特許 7554838 ＣＳＦ－１Ｒキナーゼ阻害剤の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-11

(45)【発行日】2024-09-20

(54)【発明の名称】ＣＳＦ－１Ｒキナーゼ阻害剤の使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/496 20060101AFI20240912BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240912BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240912BHJP

【ＦＩ】

A61K31/496

A61P43/00 111

A61P35/00

A61P37/02

A61P29/00

A61P35/02

A61P43/00 121

A61K39/395 T

A61K39/395 N

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2022552235

(86)(22)【出願日】2021-02-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-13

(86)【国際出願番号】 CN2021078098

(87)【国際公開番号】W WO2021170078

(87)【国際公開日】2021-09-02

【審査請求日】2022-11-04

(31)【優先権主張番号】202010128115.4

(32)【優先日】2020-02-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】522341377

【氏名又は名称】上▲海▼▲潤▼石医▲薬▼科技有限公司

(73)【特許権者】

【識別番号】522116605

【氏名又は名称】中国科学院上▲海▼▲薬▼物研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】▲張▼ ▲アオ▼

(72)【発明者】

【氏名】耿 美玉

(72)【発明者】

【氏名】艾 ▲菁▼

(72)【発明者】

【氏名】王 彩霞

(72)【発明者】

【氏名】彭 霞

(72)【発明者】

【氏名】▲張▼ ▲陽▼

(72)【発明者】

【氏名】丁 健

【審査官】三上 晶子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１９－５１２０１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】Manman WEI et al.，“Design, synthesis and biological evaluation of a series of novel 2-benzamide-4-(6-oxy-N-methyl-1-naphthamide)-pyridine derivatives as potent fibroblast growth factor receptor (FGFR) inhibitors”，European Journal of Medicinal Chemistry，2018年06月，Vol. 154，p.9-28，DOI: 10.1016/j.ejmech.2018.05.005

【文献】Xi-fei JIANG et al.，“SOMCL-085, a novel multi-targeted FGFR inhibitor, displays potent anticancer activity in FGFR-addicted human cancer models”，Acta Pharmacologica Sinica，2017年09月14日，Vol. 39, No. 2，p.243-250，DOI: 10.1038/aps.2017.96

【文献】Sangeetha PALAKURTHI et al.，“The Combined Effect of FGFR Inhibition and PD-1 Blockade Promotes Tumor-Intrinsic Induction of Antitumor Immunity”，Cancer Immunology Research，2019年09月01日，Vol. 7, No. 9，p.1457-1471，DOI: 10.1158/2326-6066.CIR-18-0595

【文献】がん情報サイト「オンコロ」「免疫チェックポイント阻害薬」[online]，2020年02月12日，検索日：2024年2月28日、インターネット<URL:https://oncolo.jp/dictionary/immunecheckpintinhibitor>

【文献】Xia PENG et al.，“Preclinical evaluation of 3D185, a novel potent inhibitor of FGFR1/2/3 and CSF-1R, in FGFR-dependent and macrophage-dominant cancer models”，Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research，2019年08月22日，Vol. 38, No. 1，DOI: 10.1186/s13046-019-1357-y

【文献】Jinho KANG et al.，“A Selective FGFR inhibitor AZD4547 suppresses RANKL/M-CSF/OPG-dependent ostoclastogenesis and breast cancer growth in the metastatic bone microenvironment”，Scientific Reports，2019年06月19日，Vol. 9, No. 1，DOI: 10.1038/s41598-019-45278-w

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／３３－３３／４４

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＳＦ－１Ｒキナーゼシグナル伝達経路に関連する疾患の治療のために使用される、式（Ｉ）：

【化1】

の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物であって、
前記ＣＳＦ－１Ｒキナーゼシグナル伝達経路に関連する疾患は、ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ依存性の癌または腫瘍、ＴＡＭｓ富化腫瘍、過形成、免疫疾患、および炎症性疾患からなる群から選ばれ、
前記ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ依存性の癌または腫瘍は、ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ依存性の白血病および腱滑膜巨細胞腫からなる群から選ばれ、
ならびに前記ＴＡＭｓ富化腫瘍は、ＴＡＭｓ富化結腸直腸癌である、
医薬組成物。

【請求項2】

免疫調節のために使用される、式（Ｉ）：

【化2】

の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物。

【請求項3】

請求項２に記載の医薬組成物であって、
前記免疫調節は、免疫増強であり、あるいは
前記免疫調節は、腫瘍免疫抑制状態の改善となる免疫増強であり、あるいは
前記免疫調節は、Ｍ２型偏りのマクロファージの生存を阻害すること、マクロファージのＭ２偏りの極性化表現型、およびマクロファージのＭ２偏りの極性化表現型がＣＤ８^＋Ｔ細胞に及ぼす抑制効果を逆転させること、生体免疫抑制性微小環境を再構築することである腫瘍免疫抑制状態の改善となる免疫増強である、
医薬組成物。

【請求項4】

免疫チェックポイント薬剤との組み合わせにおける腫瘍の治療または阻害のために使用される、式（Ｉ）：

【化3】

の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物であって、
前記免疫チェックポイント薬剤は、ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体、またはａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体である、
医薬組成物。

【請求項5】

請求項４に記載の医薬組成物であって、
前記腫瘍は、前記免疫チェックポイント薬剤に対する感受性の低い腫瘍である、
医薬組成物。

【請求項6】

請求項４または５に記載の医薬組成物であって、
前記腫瘍は結腸癌または結腸直腸癌である、
医薬組成物。

【請求項7】

請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、経口投与、腫瘍内投与、直腸投与、非経口投与または局所投与のために製剤される、
医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

〔関連出願の相互参照〕
本出願は、２０２０年０２月２８日に中国国家知識産権局に提出された出願番号が２０２０１０１２８１１５．４で、発明名称が「ＣＳＦ－１Ｒキナーゼ阻害剤の使用」である先行発明特許出願の優先権を請求する。この先願の全文は援用により本願に完全に組み込まれている。

【0002】

本発明は、医薬分野に属し、具体的には、ＣＳＦ－１Ｒキナーゼ阻害剤の、ＣＳＦ－１Ｒキナーゼシグナル伝達経路に関連する疾患の治療または腫瘍免疫抑制状態の改善のための医薬の製造における使用に関する。

【背景技術】

【0003】

機能全体、分割不可能な腫瘍微小環境としては、腫瘍進行に重要な役割を果たしている。微小環境中の多数の間質細胞、例えば腫瘍関連マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、線維芽細胞、殺傷性Ｔ細胞（キラーＴ細胞）など、腫瘍細胞と相互作用することにより腫瘍の進行を促進する。

【0004】

ここで、腫瘍関連マクロファージ、（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ:ＴＡＭｓ）は、重要な微小環境間質細胞であり、一部の腫瘍組織中のマクロファージの割合は５０％に達することができ、通常ＴＡＭｓは腫瘍中の大量浸潤は腫瘍患者の予後不良の重要な指標と考えられている。ＴＡＭｓはエフェクターＴ細胞の殺傷効果を直接阻害し、協調的に腫瘍免疫抑制性微小環境を促進するだけでなく、腫瘍内血管形成を促進することによって、多環節的に腫瘍細胞の増殖と転移を促進する。ＴＡＭｓに腫瘍抑制効果を有するのはＭ１型偏りのマクロファージであり、Ｍ２型偏りのマクロファージは腫瘍促進効果を有すると、一般的に考えられている。コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ－１Ｒ）はマクロファージに発現し、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭｓ）のＭ２極性化表現型（Ｍ２ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）への分化、ＴＡＭの維持、生存、増殖に重要である。このため、ＣＳＦ－１Ｒ軸線を標的とし、ＴＡＭのＭ２偏りの腫瘍促進表現型を阻害し、生体免疫抑制性微小環境を再構築し、殺傷性Ｔ細胞を有効に活性化することは、すでに重要な抗腫瘍標的化戦略となり、膵臓癌、肺癌、結腸癌、乳癌などの様々な難治性や多発性腫瘍タイプへの応用に重要なポテンシャルを持っている。

【0005】

日本製薬企業第一三共株式会社が開発した最初のＣＳＦ－１Ｒ標的治療薬であるペキシダルチニブ（Ｐｅｘｉｄａｒｔｉｎｉｂ、ＰＬＸ３３９７、商品名：ＴＵＲＡＬＩＯ）は、２０１９年８月３日に米国で発売され、成人患者の稀少疾患である腱滑膜巨細胞腫（ＴＧＣＴ）の治療に承認された。しかし、当該医薬は毒性副作用が比較的大きく、医薬ラベルの中に黒い枠付き警告が添付されており、この医薬は深刻で潜在的な致命的肝障害のリスクがあることを示している。見られるように、多発性固形腫瘍を治療するための安全で有効なＣＳＦ－１Ｒ標的の薬剤の開発にはまだ成功していない。そのため、臨床ニーズを満たすための更なる研究が必要である。

【0006】

ＷＯ２０１７１４０２６９Ａ１には、式（Ａ）の化合物、特に式（Ｉ）で表される構造を有する化合物が開示されている。

【化1】

【0007】

これらの化合物は優れた活性を有するＦＧＦＲ阻害剤であり、腫瘍細胞増殖を直接抑制することができる。本出願の発明者は研究開発の過程において、化合物ＩはＣＳＦ－１Ｒキナーゼの強力な阻害剤でもあり、腫瘍関連マクロファージがＭ２偏りの腫瘍促進表現型を抑制でき、活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化し、腫瘍免疫抑制性微小環境に拮抗し、免疫チェックポイント薬剤の抗腫瘍薬効を増強し、複数のマウス由来細胞の皮下移植腫瘍モデルと遺伝子組換えモデルに顕著な薬効を示すことを驚くべきことに発見した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】ＷＯ２０１７１４０２６９Ａ１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

ＣＴＬＡ－４抗体、ａｎｔｉ－ＰＤ－１／ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体をはじめとする免疫チェックポイント薬剤は、過去１０年間の癌治療において最も重要な進展であり、このような免疫療法は抗腫瘍免疫力を修復させ、免疫脱出を逆転させ、腫瘍細胞死を促進し、その適応症は拡大しつつあり、従来の多くの標準治療法を再構築してきた。しかし、免疫系が過度に活性化される可能性があり、免疫関連の有害事象が増加していることは無視できない。報告によれば、抗ＣＴＬＡ－４抗体であるＹｅｒｖｏｙで治療した患者の６０％高くのが免疫関連の有害事象を経験することが報告されており、そのうちの１０～３０％が重症（３～４級）の免疫関連有害事象であって用量依存性であった。ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体で治療した患者の約１０％は、疲労、頭痛、関節痛、皮疹、かゆみ、肺炎、下痢および／又は大腸炎、肝炎および内分泌疾患を含む３級以上（≧３級）の免疫関連有害事象を経験した。抗ＣＴＬＡ－４抗体とａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体の併用投与は免疫関連の有害事象の発生率と重症度を増加させた。ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体Ｂａｖｅｎｃｉｏ治療を受けている患者の一部には、主に１～３級の重症度である輸液関連反応を経験した。通常、これらの副作用は用量と関連があり、用量を低下させると副作用を低減または軽減することができるが、同時に抗腫瘍効果の低下をもたらすことも多い。したがって、どのように免疫チェックポイント薬剤の抗腫瘍効果を増強するか、または低用量条件下で抗腫瘍作用を発揮させるかは解決すべき緊急の技術的課題である。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤医薬の製造における使用を提供する。

【化2】

【0011】

［式中、Ｘは、ＣＨおよびＮからなる群から選ばれ、
環Ａは置換もしくは非置換の６～１０員のアリール、および置換もしくは非置換の５～１２員のヘテロアリールからなる群から選ばれてもよく、ここで、前記の置換とは、基上の１つ以上の水素原子がＣ_１－Ｃ_８アルキル、Ｃ_１－Ｃ_８アルコキシル、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルアミノ、ハロゲン、およびハロＣ_１－Ｃ_８アルキルからなる群から選ばれる置換基で置換されていることを意味し、
Ｒ_１は－ＣＯＮＨＲ_３および－ＣＯＯＲ_３からなる群から選ばれ、
Ｒ_２は、置換もしくは非置換のＣ_１－Ｃ_８アルキル、置換もしくは非置換のＣ_１－Ｃ_８アルコキシル、置換もしくは非置換の４～１０員のヘテロシクロ基、置換もしくは非置換のアミノ基、置換もしくは非置換のＣ_１－Ｃ_８アルキルアミノ基、および－ＮＨＣＯＲ_３からなる群から選ばれ、ここで、前記の置換とは、基をさらにＣ_１－Ｃ_８アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシルＣ_１－Ｃ_８アルキル、－ＣＯＯＲ_３、アミノ置換Ｃ_３－Ｃ_１０シクロアルキル、非置換または1つ以上のハロゲン原子、およびヒドロキシルもしくはＣ_１－Ｃ_８アルキルで置換された４～１０員のヘテロシクロアルキルからなる群から選ばれる１つ以上の置換基で置換されていることを意味し、
Ｒ_３は、水素、Ｃ_１－Ｃ_８アルキル、およびＣ_２－Ｃ_１０アルケニルからなる群から選ばれる。］。

【0012】

一実施形態において、前記の式（Ａ）の化合物において、環Ａは、置換もしくは非置換の６～１０員のアリール、および置換もしくは非置換の５～１０員のヘテロアリールからなる群から選ばれる。

【0013】

一実施形態において、前記の式（Ａ）の化合物において、環Ａは、置換もしくは非置換の６～１０員のアリール、および置換もしくは非置換の５～６員のヘテロアリールからなる群から選ばれる。

【0014】

一実施形態において、前記の式（Ａ）の化合物において、環Ａは、置換もしくは非置換の基であるベンゼン環、ナフタリン環、ピリジン環、ピラジン環、チオフェン環、フラン環、イミダゾール環、ピロール環、オキサゾール環、チアゾール環、ピラゾール環、インドール環、ピリミジン環、ベンゾフラン環、ベンゾチアゾール環、ベンゾイミダゾール環、キノリン環、およびイソキノリン環からなる群から選ばれる。

【0015】

一実施形態において、前記の式（Ａ）の化合物において、環Ａは、置換もしくは非置換のベンゼン環、置換もしくは非置換チアゾール環、置換もしくは非置換のオキサゾール環、および置換もしくは非置換のピリミジン環からなる群から選ばれる。

【0016】

一実施形態において、前記の式（Ａ）の化合物において、Ｒ_２は、置換もしくは非置換のＣ_１－Ｃ_４アルキル、置換もしくは非置換のＣ_１－Ｃ_４アルコキシル、置換もしくは非置換の５～６員のヘテロシクロ基、置換もしくは非置換のアミノ基、置換もしくは非置換のＣ_１－Ｃ_４アルキルアミノ基、および－ＮＨＣＯＲ_３からなる群から選ばれ、ここで、前記の置換とは、基をさらに、Ｃ_１－Ｃ_８アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシルＣ_１－Ｃ_８アルキル、－ＣＯＯＲ_３、アミノ置換Ｃ_３－Ｃ_１０シクロアルキル、非置換または1つ以上のハロゲン原子、およびヒドロキシルもしくはＣ_１－Ｃ_８アルキルで置換された４～１０員のヘテロシクロアルキルからなる群から選ばれる１つ以上の置換基で置換されていることを指す。

【0017】

一実施形態において、前記の式（Ａ）の化合物において、Ｒ_３は、水素、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、およびＣ_２－Ｃ_６アルケニルからなる群から選ばれる。

【0018】

一実施形態において、前記の式（Ａ）の化合物において、Ｒ_３は、水素、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル、およびＣ_２－Ｃ_４アルケニルからなる群から選ばれる。

【0019】

一実施形態において、前記の式（Ａ）の化合物において、Ｒ_３は、水素、メチル、ビニルからなる群から選ばれる。

【0020】

一実施形態において、前記の式（Ａ）の化合物は、好ましくは、以下の式（Ｉ）で表される化合物（本明細書において化合物Ｉともいう）である。

【化3】

【0021】

本発明は、前記式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩の、ＣＳＦ－１Ｒキナーゼシグナル伝達経路に関連する疾患を治療する医薬の製造における使用を提供する。

【0022】

本発明に係るＣＳＦ－１Ｒキナーゼシグナル伝達経路に関連する疾患は、癌または腫瘍、過形成、免疫疾患、炎症などを含み、好ましくは、癌または腫瘍である。本発明に係る癌または腫瘍は、好ましくはＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ依存性の癌または腫瘍、ＴＡＭｓ富化腫瘍である。好ましくは、前記ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ依存性の癌または腫瘍は、ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ依存性の白血病、腱滑膜巨細胞腫などを含む。好ましくは、ＴＡＭｓ富化腫瘍は、結腸癌または結腸直腸癌を含むが、これらに限定されない。

【0023】

一態様によれば、本発明は、上記の式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩の、免疫調節剤（免疫調節用医薬）の製造における使用を提供し、前記免疫調節は、好ましくは免疫増強である。前記免疫増強は、例えば腫瘍免疫抑制状態の改善であってもよい。前記腫瘍免疫抑制状態の改善は、好ましくはＭ２型偏りのマクロファージの生存を阻害すること、マクロファージのＭ２型偏りの極性化表現型およびマクロファージのＭ２偏りの極性化表現型がＣＤ８^＋Ｔ細胞に及ぼす抑制効果を逆転させること、生体免疫抑制性微小環境を再構築することである。

【0024】

一態様によれば、本発明は、上記の式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩の、Ｍ２型偏りの極性化表現型マクロファージの増殖を抑制するための医薬の製造における使用を提供する。

【0025】

一態様によれば、本発明は、前記式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩の、腫瘍を治療または抑制するための医薬の製造における使用をさらに提供し、好ましくは、前記腫瘍は免疫チェックポイント薬剤に非感受性である。前記免疫チェックポイント薬剤は、好ましくは、ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体、ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体などであり、前記腫瘍は結腸癌および結腸直腸癌を含むが、これらに限定されない。

【0026】

一態様によれば、本発明は、前記式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩の、免疫チェックポイント薬剤の抗腫瘍効果を増強するための医薬の製造における使用をさらに提供する。ここで、前記免疫チェックポイント薬剤は、好ましくはａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体、またはａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体である。

【0027】

一態様によれば、本発明は、前記式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩および免疫チェックポイント薬剤の組み合わせの、抗腫瘍医薬の製造における使用をさらに提供する。ここで、前記免疫チェックポイント薬剤は、好ましくはａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体、またはａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体である。

【0028】

一態様によれば、本発明は、前記式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩の、免疫チェックポイント薬剤との組み合わせの抗腫瘍医薬の製造における使用をさらに提供する。ここで、前記免疫チェックポイント薬剤は、好ましくはａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体、またはａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体である。

【0029】

さらに、上記の使用において、前記医薬には、治療有効量の式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩、および任意に選択的な薬学的に許容される賦形剤または担体を含む。

【0030】

本発明に係る医薬の投与方式は特に限定されず、代表的な投与方式としては、経口投与、腫瘍内投与、直腸投与、非経口投与（静脈内投与、筋肉内投与または皮下投与）および局所投与などが挙げられるが、これらに限定されない。それに応じて、本発明に係る医薬は、経口投与剤形、注射剤形、局所投与剤形または外用剤形などを含む臨床的に許容される各種の剤形に製剤化することができる。

【0031】

好ましくは、本発明に係る式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩は、臨床的に単独で使用してもよく、他の治療成分と組み合わせて使用してもよい。前記他の治療成分は、抗腫瘍医薬または免疫調節剤から選ばれ、例えば、ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体、ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体などを含む免疫チェックポイント薬剤と組み合わせて使用してもよい。臨床上の使用の便宜上、本発明に係る化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩は、他の治療成分と組み合わせて複合医薬を製造することができる。前記の他の治療成分は、好ましくは抗腫瘍医薬または免疫調節剤であり、例えば免疫チェックポイント薬剤であり、前記免疫チェックポイント薬剤は、好ましくはａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体、またはａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体などである。

【0032】

本発明は、前記式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩および免疫チェックポイント薬剤を含む医薬組成物さらに提供する。前記免疫チェックポイント薬剤は、好ましくは、ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体、ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体などである。

【0033】

本発明は、治療有効量の本発明に係る化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩を、治療を必要とする哺乳類（例えば、ヒト）に投与することを含む前記医薬の使用方法をさらに提供する。

【0034】

本発明は、治療有効量の本発明に係る式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩を、前記疾患の治療を必要とする哺乳類（例えば、ヒト）に投与するステップを含むＣＳＦ－１Ｒキナーゼシグナル伝達経路に関連する疾患の治療方法を提供する。本発明に係るＣＳＦ－１Ｒキナーゼシグナル伝達経路に関連する疾患は、癌または腫瘍、過形成、免疫疾患、炎症などを含み、好ましくは、癌または腫瘍である。上記の癌または腫瘍は、好ましくはＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ依存性の癌または腫瘍、ＴＡＭｓ富化腫瘍である。前記ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ依存性の癌または腫瘍は、ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ依存性の白血病、腱滑膜巨細胞腫などを含む。ＴＡＭｓ富化腫瘍は、結腸癌または結腸直腸癌を含むが、これらに限定されない。

【0035】

本発明は、治療有効量の本発明に係る式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩を、免疫調節を必要とする哺乳類（例えば、ヒト）に投与するステップを含む免疫調節の方法をさらに提供する。前記免疫調節は、好ましくは免疫増強であり、前記免疫増強は、例えば腫瘍免疫抑制状態の改善であってもよい。前記腫瘍免疫抑制状態の改善は、好ましくはＭ２型偏りのマクロファージの生存を阻害すること、マクロファージのＭ２型偏りの極性化表現型、およびマクロファージのＭ２偏りの極性化表現型がＣＤ８^＋Ｔ細胞に及ぼす抑制効果を逆転させること、生体免疫抑制性微小環境を再構築することである。

【0036】

本発明は、治療有効量の本発明に係る式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩を、腫瘍の治療または抑制を必要とする哺乳類（例えば、ヒト）に投与するステップを含む腫瘍の治療または抑制方法をさらに提供し、好ましくは、前記腫瘍は免疫チェックポイント薬剤に非感受性である。前記免疫チェックポイント薬剤は、好ましくは、ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体、ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体などであり、前記腫瘍は結腸癌および結腸直腸癌を含むが、これらに限定されない。

【0037】

本発明は、本発明に係る式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩と、免疫チェックポイント薬剤との組み合わせを、腫瘍の治療または抑制を必要とする哺乳類（例えば、ヒト）に投与するステップを含む免疫チェックポイント薬剤の抗腫瘍薬効の増強方法をさらに提供する。前記免疫チェックポイント薬剤は、好ましくは、ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体、ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体などである。

【0038】

本発明は、治療有効量の本発明に係る式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩と、免疫チェックポイント薬剤との組み合わせを、腫瘍の治療または抑制を必要とする哺乳類（例えば、ヒト）に投与するステップを含む腫瘍の治療または抑制方法さらに提供する。前記免疫チェックポイント薬剤は、好ましくは、ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体、ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体などであり、前記腫瘍は結腸癌および結腸直腸癌を含むが、これらに限定されない。

【0039】

本明細書に記載の「治療有効量」とは、薬学的に有効な投与用量、すなわち重篤な副作用を起こさずに症状を有意に改善するのに活性化合物（すなわち式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩）の十分な量を指す。体重６０ｋｇのヒトに対しては、式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩の1日投与量は、通常０．０１～２,０００ｍｇであり、好ましくは０．５～５００ｍｇ、または１～５００ｍｇであり、または０．５～２５０ｍｇ、または０．５～２００ｍｇ、または０．５～１５０ｍｇ、または０．５～１００ｍｇ、または０．５～５０ｍｇ、または０．５～４０ｍｇ、または０．５～３０ｍｇであり、最も好ましくは０．５～２５ｍｇである。例示的な有効投与量は、例えば、０．５ｍｇ、０．７５ｍｇ、０．８７ｍｇ、１ｍｇ、１．２５ｍｇ、１．５ｍｇ、１．７５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、２．７５ｍｇ、３ｍｇ、３．２５ｍｇ、３．５ｍｇ、３．７５ｍｇ、４ｍｇ、４．２５ｍｇ、４．５ｍｇ、４．７５ｍｇ、５ｍｇ、５．２５ｍｇ、５．５ｍｇ、５．７５ｍｇ、６ｍｇ、６．２５ｍｇ、６．５ｍｇ、６．７５ｍｇ、７ｍｇ、７．２５ｍｇ、７．５ｍｇ、７．７５ｍｇ、７．８７ｍｇ、８ｍｇ、８．２５ｍｇ、８．５ｍｇ、８．７５ｍｇ、９ｍｇ、９．２５ｍｇ、９．５ｍｇ、９．７５ｍｇ、１０ｍｇ、１０．５ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、２２ｍｇ、２５ｍｇが挙げられる。好ましくは、上記の１日投与量は、一般式（Ａ）の化合物、特に、化合物Ｉに基づく量である。一日一回の単回投与し、１日に複数回投与し、間隔をおいて投与することができる。ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体、ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体の投与用量は、具体的な抗体の種類、癌の種類、および癌の進行段階などの状況に依存する。各投与用量は、０．５ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１～２０ｍｇ／ｋｇとすることができる。例えば、体重６０ｋｇのヒトに対しては、各投与用量は、通常１ｍｇ～１８００ｍｇ、例えば、５０ｍｇ～１２００ｍｇ、または１００ｍｇ～９００ｍｇ、１５０ｍｇ～６００ｍｇ、または２００ｍｇ～５００ｍｇとすることができる。各投与の例示的な用量は、例えば、６０ｍｇ、１００ｍｇ、１２０ｍｇ、１５０ｍｇ、１８０ｍｇ、２１０ｍｇ、２４０ｍｇ、２７０ｍｇ、３００ｍｇ、３３０ｍｇ、３６０ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、９００ｍｇ、１２００ｍｇなどである。間隔投与において、投与頻度は、例えば、３～７日に１回投与、または１～６週間に１回投与、例えば、３日に１回投与、５日に１回投与、１週間に１回投与、１０日に１回投与、２週間に１回投与、３週間に１回投与、４週間に１回投与、６週間に１回投与などをした。具体的な投与用量および投与頻度は、投与経路や患者の健康状態などの要因を考慮に入れるべきであり、これらのすべては、従来のスキルに従って熟練した医師によって決定することができる。前記投与方式は特に限定されず、代表的な投与方式としては、経口投与、腫瘍内投与、直腸投与、非経口投与（静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与）、および局所投与が挙げられるが、これらに限定されない。

【0040】

本発明は、前記式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤として使用するための化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩をさらに提供する。

【0041】

本発明は、癌または腫瘍、過形成、免疫疾患、炎症などを含む、好ましくは癌または腫瘍を含むＣＳＦ－１Ｒキナーゼシグナル伝達経路に関連する疾患を治療するための前記式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩をさらに提供する。本発明に係る癌または腫瘍は、好ましくはＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ依存性の癌または腫瘍、ＴＡＭｓ富化腫瘍である。好ましくは、前記ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ依存性の癌または腫瘍は、ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ依存性の白血病、腱滑膜巨細胞腫などを含む。好ましくは、ＴＡＭｓ富化腫瘍は、結腸癌または結腸直腸癌を含むが、これらに限定されない。

【0042】

本発明は、生体の免疫調節に使用するための前記式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩をさらに提供する。前記生体の免疫調節は、好ましくは、免疫増強である。前記免疫増強は、例えば腫瘍免疫抑制状態の改善であってもよい。前記腫瘍免疫抑制状態の改善は、好ましくは、Ｍ２型偏りのマクロファージの生存を阻害すること、マクロファージのＭ２型偏りの極性化表現型、およびマクロファージのＭ２偏りの極性化表現型がＣＤ８^＋Ｔ細胞に及ぼす抑制効果を逆転させること、生体免疫抑制性微小環境を再構築することである。

【0043】

本発明は、Ｍ２型偏りの極性化表現型マクロファージの増殖を阻害するための前記式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩をさらに提供する。

【0044】

本発明は、腫瘍を治療または阻害するための前記式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩をさらに提供する。好ましくは、前記腫瘍は免疫チェックポイント薬剤に非感受性である。前記免疫チェックポイント薬剤は、好ましくは、ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体、ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体などであり、前記腫瘍は結腸癌および結腸直腸癌を含むが、これらに限定されない。

【0045】

本発明は、免疫チェックポイント薬剤の抗腫瘍薬効を増強するための前記式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩をさらに提供する。そのうち前記免疫チェックポイント薬剤は、好ましくはａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体、またはａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体である。

【0046】

本発明は、哺乳類（例えば、ヒト）における腫瘍を治療または阻害するための、免疫チェックポイント薬剤と組み合わせて使用される前記式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩をさらに提供する。前記免疫チェックポイント薬剤は、好ましくは、ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体、ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体などである。

【0047】

一態様によれば、本発明は、哺乳類（例えば、ヒト）における腫瘍を治療または阻害するための前記式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩および免疫チェックポイント薬剤を含む医薬組成物をさらに提供する。前記免疫チェックポイント薬剤は、好ましくはａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体、またはａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体である。

【0048】

本明細書に記載のＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ依存性の癌または腫瘍とは、ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒの高発現または高活性化の癌または腫瘍を指す。前記ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒの高発現または高活性化は、当業者が当該技術分野の通常の測定方法（酵素免疫、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、組織チップ、遺伝子検出などの方法を含むが、これらに限定されない）を用いて癌または腫瘍の組織および／または細胞におけるＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒの発現レベルまたは活性化レベルを検出し、その発現レベルまたは活性化レベルは正常レベルの１３０％以上、より好ましくは１５０％以上、好ましくは１７５％以上、さらに好ましくは２００％以上、特に好ましくは２５０％以上、最も好ましくは３００％以上である。前記正常レベルは、正常集団に相応する組織および／または細胞におけるＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒの発現レベルまたは活性化レベルであってもよく、同じ患者の癌周組織および／または細胞におけるＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒの発現レベルまたは活性化レベルであってもよい。

【0049】

本明細書に記載のＴＡＭｓ富化腫瘍とは、腫瘍組織においてＴＡＭｓ浸潤が豊富である腫瘍を指し、当業者が当該技術分野の通常の測定方法（酵素免疫、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、組織チップ、遺伝子検出などの方法を含むが、これらに限定されない）を用いてＴＡＭｓの表面マーカーを検出しまたはＴＡＭｓ計数を行い、腫瘍組織におけるＴＡＭｓの表面マーカーの発現レベルと癌周組織における対応の表面マーカーの発現レベルとが異なるか、または腫瘍組織におけるＴＡＭｓ計数は、癌周組織におけるＴＡＭの発現レベルの１３０％以上、好ましくは１５０％以上、より好ましくは１７５％以上、さらに好ましくは２００％以上、特に好ましくは２５０％以上、最も好ましくは３００％以上である。ＴＡＭｓ浸潤が豊富であると認定することができ、前記腫瘍はＴＡＭｓ富化腫瘍と認定することができる。前記ＴＡＭｓの表面マーカーには、一般的なＴＡＭｓ表面マーカー、腫瘍促進マクロファージの表面マーカー、腫瘍抑制マクロファージの表面マーカーを含むが、これらに限定されない。前記一般的なＴＡＭｓ表面マーカーは、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ６８および／またはＣＤ１１ｂなどを含むが、これらに限定されなく、好ましくはＣＤ６８および／またはＣＤ１１ｂである。前記腫瘍促進マクロファージの表面マーカーは、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ１、ＣＤ１１５、ＣＤ２０６、ＰＰＡＲＧ、ＡＲＧ１、ＣＤ１６３、ＣＤ３０１、Ｄｅｃｔｉｎ－１、ＰＤＬ２、Ｆｉｚｚ１、ＣＤ２０４、ＰＤ－Ｌ１、Ａｒｇｉｎａｓｅ－Ｉ、ＹＭ１、ＭＧＬ２、Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ＭＭＰｓ、またはＣＣＲ２などを含むがこれらに限定されなく、好ましくはＣＤ２０６である。前記腫瘍抑制マクロファージの表面マーカーは、ＩＬ１ａ、ＩＬ１ｂ、ＩＬ６、ＮＯＳ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＨＬＡ－ＤＲ（ＣＤ７４）またはＣＤ１６９などを含むがこれらに限定されなく、好ましくはＣＤ８６および／またはＭＨＣ－ＩＩである。前記表面マーカーの発現レベルが異なることは、以下のようなことを指す。前記表面マーカーが一般的なＴＡＭｓの表面マーカーである時に、腫瘍組織における前記の表面マーカーの発現レベルが癌周組織における対応の表面マーカーの発現レベルの１３０％以上、好ましくは１５０％以上、より好ましくは２００％以上であり、前記表面マーカーが腫瘍促進マクロファージの表面マーカー（例えば、ＣＤ２０６など）である時に、腫瘍組織における前記の表面マーカーの発現レベルは、癌周組織における対応の表面マーカーの発現レベルの１３０％以上、好ましくは１５０％以上、より好ましくは２００％以上である。好ましくは、前記表面マーカーは、腫瘍抑制マクロファージの表面マーカー（例えば、ＣＤ８６および／またはＭＨＣ－ＩＩなど）を含む時に、腫瘍組織における前記の腫瘍抑制マクロファージの表面マーカーの発現レベルは、癌周組織における対応の表面マーカーの発現レベルの８０％以下、好ましくは５０％以下である。

【0050】

本明細書の文脈において、前記腫瘍が免疫チェックポイント薬剤に非感受性であるということは、前記腫瘍が通常用量の免疫チェックポイント薬剤を用いて治療する時に腫瘍抑制率が５０％未満であることを指す。好ましくは、通常用量範囲の下限量の免疫チェックポイント薬剤を用いて治療する時に腫瘍抑制率が３０％未満、より好ましくは２０％未満、さらに好ましくは１０％未満である。本発明に係る実施形態において、前記腫瘍抑制率は、腫瘍増殖抑制率ＴＧＩ（％）で表し、計算式：ＴＧＩ（％）＝１００×｛１－［（Ｖ_{ＴｒｅａｔｅｄＦｉｎａｌｄａｙ}－Ｖ_{ＴｒｅａｔｅｄＤａｙ０}）／（Ｖ_{ＣｏｎｔｒｏｌＦｉｎａｌｄａｙ}－Ｖ_{ＣｏｎｔｒｏｌＤａｙ０}）］、そのうちＶは腫瘍体積であり、計算式：Ｖ＝１／２×ａ×ｂ^２、そのうちａ、ｂは、それぞれ腫瘍の長さと幅である。

【0051】

本明細書の文脈において、前記ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体には、例えば、ＣＤ２７９、ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ、ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ、Ｃａｍｒｅｉｚｕｍａｂ、ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂなどが挙げられる。前記ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体には、例えば、ＣＤ２７４、ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂなどが挙げられる。

【0052】

本発明に記載の数値または数値範囲は、当該技術分野に許容される範囲内で上下に変動させることができ、例えば、前記数値または数値範囲に基づく±１０％、または±９％、または±８％、または±７％、または±６％、または±５％、または±４％、または±３％、または±２％、または±１％である。

【0053】

本明細書に記載の式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特に化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩は、特に限定されず、好ましくは、無機酸塩、有機酸塩、アルキルスルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩を含む。前記無機酸塩には、塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩などを含む。前記有機酸塩には、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩などを含む。前記アルキルスルホン酸塩は、メタンスルホン酸塩、エチル基スルホン酸塩などを含む。前記アリールスルホン酸塩には、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩などを含む。

【0054】

本明細書の文脈において、用語「ヘテロ環基（複素環基）」は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選ばれる１、２、３、４または５個のヘテロ原子を有する環状基である。

【0055】

本明細書に係るアルキルは、脂肪族アルキルであることが好ましく、直鎖アルキル、分岐鎖状アルキル、スピロシクロアルキル、架橋シクロアルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アルコキシアルキル、アルコキシアシルアルキル、シクロアルキルアルキルであってもよく、非限定的にはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、（ｔｅｒｔ－ブチル）、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アリル、プロパルギル、シクロブテニル、シクロヘキセニルを含む。「Ｃ_１－Ｃ_８」というような用語は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個の炭素原子を有する対応の基を意図しており、例えば、「Ｃ_１－Ｃ_８アルキル」とは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個の炭素原子を有するアルキルを示し、「Ｃ_２－Ｃ_１０アルケニル」とは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子を有するアルケニルである。

【0056】

本明細書において、前記アルケニルは、ビニル、アクリル、ブテノイル、スチリル、フェニルプロペニル、または類似の基であることが好ましい。

【0057】

本明細書において、前記シクロアルキルは飽和または部分不飽和の単環または多環の環式炭化水素置換基であってもよく、そのうち、シクロアルキルは３～２０個の炭素原子を含み、好ましくは３～１２個の炭素原子を含み、さらに好ましくは３～１０個の炭素原子を含む。単環のシクロアルキルの非限定実施例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロオクチルなどが挙げられる。多環シクロアルキルは、スピロ環、縮合環および架橋環のシクロアルキルが挙げられる。

【0058】

前記ヘテロ環基とは、飽和または部分飽和の単環または多環の環式置換基を指し、そのうち４～１０員のヘテロシクロ基を含み、かつ前記のヘテロ環基は、そのうち１個以上のヘテロ原子（窒素、酸素、硫黄）を含有する飽和または不飽和の単環、二環、スピロ環、縮合環、架橋環などである。本明細書に記載のヘテロ環基は、モルホリン環、ピペリジン環、ピペラジン環、Ｎ－アルキルまたはアシル置換ピペラジン環、ホモピペリジン環、Ｎ－アルキルまたはアシル置換ホモピペリジン環、ピロール、テトラヒドロピロール、７Ｈ－プリンなどからなる群から選ばれる基を含むがこれらに限定されない。

【0059】

前記アリールとは、例えばフェニルおよびナフチルなどの共役π電子系を持つ、６～１０員の全炭素単環または縮合多環（すなわち、隣接する炭素原子対を共有する環）の基を指す。前記アリール環は、ヘテロ環基、ヘテロアリールまたはシクロアルキル環と縮合可能であり、非限定的な実施例には、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイソキサゾール、ベンゾピラゾール、キノリン、ベンゾインドール、ベンゾジヒドロフランを含む。

【0060】

前記ヘテロアリールとは、１～４個のヘテロ原子、５～１４個の環原子を含むヘテロ芳香族系であり、そのうちヘテロ原子には、酸素、硫黄および窒素を含む基を指す。ヘテロアリールとしては、例えば、フラニル、チエニル、ピリジニル、ピロリル、Ｎ－アルキルピロリル、ピリミジニル、ピラジニル、イミダゾリル、テトラゾリルなどの５員または６員の基であることが好ましい。前記ヘテロアリールとは、アリール、ヘテロ環基またはシクロアルキル環上に縮合可能であり、そのうち親構造と結合している環はヘテロアリール環である。

【0061】

特に断らない限り、本発明に記載の構造式は、すべての互変異性体、光学異性体および立体異性体形式（例えば、エナンチオマー、ジアステレオマー、幾何異性体または立体配座異性体）、例えば、不斉中心を有するＲ、Ｓ配置，二重結合の（Ｚ）、（Ｅ）異性体および（Ｚ）、（Ｅ）の配座異性体を含むことを指す。したがって、本発明に係る化合物の単一の立体化学的異性体、互変異性体またはエナンチオマー、ジアステレオマーまたは幾何異性体または配座異性体または互変異性体の混合物のいずれも、本発明に係る範囲に属する。

【0062】

用語「互変異性体」とは、異なるエネルギーをもつ構造異性体が低エネルギー障壁を超えて相互に相互変換できることを指す。例えば、プロトン互変異性体（すなわち、プロトン移動）には、例えば１Ｈ－インダゾールと２Ｈ－インダゾール、１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾールと３Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾールなどのプロトン移動による相互変換が含まれる。原子価（価電子）互変異性体は、いくつかの結合形成電子再結合による相互変換が含まれる。

【0063】

インビボ、インビトロの研究によれば、以下の効果が認められた。
（１）本発明の化合物Ｉは、インビトロでＣＳＦ－１Ｒキナーゼ活性を有意に阻害した。
（２）本発明に係る化合物Ｉは、ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ駆動のマウス骨髄性白血病細胞株の増殖を有意に阻害することができ、市販の医薬Ｐｅｘｉｄａｒｔｉｎｉｂよりも優れた効果を持ち、化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩は、ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ依存性疾患、例えば、ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ依存性の白血病、腱滑膜巨細胞腫などを治療するために使用できることが示唆された。
（３）本発明の化合物Ｉは、ＣＳＦ－１により誘導されたマクロファージの生存をインビトロで阻害し、マクロファージのＭ２偏りの極性化表現型を逆転させ、市販の医薬Ｐｅｘｉｄａｒｔｉｎｉｂよりも優れた効果を持つ。ＴＡＭｓ富化腫瘍モデル（ＭＣ３８モデル）において、化合物ＩはＭ２型偏りのＴＡＭｓ浸潤を有意に減少させ、Ｍ２型偏りのマクロファージのＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する抑制効果を逆転させ、腫瘍免疫抑制性微小環境に拮抗し、有意な抗腫瘍効果を奏すことが示された。
（４）ＣＴ－２６移植腫瘍モデルについては、ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、３日１回経口投与し）単独投与の時に、腫瘍抑制率は６．７％であった。化合物Ｉ５ｍｇ／ｋｇ（１日１回経口投与し）の腫瘍抑制率は４５．８％であり、ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、３日１回経口投与し）を化合物Ｉと併用した場合、１日１回５ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、腫瘍抑制率は８０．８％に達した。化合物Ｉは免疫チェックポイント薬剤に非感受性の腫瘍に対して抑制効果があるだけでなく、かつ免疫チェックポイント薬剤と併用した場合に有意な相乗効果を奏すことが示された。

【0064】

研究結果によれば、本発明に記載の化合物Ｉもしくはその薬学的に許容される塩は、腫瘍微小環境を再構築することにより、腫瘍免疫抑制状態を改善し、抗腫瘍治療効果を発揮し、免疫チェックポイント薬剤の抗腫瘍効果を増強することができ、良好な臨床応用の見通しがある。

【図面の簡単な説明】

【0065】

【図1】化合物Ｉがマウス由来のＢＭＤＭのＭ２偏り極性化表現型を逆転させたことを示す図である。そのうち、図１のＡは、化合物ＩがＭ２型マクロファージの表面マーカーＣＤ２０６の発現を下方制御し、Ｍ２型偏りのマクロファージの極性化表現型を阻害することを示し、図１のＢは、化合物ＩがＭ１型マクロファージの表面マーカーＣＤ８６の発現を増強することを示し、図１のＣは、化合物ＩがＭ１型マクロファージの表面マーカーＭＨＣ－ＩＩの発現を増強し、Ｍ１型偏りのマクロファージの極性化表現型を促進することを示した。

【図2】化合物ＩがＣＳＦ－１により誘導されたＢＭＤＭのＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する増殖抑制効果を逆転させ、ＣＳＦ－１により誘導されたＢＭＤＭのＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化に対する抑制効果を逆転させたことを示す図である。そのうち、図２のＡ（パネル）は、化合物ＩがＣＳＦ－１により誘導されたＢＭＤＭのＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖抑制効果を解除させたことを示し、図２のＢは、代表的なフローサイトメトリーの結果を示しており、図２のＣは、化合物Ｉ解除ＣＳＦ－１により誘導されたＢＭＤＭのＣＤ８^＋Ｔ細胞Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ発現に対する抑制効果を解除させたことを示し、図２のＤは、化合物ＩがＣＳＦ－１により誘導されたＢＭＤＭのＣＤ８^＋Ｔ細胞ＩＦＮγ発現に対する抑制効果を解除させたことを示した。

【図3】化合物Ｉが結腸癌ＭＣ３８マウス移植腫瘍モデルにおける免疫細胞浸潤を再構築することを示す図である。そのうち、図３のＡは、化合物ＩがＴＡＭの浸潤を有意に阻害することを示し、図３のＢは、化合物ＩがＴＡＭにおけるＣＤ２０６^＋のマクロファージの割合を下方制御したことを示し、図３のＣは、化合物ＩがＴｒｅｇ細胞の浸潤を阻害したことを示し、図３のＤは、化合物ＩがＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤に対する影響を示し、図３のＥは、化合物ＩがＣＤ８^＋ＴにおけるＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂ^＋Ｔ細胞の浸潤を増強したことを示し、図３のＦは、化合物ＩがＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤に対する影響を示した。

【図4】マウスの皮下移植腫瘍ＭＣ３８に対する化合物Ｉの増殖抑制効果を示す図である。

【図5】化合物Ｉがマウス皮下移植腫瘍ＣＴ－２６増殖に対するａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体の抑制効果を増強することを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0066】

以下、具体実施例を参照してさらに本発明を説明する。これらの実施例は、単に本発明を説明するために過ぎず、本発明に係る範囲を限定することを意図したものではないことを理解すべきである。以下の実施例において具体的な条件を明記しない実験方法は、通常従来的な条件またはメーカーが提案した条件に従う。特に断らない限り、百分率（パーセント）および部は、重量によるものである。

【実施例】

【0067】

［実施例１］ＣＳＦ－１Ｒキナーゼ活性に対する化合物Ｉの影響
１．試験方法：Ｚ’－ＬＹＴＥ^ＴＭ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ
検出は、Ｚ’－ＬＹＴＥ^ＴＭ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＰＶ３１９０，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の取扱説明書を参照して、具体的に次のステップで行った。Ｚ’－ＬＹＴＥ ^ＴＭ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ １ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐｅｐｔｉｄｅ、５Ｘ Ｋｉｎａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ、ＡＴＰ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｂ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｓｔｏｐ Ｒｅａｇｅｎｔそれぞれの試薬を室温に平衡化させ、順次添加した。ＣＳＦ－１Ｒキナーゼ（ＰＲ４５９８Ａ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）活性に対する種々の濃度化合物の影響を検出し、濃度ごとに二重ウェルを取り、４％のＤＭＳＯを共溶媒として用いた。反応終了後、すべての反応ウェルに、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒで（１：２５６）希釈したＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｂ ５μＬを加え、室温で１時間反応した後、すべての反応ウェルにＳｔｏｐ Ｒｅａｇｅｎｔ ５μＬを加えて反応を停止させ、Ｓｙｎｅｒｇｙ ２ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒで蛍光シグナル（励起光波長は４００ｎｍ、発光光波長は４４５ｎｍ、５２０ｎｍ）を検出した。

【0068】

全活性ウエルおよび対照シグナルウエルから各ウェルの抑制率を計算し、データ分析方法は次の通りである。

【数1】

蛍光強度比＝「供給体」蛍光分子クマリン蛍光強度（４４５ｎｍ）および「受容体」蛍光分子フルオレセイン蛍光強度（５２０ｎｍ）の比（Ｓ４４５／Ｓ５２０）

【0069】

Ｃ_１００％＝１００％リン酸化対照ウェル「供給体」蛍光分子クマリンの平均蛍光強度
Ｃ_０％＝０％リン酸化対照ウェル「供給体」蛍光分子クマリンの平均蛍光強度
Ｆ_１００％＝１００％リン酸化対照ウェル「受容体」蛍光分子フルオレセインの平均蛍光強度
Ｆ_０％＝０％リン酸化対照ウェル「受容体」蛍光分子フルオレセインの平均蛍光強度

【0070】

２．実験結果
化合物ＩはＣＳＦ－１Ｒキナーゼを阻害したＩＣ_５０は１５．０±３．２ｎＭであり、市販薬Ｐｅｘｉｄａｒｔｉｎｉｂ（ＰＬＸ３３９７）に相当する。化合物ＩがＣＳＦ－１Ｒキナーゼの活性を阻害でき、したがって、ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒキナーゼ阻害剤として使用でき、それはＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ依存性の癌または腫瘍に対して抑制効果を有する可能であると示されている。

【0071】

ＣＳＦ－１Ｒキナーゼ阻害剤Ｐｅｘｉｄａｒｔｉｎｉｂ（ＰＬＸ３３９７、商品名：Ｔｕｒａｌｉｏ）は、２０１９年８月３日に米国で販売され、成人患者に対して稀な疾患である腱滑膜巨細胞腫（ＴＧＣＴ）の治療が承認された。化合物ＩのＣＳＦ－１Ｒに対する活性阻害がＰｅｘｉｄａｒｔｉｎｉｂに相当し、化合物Ｉが治療腱滑膜巨細胞腫（ＴＧＣＴ）の治療効果を有することが示唆された。

【0072】

同時に、ＣＳＦ－１Ｒキナーゼは、腫瘍関連マクロファージの重要な標的である。化合物Ｉは、ＣＳＦ－１Ｒキナーゼ活性に有意な抑制効果があり、腫瘍微小環境を再構築し、腫瘍に拮抗する潜在性も示唆した。

【0073】

【表1】

備考：^＊ａ化合物Ｉ：ＩＣ_５０値を独立に３回繰り返して測定し、^＊ｂＰＬＸ３３９７：ＩＣ_５０値を独立に２回繰り返して測定し、平均値±ＳＤで表す。

【0074】

［実施例２］ＣＳＦ－１Ｒ媒介性の細胞増殖および初代マクロファージ生存に対する化合物Ｉの影響

【0075】

１．試験方法
１．１ ＣＳＦ－１Ｒ高活性化マウス骨髄性白血病細胞Ｍ－ＮＦＳ－６０の増殖に対する化合物Ｉの影響
対数増殖期のＣＳＦ－１Ｒ高活性化マウス骨髄性白血病細胞株Ｍ－ＮＦＳ－６０細胞を、適切な密度（９０μＬ／ウェル）で９６ウェルプレート（Ｍ－ＮＦＳ－６０細胞の培地において６２ｎｇ／ｍＬヒト組換えマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）を含む）に播種し、一晩培養した後、異なる濃度の化合物Ｉを加えて７２時間インキュベートした。溶媒対照群（陰性対照）を設定した。化合物が細胞を７２時間作用した後、ウェル当たりＣＣＫ－８試薬１０μＬを加え、３７℃のインキュベーターに２～４時間入れた後、全波長マイクロプレートリーダーで読み取った（測定波長：４５０ｎｍ）。

【0076】

１．２ ＣＳＦ－１により誘導されたマウス由来マクロファージ生存に対する化合物Ｉの影響

【0077】

ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６週間齢、健常）を犠牲させ、骨髄細胞を大腿骨と脛骨から採取し、赤血球溶解処理後適切な密度（９０μＬ/ウェル）で９６ウェルプレートに播種し、ウェル当たり１００ｎｇ／ｍＬのＣＳＦ－１因子誘導マクロファージ（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ＢＭＤＭ）を加え、同時に異なる濃度の化合物を加えてプレートを７日間インキュベートし、溶媒対照群（陰性対照）を設定した。化合物を７日間細胞に作用させた後、ウェル当たりＣＣＫ－８試薬１０μＬを加え、３７℃のインキュベーターに２～４時間入れた後、全波長マイクロプレートリーダーで読み取った（測定波長：４５０ｎｍ）。

【0078】

１．３ ＣＳＦ－１により誘導されたヒト由来マクロファージの生存に及ぼす化合物Ｉの影響

【0079】

凍結保存されたヒト由来の末梢血（健常人の末梢血に由来する）単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）を、液体窒素から取り出して蘇生させた後ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで５×１０^７個の細胞／ｍＬで再懸濁し、最終濃度１００μｇ／ｍＬでＤＮＡ酵素Ｉを加え、室温で１５分間インキュベートした。３００ｇで５分間遠心分離した後、上清を捨て、ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで再度５×１０^７個の細胞／ｍＬで再懸濁した後、７０μＭの濾過網でフローチューブに濾過し、ＳＴＥＭＣＥＬＬ社のＣＤ１４^＋単球陰性選別ビーズ選別キットを使用して選別し、その取扱説明書の具体的な実験手順は以下の通りであった。

【0080】

細胞を５×１０^７個の細胞／ｍＬで再懸濁した後、１ｍＬ当たりの試料に５０μＬのｃｏｃｋｔａｉｌを加え、試料は室温で５分間インキュベートした。磁気ビーズを３０秒間ボルテックスし、試料に加えて再度５分間インキュベートした。試料体積を２．５ｍＬまで補充し、磁気フレーム（ＳＴＥＭＣＥＬＬ，＃１８０００）上に２．５分間置いた。上清を遠心管に移し、３００ｇで５分間遠心分離した。細胞は１６４０培養液で適切な体積まで再懸濁した。実験の必要に応じてＣＳＦ－１因子１００ｎｇ／ｍＬを細胞懸濁液に加えた。９６ウェルプレートに細胞を一定の密度で播種し、ウェル当たり９０μＬを加えて細胞の状態が安定した後、異なる濃度の化合物を加えてプレートを７日間インキュベートし、空白溶媒対照群（無溶媒対照群）を設定した。作用させた後、９６ウェルプレートにおいてウェル当たりＣＣＫ－８試薬１０μＬを加え、３７℃のインキュベーターに２～４時間入れた後、可変波長マイクロプレートリーダーで読み取った（測定波長：４５０ｎｍ）。

【0081】

２．実験結果
化合物Ｉは用量依存的にＣＳＦ－１媒介性のＭ－ＮＦＳ－６０の細胞増殖を抑制し、その増殖阻害のＩＣ_５０は１．２±０．５ｎＭであった。

【0082】

化合物Ｉは用量依存的にＣＳＦ－１により誘導されたマクロファージの生存を阻害し、そのマウス由来マクロファージ生存阻害のＩＣ_５０は、１０．２±０．８ｎＭであり、そのヒト由来マクロファージ生存阻害のＩＣ_５０は３０．５±５．１ｎＭであった。

【0083】

注目すべきことは、本発明の化合物Ｉは、ＣＳＦ－１Ｒキナーゼ活性の抑制効果は、市販の医薬Ｐｅｘｉｄａｒｔｉｎｉｂ（ＰＬＸ３３９７）に相当するが、細胞試験において、化合物ＩがＣＳＦ－１Ｒ高活性化白血病細胞Ｍ－ＮＦＳ－６０およびＣＳＦ－１により誘導されたマクロファージ生存に対していずれもより強力な抑制効果を示し、ＩＣ_５０はＰＬＸ３３９７の約１／５～１／５０であり、当業者の期待をはるかに超えている。化合物Ｉは、より良い細胞活性を有し、臨床使用においてＰｅｘｉｄａｒｔｉｎｉｂ（ＰＬＸ ３３９７）よりも優れた治療効果を達成する可能性があると示唆されている。化合物Ｉがより優れた細胞活性を持ち、臨床に使用する場合にＰｅｘｉｄａｒｔｉｎｉｂ（ＰＬＸ ３３９７）よりも優れた治療効果を達成する可能性があると示唆されている。

【0084】

【表2】

備考：化合物ＩおよびＰＬＸ３３９７は、それぞれＭ－ＮＦＳ－６０細胞に３日間に作用し、細胞増殖に対する阻害のＩＣ_５０は、独立に３回繰り返して平均値±ＳＤで示した。化合物ＩおよびＰＬＸ３３９７は、それぞれＢＭＤＭおよびＰＢＭＣ細胞に７日間作用し、細胞生存に対する阻害のＩＣ_５０は、２回繰り返して平均値±ＳＤで示した。

【0085】

［実施例３］化合物ＩがマクロファージのＭ２型偏りの極性化表現型を逆転させる
１．試験方法
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６週間齢、健常）を犠牲させ、骨髄細胞を大腿骨と脛骨から採取し、赤血球溶解処理後適切な密度（２ｍＬ／ウェル）で６ウェルプレートに播種し、ＣＳＦ－１因子誘導マクロファージ（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ＢＭＤＭ）をウェル当たり１００ｎｇ／ｍＬで加えた。誘導７日間後、細胞培養液を交換し、上記と同じ濃度のＣＳＦ－１因子を加えたと共に１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ４および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１３でマクロファージＭ２型極性化を誘導した。極性化（分極）を誘導しながら、適切な濃度の化合物を試験ウェルおよび陰性対照ウェルを加え、４８時間後、細胞を採取してフローサイトメトリー分析を行った。

【0086】

良好な状態の細胞を収集し、まずＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳ １００μＬで各試料を再懸濁し、取扱説明書に従って調製した死細胞と生細胞を識別するための蛍光抗体０．５μＬを加えて４℃、暗所で３０分間染色した。３０分後、１ｍＬのｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、４℃で３００ｇで５分間遠心分離した。ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いて１００μＬごとにブロッキング抗体ＴｒｕＳｔａｉｎ ｆｃＸ^ＴＭ（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＣＤ１６／３２）２μＬを加えてブロッキング抗体希釈液を調製し、各試料１００μＬ系に基づいてブロッキングを加えて１０分間ブロッキングした後、抗体の取扱明細書により表面タンパク質に対応する蛍光抗体を試料に加え、４℃で３０分間インキュベートした。その後、単一染色対照チューブおよびＦＭＯ対照チューブを設定した後に、ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １ｍＬで２回洗浄し、４℃で３００ｇで５分間遠心分離した。

【0087】

表面タンパク質のみを調べたところ、遠心分離した後、試料を３００μＬのＰＢＳで再懸濁し、直ちに機器に入れ、あるいは４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定した後、５００ｇで７分間遠心分離し、上清を捨て、ＰＢＳで再懸濁し、さらに機器で分析するために貯蔵した。

【0088】

同時に細胞内因子を調べたところ、遠心後に上清を捨てた場合にも、１００μＬの再懸濁試料が保持されていた。さらにＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｉｘａｔｉｏｎ＆Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＳｅｔにおけるＩＣｆｉｘａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて１００μＬで各試料に加え、４℃で３０分間固定し、固定終了後、５００ｇで7分間遠心分離し、三重蒸留水(ｔｒｉ－ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ：ＴＤＷ）で１０×Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（浸透圧緩衝液）を１×膜破壊溶液に調製した。遠心分離後、各試料２ｍＬに１×膜破壊溶液を加えて試料を再懸濁し、５００ｇで７分間遠心分離し、２回繰り返し、１×膜破壊溶液を用いて抗体説明書に推奨されるように細胞内蛍光抗体を調製した。ウェル当たり１００μＬの体系に細胞を再懸濁し、４℃で３０分間染色した。この手順では、単一染色対照チューブおよびＦＭＯ対照チューブを設定した後に、５００ｇで7分間遠心分離し、かつ１×膜破壊溶液２ｍＬで２回洗浄し、最後に試料を３００μＬのＰＢＳで再懸濁し、機器分析のために用意した。

【0089】

２．実験結果
実験結果は、マウス由来のＢＭＤＭ実験系において、化合物Ｉは用量２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭのいずれにおいてもＭ２型マクロファージの表面マーカーＣＤ２０６分子の発現レベルを有意に抑制した（図１のＡ）。これと共に、化合物ＩはＭ１型マクロファージの表面マーカーＣＤ８６およびＭＨＣ－ＩＩ分子の発現を有意に増強できた（図１のＢ、図１の１Ｃ）。化合物ＩはＩＬ４、ＩＬ１３により誘導されたＭ２型偏りのマクロファージの分化を逆転させることができ、Ｍ２型偏りのマクロファージの割合を下方制御し、Ｍ１型偏りのマクロファージの浸潤を上方制御することができた。

【0090】

［実施例４］化合物ＩのマクロファージのＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する抑制効果を逆転させる
１．試験方法
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６週間齢、健常）から無傷の脾臓を分離し出し、脾臓をｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ中で均質化した後、３００ｇで５分間遠心分離し、その後細胞を赤血球溶解液に入れて赤血球溶解させた。脾臓細胞を得た後ＰＢＳで２回洗浄し、毎回３００ｇで５分間遠心分離し、その後細胞を２×１０^７個の細胞／ｍＬまで再懸濁し、最終濃度５ｍＭのＣＦＳＥを加えて１５分間染色した後、９倍体積のＰＢＳを加えてスピード４００ｇで５分間遠心分離し、さらに正常培養液１０ｍＬで１回洗浄し、最終的に得られた脾臓細胞にαＣＤ３／αＣＤ２８およびＩＬ－２を加えて刺激し、因子を加えていない細胞を陰性対照とし、因子を加えた細胞を陽性対照とした。他の細胞は、化合物および溶媒対照で前処理されたＣＳＦ－１により誘導されたＢＭＤＭ（１００,０００／ウェル）と共培養した。前処理したＢＭＤＭと全脾臓細胞とが１：３０の割合で共培養した。αＣＤ３／αＣＤ２８／ＩＬ２活性化Ｔ細胞を加えて７２時間共培養した。７２時間後、１：５００の割合でｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ^ＴＭ Ｃｅｌｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）（５００Ｘ）を加えて４時間インキュベーションした後、脾臓細胞を収集した。かつ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットの増殖および活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋Ｔ、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ^＋ＣＤ８^＋Ｔ）の割合を、フローサイトメトリーで分析した。

【0091】

２．実験結果
その結果は、αＣＤ３／αＣＤ２８／ＩＬ２を加えてＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を活性化することができ、ＣＳＦ－１により誘導されたＢＭＤＭを加えた後、そのような増殖作用が有意に阻害されることが示された。ＣＳＦ－１により誘導されたＢＭＤＭを化合物Ｉでプレインキュベーション（前培養）した後、上記の増殖抑制効果を解除することができ（図２のＡ、図２のＢ）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖は溶媒対照群に比べて有意に上昇した。

【0092】

活性化されたＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＩＦＮγおよびグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）を高く発現していた。ＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋ＴおよびＧｒａｎｚｙｍｅＢ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合の検出結果は、溶媒対照群に比べて、化合物Ｉ前処理のＢＭＤＭとＣＤ８^＋Ｔ細胞との共培養系において、グランザイムＢおよびＩＦＮγ陽性のＣＤ８^＋Ｔの割合が有意に上昇することが示されており（図２Ｃ、２Ｄ）、化合物Ｉは、ＣＳＦ－１により誘導されたＢＭＤＭが活性化のＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する免疫抑制効果を解除したことが示された。

【0093】

［実施例５］結腸直腸癌ＭＣ３８移植腫瘍モデルにおける免疫微小環境に対する化合物Ｉの影響
１．試験方法
良好な状態のＭＣ３８細胞を、２．５×１０^７個の細胞/ｍＬまで再懸濁し、各匹のマウスにそれぞれ細胞懸濁液２００μＬをマウス右側腋窩皮下に播種し、腫瘍細胞がマウス体内において皮下移植腫瘍を形成し、平均約１００ｍｍ^３程度までに成長した場合に、マウスを無作為に投与群および対照群に分けた。被検化合物は所望の濃度で配合し、対応する等量の溶媒を用いて溶媒対照とした。薬物は経口投与し、１日１回で２４日間連続投与した。

【0094】

（１）腫瘍組織免疫細胞亜集団のスキャン実験：
投与期間中、マウス移植腫瘍体積の測定とマウス体重の秤量を２～４日ごとに１回行った。ＭＣ３８皮下移植腫瘍の溶媒対照群を７００～８００ｍｍ^３までに成長した場合に、実験を停止し、マウスから摘出した新鮮な腫瘍はハサミで２ｍｍ^３以下の断片に剪断した。消化酵素は、Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（腫瘍解離キット）の取扱説明書に従って調製した。調製した酵素溶液２．５ｍＬで腫瘍組織塊を再懸濁し、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ^ＴＭ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ機器に入れ、選択されたプログラムで腫瘍を解離させた。解離終了後、懸濁液を７０μＭのろ過スクリーンでろ過して細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を赤血球溶解液で１０分間赤血球溶解し、３００ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで再懸濁した。細胞計数後所望量の細胞を取り出した。まずＰＢＳで細胞を２回洗浄した。洗浄完了後、各試料を１００μＬのＰＢＳで再懸濁し、取扱明細書に従って調製した死細胞と生細胞を識別する蛍光抗体０．５μＬを加えて４℃で３０分間暗所で染色した。３０分間後、１ｍＬのｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、４℃で３００ｇ、５分間遠心分離した。ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いて１００μＬごとにブロッキング抗体ＴｒｕＳｔａｉｎｆｃＸ^ＴＭ（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＣＤ１６／３２）２μＬを加えてブロッキング抗体希釈液を調製し、各試料１００μＬ系を加え、１０分間ブロッキングした後、抗体説明書に従って表面タンパク質に対応する蛍光抗体を試料に加え、４℃で３０分間インキュベートした。この手順では単一染色対照チューブおよびＦＭＯ対照チューブを設定した後、同様に１ｍＬのｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、毎回に４℃、３００ｇで５分間遠心分離した。

【0095】

表面タンパク質のみを調べてみると、遠心分離後３００μＬのＰＢＳで再懸濁し、直ちに機器に入れて操作したり、または４％パラホルムアルデヒドで再懸濁して１５分間固定したりした後、５００ｇで７分間遠心分離して上清を捨て、ＰＢＳで再懸濁し、機器分析のために用意した。

【0096】

細胞内因子も同時に調べる必要がある場合、遠心後に上清を捨てたところ、再懸濁試料１００μＬが残っており、さらにＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｉｘａｔｉｏｎ＆Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（細胞内固定および浸透圧緩衝液セット）におけるＩＣｆｉｘａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて各試料に１００μＬ加え、４℃で３０分間固定した。固定完了後、５００ｇで７分間遠心分離し、三重蒸留水で１０×Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（浸透圧緩衝液）を１×膜破壊溶液に調製し、遠心分離後、各試料に２ｍＬの１×膜破壊溶液を加えて試料を再懸濁し、５００ｇで７分間遠心分離し、このように２回繰り返し、１×膜破壊溶液で抗体の取扱説明書で推奨されるように細胞内蛍光抗体を調製し、細胞をウェル当たり１００μＬの体系に再懸濁し、４℃で３０分間染色した。この手順では、単一染色対照チューブおよびＦＭＯ対照チューブを設定した後、試料を５００ｇで７分間遠心分離し、２ｍＬの１×膜破壊溶液で２回洗浄した。最後に試料を３００μＬのＰＢＳで再懸濁し、このように機器分析のために用意した。

【0097】

核内タンパク質を同時に染色する必要がある場合、遠心分離後、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（転写因子染色緩衝液セット）における固定液で固定し、各試料に２００μＬを加え、４℃で３０分間固定した。固定完了後、５００ｇで７分間遠心分離し、三重蒸留水で１０×Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（浸透圧緩衝液）を１×膜破壊溶液に調製し、遠心分離後、各試料に２ｍＬの１×膜破壊溶液を加えて試料を再懸濁し、５００ｇで７分間遠心分離し、このように２回繰り返し、１×膜破壊溶液で抗体の取扱説明書で推奨されるように細胞内蛍光抗体を調製し、細胞をウェル当たり１００μＬの体系に再懸濁し、４℃で３０分間染色した。この手順では、単一染色対照チューブおよびＦＭＯ対照チューブを設定した後、試料を５００ｇで７分間遠心分離し、２ｍＬの１×膜破壊溶液で２回洗浄した。最後に試料を３００μＬのＰＢＳで再懸濁し、このように機器分析のために用意した。

【0098】

（２）薬効学的実験：
投与期間中、マウス移植腫瘍体積の測定とマウス体重の秤量を２～４日ごとに１回行った。投与２４日間後実験を終了した。
腫瘍体積（ＴＶ）は、計算式ＴＶ＝１／２×ａ×ｂ^２で算出され、そのうちａ、ｂは、それぞれ移植腫瘍の長さと幅である。

【0099】

抗腫瘍活性の評価指数は、腫瘍増殖抑制率ＴＧＩ（％）であり、計算式ＴＧＩ（％）＝１００×｛１－［（Ｖ_{ＴｒｅａｔｅｄＦｉｎａｌｄａｙ}－Ｖ_{ＴｒｅａｔｅｄＤａｙ０}）／（Ｖ_{ＣｏｎｔｒｏｌＦｉｎａｌｄａｙ}－Ｖ_{ＣｏｎｔｒｏｌＤａｙ０}）］で算出される。統計的検定はｔ検定を用い、ｐ≦０．０５は有意差であった。

【0100】

２．実験結果
本発明者らは、結腸直腸癌モデルにおいてマクロファージ浸潤が豊富なＭＣ３８マウス皮下移植腫瘍モデルを選択し、腫瘍免疫微環境に対する化合物Ｉの影響を調べた。研究によれば、殺傷性ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、免疫細胞において重要なエフェクターであることが示された。腫瘍における殺傷性Ｔ細胞の浸潤と殺傷能は、抗腫瘍効果の肝心な要素であり、活性化Ｔ細胞は、ＩＦＮγ、ＧｒａｎｚｙｍｅＢなどを分泌することにより、抗腫瘍機能を発揮することができる。Ｍ２型偏りのＴＡＭｓは、殺傷性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を抑制し、腫瘍免疫抑制状態をもたらす。腫瘍増殖において、調節性Ｔ細胞（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｔｒｅｇ）と複数種類の免疫細胞と相互作用して抑制性サイトカインを産生し、免疫抑制の腫瘍微小環境を促進し、腫瘍増殖を促進し、治療に対する腫瘍の応答を阻害する。ＭＣ３８マウス移植腫瘍モデルにおけるマクロファージの重要な役割を考慮した上で、発明者らはマクロファージの浸潤およびＭ２型偏りの極性化とリンパ球相におけるＴ細胞の浸潤および活性化の検出を行った。

【0101】

結果は、化合物Ｉの各用量群では、腫瘍組織全体のＴＡＭｓの浸潤が溶媒対照群に比べて有意に低下し、かつ、ＴＡＭｓにおけるＣＤ２０６^＋Ｍ２型偏りのマクロファージの浸潤をさらに下方制御していることが示された（図３のＡ、図３のＢ）。Ｔｒｅｇ細胞の浸潤は、化合物Ｉの作用下で有意に減少した（図３のＣ）。発明者らは、Ｔ細胞におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の浸潤をさらに分析し、溶媒対照群に比べて、化合物Ｉ投与群ではＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤およびＩＦＮγ^＋のＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤の程度に有意な変化はなかったが、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ^＋のＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤は有意に増加した（１０ｍｇ／ｋｇ群）ことを見出した（図３のＤ、図３のＥ、図３のＦ）。

【0102】

さらに、インビボでの抗腫瘍活性評価結果によれば、化合物Ｉは、ＣＳＦ－１Ｒを標的としてマウス体内マクロファージの浸潤、特にＭ２型マクロファージの浸潤を抑制し、Ｔｒｅｇの浸潤を下方制御し、活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞（とりわけ、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ^＋のＣＤ８^＋Ｔ細胞）の浸潤を増強し、腫瘍微小環境全体を再構築し、腫瘍免疫抑制状態を逆転させ、腫瘍拮抗作用を発揮し、マウス結腸癌ＭＣ３８細胞移植腫瘍増殖を有意に抑制したことが示された（表３、図４）。

【0103】

【表3】

【0104】

［実施例６］化合物Ｉ増感免疫チェックポイント薬剤の抗腫瘍効果
１．試験方法
各ＢＡＬＢ／ｃマウスに対しては、それぞれＣＴ－２６細胞を５×１０^６個の細胞でマウスの右側腋窩皮下に播種し、腫瘍細胞がマウス体内に皮下移植腫瘍を形成し、平均約１００ｍｍ^３程度に達した時点でマウスを無作為に投与群および対照群に分配した。ａｎｔｉ－ＰＤ－１単独投与群：ａｎｔｉ－ＰＤ－１（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ社、ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＰＤ－１（ＣＤ２７９）（ｃａｔａｌｏｇ：ＢＥ０２７３））１０ｍｇ／ｋｇで３日１回経口投与し、１２日間連続投与した。対照群には、同量のａｎｔｉ－ＰＤ－１のアイソタイプ対照Ｈａｍｓｔｅｒ Ｉｇ（Ｒａｔ ｌｇＧ２ａ）を投与し、投与の経路、用量および頻度はａｎｔｉ－ＰＤ－１群と同様にした。化合物Ｉ単独投与群（化合物Ｉ＋Ｒａｔ ｌｇＧ２ａ）：化合物Ｉ ５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与し、１２日間連続投与すると共にＲａｔ ｌｇＧ２ａを投与した（投与方式は対照群と同じ）。また、ａｎｔｉ－ＰＤ－１（１０ｍｇ／ｋｇ、３日１回経口投与し）と化合物Ｉ（５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与し）との併用投与群を設定した。実験の過程全体において、週２回に移植腫瘍体積を測定し、同時にマウス体重を秤量した。

【0105】

腫瘍体積（ＴＶ）は、計算式ＴＶ＝１／２×ａ×ｂ^２で算出され、そのうち、ａおよびｂは、それぞれ移植腫瘍の長さと幅である。
測定の結果に基づいて下記の計算式で相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ：ＲＴＶ）が算出された。
ＲＴＶ＝Ｖ_ｔ／Ｖ_０
そのうち、Ｖ_０は投与開始時（すなわち、籠で分けて最初投与の時、ｄ０）に測定された腫瘍体積であり、Ｖ_ｔは毎回測定時の腫瘍体積である。

【0106】

抗腫瘍活性の評価指数は、腫瘍増殖抑制率ＴＧＩ（％）であり、次の計算式で算出された。
ＴＧＩ（％）＝１００×｛１－［（Ｖ_{ＴｒｅａｔｅｄＦｉｎａｌｄａｙ}－Ｖ_{ＴｒｅａｔｅｄＤａｙ０}）／（Ｖ_{ＣｏｎｔｒｏｌＦｉｎａｌｄａｙ}－Ｖ_{ＣｏｎｔｒｏｌＤａｙ０}）］。
統計的検定は、ｔ検定を用いて行い、ｐ≦０．０５は有意差を示した。

【0107】

２．実験結果
この実験結果では、ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体単独（１０ｍｇ／ｋｇ、３日１回経口投与し）の腫瘍抑制率は６．７％であり、化合物Ｉ単独（５ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍抑制率は４５．８％であったことが示された。ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体（すなわち、３日１回経口投与し、毎回投与用量１０ｍｇ／ｋｇ）を使用した上で化合物Ｉと組み合わせて１日１回５ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、腫瘍抑制率は８０．８％に達した（表４、図５）。このことから、化合物Ｉの併用では、ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体のＣＴ－２６モデルにおける腫瘍抑制効果を増強できることが示された。

【0108】

【表4】

【0109】

本発明で使用される英語の略語の全称およびその対応日本語の名称は次の通りである。
ＣＳＦ－１Ｒ：Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、マクロファージコロニー刺激因子受容体
ＣＳＦ－１：Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ １、マクロファージコロニー刺激因子。
ＴＡＭ：Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ、腫瘍関連マクロファージ。
Ｔｒｅｇ：Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ、調節性Ｔ細胞。
ＤＣ：Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、樹状細胞。
ＰＢＭＣ：Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、末梢血単核細胞。
ＢＭＤＭ：Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ、骨髄由来マクロファージ。
ａｎｔｉ－ＰＤ－１：Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １、プログラム細胞死受容体－１。
ＦＭＯ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｎｕｓ Ｏｎｅ、１を引いた蛍光対照（マルチカラー測定時の蛍光補正のコントロールサンプル）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】