特許 7553465 装置、システム及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-09

(45)【発行日】2024-09-18

(54)【発明の名称】装置、システム及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20240910BHJP

   C12Q 1/6823 20180101ALI20240910BHJP

   C12Q 1/6825 20180101ALI20240910BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20240910BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C12Q1/6823 Z

C12Q1/6825 Z

C12Q1/6844 Z

【請求項の数】 24

(21)【出願番号】P 2021560167

(86)(22)【出願日】2020-03-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-20

(86)【国際出願番号】 GB2020050809

(87)【国際公開番号】W WO2020193980

(87)【国際公開日】2020-10-01

【審査請求日】2023-03-01

(31)【優先権主張番号】1904191.2

(32)【優先日】2019-03-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】521438803

【氏名又は名称】ナノベリー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(74)【代理人】

【識別番号】100165157

【弁理士】

【氏名又は名称】芝 哲央

(74)【代理人】

【識別番号】100205659

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 拓也

(74)【代理人】

【識別番号】100126000

【弁理士】

【氏名又は名称】岩池 満

(74)【代理人】

【識別番号】100185269

【弁理士】

【氏名又は名称】小菅 一弘

(72)【発明者】

【氏名】コジラ ジャージー

(72)【発明者】

【氏名】リー ムン チン

【審査官】吉門 沙央里

(56)【参考文献】

【文献】特開２００６－０６７９１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１２－５０６７１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００２－５０５８４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５３３２９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】E.M.Linardy, et al.，Biosensors and Bioelectronics ，2016年，Vol.75，p.59-66

【文献】E.Xiong et al.，Analyst，2019年，Vol.144，p.634-640

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００－３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

バイオマーカーを検出するための複数のＤＮＡ形成物の集合であって、前記複数の形成物は、
標的バイオマーカーを受け入れてこれにより競合的なハイブリダイゼーションによってトリガＤＮＡ配列を放出するように適合されたディテクタと、
前記トリガＤＮＡ配列とハイブリダイズし、これによりキーＤＮＡ配列及び前記トリガＤＮＡ配列又はさらなるトリガＤＮＡ配列を放出するように適合されたアンプリファイアであって、放出が競合的なハイブリダイゼーションにより、と、
前記キーＤＮＡ配列とハイブリダイズし、これにより観察者が検出可能な信号を生成するように適合されたレスポンダと
を含む複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項2】

競合的なハイブリダイゼーションが、トーホールドを介した鎖置換又はトーホールド交換である、請求項１に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項3】

前記複数の形成物のうちの２つ以上が共通の本体に取り付けられている請求項１又は２に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項4】

前記共通の本体が、ＤＮＡ形成物、ナノ粒子又は基板である請求項３に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項5】

前記複数の形成物のうちの２つ以上が所定の配置で前記共通の本体に取り付けられている請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項6】

前記ディテクタが、標的ＤＮＡ配列を受け入れ、これによりトリガＤＮＡ配列を放出するように適合されている請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項7】

前記標的ＤＮＡ配列が循環腫瘍ＤＮＡである請求項６に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項8】

前記ディテクタが、複数のバイオマーカーとハイブリダイゼーションし、これにより１つ以上のトリガＤＮＡ配列を放出するように適合されている請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項9】

前記ディテクタが、ＤＮＡ本体に取り付けられた、標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズしてトリガＤＮＡ配列を放出するように適合されている１種以上のプローブＤＮＡ配列を含む請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項10】

干渉するＤＮＡ配列とハイブリダイズし、これにより非干渉性ＤＮＡ配列を放出するように適合されたブロッカーをさらに含む請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項11】

前記干渉するＤＮＡ配列がセルフリーＤＮＡである請求項１０に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項12】

前記アンプリファイアが複数のアンプリファイアサブユニットを含み、各アンプリファイアサブユニットが、トリガＤＮＡ配列とハイブリダイズし、キーＤＮＡ配列及び前記トリガＤＮＡ配列又はさらなるトリガＤＮＡ配列を放出するように適合されている請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項13】

前記アンプリファイアが、トリガＤＮＡ配列とハイブリダイズするように適合された１種以上のアンプリファイアＤＮＡ配列の１つ以上のインスタンスと、キーＤＮＡ配列を放出するように適合されたキーホルダーＤＮＡ配列の１つ以上のインスタンスとを含む請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項14】

第１のアンプリファイアＤＮＡ配列が、前記トリガＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションによって立体構造を変化させるように適合されている請求項１３に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項15】

第２のアンプリファイアＤＮＡ配列が、前記第１のアンプリファイアＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションによって立体構造を変化させ、これにより前記トリガＤＮＡ配列を放出するように適合されている請求項１４に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項16】

前記キーホルダーＤＮＡ配列が、前記キーＤＮＡ配列にハイブリダイズし、かつ前記アンプリファイアＤＮＡ配列又はその一部とハイブリダイズし、これにより前記キーＤＮＡ配列を放出するように適合されている請求項１３から請求項１５のいずれか１項に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項17】

前記アンプリファイアが、異なる種のキーＤＮＡ配列を放出するための複数の増幅経路を含む請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項18】

前記レスポンダが、第１の構成でレポーターを囲み、第２の構成で前記レポーターを放出するように少なくとも部分的に適合されたＤＮＡ捕捉形成物を含む請求項１から請求項１７のいずれか１項に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項19】

前記レポーターがプロモーター部分を有するレポーター遺伝子であり、前記ＤＮＡ捕捉形成物が、前記第１の構成において前記プロモーター部分を囲むように少なくとも部分的に適合されている請求項１８に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項20】

前記ＤＮＡ捕捉形成物が、少なくとも１つのキーＤＮＡ配列と前記ＤＮＡ形成物の少なくとも１つのロックＤＮＡ配列部分とのハイブリダイゼーションにより、前記第１の構成から第２の構成に変化するように適合されている請求項１８又は請求項１９に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合。

【請求項21】

標的バイオマーカーの検出方法であって、請求項１から請求項２０のいずれか１項に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合を、体液に導入する工程を含む方法。

【請求項22】

標的バイオマーカーの検出方法であって、
標的バイオマーカーをプローブにハイブリダイズさせて、競合的なハイブリダイゼーションによりトリガＤＮＡ配列を放出させる工程と、
前記トリガＤＮＡ配列をアンプリファイアＤＮＡ配列にハイブリダイズさせて、これにより前記アンプリファイアＤＮＡ配列の１つ以上の立体構造変化を引き起こし、キーＤＮＡ配列を放出し、前記トリガＤＮＡ配列又は別のトリガＤＮＡ配列を放出する工程であって、放出が競合的なハイブリダイゼーションによる工程と、
前記キーＤＮＡ配列をＤＮＡ捕捉形成物のロックＤＮＡ配列部分にハイブリダイズさせ、これにより観察者が検出可能な信号を生成させる工程と
を含む方法。

【請求項23】

前記プローブ、前記アンプリファイアＤＮＡ配列の少なくとも一部、及び／又はＤＮＡ捕捉形成物が、共通の本体上に並置されている請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

実行されたときに、請求項１から請求項２０のいずれか１項に記載の複数のＤＮＡ形成物の集合のシミュレーションを生成するように適合されたソフトウェアコードを含むコンピュータプログラム製品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＤＮＡナノ構造体、及びＤＮＡナノ構造体の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

循環腫瘍デオキシリボ核酸（ｃｔＤＮＡ）は、血液中を循環しているＤＮＡであり、腫瘍及びその進行状態に特異的であり、またそれを示すものである。これにより、患者から生検を採取するという負担なく、腫瘍の状態に関する貴重な情報を得ることができる一方で、血液試料中のｃｔＤＮＡには、複雑な試料の中で分析対象が少ないという問題がある。血液試料には、腫瘍とは関係のないＤＮＡ、すなわち無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）も含まれているため、ｃｔＤＮＡとこのようなｃｆＤＮＡを区別することも必要である。微量のＤＮＡを高い特異性及び高い感度で検出するために、新しいアプローチが求められている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

第１の態様によれば、バイオマーカーを検出するための複数のＤＮＡ形成物の集合（ＤＮＡ群）であって、この形成物は、標的バイオマーカーを受け入れてこれによりトリガＤＮＡ配列を放出するように適合されたディテクタ（検出要素）と、このトリガＤＮＡ配列とハイブリダイズし、これによりキーＤＮＡ配列及び上記トリガＤＮＡ配列又はさらなるトリガＤＮＡ配列を放出するように適合されたアンプリファイア（増幅要素）と、このキーＤＮＡ配列とハイブリダイズし、これにより観察者が検出可能な信号を生成するように適合されたレスポンダ（応答要素）とを含む複数のＤＮＡ形成物の集合（ＤＮＡ群）が提供される。

【0004】

検出のための経路を形成するＤＮＡ配列の集合により、経路の機能を正確に設計し制御することができる。検出、増幅及び応答を組み合わせることで、非常に高感度な検出が可能になる。

【0005】

好ましくは、上記形成物のうちの２つ以上が共通の本体に取り付けられている。このように形成物を並置することで、形成物間の効率的な相互作用を可能にすることができる。好ましくは、上記ディテクタ、上記アンプリファイアの少なくとも一部、及び上記レスポンダが、共通の本体に取り付けられている。上記形成物は、テザー又はアンカーを介して共通の本体に取り付けられてもよい。このテザーは、異なるＤＮＡ形成物が互いに接近することができるように適合されていてもよい。あるいは、上記ＤＮＡ形成物は、ＤＮＡ形成物のアンカー部分で共通の本体に取り付けてもよい。

【0006】

汎用性のため、並びに精密な設計及び組み立てを可能にするために、上記共通の本体はＤＮＡ形成物であってもよい。簡単にするために、上記共通の本体はナノ粒子であってもよい。さらなる巨視的な特徴部と統合するために、上記共通の本体は基板であってもよい。

【0007】

相互作用を制御するために、上記形成物のうちの２つ以上が所定の配置で共通の本体に取り付けられてもよい。例えば、ディテクタとレスポンダの間にアンプリファイアが配置されてもよい。

【0008】

上記ディテクタは、標的ＤＮＡ配列を受け入れ、これによりトリガＤＮＡ配列を放出するように適合されてもよい。バイオマーカーとしての標的ＤＮＡ配列の検出は、非常に選択的な検出を可能にし、高い特異性を提供することができる。標的ＤＮＡ配列は、循環腫瘍ＤＮＡであってもよい。上記ディテクタは、標的ＲＮＡ配列（好ましくは循環腫瘍ＲＮＡ）を受け入れ、これによりトリガＤＮＡ配列を放出するように適合されていてもよい。上記ディテクタは、標的タンパク質（好ましくは循環腫瘍タンパク質）を受け入れ、これによりトリガＤＮＡ配列を放出するように適合されていてもよい。

【0009】

より特異性を高めるために、上記ディテクタが、複数のバイオマーカーとハイブリダイズして、これにより１種以上のトリガＤＮＡ配列を放出するように適合されていてもよい。

【0010】

好ましくは、上記ディテクタは、ＤＮＡ本体に（好ましくは所定の配置で、任意にテザーを用いて）取り付けられ、標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズしてトリガＤＮＡ配列を放出するように適合された１種以上のプローブＤＮＡ配列を含む。

【0011】

上記プローブＤＮＡ配列は、競合的なハイブリダイゼーションによって、好ましくはトーホールドを介した鎖置換によって、又はトーホールド交換によって、標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズし、トリガＤＮＡ配列を放出するように構成されていてもよい。好ましくは、このプローブＤＮＡ配列は、トリガＤＮＡ配列にハイブリダイズし、そして標的ＤＮＡ配列と優先的にハイブリダイズし、これによりトリガＤＮＡ配列を放出するように適合されている。

【0012】

より高い特異性及びより少ない偽陽性のために、当該複数のＤＮＡ形成物の集合は、干渉するＤＮＡ配列とハイブリダイズし、任意にこれにより非干渉性ＤＮＡ配列を放出するように適合されたブロッカーをさらに含んでもよい。干渉するＤＮＡ配列は、好ましくは無細胞ＤＮＡである。ブロッカーは、競合的なハイブリダイゼーション、好ましくはトーホールドを介した鎖置換、又はトーホールド交換によって、干渉するＤＮＡ配列とハイブリダイズし、任意に非相互作用性ＤＮＡ配列を放出するように構成されたブロッカーＤＮＡ配列であってもよい。

【0013】

好ましくは、上記アンプリファイアは複数のアンプリファイアサブユニットを含み、各アンプリファイアサブユニットは、トリガＤＮＡ配列とハイブリダイズし、キーＤＮＡ配列及びトリガＤＮＡ配列又はさらなるトリガＤＮＡ配列を放出するように適合されている。このさらなるトリガＤＮＡ配列は、好ましくは、トリガＤＮＡ配列と同じＤＮＡ配列を有する。上記複数のアンプリファイアサブユニットは、好ましくは、互いに機能的に同一であり、好ましくは、同じキーＤＮＡ配列のコピーを放出する。複数の第１のアンプリファイアサブユニットは、第１のキーＤＮＡ配列を放出するように適合されていてもよく、複数の第２のアンプリファイアサブユニットは、第２のキーＤＮＡ配列を放出するように適合されていてもよい。

【0014】

上記アンプリファイアは、トリガＤＮＡ配列とハイブリダイズするように適合された（任意に、共通の本体、好ましくはＤＮＡ本体に、好ましくは所定の配置で、任意にテザーを介して固定されている）１種以上のアンプリファイアＤＮＡ配列の１つ以上のインスタンス（個物）と、キーＤＮＡ配列を放出するように適合された（任意に、共通の本体、好ましくはＤＮＡ本体に、好ましくは所定の配置で、任意にテザーを介して固定されている）キーホルダーＤＮＡ配列の１つ以上のインスタンスとを含んでもよい。

【0015】

第１のアンプリファイアＤＮＡ配列は、トリガＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションによって立体構造を変化させるように適合されていてもよい。第２のアンプリファイアＤＮＡ配列は、第１のＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションによって立体構造（コンフォメーション）を変化させ、これによりトリガＤＮＡ配列を放出するように適合されてもよい。第１のアンプリファイアＤＮＡ配列は、競合的なハイブリダイゼーション（好ましくは、トーホールドを介した鎖置換若しくはトーホールド交換による）並びに／又は１つ以上の立体構造変化（好ましくは、第１のアンプリファイアＤＮＡ配列の立体構造変化及び第２のアンプリファイアＤＮＡ配列の立体構造変化による）によって、第２のアンプリファイアＤＮＡ配列とハイブリダイズし、トリガＤＮＡ配列を放出するように構成されてもよい。

【0016】

キーホルダーＤＮＡ配列は、キーＤＮＡ配列にハイブリダイズしてもよい。キーホルダーＤＮＡ配列は、好ましくは競合的なハイブリダイゼーション（好ましくは、トーホールドを介した鎖置換若しくはトーホールド交換による）及び／又は立体構造変化（好ましくは、１つ以上のアンプリファイアＤＮＡ配列の立体構造変化による）によって、アンプリファイアＤＮＡ配列又はその一部と優先的にハイブリダイズし、これによりキーＤＮＡ配列を放出するように適合されてもよい。

【0017】

堅牢性のため及び偽陽性の回避のために、上記アンプリファイアは、異なる種のキーＤＮＡ配列を放出するための複数の増幅経路を含んでいてもよい。複数の第１のアンプリファイアサブユニットは、第１のキーＤＮＡ配列を放出するように適合されていてもよく、複数の第２のアンプリファイアサブユニットは、第２のキーＤＮＡ配列を放出するように適合されていてもよい。フィードフォワードループによる高い増幅のために、複数の増幅経路が互いに増幅するように適合されてもよい。

【0018】

好ましくは、上記レスポンダは、少なくとも部分的に、第１の構成でレポーターを囲み、第２の構成でレポーターを放出するように適合されたＤＮＡ捕捉形成物を含む。これにより、条件付き放出を可能にすることができる。

【0019】

観察者が検出可能な信号の生成を容易にするために、上記レポーターは、プロモーター部分を有するレポーター遺伝子であってもよく、上記ＤＮＡ捕捉形成物は、第１の構成においてプロモーター部分を囲むように少なくとも部分的に適合されていてもよい。

【0020】

上記ＤＮＡ捕捉形成物は、少なくとも１つのキーＤＮＡ配列とＤＮＡ捕捉形成物の少なくとも１つのロックＤＮＡ配列部分とのハイブリダイゼーションにより、第１の構成から第２の構成へと変化するように適合されてもよい。このロックＤＮＡ配列は、競合的なハイブリダイゼーションによって（好ましくは、トーホールドを介した鎖置換又はトーホールド交換によって）キーＤＮＡ配列とハイブリダイズするように構成されてもよい。

【0021】

別の態様によれば、標的バイオマーカーの検出方法であって、先行する請求項のいずれかに記載の複数のＤＮＡ形成物の集合を、体液、好ましくは血液の試料に、好ましくはインビトロで導入する工程を含む方法が提供される。

【0022】

別の態様によれば、標的バイオマーカーの検出方法であって、標的バイオマーカーをプローブにハイブリダイズさせて、これによりトリガＤＮＡ配列を放出させる工程と、このトリガＤＮＡ配列をアンプリファイアＤＮＡ配列にハイブリダイズさせて、これによりこのアンプリファイアＤＮＡ配列に１つ以上の立体構造変化を引き起こし、キーＤＮＡ配列を放出し、（任意に、上記アンプリファイアＤＮＡ配列にハイブリダイズするように適合された第２のアンプリファイアＤＮＡ配列によって）上記トリガＤＮＡ配列又は別のトリガＤＮＡ配列を放出する工程と、上記キーＤＮＡ配列をＤＮＡ捕捉形成物のロックＤＮＡ配列部分にハイブリダイズさせ、これにより（任意に、レポーターを放出するために上記ＤＮＡ捕捉形成物の構成を変化させることにより）観察者が検出可能な信号を生成させる工程とを含む方法が提供される。

【0023】

上記アンプリファイアＤＮＡ配列は、トリガＤＮＡ配列とハイブリダイズするように適合された１種以上のアンプリファイアＤＮＡ配列の１つ以上のインスタンスと、キーＤＮＡ配列を放出するように適合されたキーホルダーＤＮＡ配列の１つ以上のインスタンスを含んでいてもよい。

【0024】

プローブ、アンプリファイアＤＮＡ配列及び／又はＤＮＡ捕捉形成物は、上述の通りであってよい。当該方法は、上述のような複数のＤＮＡ形成物の集合を使用してもよい。

【0025】

プローブ、アンプリファイアＤＮＡ配列、及び／又はＤＮＡ捕捉形成物は、共通の本体、好ましくはＤＮＡ構造体上に並置されてもよい。

【0026】

当該方法は、上記ＤＮＡ構造体を、体液、好ましくは血液の試料に、好ましくはインビトロで導入することをさらに含んでもよい。

【0027】

別の態様によれば、実行されたときに、上述のような複数のＤＮＡ形成物の集合のシミュレーションを生成するように適合されたソフトウェアコードを含むコンピュータプログラム製品が提供される。

【0028】

別の態様によれば、上述の複数のＤＮＡ形成物の集合の製造方法であって、上記複数のＤＮＡ形成物の集合をシミュレーションする工程と、そのシミュレーションに基づいて、上記ＤＮＡ形成物のためのＤＮＡ配列を決定する工程と、これにより決定されたＤＮＡ配列に基づいて、複数のＤＮＡ形成物の集合を製造する工程とを含む方法が提供される。

【0029】

本明細書で使用される場合、用語「ＤＮＡ配列」及び「ＤＮＡ鎖」は、好ましくは交換可能であり、好ましくは、所定の配列を有するＤＮＡ鎖を指す。

【0030】

本明細書で使用する場合、用語「増幅」は、好ましくは、ある数の入力種のインスタンスを入力した結果、より多数の出力種のインスタンスが放出されるプロセスを指す。「アンプリファイア」は、好ましくは、ある数の入力種のインスタンスを受け入れ、その結果、より多数の出力種のインスタンスを放出するように適合された機能的ユニットを指す。

【0031】

本明細書で使用する場合、用語「複数のＤＮＡ形成物の集合」は、共通の溶液中にある、共通の基板に取り付けられている、又は共通の本体に取り付けられている複数のＤＮＡ形成物を指すことが好ましい。本明細書で使用する場合、用語「ＤＮＡ形成物」は、好ましくは特定の配列を有する及び／又は特定の構造を形成するＤＮＡ鎖を指す。そのようなＤＮＡ鎖は、それにハイブリダイズした更なるＤＮＡ鎖を有していても、有していなくてもよい。そのようなＤＮＡ鎖は、異なる可能な立体構造の１つの状態にあってもよい。

【0032】

本発明は、添付の図面を参照しながら本明細書で実質的に説明される方法及び／又は装置に及ぶ。

【0033】

別の態様によれば、本明細書に記載された方法のいずれかを実施するための、及び／又は本明細書に記載された装置の特徴のいずれかを具現化するための、コンピュータプログラム並びにコンピュータプログラム製品が提供される。別の態様によれば、本明細書に記載された方法のいずれかを実施するための、及び／又は本明細書に記載された装置の特徴のいずれかを具現化するためのプログラムを格納した非一時的なコンピュータ可読媒体が提供される。別の態様によれば、本明細書に記載された任意の方法を実施するためのソフトウェアコードを含むコンピュータプログラム製品が提供される。ハードウェアに実装されている特徴は、一般的にソフトウェアに実装されていてもよく、その逆もまた然りである。本明細書において、ソフトウェアの特徴及びハードウェアの特徴に関するあらゆる言及は、それに応じて解釈されるべきである。

【0034】

本発明は、本明細書に記載された方法のいずれかを実施するための、及び／又は、本明細書に記載された装置の特徴のいずれかを具現化するためのコンピュータプログラムを具現化した信号、そのような信号を送信する方法、並びに、本明細書に記載された方法のいずれかを実施するための、及び／又は本明細書に記載された装置の特徴のいずれかを具現化するためのコンピュータプログラムをサポートするオペレーティングシステムを有するコンピュータ製品も提供する。

【0035】

本明細書に記載されているような任意の装置の特徴は、方法の特徴としても提供されてよく、その逆もまた然りである。

【0036】

本発明の一態様における任意の特徴は、任意の適切な組み合わせで、本発明の他の態様に適用されてもよい。特に、方法の態様は、装置の態様に適用されてもよく、その逆もまた然りである。さらには、１つの態様におけるいずれかの、いくつかの及び／又はすべての特徴は、任意の適切な組み合わせで、任意の他の態様におけるいずれかの、いくつかの及び／又はすべての特徴に適用することができる。

【0037】

また、本発明のいずれかの態様で説明され、定義された様々な特徴の特定の組み合わせは、独立して実装及び／又は供給及び／又は使用することができることを理解すべきである。

【0038】

本明細書で使用する場合、ミーンズ・プラス・ファンクションの特徴は、適切にプログラムされたプロセッサ及び関連するメモリ等、対応する構造の観点から代替的に表現されてもよい。

【0039】

本発明のこれら及び他の態様は、以下の図を参照して説明される以下の例示的な実施形態から明らかになるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】図１は、ＤＮＡナノデバイスの模式図である。

【図2a】図２ａは、異なる状態にあるＤＮＡナノデバイスのディテクタ部分の図である。

【図2b】図２ｂは、異なる状態にあるＤＮＡナノデバイスのディテクタ部分の図である。

【図2c】図２ｃは、異なる状態にあるＤＮＡナノデバイスのディテクタ部分の図である。

【図3a】図３ａは、異なる状態にあるＤＮＡナノデバイスのアンプリファイア部分の図である。

【図3b】図３ｂは、異なる状態にあるＤＮＡナノデバイスのアンプリファイア部分の図である。

【図3c】図３ｃは、異なる状態にあるＤＮＡナノデバイスのアンプリファイア部分の図である。

【図3d】図３ｄは、異なる状態にあるＤＮＡナノデバイスのアンプリファイア部分の図である。

【図4a】図４ａは、異なる状態にあるＤＮＡナノデバイスのレスポンダ部分の図である。

【図4b】図４ｂは、異なる状態にあるＤＮＡナノデバイスのレスポンダ部分の図である。

【図5a】図５ａは、異なる状態にあるＤＮＡナノデバイスの代替のアンプリファイア部分の図である。

【図5b】図５ｂは、異なる状態にあるＤＮＡナノデバイスの代替のアンプリファイア部分の図である。

【図5c】図５ｃは、異なる状態にあるＤＮＡナノデバイスの代替のアンプリファイア部分の図である。

【図5d】図５ｄは、異なる状態にあるＤＮＡナノデバイスの代替のアンプリファイア部分の図である。

【図6】図６は、ＤＮＡナノデバイスの別の代替のアンプリファイア部分の図である。

【図7】図７は、ブロッキング部分を有するＤＮＡナノデバイスの図である。

【図8】図８は、ＤＮＡナノデバイスのブロッキング部分の図である。

【図9】図９は、ＤＮＡナノデバイスの生成方法の一例を示す。

【発明を実施するための形態】

【0041】

図１は、ＤＮＡナノデバイス２（ナノロボットともいう）を示す。ＤＮＡナノデバイス２は、血液試料を用いて、癌の早期発見を可能にするために設計されている。このＤＮＡナノデバイスは、ともに血液中に存在する循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）１８及び無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を区別するのに十分な感度を有しており、ｃｔＤＮＡ標的フラグメント１８は、ｃｆＤＮＡと比較して、単に１つの点変異１９を有しているだけであってもよい。ｃｔＤＮＡが検出されると、ＤＮＡナノデバイスは、ユーザーが観察可能な信号（例えば、蛍光信号）を引き起こし、これによって臨床医に診断のための迅速な応答を与える。このＤＮＡナノデバイスは、腫瘍細胞に由来する特定の遺伝子変異を識別するため、疾患の種類やステージを知らせることができる。

【0042】

ＤＮＡナノデバイス２は、オリゴヌクレオチド、つまり短い一本鎖のＤＮＡ分子、を用いて、この分野で周知の自己組織化プロセスによって形成されている。

【0043】

ＤＮＡナノデバイス２は、より大きな共通のＤＮＡ構造体（図示の例では矩形体３）に固定（繋留）された多数の機能的ＤＮＡ形成物を含む。機能的ＤＮＡ形成物は、いくつかの例では１０～９０塩基対の長さであることができるが、同様に長く（又は短く）てもよく、例えば１００塩基対の長さ、２５０塩基対の長さ、３００塩基対の長さ、４００塩基対の長さ、又はこれより長くてもよい。

【0044】

図では、機能的ＤＮＡ形成物を構成するＤＮＡ鎖を線で示し、ＤＮＡ鎖の３’末端をフックで示し、本体３に対するＤＮＡ形成物のアンカーポイントを図１の凡例に示した記号で示している。標的となるｃｆＤＮＡ鎖上の点変異の位置は、図１の凡例に示した記号で示されている。ＤＮＡ鎖をより詳細に示す図では、ドメインとも呼ばれるＤＮＡ塩基のグループは、ａ、ｂ、ｃ等の小文字で表されている。星印の付いた文字は、相補的なドメインを示しており、例えば、ドメインａ^＊はドメインａと相補的である。相補的なドメインどうしのハイブリダイゼーションは、図中で相補的なドメイン間の接続線の配列によって示されている。ドメインは、ＤＮＡ鎖の挙動や相互作用を理解するための概念である。ドメイン内のＤＮＡ塩基の配列は、（例えば、特定の標的のために）決められていてもよいし、ＤＮＡ鎖の挙動（例えば、ヘアピンループを形成する傾向）を設計するために選択されてもよい。一例では、ドメインは５～５０塩基対の長さ、例えば１０塩基対の長さ、１５塩基対の長さ、２０塩基対の長さ、２５塩基対の長さ、３０塩基対の長さ、又は４０塩基対の長さであることができる。同じ鎖上にある異なるドメインは、異なる長さを有してもよい。

【0045】

ナノデバイス２の本体３には、例えば管状、不定形、あるいは図示のようなＤＮＡシート等、多種多様な二次元及び三次元の形状や形態を用いることができる。ＤＮＡナノデバイス２は、環境（試料を含む）と相互作用するように、及び相互に作用するように設計された多数の機能的形成物を含む。機能的形成物は、適切な位置で本体３に固定されている。これにより、互いに相互作用するように意図された機能的特徴部の並置を可能にし、その相互作用を促進することができる。ＤＮＡは、機能的特徴部を互いに相対的に特定の位置に高度に制御可能に固定することを可能にすることができるので、本体３にとって特に有利な材料である。この機能的形成物は、放出されたり、交換されたり、他の部分を受け入れたりすることができる部分を含む。これにより、機能的特徴部を環境と相互作用させ、及び相互に作用させることができる。並置と、異なる機能を実行する形成物を組み込む能力とにより、観察可能な信号をもたらす分子イベントを、ＤＮＡナノデバイス２の性能を最適化するように設計することができる。

【0046】

図１に示されたＤＮＡナノデバイス２は、３つの機能的部分又はモジュールを含む。
・ディテクタ４、
・アンプリファイア６、及び
・レスポンダ８

【0047】

各モジュールは特定の機能を果たし、それらが相互に作用することで、意図された検出及び信号伝達を行う。

【0048】

機能的ＤＮＡ形成物は、競合的なハイブリダイゼーションの原理に基づいて相互に作用し、特にトーホールドを介した鎖置換及びトーホールド交換によって、自発的にお互いを受け入れたり放出したりする。機能的ＤＮＡ形成物の中の一部は、双安定構成を持つ部分を含み、お互いの相互作用に応じて構成を変えることができる（これは、分子論理とも呼ばれる）。

【0049】

ディテクタモジュール４及びアンプリファイアモジュール６は、トーホールドを介した鎖置換、トーホールド交換、分子論理ゲート（１つ以上の物理的又は化学的な入力及び１つの出力に基づいて論理演算を行う分子）等のＤＮＡコンピューティングの原理に基づいている。

【0050】

レスポンダ８は、ダイナミックなＤＮＡナノテクノロジーの原理（ＤＮＡオリガミ）、及び蛍光信号を生成するための無細胞発現系に基づいている。

【0051】

これより、個々のモジュールとその相互作用について、より詳しく説明する。

【0052】

図２ａ～図２ｃは、異なる動作状態にあるディテクタ４をより詳細に示す。図２ａ及び図２ｂは、標的Ｔへの曝露前及び曝露後のディテクタ４を示し、図２ｃは、ディテクタ４のＤＮＡ鎖をより詳細に示す。

【0053】

ディテクタ４は、プローブＰとして機能するＤＮＡ鎖を含む。プローブＰは、アンカーポイント１２でＤＮＡナノデバイス２の本体３に固定されている（図では、全般的に、アンカーポイントは図１の凡例に示されているような記号で示されている）。図２ａのプローブＰは、標的Ｔ（検出すべきｃｔＤＮＡ配列）に曝露される前の状態を示している。初期構成では、「トリガ」ＤＮＡ鎖又は「トリガ」ＤＮＡ配列とも呼ばれる出力鎖Ｏがプローブ鎖Ｐに（部分的に）ハイブリダイズしている。

【0054】

図２ｂでは、標的Ｔが、トーホールドを介した鎖置換により、出力Ｏを置換している。標的ＴはプローブＰにハイブリダイズし、出力Ｏは放出（解放）される。

【0055】

使用時には、標的ＤＮＡ鎖ＴはプローブＰのトーホールド領域に付着し、出力鎖Ｏを凌駕して出力鎖ＯをプローブＰから置換する（追い出す）。

【0056】

プローブＰ及び出力Ｏは、プローブＰが標的ＴのｃｔＤＮＡ（癌の突然変異を持つ）とｃｆＤＮＡとを区別できるように設計されている。プローブＰは標的Ｔに相補的であり、出力ＯはｃｆＤＮＡよりもプローブへの親和性が高いが、標的Ｔよりも相補性が低い。

【0057】

出力Ｏは、下流のモジュールであるアンプリファイア６をトリガする。

【0058】

図３ａ、図３ｂ、図３ｃ及び図３ｄは、異なる動作状態にあるアンプリファイア６のサブユニットをより詳細に示す。

【0059】

図示されたアンプリファイア６サブユニットは、アンプリファイアＡ１及びＡ２として機能する２つの鎖と、キーホルダーＨとして機能する第３の鎖の、３つのＤＮＡ鎖を含む。アンプリファイアＡ１、Ａ２及びキーホルダーＨの両方は、アンカーポイント１２で本体３に取り付けられたテザー１３を介して、ＤＮＡナノデバイス２の本体３に繋がれている（テザーで接続されている）。

【0060】

図３ａでは、アンプリファイア６サブユニットが、出力Ｏに曝露される前の初期構成で示されている。初期構成では、キーＤＮＡ鎖ＫがキーホルダーＨにハイブリダイズしている。２つのアンプリファイア鎖Ａ１、Ａ２はそれぞれ、分子論理ゲートを含んでおり、すなわち、それぞれが、状況に応じて開いたり閉じたりすることができるヘアピンループの準安定構成を有している。

【0061】

図３ｂでは、（ディテクタモジュール４からの）出力Ｏに曝露された後のアンプリファイア６サブユニットが示されている。トリガ鎖Ｏは、第１のアンプリファイア鎖Ａ１の論理ゲートの立体構造変化を促進し、すなわちＯがＡ１にハイブリダイズし、これによりＡ１の構成が変化する（ヘアピンループが開く）。

【0062】

図３ｃでは、増幅手順のさらなる段階でのアンプリファイア６サブユニットが示されている。その後、Ａ１の露出した部分がＡ２にハイブリダイズし、その間にＡ２のヘアピンループが開き、Ａ２がＯを置換する。その後、又は同時に、ＨがＡ１にハイブリダイズし、これによりＫが放出される。

【0063】

図３ｄは、第２のアンプリファイア鎖Ａ２及びキーホルダー鎖Ｈの両方が第１のアンプリファイア鎖Ａ１にハイブリダイズし、キーＫ及びトリガ鎖Ｏが解放された状態のアンプリファイア６サブユニットを示す。

【0064】

アンプリファイア６サブユニットの動作の結果、２本の鎖、つまり１本のキー鎖Ｋ及び元のトリガ鎖Ｏが放出される。次いで、トリガ鎖Ｏは別の同様のアンプリファイア６サブユニットにリサイクルされる。放出された出力Ｏは、図３ａに示すように、初期状態のさらなるアンプリファイアサブユニットへと続き、そのサブユニットでの類似した一連の工程により、出力鎖Ｏと同様に、さらなるキーＫ２８が放出される。

【0065】

キーＫは、下流のモジュールであるレスポンダ８を活性化する。

【0066】

触媒的に、単一の入力Ｏを再利用して、複数のアンプリファイアサブユニットから複数のキー鎖Ｋを放出することができる。各アンプリファイア６サブユニットは、出力Ｏを受け取り、キーＫを出力するとともに、さらなる消費のために出力Ｏも出力する。図１に示された例では、３つのアンプリファイア６サブユニットが示されているが（それぞれが２つのアンプリファイア鎖とキーホルダーを含む）、任意の数のサブユニットがアンプリファイア６に含まれてもよい。アンプリファイアサブユニットの数を変化させることで、所望の増幅率、すなわち、各活性化鎖（ディテクタからの出力Ｏ）に対して放出されるキー鎖の数を変化させることができる。ｎ個のアンプリファイアサブユニットを含めることで、ｎ個のキーＫが放出される。最初の１本の出力鎖Ｏは、ｎ個のキー鎖Ｋに増幅される。これは、単一の標的鎖Ｔに対してｎ個のキー鎖Ｋの形で増幅された応答を提供することにより、低濃度の標的ｃｔＤＮＡの検出を可能にする。

【0067】

他の特定の増幅プロセス（一般にヘアピンＤＮＡカスケード増幅として知られる）を使用して、単一のトリガ鎖（ディテクタからの出力鎖Ｏ）から触媒的に複数のキー鎖を生成してもよい。

【0068】

図４ａ及び図４ｂは、異なる動作状態にあるレスポンダ８をより詳細に示す。図４ａは、キーＫに曝露される前のレスポンダ８を示す。

【0069】

図４ａに示す初期構成では、図示されたレスポンダ８は、捕捉ボックスＣと、捕捉ボックスＣによって捕捉されたレポーター遺伝子Ｒとを含む。

【0070】

捕捉ボックスＣは、レポーター遺伝子Ｒを拘束し、囲まれた部分の露出を防止する囲いを形成することができる多数のＤＮＡ鎖を含む。レポーター遺伝子の囲まれた部分はプロモーター配列であるため、レポーター遺伝子Ｒが捕捉ボックスＣから解放されてプロモーター部分が露出する時まで、レポーター遺伝子の発現が阻止される。レポーター遺伝子Ｒは、緑色蛍光タンパク質等の蛍光タンパク質をコードしており、当該技術分野で公知のように、無細胞タンパク質発現によって産生することができる。

【0071】

捕捉ボックスＣは、閉じた構成と開いた構成とを有する双安定なＤＮＡ形成物である。レスポンダ８は、ロックＤＮＡ鎖Ｌを含む。キー鎖Ｋとロック鎖Ｌとのハイブリダイゼーションにより、捕捉ボックスＣは、閉じた構成から開いた構成へと変化する。

【0072】

図４ｂでは、キー鎖Ｋがロック鎖Ｌにハイブリダイズし、捕捉ボックスＣが開状態になり、レポーター遺伝子Ｒが放出されている。

【0073】

放出されたレポーター遺伝子は発現され、発現されたタンパク質の蛍光は、試料中の標的ｃｔＤＮＡの存在を観察者に示すことができる。

【0074】

レスポンダは、それぞれがレポーター遺伝子Ｒを有する捕捉ボックスＣの多数のインスタンスを含んでもよい。各捕捉ボックスＣは、キー配列Ｋの１つによって開かれ、これにより、微量の分析物について観察可能な蛍光信号を生成することができる。

【0075】

図５ａ～図５ｄは、各増幅サブユニットが、アンカーポイント１２でＤＮＡ本体３にともに固定されたアンプリファイア鎖Ａ及びキーホルダー鎖Ｈを含む、別のアンプリファイア６サブユニットを示す。図５ａ～図５ｃは、異なる動作状態にあるアンプリファイア６サブユニットを示し、図５ｄは、アンプリファイア６サブユニットのＤＮＡ鎖をより詳細に示す。

【0076】

図５ａは、出力鎖Ｏのさらなるコピーと中間ＤＮＡ鎖Ｉとの２本のＤＮＡ鎖がアンプリファイアＡに（部分的に）ハイブリダイズしている初期構成を示す。図示された例では、出力鎖Ｏは、ヘアピンループの準安定構成の状態にある。

【0077】

図５ｂでは、出力Ｏは、トーホールドを介した鎖置換により、アンプリファイアＡにハイブリダイズしている。出力Ｏは、アンプリファイアＡのトーホールド領域に付着し、中間体ＩをアンプリファイアＡから追い出すために中間体Ｉを凌駕する。｛中間体Ｉ＋出力Ｏ｝ハイブリッドが解放される。

【0078】

図５ｃでは、中間体Ｉは、トーホールドを介した鎖置換により、キーホルダーＨとハイブリダイズしている。出力ＯはキーＫと同様に放出されている。

【0079】

次の工程では、放出された出力Ｏは、図４ａに示されるような初期状態のさらなるアンプリファイアサブユニットへと続き、出力鎖Ｏは、さらなるアンプリファイアＡにハイブリダイズされ、従って、さらなる｛中間体Ｉ＋出力Ｏ｝ハイブリッドを追い出し、類似した一連の工程により、さらなるキーＫが放出される。

【0080】

図６は、図３ａ～図３ｄを参照して上述したようなアンプリファイアサブユニットの変形例を示す。この変形例では、レスポンダは、操作する（すなわち、レポーターを解放するために構成を閉から開に変える）ために２つのキーＫ１、Ｋ２を必要とする。このアンプリファイアは、右側の経路と左側の経路（検出される最初のｃｔＤＮＡに対応）の２つの経路を含み、各経路に対してプローブＰＲ、ＰＬが適切なトリガＯＲ、ＯＬを提供する。この例では、レスポンダが２つのキーを必要とするため、初期構成でのレスポンダの高い安定性を可能にすることができ、レスポンダの自発的な起動を防止することができ、従って偽陽性の率を低くすることができる。関連する変形例では、単一のプローブＰが２つのトリガ、ＯＲ及びＯＬを持ち、標的ＴがプローブＰにハイブリダイズすると両方が放出される。

【0081】

さらなる変形例では、両方の経路（右及び左）が互いに増幅し、フィードフォワードループを形成するように適合されている。この場合、単一の標的ｃｔＤＮＡ分子の検出が連鎖反応を引き起こすことができ、高感度、及びＤＮＡナノデバイスの応答時間が非常に短くなるという効果が達成される。

【0082】

図７は、上述したＤＮＡナノデバイスの変形例を示す。ＤＮＡナノデバイス５０は、上述したように、ディテクタ４、アンプリファイアモジュール６、及びレスポンダ８を含む。加えて、ＤＮＡナノデバイス５０は、ｃｆＤＮＡ（血液中に自然に存在する）を捕捉し、デバイスの残部と相互作用しない鎖を放出するためのブロッキング部分（又はブロッキングモジュール）４０を含む。ブロッキングモジュール４０は、多数のブロッキングプローブＢを含む。ディテクタ４のプローブＰが標的ｃｔＤＮＡ鎖Ｔと最もよくハイブリダイズするのに対し、ブロッキングプローブＢは、干渉するｃｆＤＮＡ鎖Ｘと最もよくハイブリダイズすることを除いて、ブロッキングプローブＢは、上述したディテクタ４のプローブＰと同様である。

【0083】

図８は、ディテクタ８を参照して上述したようなプローブＰと、ブロッキングプローブＢとをより詳細に示す。ブロッキングプローブＢは、ＤＮＡナノデバイス５０の本体３にアンカーポイントで固定されているＤＮＡ鎖である。初期構成では、非相互作用鎖ＮがブロッキングプローブＢに（部分的に）ハイブリダイズしている。ｃｆＤＮＡ鎖等の干渉鎖Ｘは、ブロッキングプローブＢにハイブリダイズしており、トーホールドを介した鎖置換によって非相互作用鎖Ｎを置換する。ブロッキングプローブＢから解放された非相互作用性鎖Ｎは、ＤＮＡナノデバイス５０の残部とは相互作用しない。ｃｆＤＮＡ等の干渉鎖Ｘを捕捉することにより、ブロッキングプローブ４０は、非標的ＤＮＡ鎖ＸがトリガＤＮＡ配列Ｏの意図しない放出を引き起こすことを防止し、これによりクロストークを低減又は防止し、ディテクタの特異性を高めることができる。

【0084】

ブロッキング部分４０は、図７に例示されているように、同じ種のブロッキングプローブの多数のインスタンスを含んでいてもよく、又はブロッキング部分４０は、多数の異なる種のブロッキングプローブ（各種のブロッキングプローブの１つ以上のインスタンスを有する）を含んでいてもよい。

【0085】

上に例示した例では、設計されたハイブリダイゼーションに参加する機能的ＤＮＡ鎖は、アンカーポイント１２で主ＤＮＡ本体３に直接固定されているか（例えば図２ａに図示）、又は機能的ＤＮＡ鎖をアンカーポイント１２で主本体３に接続するテザー１３を介して繋留されている（例えば図３ａに図示）。変形例では、いくつかの機能的ＤＮＡ鎖は直接固定され、いくつかはテザーを介して繋留される。任意に、いくつかの（又はすべての）機能的ＤＮＡ鎖は、ＤＮＡナノデバイスを囲む自由な溶液中に、テザーなしで提供されてもよい（例えば、アンプリファイアサブユニットの第２のアンプリファイア鎖Ａ２）。直接固定することで、異なる種類の機能的ＤＮＡ鎖の位置及び並置を良好に制御し、それらの相互作用を促進する。テザーで繋ぐこと（テザー接続）は、位置の制御性はより低いが、移動の自由度及び立体構造の変化の自由度がより高く、他の機能的ＤＮＡ鎖との相互作用（ハイブリダイゼーション）が可能であり、機能的ＤＮＡ鎖の露出度が良好になる可能性がある。自由溶液の提供は、十分な利用可能性を確保するために、比較的高い濃度を必要とする場合がある。テザーは、系の他の部分との相互作用を阻止し、ヘアピンループ等の二次構造の形成を阻止するように選択されたＤＮＡ配列であってもよい。テザーは、バイオポリマー（例えばアクチン、リグニン、チューブリン）等のＤＮＡ以外の材料のものであってもよい。テザーの長さは、上述の機能的ＤＮＡ鎖に一定の範囲の動きを与えるように選択されてもよい。

【0086】

変形例では、機能的ユニット（ＤＮＡ鎖）が取り付けられた本体は、上述のＤＮＡ構造体ではなく、別の材料である。例えば、本体は、ナノ粒子（有機物又は無機物）、カーボンナノチューブ、ミセル又はリポソームであってもよい。変形例では、本体は基板（例えばガラス、シリコン、ポリマー、セラミック）であり、この基板は、マイクロ流体デバイス、フローセル、ウェルプレート、キュベット、テストストリップ、又は他のアッセイデバイス等、より大きなデバイスの一部を形成してもよい。異なる機能的ユニットを基板にパターニングするには、フォトリソグラフィーやソフトリソグラフィー等の微細加工技術を用いてもよい。共有結合を形成することで、例えば、機能的ユニットを本体に固定したり、デザー接続したりすることができる。

【0087】

上述のようなＤＮＡナノデバイスの設計には、コンピュータプログラム製品が用いられる。ＤＮＡナノデバイスの設計は多変量の問題であり、適切なＤＮＡナノデバイスを構築するために必要なＤＮＡ鎖の正確な配列は、多くの要因に依存する。この多くの要因には以下のものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
・医療診断又は他の目的で関心のある遺伝子変異又はバイオマーカーによって決まる、目的とする標的ＤＮＡ配列。
・試料環境におけるナノロボット全体の化学的安定性。
・反応速度。
・個々のモジュールの構造、すなわち、所望の感度に必要なプローブ及びアンプリファイアの数、並びにそれらの間の出力／入力の望ましい伝達メカニズム。
・クロストークの最小化：例えば、ディテクタ部分の特異性、ブロッキングプローブの数及び構造、同じＤＮＡナノデバイスの機能的部分や機能的ユニット間のクロストーク、また、異なる標的を検出することを目的とした（共通のＤＮＡナノデバイス上のものであれ、別々のＤＮＡナノデバイス上のものであれ）異なる経路間のクロストーク。例えば、Ｘ型のトリガ（Ｘ型のｃｔＤＮＡを検出することによって放出される）は、Ｘ型のアンプリファイアとのみ相互作用するはずである。Ｘ型のトリガは、他のタイプの変異及びおそらく他のタイプの癌を示すＹ型及びＺ型のアンプリファイアとは相互作用しないはずである。

【0088】

これらの要素を考慮して、ＤＮＡナノデバイスの性能を最適化することができる。機械学習システムが、このような多変量最適化を行い、所望の特性に応じてＤＮＡナノデバイスを設計し、検出すべき癌の変異のプールを与える。

【0089】

ＡＩの訓練データは、シミュレーションデータ、実験データ、又はその両方によって提供することができる。

【0090】

図８は、入力、出力、及び結果として得られるＤＮＡナノデバイス２のセットの一例を示す。ソフトウェア６２は、入力に依存して、ＤＮＡナノデバイス２の性能をシミュレーション６０する。最適にシミュレートされたＤＮＡナノデバイス２に対して、ソフトウェア５０は、ＤＮＡナノデバイスを形成するためのＤＮＡ配列を出力し、潜在的には、特徴的なレイアウト及び／又はさらなる製造情報を出力する。

【0091】

出力によって指定された通りに、ＤＮＡナノデバイス２が生成される。ＤＮＡナノデバイス２の特性がテストされ、シミュレーション６０を検証するためにソフトウェア５０にフィードバックされる。

【0092】

上述の例では、当該ＤＮＡナノデバイスは、血液試料のインビトロ分析のためのものであり、この血液試料は、例えば、血漿成分の分離、ＤＮＡ増幅、試薬の添加、又は他の処理等の準備を受けてもよいことが理解されよう。変形例では、当該ＤＮＡナノデバイスは、リンパ液、脳脊髄液、膵液、胆汁液、尿、唾液、痰、糞便、胸水、羊水、涙液、汗等の別の体液又は排泄物にも同様に使用することができる。変形例では、当該ＤＮＡナノデバイスをインビボ検出に使用することができる。

【0093】

上述の例では、当該ＤＮＡナノデバイスはｃｔＤＮＡの検出用であり、変形例では、当該ＤＮＡナノデバイスは循環腫瘍ＲＮＡの検出に適合している。

【0094】

他の例では、当該ＤＮＡナノデバイスは、循環腫瘍タンパク質、又はα－フェトプロテイン、イオンチャネルタンパク質、若しくは炎症マーカー等の他のバイオマーカーの検出に適合している。この例では、上述のプローブは、バイオマーカーへの曝露時にトリガＤＮＡ配列を放出するように適合されていてもよく、このトリガＤＮＡ配列は、上述のように増幅及び応答を進行させる。一例として、図１を参照して上述したディテクタは、バイオマーカー等の標的分子と結合することができるアプタマーを形成するように（適切な配列を選択することによって）適合されたプローブＤＮＡ配列を含む。アプタマーは、ユニークな３次元構造を持つ一本鎖のオリゴヌクレオチドであり、高い選択性及び特異性で標的（典型的にはリガンド）を結合することができる。アプタマーは、標的分子との結合により、アプタマーの立体構造変化（例えば、アプタマーの二次構造の変化）が生じるように選択される。そして、アプタマーの立体構造変化は、トリガＤＮＡ配列の放出を引き起こし、このトリガＤＮＡ配列は、上述したように増幅と応答を進行させる。別の変形例では、当該ＤＮＡナノデバイスのディテクタモジュールは、図１を参照して説明したプローブＤＮＡ配列ＰとトリガＤＮＡ配列Ｏとのハイブリッドに加えて、標的バイオマーカーと結合するように適合されたアプタマー（任意に、ＤＮＡ本体にテザー接続されている）を含む。初期構成では、アプタマーはプローブＰに結合しない。アプタマーは、標的バイオマーカーの結合時に立体構造を変化させ、従って、プローブＰとハイブリダイズする領域を露出させて、これによりプローブＰからトリガＤＮＡ配列Ｏを放出させるようになっている。その後、トリガＤＮＡ配列は、上述のように増幅及び応答を進行させる。

【0095】

別の例では、当該ＤＮＡナノデバイスは、例えば、法医学的分析において、他の微量ＤＮＡ、ＲＮＡ又は他のバイオマーカーを検出するためのものである。

【0096】

上述の例は、単一のｃｔＤＮＡ標的種を検出するためのＤＮＡナノデバイスに言及しているが、変形例では、ＤＮＡナノデバイスは、それぞれが異なるｃｔＤＮＡ種のための複数のプローブのライブラリを担持する。この複数のプローブはすべて同じ経路を使用してもよいし、各プローブがＤＮＡナノデバイスに収容された異なる経路をトリガしてもよく、プローブの種類に固有の観測可能な信号を生成してもよい。

【0097】

上述の例では、当該ＤＮＡナノデバイスは、蛍光タンパク質の無細胞発現についてのレポーター遺伝子によって応答する。変形例では、他の方法としては、例えば、以下のような他の信号伝達手段が実行されてもよい。
・増幅段階で出力されるキーＫが、適切な蛍光タグからクエンチャーを置換するように適合されている場合の蛍光。
・増幅段階で出力されるキーＫがＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）におけるドナー分子又はアクセプター分子を含むように適合され、レポーター鎖が相補的なＦＲＥＴアクセプター／ドナーを含み、キーＫ鎖を受け入れるように適合されている場合の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）。
・放射性標識、磁気ビーズの装飾、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、金又は銀のナノ粒子の装飾。

【0098】

本発明は、純粋に例示のために上記で説明されており、本発明の範囲内で細部の変更が可能であることが理解されるであろう。

【0099】

請求項に記載されている参照番号は、例示を目的としたものにすぎず、請求項の範囲を限定するものではない。

【0100】

本明細書及び特許請求の範囲で使用される用語「含む」は、好ましくは「少なくとも一部で…からなる」を意味する。

【図1】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図3d】

【図4a】

【図4b】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】