特許 7553924 神経網膜と網膜色素上皮細胞とハイドロゲルとを含む複合体及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-10

(45)【発行日】2024-09-19

(54)【発明の名称】神経網膜と網膜色素上皮細胞とハイドロゲルとを含む複合体及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/38 20060101AFI20240911BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240911BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240911BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20240911BHJP

   A61L 27/40 20060101ALI20240911BHJP

   A61L 27/44 20060101ALI20240911BHJP

   A61L 27/52 20060101ALI20240911BHJP

   A61L 27/50 20060101ALI20240911BHJP

   A61L 27/58 20060101ALI20240911BHJP

   A61L 27/22 20060101ALI20240911BHJP

【ＦＩ】

A61L27/38 200

A61P27/02

A61P43/00 121

A61K35/30

A61L27/40

A61L27/44

A61L27/52

A61L27/50

A61L27/58

A61L27/22

【請求項の数】 28

(21)【出願番号】P 2021516241

(86)(22)【出願日】2020-04-24

(86)【国際出願番号】 JP2020017635

(87)【国際公開番号】W WO2020218480

(87)【国際公開日】2020-10-29

【審査請求日】2023-03-08

(31)【優先権主張番号】P 2019086199

(32)【優先日】2019-04-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】000002912

【氏名又は名称】住友ファーマ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100140888

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 欣乃

(72)【発明者】

【氏名】田中 佑治

(72)【発明者】

【氏名】万代 道子

(72)【発明者】

【氏名】高橋 政代

(72)【発明者】

【氏名】山▲崎▼ 優

【審査官】長谷川 茜

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／０８９５１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／０５００１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】ARAMANT RB. et al.，Successful cotransplantation of intact sheets of fetal retina with retinal pigment epithelium.，IOVS，1999年，Vol.40, No.7，pp.1557-1564

【文献】秋葉龍太朗ほか，ｉＰＳ細胞由来網膜シートを用いた網膜変性に対する再生医療，日薬理誌，2020年03月01日，Vol.155，pp.93-98

【文献】TU HY. et al.，EBioMedicine，2018年，Vol.39，pp.562-574

【文献】荒川大二朗ほか，ヒトｉＰＳ細胞由来網膜色素上皮細胞を用いた新規治療法の開発，日薬理誌，2016年，Vol.148，p.217

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｌ １５／００ －３３／１８

Ａ６１Ｋ ３５／００ －３５／７６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとハイドロゲルとを含む複合体であって、
前記神経網膜及び前記網膜色素上皮細胞シートがそれぞれ、ヒト多能性幹細胞由来であり、
前記神経網膜において、少なくとも視細胞層を含む神経網膜層が形成されており、前記視細胞層は少なくとも視細胞、視細胞前駆細胞及び網膜前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、
前記ハイドロゲルの融解点が、２０℃～４０℃であり、
前記神経網膜及び前記網膜色素上皮細胞シートの全体が前記ハイドロゲルに包埋されており、前記神経網膜と前記網膜色素上皮細胞シートとはそれぞれの表面の接線方向が凡そ平行しており、前記神経網膜の頂端面と前記網膜色素上皮細胞シートの頂端面とが向き合っており、両者が前記ハイドロゲルによって隔離されて接触していない、複合体。

【請求項2】

前記ハイドロゲルのゼリー強度が、１０００ｇ～２０００ｇである、請求項１に記載の複合体。

【請求項3】

前記ハイドロゲルの濃度が１０重量％～５０重量％である、請求項１又は２に記載の複合体。

【請求項4】

前記ハイドロゲルのｐＨが６．５～７．５である、請求項１～３のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項5】

前記ハイドロゲルが、生分解性を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項6】

前記ハイドロゲルがゼラチンのハイドロゲルである、請求項１～５のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項7】

前記ゼラチンが、アルカリ処理及び／又は加熱処理されたゼラチンである、請求項６に記載の複合体。

【請求項8】

前記神経網膜が、ヒト多能性幹細胞を分化誘導して得られた細胞凝集体から得られる神経網膜であり、
前記細胞凝集体が少なくとも第一の上皮組織及び第二の上皮組織を含み、前記第一の上皮組織はヒト神経網膜を含み、第二の上皮組織は、前記第一の上皮組織の表面における接線の傾きの連続性と異なる表面の接線の傾きの連続性を有し、かつ網膜系細胞以外の細胞及び／又は網膜色素上皮細胞を含み、
前記神経網膜が、前記細胞凝集体における、第二の上皮組織から最も離れた第一の上皮組織上の領域を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項9】

前記神経網膜が、上皮組織の構造を有し、頂端面と基底とを有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項10】

前記神経網膜が、
（１）多能性幹細胞由来であり、
（２）３次元構造を有し、
（３）視細胞層及び内層を含む複数の層構造を有する神経網膜層を含み、
（４）視細胞層が、視細胞前駆細胞及び視細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、
（５）内層が、網膜前駆細胞、神経節細胞、アマクリン細胞及び双極細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、
（６）神経網膜層の表面が、頂端面を有し、
（７）頂端面に沿って存在する視細胞層の内側に内層が存在し、
（８）神経網膜の表面の総面積に対して、神経網膜層の面積が５０％以上であり、
（９）神経網膜層の頂端面の総面積に対して、連続上皮構造の面積が８０％以上である、
ことを特徴とする神経網膜である、請求項１～９のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項11】

前記網膜色素上皮細胞シートが、網膜色素上皮細胞が少なくとも二次元の方向に生物学的結合により互いに接着し、単一又は複数の細胞から構成される単層又は重層のシート状の構造体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項12】

神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとハイドロゲルとを含む複合体の製造方法であって、
前記神経網膜及び前記網膜色素上皮細胞シートがそれぞれ、ヒト多能性幹細胞由来であり、
前記神経網膜において、少なくとも視細胞層を含む神経網膜層が形成されており、前記視細胞層は少なくとも視細胞、視細胞前駆細胞及び網膜前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、
前記ハイドロゲルの融解点が、２０℃～４０℃であり、
前記方法が、
（１）容器中に前記網膜色素上皮細胞シート及び前記神経網膜のいずれか一方を設置する第一工程と、
（２）流動状態のハイドロゲルを、前記一方を設置した前記容器に添加する第二工程と、
（３）冷却し、前記一方の全体を包埋するように前記ハイドロゲルを固め、前記一方と前記ハイドロゲルとを備える第１のハイドロゲル層を形成する第三工程と、
（４）前記第１のハイドロゲル層中の前記一方と、前記網膜色素上皮細胞シート及び前記神経網膜の他方とがそれぞれの表面の接線方向が凡そ平行となり、かつ、前記神経網膜の頂端面と前記網膜色素上皮細胞の頂端面とが向き合うように、前記第１のハイドロゲル層上に前記他方をさらに設置する第四工程と、
（５）流動状態のハイドロゲルを、前記他方をさらに設置した前記容器に添加する第五工程と、
（６）冷却し、前記第１のハイドロゲル層及び前記他方の全体を包埋するように前記ハイドロゲルを固め、前記第１のハイドロゲル層と前記他方と前記ハイドロゲルとを備える第２のハイドロゲル層を形成する第六工程と
を含む、製造方法。

【請求項13】

前記第三工程において、２℃～８℃に冷却する、請求項１２に記載の製造方法。

【請求項14】

前記第六工程において、２℃～８℃に冷却する、請求項１２又は１３に記載の製造方法。

【請求項15】

第六工程の後に、（７）前記複合体を１０℃～２０℃で保存する第七工程をさらに含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の製造方法。

【請求項16】

前記ハイドロゲルのゼリー強度が、１０００ｇ～２０００ｇである、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の製造方法。

【請求項17】

前記ハイドロゲルの濃度が１０重量％～５０重量％である、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の製造方法。

【請求項18】

前記ハイドロゲルのｐＨが６．５～７．５である、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の製造方法。

【請求項19】

前記ハイドロゲルが、生分解性を有する、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の製造方法。

【請求項20】

前記ハイドロゲルがゼラチンのハイドロゲルである、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の製造方法。

【請求項21】

前記ゼラチンが、アルカリ処理及び／又は加熱処理されたゼラチンである、請求項２０に記載の製造方法。

【請求項22】

前記神経網膜が、ヒト多能性幹細胞を分化誘導して得られた細胞凝集体から得られる神経網膜であり、
前記細胞凝集体が少なくとも第一の上皮組織及び第二の上皮組織を含み、前記第一の上皮組織はヒト神経網膜を含み、第二の上皮組織は、前記第一の上皮組織の表面における接線の傾きの連続性と異なる表面の接線の傾きの連続性を有し、かつ網膜系細胞以外の細胞及び／又は網膜色素上皮細胞を含み、
前記神経網膜が、前記細胞凝集体における、第二の上皮組織から最も離れた第一の上皮組織上の領域を含む、請求項１２～２１のいずれか一項に記載の製造方法。

【請求項23】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の複合体を有効成分として含有する、医薬組成物。

【請求項24】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の複合体を含有してなる、網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の治療薬。

【請求項25】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の複合体を含有してなる、移植用組成物。

【請求項26】

患者の眼底又は網膜下に移植するための請求項２５に記載の移植用組成物。

【請求項27】

移植された患者において、移植された複合体の神経網膜が該患者の神経網膜層に向き、移植された複合体の網膜色素上皮細胞シートが該患者の網膜色素上皮層に向いた状態で生着するように移植されるための、請求項２６に記載の移植用組成物。

【請求項28】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の複合体の、移植用組成物の製造における使用であって、前記移植用組成物は、前記複合体を含有してなり、かつ、以下の工程を含む、網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の治療方法に用いられる、使用：
（１）前記複合体を患者の眼底又は網膜下に移植する工程、
（２）患者の生体内において、移植された複合体の神経網膜が該患者の神経網膜層に向き、移植された複合体の網膜色素上皮細胞シートが該患者の網膜色素上皮層に向いた状態で生着される工程。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとハイドロゲルとを含む複合体及びその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

進行した加齢黄斑変性症等の視細胞と網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞が同時に障害される場合には、神経網膜（ＮＲ）と網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の同時移植が望ましいとされている。

【0003】

網膜色素変性等網膜組織の障害に基づく疾患に対する網膜の移植治療に関連し、多能性幹細胞から神経網膜、又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を製造する方法の研究が活発に行われている。多能性幹細胞から神経網膜を製造する方法として、例えば、多能性幹細胞の凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養することにより、神経網膜を得る方法（特許文献１、２及び非特許文献１）が知られている。また、多能性幹細胞からＲＰＥ細胞を製造する方法として、例えば、レチノイン酸受容体アンタゴニストを含む培地中で誘導した網膜前駆細胞からＲＰＥ細胞を得る方法（特許文献３）が知られている。しかし、別々に調製されたＮＲとＲＰＥ細胞の両者が生体網膜における網膜組織と同様に方向性をもって正しく局在している状態で、両者を含む網膜組織を製造する方法は知られていない。

【0004】

一方、これまで、移植においてゼラチンを利用する技術が検討されてきた。例えば、視細胞層を切り出す際の切り出しやすさを改善するために、生体網膜組織をゼラチンで固める方法（非特許文献２）、温度感受性ゼラチンで生体網膜組織を包埋する方法（非特許文献３）、壊れやすい胎児組織を保護するために、ヒト胎児由来網膜組織をゼラチンで包埋する方法（非特許文献４）等が挙げられる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】国際公開第２０１５／０２５９６７号

【文献】国際公開第２０１６／０６３９８６号

【文献】国際公開第２０１２／１７３２０７号

【非特許文献】

【0006】

【文献】Kuwahara A. et al., “ Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue”, Nature Communications, 6, 6286 (2015)

【文献】Taylor et al., “The epidemiology of infection in trachoma.” IOVS 1989 Aug; Volume 30, Issue 8, p1823-1833

【文献】M‘Barek et al., “Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration”, Sci. Transl. Med. 2017 Dec; Volume 9, Issue 421

【文献】Seiler et al., “Cell replacement and visual restoration by retinal sheet transplants”, Prog Retin Eye Res.2012 Nov; 31(6): 661-687

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明者らの検討によれば、ハイドロゲルで包埋した神経網膜及び網膜色素上皮細胞シートを含む複合体を製造する際に、神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとが分離しているため、移植までの操作の過程で複合体が崩れやすく、移植に適した複合体を製造できないという課題を見出した。また、本発明者らの検討によれば、ハイドロゲルで包埋した神経網膜及び網膜色素上皮細胞シートを含む複合体を製造する際に、別々に製造された神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとを直接的に長時間接触させると、物理的な接触により細胞が傷害されてしまうことが判明した。

【0008】

一方、ハイドロゲルが分解されにくいと、移植した神経網膜と同時に移植したＲＰＥ細胞若しくはホストのＲＰＥ細胞との相互作用又はこれらの細胞の間での物質の移動がされにくいという観点から、ハイドロゲルは移植後速やかに溶解し、分解及び吸収されることが好ましい。

【0009】

そこで、本発明は上記事情に鑑みて、移植に適した神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとの複合体及びその製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らが、鋭意研究の結果、例えば融解点が体温付近のハイドロゲルを、低温条件下、高濃度で固める事により、神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとの複合体の取り扱いが容易になり、移植に適した網膜組織を提供できることを見出した。特に、神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとの間並びにその周囲にハイドロゲルを介在させることによって、細胞傷害を防止することができ、かつ、神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとの複合体の取り扱いが容易になり、移植に適した網膜組織を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0011】

すなわち、本発明は以下の各発明に関する。
［１］
神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとハイドロゲルとを含む複合体であって、
上記神経網膜及び上記網膜色素上皮細胞シートがそれぞれ、ヒト多能性幹細胞由来であり、
上記神経網膜において、少なくとも視細胞層を含む神経網膜層が形成されており、上記視細胞層は少なくとも視細胞、視細胞前駆細胞及び網膜前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、
上記ハイドロゲルの融解点が、２０℃～４０℃であり、
上記神経網膜及び上記網膜色素上皮細胞シートの全体が上記ハイドロゲルに包埋されており、上記神経網膜と上記網膜色素上皮細胞シートとはそれぞれの表面の接線方向が凡そ平行しており、上記神経網膜の頂端面と上記網膜色素上皮細胞シートの頂端面とが向き合っており、両者が上記ハイドロゲルによって隔離されて接触していない、複合体。
［２］
上記ハイドロゲルのゼリー強度が、１０００ｇ～２０００ｇである、上記［１］に記載の複合体。
［３］
上記ハイドロゲルの濃度が１０重量％～５０重量％である、上記［１］又は［２］に記載の複合体。
［４］
上記ハイドロゲルのｐＨが６．５～７．５である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の複合体。
［５］
上記ハイドロゲルが、生分解性を有する、上記［１］～［４］のいずれかに記載の複合体。
［６］
上記ハイドロゲルがゼラチンのハイドロゲルである、上記［１］～［５］のいずれかに記載の複合体。
［７］
上記ゼラチンが、アルカリ処理及び／又は加熱処理されたゼラチンである、上記［６］に記載の複合体。
［８］
上記神経網膜が、ヒト多能性幹細胞を分化誘導して得られた細胞凝集体から得られる神経網膜であり、
上記細胞凝集体が少なくとも第一の上皮組織及び第二の上皮組織を含み、上記第一の上皮組織はヒト神経網膜を含み、第二の上皮組織は、上記第一の上皮組織の表面における接線の傾きの連続性と異なる表面の接線の傾きの連続性を有し、かつ網膜系細胞以外の細胞及び／又は網膜色素上皮細胞を含み、
上記神経網膜が、上記細胞凝集体における、第二の上皮組織から最も離れた第一の上皮組織上の領域を含む、上記［１］～［７］のいずれかに記載の複合体。
［９］
神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとハイドロゲルとを含む複合体の製造方法であって、
上記神経網膜及び上記網膜色素上皮細胞シートがそれぞれ、ヒト多能性幹細胞由来であり、
上記神経網膜において、少なくとも視細胞層を含む神経網膜層が形成されており、上記視細胞層は少なくとも視細胞、視細胞前駆細胞及び網膜前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、
上記ハイドロゲルの融解点が、２０℃～４０℃であり、
上記方法が、
（１）容器中に上記網膜色素上皮細胞シート及び上記神経網膜のいずれか一方を設置する第一工程と、
（２）流動状態のハイドロゲルを、上記一方を設置した上記容器に添加する第二工程と、
（３）冷却し、上記一方の全体を包埋するように上記ハイドロゲルを固め、上記一方と上記ハイドロゲルとを備える第１のハイドロゲル層を形成する第三工程と、
（４）上記第１のハイドロゲル層中の上記一方と、上記網膜色素上皮細胞シート及び上記神経網膜の他方とがそれぞれの表面の接線方向が凡そ平行となり、かつ、上記神経網膜の頂端面と上記網膜色素上皮細胞の頂端面とが向き合うように、上記第１のハイドロゲル層上に上記他方をさらに設置する第四工程と、
（５）流動状態のハイドロゲルを、上記他方をさらに設置した上記容器に添加する第五工程と、
（６）冷却し、上記第１のハイドロゲル層及び上記他方の全体を包埋するように上記ハイドロゲルを固め、上記第１のハイドロゲル層と上記他方と上記ハイドロゲルとを備える第２のハイドロゲル層を形成する第六工程と
を含む、製造方法。
［１０］
上記第三工程において、２℃～８℃に冷却する、上記［９］に記載の製造方法。
［１１］
上記第六工程において、２℃～８℃に冷却する、上記［９］又は［１０］に記載の製造方法。
［１２］
第六工程の後に、（７）上記複合体を１０℃～２０℃で保存する第七工程をさらに含む、上記［９］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］
上記ハイドロゲルのゼリー強度が、１０００ｇ～２０００ｇである、上記［９］～［１２］に記載の製造方法。
［１４］
上記ハイドロゲルの濃度が１０重量％～５０重量％である、上記［９］～［１３］に記載の製造方法。
［１５］
上記ハイドロゲルのｐＨが６．５～７．５である、上記［９］～［１４］のいずれかに記載の製造方法。
［１６］
上記ハイドロゲルが、生分解性を有する、上記［９］～［１５］のいずれかに記載の製造方法。
［１７］
上記ハイドロゲルがゼラチンのハイドロゲルである、上記［９］～［１６］のいずれかに記載の製造方法。
［１８］
上記ゼラチンが、アルカリ処理及び／又は加熱処理されたゼラチンである、上記［１７］に記載の製造方法。
［１９］
上記神経網膜が、ヒト多能性幹細胞を分化誘導して得られた細胞凝集体から得られる神経網膜であり、
上記細胞凝集体が少なくとも第一の上皮組織及び第二の上皮組織を含み、上記第一の上皮組織はヒト神経網膜を含み、第二の上皮組織は、上記第一の上皮組織の表面における接線の傾きの連続性と異なる表面の接線の傾きの連続性を有し、かつ網膜系細胞以外の細胞及び／又は網膜色素上皮細胞を含み、
上記神経網膜が、上記細胞凝集体における、第二の上皮組織から最も離れた第一の上皮組織上の領域を含む、上記［９］～［１８］のいずれかに記載の製造方法。
［２０］
上記［１］～［８］のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する、医薬組成物。
［２１］
上記［１］～［８］のいずれかに記載の複合体を含有してなる、網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の治療薬。
［２２］
上記［１］～［８］のいずれかに記載の複合体を含有してなる、移植用組成物。
［２３］
患者の眼底又は網膜下（Ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ Ｓｐａｃｅ）に移植するための［２２］に記載の移植用組成物。
［２４］
移植された患者において、移植された複合体の神経網膜が該患者の神経網膜層に向き、移植された複合体の網膜色素上皮細胞シートが該患者の網膜色素上皮層に向いた状態で生着するように移植されるための、［２３］に記載の移植用組成物。
［２５］
以下の工程を含む、網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の治療方法：
（１）［１］～［８］のいずれかに記載の複合体を患者の眼底又は網膜下（Ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ Ｓｐａｃｅ）に移植する工程、
（２）患者の生体内において、移植された複合体の神経網膜が該患者の神経網膜層に向き、移植された複合体の網膜色素上皮細胞シートが該患者の網膜色素上皮層に向いた状態で生着される工程。

【発明の効果】

【0012】

本発明によれば、移植に適した神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとの複合体及びその製造方法を提供することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】実施例１における、ｈＥＳ細胞由来神経網膜（Ａ）、ｈＥＳ細胞由来浮遊ＲＰＥ（Ｂ）、及び、ｈＥＳ細胞由来ＲＰＥ細胞シート（Ｃ）を顕微鏡で観察した結果を示す画像である。

【図2】実施例５における、ｐＨ５のゼラチンで３日間包埋し、回復培養した後のｈＥＳ細胞由来神経網膜の形態を顕微鏡で観察した結果を示す画像である。

【図3】実施例５における、ｐＨ７のゼラチンで３日間包埋し、回復培養した後のｈＥＳ細胞由来神経網膜の形態を顕微鏡で観察した結果を示す画像である。

【図4】実施例５における、ｈＥＳ細胞由来神経網膜に対してＤＡＰＩ、ＲＣＶＲＮ及びＨＬＡ ｃｌａｓｓＩで免疫染色を行った結果、及びＣＲＸ：：Ｖｅｎｕｓの蛍光（ｐＨ５）を示す蛍光顕微鏡画像である。

【図5】実施例５における、ｈＥＳ細胞由来神経網膜に対してＤＡＰＩ、ＲＣＶＲＮ及びＨＬＡ ｃｌａｓｓＩで免疫染色を行った結果、及びＣＲＸ：：Ｖｅｎｕｓの蛍光（ｐＨ７）を示す蛍光顕微鏡画像である。

【図6】実施例５における、ｈＥＳ細胞由来神経網膜に対してＤＡＰＩ、Ｅｚｒｉｎ及びＣｏｌＩＶで免疫染色を行った結果、及びＣＲＸ：：Ｖｅｎｕｓの蛍光を示す蛍光顕微鏡画像である。

【図7】実施例５における、ｈＥＳ細胞由来神経網膜に対してＤＡＰＩ、Ｃｈｘ１０及びＰａｘ６で免疫染色を行った結果、及びＣＲＸ：：Ｖｅｎｕｓの蛍光を示す蛍光顕微鏡画像である。

【図8】実施例５における、ｈＥＳ細胞由来神経網膜に対してＤＡＰＩ、Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｃｈｘ１０及びＫｉ６７で免疫染色を行った結果を示す蛍光顕微鏡画像である。

【図9】実施例７の実験手順を示す概念図である。

【図10】実施例７における、網膜色素上皮（ＲＰＥ）シート上に神経網膜（ＮＲ）が載っているサンプル（１）、及びサンプル（２）を示す写真である。

【図11】実施例７における、ＲＰＥシート上にＮＲが載っているサンプル（１）、及びサンプル（２）のＣＲＸ：：Ｖｅｎｕｓの蛍光を示す蛍光顕微鏡画像である。

【図12】実施例７における、ゼラチンの切出し作業の手順を示す写真である。

【図13】実施例７における、包埋されたヒトＥＳ細胞由来ＲＰＥと神経網膜複合体の切片に対してＣＲＸ：：Ｖｅｎｕｓの蛍光を示す蛍光顕微鏡画像である。

【図14】実施例７における、ゼラチン接着直後の包埋されたヒトＥＳ細胞由来ＲＰＥと神経網膜複合体の切片に対してＤＡＰＩで染色を行った結果、及びＣＲＸ：：Ｖｅｎｕｓの蛍光を示す蛍光顕微鏡画像である。

【図15】実施例８における、組織切片中のヒト細胞及びＲＰＥ細胞に対してＤＡＰＩ、Ｓｔｅｍ１２１及びＲＰＥ６５で免疫染色を行った結果、及びＣＲＸ：：Ｖｅｎｕｓの蛍光を示す蛍光顕微鏡画像である。

【図16】実施例８における、組織切片中のヒト細胞及びＲＰＥ細胞に対してＤＡＰＩ、Ｓｔｅｍ１２１及びＲＰＥ６５で免疫染色を行った結果、及びＣＲＸ：：Ｖｅｎｕｓの蛍光を示す蛍光顕微鏡画像である。

【図17】実施例８における、組織切片中のヒト細胞及びＲＰＥ細胞に対してＤＡＰＩ、ＨｕＮｕ及びＭＩＴＦで免疫染色を行った結果を示す蛍光顕微鏡画像である。

【図18】実施例８における、組織切片中のヒト細胞及びＲＰＥ細胞に対してＤＡＰＩ、ＨｕＮｕ、ＭＩＴＦ及びＢＦで免疫染色を行った結果を示す蛍光顕微鏡画像である。

【図19】実施例８における、組織切片中のヒト細胞及びＲＰＥ細胞に対してＤＡＰＩ、ＨｕＮｕ、ＭＩＴＦ及びＩｂａ－１で免疫染色を行った結果を示す蛍光顕微鏡画像である。

【図20】実施例８における、組織切片中のヒト細胞及びＲＰＥ細胞に対してＤＡＰＩ、ＨｕＮｕ、ＭＩＴＦ及びＩｂａ－１で免疫染色を行った結果を示す蛍光顕微鏡画像である。

【図21】実施例９における、ＲＰＥ細胞シート上にＮＲが載っていることを示す顕微鏡画像（Ａ）及びＣＲＸ：：Ｖｅｎｕｓの蛍光を示す蛍光顕微鏡画像（Ｂ）である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

〔定義〕
「幹細胞」とは、分化能及び増殖能（特に自己複製能）を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、単能性幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）及び／又は胚体外組織に属する細胞系譜すべてに分化しうる能力（分化多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいう。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。

【0015】

「多能性幹細胞」は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）等を挙げることが出来る。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から得られるＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ｅｎｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ）や、生殖細胞（例えば精巣）から作製されたＧＳ細胞も多能性幹細胞に包含される。

【0016】

１９９８年にヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。胚性幹細胞は、内部細胞凝集体をフィーダー細胞上又はｂＦＧＦを含む培地中で培養することにより製造することが出来る。胚性幹細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。ヒト胚性幹細胞であるＣｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ株（ＫｈＥＳ－１由来）は国立研究開発法人理化学研究所より入手可能である。

【0017】

「人工多能性幹細胞」とは、体細胞を、公知の方法等により初期化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）することにより、多能性を誘導した細胞である。

【0018】

人工多能性幹細胞は、２００６年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４），ｐｐ．６６３－６７６）。人工多能性幹細胞は、２００７年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Ｃｅｌｌ，２００７，１３１（５），ｐｐ．８６１－８７２；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５８），ｐｐ．１９１７－１９２０；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，２６（１），ｐｐ．１０１－１０６）。

【0019】

人工多能性幹細胞は、具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等分化した体細胞をＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ）、Ｇｌｉｓ１、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、ｌｉｎ２８、Ｅｓｒｒｂ等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい初期化因子の組み合わせとしては、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＭｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ又はＬ－Ｍｙｃ）、（２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８及びＬ－Ｍｙｃ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ２０１３；３１：４５８－４６６）を挙げることが出来る。

【0020】

人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加等により体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４１，ｐｐ．６５１－６５４）。

【0021】

また、株化された人工多能性幹細胞を入手する事も可能であり、例えば、京都大学で樹立された２０１Ｂ７細胞、２０１Ｂ７－Ｆｆ細胞、２５３Ｇ１細胞、２５３Ｇ４細胞、１２０１Ｃ１細胞、１２０５Ｄ１細胞、１２１０Ｂ２細胞、１２３１Ａ３細胞等のヒト人工多能性細胞株が、京都大学及びｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。株化された人工多能性幹細胞として、例えば、京都大学で樹立されたＦｆ－Ｉ０１細胞及びＦｆ－Ｉ１４細胞が、京都大学より入手可能である。

【0022】

本明細書において、多能性幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞であり、より好ましくは人工多能性幹細胞である。

【0023】

本明細書において、多能性幹細胞は、ヒトの多能性幹細胞であり、好ましくはヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又はヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である。

【0024】

ヒトｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は、当業者に周知の方法で維持培養及び拡大培養に付すことができる。

【0025】

「網膜組織（Ｒｅｔｉｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ）」とは、生体網膜において各網膜層を構成する網膜系細胞が、一種類又は複数種類、一定の秩序に従い存在する組織を意味し、「神経網膜（Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｔｉｎａ）」は、網膜組織であって、後述する網膜層のうち網膜色素上皮層を含まない内側の神経網膜層を含む組織を意味する。

【0026】

「網膜系細胞」とは、生体網膜において各網膜層を構成する細胞又はその前駆細胞を意味する。網膜系細胞には、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、毛様体周縁部細胞、これらの前駆細胞（例：視細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞等）、網膜前駆細胞等の細胞が含まれるがこれらに限定されない。網膜系細胞のうち、神経網膜層を構成する細胞として、具体的には、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞、及びこれらの前駆細胞（例：視細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞等）等の細胞が挙げられる。

【0027】

「成熟した網膜系細胞」とは、ヒト成人の網膜組織に含まれ得る細胞を意味し、具体的には、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、毛様体周縁部細胞等の分化した細胞を意味する。「未成熟な網膜系細胞」とは、成熟した網膜系細胞への分化が決定づけられている前駆細胞（例：視細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、網膜前駆細胞等）を意味する。

【0028】

視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜神経節細胞前駆細胞、ミュラーグリア前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。

【0029】

「網膜前駆細胞」とは、視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜神経節細胞前駆細胞、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮前駆細胞等のいずれの未成熟な網膜系細胞にも分化しうる前駆細胞であって、最終的に、視細胞、桿体視細胞、錐体視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞等のいずれの成熟した網膜系細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。

【0030】

「視細胞（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ）」とは、網膜の視細胞層に存在し、光刺激を吸収し電気信号へと変換する役割を持つ。視細胞には、明所で機能する錐体（ｃｏｎｅ）と暗所で機能する杆体（又は桿体、ｒｏｄ）の２種類がある。視細胞は視細胞前駆細胞から分化し、成熟する。細胞が視細胞若しくは視細胞前駆細胞であるか否かは、当業者であれば、例えば後述する細胞マーカー（視細胞前駆細胞で発現するＣｒｘ及びＢｌｉｍｐ１、視細胞で発現するリカバリン、成熟視細胞で発現するロドプシン、Ｓ－Ｏｐｓｉｎ及びＭ／Ｌ－Ｏｐｓｉｎ等）の発現、外節構造の形成等により容易に確認できる。一態様において、視細胞前駆細胞はＣｒｘ陽性細胞であり、視細胞はロドプシン、Ｓ－Ｏｐｓｉｎ及びＭ／Ｌ－Ｏｐｓｉｎ陽性細胞である。

【0031】

網膜系細胞の存在は、網膜系細胞のマーカー（以下、「網膜系細胞マーカー」という場合がある。）の発現の有無によって確認することができる。網膜系細胞マーカーの発現の有無、又は細胞集団若しくは組織における網膜系細胞マーカー陽性細胞の割合は、当業者であれば容易に確認することができる。例えば、市販の抗体を用いたフローサイトメトリー、免疫染色等の手法によって、特定の網膜系細胞マーカー陽性細胞の数を全細胞数で除することにより確認することができる。

【0032】

網膜系細胞マーカーとしては、網膜前駆細胞で発現するＲｘ（Ｒａｘとも言う）及びＰＡＸ６、神経網膜前駆細胞で発現するＲｘ、ＰＡＸ６及びＣｈｘ１０、視細胞前駆細胞で発現するＣｒｘ及びＢｌｉｍｐ１等が挙げられる。また、双極細胞で強発現するＣｈｘ１０、双極細胞で発現するＰＫＣα、Ｇｏα、ＶＳＸ１及びＬ７、網膜神経節細胞で発現するＴｕＪ１及びＢｒｎ３、アマクリン細胞で発現するＣａｌｒｅｔｉｎｉｎ及びＨＰＣ－１、水平細胞で発現するＣａｌｂｉｎｄｉｎ、視細胞及び視細胞前駆細胞で発現するＲｅｃｏｖｅｒｉｎ、桿体細胞で発現するＲｈｏｄｏｐｓｉｎ、桿体視細胞及び桿体視細胞前駆細胞で発現するＮｒｌ、錐体視細胞で発現するＳ－ｏｐｓｉｎ及びＬＭ－ｏｐｓｉｎ、錐体細胞、錐体視細胞前駆細胞及び神経節細胞で発現するＲＸＲ－γ、錐体視細胞のうち、分化初期に出現する錐体視細胞又はその前駆細胞で発現するＴＲβ２、ＯＴＸ２及びＯＣ２、水平細胞、アマクリン細胞及び神経節細胞で共通して発現するＰａｘ６、網膜色素上皮細胞で発現するＲＰＥ６５及びＭｉｔｆ、ミューラー細胞で発現するＣＲＡＬＢＰ等が挙げられる。

【0033】

「陽性細胞」とは、特定のマーカーを細胞表面上又は細胞内に発現している細胞を意味する。例えば、「Ｃｈｘ１０陽性細胞」とは、Ｃｈｘ１０タンパク質を発現している細胞を意味する。

【0034】

「網膜色素上皮細胞」とは、生体網膜において神経網膜の外側に存在する上皮細胞を意味する。細胞が網膜色素上皮細胞であるか否かは、当業者であれば、例えば後述する細胞マーカー（ＲＰＥ６５、Ｍｉｔｆ、ＣＲＡＬＢＰ、ＭＥＲＴＫ、ＢＥＳＴ１等）の発現や、メラニン顆粒の存在（黒褐色）、細胞間のタイトジャンクション、多角形・敷石状の特徴的な細胞形態等により容易に確認できる。細胞が網膜色素上皮細胞の機能を有するか否かは、ＶＥＧＦ及びＰＥＤＦ等のサイトカインの分泌能等により容易に確認できる。一態様において、網膜色素上皮細胞はＲＰＥ６５陽性細胞、Ｍｉｔｆ陽性細胞、又は、ＲＰＥ６５陽性かつＭｉｔｆ陽性細胞である。

【0035】

「網膜色素上皮細胞シート」とは、網膜色素上皮細胞が少なくとも二次元の方向に生物学的結合により互いに接着し、単一又は複数の細胞から構成される単層又は重層のシート状の構造体を意味する。

【0036】

「網膜層」とは、網膜を構成する各層を意味し、具体的には、網膜色素上皮層、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層及び内境界膜を挙げることができる。

【0037】

「神経網膜層」とは、神経網膜を構成する各層を意味し、具体的には、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層及び内境界膜を挙げることができる。「視細胞層」とは、網膜層（神経網膜層）の１種であり、神経網膜の最も外側に形成され、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、視細胞前駆細胞及び網膜前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を多く含む網膜層を意味する。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現の有無又は発現の程度等によって確認できる。

【0038】

「細胞凝集体」（Ｃｅｌｌ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ）とは、複数の細胞同士が接着して立体構造を形成しているものであれば特に限定はなく、例えば、培地等の媒体中に分散していた細胞が集合して形成する塊、又は細胞分裂を経て形成される細胞の塊等をいう。細胞凝集体には、特定の組織を形成している場合も含まれる。

【0039】

「スフェア（ｓｐｈｅｒｅ）状細胞凝集体」は、球状に近い立体的な形を有する細胞凝集体を意味する。球状に近い立体的な形とは、三次元構造を有する形であって、二次元面に投影したときに、例えば、円形又は楕円形を示す球状形、及び球状形が複数融合して形成される形状（例えば二次元に投影した場合に２～４個の円形若しくは楕円形が重なりあって形成する形を示す）が挙げられる。一態様において、凝集体のコア部は、小胞性層状構造を有し、明視野顕微鏡の下では、中央部が暗く外縁部分が明るく観察されるという特徴を有する。

【0040】

「毛様体周縁部様構造体」とは、毛様体周縁部と類似した構造体のことである。「毛様体周縁部（ｃｉｌｉａｒｙ ｍａｒｇｉｎａｌ ｚｏｎｅ；ＣＭＺ）」としては、例えば、生体網膜において神経網膜と網膜色素上皮との境界領域に存在する組織であり、且つ、網膜の組織幹細胞（網膜幹細胞）を含む領域を挙げることができる。毛様体周縁部は、毛様体縁（ｃｉｌｉａｒｙｍａｒｇｉｎ）又は網膜縁（ｒｅｔｉｎａｌ ｍａｒｇｉｎ）とも呼ばれ、毛様体周縁部、毛様体縁及び網膜縁は同等の組織である。毛様体周縁部は、網膜組織への網膜前駆細胞、分化細胞の供給、網膜組織構造の維持等に重要な役割を果たしていることが知られている。毛様体周縁部のマーカー遺伝子としては、例えば、Ｒｄｈ１０遺伝子（陽性）、Ｏｔｘ１遺伝子（陽性）及びＺｉｃ１（陽性）を挙げることができる。

【0041】

「頂端面（ａｐｉｃａｌ）」とは、上皮組織において、ムコ多糖に富み（ＰＡＳ染色陽性）、ラミニン及びＩＶ型コラーゲンを多く含む５０－１００ｎｍの、上皮細胞が産生した基底（ｂａｓａｌ）側の層（基底膜）が存在する基底膜側とは反対側に形成される表面（表層面）のことをいう。「基底膜」とは、ラミニン及びＩＶ型コラーゲンを多く含む５０－１００ｎｍの、上皮細胞が産生した基底（ｂａｓａｌ）側の層（基底膜）のことをいう。一態様において、視細胞又は視細胞前駆細胞が認められる程度に発生段階が進行した網膜組織においては、外境界膜が形成され、視細胞、視細胞前駆細胞が存在する視細胞層（外顆粒層）に接する面のことをいう。また、このような頂端面は、頂端面のマーカー（例：ａｔｙｐｉｃａｌ－ＰＫＣ（以下、「ａＰＫＣ」と略す）、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）に対する抗体を用いて、当業者に周知の免疫染色法等で同定することができる。

【0042】

「連続上皮組織」とは、連続上皮構造を有する組織である。連続上皮構造とは、上皮組織が連続している状態のことである。上皮組織が連続しているとは、例えば、上皮組織に対する接線方向に１０細胞～１０^７細胞、好ましくは接線方向に３０細胞～１０^７細胞、更に好ましくは１０^２細胞～１０^７細胞、並んでいる状態のことである。

【0043】

例えば、網膜組織において形成される連続上皮構造は、網膜組織が上皮組織に特有の頂端面を持ち、頂端面が神経網膜層を形成する各層のうち、少なくとも視細胞層（外顆粒層）等と概ね平行に、かつ連続的に網膜組織の表面に形成される。例えば、多能性幹細胞より作製した網膜組織を含む細胞凝集体の場合、凝集体の表面に頂端面が形成され、表面に対して接線方向に１０細胞以上、好ましくは３０細胞以上、より好ましくは１００細胞以上、更に好ましくは４００細胞以上の視細胞又は視細胞前駆細胞が規則正しく連続して配列する。

【0044】

「ハイドロゲル」とは、三次元の網目構造に架橋された高分子の内部に、水等の液体を取り込んだものである。ハイドロゲルを形成する高分子としては、例えば、ゼラチン、コラーゲン、ペクチン、ヒアルロン酸、アルギン酸等が挙げられる。本明細書における「ハイドロゲル」の具体的な物性等は後述する。

【0045】

〔複合体〕
本発明の一態様は、神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとハイドロゲルとを含む複合体である。

【0046】

本発明に係る複合体において、神経網膜及び網膜色素上皮細胞シートは、ヒト多能性幹細胞由来である。本発明に係る複合体において、神経網膜及び網膜色素上皮細胞シートはそれぞれ、ヒト多能性幹細胞由来である。神経網膜において、少なくとも視細胞層を含む神経網膜層が形成されており、視細胞層は少なくとも視細胞、視細胞前駆細胞及び網膜前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含む。網膜色素上皮細胞シートは、網膜色素上皮細胞が多角形又は敷石状の細胞形態で形成するシート状の構造を有する。神経網膜及び網膜色素上皮細胞シートの全体は、ハイドロゲルに包埋されており、神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとはそれぞれの表面の接線方向が凡そ平行しており、神経網膜の頂端面と網膜色素上皮細胞の頂端面とが向き合っており、両者がハイドロゲルによって隔離されて接触していない。

【0047】

＜神経網膜の製造＞
神経網膜は、多能性幹細胞由来であり、具体的に多能性幹細胞を分化誘導することによって得ることができる。分化誘導はＷＯ２０１１／０５５８５５、ＷＯ２０１３／０７７４２５、ＷＯ２０１５／０２５９６７、ＷＯ２０１６／０６３９８５、ＷＯ２０１６／０６３９８６、ＷＯ２０１７／１８３７３２、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１０ Ｊａｎ ２０；５（１）：ｅ８７６３．、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２０１１ Ａｕｇ；２９（８）：１２０６－１８．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１４ Ｊｕｎ １０；１１１（２３）：８５１８－２３、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１４ Ｊｕｎ １０；５：４０４７に開示されている方法が挙げられるが、特に限定されない。

【0048】

神経網膜は、神経網膜の細胞凝集体として製造される。具体的な一態様として、下記工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を含む方法によって神経網膜の細胞凝集体を調製することができる。
（Ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに２）未分化維持因子を含む培地で培養する工程、
（Ｂ）無血清培地中で浮遊培養することによって細胞凝集体を形成させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中でさらに浮遊培養する工程。

【0049】

本方法は、例えばＷＯ２０１６／０６３９８５、ＷＯ２０１７／１８３７３２にも開示されており、より詳細にはＷＯ２０１６／０６３９８５、ＷＯ２０１７／１８３７３２を参照することが可能である。

【0050】

ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とは、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路、すなわちＳｍａｄファミリーによって伝達される、シグナル伝達経路を阻害する物質を表し、具体的にはＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質（例：ＳＢ４３１５４２、ＬＹ－３６４９４７、ＳＢ－５０５１２４、Ａ－８３－０１等）、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路阻害物質（例：ＳＢ４３１５４２、Ａ－８３－０１等）及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質（例：ＬＤＮ１９３１８９、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ等）を挙げることができる。これらの物質は市販されており入手可能である。

【0051】

ソニック・ヘッジホッグ（以下、「Ｓｈｈ」と記すことがある。）シグナル伝達経路作用物質とは、Ｓｈｈによって媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、ＰＭＡ（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）、ＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ Ａｇｏｎｉｓｔ）等が挙げられる。

【0052】

ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度は、網膜系細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えば、ＳＢ４３１５４２は、通常０．１～２００μＭ、好ましくは２～５０μＭの濃度で使用される。Ａ－８３－０１は、通常０．０５～５０μＭ、好ましくは０．５～５μＭの濃度で使用される。ＬＤＮ１９３１８９は、通常１～２０００ｎＭ、好ましくは１０～３００ｎＭの濃度で使用される。ＳＡＧは、通常、１～２０００ｎＭ、好ましくは１０～７００ｎＭの濃度で使用される。ＰＭＡは、通常０．００２～２０μＭ、好ましくは０．０２～２μＭの濃度で使用される。

【0053】

工程（Ａ）におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、培地として未分化維持因子を含む上記フィーダーフリー培地を用いるとよい。

【0054】

工程（Ａ）におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、フィーダー細胞に代わる足場を多能性幹細胞に提供するため、適切なマトリクスを足場として用いてもよい。足場として用いることのできるマトリクスとしては、ラミニン（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８，６１１－６１５，（２０１０））、ラミニン断片（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ３，１２３６，（２０１２））、基底膜標品（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９，９７１－９７４，（２００１））、ゼラチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、ビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）等が挙げられる。

【0055】

工程（Ａ）における多能性幹細胞の培養時間は、工程（Ｂ）において形成される細胞凝集体の質を向上させる効果が達成可能な範囲で特に限定されないが、通常０．５～１４４時間である。一態様において、好ましくは２～９６時間、より好ましくは６～４８時間、さらに好ましくは１２～４８時間、よりさらに好ましくは１８～２８時間（例、２４時間）である。

【0056】

無血清培地の準備及び細胞凝集体の形成は、上述と同様に実施することができる。

【0057】

一態様において、工程（Ｂ）において用いられる培地は、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む。ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としては、上述したものを上述の濃度で用いることができる。ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質は、好ましくは、浮遊培養開始時から培地に含まれる。培地には、ＲＯＣＫ阻害剤（例、Ｙ－２７６３２）を添加してもよい。培養時間は例えば、１２時間～６日間である。

【0058】

ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質とは、ＢＭＰによって媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４若しくはＢＭＰ７等のＢＭＰタンパク質、ＧＤＦ７等のＧＤＦタンパク質、抗ＢＭＰ受容体抗体、又は、ＢＭＰ部分ペプチド等が挙げられる。ＢＭＰ２タンパク質、ＢＭＰ４タンパク質及びＢＭＰ７タンパク質は例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から、ＧＤＦ７タンパク質は例えば和光純薬から入手可能である。

【0059】

用いられる培地は、例えば、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が添加された無血清培地又は血清培地（好ましくは、無血清培地）が挙げられる。無血清培地、血清培地は上述の通り準備することができる。

【0060】

ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、網膜系細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばヒトＢＭＰ４タンパク質の場合は、約０．０１ｎＭ～約１μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ～約１００ｎＭ、より好ましくは約１ｎＭ～約１０ｎＭ、さらに好ましくは約１．５ｎＭ（５５ｎｇ／ｍＬ）の濃度となるように培地に添加する。

【0061】

ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、工程（Ａ）の浮遊培養開始から約２４時間後以降に添加されていればよく、浮遊培養開始後数日以内（例えば、１５日以内）に培地に添加してもよい。好ましくは、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、浮遊培養開始後１日目～１５日目までの間、より好ましくは１日目～９日目までの間、最も好ましくは３日目に培地に添加する。

【0062】

具体的な態様として、例えば、工程（Ｂ）の浮遊培養開始後１～９日目、好ましくは１～３日目に、培地の一部又は全部をＢＭＰ４を含む培地に交換し、ＢＭＰ４の終濃度を約１～１０ ｎＭに調製し、ＢＭＰ４の存在下で例えば１～１２日、好ましくは２～９日、さらに好ましくは２～５日間培養することができる。ここにおいて、ＢＭＰ４の濃度を、同一濃度を維持すべく、１回若しくは２回程度培地の一部又は全部をＢＭＰ４を含む培地に交換することができる。又はＢＭＰ４の濃度を段階的に減じることもできる。

【0063】

上記工程（Ａ）～工程（Ｃ）における培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃～約４０℃、好ましくは約３７℃である。またＣＯ_２濃度は、例えば約１％～約１０％、好ましくは約５％である。

【0064】

上記工程（Ｃ）における培養期間を変動させることによって、神経網膜の細胞凝集体に含まれる網膜系細胞として、様々な分化段階の網膜系細胞を製造することができる。すなわち、未成熟な網膜系細胞（例：網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞）と成熟した網膜系細胞（例：視細胞）とを様々な割合で含む、神経網膜の細胞凝集体中の網膜系細胞を製造することができる。工程（Ｃ）の培養期間を延ばすことによって、成熟した網膜系細胞の割合を増やすことができる。

【0065】

上記工程（Ｂ）及び／又は工程（Ｃ）は、ＷＯ２０１７／１８３７３２に開示された方法を使用することもできる。すなわち、工程（Ｂ）及び／又は工程（Ｃ）において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質をさらに含む培地で浮遊培養し、神経網膜の細胞凝集体を形成することができる。

【0066】

工程（Ｂ）及び／又は工程（Ｃ）に用いる、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されず、タンパク質、核酸、低分子化合物等のいずれであってもよい。Ｗｎｔにより媒介されるシグナルは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）及びＬＲＰ５／６（ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ５／６）のヘテロ二量体として存在するＷｎｔ受容体を介して伝達される。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、例えば、Ｗｎｔ又はＷｎｔ受容体に直接作用する物質（抗Ｗｎｔ中和抗体、抗Ｗｎｔ受容体中和抗体等）、Ｗｎｔ又はＷｎｔ受容体をコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、Ｗｎｔ受容体とＷｎｔの結合を阻害する物質（可溶型Ｗｎｔ受容体、ドミナントネガティブＷｎｔ受容体等、Ｗｎｔアンタゴニスト、Ｄｋｋ１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質等）、Ｗｎｔ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質［ＣＫＩ－７（Ｎ－（２－アミノエチル）－５－クロロイソキノリン－８－スルホンアミド）、Ｄ４４７６（４－［４－（２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－６－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド）、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ （ＩＷＲ１ｅ） （４－［（３ａＲ，４Ｓ，７Ｒ，７ａＳ）－１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル］－Ｎ－８－キノリニル－ベンズアミド）、並びに、ＩＷＰ－２（Ｎ－（６－メチル－２－ベンゾチアゾリル）－２－［（３，４，６，７－テトラヒドロ－４－オキソ－３－フェニルチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）チオ］アセタミド）等の低分子化合物等］等が挙げられるが、これらに限定されない。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。ＣＫＩ－７、Ｄ４４７６、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ （ＩＷＲ１ｅ）、ＩＷＰ－２等は公知のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質であり、市販品等を適宜入手可能である。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として好ましくはＩＷＲ１ｅが用いられる。

【0067】

工程（Ｂ）におけるＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、良好な細胞凝集体の形成を誘導可能な濃度であればよい。例えばＩＷＲ－１－ｅｎｄｏの場合は、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約０．３μＭから約３０μＭ、より好ましくは約１μＭから約１０μＭ、更に好ましくは約３μＭの濃度となるように培地に添加する。ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ以外のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏの濃度と同等のＷｎｔシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

【0068】

工程（Ｂ）において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を培地に添加するタイミングは、早い方が好ましい。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、工程（Ｂ）における浮遊培養開始から、通常６日以内、好ましくは３日以内、より好ましくは１日以内、より好ましくは１２時間以内、更に好ましくは工程（Ｂ）における浮遊培養開始時に、培地に添加される。具体的には、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を添加した基礎培地の添加や、該基礎培地への一部若しくは全部の培地交換を行う事ができる。工程（Ａ）で得られた細胞を、工程（Ｂ）においてＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は特に限定されないが、好ましくは、工程（Ｂ）における浮遊培養開始時に培地へ添加した後、工程（Ｂ）終了時（ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質添加直前）まで作用させる。更に好ましくは、後述する通り、工程（Ｂ）終了後（すなわち工程（Ｃ）の期間中）も、継続してＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質に曝露させる。一態様としては、後述する通り、工程（Ｂ）終了後（すなわち工程（Ｃ）の期間中）も、継続してＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質に作用させ、網膜組織が形成されるまで作用させてもよい。

【0069】

工程（Ｃ）において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、前述のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質のいずれかを用いる事ができるが、好ましくは、工程（Ｂ）で用いたＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質と同一の種類のものを工程（Ｃ）において使用する。

【0070】

工程（Ｃ）におけるＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、網膜前駆細胞及び網膜組織を誘導可能な濃度であればよい。例えばＩＷＲ－１－ｅｎｄｏの場合は、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約０．３μＭから約３０μＭ、より好ましくは約１μＭから約１０μＭ、更に好ましくは約３μＭの濃度となるように培地に添加する。ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ以外のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏの濃度と同等のＷｎｔシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。工程（Ｃ）の培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、工程（Ｂ）の培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度を１００としたとき、好ましくは５０～１５０、より好ましくは８０～１２０、更に好ましくは９０～１１０であり、第二工程の培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度と同等であることが、より好ましい。

【0071】

Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の培地への添加時期は、網膜系細胞若しくは網膜組織を含む凝集体形成を達成できる範囲で特に限定されないが、早ければ早い方が好ましい。好ましくは、工程（Ｃ）開始時にＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が培地に添加される。より好ましくは、工程（Ｂ）においてＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が添加された後、工程（Ｃ）においても継続して（即ち、工程（Ｂ）の開始時から）培地中に含まれる。更に好ましくは、工程（Ｂ）の浮遊培養開始時にＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が添加された後、工程（Ｃ）においても継続して培地中に含まれる。例えば、工程（Ｂ）で得られた培養物（Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中の凝集体の懸濁液）にＢＭＰシグナル伝達作用物質（例、ＢＭＰ４）を添加すればよい。

【0072】

Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は、特に限定されないが、好ましくは、工程（Ｂ）における浮遊培養開始時にＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が添加される場合において、工程（Ｂ）における浮遊培養開始時を起算点として、２日間から３０日間、より好ましくは６日間から２０日間、８日間から１８日間、１０日間から１８日間、又は１０日間から１７日間（例えば、１０日間）である。別の態様において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は、工程（Ｂ）における浮遊培養開始時にＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が添加される場合において、工程（Ｂ）における浮遊培養開始時を起算点として、好ましくは３日間から１５日間（例えば、５日間、６日間、７日間）であり、より好ましくは６日間から１０日間（例えば、６日間）である。

【0073】

上述した方法で得た神経網膜の細胞凝集体をＷｎｔシグナル伝達経路作用物質、及び／又は、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で３日間から６日間程度の期間培養（工程（Ｄ））後、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まない無血清培地又は血清培地中で３０日間～６０日間程度培養する（工程（Ｅ））ことによって、毛様体周縁部様構造体を含む神経網膜を製造することもできる。

【0074】

一態様として、工程（Ａ）～（Ｃ）で得られた神経網膜の細胞凝集体であって、工程（Ｂ）の浮遊培養開始後６～３０日目、１０～２０日目（１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目又は２０日目）の神経網膜の細胞凝集体から、上記工程（Ｄ）及び工程（Ｅ）により、毛様体周縁部様構造体を含む神経網膜を製造できる。

【0075】

Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としては、Ｗｎｔによって媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。具体的なＷｎｔシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ）、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）を挙げることができる。例えばＣＨＩＲ９９０２１の場合には、約０．１μＭ～約１００μＭ、好ましくは約１μＭ～約３０μＭの範囲を挙げることができる。

【0076】

ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としては、ＦＧＦによって媒介されるシグナル伝達を阻害できるものである限り特に限定されない。ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としては、例えば、ＳＵ－５４０２、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８等が挙げられる。例えばＳＵ－５４０２の場合、約０．１μＭ～約１００μＭ、好ましくは約１μＭ～約３０μＭ、より好ましくは約５μＭの濃度で添加する。

【0077】

上記工程（Ｅ）の一部又は全部の工程は、ＷＯ２０１９／０１７４９２に開示された連続上皮組織維持用培地を用いて培養することができる。すなわち、連続上皮組織維持用培地を用いて培養することにより、神経網膜の連続上皮構造を維持することができる。一例として、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（例：サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、２１１０３０４９）にＢ２７サプリメント（例：サーモフィッシャーサイエンティフィック、１２５８７０１０）を配合した培地を連続上皮組織維持用培地として挙げることができる。

【0078】

上記工程（Ｅ）の一部又は全部の工程において、細胞増殖用基礎培地、連続上皮組織維持用培地又はこれらの混合培地のいずれの培地を用いている場合であっても、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質をさらに含んでよい。甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質を含む培地で培養することにより、神経網膜に含まれる双極細胞、アマクリン細胞、神経節細胞又は水平細胞等の割合が低く、かつ視細胞前駆細胞の割合を増大させた神経網膜を含む細胞凝集体の製造が可能となる。

【0079】

本明細書において、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質とは、甲状腺ホルモンにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質であり、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路を増強し得るものであれば特に限定はない。甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、トリヨードサイロニン（以下、Ｔ３と略すことがある）、サイロキシン（以下、Ｔ４と略すことがある）、甲状腺ホルモン受容体（好ましくはＴＲβ受容体）アゴニスト等が挙げられる。

【0080】

甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質としてＴ３を用いる場合には、例えば、０．１～１０００ｎＭの範囲となるように培地に添加することができる。好ましくは、１～５００ｎＭ；より好ましくは１０～１００ｎＭ；更に好ましくは３０～９０ｎＭ；更により好ましくは６０ｎＭ前後の濃度のＴ３に相当する甲状腺ホルモンシグナル伝達亢進活性を有する濃度が挙げられる。甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質としてＴ４を用いる場合には、例えば、１ｎＭ～５００μＭの範囲となるように培地に添加することができる。好ましくは、５０ｎＭ～５０μＭ；より好ましくは５００ｎＭ～５μＭの範囲である。その他の甲状腺ホルモン受容体アゴニストを用いる場合、上述の濃度のＴ３又はＴ４が示すアゴニスト活性と同程度の活性を示す濃度であればよい。

【0081】

工程（Ｅ）において用いられる培地は、適宜、Ｌ－グルタミン、タウリン、血清などを含んでいてもよい。工程（Ｅ）において用いられる培地は、一例において、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質からなる群から選択される１以上（好ましくは全部）を添加されていない培地である。

【0082】

上述の方法によって、神経網膜の細胞凝集体を製造することができるが、これらに限定されない。

【0083】

本発明に係る神経網膜は、視細胞層及び内層を含む神経網膜層を含み、視細胞層において視細胞前駆細胞及び視細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、かつ、上皮組織の構造を有し、頂端面と基底とを有する。上皮組織の構造は連続上皮構造であることが好ましい。

【0084】

一態様において、本発明に係る神経網膜は、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いて神経網膜の細胞凝集体から切り出すことによって得ることができる。スフェア状の神経網膜の細胞凝集体から切り出すことにより、神経網膜シートを得ることができる。神経網膜シートとは、上述の神経網膜層の層構造を維持した重層のシート状の構造体を意味する。

【0085】

一態様において、本発明に係る神経網膜は、ヒト多能性幹細胞を分化誘導して得られた、細胞凝集体から得られる神経網膜であってよい。上記細胞凝集体が少なくとも第一の上皮組織及び第二の上皮組織を含み、第一の上皮組織は、ヒト神経網膜を含み、第二の上皮組織は、第一の上皮組織の表面における接線の傾きの連続性と異なる表面の接線の傾きの連続性を有し、かつ網膜系細胞以外の細胞及び／又は網膜色素上皮細胞を含んでいてよい。第二の上皮組織に含まれる網膜系細胞以外の細胞は、眼球関連組織及び脳脊髄組織の細胞が挙げられ、眼球関連組織としては、網膜色素上皮細胞及び毛様体周縁部構造体が挙げられる。本発明に係る神経網膜は、目視により当該凝集体より第二の上皮組織を含まない様に神経網膜を切り出すことにより得ることができる。本発明に係る神経網膜は、上記細胞凝集体における、第二の上皮組織から最も離れた第一の上皮組織上の領域、特に第一の上皮組織の中心付近の領域を含んでいてよい。一態様において、本発明に係る神経網膜は、連続上皮組織の中心付近の領域を含んでいてよい。

【0086】

一態様において、本発明に係る神経網膜は、
（１）多能性幹細胞由来であり、
（２）３次元構造を有し、
（３）視細胞層及び内層を含む複数の層構造を有する神経網膜層を含み、
（４）視細胞層が、視細胞前駆細胞及び視細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、
（５）内層が、網膜前駆細胞、神経節細胞、アマクリン細胞及び双極細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、
（６）神経網膜層の表面が、頂端面を有し、
（７）頂端面に沿って存在する視細胞層の内側に内層が存在し、
（８）神経網膜の表面の総面積に対して、神経網膜層の面積が５０％以上であり、
（９）神経網膜層の頂端面の総面積に対して、連続上皮構造の面積が８０％以上である、
ことを特徴とする神経網膜である。

【0087】

当該神経網膜は、（３）視細胞層及び内層を含む複数の層構造を有する神経網膜層を含む。（６）及び（７）に記載の通り、視細胞層は当該神経網膜の外側（表面）に存在するが、内層にも異所性の視細胞層が存在してもよい。

【0088】

当該神経網膜は、（５）内層が、網膜前駆細胞、神経節細胞、アマクリン細胞及び双極細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含むが、異所性の視細胞前駆細胞及び視細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含んでもよい。一態様において、神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞の含有率が総細胞数の３０％以下である神経網膜、神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞及び双極細胞の含有率が総細胞数の３０％以下である神経網膜、及び／又は、双極性細胞の含有率が総細胞数の１０％以下である神経網膜も提供される。

【0089】

当該神経網膜は、（８）神経網膜の表面の総面積に対して、神経網膜層の面積が４０％以上であり、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上である。当該神経網膜は、（９）神経網膜層の頂端面の総面積に対して、連続上皮構造の面積が６０％以上であり、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上である。

【0090】

一態様において、本発明に係る神経網膜の長径は、例えば３００μｍ～３３００μｍであってよく、好ましくは６００μｍ～２５００μｍ、より好ましくは１１００μｍ～１７００μｍである。

【0091】

一態様において、本発明に係る神経網膜の短径は、例えば１００μｍ～２０００μｍであってよく、好ましくは２００μｍ～１５００μｍ、より好ましくは４００μｍ～１１００μｍである。

【0092】

一態様において、本発明に係る神経網膜の高さは、例えば５０μｍ～１５００μｍであってよく、好ましくは１００μｍ～１０００μｍ、より好ましくは２００μｍ～７００μｍである。

【0093】

一態様において、本発明に係る神経網膜の体積は、例えば０．００１ｍｍ^３～４．０ｍｍ^３であってよく、好ましくは０．０１ｍｍ^３～１．５ｍｍ^３、より好ましくは０．０７ｍｍ^３～０．５７ｍｍ^３である。

【0094】

神経網膜の長径、短径及び高さを測定する方法は、特に限定されず、例えば、顕微鏡下で撮像した画像から測定すればよい。例えば、細胞凝集体から切り出した神経網膜について、切断面を対物レンズ側に向けた状態で撮像した正面画像と、切断面が対物レンズから見て垂直になるよう傾けた状態で撮像した横面画像とを、実体顕微鏡で撮像し、撮像した画像から測定できる。ここで、長径とは、正面画像において、該シート断面上の２つの端点を結ぶ線分のうち、最も長い線分及びその長さを意味する。短径とは、正面画像において、該シート断面上の２つの端点を結ぶ線分で長径と直交する線分のうち、最も長い線分及びその長さを意味する。高さとは、該シート断面に直交する線分で、該シート断面との交点と網膜シートの頂点を端点とする線分のうち、最も長い線分及びその長さを意味する。該シートの体積とは、神経網膜が、断面が長径を通るように半割した楕円体であると近似したうえで、以下の計算式に従い算出した体積を意味する。
体積=２／３×円周率（π）×（長径／２）×（短径／２）×高さ

【0095】

＜網膜色素上皮細胞シートの製造＞
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は、多能性幹細胞由来であり、具体的に多能性幹細胞を分化誘導することによって得ることができる。網膜色素上皮細胞を製造する方法は、ＷＯ２００５／０７００１１、ＷＯ２００６／０８０９５２、ＷＯ２０１１／０６３００５、ＷＯ２０１２／１７３２０７号、ＷＯ２０１５／０５３３７５号、ＷＯ２０１５／０５３３７６号、ＷＯ２０１５／０６８５０５号、ＷＯ２０１７／０４３６０５、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ２（２）， ２０５－２１８ （２０１４）及びＣｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， １０（６）， ７７１－７８５ （２０１２）に開示されている方法が挙げられるが、特に限定されない。また、上述したＷＯ２０１６／０６３９８５に記載の方法を改良することで網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞シートを調製することも可能である。網膜色素上皮細胞は、細胞シート又はスフェア状細胞凝集体として製造されてもよい。スフェア状細胞凝集体として製造された場合、例えば、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いて細胞凝集体を切り開くことでＲＰＥ細胞シートを調製可能である。

【0096】

ＷＯ２０１６／０６３９８５に記載の方法の改良法としては、上述した方法のうち、多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、１）分化誘導一日前にＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質で処理し、２）分化誘導開始時にソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を処理しない条件で培養する。その後、上述した工程（Ｂ）及び（Ｃ）を行う。さらに、上記工程（Ｄ）の開始時期を早める方が好ましい。具体的には、工程（Ｂ）の浮遊培養開始９日前後（例：７日、８日、９日、１０日、１１日後）に工程（Ｄ）を開始する。その後、上述した工程（Ｅ）を実施すればよい。本方法により、スフェア状のＲＰＥ細胞の細胞凝集体が得られる。当該細胞凝集体を分散させて細胞懸濁液にしてもよいし、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いて細胞凝集体を切り開くことでＲＰＥ細胞シートを調製することもできる。分散させた細胞懸濁液を接着培養で培養することにより、ＲＰＥ細胞シートを調製することもできる。

【0097】

網膜色素上皮細胞シートは、神経網膜の細胞凝集体と接触させる前に、多角形又は敷石状の細胞形態を有するまでさらに培養してもよい。この場合の培地は、特に限定されないが、網膜色素上皮細胞の維持培地（以下、ＲＰＥ維持培地と記載することもある。）に交換し、さらに培養することもできる。それにより、さらにはっきりとメラニン色素沈着細胞群や基底膜に接着する多角扁平状の形態を有する細胞群を観察することができる。ＲＰＥ維持培地による培養は、網膜色素上皮細胞のコロニーが形成される限り限定されないが、例えば３日に１回以上の頻度で全量培地交換を行いながら５～２０日間程度培養を行う。当業者であれば、当該形態を確認しながら、培養期間を容易に設定することができる。網膜色素上皮細胞の維持培地は、例えばＩＯＶＳ，Ｍａｒｃｈ ２００４， Ｖｏｌ． ４５， Ｎｏ．３、ＭａｓａｔｏｓｈｉＨａｒｕｔａら、ＩＯＶＳ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１１， Ｖｏｌ． ５２， Ｎｏ． １２、Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ１２２ （１７）、Ｆｕｍｉｔａｋａ Ｏｓａｋａｄａｒら、ｅｂｒｕａｒｙ ２００８， Ｖｏｌ． ４９， Ｎｏ． ２、Ｇａｍｍらに記載のものを使用することができる。

【0098】

一態様において、網膜色素上皮細胞シートの長径は、例えば３ｍｍ～５０ｍｍ、５ｍｍ～３０ｍｍ、１０ｍｍ～２０ｍｍなどの範囲であってよい。

【0099】

一態様において、網膜色素上皮細胞シートの短径は、例えば２ｍｍ～４０ｍｍ、５ｍｍ～３０ｍｍ、１０ｍｍ～２０ｍｍなどの範囲であってよい。

【0100】

網膜色素上皮細胞シートのメラニン色素沈着の程度は特に限定されない。網膜色素上皮細胞シート中に含まれる網膜色素上皮細胞におけるメラニン色素沈着の程度は、細胞間で同程度である方が好ましい。一態様として、網膜色素上皮細胞シートの平均メラニン含有量は、２０ｐｇ／細胞未満、１５ｐｇ／細胞未満、１０ｐｇ／細胞未満、８ｐｇ／細胞未満、７ｐｇ／細胞未満、６ｐｇ／細胞未満、５ｐｇ／細胞未満、４ｐｇ／細胞未満、３ｐｇ／細胞未満、２ｐｇ／細胞未満、１ｐｇ／細胞未満であってよい。また、網膜色素上皮細胞シートの平均メラニン含有量は、０．１ｐｇ／細胞以上、０．５ｐｇ／細胞以上、１ｐｇ／細胞以上、２ｐｇ／細胞以上、５ｐｇ／細胞以上であってもよい。

【0101】

網膜色素上皮細胞シート中のメラニン含有量は、例えば、網膜色素上皮細胞シートを分散させた後、ＮａＯＨなどを用いて抽出した細胞抽出物を用いて、分光光度計等を用いて測定することができる。平均メラニン含有量は、メラニン含有量を網膜色素上皮細胞シートに含まれる総細胞数で除することにより求めることができる。

【0102】

＜ハイドロゲル＞
本発明におけるハイドロゲルは、細胞を生きたまま包埋できるものであればよく、例えば、ゼラチンのハイドロゲル、コラーゲンのハイドロゲル、ペクチンのハイドロゲル、ヒアルロン酸のハイドロゲル、アルギン酸のハイドロゲルであってよく、好ましくは、ゼラチンのハイドロゲルである。これらのハイドロゲルは、生分解性及び所望の融解点を有するため、扱いやすく、かつ、高い生着率を期待できる。生分解性とは、生体内の酵素等により分解され、吸収若しくは排泄されることを意味する。本発明におけるハイドロゲルは、融解点が２０℃～４０℃の範囲のハイドロゲルである。すなわち、移植した場合に体温で融解するという特徴を有する。以下、「ゼラチン」を例に、その物性を詳細に記載する。ゼラチン以外のハイドロゲルについて、後述するゼラチンと同様の物性を有するハイドロゲルが好ましい。

【0103】

「ゼラチン」とは、水に不溶性のコラーゲンを、例えば酸あるいはアルカリで前処理し、熱加水分解するなどにより可溶化したものである。本明細書において、特別の記載がなければ、ハイドロゲルの状態のゼラチンを意味するが、「ゼラチンのハイドロゲル」と明確化して記載することもある。加熱によりコラーゲンの３本鎖らせんの分子構造が壊れ、ランダムな３本の分子に分かれることにより可溶化される。ゼラチンの原材料としては、主として牛骨及び牛皮、豚皮、豚骨、魚鱗などが用いられる。これらのコラーゲン原材料からゼラチンを抽出するために、塩酸や硫酸などの無機酸もしくは石灰を用いて、原料の前処理を行う。原料の前処理条件により、前者を酸処理ゼラチン（又は、Ａタイプゼラチン）、後者をアルカリ処理（石灰処理）ゼラチン（Ｂタイプゼラチン）と呼ぶこともある。酸処理ゼラチンとアルカリ処理ゼラチンではゼラチンの性質が異なる。また、加熱処理により加水分解を行うことで、ゼラチンの分子量は低下し、溶解度は向上し、同条件においてゼリー強度は低下する。例えば、温水（５０℃～８０℃）により加熱処理することもでき、複数回繰り返してもよい。市販のゼラチンを入手することも可能であり、例えば、ゼラチンＬＳ－Ｈ（新田ゼラチン（株）、豚皮アルカリ処理ゼラチン、非加熱処理ゼラチン、高ゼリー強度）ゼラチンＬＳ－Ｗ（新田ゼラチン（株）、豚皮アルカリ処理ゼラチン、加熱処理ゼラチン、低ゼリー強度）が挙げられる。アルカリ処理（石灰処理）ゼラチン（Ｂタイプゼラチン）が好ましく、加熱処理ゼラチンが好ましい。

【0104】

コラーゲンは約１０万の分子量をもつ３本のポリペプチド鎖（α鎖）で構成されている。コラーゲン分子が加熱処理によって変性すると、３本のα鎖（α成分）にわかれる。それ以外にα鎖の２量体（β成分：約２０万の分子量）と３量体（γ成分：約３０万の分子量）も生成され得る。また、ゼラチンの処理工程によって、コラーゲン、ゼラチンの分子間又は分子内結合の一部もランダムに切断されるため、ゼラチンは種々の分子量を持つ分子の集合体である。加熱処理の有無等により異なるが、通常、市販ゼラチンは、数万～数百万の分子量分布を有する。一態様として、ゼラチンでは、５０％以上（好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上）が約１０万～約３０万の範囲に含まれる分子量分布が好ましい。また、ゼラチンの好ましい平均分子量は、約５万～約１００万、約１０万～約８０万、約１０万～約６０万、約２０万～約５０万、約３０万～約５０万の範囲である。

【0105】

なお、分子量分布及び平均分子量は、当業者であれば周知知られた方法により測定することができる。例えば、高速液体クロマトグラフを用いて、ゼラチン水溶液をゲル濾過法によってクロマトグラムを求めることで分子量分布を推定し、さらにプルラン換算などにより平均分子量を推定することができる。

【0106】

「等イオン点」とは、タンパク質，もしくは両性電解質の水溶液が，他のイオンの共存しない状態（水が電離して生成する水素イオン、水酸化物イオン、対象となる両性電解質そのもののイオンを除く）で示すｐＨを意味する。等イオン点は当業者であれば周知知られて方法により測定することができる。具体例として、イオン交換樹脂により脱塩した検液（ゼラチン水溶液）のｐＨ計により水素イオン濃度を測定すればよい。例えば、ゼラチンの製造工程においてアルカリ処理を行うと、大部分が脱アミドされているため、等イオン点は約ｐＨ５と低くなる。これに対し、酸処理ゼラチンでは、脱アミド率が低く、コラーゲンに近いｐＨ７～９の等イオン点を示す。ゼラチン水溶液は等イオン点より低ｐＨ側で＋（プラス）、高ｐＨ側では－（マイナス）に荷電する。本明細書におけるハイドロゲル（ゼラチン等）は、約ｐＨ４～約ｐＨ７、約ｐＨ５～約ｐＨ７、約ｐＨ６～約ｐＨ７の等イオン点を示す方が好ましい。

【0107】

ゼラチンを含むハイドロゲルは、加熱又は冷却によって、溶液がゲルからゾル、ゾルからゲルに相変化する。ゼラチンなどのハイドロゲルは、冷却して流動性を失うことでゲル（ゼリー）化し、加熱して流動性を獲得することによりゾル（水溶液）化する。ゼラチンを例にとると、ゼラチンがゼリー化するのは、冷却により、ゼラチン分子の一部が、コラーゲンと同様のらせん構造をとることで分子間にネットワークを形成するためである。ここで、「融解点」とは、一定圧力のもとで、ゾル化する温度を意味し、「凝固点」とは、一定圧力のもとで、ゲル化する温度を意味する。上述の通り、冷却を続けるとより強固なゲルを形成する。本明細書におけるハイドロゲルは、融解点が２０℃～４０℃（例：２０℃～３５℃、２５℃～３５℃、３０℃～４０℃、３５℃～４０℃）である。一般に、ゲルの融点は、ネットワークの強さの尺度であり、ハイドロゲルの濃度及び分子量の上昇に伴い、ハイドロゲル（例：ゼラチン）の融解点は上昇する。また、例えば、糖類により固形分を増加させると融解点及び凝固点は上昇する傾向にある。この様に、一定の範囲で融解点及び凝固点を変動させることが可能である。

【0108】

ハイドロゲルの融解点の測定方法は、特に限定されず、例えば、ＪＩＳ Ｋ６５０３に定められた方法によって測定できる。具体的には、検液（例：１０ｗ／ｗ％濃度のゼラチン溶液）を、直径１０ｍｍのガラス管中で、末端５ｍｍの位置から４５ｍｍの高さのゲルを作り、末端５ｍｍが下に来るように水槽に入れて昇温したとき、ゲルが融けて末端の気泡の上端が１０ｍｍ上昇した温度を融解点とすればよい。

【0109】

ハイドロゲルの凝固点の測定方法は、特に限定されず、例えば、ＪＩＳ Ｋ６５０３に定められた方法によって測定できる。具体的には、３５℃にした検液（例：１０ｗ／ｗ％濃度のゼラチン溶液）を３５℃の緩衝浴を持った１５℃の水槽で攪拌しながら徐々に冷却させ、戻り現象（溶液を攪拌した時に生ずる気泡などが、撹拌を止めたとき、慣性で撹拌方向へ動くのではなく、逆の方向に引き戻される現象）が認められた時の温度を凝固点とすればよい。戻り現象を確認しやすくするために、検液には、濾紙片などを入れておくとよい。

【0110】

ハイドロゲルの「ゼリー強度」とは、ゲルを形成した物体の機械的強度を意味する。通常一定形状のゲルを変形させるのに要する力又はゲルを破断させるのに要する力（単位：ｇ、ｄｙｎｅ（ｓ）／ｃｍ^２又はｇ／ｃｍ^２）で表現され、主としてゲルの硬さの尺度である。なお、１ダイン（ｄｙｎｅ（ｓ））は、質量１グラム（ｇ）の物体に働くとき、その方向に１センチメートル毎秒毎秒（ｃｍ／ｓ２）の加速度を与える力と定義される。例えばゼラチンを含むハイドロゲルのゼリー強度は、その濃度、温度、ｐＨ及び共存物質などにより変動があるが、同一条件では分子量などの固有の性質に依存して変化する。ゼラチンの「ゼリー強度」は、例えば、日本薬局方 薬食発０５３１第３号やＪＩＳ Ｋ６５０３に定められた方法で試験される。具体的には、ゼラチン溶液を１０℃で１７時間冷却して調製したゼリーの表面を、２分の１インチ（１２．７ｍｍ）径のプランジャーで４ｍｍ押し下げるのに必要な荷重を、ゼリー強度とする。通常、ゼラチン濃度が増加するにつれて、ゼリー強度も増加する。また、通常、酸性ｐＨ（例：ｐＨ４以下）及びアルカリ性ｐＨ（例：ｐＨ８以上）においてはゼラチンのゼリー強度は大きく低下する。また、ある一定の範囲（例：分子量３万～７万）では、分子量が高いほどゼリー強度は高くなるが、ある程度以上（例：分子量１０万以上）になるとゼリー強度は一定になる。さらに、通常、ゲル化には２０℃以下での冷却が必要であり、例えば４℃～２０℃程度の冷却温度の範囲において、冷却温度が低いほどゼリー強度は高くなる。分子の配向やネットワーク形成する反応は比較的遅い速度で進行するため、その内部においては、ゲル形成後も分子間のネットワークが形成するため、冷却開始後１～５時間程度をかけてゼリー強度は上昇する。また、急速に冷却する方がゼリー強度は上昇する。分子が配向する時間的余裕なく分子間に細かくネットワークが形成されるためである。

【0111】

本明細書において、例えば１０℃～２０℃において、包埋される細胞や組織に影響を与えない範囲であって、かつ、複合体の通常の移植操作等において、ハイドロゲルが崩れない程度のゼリー強度であればよい。ゼリー強度は、５重量％～３０重量％程度のハイドロゲル（ゼラチン）において、例えば、ハイドロゲル（ゼラチン）のゼリー強度は、ＪＩＳ Ｋ６５０３に定められた方法において、５０ｇ以上、１００ｇ以上、２００ｇ以上、５００ｇ以上、１０００ｇ以上、１２００ｇ以上、１３００ｇ以上、１４００ｇ以上又は１５００ｇ以上であってよい。また、ハイドロゲル（ゼラチン）のゼリー強度は、３０００ｇ以下、２５００ｇ以下又は２０００ｇ以下であってよい。

【0112】

「粘度」とは、流体の粘りの強さを表す指標である。当業者であれば、周知知られた方法により粘度を測定することができる。例えば、ＪＩＳ Ｋ６５０３に定められた方法で測定することができる。すなわち、一定量のゼラチン溶液（６０℃、６．６７％）が、ピペット型粘度計を流下する時間を、粘度値（単位：ｍＰａ・ｓ）に換算すればよい。

【0113】

ゼラチンを含むハイドロゲルのゾル状態における粘度は、ゼラチンなどの濃度や系の温度、ｐＨ、共存塩類などによって影響される。一般に、ゼラチンなどの濃度の上昇や温度の低下にともない、粘度は上昇する。例えば、Ｂタイプゼラチンでは、粘度はｐＨに依存し、等イオン点のｐＨ付近において、粘度が最小となる。一方、Ａタイプゼラチンにおいては、粘度とｐＨに顕著な関係は認められない。

【0114】

ゼラチンを含むハイドロゲルの粘度は、後述する複合体を形成できる程度の粘度であれば特に限定はない。生きた細胞を包埋するため、細胞へのダメージを考慮すると、約４０℃（約３０℃～約５０℃程度）のハイドロゲルを用いて細胞を包埋する必要がある。従って、約４０℃（３０℃～５０℃程度）において、細胞を包埋するのに必要な程度の粘度、例えば、２～５０ｍＰａ・ｓ（５～３０ｍＰａ・ｓ）程度の粘度を示すハイドロゲルが挙げられる。

【0115】

「起泡率」とは、検体の元の体積（Ｖ_０）に対する泡を含む全体積（Ｖ_１）の割合（Ｖ_１／Ｖ_０）を意味する。起泡率は低い方が好ましい。具体的には、１．２以下（好ましくは、１．１５以下、１．１以下、１．０５以下）である。起泡率は、例えば、写真用ゼラチン試験法であるパギイ法第１０版（２００６年版）により測定することができる。具体的には、メスシリンダーに入れた５０℃の５０ｍＬの検液を、振幅３００ｍｍ、振動数１４５回／分で１分間振動させ後、振動停止から３分後に泡を含む全体積を読みとればよい。

【0116】

本明細書に記載のハイドロゲルは、移植により生体内に投与するため、日本薬局方に定める純度試験の基準をクリアしている方が好ましい。例えば、日本薬局方において、ゼラチン及び精製ゼラチンの品質規格と試験法が定められており、具体的には下記の基準を満たす。
（１）異臭及び不溶物 本品１．０ｇに水４０ｍＬを加え、加熱して溶かすとき、液は不快臭がない。また、この液は澄明であるか、又は濁ることがあってもわずかであり、その色は色の比較液Ａより濃くない。
（２）亜硫酸塩 ６０ｐｐｍ以下
（３）重金属 ５０ｐｐｍ以下（２０ｐｐｍ以下）
（４）ヒ素 １ｐｐｍ以下
（５）水銀 ０．１ｐｐｍ以下
（６）乾燥減量 １５．０％以下
（７）強熱残分 ２．０％以下

【0117】

ハイドロゲルの濃度は、各種操作による崩れや操作中の溶解等を防止するという観点から、高い方が好ましい。ハイドロゲルの濃度は、ハイドロゲルを溶解させる媒体（溶媒）に対するハイドロゲルの割合である。ハイドロゲルの濃度は、例えば、ゼラチンを用いる場合、１０重量％～５０重量％であってよく、好ましくは２５重量％～５０重量％、３０重量％～５０重量％、又は２０重量％～４０重量％である。

【0118】

ハイドロゲルの濃度は、上述の範囲になるように、計量したハイドロゲルに対し適切な媒体により溶解させればよい。媒体は細胞に影響を与えないものであればよく、例えば、ＨＢＳＳなどの緩衝塩溶液などが挙げられる。

【0119】

ハイドロゲルのｐＨは、包埋する組織や移植後の生体への傷害を軽減する目的で、中性付近が好ましい。例えば６～８又は６．５～７．５であってよく、好ましくは７～７．５である。ハイドロゲルのｐＨは、溶液若しくはゾル状態におけるｐＨとして測定すればよい。上述の通り、当該ｐＨ範囲であれば、ゼリー強度が大きく低下することもない。ハイドロゲルのｐＨの測定方法は、特に限定されず、例えば、市販のｐＨ計やｐＨ試験紙によって測定できる。

【0120】

一態様において、ハイドロゲルは、生分解性を有するハイドロゲルであることが好ましい。複合体をヒトに移植した後、生分解性のハイドロゲルの生分解により、移植された神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとが徐々に接触し、成熟後は生体網膜と同様に視細胞の外節が網膜色素上皮細胞シートと接触することが好ましい。また、接触しなくても移植した網膜色素上皮細胞シートが新生血管の滲出を抑える機能、及び／又は、レチノイドサイクルや外節の貪食、栄養等の供給をできる機能を有していればいい。主たる生体構成成分であるコラーゲンを処理することで得られるゼラチンは、生分解性を有するハイドロゲルである。

【0121】

一態様において、本明細書におけるハイドロゲルは、２０℃～４０℃の範囲の融解点を有し、かつ下記の物性の１以上を満たすハイドロゲルが好ましい。
（１）調製方法：アルカリ処理及び／又は加熱処理
（２）平均分子量：約１０万～約５０万
（３）濃度：１０重量％～５０重量％（好ましくは２５重量％～５０重量％、３０重量％～５０重量％、又は２０重量％～４０重量％）
（４）ゼリー強度：５０ｇ以上、１００ｇ以上、２００ｇ以上、５００ｇ以上、１０００ｇ以上、１２００ｇ以上、１３００ｇ以上、１４００ｇ以上又は１５００ｇ以上（３０００ｇ以下、２５００ｇ以下又は２０００ｇ以下）
（５）ｐＨ：６～８（好ましくは、６．５～７．５、７～７．５）
（６）等イオン点：酸性領域（約ｐＨ４～約ｐＨ７、約ｐＨ５～約ｐＨ７、約ｐＨ６～約ｐＨ７）
（７）起泡率：１．２以下（好ましくは、１．１５以下、１．１以下、１．０５以下）
（８）粘度：約４０℃（３０℃～５０℃程度）において、約５～３０ｍＰａ・ｓ。

【0122】

＜複合体の構造＞
一態様において、本発明に係る複合体において、ハイドロゲルは神経網膜及び網膜色素上皮細胞シートの全体を包埋する。「包埋」とは、細胞等がハイドロゲルに埋め込まれた状態で覆われていることを意味する。神経網膜及び網膜色素上皮細胞シートを包埋するとは、例えば、神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとの間及びその周囲にハイドロゲルが存在する状態であってよい。なお、本願においては、特に別々に製造又は単離した神経網膜及び網膜色素上皮細胞シートの使用を予定しているため、網膜色素上皮細胞が神経網膜層とともに連続する上皮構造を構成していない。

【0123】

複合体において、ハイドロゲルが単層構造を有してもよく、二層以上の構造を有してもよい。一態様においては、複合体は、網膜色素上皮細胞シートのみを包埋する第１のハイドロゲル層と、第１のハイドロゲル層及び神経網膜を包埋する第２のハイドロゲル層とを備えていてもよい。別の態様においては、複合体は、神経網膜のみを包埋する第１のハイドロゲル層と、第１のハイドロゲル層及び網膜色素上皮細胞シートを包埋する第２のハイドロゲル層とを備えていてもよい。

【0124】

本発明に係る複合体において、神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとは、それぞれ接線方向が凡そ平行している。「接線方向が凡そ平行している」とは、神経網膜と網膜色素上皮細胞シートの向かい合った面の接線方向が平行していることを意味する。また、本発明に係る複合体において、神経網膜の頂端面と網膜色素上皮細胞の頂端面とが向き合っている。すなわち、神経網膜の頂端面と網膜色素上皮細胞の頂端面とが近接した状態で存在する。

【0125】

一態様において、複合体中の神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとがハイドロゲルに隔離されて接触しない。そのため、神経網膜と網膜色素上皮細胞シートが機械的な接触による細胞の傷害を低減することができる。なお、「神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとが接触しない」こととは、神経網膜と網膜色素上皮細胞シートが物理的に接していないことを意味する。ハイドロゲルによって神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとが接触しないことは、例えば目視（例：顕微鏡下）により確認する事ができる。

【0126】

本発明に係る複合体において、ハイドロゲルに包埋される神経網膜としては、単一の連続した神経網膜であってよく、複数の連続した神経網膜であってもよい。１つの複合体によりより広い範囲の網膜組織の障害状態又は網膜組織の損傷状態を治療することができるため、複数の神経網膜を包埋することが好ましい。この場合、複数の神経網膜は、それぞれの頂端面が同じ方向に向いて横一列に並んでいることが好ましい。また、ハイドロゲルに包埋される網膜色素上皮細胞シートは、単一の連続したシート状の網膜色素上皮組織であってよく、複数の連続したシート状の網膜色素上皮組織であってもよい。複数の網膜色素上皮組織がハイドロゲルに包埋される場合、それぞれ網膜色素上皮組織の頂端面が同じ方向に向いて横一列に並んでいることが好ましい。

【0127】

〔複合体の製造方法〕
本発明の一態様は、神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとハイドロゲルとを含む複合体の製造方法である。本発明に係る製造方法において、製造される複合体、並びに複合体に含まれる神経網膜、網膜色素上皮細胞シート及びハイドロゲルは、上述の複合体において説明したものと同様の態様を適用できる。

【0128】

本発明に係る製造方法において、神経網膜及び網膜色素上皮細胞シートは、ヒト多能性幹細胞由来である。ハイドロゲルの融解点は、２０℃～４０℃であり、例えば上述のハイドロゲルを用いことができる。好ましくは、ハイドロゲルはゼラチンのハイドロゲルである。

【0129】

神経網膜及び網膜色素上皮細胞シートを細胞外マトリクス（例：コラーゲン）上で培養し製造した場合、神経網膜及び網膜色素上皮細胞シートの回収には細胞外マトリクスを分解する酵素（例：コラゲナーゼ）による剥離を行うことがある。その場合は、当該酵素の混入を防止するため、培地等により複数回洗浄することが好ましい。

【0130】

複合体の製造方法として、神経網膜と網膜色素上皮細胞シートを同時に包埋する方法（一段階包埋法ともいう）、又は、神経網膜及び網膜色素上皮細胞シートのいずれかを先に包埋してハイドロゲル層を形成させ、その後当該ハイドロゲル層と神経網膜及び網膜色素上皮細胞シートのもう一方とを包埋する方法（二段階包埋法ともいう）が挙げられる。神経網膜と網膜色素上皮細胞シートとの物理的な接触を避けるため、二段階で包埋する方が好ましい。

【0131】

本発明に係る製造方法は、一態様において、二段階包埋法であり、
（１）容器中に上記網膜色素上皮細胞シート及び上記神経網膜のいずれか一方を設置する第一工程と、
（２）流動状態のハイドロゲルを、上記一方を設置した容器に添加する第二工程と、
（３）冷却し、上記一方の全体を包埋するようにハイドロゲルを固め、上記一方とハイドロゲルとを備える第１のハイドロゲル層を形成する第三工程と、
（４）第１のハイドロゲル層中の上記一方と、上記網膜色素上皮細胞シート及び上記神経網膜の他方とがそれぞれの表面の接線方向が凡そ平行となり、かつ、神経網膜の頂端面と網膜色素上皮細胞の頂端面とが向き合うように、第１のハイドロゲル層上に上記他方をさらに設置する第四工程と、
（５）流動状態のハイドロゲルを、上記他方をさらに設置した容器に添加する第五工程と、
（６）冷却し、第１のハイドロゲル層及び神経網膜の全体を包埋するようにハイドロゲルを固め、第１のハイドロゲル層と上記他方とハイドロゲルとを備える第２のハイドロゲル層を形成する第六工程と
を含む。

【0132】

（１）第一工程において、容器中に網膜色素上皮細胞シート及び神経網膜のいずれか一方を設置する方法は特に限定されず、例えば、ピンセットやシートをすくい上げる平らな器具等によって設置できる。容器は、特に限定されず、網膜色素上皮細胞シート又は神経網膜のサイズによって適切に選択することができるが、例えばシャーレやスライドガラス、シリコンシート、プラスチック容器等が挙げられる。

【0133】

（２）第二工程において、ハイドロゲルを容器に添加する方法は特に限定されず、例えば、ピペットマンやスポイトで添加する方法によって行うことができる。第一工程において、網膜色素上皮細胞シートを設置した場合には、網膜色素上皮細胞シートがシート状を維持できるよう、静かにゆっくりと添加することが好ましい。流動状態のハイドロゲルの温度は、細胞へのダメージを考慮して、例えば、約２５℃～約５０℃、好ましくは３０℃～４０℃であってよい。

【0134】

（３）第三工程において、容器ごと、例えば２℃～８℃、好ましくは４℃～５℃に冷却し、第一工程において設置された網膜色素上皮細胞シート及び神経網膜のいずれか一方を包埋するようにハイドロゲルを固め、第１層のハイドロゲルを形成する。第三工程における冷却温度は、融解点から１５℃～２５℃低い温度（好ましくは、２０℃～２５℃）であればよい。冷却時間は、ハイドロゲルが固めればよくて、ハイドロゲルの種類によって異なるが、低温による細胞への悪影響を考慮してできるだけ早い方が好ましい。例えば１０分～１時間であってよく、５分～３時間又は５時間以上であってよい。冷却手段は、特に限定しないが、例えば氷上、４℃冷蔵庫、保冷剤上等が挙げられる。

【0135】

（４）第四工程において、第１層のハイドロゲル上に網膜色素上皮細胞シート及び神経網膜の他方を設置する方法は特に限定されず、例えば、ピンセットや薬さじなどを使用する方法によって設置できる。このときに、網膜色素上皮細胞シートと、神経網膜とがそれぞれの表面の接線方向が凡そ平行となり、かつ、神経網膜の頂端面と網膜色素上皮細胞の頂端面とが向き合うように設置する。この状態で設置することによって、生体の網膜と同様の配向で移植することができる。

【0136】

（５）第五工程において、流動状態のハイドロゲルの温度は、細胞へのダメージを考慮して、例えば、約２５℃～約５０℃、好ましくは３０℃～４０℃であってよい。第五工程の流動状態のハイドロゲルの温度は、第二工程のものと同じであっても、異なってもいてもよい。

【0137】

第五工程において、第二工程と同様な手段によって、ハイドロゲルを容器に添加することができる。このとき、第一工程において設置された網膜色素上皮細胞シート及び神経網膜のいずれか一方を包埋する第１層のハイドロゲルと、網膜色素上皮細胞シート及び神経網膜の他方とを包み込むように、かつ両者の位置関係を壊さないよう、静かにゆっくりと泡をできるだけ入れないように添加することが好ましい。

【0138】

（６）第六工程において、第三工程と同様に冷却することができる。

【0139】

一態様においては、本発明の複合体の製造方法は、第六工程の後に、（７）当該複合体を１０℃～２０℃で保存する第七工程をさらに含んでもよい。低温状態は細胞にとってのストレスである一方、温度を上昇させるとハイドロゲルが溶解し及び／又はゼリー強度の低下により取扱い難くなる。従って、（７）第七工程において、当該複合体を保存する温度は、例えば８℃～２５℃、好ましくは１０℃～２０℃である。第七工程において、固定後、さらに冷却してもよい。冷却温度は、融解点から５℃～１５℃低い温度（好ましくは、１０℃～１５℃低い温度）であってもよい。

【0140】

上述の二段階包埋法において、先に網膜色素上皮細胞シートをハイドロゲルで包埋する方が好ましい。

【0141】

本発明に係る製造方法は、一態様において、一段階包埋法であり、
（１）容器中に網膜色素上皮細胞シート及び神経網膜を設置する第一工程と、
（２）流動状態のハイドロゲルを、網膜色素上皮細胞シート及び神経網膜を設置した容器に添加する第二工程と、
（３）冷却し、網膜色素上皮細胞シート及び神経網膜の全体を包埋するようにハイドロゲルを固め、網膜色素上皮細胞シート、神経網膜及びハイドロゲルを備えるハイドロゲル層を形成する第三工程と
を含む。

【0142】

第一工程において、網膜色素上皮細胞シートと、神経網膜とがそれぞれの表面の接線方向が凡そ平行となり、かつ、神経網膜の頂端面と網膜色素上皮細胞の頂端面とが向き合うようにピンセットで位置を調整しながら設置する。この状態で設置することによって、生体の網膜と同様の配向で移植することができる。

【0143】

第二工程及び第三工程は、二段階包埋法において記載した通りに実施すればよい。また、二段階包埋法における第七工程をさらに含んでもよい。

【0144】

〔医薬組成物、治療薬及び治療方法〕
本発明の一態様として、本発明で得られる複合体を有効成分として含有する医薬組成物が挙げられる。医薬組成物は、本発明の複合体のほか、好ましくはさらに医薬として許容される担体を含む。

【0145】

医薬組成物は、網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の治療に使用し得る。網膜組織の障害に基づく疾患としては、例えば、網膜変性疾患、黄斑変性症、加齢黄斑変性、網膜色素変性、緑内障、角膜疾患、網膜剥離、中心性漿液性網脈絡膜症、錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー等の眼科疾患が挙げられる。網膜組織の損傷状態としては、例えは、視細胞や網膜色素上皮細胞等が変性死している状態等が挙げられる。

【0146】

医薬として許容される担体としては、生理的な水性溶媒（生理食塩水、緩衝液、無血清培地等）を用いることができる。必要に応じて、医薬組成物には、移植医療において、移植する組織又は細胞を含む医薬に、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。

【0147】

本発明の一態様として、本発明で得られる複合体を含有してなる、網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の治療薬が挙げられる。

【0148】

本発明の治療薬は、網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患を有する患者に、本発明で得られる複合体を移植することによって、網膜組織の障害状態又は網膜組織の損傷状態を治療することができる。網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患としては、上述した疾患が挙げられる。

【0149】

本発明の一態様として、本発明で得られる複合体を含有してなる、移植用組成物が挙げられる。患者の眼底又は網膜下（Ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ Ｓｐａｃｅ）に移植するために、本発明の複合体を用いることができる。また、移植された患者において、移植された複合体の神経網膜が該患者の神経網膜層に向き、移植された複合体の網膜色素上皮細胞シートが該患者の網膜色素上皮層に向いた状態で生着するように移植されるために、本発明の複合体を用いることができる。移植用組成物は、本発明の複合体のほか、好ましくはさらに医薬として許容される担体を含む、医薬として許容される担体は上述した通りである。

【0150】

本発明の一態様として、以下の工程を含む、網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の治療方法が挙げられる。
（１）本発明で得られる複合体を患者の眼底又は網膜下（Ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ Ｓｐａｃｅ）に移植する工程、
（２）患者の生体内において、移植された複合体の神経網膜が該患者の神経網膜層に向き、移植された複合体の網膜色素上皮細胞シートが該患者の網膜色素上皮層に向いた状態で生着される工程。

【0151】

本発明の一態様として、本発明で得られる複合体を、移植を必要とする対象（例えば、眼科疾患が起きている眼の網膜下）に移植することを含む、網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患を治療する方法が挙げられる。網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬として、又は、当該網膜組織の損傷状態において、該当する損傷部位を補充するために、本発明の複合体を用いることができる。移植を必要とする、網膜組織の障害に基づく疾患を有する患者、又は網膜組織の損傷状態の患者に、本発明の複合体を移植し、当該障害を受けた網膜組織を補充することによって、網膜組織の障害に基づく疾患、又は網膜組織の損傷状態を治療することができる。移植方法としては、例えば、眼球の切開などにより損傷部位の網膜下に移植用本発明の複合体を移植する方法が挙げられる。移植する方法としては、例えば細い管を用いて注入する方法やピンセットで挟んで移植する方法が挙げられ、細い管としては注射針等が挙げられる。

【実施例】

【0152】

以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。

【0153】

＜実施例１ ヒトＥＳ細胞からＳＦＥＢｑ法による網膜色素上皮細胞シート（ＲＰＥ細胞シート）及び神経網膜の作製＞
Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

【0154】

具体的なヒトＥＳ細胞の維持培養操作は、以下の様に行った。まず、サブコンフレント（培養面積の６割が細胞に覆われる程度）になったヒトＥＳ細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（商品名、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散した。その後、単一細胞へ分散されたヒトＥＳ細胞を、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、１０μＭ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にてフィーダーフリー条件下で培養した。上記プラスチック培養ディッシュとして、６ウェルプレート（イワキ社製、細胞培養用、培養面積９．４ｃｍ^２）を用いた場合、上記単一細胞へ分散されたヒトＥＳ細胞の播種細胞数は１ウェルあたり０．４～１．２×１０^４細胞とした。播種した１日後に、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地に交換した。以降、１～２日ごとに一回Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地にて培地交換した。その後、サブコンフレント１日前になるまでフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー条件下）で培養した。当該サブコンフレント１日前のヒトＥＳ細胞を、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、５μＭ）及びＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、３００ｎＭ）の存在下（Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ処理）で、１日間フィーダーフリー条件下で培養した。

【0155】

ヒトＥＳ細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて細胞分散液処理し、更にピペッティング操作によって単一細胞に分散した後、単一細胞に分散されたヒトＥＳ細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ ９６ウェルＶ底プレート，住友ベークライト社製）の１ウェルあたり１．２×１０^４細胞になるように１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ_２で浮遊培養した。その際の無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地との１：１混合液に１０％ ＫＳＲ、４５０μＭ １－モノチオグリセロール、１×Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを添加した無血清培地を用いた。

【0156】

浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、終濃度１０μＭ）及びＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、３００ｎＭ又は３０ｎＭ、０ｎＭ）を添加した。浮遊培養開始後３日目に、Ｙ２７６３２及びＳＡＧを含まず、ヒト組み換えＢＭＰ４（商品名：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＢＭＰ－４、Ｒ＆Ｄ社製）を含む培地を用いて、外来性のヒト組み換えＢＭＰ４を終濃度１．５ｎＭで含む培地を５０μＬ添加した。浮遊培養開始後６日目以降、３日に一回Ｙ２７６３２及びＳＡＧ及びヒト組み換えＢＭＰ４を含まない培地で半量交換した。神経網膜及びＲＰＥ細胞シートとも、ここまでの製造方法は同じ方法で実施した。

【0157】

（神経網膜の製造方法）
当該浮遊培養開始後１５日から１８日目の凝集体を、９０ｍｍの低接着培養皿（住友ベークライト社製）に移し、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質（ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ）及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質（ＳＵ５４０２、５μＭ）を含む無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％ Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地）で３７℃、５％ＣＯ_２で、３～４日間培養した。その後、９０ｍｍの低接着培養皿（住友ベークライト社製）にて、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まず血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（以下、ＮｕｃＴ０培地ということもある）で長期培養した。浮遊培養開始後（分化誘導）４０日目以降、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まない血清培地（ＮｕｃＴ０培地とＮｕｃＴ２培地の混合培地、以下、ＮｕｃＴ１培地ということもある）で長期培養した。浮遊培養開始後（分化誘導）６０日目以降、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質Ｔ３を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（以下、ＮｕｃＴ２培地ということもある）で長期培養（浮遊培養開始後８０日から１５０日程度）することで、スフェア状の神経網膜及びＰＲＥ細胞を得た。神経網膜及びＲＰＥ細胞をピックアップした。スフェア状のヒトＥＳ細胞由来ＲＰＥを眼科用バサミで展開して切り開き、一層のシート状にして、ＲＰＥ細胞シートを得た。

【0158】

顕微鏡を用いて、観察した結果、ヒトＥＳ細胞株において、層構造を有する神経網膜（ＮＲ）及び、ＲＰＥ細胞が分化されることが分かった（図１のＡ及びＢ）。

【0159】

また、このスフェア状のＲＰＥ細胞をｉＭａｔｒｉｘ５１１でコーティングしたディッシュに接着してＢ２７及び２００ｍＭ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含むＤＭＥＭ、Ｆ１２培地（ＳＦＲＭ培地と言う）にＳＢ４３１５４２（ＷＡＫＯ社）とｂＦＧＦ（ＷＡＫＯ社）を添加して培養し、拡大培養後、良好なＲＰＥの箇所をピックアップして継代した。拡大培養後、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標；日本全薬工業株式会社）で凍結保存した。凍結保存したＲＰＥを再度ｉＭａｔｒｉｘ５１１でコーティングしたディッシュ上で拡大培養後、ｂｅＭａｔｒｉｘ低エンドトキシン化コラーゲン液（新田ゼラチン社 ＣｏｌｌａｇｅｎＡＴ）を用いて、コラーゲンゲル化させた上で１か月間、Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ社）に１０％ＦＢＳを添加した培地で培養後、ＳＦＲＭ培地にＳＢ４３１５４３およびｂＦＧＦを添加して培養したところ、六角形構造を有するＲＰＥ細胞シートを作製できることがわかった（図１のＣ）。このようにして作製したＲＰＥ細胞シートはＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてコラーゲンゲルを消化し、回収できる。以下の実施例では、実施例１と同様の方法で、網膜色素上皮細胞シート（ＲＰＥ細胞シート）及び神経網膜を製造した。

【0160】

＜実施例２ 実験条件の検討―ゼラチンの濃度と溶けやすさ―＞
網膜下にゼラチンを移植する際、できるだけ低濃度で移植し、速やかに溶解及び吸収・分解する方が好ましい。一方で、移植時にゼラチンがすぐ溶けるようであれば取り扱いにくくなるため、最適な濃度を検討した。

【0161】

ゼラチンＬＳ－Ｗ（新田ゼラチン社製）を、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％の濃度になるようにＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて３７℃で溶解させ、それぞれをスライドガラス上に数滴滴下した。滴下後、４℃の冷蔵庫中に３０分インキュベートした。インキュベート後、スライドガラスを垂直に立てた状態で室温（２５℃）に５分程度置き、垂れてくることを指標に溶けやすさを検討した。

【0162】

その結果、１０重量％、１５重量％、２０重量％の濃度の場合、室温で速やかに溶けることがわかった。一方で、２５重量％以上の濃度の場合、室温において固まったままであることがわかった。従って、実施例３以降では、ゼラチンの濃度は３０重量％で実施することとした。

【0163】

＜実施例３ 実験条件の検討―ゼラチンが溶ける温度―＞
ゼラチンＬＳ－Ｗ（新田ゼラチン社製）の溶解温度について検討した。ゼラチンＬＳ－Ｗを、３７℃でＨＢＳＳを用いて３０重量％になるように溶解させ、４℃、１６℃、２６℃、３７℃で１日インキュベートした。なお、４℃での保管は冷蔵庫にて、１６℃、２６℃及び３７℃保管は。それぞれの温度に設定したＣＯ_２インキュベーター内にて実施した。

【0164】

一日後に観察したところ、４℃及び１６℃ではゼラチンは固まったままであったのに対し、２６℃及び３７℃ではゼラチンは完全に溶解した。よって、３０重量％ゼラチンＬ－ＳＷの溶解温度は１６℃から２６℃の間であることがわかった。

【0165】

＜実施例４ 実験条件の検討―ｐＨ調整と溶けやすさ―＞
ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ社製）に溶解した３０重量％ゼラチンＬＳ－Ｗ（新田ゼラチン社製）はｐＨ５．０～６．０付近の酸性であり、アシドーシスなど、細胞に対して良くない影響が考えられる。そこで、１００ｕＬの３０重量％ゼラチンＬ－ＳＷに対して１．２Ｎ ＮａＯＨを１ｕＬ、２ｕＬ、３ｕＬ又は４ｕＬ添加することで、ｐＨ６付近、ｐＨ７付近、ｐＨ８付近に調整した。

【0166】

それぞれのｐＨで調整したゼラチンの性質（溶けやすさ）が変わっていないかを検討するために、ヒトＥＳ細胞由来神経網膜を５～１０個包埋した状態で、１６℃に設定した５％ＣＯ_２インキュベーター内で１日及び３日インキュベートした。その結果、中性付近に調整したゼラチンは、１６℃において１～３日間固まったままだった。従って、ｐＨ調整で中性にしてもゼラチンの特性は変わらないことがわかった。よって、ゼラチンＬＳ－Ｗ（新田ゼラチン社製）は中性領域においても溶解温度に大きな変化はないことがわかった。実施例５以降では、ｐＨは７付近で使用することとした。

【0167】

＜実施例５ ゼラチン包埋したｈＥＳ細胞由来神経網膜の毒性試験＞
高濃度（３０重量％）及び酸性領域又は中性領域のＰＨを有するゼラチンＬ－ＳＷ（新田ゼラチン社製）が細胞の生存及び分化に与える影響について検討を行った。ｈＥＳ細胞由来神経網膜を３０重量％のゼラチン（ｐＨ５又はｐＨ７）で３日間包埋し１６℃で保存した。その後、約３７℃でインキュベートすることによりゼラチンを溶かしてから、３日間、９日間、１４日間増殖培地中で回復培養した。その後、顕微鏡下において組織の形態及び各種マーカーの発現等を免疫染色により確認した。

【0168】

顕微鏡下において組織の形態を確認した結果、３０重量％のゼラチンで３日間包埋し１６℃で保存したヒトＥＳ細胞由来神経網膜は、３日間培養後には少し細胞死や層構造の乱れが見られたが（図２及び図３、矢印）、９日間以上培養すると、問題なく回復することがわかった（図２及び図３）。また、ｐＨ５のゼラチンは直後のダメージが強いことから、中性付近のゼラチンが好ましいことを確認できた（図２）。

【0169】

神経網膜では通常条件下においてＨＬＡ ｃｌａｓｓ１が発現していないが、炎症条件下になると発現が上昇することがわかっている。そこで、ｈＥＳ細胞由来神経網膜の形態及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ１の発現について、ｐＨ５とｐＨ７のゼラチンで包埋し、保管した後、１４日間回復培養し、比較した。その結果、ｐＨ５のゼラチンで包埋及び保管した場合、ｈＥＳ細胞由来神経網膜の層構造及び連続上皮構造はよく保たれておりＲｅｃｏｖｅｒｉｎ陽性の視細胞が確認されたが、一部連続上皮構造が崩れてロゼット化しているものが確認された（図４）。ロゼット化した箇所ではＨＬＡ ｃｌａｓｓ１の発現が上昇しており、ゼラチンの酸性度によるダメージの可能性が考えられる。一方、ｐＨ７のゼラチンで包埋及び保管した場合、ｈＥＳ細胞由来神経網膜の層構造はよく保たれており、Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ陽性の視細胞が多数確認された（図５）。また、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ１の発現は認められなかった（図５）。

【0170】

次に、ゼラチンは基底膜成分であるコラーゲンを分解させたものであるため、ゼラチンによりｈＥＳ細胞由来神経網膜のＡｐｉｃａｌ及びｂａｓａｌの極性や層構造（連続上皮構造）の崩れ、分化誘導の促進、又はアポトーシス等が引きおこされる可能性について検討した。具体的には、１４日間の回復培養後におけるヒトＥＳ細胞由来神経網膜のＡｐｉｃａｌ及びＢａｓａｌの極性の変化、分化誘導の促進の有無（前駆細胞の存在の確認）及びアポトーシス誘導の有無を、それぞれのマーカーを免疫染色することにより確認した。結果を図６～８に示す。

【0171】

その結果、Ａｐｉｃａｌ及びＢａｓａｌの極性は保たれたままであり、ゼラチンの影響がないことが示された（Ｅｚｒｉｎ：Ａｐｉｃａｌマーカー、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｃｏｌ ＩＶ：Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＶ・Ｂａｓａｌマーカー、Ａｂｃａｍ社製）（図６）。また、網膜マーカーについて、Ｃｒｘ（ＴａＫａＲａ社製）、Ｃｈｘ１０（Ｅｘａｌｐｈａ社製）及びＰａｘ６（ＢＤ社製）それぞれの陽性細胞の局在は正しく維持されており、ゼラチンの影響はないことが示された（Ｃｒｘ：視細胞前駆細胞、Ｃｈｘ１０＆Ｐａｘ６：網膜前駆細胞、Ｐａｘ６：アマクリン細胞）（図７）。網膜前駆細胞も存在していた。さらに、アポトーシスについて、活性型Ｃａｓｐａｓｅ３（ＢＤ社製）陽性のアポトーシスを起こしている細胞はほとんど確認されず、ゼラチンの影響はないことが示された（図８）。これらの影響について、ｐＨの違いによる差異も認められなかった。

【0172】

以上の結果から、ゼラチンで３日間包埋し１６℃で保存したヒトＥＳ細胞由来神経網膜は、ゼラチンを溶かした直後には少しダメージが見られたが、問題なく回復することがわかった。また、ｐＨ５のゼラチンは直後のダメージが強いことから、中性付近のゼラチンが好ましいことを確認できた。

【0173】

＜実施例６ ヒトＥＳ細胞由来神経網膜の３０重量％ゼラチンＬＳ－Ｗへの並列包埋＞
実施例１と同じ方法で製造した浮遊培養開始後８０日から１５０日のヒトＥＳ細胞由来神経網膜を眼科用バサミで切り出し、移植可能な大きさに用意し、６０ｃｍ ｄｉｓｈ（住友ベークライト社）上に置き、培地を除去した。上から３７℃で加熱した３０重量％ゼラチンＬＳ－Ｗ（新田ゼラチン社製）を２０～３０ｕＬ滴下し、切り出した神経網膜を横に並べて配置し、４℃で３０分間、冷却した。その結果から、横に連続して、移植片を複数個連続して用意することができた。ゼラチンを添加してから横に並べて配置することで、移植する際に複数個の移植片を同時に用意することができることがわかった。

【0174】

＜実施例７ ヒトＥＳ細胞由来ＲＰＥとヒトＥＳ細胞由来神経網膜の３０重量％ゼラチンＬＳ－Ｗへの２段階包埋＞
実施例１と同じ方法で製造した浮遊培養開始後８０日から１５０日のヒトＥＳ細胞由来神経網膜及びＲＰＥ細胞シートを用意した。ゼラチンで固めるための容器として、スライドガラス（松浪硝子社）上の両端にスペーサーとして２００μｍ厚のシリコンシート２枚を重ねた４００ｕｍのシリコンシートを置いた。ＲＰＥ細胞シートをスライドガラスの上に静置した。上から５２℃で加熱した３０重量％ゼラチンＬＳ－Ｗ（新田ゼラチン社製）を５０ｕＬ滴下し、上からスライドガラスを重ねて、４℃で２０分間、冷却した。冷却後、ＲＰＥを埋没させたゲルを剥がして、反転させＲＰＥのＡｐｉｃａｌ面を上側にした。実施例１で作製した神経網膜組織から切り出してきた神経網膜をＡｐｉｃａｌ面が下（ＲＰＥ側）になるように、ＲＰＥ細胞シート上に置き、５２℃のゼラチンＬＳ－Ｗを上から滴下して、カバーガラスを被せた。４℃で２０分間冷却した。実施例７の手順を図９に示す。

【0175】

冷却後、ＲＰＥ細胞シートと神経網膜が固まった状態で、回収することができた。顕微鏡を用いて観察したところ、ＲＰＥ細胞シート上に神経網膜が乗っていることが確認された（図１０及び１１）。また、メスやピンセットを用いて周囲の不要なゼラチンを除去した後、スライドグラスに接着しているゼラチンを剥がし、ピンセットで回収した（図１２）。このヒトＥＳ細胞由来ＲＰＥ細胞シートと神経網膜の複合体をＰＢＳにて洗浄し、４％ＰＦＡを用いて１５分間更に４℃で固定した。ＰＢＳにて洗浄後、３０％Ｓｕｃｒｏｓｅ溶液に浸した。その後、クリオモルドにＯＣＴコンパウンドを用いて包埋した。クリオスタットで１２μｍの切片を作製した。この切片に対して共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製ＳＰ－８）で観察を行った。その結果、ヒトＥＳ細胞由来神経網膜及びＲＰＥ細胞シートがゼラチンにより隔離され接触しないが、近接していることがわかった（図１３及び１４）。この結果から、ゼラチンを用いて、二段階で包埋する事で、ヒトＥＳ細胞からそれぞれ別々に分化誘導したＲＰＥ細胞シートと神経網膜が、ゼラチンにより隔離されて接触していないが近接した状態で得ることができることがわかった。

【0176】

＜実施例８ ＮＲ－ＲＰＥ細胞シートの移植及び生着確認＞
実施例７の方法で作製したゼラチンで固めたヒトＥＳ細胞由来ＲＰＥ細胞シート及び神経網膜の複合体をメスとハサミを用いて、移植針で吸えるように細長く切り出した。切り出した複合シートについてガラスキャピラリーを用いて、吸引し、ヌードラットの網膜下に移植した。移植は眼球の一部を切開し、切開部位からガラスキャピラリーを硝子体に侵入させ、網膜下に移植した。移植１週間後、ラットから眼摘し、パラホルムアルデヒド固定してスクロース置換した。クライオスタットで１２μｍの組織切片を作製した。切り出した切片に対して、免疫染色によって、ヒト細胞質マーカー特異的マウスモノクローナル抗体（商品名：Ｓｔｅｍ１２１、ＴａＫａＲａ社製）、抗ＲＰＥ６５抗体（商品名：ＲＰＥ６５ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、抗ＨｕＮｕ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、抗ＭＩＴＦ抗体（ＥｘＡｌｐｈａ社製）、抗Ｉｂａ１抗体（Ｗａｋｏ社製）を用いて、それぞれ、組織切片中のヒト細胞及びＲＰＥ細胞を染色し、移植後のグラフトを評価した。ヒト細胞を染色することにより、移植したヒト由来細胞であるか否かを判断した。

【0177】

染色した組織を、共焦点顕微鏡（商品名：ＴＣＳ ＳＰ８、ライカ社製）を用いて蛍光観察を行った。結果を図１５～２０に示す。Ｓｔｅｍ１２１とＲＰＥ６５で染色した切片を観察したところ、移植片（Ｇｒａｆｔ）由来のＲＰＥとそのすぐ上側にＣＲＸ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の視細胞ロゼット（Ｒｏｓｅｔｔｅ）が観察された。この結果から、ＮＲ－ＲＰＥ細胞シートの同時移植ではＮＲとＲＰＥ細胞は方向性をもって同時移植及び生着が可能であることが示された。

【0178】

＜実施例９ ヒトＥＳ細胞由来ＲＰＥシートとヒトＥＳ細胞由来神経網膜の３０重量％ゼラチンＬ－ＳＷへの１段階包埋＞
実施例１と同じ方法で製造した浮遊培養開始後８０日から１５０日のヒトＥＳ細胞由来神経網膜及びＲＰＥ細胞シートを用意した。製造したヒトＥＳ細胞由来ＲＰＥ細胞シートを、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅを使用してＣｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｌから回収し、十分洗浄後、６０ｍｍ ｄｉｓｈ（住友ベークライト社）上に置いた。また、１０個のヒトＥＳ細胞由来神経網膜を眼科用バサミで切り出し、ＲＰＥ細胞シートの上に置いた。上から３７℃で加熱した３０重量％ゼラチンＬＳ－Ｗ（新田ゼラチン社製）を２０～３０ｕＬ滴下し、ピンセットを用いて神経網膜とＲＰＥの位置関係を調整し、４℃で３０分間、冷却した。

【0179】

冷却後、周囲の余分なところをメスを用いて切除し、ＲＰＥ細胞シートと神経網膜を固まった状態で、回収することができた。顕微鏡を用いて観察したところ、ＲＰＥ細胞シート上にＮＲが載っていることが確認された（図２１）。図２１のＡは顕微鏡画像、図２１のＢはＣＲＸ：：Ｖｅｎｕｓの蛍光を示す蛍光顕微鏡画像を示す。この結果から、ヒトＥＳ細胞からそれぞれ別々に分化誘導したＲＰＥ細胞シートと神経網膜を、ゼラチンを用いて１段階で包埋する事ができることがわかった。また、１段階で包埋した場合においても、神経網膜とＲＰＥ細胞シートがゼラチンにより隔離されて接触していないが近接した状態で得られることもあった。

【産業上の利用可能性】

【0180】

本発明によれば、移植に適した神経網膜と網膜色素上皮細胞との複合体及びその製造方法を提供することが可能となる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】