特許 7554357 フグ内臓由来の高純度テトロドトキシンの効率的な抽出、分離、調製の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-10

(45)【発行日】2024-09-19

(54)【発明の名称】フグ内臓由来の高純度テトロドトキシンの効率的な抽出、分離、調製の方法

(51)【国際特許分類】

   C07D 491/22 20060101AFI20240911BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20240911BHJP

【ＦＩ】

C07D491/22

G01N30/88 E

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2023523323

(86)(22)【出願日】2022-05-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-26

(86)【国際出願番号】 CN2022090917

(87)【国際公開番号】W WO2022233298

(87)【国際公開日】2022-11-10

【審査請求日】2022-12-27

(31)【優先権主張番号】202110487094.X

(32)【優先日】2021-05-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】522504558

【氏名又は名称】中洋生物科技（上海）股▲ふん▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110000408

【氏名又は名称】弁理士法人高橋・林アンドパートナーズ

(72)【発明者】

【氏名】リ，ハイハン

(72)【発明者】

【氏名】チャン，リンリン

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ウェンロン

(72)【発明者】

【氏名】ゼン，ジュンメイ

(72)【発明者】

【氏名】チュー，ジヨン

(72)【発明者】

【氏名】イエ，チエホア

(72)【発明者】

【氏名】チン，シャオミン

【審査官】吉岡 沙織

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２００２／００６０１８８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１１１１１７９１７（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０１８９１７５１（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０１３１７８４６（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｄ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＦＳＴＡ／ＡＧＲＩＣＯＬＡ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

フグ内臓由来のテトロドトキシンの効率的な抽出、分離、調製の方法であって、
（１）新鮮なフグまたは解凍したフグの内臓組織を小さく切り分け、所定体積の酸性アルコールを加えて、ホモジナイザーでホモジネーションを行い、
（２）前記（１）で得られたホモジネート液に所定量の流動助剤またはろ過助剤を加えて、撹拌して均一に混合した後、カラムクロマトグラフィーのカラムの充填方法に従ってカラムに充填し、所定時間静置後、前記酸性アルコールと同じ酸性アルコールを用いてカラムクロマトグラフィーの溶出方法に従って材料からＴＴＸを完全に溶出させ、溶出液におけるＴＴＸ含有量をＨＰＬＣで測定し、溶出液にＴＴＸが含まれなくなるまで繰り返し、抽出液としてＴＴＸを含有する溶出液を回収し、
（３）前記（２）によるＴＴＸの抽出液を真空濃縮機により減圧して水相に濃縮し、再利用のためにエタノールを回収し、脂溶性物質を除去するため水相を有機溶媒で抽出し、得られた水相がＴＴＸの抽出濃縮液であり、
（４）前記（３）で得られたＴＴＸの抽出濃縮液を、前処理したイオン交換樹脂カラムでクロマトグラフィーにより分離し、試料をロードしたら、中性アンモニウム塩および純水で不純物を溶出し、次に酸性水溶液でＴＴＸを溶出し、ＴＴＸ含有量の高い溶出液を収集し、ナノろ過濃縮または減圧濃縮で濃縮乾固し、ＴＴＸの粗製品を得、
（５）ＴＴＸの粗製品を、水溶液または有機溶媒で酸塩基沈殿法または結晶化を繰り返し、ＨＰＬＣで分析した純度が９８％以上になる高純度のＴＴＸを得る
ステップを含むことを特徴とするフグ内臓由来のテトロドトキシンの効率的な抽出、分離、調製の方法。

【請求項2】

ステップ（１）では、前記フグ内臓は、テトロドトキシンを含有するフグの卵巣または肝臓である
ことを特徴とする請求項１に記載のフグ内臓由来のテトロドトキシンの効率的な抽出、分離、調製の方法。

【請求項3】

ステップ（２）では、流動助剤または濾過助剤は、珪藻土であり、その添加量はフグ内臓の重量の０．５～１．０倍である
ことを特徴とする請求項１に記載のフグ内臓由来のテトロドトキシンの効率的な抽出、分離、調製の方法。

【請求項4】

ステップ（２）では、ホモジネート液中に流動助剤を加え、撹拌して均一に混合した後、カラムへのロードと、不純物の溶出と、ＴＴＸの溶出との方法およびプロセスは、完全にカラムクロマトグラフィーの方法に従って実行する
ことを特徴とする請求項１に記載のフグ内臓由来のテトロドトキシンの効率的な抽出、分離、調製の方法。

【請求項5】

ステップ（３）では、脂溶性物質を除去するため水相を有機溶媒で抽出し、使用される有機溶媒は酢酸エチルであり、抽出して得られる水相がＴＴＸの抽出濃縮液である
ことを特徴とする請求項１に記載のフグ内臓由来のテトロドトキシンの効率的な抽出、分離、調製の方法。

【請求項6】

ステップ（４）では、前記イオン交換樹脂カラムは陽イオン交換樹脂カラムである
ことを特徴とする請求項１に記載のフグ内臓由来のテトロドトキシンの効率的な抽出、分離、調製の方法。

【請求項7】

ステップ（４）では、陽イオン交換樹脂カラムからクロマトグラフィーにより分離され得られたＴＴＸの溶出液をナノろ過膜で小量まで濃縮し、前記ナノろ過濃縮膜は、分画分子量が１００～３００ダルトンのナノろ過膜である
ことを特徴とする請求項６に記載のフグ内臓由来のテトロドトキシンの効率的な抽出、分離、調製の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、動物体内の生理活性物質の抽出、分離、精製の技術分野に属し、特にフグ内臓由来のフグ毒の調製方法に関する。

【背景技術】

【0002】

関係出願の相互参照
本開示は、２０２１年０５月０４日に中国専利局に提出された出願番号が「ＣＮ２０２１１０４８７０９４．Ｘ」であり、名称が「フグ内臓由来の高純度テトロドトキシンの効率的な抽出、分離、調製の方法」である中国出願に基づいて優先権を主張し、その全ての内容は、参照として本開示に取り込まれる。

【0003】

テトロドトキシン（Ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ，ＴＴＸ）は、最初、フグ（ｐｕｆｆｅｒｆｉｓｈ，Ｌａｇｏｃｅｐｈａｌｕｓ ｓｃｅｌｅｒａｔｕｓ）から抽出された、小分子の非タンパク質性のアルカロイド系神経毒素である。１９０９年、日本の学者Ｔａｗａｒａによりテトロドトキシンの粗毒素がフグの卵巣から初めて抽出され、命名された（Ｂａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。１９５０年、Ｙｏｋｏｏにより初めてトラフグの卵巣由来の、精製したＴＴＸ結晶が得られた（Ｙｏｋｏｏ，１９５０）。１９６４年、ＴＴＸの化学式（Ｃ₁₁Ｈ₁₇Ｎ₃Ｏ₈）およびその化学構造が特定された（Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９６４、Ｗｏｏｄｗａｒｄ ａｎｄ Ｇｏｕｇｏｕｔａｓ，１９６４、Ｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｉｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，１９６４）。長い間、テトロドトキシンがフグの体内の特有の毒性物質と考えられていたが、１９６４年にアメリカの科学者Ｍｏｓｈｅｒらがカリフォルニアイモリ（Ｔａｒｉｃｈａ ｔｏｒｏｓａ）からＴＴＸを単離したことから（Ｍｏｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９６４）、この説が変わった。これまでの研究から、ＴＴＸは、多種のフグの体内だけでなく、脊椎動物と無脊椎動物を含む１４０種近くの動物に広く存在することが明らかになり（Ｌｏｒｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，１０１６）、例えば、ハゼ（朱国萍ら、２０１５）、イモリ（Ｙｏｔｓｕ－Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、二枚貝と腹足類（Ｌａｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）、ヒョウモンダコ（Ｗｈｉｔｅｌａｗ ｅｔ ａｌ．，２０１９）、ヒモムシ（Ｖｌａｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、線形動物（毛▲しょう▼ら、２０２０）などが挙げられる。そして、多くの微生物がＴＴＸを産生できることが分かった（Ｃｈａｕ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｍａｇａｒｌａｍｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１７）。

【0004】

ＴＴＸは、既知の毒性の最も強い神経毒素の一つであり、ヒトに対してシアン化物の１２００倍ぐらいの毒性を持ち、しかも既知の解毒剤が存在しない（Ｌａｇｏ ｅｔ ａｌ．、２０１５）。ＴＴＸのマウスに対するＬＤ₅₀値は、１０μｇ／ｋｇ（腹膜内）、１６μｇ／ｋｇ（皮下）と３３２μｇ／ｋｇ（経口）である（Ｋａｏ、１９６６）。ヒトがＴＴＸを摂取した後の中毒症状は、摂取量によって変わる（Ｈｏｍａｉｒａ ｅｔ ａｌ．、２０１０）。症状は、最初に口唇および舌に痺れが起こり（異常感覚）、次に頭痛や嘔吐が現れ、さらに筋無力や運動失調に至る可能性がある。重症の場合には、呼吸困難や心不全で死亡することがある（Ｎｏｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｅｅｂｅｓｕ、２００１）。ＴＴＸのヒトに対する致死量は１．３３μｇ／ｋｇである（Ｋａｓｔｅｅｌ ａｎｄ ｗｅｓｔｅｒｉｎｋ、２０１７）。生物連鎖によるＴＴＸの伝播や大量の海水および淡水の養殖動物にＴＴＸが含まれているなどの問題から、人々は環境安全に対する懸念が高まり、重視している。

【0005】

ＴＴＸは、神経と筋肉麻痺を引き起こす電位依存性ナトリウムチャネルの遮断剤であり、がんや外科手術などのさまざまな患者への局所麻酔や、依存性のない鎮痛剤などとして医療に用いられる。ＴＴＸは、局所麻酔薬として（Ｏｇｕｒａ ａｎｄ Ｍｏｒｉ、１９６８）、顕著な心血管系の副作用（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、２０１０；Ｓｔｏｅｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０１６）や筋毒性（Ｐａｄｅｒａ ｅｔ ａｌ．、２００６）を有しない。また、ＴＴＸは、臨床でよく使用されている局所麻酔薬とは異なり、その結合部位が膜の外にあり、他の局所麻酔薬と併用することで相乗効果を生み出すことができる（Ｋｏｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．、１９９８；Ｂｅｒｄｅ ｅｔ ａｌ．、２０１１；ＭｃＡｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．、２０１５）。研究者たちもＴＴＸの麻酔特性を利用して、例えば、深刻ながん性疼痛（Ｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００８；２０１７）やオピオイドの離脱症候群の緩和（陳素青ら、２００１；Ｋｏｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．、２００３；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、２００９）などさまざまな種類の痛みの治療に取り組んでいる。また、研究により、ＴＴＸ処理した担がんマウスにおいて、腫瘍の成長が著しく抑制されたことが明らかになった（Ｅｌ－Ｄａｙｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。また、ＴＴＸは、腫瘍細胞の移動性や浸潤性を抑制し、高転移性腫瘍および白血病の転移を防ぐことができる（Ｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．、２０１４；Ｓｔｏｃｋ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｂ、２０１５）。ＴＴＸは、多くの分野で臨床応用が期待されている。

【0006】

ＴＴＸは複雑な構造を持ち、化学的に合成することが困難である。２００３年にＴＴＸの全合成が完了したが（Ｏｈｙａｂｕ ｅｔ ａｌ．、２００３）、人工合成は、ステップ数が多すぎて平均２３～６７のステップを必要とし、得られた収率はわずか０．３４％～１．８２％（Ｃｈａｕ ａｎｄ Ｃｕｙｆｉｋｕｂ、２０１１；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．、２０１９）である。また、合成過程において、一連の精製方法を開発する必要もある。したがって、ＴＴＸおよびその類縁体の実験室での合成方法による大量生産は実現困難である（Ｃｈａｕ ａｎｄ Ｃｕｙｆｉｋｕｂ、２０１１；Ｂａｎｅ ｅｔ ａｌ．、２０１４；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．、２０１９）。多くの微生物がＴＴＸを産生することができるが、収量が非常に低く（Ｌａｇｏ ｅｔ ａｌ．、２０１５）、その生産メカニズムがまだ不明であるため、収量の増加や精製方法の開発が解決すべき課題となる（劉燕▲てい▼ら、２００８）。そのため、現在では、動物組織由来のＴＴＸの抽出、調製が、ＴＴＸの主な供給源となっている。

【0007】

式１に示すように、ＴＴＸは、化学式Ｃ₁₁Ｈ₁₇Ｎ₃Ｏ₈、分子量３１９．２７、１９０－２００ｎｍにおいて強い吸収を持つアミノペルヒドロキナゾリン化合物（ｐＫａ ８．７６）であり、一つのかご型オルトエステル構造を含む（Ｍｏｃｚｙｄｌｏｗｓｋｉ、２０１３）。ＴＴＸは、分子におけるほぼすべての炭素原子が不斉置換基を持ち、１，２，３－アミノグアニジンとその近傍のＣ－４、Ｃ－９、Ｃ－１０のヒドロキシ基が官能基である。ＴＴＸの結晶は白色で無臭、特定の融点はなく、２２０℃以上で漸次に炭化するが（崔建洲ら、２００５）、３００℃でも融解しない（Ｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｋａｗａｍｕｒａ、１９５２）。純粋なＴＴＸは、水、およびメタノール、エタノール、ジメチルスルホキシドなどの大部分の有機溶媒に溶けないが、希酢酸溶液に溶けやすく、その活性は強酸や強塩基溶液では失活しやすい（Ｍｏｃｚｙｄｌｏｗｓｋｉ、２０１３）。ＴＴＸは、中性の溶液中で正電荷を持ち、弱酸性条件下で、オルトエステルと、ラクトンと、４－ｅｐｉＴＴＸと、４、９－ａｎｈｙｄｒｏＴＴＸとが共存する（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ａｎｄ Ｉｓｏｂｅ、２０１３）。

【0008】

【化1】

【0009】

ＴＴＸの構造と性質は独特であり、従来の天然アルカロイド系物質の分離、精製方法では、生体材料からＴＴＸを抽出分離、精製して、高純度のものを調製することは困難である（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。最初、Ｔａｗａｒａ（１９０９年）は、酢酸鉛沈殿法によりフグ卵巣の水抽出物からＴＴＸを単離したが、その純度はわずか０．２％～４％（Ｍｏｃｚｙｄｌｏｗｓｋｉ、２０１３）であった。多くの試みがなされたが、１９５０年代の初めにＹｏｋｏｏは粗毒素をリンタングステン酸、ピクリン酸水銀、ピクロロン酸およびフェニルヒドラジンなどで順次処理した後、さらにアルミナカラムクロマトグラフィーと再結晶を行うことで、純粋な結晶性のＴＴＸの調製を実現した（Ｙｏｋｏｏ、１９５０）。その後、ＴｓｕｄａとＫａｗａｍｕｒａは１０００ｋｇのフグ卵巣を原料として、ポテトスターチ分配クロマトグラフィー、活性炭吸着クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィーによりＴＴＸを分離、精製した（Ｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｋａｗａｍｕｒａ、１９５２）。

【0010】

現在、ＴＴＸの調製プロセスは一般的に、フグの内臓組織を原料とし、酢酸水溶液を抽出溶媒とし、超音波または／および加熱による抽出を行う。抽出物に対して、陽イオン交換カラムによりクロマト－活性炭カラムにより精製し、酸塩基沈殿法でＴＴＸを析出させ、最後に分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による精製および再結晶を行う。ＴＴＸの抽出、精製方法について、主な報告を表２にまとめた。

【0011】

【表1】

【0012】

しかし、これらの抽出および分離・調製方法には、以下の問題がある。
（１）抽出効率が低い。ＴＴＸは組織から完全に抽出することが難しく、浸漬抽出や超音波補助の抽出などの従来の抽出方法では抽出効率が低く、抽出溶媒の使用量も多い。
（２）抽出用溶媒は、酸性溶媒を使用することが多いため、抽出液にタンパク質などの水溶性物質が多く含まれ、その後のＴＴＸの分離精製工程でタンパク質を除去することが必要になり、分離精製することが困難である。また、分離精製のステップ数が多く、収率が非常に低い。
（３）大部分の報告は、実験室での研究まで止まっており、実験方法と結果が検証されていない。再現が難しく、ＴＴＸの量産に用いることが困難である。
したがって、量産に適するＴＴＸの抽出、分離、精製のための簡単で効率的な方法とプロセスの開発が重要である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0013】

【文献】陳素青，任雷鳴，黄致強．ラットおよびマウスにおけるナロキソン刺激によるモルヒネ離脱症状に対するテトロドトキシンの影響．中国薬理学および毒理学雑誌，２００１（０６）：４３４－４４０．

【文献】崔建洲，宮慶礼，顧謙群ら．テトロドトキシン（ＴＴＸ）の効率的な調製法に関する研究．高技術通訊，２００５（４）：８９－９４．

【文献】▲でん▼興朝，黄連生，陳歓ら．テトロドトキシンの抽出精製方法：ＣＮ１０８５８６４７５Ａ．２０１８－０９－２８．

【文献】黄枝梅．テトロドトキシンの抽出および分離精製プロセルに関する研究．福建農林大学，２０１０．

【文献】劉燕▲てい▼，雷紅涛，鐘青萍．テトロドトキシン研究の進展．食品研究および開発，２００８（０２）：１５６－１６０．

【文献】毛▲しょう▼，沐小玲，鮑宝龍．東海区にあるシマフグに寄生したアニサキスの同定およびテトロドトキシンの検出．上海海洋大学学報，２０２０：１－９．

【文献】蘇捷，劉智禹，黄枝梅．テトロドトキシンの分離精製に関する研究．福建水産，２０１０（４）：５６－５９．

【文献】孫博倫．オリイレヨフバイにおけるテトロドトキシンの抽出、精製および調製技術に関する研究．浙江海洋大学，２０１８．

【文献】譚桂莉，林国友．テトロドトキシンのＨＰＬＣによる検出方法．企業科技および発展，２０１１（１３）：２６－２８．

【文献】王秀菊，丁亜民，尹志勇．高純度のテトロドトキシンの抽出方法：ＣＮ１０２５８４８４３Ａ．２０１２－０７－１８．

【文献】楊育暉．テトロドトキシンの抽出および初期精製の方法：ＣＮ１０４３１１５６９Ａ．２０１５－０１－２８．

【文献】易瑞▲そう▼，許晨，洪専ら．テトロドトキシンの高純度単体の規模的調製方法：ＣＮ１３８５４３１．２００２－１２－１８．

【文献】張小軍，陳思，曾軍杰ら．テトロドトキシンの効率的な抽出方法：ＣＮ１０７６４１１２８Ｂ．２０２０－０３－１７．

【文献】鐘馨稼，劉延東．テトロドトキシンの調製方法：ＷＯ２０１６０６１８７４Ａ１．２０１６－０４－２８．

【文献】曾軍杰，張小軍，陳思ら．高純度のテトロドトキシンの調製方法：ＣＮ１０７８８００５４Ａ．２０１８－０４－０６．

【文献】趙東豪，王旭峰，王強ら．テトロドトキシンの標準生体試料の調製方法：ＣＮ１０９１４２６０２Ａ．２０１９－０１－０４．

【文献】朱国萍，療建萌，伍彬ら．フタスあジノボリハゼ（Ａｍｏｙａ ｃａｎｉｎｕｓ）の体内におけるテトロドトキシンの季節的変化法則．海洋環境科学，２０１５，３４（０１）：６６－６９．

【文献】Ｂａｎｅ Ｖ， Ｌｅｈａｎｅ Ｍ， Ｄｉｋｓｈｉｔ Ｍ． Ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ： ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｔｏｘｉｃｉｔｙ， ｓｏｕｒｃｅ， ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ［Ｊ］． Ｔｏｘｉｎｓ， ２０１４， ６（２）： ６９３－７５５．

【文献】Ｂｅｒｄｅ Ｃ， Ａｔｈｉｒａｍａｎ Ｕ， Ｙａｈａｌｏｍ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ－Ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ－Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ Ｌｏｃａｌ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ［Ｊ］． Ｍａｒｉｎｅ Ｄｒｕｇｓ， ２０１１， ９： ２７１７－２７２８．

【文献】Ｂｕｃｈｗａｌｄ Ｈ Ｄ， Ｄｕｒｈａｍ Ｌ， Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｈ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｏｆ ｔａｒｉｃｈａｔｏｘｉｎ ａｎｄ ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９６４， １４３（３６０５）， ４７４－４７５．

【文献】Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｊ Ｆ． Ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｌｏｃａｌ ａｎｅｓｔｈｅｔｉｃ ｃａｒｄｉａｃ ｔｏｘｉｃｉｔｙ： ａ ｒｅｖｉｅｗ ［Ｊ］． Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ａｎｄ Ｐａｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０１０， ３５（２）： １６７－１７６．

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【文献】Ｅｌ－Ｄａｙｅｍ Ｓ Ｍ Ａ， Ｆｏｕｄａ Ｆ Ｍ， Ａｌｉ Ｅ Ｈ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ ａｎｄ／ｏｒ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｏｎ Ｅｈｒｌｉｃｈ ａｓｃｉｔｅｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ－ｂｅａｒｉｎｇ ｆｅｍａｌｅ ｍｉｃｅ ［Ｊ］． Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｈｅａｌｔｈ， ２０１３， ２９： ４０４－４１７．

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【発明の概要】

【0014】

本開示は、抽出効率が高い、設備投資が低い、操作が簡単である、フグ内臓由来の高純度テトロドトキシンの抽出、分離、調製方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0015】

上記の技術的目的を達成するために、本開示は、以下の技術案を用いる。
フグ内臓由来の高純度のテトロドトキシンの抽出、調製方法は、下記のステップを含む。
（１）新鮮なフグまたは解凍したフグの内臓組織を小さく切り分け、所定体積の酸性アルコールを加えて、ホモジナイザーでホモジネーションを行い、
（２）（１）で得られたホモジネート液に所定量の流動助剤または濾過助剤を加えて、撹拌して均一に混合した後、カラムクロマトグラフィーのカラムの充填方法に従って抽出物をカラムに充填し、所定時間静置後、上述の酸性アルコールと同じ酸性アルコールを用いてカラムクロマトグラフィーの溶出方法に従って材料から不純物とＴＴＸを順次に溶出させ、溶出液におけるＴＴＸ含有量をＨＰＬＣで測定し、溶出液にＴＴＸが含まれなくなるまで繰り返し、ＴＴＸの抽出液としてＴＴＸを含有する溶出液を回収し、
（３）（２）によるＴＴＸの抽出液を真空濃縮機により減圧して水相に濃縮し、再利用のためにエタノールを回収し、脂溶性物質を除去するため水相を有機溶媒で抽出し、得られた水相がＴＴＸの抽出濃縮液であり、
（４）（３）で得られたＴＴＸの抽出濃縮液を、前処理したイオン交換樹脂カラムでクロマトグラフィーにより分離し、試料をロードしたら、中性アンモニウム塩および水で不純物を順次溶出し、次に酸性アルコールでＴＴＸを溶出し、ＴＴＸ含有の溶出液を収集し、ナノろ過濃縮装置で小量まで濃縮し、そして真空濃縮機で濃縮乾固し、ＴＴＸの粗製品を得、
（５）（４）で得られたＴＴＸの粗製品を、水および有機溶媒で酸塩基沈殿法または結晶化を繰り返し、ＨＰＬＣで分析した純度が９８％以上になる高純度のＴＴＸを得る。

【0016】

いくつかの実施形態では、ステップ（１）において、フグ内臓はフグの卵巣または肝臓である。卵巣または肝臓を小さく切り分けた後、２．０倍体積の９５％酸性アルコールを加え、ホモジナイザーでフグの内臓組織に対してホモジネーションを行う。

【0017】

いくつかの実施形態では、ステップ（２）において、ホモジネート液に加える流動助剤または濾過助剤は、珪藻土である。フグの内臓組織のホモジネート液に内臓重量の０．５～１．０倍の珪藻土を加え、撹拌して均一に混合した後、混合物をカラムにゆっくりと流し込む。１時間静置して材料中のＴＴＸが全部溶解した後、９５％酸性アルコールで溶出液にＴＴＸがなくなるまでＴＴＸを溶出する。

【0018】

いくつかの実施形態では、ステップ（３）において、ＴＴＸ抽出液を真空濃縮機により減圧して水相に濃縮し、再利用のためにエタノールを回収する。脂溶性物質を除去するため水相を有機溶媒で抽出し、得られた水相がＴＴＸ水溶液である。

【0019】

いくつかの実施形態では、ステップ（４）において、ＴＴＸ水溶液を、前処理されたまたは再生されたＤ－１５２弱酸性陽イオン交換樹脂カラムでクロマトグラフィーにより分離する。試料をロードしたら、順次、中性アンモニウム塩、純水、低濃度酢酸（０．１～１．０％）溶液および高濃度酢酸溶液で不純物を溶出し、そして３～５％酢酸溶液でＴＴＸを溶出する。

【0020】

いくつかの実施形態において、ステップ（５）では、ＴＴＸの溶出液を分画分子量１００～３００のナノろ過膜濃縮装置で小量まで濃縮し、そして真空濃縮機で濃縮乾固する。得られた濃縮物はアルカリ性アルコールおよびアルカリ性水溶液で不純物を溶出し、酸性水溶液で不溶物を溶出して除去する。溶液をアルカリ性（ｐＨ８～９）に調整し、４℃の冷蔵庫に入れて結晶化させ、高純度のＴＴＸを得る。

【発明の効果】

【0021】

従来技術と比較して、本開示は、以下の利点を有する。
（１）本開示に係るＴＴＸの抽出、分離、調製方法によれば、抽出のステップでは、カラムクロマトグラフィーによる抽出という効率的で省エネルギーの新しい方法を用いており、抽出過程がワンステップで済むので、抽出効率が高い。７倍量の抽出溶媒で原料中のＴＴＸを完全に抽出することができる。
（２）本開示に係るＴＴＸの抽出、分離、調製方法によれば、抽出溶媒として高濃度の酸性アルコールを用いてカラムクロマトグラフィーによる抽出を行うため、抽出液に水溶性不純物が少なく、タンパク質などの高分子の水溶性物質を含まない。よって、その後のＴＴＸの分離、精製を大幅に簡略化することができる。また、抽出溶媒を回収して再利用することも可能である。
（３）本開示に係るＴＴＸの抽出、分離、調製方法によれば、プロセスが簡単で、ステップ数が少なく、分離、精製の回収率が高く、ＴＴＸの純粋品の総収率が高い。また、ＴＴＸの調製にかかるコストも低い。
（４）本開示に係るＴＴＸの抽出、分離、調製方法によれば、使用された装置は通常のカラムクロマトグラフィーおよび濃縮装置などの従来の装置であり、設備投資が低い。
（５）本開示に係るＴＴＸの抽出、分離、調製方法によれば、抽出、分離、調製は全て室温下で行われ、有機溶媒の使用量が少なく、回収して再利用することも可能であるため、省エネルギーでエコである。

【0022】

説明を簡単にするために、以下の実施形態および図面を参照しながら本開示を詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】本開示に係るＴＴＸの抽出、分離、調製のプロセスのフロチャートである。

【図2】調製したＴＴＸ試料のＨＰＬＣ分析結果である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本開示に係る、フグ内臓由来の高純度テトロドトキシンの効率的な抽出、分離、調製の方法を、下記のように実施した。
（１）１５ｋｇのフグ卵巣を水で洗浄して不純物を除去したあと、肉挽き器で粉砕し、フグ卵巣の重量の２～３倍の酸性（１％酢酸）無水エタノールおよび０．６倍の珪藻土を加えて均一に撹拌した。φ２００×１５００ｍｍのカラムに均一にロードし、１時間静置後、クロマトグラフィーの溶出液にＴＴＸが含まれなくなるまで酸性エタノールで溶出した。ＴＴＸの抽出液としてクロマトグラフィーの溶出液を収集した。ＴＴＸを１２３６．０ｍｇ含む抽出液が得られ、ＴＴＸの抽出率は９６％であった。
（２）ＴＴＸの抽出液を減圧して水相に濃縮し、回収したエタノールを再利用することができる。濃縮液を１／２～１／１０体積の酢酸エチルで抽出し、低極性不純物を除去し、ＴＴＸの抽出濃縮液を得た。ＴＴＸを１１６８ｍｇ含む抽出濃縮液が得られ、ＴＴＸの回収率は９０．５％であった。
（３）１５ｋｇのフグ卵巣の抽出濃縮液をＤ－１５２弱酸性陽イオン交換樹脂カラムでクロマトグラフィー（φ１００ｘ１０００ｍｍ）により分離し、ロードしたら０．２％リン酸アンモニウム溶液、純水および０．５％酢酸水溶液でそれぞれ３ＢＶ溶出して、不純物を除去した。その後、ＴＴＸがなくなるまで２％酢酸水溶液で溶出した。ＴＴＸの回収率は９３．６％であった。ＴＴＸ濃縮画分を収集し、ナノろ過で小量まで濃縮し、減圧して濃縮乾固し、ＴＴＸの粗製品が得られ、ＴＴＸの回収率は９０．４％であった。ＴＴＸ含有量の少ない溶出液を再びＤ－１５２弱酸性陽イオン交換樹脂カラムでクロマトグラフィーにより濃縮してＴＴＸを回収した。
（４）ＴＴＸの粗製品をアルカリ性エタノールおよびアルカリ性水溶液で３回溶出して、沈殿物に対して、酸塩基沈殿法による処理を３回繰り返して、精製したＴＴＸが得られ、ＴＴＸの回収率は８０．７％であった。
（５）ＴＴＸをＨＰＬＣで分析し、その含有量を測定し、ＴＴＸ８１５．６ｍｇを得た。ＨＰＬＣ分析により、ＴＴＸの純度は９８％以上であった（図２を参照）。ＴＴＸの総回収率は６３．３％であった。

【図1】

【図2】