインスリン放出を誘導する類似体を、非機能的であると考えた（図示せず）。インスリン分泌のレベルを、新規類似体については黒く塗りつぶされたバーで、かつ比較物については対照的なパターンで示す。バーは、平均値と平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を意味する。
【図12】ＦＯＬ－００５及びＦＯＬ－０１４は、マウスにおいて注射後に特定の分布パターンを示した。３Ｈ－ＦＯＬ－００５の皮下投与後に、放射能の全体的な最高レベルは、注射の１時間（Ａ）及び２時間（Ｂ）後に、膵臓及び注射部位に存在した。３Ｈ－ＦＯＬ－００５の蓄積は、肝臓、腎臓、唾液腺でも見られる。インビボでＰｅａｒｌ Ｔｒｉｌｏｇｙ小動物イメージングシステムを用いて、皮下注射を介したＮＭＲＩヌードマウスにおけるＣｙ７.５標識ＦＯＬ－００５（Ｃ）及びＦＯＬ－０１４（Ｄ）の生体分布並びに組織局在化を検討した。初期対照イメージング後に、マウス１匹あたり１０ｎｍｏｌの用量を投与し、ライブイメージングを５分、２０分、５０分、６０分、２時間、４時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で行った。両方のペプチドの高い蓄積が、膵臓領域及び注射部位で明らかであった。
【図13】ＦＯＬ－０５６は、ＩＮＳ－１Ｅ細胞からのインスリン分泌を誘導する。高（１６.７ｍＭ）グルコース実験緩衝液中のＩＮＳ－１Ｅ細胞に補充したペプチドＦＯＬ－０５６は、非補充高グルコース緩衝液で処理した細胞と比較して、インスリン分泌を有意に増加させた。比較物ペプチドＦＯＬ－０１４の存在もまた、インスリン分泌の有意な増加をもたらした。ペプチドを、１００ｎＭの濃度で実験緩衝液に添加した。
【図14】ＦＯＬ－０５６は、長期の糖毒性状態の間にＩＮＳ－１Ｅ細胞のインスリン分泌能を維持する。ＩＮＳ－１ β細胞を、ＦＯＬ－０１４又はＦＯＬ－０５６の存在又は非存在下で７２時間、毒性レベルのグルコース（２０ｍＭ）に供した。参考のために、低い（５ｍＭ）グルコースに供した細胞を含めた。（Ａ）毒性レベルのグルコースへの長期暴露は、インスリンを分泌するβ細胞の能力を有意に低下させる。（Ｂ）高グルコース培地中のＦＯＬ－０１４の存在は、高グルコース培地単独と比較して、β細胞のインスリン分泌能を有意に向上させた。高グルコース培地中のＦＯＬ－０５６の存在は、糖毒性作用を無効にし低（５ｍＭ）グルコース処理グループのβ細胞と同じレベルでインスリン放出を保持した。
【図15】天然のＧＬＰ－１と共に投与したＦＯＬ－０５６は、インスリン分泌に対する相加効果を誘発した。ＩＮＳ－１細胞からのインスリン放出を、ＦＯＬ－０５６とのＧＬＰ－１の併用処理（両方のペプチドを１００ｎＭ濃度で）の後に測定し、各ペプチド単独の効果と比較した。ＧＬＰ－１とＦＯＬ－０５６の組み合わせは、各ペプチド単独と比較してインスリン分泌を有意に増加させた（ＧＬＰ－１と比較してＰ＝０.００３７及びＦＯＬ－０５６と比較してＰ＝０.０００３）。データは平均値を表す。エラーバーをＳＥＭとして示す。
【図16】新規ペプチド類似体は、ＩＮＳ－１Ｅ細胞からのインスリン分泌を誘導する。高（１６.７ｍＭ）グルコース実験緩衝液中のＩＮＳ－１Ｅ細胞に補充したペプチドＦＯＬ－０５７、ＦＯＬ－０５８及びＦＯＬ－０５９は、非補充高グルコース緩衝液で処理した細胞と比較してインスリン分泌を増加させた。リラグルチドを比較のために含めた。ペプチドを１００ｎＭの濃度で実験緩衝液に添加した。データは平均値を表す。エラーバーをＳＥＭとして示す。
【図17】新規ペプチド類似体は、長期の糖毒性状態の間にＩＮＳ－１Ｅ細胞のインスリン分泌能力を維持する。ＩＮＳ－１Ｅ β細胞を、いくつかの新規ペプチド類似体の存在下又は非存在下で、７２時間、毒性レベルのグルコース（２０ｍＭ）に供した。参考のために、低い（５ｍＭ）グルコースに供した細胞を含めた（図示せず）。高グルコース培地中のペプチド類似体の存在は、高グルコース培地単独と比較して、β細胞のインスリン分泌能を向上させた。高グルコース対照の平均を下回るインスリン放出を誘導する類似体を、非機能的であると考えた（図示せず）。データは平均値を表す。エラーバーをＳＥＭとして示す。
【図18】ＦＯＬ－０５６及びＦＯＬ－０１４は１.２Ｂ４ヒトβ細胞からのインスリン分泌を誘発した。高（１６.７ｍＭ）グルコース実験緩衝液中の１.２Ｂ４細胞に補充したペプチドＦＯＬ－０５６及びＦＯＬ－０１４は、非補充高グルコース緩衝液で処理した細胞と比較してインスリン分泌を有意に増加させた。リラグルチドを比較のために含めた。ペプチドを１００ｎＭの濃度で実験緩衝液に添加した。データは平均値を表す。エラーバーをＳＥＭとして示す。
【図19】ＦＯＬ－０５６はヒト小島からのインスリン分泌を誘導した。高（１６.７ｍＭ）グルコース実験緩衝液中の２つの別々のドナーから新たに単離したヒト小島に補充したペプチドＦＯＬ－０５６は、非補充高グルコース緩衝液で処理した細胞と比較してインスリン分泌を有意に増加させた。リラグルチドの効果を、比較のために試験した。ＦＯＬ－０５６及びリラグルチドを、それぞれ１及び１００ｎＭの濃度で実験緩衝液に添加した。データは平均値を表す。エラーバーをＳＥＭとして示す。
【図20】ＦＯＬ－０５６は、食事誘発肥満マウスモデルにおいてグルコースレベルの上昇に応答してインスリン分泌能を保持した。高脂肪食のｃ５７Ｂｌ６マウスに投与した１２週後に、グルコース注入後の血漿インスリンの増加として測定される急性インスリン応答（ＡＩＲ）は、未処置対照群と比較して、ＦＯＬ－０５６で処置したマウスにおいて有意により高かった（Ｐ＝０.０１）。データは平均値を表す。エラーバーをＳＥＭとして示す。
【図21】ＦＯＬ－０１４又はＦＯＬ－０５６の投与は糖尿病マウスモデルにおいてＨｂＡ１ｃを低下させた。投与の４週後にｄｂ／ｄｂマウスから採取した全血試料の分析は、未処置対照動物と比較して、ＦＯＬ－０１４（Ｐ＝０.００１５）又はＦＯＬ－０５６（Ｐ＝０.００２８）で処置した動物において有意により低いＨｂＡ１ｃを示した。データは平均値を表す。エラーバーをＳＥＭとして示す。
【発明を実施するための形態】
【0023】
詳細な説明
本開示は、特許請求の範囲で定義されるとおりである。
本開示は、特許請求の範囲で定義されるとおりである。
【0024】
一態様では、本開示は、
ａ）一般式：Ｘ１ＬＸ２ＹＧＩＫ（配列番号１７７）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ又はＧであり；
Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
但し、Ｘ２がＴの場合は、ペプチド又はペプチド類似体は２５個以下のアミノ酸を含み；かつ
Ｘ１がＥであり、Ｘ２がＳである場合には、ペプチド又はペプチド類似体は８５個以下のアミノ酸残基を含む）
のアミノ酸配列を含むペプチド又はペプチド類似体：
ｂ）発現時にａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター；又は
ｄ）ｂ）のポリヌクレオチド、又はｃ）のベクターを含む細胞、
を含むか、又はそれからなる薬剤に関する。
ａ）一般式：Ｘ１ＬＸ２ＹＧＩＫ（配列番号１７７）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ又はＧであり；
Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
但し、Ｘ２がＴの場合は、ペプチド又はペプチド類似体は２５個以下のアミノ酸を含み；かつ
Ｘ１がＥであり、Ｘ２がＳである場合には、ペプチド又はペプチド類似体は８５個以下のアミノ酸残基を含む）
のアミノ酸配列を含むペプチド又はペプチド類似体：
ｂ）発現時にａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター；又は
ｄ）ｂ）のポリヌクレオチド、又はｃ）のベクターを含む細胞、
を含むか、又はそれからなる薬剤に関する。
【0025】
一実施形態では、本開示は、
一般式：
Ｘ１ＬＸ２ＹＧＩＫ（配列番号１７７）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ又はＧであり；
Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
但し、Ｘ２がＴの場合は、ペプチド又はペプチド類似体は２５個以下のアミノ酸を含み；かつ
Ｘ１がＥであり、Ｘ２がＳである場合には、ペプチド又はペプチド類似体は８５個以下のアミノ酸残基を含む）
のアミノ酸配列を含むペプチド又はペプチド類似体に関する。
一般式：
Ｘ１ＬＸ２ＹＧＩＫ（配列番号１７７）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ又はＧであり；
Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
但し、Ｘ２がＴの場合は、ペプチド又はペプチド類似体は２５個以下のアミノ酸を含み；かつ
Ｘ１がＥであり、Ｘ２がＳである場合には、ペプチド又はペプチド類似体は８５個以下のアミノ酸残基を含む）
のアミノ酸配列を含むペプチド又はペプチド類似体に関する。
【0026】
一実施形態では、本開示は、発現時に、本明細書に記載のペプチド又はペプチド類似体をコードするポリヌクレオチドに関する。
【0027】
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【0028】
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む細胞に関する。一実施形態では、本開示は、本明細書に記載のベクターを含む細胞に関する。
【0029】
一実施形態では、本開示は、
ａ）ペプチドであって、
ｉ）配列番号１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３及び１８４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド；
ｉｉ）ｉ）のペプチドのいずれか１つの生物学的に活性な配列バリアントであって、任意の１つのアミノ酸が別のタンパク質原性又は非タンパク質原性のアミノ酸に改変され、但し、５個以下のアミノ酸がそのように改変される、配列バリアント；
ｉｉｉ）ｉ）又はｉｉ）のいずれか１つのペプチドの生物学的に活性な断片であって、ｉ）又はｉｉ）のいずれか１つの少なくとも１０個の連続アミノ酸を含む、断片、
からなる群から選択される、ペプチド；
ｂ）発現時にａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター；又は
ｄ）ｂ）のポリヌクレオチド、又はｃ）のベクターを含む細胞、
を含む薬剤に関する。
ａ）ペプチドであって、
ｉ）配列番号１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３及び１８４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド；
ｉｉ）ｉ）のペプチドのいずれか１つの生物学的に活性な配列バリアントであって、任意の１つのアミノ酸が別のタンパク質原性又は非タンパク質原性のアミノ酸に改変され、但し、５個以下のアミノ酸がそのように改変される、配列バリアント；
ｉｉｉ）ｉ）又はｉｉ）のいずれか１つのペプチドの生物学的に活性な断片であって、ｉ）又はｉｉ）のいずれか１つの少なくとも１０個の連続アミノ酸を含む、断片、
からなる群から選択される、ペプチド；
ｂ）発現時にａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター；又は
ｄ）ｂ）のポリヌクレオチド、又はｃ）のベクターを含む細胞、
を含む薬剤に関する。
【0030】
一実施形態では、本開示はペプチドを含む薬剤に関し、ペプチドは、配列番号１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３及び１８４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチドからなる群から選択される。
【0031】
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載のペプチドのいずれか１つの生物学的に活性な配列バリアントに関し、任意の１つのアミノ酸が、別のタンパク質原性又は非タンパク質原性アミノ酸に改変され、但し、５個以下のアミノ酸がそのように改変される。
【0032】
一実施形態では、本開示は、
ａ）ペプチドであって、ＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号４）、ＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号８）、ＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１３）、及びＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１９）、ＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２６）、ＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号３４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、ペプチド；
ｂ）発現時にａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター；及び
ｄ）ｂ）のポリヌクレオチド、又はｃ）のベクターを含む細胞
を含む薬剤に関する。
ａ）ペプチドであって、ＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号４）、ＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号８）、ＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１３）、及びＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１９）、ＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２６）、ＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号３４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、ペプチド；
ｂ）発現時にａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター；及び
ｄ）ｂ）のポリヌクレオチド、又はｃ）のベクターを含む細胞
を含む薬剤に関する。
【0033】
一実施形態では、本開示は、ペプチドを含む薬剤に関し、ペプチドは、ＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号４）、ＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号８）、ＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１３）、及びＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１９）、ＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２６）及びＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号３４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0034】
一実施形態では、本開示は、一般式：
Ｚ１Ｚ２ＳＺ３Ｚ４ＹＧＬＲ（配列番号１７８）
（式中、
Ｚ１は、Ｄ又はＧであり；
Ｚ２は、Ｉ又はＧであり；
Ｚ３は、Ｖ又はＬであり；
Ｚ４は、Ｖ又はＡである）
のアミノ酸配列を含むペプチドに関する。
Ｚ１Ｚ２ＳＺ３Ｚ４ＹＧＬＲ（配列番号１７８）
（式中、
Ｚ１は、Ｄ又はＧであり；
Ｚ２は、Ｉ又はＧであり；
Ｚ３は、Ｖ又はＬであり；
Ｚ４は、Ｖ又はＡである）
のアミノ酸配列を含むペプチドに関する。
【0035】
本明細書で使用する「存在しない」という用語、例えば、「Ｘ６は、Ｃ、Ｉであるか、又は存在しない」は、存在しないアミノ酸のすぐ隣のアミノ酸残基が、従来のアミド結合により互いに直接連結されると理解されるべきである。
【0036】
本明細書に記載の「ペプチド類似体」という用語は、天然に存在しないアミノ酸配列、又は改変されている、天然に存在するアミノ酸配列を指す。
【0037】
本明細書で使用する「アミノ酸」という用語は、標準の２０個の遺伝的にコードされたアミノ酸及びそれらの対応する（天然「Ｌ」型と比較して）「Ｄ」型の立体異性体、オメガアミノ酸及び他の天然に存在するアミノ酸、従来にないアミノ酸（例えば、α，α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸など）及び化学的誘導体化アミノ酸（下記参照）を含む。
【0038】
アミノ酸が、「アラニン」又は「Ａｌａ」又は「Ａ」などのように具体的に列挙されている場合、この用語は、特に明示的に述べられない限り、Ｌ－アラニンとＤ－アラニンの両方を指す。他の従来にないアミノ酸も、所望の機能性がペプチドによって保持される限り、本開示のペプチドに適した成分であり得る。示されるペプチドについて、コードされる各アミノ酸残基は、適切な場合、従来のアミノ酸の些細な名前に対応する単一文字指定により表される。
【0039】
１以上のアミノ酸の化学的誘導体は、機能的側基との反応により達成され得る。このような誘導体は、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ－トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、ｔ－ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成する分子を含む。遊離カルボキシル基は、誘導体化されて、塩、メチルエステル及びエチルエステル、又は他の種類のエステル及びヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基は、誘導体化されて、Ｏ－アシル誘導体又はＯ－アルキル誘導体を形成し得る。化学的誘導体として、２０個の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドも含まれる。例えば、４－ヒドロキシプロリンはプロリンと置換されてよく；５－ヒドロキシリジンはリジンと置換されてよく；３－メチルヒスチジンはヒスチジンと置換されてよく；ホモセリンはセリンと、オルニチンはリジンと置換されてよい。誘導体はまた、必要な活性が維持される限り、１以上の付加又は欠失を含むペプチドを含む。他の含まれる修飾は、アミド化、アミノ末端アシル化（例えば、アセチル化又はチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニア又はメチルアミンを用いた）などの末端修飾などである。
【0040】
本開示のペプチドの一部は、天然に存在するオステオポンチンタンパク質のサブ領域とアミノ酸配列の類似性を共有する。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、天然に存在するオステオポンチンタンパク質の活性断片又は断片などのバリアントとみなされ得る。
【0041】
本開示のペプチドのいくつかは、天然に存在するテネイシンタンパク質のサブ領域とアミノ酸配列の類似性を共有する。いくつかの実施形態では、上記ペプチドは、天然に存在するテネイシンタンパク質の活性断片又は断片などのバリアントとみなされ得る。
【0042】
「断片」には、アミノ酸配列の少なくとも５個の連続アミノ酸、例えば、アミノ酸配列の少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の連続アミノ酸が含まれる。そのため、断片は、１５個以下のアミノ酸長、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５個のアミノ酸長であり得る。
【0043】
一実施形態では、上記ペプチドは、８５個以下の、８０個以下など、７５個以下など、７０個以下など、６５個以下など、６０個以下など、５５個以下など、５０個以下など、５５個以下など、４０個以下などのアミノ酸、３５個以下など、３０個以下など、２８個以下など、２６個以下など、２４個以下など、２２個以下など、２０個以下など、１９個以下など、１８個以下など、１７個以下など、１６個以下など、１５個以下など、１４個以下など、１３個以下など、１２個以下など、１１個以下など、１０個以下などのアミノ酸長のペプチドである。
【0044】
別の実施形態では、上記ペプチドは、５～３０のアミノ酸長、５～２０など、８～２０など、８～１６など、１０～１５などのアミノ酸長である。
【0045】
さらに別の実施形態では、上記断片は、１５個以下のアミノ酸長、１４個未満のアミノ酸長など、１３個未満のアミノ酸長など、１２個未満のアミノ酸長など、１１個未満のアミノ酸長など、１０個未満のアミノ酸長など、９個未満のアミノ酸長など、８個未満のアミノ酸長など、７個未満のアミノ酸長など、６個未満のアミノ酸長など、５個未満のアミノ酸長などを含む。
【0046】
「バリアント」という用語は、親ペプチドと１００％アミノ酸配列同一性を共有しないペプチドを指し、すなわち、１以上のアミノ酸が変異していなければならない。「変異」とは、親ペプチド中の特定の位置でアミノ酸を改変することを指す。例えば、特定の位置にあるアミノ酸は、除去されるか、改変されるか、置換され得るか、又は１以上のアミノ酸の挿入／付加の部位であり得る。置換が保存的又は非保存的であり得ることは、当業者には理解されるであろう。
【0047】
一実施形態では、上記ペプチドバリアントは、５個以下のアミノ酸が、別のタンパク質原性又は非タンパク質原性アミノ酸に改変され、４個以下のアミノ酸など、３個以下のアミノ酸など、２個以下のアミノ酸など、１個以下のアミノ酸などが改変される配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、１以上のアミノ酸が保存的に置換される。「保存的に置換される」とは、ペプチドの機能が著しく変化しないように、１つのアミノ酸を類似の性質（サイズ、疎水性など）を有する別のアミノ酸に置換することを指す。そのため、「保存的置換」により、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせが意図される。
【0048】
別の実施形態では、上記ペプチドは、Ｎ末端及び／若しくはＣ末端で並びに／又は配列内の内部に挿入される、１以上の追加のアミノ酸を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、少なくとも２個の追加のアミノ酸、少なくとも３個など、少なくとも４個など、少なくとも５個など、少なくとも６個など、少なくとも７個など、少なくとも８個など、少なくとも９個など、少なくとも１０個など、少なくとも１５個など又は少なくとも２０などの追加のアミノ酸が挿入される。追加のアミノ酸は、野生型ヒトオステオポンチン（配列番号６６）の対応する位置からの、又は野生型マウスオステオポンチン（配列番号１３４）の対応する位置からのアミノ酸であり得る。野生型オステオポンチンの「対応する位置」という用語は、追加のアミノ酸が、上記の野生型オステオポンチンの中の同等位置に存在するものと同じであることを意味する（配列番号１のアミノ酸配列が配列番号６６の斜体で下線の付いた配列に置き換えられると考えるならば）。
【0049】
別の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、１３６、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１３８、１３９、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６７、１６８、１６９、１７１、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３及び１８４からなる群から選択される；
【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【0050】
一実施形態では、上記ペプチドは、哺乳動物のオステオポンチンバリアント及び／又は断片などの、オステオポンチンに由来する。
【0051】
一実施形態では、上記ペプチドは、非タンパク質原性アミノ酸残基を含むペプチドなど、天然に存在しない。
【0052】
いくつかの実施形態では、上記ペプチドは、ＰＥＧ、単糖、フルオロフォア、クロモフォア、放射性化合物、及び細胞透過性ペプチドからなる群から選択され得る部分にさらにコンジュゲートされる。一実施形態では、フルオロフォアは、ルシファーイエロー、ビオチン、５、６－カルボキシルテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、インドジカルボシアニン（Ｃ５）アレクサフルオロ（登録商標）４８８、アレクサフルオロ（登録商標）５３２、アレクサフルオロ（登録商標）６４７、ＡＴＴＯ４８８、ＡＴＴＯ５３２、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、アレクサフルオロ（登録商標）３５０、ＤＹ－４１５、ＡＴＴＯ４２５、ＡＴＴＯ４６５、Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）ＦＬ、フルオレセインイソチオシアネート、オレゴングリーン（登録商標）４８８、オレゴングリーン（登録商標）５１４、ローダミングリーン（商標）、５'－テトラクロロ－フルオレセイン、ＡＴＴＯ５２０、６－カルボキ－４'，５'－ジクロロ－２'、７'－ジメトキシフルオレセイン、ヤキマ（Ｙａｋｉｍａ）イエロー（商標）色素、Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）５３０／５５０、ヘキサクロロフルオレセイン、アレクサフルオロ（登録商標）５５５、ＤＹ－５４９、Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）ＴＭＲ－Ｘ、シアニンホスホロアミダイト（シアニン３、シアニン３．５、シアニン５、シアニン５．５、シアニン７.５）、ＡＴＴＯ５５０、ローダミンレッド（商標）、ＡＴＴＯ５６５、カーボキシ－Ｘ－ローダミン、テキサスレッド（スルホローダミン１０１酸性塩化物）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）レッド６１０、ＡＴＴＯ５９４、ＤＹ－４８０－ＸＬ、ＤＹ－６１０、ＡＴＴＯ６１０、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）レッド６４０、Ｂｏｄｉｐｙ６３０／６５０、ＡＴＴＯ６３３、Ｂｏｄｉｐｙ６５０／６６５、ＡＴＴＯ６４７Ｎ、ＤＹ－６４９、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）レッド６７０、ＡＴＴＯ６８０、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）レッド７０５、ＤＹ－６８２、ＡＴＴＯ７００、ＡＴＴＯ７４０、ＤＹ－７８２、ＩＲＤ７００、ＩＲＤ８００、ＣＡＬフルオロ（登録商標）ゴールド５４０ｎｍ、ＣＡＬフルオロ（登録商標）５２２ｎｍ、ＣＡＬフルオロ（登録商標）ゴールド５４４ｎｍ、ＣＡＬフルオロ（登録商標）オレンジ５６０ｎｍ、ＣＡＬフルオロ（登録商標）オレンジ５３８ｎｍ、ＣＡＬフルオロ（登録商標）オレンジ５５９ｎｍ、ＣＡＬフルオロ（登録商標）レッド５９０ｎｍ、ＣＡＬフルオロ（登録商標）レッド５６９ｎｍ、ＣＡＬフルオロ（登録商標）レッド５９１ｎｍ、ＣＡＬフルオロ（登録商標）レッド６１０ｎｍ、ＣＡＬフルオロ（登録商標）レッド５９０ｎｍ、ＣＡＬフルオロ（登録商標）レッド６１０ｎｍ、ＣＡＬフルオロ（登録商標）レッド６３５ｎｍ、クエーサー（登録商標）５７０ｎｍ、クエーサー（登録商標）５４８ｎｍ、クエーサー（登録商標）５６６ｎｍ（Ｃｙ３）、クエーサー（登録商標）６７０ｎｍ、クエーサー（登録商標）６４７ｎｍ、クエーサー（登録商標）６７０ｎｍ、クエーサー（登録商標）７０５ｎｍ、クエーサー６９０ｎｍ（登録商標）、クエーサー（登録商標）７０５ｎｍ（Ｃｙ５.５）、パルサー（登録商標）６５０色素、スーパーロックス（登録商標）色素からなる群から選択される。
【0053】
別の実施形態では、上記ペプチドは、グリコシル化されるか、又はペグ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化及び／又はアルキル化などでさらに改変される。
【0054】
一実施形態では、上記ペプチドは、タンデムリピートを含むか、又はそれからなり、これは、本明細書に記載の配列の任意の１以上のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり得る。
【0055】
一実施形態では、上記ペプチドは環状である。環状構造は、任意の適切な合成方法により達成され得る。そのため、ヘテロデティック結合は、ジスルフィド、システイン、アルキレン又は硫化物架橋を介する形成を含み得るが、これらに限定されない。
【0056】
さらなる実施形態では、ペプチドは融合を含むか、又はそれからなる。例えば、ペプチドは、配列番号１又は１３６のアミノ酸配列の融合を含み得る。
【0057】
ペプチドの「融合」という用語は、例えば、他の任意のペプチドに融合された配列番号１又は１３６（又は断片又はそのバリアント）に対応するアミノ酸配列に関する。例えば、上記ペプチドは、上記ペプチドの精製を促進するために、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はプロテインＡなどのポリペプチドに融合され得る。このような融合の例は、当業者にはよく知られている。同様に、上記ペプチドは、ＨｉＳ６などのオリゴヒスチジンタグ、又はよく知られているＭｙｃタグエピトープなどの抗体により認識されるエピトープに融合され得る。上記ペプチドの任意のバリアント又は誘導体への融合も本開示の範囲に含まれる。
【0058】
あるいは、融合部分は、当業者に公知である、ポリペプチドの細胞取り込みを促進できる親油性の分子又はペプチドドメインであり得る。
【0059】
新規ペプチド
一実施形態では、本開示は、ＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７０）、ＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７１）、ＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７２）、ＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７３）、ＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７４）、ＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７５）、ＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列表番号１４８）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＴＹＧＩＫ（配列表番号１７６）、又はそのバリアント若しくは断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチドに関する。
一実施形態では、本開示は、ＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７０）、ＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７１）、ＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７２）、ＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７３）、ＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７４）、ＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７５）、ＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列表番号１４８）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＴＹＧＩＫ（配列表番号１７６）、又はそのバリアント若しくは断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチドに関する。
【0060】
一実施形態では、ペプチド又はペプチド類似体は、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩ（配列番号１７９）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧ（配列番号１８０）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹ（配列番号１８１）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳ（配列番号１８２）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬ（配列番号１８３）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥ（配列番号１８４）、又はそのバリアント若しくは断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0061】
一実施形態では、本開示は、ペプチドを含む薬剤に関し、ペプチドは、アミノ酸配列ＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７０）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる。
【0062】
一実施形態では、本開示は、ペプチドを含む薬剤に関し、ペプチドは、アミノ酸配列ＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７１）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる。
【0063】
一実施形態では、本開示は、ペプチドを含む薬剤に関し、ペプチドは、アミノ酸配列ＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７２）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる。
【0064】
一実施形態では、本開示は、ペプチドを含む薬剤に関し、ペプチドは、アミノ酸配列ＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７３）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる。
【0065】
一実施形態では、本開示は、ペプチドを含む薬剤に関し、ペプチドは、アミノ酸配列ＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７４）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる。
【0066】
一実施形態では、本開示は、ペプチドを含む薬剤に関し、ペプチドは、アミノ酸配列ＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７５）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる。
【0067】
一実施形態では、本開示は、ペプチドを含む薬剤に関し、ペプチドは、アミノ酸配列ＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７６）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる。
【0068】
一実施形態では、本開示は、ペプチドを含む薬剤に関し、ペプチドは、アミノ酸配列ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩ（配列番号１７９）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる。
【0069】
一実施形態では、本開示は、ペプチドを含む薬剤に関し、ペプチドは、アミノ酸配列ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧ（配列番号１８０）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる。
【0070】
一実施形態では、本開示は、ペプチドを含む薬剤に関し、ペプチドは、アミノ酸配列ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹ（配列番号１８１）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる。
【0071】
一実施形態では、本開示は、ペプチドを含む薬剤に関し、ペプチドは、アミノ酸配列ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳ（配列番号１８２）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる。
【0072】
一実施形態では、本開示は、ペプチドを含む薬剤に関し、ペプチドは、アミノ酸配列ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬ（配列番号１８３）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる。
【0073】
一実施形態では、本開示は、ペプチドを含む薬剤に関し、ペプチドは、アミノ酸配列ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥ（配列番号１８４）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる。
【0074】
一実施形態では、本開示は、
ａ）アミノ酸配列ＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号４）、ＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号８）、ＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１３）、及びＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１９）、ＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２６）、ＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号３４）を含むか、若しくはそれらからなるペプチド又はペプチド類似体；
ｂ）発現時にａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター；又は
ｄ）ｂ）のポリヌクレオチド、又はｃ）のベクターを含む細胞
を含む薬剤に関する。
ａ）アミノ酸配列ＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号４）、ＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号８）、ＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１３）、及びＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１９）、ＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２６）、ＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号３４）を含むか、若しくはそれらからなるペプチド又はペプチド類似体；
ｂ）発現時にａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター；又は
ｄ）ｂ）のポリヌクレオチド、又はｃ）のベクターを含む細胞
を含む薬剤に関する。
【0075】
一実施形態では、本開示は、アミノ酸配列ＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号４）、ＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号８）、ＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１３）、及びＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１９）、ＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２６）、ＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号３４）を含むか、若しくはそれらからなるペプチド又はペプチド類似体を含む薬剤に関する。
【0076】
いくつかの実施形態では、上記バリアントは、任意の１個のアミノ酸が別のタンパク質原性又は非タンパク質原性アミノ酸に改変されている配列を含むか、又はそれからなり、ただし５個以下のアミノ酸がそのように改変され、４個以下のアミノ酸など、３個以下のアミノ酸など、２個以下のアミノ酸など、１個以下のアミノ酸などが改変される。いくつかの実施形態では、１以上のアミノ酸が保存的に置換される。
【0077】
いくつかの実施形態では、上記ペプチドは、Ｎ末端及び／若しくはＣ末端で並びに／又は配列内の内部に挿入される１以上の追加のアミノ酸を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、少なくとも２個の追加のアミノ酸、少なくとも３個など、少なくとも４個など、少なくとも５個など、少なくとも６個など、少なくとも７個など、少なくとも８個など、少なくとも９個など、少なくとも１０個など、少なくとも１５個など又は少なくとも２０個などの追加のアミノ酸が挿入される。
【0078】
一実施形態では、ペプチド又はペプチド類似体は、Ｎ末端でアミノ酸残基Ｐを含む。
【0079】
一実施形態では、上記ペプチドは、８５個以下の、８０個以下など、７５個以下など、７０個以下など、６５個以下など、６０個以下など、５５個以下など、５０個以下など、５５個以下など、４０個以下などのアミノ酸、３５個以下など、３０個以下など、２８個以下など、２６個以下など、２４個以下など、２２個以下など、２０個以下など、１９個以下など、１８個以下など、１７個以下など、１６個以下など、１５個以下など、１４個以下など、１３個以下など、１２個以下など、１１個以下など、１０個以下などのアミノ酸長である。
【0080】
いくつかの実施形態では、上記ペプチドは、ＰＥＧ、単糖、フルオロフォア、クロモフォア、放射性化合物、及び細胞透過性ペプチドからなる群から選択され得る部分にさらにコンジュゲートされる。
【0081】
一実施形態では、上記ペプチドは、グリコシル化されるか、又はペグ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化及び／又はアルキル化によりさらに改変される。
【0082】
いくつかの実施形態では、上記ペプチドは、タンデムリピートを含むか、又はそれからなり、これは、本明細書に記載の配列の任意の１以上のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり得る。
【0083】
一実施形態では、上記ペプチドは環状である。環状構造は、任意の適切な合成方法により達成され得る。そのため、ヘテロデティック結合は、システイン、ジスルフィド、アルキレン又は硫化物架橋を介する形成を含み得るが、これらに限定されない。
【0084】
徴候
本開示の薬剤、ペプチド又はペプチド類似体、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、又は細胞は、内分泌、栄養及び代謝の疾患並びに障害の治療での使用に適している。
本開示の薬剤、ペプチド又はペプチド類似体、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、又は細胞は、内分泌、栄養及び代謝の疾患並びに障害の治療での使用に適している。
【0085】
一実施形態では、内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療を必要とする哺乳動物は、ヒトである。
【0086】
いくつかの実施形態では、内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患は、糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、栄養障害関連糖尿病、グルコース調節及び膵臓内分泌の障害、インスリン抵抗性症候群、グルコース耐性障害、高血糖症、高インスリン血症、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【0087】
いくつかの実施形態では、内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患は、糖尿病、甲状腺の障害、グルコース調節及び膵臓内分泌の障害、内分泌腺の障害、栄養障害、栄養不足、肥満、過栄養、及び代謝障害からなる群から選択される。
【0088】
一実施形態では、糖尿病は、１型糖尿病、２型糖尿病、栄養障害関連糖尿病、特定糖尿病、及び不特定糖尿病からなる群から選択される。
【0089】
一実施形態では、グルコース調節及び膵臓内分泌の障害は、非糖尿病低血糖性昏睡及び膵臓内分泌の障害からなる群から選択される。
【0090】
一実施形態では、肥満及び過栄養の障害は、局所的な脂肪、過栄養、及び過栄養の後遺症からなる群から選択される。
【0091】
一実施形態では、栄養不足の障害は、芳香族アミノ酸代謝の障害、分岐鎖アミノ酸代謝及び脂肪酸代謝の障害、アミノ酸代謝障害、乳糖不耐症、糖代謝障害、スフィンゴ脂質代謝障害、脂質貯蔵障害、グリコサミノグリカン代謝障害、糖タンパク質代謝障害、リポタンパク質代謝障害、脂血症、プリン及びピリミジン代謝障害、ポルフィリン及びビリルビンの代謝障害、ミネラル代謝障害、嚢胞性線維症、アミロイドーシス、体液量減少、流体、電解質及び酸塩基バランスの障害、並びに処置後の内分泌及び代謝の障害からなる群から選択される。
【0092】
組成物
一態様では、本開示は、本明細書に記載の薬剤を含む組成物に関する。組成物は、医薬組成物であり得る。
一態様では、本開示は、本明細書に記載の薬剤を含む組成物に関する。組成物は、医薬組成物であり得る。
【0093】
一態様では、本開示は、哺乳動物における内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療で使用するための
ａ）（ｉ）一般式：
Ｘ１ＬＸ２ＹＧＩＫ（配列番号１７７）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ又はＧであり；
Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
但し、Ｘ２がＴの場合は、ペプチド又はペプチド類似体は２５個以下のアミノ酸残基を含む）
のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド：
（ｉｉ）一般式：
Ｚ１Ｚ２ＳＺ３Ｚ４ＹＧＬＲ（配列番号１７８）
（式中、
Ｚ１は、Ｄ又はＧであり；
Ｚ２は、Ｉ又はＧであり；
Ｚ３は、Ｖ又はＬであり；
Ｚ４は、Ｖ又はＡである）
のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド；並びに
（ｉｉｉ）ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬ（配列番号３）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧ（配列番号６）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹ（配列番号１０）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶ（配列番号１５）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶ（配列番号２１）及びＶＤＴＹＤＧＤＩＳ（配列番号２８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド、からなる群から選択されるペプチド又はペプチド類似体；
ｂ）発現時にａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター；又は
ｄ）ｂ）のポリヌクレオチド、又はｃ）のベクターを含む細胞
を含むか、又はそれからなる薬剤に関する。
ａ）（ｉ）一般式：
Ｘ１ＬＸ２ＹＧＩＫ（配列番号１７７）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ又はＧであり；
Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
但し、Ｘ２がＴの場合は、ペプチド又はペプチド類似体は２５個以下のアミノ酸残基を含む）
のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド：
（ｉｉ）一般式：
Ｚ１Ｚ２ＳＺ３Ｚ４ＹＧＬＲ（配列番号１７８）
（式中、
Ｚ１は、Ｄ又はＧであり；
Ｚ２は、Ｉ又はＧであり；
Ｚ３は、Ｖ又はＬであり；
Ｚ４は、Ｖ又はＡである）
のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド；並びに
（ｉｉｉ）ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬ（配列番号３）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧ（配列番号６）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹ（配列番号１０）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶ（配列番号１５）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶ（配列番号２１）及びＶＤＴＹＤＧＤＩＳ（配列番号２８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド、からなる群から選択されるペプチド又はペプチド類似体；
ｂ）発現時にａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター；又は
ｄ）ｂ）のポリヌクレオチド、又はｃ）のベクターを含む細胞
を含むか、又はそれからなる薬剤に関する。
【0094】
一態様では、本開示は、哺乳動物における内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療で使用するための一般式：
Ｘ１ＬＸ２ＹＧＩＫ（配列番号１７７）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ又はＧであり；
Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
但し、Ｘ２がＴの場合は、ペプチド又はペプチド類似体は２５個以下のアミノ酸残基を含む）
のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるペプチド又はペプチド類似体を含むか、又はそれからなる薬剤に関する。
Ｘ１ＬＸ２ＹＧＩＫ（配列番号１７７）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ又はＧであり；
Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
但し、Ｘ２がＴの場合は、ペプチド又はペプチド類似体は２５個以下のアミノ酸残基を含む）
のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるペプチド又はペプチド類似体を含むか、又はそれからなる薬剤に関する。
【0095】
一態様では、本開示は、哺乳動物における内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療で使用するための一般式：
Ｚ１Ｚ２ＳＺ３Ｚ４ＹＧＬＲ（配列番号１７８）
（式中、
Ｚ１は、Ｄ又はＧであり；
Ｚ２は、Ｉ又はＧであり；
Ｚ３は、Ｖ又はＬであり；
Ｚ４は、Ｖ又はＡである）
のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるペプチド又はペプチド類似体を含むか、又はそれからなる薬剤に関する。
Ｚ１Ｚ２ＳＺ３Ｚ４ＹＧＬＲ（配列番号１７８）
（式中、
Ｚ１は、Ｄ又はＧであり；
Ｚ２は、Ｉ又はＧであり；
Ｚ３は、Ｖ又はＬであり；
Ｚ４は、Ｖ又はＡである）
のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるペプチド又はペプチド類似体を含むか、又はそれからなる薬剤に関する。
【0096】
一態様では、本開示は、哺乳動物における内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療で使用するためのＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬ（配列番号３）ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧ（配列番号６）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹ（配列番号１０）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶ（配列番号１５）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶ（配列番号２１）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳ（配列番号２８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチドに関する。
【0097】
一実施形態では、本開示は、哺乳動物における内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療で使用するための本明細書に記載のペプチドを発現時にコードするポリヌクレオチドに関する。
【0098】
一実施形態では、本開示は、哺乳動物における内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療で使用するための本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【0099】
一実施形態では、本開示は、哺乳動物における内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療で使用するための本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む細胞に関する。
【0100】
一実施形態では、本開示は、哺乳動物における内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療で使用するための本明細書記載のベクターを含む細胞に関する。
【0101】
一態様では、本開示は、内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療で使用するための、本明細書に記載の薬剤を含む組成物に関する。一実施形態では、上記組成物は、医薬組成物である。
【0102】
一実施形態では、薬剤は、第２の有効成分をさらに含む。上記第２の有効成分は、インスリン、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）、ビグアニド、フォルスコリン化合物、スルホニル尿素、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）阻害剤、α－グルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン、メグリチジン及びナトリウムグルコース共輸送体－２（ＳＧＬＴ２）阻害剤からなる群から選択され得る。
【0103】
他の方法
一態様では、本開示は、内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の薬剤、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を投与することを含む、方法に関する。
一態様では、本開示は、内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の薬剤、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を投与することを含む、方法に関する。
【0104】
一態様では、本開示は、哺乳動物における内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療で使用する医薬の製造のための、本明細書に記載の薬剤、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞の使用に関する。
【0105】
一態様では、本開示は、本明細書に記載のペプチドを発現時にコードするポリヌクレオチドに関する。一態様では、本開示は、本明細書に記載のペプチドを発現時にコードする上記ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。一態様では、本開示は、本明細書に記載のペプチドを発現時にコードする上記ポリヌクレオチド又は上記ベクターを含む細胞に関する。
【0106】
一態様では、本開示はインスリン分泌を増加させるための方法であって、それを必要とする個体に、本明細書に記載の治療有効量のペプチド又はペプチド類似体を投与することを含む、方法に関する。一実施形態では、上記方法はインビトロ法である。一態様では、本開示はインスリン分泌を増加させるための方法であって、それを必要とする個体に、本明細書に記載の治療有効量の薬剤、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を投与することを含む、方法に関する。一実施形態では、上記方法はインビトロ法である。
【0107】
一態様では、本開示は、血糖値を減少させるための方法であって、それを必要とする個体に、本明細書に記載の治療有効量のペプチド又はペプチド類似体、薬剤、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を投与することを含む、方法に関する。一実施形態では、上記方法はインビトロ法である。一実施形態では、インスリン分泌が増加される。別の実施形態では、グルコースの細胞取り込みが増加される。さらに別の実施形態では、インスリン産生が増加される。別の実施形態では、グルカゴン産生が減少される。
【0108】
一態様では、本開示は、β細胞形態を改善するための方法、例えば、インビトロ法であって、それを必要とする個体に、本明細書に記載の治療有効量のペプチド又はペプチド類似体、薬剤、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を投与することを含む、方法に関する。
【0109】
一態様では、本開示は、β細胞生存率を向上させるための方法であって、それを必要とする個体に、本明細書に記載の治療有効量のペプチド又はペプチド類似体、薬剤、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を投与することを含む、方法に関する。
【0110】
一態様では、本開示は、糖尿病並びに糖尿病関連障害及び疾患の発症を遅延させるための方法であって、それを必要とする個体に、本明細書に記載の治療有効量のペプチド又はペプチド類似体、薬剤、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を投与することを含む、方法に関する。
【0111】
本開示の一実施形態では、薬剤は検出可能な部分をさらに含んでよい。例えば、検出可能な部分は、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、１２３Ｉ及び２０１Ｔｌからなる群から選択される放射性同位元素などの、放射性同位元素を含むか、又はそれらからなり得る。結合部分は、マルチイメージング（例えば、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学、又は超音波）できるナノ粒子に結合され得る。あるいは、検出可能な部分は、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒ及び５６Ｆｅからなる群から選択される常磁性同位体などの、常磁性同位体を含むか、又はそれからなってよい。
【0112】
薬剤が検出可能な部分を含む場合、その検出可能な部分は、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学又は超音波のイメージングなどのイメージング技術により検出され得る。
【0113】
一態様では、本開示は、個体における膵臓の疾患、障害又は損傷の診断のための診断組成物の調製のための、本明細書に記載の薬剤、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞の使用に関する。
【0114】
条項
１．ペプチド又はペプチド類似体を含む薬剤であって、一般式：
Ｘ１ＬＸ２ＹＧＩＫ（配列番号１７７）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ又はＧであり；
Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
但し、Ｘ２がＴの場合は、ペプチド又はペプチド類似体は２５個以下のアミノ酸残基を含み；かつ
Ｘ１がＥであり、Ｘ２がＳである場合は、ペプチド又はペプチド類似体は、８５個以下のアミノ酸残基を含む）
のアミノ酸配列を含む、ペプチド又はペプチド類似体を含む薬剤。
２．ペプチドを含む薬剤であって、一般式：
Ｚ１Ｚ２ＳＺ３Ｚ４ＹＧＬＲ（配列番号１７８）
（式中、
Ｚ１は、Ｄ又はＧであり；
Ｚ２は、Ｉ又はＧであり；
Ｚ３は、Ｖ又はＬであり；
Ｚ４は、Ｖ又はＡである）
のアミノ酸配列を含む、ペプチドを含む薬剤。
３．条項２に記載の薬剤であって、ペプチドを含み、上記ペプチドが、ＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号４）、ＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号８）、ＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１３）、及びＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１９）、ＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２６）、ＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号３４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、薬剤。
４．アミノ酸配列ＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号４）、ＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号８）、ＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１３）、及びＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１９）、ＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２６）、ＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号３４）を含むか、若しくはそれらからなるペプチド又はペプチド類似体を含む薬剤。
５．天然に存在しない、例えば、非タンパク質原性のアミノ酸残基を含む、条項１～４のいずれか一項に記載の薬剤。
６．部分にコンジュゲートされる、条項１～５のいずれか一項に記載の薬剤。
７．部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、単糖、フルオロフォア、クロモフォア、放射性化合物、及び細胞透過性ペプチドからなる群から選択される、条項１～６のいずれか一項に記載の薬剤。
８．グリコシル化されるか、又はペグ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化及び／又はアルキル化によりさらに修飾される、条項１～７のいずれか一項に記載の薬剤。
９．タンデムリピートを含むか、又はそれからなる、条項１～８のいずれか一項に記載の薬剤。
１０．タンデムリピートが、条項１～９に記載の配列の任意の１以上のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、条項１～９のいずれか一項に記載の薬剤。
１１．別のポリペプチドに融合される、条項１～１０のいずれかに記載の薬剤。
１２．上記ポリペプチドが、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びプロテインＡからなる群から選択される、条項１～１１のいずれか一項に記載の薬剤。
１３．タグに融合される、条項１～１２のいずれかに記載の薬剤。
１４．上記タグが、オリゴヒスチジンタグである、条項１～１３のいずれか一項に記載の薬剤。
１５．ペプチドが環状であるように、環状である、条項１～１４のいずれかに記載の薬剤。
１６．ペプチド又はペプチド類似体が、例えば、環状又は部分的に環状のペプチドを形成するために、少なくとも１つの分子内システインブリッジを形成できる、条項１～１５のいずれかに記載の薬剤。
１７．ペプチド又はペプチド類似体が、ＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７０）、ＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７１）、ＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７２）、ＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７３）、ＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７４）、ＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７５）、ＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列表番号１４８）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＴＹＧＩＫ（配列表番号１７６）、又はそのバリアント若しくは断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、条項１～１６のいずれかに記載の薬剤。
１８．ペプチド又はペプチド類似体が、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩ（配列番号１７９）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧ（配列番号１８０）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹ（配列番号１８１）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳ（配列番号１８２）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬ（配列番号１８３）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥ（配列番号１８４）、又はそのバリアント若しくは断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、条項１～１７のいずれかに記載の薬剤。
１９．ペプチド又はペプチド類似体が、アミノ酸配列ＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７０）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる、条項１～１８のいずれかに記載の薬剤。
２０．ペプチド又はペプチド類似体が、アミノ酸配列ＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７１）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる、条項１～１９のいずれかに記載の薬剤。
２１．ペプチド又はペプチド類似体が、アミノ酸配列ＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７２）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる、条項１～２０のいずれかに記載の薬剤。
２２．ペプチド又はペプチド類似体が、アミノ酸配列ＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７３）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる、条項１～２１のいずれかに記載の薬剤。
２３．ペプチド又はペプチド類似体が、アミノ酸配列ＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７４）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる、条項１～２２のいずれかに記載の薬剤。
２４．ペプチド又はペプチド類似体が、アミノ酸配列ＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７５）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる、条項１～２３のいずれかに記載の薬剤。
２５．ペプチド又はペプチド類似体が、アミノ酸配列ＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７６）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる、条項１～２４のいずれかに記載の薬剤。
２６．バリアントが、任意の１つのアミノ酸が別のタンパク質原性又は非タンパク質原性アミノ酸に改変された、但し５個以下のアミノ酸がそのように改変される、配列を含むか、又はそれからなる、条項１～２５のいずれか一項に記載の薬剤。
２７．バリアントが、５個以下のアミノ酸が別のタンパク質原性又は非タンパク質原性アミノ酸に改変され、４個以下のアミノ酸など、３個以下のアミノ酸など、２個以下のアミノ酸など、１個以下のアミノ酸などが改変される、配列を含むか、又はそれからなる、条項１～２６のいずれか一項に記載の薬剤。
２８．１以上のアミノ酸が、保存的に置換される、条項１～２７のいずれか一項に記載の薬剤。
２９．ペプチド又はペプチド類似体が、Ｎ末端及び／若しくはＣ末端で並びに／又は配列内の内部に挿入される、１以上の追加のアミノ酸を含むか、又はそれからなる、条項１～２８のいずれか一項に記載の薬剤。
３０．ペプチド又はペプチド類似体が、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかにコンジュゲートされる１個の追加のアミノ酸を含む、条項１～２９のいずれか一項に記載の薬剤。
３１．ペプチド又はペプチド類似体が、Ｎ末端に挿入される１個のプロリンを含むか、又はそれからなる、条項１～３０のいずれか一項に記載の薬剤。
３２．薬剤が、８５個以下の、８０個以下など、７５個以下など、７０個以下など、６５個以下など、６０個以下など、５５個以下など、５０個以下など、５５個以下など、４０個以下などのアミノ酸、３５個以下など、３０個以下など、２８個以下など、２６個以下など、２４個以下など、２２個以下など、２０個以下など、１９個以下など、１８個以下など、１７個以下など、１６個以下など、１５個以下など、１４個以下など、１３個以下など、１２個以下など、１１個以下など、１０個以下などのアミノ酸を含む、条項１～３１のいずれか一項に記載の薬剤。
３３．薬剤が、ペプチド若しくはペプチド類似体のＮ末端又はＣ末端にコンジュゲートされる少なくとも２個の追加のアミノ酸、少なくとも３個など、少なくとも４個など、少なくとも５個など、少なくとも６個など、少なくとも７個など、少なくとも８個など、少なくとも９個など、少なくとも１０個など、少なくとも１５個など又は少なくとも２０個などのアミノ酸を含む、条項１～３２のいずれか一項に記載の薬剤。
３４．薬剤が、検出可能な部分をさらに含む、条項１～３３のいずれかに記載の薬剤。
３５．検出可能な部分が、放射性同位元素を含むか、又はそれからなる、条項１～３４のいずれかに記載の薬剤。
３６．放射性同位元素が、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、１２３Ｉ及び２０１Ｔｌからなる群から選択される、条項の１～３５いずれかに記載の薬剤。
３７．検出可能な部分が、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学又は超音波のイメージングなどのイメージング技術により検出可能である、条項１～３６のいずれかに記載の薬剤。
３８．個体における膵臓の疾患、障害又は損傷の診断のための診断用組成物の調製のための、条項１～３７のいずれかに記載の薬剤の使用。
３９．発現時に、条項１～３８のいずれか一項に記載のペプチド又はペプチド類似体をコードするポリヌクレオチド。
４０．条項３９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
４１．条項３９に記載のポリヌクレオチド、又は条項４０に記載のベクターを含む細胞。
４２．条項１～４１のいずれかに記載の薬剤を含む組成物。
４３．医薬組成物である、条項１～４２のいずれか一項に記載の組成物。
４４．医薬として使用するための、請求項１～３７に記載の薬剤、請求項３９に記載のポリヌクレオチド、請求項４０に記載のベクター、請求項４１に記載の細胞又は請求項４２～４３に記載の組成物。
４５．哺乳動物における内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療での使用のための
ａ）（ｉ）一般式：
Ｘ１ＬＸ２ＹＧＩＫ（配列番号１７７）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ又はＧであり；
Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
但し、Ｘ２がＴの場合は、ペプチド又はペプチド類似体は２５個以下のアミノ酸残基を含む）
のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド：
（ｉｉ）一般式：
Ｚ１Ｚ２ＳＺ３Ｚ４ＹＧＬＲ（配列番号１７８）
（式中、
Ｚ１は、Ｄ又はＧであり；
Ｚ２は、Ｉ又はＧであり；
Ｚ３は、Ｖ又はＬであり；
Ｚ４は、Ｖ又はＡである）
のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド；又は
（ｉｉｉ）ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬ（配列番号３）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧ（配列番号６）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹ（配列番号１０）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶ（配列番号１５）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶ（配列番号２１）及びＶＤＴＹＤＧＤＩＳ（配列番号２８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド、からなる群から選択されるペプチド；
ｂ）発現時にａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター；又は
ｄ）ｂ）のポリヌクレオチド、又はｃ）のベクターを含む細胞
からなる群から選択される薬剤。
４６．ペプチドが、配列番号１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５及び１５６からなる群から選択される、条項１～４５のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
４７．ペプチドが、配列番号１、１３６、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１３８、１３９、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３及び１８４からなる群から選択される、条項１～４６のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
４８．上記薬剤が、第２の又はさらなる有効成分を含む、条項１～４７のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
４９．第２の又はさらなる活性成分が、インスリン、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、スルホニル尿素、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）阻害剤、α－グルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン、メグリチジン及びナトリウムグルコース共輸送体－２（ＳＧＬＴ２）阻害剤からなる群から選択される、条項４８に記載の使用のための薬剤又は組成物。
５０．哺乳動物における内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療での使用のための、条項１～４９のいずれかに記載の薬剤又は組成物。
５１．哺乳動物が、ヒトである、条項５０に記載の使用のための薬剤又は組成物。
５２．内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患が、糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、栄養障害関連糖尿病、グルコース調節及び膵臓内分泌の障害、インスリン抵抗性症候群、グルコース耐性障害、高血糖症、高インスリン血症、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、条項１～５１のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
５３．内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患が、糖尿病、甲状腺の障害、グルコース調節及び膵臓内分泌の障害、内分泌腺の障害、栄養障害、栄養不足、肥満、過栄養、及び代謝障害からなる群から選択される、条項１～５２のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
５４．糖尿病が、１型糖尿病、２型糖尿病、栄養障害関連糖尿病、特定糖尿病、及び不特定糖尿病からなる群から選択される、条項１～５３のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
５５．グルコース調節及び膵臓内分泌の障害が、非糖尿病低血糖性昏睡及び膵臓内分泌の障害からなる群から選択される、条項１～５４のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
５６．肥満及び過栄養の障害が、局所的な脂肪、過栄養、及び過栄養の後遺症からなる群から選択される、条項１～５５のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
５７．栄養不足の障害が、芳香族アミノ酸代謝の障害、分岐鎖アミノ酸代謝及び脂肪酸代謝の障害、アミノ酸代謝障害、乳糖不耐症、糖代謝障害、スフィンゴ脂質代謝障害、脂質貯蔵障害、グリコサミノグリカン代謝障害、糖タンパク質代謝障害、リポタンパク質代謝障害、脂血症、プリン及びピリミジン代謝障害、ポルフィリン及びビリルビンの代謝障害、ミネラル代謝障害、嚢胞性線維症、アミロイドーシス、体液量減少、流体、電解質及び酸塩基バランスの障害、並びに処置後の内分泌及び代謝の障害からなる群から選択される、条項１～５６のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
５８．内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、条項１～５７のいずれか一項に記載の薬剤を投与することを含む、方法。
５９．哺乳動物における内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療での使用のための医薬の製造のための、条項１～５８のいずれか一項に記載の薬剤の使用。
６０．糖尿病及び糖尿病関連の障害並びに疾患の発症を遅延させるための方法であって、それを必要とする個体に、条項１～５９のいずれか一項で定義される薬剤の治療有効量を投与することを含む、方法。
６１．血糖値を減少させるための方法であって、それを必要とする個体に、条項１～６０のいずれか一項に記載の薬剤の治療有効量を投与することを含む、方法。
６２．インスリン分泌が増加される、条項６１に記載の方法。
６３．グルコースの細胞内取り込みが増加される、条項６１に記載の方法。
６４．インスリン産生が増加される、条項６１に記載の方法。
６５．グルカゴン産生が減少される、条項６１に記載の方法。
６６．ベータ細胞の生存率を改善するための方法であって、それを必要とする個体に、条項１～６５のいずれか一項に記載の薬剤の治療有効量を投与することを含む、方法。
６７．ベータ細胞形態を改善するための方法であって、それを必要とする個体に、条項１～６６のいずれか一項に記載の薬剤の治療有効量を投与することを含む、方法。
６８．膵島の生存率及び／若しくは形態を安定化又は改善するための方法であって、それを必要とする個体に、条項１～６７のいずれか一項に記載の薬剤の治療有効量を投与することを含む、方法。
１．ペプチド又はペプチド類似体を含む薬剤であって、一般式：
Ｘ１ＬＸ２ＹＧＩＫ（配列番号１７７）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ又はＧであり；
Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
但し、Ｘ２がＴの場合は、ペプチド又はペプチド類似体は２５個以下のアミノ酸残基を含み；かつ
Ｘ１がＥであり、Ｘ２がＳである場合は、ペプチド又はペプチド類似体は、８５個以下のアミノ酸残基を含む）
のアミノ酸配列を含む、ペプチド又はペプチド類似体を含む薬剤。
２．ペプチドを含む薬剤であって、一般式：
Ｚ１Ｚ２ＳＺ３Ｚ４ＹＧＬＲ（配列番号１７８）
（式中、
Ｚ１は、Ｄ又はＧであり；
Ｚ２は、Ｉ又はＧであり；
Ｚ３は、Ｖ又はＬであり；
Ｚ４は、Ｖ又はＡである）
のアミノ酸配列を含む、ペプチドを含む薬剤。
３．条項２に記載の薬剤であって、ペプチドを含み、上記ペプチドが、ＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号４）、ＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号８）、ＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１３）、及びＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１９）、ＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２６）、ＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号３４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、薬剤。
４．アミノ酸配列ＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号４）、ＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号８）、ＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１３）、及びＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１９）、ＧＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２６）、ＤＩＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号３４）を含むか、若しくはそれらからなるペプチド又はペプチド類似体を含む薬剤。
５．天然に存在しない、例えば、非タンパク質原性のアミノ酸残基を含む、条項１～４のいずれか一項に記載の薬剤。
６．部分にコンジュゲートされる、条項１～５のいずれか一項に記載の薬剤。
７．部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、単糖、フルオロフォア、クロモフォア、放射性化合物、及び細胞透過性ペプチドからなる群から選択される、条項１～６のいずれか一項に記載の薬剤。
８．グリコシル化されるか、又はペグ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化及び／又はアルキル化によりさらに修飾される、条項１～７のいずれか一項に記載の薬剤。
９．タンデムリピートを含むか、又はそれからなる、条項１～８のいずれか一項に記載の薬剤。
１０．タンデムリピートが、条項１～９に記載の配列の任意の１以上のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、条項１～９のいずれか一項に記載の薬剤。
１１．別のポリペプチドに融合される、条項１～１０のいずれかに記載の薬剤。
１２．上記ポリペプチドが、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びプロテインＡからなる群から選択される、条項１～１１のいずれか一項に記載の薬剤。
１３．タグに融合される、条項１～１２のいずれかに記載の薬剤。
１４．上記タグが、オリゴヒスチジンタグである、条項１～１３のいずれか一項に記載の薬剤。
１５．ペプチドが環状であるように、環状である、条項１～１４のいずれかに記載の薬剤。
１６．ペプチド又はペプチド類似体が、例えば、環状又は部分的に環状のペプチドを形成するために、少なくとも１つの分子内システインブリッジを形成できる、条項１～１５のいずれかに記載の薬剤。
１７．ペプチド又はペプチド類似体が、ＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７０）、ＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７１）、ＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７２）、ＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７３）、ＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７４）、ＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７５）、ＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列表番号１４８）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＴＹＧＩＫ（配列表番号１７６）、又はそのバリアント若しくは断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、条項１～１６のいずれかに記載の薬剤。
１８．ペプチド又はペプチド類似体が、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩ（配列番号１７９）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧ（配列番号１８０）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹ（配列番号１８１）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳ（配列番号１８２）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥＬ（配列番号１８３）、ＫＰＬＡＥＩＤＳＩＥ（配列番号１８４）、又はそのバリアント若しくは断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、条項１～１７のいずれかに記載の薬剤。
１９．ペプチド又はペプチド類似体が、アミノ酸配列ＬＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７０）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる、条項１～１８のいずれかに記載の薬剤。
２０．ペプチド又はペプチド類似体が、アミノ酸配列ＡＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７１）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる、条項１～１９のいずれかに記載の薬剤。
２１．ペプチド又はペプチド類似体が、アミノ酸配列ＥＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７２）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる、条項１～２０のいずれかに記載の薬剤。
２２．ペプチド又はペプチド類似体が、アミノ酸配列ＩＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７３）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる、条項１～２１のいずれかに記載の薬剤。
２３．ペプチド又はペプチド類似体が、アミノ酸配列ＤＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７４）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる、条項１～２２のいずれかに記載の薬剤。
２４．ペプチド又はペプチド類似体が、アミノ酸配列ＳＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７５）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる、条項１～２３のいずれかに記載の薬剤。
２５．ペプチド又はペプチド類似体が、アミノ酸配列ＩＥＬＳＹＧＩＫ（配列番号１７６）、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、又はそれからなる、条項１～２４のいずれかに記載の薬剤。
２６．バリアントが、任意の１つのアミノ酸が別のタンパク質原性又は非タンパク質原性アミノ酸に改変された、但し５個以下のアミノ酸がそのように改変される、配列を含むか、又はそれからなる、条項１～２５のいずれか一項に記載の薬剤。
２７．バリアントが、５個以下のアミノ酸が別のタンパク質原性又は非タンパク質原性アミノ酸に改変され、４個以下のアミノ酸など、３個以下のアミノ酸など、２個以下のアミノ酸など、１個以下のアミノ酸などが改変される、配列を含むか、又はそれからなる、条項１～２６のいずれか一項に記載の薬剤。
２８．１以上のアミノ酸が、保存的に置換される、条項１～２７のいずれか一項に記載の薬剤。
２９．ペプチド又はペプチド類似体が、Ｎ末端及び／若しくはＣ末端で並びに／又は配列内の内部に挿入される、１以上の追加のアミノ酸を含むか、又はそれからなる、条項１～２８のいずれか一項に記載の薬剤。
３０．ペプチド又はペプチド類似体が、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかにコンジュゲートされる１個の追加のアミノ酸を含む、条項１～２９のいずれか一項に記載の薬剤。
３１．ペプチド又はペプチド類似体が、Ｎ末端に挿入される１個のプロリンを含むか、又はそれからなる、条項１～３０のいずれか一項に記載の薬剤。
３２．薬剤が、８５個以下の、８０個以下など、７５個以下など、７０個以下など、６５個以下など、６０個以下など、５５個以下など、５０個以下など、５５個以下など、４０個以下などのアミノ酸、３５個以下など、３０個以下など、２８個以下など、２６個以下など、２４個以下など、２２個以下など、２０個以下など、１９個以下など、１８個以下など、１７個以下など、１６個以下など、１５個以下など、１４個以下など、１３個以下など、１２個以下など、１１個以下など、１０個以下などのアミノ酸を含む、条項１～３１のいずれか一項に記載の薬剤。
３３．薬剤が、ペプチド若しくはペプチド類似体のＮ末端又はＣ末端にコンジュゲートされる少なくとも２個の追加のアミノ酸、少なくとも３個など、少なくとも４個など、少なくとも５個など、少なくとも６個など、少なくとも７個など、少なくとも８個など、少なくとも９個など、少なくとも１０個など、少なくとも１５個など又は少なくとも２０個などのアミノ酸を含む、条項１～３２のいずれか一項に記載の薬剤。
３４．薬剤が、検出可能な部分をさらに含む、条項１～３３のいずれかに記載の薬剤。
３５．検出可能な部分が、放射性同位元素を含むか、又はそれからなる、条項１～３４のいずれかに記載の薬剤。
３６．放射性同位元素が、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、１２３Ｉ及び２０１Ｔｌからなる群から選択される、条項の１～３５いずれかに記載の薬剤。
３７．検出可能な部分が、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学又は超音波のイメージングなどのイメージング技術により検出可能である、条項１～３６のいずれかに記載の薬剤。
３８．個体における膵臓の疾患、障害又は損傷の診断のための診断用組成物の調製のための、条項１～３７のいずれかに記載の薬剤の使用。
３９．発現時に、条項１～３８のいずれか一項に記載のペプチド又はペプチド類似体をコードするポリヌクレオチド。
４０．条項３９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
４１．条項３９に記載のポリヌクレオチド、又は条項４０に記載のベクターを含む細胞。
４２．条項１～４１のいずれかに記載の薬剤を含む組成物。
４３．医薬組成物である、条項１～４２のいずれか一項に記載の組成物。
４４．医薬として使用するための、請求項１～３７に記載の薬剤、請求項３９に記載のポリヌクレオチド、請求項４０に記載のベクター、請求項４１に記載の細胞又は請求項４２～４３に記載の組成物。
４５．哺乳動物における内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療での使用のための
ａ）（ｉ）一般式：
Ｘ１ＬＸ２ＹＧＩＫ（配列番号１７７）
（式中、
Ｘ１は、Ｅ又はＧであり；
Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
但し、Ｘ２がＴの場合は、ペプチド又はペプチド類似体は２５個以下のアミノ酸残基を含む）
のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド：
（ｉｉ）一般式：
Ｚ１Ｚ２ＳＺ３Ｚ４ＹＧＬＲ（配列番号１７８）
（式中、
Ｚ１は、Ｄ又はＧであり；
Ｚ２は、Ｉ又はＧであり；
Ｚ３は、Ｖ又はＬであり；
Ｚ４は、Ｖ又はＡである）
のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド；又は
（ｉｉｉ）ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧＬ（配列番号３）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹＧ（配列番号６）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶＹ（配列番号１０）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶＶ（配列番号１５）、ＶＤＴＹＤＧＤＩＳＶ（配列番号２１）及びＶＤＴＹＤＧＤＩＳ（配列番号２８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるペプチド、からなる群から選択されるペプチド；
ｂ）発現時にａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター；又は
ｄ）ｂ）のポリヌクレオチド、又はｃ）のベクターを含む細胞
からなる群から選択される薬剤。
４６．ペプチドが、配列番号１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５及び１５６からなる群から選択される、条項１～４５のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
４７．ペプチドが、配列番号１、１３６、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１３８、１３９、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３及び１８４からなる群から選択される、条項１～４６のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
４８．上記薬剤が、第２の又はさらなる有効成分を含む、条項１～４７のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
４９．第２の又はさらなる活性成分が、インスリン、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、スルホニル尿素、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）阻害剤、α－グルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン、メグリチジン及びナトリウムグルコース共輸送体－２（ＳＧＬＴ２）阻害剤からなる群から選択される、条項４８に記載の使用のための薬剤又は組成物。
５０．哺乳動物における内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療での使用のための、条項１～４９のいずれかに記載の薬剤又は組成物。
５１．哺乳動物が、ヒトである、条項５０に記載の使用のための薬剤又は組成物。
５２．内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患が、糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、栄養障害関連糖尿病、グルコース調節及び膵臓内分泌の障害、インスリン抵抗性症候群、グルコース耐性障害、高血糖症、高インスリン血症、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、条項１～５１のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
５３．内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患が、糖尿病、甲状腺の障害、グルコース調節及び膵臓内分泌の障害、内分泌腺の障害、栄養障害、栄養不足、肥満、過栄養、及び代謝障害からなる群から選択される、条項１～５２のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
５４．糖尿病が、１型糖尿病、２型糖尿病、栄養障害関連糖尿病、特定糖尿病、及び不特定糖尿病からなる群から選択される、条項１～５３のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
５５．グルコース調節及び膵臓内分泌の障害が、非糖尿病低血糖性昏睡及び膵臓内分泌の障害からなる群から選択される、条項１～５４のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
５６．肥満及び過栄養の障害が、局所的な脂肪、過栄養、及び過栄養の後遺症からなる群から選択される、条項１～５５のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
５７．栄養不足の障害が、芳香族アミノ酸代謝の障害、分岐鎖アミノ酸代謝及び脂肪酸代謝の障害、アミノ酸代謝障害、乳糖不耐症、糖代謝障害、スフィンゴ脂質代謝障害、脂質貯蔵障害、グリコサミノグリカン代謝障害、糖タンパク質代謝障害、リポタンパク質代謝障害、脂血症、プリン及びピリミジン代謝障害、ポルフィリン及びビリルビンの代謝障害、ミネラル代謝障害、嚢胞性線維症、アミロイドーシス、体液量減少、流体、電解質及び酸塩基バランスの障害、並びに処置後の内分泌及び代謝の障害からなる群から選択される、条項１～５６のいずれか一項に記載の使用のための薬剤又は組成物。
５８．内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、条項１～５７のいずれか一項に記載の薬剤を投与することを含む、方法。
５９．哺乳動物における内分泌疾患、栄養疾患及び／又は代謝疾患の治療での使用のための医薬の製造のための、条項１～５８のいずれか一項に記載の薬剤の使用。
６０．糖尿病及び糖尿病関連の障害並びに疾患の発症を遅延させるための方法であって、それを必要とする個体に、条項１～５９のいずれか一項で定義される薬剤の治療有効量を投与することを含む、方法。
６１．血糖値を減少させるための方法であって、それを必要とする個体に、条項１～６０のいずれか一項に記載の薬剤の治療有効量を投与することを含む、方法。
６２．インスリン分泌が増加される、条項６１に記載の方法。
６３．グルコースの細胞内取り込みが増加される、条項６１に記載の方法。
６４．インスリン産生が増加される、条項６１に記載の方法。
６５．グルカゴン産生が減少される、条項６１に記載の方法。
６６．ベータ細胞の生存率を改善するための方法であって、それを必要とする個体に、条項１～６５のいずれか一項に記載の薬剤の治療有効量を投与することを含む、方法。
６７．ベータ細胞形態を改善するための方法であって、それを必要とする個体に、条項１～６６のいずれか一項に記載の薬剤の治療有効量を投与することを含む、方法。
６８．膵島の生存率及び／若しくは形態を安定化又は改善するための方法であって、それを必要とする個体に、条項１～６７のいずれか一項に記載の薬剤の治療有効量を投与することを含む、方法。
【0115】
実施例
本開示は、以下の例によってさらに説明されるが、これは、本開示を限定されるものと解釈されるべきではない。これらの実施例は、本開示の例示的ペプチドがβ細胞増殖を刺激し、かつ糖毒性状態により誘導されるアポトーシスからβ細胞を保護及び救出する能力を有することを実証する。例示的なペプチドが、ラットβ細胞及び単離されたマウス膵島からのインスリン分泌を刺激する能力を有することも実証され、ここでペプチドはグルカゴンレベルを低下させることも実証される。さらに、実施例は、ペプチドがグルコース負荷試験で、インビボで血漿グルコースレベルを低下させ、かつＢＢ ｌｙｐ／ｌｙｐラットにおける１型糖尿病の発症を遅らせることを実証する。
本開示は、以下の例によってさらに説明されるが、これは、本開示を限定されるものと解釈されるべきではない。これらの実施例は、本開示の例示的ペプチドがβ細胞増殖を刺激し、かつ糖毒性状態により誘導されるアポトーシスからβ細胞を保護及び救出する能力を有することを実証する。例示的なペプチドが、ラットβ細胞及び単離されたマウス膵島からのインスリン分泌を刺激する能力を有することも実証され、ここでペプチドはグルカゴンレベルを低下させることも実証される。さらに、実施例は、ペプチドがグルコース負荷試験で、インビボで血漿グルコースレベルを低下させ、かつＢＢ ｌｙｐ／ｌｙｐラットにおける１型糖尿病の発症を遅らせることを実証する。
【0116】
実施例１：ペプチド設計
新規ペプチドを合理的な構造活性調査の後に設計した。ＦＯＬ－００５（配列番号１）の場合、ペプチドを、ＲＧＤ部位付近で設計したが、異なるインテグリンとおそらく相互作用できる異なる構造を作製するために変異させた。ＦＯＬ－００５と同様の配列が、テネイシンＣの第３フィブロネクチンＩＩＩ型リピートドメイン（ＴＮｆｎ３）で同定され、ＦＯＬ－００５の変異ＲＧＤ部位とかなり類似していることが判明した。ペプチドを、ＦＯＬ－０１４と命名したこの配列から設計した。テネイシン－３ ＴＮｆｎ３ドメインのＸ線結晶構造（ＰＤＢコード１ ＴＥＮ、Ｌｅａｈｙら（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８（５０８４）：９８７－９１）を分析した。ＦＯＬ－０１４（配列番号１３６）の配列は、前のベータターンと第３ベータシート全体にまたがっている。ＦＯＬ－０１４バリアントを、３次元の分子構造の構造変更及び安定化を可能にするように設計した。具体的には、ペプチドバリアントは、露出した側鎖を有するβターン領域と幾何学的形状を維持するためのいくつかの環化バリアントを包含した。
新規ペプチドを合理的な構造活性調査の後に設計した。ＦＯＬ－００５（配列番号１）の場合、ペプチドを、ＲＧＤ部位付近で設計したが、異なるインテグリンとおそらく相互作用できる異なる構造を作製するために変異させた。ＦＯＬ－００５と同様の配列が、テネイシンＣの第３フィブロネクチンＩＩＩ型リピートドメイン（ＴＮｆｎ３）で同定され、ＦＯＬ－００５の変異ＲＧＤ部位とかなり類似していることが判明した。ペプチドを、ＦＯＬ－０１４と命名したこの配列から設計した。テネイシン－３ ＴＮｆｎ３ドメインのＸ線結晶構造（ＰＤＢコード１ ＴＥＮ、Ｌｅａｈｙら（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８（５０８４）：９８７－９１）を分析した。ＦＯＬ－０１４（配列番号１３６）の配列は、前のベータターンと第３ベータシート全体にまたがっている。ＦＯＬ－０１４バリアントを、３次元の分子構造の構造変更及び安定化を可能にするように設計した。具体的には、ペプチドバリアントは、露出した側鎖を有するβターン領域と幾何学的形状を維持するためのいくつかの環化バリアントを包含した。
【0117】
全てのペプチドを、いくつかのペプチドメーカーを用いて固相ペプチド合成法により合成した。主に、ペプチドバリアントは、カリフォルニア州のＢｉｏｐｅｐｔｉｄｅ社により提供された。
【0118】
実施例２：ＦＯＬ－００５及びＦＯＬ－０１４はＩＮＳ－１細胞の増殖を誘導した
ＦＯＬ－００５及びＦＯＬ－０１４がβ細胞の増殖を誘導できるかどうかを調べるために、ＩＮＳ－１細胞を用いた。ラットＩＮＳ－１細胞を、９６ウェルプレート中の補助剤を有するＲＰＭＩ培地に播種し、２時間後、培地を補助剤なしのＲＰＭＩに変えた。増殖実験中に、細胞を異なる試験条件（コートした又は溶液中の、ＦＯＬ－００５、ＦＯＬ－０１４、４８時間のインキュベーション）でインキュベートし、培養期間の最後の２０時間に、細胞を１μＣｉ／ウェルの[メチル－３Ｈ]チミジンでパルスした。細胞をその後、ＦｉｌｔｅｒＭａｔｅハーベスタを使用してガラス繊維フィルター上に収集した。フィルターを空気乾燥し、結合した放射能を、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。ＦＯＬ－００５がβ細胞増殖に影響を与えたかどうかを調べるために、ＩＮＳ－１細胞を漸増量（０.０６～６μＭ）の可溶性ＦＯＬ－００５で４８時間処理し、増殖を、新たに合成したＤＮＡへの放射標識チミジン取り込みにより測定した。ＦＯＬ－００５は、ＩＮＳ－１細胞増殖を刺激した（図１Ａ）。ＦＯＬ－００５又はＦＯＬ－０１４のいずれかでコートし、後にＩＮＳ－１細胞の添加前に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックしたウェルも、対照（Ｃｔｒｌ）コーティングウェルと比較して増殖を刺激した（図１Ｂ～Ｃ）。
ＦＯＬ－００５及びＦＯＬ－０１４がβ細胞の増殖を誘導できるかどうかを調べるために、ＩＮＳ－１細胞を用いた。ラットＩＮＳ－１細胞を、９６ウェルプレート中の補助剤を有するＲＰＭＩ培地に播種し、２時間後、培地を補助剤なしのＲＰＭＩに変えた。増殖実験中に、細胞を異なる試験条件（コートした又は溶液中の、ＦＯＬ－００５、ＦＯＬ－０１４、４８時間のインキュベーション）でインキュベートし、培養期間の最後の２０時間に、細胞を１μＣｉ／ウェルの[メチル－３Ｈ]チミジンでパルスした。細胞をその後、ＦｉｌｔｅｒＭａｔｅハーベスタを使用してガラス繊維フィルター上に収集した。フィルターを空気乾燥し、結合した放射能を、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。ＦＯＬ－００５がβ細胞増殖に影響を与えたかどうかを調べるために、ＩＮＳ－１細胞を漸増量（０.０６～６μＭ）の可溶性ＦＯＬ－００５で４８時間処理し、増殖を、新たに合成したＤＮＡへの放射標識チミジン取り込みにより測定した。ＦＯＬ－００５は、ＩＮＳ－１細胞増殖を刺激した（図１Ａ）。ＦＯＬ－００５又はＦＯＬ－０１４のいずれかでコートし、後にＩＮＳ－１細胞の添加前に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックしたウェルも、対照（Ｃｔｒｌ）コーティングウェルと比較して増殖を刺激した（図１Ｂ～Ｃ）。
【0119】
これは、ＦＯＬ－００５及びＦＯＬ－０１４がβ細胞と相互作用し増殖を誘導したことを実証した。
【0120】
実施例３：ＦＯＬ－００５は糖毒性からΒ細胞を保護した
膵臓β細胞の糖毒性は２型糖尿病において十分に確立された過程であるため、次に、糖毒性状態の間のβ細胞に対するＦＯＬ－００５の保護効果を調べた。まず、２０ｍＭのグルコースが、４８時間の曝露後にＩＮＳ細胞中で細胞アポトーシスを誘導することを確認した。高グルコース（２０ｍＭ）を含むＲＰＭＩ培地は、５ｍＭグルコースを含む培地でインキュベートした細胞と比較して、ＩＮＳ細胞においてより多くのアネキシンＶ陽性細胞及びより高いカスパーゼ－３活性を誘導した（図２Ａ～Ｂ）。ＦＯＬ－００５と同時での２０ｍＭグルコースへのＩＮＳ－１細胞の曝露は、アネキシンＶ染色とカスパーゼ－３活性の両方により検出されるように、細胞アポトーシスを減少させた（図２Ａ～Ｂ）。ＩＮＳ－１細胞におけるアポトーシスの割合を、カスパーゼ－３アッセイキットで測定するか、又はアネキシンＶアポトーシス検出キットを用いて７－ＡＡＤで染色するかのいずれかで測定した。カスパーゼ－３活性を、励起波長３８０ｎｍ、発光波長４４０ｎｍでの蛍光で測定した。カスパーゼ－３活性を次いで、各ウェル中のタンパク質濃度に正規化した。アネキシンＶ染色細胞の測定を、ＣｙＡｎ ＡＤＰフローサイトメーターを用いて行い、Ｓｕｍｍｉｔ Ｖ４.３ソフトウェアで解析した。
膵臓β細胞の糖毒性は２型糖尿病において十分に確立された過程であるため、次に、糖毒性状態の間のβ細胞に対するＦＯＬ－００５の保護効果を調べた。まず、２０ｍＭのグルコースが、４８時間の曝露後にＩＮＳ細胞中で細胞アポトーシスを誘導することを確認した。高グルコース（２０ｍＭ）を含むＲＰＭＩ培地は、５ｍＭグルコースを含む培地でインキュベートした細胞と比較して、ＩＮＳ細胞においてより多くのアネキシンＶ陽性細胞及びより高いカスパーゼ－３活性を誘導した（図２Ａ～Ｂ）。ＦＯＬ－００５と同時での２０ｍＭグルコースへのＩＮＳ－１細胞の曝露は、アネキシンＶ染色とカスパーゼ－３活性の両方により検出されるように、細胞アポトーシスを減少させた（図２Ａ～Ｂ）。ＩＮＳ－１細胞におけるアポトーシスの割合を、カスパーゼ－３アッセイキットで測定するか、又はアネキシンＶアポトーシス検出キットを用いて７－ＡＡＤで染色するかのいずれかで測定した。カスパーゼ－３活性を、励起波長３８０ｎｍ、発光波長４４０ｎｍでの蛍光で測定した。カスパーゼ－３活性を次いで、各ウェル中のタンパク質濃度に正規化した。アネキシンＶ染色細胞の測定を、ＣｙＡｎ ＡＤＰフローサイトメーターを用いて行い、Ｓｕｍｍｉｔ Ｖ４.３ソフトウェアで解析した。
【0121】
結論として、糖毒性がβ細胞アポトーシスを誘導することはよく知られているが、ＦＯＬ－００５の存在下で糖毒性誘導アポトーシスが減少した。
【0122】
実施例４：ＦＯＬ－００５はＩＮＳ－１細胞からのインスリン分泌を誘導した
ＦＯＬ－００５のインスリン分泌に対する刺激効果を調べるために、ＩＮＳ－１ β細胞を以下の実験で用いた。細胞をｃＲＰＭＩに一晩播種し、次いで、ＰＢＳで洗浄し、その後ｐＨ７.４の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０.１％の牛血清アルブミンを補充したクレブスリンガー重炭酸緩衝液（ＫＲＢ）において３７℃で６０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後に、緩衝液を交換し、ＩＮＳ－１細胞を異なる試験条件（０ｍＭ、５ｍＭ又は２０ｍＭのグルコース）でインキュベートし、３７℃で６０分間ペプチドＦＯＬ－００５又はＦＯＬ－０１５（配列番号１５８）で刺激するか又は未処理の状態でおいた。インキュベーション直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、インスリン放射免疫アッセイキットを用いるその後のインスリンアッセイのために凍結した。
ＦＯＬ－００５のインスリン分泌に対する刺激効果を調べるために、ＩＮＳ－１ β細胞を以下の実験で用いた。細胞をｃＲＰＭＩに一晩播種し、次いで、ＰＢＳで洗浄し、その後ｐＨ７.４の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０.１％の牛血清アルブミンを補充したクレブスリンガー重炭酸緩衝液（ＫＲＢ）において３７℃で６０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後に、緩衝液を交換し、ＩＮＳ－１細胞を異なる試験条件（０ｍＭ、５ｍＭ又は２０ｍＭのグルコース）でインキュベートし、３７℃で６０分間ペプチドＦＯＬ－００５又はＦＯＬ－０１５（配列番号１５８）で刺激するか又は未処理の状態でおいた。インキュベーション直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、インスリン放射免疫アッセイキットを用いるその後のインスリンアッセイのために凍結した。
【0123】
結果は、ＦＯＬ－００５ペプチドで刺激したβ細胞が、グルコースのない条件下で、無刺激対照細胞又はＦＯＬ－０１５対照ペプチドで刺激した細胞に比べて、より多くのインスリンを分泌したことを実証した（図３Ａ）。グルコース（５ｍＭ又は２０ｍＭ）に供したＩＮＳ－１β細胞は、ＦＯＬ－００５ペプチド（６μＭ）刺激後にインスリン分泌に応答した（図３Ｂ）。２０ｍＭグルコースの存在下にて６μＭのＦＯＬ－００５ペプチドで刺激したＩＮＳ－１細胞は、５ｍＭグルコースとインキュベートしたＦＯＬ－００５刺激細胞と比較して、より多くのインスリン分泌に応答した（図３Ｂ）。
【0124】
実施例５：ＦＯＬ－００５はマウス膵島からのインスリン分泌を誘導した
マウス膵島を、８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）から単離した。マウスを、イソフルランの過剰投与と頸部脱臼により屠殺した。０.９Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＰ３ｍｌを膵管に注入して、膵臓を膨らませた。次いで、膵臓を取り出し、コラーゲンを３７℃で１９分間消化した。試料を激しく振って組織を破壊した。消化物を、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を有する氷冷ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に移した。懸濁液を１０分間静止させて、小島を沈ませ、小島を新鮮なＨＢＳＳで４回洗浄した。次いで、小島を手で摘み、大きさに応じて選別した。小島（９６ウェルプレートの１ウェルあたりｎ＝３）を、ｐＨ７.４の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０.１％の牛血清アルブミンを補充したＫＲＢ緩衝液中で、３７℃で１０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後に、緩衝液を交換し、小島を、０.１％牛血清アルブミンを有する新しいＫＲＢ緩衝液中で異なる試験条件（未処理のＣｔｒｌ、ＦＯＬ－００５ペプチド、又はＧＬＰ－１）で、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、その後のインスリンアッセイのために凍結した。
マウス膵島を、８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）から単離した。マウスを、イソフルランの過剰投与と頸部脱臼により屠殺した。０.９Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＰ３ｍｌを膵管に注入して、膵臓を膨らませた。次いで、膵臓を取り出し、コラーゲンを３７℃で１９分間消化した。試料を激しく振って組織を破壊した。消化物を、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を有する氷冷ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に移した。懸濁液を１０分間静止させて、小島を沈ませ、小島を新鮮なＨＢＳＳで４回洗浄した。次いで、小島を手で摘み、大きさに応じて選別した。小島（９６ウェルプレートの１ウェルあたりｎ＝３）を、ｐＨ７.４の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０.１％の牛血清アルブミンを補充したＫＲＢ緩衝液中で、３７℃で１０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後に、緩衝液を交換し、小島を、０.１％牛血清アルブミンを有する新しいＫＲＢ緩衝液中で異なる試験条件（未処理のＣｔｒｌ、ＦＯＬ－００５ペプチド、又はＧＬＰ－１）で、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、その後のインスリンアッセイのために凍結した。
【0125】
結果は、ＧＬＰ－１（１００ｎＭ）又はＦＯＬ－００５（６μＭ）で刺激した単離マウス膵島が、非刺激対照小島と比較してより多くのインスリンを分泌したことを実証した（図３Ｃ）。
【0126】
実施例６：ＦＯＬ－０１４はＩＮＳ－１細胞からのインスリン分泌を誘導した
ＩＮＳ－１ β細胞を用いて、ＦＯＬ－０１４のインスリン分泌に対する刺激効果を調べた。細胞を一晩播種し、次いで、ＰＢＳで洗浄し、その後ｐＨ７.４の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０.１％牛血清アルブミンを補充したクレブスリンガー重炭酸緩衝液（ＫＲＢ）で、３７℃で６０分間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後に、緩衝液を交換し、ＩＮＳ－１細胞を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０.１％牛血清アルブミンを補充した新しいＫＲＢ緩衝液中でインキュベートし、３７℃で６０分間ペプチドＦＯＬ－０１４で刺激するか又は未処理の状態でおいた。インキュベーション直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、その後のインスリンアッセイのために凍結した。
ＩＮＳ－１ β細胞を用いて、ＦＯＬ－０１４のインスリン分泌に対する刺激効果を調べた。細胞を一晩播種し、次いで、ＰＢＳで洗浄し、その後ｐＨ７.４の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０.１％牛血清アルブミンを補充したクレブスリンガー重炭酸緩衝液（ＫＲＢ）で、３７℃で６０分間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後に、緩衝液を交換し、ＩＮＳ－１細胞を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０.１％牛血清アルブミンを補充した新しいＫＲＢ緩衝液中でインキュベートし、３７℃で６０分間ペプチドＦＯＬ－０１４で刺激するか又は未処理の状態でおいた。インキュベーション直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、その後のインスリンアッセイのために凍結した。
【0127】
結果は、ＦＯＬ－０１４ペプチドで刺激したβ細胞が、非刺激対照細胞と比較してより多くのインスリンを分泌したことを実証した（図４Ａ）。
【0128】
実施例７：ＦＯＬ－０１４はマウス膵島からのインスリン分泌を誘導した
マウス膵島を、実施例５に記載されるように、８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスから単離した。次いで、小島を手で摘み、大きさに応じて選別した。小島（９６ウェルプレートの１ウェルあたりｎ＝５）を、ｐＨ７.４の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０.１％牛血清アルブミンを補充した２００μｌのＫＲＢ緩衝液中で１０分間、３７℃でプレインキュベートした。プレインキュベーション後に、緩衝液を交換し、０.１％牛血清アルブミンを有する新しいＫＲＢ緩衝液中で、小島を異なる試験条件（未処理のＣｔｒｌ、ＦＯＬ－０１４ペプチド、及びＧＬＰ－１）で、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、その後のインスリンアッセイのために凍結した。
マウス膵島を、実施例５に記載されるように、８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスから単離した。次いで、小島を手で摘み、大きさに応じて選別した。小島（９６ウェルプレートの１ウェルあたりｎ＝５）を、ｐＨ７.４の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０.１％牛血清アルブミンを補充した２００μｌのＫＲＢ緩衝液中で１０分間、３７℃でプレインキュベートした。プレインキュベーション後に、緩衝液を交換し、０.１％牛血清アルブミンを有する新しいＫＲＢ緩衝液中で、小島を異なる試験条件（未処理のＣｔｒｌ、ＦＯＬ－０１４ペプチド、及びＧＬＰ－１）で、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、その後のインスリンアッセイのために凍結した。
【0129】
結果は、ＦＯＬ－０１４（６μＭ）で刺激したマウス膵島が、非刺激対照小島と比較してより多くのインスリンを分泌したことを示す（図４Ｂ）。ＧＬＰ－１（１００ｎＭ）又はＦＯＬ－０１４（０.６μＭ）は、インスリン分泌に影響を与えなかった（図４Ｂ）。
【0130】
実施例８～１１；２０～２１：ＦＯＬ－０１４、ＦＯＬ－００５及び関連ペプチドによるＩＮＳ－１細胞株からのインスリン分泌の刺激
材料及び方法：ラットＩＮＳ－１ β細胞（継代６０～７０）を、特に明記しない限り、ｃＲＰＭＩ培地（１０％ウシ胎児血清、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリン、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び５０μＭのβ－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０）中で、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。ＩＮＳ－１細胞を９６ウェルプレート中のｃＲＰＭＩ培地に播種（２×１０３細胞／ウェル）し、一晩インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後ｐＨ７.４の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０.１％牛血清アルブミン及び２.８ｍＭのグルコースを補充したクレブスリンガー重炭酸緩衝液中で、３７℃で１２０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、緩衝液を上記の新鮮なクレブスリンガー緩衝液と交換し、後述する個々の実験のために特定の濃度のグルコース及びペプチドを補充した。３７℃で６０分間のインキュベーションの直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、その後のインスリンＥＬＩＺＡアッセイのために凍結した。
材料及び方法：ラットＩＮＳ－１ β細胞（継代６０～７０）を、特に明記しない限り、ｃＲＰＭＩ培地（１０％ウシ胎児血清、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリン、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び５０μＭのβ－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０）中で、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。ＩＮＳ－１細胞を９６ウェルプレート中のｃＲＰＭＩ培地に播種（２×１０３細胞／ウェル）し、一晩インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後ｐＨ７.４の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０.１％牛血清アルブミン及び２.８ｍＭのグルコースを補充したクレブスリンガー重炭酸緩衝液中で、３７℃で１２０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、緩衝液を上記の新鮮なクレブスリンガー緩衝液と交換し、後述する個々の実験のために特定の濃度のグルコース及びペプチドを補充した。３７℃で６０分間のインキュベーションの直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、その後のインスリンＥＬＩＺＡアッセイのために凍結した。
【0131】
実施例８．ＦＯＬ－０１４に誘導されるインスリン分泌は非線形的に用量に依存する
ＩＮＳ－１細胞からのインスリン放出を、漸増濃度のＦＯＬ－０１４への曝露後に測定し、高グルコース濃度（１６．７ｍＭ）中のＧＬＰ－１の刺激効果及び未処理対照と比較した。試験したＦＯＬ－０１４の全ての濃度は、未処理対照と比較して有意により高いインスリン放出を誘発した。６ｎＭ以上で、ＦＯＬ－０１４は、１００ｎＭのＧＬＰ－１と同じ範囲内でインスリン放出を引き起こした。０．６～６０ｎＭの範囲の濃度で、インスリン分泌は、ＦＯＬ－０１４濃度の増加に関連して直線的に増加した。６００ｎＭ以上のＦＯＬ－０１４濃度への曝露は、インスリン分泌を増加させなかった（図５）。
ＩＮＳ－１細胞からのインスリン放出を、漸増濃度のＦＯＬ－０１４への曝露後に測定し、高グルコース濃度（１６．７ｍＭ）中のＧＬＰ－１の刺激効果及び未処理対照と比較した。試験したＦＯＬ－０１４の全ての濃度は、未処理対照と比較して有意により高いインスリン放出を誘発した。６ｎＭ以上で、ＦＯＬ－０１４は、１００ｎＭのＧＬＰ－１と同じ範囲内でインスリン放出を引き起こした。０．６～６０ｎＭの範囲の濃度で、インスリン分泌は、ＦＯＬ－０１４濃度の増加に関連して直線的に増加した。６００ｎＭ以上のＦＯＬ－０１４濃度への曝露は、インスリン分泌を増加させなかった（図５）。
【0132】
結果は、ＦＯＬ－０１４が非線形用量依存的にインビトロでＩＮＳ－１ β細胞からのインスリン分泌を有意に増加させたことを実証した。
【0133】
実施例９．インスリン分泌を誘導するＦＯＬ－０１４の能力はグルコース依存的である
ＩＮＳ－１細胞からのインスリン放出を、上昇するグルコース濃度で、６０ｎＭのＦＯＬ－０１４への曝露後に測定した。未処理の対照試料において、上昇したグルコース濃度は、１１．１ｍＭ以上のグルコースでインスリン分泌を増加させた。ＦＯＬ－０１４の存在下で、インスリン分泌は、５．５ｍＭのグルコースから既にグルコース依存的に有意に増加した（図６）。
ＩＮＳ－１細胞からのインスリン放出を、上昇するグルコース濃度で、６０ｎＭのＦＯＬ－０１４への曝露後に測定した。未処理の対照試料において、上昇したグルコース濃度は、１１．１ｍＭ以上のグルコースでインスリン分泌を増加させた。ＦＯＬ－０１４の存在下で、インスリン分泌は、５．５ｍＭのグルコースから既にグルコース依存的に有意に増加した（図６）。
【0134】
結果は、ＦＯＬ－０１４の存在が、グルコース濃度依存的にインビトロでＩＮＳ－１ β細胞からのインスリン分泌を有意に増加させたこと、及びＦＯＬ－０１４は、わずかに上昇したグルコースレベルでも有効であったことを実証した。
【0135】
実施例１０．ＧＬＰ－１と組み合わせたＦＯＬ－０１４又はＦＯＬ－００５は、いずれかのペプチド単独と比較してインスリン分泌を増加させた
ＩＮＳ－１細胞からのインスリン分泌を、ＦＯＬ－００５、ＦＯＬ－０１４、ＧＬＰ－１又はそれらの組み合わせへの曝露後に測定し、未処理の対照の割合として表した。ＧＬＰ－１とＦＯＬ－０１４の併用効果は、ＧＬＰ－１又はＦＯＬ－０１４単独よりも有意により高いインスリン放出をもたらした。ＦＯＬ－００５とＧＬＰ－１の組み合わせによる相加効果はあまり顕著でなかったが、ＧＬＰ－１単独と比較してインスリン分泌を増加させた。実験を、１６．７ｍＭグルコースの存在下で行った（図７）。
ＩＮＳ－１細胞からのインスリン分泌を、ＦＯＬ－００５、ＦＯＬ－０１４、ＧＬＰ－１又はそれらの組み合わせへの曝露後に測定し、未処理の対照の割合として表した。ＧＬＰ－１とＦＯＬ－０１４の併用効果は、ＧＬＰ－１又はＦＯＬ－０１４単独よりも有意により高いインスリン放出をもたらした。ＦＯＬ－００５とＧＬＰ－１の組み合わせによる相加効果はあまり顕著でなかったが、ＧＬＰ－１単独と比較してインスリン分泌を増加させた。実験を、１６．７ｍＭグルコースの存在下で行った（図７）。
【0136】
結果は、ＧＬＰ－１とＦＯＬ－０１４の組み合わせが、各ペプチド単独と比較して、インビトロでＩＮＳ－１細胞からのインスリン分泌をさらに増強できたことを実証した。さらに、ＦＯＬ－００５とＧＬＰ－１の組み合わせは、インスリン分泌を接線方向に増加させた。
【0137】
実施例１１．膵臓β細胞株においてインスリン分泌を誘導する新規ペプチド類似体の能力を調べた
ＦＯＬ－００５又はＦＯＬ－０１４のいずれかに由来する新規ペプチド類似体を、１６．７ｍＭグルコースの存在下で、２つの別々のＩＮＳ－１細胞株中でインスリン分泌を誘導するそれらの能力に関して試験した。ＦＯＬ－００５、ＦＯＬ－０１４及びＧＬＰ－１並びに高グルコース（１６．７ｍＭ）及び低グルコース（２．８ｍＭ）対照（図示せず）を各実験に含め、ペプチド濃度は１００ｎＭであった。実験間の変動を補正するために、全ての値を正規化し、個々の実験における高グルコース対照の平均値の割合として表した。類似体をその後、性能に応じてランク付けした（図１１Ａ及び１１Ｂ）。高グルコース対照の平均値を下回るインスリン応答を誘発するペプチド類似体を、非機能的であると考え、それゆえ除外した（図示せず）。
ＦＯＬ－００５又はＦＯＬ－０１４のいずれかに由来する新規ペプチド類似体を、１６．７ｍＭグルコースの存在下で、２つの別々のＩＮＳ－１細胞株中でインスリン分泌を誘導するそれらの能力に関して試験した。ＦＯＬ－００５、ＦＯＬ－０１４及びＧＬＰ－１並びに高グルコース（１６．７ｍＭ）及び低グルコース（２．８ｍＭ）対照（図示せず）を各実験に含め、ペプチド濃度は１００ｎＭであった。実験間の変動を補正するために、全ての値を正規化し、個々の実験における高グルコース対照の平均値の割合として表した。類似体をその後、性能に応じてランク付けした（図１１Ａ及び１１Ｂ）。高グルコース対照の平均値を下回るインスリン応答を誘発するペプチド類似体を、非機能的であると考え、それゆえ除外した（図示せず）。
【0138】
結果は、インビトロでＩＮＳ－１ β細胞からのインスリン分泌を増強するいくつかの新規ペプチド類似体の能力を実証した。
【0139】
実施例１２．ＦＯＬ－０１４はマウス由来膵島からのインスリン分泌を増加させる
１２週齢の雄のＣ５７／ｂｌ６マウスを、イソフルランと頸部脱臼で安楽死させた。肝管をクランプした後、０．９Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＰ３ｍｌを胆管に注入して、膵臓を膨らませた。次いで、膵臓を取り出し、３７℃で１９分間消化した。試料を激しく振って組織を破壊した。消化物をすぐに、Ｃａ２＋及びＭｇ２+を有する氷冷ハンクス平衡塩類溶液に移した。懸濁液を８分間静止させて、小島を沈ませ、小島を同じ様式で４回洗浄した。次いで、小島を手で摘み、大きさに応じて選別した。
１２週齢の雄のＣ５７／ｂｌ６マウスを、イソフルランと頸部脱臼で安楽死させた。肝管をクランプした後、０．９Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＰ３ｍｌを胆管に注入して、膵臓を膨らませた。次いで、膵臓を取り出し、３７℃で１９分間消化した。試料を激しく振って組織を破壊した。消化物をすぐに、Ｃａ２＋及びＭｇ２+を有する氷冷ハンクス平衡塩類溶液に移した。懸濁液を８分間静止させて、小島を沈ませ、小島を同じ様式で４回洗浄した。次いで、小島を手で摘み、大きさに応じて選別した。
【0140】
新たに分離した小島を９６ウェルプレートに５個のグループで播種し、クレブスリンガー重炭酸緩衝液（ｐＨ７.４）中で、３７℃で１時間プレインキュベートした。この小島を、０．６又は６μＭのＦＯＬ－０１４又は１００ｎＭのＧＬＰ－１を補充したクレブスリンガー緩衝液中で、３７℃で１時間インキュベートするか、又は対照のために補充しないでそのままにした。インキュベーションの直後に、培地を、ＭｅｒｃｏｄｉａＥＬＩＳＡキットを用いるインスリン及びグルカゴンのアッセイのために除去した。単離したマウス小島からのインスリン（図８Ａ及びＢ）及びグルカゴン（図８Ｃ及びＤ）分泌に対するＦＯＬ－０１４の効果を、低グルコース（２．８ｍＭ；図８Ａ及びＣ）又は高グルコース（１６．７ｍＭ；図８Ｂ及びＤ）濃度の存在下で測定した。ＦＯＬ－０１４の有意な効果が、インスリンに対し高グルコースの存在下で、かつグルカゴンに対し高グルコースと低グルコースの両方の存在下で観察された。ＦＯＬ－０１４の効果は、ＧＬＰ－１の効果とは異なり、ＧＬＰ－１は低グルコース試料においてもインスリン分泌を増強したが低グルコース条件でグルカゴン分泌を阻害できなかった。
【0141】
結果は、ＦＯＬ－０１４が膵島においてインスリン分泌を増強しグルカゴン分泌を阻害したことを実証した。
【0142】
実施例１３．ＦＯＬ－０１４はマウスの腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）において血漿グルコースレベルを低下させた
１０週齢の野生型雄Ｃ５７ｂｌ／６マウスからの全血を、グルコース及びインスリン測定のために収集した。４時間の絶食の後に、マウスを３つのグループに分け、生理食塩水、３０ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチド（図９Ａ）又は２００ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチド（図９Ｂ）のいずれかを腹腔内（ｉｐ）注射した。ＦＯＬ－０１４又は生理食塩水（対照）の注入の１５分後、マウスにグルコース／ｋｇの２ｇをｉｐ投与した。血糖値を、グルコース注入後５、１５、３０、４５及び６０分の時点で測定した。統計計算を、スチューデントｔ検定を用いて行った。２００ｎｍｏｌ／ｋｇで投与したＦＯＬ－０１４は、曲線下面積として測定した場合、対照と比較して、血漿グルコースレベルを顕著に低下させた。加えて、差は１５分、３０分及び４５分の時点で顕著であった。３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、ＦＯＬ－０１４は、グルコース注入後４５分の時点で顕著な効果を有して血漿グルコースレベルを低下させた。
１０週齢の野生型雄Ｃ５７ｂｌ／６マウスからの全血を、グルコース及びインスリン測定のために収集した。４時間の絶食の後に、マウスを３つのグループに分け、生理食塩水、３０ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチド（図９Ａ）又は２００ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチド（図９Ｂ）のいずれかを腹腔内（ｉｐ）注射した。ＦＯＬ－０１４又は生理食塩水（対照）の注入の１５分後、マウスにグルコース／ｋｇの２ｇをｉｐ投与した。血糖値を、グルコース注入後５、１５、３０、４５及び６０分の時点で測定した。統計計算を、スチューデントｔ検定を用いて行った。２００ｎｍｏｌ／ｋｇで投与したＦＯＬ－０１４は、曲線下面積として測定した場合、対照と比較して、血漿グルコースレベルを顕著に低下させた。加えて、差は１５分、３０分及び４５分の時点で顕著であった。３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、ＦＯＬ－０１４は、グルコース注入後４５分の時点で顕著な効果を有して血漿グルコースレベルを低下させた。
【0143】
結果は、ＦＯＬ－０１４が、健康な野生型マウスで行ったグルコース負荷試験において血漿グルコースレベルを低下できたことを実証した。
【0144】
実施例１４．ＦＯＬ－０１４はＢＢ ｌｙｐ／ｌｙｐラットにおいて１型糖尿病の発症を遅らせた
ＢＢ ｌｙｐ／ｌｙｐラットを、４０日目から、血漿グルコースレベルが１１．１ｍＭ以上と定義される１型糖尿病の発症までの週３回のプラセボ（塩化ナトリウム、９ｍｇ／ｍｌ）又はＦＯＬ－０１４処置のために無作為化した。生理食塩水中１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量のＦＯＬ－０１４ペプチド又はプラセボ（生理食塩水）を皮下投与し、動物を、臨界血漿グルコースレベルを超えた直後に屠殺した。ＦＯＬ－０１４処置動物とプラセボ処置を施した動物の差は、１型糖尿病の発症の平均の齢として表した場合（図１０Ａ）と、１日あたり１型糖尿病を発症する動物の割合として説明した場合（図１０Ｂ）の両方で顕著であった。
ＢＢ ｌｙｐ／ｌｙｐラットを、４０日目から、血漿グルコースレベルが１１．１ｍＭ以上と定義される１型糖尿病の発症までの週３回のプラセボ（塩化ナトリウム、９ｍｇ／ｍｌ）又はＦＯＬ－０１４処置のために無作為化した。生理食塩水中１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量のＦＯＬ－０１４ペプチド又はプラセボ（生理食塩水）を皮下投与し、動物を、臨界血漿グルコースレベルを超えた直後に屠殺した。ＦＯＬ－０１４処置動物とプラセボ処置を施した動物の差は、１型糖尿病の発症の平均の齢として表した場合（図１０Ａ）と、１日あたり１型糖尿病を発症する動物の割合として説明した場合（図１０Ｂ）の両方で顕著であった。
【0145】
結果は、ＦＯＬ－０１４処置が、ＢＢ ｌｙｐ／ｌｙｐラットにおける１型糖尿病の発症を顕著に遅らせたことを実証した。
【0146】
実施例１５．ＦＯＬ－００５及びＦＯＬ－０１４はマウスにおいて臓器特異的分布パターンを示した
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにＨ３標識ＦＯＬ－００５を皮下注射し、注射の１時間後（図１２Ａ）又は２時間後（図１２Ｂ）に安楽死させた。全身断面化後、標識ペプチドの分布を可視化した。強い結合が膵臓及び注射部位で明らかであった。Ｐｅａｒｌ Ｔｒｉｌｏｇｙ小動物イメージングシステムを用いて、皮下注射を介したＮＭＲＩヌードマウスにおける２種類のＣｙ７．５標識ペプチドのＦＯＬ－００５（図１２Ｃ）及びＦＯＬ－０１４（図１２Ｄ）の生体分布及び組織局在化を、インビボで調査した。ペプチドの高い蓄積が膵臓組織領域で明らかであった。同じ分布パターンが、ｉ．v．投与後に見出された（図示せず）。各ペプチドの用量は、１匹のマウスあたり１０ｎｍｏｌであった。マウスを、注射前、標識ペプチドの投与後５分、２０分、５０分、６０分、２時間、４時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点でイメージングした。
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにＨ３標識ＦＯＬ－００５を皮下注射し、注射の１時間後（図１２Ａ）又は２時間後（図１２Ｂ）に安楽死させた。全身断面化後、標識ペプチドの分布を可視化した。強い結合が膵臓及び注射部位で明らかであった。Ｐｅａｒｌ Ｔｒｉｌｏｇｙ小動物イメージングシステムを用いて、皮下注射を介したＮＭＲＩヌードマウスにおける２種類のＣｙ７．５標識ペプチドのＦＯＬ－００５（図１２Ｃ）及びＦＯＬ－０１４（図１２Ｄ）の生体分布及び組織局在化を、インビボで調査した。ペプチドの高い蓄積が膵臓組織領域で明らかであった。同じ分布パターンが、ｉ．v．投与後に見出された（図示せず）。各ペプチドの用量は、１匹のマウスあたり１０ｎｍｏｌであった。マウスを、注射前、標識ペプチドの投与後５分、２０分、５０分、６０分、２時間、４時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点でイメージングした。
【0147】
実施例１６．診断用途のための組織特異的イメージング
本明細書の上で定義したように調製した薬剤を、当業者に公知の方法を用いて、適切なイメージングプローブ又は部分へのコンジュゲーションにより標識した。コンジュゲートしたペプチド－プローブ剤をその後、対象に投与し、生体分布をその後、例えば、投与後４８時間まで監視した。そのため、コンジュゲート薬剤を、膵臓の状態を調査するための診断の又は予後のツールとして使用する。そのようなものとして、コンジュゲート薬剤は、疾患、疾患の過程及び進行、感受性の検出、診断、又は監視、並びに治療の有効性を決定するのに適している。薬剤は特に、対象の糖尿病状態を監視するのに適している。コンジュゲート薬剤は、疾患、特に糖尿病を発症するリスクの監視及び／又は予測にも使用される。この試験は、単独で又は血液検査、遺伝子検査、尿検査、及び生検などの当業者に公知の他の試験と組み合わせて使用される。
本明細書の上で定義したように調製した薬剤を、当業者に公知の方法を用いて、適切なイメージングプローブ又は部分へのコンジュゲーションにより標識した。コンジュゲートしたペプチド－プローブ剤をその後、対象に投与し、生体分布をその後、例えば、投与後４８時間まで監視した。そのため、コンジュゲート薬剤を、膵臓の状態を調査するための診断の又は予後のツールとして使用する。そのようなものとして、コンジュゲート薬剤は、疾患、疾患の過程及び進行、感受性の検出、診断、又は監視、並びに治療の有効性を決定するのに適している。薬剤は特に、対象の糖尿病状態を監視するのに適している。コンジュゲート薬剤は、疾患、特に糖尿病を発症するリスクの監視及び／又は予測にも使用される。この試験は、単独で又は血液検査、遺伝子検査、尿検査、及び生検などの当業者に公知の他の試験と組み合わせて使用される。
【0148】
実施例１７：配列の概要
【表1】
【0149】
本発明は、以下の２つの実施例でさらに例示されるが、これは本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。これらの実施例は、本発明の例示的ペプチドが、ラットβ細胞からのインスリン分泌を刺激する能力を有し、かつインスリンを分泌するそれらの能力を保持することにより、糖毒性状態の影響からβ細胞を保護する能力を有することを実証する。
【0150】
実施例１８：ＦＯＬ－０５６はＩＮＳ－１Ｅ細胞からのインスリン分泌を誘導する
インスリン分泌に対するＦＯＬ－０５６の刺激効果を調べるために、ＩＮＳ－１Ｅ細胞を用いた。細胞を一晩播種し、ＰＢＳで洗浄し、その後ｐＨ７.４の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％牛血清アルブミンを補充したクレブスリンガー重炭酸緩衝液（ＫＲＢ）中で、３７℃で６０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、緩衝液を廃棄し、ＩＮＳ－１Ｅ細胞を、ペプチドＦＯＬ－０５６の有り無しで、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％牛血清アルブミンを補充した新鮮なＫＲＢ緩衝液中でインキュベートした。比較目的のために、ＦＯＬ－０１４で処理した細胞を含めた。３７℃で、６０分インキュベーションした後、緩衝液を除去し、その後のインスリンアッセイのために凍結した。結果は、ペプチドＦＯＬ－０５６で刺激したβ細胞が、非刺激対照細胞と比較して顕著により多くのインスリンを分泌することを実証する（図１３）。
インスリン分泌に対するＦＯＬ－０５６の刺激効果を調べるために、ＩＮＳ－１Ｅ細胞を用いた。細胞を一晩播種し、ＰＢＳで洗浄し、その後ｐＨ７.４の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％牛血清アルブミンを補充したクレブスリンガー重炭酸緩衝液（ＫＲＢ）中で、３７℃で６０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、緩衝液を廃棄し、ＩＮＳ－１Ｅ細胞を、ペプチドＦＯＬ－０５６の有り無しで、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％牛血清アルブミンを補充した新鮮なＫＲＢ緩衝液中でインキュベートした。比較目的のために、ＦＯＬ－０１４で処理した細胞を含めた。３７℃で、６０分インキュベーションした後、緩衝液を除去し、その後のインスリンアッセイのために凍結した。結果は、ペプチドＦＯＬ－０５６で刺激したβ細胞が、非刺激対照細胞と比較して顕著により多くのインスリンを分泌することを実証する（図１３）。
【0151】
実施例１９：ＦＯＬ－０５６は、長期の糖毒性状態の間ＩＮＳ－１Ｅ細胞のインスリン分泌能力を保持する
ＦＯＬ－０５６のβ細胞保護効果を調べるために、ＩＮＳ－１Ｅを７２時間、細胞毒性レベルのグルコースに供した。ラットＩＮＳ－１Ｅ細胞を、９６ウェルプレート中のｃＲＰＭＩ培地に播種した（２×１０３細胞／ウェル）。７２時間のインキュベーション後、培地を、ＦＯＬ－０５６又はＦＯＬ－０１４の有り無しで２０ｍＭグルコースを含むＲＰＭＩに交換し、さらに７２時間３７℃で培養して、糖毒性を誘導した。５ｍＭグルコースを含むＲＰＭＩを、低グルコース対照として含めた。７２時間後、培地を除去し、ＩＮＳ－１Ｅ細胞を、ｐＨ７．４の（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％牛血清アルブミン及び２．８ｍＭグルコースを補充した）クレブスリンガー重炭酸緩衝液（ＫＲＥＢ）で２時間平衡化した。平衡化後、緩衝液を交換し、ＩＮＳ－１Ｅ細胞を、補充した１６．７ｍＭグルコースを含むＫＲＥＢ中で１時間インキュベートした。インキュベーションの直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、その後のインスリン含量のアッセイのために凍結した。
ＦＯＬ－０５６のβ細胞保護効果を調べるために、ＩＮＳ－１Ｅを７２時間、細胞毒性レベルのグルコースに供した。ラットＩＮＳ－１Ｅ細胞を、９６ウェルプレート中のｃＲＰＭＩ培地に播種した（２×１０３細胞／ウェル）。７２時間のインキュベーション後、培地を、ＦＯＬ－０５６又はＦＯＬ－０１４の有り無しで２０ｍＭグルコースを含むＲＰＭＩに交換し、さらに７２時間３７℃で培養して、糖毒性を誘導した。５ｍＭグルコースを含むＲＰＭＩを、低グルコース対照として含めた。７２時間後、培地を除去し、ＩＮＳ－１Ｅ細胞を、ｐＨ７．４の（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％牛血清アルブミン及び２．８ｍＭグルコースを補充した）クレブスリンガー重炭酸緩衝液（ＫＲＥＢ）で２時間平衡化した。平衡化後、緩衝液を交換し、ＩＮＳ－１Ｅ細胞を、補充した１６．７ｍＭグルコースを含むＫＲＥＢ中で１時間インキュベートした。インキュベーションの直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、その後のインスリン含量のアッセイのために凍結した。
【0152】
結果は、糖毒性状態の間のＦＯＬ－０５６の存在が、保持されたグルコース誘導性インスリン分泌により示されるように、β細胞機能を維持することを実証する。
【0153】
実施例２０．ＧＬＰ－１と組み合わせたＦＯＬ－０５６は、いずれかのペプチド単独と比較してインスリン分泌を増加させる
ＩＮＳ－１細胞からのインスリン分泌を、ＦＯＬ－０５６、ＧＬＰ－１又はそれらの組み合わせへの曝露後に測定し、未処理の対照の割合として表した。ＧＬＰ－１とＦＯＬ－０５６の併用効果は、ＧＬＰ－１又はＦＯＬ－０５６単独よりも顕著により高いインスリン放出をもたらした。実験を、１６．７ｍＭグルコースの存在下で行った（図１５）。
ＩＮＳ－１細胞からのインスリン分泌を、ＦＯＬ－０５６、ＧＬＰ－１又はそれらの組み合わせへの曝露後に測定し、未処理の対照の割合として表した。ＧＬＰ－１とＦＯＬ－０５６の併用効果は、ＧＬＰ－１又はＦＯＬ－０５６単独よりも顕著により高いインスリン放出をもたらした。実験を、１６．７ｍＭグルコースの存在下で行った（図１５）。
【0154】
結果は、ＧＬＰ－１とＦＯＬペプチドの断片の組み合わせが、各ペプチド単独と比較してインビトロでＩＮＳ－１細胞からのインスリン分泌をさらに増強することを実証する。
【0155】
実施例２１．新規ペプチド類似体は膵臓のβ細胞株でインスリン分泌を誘導する
新規ペプチド類似体を、２０ｍＭグルコースの存在下で、ＩＮＳ－１細胞株中でインスリン分泌を誘導するそれらの能力を調べるために試験した。リラグルチドならびに高グルコース（２０ｍＭ）及び低グルコース（５ｍＭ）対照を各実験に含めた（ペプチド濃度は１００ｎＭであった）。実験間の変動を補正するために、全ての値を正規化し、個々の実験における高グルコース対照の平均値の割合として表した。類似体をその後、性能に応じてランク付けした（図１６）。
新規ペプチド類似体を、２０ｍＭグルコースの存在下で、ＩＮＳ－１細胞株中でインスリン分泌を誘導するそれらの能力を調べるために試験した。リラグルチドならびに高グルコース（２０ｍＭ）及び低グルコース（５ｍＭ）対照を各実験に含めた（ペプチド濃度は１００ｎＭであった）。実験間の変動を補正するために、全ての値を正規化し、個々の実験における高グルコース対照の平均値の割合として表した。類似体をその後、性能に応じてランク付けした（図１６）。
【0156】
結果は、インビトロでＩＮＳ－１ β細胞からのインスリン分泌を増強する新規ペプチド類似体の能力を実証する。
【0157】
実施例２２：ＦＯＬ－００５及びＦＯＬ－０１４に由来する新規ペプチドは、長期の糖毒性状態の間ＩＮＳ－１細胞のインスリン分泌能を維持する
ＦＯＬ－００５及びＦＯＬ－０１４に由来するいくつかの新規ペプチド断片のβ細胞保護効果を調べるために、ＩＮＳ－１細胞を７２時間、細胞毒性レベルのグルコースに供した。ラットＩＮＳ－１細胞を、９６ウェルプレート（２×１０３個の細胞／ウェル）中のｃＲＰＭＩ培地に播種した。７２時間のインキュベーション後、ペプチドの有り無しで２０ｍＭグルコースを含むＲＰＭＩに培地を交換し、さらに７２時間、３７℃で培養して、糖毒性を誘導した。５ｍＭグルコースを含むＲＰＭＩを低グルコース対照（図示せず）として含め、リラグルチドを比較のために含めた。７２時間後、培地を除去し、ＩＮＳ－１細胞を、ｐＨ７．４の、（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％牛血清アルブミン及び２．８ｍＭグルコースを補充した）クレブスリンガー重炭酸緩衝液（ＫＲＥＢ）中で２時間平衡化した。平衡化後、緩衝液を交換し、補充した１６．７ｍＭグルコースを含むＫＲＥＢ中でＩＮＳ－１細胞を１時間インキュベートした。インキュベーションの直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、インスリン含量のその後のアッセイのために凍結した。実験間の変動を補正するために、全ての値を正規化し、個々の実験における高グルコース対照の平均値の割合として表した。類似体をその後、性能に応じてランク付けした（図１７）。
ＦＯＬ－００５及びＦＯＬ－０１４に由来するいくつかの新規ペプチド断片のβ細胞保護効果を調べるために、ＩＮＳ－１細胞を７２時間、細胞毒性レベルのグルコースに供した。ラットＩＮＳ－１細胞を、９６ウェルプレート（２×１０３個の細胞／ウェル）中のｃＲＰＭＩ培地に播種した。７２時間のインキュベーション後、ペプチドの有り無しで２０ｍＭグルコースを含むＲＰＭＩに培地を交換し、さらに７２時間、３７℃で培養して、糖毒性を誘導した。５ｍＭグルコースを含むＲＰＭＩを低グルコース対照（図示せず）として含め、リラグルチドを比較のために含めた。７２時間後、培地を除去し、ＩＮＳ－１細胞を、ｐＨ７．４の、（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％牛血清アルブミン及び２．８ｍＭグルコースを補充した）クレブスリンガー重炭酸緩衝液（ＫＲＥＢ）中で２時間平衡化した。平衡化後、緩衝液を交換し、補充した１６．７ｍＭグルコースを含むＫＲＥＢ中でＩＮＳ－１細胞を１時間インキュベートした。インキュベーションの直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、インスリン含量のその後のアッセイのために凍結した。実験間の変動を補正するために、全ての値を正規化し、個々の実験における高グルコース対照の平均値の割合として表した。類似体をその後、性能に応じてランク付けした（図１７）。
【0158】
結果は、糖毒性状態の間のいくつかの新規ペプチドの存在が、保持されたグルコース誘導性インスリン分泌により示されるように、β細胞機能を維持することを実証する。
【0159】
実施例２３：ＦＯＬ－０５６ペプチドによるヒト膵臓β細胞からのインスリン分泌の刺激
ヒト細胞におけるＦＯＬ－０１４及びＦＯＬ－０５６の効果を試験するために、ヒト膵臓β細胞株１．２Ｂ４を、１０％牛胎児血清、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリン、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、１ｍＭのＬ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ １６４０中で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。１．２Ｂ４細胞を２４ウェルプレートのＲＰＭＩ培地中に播種し、一晩インキュベーションした後、培地を除去し、その後ｐＨ７.４の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％牛血清アルブミン及び１．０ｍＭグルコースを補充したクレブスリンガー重炭酸緩衝液中で、３７℃で４０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、緩衝液を上記の新鮮なクレブスリンガー緩衝液と交換し、グルコースを特定の濃度１ｍＭ又は１６．７ｍＭで補充した。ＦＯＬ－０１４、ＦＯＬ－０５６又はリラグルチドを、１６．７ｍＭグルコースの存在下で、１００ｎＭの濃度で添加した。３７℃で６０分インキュベーションした直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、その後のインスリンＥＬＩＳＡアッセイのために凍結した。（図１８）。
ヒト細胞におけるＦＯＬ－０１４及びＦＯＬ－０５６の効果を試験するために、ヒト膵臓β細胞株１．２Ｂ４を、１０％牛胎児血清、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリン、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、１ｍＭのＬ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ １６４０中で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。１．２Ｂ４細胞を２４ウェルプレートのＲＰＭＩ培地中に播種し、一晩インキュベーションした後、培地を除去し、その後ｐＨ７.４の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％牛血清アルブミン及び１．０ｍＭグルコースを補充したクレブスリンガー重炭酸緩衝液中で、３７℃で４０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、緩衝液を上記の新鮮なクレブスリンガー緩衝液と交換し、グルコースを特定の濃度１ｍＭ又は１６．７ｍＭで補充した。ＦＯＬ－０１４、ＦＯＬ－０５６又はリラグルチドを、１６．７ｍＭグルコースの存在下で、１００ｎＭの濃度で添加した。３７℃で６０分インキュベーションした直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、その後のインスリンＥＬＩＳＡアッセイのために凍結した。（図１８）。
【0160】
結果は、ペプチドＦＯＬ－０１４及びＦＯＬ－０５６が１６．７ｍＭグルコースの存在下で、１．２Ｂ４ヒトβ細胞においてインスリン分泌能力を増加させることを実証する。
【0161】
実施例２４：ＦＯＬ－０５６ペプチドによるヒト膵島からのインスリン分泌の刺激
ヒト一次組織におけるＦＯＬ－０５６の機能性を調べるために、２人の非糖尿病ヒトドナーからの膵島を使用した。小島を手で摘み、１２のグループに分量し、ｐＨ７.４の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％牛血清アルブミン及び１．０ｍＭグルコースを補充したクレブスリンガー重炭酸緩衝液１ｍｌ中で、３７℃でインキュベートした。プレインキュベーション後、緩衝液を上記の新鮮なクレブスリンガー緩衝液と交換し、特定のグルコース濃度（１ｍＭ又は１６．７ｍＭ）、ＦＯＬ－０５６ペプチド（１ｎＭ）又はリラグルチド（１００ｎＭ）を補充した。３７℃で６０分インキュベーションした直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、その後のインスリンＥＬＩＳＡアッセイのために凍結した。（図１９）。
ヒト一次組織におけるＦＯＬ－０５６の機能性を調べるために、２人の非糖尿病ヒトドナーからの膵島を使用した。小島を手で摘み、１２のグループに分量し、ｐＨ７.４の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％牛血清アルブミン及び１．０ｍＭグルコースを補充したクレブスリンガー重炭酸緩衝液１ｍｌ中で、３７℃でインキュベートした。プレインキュベーション後、緩衝液を上記の新鮮なクレブスリンガー緩衝液と交換し、特定のグルコース濃度（１ｍＭ又は１６．７ｍＭ）、ＦＯＬ－０５６ペプチド（１ｎＭ）又はリラグルチド（１００ｎＭ）を補充した。３７℃で６０分インキュベーションした直後に、緩衝液のアリコートを取り出し、その後のインスリンＥＬＩＳＡアッセイのために凍結した。（図１９）。
【0162】
結果は、ＦＯＬ－０５６が、高グルコースレベルに対する応答としてインスリンを分泌する主なヒト膵島の能力を増強することを実証する。
【0163】
実施例２５及び２６：長期の食事療法はＣ５７Ｂｌ６マウスに肥満を誘導する
材料及び方法：高脂肪食モデルにおけるＦＯＬ－０５６のインビボでの影響を調べるために、野生型ｃ５７Ｂｌ６マウスに、高脂肪食を１２週間与えながら、３００ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＯＬ－０５６を週５日皮下投与した。対照動物にはＰＢＳを投与した。
材料及び方法：高脂肪食モデルにおけるＦＯＬ－０５６のインビボでの影響を調べるために、野生型ｃ５７Ｂｌ６マウスに、高脂肪食を１２週間与えながら、３００ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＯＬ－０５６を週５日皮下投与した。対照動物にはＰＢＳを投与した。
【0164】
実施例２５：ＦＯＬ－０５６の長期投与はインビボで急性インスリン応答を増加させる
食事誘発型肥満ｃ５７Ｂｌ６マウスにおいて、未処置の場合とＦＯＬ－０５６を投与した場合で、空腹時血漿インスリンレベルを、１ｇ／ｋｇの静脈内グルコース注入の前と注入１分後に測定した。急性インスリン応答（ＡＩＲ）を得るために、グルコース注入前に測定したインスリン値を、各個々のマウスへの注射後に測定した値から差し引いた。（図２０）。
食事誘発型肥満ｃ５７Ｂｌ６マウスにおいて、未処置の場合とＦＯＬ－０５６を投与した場合で、空腹時血漿インスリンレベルを、１ｇ／ｋｇの静脈内グルコース注入の前と注入１分後に測定した。急性インスリン応答（ＡＩＲ）を得るために、グルコース注入前に測定したインスリン値を、各個々のマウスへの注射後に測定した値から差し引いた。（図２０）。
【0165】
結果は、ＦＯＬ－０５６で処置したマウスにおける急性インスリン応答（ＡＩＲ）が、未処置の対照マウスと比較して顕著に改善したことを実証する。
【0166】
実施例２６：投与の４週後の糖尿病マウスにおけるＨｂＡ１ｃの低下
糖尿病マウスにおけるＦＯＬ－０１４及びＦＯＬ－０５６の長期的な効果を調べるために、ｄｂ／ｄｂマウスに１００ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチドを週５日、４週間、皮下投与した。対照マウスにはＰＢＳを注入した。処置の４週後、マウスを屠殺し、２５μｌの全血を、その後のＨｂＡ１ｃ分析のために直ちに凍結した。（図２１）。
糖尿病マウスにおけるＦＯＬ－０１４及びＦＯＬ－０５６の長期的な効果を調べるために、ｄｂ／ｄｂマウスに１００ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチドを週５日、４週間、皮下投与した。対照マウスにはＰＢＳを注入した。処置の４週後、マウスを屠殺し、２５μｌの全血を、その後のＨｂＡ１ｃ分析のために直ちに凍結した。（図２１）。
【0167】
結果は、ＦＯＬ－０１４及びＦＯＬ－０５６による４週間の処置が、未処置の対照群と比較してｄｂ／ｄｂマウスにおいてＨｂＡ１ｃを低下させることを実証する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【配列表】