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▶ アクゾ ノーベル コーティングス インターナショナル ビー ヴィの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-10
(45)【発行日】2024-09-19
(54)【発明の名称】水生環境における対象物上のバイオフィルムバイオマスの推定
(51)【国際特許分類】
G01N 21/27 20060101AFI20240911BHJP
G01N 21/94 20060101ALI20240911BHJP
G01N 17/00 20060101ALI20240911BHJP
【ＦＩ】
G01N21/27 A
G01N21/94
G01N17/00
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2023518913
(86)(22)【出願日】2021-09-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-01
(86)【国際出願番号】 EP2021076725
(87)【国際公開番号】W WO2022069505
(87)【国際公開日】2022-04-07
【審査請求日】2023-04-18
(31)【優先権主張番号】63/086,852
(32)【優先日】2020-10-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】20210887.4
(32)【優先日】2020-12-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】500286643
【氏名又は名称】アクゾ ノーベル コーティングス インターナショナル ビー ヴィ
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100128484
【弁理士】
【氏名又は名称】井口 司
(72)【発明者】
【氏名】ロングイヤー，ジェニファー エリーゼ
(72)【発明者】
【氏名】ストッドリー，ポール
【審査官】井上 徹
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５１３２３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平９－２４８１９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／００５３３９１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００５／０１５１９７１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００７－５３５６６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／００３８０６５（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２１／００－２１／０１
Ｇ０１Ｎ ２１／１７－２１／７４
Ｇ０１Ｎ ２１／８４－２１／９５８
Ｇ０１Ｊ ３／００－ ４／０４
Ｇ０１Ｊ ７／００－ ９／０４
Ｇ０１Ｎ １７／００
Ｇ０６Ｔ ７／００－ ７／９０
Ｃ１２Ｍ １／００
Ｃ１２Ｑ １／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象物のコーティング上の水生環境由来のバイオフィルムバイオマスを推定するための方法であって、ａ）前記対象物上の前記コーティングの汚損部分の１つ又はそれ以上のデジタル画像を取得するステップと、
ｂ）前記１つ又はそれ以上の画像のそれぞれから、前記コーティングの前記部分に対するそれぞれの反射率値を決定するステップと、
ｃ）前記１つ又はそれ以上の反射率値に基づいて、バイオマスを表すスペクトル指標の値を決定するステップと、
ｄ）前記スペクトル指標ＳＩ、及び参照コーティングについて決定された１つ又はそれ以上の較正値に基づいて、バイオマス色素表面積密度を計算するステップと、
ｅ）前記参照コーティングに対する前記対象物の前記コーティングの前記反射率の差に関連する補償を適用することによって、前記計算されたバイオマス色素表面積密度を前記対象物の前記コーティングの前記反射率に関して補償するステップと
を含む、方法。
【請求項2】
前記補償は、前記バイオフィルムバイオマスの下にある前記コーティングを表す比較反射率値に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記比較反射率値は、－すべてのバイオマスが除去された前記対象物の前記コーティングの一部について決定された反射率値；
－参照対象物から決定された反射率値；又は
－データベースに記憶された反射率値
である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記比較反射率値が、１つ又はそれ以上の画像が取得される１つ又はそれ以上のスペクトル帯域における前記バイオフィルムバイオマスの下にある前記コーティングの前記反射率値の最小値である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項5】
前記１つ又はそれ以上の画像のそれぞれが０～１００ｎｍのＦＷＨＭの帯域幅を有するスペクトル帯域で取得される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
ステップｅ）において、現在のコーティング上の前記推定バイオマス色素表面積密度ｂｉｏｍａｓｓｃｕｒｒｅｎｔは、ステップｄ）で決定された前記スペクトル指標ｂｉｏｍａｓｓＳＩから計算された前記バイオマスから、誤差係数ＥＦｃｕｒｒｅｎｔ及びベースライン誤差ＢＥｃｕｒｒｅｎｔによって、以下の式【数1】
【請求項7】
前記スペクトル帯域のうちの少なくとも１つが、クロロフィルの吸光波長を包含するように選択され、または前記スペクトル帯域のうちの少なくとも１つが、クロロフィルの吸光波長を除外するように選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項8】
前記スペクトル帯域のうちの少なくとも１つが、４３３、４６０、４９６、５５５、５８４、６０１、６７３又は８００ｎｍ付近で選択される、請求項４、５、又は７に記載の方法。
【請求項9】
前記スペクトル指標が、２つの反射率値の比を含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
前記スペクトル指標ＳＩが、－
【数2】
－
【数3】
の一方であり、式中、Ｒ６７３は６０５～７４０ｎｍの範囲内における前記決定された反射率値であり；Ｒ８００は７２０～９００ｎｍの範囲内における前記決定された反射率値であり、Ｒ６７３ｃｌｅａｎは６０５～７４０ｎｍの範囲内における、バイオマスを含まない前記対象物のコーティングの前記反射率値である、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
－前記スペクトル指標がコーティング正規化赤色反射率である場合、【数4】
【数5】
【請求項12】
ステップｄ）において、前記色素表面積密度が、【数6】
【請求項13】
－前記スペクトル指標がコーティング正規化赤色反射率である場合、ａ＝－１．９２１、ｂ＝０．０９３、ｃ＝２．４７７であり；及び
－前記スペクトル指標が正規化差分植生指標である場合、
ａ＝０．６１８、ｂ＝０．２４０、ｃ＝－０．３２１である、
請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記１つ又はそれ以上のデジタル画像が、潜水艦を使用して取得される、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項15】
対象物のコーティング上の水生環境由来のバイオフィルムバイオマスを推定するためのシステムであって、－前記対象物上の前記コーティングの汚損部分の１つ又はそれ以上のデジタル画像を取得し、
－前記１つ又はそれ以上の画像のそれぞれから、前記コーティングの前記部分に対するそれぞれの反射率値を決定し、
－前記１つ又はそれ以上の反射率値に基づいて、バイオマスを表すスペクトル指標の値を決定し、
－前記スペクトル指標ＳＩ、及び参照コーティングについて決定された１つ又はそれ以上の較正値に基づいて、バイオマス色素表面積密度を計算し、
－前記参照コーティングに対する前記対象物の前記コーティングの前記反射率の差に関連する補償を適用することによって、前記計算されたバイオマス色素表面積密度を前記対象物の前記コーティングの前記反射率に関して補償する
ように構成されたプロセッサを含む、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、水生環境における対象物上のバイオフィルム汚損のバイオマスを推定するための方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【0002】
汚損は、水生環境に恒久的又は断続的に浸漬される構造物に関する一般的な問題である。そのような構造物には、船舶、ボート及びヨットの船体及びバラストタンク；海底石油及びガスの探査、生産及び貯蔵のための固定及び浮体構造物；風力及び波エネルギー発電のための海洋構造物；並びに導管及びパイプラインが含まれる。
【0003】
汚損の問題には、摩擦抵抗の増加によるボートの燃料コストの増加が含まれる。静止構造物、例えば、掘削リグでは、支持脚の周りの水流を変化させる可能性があり、応力が予測不可能となり、増大するリスクがある。また、検査中に欠陥及び亀裂を不明瞭にする可能性もある。汚損は、配管、例えば、冷却水又はバラストタンクの吸気口の断面積をさらに減少させ、流量を減少させる可能性がある。汚損制御コーティングを使用して汚損成長を低減することができるが、そのようなコーティングは、生物の付着又はバイオフィルム形成を完全には防止しない。
【0004】
汚損は、大きく２つのカテゴリー、すなわち、マクロ生物汚損（フジツボなど）及び微生物汚損（バイオフィルム／スライム）に分けることができる。水生環境において対象物上にどれだけの汚損（すなわち、マクロ汚損及び微生物汚損の両方）が存在するかを測定することができる定量的方法を有することは、追加の抗力を推定すること、並びに／又は対象物の洗浄及び／若しくは再コーティングの必要性を決定することを助けることができる。
【0005】
微生物汚損に関与するバイオフィルムは、一般に、有色微細藻類及び／又は細菌を含有する。これらは、光合成色素、例えば、クロロフィルａを含有することが多い。ｉｎ－ｖｉｖｏでクロロフィルａは約６７３ｎｍの光を非常に強く吸光し、バイオフィルムは近赤外波長ではほとんど透明である傾向がある。したがって、どれだけの赤色光を反射するかを測定することによって、かつ多くの場合は、これを近赤外反射のベースライン測定値と比較することによって（バイオマスのどの指標が使用されるかに応じて）、典型的な汚損バイオフィルムサンプル中にどれだけのクロロフィルがあるかを推定することが可能である。
【0006】
バイオフィルムの定量的イメージングは以前に行われていたが、バイオフィルムは一般に、特徴的な吸光度特性を有する均質な材料として主に処理されてきた。これらのモデルは、一般に満足のいく結果を提供せず、及び／又は多くの異なる対象物に使用することができない。したがって、バイオフィルム汚損の定量的決定を改善する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、例えば水生環境に恒久的又は断続的に浸漬された、対象物のコーティング上の水生環境由来のバイオフィルムバイオマスを推定するための方法及びシステムであって、比較的正確であり、様々な対象物に使用することができ、実装が容易である、方法及びシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
一態様では、本発明は、コーティング上、例えば、水生環境に恒久的又は断続的に浸漬された対象物上のコーティング上の水生環境由来のバイオフィルムバイオマスを推定するための方法を提供する。そのような対象物は、例えば、船舶、ボート若しくはヨットの船体若しくはバラストタンク；海底石油及びガスの探査、生産及び貯蔵のための固定若しくは浮体構造物；風力若しくは波エネルギー発電のための海洋構造物；又は導管若しくはパイプラインであり得る。水生環境は、例えば、海洋、淡水又は汽水環境であり得る。
【0009】
本方法は、対象物上のコーティングの汚損部分の１つ又はそれ以上のデジタル画像を取得するステップａ）を含む。１つ又はそれ以上のデジタル画像のうちの各デジタル画像は、スペクトル帯域で取得することができる。スペクトル帯域は、例えば、０～１００ｎｍ又はそれ以上の範囲のスペクトル幅を有することができる。ここで、０ｎｍのスペクトル幅は、単一波長を示す。したがって、本明細書では、単一の波長もスペクトル帯域と見なされる。スペクトル帯域は、例えば、０～１００ｎｍのＦＷＨＭ（半値全幅）又はそれ以上の範囲のスペクトル幅を有することができる。互いに異なるデジタル画像は、同じ又は異なるスペクトル帯域で取得することができる。各デジタル画像は、１つ又はそれ以上の画素を含むことができる。
【0010】
本方法は、１つ又はそれ以上の画像のそれぞれから、コーティングの部分のそれぞれの反射率値を決定するステップｂ）を含む。
【0011】
本方法は、１つ又はそれ以上の反射率値に基づいて、バイオマスを表すスペクトル指標の値を決定するステップｃ）を含む。
【0012】
本方法は、スペクトル指標ＳＩ、及び参照コーティングについて決定された１つ又はそれ以上の較正値に基づいて、バイオマス色素表面積密度ｂｉｏｍａｓｓＳＩを計算するステップｄ）を含む。参照コーティングは、対象物のコーティングとは異なる、例えば異なる色を有することができる。この計算されたバイオマス色素表面積密度は、バイオフィルムバイオマスの尺度であり得るが、この決定された密度の値は、対象物の下にあるコーティングの反射率によって影響を受けることが分かっている。したがって、この決定された密度は、対象物のコーティングの反射率に応じてバイオマスを過大評価又は過小評価する可能性があるため、バイオフィルムバイオマスの信頼できる指標ではない。
【0013】
それに加えて、本方法は、参照コーティングに対する対象物のコーティングの反射率の差に関連する補償を適用することによって、このようにして計算されたバイオマス色素表面積密度ｂｉｏｍａｓｓＳＩを、対象物のコーティングの反射率に関して補償し、それによって現在のコーティング表面ｂｉｏｍａｓｓｃｕｒｒｅｎｔ上の推定バイオマス密度を取得するステップｅ）を含む。したがって、対象物の下にあるコーティングの反射率に関して補償され、その結果、バイオフィルムバイオマスをより正確に決定することができる。さらに、本方法によれば、バイオマス色素表面積密度ｂｉｏｍａｓｓＳＩを、コーティングごとのスペクトル指標に対して較正する必要はない。較正は、参照コーティングに関して行うことができ、次いで、対象物上の実際のコーティングと参照コーティングとの間の差が補償される。本方法は、コンピュータ実装方法であり得る。
【0014】
任意選択的に、補償は、バイオフィルムバイオマスの下にあるコーティングの部分を表す比較反射率値に基づく。したがって、１つ又はそれ以上の画像におけるバイオマスの下にあるコーティングの反射率値は、比較反射率値を介して考慮することができる。比較反射率値は、すべてのバイオマスが除去された対象物のコーティングの一部について決定された反射率値；参照対象物から決定された反射率値；又はデータベースに記憶された反射率値であり得る。比較反射率値は、１つ又はそれ以上の画像が取得される１つ又はそれ以上のスペクトル帯域における、バイオフィルムバイオマスの下にあるコーティングの反射率値の最小値であり得る。
【0015】
したがって、ステップｄ）において、バイオマス色素表面積密度ｂｉｏｍａｓｓＳＩは、現在のコーティングが参照反射率スペクトルを有する参照コーティングであるかのように決定することができる。次いで、ステップｅ）において、参照コーティングに対して決定されたバイオマス色素表面積密度ｂｉｏｍａｓｓＳＩを、参照コーティングに対する現在のコーティングの反射率の差に関して補償することによって、現在のコーティング表面上のバイオマス密度ｂｉｏｍａｓｓｃｕｒｒｅｎｔを推定することができる。任意選択的に、参照コーティングの反射率は、所定の波長で決定され、現在のコーティングの反射率は、参照コーティングに対する現在のコーティングの反射率の差を決定するために、同じ所定の波長で決定される。
【0016】
任意選択的に、スペクトル指標及び１つ又はそれ以上の較正値ｂｉｏｍａｓｓＳＩから計算されたバイオマス推定値は、誤差係数ＥＦｃｕｒｒｅｎｔ及びベースライン誤差ＢＥｃｕｒｒｅｎｔによって調整することができ、これらはいずれも、バイオマスが存在する現在のコーティングの反射率スペクトルの関数である。次いで、現在のコーティング上の推定バイオマスｂｉｏｍａｓｓｃｕｒｒｅｎｔを以下の式
から決定することができる。
【数1】
【0017】
任意選択的に、スペクトル帯域は、１００ｎｍ幅のＦＷＨＭ又はそれ以下、例えば５０ｎｍ幅のＦＷＨＭ又はそれ以下、例えば３０ｎｍ幅のＦＷＨＭ又はそれ以下、例えば５ｎｍのＦＷＨＭ又はそれ以下である。スペクトル帯域は、少なくとも０．１ｎｍ、例えば少なくとも１ｎｍであり得る。したがって、スペクトル帯域は、０．１～１００、０．１～５０、０．１～３０又は０．１～５、例えば１～１００、１～５０又は１～３０又は１～５の範囲であり得る。
【0018】
任意選択的に、スペクトル帯域のうちの少なくとも１つは、クロロフィル、例えば、クロロフィルａの吸光波長を包含するように選択される。対象物上のコーティングの汚損部分の単一のデジタル画像を取得する場合、スペクトル帯域は、クロロフィルの吸光波長を包含するように選択することができる。対象物上のコーティングの汚損部分の２つ又はそれ以上のデジタル画像を取得する場合、それらの画像のうちの少なくとも１つは、クロロフィルの吸光波長を包含するスペクトル帯域で取得することができる。対象物上のコーティングの汚損部分の２つ又はそれ以上のデジタル画像を取得する場合、画像のうちの少なくとも１つは、クロロフィルの吸光波長を除外するように選択されたスペクトル帯域で取得することができる。したがって、バイオマスの存在は、クロロフィルによる光の吸光から決定することができる。
【0019】
実施形態では、スペクトル帯域は、３５０～９００ｎｍの範囲内、例えば４００～８５０ｎｍの範囲内にあり、すなわち、スペクトル帯域は、上記範囲内に入る１つ又はそれ以上の波長を包含する。任意選択的に、スペクトル帯域のうちの少なくとも１つは、４３３、４６０、４９６、５５５、５８４、６０１、６７３又は８００ｎｍ付近、すなわち、スペクトル帯域が指定された波長のいずれかであるか又はそれを包含するように選択される。スペクトル帯域のうちの少なくとも１つは、３９０～４８０ｎｍ、４１０～５１０ｎｍ、４４０～５５０ｎｍ、５００～６１０ｎｍ、５２５～６４５ｎｍ、５４０～６６０ｎｍ、６０５～７４０ｎｍ、又は７２０～９００ｎｍの範囲内にあるように選択することができる。
【0020】
任意選択的に、ステップｃ）で決定されたスペクトル指標は、２つの反射率値の比を含む。反射率値の比は、例えば対象物コーティングの反射率に対する反射率値の正規化を可能にする。任意選択的に、ステップｃ）で決定されたスペクトル指標は、２つの反射率値の合計及び／又は差を含む。反射率値の一方は、クロロフィルの吸光波長を包含するスペクトル帯域に対するものであり得る。反射率値の他方は、クロロフィルの吸光波長を包含しないスペクトル帯域に対するものであり得る。したがって、クロロフィルによる光の吸光の相対的な影響を考慮することができる。
【0021】
任意選択的に、ステップｃ）で決定されるスペクトル指標ＳＩは、
－
として定義されるコーティング正規化赤色反射率；又は
－
として定義される正規化差分植生指標
のうちの一方である。
しかしながら、他のスペクトル指標、例えば（これらに限定されないが）、
として定義される微小底生植物指標(Microphytobenthos Index)、
として定義される海色指標(Ocean Color Index)、又は
として定義される珪藻指標(Diatom Index)が使用され得ることが理解されよう。
－
【数2】
－
【数3】
のうちの一方である。
しかしながら、他のスペクトル指標、例えば（これらに限定されないが）、
【数4】
【数5】
【数6】
【0022】
ここで、Ｒ４３３は、３９０～４８０ｎｍの範囲内、例えば４３３ｎｍにおいて決定された反射率値であり；Ｒ４６０は、４１０～５１０ｎｍの範囲内、例えば４６０ｎｍにおいて決定された反射率値であり；Ｒ４９６は、４４０～５５０ｎｍの範囲内、例えば４９６ｎｍにおいて決定された反射率値であり；Ｒ５５５は、５００～６１０ｎｍの範囲内、例えば５５５ｎｍにおいて決定された反射率値であり；Ｒ５８４は、５２５～６４５ｎｍの範囲内、例えば５８４ｎｍにおいて決定された反射率値であり；Ｒ６０１は、５４０～６６０ｎｍの範囲内、例えば６０１ｎｍにおいて決定された反射率値であり；Ｒ６７３は、６０５～７４０ｎｍの範囲内、例えば６７３ｎｍにおいて決定された反射率値であり；Ｒ８００は、７２０～９００ｎｍの範囲内、例えば８００ｎｍにおいて決定された反射率値であり；Ｒ６７３ｃｌｅａｎは、６０５～７４０ｎｍの範囲内、例えば６７３ｎｍにおける、バイオマスを含まない対象物のコーティング上での反射率値、例えば、対象物の洗浄された部分において決定された反射率値、対象物と同じ若しくは類似のコーティングを有する参照物の反射率値、又は記憶された参照反射率値である。スペクトル指標は、ステップｄ）においてバイオマス色素表面積密度を推定するために使用することができる。正規化赤色反射率及び正規化差分植生指標を覆うスペクトル指標は、バイオマス色素表面積密度の良好な推定値を提供することが見出された。
【0023】
上記から、コーティング正規化赤色反射率は、Ｒ６７３ｃｌｅａｎの記憶値と組み合わせて、対象物上のコーティングの汚損部分の、１つのスペクトル帯域における単一デジタル画像から決定することができることが分かる。他の例では、スペクトル指標は、対象物上のコーティングの汚損部分の、互いに異なるスペクトル帯域における２つ又はそれ以上のデジタル画像から決定される。２つ又はそれ以上の画像は、ハイパースペクトル画像の別個の層であり得る。
【0024】
ステップｄ）におけるバイオマス色素表面積密度の計算は、１つ又はそれ以上の較正値に基づく。較正値は、所定の反射率を有する参照コーティングに対して決定することができる。本発明によれば、参照コーティングは、対象物上の現在のコーティングである必要はない。ステップｅ）は、参照コーティングに対する対象物のコーティングの反射率に関連する補償を適用することによって、現在のコーティングに基づいて計算されたバイオマス色素表面積密度を、対象物のコーティングの反射率に関して補償するために提供される。
【0025】
任意選択的に、ステップｄ）において、色素表面積密度は、
から決定され、式中、ＳＩはスペクトル指標値であり、ａ、ｂ及びｃは較正値である。較正値ａ、ｂ及びｃは、所定の反射率を有する参照コーティングに対して決定することができる。
【数7】
【0026】
一例では、灰色及び２４％の反射率値を有する参照コーティングに対して較正値ａ、ｂ及びｃが決定される。その場合、以下の較正値が見出された。
－スペクトル指標がコーティング正規化赤色反射率である場合、
ａ＝－１．９２１、ｂ＝０．０９３、ｃ＝２．４７７であり；及び
－スペクトル指標が正規化差分植生度である場合、
ａ＝０．６１８、ｂ＝０．２４０、ｃ＝－０．３２１である。
－スペクトル指標がコーティング正規化赤色反射率である場合、
ａ＝－１．９２１、ｂ＝０．０９３、ｃ＝２．４７７であり；及び
－スペクトル指標が正規化差分植生度である場合、
ａ＝０．６１８、ｂ＝０．２４０、ｃ＝－０．３２１である。
【0027】
これらの較正値は、ステップｄ）において、現在のコーティングが参照コーティングである場合に当てはまる推定バイオマス色素表面積密度ｂｉｏｍａｓｓＳＩをもたらすので、ステップｅ）において、推定バイオマス色素表面積密度ｂｉｏｍａｓｓＳＩは、参照コーティングに対する対象物のコーティングの反射率に関連する補償を適用することによって、参照コーティングに対する対象物の現在のコーティングの反射率差を補償することができる。上記のように、現在のコーティング上の推定バイオマスｂｉｏｍａｓｓｃｕｒｒｅｎｔを式ＥＱ１から決定することができる。したがって、式ＥＱ１及びＥＱ２を組み合わせると、現在のコーティングのバイオマス色素表面積密度ｂｉｏｍａｓｓｃｕｒｒｅｎｔは、
から決定することができる。
【数8】
【0028】
ステップｄ）及びｅ）は、別々のステップとして、又は組み合わせたステップとして実行され得ることが理解されよう。例えば、式ＥＱ１及びＥＱ２は、ステップｄ）及びｅ）を別々に実行するときに使用することができる。式ＥＱ３は、例えば、ステップｄ）及びｅ）を組み合わせたステップとして実行するときに使用することができる。
【0029】
以下の例示的な誤差係数ＥＦｃｕｒｒｅｎｔ、及びベースライン誤差ＢＥｃｕｒｒｅｎｔ値が見出された：
－スペクトル指標がコーティング正規化赤色反射率である場合、
－スペクトル指標が正規化差分植生度である場合、
式中、Ｒｃｕｒｒｅｎｔ６７３は、６７３ｎｍにおける現在のコーティングの反射率値である。
これらの較正曲線を使用して、対象物上の特定のコーティングの誤差係数ＥＦｃｕｒｒｅｎｔ、及びベースライン誤差ＢＥｃｕｒｒｅｎｔの値を決定することができる。したがって、参照コーティングについて決定された較正値ａ、ｂ及びｃ、並びに参照コーティングに対する現在のコーティングの反射率の差を補償する誤差係数ＥＦｃｕｒｒｅｎｔ及びベースライン誤差ＢＥｃｕｒｒｅｎｔ値を使用して、現在のコーティングのバイオマス色素表面積密度ｂｉｏｍａｓｓｃｕｒｒｅｎｔの推定値を決定することが可能である。
－スペクトル指標がコーティング正規化赤色反射率である場合、
【数9】
【数10】
これらの較正曲線を使用して、対象物上の特定のコーティングの誤差係数ＥＦｃｕｒｒｅｎｔ、及びベースライン誤差ＢＥｃｕｒｒｅｎｔの値を決定することができる。したがって、参照コーティングについて決定された較正値ａ、ｂ及びｃ、並びに参照コーティングに対する現在のコーティングの反射率の差を補償する誤差係数ＥＦｃｕｒｒｅｎｔ及びベースライン誤差ＢＥｃｕｒｒｅｎｔ値を使用して、現在のコーティングのバイオマス色素表面積密度ｂｉｏｍａｓｓｃｕｒｒｅｎｔの推定値を決定することが可能である。
【0030】
任意選択的に、１つ又はそれ以上のデジタル画像は、潜水艦、例えば、無人潜水艦を使用して取得される。潜水艦は、デジタルカメラ、例えば、ハイパースペクトルカメラを含むことができる。代替的又は追加的に、１つ又はそれ以上のデジタル画像は、ダイバー、船体クローラ、対象物に沿って下降可能なイメージングユニット、（ドライドック）フォトブースなどによって取得することができる。
【0031】
本発明の別の態様によれば、例えば水生環境に恒久的又は断続的に浸漬された対象物上のコーティング上の、水生環境由来のバイオフィルムバイオマスを推定するためのシステムが提供される。システムはプロセッサを含む。プロセッサは、対象物上のコーティングの汚損部分の１つ又はそれ以上のデジタル画像を取得するように構成される。プロセッサは、１つ又はそれ以上の画像のそれぞれから、コーティングの部分のそれぞれの反射率値を決定するように構成される。プロセッサは、１つ又はそれ以上の反射率値に基づいて、バイオマスを表すスペクトル指標の値を決定するように構成される。プロセッサは、スペクトル指標ＳＩ、及び参照コーティングについて決定された１つ又はそれ以上の較正値に基づいて、バイオマス色素表面積密度を計算するように構成される。プロセッサは、対象物のコーティングの反射率に関連する補償を適用することによって、対象物のコーティングの反射率について計算されたバイオマス色素表面積密度を補償するように構成される。
【0032】
任意選択的に、システムはデジタルカメラを含む。デジタルカメラは、１つ又はそれ以上の画像を取得するために使用することができる。カメラによって取得された画像は、スペクトル帯域を取得することができる。カメラは、例えば、汎用デジタルカメラであり得、カメラの赤色、緑色、及び青色チャネルのうちの１つ又はそれ以上、並びに任意選択的に赤外線チャネルをスペクトル帯域として使用することができる。デジタルカメラは、例えば、０～１００ｎｍのＦＷＨＭの帯域幅を有するスペクトル帯域フィルタを含むことができる。カメラは、マルチスペクトルカメラであり得る。マルチスペクトルカメラは、例えば、約６００ｎｍ～約７００ｎｍの赤色スペクトル帯域を有することができる。マルチスペクトルカメラは、約７５０ｎｍ～約９５０ｎｍ又はそれ以上の赤外スペクトル帯域を有することができる。マルチスペクトルカメラは、例えば、約４００ｎｍ～約５００ｎｍの青色スペクトル帯域を有することができる。マルチスペクトルカメラは、例えば、約５００ｎｍ～約６００ｎｍの緑色スペクトル帯域を有することができる。カメラは、ハイパースペクトルカメラであり得る。
【0033】
デジタルカメラは、ダイバーによって保持され得る。任意選択的に、システムは、水線の下の対象物の画像を取得するための潜水艦、例えば、無人潜水艦を含む。代替的又は追加的に、システムは、船体クローラ、対象物に沿って下降可能なイメージングユニット、（ドライドック）フォトブースなどを含む。
【0034】
本発明のさらなる態様によれば、水生環境に恒久的又は断続的に浸漬された対象物上のコーティング上のバイオフィルムバイオマスを推定するためのコンピュータプログラム製品であって、
プログラム可能なコンピュータによって実装されると、コンピュータに、
－対象物上のコーティングの汚損部分の１つ又はそれ以上のデジタル画像を取得させ、
－１つ又はそれ以上の画像のそれぞれから、コーティングの部分に対するそれぞれの反射率値を決定させ、
－１つ又はそれ以上の反射率値に基づいて、バイオマスを表すスペクトル指標の値を決定させ、
－スペクトル指標ＳＩ、及び参照コーティングについて決定された１つ又はそれ以上の較正値に基づいて、バイオマス色素表面積密度を計算させ、かつ
－参照コーティングに対する対象物のコーティングの反射率の差に関連する補償を適用することによって、対象物のコーティングの反射率について計算されたバイオマス色素表面積密度を補償させる、
コンピュータ実装可能命令を含む、コンピュータプログラム製品が提供される。
プログラム可能なコンピュータによって実装されると、コンピュータに、
－対象物上のコーティングの汚損部分の１つ又はそれ以上のデジタル画像を取得させ、
－１つ又はそれ以上の画像のそれぞれから、コーティングの部分に対するそれぞれの反射率値を決定させ、
－１つ又はそれ以上の反射率値に基づいて、バイオマスを表すスペクトル指標の値を決定させ、
－スペクトル指標ＳＩ、及び参照コーティングについて決定された１つ又はそれ以上の較正値に基づいて、バイオマス色素表面積密度を計算させ、かつ
－参照コーティングに対する対象物のコーティングの反射率の差に関連する補償を適用することによって、対象物のコーティングの反射率について計算されたバイオマス色素表面積密度を補償させる、
コンピュータ実装可能命令を含む、コンピュータプログラム製品が提供される。
【0035】
コンピュータプログラム製品は、不揮発性メモリデバイスに記憶することができる。
【0036】
本方法に関して述べたすべての特徴及び選択肢は、システム及びコンピュータプログラム製品に等しく適用され、逆もまた同様であることが理解されよう。上記の態様、特徴及び選択肢のいずれか１つ又はそれ以上を組み合わせることができることも明らかであろう。
【0037】
本発明の実施形態を、添付の図面を参照して詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1】システムの一例を示す。
【0039】
【0040】
【図3】例示的なコーティングの反射率スペクトルを示す。
【0041】
【図4】反射率スペクトルを示す。
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【図8】ＮＤＶＩ推定誤差を示す。
【0048】
【0049】
【図10】スペクトル帯域幅を示す。
【0050】
【図11A】推定誤差を示す。
【0051】
【図11B】推定誤差を示す。
【0052】
【図12】方法の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【0053】
水生環境に恒久的又は断続的に浸漬された対象物は、バイオフィルムによる汚損を受けやすい。そのような汚損バイオフィルムは、一般に、細胞から滲出する細胞外マトリックスに埋め込まれた微生物の多様なコミュニティから構成される。マトリックスは、接着、凝集及び保護を提供する。バイオフィルムのマトリックス形成に一般的に関与する微生物の例には、細菌、古細菌、及び微細藻類、例えば、シアノバクテリア及び原虫が含まれる。これらの種類の微生物は重要な構成要素であるため、水生汚損バイオフィルムは互換的に、微生物汚損と呼ばれる。しかしながら、汚損バイオフィルムに関しては、マトリックスに組み込まれた他のパッセンジャー、例えば、有害生物若しくは非生物堆積物、通常はプランクトン様（例えば植物プランクトン）として分類される包埋細胞、又は小さな多細胞生物、例えば、真菌若しくは少量の糸状藻類を含めることが可能である。
【0054】
汚損成長を低減するために、浸漬された表面（例えば、船体、静止オイルリグ、海洋再生可能装置）を、生物学的成長を完全には防止しないが抑止する海洋汚損制御コーティングで被覆することができる。
【0055】
汚損制御コーティングに見られる海洋バイオフィルムの定量的特徴付けは、コーティングの作用様式及び有効性に関する洞察を提供する。バイオフィルムプロセスを探索するために使用されている多くの技術の中には、顕微鏡検査、リン脂質分析、微小電極、及び光コヒーレンストモグラフィがある。これらの方法の共通点は、それらが小さなバイオフィルムサンプルの収集及び／又は分析に依存することであるが、このため、大きな対象物、例えば、船舶にわたるバイオ汚損の変動性を捕捉するための実用性が限られている。ハイパースペクトルイメージングは、有色生物、例えば、藻類、微細藻類及び／又は細菌、例えば光合成藻類、光合成微細藻類及び／又は光合成細菌による汚損をマッピングするのに非常に適していることが見出されている。
【0056】
浸漬された対象物、例えば、船舶を汚損するバイオフィルムは、一般に光栄養性である。珪藻は、通常、汚損バイオフィルム中の主要な微細藻類構成分類群として報告されている。汚損バイオフィルム中で報告されている他の微細藻類光栄養生物には、シアノバクテリア及びさらなる真核生物が含まれる。藻類分類群は特徴的な反射率スペクトル特徴をもたらす特徴的な色素（例えば、光合成色素及び補助色素）を有するので、有色細菌及び／又は藻類バイオマスは、スペクトル反射率データによって特徴付けることができる。本明細書ではＣｈｌ ａとも表されるクロロフィルａは、すべての光合成基に共通の色素であり、例えば、約６７０ｎｍで強く吸光し、この特徴は一般に他の色素ピークと重ならない。
【0057】
スペクトルイメージングは、定量的なスペクトル反射率データを捕捉するので、藻類のスペクトル特徴から決定することができる藻類バイオマスに関する大きな空間プロセスを調べるのによく適している。スペクトルイメージングは、サンプル由来のバイオフィルムを特徴付ける方法とは対照的に、容易にスケーリングし、したがって、浸漬された対象物のバイオフィルム汚損プロセスを特徴付けるための高い可能性を有する。スペクトルイメージングによって取得された画像は、１つ又はそれ以上の画素を含むことができる。
【0058】
本発明の利点は、構造物上の汚損の全体像を与えるために、広い領域にわたって汚損をマッピングすることが可能で、したがって、注意、例えば、洗浄を特に必要とし得る任意の問題領域を識別するのに役立つことができることである。しかしながら、特定の関心領域に関するより迅速な情報を取得することができるように、より小さな領域、さらには個々の画素にわたって使用されるように適合させることもできる。
【0059】
ハイパースペクトルイメージングは、藻類色素濃度に較正されたハイパースペクトルバイオマス指標を使用して、バイオマスを定量及びマッピングすることができる。クロロフィルａは、一次生産力及びバイオマスの確立されたプロキシであるため、ハイパースペクトル較正に採用することができる。Ｃｈｌ ａは、約６７０ｎｍでの吸光度特徴深さを、他の色素の影響が少ない近赤外又は青色の参照波長での反射率と比較することによって指標化することができる。例は、正規化差分植生指標ＮＤＶＩ、又は微小底生植物指標ＭＰＢＩである。ユーグレニド（緑藻類）及び珪藻（褐藻類）のバイオマスを定量化するさらなる指標も開発されている。
【0060】
バイオフィルム反射率スペクトルは、下にある土台(substrata)のスペクトルによって修正される。海洋輸送では、着色海洋汚損制御コーティングが土台であるため、バイオフィルム汚損のスペクトル測定を行う場合、それらのスペクトルシグネチャを考慮することが必要である。殺生物性防汚コーティングは、例えば、より高い酸化銅含有量のために非常に一般的に赤色又は赤褐色であり、浮体海洋再生可能プラットフォームに塗布されるコーティングは、高い視認性のために黄色であることが要求されるが、一方、ヨット防汚コーティングは、虹色で配合される。これらの着色コーティングはすべて非平坦な反射率スペクトルを有するので、バックグラウンドコーティングのスペクトル反射率が実験結果を歪ませないことを保証するための方法を使用することができる。
【0061】
図１２は、例えば水生環境に恒久的又は断続的に浸漬された対象物のコーティング上の、水生環境由来のバイオフィルムバイオマスを推定するための方法１００を示す。本方法は、
ａ）スペクトル帯域で対象物上のコーティングの汚損部分の１つ又はそれ以上のデジタル画像を取得するステップ１０２と、
ｂ）１つ又はそれ以上の画像のそれぞれから、コーティングの部分に対するそれぞれの反射率値を決定するステップ１０４と、
ｃ）１つ又はそれ以上の反射率値に基づいて、バイオマスを表すスペクトル指標の値を決定するステップ１０６と、
ｄ）スペクトル指標ＳＩ、及び１つ又はそれ以上の較正値に基づいて、バイオマス色素表面積密度を計算するステップ１０８と、
ｅ）対象物のコーティングの反射率に関連する補償を適用することによって、計算されたバイオマス色素表面積密度を、対象物のコーティングの反射率に関して補償するステップ１１０と
を含む。
ａ）スペクトル帯域で対象物上のコーティングの汚損部分の１つ又はそれ以上のデジタル画像を取得するステップ１０２と、
ｂ）１つ又はそれ以上の画像のそれぞれから、コーティングの部分に対するそれぞれの反射率値を決定するステップ１０４と、
ｃ）１つ又はそれ以上の反射率値に基づいて、バイオマスを表すスペクトル指標の値を決定するステップ１０６と、
ｄ）スペクトル指標ＳＩ、及び１つ又はそれ以上の較正値に基づいて、バイオマス色素表面積密度を計算するステップ１０８と、
ｅ）対象物のコーティングの反射率に関連する補償を適用することによって、計算されたバイオマス色素表面積密度を、対象物のコーティングの反射率に関して補償するステップ１１０と
を含む。
【0062】
以下、ステップａ）～ｅ）の例をより詳細に説明する。
【0063】
図１は、例えば水生環境に恒久的又は断続的に浸漬された対象物１４のコーティング１２上の、水生環境由来のバイオフィルムバイオマスを推定するためのシステム１０の一例を示す。この例では、対象物１４は、水線１６の下に部分的に沈められた船舶である。この例では、システム１０は、スペクトル帯域で対象物１４上のコーティングの汚損部分２０の１つ又はそれ以上のデジタル画像を取得するように配置構成されたデジタルカメラ１８、例えば、ハイパースペクトルカメラを含む。スペクトル帯域は、例えば、０～１００ｎｍのＦＷＨＭ（半値全幅）の範囲のスペクトル幅を有することができる。デジタルカメラは、１つ又はそれ以上の画素を含むことができる。デジタルカメラは、ラインスキャンカメラと呼ばれる場合もある１Ｄセンサアレイを含むことができる。デジタルカメラは、２Ｄセンサアレイを含むことができる。
【0064】
システム１０は、カメラ１８に接続された、又は接続可能なプロセッサ２２を含む。プロセッサは、システムの水中部分の一部分であり得る。プロセッサがシステムの水面上部分の一部分であることも可能である。プロセッサ２２は、カメラから、対象物上のコーティングの汚損部分の１つ又はそれ以上のデジタル画像を取得するように配置構成される。プロセッサ２２は、１つ又はそれ以上の画像のそれぞれから、コーティングの部分のそれぞれの反射率値を決定するように配置構成される。プロセッサは、１つ又はそれ以上の反射率値に基づいて、バイオマスを表すスペクトル指標の値を決定するように配置構成される。プロセッサ２２は、スペクトル指標ＳＩ、及び参照コーティングについて決定された１つ又はそれ以上の較正値に基づいて、バイオマス色素表面積密度を計算するように配置構成される。プロセッサ２２は、参照コーティングに対する対象物のコーティングの反射率の差に関連する補償を適用することによって、計算されたバイオマス色素表面積密度を、対象物のコーティングの反射率に関して補償するように配置構成される。これについては、以下でより詳細に説明する。
【0065】
以下の実験は、対象物のコーティングの反射率に関連する補償を適用することによって、計算されたバイオマス色素表面積密度を対象物のコーティングの反射率に関して補償することによって、微生物汚損バイオマスの良好な推定値を達成できることを実証している。
【0066】
バイオフィルム実験
実験は、実世界の海洋微生物船舶汚損で観察されたものに近似する培養微細藻類及び細菌バイオフィルムに基づいていた。様々な密度の単一培養バイオフィルムを調製した。単一培養種は、微生物汚損集団に存在すると文献で報告されている、及び／又は汚損バイオフィルム試料で観察された藻類群から選択された。サンプリングされた海洋汚損物から播種された混合集団微細藻類及び細菌バイオフィルムも調製し、試験して、分類学的不均一性の影響に関する洞察を提供した。
実験は、実世界の海洋微生物船舶汚損で観察されたものに近似する培養微細藻類及び細菌バイオフィルムに基づいていた。様々な密度の単一培養バイオフィルムを調製した。単一培養種は、微生物汚損集団に存在すると文献で報告されている、及び／又は汚損バイオフィルム試料で観察された藻類群から選択された。サンプリングされた海洋汚損物から播種された混合集団微細藻類及び細菌バイオフィルムも調製し、試験して、分類学的不均一性の影響に関する洞察を提供した。
【0067】
バイオフィルムをガラス上で成長させ、同じバイオフィルムを異なる色のバックグラウンドで測定することができるように、汚損されたガラスをスペクトルイメージングのために６つのコーティング色のそれぞれの上に配置した。
【0068】
バイオフィルム培養
単培養：２つの珪藻種（アクナンテス属の種(Achnanthes sp)、ＣＣＡＰ１０９５／１、アンフォラ属の種(Amphora sp)、ＣＣＡＰ１００１／３）、緑藻類（クロレラ属の種(Chlorella sp)、ＣＣＡＰ２１１／５３）、及びシアノバクテリウム（ノジュラリア属の種(Nodularia sp)、ＣＣＡＰ１４５２／６）の単培養物を、Ｓｃｏｔｔｉｓｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｚｏａ（ＳＡＭＳ ＣＣＡＰ）から入手した。各種について、元の種培養物（２０ｍＬ）を１８℃で１２時間のオン／オフ照明サイクル下（Ｓｙｌｖａｎｉａ Ｔ８白色蛍光８４０＋温白色蛍光８４０(Lorenz et al.,2005,Maintenance of Actively Metabolizing Microalgal Cultures.Algal culturing techniques,145)で、３×１２５ｍＬの細胞懸濁液にスケールアップした。微細藻類を、ＣＣＡＰ仕様に従って、栄養富化された人工海水微細藻類成長培地：Ｇｕｉｌｌａｒｄのｆ２＋Ｓｉ、すなわち、珪藻成長を支援するためにシリカを添加した一般的な海洋微細藻類成長培地（アクナンテス属、アンフォラ属）、Ｇｕｉｌｌａｒｄのｆ２、すなわち、シリカを含まないもの（クロレラ属）(Guillard and Ryther,1962,Studies of marine planktonic diatoms:I.Cyclotella nana Hustedt,and Detonula confervacea(Cleve)Gran.Canadian journal of microbiology,8,229-239)、又は藍藻類（ノジュラリア属）の培養のために開発されたＢｌｕｅ Ｇｒｅｅｎ Ｍｅｄｉａ(Stanier et al.,1971,Purification and properties of unicellular blue-green algae(order Chroococcales).Bacteriological reviews,35,171)において培養した。
単培養：２つの珪藻種（アクナンテス属の種(Achnanthes sp)、ＣＣＡＰ１０９５／１、アンフォラ属の種(Amphora sp)、ＣＣＡＰ１００１／３）、緑藻類（クロレラ属の種(Chlorella sp)、ＣＣＡＰ２１１／５３）、及びシアノバクテリウム（ノジュラリア属の種(Nodularia sp)、ＣＣＡＰ１４５２／６）の単培養物を、Ｓｃｏｔｔｉｓｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｚｏａ（ＳＡＭＳ ＣＣＡＰ）から入手した。各種について、元の種培養物（２０ｍＬ）を１８℃で１２時間のオン／オフ照明サイクル下（Ｓｙｌｖａｎｉａ Ｔ８白色蛍光８４０＋温白色蛍光８４０(Lorenz et al.,2005,Maintenance of Actively Metabolizing Microalgal Cultures.Algal culturing techniques,145)で、３×１２５ｍＬの細胞懸濁液にスケールアップした。微細藻類を、ＣＣＡＰ仕様に従って、栄養富化された人工海水微細藻類成長培地：Ｇｕｉｌｌａｒｄのｆ２＋Ｓｉ、すなわち、珪藻成長を支援するためにシリカを添加した一般的な海洋微細藻類成長培地（アクナンテス属、アンフォラ属）、Ｇｕｉｌｌａｒｄのｆ２、すなわち、シリカを含まないもの（クロレラ属）(Guillard and Ryther,1962,Studies of marine planktonic diatoms:I.Cyclotella nana Hustedt,and Detonula confervacea(Cleve)Gran.Canadian journal of microbiology,8,229-239)、又は藍藻類（ノジュラリア属）の培養のために開発されたＢｌｕｅ Ｇｒｅｅｎ Ｍｅｄｉａ(Stanier et al.,1971,Purification and properties of unicellular blue-green algae(order Chroococcales).Bacteriological reviews,35,171)において培養した。
【0069】
混合集団培養ＨＰ（ハートルプール(Hartlepool)）：ＨＰ培養の供給源集団は、英国北東部の海岸にあるハートルプールマリーナに３～６ヶ月間、水面下およそ０．５ ｍに浸漬した無毒性パネルから収集したバイオフィルムであった。バイオフィルム試料をＧｕｉｌｌａｒｄのｆ２＋Ｓｉ培地に混合して５００ｍＬの細胞懸濁液を作成し、１２５μｍフィルタで濾過して大きな粒子を除去した。
【0070】
混合集団培養ＩＰ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｉｎｔ）：ＩＰ培養の供給源集団は、シンガポールのラッフルズ(Raffles)マリーナに１ヶ月間、水面下およそ０．５ｍに浸漬した無毒性パネルから収集したバイオフィルムであった。バイオフィルム試料を海水に混合して細胞懸濁液を作成し、１２５μｍフィルタで濾過して大きな粒子を除去した。１Ｌ細胞懸濁培養物を２５℃、１２時間のオン／オフ照明サイクル（５８Ｗ Ｍａｒｉｎｅ Ｗｈｉｔｅ、Ａｃｔｉｎｉｃ Ｂｌｕｅ、Ａｒｃａｄｉａ）下で、Ｇｕｉｌｌａｒｄのｆ２＋Ｓｉ栄養培地で富化された人工海水を含有する、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｉｎｔ製２５０Ｌ再循環混合集団独立栄養海洋バイオフィルム培養システム(Longyear,2014,Section 2 Mixed population fermentor.Biofouling Methods,214)にスケールアップした。
【0071】
バイオフィルム形成
すべてのバイオフィルムは、ガラス製カバースリップ（円形、直径１９ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で成長させた。バイオフィルムは壊れやすいので、支持のためにガラス顕微鏡スライド上にカバースリップを置き（２５×７５ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ、スライドあたり２～３枚）、マイクロプレートシーリングフィルムで固定した。シーリングフィルムに、クラフト穴パンチを用いて作成した円形穴（直径９ｍｍ）で事前に穿刺し、下にあるカバースリップの中心に置いた。この構成では、各カバースリップの中央領域のみを汚損に曝露させた。成長期間後にマスキングフィルムを除去した場合、得られたバイオフィルムは明確に画定された周縁部を有し、清浄なガラスの対照的な領域によって囲まれていた。
すべてのバイオフィルムは、ガラス製カバースリップ（円形、直径１９ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で成長させた。バイオフィルムは壊れやすいので、支持のためにガラス顕微鏡スライド上にカバースリップを置き（２５×７５ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ、スライドあたり２～３枚）、マイクロプレートシーリングフィルムで固定した。シーリングフィルムに、クラフト穴パンチを用いて作成した円形穴（直径９ｍｍ）で事前に穿刺し、下にあるカバースリップの中心に置いた。この構成では、各カバースリップの中央領域のみを汚損に曝露させた。成長期間後にマスキングフィルムを除去した場合、得られたバイオフィルムは明確に画定された周縁部を有し、清浄なガラスの対照的な領域によって囲まれていた。
【0072】
単培養及び混合培養ＨＰのために、バイオフィルムを４ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で成長させた（集団あたり２～３プレート）。一定範囲のバイオフィルム密度を培養するために、それぞれ１０ｍＬウェルに添加した栄養培地に対する接種物（親培養物）の比を順次増加させ、最終ウェルは接種物のみを含有していた。プレートを密封し、バイオフィルムを１８℃で１２時間のオン／オフ照明サイクル下で培養した（Ｓｙｌｖａｎｉａ Ｔ８白色蛍光８４０＋温白色蛍光８４０(Lorenz et al.,2005,Maintenance of Actively Metabolizing Microalgal Cultures.Algal culturing techniques,145)。２週間ごとに、１ウェルあたり５ｍＬの栄養培地を、バイオフィルムを破壊しないように注意しながら血清学的ピペッティングによって置き換え、目に見える様々な密度のバイオフィルムがマスキングフィルム及び露出ガラスにわたって発達するまでプレートを再密封した。成長期間（２ヶ月ほど）後、マスキングを除去し、各集団からのバイオフィルムを含む８～１２個のスリップをイメージングのために調製した。
【0073】
混合培養ＩＰのために、スライドを、再循環培養系に組み込まれた、照射された８ｃｍの深さのチャネルの中に水平に置いた。数週間にわたって、空間的に不均一なバイオフィルムは、スライドを含むチャネルのすべての表面に定着した。スライドをチャネルから除去し、マスキングを除去した。一連のバイオフィルム密度によって汚損されたカバースリップ及び組成物をイメージングのために調製した。
【0074】
機器構成
バイオフィルムをハイパースペクトル線走査システム（共振ベンチトップｐｉｋａＸＣ、３７７～１０２９ｎｍ、３．３ｎｍ波帯、２００チャネル、１７ｍｍ焦点距離のＳｃｈｎｅｉｄｅｒ対物レンズ、３０．８°視野）でイメージングした。この機器では、サンプルがレンズの下の自動並進ステージに設置され、イメージャが幅１６００画素の単一行のスペクトルを収集し、サンプルステージが視野（ＦＯＶ）を横切って移動するに従って、ユーザ定義のフレームレートでデータを連続的に取り込むことによって画像が作成される。各画素の空間幅寸法は、レンズＦＯＶ及びレンズからイメージング面までの距離によって決定される。各画素の長さ寸法は、直線状並進ステージの速度及びフレームレートによって決定される。イメージングシステムは、およそ０．０６ｍｍ×０．０６ｍｍのほぼ正方形のアスペクト比の画素を生成するように設定され、これにより、７５ ｍｍの顕微鏡スライドの全長を単一の走査内でイメージングすることが可能になった。
バイオフィルムをハイパースペクトル線走査システム（共振ベンチトップｐｉｋａＸＣ、３７７～１０２９ｎｍ、３．３ｎｍ波帯、２００チャネル、１７ｍｍ焦点距離のＳｃｈｎｅｉｄｅｒ対物レンズ、３０．８°視野）でイメージングした。この機器では、サンプルがレンズの下の自動並進ステージに設置され、イメージャが幅１６００画素の単一行のスペクトルを収集し、サンプルステージが視野（ＦＯＶ）を横切って移動するに従って、ユーザ定義のフレームレートでデータを連続的に取り込むことによって画像が作成される。各画素の空間幅寸法は、レンズＦＯＶ及びレンズからイメージング面までの距離によって決定される。各画素の長さ寸法は、直線状並進ステージの速度及びフレームレートによって決定される。イメージングシステムは、およそ０．０６ｍｍ×０．０６ｍｍのほぼ正方形のアスペクト比の画素を生成するように設定され、これにより、７５ ｍｍの顕微鏡スライドの全長を単一の走査内でイメージングすることが可能になった。
【0075】
並進ステージは、広スペクトル石英ハロゲンランプ（Ｒｅｓｏｎｏｎ）の四光アセンブリによって可視及び近赤外スペクトル（約３８０ｎｍ～約９８０ｎｍの範囲）にわたって照射された。画像のダイナミックレンジは、白色テフロン（Ｒｅｓｏｎｏｎ）片から測定された反射率スペクトルが機器の１４ビット感度に及ぶが飽和しないように、レンズ虹彩を使用して機器の露出レベルを手動で設定することによって最大化された。
【0076】
機器の電気ノイズスペクトルを、レンズキャップを適所に置いて収集し、製造業者によって指定された機器ソフトウェア（Ｓｐｅｃｔｒａｎｏｎ）の暗補正を使用して明らかにした。ランプの位置決めによるイメージング視野にわたる可変照射を、無地の白色テフロンパネルをイメージングすることによって測定し、製造業者によって推奨される標準応答補正機能を使用してソフトウェアで明らかにした。
【0077】
画像処理中の反射率較正を可能にするために、各実験画像視野の中央に、スペクトラロン反射率標準（３６０～１１００ｎｍからの５０％フラットスペクトル応答、ＮＩＳＴ認定）を含めた。
【0078】
バイオフィルムイメージング
各バイオフィルムは、コーティングされた顕微鏡スライド上にカバースリップを静かに再度配置するプロセスを通して、下にあるバックグラウンドの色を変えて繰り返しイメージングされた。
各バイオフィルムは、コーティングされた顕微鏡スライド上にカバースリップを静かに再度配置するプロセスを通して、下にあるバックグラウンドの色を変えて繰り返しイメージングされた。
【0079】
非毒性バックグラウンド：汚損剥離コーティングＩｎｔｅｒｓｌｅｅｋ（商標）９００（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｉｎｔ，Ｌｔｄ）の灰色スケール（白色、灰色、黒色）及び原色（赤色、黄色及び青色）の変形を、それらが輝度レベル及びスペクトル特徴の範囲を表し、また非毒性であったので選択した。コーティングを、コーティングの指定された塗布スキームに従って、防食プライマー及び汚損剥離タイコート（Ｉｎｔｅｒｓｈｉｅｌｄ（商標）３００及びＩｎｔｅｒｓｌｅｅｋ（商標）７５７）上のガラス顕微鏡スライドにローラーによって塗布した。スライドをハートルプールマリーナの海水に数ヶ月浸漬し、回収し、スポンジで完全に洗浄した。
【0080】
バイオフィルム転写及び反復イメージング：第１のカラー顕微鏡スライドを反転ウェルプレートカバーに置き、人工海水を浅い深さ（＜２ｍｍ）まで満たした。バイオフィルムを有する３つ又は４つのカバースリップを、バイオフィルムが外れないように注意しながら、鉗子を用いて各スライドの上に静かに置いた。培養物あたりのすべてのバイオフィルム（それぞれ８～１２のバイオフィルム）が皿に装填されたとき、画像を収集した。次いで、次の組のカラースライドを第１のカラースライドに隣接して配置し、鉗子を用いてカバースリップを１つの色から別の色まで静かにスライドさせ、その後、第１のカラースライドを除去した。第２の組のスライドを皿の中央に置き、第２の画像を収集したなどであった。皿の中の水はハロゲンランプの下で温められたので、およそ２つの画像ごとに交換された。色が使用される順序は、任意の少量のバイオマスが移送中に取り除かれた場合（しかし、これはほとんど観察されなかった）に順序の影響を最小限に抑えるように任意に選択された。この戦略を使用することにより、全く同じバイオフィルムから異なる色のバックグラウンドを有するスペクトルを獲得し、したがって、唯一の変数としてバックグラウンド色を制限することができる。
【0081】
バイオフィルム色素分析
色素分析が、微細藻類バイオマスの従来の定量的だが破壊的な測定基準を提供し、後処理スペクトル指標較正の基礎データセットを生成した。
色素分析が、微細藻類バイオマスの従来の定量的だが破壊的な測定基準を提供し、後処理スペクトル指標較正の基礎データセットを生成した。
【0082】
色素抽出：バイオフィルムイメージング後、バイオフィルム及びカバースリップをガラス繊維フィルタ（０．４５μｍ）に挟み、瞬間凍結し、抽出（８～１０ヶ月）まで凍結保存容器(cryostorage)（ＬＮ２気相）に置いた。細胞膜を破裂するために１分間の超音波処理（５５ワットＱＳｏｎｉｃａソニケーター）を用いて、１ｍＬの冷却メタノール（ＭｅＯＨ、１００％、分析グレード）中で藻類色素を抽出し、バイオフィルムマトリックスを破壊し、次いでインライン０．４５μｍフィルター（Ｗａｔｍａｎ）を通して注入して残留沈殿物を除去した。
【0083】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：バイオフィルム抽出物のＨＰＬＣ分析は、Ｖａｎ Ｈｅｕｋｅｌｅｍ及びＴｈｏｍａｓ(Van Heukelem and Thomas,2001,Computer-assisted high-performance liquid chromatography method development with applications to the isolation and analysis of phytoplankton pigments.Journal of Chromatography A,910,31-49)によって概説された方法に従い、ダイオードアレイ検出器（ＵＶシグナル／波長＝４５０ｎｍ／４、波長範囲３５０～７５０ｎｍ）及びＺｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ８（ＲＰ、３．５ｕｍ、４．６×１５０ｍｍ）カラムを有するＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ １１００機器（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）での使用のために調整した。分析の日に、最大１８個のサンプルを、実行前に、緩衝液（２８ｍＭ水性テトラブチルアンモニウムアセテート（ＴＢＡＡ）、ｐＨ６．５）と１：１調製で最初に混合し、琥珀色のバイアルに入れ、冷却したオートサンプラー内で５℃で待機させ、一晩実行した。移動相Ａ（７０：３０（ｖ／ｖ）メタノール、２８ｍＭ ＴＢＡＡ水溶液、ｐＨ６．５）及びＢ（メタノール）を、６０℃のカラム温度で、プロファイル［０分：９５％Ａ、５％Ｂ；２２分：５％Ａ、９５％Ｂ；３１分、９５％Ａ、５％Ｂ］に従って１．１ｍｌ／分のフローによって導入した。
【0084】
色素面積密度の決定：ＨＰＬＣ機器及び方法を、微生物で汚損された船舶及び浸漬板試料にしばしば見られる微細藻類群、例えば、珪藻、緑藻類、シアノバクテリア、渦鞭毛藻類及びクリプトフィテスに見られる１６種の微細藻類色素のピーク高さについて較正した。色素は、商業的供給業者ＤＨＩからのクロロフィルａ、ｂ及びｃ２、ペリジニン、プラシノキサンチン、ビオラキサンチン、ルテイン、フコキサンチン、ゼアキサンチン、ベータ－カロテン、ジアジノキサンチン；アロキサンチン；ミクソキサントフィル；ジビニルクロロフィルａ、１９－ヘキサ－フコキサンチン；及びネオキサンチンである。実験試料のクロマトグラムを分析し、較正された色素に関連する各ピークの絶対保持時間及び相対保持時間並びにＵＶ吸光度スペクトルによってピーク同一性を確認した。各バイオフィルム中の１６個の較正された色素の濃度［ｎｇ／ｍＬ ＭｅＯＨ］を、クロマトグラムピーク高さから決定した。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ．１．５１ｄ）で実験画像をスケーリングした後、手動画素選択ツールを用いて測定した各色素濃度を、バイオフィルム面積で割ることによって、濃度を色素表面積密度［μｇ／ｃｍ２］に変換した。
【0085】
ハイパースペクトル指標からのバイオマス推定
スペクトル指標値をバイオマスの推定値に変換するための較正式の開発を通じて、非破壊ハイパースペクトル測定及び破壊的色素分析測定を連結した。
スペクトル指標値をバイオマスの推定値に変換するための較正式の開発を通じて、非破壊ハイパースペクトル測定及び破壊的色素分析測定を連結した。
【0086】
バックグラウンドコーティング反射率スペクトル
図２Ａは、カバースリップの清浄な領域からコーティング反射率スペクトルがどのように測定されたか（実線、１）、すべてのバイオマスを含む関心領域ＲＯＩからバイオフィルムスペクトルがどのように測定されたか（点線、２）、及びバイオフィルムを取り囲む清浄なガラスのＲＯＩからペアの局所的なコーティングスペクトルがどのように測定されたか（斜線領域、３）を示す。コーティングの平均反射率スペクトルＲｃｏａｔｉｎｇを、イメージャのソフトウェアパッケージ（Ｓｐｅｃｔｒａｎｏｎ、バージョン２．６８、Ｒｅｓｏｎｏｎ、ＭＴ、米国）の手動選択ツールを使用して、ハイパースペクトル画像のガラスカバースリップの清浄な領域の周りに描かれたＲＯＩから測定した（図２Ａの１を参照）。５０％反射率標準Ｒｒｅｆの平均反射率スペクトル（図２Ｂの４を参照）もハイパースペクトル画像から測定した。測定されたコーティングスペクトルは、反射率標準のスペクトルにスケーリングすることによって、輝度デジタル数測定値［ＤＮ］から入射光の反射率［０～１００％］に変換され、ここで、
である。
図２Ａは、カバースリップの清浄な領域からコーティング反射率スペクトルがどのように測定されたか（実線、１）、すべてのバイオマスを含む関心領域ＲＯＩからバイオフィルムスペクトルがどのように測定されたか（点線、２）、及びバイオフィルムを取り囲む清浄なガラスのＲＯＩからペアの局所的なコーティングスペクトルがどのように測定されたか（斜線領域、３）を示す。コーティングの平均反射率スペクトルＲｃｏａｔｉｎｇを、イメージャのソフトウェアパッケージ（Ｓｐｅｃｔｒａｎｏｎ、バージョン２．６８、Ｒｅｓｏｎｏｎ、ＭＴ、米国）の手動選択ツールを使用して、ハイパースペクトル画像のガラスカバースリップの清浄な領域の周りに描かれたＲＯＩから測定した（図２Ａの１を参照）。５０％反射率標準Ｒｒｅｆの平均反射率スペクトル（図２Ｂの４を参照）もハイパースペクトル画像から測定した。測定されたコーティングスペクトルは、反射率標準のスペクトルにスケーリングすることによって、輝度デジタル数測定値［ＤＮ］から入射光の反射率［０～１００％］に変換され、ここで、
【数11】
【0087】
図３は、白色（Ｗ）、灰色（Ｇ）及び黒色（Ｂｋ）コーティングの反射率スペクトルが比較的平坦（それぞれ６４％、２４％、及び１％の平均反射率）であった一方で、黄色（Ｙ）、赤色（Ｒ）及び青色（Ｂｌ）の原色コーティングのスペクトルは、色固有の反射率及び吸光度特徴を有していたことを示す。
【0088】
この実験では、ハイパースペクトル画像の灰色（Ｇ）のコーティングサブセットが、ハイパースペクトル指標を較正するための参照コーティングとして選択されたが、これは、コーティングが、先に公開された自然沈殿物のスペクトルと密接に一致する平坦なスペクトル応答及び全体的な反射率を有することが分かったからである。しかしながら、任意の他のコーティング又は基材を参照として選択することができることが理解されよう。
【0089】
バイオフィルム反射率スペクトル
各培養物（ｃ）の各バイオフィルム（ｎ）に関して、バイオフィルムの周囲の輪郭を描くＲＯＩに対する平均スペクトルＲｂｉｏｍ（ｃ，ｎ）を測定した（図２Ａ、矢印２）。各バイオフィルムに局所的な、バイオフィルムを取り囲む清浄なガラス製カバースリップの領域を封入する灰色コーティングＲＯＩ Ｒｇｒｅｙｍ（ｃ，ｎ）も定義された（図２Ａ、矢印３）。表面が完全に平坦ではなく、照射の局所的な変動を引き起こすため、局所的なコーティングスペクトルを測定した。
各培養物（ｃ）の各バイオフィルム（ｎ）に関して、バイオフィルムの周囲の輪郭を描くＲＯＩに対する平均スペクトルＲｂｉｏｍ（ｃ，ｎ）を測定した（図２Ａ、矢印２）。各バイオフィルムに局所的な、バイオフィルムを取り囲む清浄なガラス製カバースリップの領域を封入する灰色コーティングＲＯＩ Ｒｇｒｅｙｍ（ｃ，ｎ）も定義された（図２Ａ、矢印３）。表面が完全に平坦ではなく、照射の局所的な変動を引き起こすため、局所的なコーティングスペクトルを測定した。
【0090】
スペクトル指標によるバイオマスの推定
微細藻類リモートセンシングの文献から引き出された２つのハイパースペクトル指標を、スペクトル的に変動した実験バイオフィルムのバイオマスを推定するためのそれらの適合性について評価した。色素の空間密度に対する指標の較正は、それらの推定誤差によってランク付けされた。
微細藻類リモートセンシングの文献から引き出された２つのハイパースペクトル指標を、スペクトル的に変動した実験バイオフィルムのバイオマスを推定するためのそれらの適合性について評価した。色素の空間密度に対する指標の較正は、それらの推定誤差によってランク付けされた。
【0091】
スペクトル指標：様々な指標は、可視及び近赤外スペクトルにわたる波長を組み合わせている。以下の表１は、微細藻類バイオマスハイパースペクトル指標の詳細を提供する。
【0092】
ここで、Ｒ６７３は、６７３ｎｍ付近の範囲、例えば６０５～７４０ｎｍの範囲、例えば６７３ｎｍにおける決定された反射率値であり；Ｒ８００は、８００ｎｍ付近の範囲、例えば７２０～９００ｎｍの範囲、例えば８００ｎｍにおける決定された反射率値であり；Ｒ６７３ｃｌｅａｎは、６７３ｎｍ付近の範囲、例えば６０５～７４０ｎｍの範囲、例えば６７３ｎｍにおける、バイオマスを含まない対象物のコーティングの反射率値である。
【0093】
【表1】
【0094】
バイオマスに対する指標較正：非線形最小二乗推定によって適合された指数モデルを定義して、バイオフィルムデータセットから計算されたスペクトル指標Ｒｂｉｏｎｏｒｍ（ｇ）と選択されたバイオフィルム色素の空間密度との間の関係を記述し、ここで、
である。
【数12】
【0095】
この適合から、較正値ａ、ｂ及びｃが決定される。
【0096】
２つの指標ｒＮｏｒｍ及びＮＤＶＩの指標値を、すべての正規化バイオフィルムスペクトルについて計算し、広く受け入れられているバイオマスプロキシである、普遍的な光合成色素クロロフィルａのバイオフィルム密度と比較した。
【0097】
指標にわたるバイオマス推定誤差の比較：（色素表面積密度として測定された）指標がバイオマスをどの程度良好に推定したかの定量的評価を行うために、指数モデルを反転して変換式
とした。
【数13】
【0098】
すべてのバイオフィルムについて、Ｒｂｉｏｎｏｒｍ（ｇ）から計算された指標値をバイオマス推定値に変換し、すべての指標について残差平方和及び平均推定誤差（推定－測定色素密度）を計算した。
【0099】
任意の色の背景におけるバイオマス推定
汚損制御コーティングは、標準的な色及びカスタム色の範囲に着色され、それぞれが、任意の汚損微細藻類のスペクトル特徴よりも潜在的に大きい特徴的なスペクトル反射率及び吸光度特徴を有する。上記で導出された指標較正は、６つの着色コーティングにわたる微細汚損への普遍的な適用性について試験された。
汚損制御コーティングは、標準的な色及びカスタム色の範囲に着色され、それぞれが、任意の汚損微細藻類のスペクトル特徴よりも潜在的に大きい特徴的なスペクトル反射率及び吸光度特徴を有する。上記で導出された指標較正は、６つの着色コーティングにわたる微細汚損への普遍的な適用性について試験された。
【0100】
色特異的なコーティング正規化バイオフィルム反射率スペクトル
白色、黒色、赤色、青色及び黄色のコーティングハイパースペクトル画像のコーティング及びバイオフィルムスペクトルを、灰色コーティングデータセットについて概説した手順に従って処理した：バイオフィルム及び局所コーティングスペクトルの測定（Ｒｂｉｏｍ、Ｒｃｏａｔｉｎｇｍ）、パーセント反射率への変換、及びすべてのバイオフィルムスペクトルの局所コーティング測定への正規化（Ｒｂｉｏｎｏｒｍ（ｗ）、Ｒｂｉｏｎｏｒｍ（ｂｋ）、Ｒｂｉｏｎｏｒｍ（ｒ）、Ｒｂｉｏｎｏｒｍ（ｂｌ）、Ｒｂｉｏｎｏｒｍ（ｙ））。元の灰色正規化データ（Ｒｂｉｏｎｏｒｍ（ｇ））も分析に含めた。
白色、黒色、赤色、青色及び黄色のコーティングハイパースペクトル画像のコーティング及びバイオフィルムスペクトルを、灰色コーティングデータセットについて概説した手順に従って処理した：バイオフィルム及び局所コーティングスペクトルの測定（Ｒｂｉｏｍ、Ｒｃｏａｔｉｎｇｍ）、パーセント反射率への変換、及びすべてのバイオフィルムスペクトルの局所コーティング測定への正規化（Ｒｂｉｏｎｏｒｍ（ｗ）、Ｒｂｉｏｎｏｒｍ（ｂｋ）、Ｒｂｉｏｎｏｒｍ（ｒ）、Ｒｂｉｏｎｏｒｍ（ｂｌ）、Ｒｂｉｏｎｏｒｍ（ｙ））。元の灰色正規化データ（Ｒｂｉｏｎｏｒｍ（ｇ））も分析に含めた。
【0101】
全コーティング上のバイオマスの推定
２つのスペクトル指標の値を、６つすべてのコーティング色及びすべてのバイオフィルムのコーティング正規化バイオフィルム反射率スペクトルから計算した。次いで、較正された変換式を使用して、すべてのコーティング上のすべてのバイオフィルムのすべての指標値からバイオマスを推定した。
２つのスペクトル指標の値を、６つすべてのコーティング色及びすべてのバイオフィルムのコーティング正規化バイオフィルム反射率スペクトルから計算した。次いで、較正された変換式を使用して、すべてのコーティング上のすべてのバイオフィルムのすべての指標値からバイオマスを推定した。
【0102】
バイオマス推定誤差（推定値から測定色素密度を引いたもの）を、各指標及び各カラーコーティングについて計算した。バイオマスに関連する推定誤差パターンを調べるために、各コーティング色データセットの誤差を測定されたバイオマスと比較し、線形回帰と適合させて、ベースライン誤差（切片）及び誤差係数（傾き）を決定した。各コーティング色の誤差係数及びベースライン推定誤差を、指標波長におけるコーティング反射率値の最小値と比較した。ＮＤＶＩについては、例えば、各カラーコーティングの誤差係数及びベースライン誤差を、６７３ｎｍ及び８００ｎｍにおけるコーティング反射率の最小値と比較した。対数方程式を計算して、ベースライン推定誤差と誤差係数との間の関係、及び指標波長におけるコーティング反射率を記述した。
【0103】
結果
バイオフィルム形成
全体として、実験的な培養方法は、様々な密度の空間的に定義された６組のバイオフィルムを首尾よくもたらした。
バイオフィルム形成
全体として、実験的な培養方法は、様々な密度の空間的に定義された６組のバイオフィルムを首尾よくもたらした。
【0104】
ＨＰＬＣによって測定したバイオフィルム顔料
単一培養：すべての種にわたって、クロロフィルａが主要な色素であり、最も高い密度で存在した。珪藻種については、フコキサンチンも高レベルで存在し、注目すべき少量の色素には、ｃｈｌ ｃ２、ベータカロテン、及びアンフォラ属の種ではジアジノキサンチンが含まれた。ノジュラリア属の種の副色素群はベータカロテンのみに限定されたが、ＨＰＬＣで測定できない追加のフィコビリン色素も存在し、バイオフィルム反射率スペクトルの構造化に寄与した可能性が高い。クロレラ属の種のバイオフィルムは、高レベルのクロロフィルｂ、及び検出可能なレベルの微量色素ビオラキサンチン、アロキサンチン、ゼアキサンチン、ルテイン、及びベータカロテンを含有していた。
単一培養：すべての種にわたって、クロロフィルａが主要な色素であり、最も高い密度で存在した。珪藻種については、フコキサンチンも高レベルで存在し、注目すべき少量の色素には、ｃｈｌ ｃ２、ベータカロテン、及びアンフォラ属の種ではジアジノキサンチンが含まれた。ノジュラリア属の種の副色素群はベータカロテンのみに限定されたが、ＨＰＬＣで測定できない追加のフィコビリン色素も存在し、バイオフィルム反射率スペクトルの構造化に寄与した可能性が高い。クロレラ属の種のバイオフィルムは、高レベルのクロロフィルｂ、及び検出可能なレベルの微量色素ビオラキサンチン、アロキサンチン、ゼアキサンチン、ルテイン、及びベータカロテンを含有していた。
【0105】
混合培養：ＨＰバイオフィルムでは、ｃｈｌ ａが主要色素であり、最大密度は１．６μｇ／ｃｍ２であり、ほとんどの単培養物と同様の密度の範囲を与えた。フコキサンチンが次の主要な色素であり、これらのバイオフィルムに珪藻が豊富に存在するという観察結果が確認された。残りの一連の色素のうち、ｃｈｌ ｂは緑藻類の存在を示し、アロキサンチンはクリプトフィテスの存在を示したが、ベータカロテンの高い値はいずれの分類群にも容易に起因しなかった。
【0106】
ＩＰバイオフィルムのｃｈｌ ａ密度の範囲は、アクナンテス属の種の単一培養を除いた他のすべての培養物よりもはるかに大きかった（最大密度６μｇ／ｃｍ２）。フコキサンチンは非常に少量しか存在せず、これらの試料では珪藻が優勢ではなかったことを示し、顕微鏡法と一致した。顕微鏡法によって観察された小型の赤褐色鞭毛状単細胞藻類の同一性を示唆する、クリプトフィテスを示すアロキサンチンは、より赤みがかったバイオフィルムに高度に濃縮されていた。比較的高いレベルのｃｈｌ ｂは、緑藻類の存在を示し、バイオフィルムの一部の明るいライムグリーンの外観と一致した。識別できないものを含む多様な追加の色素は、ＩＰバイオフィルムの多様性及び不均一性を強調した。
【0107】
高スペクトル指標からのバイオマス推定
微細藻類バイオフィルム反射率スペクトル
６組の実験室バイオフィルムから測定された反射率スペクトルは、様々な特徴的な吸光度特徴を有しており、これは、図４に示す吸光度スペクトルに見られるように、灰色コーティングのバックグラウンドの平坦なスペクトル反射率に対して非常に可視であった。図４は、６組の実験室バイオフィルムの反射率スペクトルを示し、ｙ軸は観察された反射率範囲を示す。スペクトルの特徴が深くなることは、より高密度のバイオマスを示している。パネル（ａ）はアクナンテス属の種のバイオフィルムを、（ｂ）はアンフォラ属の種を、（ｃ）はＨＰ混合培養バイオフィルムを、（ｄ）はノジュラリア属の種のバイオフィルムを、（ｅ）はクロレラ属の種のバイオフィルムを、（ｆ）はＩＰ混合培養バイオフィルムを示す。４００ｎｍ未満の測定値には有意なノイズがあり、かつ最小の照度であったため、４００ｎｍ未満の波長は実験ではさらに考慮しなかった。赤外線では、ノイズの増加とは別に、８５０ｎｍから１１００ｎｍへの反射率スペクトルの観察可能な変化はほとんどなかったため、８５０ｎｍを超える波長も実験ではさらに考慮されなかった。
微細藻類バイオフィルム反射率スペクトル
６組の実験室バイオフィルムから測定された反射率スペクトルは、様々な特徴的な吸光度特徴を有しており、これは、図４に示す吸光度スペクトルに見られるように、灰色コーティングのバックグラウンドの平坦なスペクトル反射率に対して非常に可視であった。図４は、６組の実験室バイオフィルムの反射率スペクトルを示し、ｙ軸は観察された反射率範囲を示す。スペクトルの特徴が深くなることは、より高密度のバイオマスを示している。パネル（ａ）はアクナンテス属の種のバイオフィルムを、（ｂ）はアンフォラ属の種を、（ｃ）はＨＰ混合培養バイオフィルムを、（ｄ）はノジュラリア属の種のバイオフィルムを、（ｅ）はクロレラ属の種のバイオフィルムを、（ｆ）はＩＰ混合培養バイオフィルムを示す。４００ｎｍ未満の測定値には有意なノイズがあり、かつ最小の照度であったため、４００ｎｍ未満の波長は実験ではさらに考慮しなかった。赤外線では、ノイズの増加とは別に、８５０ｎｍから１１００ｎｍへの反射率スペクトルの観察可能な変化はほとんどなかったため、８５０ｎｍを超える波長も実験ではさらに考慮されなかった。
【0108】
６つすべての培養物のスペクトルは、クロロフィルａに起因し、バイオフィルムの密度が増加するにつれて深くなる６７３ｎｍでの吸光度特徴によってマークされた。珪藻バイオフィルムは、クロロフィルｃの存在による褐藻類の吸光度に典型的な約６３０ｎｍの吸光度特徴を示した。緑藻類バイオフィルム反射率スペクトルは、４００～５００ｎｍの強い吸光度でマークされたが、５００～６００ｎｍ付近の吸光度はほとんどなかった。シアノバクテリアのバイオフィルムは、おそらくフィコシアニンに起因する約６２５ｎｍのスペクトル吸光度を示した。ＨＰ混合集団バイオフィルムのスペクトルは、アンフォラ属の種のスペクトルによく似ており、珪藻がこれらのバイオフィルムの重要な構成要素であることを示唆している。ＩＰバイオフィルムは、いかなる単一培養物にも密接してマッピングされない一貫性のないスペクトルを有していた。バイオフィルムのより緑色のスペクトルはクロレラ属の種のバイオフィルムスペクトルに類似していたが、赤褐色バイオフィルムのスペクトルは異なっていた。
【0109】
スペクトル指標化によるバイオマスの推定
図５Ａ及び図５Ｂは、灰色コーティング上のバイオフィルムのコーティング正規化反射率スペクトルから測定されたｃｈｌ ａのμｇ／ｃｍ２単位の密度の関数として、スペクトル指標ｒＮｏｒｍ及びＮＤＶＩの決定された値をそれぞれ示す。黒丸、四角及び三角は珪藻土試料（アンフォラ属の種、アクナンテス属の種、ハートルプールバイオフィルム）を、白丸、四角及び三角は緑藻類、藍藻類及びシンガポールスライム試料を表す。
図５Ａ及び図５Ｂは、灰色コーティング上のバイオフィルムのコーティング正規化反射率スペクトルから測定されたｃｈｌ ａのμｇ／ｃｍ２単位の密度の関数として、スペクトル指標ｒＮｏｒｍ及びＮＤＶＩの決定された値をそれぞれ示す。黒丸、四角及び三角は珪藻土試料（アンフォラ属の種、アクナンテス属の種、ハートルプールバイオフィルム）を、白丸、四角及び三角は緑藻類、藍藻類及びシンガポールスライム試料を表す。
【0110】
視覚的に最も高密度の明緑色ＩＰ混合培養バイオフィルム（図５Ａ、図５Ｂ、白三角）及び最も高密度の褐色単一培養のアクナンテス属の種のバイオフィルム（黒四角）に対するｒＮｏｒｍ及びＮＤＶＩ指標データにわたる強い整合性は、２つの指標が真に微細藻類バイオマスを定量化するための広範なツールであることを強調した。
【0111】
表２は、灰色コーティング正規化バイオフィルム反射率スペクトルから計算された、図５Ａ及び図５Ｂに示すような較正曲線（実線）の指数モデル係数、及び抽出された色素密度測定値と比較した、これらの指標からのバイオマス推定値の平均絶対誤差を示す。
【0112】
【表2】
【0113】
任意の色の背景におけるバイオマス推定
バイオフィルム反射率スペクトル
バイオフィルムの実験的に測定されたスペクトルＲｂｉｏｍは、下にあるコーティングのスペクトルによって強く形状が決定され（図６Ａ～図６Ｆ）、バイオフィルム及びコーティングの相対反射率は、正規化スペクトルでより一層明確になり（図７Ａ～図７Ｆ）、ここで、各スペクトルは、バイオフィルムが存在しないそれぞれのコーティングのスペクトルに対して正規化されている。
バイオフィルム反射率スペクトル
バイオフィルムの実験的に測定されたスペクトルＲｂｉｏｍは、下にあるコーティングのスペクトルによって強く形状が決定され（図６Ａ～図６Ｆ）、バイオフィルム及びコーティングの相対反射率は、正規化スペクトルでより一層明確になり（図７Ａ～図７Ｆ）、ここで、各スペクトルは、バイオフィルムが存在しないそれぞれのコーティングのスペクトルに対して正規化されている。
【0114】
バックグラウンドコーティングのスペクトル（図３参照）は、実験バイオフィルムから測定された反射率スペクトルを明確に構造化した。赤色、青色、及び黒色のコーティング（図７Ｂ、図７Ｄ及び図７Ｅ）上のバイオフィルムの正規化スペクトルは、バイオフィルムが色固有の波長範囲にわたってコーティングよりも明るい（正規化反射率＞１）ことを示した。対照的に、バイオフィルムはすべて、白色、灰色、及び黄色のコーティングよりも暗く（正規化反射率＜１、図７Ａ、図７Ｃ、及び図７Ｆ）、これらの色のバイオフィルムのコーティング正規化スペクトルは非常に類似していた。
【0115】
強度はコーティング色によって変化したが、６７３ｎｍ付近の強いｃｈｌ ａ吸光度特徴がスペクトルにおいて明確に識別可能であった。
【0116】
清浄な（すなわち、バイオフィルムなしの）灰色、白色、及び黒色のコーティングは、輝度レベルを除いて、わずかに異なるだけの非常に類似した平坦な反射率スペクトルを有していた（図３）。黒色コーティング上のバイオフィルムのスペクトルは、灰色又は白色のバイオフィルムのスペクトルとの差を示した。灰色コーティング上のバイオフィルム（この実験における較正の基礎となったデータセット）については、測定されたスペクトルの特徴は、正規化されたスペクトルの特徴と密接に一致した（図６Ｃ及び図７Ｃを参照）。すべてのスペクトル値は、正規化後にほぼ１以下であり、バイオフィルムが清浄な灰色のコーティングよりも暗いことを示している。白色コーティング上のバイオフィルムの正規化スペクトルでは、灰色と同じ一般的なスペクトル特徴が観察可能であった。黒色コーティングの正規化前（図６Ｅ、平均反射率０～４％）及び正規化後（図７Ｅ、反射率０．４８～２．１５）のスペクトルは、微細藻類が強い吸光度特徴を有する波長（例えば約６７３ｎｍ）を除いて、バイオフィルムが黒色コーティング自体よりも反射性であることを示した。
【0117】
赤色、青色及び黄色のコーティング上のバイオフィルムのスペクトル反射率の特徴は、各コーティングに固有の波長範囲にわたってそれらの白色、灰色又は黒色の対応物に匹敵した。赤色データセットを、それぞれおよそ５５０ｎｍ未満及びおよそ５５０ｎｍ超の暗及び明スペクトル範囲に分割した。より青色の波長（＜５５０ｎｍ）では、黒色データセットと同様に、赤色コーティング自体がわずかに反射性であり（図３を参照）、バイオフィルムはコーティングよりも明るく、正規化スペクトル値は１．０より大きかった（最大１．９８、図７Ｂ）。より赤色の波長（＞５５０ｎｍ）では、赤色コーティングが最も明るくなる波長範囲であり、正規化スペクトル値は０．１８～１の範囲であり、白色及び灰色のデータセットに類似していた。青色コーティングデータセット（図７Ｄ）については、４００～５００ｎｍの波長範囲及び近赤外において、（一般的に）バイオマスが増加するにつれてスペクトル反射率が減少し、青色コーティングが最も明るく、灰色及び白色データセットと同様であった。青色コーティングは、５００～７００ｎｍの間の光をほとんど反射しなかった（約５％、図３参照）。この波長範囲にわたって、バイオフィルムは、白色及び灰色のデータセットと比較して浅いが、６７３ｎｍでの吸光度特徴ｃｈｌ ａが依然として正規化スペクトルに存在したことを除いて、典型的にはコーティングよりも明るかった（正規化値１～１．２５）。黄色コーティング正規化スペクトルは、白色及び灰色データセットとプロファイルが類似しており、類似のスペクトル値を有していた（０．１５～１）。
【0118】
灰色較正を他の色に適用する場合のバイオマス推定誤差：
密度固有の適合の良好度：図８は、灰色データから導出されたＮＤＶＩ較正を他の５つの色に適用することから生じるバイオマス推定誤差（μｇ／ｃｍ２単位のｃｈｌ ａの推定値から測定値を引いたもの）が、各コーティング色において指向性を有し、固有であったことを示す。色固有の推定誤差は指向性を有し、バイオマスに線形に関連していた。例えば、青色データセット誤差（灰色コーティング上のバイオフィルムから決定された指標較正を青色のバイオフィルムに適用することから生じるバイオマス推定誤差）は、一貫してバイオマスを過小評価し、過小評価誤差は、バイオマスが増加するにつれて線形に増加した（Ｒ２＝０．８４）。青色コーティングデータセットについて、ベースラインバイオマス推定誤差及び誤差係数（線形モデルの切片及び傾き）の両方が有意であった（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１）。黒色コーティングＮＤＶＩデータセットについても、同様のパターンのバイオマス過小評価を測定した（ベースライン誤差ｐ＜０．１、誤差係数ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．８５３）。対照的に、白色及び黄色のコーティングデータセットＮＤＶＩ値は、バイオマスの過大評価を線形に増加させたが、白色線形モデルの傾きのみが有意であった（Ｐ＜０．０５）。
密度固有の適合の良好度：図８は、灰色データから導出されたＮＤＶＩ較正を他の５つの色に適用することから生じるバイオマス推定誤差（μｇ／ｃｍ２単位のｃｈｌ ａの推定値から測定値を引いたもの）が、各コーティング色において指向性を有し、固有であったことを示す。色固有の推定誤差は指向性を有し、バイオマスに線形に関連していた。例えば、青色データセット誤差（灰色コーティング上のバイオフィルムから決定された指標較正を青色のバイオフィルムに適用することから生じるバイオマス推定誤差）は、一貫してバイオマスを過小評価し、過小評価誤差は、バイオマスが増加するにつれて線形に増加した（Ｒ２＝０．８４）。青色コーティングデータセットについて、ベースラインバイオマス推定誤差及び誤差係数（線形モデルの切片及び傾き）の両方が有意であった（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１）。黒色コーティングＮＤＶＩデータセットについても、同様のパターンのバイオマス過小評価を測定した（ベースライン誤差ｐ＜０．１、誤差係数ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．８５３）。対照的に、白色及び黄色のコーティングデータセットＮＤＶＩ値は、バイオマスの過大評価を線形に増加させたが、白色線形モデルの傾きのみが有意であった（Ｐ＜０．０５）。
【0119】
コーティングスペクトルの関数としてのスペクトル指標バイオマス推定誤差
海洋コーティング色の範囲は、実験に含まれた６つをはるかに超えているので、密度固有のバイオマス推定誤差の個々の色パターンをコーティングスペクトルに対して考慮して、コーティング色とハイパースペクトル指標のバイオマス推定誤差との間の一般的な関係を推測した。各色のベースライン推定誤差ＢＥ及び誤差係数ＥＦを、各指標に組み込まれた波長（例えばＮＤＶＩの場合は６７３又は８００ｎｍ）でのコーティングの最小反射率と比較した。コーティングスペクトル特性と推定誤差との間の非線形関係が明らかである。
海洋コーティング色の範囲は、実験に含まれた６つをはるかに超えているので、密度固有のバイオマス推定誤差の個々の色パターンをコーティングスペクトルに対して考慮して、コーティング色とハイパースペクトル指標のバイオマス推定誤差との間の一般的な関係を推測した。各色のベースライン推定誤差ＢＥ及び誤差係数ＥＦを、各指標に組み込まれた波長（例えばＮＤＶＩの場合は６７３又は８００ｎｍ）でのコーティングの最小反射率と比較した。コーティングスペクトル特性と推定誤差との間の非線形関係が明らかである。
【0120】
図９Ａ及び図９Ｂは、ｒＮｏｒｍ及びＮＤＶＩに対する誤差係数ＥＦ及びベースライン誤差ＢＥの推定をそれぞれ示し、指標に組み込まれた波長（両方とも６７３ｎｍ）でのコーティング反射率の最小値に対してプロットされている。
【0121】
【0122】
【表3】
【0123】
６つのコーティングデータセットにわたるｒＮｏｒｍ及びＮＤＶＩバイオマス推定値に対するベースライン誤差及び誤差係数は、コーティング最小反射率の対数に対して変化した（図９Ａ、図９Ｂを参照）。誤差係数関係パラメータは、２つの指標について非常に類似していた（ｒＮｏｒｍ、ＮＤＶＩについて：それぞれＲ２＝０．９９、０．９５、係数＝０．２６、０．２４）。ｒＮｏｒｍベースライン誤差は、コーティング最小反射率による対数増加に従った（図９Ａ、Ｒ２＝０．９１、ｃｏｅｆ＝０．０８６）。ＮＤＶＩ誤差はあまり顕著な対数ではなく（図９Ｂ、Ｒ２＝０．４３、ｃｏｅｆ＝０．０２５）、所望に応じて線形モデルによって記述することができる。
【0124】
図１０は、デジタル画像に使用するための可能性のある異なるスペクトル範囲の例を示し、この例では、灰色の基材上のハートルプール（ＨＰ）バイオフィルムの反射率スペクトルに対するものである（図４のパネル（ｅ）を参照）。この例では、第１のスペクトル範囲は、６７３ｎｍ付近、例えば６７３ｎｍ付近を中心として選択される。この例における第２のスペクトル範囲は、８００ｎｍ付近、例えば８００ｎｍ付近を中心として選択される。図１０において、ｗ１ａは、３．３ｎｍのＦＷＨＭの第１のスペクトル範囲を表し、ｗ２ａは、３．３ｎｍのＦＷＨＭの第２のスペクトル範囲を表す。図１０において、ｗ１ｂは、９．９ｎｍのＦＷＨＭの第１のスペクトル範囲を表し、ｗ２ｂは、９．９ｎｍのＦＷＨＭの第２のスペクトル範囲を表す。図１０において、ｗ１ｃは、１６．５ｎｍのＦＷＨＭの第１のスペクトル範囲を表し、ｗ２ｃは、１６．５ｎｍのＦＷＨＭの第２のスペクトル範囲を表す。図１０において、ｗ１ｄは、２９．７ｎｍのＦＷＨＭの第１のスペクトル範囲を表し、ｗ２ｄは、２９．７ｎｍのＦＷＨＭの第２のスペクトル範囲を表す。図１０において、ｗ１ｅは、６２．７ｎｍのＦＷＨＭの第１のスペクトル範囲を表し、ｗ２ｅは、６２．７ｎｍのＦＷＨＭの第２のスペクトル範囲を表す。図１０において、ｗ１ｆは、１００ｎｍのＦＷＨＭの第１のスペクトル範囲を表し、ｗ２ｆは、１００ｎｍのＦＷＨＭの第２のスペクトル範囲を表す。この例では、スペクトル帯域ｗ１ｆは６７３ｎｍ付近を中心としていない。スペクトル帯域ｗ１ｆは、市販のデジタルカメラの感度である、赤色チャネルスペクトルＲにほぼ対応することが理解されよう。スペクトル帯域ｗ２ｆは、修正した市販のデジタルカメラ（例えば、ＩＲカットフィルタの除去後）によって達成可能なスペクトル感度である、赤外線チャネルＩＲにほぼ対応する。
【0125】
図１１Ａ及び図１１Ｂは、使用されるスペクトル帯域の帯域幅の関数としてバイオマス推定誤差（μｇ／ｃｍ２単位）を示す。図１１ＡはＮＤＶＩに関する。図１１ＢはｒＮｏｒｍに関する。各パネルは、それぞれのスペクトル帯域幅をｎｍ単位で示す。各パネルにおいて、縦軸は、参照コーティングに対する対象物のコーティングの反射率の差に関連する補償を適用した後の（６つの色のそれぞれに対する）平均推定誤差を表す。各パネルにおいて、横軸は、参照コーティングに対する対象物のコーティングの反射率の差に関連する補償を適用しない（６つの色のそれぞれに対する）平均推定誤差を表す。したがって、示された点が縦軸よりも横軸に近い場合、参照コーティングに対する対象物のコーティングの反射率の差に関連する補償は、バイオマス推定誤差を低減した。図１１Ａから分かるように、ＮＤＶＩの場合、参照コーティングに対する対象物のコーティングの反射率の差に関連する補償は、黒色を除くすべての色についてバイオマス推定誤差を低減した。図１１Ｂから分かるように、ｒＮｏｒｍでは、参照コーティングに対する対象物のコーティングの反射率の差に関連する補償は、より大きなバンド幅値において、黒色を除くすべての色についてバイオマス推定誤差を低減した。
【0126】
本方法は、対象物の現在のコーティングの任意の色に関して適用することができるが、コーティングが黒色である場合には正確さが劣る場合がある。したがって、本方法は、対象物の現在のコーティングが黒色でない場合、例えば、５００～７００ｎｍの範囲内の少なくとも１つの波長、好ましくは複数の波長、例えば、スペクトル指標を決定するのに使用される波長又はスペクトル帯域に対して少なくとも５％の反射率を有する場合に、改善された精度で適用することができる。
【0127】
黒色コーティングに対する結果は、ｒＮｏｒｍ及びＮＤＶＩの誤差係数ＥＦｃｕｒｒｅｎｔ及びベースライン誤差ＢＥｃｕｒｒｅｎｔを計算するために使用されるデータ点の数を増やすことによって改善することができる。
【0128】
上記から、参照スペクトル指標較正値ｂｉｏｍａｓｓＳＩから計算されたバイオマス推定値は、いずれもバイオマスが存在する現在のコーティングの反射率スペクトルの関数である誤差係数ＥＦｃｕｒｒｅｎｔ及びベースライン誤差ＢＥｃｕｒｒｅｎｔによって調整することができるということになる。次いで、現在のコーティング上の推定バイオマスであるｂｉｏｍａｓｓｃｕｒｒｅｎｔは、以下の式
から、かつ例えば表３に見られるように、誤差係数ＥＦ及びベースライン誤差ＢＥを使用して決定することができる。
【数14】
【0129】
これは、例えば表２に見られるように、スペクトル指標から色素表面積密度を決定するための、較正値ａ、ｂ及びｃを使用する式
と組み合わせることができる。
【数15】
【0130】
２つの式を組み合わせて、式
とすることができる。
【数16】
【0131】
したがって、スペクトル指標ＳＩ、及び１つ又はそれ以上の較正値に基づくと同時に、対象物のコーティングの反射率に関連する補償を適用することにより、計算されたバイオマス色素表面積密度を対象物のコーティングの反射率に関して補償して、例えば水生環境に恒久的又は断続的に浸漬された対象物上のコーティング上の水生環境由来のバイオフィルムバイオマスを推定することが可能である。したがって、バイオフィルムバイオマスは、提示された式及び較正値を使用して、任意の色の対象物、例えば船舶において推定することができる。
【0132】
本明細書では、２４％の反射率を有する灰色コーティングが、スペクトル指標に基づいてバイオマス色素表面積密度を推定するための較正値ａ、ｂ及びｃを決定するための参照点として選択されたが、例えば異なる反射率を有し、較正値ａ、ｂ及びｃの数値を変更し得る別の参照コーティングが選択された可能性があることが理解されよう。しかしながら、このことは、本方法の背後にある本発明の概念に影響を及ぼさない。
【0133】
また、本明細書では、２４％の反射率を有する灰色コーティングが、微生物汚損層の下の異なるカラーコーティングを補正するための誤差係数ＥＦ及びベースライン誤差ＢＥを決定するための基準点として選択されたが、例えば異なる反射率を有し、誤差係数ＥＦ及びベースライン誤差ＢＥの数値を変更し得る別の参照コーティングが選択された可能性があることも理解されよう。しかしながら、このことも、本方法の背後にある本発明の概念に影響を及ぼさない。
【0134】
本方法を使用して、バイオフィルム層の下のコーティングの色に関係なく、スペクトル指標を１つ又はそれ以上のデジタル画像から決定することができ、それに基づいて、コーティング色が較正値を決定する際に使用される参照コーティング色に対応するかのようにバイオマス色素表面積密度を推定することができ、このように推定されたバイオマス色素表面積密度は、上述したように、参照コーティング色に対する対象物のコーティングの反射率に関連する補償を適用することによって、対象物の現在のコーティングの反射率に関して補償することができる。
【0135】
本方法は、対象物のコーティングの汚損部分、例えば、水中の１つ又はそれ以上のデジタル画像を、例えば（無人）潜水艦を使用して取得することを可能にする。１つ又はそれ以上の画像は、異なるスペクトル範囲、例えば１００ｎｍ以下、例えば５０ｎｍ以下、例えば２０ｎｍ以下、例えば３ｎｍ以下のＦＷＨＭを有するスペクトル範囲の画像を含むことができる。１つ又はそれ以上の画像は、ハイパースペクトルカメラを使用して取得することができる。汎用デジタルカメラを使用して１つ又はそれ以上の画像を取得することも可能である。
【0136】
ダイバー及び遠隔操作車両ＲＯＶ、船舶の検査は、市販の水中カメラ及び照明リグを使用することができる。カメラは、６７３ｎｍのｃｈｌ ａ赤色光吸光度特徴に合わせて特別に調整されたバンドパスフィルタに適合させることができる。適切な較正及びイメージングプロトコルと組み合わせると、ｒＮｏｒｍバイオマス推定を水中検査に組み込むことが可能である。ＮＤＶＩイメージングは水位線から約２ｍ又はそれ以上の深さである。実施形態において、表面からのＮＩＲ反射率は、任意選択的にＩＲランプアセンブリ及びＩＲ感受性イメージングシステムなどの機器を使用して測定することができる。
【0137】
本明細書では、本発明の実施形態の特定の例を参照して本発明を説明するが、これは特許請求される本発明の範囲を限定すると見なされるべきではない。明確さ及び簡潔さのために、特徴は、同じ又は別個の実施形態の一部として本明細書に記載されているが、これらの別個の実施形態に記載されている特徴の全部又は一部の組み合わせを有する代替の実施形態も想定される。
【0138】
実施例では、ハイパースペクトルカメラが使用される。１つ又はそれ以上のバンドパスフィルタと組み合わせたブロードバンドデジタルカメラを使用することも可能であることは明らかであろう。スペクトル帯域照射と組み合わせたブロードバンドデジタルカメラを使用することも可能である。例えば、赤色チャネル及び任意選択的に赤外線チャネルを使用するブロードバンドデジタルカメラを使用することも可能である。赤色チャネルは、およそ６００～７００ｎｍであり得る。赤外線チャネルは、およそ７５０～８５０ｎｍであり得る。
【0139】
しかしながら、他の修正、変形、及び代替も可能である。したがって、明細書、図面及び実施例は、限定的な意味ではなく例示的な意味で考慮されるべきである。
【0140】
特許請求の範囲において、括弧の間に配置されたいかなる参照符号も、特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。「備える、含む(comprising)」という語は、特許請求の範囲に列挙されたもの以外の他の特徴又はステップの存在を排除するものではない。さらに、「１つの(a)」及び「１つの(an)」という単語は、「ただ１つの(only one)」に限定されると解釈されるべきではなく、代わりに「少なくとも１つの(at least one)」を意味するために使用され、複数を排除するものではない。
本願発明には以下の態様が含まれる。
項１．
対象物のコーティング上の水生環境由来のバイオフィルムバイオマスを推定するための方法であって、
ａ）前記対象物上の前記コーティングの汚損部分の１つ又はそれ以上のデジタル画像を取得するステップと、
ｂ）前記１つ又はそれ以上の画像のそれぞれから、前記コーティングの前記部分に対するそれぞれの反射率値を決定するステップと、
ｃ）前記１つ又はそれ以上の反射率値に基づいて、バイオマスを表すスペクトル指標の値を決定するステップと、
ｄ）前記スペクトル指標ＳＩ、及び参照コーティングについて決定された１つ又はそれ以上の較正値に基づいて、バイオマス色素表面積密度を計算するステップと、
ｅ）前記参照コーティングに対する前記対象物の前記コーティングの前記反射率の差に関連する補償を適用することによって、前記計算されたバイオマス顔料表面積密度を前記対象物の前記コーティングの前記反射率に関して補償するステップと
を含む、方法。
項２．
前記補償は、前記バイオフィルムバイオマスの下にある前記コーティングを表す比較反射率値に基づく、項１に記載の方法。
項３．
前記比較反射率値は、
－すべてのバイオマスが除去された前記対象物の前記コーティングの一部について決定された反射率値；
－参照対象物から決定された反射率値；又は
－データベースに記憶された反射率値
である、項２に記載の方法。
項４．
前記１つ又はそれ以上の画像のそれぞれが、例えば０～１００ｎｍのスペクトル帯域で取得される、項１から３のいずれかに記載の方法。
項５．
前記比較反射率値が、前記１つ又はそれ以上のスペクトル帯域における前記バイオフィルムバイオマスの下にある前記コーティングの前記反射率値の最小値である、項４に記載の方法。
項６．
ステップｅ）において、前記現在のコーティング上の前記推定バイオマス色素表面積密度ｂｉｏｍａｓｓｃｕｒｒｅｎｔは、ステップｄ）で決定された前記スペクトル指標ｂｉｏｍａｓｓＳＩから計算された前記バイオマスから、誤差係数ＥＦｃｕｒｒｅｎｔ及びベースライン誤差ＢＥｃｕｒｒｅｎｔによって、以下の式
から決定することができる、項１から５のいずれかに記載の方法。
項７．
前記スペクトル帯域のうちの少なくとも１つが、クロロフィルの吸光波長を包含するように選択され、及び／又は前記スペクトル帯域のうちの少なくとも１つが、クロロフィルの吸光波長を除外するように選択される、項１から６のいずれかに記載の方法。
項８．
前記スペクトル帯域のうちの少なくとも１つが、４３３、４６０、４９６、５５５、５８４、６０１、６７３又は８００ｎｍ付近で選択される、項１から７のいずれかに記載の方法。
項９．
前記スペクトル指標が、２つの反射率値の比を含む、項１から８のいずれかに記載の方法。
項１０．
前記スペクトル指標ＳＩが、
－
として定義されるコーティング正規化赤色反射率；
－
として定義される正規化差分植生指標
の一方であり、式中、Ｒ６７３は、６０５～７４０ｎｍの範囲内、例えば６７３ｎｍにおける前記決定された反射率値であり；Ｒ８００は、７２０～９００ｎｍの範囲内、例えば８００ｎｍにおける前記決定された反射率値であり、Ｒ６７３ｃｌｅａｎは、６０５～７４０ｎｍの範囲内、例えば、６７３ｎｍにおける、バイオマスを含まない前記対象物のコーティングの前記反射率値である、項１から９のいずれかに記載の方法。
項１１．
－前記スペクトル指標が前記コーティング正規化赤色反射率である場合、
－前記スペクトル指標が前記正規化差分植生度である場合、
式中、Ｒｃｕｒｒｅｎｔ６７３は、６７３ｎｍにおける前記現在のコーティングの前記反射率値である、項１０に記載の方法。
項１２．
ステップｄ）において、前記色素表面積密度が、
から決定され、式中、ａ、ｂ及びｃは較正値である、項１から１１のいずれかに記載の方法。
項１３．
－前記スペクトル指標が前記コーティング正規化赤色反射率である場合、
ａ＝－１．９２１、ｂ＝０．０９３、ｃ＝２．４７７であり；及び
－前記スペクトル指標が前記正規化差分植生度である場合、
ａ＝０．６１８、ｂ＝０．２４０、ｃ＝－０．３２１である、
項１２に記載の方法。
項１４．
前記１つ又はそれ以上のデジタル画像が、潜水艦、例えば、無人潜水艦を使用して取得される、項１から１３のいずれかに記載の方法。
項１５．
対象物のコーティング上の水生環境由来のバイオフィルムバイオマスを推定するためのシステムであって、
－前記対象物上の前記コーティングの汚損部分の１つ又はそれ以上のデジタル画像を取得し、
－前記１つ又はそれ以上の画像のそれぞれから、前記コーティングの前記部分に対するそれぞれの反射率値を決定し、
－前記１つ又はそれ以上の反射率値に基づいて、バイオマスを表すスペクトル指標の値を決定し、
－前記スペクトル指標ＳＩ、及び参照コーティングについて決定された１つ又はそれ以上の較正値に基づいて、バイオマス色素表面積密度を計算し、
－前記参照コーティングに対する前記対象物の前記コーティングの前記反射率の差に関連する補償を適用することによって、前記計算されたバイオマス顔料表面積密度を前記対象物の前記コーティングの前記反射率に関して補償する
ように構成されたプロセッサを含む、システム。
本願発明には以下の態様が含まれる。
項１．
対象物のコーティング上の水生環境由来のバイオフィルムバイオマスを推定するための方法であって、
ａ）前記対象物上の前記コーティングの汚損部分の１つ又はそれ以上のデジタル画像を取得するステップと、
ｂ）前記１つ又はそれ以上の画像のそれぞれから、前記コーティングの前記部分に対するそれぞれの反射率値を決定するステップと、
ｃ）前記１つ又はそれ以上の反射率値に基づいて、バイオマスを表すスペクトル指標の値を決定するステップと、
ｄ）前記スペクトル指標ＳＩ、及び参照コーティングについて決定された１つ又はそれ以上の較正値に基づいて、バイオマス色素表面積密度を計算するステップと、
ｅ）前記参照コーティングに対する前記対象物の前記コーティングの前記反射率の差に関連する補償を適用することによって、前記計算されたバイオマス顔料表面積密度を前記対象物の前記コーティングの前記反射率に関して補償するステップと
を含む、方法。
項２．
前記補償は、前記バイオフィルムバイオマスの下にある前記コーティングを表す比較反射率値に基づく、項１に記載の方法。
項３．
前記比較反射率値は、
－すべてのバイオマスが除去された前記対象物の前記コーティングの一部について決定された反射率値；
－参照対象物から決定された反射率値；又は
－データベースに記憶された反射率値
である、項２に記載の方法。
項４．
前記１つ又はそれ以上の画像のそれぞれが、例えば０～１００ｎｍのスペクトル帯域で取得される、項１から３のいずれかに記載の方法。
項５．
前記比較反射率値が、前記１つ又はそれ以上のスペクトル帯域における前記バイオフィルムバイオマスの下にある前記コーティングの前記反射率値の最小値である、項４に記載の方法。
項６．
ステップｅ）において、前記現在のコーティング上の前記推定バイオマス色素表面積密度ｂｉｏｍａｓｓｃｕｒｒｅｎｔは、ステップｄ）で決定された前記スペクトル指標ｂｉｏｍａｓｓＳＩから計算された前記バイオマスから、誤差係数ＥＦｃｕｒｒｅｎｔ及びベースライン誤差ＢＥｃｕｒｒｅｎｔによって、以下の式
【数1】
項７．
前記スペクトル帯域のうちの少なくとも１つが、クロロフィルの吸光波長を包含するように選択され、及び／又は前記スペクトル帯域のうちの少なくとも１つが、クロロフィルの吸光波長を除外するように選択される、項１から６のいずれかに記載の方法。
項８．
前記スペクトル帯域のうちの少なくとも１つが、４３３、４６０、４９６、５５５、５８４、６０１、６７３又は８００ｎｍ付近で選択される、項１から７のいずれかに記載の方法。
項９．
前記スペクトル指標が、２つの反射率値の比を含む、項１から８のいずれかに記載の方法。
項１０．
前記スペクトル指標ＳＩが、
－
【数2】
－
【数3】
の一方であり、式中、Ｒ６７３は、６０５～７４０ｎｍの範囲内、例えば６７３ｎｍにおける前記決定された反射率値であり；Ｒ８００は、７２０～９００ｎｍの範囲内、例えば８００ｎｍにおける前記決定された反射率値であり、Ｒ６７３ｃｌｅａｎは、６０５～７４０ｎｍの範囲内、例えば、６７３ｎｍにおける、バイオマスを含まない前記対象物のコーティングの前記反射率値である、項１から９のいずれかに記載の方法。
項１１．
－前記スペクトル指標が前記コーティング正規化赤色反射率である場合、
【数4】
【数5】
項１２．
ステップｄ）において、前記色素表面積密度が、
【数6】
項１３．
－前記スペクトル指標が前記コーティング正規化赤色反射率である場合、
ａ＝－１．９２１、ｂ＝０．０９３、ｃ＝２．４７７であり；及び
－前記スペクトル指標が前記正規化差分植生度である場合、
ａ＝０．６１８、ｂ＝０．２４０、ｃ＝－０．３２１である、
項１２に記載の方法。
項１４．
前記１つ又はそれ以上のデジタル画像が、潜水艦、例えば、無人潜水艦を使用して取得される、項１から１３のいずれかに記載の方法。
項１５．
対象物のコーティング上の水生環境由来のバイオフィルムバイオマスを推定するためのシステムであって、
－前記対象物上の前記コーティングの汚損部分の１つ又はそれ以上のデジタル画像を取得し、
－前記１つ又はそれ以上の画像のそれぞれから、前記コーティングの前記部分に対するそれぞれの反射率値を決定し、
－前記１つ又はそれ以上の反射率値に基づいて、バイオマスを表すスペクトル指標の値を決定し、
－前記スペクトル指標ＳＩ、及び参照コーティングについて決定された１つ又はそれ以上の較正値に基づいて、バイオマス色素表面積密度を計算し、
－前記参照コーティングに対する前記対象物の前記コーティングの前記反射率の差に関連する補償を適用することによって、前記計算されたバイオマス顔料表面積密度を前記対象物の前記コーティングの前記反射率に関して補償する
ように構成されたプロセッサを含む、システム。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図 】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
