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特許7554420神経幹細胞の増殖促進剤及びそれを用いた神経幹細胞の増殖促進方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-11
(45)【発行日】2024-09-20
(54)【発明の名称】神経幹細胞の増殖促進剤及びそれを用いた神経幹細胞の増殖促進方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0797 20100101AFI20240912BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240912BHJP
C07H 21/04 20060101ALI20240912BHJP
A61K 31/7088 20060101ALN20240912BHJP
A61P 25/00 20060101ALN20240912BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0797
C12N15/11 Z
C07H21/04 Z
A61K31/7088
A61P25/00
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2023077502
(22)【出願日】2023-05-09
(62)【分割の表示】P 2021120019の分割
【原出願日】2021-07-20
(65)【公開番号】P2023100900
(43)【公開日】2023-07-19
【審査請求日】2023-05-09
(31)【優先権主張番号】P 2020123896
(32)【優先日】2020-07-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 発行者名：公益社団法人 日本薬剤学会（主催者） 刊行物名：日本薬剤学会第３６年会の講演要旨集 演題番号：一般演題Ｐ－０５５ 日本薬剤学会第３６年会のＨＰ掲載年月日：令和３年５月７日
(73)【特許権者】
【識別番号】500492750
【氏名又は名称】フォーデイズ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001999
【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】加藤 将夫
(72)【発明者】
【氏名】増尾 友佑
(72)【発明者】
【氏名】石本 尚大
(72)【発明者】
【氏名】須藤 慶太
(72)【発明者】
【氏名】桐山 恵介
【審査官】戸来 幸男
(56)【参考文献】
【文献】Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1967年，vol.57，pp.423-430
【文献】Biochemistry，1993年，vol.32，pp.6019-6031
【文献】Biochemistry，1997年，vol.36，pp.1790-1797
【文献】Tetrahedron Lett.，1989年，vol.30，pp.543-546
【文献】第92回日本薬理学会年会，2019年，Session ID:1-P-1033，p.1
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００－５／２８
Ｃ１２Ｎ １５／１１
Ｃ０７Ｈ ２１／００－２１／０４
ＰｕｂＭｅｄ
Ｇｏｏｇｌｅ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣにおいて該リン酸基の一部が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣ。
【請求項2】
デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣにおいて該リン酸基の一部が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内２つが連結してなるオリゴヌクレオチドＣ６。
【請求項3】
デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣにおいて該リン酸基の一部が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内４つが連結してなるオリゴヌクレオチドＣ１２。
【請求項4】
デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又は該リン酸基の一部が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣにホスホロチオエート基が付いたトリヌクレオチドＣｓＣｓＣ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は主に神経幹細胞（ＮＳＣｓ）の増殖を促進することが可能な神経幹細胞の増殖促進剤に関するものである。詳細には、デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣ（以下これらを「トリヌクレオチドＣＣＣ」又は「ＣＣＣ」とも総称する。）を含む神経幹細胞の増殖促進剤に関する。そして、さらにトリヌクレオチドＣＣＣに加え、安定性を高めるためにホスホロチオエート基を付けて合成したＣｓＣｓＣを含む神経幹細胞の増殖促進剤に関する。
【背景技術】
【0002】
脳損傷又は神経変性障害に起因する脳疾患は日常生活の質の大幅な低下につながる。健康に対する世間一般の関心の高まりを反映して、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）又は核タンパク質を原料又は有効成分として用いた健康食品が提供されている。サケ白子などには、デオキシリボ核酸、プロタミン又は複合体である核タンパク質が高濃度に含まれている。したがって、人の脳機能を強化する可能性を提供するために、脳機能に対する促進、改善の効果に寄与するサケ白子などに含まれる機能的成分を解明することは重要な課題の一つである。
【0003】
一方、加水分解されたサケ白子抽出物（ＨＳＭＥ）の食事摂取が健康な個人の脳機能を強化する可能性を示唆し加水分解されたサケ白子抽出物の核酸が脳機能に対する効果に寄与する機能的成分であり得る旨が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【0004】
非特許文献１には、水溶性サケ白子抽出物の摂取によって認知機能が促進される作用が発揮されることが開示されている。該文献では、加水分解されたサケ白子抽出物の経口投与により、海馬のシトシン、シチジン、及びデオキシシチジンの濃度が増加したと報告されている。ポリメラーゼ連鎖反応の定量的分析により、加水分解されたサケ白子抽出物食を摂取したマウスの海馬において神経幹細胞（ＮＳＣｓ）、星状細胞、希突起膠細胞、小膠細胞を含む脳実質細胞のマーカー遺伝子の発現が増加し、加水分解されたサケ白子抽出物の摂取は、その少なくとも一部は脳実質細胞の活性化を通じて、マウスの正常な状態での物体認識と物体位置記憶を強化する可能性がある点が示されている。
【0005】
しかしながら、神経幹細胞の増殖促進や神経幹細胞の分化誘導などに影響を及ぼす機能成分については全く明らかになっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｎａｋａｍｉｃｈｉ Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｍｅｄ Ｆｏｏｄ． ２０１９ Ａｐｒ；２２（４）：４０８－４１５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、神経幹細胞の増殖促進剤を提供することを主目的とする。より詳しくは、デオキシシチジン一リン酸又はこれよりリン酸基が除去されたデオキシシチジンが三つ連なったものであるトリヌクレオチドＣＣＣを用いて神経幹細胞の増殖を促進することを可能とすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記の課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、上記トリヌクレオチドＣＣＣ（以下、ＣＣＣとも称する）を機能成分として神経幹細胞の増殖を促進する作用があることそして、神経幹細胞の増殖促進剤として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち、本発明は以下の通りのものである。
［１］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣが含まれる神経幹細胞の増殖促進剤。
［２］ 前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及び前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内２つ以上を連ねるオリゴヌクレオチドがさらに含まれる［１］に記載の神経幹細胞の増殖促進剤。
［３］前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及び前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内２つを連結してなるオリゴヌクレオチドＣ６又は前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及び前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内４つを連結してなるオリゴヌクレオチドＣ１２がさらに含まれる［１］に記載の神経幹細胞の増殖促進剤。
［４］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの全部又は一部が、前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又は前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣにホスホロチオエート基が付いたトリヌクレオチドＣｓＣｓＣに置換されているトリヌクレオチドが含まれる神経幹細胞の増殖促進剤。
［５］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣが神経幹細胞の培養培地に添加される工程を含む神経幹細胞の増殖促進方法。
［６］前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及び前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内２つ以上を連ねるオリゴヌクレオチドが神経幹細胞の培養培地にさらに添加される工程を含む［５］に記載の神経幹細胞の増殖促進方法。
［７］前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及び前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内２つを連結してなるオリゴヌクレオチドＣ６又は前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及び前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内４つを連結してなるオリゴヌクレオチドＣ１２が神経幹細胞の培養培地にさらに添加される工程を含む［５］に記載の神経幹細胞の増殖促進方法。
［８］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの全部又は一部が、リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又は前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣにホスホロチオエート基が付いたトリヌクレオチドＣｓＣｓＣに置換されたトリヌクレオチドを神経幹細胞の培養培地に添加する工程を含む神経幹細胞の増殖促進方法。
［９］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣ。
［１０］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及びこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内２つが連結してなるオリゴヌクレオチドＣ６。
［１１］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及びこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内４つが連結してなるオリゴヌクレオチドＣ１２。
［１２］ デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣにホスホロチオエート基が付いたトリヌクレオチドＣｓＣｓＣ。
［１３］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣ
Ｃ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣが含まれる神経幹細胞の分化誘導剤。
［１４］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣが含まれる神経新生の促進剤。
［１５］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣと、前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又は前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内２つ以上を連ねるオリゴヌクレオチドとが含まれる脳機能を強化する健康食品。
［１６］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣ、
前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及び前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内２つを連結してなるオリゴヌクレオチドＣ６、並びに
前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及び前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内４つを連結してなるオリゴヌクレオチドＣ１２の内少なくとも２種以上が含まれる脳機能を強化する健康食品。
［１７］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの全部又は一部が、前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又は前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣにホスホロチオエート基が付いたトリヌクレオチドＣｓＣｓＣに置換されたトリヌクレオチドを含む脳機能を強化する健康食品。
［１］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣが含まれる神経幹細胞の増殖促進剤。
［２］ 前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及び前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内２つ以上を連ねるオリゴヌクレオチドがさらに含まれる［１］に記載の神経幹細胞の増殖促進剤。
［３］前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及び前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内２つを連結してなるオリゴヌクレオチドＣ６又は前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及び前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内４つを連結してなるオリゴヌクレオチドＣ１２がさらに含まれる［１］に記載の神経幹細胞の増殖促進剤。
［４］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの全部又は一部が、前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又は前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣにホスホロチオエート基が付いたトリヌクレオチドＣｓＣｓＣに置換されているトリヌクレオチドが含まれる神経幹細胞の増殖促進剤。
［５］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣが神経幹細胞の培養培地に添加される工程を含む神経幹細胞の増殖促進方法。
［６］前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及び前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内２つ以上を連ねるオリゴヌクレオチドが神経幹細胞の培養培地にさらに添加される工程を含む［５］に記載の神経幹細胞の増殖促進方法。
［７］前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及び前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内２つを連結してなるオリゴヌクレオチドＣ６又は前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及び前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内４つを連結してなるオリゴヌクレオチドＣ１２が神経幹細胞の培養培地にさらに添加される工程を含む［５］に記載の神経幹細胞の増殖促進方法。
［８］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの全部又は一部が、リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又は前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣにホスホロチオエート基が付いたトリヌクレオチドＣｓＣｓＣに置換されたトリヌクレオチドを神経幹細胞の培養培地に添加する工程を含む神経幹細胞の増殖促進方法。
［９］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣ。
［１０］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及びこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内２つが連結してなるオリゴヌクレオチドＣ６。
［１１］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及びこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内４つが連結してなるオリゴヌクレオチドＣ１２。
［１２］ デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣにホスホロチオエート基が付いたトリヌクレオチドＣｓＣｓＣ。
［１３］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣ
Ｃ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣが含まれる神経幹細胞の分化誘導剤。
［１４］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣが含まれる神経新生の促進剤。
［１５］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣと、前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又は前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内２つ以上を連ねるオリゴヌクレオチドとが含まれる脳機能を強化する健康食品。
［１６］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣ、
前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及び前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内２つを連結してなるオリゴヌクレオチドＣ６、並びに
前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ及び前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの内４つを連結してなるオリゴヌクレオチドＣ１２の内少なくとも２種以上が含まれる脳機能を強化する健康食品。
［１７］デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたリン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣの全部又は一部が、前記リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又は前記リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣにホスホロチオエート基が付いたトリヌクレオチドＣｓＣｓＣに置換されたトリヌクレオチドを含む脳機能を強化する健康食品。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、デオキシシチジン一リン酸が三つ連なってなるリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣ又はこれより一部のリン酸基が除去されたトリヌクレオチドＣＣＣを含む神経幹細胞の増殖促進剤を用いて、前記トリヌクレオチドＣＣＣを神経幹細胞の培養培地に添加する工程を含む方法によって、神経幹細胞の増殖を促進することが可能となる。また前記トリヌクレオチドＣＣＣが２つに連結してなるオリゴヌクレオチドＣ６又は前記トリヌクレオチドＣＣＣが４つに連結してなるオリゴヌクレオチドＣ１２をさらに含む神経幹細胞の増殖促進剤を用いて、前記オリゴヌクレオチドＣ６又はオリゴヌクレオチドＣ１２を神経幹細胞の培養培地に添加する工程を含む方法によって、神経幹細胞の増殖を促進することが可能となる。さらに前記トリヌクレオチドＣＣＣと、前記オリゴヌクレオチドＣ６、又は前記オリゴヌクレオチドＣ１２とを含有する脳機能を強化することができる健康食品を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図4】図４はＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる培地中の核酸濃度（Ａ：シトシン、Ｂ：シチジン、Ｃ：デオキシシチジン、Ｄ：デオキシシチジン一リン酸）の定量において得られた結果を示すグラフである。横軸に示した化合物を添加して３日後の培地中の核酸濃度を縦軸に示している。
【図9】図９はトリヌクレオチドＣＣＣが２つに連結してなるオリゴヌクレオチドＣ６又は前記トリヌクレオチドＣＣＣが４つに連結してなるオリゴヌクレオチドＣ１２等の神経幹細胞増殖能（Ａ：ＭＴＴアッセイの結果、Ｂ：ＡＴＰ活性アッセイの結果、Ｃ：細胞塊面積測定の結果）、及びリン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣの神経幹細胞増殖促進能（Ｄ：ＭＴＴアッセイの結果、Ｅ：ＡＴＰ活性アッセイの結果）を評価して得られた結果である。
【図12】図１２は図１１の顕微鏡イメージングを定量分析して得られた結果［Ａ：アストロサイト（ＧＦＡＰ）の割合、Ｂ：未成熟な神経細胞（βＩＩＩ－チューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ））の割合］を示すグラフである。
【図17】図１７はウッシングタイプチャンバー法による小腸膜透過試験{Ａ：模式図、Ｂ：核酸画分試料（以下これをＮＡＦとも称する。）中の核酸（デオキシリボヌクレオチド）の分子量分布をフォトダイオードアレイ検出器（測定波長：２５０－２７０ ｎｍ）により検出したグラフ}を示した。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
［統計学的解析］
本研究における全ての実験は、少なくとも２回以上実施された。数値データは、平均±標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ，（ｍｅａｎ±ＳＤ））で表示した。有意差はスチューデントのt検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）又はダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）検定を用いて評価した。
［統計学的解析］
本研究における全ての実験は、少なくとも２回以上実施された。数値データは、平均±標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ，（ｍｅａｎ±ＳＤ））で表示した。有意差はスチューデントのt検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）又はダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）検定を用いて評価した。
【実施例】
【0013】
［合成例］
＜オリゴヌクレオチド合成＞
オリゴヌクレオチドはホスホロアミダイト法による固相合成によって作製した（文献；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１３ Ｊａｎ １１；２８８（２）：１４２０－７）。例えば、リン酸除去トリヌクレオチド「５’－ＣＣＣ－３’」を作製する場合、３’末端から５’末端の順に合成していくため、まずは固相に担持されたデオキシシチジン｛ニトフェーズ（登録商標）ＨＬ ｄＣ（ａｃ）２５０、ＫＩＮＯＶＡＴＥ社｝から、デブロッキング溶液［ジクロロ酢酸－トルエン（３：９７）］（富士フィルム和光純薬株式会社）を用いて５’位の４，４’－ジメトキシトリチル基を除去する（脱保護）。脱保護したヌクレオチドに対し、デオキシシチジンホスホロアミダイト（富士フィルム和光純薬株式会社）とアクチベーター溶液［１Ｈ－テトラゾール・アセトニトリル溶液］（富士フィルム和光純薬株式会社）を用いて縮合する（カップリング）。ここで、カップリング反応での未反応物による副反応を抑制するため、キャッピング試薬であるキャップＡ溶液［無水酢酸／テトラヒドロフラン溶液］（富士フィルム和光純薬株式会社）及びキャップＢ溶液［テトラヒドロフラン／１－メチルイミダゾール／ピリジン（８：１：１）溶液］（富士フィルム和光純薬株式会社）を用いて未反応鎖の５’位水酸基をアセチル化する（キャッピング）。その後、酸化溶液［ヨウ素・テトラヒドロフラン：ピリジン：水（７８：２０：２）溶液］（富士フィルム和光純薬株式会社）を用いて亜リン酸エステルをリン酸エステルに変換する（安定化）。再度、脱保護した後、デオキシシチジンホスホロアミダイトを用いてカップリング反応を行う。その後、キャッピング、安定化及び脱保護の反応を行い、最後にアンモニア水を用いて担体からの切り出しを行うことで目的のトリヌクレオチド「５’－ＣＣＣ－３’」（リン酸基除去トリヌクレオチド）を作製する。実際には、合成効率を考え、ＡＢＩ社製ｍｏｄｅｌ３９４、３９２等のオリゴヌクレオチド合成装置で合成を行う。
また、５’末端にリン酸基を付加したリン酸付加トリヌクレオチド「５’－ｐＣＣＣ－３’」を合成する場合は、上記で作製したトリヌクレオチド「５’－ＣＣＣ－３’」に化学リン酸化反応試薬２－［２－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）エチルスルホニル］エチル－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト（ホンジェネ・バイオテクノロジー社）を用いて、その手順書に従ってトリヌクレオチドの５’末端にリン酸基を付加することで目的のトリヌクレオチド「５’－ｐＣＣＣ－３’」を作製する。実施例１で使用した他のトリヌクレオチドも同様に作成する。
さらに、ホスホロチオエート基を付加したトリヌクレオチドＣｓＣｓＣを合成する場合は、前述のトリヌクレオチド「５’－ＣＣＣ－３’」を作製する工程のうち、亜リン酸エステルをリン酸エステルに変換する安定化の工程の代わりに硫化剤であるＤＤＴＴ硫化試薬（富士フィルム和光純薬株式会社）で処理することで目的のホスホロチオエート基が付いたトリヌクレオチドＣｓＣｓＣを作製する。
＜オリゴヌクレオチド合成＞
オリゴヌクレオチドはホスホロアミダイト法による固相合成によって作製した（文献；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１３ Ｊａｎ １１；２８８（２）：１４２０－７）。例えば、リン酸除去トリヌクレオチド「５’－ＣＣＣ－３’」を作製する場合、３’末端から５’末端の順に合成していくため、まずは固相に担持されたデオキシシチジン｛ニトフェーズ（登録商標）ＨＬ ｄＣ（ａｃ）２５０、ＫＩＮＯＶＡＴＥ社｝から、デブロッキング溶液［ジクロロ酢酸－トルエン（３：９７）］（富士フィルム和光純薬株式会社）を用いて５’位の４，４’－ジメトキシトリチル基を除去する（脱保護）。脱保護したヌクレオチドに対し、デオキシシチジンホスホロアミダイト（富士フィルム和光純薬株式会社）とアクチベーター溶液［１Ｈ－テトラゾール・アセトニトリル溶液］（富士フィルム和光純薬株式会社）を用いて縮合する（カップリング）。ここで、カップリング反応での未反応物による副反応を抑制するため、キャッピング試薬であるキャップＡ溶液［無水酢酸／テトラヒドロフラン溶液］（富士フィルム和光純薬株式会社）及びキャップＢ溶液［テトラヒドロフラン／１－メチルイミダゾール／ピリジン（８：１：１）溶液］（富士フィルム和光純薬株式会社）を用いて未反応鎖の５’位水酸基をアセチル化する（キャッピング）。その後、酸化溶液［ヨウ素・テトラヒドロフラン：ピリジン：水（７８：２０：２）溶液］（富士フィルム和光純薬株式会社）を用いて亜リン酸エステルをリン酸エステルに変換する（安定化）。再度、脱保護した後、デオキシシチジンホスホロアミダイトを用いてカップリング反応を行う。その後、キャッピング、安定化及び脱保護の反応を行い、最後にアンモニア水を用いて担体からの切り出しを行うことで目的のトリヌクレオチド「５’－ＣＣＣ－３’」（リン酸基除去トリヌクレオチド）を作製する。実際には、合成効率を考え、ＡＢＩ社製ｍｏｄｅｌ３９４、３９２等のオリゴヌクレオチド合成装置で合成を行う。
また、５’末端にリン酸基を付加したリン酸付加トリヌクレオチド「５’－ｐＣＣＣ－３’」を合成する場合は、上記で作製したトリヌクレオチド「５’－ＣＣＣ－３’」に化学リン酸化反応試薬２－［２－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）エチルスルホニル］エチル－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト（ホンジェネ・バイオテクノロジー社）を用いて、その手順書に従ってトリヌクレオチドの５’末端にリン酸基を付加することで目的のトリヌクレオチド「５’－ｐＣＣＣ－３’」を作製する。実施例１で使用した他のトリヌクレオチドも同様に作成する。
さらに、ホスホロチオエート基を付加したトリヌクレオチドＣｓＣｓＣを合成する場合は、前述のトリヌクレオチド「５’－ＣＣＣ－３’」を作製する工程のうち、亜リン酸エステルをリン酸エステルに変換する安定化の工程の代わりに硫化剤であるＤＤＴＴ硫化試薬（富士フィルム和光純薬株式会社）で処理することで目的のホスホロチオエート基が付いたトリヌクレオチドＣｓＣｓＣを作製する。
【0014】
［実験方法１］
＜マウス由来初代培養神経幹細胞の単離／培養＞
妊娠１５日齢のマウスより胎児の大脳皮質を単離しメスで細断した。０．２５％ トリプシンと２８ ｍＭのグルコースを含むＰＢＳに浸し、３７℃で、２０分間インキュベートした。組織をピペッティングによりばらばらにほぐし、０．２％ アガロースをコーティングした（Ａｇａｒｏｓｅ ｃｏａｔｉｎｇ）６ウェルプレートに５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で播種し、浮遊条件下で培養した。最初の６日間は、１００ Ｕ／ｍＬのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、１００ μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、０．５％ Ｂ２７（１２５８７０１０、サーモフィッシャーサイエンティフィック）、１０ ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、１０ ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄ８４３７、シグマ アルドリッチ）で、３７℃、５
％ ＣＯ２インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）において培養を行った。培養３日目に、培地を半量換え、アガロースをコーティングしてない（Ｎｏ ａｇａｒｏｓｅ ｃｏａｔｉｎｇ）６ウェルプレートに撒きなおした。神経幹細胞は、細胞塊を形成し、その大きさは培養日数依存的に増加していく。６日目に、ニューロカルト化学解離キット（Ｎｅｕｒｏ Ｃｕｌｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ） （Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）により細胞塊を分散させ、９６ウェルプレートに８×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで撒きなおし（Ｒｅｓｅｅｄｉｎｇ）、０．１ μｇ／ｍＬ及び１ μｇ／ｍＬの各核酸（トリヌクレオチドＣＣＣ、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、シチジン（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ）、シトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ））や１０ μＭフォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、陽性対照）を曝露した。３日後に、ＭＴＴアッセイ（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）、ＡＴＰアッセイ（ＡＴＰ ａｓｓａｙ）、細胞塊面積（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ Ａｒｅａ）測定により、神経幹細胞増殖能を評価した。
＜マウス由来初代培養神経幹細胞の単離／培養＞
妊娠１５日齢のマウスより胎児の大脳皮質を単離しメスで細断した。０．２５％ トリプシンと２８ ｍＭのグルコースを含むＰＢＳに浸し、３７℃で、２０分間インキュベートした。組織をピペッティングによりばらばらにほぐし、０．２％ アガロースをコーティングした（Ａｇａｒｏｓｅ ｃｏａｔｉｎｇ）６ウェルプレートに５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で播種し、浮遊条件下で培養した。最初の６日間は、１００ Ｕ／ｍＬのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、１００ μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、０．５％ Ｂ２７（１２５８７０１０、サーモフィッシャーサイエンティフィック）、１０ ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、１０ ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄ８４３７、シグマ アルドリッチ）で、３７℃、５
％ ＣＯ２インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）において培養を行った。培養３日目に、培地を半量換え、アガロースをコーティングしてない（Ｎｏ ａｇａｒｏｓｅ ｃｏａｔｉｎｇ）６ウェルプレートに撒きなおした。神経幹細胞は、細胞塊を形成し、その大きさは培養日数依存的に増加していく。６日目に、ニューロカルト化学解離キット（Ｎｅｕｒｏ Ｃｕｌｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ） （Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）により細胞塊を分散させ、９６ウェルプレートに８×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで撒きなおし（Ｒｅｓｅｅｄｉｎｇ）、０．１ μｇ／ｍＬ及び１ μｇ／ｍＬの各核酸（トリヌクレオチドＣＣＣ、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、シチジン（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ）、シトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ））や１０ μＭフォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、陽性対照）を曝露した。３日後に、ＭＴＴアッセイ（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）、ＡＴＰアッセイ（ＡＴＰ ａｓｓａｙ）、細胞塊面積（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ Ａｒｅａ）測定により、神経幹細胞増殖能を評価した。
【0015】
図１は、上記マウス由来初代培養神経幹細胞の単離・培養の実験方法の流れを模式図として示されている。
【0016】
以下、実施例及び試験例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等の具体的範囲に限定されるものではない。
【0017】
［実施例１］
＜神経幹細胞の増殖に及ぼす効果＞
（試験例１）
＜ＡＴＰアッセイ（ＡＴＰ ａｓｓａｙ）＞
ＡＴＰ測定キットＡＴＰｌｉｔｅ （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の推奨プロトコルに従った。細胞が撒かれた９６ウェルプレートを、ディッシュ用遠心機により遠心した（１０００ ｒｐｍ、５分、室温）。上清をすべて除去し、１００ μＬ ＰＢＳを加え、さらに、キットの試薬（哺乳類細胞溶解液、Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ） ５０ μＬ／ｗｅｌｌ加え、７００ ｒｐｍ、１０分間振盪させた。キットのＡＴＰｌｉｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ５ ｍＬを凍結乾燥基質溶液（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に加えて、沈殿が溶けるまで優しく撹拌し、これを５０ μＬ／ｗｅｌｌ加え、７００ ｒｐｍ、５分間振盪させた。１００
μＬずつ測定用プレートに移し、アルミホイルで包み１０分間静置した。ＳｐａｒｋTM１０Ｍマルチ検出モードリーダー（ＴＥＣＡＮ）により発光を測定した。
＜神経幹細胞の増殖に及ぼす効果＞
（試験例１）
＜ＡＴＰアッセイ（ＡＴＰ ａｓｓａｙ）＞
ＡＴＰ測定キットＡＴＰｌｉｔｅ （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の推奨プロトコルに従った。細胞が撒かれた９６ウェルプレートを、ディッシュ用遠心機により遠心した（１０００ ｒｐｍ、５分、室温）。上清をすべて除去し、１００ μＬ ＰＢＳを加え、さらに、キットの試薬（哺乳類細胞溶解液、Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ） ５０ μＬ／ｗｅｌｌ加え、７００ ｒｐｍ、１０分間振盪させた。キットのＡＴＰｌｉｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ５ ｍＬを凍結乾燥基質溶液（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に加えて、沈殿が溶けるまで優しく撹拌し、これを５０ μＬ／ｗｅｌｌ加え、７００ ｒｐｍ、５分間振盪させた。１００
μＬずつ測定用プレートに移し、アルミホイルで包み１０分間静置した。ＳｐａｒｋTM１０Ｍマルチ検出モードリーダー（ＴＥＣＡＮ）により発光を測定した。
【0018】
（試験例２）
＜ＭＴＴアッセイ（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）＞
本発明においては、神経幹細胞増殖の促進を確認する方法としてＭＴＴ試験を用いる。ＭＴＴアッセイは、ＭＴＴ（３－（４，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｌ－２－ｙｌ）－２，５－Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚａｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ）を用いた公知の比色分析試験である。
細胞が撒かれた９６ウェルプレートを、ディッシュ用遠心機により遠心した（１０００
ｒｐｍ、１０分、室温）。培地を除き、０．５ ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ及び３３ ｍＭ グルコースを含むＰＢＳを１００ μＬ／ｗｅｌｌ加え、３７℃、５％ ＣＯ２ インキュベーター内で１時間静置する。反応停止のために、０．０４Ｍ ＨＣｌを含むイソプロパノールを、各ウェルに１００ μＬ添加して、５７０ ｎｍの吸光度を測定した。
＜ＭＴＴアッセイ（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）＞
本発明においては、神経幹細胞増殖の促進を確認する方法としてＭＴＴ試験を用いる。ＭＴＴアッセイは、ＭＴＴ（３－（４，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｌ－２－ｙｌ）－２，５－Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚａｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ）を用いた公知の比色分析試験である。
細胞が撒かれた９６ウェルプレートを、ディッシュ用遠心機により遠心した（１０００
ｒｐｍ、１０分、室温）。培地を除き、０．５ ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ及び３３ ｍＭ グルコースを含むＰＢＳを１００ μＬ／ｗｅｌｌ加え、３７℃、５％ ＣＯ２ インキュベーター内で１時間静置する。反応停止のために、０．０４Ｍ ＨＣｌを含むイソプロパノールを、各ウェルに１００ μＬ添加して、５７０ ｎｍの吸光度を測定した。
【0019】
（試験例３）
＜細胞塊面積（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ ａｒｅａ）測定＞
各ウェルから１００ μＬずつ培地を除去し、４ μＭ カルセイン－ＡＭを含むＰＢ
Ｓを１００ μＬずつ加え、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内に３０分間静置した。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００により撮影し、ソフトウェア ＩｍａｇｅＪにより細胞塊面積を測定した。
＜細胞塊面積（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ ａｒｅａ）測定＞
各ウェルから１００ μＬずつ培地を除去し、４ μＭ カルセイン－ＡＭを含むＰＢ
Ｓを１００ μＬずつ加え、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内に３０分間静置した。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００により撮影し、ソフトウェア ＩｍａｇｅＪにより細胞塊面積を測定した。
【0020】
＜ＭＴＴアッセイ、ＡＴＰアッセイ及び細胞塊面積測定の結果＞
結果を図２に示す。図２中、各核酸の添加濃度は［実験方法１］に記載の通りである。「＊」はＰ＜０．０５（コントロールに対する）であることを示す。フォルスコリンは核酸とは異なる陽性対照として用いた。
図２に示すように、３つのヌクレオチドが連なったトリヌクレオチド（全６４種）のうちＣＣＣを添加した場合のみ、マウス胎仔由来神経幹細胞におけるＡＴＰアッセイで有意に増加した。さらに、トリヌクレオチドＣＣＣ、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、シチジン（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ）及びシトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で処理後の神経幹細胞の増殖に及ぼす効果との対比において、ＭＴＴアッセイや細胞塊面積においてもトリヌクレオチドＣＣＣ添加のみで有意に増加し、有意に神経幹細胞の増殖を促進する効果が見えたことが分かる。
結果を図２に示す。図２中、各核酸の添加濃度は［実験方法１］に記載の通りである。「＊」はＰ＜０．０５（コントロールに対する）であることを示す。フォルスコリンは核酸とは異なる陽性対照として用いた。
図２に示すように、３つのヌクレオチドが連なったトリヌクレオチド（全６４種）のうちＣＣＣを添加した場合のみ、マウス胎仔由来神経幹細胞におけるＡＴＰアッセイで有意に増加した。さらに、トリヌクレオチドＣＣＣ、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、シチジン（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ）及びシトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で処理後の神経幹細胞の増殖に及ぼす効果との対比において、ＭＴＴアッセイや細胞塊面積においてもトリヌクレオチドＣＣＣ添加のみで有意に増加し、有意に神経幹細胞の増殖を促進する効果が見えたことが分かる。
【0021】
これらの結果によって、トリヌクレオチドＣＣＣにて神経幹細胞の増殖を促進された効果が見えた一方、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン、シチジン、シトシンでは効果がなかったことから、神経幹細胞増殖に対してトリヌクレオチドＣＣＣが重要であると示唆された。
実施例１では、神経幹細胞増殖に及ぼす効果を評価することにより、トリヌクレオチドＣＣＣを用いて神経幹細胞増殖を促進することが可能であるのを確認した。
実施例１では、神経幹細胞増殖に及ぼす効果を評価することにより、トリヌクレオチドＣＣＣを用いて神経幹細胞増殖を促進することが可能であるのを確認した。
【0022】
［実施例２］
＜培地中の核酸濃度の定量＞
トリヌクレオチドＣＣＣ、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン、シチジン、シトシンの、神経幹細胞へ添加後に特定の時間後の分解を追跡した。
＜培地中の核酸濃度の定量＞
トリヌクレオチドＣＣＣ、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン、シチジン、シトシンの、神経幹細胞へ添加後に特定の時間後の分解を追跡した。
【0023】
（試験例４）
＜ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる核酸濃度の定量＞
［実験方法１］の方法に従って、培養培地を回収し、２２，０００ ×ｇ、４℃、１０分で遠心する。得られた上清１００ μＬに２ μＭ 内標準物質５端－ジオキシ－５端－フルオロシチジン及び２ ｍＭのＥＤＴＡを含む水を１０ μＬ、１００％ メタノールを４８０ μＬ、水１０ μＬを添加し、３分間、室温でボルテックスを行った。２２，０００ ×ｇ、４℃、１０分間遠心を行い、上清５３０ μＬを回収し、さらに２２，０００ ×ｇ、４℃、１０分間遠心を行い、上清５００ μＬを回収し、エバポレーターにより蒸発乾固した。水７５ μＬ、アセトニトリル７５ μＬを添加し、ソニケーションにより溶解させた。２２，０００ ×ｇ、４℃、１０分間遠心を行い、上清１ μＬを測定に用いた。測定には、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ アミドカラム（粒子サイズ：１．７ μｍ、カラム直径：２．１×１５０ ｍｍ；ウォーターズ株式会社）を装備したＬＣＭＳ－８０４０（島津）を用い、シトシン、シチジン、デオキシシチジン、及びデオキシシチジン一リン酸の定量を行った。
カラム温度は５０℃で維持した。溶出は、以下に示す溶媒Ａ及び溶媒Ｂを用いて、０．４ ｍＬ／ｍｉｎの流速で行った。イオン化は、陽イオンエレクトロスプレー法を用いた。ｍ／ｚをそれぞれシトシン（１１２．００ ないし １１２．０５）、シチジン（２４４．００ ないし １１２．００）、デオキシシチジン（ｄＣ）（２２８．００ ないし
１１２．０５）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）（３０７．９５ ないし １１２．００）に設定し、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）取得モードにより検出された。分析は、ラボソリューション ソフトウェア（島津）を用い行った。詳しい測定条件は以下の通りである。
溶媒Ａは、５ ｍＭ 酢酸アンモニウム、５ ｍＭ ギ酸アンモニウム、及び２％ ギ酸及びアセトニトリルの混合物（ギ酸：アセトニトリル＝８０：２０）を含有する水溶液。
溶媒Ｂは、１ ｍＭ 酢酸アンモニウム水溶液、１ ｍＭ ギ酸アンモニウム水溶液、及び２％ ギ酸及びアセトニトリルの混合物（ギ酸：アセトニトリル＝５：９５）を含有する水溶液。
移動相の条件は以下の通りである。
０-０．５分： １％ Ａ／９９％ Ｂ
０．５-７．０分： １％ Ａ／９９％ Ｂ ないし １５％ Ａ／８５％Ｂ
７．０-７．５分： １５％ Ａ／８５％ Ｂ
７．５-９．０分： ７０％ Ａ／３０％ Ｂ
９．０-９．２分： ７０％ Ａ／３０％ Ｂ ないし １％Ａ／９９％Ｂ
９．２-１４．５分： １％Ａ／９９％Ｂ
＜ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる核酸濃度の定量＞
［実験方法１］の方法に従って、培養培地を回収し、２２，０００ ×ｇ、４℃、１０分で遠心する。得られた上清１００ μＬに２ μＭ 内標準物質５端－ジオキシ－５端－フルオロシチジン及び２ ｍＭのＥＤＴＡを含む水を１０ μＬ、１００％ メタノールを４８０ μＬ、水１０ μＬを添加し、３分間、室温でボルテックスを行った。２２，０００ ×ｇ、４℃、１０分間遠心を行い、上清５３０ μＬを回収し、さらに２２，０００ ×ｇ、４℃、１０分間遠心を行い、上清５００ μＬを回収し、エバポレーターにより蒸発乾固した。水７５ μＬ、アセトニトリル７５ μＬを添加し、ソニケーションにより溶解させた。２２，０００ ×ｇ、４℃、１０分間遠心を行い、上清１ μＬを測定に用いた。測定には、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ アミドカラム（粒子サイズ：１．７ μｍ、カラム直径：２．１×１５０ ｍｍ；ウォーターズ株式会社）を装備したＬＣＭＳ－８０４０（島津）を用い、シトシン、シチジン、デオキシシチジン、及びデオキシシチジン一リン酸の定量を行った。
カラム温度は５０℃で維持した。溶出は、以下に示す溶媒Ａ及び溶媒Ｂを用いて、０．４ ｍＬ／ｍｉｎの流速で行った。イオン化は、陽イオンエレクトロスプレー法を用いた。ｍ／ｚをそれぞれシトシン（１１２．００ ないし １１２．０５）、シチジン（２４４．００ ないし １１２．００）、デオキシシチジン（ｄＣ）（２２８．００ ないし
１１２．０５）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）（３０７．９５ ないし １１２．００）に設定し、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）取得モードにより検出された。分析は、ラボソリューション ソフトウェア（島津）を用い行った。詳しい測定条件は以下の通りである。
溶媒Ａは、５ ｍＭ 酢酸アンモニウム、５ ｍＭ ギ酸アンモニウム、及び２％ ギ酸及びアセトニトリルの混合物（ギ酸：アセトニトリル＝８０：２０）を含有する水溶液。
溶媒Ｂは、１ ｍＭ 酢酸アンモニウム水溶液、１ ｍＭ ギ酸アンモニウム水溶液、及び２％ ギ酸及びアセトニトリルの混合物（ギ酸：アセトニトリル＝５：９５）を含有する水溶液。
移動相の条件は以下の通りである。
０-０．５分： １％ Ａ／９９％ Ｂ
０．５-７．０分： １％ Ａ／９９％ Ｂ ないし １５％ Ａ／８５％Ｂ
７．０-７．５分： １５％ Ａ／８５％ Ｂ
７．５-９．０分： ７０％ Ａ／３０％ Ｂ
９．０-９．２分： ７０％ Ａ／３０％ Ｂ ないし １％Ａ／９９％Ｂ
９．２-１４．５分： １％Ａ／９９％Ｂ
【0024】
＜結果＞
図３は、上記試験例４の流れを模式図として示されている。
図３に示すように、１ μｇ／ｍＬのトリヌクレオチドＣＣＣや他の核酸を神経幹細胞へ添加すると、添加後の特定の時間において各核酸が分解した結果を図４に示した。それぞれ添加された核酸が主成分として検出された一方、トリヌクレオチドＣＣＣ添加後に特徴的な核酸は検出されておらず、検討されたトリヌクレオチドＣＣＣ以外の核酸が増殖促進作用を示している可能性は低いと思われた。
図３は、上記試験例４の流れを模式図として示されている。
図３に示すように、１ μｇ／ｍＬのトリヌクレオチドＣＣＣや他の核酸を神経幹細胞へ添加すると、添加後の特定の時間において各核酸が分解した結果を図４に示した。それぞれ添加された核酸が主成分として検出された一方、トリヌクレオチドＣＣＣ添加後に特徴的な核酸は検出されておらず、検討されたトリヌクレオチドＣＣＣ以外の核酸が増殖促進作用を示している可能性は低いと思われた。
【0025】
【0026】
＜ＭＴＴアッセイの結果＞
結果を図６に示した。図６中、ＤＩＶは１日培養を意味する。
図６に示すように、トリヌクレオチドＣＣＣによる増殖促進は２日後から３日後にかけて見られる一方、ｄＣＭＰやｄＣでは、相変わらず、増殖効果がなかった。
この結果により、トリヌクレオチドＣＣＣは神経幹細胞の増殖を促進する効果があるが、ｄＣＭＰやｄＣには増殖効果がなかったことを考えると、トリヌクレオチドＣＣＣは神経幹細胞の増殖促進に有利、且つ重要である。
結果を図６に示した。図６中、ＤＩＶは１日培養を意味する。
図６に示すように、トリヌクレオチドＣＣＣによる増殖促進は２日後から３日後にかけて見られる一方、ｄＣＭＰやｄＣでは、相変わらず、増殖効果がなかった。
この結果により、トリヌクレオチドＣＣＣは神経幹細胞の増殖を促進する効果があるが、ｄＣＭＰやｄＣには増殖効果がなかったことを考えると、トリヌクレオチドＣＣＣは神経幹細胞の増殖促進に有利、且つ重要である。
【0027】
＜培地中各核酸濃度の変化の結果＞
神経幹細胞増殖能及び培地中各核酸濃度と培養時間との対応関係の結果が図７の折れ線グラフに示された。図７の中には、ＤＩＶは１日培養を意味し、横軸は培養時間であり、吹き出しに示された化合物を添加後の培地中各核酸濃度の変化を示している。トリヌクレオチドＣＣＣ添加後のみで特徴的に検出された核酸は見られず、検討されたトリヌクレオチドＣＣＣ以外の核酸が増殖促進作用を示している可能性は低いと思われた。
神経幹細胞増殖能及び培地中各核酸濃度と培養時間との対応関係の結果が図７の折れ線グラフに示された。図７の中には、ＤＩＶは１日培養を意味し、横軸は培養時間であり、吹き出しに示された化合物を添加後の培地中各核酸濃度の変化を示している。トリヌクレオチドＣＣＣ添加後のみで特徴的に検出された核酸は見られず、検討されたトリヌクレオチドＣＣＣ以外の核酸が増殖促進作用を示している可能性は低いと思われた。
【0028】
［実施例４］
Ｃの数をトリマー（ｔｒｉｍｅｒ）からもっと多く増やし、前記トリヌクレオチドＣＣＣが２つに連結してなるオリゴヌクレオチドＣ６又は前記トリヌクレオチドＣＣＣが４つに連結してなるオリゴヌクレオチドＣ１２を神経幹細胞の培養培地に添加する工程後、神経幹細胞の増殖能及び培地中各核酸濃度を測定し、その結果により、Ｃ６又はＣ１２が神経幹細胞の増殖に与える影響を評価した。
図８は、オリゴヌクレオチドＣ６又はオリゴヌクレオチドＣ１２を神経幹細胞の培養培地に添加する工程及びその後増殖能及び核酸濃度の測定の模式図である。
＜ＭＴＴアッセイ、ＡＴＰアッセイ及び細胞塊面積測定の結果＞
結果を図９に示す。図９中、＊はＰ＜０．０５（コントロールに対する）であることを示す。
図９に示すように、フォルスコリンは核酸とは異なる陽性対照として用いた。試験の結果は、リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣ、リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣだけでなく、トリヌクレオチドＣＣＣをその２倍又は４倍の長さにし、オリゴヌクレオチドＣ６（図９中のＣ６）やオリゴヌクレオチドＣ１２（図９中のＣ１２）にて処理後の神経幹細胞でも同様にＡＴＰアッセイで有意に増加した。さらに、ＭＴＴアッセイや細胞塊面積においても有意に増加し、神経幹細胞の増殖を促進する効果がある。
Ｃの数をトリマー（ｔｒｉｍｅｒ）からもっと多く増やし、前記トリヌクレオチドＣＣＣが２つに連結してなるオリゴヌクレオチドＣ６又は前記トリヌクレオチドＣＣＣが４つに連結してなるオリゴヌクレオチドＣ１２を神経幹細胞の培養培地に添加する工程後、神経幹細胞の増殖能及び培地中各核酸濃度を測定し、その結果により、Ｃ６又はＣ１２が神経幹細胞の増殖に与える影響を評価した。
図８は、オリゴヌクレオチドＣ６又はオリゴヌクレオチドＣ１２を神経幹細胞の培養培地に添加する工程及びその後増殖能及び核酸濃度の測定の模式図である。
＜ＭＴＴアッセイ、ＡＴＰアッセイ及び細胞塊面積測定の結果＞
結果を図９に示す。図９中、＊はＰ＜０．０５（コントロールに対する）であることを示す。
図９に示すように、フォルスコリンは核酸とは異なる陽性対照として用いた。試験の結果は、リン酸除去トリヌクレオチドＣＣＣ、リン酸付加トリヌクレオチドＣＣＣだけでなく、トリヌクレオチドＣＣＣをその２倍又は４倍の長さにし、オリゴヌクレオチドＣ６（図９中のＣ６）やオリゴヌクレオチドＣ１２（図９中のＣ１２）にて処理後の神経幹細胞でも同様にＡＴＰアッセイで有意に増加した。さらに、ＭＴＴアッセイや細胞塊面積においても有意に増加し、神経幹細胞の増殖を促進する効果がある。
【0029】
［実施例５］
神経幹細胞の神経細胞及びグリア細胞への分化能について評価した。
神経幹細胞の神経細胞及びグリア細胞への分化能について評価した。
【0030】
（試験例５）
＜マウス由来初代培養神経幹細胞の分化誘導＞
［実験方法１］の方法に従って６日目に、ニューロカルト化学解離キット（Ｎｅｕｒｏ
Ｃｕｌｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により細胞塊を分散させ、６ウェルプレートに０．８×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで撒きなおし、１ μｇ／ｍＬ トリヌクレオチドＣＣＣあるいは１０ μＭ フォルスコリンにて曝露した。３日後に、ニューロカルト化学解離キット（Ｎｅｕｒｏ Ｃｕｌｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）による細胞塊を分散させ、あらかじめポリーＬーリジンがコーティングされた９６ウェルプレートに３×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで撒きなおし、接着培養を行った。分化誘導時の培地は、５％ ＦＢＳ、１００ Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、２８ ｍＭ グルコース、２ ｍＭ グルタミン、５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５ μｇ／ｍＬ アポトランスフェリン、２５０
ｎｇ／ｍＬ インスリン、０．５ ｐＭ エストラジオール、１．５
ｎＭ トリヨードチロニン、１０ ｎＭ プロゲステロン、４ ｎｇ／ｍＬ セレン酸ナトリウム、５０ μＭ プトレッシンを添加したＤＭＥＭ（Ｄ５７９６、シグマ アルドリッチ）を用いた。３日後、免疫染色を行い、分化能を評価した。
＜マウス由来初代培養神経幹細胞の分化誘導＞
［実験方法１］の方法に従って６日目に、ニューロカルト化学解離キット（Ｎｅｕｒｏ
Ｃｕｌｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により細胞塊を分散させ、６ウェルプレートに０．８×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで撒きなおし、１ μｇ／ｍＬ トリヌクレオチドＣＣＣあるいは１０ μＭ フォルスコリンにて曝露した。３日後に、ニューロカルト化学解離キット（Ｎｅｕｒｏ Ｃｕｌｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）による細胞塊を分散させ、あらかじめポリーＬーリジンがコーティングされた９６ウェルプレートに３×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで撒きなおし、接着培養を行った。分化誘導時の培地は、５％ ＦＢＳ、１００ Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、２８ ｍＭ グルコース、２ ｍＭ グルタミン、５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５ μｇ／ｍＬ アポトランスフェリン、２５０
ｎｇ／ｍＬ インスリン、０．５ ｐＭ エストラジオール、１．５
ｎＭ トリヨードチロニン、１０ ｎＭ プロゲステロン、４ ｎｇ／ｍＬ セレン酸ナトリウム、５０ μＭ プトレッシンを添加したＤＭＥＭ（Ｄ５７９６、シグマ アルドリッチ）を用いた。３日後、免疫染色を行い、分化能を評価した。
【0031】
（試験例６）
＜免疫染色（分化能評価）＞
細胞を、ＰＢＳで洗浄し、４％ パラホルムアルデヒドにより、室温、２０分インキュベートし固定化した。さらに、３％ ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳにて室温、３０分間インキュベートし、ブロッキングを行った。未成熟な神経細胞のマーカー（βＩＩＩ－チューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ））、アストロサイトのマーカー（ＧＦＡＰ）を、ブロッキング液を１０倍希釈した溶液により、各１／１０００で希釈し、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳによって、３回洗浄し、蛍光標識された二次抗体を、ブロッキング液を１０倍希釈した溶液により１０００倍に希釈し、室温で１時間反応させた。二次抗体反応を終えた細胞は、ＰＢＳにより３回洗浄を行い、ＤＡＰＩ封入剤を添加し、周りをマニキュアで密封し、室温、遮光条件下で乾燥させた。観察は、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００を用いて行った。神経分化能の評価においては、緑色蛍光で染色したβＩＩＩ－チューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）陽性細胞数と、赤色蛍光で染色したＧＦＡＰ陽性細胞数を、全細胞数であるＤＡＰＩ陽性細胞数に占める各陽性細胞数の割合により算出した。
図１０は、マウス由来初代培養神経幹細胞の分化誘導及び免疫染色の流れの模式図である。
＜免疫染色（分化能評価）＞
細胞を、ＰＢＳで洗浄し、４％ パラホルムアルデヒドにより、室温、２０分インキュベートし固定化した。さらに、３％ ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳにて室温、３０分間インキュベートし、ブロッキングを行った。未成熟な神経細胞のマーカー（βＩＩＩ－チューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ））、アストロサイトのマーカー（ＧＦＡＰ）を、ブロッキング液を１０倍希釈した溶液により、各１／１０００で希釈し、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳによって、３回洗浄し、蛍光標識された二次抗体を、ブロッキング液を１０倍希釈した溶液により１０００倍に希釈し、室温で１時間反応させた。二次抗体反応を終えた細胞は、ＰＢＳにより３回洗浄を行い、ＤＡＰＩ封入剤を添加し、周りをマニキュアで密封し、室温、遮光条件下で乾燥させた。観察は、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００を用いて行った。神経分化能の評価においては、緑色蛍光で染色したβＩＩＩ－チューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）陽性細胞数と、赤色蛍光で染色したＧＦＡＰ陽性細胞数を、全細胞数であるＤＡＰＩ陽性細胞数に占める各陽性細胞数の割合により算出した。
図１０は、マウス由来初代培養神経幹細胞の分化誘導及び免疫染色の流れの模式図である。
【0032】
＜結果＞
免疫染色を行い、トリヌクレオチドＣＣＣを用いて神経幹細胞を培養した後の神経細胞
への分化誘導の結果を、図１１の画像で示した。
図１１の画像にて免疫染色の各陽性細胞数を定量し、その結果を図１２の柱系図に示した。トリヌクレオチドＣＣＣにて培養すると神経細胞に分化する割合が増える傾向にある一方、アストロサイト（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）への分化は変わらない。神経新生が選択的に促進されている。
免疫染色を行い、トリヌクレオチドＣＣＣを用いて神経幹細胞を培養した後の神経細胞
への分化誘導の結果を、図１１の画像で示した。
図１１の画像にて免疫染色の各陽性細胞数を定量し、その結果を図１２の柱系図に示した。トリヌクレオチドＣＣＣにて培養すると神経細胞に分化する割合が増える傾向にある一方、アストロサイト（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）への分化は変わらない。神経新生が選択的に促進されている。
【0033】
非特許文献１には、水溶性のサケ白子抽出物を摂取した場合、脳内（海馬中）のシチジン量やデオキシシチジン量が増加したとの動物試験の結果が報告されている。その時、さらに行動試験や培養細胞試験において脳機能の改善作用や神経幹細胞の増殖促進が見られるとも報告されている。一方、本発明の実施例２ないし実施例４は、トリヌクレオチドＣＣＣ、オリゴヌクレオチドＣ６又はオリゴヌクレオチドＣ１２を細胞の培養液に加入すると、前記ヌクレオチドもシチジンやデオキシシチジンなどに分解され（図４、図７）、神経幹細胞の増殖を促進する（図２、図６、図９）ことから、本発明にあっては、非特許文献１の動物試験の結果のように、脳機能改善作用が発現することが期待される。
要するに、トリヌクレオチドＣＣＣ、オリゴヌクレオチドＣ６又はオリゴヌクレオチドＣ１２を含む健康食品を摂取することは、ヒトの脳機能を強化することができると思われる。
したがって、本発明によるトリヌクレオチドＣＣＣ、オリゴヌクレオチドＣ６又はオリゴヌクレオチドＣ１２を含有する、例えば、前記トリヌクレオチドが多く存在している水溶性サケ白子抽出物を含む食品は脳機能改善作用を発現する健康食品として、好ましく使用することができる。また、本発明によるトリヌクレオチドＣＣＣ、オリゴヌクレオチドＣ６又はオリゴヌクレオチドＣ１２を含有する水溶性サケ白子抽出物と、ほかの栄養補給成分、例えば、たんぱく質、脂質、炭水化物、ビタミンＣ、パントテン酸カルシウム、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ２、ビタミンＢ１、食塩等とを組み合わせて、それらの栄養補給機能、並びに脳機能を強化するとともに健康を維持することを目的として、サプリメント特定保健用食品、機能性表示食品、栄養補助食品等としても、好ましく使用することができる。
要するに、トリヌクレオチドＣＣＣ、オリゴヌクレオチドＣ６又はオリゴヌクレオチドＣ１２を含む健康食品を摂取することは、ヒトの脳機能を強化することができると思われる。
したがって、本発明によるトリヌクレオチドＣＣＣ、オリゴヌクレオチドＣ６又はオリゴヌクレオチドＣ１２を含有する、例えば、前記トリヌクレオチドが多く存在している水溶性サケ白子抽出物を含む食品は脳機能改善作用を発現する健康食品として、好ましく使用することができる。また、本発明によるトリヌクレオチドＣＣＣ、オリゴヌクレオチドＣ６又はオリゴヌクレオチドＣ１２を含有する水溶性サケ白子抽出物と、ほかの栄養補給成分、例えば、たんぱく質、脂質、炭水化物、ビタミンＣ、パントテン酸カルシウム、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ２、ビタミンＢ１、食塩等とを組み合わせて、それらの栄養補給機能、並びに脳機能を強化するとともに健康を維持することを目的として、サプリメント特定保健用食品、機能性表示食品、栄養補助食品等としても、好ましく使用することができる。
【0034】
［実施例６］
神経幹細胞の増殖促進効果が示されていたトリヌクレオチドＣＣＣに加え、安定性を高めるためにホスホロチオエート基を付けて合成したＣｓＣｓＣを用いてマウスの神経幹細胞の増殖促進効果を検討した。ホスホロチオエート基は、リン酸基の酸素原子が硫黄原子に置換された構造である。この構造はエキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼの活性に耐性がある。ゆえに、トリヌクレオチドＣｓＣｓＣは、トリヌクレオチドＣＣＣに比べ安定性が高いといわれている。
神経幹細胞の増殖促進効果が示されていたトリヌクレオチドＣＣＣに加え、安定性を高めるためにホスホロチオエート基を付けて合成したＣｓＣｓＣを用いてマウスの神経幹細胞の増殖促進効果を検討した。ホスホロチオエート基は、リン酸基の酸素原子が硫黄原子に置換された構造である。この構造はエキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼの活性に耐性がある。ゆえに、トリヌクレオチドＣｓＣｓＣは、トリヌクレオチドＣＣＣに比べ安定性が高いといわれている。
【0035】
＜ＭＴＴアッセイ、ＡＴＰアッセイ及び細胞塊面積測定＞
試験は、６日目まで、［実験方法１］の方法に従い、６日目に、ニューロカルト化学解離キットにより細胞塊を分散させ、９６ウェルプレートに０．８×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで撒きなおし、０．１、１及び１０ μｇ／ｍＬ トリヌクレオチドＣＣＣあるいは０．１、１及び１０ μｇ／ｍＬ トリヌクレオチドＣｓＣｓＣを曝露した。神経幹細胞増殖能の評価は、その３日後に、ＭＴＴアッセイ（試験例２参照）、ＡＴＰアッセイ（試験例１参照）、細胞塊面積（試験例３参照）測定により行われた。図１３は実施例６の方法の流れを示す模式図である。
試験は、６日目まで、［実験方法１］の方法に従い、６日目に、ニューロカルト化学解離キットにより細胞塊を分散させ、９６ウェルプレートに０．８×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで撒きなおし、０．１、１及び１０ μｇ／ｍＬ トリヌクレオチドＣＣＣあるいは０．１、１及び１０ μｇ／ｍＬ トリヌクレオチドＣｓＣｓＣを曝露した。神経幹細胞増殖能の評価は、その３日後に、ＭＴＴアッセイ（試験例２参照）、ＡＴＰアッセイ（試験例１参照）、細胞塊面積（試験例３参照）測定により行われた。図１３は実施例６の方法の流れを示す模式図である。
【0036】
＜ＭＴＴアッセイ、ＡＴＰアッセイ及び細胞塊面積測定の結果＞
結果を図１４に示す。図１４のＡはＭＴＴアッセイ、図１４のＢはＡＴＰアッセイ、図１４のＣは細胞塊面積測定の結果を示す。「＊」はＰ＜０．０５（コントロールに対する）であることを示す。フォルスコリンはオリゴヌクレオチド等の核酸関連物質とは異なる陽性対照として用いた。
図１４に示すように、ＭＴＴアッセイ、ＡＴＰアッセイ及び細胞塊面積測定のいずれの結果においても、トリヌクレオチドＣｓＣｓＣを用いた場合は、トリヌクレオチドＣＣＣを用いた場合と同様にコントロールに対し有意に神経幹細胞の増殖を促進する濃度が存在する。トリヌクレオチドＣｓＣｓＣを用いた場合は、トリヌクレオチドＣＣＣを用いた場合と類似した結果が得られた。トリヌクレオチドＣｓＣｓＣは有意に神経幹細胞の増殖を促進する効果を有することが判った。
先に述べたように、トリヌクレオチドＣｓＣｓＣは、トリヌクレオチドＣＣＣよりも安定性に優れているため、トリヌクレオチドＣｓＣｓＣは分解して神経幹細胞の増殖に関与しているのではなく、分解せずトリヌクレオチドＣｓＣｓＣとして神経幹細胞の増殖に関与していることが判った。
結果を図１４に示す。図１４のＡはＭＴＴアッセイ、図１４のＢはＡＴＰアッセイ、図１４のＣは細胞塊面積測定の結果を示す。「＊」はＰ＜０．０５（コントロールに対する）であることを示す。フォルスコリンはオリゴヌクレオチド等の核酸関連物質とは異なる陽性対照として用いた。
図１４に示すように、ＭＴＴアッセイ、ＡＴＰアッセイ及び細胞塊面積測定のいずれの結果においても、トリヌクレオチドＣｓＣｓＣを用いた場合は、トリヌクレオチドＣＣＣを用いた場合と同様にコントロールに対し有意に神経幹細胞の増殖を促進する濃度が存在する。トリヌクレオチドＣｓＣｓＣを用いた場合は、トリヌクレオチドＣＣＣを用いた場合と類似した結果が得られた。トリヌクレオチドＣｓＣｓＣは有意に神経幹細胞の増殖を促進する効果を有することが判った。
先に述べたように、トリヌクレオチドＣｓＣｓＣは、トリヌクレオチドＣＣＣよりも安定性に優れているため、トリヌクレオチドＣｓＣｓＣは分解して神経幹細胞の増殖に関与しているのではなく、分解せずトリヌクレオチドＣｓＣｓＣとして神経幹細胞の増殖に関与していることが判った。
【0037】
［実施例７］
＜トリヌクレオチドＣＣＣ及びトリヌクレオチドＣｓＣｓＣの代謝＞
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより、神経幹細胞培養培地中で各オリゴヌクレオチド濃度と時間推移との両方を測定し、両者の対応関係を解明した。
試験は、６日目まで、［実験方法１］の方法に従い、６日目に、ニューロカルト化学解離キットにより細胞塊を分散させ、９６ウェルプレートに０．８×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで撒きなおし、１ μｇ／ｍＬ トリヌクレオチドＣＣＣあるいは１ μｇ／ｍＬ トリヌクレオチドＣｓＣｓＣを曝露した。その後に、培地を採取しＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。図１５は、実施例７の方法の流れを示す模式図である。
＜トリヌクレオチドＣＣＣ及びトリヌクレオチドＣｓＣｓＣの代謝＞
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより、神経幹細胞培養培地中で各オリゴヌクレオチド濃度と時間推移との両方を測定し、両者の対応関係を解明した。
試験は、６日目まで、［実験方法１］の方法に従い、６日目に、ニューロカルト化学解離キットにより細胞塊を分散させ、９６ウェルプレートに０．８×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで撒きなおし、１ μｇ／ｍＬ トリヌクレオチドＣＣＣあるいは１ μｇ／ｍＬ トリヌクレオチドＣｓＣｓＣを曝露した。その後に、培地を採取しＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。図１５は、実施例７の方法の流れを示す模式図である。
【0038】
＜培地中各オリゴヌクレオチド濃度の変化の結果＞
培地中各オリゴヌクレオチド濃度と培養時間との対応関係の結果を図１６の折れ線グラフに示す。図１６のＡは、トリヌクレオチドＣＣＣの変化を示し、図１６のＢは、トリヌクレオチドＣｓＣｓＣの変化を示す。図１６の横軸は培養時間であり、ＤＩＶは１日培養を意味する。なお、実施例６で示したように、トリヌクレオチドＣＣＣ及びトリヌクレオチドＣｓＣｓＣにおいては、同様に神経幹細胞の増殖がみられた。図１６により、トリヌクレオチドＣＣＣ添加後トリヌクレオチドＣＣＣは、時間の経過に伴い培地中で減少した。しかし、トリヌクレオチドＣｓＣｓＣの添加後トリヌクレオチドＣｓＣｓＣはトリヌクレオチドＣＣＣに比べ変化しないことが示された。
この結果から、トリヌクレオチドＣｓＣｓＣは、分解されず神経幹細胞の増殖に作用している、即ち、培地中に添加したトリヌクレオチドＣＣＣはトリヌクレオチドの形のまま神経幹細胞の増殖に作用していることが示された。
培地中各オリゴヌクレオチド濃度と培養時間との対応関係の結果を図１６の折れ線グラフに示す。図１６のＡは、トリヌクレオチドＣＣＣの変化を示し、図１６のＢは、トリヌクレオチドＣｓＣｓＣの変化を示す。図１６の横軸は培養時間であり、ＤＩＶは１日培養を意味する。なお、実施例６で示したように、トリヌクレオチドＣＣＣ及びトリヌクレオチドＣｓＣｓＣにおいては、同様に神経幹細胞の増殖がみられた。図１６により、トリヌクレオチドＣＣＣ添加後トリヌクレオチドＣＣＣは、時間の経過に伴い培地中で減少した。しかし、トリヌクレオチドＣｓＣｓＣの添加後トリヌクレオチドＣｓＣｓＣはトリヌクレオチドＣＣＣに比べ変化しないことが示された。
この結果から、トリヌクレオチドＣｓＣｓＣは、分解されず神経幹細胞の増殖に作用している、即ち、培地中に添加したトリヌクレオチドＣＣＣはトリヌクレオチドの形のまま神経幹細胞の増殖に作用していることが示された。
【0039】
［実施例８］
＜ウッシングタイプチャンバー法による小腸膜透過試験＞
試験に用いた動物は８週齢の雄性ＩＣＲマウスである。試験に用いた腸は、１８時間絶食後のマウスをイソフルランガス麻酔で仰向けに固定し、マウスの小腸上部の腸管を採取した。取り出した腸管は腸軸に沿って切り開き、氷冷した生理食塩水で内容物を洗った後にピンセットを使用し筋層を剥いだ。小腸の組織切片は直ちに有効表面積０．２５ ｃｍ２のウッシングタイプチャンバーに装着した。試験は、ｐＨ６．０に調整した試薬を添加側に２ ｍＬ添加し、ｐＨ７．４に調整した輸送バッファーを透過側に２ ｍＬ添加することで開始した。評価は添加側から透過側への膜透過する物質を測定することで行った。筋層剥離後の膜の完全性は、パラセルラーマーカーとして平均分子量４０００のＦＩＴＣ－デキストラン（ＦＤ－４）を用いることで確認した。実験は３７℃で行い、常に９５％Ｏ２／５％ＣＯ２ガスを両溶液中に通気させた。サンプリングは所定の時間に透過側のバッファーを２００ μＬ採取し、当量のバッファーを補充することでチャンバー内のバッファー量が変化しないようにした。また、添加側のサンプリングは所定の時間にバッファーを２０ μＬ採取した。サンプリングは薬液添加後２時間まで行った。得られたサンプルは、測定するまで－３０℃で凍結保存した。ウッシングタイプチャンバー法の模式図を
図１７のＡに示す。図１７中のＮＡＦ（核酸画分）は、高濃度・高分子ＤＮＡ－Ｎａを加水分解することでモノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド及びテトラヌクレオチドを多く含むように作製したサンプルである。図１７のＢはＮＡＦ中の核酸（デオキシリボヌクレオチド）の分子量分布をフォトダイオードアレイ検出器（測定波長：２５０－２７０ ｎｍ）により検出したグラフである。
＜ウッシングタイプチャンバー法による小腸膜透過試験＞
試験に用いた動物は８週齢の雄性ＩＣＲマウスである。試験に用いた腸は、１８時間絶食後のマウスをイソフルランガス麻酔で仰向けに固定し、マウスの小腸上部の腸管を採取した。取り出した腸管は腸軸に沿って切り開き、氷冷した生理食塩水で内容物を洗った後にピンセットを使用し筋層を剥いだ。小腸の組織切片は直ちに有効表面積０．２５ ｃｍ２のウッシングタイプチャンバーに装着した。試験は、ｐＨ６．０に調整した試薬を添加側に２ ｍＬ添加し、ｐＨ７．４に調整した輸送バッファーを透過側に２ ｍＬ添加することで開始した。評価は添加側から透過側への膜透過する物質を測定することで行った。筋層剥離後の膜の完全性は、パラセルラーマーカーとして平均分子量４０００のＦＩＴＣ－デキストラン（ＦＤ－４）を用いることで確認した。実験は３７℃で行い、常に９５％Ｏ２／５％ＣＯ２ガスを両溶液中に通気させた。サンプリングは所定の時間に透過側のバッファーを２００ μＬ採取し、当量のバッファーを補充することでチャンバー内のバッファー量が変化しないようにした。また、添加側のサンプリングは所定の時間にバッファーを２０ μＬ採取した。サンプリングは薬液添加後２時間まで行った。得られたサンプルは、測定するまで－３０℃で凍結保存した。ウッシングタイプチャンバー法の模式図を
図１７のＡに示す。図１７中のＮＡＦ（核酸画分）は、高濃度・高分子ＤＮＡ－Ｎａを加水分解することでモノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド及びテトラヌクレオチドを多く含むように作製したサンプルである。図１７のＢはＮＡＦ中の核酸（デオキシリボヌクレオチド）の分子量分布をフォトダイオードアレイ検出器（測定波長：２５０－２７０ ｎｍ）により検出したグラフである。
【0040】
試薬等は以下の組成で準備した。
＜輸送バッファー＞
ＮａＣｌ ７．４８０ ｇ／Ｌ （１２８ ｍＭ）
ＫＣｌ ０．３８０ ｇ／Ｌ （５．１ ｍＭ）
Ｄ（＋）－グルコース ０．９０１ ｇ／Ｌ （５．０ ｍＭ）
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．２０６ ｇ／Ｌ （１．４ ｍＭ）
ＫＨ２ＰＯ４ ０．１７７ ｇ／Ｌ （１．３ ｍＭ）
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．３２０ ｇ／Ｌ （１．３ ｍＭ）
ＮａＨＣＯ３ １．７６４ ｇ／Ｌ （２１ ｍＭ）
ＮａＨ２ＰＯ４ １．１２０ ｇ／Ｌ （１０ ｍＭ）
ｐＨ６．０は５ Ｎ ＨＣｌを用いて調製し、ｐＨ７．４は５Ｎ ＮａＯＨを用いて調製した。ｐＨ調製前、調製時は９５％Ｏ２／５％ＣＯ２ガスを用いてバブリングを行った。
＜ＮＡＦ ８ ｍｇ／ｍＬ＞
試薬は、ＦＤ－４を１００ μＭになるようにｐＨ６．０の輸送バッファーで溶解し、核酸画分試料（ＮＡＦ）の濃度を８ ｍｇ／ｍＬになるように輸送バッファーで希釈した。
＜輸送バッファー＞
ＮａＣｌ ７．４８０ ｇ／Ｌ （１２８ ｍＭ）
ＫＣｌ ０．３８０ ｇ／Ｌ （５．１ ｍＭ）
Ｄ（＋）－グルコース ０．９０１ ｇ／Ｌ （５．０ ｍＭ）
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．２０６ ｇ／Ｌ （１．４ ｍＭ）
ＫＨ２ＰＯ４ ０．１７７ ｇ／Ｌ （１．３ ｍＭ）
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．３２０ ｇ／Ｌ （１．３ ｍＭ）
ＮａＨＣＯ３ １．７６４ ｇ／Ｌ （２１ ｍＭ）
ＮａＨ２ＰＯ４ １．１２０ ｇ／Ｌ （１０ ｍＭ）
ｐＨ６．０は５ Ｎ ＨＣｌを用いて調製し、ｐＨ７．４は５Ｎ ＮａＯＨを用いて調製した。ｐＨ調製前、調製時は９５％Ｏ２／５％ＣＯ２ガスを用いてバブリングを行った。
＜ＮＡＦ ８ ｍｇ／ｍＬ＞
試薬は、ＦＤ－４を１００ μＭになるようにｐＨ６．０の輸送バッファーで溶解し、核酸画分試料（ＮＡＦ）の濃度を８ ｍｇ／ｍＬになるように輸送バッファーで希釈した。
【0041】
＜測定対象＞
測定対象は、透過側からサンプリングしたバッファーを１０ μＬ、 移動相Ｂ（１０
ｍＭ酢酸アンモニウム、９５％アセトニトリル／５％Ｈ２Ｏ）を９０ μＬ加えた後ボルテックスと遠心（２６，４１８ ×ｇ、４℃、１０分）を２度行い、上清を回収した。一方の測定対象は、添加側からサンプリングしたバッファーを１００倍希釈し、希釈液１０ μＬと移動相９０ｕＬを加え、ボルテックスと遠心（２６，４１８ ×ｇ、４℃、１０分）を２度行い、上清を回収した。
測定対象は、透過側からサンプリングしたバッファーを１０ μＬ、 移動相Ｂ（１０
ｍＭ酢酸アンモニウム、９５％アセトニトリル／５％Ｈ２Ｏ）を９０ μＬ加えた後ボルテックスと遠心（２６，４１８ ×ｇ、４℃、１０分）を２度行い、上清を回収した。一方の測定対象は、添加側からサンプリングしたバッファーを１００倍希釈し、希釈液１０ μＬと移動相９０ｕＬを加え、ボルテックスと遠心（２６，４１８ ×ｇ、４℃、１０分）を２度行い、上清を回収した。
【0042】
＜ダイオードアレイ検出器による測定＞
測定は、サンプル調製後、カラムとしてアドバンスバイオＳＥＣ（３００Ａ ２．７μｍ ４．６×１５０ｍｍ）を用いて分離した後、フォトダイオードアレイ検出器を用いた。移動相は、（Ａ）１０ ｍＭ 酢酸アンモニウム、（Ｈ２Ｏ）と（Ｂ）１０ｍＭ酢酸アンモニウム、（９５％アセトニトリル／５％Ｈ２Ｏ）を用いた。測定時の条件は、注入量を３ μＬとし、流速を０．２ ｍＬ／ｍｉｎとして、移動相の割合は８０％Ａ／２０％Ｂで１５分とし、フォトダイオードアレイ検出器を用いて測定波長を２５０－２７０ ｎｍとした。
＜飛行時間型質量分析法による測定＞
測定は、サンプル調製後、カラムとしてショウデックス親水性相互作用クロマトグラフィ用カラムＶＮ－５０ ２Ｄ （２．０ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ）を用いて分離した。移動相は、（Ａ）５０ ｍＭ ギ酸アンモニウム（９５％アセトニトリル／５％Ｈ２Ｏ）と（Ｂ）１０ｍＭ ギ酸アンモニウム（９５％アセトニトリル／５％Ｈ２Ｏ）を用いた。測定時の条件は、流速を０．３ ｍＬ／ｍｉｎとして、飛行時間型質量分析法で測定した。
測定は、サンプル調製後、カラムとしてアドバンスバイオＳＥＣ（３００Ａ ２．７μｍ ４．６×１５０ｍｍ）を用いて分離した後、フォトダイオードアレイ検出器を用いた。移動相は、（Ａ）１０ ｍＭ 酢酸アンモニウム、（Ｈ２Ｏ）と（Ｂ）１０ｍＭ酢酸アンモニウム、（９５％アセトニトリル／５％Ｈ２Ｏ）を用いた。測定時の条件は、注入量を３ μＬとし、流速を０．２ ｍＬ／ｍｉｎとして、移動相の割合は８０％Ａ／２０％Ｂで１５分とし、フォトダイオードアレイ検出器を用いて測定波長を２５０－２７０ ｎｍとした。
＜飛行時間型質量分析法による測定＞
測定は、サンプル調製後、カラムとしてショウデックス親水性相互作用クロマトグラフィ用カラムＶＮ－５０ ２Ｄ （２．０ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ）を用いて分離した。移動相は、（Ａ）５０ ｍＭ ギ酸アンモニウム（９５％アセトニトリル／５％Ｈ２Ｏ）と（Ｂ）１０ｍＭ ギ酸アンモニウム（９５％アセトニトリル／５％Ｈ２Ｏ）を用いた。測定時の条件は、流速を０．３ ｍＬ／ｍｉｎとして、飛行時間型質量分析法で測定した。
【0043】
＜ダイオードアレイ検出器による測定結果＞
図１８はウッシングタイプチャンバー法による添加側へＮＡＦ添加した際の小腸膜透過
試験結果である。図１８のＡは添加側の０分経過時の培地、図１８のＢは添加側の１２０分経過時の培地、図１８のＣは透過側の０分経過時の培地、及び図１８のＤは透過側の１２０分経過時の培地中の核酸（デオキシリボヌクレオチド）の分子量分布を示す。通説では、核酸はモノヌクレオチドまで分解されないと腸管で吸収されないとされているが、図１８に示した結果は、ウッシングタイプチャンバー法による小腸膜透過試験により、モノヌクレオチドだけでなく、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド及びテトラヌクレオチドも小腸膜を透過することを示した。
＜飛行時間型質量分析法による測定結果＞
図１９はウッシングタイプチャンバー法による添加側へＮＡＦ添加した際の小腸膜透過試験の飛行時間型質量分析法の測定結果である。図１９のＡはブランクのサンプル、図１９のＢはＣＣＣ標品のサンプル、図１９のＣは添加側の０分経過時の培地、図１９のＤは添加側の１２０分経過時の培地、図１９のＥは透過側の０分経過時の培地、及び図１９のＦは透過側の１２０分経過時の培地中に含まれるトリヌクレオチドＣＣＣを測定した結果を示す。図１９に示した結果は、ウッシングタイプチャンバー法による小腸膜透過試験によりトリヌクレオチドＣＣＣが小腸膜を透過することを示した。
図１８はウッシングタイプチャンバー法による添加側へＮＡＦ添加した際の小腸膜透過
試験結果である。図１８のＡは添加側の０分経過時の培地、図１８のＢは添加側の１２０分経過時の培地、図１８のＣは透過側の０分経過時の培地、及び図１８のＤは透過側の１２０分経過時の培地中の核酸（デオキシリボヌクレオチド）の分子量分布を示す。通説では、核酸はモノヌクレオチドまで分解されないと腸管で吸収されないとされているが、図１８に示した結果は、ウッシングタイプチャンバー法による小腸膜透過試験により、モノヌクレオチドだけでなく、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド及びテトラヌクレオチドも小腸膜を透過することを示した。
＜飛行時間型質量分析法による測定結果＞
図１９はウッシングタイプチャンバー法による添加側へＮＡＦ添加した際の小腸膜透過試験の飛行時間型質量分析法の測定結果である。図１９のＡはブランクのサンプル、図１９のＢはＣＣＣ標品のサンプル、図１９のＣは添加側の０分経過時の培地、図１９のＤは添加側の１２０分経過時の培地、図１９のＥは透過側の０分経過時の培地、及び図１９のＦは透過側の１２０分経過時の培地中に含まれるトリヌクレオチドＣＣＣを測定した結果を示す。図１９に示した結果は、ウッシングタイプチャンバー法による小腸膜透過試験によりトリヌクレオチドＣＣＣが小腸膜を透過することを示した。
【産業上の利用可能性】
【0044】
本発明によれば、トリヌクレオチドＣＣＣを神経幹細胞の増殖促進剤の機能成分として神経幹細胞の増殖及び神経新生を促進することが可能となる。さらにトリヌクレオチドＣＣＣ、オリゴヌクレオチドＣ６又はオリゴヌクレオチドＣ１２を含む健康食品を提供することが可能となる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
