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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-09
(45)【発行日】2024-09-18
(54)【発明の名称】スタフィロコッカス細菌の同定方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20240910BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20240910BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240910BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z
C12Q1/689 Z
C12Q1/686 Z ZNA
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2020182363
(22)【出願日】2020-10-30
(65)【公開番号】P2022072747
(43)【公開日】2022-05-17
【審査請求日】2023-10-03
(73)【特許権者】
【識別番号】591167430
【氏名又は名称】株式会社ＫＲＩ
(72)【発明者】
【氏名】石川 文啓
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】特開２００４－１５４０５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２５３５９（ＪＰ，Ａ）
【文献】J. Clin. Microbiol.，1996年，vol.34，p.2770-2777
【文献】Scientific Reports，2020年10月09日，vol.10，article no.16907
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／６８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
スタフィロコッカス属細菌の同定方法であって、スタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを増幅して、増幅したゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、前記ゲノムＤＮＡ断片の塩基配列のＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列を既知のスタフィロコッカス属細菌のＤＮＡ配列と比較することによりスタフィロコッカス細菌を同定する方法。
【請求項2】
スタフィロコッカス属細菌の同定方法であって、スタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを増幅して、増幅したゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、前記ゲノムＤＮＡ断片の塩基配列の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列、ＬｙｓＳ遺伝子のＤＮＡ配列及びＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列を既知のスタフィロコッカス属細菌のＤＮＡ配列と比較することによりスタフィロコッカス細菌を同定する方法。
【請求項3】
スタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを増幅する方法であって、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号２に示される塩基配列からなるリバースプライマーを用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）法により増幅する増幅方法。
【請求項4】
スタフィロコッカス属細菌の同定方法であって、検体を請求項３に記載のＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）法によりスタフィロコッカス属細菌のゲノムＤＮＡを増幅した後、増幅したゲノムＤＮＡをＴＡクローニングしてスタフィロコッカス属細菌のゲノムＤＮＡを単離し、単離したゲノムＤＮＡをシーケンス解析することによりスタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を決定する請求項１又は請求項２に記載のスタフィロコッカス細菌を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ゲノムＤＮＡ配列を利用したスタフィロコッカス属細菌の検出及び同定への利用に関する技術である。
【背景技術】
【0002】
細菌の検出および同定は、臨床現場、食品製造現場や公衆衛生環境の安全管理現場において恒常的に必要とされている技術である。現在、細菌検査に用いられている手法は顕微鏡観察や選択培地による培養方法および生理・化学的性質の検査が主である。これら一般的な細菌検査方法は培養に時間を要するため日単位の時間を要する。
【0003】
スタフィロコッカス属の細菌はヒトを含む動物の皮膚や腸内に存在する常在性の細菌である。その多くは非病原性もしくは弱毒性であり、他の常在性の細菌と共に細菌叢を形成する事によって、病原性の高い細菌の侵入を阻む役割を担っている。
皮膚に常在するスタフィロコッカス属の表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）は、グリセリンや有機酸等を産生して皮膚の保湿機能やバリア機能の維持に寄与し、皮膚表面を弱酸性に保つことで有害菌の繁殖を抑制する事が知られている（非特許文献１）。
皮膚に常在するスタフィロコッカス属の表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）は、グリセリンや有機酸等を産生して皮膚の保湿機能やバリア機能の維持に寄与し、皮膚表面を弱酸性に保つことで有害菌の繁殖を抑制する事が知られている（非特許文献１）。
【0004】
一方、スタフィロコッカス属の中で特に毒性の強い黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏ ｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）もまたヒト等に常在する事が知られている。黄色ブドウ球菌は、常在細菌叢のバランスが保たれている場合は増殖できず問題とならない。しかしながら、常在細菌叢のバランスが崩れた際に黄色ブドウ球菌は増殖し、アトピー性皮膚炎や化膿の起因菌となる（非特許文献２）。
また、黄色ブドウ球菌は食中毒の主要な原因菌であることから、食品衛生上においても非常に重要な菌種であると考えられている。
そのため、医学分野、美容分野、食品衛生分野において、検体に存在する複数のスタフィロコッカス属細菌の種を簡便に検出・同定する方法が、有害菌、有用菌、無害菌の識別のために必要とされている。
また、黄色ブドウ球菌は食中毒の主要な原因菌であることから、食品衛生上においても非常に重要な菌種であると考えられている。
そのため、医学分野、美容分野、食品衛生分野において、検体に存在する複数のスタフィロコッカス属細菌の種を簡便に検出・同定する方法が、有害菌、有用菌、無害菌の識別のために必要とされている。
【0005】
近年，次世代シークエンシング（ＮＧＳ）に代表されるＤＮＡシークエンサーのハイスループット化によってＤＮＡ配列決定が短時間に多量の情報を得ることが可能となった。それによって、これまでに細菌の同定の基準としていた標準株や、種が同定された株の全ゲノムデータが公開データベースに急速に蓄積されている。
蓄積された既知種のＤＮＡ配列データを利用して標的細菌を簡易的に分類、同定する方法として、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）法によってリボソームを構成する５Ｓ ｒＲＮＡ（５ＳリボソームＲＮＡ）もしくは１６Ｓ ｒＲＮＡ（１６ＳリボソームＲＮＡ）もしくは２３Ｓ ｒＲＮＡ（２３ＳリボソームＲＮＡ）遺伝子のゲノムＤＮＡ、あるいはそれらの一部のゲノムＤＮＡを増幅してその塩基配列を決定する方法が用いられてきた（特許文献２）．ＰＣＲ法を用いると少量のゲノムＤＮＡから特定のＤＮＡ領域を短時間で増幅する事が可能となるため、標的微生物の分離培養・増菌培養を必要としない。そのため選択培地による培養方法による細菌検査と比較して迅速に検出・同定が可能となる。
しかしながら、細菌はゲノム上にリボソームＲＮＡ遺伝子が複数コピー存在し多型を有するため、同一の細菌であってもリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列は一つに定まらない。また、細菌の種類によってはその近縁種とリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列の類似性が高く、種を識別する事が困難となることがある。
蓄積された既知種のＤＮＡ配列データを利用して標的細菌を簡易的に分類、同定する方法として、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）法によってリボソームを構成する５Ｓ ｒＲＮＡ（５ＳリボソームＲＮＡ）もしくは１６Ｓ ｒＲＮＡ（１６ＳリボソームＲＮＡ）もしくは２３Ｓ ｒＲＮＡ（２３ＳリボソームＲＮＡ）遺伝子のゲノムＤＮＡ、あるいはそれらの一部のゲノムＤＮＡを増幅してその塩基配列を決定する方法が用いられてきた（特許文献２）．ＰＣＲ法を用いると少量のゲノムＤＮＡから特定のＤＮＡ領域を短時間で増幅する事が可能となるため、標的微生物の分離培養・増菌培養を必要としない。そのため選択培地による培養方法による細菌検査と比較して迅速に検出・同定が可能となる。
しかしながら、細菌はゲノム上にリボソームＲＮＡ遺伝子が複数コピー存在し多型を有するため、同一の細菌であってもリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列は一つに定まらない。また、細菌の種類によってはその近縁種とリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列の類似性が高く、種を識別する事が困難となることがある。
【0006】
スタフィロコッカス属内の菌種は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列の細菌種間の類似性は高く、属レベルの識別には１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列を用いることが有効である。しかし、サンガー法もしくは膨大な数のＤＮＡの塩基配列を一度に解析するＮＧＳ（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いた１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子）の塩基配列決定では、属レベルの識別に留まり種の同定に至らない。
複数遺伝子のＤＮＡ配列を用いて株を識別する ＭＬＳＴ（Ｍｕｌｔｉ ｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｙｐｉｎｇ）法は、スタフィロコッカス属の細菌においても株レベルの詳細な分類が可能であるが、標的細菌の増菌培養・分離培養を必要とするため、多量の解析が困難である（非特許文献３）。
複数遺伝子のＤＮＡ配列を用いて株を識別する ＭＬＳＴ（Ｍｕｌｔｉ ｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｙｐｉｎｇ）法は、スタフィロコッカス属の細菌においても株レベルの詳細な分類が可能であるが、標的細菌の増菌培養・分離培養を必要とするため、多量の解析が困難である（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特開２０１２－３９９７７号公報
【文献】特開平１１－１３７２５９号公報
【文献】特開２０１９－１０７０１９号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】出来尾格、服部正平 共著、「人体と共生する１００兆個の菌たち」、Ｎｅｗｔｏｎ（株式会社 ニュートンプレス刊）、２０１０年１１月号、６８～７５ページ
【文献】Ｔｅｔｓｕｒｏ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、Ｍａｒｔｉｎ Ｇｌａｔｚ、Ｋｅｉｓｕｋｅ Ｈｏｒｉｕｃｈｉ、Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｈａｒｕｈｉｋｏ Ａｋｉｙａｍａ、Ｄａｎｉｅｌ Ｈ． Ｋａｐｌａｎ，Ｈｅｉｄｉ Ｈ． Ｋｏｎｇ、Ｍａｓａｙｕｋｉ Ａｍａｇａｉ、Ｋｅｉｓｕｋｅ Ｎａｇａｏ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１５，７５６－６６
【文献】長尾美紀、太田美智男、日臨微生物誌２００７，１５９－６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
複数種スタフィロコッカス属菌を種レベルに迅速で簡易的に検出・同定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
上記目的を達成するために、本発明者は鋭意検討した結果、以下のスタフィロコッカス細菌を同定する方法を発明することができた。すなわち、本発明は以下の技術的構成を有するスタフィロコッカス細菌を同定する方法である。
【0011】
〔１〕 スタフィロコッカス属細菌の同定方法であって、スタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを増幅して、増幅したゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、前記ゲノムＤＮＡ断片の塩基配列のＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列を既知のスタフィロコッカス属細菌のＤＮＡ配列と比較することによりスタフィロコッカス細菌を同定する方法。
〔２〕 スタフィロコッカス属細菌の同定方法であって、スタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６ＳｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを増幅して、増幅したゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、前記ゲノムＤＮＡ断片の塩基配列の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列、ＬｙｓＳ遺伝子のＤＮＡ配列及びＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列を既知のスタフィロコッカス属細菌のＤＮＡ配列と比較することによりスタフィロコッカス細菌を同定する方法。
〔３〕 スタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを増幅する方法であって、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号２に示される塩基配列からなるリバースプライマーを用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）法により増幅する増幅方法。
〔４〕 スタフィロコッカス属細菌の同定方法であって、検体を前記〔３〕に記載のＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）法によりスタフィロコッカス属細菌のゲノムＤＮＡを増幅した後、増幅したゲノムＤＮＡをＴＡクローニングしてスタフィロコッカス属細菌のゲノムＤＮＡを単離し、単離したゲノムＤＮＡをシーケンス解析することによりスタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を決定する前記〔１〕又は前記〔２〕に記載のスタフィロコッカス細菌を同定する方法。
〔２〕 スタフィロコッカス属細菌の同定方法であって、スタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６ＳｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを増幅して、増幅したゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、前記ゲノムＤＮＡ断片の塩基配列の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列、ＬｙｓＳ遺伝子のＤＮＡ配列及びＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列を既知のスタフィロコッカス属細菌のＤＮＡ配列と比較することによりスタフィロコッカス細菌を同定する方法。
〔３〕 スタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを増幅する方法であって、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号２に示される塩基配列からなるリバースプライマーを用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）法により増幅する増幅方法。
〔４〕 スタフィロコッカス属細菌の同定方法であって、検体を前記〔３〕に記載のＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）法によりスタフィロコッカス属細菌のゲノムＤＮＡを増幅した後、増幅したゲノムＤＮＡをＴＡクローニングしてスタフィロコッカス属細菌のゲノムＤＮＡを単離し、単離したゲノムＤＮＡをシーケンス解析することによりスタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を決定する前記〔１〕又は前記〔２〕に記載のスタフィロコッカス細菌を同定する方法。
【0012】
前記〔３〕に記載のフォワードプライマー及びリバースプライマーは、詳しくは配列表に示すが、以下の塩基配列である。
フォワードプライマーの塩基配列
Ｓｔａｐｈｙｌｏ＿ＬｙｓＳ＿１３１８Ｆ：５’－ＣＡＡＧＧＴＡＡＹＧＡＹＧＡＡＧＣＩＣＡＴＧＡＩＡＴＧＧ－３’
前記フォワードプライマーの塩基配列中のＹはＣ又はＴの縮重塩基を示し、Ｉはイノシンを示す。そして、Ｉで示す１８及び２４塩基目の塩基は、それぞれイノシンが好ましいが、アデニン（Ａ）、チニン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）のいずれか又はいずれか２つ以上の組み合わせであてもよい。
リバースプライマーの塩基配列
Ｓｔａｐｈｙｌｏ＿１６ＳＶ１Ｖ２＿Ｒ：５’－ＴＧＧＣＣＧＡＴＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＧＧＴＣ－３’
フォワードプライマーの塩基配列
Ｓｔａｐｈｙｌｏ＿ＬｙｓＳ＿１３１８Ｆ：５’－ＣＡＡＧＧＴＡＡＹＧＡＹＧＡＡＧＣＩＣＡＴＧＡＩＡＴＧＧ－３’
前記フォワードプライマーの塩基配列中のＹはＣ又はＴの縮重塩基を示し、Ｉはイノシンを示す。そして、Ｉで示す１８及び２４塩基目の塩基は、それぞれイノシンが好ましいが、アデニン（Ａ）、チニン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）のいずれか又はいずれか２つ以上の組み合わせであてもよい。
リバースプライマーの塩基配列
Ｓｔａｐｈｙｌｏ＿１６ＳＶ１Ｖ２＿Ｒ：５’－ＴＧＧＣＣＧＡＴＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＧＧＴＣ－３’
【発明の効果】
【0013】
ＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子の並びがゲノム上に一か所であるため、スタフィロコッカスの菌株において標的の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は一種類に定まり、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子による菌種を検出・同定する際の解像度が向上する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】スタフィロコッカス属菌を種レベルで迅速に検出・同定するためにＤＮＡ検査に用いる領域
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明のスタフィロコッカス属細菌を同定する方法は、スタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを増幅して、増幅したゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、前記ゲノムＤＮＡ断片の塩基配列のＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列を既知のスタフィロコッカス属細菌のＤＮＡ配列と比較することを特徴とし、フィロコッカス細菌を種レベルに迅速で簡易的に検出・同定することができる。
【0016】
本発明の発明者は、スタフィロコッカス属細菌の遺伝子に関するデータを解析した結果、スタフィロコッカス属では、５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及び１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が複数存在する場合があるが、ＬｙｓＳ遺伝子はゲノムＤＮＡに一つしか存在せず、ＬｙｓＳ遺伝子～５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子～１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子がゲノムＤＮＡに順に並んで存在しており、それらの遺伝子の並びが存在する領域はゲノムＤＮＡ上で一か所のみであることを見出した。
【0017】
スタフィロコッカス属の細菌のゲノムＤＮＡにおいて、ＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までの間には複数の遺伝子が存在しており、その遺伝子の並びは保存されている。その並びは、ＬｙｓＳ遺伝子、５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（５ＳリボソームＲＮＡ遺伝子）、８種類のｔＲＮＡ遺伝子（トランスファーＲＮＡ遺伝子）、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の順番である（図１）。
【0018】
その中でも、ＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列の相違は著しく、ＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列を既知のスタフィロコッカス属細菌のＤＮＡ配列と比較することにより、スタフィロコッカス属細菌を種レベルに迅速で簡易的に検出・同定することができる。
【0019】
スタフィロ属について、ＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノム領域における１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（全長）、ＬｙｓＳ遺伝子（全長）、ＬｙｓＳ遺伝子と５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の間の領域の遺伝子について既存のデータを解析して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）もしくはＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（表皮ブドウ球菌）とその他のスタフィロコッカス属の細菌との類似性を比較した結果を表１に示す。
【表1】
【0020】
表１に示すように、スタフィロコッカス属内の菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列の細菌種間の類似性は平均値で９７．８％であり、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は種間の類似性は高く細菌識別の解像度が低い。しかし、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列のデータは、これまでに公開データベースにデータが多量に蓄積されており、そのため属レベルの識別には有効であるが、種レベルまでは同定することはできない。
【0021】
また、スタフィロコッカス属内の菌種のＬｙｓＳ遺伝子のＤＮＡ配列の種間の類似性は平均値で８０．９％であり、種間の配列の相違が１６Ｓ ｒＤＮＡよりも多いためより詳細な識別が可能である。ＬｙｓＳ遺伝子は、単独でもデータを比較して種の同定に用いることができるが、塩基配列決定の際にシークエンスエラーが生じる場合があり、その場合種の判別が困難となる。
【0022】
さらに、スタフィロコッカス属内の菌種のＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列（図１の矢印３）の種間の類似性は平均値で３８．０％である。ＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列は、ＬｙｓＳ遺伝子よりも種間の配列の相違が多く容易に種の識別が可能である。
【0023】
また、前記ゲノムＤＮＡ断片の塩基配列の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列、ＬｙｓＳ遺伝子のＤＮＡ配列及びＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間の３か所のＤＮＡ配列を既知のスタフィロコッカス属細菌のＤＮＡ配列と比較することにより、より精密にスタフィロコッカス属細菌を同定することができる。
【0024】
続いて、スタフィロコッカス属細菌の同定方法について、対象となる検体の採取から同定に至るまでの方法をより具体的に説明する。
【0025】
本発明の同定の対象となる検体は、食品、土壌、水、皮膚、血液などの臨床検体などを挙げることができる。
【0026】
スタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを増幅するために、検体は通常の方法で採取し被検体試料とする。
【0027】
採取した被検体試料は、液状試料の場合は、採取試料をそのまま又は希釈して試料液とし、個体試料の場合は、細かく磨り潰す等して希釈水を加えて均質化した物を試料液として使用する。
実施例に示されている皮膚を検体とする場合について説明すると、皮膚常在細菌の採取方法は、湿式綿棒による採取法、テープストリッピング法カップスクラブ法等がある。皮膚上の菌数や菌種の評価という面では一定面積中に生息する微生物を掻取るスクラブ法が簡便法として優れている。
実施例に示されている皮膚を検体とする場合について説明すると、皮膚常在細菌の採取方法は、湿式綿棒による採取法、テープストリッピング法カップスクラブ法等がある。皮膚上の菌数や菌種の評価という面では一定面積中に生息する微生物を掻取るスクラブ法が簡便法として優れている。
【0028】
採取した被検体試料の試料液は、そのままでも良いが、通常は、ろ過、遠心分離などを適宜選択することによって、菌を濃縮、分離する前処理をして核酸抽出工程に供される。
【0029】
次に、被検体試料からゲノムＤＮＡを増幅するために被検体試料中に含まれる細菌から核酸を抽出する。当該核酸の抽出は、バクテリアからのトータルＤＮＡを精製する方法において、公知の核酸抽出方法により行えばよい（核酸抽出工程）。
【0030】
このようにして抽出した核酸を鋳型としてプライマー対を使用して前記核酸の増幅を行う（核酸増幅工程）。
核酸の増幅は、特に制限されるものではないが、通常、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）法により行う。以下の説明は、核酸の増幅がＰＣＲ法で行われたとして説明する。
核酸の増幅は、特に制限されるものではないが、通常、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）法により行う。以下の説明は、核酸の増幅がＰＣＲ法で行われたとして説明する。
【0031】
核酸増幅のＰＣＲ法に用いるプライマー対は、スタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを増幅することができるフォワードプライマーとリバースプライマーの対であれば何でもよい。フォワードプライマーとリバースプライマーは、スタフィロ属だけが共通して持っている配列を設計領域として、通常２０～４０ｂｐ程度のものを用いればよい。
【0032】
表１に示したように、スタフィロコッカス属では、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列及びＬｙｓＳ遺伝子のＤＮＡ配列の種間の類似性が高いので、ＬｙｓＳ遺伝子の下流側のＤＮＡ配列の一部および１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の上流側のＤＮＡ配列の一部が両末端になるようにフォワードプライマーとリバースプライマーを選んで核酸増幅を行い、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の上流側のＤＮＡ配列の一部及び／又はＬｙｓＳ遺伝子の下流側のＤＮＡ配列の一部ついて相同性を検索すれば、スタフィロコッカス属レベルの判別が可能である。
【0033】
スタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを増幅するプライマー対の１例を挙げると、配列表の配列番号１に示される塩基配列（Ｓｔａｐｈｙｌｏ＿ＬｙｓＳ＿１３１８Ｆ：５’－ＣＡＡＧＧＴＡＡＹＧＡＹＧＡＡＧＣＩＣＡＴＧＡＩＡＴＧＧ－３’）からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号２に示される塩基配列（Ｓｔａｐｈｙｌｏ＿１６ＳＶ１Ｖ２＿Ｒ：５’－ＴＧＧＣＣＧＡＴＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＧＧＴＣ－３’）からなるリバースプライマーを挙げることができる。
前記プライマー対を用いてゲノムＤＮＡを増幅すれば、ＬｙｓＳ遺伝子の下流側１７１ｂｐ程度のＤＮＡ配列（図１の矢印２）から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の上流側の多様性のあるＶ１～Ｖ２領域を含む３２０ｂｐ程度のＤＮＡ配列（図１の矢印１）までのゲノムＤＮＡを増幅することができる。
前記プライマー対を用いてゲノムＤＮＡを増幅すれば、ＬｙｓＳ遺伝子の下流側１７１ｂｐ程度のＤＮＡ配列（図１の矢印２）から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の上流側の多様性のあるＶ１～Ｖ２領域を含む３２０ｂｐ程度のＤＮＡ配列（図１の矢印１）までのゲノムＤＮＡを増幅することができる。
【0034】
前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーは、プライマーとしての機能を変更しない範囲で適宜変更することができる。例えば、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーは数個の塩基が置換、付加もしくは欠損したオリゴヌクレオチドであっても、ＰＣＲの反応条件のアニーリング温度を最適条件から低く設定することや、アニーリング時間を長く設定することによって、スタフィロコッカス属菌のゲノムＤＮＡの標的領域を増幅することができる。
【0035】
ＰＣＲ法は、具体的には前記抽出した核酸、フォワードプライマー及びリバースプライマーを反応液に添加してサーマルサイクラーにより反応させる。
反応液は、通常用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとＮＴＰを含むものを用いればよい。
ＰＣＲに使用する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ・ＴａｑポリメラーゼのようなＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ等、公知の重合酵素を使用すればよい。
反応液は、通常用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとＮＴＰを含むものを用いればよい。
ＰＣＲに使用する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ・ＴａｑポリメラーゼのようなＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ等、公知の重合酵素を使用すればよい。
【0036】
サーマルサイクラーでの反応は、どのような条件で行ってもよく、核酸増幅の条件（変性温度、アニール温度およびアニール時間、サイクル数、伸長温度および伸長時間）は設計したプライマーの長さやＧＣ含有量等によって適宣決定する。
一例を示すと、変性温度が９２～９８℃、アニール温度が５０～６８℃、アニール時間が１０秒～１分、サイクル数が２０～４０サイクル、伸長温度が６８～７２℃、伸長時間が１分～１０分で行えばよい。
一例を示すと、変性温度が９２～９８℃、アニール温度が５０～６８℃、アニール時間が１０秒～１分、サイクル数が２０～４０サイクル、伸長温度が６８～７２℃、伸長時間が１分～１０分で行えばよい。
【0037】
ＰＣＲ反応が終了した後、増幅したＰＣＲ増幅産物から目的のサイズのＰＣＲ産物を分取するために、ＰＣＲ反応液を採取して電気泳動を行いサイズの異なるＤＮＡを分離する。（電気泳動工程）。
電気泳動工程では、適切な緩衝液およびゲルを使用して通常の方法で行う。電気泳動時間・電圧は適宣設定する。使用するゲルを例示するとアガロースゲル、アクリルアミドゲルなどが挙げられる。また、使用する緩衝液としては、トリス酢酸ＥＤＴＡ緩衝液、トリスホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液などが挙げられる。
電気泳動工程では、適切な緩衝液およびゲルを使用して通常の方法で行う。電気泳動時間・電圧は適宣設定する。使用するゲルを例示するとアガロースゲル、アクリルアミドゲルなどが挙げられる。また、使用する緩衝液としては、トリス酢酸ＥＤＴＡ緩衝液、トリスホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液などが挙げられる。
【0038】
電気泳動工程の後、所定濃度のエチジウムブロマイド等の染色剤によりＰＣＲ産物を所定時間染色してＬＥＤの主波長５００ｎｍ、ＵＶライト等の照射等によって可視化することによってＰＣＲ産物を検出する。電気泳動によってＤＮＡのサイズ毎に分離されたＤＮＡはバンド状に可視化される（ＰＣＲ増幅産物検出工程）。
【0039】
ＰＣＲ増幅産物検出工程によってＤＮＡのサイズを確認した後、目的のサイズＤＮＡ断片のバンドをアガロースゲルから切り出し、精製する。切り出したアガロースゲル片からのＤＮＡ断片の精製は、公知の核酸抽出方法により行う（切り出し精製工程）。
【0040】
前記精製されたＤＮＡ断片は、シーケンス解析することにより、ゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を決定することができる。
シーケンシング方法としては、キャピラリー電気泳動によるサンガー法シークエンス、次世代シークエンシング、次世代シークエンシングのロングリードタイプ等を使用することができる。
シーケンシング方法としては、キャピラリー電気泳動によるサンガー法シークエンス、次世代シークエンシング、次世代シークエンシングのロングリードタイプ等を使用することができる。
【0041】
キャピラリー電気泳動によるサンガー法シークエンスは、例えば３７３０ｘｌ ＤＮＡ アナライザ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）やＳｅｑＳｔｕｄｉｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）が利用できる。
【0042】
しかし、サンガー法シークエンスでシーケンス解析するためには、その前処理としてＴＡクローニングによって増殖する必要がある。前記ＰＣＲ法において、３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって核酸を増幅した場合は、３’末端が平滑化されているので、その場合は、ＰＣＲ増幅産物の平滑末端へのアデニンを付加した後に、ＴＡクローニングを実施する。
【0043】
ＴＡクローニングは、通常の方法を用いて行うことができる。すなわち、ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドにより大腸菌を形質転換し、培養、抽出、生成すればよい。具体的には、形質転換された大腸菌を、まず、寒天培地に播種して培養しコロニーを形成させ、各コロニーをピックアップし液体培地により培養して、培養されたプラスミドを通常用いられる方法によって抽出し精製することにより単一のＤＮＡが組み込まれたプラスミドを得ることができる。
【0044】
形質転換に使用する大腸菌ホストは、公知のクローニングに使用可能な大腸菌ホストを用いることが出来る。大腸菌ホストの一例を示すとＥ． ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８（タカラバイオ社製）がある。
【0045】
上記工程を経て得られた単一の増幅したゲノムＤＮＡ断片の塩基配列は、サンガー法シーケンシングによりシーケンス解析することにより、スタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を決定する。
【0046】
キャピラリー電気泳動によるサンガー法シークエンスは、例えば３７３０ｘｌ ＤＮＡ アナライザ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）やＳｅｑＳｔｕｄｉｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）が利用できる。
【0047】
次世代シークエンシングは、ショートリードタイプのＭｉｓｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｈｉｓｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｎｏｖａｓｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）もしくはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、Ｉｏｎ ＧｅｎｅＳｔｕｄｉｏ Ｓ５次世代シーケンスシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック）が利用できる。そのほかに、次世代シークエンシングのロングリードタイプのＰａｃＢｉｏ ＲＳ ＩＩ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）もしくはＭｎｉＩＯＮ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ）、ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ）が利用できる。
【0048】
以上の様にして決定されたスタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡ断片の塩基配列について、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列、ＬｙｓＳ遺伝子のＤＮＡ配列及びＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列を既知のスタフィロコッカス属細菌のＤＮＡ配列と相同性検索により配列を比較することにより、スタフィロコッカス細菌を同定することができる。
【0049】
既知のスタフィロコッカス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列、ＬｙｓＳ遺伝子のＤＮＡ配列及びＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列は、データベースに公開されている既知のスタフィロコッカス属菌のゲノムＤＮＡ配列を利用して、既知のスタフィロコッカス属菌の種別に構築してデータベース化しておく。
【0050】
相同性検索の結果、検索に用いたＤＮＡ配列とヒットしたＤＮＡ配列との類似性において、ヒットしたＤＮＡ配列の菌種の種内類似性の範囲内であること、かつ、その他の菌種間との類似性が種内類似性よりも低い場合に、検索に用いたＤＮＡ配列はヒットした種であることが判断できる。
【0051】
相同性検索は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＳＣＡＮＰＳ等の既存の相同性検索手法を用いて行うことができる。例えは、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって公開されているｂｌａｓｔｎプログラムを用いることができる。
【実施例】
【0052】
本実施例では、皮膚常在菌のスタフィロコッカス属の細菌の同定を行った例を示すが，本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【0053】
（１）検体の採取
検体は、スクラブ法によって皮膚表面の組織を採取した。具体的には、前腕屈側部に円柱カップを押し付け２ｍＬサンプリング液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）、０．１％（Ｖ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０溶液）を添加した。その後、ラバーポリスマンを用いてカップ円柱カップ内側の皮膚を１分間スクラブし、２ｍＬチューブへスクラブしたサンプリング液を回収した。回収したサンプリング液を室温で５分間、２０，０００ｘｇで遠心分離し、上清を捨て、沈殿物を得た。
検体は、スクラブ法によって皮膚表面の組織を採取した。具体的には、前腕屈側部に円柱カップを押し付け２ｍＬサンプリング液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）、０．１％（Ｖ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０溶液）を添加した。その後、ラバーポリスマンを用いてカップ円柱カップ内側の皮膚を１分間スクラブし、２ｍＬチューブへスクラブしたサンプリング液を回収した。回収したサンプリング液を室温で５分間、２０，０００ｘｇで遠心分離し、上清を捨て、沈殿物を得た。
【0054】
（２）ＤＮＡの抽出
遠心分離で得られた沈殿物を倉敷紡績株式会社製のＤＮＡ抽出キットＱｕｉｃｋＧｅｎｅ ＤＮＡ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ Ｓを用いてキットのプロトコルに従ってゲノムＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡをキット添付のＣＤＴ １００μＬに溶解した。
遠心分離で得られた沈殿物を倉敷紡績株式会社製のＤＮＡ抽出キットＱｕｉｃｋＧｅｎｅ ＤＮＡ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ Ｓを用いてキットのプロトコルに従ってゲノムＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡをキット添付のＣＤＴ １００μＬに溶解した。
【0055】
（３）ＰＣＲによるＤＮＡの増幅
次に、スタフィロコッカス属の細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを解析するため、ＰＣＲによるＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲはＫＯＤ－Ｍｕｌｔｉ＆Ｅｐｉ（登録商標）を用いた。ＰＣＲプライマーは、フォワードプライマー（Ｓｔａｐｈｙｌｏ＿ＬｙｓＳ＿１３１８Ｆ）（配列番号１）に５’－ＣＡＡＧＧＴＡＡＹＧＡＹＧＡＡＧＣＩＣＡＴＧＡＩＡＴＧＧ－３、リバースプライマー（Ｓｔａｐｈｙｌｏ＿１６ＳＶ１Ｖ２＿Ｒ）（配列番号２）に５’－ＴＧＧＣＣＧＡＴＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＧＧＴＣ－３’を用いた。ＰＣＲサイクルは、９８℃・２分、（９８℃・１０秒、６３℃・３０秒、６８℃・２分）×３４サイクルで増幅した。
ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動（１．５％アガロースゲル）によって分離した。
次に、スタフィロコッカス属の細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを解析するため、ＰＣＲによるＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲはＫＯＤ－Ｍｕｌｔｉ＆Ｅｐｉ（登録商標）を用いた。ＰＣＲプライマーは、フォワードプライマー（Ｓｔａｐｈｙｌｏ＿ＬｙｓＳ＿１３１８Ｆ）（配列番号１）に５’－ＣＡＡＧＧＴＡＡＹＧＡＹＧＡＡＧＣＩＣＡＴＧＡＩＡＴＧＧ－３、リバースプライマー（Ｓｔａｐｈｙｌｏ＿１６ＳＶ１Ｖ２＿Ｒ）（配列番号２）に５’－ＴＧＧＣＣＧＡＴＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＧＧＴＣ－３’を用いた。ＰＣＲサイクルは、９８℃・２分、（９８℃・１０秒、６３℃・３０秒、６８℃・２分）×３４サイクルで増幅した。
ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動（１．５％アガロースゲル）によって分離した。
【0056】
（４）ＰＣＲ産物の切り出し
ＰＣＲ産物のＤＮＡサイズが、１．５ｋｂｐから３．０ｋｂｐのバンドをアガロースゲルから切り出し，Ｇｅｌ／ＰＣＲ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｉｏｇｅｎｅ）を用いて精製した。
ＰＣＲ産物のＤＮＡサイズが、１．５ｋｂｐから３．０ｋｂｐのバンドをアガロースゲルから切り出し，Ｇｅｌ／ＰＣＲ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｉｏｇｅｎｅ）を用いて精製した。
【0057】
（５）ＴＡクローニング ＴＡクローニングの前処理として、１０×Ａ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｍｉｘ（東洋紡）を用いて、精製したＰＣＲ産物にｄＡを付加した。
前記ｄＡを付加したＰＣＲ産物のＴＡクローニングを実施した。
Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社）を用いてＴ－Ｖｅｃｔｅｒ ｐＭＤ２０ （タカラバイオ株式会社）に３’末端にｄＡを付加したＰＣＲ産物をライゲーションした後、Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓに形質転換した。ＬＢ－ａｍｐ培地に播種後、３７℃、一晩培養しコロニーを形成させた。得られたコロニーについて、コロニーダイレクトＰＣＲ（配列番号１および２のプライマーを使用）を実施し，目的の長さのＤＮＡがクローニングされた大腸菌を選抜した。選抜した大腸菌をＭｉｎｉ Ｐｌｕｓ（登録商標） Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いてキットのプロトコルに従ってプラスミドＤＮＡを抽出・精製し、皮膚常在性細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡ断片を導入したプラスミドＤＮＡを得た。
前記ｄＡを付加したＰＣＲ産物のＴＡクローニングを実施した。
Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社）を用いてＴ－Ｖｅｃｔｅｒ ｐＭＤ２０ （タカラバイオ株式会社）に３’末端にｄＡを付加したＰＣＲ産物をライゲーションした後、Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓに形質転換した。ＬＢ－ａｍｐ培地に播種後、３７℃、一晩培養しコロニーを形成させた。得られたコロニーについて、コロニーダイレクトＰＣＲ（配列番号１および２のプライマーを使用）を実施し，目的の長さのＤＮＡがクローニングされた大腸菌を選抜した。選抜した大腸菌をＭｉｎｉ Ｐｌｕｓ（登録商標） Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いてキットのプロトコルに従ってプラスミドＤＮＡを抽出・精製し、皮膚常在性細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡ断片を導入したプラスミドＤＮＡを得た。
【0058】
（６）ＤＮＡシーケンス解析
前記ＴＡクローニングにより得たプラスミドＤＮＡを、下記の２種類のシークエンシングのプライマーを用いてサンガー法シーケンシングを行い、ＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
フォワードプライマー（配列番号３）
Ｍ１３ｒｅｖ：５’－ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ－３’
リバースプライマー（配列番号４）
Ｍ１３ Ｍｏｄ．ｉ：５’－ＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧ－３’
前記ＴＡクローニングにより得たプラスミドＤＮＡを、下記の２種類のシークエンシングのプライマーを用いてサンガー法シーケンシングを行い、ＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
フォワードプライマー（配列番号３）
Ｍ１３ｒｅｖ：５’－ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ－３’
リバースプライマー（配列番号４）
Ｍ１３ Ｍｏｄ．ｉ：５’－ＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧ－３’
【0059】
（７）ＤＮＡ配列データベースの構築
スタフィロコッカス属の細菌の株のＬｙｓＳ遺伝子のＤＮＡ配列、ＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子 （ＬｙｓＳ遺伝子の下流の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子） のＤＮＡ配列の合計３種類のＤＮＡ配列データベースの構築を以下のように行った。
Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）によって公開されているＤＮＡ配列のデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ）から全ゲノム配列が登録されているスタフィロコッカス属の細菌の株のゲノム配列データを取得した。
取得したゲノム配列データのアノテーション情報を参照することによって、各株のゲノム配列の中からＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのＤＮＡ配列を取得した。
取得した各株のＤＮＡ配列からＬｙｓＳ遺伝子のＤＮＡ配列、ＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列の合計３種類のＤＮＡ配列をそれぞれｍｕｌｔｉ－ＦＡＳＴＡ形式でファイルに保存した。
ＢｉｏＥｄｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／ｂｉｏｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ）のＡｃｃｅｓｓｏｒｙ ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎからＣｒｅａｔｅ ａ ｌｏｃａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｉｌｅを実行し、作成した上記３領域のＤＮＡ配列データファイルから配列検索プログラムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）のデータベースを構築した。
スタフィロコッカス属の細菌の株のＬｙｓＳ遺伝子のＤＮＡ配列、ＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子 （ＬｙｓＳ遺伝子の下流の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子） のＤＮＡ配列の合計３種類のＤＮＡ配列データベースの構築を以下のように行った。
Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）によって公開されているＤＮＡ配列のデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ）から全ゲノム配列が登録されているスタフィロコッカス属の細菌の株のゲノム配列データを取得した。
取得したゲノム配列データのアノテーション情報を参照することによって、各株のゲノム配列の中からＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのＤＮＡ配列を取得した。
取得した各株のＤＮＡ配列からＬｙｓＳ遺伝子のＤＮＡ配列、ＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列の合計３種類のＤＮＡ配列をそれぞれｍｕｌｔｉ－ＦＡＳＴＡ形式でファイルに保存した。
ＢｉｏＥｄｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／ｂｉｏｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ）のＡｃｃｅｓｓｏｒｙ ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎからＣｒｅａｔｅ ａ ｌｏｃａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｉｌｅを実行し、作成した上記３領域のＤＮＡ配列データファイルから配列検索プログラムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）のデータベースを構築した。
【0060】
（８）ＤＮＡ配列の配列解析による細菌の種の同定
前記（６）で取得したＤＮＡ配列は、ＢｉｏＥｄｉｔのＡｃｃｅｓｓｏｒｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎからｌｏｃａｌ ｂｌａｓｔを実行し、下記パラメーターによるｂｌａｓｔ検索を実施した。
プログラム：ｂｌａｓｔｎ
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅ：前記（７）で構築したＬｙｓＳ遺伝子のＤＮＡ配列、ＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列の合計３種類のデータベース
Ｑｕｅｒｙ：前記（６）で取得したＤＮＡ配列
前記（６）で取得したＤＮＡ配列は、ＢｉｏＥｄｉｔのＡｃｃｅｓｓｏｒｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎからｌｏｃａｌ ｂｌａｓｔを実行し、下記パラメーターによるｂｌａｓｔ検索を実施した。
プログラム：ｂｌａｓｔｎ
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅ：前記（７）で構築したＬｙｓＳ遺伝子のＤＮＡ配列、ＬｙｓＳ遺伝子から５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間のＤＮＡ配列、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列の合計３種類のデータベース
Ｑｕｅｒｙ：前記（６）で取得したＤＮＡ配列
【0061】
（８）皮膚由来検体の同定結果
皮膚表面の組織から採取した検体について、スタフィロコッカス属細菌のＢｌａｓｔ検索を行った結果を表２に示す。
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のデータベースに対するＢｌａｓｔ検索において、１番目にヒットしたスタフィロコッカス属の細菌の株のＤＮＡ配列の類似性は９９％から１００％であった。また、２番目にヒットした株のＤＮＡ配列の類似性は９８％から９９％であった。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列類似性が既知のスタフィロコッカスの細菌と９９％以上であったことから、皮膚検体から取得したＤＮＡ配列は何れもスタフィロコッカス属の細菌由来であることが確認できた。一方、１番目と２番目にヒットした株のＤＮＡ配列の類似性の差がごく僅かであったため、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較のみでは、種の同定には至らない結果であった。
ＬｙｓＳ遺伝子のデータベースに対するＢｌａｓｔ検索において、最上位にヒットしたスタフィロコッカス属の細菌の株のＤＮＡ配列の類似性は９４％から９９％であった。また、２番目にヒットした株のＤＮＡ配列の類似性は８２％から８９％であった。
１番目と２番目にヒットした株のＤＮＡ配列の類似性の差は７％から１４％であった。このことから、２番目にヒットした株の種で無い事が推測され、１番目にヒットした株の種がＢｌａｓｔ検索にかけたＤＮＡ配列の由来種であることが確認できた。
ＬｙｓＳ遺伝子と５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の間のＤＮＡ配列のデータベースに対するＢｌａｓｔ検索においてもＬｙｓＳ遺伝子のデータベースに対するＢｌａｓｔ検索と同様の結果であった。
皮膚表面の組織から採取した検体は、Ｂｌａｓｔ検索で１番目にヒットした株の種と高い相同性を示しており、１番目にヒットした株の種が検体の細菌であることが種レベルで確認することができた。
皮膚表面の組織から採取した検体について、スタフィロコッカス属細菌のＢｌａｓｔ検索を行った結果を表２に示す。
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のデータベースに対するＢｌａｓｔ検索において、１番目にヒットしたスタフィロコッカス属の細菌の株のＤＮＡ配列の類似性は９９％から１００％であった。また、２番目にヒットした株のＤＮＡ配列の類似性は９８％から９９％であった。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列類似性が既知のスタフィロコッカスの細菌と９９％以上であったことから、皮膚検体から取得したＤＮＡ配列は何れもスタフィロコッカス属の細菌由来であることが確認できた。一方、１番目と２番目にヒットした株のＤＮＡ配列の類似性の差がごく僅かであったため、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較のみでは、種の同定には至らない結果であった。
ＬｙｓＳ遺伝子のデータベースに対するＢｌａｓｔ検索において、最上位にヒットしたスタフィロコッカス属の細菌の株のＤＮＡ配列の類似性は９４％から９９％であった。また、２番目にヒットした株のＤＮＡ配列の類似性は８２％から８９％であった。
１番目と２番目にヒットした株のＤＮＡ配列の類似性の差は７％から１４％であった。このことから、２番目にヒットした株の種で無い事が推測され、１番目にヒットした株の種がＢｌａｓｔ検索にかけたＤＮＡ配列の由来種であることが確認できた。
ＬｙｓＳ遺伝子と５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の間のＤＮＡ配列のデータベースに対するＢｌａｓｔ検索においてもＬｙｓＳ遺伝子のデータベースに対するＢｌａｓｔ検索と同様の結果であった。
皮膚表面の組織から採取した検体は、Ｂｌａｓｔ検索で１番目にヒットした株の種と高い相同性を示しており、１番目にヒットした株の種が検体の細菌であることが種レベルで確認することができた。
【0062】
表２ 皮膚由来の細菌ＤＮＡ配列を用いたＢｌａｓｔ検索の結果
【表2】
【産業上の利用可能性】
【0063】
以上説明したように、本発明によれば、従来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定法と同様の煩雑さで、これまで困難であったスタフィロコッカス属内の菌種を種レベルで簡易に迅速に検出・同定が可能になる。したがって、本発明は、食品の衛生検査や感染症患者の検査、美容分野の産業利用に供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【0064】
配列番号：１は、スタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを増幅するフォワードプライマーの配列である。
配列番号：２は、スタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを増幅するリバースプライマーの配列である。
配列番号：３は、実施例で用いたＤＮＡシークエンシングのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：４は、実施例で用いたＤＮＡシークエンシングのリバースプライマーの配列である。
配列番号：２は、スタフィロコッカス属細菌のＬｙｓＳ遺伝子から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子までのゲノムＤＮＡを増幅するリバースプライマーの配列である。
配列番号：３は、実施例で用いたＤＮＡシークエンシングのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：４は、実施例で用いたＤＮＡシークエンシングのリバースプライマーの配列である。
【図1】
【配列表】