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特許7554850アンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含む肥満関連疾患の予防及び治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-11
(45)【発行日】2024-09-20
(54)【発明の名称】アンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含む肥満関連疾患の予防及び治療用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/713 20060101AFI20240912BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20240912BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20240912BHJP
A61K 47/58 20170101ALI20240912BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20240912BHJP
A61K 47/59 20170101ALI20240912BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20240912BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240912BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240912BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240912BHJP
【ＦＩ】
A61K31/713
A61K9/19
A61K47/60
A61K47/58
A61K47/54
A61K47/59
A61K47/69
A61P3/04
A61K48/00
C12N15/113 Z ZNA
【請求項の数】
22
(21)【出願番号】P 2022569252
(86)(22)【出願日】2021-05-13
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-14
(86)【国際出願番号】 IB2021054077
(87)【国際公開番号】W WO2021229479
(87)【国際公開日】2021-11-18
【審査請求日】2023-01-05
(31)【優先権主張番号】10-2020-0057879
(32)【優先日】2020-05-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】514171197
【氏名又は名称】バイオニア コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＮＥＥＲ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】８－１１， Ｍｕｎｐｙｅｏｎｇｓｅｏ－ｒｏ， Ｄａｅｄｅｏｋ－ｇｕ， Ｄａｅｊｅｏｎ ３４３０２， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(73)【特許権者】
【識別番号】522397709
【氏名又は名称】サーナゲン セラピューティックス コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＳＩＲＮＡＧＥＮ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】パク ジュンホン
(72)【発明者】
【氏名】パク ハンオ
(72)【発明者】
【氏名】ユン スンイル
(72)【発明者】
【氏名】キム テリム
(72)【発明者】
【氏名】フアン ソヒョン
(72)【発明者】
【氏名】ソン カン
(72)【発明者】
【氏名】チョン サンヒョク
(72)【発明者】
【氏名】キム チャンソン
(72)【発明者】
【氏名】イ ミスン
(72)【発明者】
【氏名】チェ ソニア
(72)【発明者】
【氏名】ソン スンソプ
【審査官】長谷川 茜
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／２２５９６８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】ROBIDOUX, J. et al.，Amphiregulin, a new adipogenic growth factor.，Diabetes，2006年，Vol.55, No. Suppl.1，p.A316 1353-P
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）と、それに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；（ｉｉ）下記の構造式（１）の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ
前記構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカー媒介共有結合を意味し、Ｒは前記（ｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを意味し、
前記親水性物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンからなる群から選択されるか、あるいは、
前記親水性物質は、下記の構造式（５）又は構造式（６）の構造を有し、
［構造式（５）］
（Ａ’ ｍ －Ｊ） ｎ
［構造式（６）］
（Ｊ－Ａ’ ｍ ） ｎ
前記構造式（５）又は構造式（６）において、Ａ’は親水性物質モノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）を、Ｊはｍ個の親水性物質モノマー間又はｍ個の親水性物質モノマーと二本鎖オリゴヌクレオチドとを互いに連結するリンカー、ｍは１～１５の整数、ｎは１～１０の整数を意味し、
親水性物質単量体Ａ’は、下記の化合物（１）～化合物（３）から選択されるいずれかの化合物であり、リンカー（Ｊ）は、－ＰＯ ３ － －、－ＳＯ ３ －及び－ＣＯ ２ －からなる群から選択され：
［化合物（１）］
［化合物（２）］
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；
からなる群から選択されるいずれかを含むことを特徴とする肥満の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項2】
前記センス鎖又はアンチセンス鎖は１９～３１個のヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記センス鎖又はアンチセンス鎖は独立してＤＮＡ又はＲＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖が化学的修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記化学的修飾が、１つ以上のヌクレオチド内の糖構造の２’炭素位置で水酸化基（－ＯＨ）がメチル基（－ＣＨ３）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、アミン基（－ＮＨ２）、フッ素（－Ｆ）、Ｏ－２－メトキシエチル基、Ｏ－プロピル基、Ｏ－２－メチルチオエチル基、Ｏ－３－アミノプロピル基、Ｏ－３－ジメチルアミノプロピル基、Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド基、及びＯ－ジメチルアミドオキシエチルからなる群から選択されるいずれかに置換される修飾；
ヌクレオチド内の糖構造の酸素が硫黄に置換される修飾；
ヌクレオチド結合がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）結合、ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合及びメチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合からなる群から選択されるいずれかの結合となる修飾；並びに
ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）及びＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）形態への修飾；
からなる群から選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の５’末端に１つ以上のリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）が結合していることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記アンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記の構造式（２）の構造を含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物：［構造式（２）］
【請求項9】
前記アンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記の構造式（３）又は構造式（４）の構造を含むことを特徴とする、請求項８に記載の医薬組成物：［構造式（３）］
【請求項10】
前記アンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記の構造式（７）又は構造式（８）の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物：［構造式（７）］
（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ
［構造式（８）］
（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ。
【請求項11】
前記親水性物質の分子量は２００～１０，０００であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記疎水性物質の分子量は２５０～１，０００であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記ステロイド誘導体が、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コレスタニルホルマート及びコレスタニルアミンからなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記グリセリド誘導体は、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドからなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記Ｘ及びＹで表される共有結合は、非分解性結合又は分解性結合であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記非分解性結合は、アミド結合又はリン酸化結合であることを特徴とする、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記分解性結合は、二硫化結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合及び酵素分解性結合からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項18】
前記ナノ粒子は、異なる配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の混合物で構成されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項19】
前記肥満は糖尿病による内臓脂肪型肥満であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項20】
前記医薬組成物は、次のいずれか一つ以上の効果を発揮することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物：（ｉ）体重の減少；
（ｉｉ）食餌効率の低下；
（ｉｉｉ）皮下脂肪の減少；
（ｉｖ）内臓脂肪の減少；
（ｖ）脂肪細胞面積の減少；及び
（ｖｉ）肝脂肪生成の抑制。
【請求項21】
前記医薬組成物は脂肪組織内のアンフィレギュリンの発現を抑制して、肥満の予防又は治療効果を発揮することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項22】
請求項１に記載の医薬組成物を含む凍結乾燥形態の肥満の予防又は治療用製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含む肥満関連疾患の予防及び治療用組成物に関し、より詳しくは、アンフィレギュリン発現を非常に特異的に高効率で妨げることができる二本鎖オリゴヌクレオチド、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体及びナノ粒子を含む肥満関連疾患の予防及び治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
１９９５年、ＧｕｏとＫｅｍｐｈｕｅｓは Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでａｎｔｉｓｅｎｓｅを用いた遺伝子の発現を抑制するのにａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡと同様にｓｅｎｓｅ ＲＮＡも有効であることを発見することにより、その原因を究明するための研究が進められ、１９９８年、Ｆｉｒｅなどが初めてｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を注入して、それに対応するｍＲＮＡが特異的に分解して遺伝子の発現が抑制される現象を確認し、これをＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）と命名した。ＲＮＡｉは、遺伝子の発現を抑制するために使用される方法であって、簡便かつ少ないコストで遺伝子抑制効果をはっきりと達成することができるので、その技術の応用分野が多様化している。
【0003】
このような遺伝子の発現を抑制する技術は特定遺伝子の発現を調節できるので、特定遺伝子の過剰発現が原因となる癌、遺伝疾患などの標的遺伝子をｍＲＮＡレベルで除去できて、疾患治療のための治療剤の開発及び標的検証の重要なツールとして活用することができる。標的遺伝子の発現を抑制する従来の技術としては、標的遺伝子に対する転移遺伝子を導入する技術が開示されているが、プロモーターを基準に逆方向（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）に転移遺伝子を導入する方法と、プロモーターを基準に正方向（ｓｅｎｓｅ）に移植遺伝子を導入する方法がある。
【0004】
このようなＲＮＡを標的とするＲＮＡ治療法は、標的ＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドを用いて当該遺伝子の機能を除去する方法であって、従来の抗体や化合物（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）のような従来の治療剤が主にタンパク質を標的とするものとは異なる。ＲＮＡを標的とする接近法には大きく２つがある。その１つは二重らせんＲＮＡを媒介とするＲＮＡｉであり、もう１つはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。現在、様々な疾患でＲＮＡを標的にして臨床が試みられている。
【0005】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、以下、「ＡＳＯ」という）は、ワトソン－クリック塩基反応に応じて目的遺伝子に結合するように設計された短い長さの合成ＤＮＡであって、遺伝子の特定塩基配列の発現を特異的に抑制することができて、遺伝子の機能を研究し、癌などの疾患を分子レベルで治療することができる治療剤を開発するために利用されてきた。このようなＡＳＯは遺伝子の発現を抑制する目標を多様に設定して容易に製作され得る利点があり、発癌遺伝子の発現と癌細胞の成長を抑制するのに活用しようとする研究があった。ＡＳＯが特定の遺伝子の発現を抑制する過程は、相補的なｍＲＮＡ配列と結合してＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘導してｍＲＮＡを除去するか、タンパク質翻訳のためのリポソーム複合体の形成及び進行を妨げることによって行われる。さらに、ＡＳＯはゲノムＤＮＡと結合してトリプルヘリックス（ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｘ）構造を形成することによって遺伝子の転写を抑制するということが報告されている。ＡＳＯは上述した潜在的な可能性があるが、それを臨床的に活用するためにはヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）に対する安定性を向上させ、目的遺伝子の塩基配列に特異的に結合するように標的組織や細胞内に効率的に伝達しなければならない。さらに、遺伝子ｍＲＮＡの二次及び三次構造はＡＳＯの特異的な結合に重要な要素であり、ｍＲＮＡの二次構造が少ない部分がＡＳＯが接近するのに非常に有利であるため、ＡＳＯを合成する前にｍＲＮＡの二次構造が少なく生成される領域を体系的に分析して、生体外だけでなく生体内でも遺伝子特異的な抑制を効果的に達成するために努力してきた。このようなＡＳＯは、ＲＮＡの種類であるｓｉＲＮＡよりも非常に安定しており、水や生理食塩水などによく溶解する利点があり、現在３つのＡＳＯがＦｅｄｅｒａｌ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）に承認されている（Ｊｅｓｓｉｃａ，Ｃ．，Ｊ Ｐｏｓｔｄｏｃ Ｒｅｓ，４：３５－５０，２０１６）。
【0006】
干渉ＲＮＡ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下、「ＲＮＡｉ」という）は、その役割が発見された以来、様々な種類の哺乳動物細胞で配列特異的なｍＲＮＡに作用するということがわかった（Ｂａｒｉｋ，Ｓ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（２００５）８３：７６４－７７３）。長い鎖のＲＮＡ二本鎖が細胞に送達されると、送達されたＲＮＡ二本鎖は、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）によって２１～２３個の二本鎖（ｂｐ：ｂａｓｅ ｐａｉｒ）で処理された短い干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、以下、「ｓｉＲＮＡ」という）に変換され、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）に結合して、ガイド（アンチセンス）鎖が標的ｍＲＮＡを認識して分解する過程を通じて標的遺伝子の発現を配列特異的に阻害する。ＳｉＲＮＡを用いた遺伝子の発現抑制技術は、標的細胞における標的遺伝子の発現を抑制し、これによる変化を観察することで標的細胞における標的遺伝子の機能を究明する研究に有用に用いられる。特に、感染性ウイルス又は癌細胞などで標的遺伝子の機能を抑制することは、当該疾患の治療方法を開発するのに有用に活用することができ、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での研究及び実験動物を用いた生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）研究を行った結果、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制が可能であると報告されている。
【0007】
Ｂｅｒｔｒａｎｄの研究陣によると、同じ標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）と比較して、生体内及び生体外でのｍＲＮＡ発現の阻害効果に優れており、その効果は長い間持続するということが明らかになった。また、ｓｉＲＮＡの作用機序は標的ｍＲＮＡと相補的に結合して配列特異的に標的遺伝子の発現を調節するので、既存の抗体ベースの医薬品や化学物質医薬品（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｄｒｕｇ）に比べて適用できる対象が画期的に拡大することができるという利点を有する。
【0008】
ｓｉＲＮＡの優れた効果及び様々な使用範囲にもかかわらず、ｓｉＲＮＡが治療薬として開発されるためには、体内でのｓｉＲＮＡの安定性の改善及び細胞送達効率の改善を通じて、ｓｉＲＮＡが標的細胞に効果的に伝達されなければならない。体内安定性の向上及びｓｉＲＮＡの非特異的な細胞免疫応答（ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）問題解決のために、ｓｉＲＮＡの一部のヌクレオチド又は骨格を核酸分解酵素耐性を有するように修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）するか、又はウイルス性ベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）、リポソームやナノ粒子などの伝達体を利用するなど、これに対する研究が活発に試みられている。
【0009】
アデノウイルスやレトロウイルスなどのウイルス性ベクターを用いた送達システムは、形質導入効率（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃａｃｙ）が高いが、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）及び発癌性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が高い。一方、ナノ粒子を含む非ウイルス性（ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ）送達システムは、ウイルス性送達システムに比べて細胞伝達効率は低いが、生体内での安定性が高く、標的特異的に伝達が可能であり、内包されているＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを細胞又は組織に取り込み（ｕｐｔａｋｅ）及び内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）し、細胞毒性及び免疫誘発がほとんどないという利点を有するので、現在ではウイルス性伝達システムに比べて有力な伝達方法として評価されている。
【0010】
非ウイルス性送達システムのうち、ナノ担体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）を用いる方法は、リポソーム、陽イオン高分子複合体などの様々な高分子を使用することによりナノ粒子を形成し、ｓｉＲＮＡをそのようなナノ粒子、すなわち、ナノ担体に担持して細胞に伝達する方法である。ナノ担体を利用する方法のうち、主に活用される方法は、高分子ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、高分子ミセル（ｐｏｌｙｍｅｒ ｍｉｃｅｌｌｅ）、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）などがある。そのうち、リポプレックスを用いた方法は陽イオン性脂質で構成されて細胞のエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）の陰イオン性脂質と相互作用して、エンドソームの脱安定化効果を引き起こして細胞内に伝達する役割を果たす。
【0011】
また、ｓｉＲＮＡパッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ；センス（ｓｅｎｓｅ））鎖の末端部位に化学物質などを連結して増強された薬力学的（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）特徴を持たせることで生体内で高い効率を誘導することができると知られている（Ｊ Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｎａｔｕｒｅ １１；４３２（７０１４）：１７３－８，２００４）。このとき、ｓｉＲＮＡセンス（ｓｅｎｓｅ；パッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ））又はアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ；ガイド（ｇｕｉｄｅ））鎖の末端に結合した化学物質の性質に応じてｓｉＲＮＡの安定性が異なる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）などの高分子化合物が接合した形態のｓｉＲＮＡは、陽イオン性物質が存在する条件でｓｉＲＮＡの陰イオン性リン酸基と相互作用して複合体を形成することにより、改善されたｓｉＲＮＡ安定性を持つ伝達体となる。特に、高分子複合体で構成されたミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）群は、薬物伝達輸送体として使用される他のシステムである、微小球体（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）やナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などに比べてその大きさが極めて小さいながらも分布が非常に一定で、自発的に形成される構造なので、製剤の品質管理及び再現性の確保が容易であるという利点がある。
【0012】
ｓｉＲＮＡの細胞内送達効率を向上させるために、ｓｉＲＮＡに生体適合性高分子である親水性物質（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を単純共有結合又はリンカー媒介共有結合で接合させるｓｉＲＮＡ接合体を通して、ｓｉＲＮＡの安定性を確保し、効率的な細胞膜透過性のための技術が開発された（韓国登録特許第８８３４７１号）。しかしながら、ｓｉＲＮＡの化学的修飾及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を接合させる（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）だけでは、生体内での低い安定性と標的臓器への送達が円滑でないという欠点は依然としてある。これらの欠点を解決するために、オリゴヌクレオチド、特に、ｓｉＲＮＡのような二本鎖オリゴＲＮＡに親水性及び疎水性物質が結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が開発された。前記構造体は疎水性物質の疎水性相互作用によりＳＡＭｉＲＮＡＴＭ（ｓｅｌｆ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｉｃｅｌｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ）と呼ばれる自己組織化ナノ粒子を形成するが（韓国登録特許第１２２４８２８号）、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ 技術は既存の伝達技術に比べて非常にサイズが小さいながらも均一なナノ粒子を得ることができるという利点がある。
【0013】
ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ 技術の具体例としては、親水性物質としてＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）又はＨＥＧ（Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ）が用いられる。ＰＥＧは合成ポリマーであり、医薬品、特に、タンパク質の溶解性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）増加及び薬物動態学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）の調整によく使用される。ＰＥＧは多分散系（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ）物質であり、１バッチ（ｂａｔｃｈ）のポリマーは他の個数の単量体の総和からなり分子量がガウス曲線形態を示し、多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ ｖａｌｕｅ、Ｍｗ／Ｍｎ）で物質の同質性の程度を表す。すなわち、ＰＥＧが低い分子量（３～５ｋＤａ）のときは、約１．０１の多分散指数を示し、高分子量（２０ｋＤａ）の場合は、約１．２という高い多分散指数を示し、高い分子量であるほど物質の同質性が比較的低い特徴を示す。従って、ＰＥＧを医薬品に結合させた場合、接合体にＰＥＧの多分散的特徴が反映されて単一物質の検証が容易ではないという欠点があるので、ＰＥＧの合成及び精製過程の改善を通じて低い多分散指数を有する物質を生産する傾向である。しかしながら、特に分子量の小さい物質にＰＥＧを結合させた場合、結合が容易になされたか確認が容易でない不便な点があるなど、物質の多分散性の特徴による問題点が存在する。
【0014】
したがって、近年では、既存の自己組織化ナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡＴＭ 技術の改良された形態として、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭを構成する二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の親水性物質を一定の分子量を有する均一な１～１５個の単量体と必要に応じてリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含む基本単位をブロック化し、それを必要に応じて適切な数を使用することにより、既存のＳＡＭｉＲＮＡＴＭに比べてより小さいサイズを持ち、また多分散性が劇的に改善された新しい形態の伝達体技術が開発された。さらに、体内にｓｉＲＮＡを注入した場合、血液中に存在する様々な酵素によってｓｉＲＮＡが急速に分解されて、標的細胞や組織などへの伝達効率が悪いことが既に知られているように、改良されたＳＡＭｉＲＮＡＴＭでも標的遺伝子に応じて安定性及び発現阻害率の偏差が示された。したがって、本発明者らは、改良された自己組織化ナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡＴＭを用いて標的遺伝子をより安定かつ効果的に発現阻害するために、ガイドであるセンス鎖はＡＳＯであるＤＮＡ配列を、パッセンジャーであるアンチセンス鎖はＲＮＡ配列を用いて、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド形態の二本鎖オリゴヌクレオチドを適用することにより、標的遺伝子に対する発現阻害効果及び安定性を増強しようとした。
一方、肥満は世界的に重要な健康問題であり、心臓疾患、第２型糖尿病、特定の癌などの多くの合併症がその増加要因となることがある。
一方、肥満は世界的に重要な健康問題であり、心臓疾患、第２型糖尿病、特定の癌などの多くの合併症がその増加要因となることがある。
【0015】
肥満の主な要因の１つは、体内に内臓脂肪が過度に積み重ねられるためである［Ｃａｒｒ ＤＢ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２００４ Ａｕｇ；５３（８）：２０８７－９４； Ｂｏｕｃｈａｒｄ Ｃ，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ Ｒｅｌａｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｏｒｄ １９９６；２０：４２０－７］。内臓脂肪は体内臓器を取り囲んでいる脂肪をいい、内臓脂肪は主に遺伝的要因［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｂ、Ｐａｎｍｉｎｅｒｖａ Ｍｅｄ ２００５；４７：２２９－４４］、人種、物理的活動、生活習慣及び炎症因子［Ｄｅｕｒｅｎｂｅｒｇ Ｐ，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ Ｒｅｌａｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｏｒｄ １９９８；２２：１１６４－７１］などによって発生する。さらに、人種に応じてアジア人の場合、内臓脂肪の蓄積の程度がひどく［ＷＨＯ Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ．Ｌａｎｃｅｔ ２００４；３６３：１５７－６３； Ｈｕ ＦＢ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００１；３４５：７９０－７］、過食又は飲酒、身体活動が少なく［Ｗａｎｎａｍｅｔｈｅｅ ＳＧ，Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００３；７７：１３１２－７； Ｋｏｍｉｙａ Ｈ，Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００６；２０８：１２３－３２］、喫煙するほど内臓脂肪を増やすことが知られている［Ｕｐａｄｈｙａｙａ Ｓ，Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ、２０１４；３（１）：３９－４５］。このような内臓脂肪が蓄積すると、内臓脂肪細胞から分泌されるインターロイキン－６や腫瘍壊死因子－アルファ及び単核球化学誘引物質タンパク質－１などと炎症反応物質が増加して、様々な合併症の原因となる［Ｄｅｓｐｒｅｓ ＪＰ．Ａｎｎ Ｍｅｄ ２００１；３３：５３４－４１］。
【0016】
内臓脂肪は代謝異常と心血管疾患を引き起こす［Ｍａｔｓｕｚａｗａ Ｙ，Ｏｂｅｓ Ｒｅｓ １９９５；３ Ｓｕｐｐｌ ５：６４５－７］。内臓脂肪が多く蓄積するほどインスリン抵抗性が高くなり、また皮下脂肪より多い場合、心臓機能に対する部分が減少し、高血圧及び循環系疾患が発生する［Ｓｃｈａｆｆｌｅｒ，Ｎａｔ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ００５；２：２７３－８０］。さらに、内臓脂肪は消化器関連疾患を引き起こすが、脂肪肝及び非アルコール性脂肪肝炎の要因として知られている［Ｂｕｓｅｔｔｏ Ｌ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ Ｍｅｔａｂ ２００５；７：３０１－６］。このような要因は、アディポネクチンは低くなりつつ抗炎症機序が減少し、肝臓に脂肪肝の形成が促進されて、非アルコール性脂肪肝が発生することになる。さらに、呼吸器系疾患においても、内臓脂肪は多くの問題を引き起こす［Ｓｃｈａｐｉｒａ ＤＶ、Ｃａｎｃｅｒ １９９４；７４：６３２－９］。皮下脂肪より内臓脂肪が多いほど、呼気予備量が低くて、制限性肺換気障害が発生すると見られる。また、内臓脂肪は乳癌発生率を増加させると知られている。さらに、前立腺癌［Ｈｓｉｎｇ ＡＷ、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ２００１；９３：７８３－９］及び大腸癌［Ｍａｎｓｏｎ ＪＥ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９５；３３３：６７７－８５］の発生増加と関連があることが知られている。
【0017】
内臓脂肪の治療は、主にダイエットの制限、身体運動及び薬物療法で行われますが、その効果はまだ限られた状況である［Ｄｉａｍａｎｔｉｓ Ｔ，Ｓｕｒｇ Ｏｂｅｓ Ｒｅｌａｔ Ｄｉｓ，２０１４； １０（１）：１７７－８３； Ｋｅｌｌｅｙ ＧＡ，Ｊ Ｏｂｅｓ，２０１３； ２０１３７８３１０３； Ｒｈｉｎｅｓ ＳＤ，Ｓ Ｄ Ｍｅｄ， ２０１３； ６６（１１）：４７１， ７３； Ｓｈａｒｍａ Ｍ，Ａｄｏｌｅｓｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｍｅｄ Ｔｈｅｒ，２０１０； １９－１９］。したがって、内臓脂肪を減らすと、心血管疾患、代謝疾患、糖尿病及び他の疾患の発生を減らして合併症を予防することができ、生活の質を改善することができる。
【0018】
本発明者らは、内臓脂肪の減少による肥満治療の研究を進めていたが、アンフィレギュリンを特異的に阻害するアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む構造体を用いる場合、糖尿病動物モデルで皮下脂肪を含む内臓脂肪を有意に減少させることができることを確認した。
【0019】
さらに、本発明者らは、高脂肪食餌誘導による肥満動物モデルにおいて副精巣脂肪におけるアンフィレギュリン発現量が著しく増加することを確認し、当該肥満動物モデルにおいて本発明によるアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む構造体を用いてアンフィレギュリン発現量を減少させる場合、体重、皮下脂肪、内臓脂肪の重量を著しく減少させ、脂肪組織の細胞サイズの増加を抑制することができ、脂肪組織におけるアンフィレギュリン発現量を減少させ、肝臓での脂肪蓄積を抑制する効能の発揮を確認することにより、アンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む構造体の抗肥満用途に対する本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0020】
本発明の目的は、新規な肥満治療又は予防用の医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0021】
前記目的を達成するために、本発明は、
（ｉ）配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）と、それに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）下記の構造式１の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
前記構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカー媒介共有結合を意味し、Ｒは前記（ｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを意味；並びに
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；からなる群から選択されるいずれかを含むことを特徴とする肥満の予防又は治療用医薬組成物を提供する。
（ｉ）配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）と、それに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）下記の構造式１の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；からなる群から選択されるいずれかを含むことを特徴とする肥満の予防又は治療用医薬組成物を提供する。
【0022】
さらに、本発明は、前記医薬組成物を含む凍結乾燥形態の製剤を提供する。
本発明は、また、肥満の予防又は治療を必要とする対象に
（ｉ）配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）と、それに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）下記の構造式１の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
前記構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカー媒介共有結合を意味し、Ｒは前記（ｉ）のアンフィレギュリン特異的な二重鎖オリゴヌクレオチドを意味；及び
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；からなる群から選択されるいずれかを投与する段階を含む肥満の予防又は治療方法を提供する。
本発明は、また、肥満の予防又は治療を必要とする対象に
（ｉ）配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）と、それに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）下記の構造式１の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；からなる群から選択されるいずれかを投与する段階を含む肥満の予防又は治療方法を提供する。
【0023】
さらに、本発明は、肥満の予防又は治療方法に使用するために
（ｉ）配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）と、それに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とをアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）下記の構造式１の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
前記構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカー媒介共有結合を意味し、Ｒは前記（ｉ）のアンフィレギュリン特異的な二重鎖オリゴヌクレオチドを意味；及び
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする医薬組成物を提供する。
（ｉ）配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）と、それに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とをアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）下記の構造式１の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする医薬組成物を提供する。
【0024】
さらに、本発明は、肥満の予防又は治療のための薬物の製造のために
（ｉ）配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）と、それに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）下記の構造式１の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
前記構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカー媒介共有結合を意味し、Ｒは前記（ｉ）のアンフィレギュリン特異的な二重鎖オリゴヌクレオチドを意味；及び
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；からなる群から選択されるいずれかの用途を提供する。
（ｉ）配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）と、それに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）下記の構造式１の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；からなる群から選択されるいずれかの用途を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】ヒトアンフィレギュリンを標的とする１，２５７個のＳＡＭｉＲＮＡスクリーニングの結果を示す。
【図2】選別されたアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのナノ粒子のサイズ分布を示し、ここで、（ａ）はＳＡＭｉ－ＡＲＥＧ＃１０、（ｂ）はＳＡＭｉ－ＡＲＥＧ＃１１、（ｃ）はＳＡＭｉ－ＡＲＥＧ＃１２である。
【図3】実施例４のアンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示したものであり、本発明の配列番号１～１４の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを濃度を異にして（２００又は６００ｎＭ）肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、アンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。
【図4】実施例５のアンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示したものであり、本発明の配列番号１０の配列をセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを濃度を異にして（１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、６００ｎＭ又は１２００ｎＭ）肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、（ａ）アンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を分析して（ｂ）ＳＡＭｉＲＮＡのＩＣ５０値を確認したグラフである。
【図5】実施例５のアンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示したものであり、本発明の配列番号１１の配列をセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを濃度を異にして（１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、６００ｎＭ又は１２００ｎＭ）肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、（ａ）アンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を分析して（ｂ）ＳＡＭｉＲＮＡのＩＣ５０値を確認したグラフである。
【図6】実施例５のアンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示したものであり、本発明の配列番号１２の配列をセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを濃度を異にして（１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、６００ｎＭ又は１２００ｎＭ）肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、（ａ）アンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を分析して（ｂ）ＳＡＭｉＲＮＡのＩＣ５０値を確認したグラフである。
【図7】実施例６のアンフィレギュリン候補配列に対する内在免疫反応実験（Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｅｓｔ）分析結果を示したものであり、本発明の配列番号１０（ＡＲ－１）、１１（ＡＲ－２）、１２（ＡＲ－３）をセンス鎖として有するアンフィレギュリンＳＡＭｉＲＮＡ ２．５μＭをそれぞれヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）に処理し、アンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡによる内在免疫関連サイトカインのｍＲＮＡの相対的な増加量を分析して、ヒト末梢血液単核細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を評価したグラフであり、ここで、（ａ）はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドＳＡＭｉＲＮＡ、（ｂ）はＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドＳＡＭｉＲＮＡである。
【図8】実施例７のアンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示すものであり、選別されたアンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡを含む二本鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドによるアンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を比較した分析結果であって、本発明の配列番号１０（ＡＲ－１）、１１（ＡＲ－２）、１２（ＡＲ－３）の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを濃度を異にして（２００ｎＭ、６００ｎＭ又は１２００ｎＭ）肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、アンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を比較して示すグラフである。
【図9】マウスアンフィレギュリンを標的とする２３７個のＳＡＭｉＲＮＡスクリーニングの結果及びそのうち、選別された９個の候補配列の効果を示す。
【図10A】実施例８のマウスアンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示したものであって、本発明の配列番号１９、２０、２１の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを濃度を異にして（２００又は５００ｎＭ）Ｍｏｕｓｅ ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ細胞株であるＭＬｇに処理し、アンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。
【図10B】実施例８のマウスアンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示したものであって、本発明の配列番号１９、２０、２１の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを濃度を異にして（２００、５００又は１０００ｎＭ）Ｍｏｕｓｅ Ｌｕｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ細胞株であるＬＡ－４に処理し、アンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。
【図11】本発明によるマウス動物モデル実験において対照群と実験群の体重変化を示したグラフである。
【図12】本発明によるマウス動物モデル実験において対照群と実験群の飼料摂取量の変化を示したグラフである。
【図13】本発明によるマウス動物モデル実験において対照群と実験群の飲み水摂取量の変化を示したグラフである。
【図14】本発明によるマウス動物モデル実験において対照群と実験群の皮下脂肪比率を示した結果である。
【図15】本発明によるマウス動物モデル実験において対照群と実験群の内臓脂肪比率を示した結果である。
【図16】本発明によるマウス動物モデル実験において本発明による構造体の内臓脂肪減少効果を示した写真である。
【図17】本発明によるマウス動物モデル実験において対照群と実験群の犠牲前の８週目の全血で空腹時血糖値を示した結果である。
【図18】本発明によるマウス動物モデル実験において対照群と実験群の犠牲前の８週目の血清中のグルコース数値を示した結果である。
【図19】本発明による高脂肪食餌肥満マウスモデル実験において高脂肪飼料を１２週間給餌した後、対照群と実験群を犠牲にして副精巣脂肪におけるアンフィレギュリン発現量を確認したグラフである。
【図20】本発明による高脂肪食餌肥満マウスモデル実験において対照群と実験群の体重変化を示してグラフである。
【図21a】本発明による高脂肪食餌肥満マウスモデル実験において対照群と実験群の飼料摂取量の平均を示したグラフである。
【図21b】本発明による高脂肪食餌肥満マウスモデル実験において対照群と実験群の飲み水摂取量の平均を示したグラフである。
【図22】本発明による高脂肪食餌肥満マウスモデル実験において対照群と実験群の食餌効率（Ｆｏｏｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒａｔｉｏ（％））を示したグラフである。
【図23a】本発明による高脂肪食餌肥満マウスモデル実験において対照群と実験群の皮下脂肪（ＳＦＰ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆａｔ ｐａｄ）、副精巣脂肪（ＥＦＰ：ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ ｐａｄ）、腎臓周辺脂肪（ＰＦＰ：Ｐｅｒｉｒｅｎａｌ ｆａｔ ｐａｄ）、腸間膜脂肪（ＭＦＰ：ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｆａｔ ｐａｄ）の重量を示した結果である。
【図23b】本発明による高脂肪食餌肥満マウスモデル実験において対照群と実験群の皮下脂肪（ＳＦＰ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆａｔ ｐａｄ）、副精巣脂肪（ＥＦＰ：ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ ｐａｄ）、腎臓周辺脂肪（ＰＦＰ：Ｐｅｒｉｒｅｎａｌ ｆａｔ ｐａｄ）、腸間膜脂肪（ＭＦＰ：ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｆａｔ ｐａｄ）の重量を体重で割ったｒａｔｉｏ（％）を示した結果である。
【図24a】本発明による高脂肪食餌肥満マウスモデル実験において対照群と実験群の皮下脂肪重量及び内臓脂肪重量を示した結果である。
【図24b】本発明による高脂肪食餌肥満マウスモデル実験において対照群と実験群におけるマウス全重量に対する各々の皮下脂肪比率及び内臓脂肪比率を示した結果である。
【図25】本発明による高脂肪食餌肥満マウスモデル実験において対照群と実験群の皮下脂肪及び内臓脂肪の減少効果を比較したＭｉｃｒｏ－ＣＴ写真と体積で示したグラフである。
【図26】本発明による高脂肪食餌肥満マウスモデル実験において対照群と実験群の皮下脂肪（ＳＦＰ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆａｔ ｐａｄ）、副精巣脂肪（ＥＦＰ：ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ ｐａｄ）、腎臓周辺脂肪（ＰＦＰ：ｐｅｒｉｒｅｎａｌ ｆａｔ ｐａｄ ）、腸間膜脂肪（ＭＦＰ：ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｆａｔ ｐａｄ）減少効果を比較した組織写真と脂肪細胞のサイズを示したグラフである。
【図27a】本発明による高脂肪食餌肥満マウスモデル実験において対照群と実験群の肝組織において脂肪蓄積の減少効果を比較した写真である。
【図27b】本発明による高脂肪食餌肥満マウスモデル実験において対照群と実験群の肝組織において脂肪蓄積の減少効果を比較した定量グラフである。
【図28】本発明による高脂肪食餌肥満マウスモデル実験において対照群と実験群の皮下脂肪（ＳＦＰ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆａｔ ｐａｄ）、副精巣脂肪（ＥＦＰ：ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ ｐａｄ）、腎臓周辺脂肪（ＰＦＰ：ｐｅｒｉｒｅｎａｌ ｆａｔ ｐａｄ ）におけるアンフィレギュリンのｍＲＮＡレベル減少効果を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0026】
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野で熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法は、当技術分野で周知であり、通常使用されるものである。
【0027】
本発明では、第２型糖尿動物モデルを用いてアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を投与する場合、皮下脂肪と内臓脂肪が著しく減少する効果を確認して、当該物質を肥満の治療又は予防用組成物として使用できることを確認した。
【0028】
さらに、本発明では、肥満誘導動物モデルにアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を投与する場合、体重の減少、食餌効率の低下、皮下脂肪の減少、内臓脂肪の減少、脂肪細胞面積の減少、肝脂肪生成の抑制効果が発揮されることを確認した。
【0029】
したがって、本発明は、一つの観点から、
（ｉ）配列番号１～１４からなる群、好ましくは、配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）と、それに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）下記の構造式１の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
前記構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカー媒介共有結合を意味し、Ｒは前記（ｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを意味；及び
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする肥満の予防又は治療用医薬組成物に関する。
（ｉ）配列番号１～１４からなる群、好ましくは、配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）と、それに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）下記の構造式１の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする肥満の予防又は治療用医薬組成物に関する。
【0030】
本発明に従って提供される好ましい二本鎖オリゴヌクレオチドに含まれる配列番号１０、１１及び１２の配列は以下の通りである。
５’－ＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＴ－３’（配列番号１０）
５’－ＡＣＣＴＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧ－３’（配列番号１１）
５’－ＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＡＡＣＣＡＴＴ－３’（配列番号１２）
５’－ＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＴ－３’（配列番号１０）
５’－ＡＣＣＴＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧ－３’（配列番号１１）
５’－ＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＡＡＣＣＡＴＴ－３’（配列番号１２）
【0031】
本発明による二本鎖オリゴヌクレオチドは、一般的なＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）作用を有する全ての物質を含む概念であって、前記アンフィレギュリンタンパク質をコード化するｍＲＮＡ特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドには、アンフィレギュリン特異的なｓｈＲＮＡなども含むことは、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者には明らかである。すなわち、前記オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであることを特徴とすることができる。
【0032】
さらに、アンフィレギュリンに対する特異性が維持される限り、前記配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖又はこれに相補的なアンチセンス鎖において、１つ以上の塩基が置換、欠失又は挿入された配列を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むアンフィレギュリン特異的なｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドも本発明の権利範囲に含まれるものであることは、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者には明らかである。
【0033】
本発明において、前記センス又はアンチセンス鎖は独立してＤＮＡ又はＲＮＡであることを特徴とすることができ、また、センス鎖はＤＮＡ、アンチセンス鎖はＲＮＡであるか、センス鎖はＲＮＡ、アンチセンス鎖はＤＮＡであるハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）形態を使用することができる。
【0034】
本発明において、前記配列番号１０、１１及び１２はＤＮＡ形態として記載されているが、ＲＮＡ形態が用いられる場合、配列番号１０、１１及び１２の配列はこれに対応するＲＮＡ配列、すなわち、ＴがＵに変更された配列を使用することができる。
【0035】
さらに、本発明による二本鎖オリゴヌクレオチドは、アンフィレギュリンに対する特異性が維持される限り、配列のセンス鎖がアンフィレギュリン遺伝子の結合部位と１００％相補的な塩基配列である場合、すなわち、完全一致（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）するものだけでなく、一部の塩基配列が一致しない場合、すなわち、不完全一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）するものも含む。
【0036】
本発明による二本鎖オリゴヌクレオチドは、一方又は両方の鎖の３’末端に１つ又は複数の非結合（ｕｎｐａｉｒｅｄ）ヌクレオチドを含む構造であるオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を含み得る。
【0037】
本発明において、前記センス鎖又はアンチセンス鎖は、好ましくは、１９～３１個のヌクレオチドから構成されることを特徴とすることができるが、これに限定されない。
【0038】
本発明において、配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖とを含む二本鎖オリゴヌクレオチドは、アンフィレギュリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）に特異的であることを特徴とすることができるが、これに限定されない。
【0039】
本発明において、前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖は、生体内安定性を向上させるために、又は核酸分解酵素耐性の付与及び非特異的な免疫反応の低減のために、様々な化学的修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むことを特徴とすることができ、化学的修飾はヌクレオチド内の糖（ｓｕｇａｒ）構造の２’炭素位置で水酸化基（－ＯＨ）がメチル基（－ＣＨ３）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、アミン基（－ＮＨ２）、フッ素（－Ｆ）、Ｏ－２－メトキシエチル基、Ｏ－プロピル基、Ｏ－２－メチルチオエチル基、Ｏ－３－アミノプロピル基、Ｏ－３－ジメチルアミノプロピル基、Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド基及びＯ－ジメチルアミドオキシエチルからなる群から選択されるいずれかに置換される修飾；ヌクレオチド内の糖構造の酸素が硫黄に置換される修飾；ヌクレオチド結合がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）結合、ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合及びメチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合からなる群から選択されるいずれかの結合となる修飾；及びＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）及びＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）形態への修飾；ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド形態への修飾；からなる群から選択されるいずれか１つ以上であることを特徴とすることができるが（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５５，６１－６５ ２００４； ＵＳ ５，６６０，９８５； ＵＳ ５，９５８，６９１； ＵＳ ６，５３１，５８４； ＵＳ ５，８０８，０２３； ＵＳ ６，３２６，３５８； ＵＳ ６，１７５，００１； Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：１１３９－１１４３，２００３； ＲＮＡ，９：１０３４－１０４８，２００３； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３１：５８９－５９５，２００３； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８（１７）５７６１－７７３、２０１０； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９（５）：１８２３－１８３２，２０１１）、これに限定されない。
【0040】
本発明において、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の５’末端に１つ以上のリン酸基（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）が結合していることを特徴とすることができ、好ましくは、１～３個のリン酸基が結合していることを特徴とすることができる。
【0041】
本発明は、他の観点から、下記の構造式（１）の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体に関し、下記の構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカー媒介共有結合を意味し、Ｒは二本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
【0042】
好ましい一具体例として、本発明によるアンフィレギュリン特異的な配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、構造式（１）のような構造を有することが好ましい。
Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１）
前記構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカー媒介共有結合を意味し、Ｒはアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１）
前記構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカー媒介共有結合を意味し、Ｒはアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
【0043】
本発明による二本鎖オリゴヌクレオチドの形態としては、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）及びｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）などが好ましいが、これらに限定されるものではなく、ｍｉＲＮＡに対する拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）役割を果たすことができる一本鎖のｍｉＲＮＡ阻害剤も含まれる。
【0044】
以下、本発明による二本鎖オリゴヌクレオチドはＲＮＡを中心に説明するが、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドと同じ特性を有する他の二本鎖オリゴヌクレオチドにも適用可能なのは当業界の通常の技術者にとって明らかである。
【0045】
より好ましくは、本発明によるアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記の構造式（２）の構造を有する。
Ａ－Ｘ－Ｓ－Ｙ－Ｂ
ＡＳ 構造式（２）
Ａ－Ｘ－Ｓ－Ｙ－Ｂ
ＡＳ 構造式（２）
【0046】
前記構造式（２）において、Ａ、Ｂ、Ｘ及びＹは前記構造式（１）における定義と同一であり、Ｓはアンフィレギュリン特異的なヌクレオチド配列のセンス鎖、ＡＳはアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖を意味する。
【0047】
より好ましくは、アンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記の構造式（３）又は（４）の構造を有する。
【0048】
構造式（３）及び構造式（４）において、Ａ、Ｂ、Ｓ、ＡＳ、Ｘ及びＹは、前記構造式（２）における定義と同じであり、５’及び３’は、アンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドセンス鎖の５’末端及び３’末端を意味する。
【0049】
前記親水性物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンからなる群から選択されることを特徴とすることができるが、これらに限定されない。
【0050】
前記構造式（１）～構造式（４）における前記アンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、アンチセンス鎖の５’末端にリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）が１～３個結合することができ、ＲＮＡの代わりにｓｈＲＮＡを使用できることは、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者にとっては明らかである。
【0051】
前記構造式（１）～構造式（４）における親水性物質は、分子量が２００～１０，０００の高分子物質であることが好ましく、より好ましくは、１，０００～２，０００の高分子物質である。例えば、親水性高分子材料としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリンなどの非イオン性親水性高分子化合物を用いることが好ましいが、必ずしもこれに限定されることではない。
【0052】
特に、構造式（１）～構造式（４）における親水性物質（Ａ）は、下記の構造式（５）又は構造式（６）のような形態の親水性物質ブロック（ｂｌｏｃｋ）の形態として用いることができるが、このような親水性物質ブロックを必要に応じて適切な数（構造式（５）又は構造式（６）におけるｎ）を用いることにより、一般合成高分子物質などを用いる場合に発生し得る多分散性による問題点を著しく改善することができる。
（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ 構造式（５）
（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ 構造式（６）
（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ 構造式（５）
（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ 構造式（６）
【0053】
前記構造式（５）において、Ａ’は親水性物質単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）、Ｊはｍ個の親水性物質単量体間又はｍ個の親水性物質単量体とオリゴヌクレオチドとを連結するリンカー、ｍは１～１５の整数、ｎは１～１０の整数を意味し、（Ａ’ｍ－Ｊ）又は（Ｊ－Ａ’ｍ）で表される繰り返し単位が親水性物質ブロックの基本単位に相当する。
【0054】
前記構造式（５）又は構造式（６）のような親水性物質ブロックを有する場合、本発明によるアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記の構造式（７）又は構造式（８）のような構造を有することができる。
（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（７）
（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（８）
（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（７）
（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（８）
【0055】
前記構造式（７）及び構造式（８）において、Ｘ、Ｒ、Ｙ及びＢは構造式（１）における定義と同じであり、Ａ’、Ｊ、ｍ及びｎは構造式（５）及び構造式（６）における定義と同じである。
【0056】
前記構造式（５）及び構造式（６）において、親水性物質単量体（Ａ’）は、非イオン性親水性高分子の単量体のうち、本発明の目的に適合するものであれば制限なく使用が可能であり、好ましくは、表１に記載の化合物（１）～化合物（３）から選択される単量体、より好ましくは、化合物（１）の単量体を使用することができ、化合物（１）において、Ｇは、好ましくは、Ｏ、Ｓ及びＮＨから選択されることができる。
【0057】
特に、親水性物質単量体のうち、特に、化合物（１）で表される単量体は様々な機能基を導入することができ、生体内の親和性が良く免疫反応を少なく誘導するなど生体適合性（ｂｉｏ－ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）に優れるだけでなく、構造式（７）又は構造式（８）による構造体内に含まれる二本鎖オリゴヌクレオチドの生体内の安定性を高め、送達効率を向上させ得るという利点があり、本発明による構造体の製造に非常に適している。
【0058】
＜表１＞
本発明における親水性物質単量体の構造
本発明における親水性物質単量体の構造
【0059】
前記構造式（５）～（８）における親水性物質は、総分子量が１，０００～２，０００の範囲内であることが特に好ましい。したがって、例えば、構造式（７）及び構造式（８）において、化合物（１）によるヘキサエチレングリコール（Ｈｅｘａｅｔｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、すなわち、ＧがＯであり、ｍが６である物質が使用される場合、ヘキサエチレングリコールスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）の分子量が３４４であるため、繰り返し回数（ｎ）は３～５であることが好ましい。特に、本発明は、必要に応じて、前記構造式（５）及び構造式（６）において、（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ又は（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎで表される親水性グループの繰り返し単位、すなわち、親水性物質ブロックがｎで表される適切な数として使用され得ることを特徴とする。前記各親水性物質ブロック内に含まれる親水性物質単量体ＡとリンカーＪは独立して各親水性物質ブロック間で同じであっても異なっていてもよい。すなわち、三つの親水性物質ブロックが使用される場合（ｎ＝３）、第１のブロックには化合物（１）による親水性物質単量体、第２のブロックには化合物（２）による親水性物質単量体、第３のブロックには化合物（３）による親水性物質単量体を使用するなど、全ての親水性物質ブロックごとに異なる親水性物質単量体を使用することができ、全ての親水性物質ブロックに化合物（１）～化合物（３）による親水性物質単量体から選択されたいずれかの親水性物質単量体を同様に使用することができる。同様に、親水性物質単量体の結合を媒介するリンカーも、各親水性物質ブロックごとに同じリンカーを使用することができ、各親水性物質ブロックごとに異なるリンカーを使用することもできる。さらに、親水性物質単量体の数ｍも、各親水性物質ブロック間で同じであっても異なっていてもよい。すなわち、第１の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が３個連結（ｍ＝３）され、第２の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が５個（ｍ＝５）、第３の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が４個連結（ｍ＝４）されるなど、相異なる数の親水性物質単量体が使用されてもよく、全ての親水性物質ブロックにおいて同じ数の親水性物質単量体が使用されてもよい。
【0060】
さらに、本発明において、前記リンカー（Ｊ）は、－ＰＯ３
－－、－ＳＯ３－及び－ＣＯ２－からなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されることではなく、使用される親水性物質の単量体などによって本発明の目的に適合する限り、いずれのリンカーも使用できることは通常の技術者にとっては明らかである。
【0061】
前記構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）における疎水性物質（Ｂ）は、疎水性相互作用を通じて構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）による二本鎖オリゴヌクレオチド構造体からなるナノ粒子を形成する役割を果たす。前記疎水性物質は分子量が２５０～１，０００であることが好ましく、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体、グリセリド（ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）誘導体、グリセロールエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、Ｃ１２～Ｃ５０の不飽和又は飽和炭化水素（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、リポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）などが使用され得るが、これらに限定されず、本発明の目的に適合するものなら、いかなる疎水性物質も使用可能であることは、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者にとっては明らかである。
【0062】
前記ステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コレスタニルホルマート及びコレスタニルアミンからなる群から選択されることができ、前記グリセリド誘導体はモノ－、ジ－及びトリ－グリセリドなどから選択され得る。この場合、グリセリドの脂肪酸は、Ｃ１２～Ｃ５０の不飽和又は飽和脂肪酸が好ましい。
【0063】
特に、前記疎水性物質のうち、飽和又は不飽和炭化水素やコレステロールが本発明による二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の合成段階で容易に結合できる利点を有するという点で好ましく、Ｃ２４炭化水素、特に、ジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を含む形態が最も好ましい。
前記疎水性物質は親水性物質の反対側の末端（ｄｉｓｔａｌ ｅｎｄ）に結合し、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれの位置に結合してもよい。
前記疎水性物質は親水性物質の反対側の末端（ｄｉｓｔａｌ ｅｎｄ）に結合し、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれの位置に結合してもよい。
【0064】
本発明による構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）における親水性物質又は疎水性物質とアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドは、単純共有結合又はリンカー媒介共有結合（Ｘ又はＹ）によって結合される。前記共有結合を媒介するリンカーは、親水性物質又は疎水性物質とアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドの末端で共有結合し、必要に応じて、特定の環境で分解可能な結合を提供する限り、特に限定されない。したがって、前記リンカーは、本発明による二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の製造過程において、アンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド及び／又は親水性物質（又は疎水性物質）を活性化するために結合するいかなる化合物も使用することができる。前記共有結合は、非分解性結合又は分解性結合のいずれであっても構わない。このとき、非分解性結合としてはアミド結合又はリン酸化結合があり、分解性結合としては二硫化結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合又は酵素分解性結合などがあるが、これらに限定されるものではない。
【0065】
さらに、前記構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）におけるＲ（又はＳ及びＡＳ）で表されるアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドは、アンフィレギュリンのｍＲＮＡと特異的に結合可能な特性を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであれば、いずれも制限なく使用可能である。好ましくは、本発明では、配列番号１０、１１及び１２から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖からなる。
【0066】
本発明は、また、本発明によるアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体において、前記構造体内の親水性物質のオリゴヌクレオチドと結合した反対側の末端部位にアミン基又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）グループをさらに導入することができる。
【0067】
これは、本発明によるアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の送達体の細胞内導入とエンドソームの脱出を容易にするためのことであり、既にＱｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ、Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ、ｌｉｐｏｓｏｍｅなどの送達体の細胞内導入とエンドソームの脱出を容易にするためにアミングループの導入とポリヒスチジングループを利用できるという点及びその効果が報告されている。
【0068】
具体的には、伝達体の末端又は外側に修飾された一次アミン基は、生体内ｐＨで陽子化しながら、負電荷を示す遺伝子と静電気的相互作用によって結合体を形成し、細胞内流入後にエンドソームの低いｐＨで緩衝効果を有する内部３級アミンによりエンドソームの脱出が容易になるにつれて、リソソームの分解から伝達体を保護できることが知られており（高分子ベースのハイブリッド物質を用いた遺伝子送達及び発現抑制、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．， Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３，ｐｐ２５４－２５９）、非必須アミノ酸の一つであるヒスチジンは、残基（－Ｒ）にイミダゾリン（ｐＫａ３ ６．０４）を有するので、エンドソームとリソソームで緩衝能力（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）を増加させる効果があり、リポソームをはじめとする非ウイルス性遺伝子伝達体からのエンドソームの脱出効率を高めるためにヒスチジン修飾を利用できることが知られている（Ｎｏｖｅｌ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １１８，ｐｐ２６２－２７０）。
【0069】
前記アミン基又はポリヒスチジングループは、１つ以上のリンカーを通じて親水性物質又は親水性物質ブロックと連結することができる。
本発明の構造式（１）による二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の親水性物質にアミン基又はポリヒスチジングループが導入される場合には、構造式（９）のような構造を有することができる。
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（９）
本発明の構造式（１）による二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の親水性物質にアミン基又はポリヒスチジングループが導入される場合には、構造式（９）のような構造を有することができる。
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（９）
【0070】
前記構造式（９）において、Ａ、Ｂ、Ｒ、Ｘ及びＹは、構造式（１）における定義と同じであり、Ｐはアミン基又はポリヒスチジングループを意味し、Ｊ１及びＪ２はリンカーであり、Ｊ１及びＪ２は独立して単純共有結合、ＰＯ３
－、ＳＯ３、ＣＯ２、Ｃ２－１２アルキル、アルケニル、アルキニルから選択されることができるが、これらに限定されず、使用される親水性物質に応じて、本発明の目的に適合するＪ１及びＪ２はいかなるリンカーでも使用できることは、通常の当業者にとっては明らかである。
【0071】
好ましくは、アミン基が導入された場合、Ｊ２は単純共有結合又はＰＯ３
－、Ｊ１はＣ６アルキルであることが好ましいが、これらに限定されない。
さらに、ポリヒスチジングループが導入された場合には、構造式（９）において、Ｊ２は単純共有結合又はＰＯ３ －、Ｊ１は化合物（４）が好ましいが、これに限定されない。
化合物（４）
さらに、ポリヒスチジングループが導入された場合には、構造式（９）において、Ｊ２は単純共有結合又はＰＯ３ －、Ｊ１は化合物（４）が好ましいが、これに限定されない。
【0072】
また、構造式（９）による二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の親水性物質が構造式（５）又は構造式（６）による親水性物質ブロックであり、これにアミン基又はポリヒスチジングループが導入される場合には、構造式（１０）又は構造式（１１）のような構造を有することができる。
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１０）
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１１）
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１０）
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１１）
【0073】
前記構造式（１０）及び構造式（１１）において、Ｘ、Ｒ、Ｙ、Ｂ、Ａ’、Ｊ、ｍ及びｎは構造式（５）又は構造式（６）における定義と同じであり、Ｐ、Ｊ１及びＪ２は構造式（９）における定義と同じである。
【0074】
特に、前記構造式（１０）及び構造式（１１）において、親水性物質は、アンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドセンス鎖の３’末端に結合した形態であることが好ましく、この場合、前記構造式（９）～構造式（１１）は、次の構造式（１２）～構造式（１４）の形態を有することができる。
【0075】
前記構造式（１２）～構造式（１４）において、Ｘ、Ｒ、Ｙ、Ｂ、Ａ、Ａ’、Ｊ、ｍ、ｎ、Ｐ、Ｊ１及びＪ２は前記構造式（９）～構造式（１１）における定義と同じであり、５’及び３’はアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドセンス鎖の５’末端及び３’末端を意味する。
【0076】
本発明で導入することができるアミン基としては、 第１級～第３級のアミン基を用いることができ、第１級のアミン基を用いることが特に好ましい。前記導入されたアミン基はアミン塩として存在することもできる。例えば、第１級のアミン基の塩はＮＨ３
＋の形態として存在することができる。
【0077】
また、本発明で導入することができるポリヒスチジングループは、３～１０個のヒスチジンを含むことが好ましく、特に好ましくは、５～８個、最も好ましくは、６個のヒスチジンを含むことができる。さらに、ヒスチジンに加えて、１つ以上のシステインを含めることができる。
【0078】
一方、本発明によるアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体及びこれから形成されたナノ粒子にターゲティング部分が設けられると、効率的に標的細胞への伝達を促進して、比較的低い濃度の投与量でも標的細胞に送達されて、高い標的遺伝子発現調節機能を示すことができ、他臓器及び細胞への非特異的なアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドの送達を防止することができる。
【0079】
これにより、本発明は、前記構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）による構造体にリガンド（Ｌ）、特に、受容体媒介内包作用（ＲＭＥ：ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｉｄｅａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を通じて標的細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増強する受容体と特異的に結合する特性を有するリガンド（ｌｉｇａｎｄ）が付加的に結合された二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を提供し、例えば、構造式（１）による二本鎖オリゴＲＮＡ構造体にリガンドが結合した形態は、次の構造式（１５）のような構造を有する。
（Ｌｉ－Ｚ）－Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１５）
（Ｌｉ－Ｚ）－Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１５）
【0080】
前記構造式（１５）において、Ａ、Ｂ、Ｘ及びＹは前記構造式（１）における定義と同じであり、Ｌは受容体媒介内包作用（ＲＥＭ）を通じて標的細胞内在化を増強する受容体に特異的に結合する特性を有するリガンドを意味し、ｉは１～５の整数、好ましくは、１～３の整数である。
【0081】
前記構造式（１５）におけるリガンドは、好ましくは、標的細胞特異的に細胞内在化を増強するＲＭＥ特性を有する標的受容体特異的抗体、アプタマー、ペプチド；又は葉酸（Ｆｏｌａｔｅ、一般にｆｏｌａｔｅとｆｏｌｉｃ ａｃｉｄは交互に使用されており、本発明における葉酸は自然状態又は人体で活性化状態であるｆｏｌａｔｅを意味する）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＮＡＧ：Ｎ－ａｃｅｔｙｌ Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）などのヘキソアミン（ｈｅｘｏａｍｉｎｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）のような糖や炭水化物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）などの化学物質などから選択することができるが、これに限定されない。
【0082】
さらに、前記構造式（１５）における親水性物質Ａは、構造式（５）及び構造式（６）による親水性物質ブロックの形態として用いることができる。
本発明の他の態様として、本発明は、アンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する方法を提供する。
本発明の他の態様として、本発明は、アンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する方法を提供する。
【0083】
本発明によるアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の製造方法は、例えば、
（１）固形支持体（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）を基にして親水性物質を結合する段階；
（２）前記親水性物質が結合した固形支持体を基にしてオリゴヌクレオチド一本鎖を合成する段階；
（３）前記オリゴヌクレオチド一本鎖５’末端に疎水性物質を共有結合させる段階；
（４）前記オリゴヌクレオチド一本鎖の配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチド一本鎖を合成する段階；
（５）合成が完了したら、固形支持体からオリゴヌクレオチド－高分子構造体及びオリゴヌクレオチド一本鎖を分離精製する段階；及び
（６）製造されたオリゴヌクレオチド－高分子構造体と相補的な配列のオリゴヌクレオチド一本鎖のアニーリングを通じて二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する段階；を含んでなることができる。
（１）固形支持体（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）を基にして親水性物質を結合する段階；
（２）前記親水性物質が結合した固形支持体を基にしてオリゴヌクレオチド一本鎖を合成する段階；
（３）前記オリゴヌクレオチド一本鎖５’末端に疎水性物質を共有結合させる段階；
（４）前記オリゴヌクレオチド一本鎖の配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチド一本鎖を合成する段階；
（５）合成が完了したら、固形支持体からオリゴヌクレオチド－高分子構造体及びオリゴヌクレオチド一本鎖を分離精製する段階；及び
（６）製造されたオリゴヌクレオチド－高分子構造体と相補的な配列のオリゴヌクレオチド一本鎖のアニーリングを通じて二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する段階；を含んでなることができる。
【0084】
本発明における固形支持体は、ＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）が好ましいが、これに限定されるものではなく、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）シリカゲル、セルロースペーパーなどを用いることができる。ＣＰＧの場合、直径は４０～１８０μｍであることが好ましく、５００～３０００Aの空隙のサイズを有することが好ましい。前記段階（５）以降、製造が完了すると、精製されたＲＮＡ－高分子構造体及びオリゴヌクレオチド一本鎖は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析機で分子量を測定して、所望のオリゴヌクレオチド－高分子構造体及びオリゴヌクレオチド一本鎖が製造されたかを確認することができる。前記製造方法において、（２）段階で合成されたオリゴヌクレオチド一本鎖の配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチド一本鎖を合成する段階（４）は、（１）段階前又は（１）段階～（５）段階のうちいずれの過程で行われても構わない。
【0085】
さらに、（２）段階で合成されたオリゴヌクレオチド一本鎖と相補的配列を含むオリゴヌクレオチド一本鎖は、５’末端にリン酸基が結合した形態として用いられたことを特徴とする製造方法も可能である。
【0086】
一方、本発明のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体にさらにリガンドが結合した二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の製造方法を提供する。
【0087】
リガンドが結合したアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する方法は、例えば、
（１）官能基が結合している固形支持体に親水性物質を結合させる段階；
（２）官能基－親水性物質が結合している固形支持体に基づいてオリゴヌクレオチド一本鎖を合成する段階；
（３）前記オリゴヌクレオチド一本鎖の５’末端に疎水性物質を共有結合させる過程により合成する段階；
（４）前記オリゴヌクレオチド一本鎖の配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチド一本鎖を合成する段階；
（５）合成が完了したら、固形支持体から官能基－オリゴヌクレオチド－高分子構造及び相補的配列のオリゴヌクレオチド一本鎖を分離する段階；
（６）前記官能基を用いて親水性物質末端にリガンドを結合して、リガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体一本鎖を製造する段階；及び
（７）製造されたリガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体と相補的な配列のオリゴヌクレオチド一本鎖のアニーリングにより、リガンド－二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する段階；を含んでなることができる。
（１）官能基が結合している固形支持体に親水性物質を結合させる段階；
（２）官能基－親水性物質が結合している固形支持体に基づいてオリゴヌクレオチド一本鎖を合成する段階；
（３）前記オリゴヌクレオチド一本鎖の５’末端に疎水性物質を共有結合させる過程により合成する段階；
（４）前記オリゴヌクレオチド一本鎖の配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチド一本鎖を合成する段階；
（５）合成が完了したら、固形支持体から官能基－オリゴヌクレオチド－高分子構造及び相補的配列のオリゴヌクレオチド一本鎖を分離する段階；
（６）前記官能基を用いて親水性物質末端にリガンドを結合して、リガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体一本鎖を製造する段階；及び
（７）製造されたリガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体と相補的な配列のオリゴヌクレオチド一本鎖のアニーリングにより、リガンド－二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する段階；を含んでなることができる。
【0088】
前記（６）段階以後、製造が完了したら、リガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体及び相補的な配列のオリゴヌクレオチド一本鎖を分離精製した後、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析機で分子量を測定して所望のリガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体及び相補的なオリゴヌクレオチドが製造されたかを確認することができる。製造されたリガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体と相補的な配列のオリゴヌクレオチド一本鎖のアニーリングにより、リガンド－二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造することができる。前記製造方法において、（３）段階で合成されたオリゴヌクレオチド一本鎖の配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチド一本鎖を合成する段階（４）は独立した合成過程であって、（１）段階前又は（１）段階～（６）段階のうちいずれの過程で行われても構わない。
【0089】
本発明は、さらに他の観点から、本発明による二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子に関する。本発明による二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の場合、疎水性物質の疎水性相互作用により自己組織化ナノ粒子を形成するが（韓国登録特許公報第１２２４８２８号）、このようなナノ粒子は体内への伝達効率及び体内における安定性が極めて優れるだけでなく、粒径の均一性に優れてＱＣ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ）が容易なので、薬物としての製造工程が簡単である。
【0090】
本発明において、前記ナノ粒子は、異なる配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の混合物で構成されることを特徴とすることができる。例えば、前記ナノ粒子は配列番号１０～１２から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖とを含む一種のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含むことができるが、さらに他の態様として、配列番号１０～１２から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖とを含む異なる種類のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを一緒に含み得、本発明に開示されていないアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドも一緒に含むことができる。
【0091】
本発明の組成物は、投与のために前記記載の有効成分に加えてさらに薬学的に許容可能な担体を一種以上含むことによって製造されることができる。薬学的に許容可能な担体は、本発明の有効成分と適合性がなければならず、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち１つ又は２つ以上の成分を混合して使用することができ、必要に応じて、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。さらに、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を追加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形に製剤化することができる。特に、凍結乾燥された形態の剤形に製剤化して提供することが好ましい。凍結乾燥剤形の製造のために、本発明が属する技術分野で通常知られている方法を使用することができ、凍結乾燥のための安定化剤を添加することができる。また、当技術分野の適当な方法で又はレミントン薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されている方法を使用して、各疾患又は成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【0092】
本発明の組成物は、通常の患者の症状及び疾患の重症度に基づいて、当技術分野の通常の専門家によって決定され得る。さらに、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などの様々な形態として製剤化することができ、単位投与量又は多投与量容器、例えば、密封アンプル及びボトルなどとして提供することができる。
【0093】
本発明の組成物は、経口又は非経口投与が可能である。本発明による組成物の投与経路はこれらに限定されないが、例えば、口腔、吸入用、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下又は局所投与が可能である。本発明による組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、方法、排泄率又は疾患の重症度等に応じてその範囲が多様であり、本技術分野の通常の専門家が容易に決めることができる。さらに、臨床投与のために公知の技術を用いて、本発明の組成物を適切な剤形に製剤化することができる。
【0094】
本発明は、他の観点から、本発明による医薬組成物を含む凍結乾燥形態の剤形に関する。
本発明は、さらに他の観点から、肥満の予防又は治療を必要とする対象に
（ｉ）配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）下記の構造式１の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
前記構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカー媒介共有結合を意味し、Ｒは前記（ｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを意味；及び
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；からなる群から選択されるいずれかを投与する段階を含む肥満の予防又は治療方法に関する。
本発明は、さらに他の観点から、肥満の予防又は治療を必要とする対象に
（ｉ）配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）下記の構造式１の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；からなる群から選択されるいずれかを投与する段階を含む肥満の予防又は治療方法に関する。
【0095】
本発明は、さらに他の観点から、肥満の予防又は治療方法に使用するために
（ｉ）配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）下記の構造式１の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
前記構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカー媒介共有結合を意味し、Ｒは前記（ｉ）のアンフィレギュリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを意味；及び
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする医薬組成物に関する。
（ｉ）配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）下記の構造式１の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする医薬組成物に関する。
【0096】
本発明は、さらに他の観点から、
（ｉ）配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）下記の構造式１の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
前記構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカー媒介共有結合を意味し、Ｒは前記（ｉ）のアンフィレギュリン特異的な二重鎖オリゴヌクレオチドを意味；及び
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；からなる群から選択されるいずれかの肥満の予防又は治療のための薬物の製造のための用途に関する。
（ｉ）配列番号１０、１１及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）下記の構造式１の構造を含むアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
［構造式（１）］
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；からなる群から選択されるいずれかの肥満の予防又は治療のための薬物の製造のための用途に関する。
【0097】
本発明において、前記肥満は糖尿病による内臓脂肪型肥満であることを特徴とすることができるが、これに限定されない。
【0098】
本発明において、本発明によるアンフィレギュリン特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、次のいずれか１つ以上の効果を発揮することを特徴とすることができるが、これらに限定されない：
（ｉ）体重の減少；
（ｉｉ）食餌効率の低下；
（ｉｉｉ）皮下脂肪の減少；
（ｉｖ）内臓脂肪の減少；
（ｖ）脂肪細胞面積の減少；及び
（ｖｉ）肝脂肪生成の抑制。
（ｉ）体重の減少；
（ｉｉ）食餌効率の低下；
（ｉｉｉ）皮下脂肪の減少；
（ｉｖ）内臓脂肪の減少；
（ｖ）脂肪細胞面積の減少；及び
（ｖｉ）肝脂肪生成の抑制。
【0099】
本発明において、前記効果は脂肪組織内のアンフィレギュリン発現を抑制して発揮されることを特徴とすることができるが、前記効果が発揮されるメカニズムはこれに限定されない。
【0100】
以下、実施例により本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは当技術分野で通常の知識を有する者にとって明らかである。
【0101】
本発明においては、アンフィレギュリンの発現を阻害し得る３つの特異的な配列を同定し、これらがアンフィレギュリンを暗号化するｍＲＮＡと相補的に結合してアンフィレギュリンの発現を効果的に抑制することにより、肥満関連疾患を効果的に治療できることを確認した。
【実施例】
【0102】
実施例１．アンフィレギュリンを標的とするＳＡＭｉＲＮＡスクリーニングのためのアルゴリズムと候補配列の選定
ＳＡＭｉＲＮＡベースの治療剤の高速大量処理スリーニング（ＳＡＭｉＲＮＡ ｂａｓｅｄ ｄｒｕｇ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）は、ｍＲＮＡ全体に対して１－塩基（１－ｂａｓｅ）又は２－塩基（２－ｂａｓｅ）スライディングウィンドウアルゴリズムを適用して可能な全ての候補配列を生成し、相同性フィルタリング（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）を進行して不要な候補配列を除去し、最終的に選別された全てのＳＡＭｉＲＮＡについて該当遺伝子発現阻害程度を確認する方法である。
ＳＡＭｉＲＮＡベースの治療剤の高速大量処理スリーニング（ＳＡＭｉＲＮＡ ｂａｓｅｄ ｄｒｕｇ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）は、ｍＲＮＡ全体に対して１－塩基（１－ｂａｓｅ）又は２－塩基（２－ｂａｓｅ）スライディングウィンドウアルゴリズムを適用して可能な全ての候補配列を生成し、相同性フィルタリング（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）を進行して不要な候補配列を除去し、最終的に選別された全てのＳＡＭｉＲＮＡについて該当遺伝子発現阻害程度を確認する方法である。
【0103】
まず、アンフィレギュリンに対するＳＡＭｉＲＮＡ候補配列の設計過程は、ヒトアンフィレギュリンｍＲＮＡであるＮＭ＿００１６５７．３（１２９０ｂｐ）に対して１－塩基スライディングウィンドウアルゴリズム（２－ｂａｓｅ ｓｌｉｄｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を適用して１９個の塩基からなる１，２５７個のＳＡＭｉＲＮＡ候補配列を最終選別してアンフィレギュリン阻害程度の実験を行った。
【0104】
実施例２．二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の合成
本発明で製造された二本鎖オリゴＲＮＡ構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ）は、下記の構造式のような構造を有する。
Ｃ２４－５’Ｓ ３’－（ヘキサエチレングリコール－ＰＯ４ －）３－ヘキサエチレングリコール
ＡＳ ５’－ＰＯ４
本発明で製造された二本鎖オリゴＲＮＡ構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ）は、下記の構造式のような構造を有する。
Ｃ２４－５’Ｓ ３’－（ヘキサエチレングリコール－ＰＯ４ －）３－ヘキサエチレングリコール
ＡＳ ５’－ＰＯ４
【0105】
ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝４）二本鎖オリゴ構造体のセンス鎖は、３，４，６－トリアセチル－１－ヘキサ（エチレングリコール）－Ｎ－アセチルガラクトサミン－シフィジ（３，４，６－ｔｒｉａｃｅｔｙｌ－１－Ｈｅｘａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）－Ｎ－Ａｃｅｔｙｌ Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ－ＣＰＧ）を支持体として、親水性物質単量体であるＤＭＴヘキサエチレングリコールホスホアミダイト（Ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）３つを前記反応を通じて連続的に結合した後、ＲＮＡ又はＤＮＡ合成を進行させた後、さらに５’末端部位に疎水性物質である二硫化結合を含むＣ２４（Ｃ６－Ｓ－Ｓ－Ｃ１８）を結合させて、３’末端にＮＡＧ－ヘキサエチレングリコール－（－ＰＯ３－ヘキサエチレングリコール）３が結合しており、５’末端にＣ２４（Ｃ６－Ｓ－Ｓ－Ｃ１８）が結合しているｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝４）のセンス鎖を作成した。
【0106】
合成が完了したら、６０℃の温湯器（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で２８％（ｖ／ｖ）アンモニアを処理して合成されたＲＮＡ一本鎖及びオリゴ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）－高分子構造体をＣＰＧから取り出した後、脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）反応によって保護残基を除去した。保護残基が除去されたＲＮＡ一本鎖及びオリゴ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）－高分子構造体は、７０℃のオーブンでＮ－メチルピロリドン（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎ）、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）及びトリエチルアミントリヒドロフルオリド（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ ｔｒｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅ）を体積比１０：３：４の割合で処理して、２’ＴＢＤＭＳ（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）を除去した。前記反応物から高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）でＲＮＡ一本鎖、オリゴ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）－高分子構造体及びリガンドが結合したオリゴ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）－高分子構造体を分離し、これをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析器（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ－ＭＳ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ、日本）で分子量を測定して、合成しようとする塩基配列及びオリゴ－高分子構造体と適合するかを確認した。その後、各々の二本鎖オリゴ構造体を製造するためにセンス鎖とアンチセンス鎖を同量混合して１Ｘ アニーリングバッファー（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ カリウムアセテート（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、２ｍＭ マグネシウムアセテート（ｐＨ７．０～７．５）に入れ、９０℃の恒温水槽で３分間反応させた後、再び３７℃で反応させて、所望のＳＡＭｉＲＮＡを製造した。製造された二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は電気泳動によってアニーリングを確認した。
【0107】
実施例３．ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレギュリンを標的としてＲＮＡｉを誘導するＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の高速大量スクリーニング（ＨＴＳ）
【0108】
３．１ ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の製造
実施例２で合成したアンフィレギュリン配列を標的とする１，２５７種のＳＡＭｉＲＮＡを１ＸＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＤＰＢＳ）（ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）に溶かして、凍結乾燥機（ＬＧＪ－１００Ｆ、ＣＮ）で５日間凍結乾燥した。凍結乾燥されたナノ粒子粉末を脱塩蒸留水（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）１．４２９ｍｌに溶かして均質化して本発明のための実験に使用した。
実施例２で合成したアンフィレギュリン配列を標的とする１，２５７種のＳＡＭｉＲＮＡを１ＸＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＤＰＢＳ）（ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）に溶かして、凍結乾燥機（ＬＧＪ－１００Ｆ、ＣＮ）で５日間凍結乾燥した。凍結乾燥されたナノ粒子粉末を脱塩蒸留水（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）１．４２９ｍｌに溶かして均質化して本発明のための実験に使用した。
【0109】
３．２ ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の細胞内処理方法
アンフィレギュリンの発現を抑制するＳＡＭｉＲＮＡの発掘のために、ヒト由来肺癌細胞株であるＡ５４９（ＡＴＣＣ(R) ＣＣＬ－１８５ＴＭ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）を用い、Ａ５４９細胞株は１０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）及び１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）を含むＧｉｂｃｏＴＭ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳ）を用いて３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。前記と同じ培地を用いてＡ５４９細胞株を９６－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳ）に２Ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分株し、翌日前記実施例３．１で脱塩蒸留水で均質化したＳＡＭｉＲＮＡを１Ｘ ＤＰＢＳで希釈して細胞に対して５００ｎＭ又は１０００ｎＭとなるように処理した。ＳＡＭｉＲＮＡの処理は、１２時間毎に１回ずつ処理する条件で合計４回処理し、３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。
アンフィレギュリンの発現を抑制するＳＡＭｉＲＮＡの発掘のために、ヒト由来肺癌細胞株であるＡ５４９（ＡＴＣＣ(R) ＣＣＬ－１８５ＴＭ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）を用い、Ａ５４９細胞株は１０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）及び１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）を含むＧｉｂｃｏＴＭ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳ）を用いて３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。前記と同じ培地を用いてＡ５４９細胞株を９６－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳ）に２Ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分株し、翌日前記実施例３．１で脱塩蒸留水で均質化したＳＡＭｉＲＮＡを１Ｘ ＤＰＢＳで希釈して細胞に対して５００ｎＭ又は１０００ｎＭとなるように処理した。ＳＡＭｉＲＮＡの処理は、１２時間毎に１回ずつ処理する条件で合計４回処理し、３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。
【0110】
３．３ ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレギュリンｍＲＮＡ発現抑制効能分析によるＳＡＭｉＲＮＡスクリーニング
実施例３－２でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲを用いてアンフィレギュリン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
実施例３－２でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲを用いてアンフィレギュリン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
【0111】
アンフィレギュリン遺伝子のｍＲＮＡ発現量分析のために、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ （登録商標）Ｄｕａｌ－ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲＴ－ｑＰＣＲキット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）の各ウェルにＡＲＥＧ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ３００ｎＭ、ＡＲＥＧ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ３００ｎＭ、ＡＲＥＧ ｐｒｏｂｅ ３００ｎＭ、ＲＰＬ１３Ａ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ３００ｎＭ、ＲＰＬ１３Ａ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ３００ｎＭ、ＲＰＬ１３Ａ ｐｒｏｂｅ ３００ｎＭ、ＴＢＰ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ４００ｎＭ、ＴＢＰ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ４００ｎＭ、ＴＢＰ ｐｒｏｂｅ ３００ｎＭが添加されて乾燥製造された（表２、高速大量スクリーニング（ＨＴＳ：Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）実験に使用されたｐｒｉｍｅｒ及びｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｂｅ配列）。製造されたキットの性能は、Ａ５４９ ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いて検量曲線を作成して、ＰＣＲ増幅効率（表３）で判定した。ＲＴ－ｑＰＣＲは、９５℃、５ｍｉｎ（９５℃、５ｓｅｃ、５８℃、１５ｓｅｃ）×４５サイクルで反応を行い、各サイクルごとに蛍光値が検出されるプロトコルを用いた。
【0112】
ＳＡＭｉＲＮＡ処理された９６－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳ）に対して、全ＲＮＡ抽出からＲＴ－ｑＰＣＲまで、自動化装置であるＥｘｉＳｔａｔｉｏｎTM ＨＴ ＫｏｒｅａにＨＴ ＤＮＡ／ＲＮＡ抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）とアンフィレギュリン分析のためのｐｒｉｍｅｒ及びｐｒｏｂｅを含んで別々に製造されたＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）Ｄｕａｌ－ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲＴ－ｑＰＣＲキット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて自動化プログラムに従って全ＲＮＡ抽出及びｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲが行われた。
【0113】
ｑＰＣＲアレイ（ａｒｒａｙ）後に導出される２つの遺伝子のＣｔ値を２（－Ｄｅｌｔａ Ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ）） Ｍｅｔｈｏｄ［Ｌｉｖａｋ ＫＪ，Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ．２００１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２（－Ｄｅｌｔａ Ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ））Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｄｅｃ；２５（４）：４ ０２－８］を用いて相対定量分析により、対照群対比実験群であるアンフィレギュリンｍＲＮＡの相対量（％）を計算した。
【0114】
＜表２＞
高速大量スクリーニング（ＨＴＳ）実験に使用したｐｒｉｍｅｒ及びｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｂｅ配列
高速大量スクリーニング（ＨＴＳ）実験に使用したｐｒｉｍｅｒ及びｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｂｅ配列
【0115】
＜表３＞
３－ｐｌｅｘ ＲＴ－ｑＰＣＲ増幅効率
３－ｐｌｅｘ ＲＴ－ｑＰＣＲ増幅効率
【0116】
高効率のＳＡＭｉＲＮＡを選別するために、最終濃度５００ｎＭ又は１０００ｎＭの濃度でのアンフィレギュリンｍＲＮＡの発現量が対照群と比較して発現量の減少効率が最も良い配列、すなわち、配列番号１～１４の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡ １４種を選別した。
【0117】
図１に示したように、アンフィレギュリンを標的とする１，２５７種のＳＡＭｉＲＮＡから、アンフィレギュリン遺伝子発現を最も効果的に抑制するＳＡＭｉＲＮＡ １４種を最終選別した。当該ＳＡＭｉＲＮＡの配列情報は下記の表４の通りである。
【0118】
＜表４＞
１－塩基スライディングウインドウスクリーニング（１ ｂａｓｅ ｓｌｉｄｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）及び高速大量スクリーニング（ＨＴＳ）により選別されたアンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡ候補配列
１－塩基スライディングウインドウスクリーニング（１ ｂａｓｅ ｓｌｉｄｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）及び高速大量スクリーニング（ＨＴＳ）により選別されたアンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡ候補配列
【0119】
実施例４．ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレギュリンを標的としてＲＮＡｉを誘導するＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子スクリーニング
実施例３で選別された配列番号１～１４の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを用いて肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、前記細胞株におけるアンフィレギュリンｍＲＮＡの発現様相を分析した。
実施例３で選別された配列番号１～１４の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを用いて肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、前記細胞株におけるアンフィレギュリンｍＲＮＡの発現様相を分析した。
【0120】
４．１ ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の細胞内処理方法
アンフィレギュリンの発現を抑制するＳＡＭｉＲＮＡの発掘のためにヒト由来肺癌細胞株であるＡ５４９を用い、Ａ５４９細胞株は１０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）及び１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）を含むＧｉｂｃｏＴＭ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳ）を用いて３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。前記と同じ培地を用いてＡ５４９細胞株を１２－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳ）に８Ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分株し、翌日前記実施例３．１で脱塩蒸留水で均質化したＳＡＭｉＲＮＡを１Ｘ ＤＰＢＳで希釈して細胞に対して２００ｎＭ又は６００ｎＭとなるように処理した。ＳＡＭｉＲＮＡの処理は、１２時間毎に１回ずつ処理する条件で合計４回処理し、３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。
アンフィレギュリンの発現を抑制するＳＡＭｉＲＮＡの発掘のためにヒト由来肺癌細胞株であるＡ５４９を用い、Ａ５４９細胞株は１０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）及び１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）を含むＧｉｂｃｏＴＭ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳ）を用いて３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。前記と同じ培地を用いてＡ５４９細胞株を１２－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳ）に８Ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分株し、翌日前記実施例３．１で脱塩蒸留水で均質化したＳＡＭｉＲＮＡを１Ｘ ＤＰＢＳで希釈して細胞に対して２００ｎＭ又は６００ｎＭとなるように処理した。ＳＡＭｉＲＮＡの処理は、１２時間毎に１回ずつ処理する条件で合計４回処理し、３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。
【0121】
４．２ ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレギュリンｍＲＮＡ発現阻害効能分析によるＳＡＭｉＲＮＡスクリーニング
実施例４－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲを用いてアンフィレギュリン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
実施例４－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲを用いてアンフィレギュリン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
【0122】
４－２－１ ＳＡＭｉＲＮＡ処理細胞からのＲＮＡ分離及びｃＤＮＡの製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、前記実施例４－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡはＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｃｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、以下の方法でｃＤＮＡを製造した。具体的には、０．２５ｍｌのエッペンドルフチューブに収められたＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭＣｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）に１チューブあたり抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れ、総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸留水を加えた。これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭ９６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）で３７℃で３０秒間ＲＮＡとプライマーをハイブリダイズさせ、４８℃で４分間ｃＤＮＡを製造する２つの過程を１２回繰り返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、前記実施例４－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡはＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｃｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、以下の方法でｃＤＮＡを製造した。具体的には、０．２５ｍｌのエッペンドルフチューブに収められたＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭＣｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）に１チューブあたり抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れ、総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸留水を加えた。これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭ９６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）で３７℃で３０秒間ＲＮＡとプライマーをハイブリダイズさせ、４８℃で４分間ｃＤＮＡを製造する２つの過程を１２回繰り返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
【0123】
４－２－２ ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレギュリンｍＲＮＡの相対定量分析
実施例４－２－１で製造されたｃＤＮＡを鋳型として、ＳＹＢＲグリーン方式のリアルタイムｑＰＣＲを通じてＳＡＭｉＲＮＡ制御サンプル対比アンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的発現率を以下の方法で分析した。９６－ウェルプレートの各ウェルに前記実施例４－２－１で製造したｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、アンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量分析のために希釈したｃＤＮＡ ３μｌとＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）２Ｘ ＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭ ｑＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を２５μｌ、蒸留水１９μｌ、アンフィレギュリンｑＰＣＲプライマー（配列番号１７及び１８（表５）；１０ ｐｍｏｌｅ／μｌ、それぞれ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を３μｌ入れて混合液を作製した。一方、アンフィレギュリンｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ、以下、ＨＫ遺伝子という）であるＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を標準遺伝子とした。前記混合液を含む９６－ウェルプレートを、ＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて以下の反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化及びｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃で３０秒間変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒間アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｓｃａｎ）の４つの過程を４２回繰り返し行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃までのメルティングカーブ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析した。
実施例４－２－１で製造されたｃＤＮＡを鋳型として、ＳＹＢＲグリーン方式のリアルタイムｑＰＣＲを通じてＳＡＭｉＲＮＡ制御サンプル対比アンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的発現率を以下の方法で分析した。９６－ウェルプレートの各ウェルに前記実施例４－２－１で製造したｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、アンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量分析のために希釈したｃＤＮＡ ３μｌとＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）２Ｘ ＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭ ｑＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を２５μｌ、蒸留水１９μｌ、アンフィレギュリンｑＰＣＲプライマー（配列番号１７及び１８（表５）；１０ ｐｍｏｌｅ／μｌ、それぞれ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を３μｌ入れて混合液を作製した。一方、アンフィレギュリンｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ、以下、ＨＫ遺伝子という）であるＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を標準遺伝子とした。前記混合液を含む９６－ウェルプレートを、ＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて以下の反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化及びｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃で３０秒間変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒間アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｓｃａｎ）の４つの過程を４２回繰り返し行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃までのメルティングカーブ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析した。
【0124】
ＰＣＲが終了した後、それぞれ得られた標的遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値はＧＡＰＤＨ遺伝子を通じて補正された標的遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現阻害を起こさないコントロール配列であるＳＡＭｉＲＮＡ（ＳＡＭｉＣＯＮＴ）が処理された実験群を対照群としてΔＣｔ値の差を求めた。前記ΔＣｔ値と計算式２（－ΔＣｔ）×１００を用いて、アンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡが処理された細胞の標的遺伝子の発現量を相対定量した。
【0125】
高効率のＳＡＭｉＲＮＡを選別するために、最終濃度２００ｎＭ又は６００ｎＭの濃度でアンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量が対照群対比発現量の減少効率が最も良い配列、すなわち、配列番号１０、１１及び１２の配列をそれぞれセンス鎖として有する３種のＳＡＭｉＲＮＡを選別した。
【0126】
図３に示したように、アンフィレギュリンを標的とする１４種のＳＡＭｉＲＮＡから、アンフィレギュリン遺伝子発現を最も効果的に抑制する３種のＳＡＭｉＲＮＡを最終選別した。当該ＳＡＭｉＲＮＡの配列情報を次の表６に示す。
【0127】
＜表５＞
ｑＰＣＲ用のプライマー配列情報
（Ｆは正方向（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー、Ｒは逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーをそれぞれ意味する）
ｑＰＣＲ用のプライマー配列情報
【0128】
＜表６＞
アンフィレギュリン発現を効果的に抑制するＳＡＭｉＲＮＡ配列
アンフィレギュリン発現を効果的に抑制するＳＡＭｉＲＮＡ配列
【0129】
実施例５．肺癌細胞株（Ａ５４９）から選別されたＳＡＭｉＲＮＡを用いたヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレギュリンの発現抑制
実施例４で選別された配列番号１０、１１及び１２の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを用いて肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、前記細胞株におけるアンフィレギュリンｍＲＮＡの発現態様を分析してＳＡＭｉＲＮＡのＩＣ５０値を確認した。
実施例４で選別された配列番号１０、１１及び１２の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを用いて肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、前記細胞株におけるアンフィレギュリンｍＲＮＡの発現態様を分析してＳＡＭｉＲＮＡのＩＣ５０値を確認した。
【0130】
５．１ ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の製造及び粒度分析
実施例２で合成したアンフィレギュリン配列を標的とする３種のＳＡＭｉＲＮＡを１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＤＰＢＳ）（ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）に溶かして、凍結乾燥機（ＬＧＪ－１００Ｆ、ＣＮ）で５日間凍結乾燥した。凍結乾燥されたナノ粒子粉末を脱塩蒸留水（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）２ｍｌに溶かして均質化して、本発明の実験に使用した。製造されたＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の粒度分析のために、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を用いてＳＡＭｉＲＮＡのサイズ及び多分散指数を測定した結果、選別されたＳＡＭｉＲＮＡに対するナノ粒子のサイズ及び多分散指数は次の表７の通りであり、グラフは図２のように測定された。
実施例２で合成したアンフィレギュリン配列を標的とする３種のＳＡＭｉＲＮＡを１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＤＰＢＳ）（ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）に溶かして、凍結乾燥機（ＬＧＪ－１００Ｆ、ＣＮ）で５日間凍結乾燥した。凍結乾燥されたナノ粒子粉末を脱塩蒸留水（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）２ｍｌに溶かして均質化して、本発明の実験に使用した。製造されたＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の粒度分析のために、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を用いてＳＡＭｉＲＮＡのサイズ及び多分散指数を測定した結果、選別されたＳＡＭｉＲＮＡに対するナノ粒子のサイズ及び多分散指数は次の表７の通りであり、グラフは図２のように測定された。
【0131】
＜表７＞
アンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡのナノ粒子のサイズ及び多分散指数
アンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡのナノ粒子のサイズ及び多分散指数
【0132】
５．２ ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の細胞内処理方法
アンフィレギュリンの発現を抑制する選別されたＳＡＭｉＲＮＡ効果を確認するために、ヒト由来肺癌細胞株Ａ５４９を使用し、Ａ５４９細胞株は、１０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）及び１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）を含むＧｉｂｃｏＴＭ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳ）を用いて３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。前記と同じ培地を用いてＡ５４９細胞株を１２－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳ）に８Ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分株し、翌日前記実施例５．１で脱塩蒸留水で均質化したＳＡＭｉＲＮＡを１Ｘ ＤＰＢＳで希釈して細胞に対して１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、６００ｎＭ、又は１２００ｎＭとなるように処理した。ＳＡＭｉＲＮＡの処理は、１２時間毎に１回ずつ処理する条件で合計４回処理し、３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。
アンフィレギュリンの発現を抑制する選別されたＳＡＭｉＲＮＡ効果を確認するために、ヒト由来肺癌細胞株Ａ５４９を使用し、Ａ５４９細胞株は、１０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）及び１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）を含むＧｉｂｃｏＴＭ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳ）を用いて３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。前記と同じ培地を用いてＡ５４９細胞株を１２－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳ）に８Ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分株し、翌日前記実施例５．１で脱塩蒸留水で均質化したＳＡＭｉＲＮＡを１Ｘ ＤＰＢＳで希釈して細胞に対して１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、６００ｎＭ、又は１２００ｎＭとなるように処理した。ＳＡＭｉＲＮＡの処理は、１２時間毎に１回ずつ処理する条件で合計４回処理し、３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。
【0133】
５．３ ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレギュリンｍＲＮＡ発現抑制効能分析によるＳＡＭｉＲＮＡ ＩＣ５０の確認
実施例５－２でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲを用いてアンフィレギュリン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
実施例５－２でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲを用いてアンフィレギュリン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
【0134】
５－３－１ ＳＡＭｉＲＮＡ処理細胞からのＲＮＡ分離及びｃＤＮＡの製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、前記実施例５－２でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡはＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｃｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、次のような方法でｃＤＮＡを製造した。具体的には、０．２５ｍｌ エッペンドルフチューブに含まれるＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｃｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）に１チューブあたり抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れ、総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理した蒸留水を加えた。これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭ９６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）で３７℃で３０秒間ＲＮＡとプライマーをハイブリダイズさせ、４８℃で４分間ｃＤＮＡを製造する２つの過程を１２回繰り返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、前記実施例５－２でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡはＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｃｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、次のような方法でｃＤＮＡを製造した。具体的には、０．２５ｍｌ エッペンドルフチューブに含まれるＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｃｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）に１チューブあたり抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れ、総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理した蒸留水を加えた。これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭ９６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）で３７℃で３０秒間ＲＮＡとプライマーをハイブリダイズさせ、４８℃で４分間ｃＤＮＡを製造する２つの過程を１２回繰り返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
【0135】
５－３－２ ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレギュリンｍＲＮＡの相対定量分析
実施例５－３－１で製造したｃＤＮＡを鋳型として、ＳＹＢＲグリーン方式のリアルタイムｑＰＣＲを通じてＳＡＭｉＲＮＡ制御サンプル対比アンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的発現率を次の方法で分析した。９６－ウェルプレートの各ウェルに前記実施例５－３－１で製造したｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、アンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量の分析のために希釈されたｃＤＮＡ ３μｌとＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）２Ｘ ＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭ ｑＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を２５μｌ、蒸留水１９μｌ、アンフィレギュリンｑＰＣＲプライマー（配列番号１７及び１８（表５）；１０ ｐｍｏｌｅ／μｌ、それぞれ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を３μｌ入れて混合液を作製した。一方、アンフィレギュリンｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子（ＨＫ遺伝子）であるＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を標準遺伝子とした。前記混合液を含む９６－ウェルプレートを、ＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて以下のような反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化及びｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃で３０秒間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で３０秒間延長、ＳＹＢＲグリーンスキャンの４つの過程を４２回繰り返し行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃までのメルティングカーブを分析した。
実施例５－３－１で製造したｃＤＮＡを鋳型として、ＳＹＢＲグリーン方式のリアルタイムｑＰＣＲを通じてＳＡＭｉＲＮＡ制御サンプル対比アンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的発現率を次の方法で分析した。９６－ウェルプレートの各ウェルに前記実施例５－３－１で製造したｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、アンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量の分析のために希釈されたｃＤＮＡ ３μｌとＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）２Ｘ ＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭ ｑＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を２５μｌ、蒸留水１９μｌ、アンフィレギュリンｑＰＣＲプライマー（配列番号１７及び１８（表５）；１０ ｐｍｏｌｅ／μｌ、それぞれ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を３μｌ入れて混合液を作製した。一方、アンフィレギュリンｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子（ＨＫ遺伝子）であるＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を標準遺伝子とした。前記混合液を含む９６－ウェルプレートを、ＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて以下のような反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化及びｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃で３０秒間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で３０秒間延長、ＳＹＢＲグリーンスキャンの４つの過程を４２回繰り返し行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃までのメルティングカーブを分析した。
【0136】
ＰＣＲが終了した後、それぞれ得られた標的遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値はＧＡＰＤＨ遺伝子を通じて補正された標的遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現阻害を起こさないコントロール配列であるＳＡＭｉＲＮＡ（ＳＡＭｉＣＯＮＴ）が処理された実験群を対照群としてΔＣｔ値の差を求めた。前記ΔＣｔ値と計算式２（－ΔＣｔ）×１００を用いて、アンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡが処理された細胞の標的遺伝子の発現量を相対定量した。
【0137】
その結果、配列番号１０、１１及び１２の配列をそれぞれセンス鎖として有するアンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡは、いずれも１００ｎＭの低濃度でも５０％以上のアンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量の減少を示し、非常に高効率でアンフィレギュリンの発現を阻害する効果を示すことを確認した。各々のＩＣ５０は、配列番号１０の配列をセンス鎖として有するアンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡの場合、図４に示したように、２８．７５ｎＭ、配列番号１１の配列をセンス鎖として有するアンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡの場合。図５に示したように、２６．０４ｎＭ、配列番号１２の配列をセンス鎖として有するアンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡの場合、図６に示したように、１２．０７ｎＭと確認した。特に、配列番号１２の配列をセンス鎖として有するアンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡの場合、図６に示したように、２５ｎＭの低濃度でも５０％以上のアンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量の減少を示して、選別された３種の配列のうち最も効果的にアンフィレギュリン遺伝子の発現を阻害する効果を示すことを確認した。
【0138】
実施例６．ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性評価
ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧによる内在免疫関連サイトカインのｍＲＮＡ増加量を確認するために１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｉｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＨｙｃｌｏｎｅＴＭ）を含むＲＰＭＩ１６４０（ＨｙｃｌｏｎｅＴＭ）培地にｅＰＢＭＣ（登録商標）Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ（ヒト末梢血液単核細胞、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＵＳＡ）を１２－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）ＵＳＡ）に１ウェルあたり５×１０５セルになるように分株した。細胞を安定化させるために３７℃、５％のＣＯ２培養器に１時間培養した後、分株したＰＢＭＣにＳＡＭｉ－ＣＯＮ（ＤＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１０（ＤＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１１（ＤＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１２（ＤＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ＣＯＮ（ＲＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１０（ＲＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１１（ＲＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１２（ＲＮＡ／ＲＮＡ）を２．５μＭとなるようにそれぞれ処理して、６時間３７℃、５％のＣＯ２培養器に培養した。陽性対照群として、２０μｇ／ｍｌのＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を使用した。
ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧによる内在免疫関連サイトカインのｍＲＮＡ増加量を確認するために１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｉｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＨｙｃｌｏｎｅＴＭ）を含むＲＰＭＩ１６４０（ＨｙｃｌｏｎｅＴＭ）培地にｅＰＢＭＣ（登録商標）Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ（ヒト末梢血液単核細胞、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＵＳＡ）を１２－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）ＵＳＡ）に１ウェルあたり５×１０５セルになるように分株した。細胞を安定化させるために３７℃、５％のＣＯ２培養器に１時間培養した後、分株したＰＢＭＣにＳＡＭｉ－ＣＯＮ（ＤＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１０（ＤＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１１（ＤＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１２（ＤＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ＣＯＮ（ＲＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１０（ＲＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１１（ＲＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１２（ＲＮＡ／ＲＮＡ）を２．５μＭとなるようにそれぞれ処理して、６時間３７℃、５％のＣＯ２培養器に培養した。陽性対照群として、２０μｇ／ｍｌのＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を使用した。
【0139】
次いで、全ての細胞を回収して、ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）とＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造社提供プロトコルに従って全ＲＮＡを抽出した。
【0140】
抽出されたＲＮＡ ２００ｎｇとＤｅｉｏｎｉｚｅｄ ｓｔｅｒｉｌｅ ＤＷ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）、そしてＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｃｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を混合して、これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭ９６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて（３７℃ ３０ｓｅｃ、４８℃ ４ｍｉｎ、５５℃ ３０ｓｅｃ）×１２サイクル、９５℃ ５ｍｉｎのような条件で反応して、合計２０μｌのｃＤＮＡを合成した。
【0141】
合成されたｃＤＮＡを、ＲＰＬ１３Ａ、Ｉ Ｌ１Ｂ、ＩＬ６、ＩＦＮＧ、ＴＮＦ、ＩＬ１２Ｂ遺伝子に対するｑＰＣＲプライマーと混合した後、ＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ９６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて９５℃ ５ｍｉｎ，（９５℃ ５ｓｅｃ、５８℃ １５ｓｅｃ）×４５サイクルの条件で増幅した。
【0142】
ｑＰＣＲアレイ後に導出される２つの遺伝子のＣｔ値を２（－Ｄｅｌｔａ Ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ）） Ｍｅｔｈｏｄ［Ｌｉｖａｋ ＫＪ，Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ．２００１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２（－Ｄｅｌｔａ Ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ）） Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｄｅｃ；２５（４）：４０２－８］を介して相対定量分析により、対照群と比較して実験群のｍＲＮＡの相対量（％）を計算した。
【0143】
その結果、図７に示したように、ヒト末梢血単核細胞（ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ：ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）におけるアンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡ＃１０、ＳＡＭｉＲＮＡ＃１１及びＳＡＭｉＲＮＡ＃１２による内在免疫関連サイトカインが発現されないことが確認された。
【0144】
実施例７．選別された配列番号１０、１１及び１２の配列をセンス鎖として含むＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドＳＡＭｉＲＮＡによるヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレギュリンの発現抑制比較分析
実施例４で選別された配列番号１０、１１及び１２の配列をそれぞれセンス鎖として有するアンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡを含む二本鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを用いて肺癌細胞株であるＡ５４９に対して処理し、前記細胞株におけるアンフィレギュリンｍＲＮＡの相対発現量（％）を比較分析した。
実施例４で選別された配列番号１０、１１及び１２の配列をそれぞれセンス鎖として有するアンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡを含む二本鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを用いて肺癌細胞株であるＡ５４９に対して処理し、前記細胞株におけるアンフィレギュリンｍＲＮＡの相対発現量（％）を比較分析した。
【0145】
７．１ ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の細胞内処理方法
アンフィレギュリンの発現を抑制するＳＡＭｉＲＮＡの発掘のためにヒト由来肺癌細胞株であるＡ５４９を用い、Ａ５４９細胞株は１０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）及び１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）を含むＧｉｂｃｏＴＭ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳ）を用いて３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。前記と同じ培地を用いてＡ５４９細胞株を１２－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳ）に８Ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分株し、翌日前記実施例３．１で脱塩蒸留水で均質化したＳＡＭｉＲＮＡを１Ｘ ＤＰＢＳで希釈して細胞に対して２００ｎＭ、６００ｎＭ、又は１２００ｎＭとなるように処理した。ＳＡＭｉＲＮＡの処理は、１２時間毎に１回ずつ処理する条件で合計４回処理し、３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。
アンフィレギュリンの発現を抑制するＳＡＭｉＲＮＡの発掘のためにヒト由来肺癌細胞株であるＡ５４９を用い、Ａ５４９細胞株は１０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）及び１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）を含むＧｉｂｃｏＴＭ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳ）を用いて３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。前記と同じ培地を用いてＡ５４９細胞株を１２－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳ）に８Ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分株し、翌日前記実施例３．１で脱塩蒸留水で均質化したＳＡＭｉＲＮＡを１Ｘ ＤＰＢＳで希釈して細胞に対して２００ｎＭ、６００ｎＭ、又は１２００ｎＭとなるように処理した。ＳＡＭｉＲＮＡの処理は、１２時間毎に１回ずつ処理する条件で合計４回処理し、３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した。
【0146】
７．２ ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレギュリンｍＲＮＡの発現抑制効能分析によるＳＡＭｉＲＮＡスクリーニング
実施例７－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲを用いてアンフィレギュリン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
実施例７－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲを用いてアンフィレギュリン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
【0147】
７－２－１ ＳＡＭｉＲＮＡ処理細胞からのＲＮＡ分離及びｃＤＮＡの製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、前記実施例７－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡはＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｃｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、以下の方法でｃＤＮＡを製造した。具体的には、０．２５ｍｌ エッペンドルフチューブに含まれるＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｃｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）に１チューブあたり抽出した１μｇずつのＲＮＡを入れ、総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸留水を加えた。これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭ９６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）で３７℃で３０秒間ＲＮＡとプライマーをハイブリダイズし、４８℃で４分間ｃＤＮＡを製造する２つの過程を１２回繰り返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化して増幅反応を終了した。
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、前記実施例７－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡはＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｃｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、以下の方法でｃＤＮＡを製造した。具体的には、０．２５ｍｌ エッペンドルフチューブに含まれるＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｃｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）に１チューブあたり抽出した１μｇずつのＲＮＡを入れ、総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸留水を加えた。これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭ９６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）で３７℃で３０秒間ＲＮＡとプライマーをハイブリダイズし、４８℃で４分間ｃＤＮＡを製造する２つの過程を１２回繰り返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化して増幅反応を終了した。
【0148】
７－２－２ ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレギュリンｍＲＮＡの相対定量分析
実施例７－２－１で製造したｃＤＮＡを鋳型として、ＳＹＢＲグリーン方式のリアルタイムｑＰＣＲを通じてＳＡＭｉＲＮＡ制御サンプル対比アンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的発現率を以下の方法で分析した。９６－ウェルプレートの各ウェルに前記実施例７－２－１で製造したｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、アンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量の分析のために希釈したｃＤＮＡ ３μｌとＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）２Ｘ ＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭ ｑＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を２５μｌ、蒸留水１９μｌ、アンフィレギュリンｑＰＣＲプライマー（配列番号１７及び１８（表５）；１０ ｐｍｏｌｅ／μｌ、それぞれ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を３μｌ入れて混合液を作製した。一方、アンフィレギュリンｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子（ＨＫ遺伝子）であるＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を標準遺伝子とした。前記混合液を含む９６－ウェルプレートを、ＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて以下の反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化及びｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃で３０秒間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で３０秒間延長、ＳＹＢＲグリーンスキャンの４つの過程を４２回繰り返し行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃までのメルティングカーブ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析した。
実施例７－２－１で製造したｃＤＮＡを鋳型として、ＳＹＢＲグリーン方式のリアルタイムｑＰＣＲを通じてＳＡＭｉＲＮＡ制御サンプル対比アンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的発現率を以下の方法で分析した。９６－ウェルプレートの各ウェルに前記実施例７－２－１で製造したｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、アンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量の分析のために希釈したｃＤＮＡ ３μｌとＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）２Ｘ ＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭ ｑＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を２５μｌ、蒸留水１９μｌ、アンフィレギュリンｑＰＣＲプライマー（配列番号１７及び１８（表５）；１０ ｐｍｏｌｅ／μｌ、それぞれ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を３μｌ入れて混合液を作製した。一方、アンフィレギュリンｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子（ＨＫ遺伝子）であるＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を標準遺伝子とした。前記混合液を含む９６－ウェルプレートを、ＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて以下の反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化及びｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃で３０秒間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で３０秒間延長、ＳＹＢＲグリーンスキャンの４つの過程を４２回繰り返し行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃までのメルティングカーブ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析した。
【0149】
ＰＣＲが終了した後、それぞれ得られた標的遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値はＧＡＰＤＨ遺伝子を通じて補正された標的遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現の阻害を起こさないコントロール配列であるＳＡＭｉＲＮＡ（ＳＡＭｉＣＯＮＴ）が処理された実験群を対照群としてΔＣｔ値の差を求めた。前記ΔＣｔ値と計算式２（－ΔＣｔ）×１００を用いて、アンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡが処理された細胞の標的遺伝子の発現量を相対定量した。
【0150】
二本鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのうち高効率のＳＡＭｉＲＮＡを選別するために、最終濃度２００ｎＭ、６００ｎＭ、１２００ｎＭの濃度でアンフィレギュリンｍＲＮＡ発現量が対照群に比べて発現量の減少効率が最も良い配列、すなわち、配列番号１２の配列をセンス鎖として有するＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであるＳＡＭｉＲＮＡ（９０％以上の遺伝子発現を抑制）を最終選別した。
【0151】
図８に示したように、選別された３種のアンフィレギュリン特異的なＳＡＭｉＲＮＡを含む二本鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドから、アンフィレギュリン遺伝子の発現を最も効果的に抑制するＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドＳＡＭｉＲＮＡ １２を最終選別した。
【0152】
実施例８．マウス（Ｍｏｕｓｅ）アンフィレギュリンを標的にしてＲＮＡｉを誘導するＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の高速大量スクリーニング（ＨＴＳ）
ｓｉＲＮＡ治療剤の場合、相異なる種（Ｓｔｒａｉｎ）に共に適用可能な最適配列の発掘は困難である。この場合、治療効果を分析する動物モデル（ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｅｓｔ確認）特異的なｓｉＲＮＡ配列（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ； ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉＲＮＡ）を設計して、当該遺伝子の発現阻害による薬学的効能（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ）及び当該遺伝子発現阻害による毒性部分を検証するように米国ＦＤＡガイドラインが存在する（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｏｂｅｒｔ Ｔ．Ｄｏｒｓａｍ Ｐｈ．Ｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ／Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｅｒ，ＦＤＡ／ＣＤＥＲ）。
ｓｉＲＮＡ治療剤の場合、相異なる種（Ｓｔｒａｉｎ）に共に適用可能な最適配列の発掘は困難である。この場合、治療効果を分析する動物モデル（ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｅｓｔ確認）特異的なｓｉＲＮＡ配列（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ； ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉＲＮＡ）を設計して、当該遺伝子の発現阻害による薬学的効能（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ）及び当該遺伝子発現阻害による毒性部分を検証するように米国ＦＤＡガイドラインが存在する（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｏｂｅｒｔ Ｔ．Ｄｏｒｓａｍ Ｐｈ．Ｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ／Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｅｒ，ＦＤＡ／ＣＤＥＲ）。
【0153】
既存のアルゴリズムベースのｓｉＲＮＡ設計プログラム（自社保有のＴｕｒｂｏ－ｓｉ－ｄｅｓｉｇｎｅｒ）を通じて既存発掘したスクリーニングを補完して、ＳＡＭｉＲＮＡベースの配列発掘高速大量スクリーニング（ＳＡＭｉＲＮＡ ｂａｓｅｄ ｓｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を進めた。標的遺伝子全体を対象に１９－ｍｅｒ長のｓｉＲＮＡを１基スライディングウィンドウスキャニングして（前記ヒトアンフィレギュリン標的スクリーニングと同じ方法）可能なマウスアンフィレギュリン遺伝子（ＮＭ＿００９７０４．４）フルトランスクリプト配列を対象に合計１１９０個の候補ｓｉＲＮＡ配列を生成し、相同性フィルタリング（ｂｌａｓｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）を進行して不要な他の遺伝子の発現に影響を及ぼす候補配列を除去して、最終的に選別された２３７種のＳＡＭｉＲＮＡを合成した後、マウス由来ＮＩＨ３Ｔ３細胞株に１０％ ＦＢＳが存在する細胞培養条件で１ｕＭの濃度で処理して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現阻害効果を表８（ｑＰＣＲ用のプライマー配列情報）のプライマーを用いて一次スクリーニングした（図９）。
【0154】
その後、さらなるスクリーニングにより前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞株から選別された２種の配列（配列番号１９及び２０）及び先行マイルストーン研究により発掘した配列番号２１のマウスＳＡＭｉＲＮＡ－アンフィレギュリンについてＭｏｕｓｅ Ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ細胞株であるＭＬｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２０６ＴＭ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）で、１０％ ＦＢＳが存在する細胞培養条件下で２００ｎＭ及び５００ｎＭの処理濃度で処理して、さらなるスクリーニングを行った結果、配列番号２０が最も優れた発現阻害効果を確認した（図１０Ａ）。
【0155】
さらに、 Ｍｏｕｓｅ Ｌｕｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅであるＬＡ－４細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１９６ＴＭ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）に選別された２種の配列（配列番号１９及び２０）及び先行マイルストーン研究により発掘した配列番号２１のマウスＳＡＭｉＲＮＡ－アンフィレギュリンを１０％ ＦＢＳが存在する細胞培養条件で２００ｎＭ、５００ｎＭ及び１０００ｎＭの処理濃度で処理してさらなる発現阻害効果を確認した結果、配列番号２０が最も優れた発現阻害効果を再確認した（図１０Ｂ）。
【0156】
図１０に示したように、マウスアンフィレギュリンを標的とする２３７種のＳＡＭｉＲＮＡから、アンフィレギュリン遺伝子発現を最も効果的に抑制する２種のＳＡＭｉＲＮＡを最終選別した。当該ＳＡＭｉＲＮＡの配列情報は下記の表９の通りである。 。
【0157】
＜表８＞
ｑＰＣＲ用のプライマー配列情報
（Ｆは正方向（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー、Ｒは逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーをそれぞれ意味する）
ｑＰＣＲ用のプライマー配列情報
【0158】
＜表９＞
マウスアンフィレギュリン発現を効果的に抑制するＳＡＭｉＲＮＡ配列
マウスアンフィレギュリン発現を効果的に抑制するＳＡＭｉＲＮＡ配列
【0159】
実施例９．第２型糖尿病モデルを用いた肥満抑制効果の確認
アンフィレギュリン発現阻害剤の肥満抑制効果を確認するために、アンフィレギュリン発現阻害剤として下記配列で表されるセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖とを含むＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ（ＳＡＭｉ－ｍＡＲＥＧ＃２０）を第２型糖尿病モデルに投与して脂肪減少に対する効果を観察した。８週間、薬物を週３回投与した後にマウスを犠牲にした後、様々な指標を観察した。
アンフィレギュリン発現阻害剤の肥満抑制効果を確認するために、アンフィレギュリン発現阻害剤として下記配列で表されるセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖とを含むＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ（ＳＡＭｉ－ｍＡＲＥＧ＃２０）を第２型糖尿病モデルに投与して脂肪減少に対する効果を観察した。８週間、薬物を週３回投与した後にマウスを犠牲にした後、様々な指標を観察した。
【0160】
９－１．動物実験方法
ＢＫＳ．Ｃｇ－ ｍ＋／＋ Ｌｅｐｒｄｂ／（ＫＲＩＢＢ；韓国生命工学研究院）５週齢のマウスの分譲を受けて実験を行った。肥満糖尿群（ｄｂ／ｄｂマウス）を分譲後、３週間馴化後、８週間齧歯類食餌（Ｒｏｄｅｎｔ ｄｉｅｔ、２９１８Ｃ、Ｈａｒｌａｎ、ＵＳＡ）を誘導して、以下の実験条件に従って実験を進行した。比較のために、肥満でない正常対照群（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）５週齢のマウスをＮＡＲＡ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入して実験を進行し、これも３週間の馴化させ、８週間齧歯類の食餌を誘導した。全てのグループは各６匹ずつ分類して実験を進めた。
ＢＫＳ．Ｃｇ－ ｍ＋／＋ Ｌｅｐｒｄｂ／（ＫＲＩＢＢ；韓国生命工学研究院）５週齢のマウスの分譲を受けて実験を行った。肥満糖尿群（ｄｂ／ｄｂマウス）を分譲後、３週間馴化後、８週間齧歯類食餌（Ｒｏｄｅｎｔ ｄｉｅｔ、２９１８Ｃ、Ｈａｒｌａｎ、ＵＳＡ）を誘導して、以下の実験条件に従って実験を進行した。比較のために、肥満でない正常対照群（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）５週齢のマウスをＮＡＲＡ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入して実験を進行し、これも３週間の馴化させ、８週間齧歯類の食餌を誘導した。全てのグループは各６匹ずつ分類して実験を進めた。
【0161】
正常対照群グループにはＰＢＳ（Ｃ－９０１１、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）１００ ｕｌを、肥満糖尿群は３グループに分け、それぞれ、ＰＢＳ １００ｕｌ、ＳＡＭｉＲＮＡ－Ｃｏｎｔ ５ｍｇ／ｋｇ １００ｕｌ、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ ５ｍｇ／ｋｇ １００ｕｌずつ週３回皮下注射方式で投与した。飼育環境温度は２１±２℃、湿度５５±５％、１５～１７／時間、照度１５０～３００ Ｌｕｘ、１２時間周期（点灯 ０６：００、消灯 １８：００）で実験期間中に一定の状態に維持した。８週間、薬物を投与した後、１６時間絶食させて犠牲にした。
【0162】
９－２．体重、飼料、飲み水摂取量の測定
体重、飼料及び飲み水摂取量は、測定ごとに一定時間に測定し、週２回測定した。
体重、飼料及び飲み水摂取量は、測定ごとに一定時間に測定し、週２回測定した。
【0163】
９－２－１．体重の変化
マウスの体重（ｇ）は週２回一定時間ごとに測定した。正常対照群は、時間が経つにつれて徐々に体重が増加する傾向を示し、マウス犠牲時の重量は３２．５±１．６４であった。肥満糖尿群３グループは、ＰＢＳ投与時に平均２８．９±２．３５、ＳＡＭｉＲＮＡ－Ｃｏｎｔ投与時に平均２７．４±３．９３、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ投与時に平均２９．７±４．１２の体重を示した（図１１）。８週に体重を観察したところ、各グループ間で統計的に有意な差は見られなかったが、正常対照マウスと比較したとき、肥満糖尿群マウスの全てのグループで微小に体重減少傾向を示し、肥満糖尿群マウスの各グループ間の体重で統計的に有意な差は認められなかった。
マウスの体重（ｇ）は週２回一定時間ごとに測定した。正常対照群は、時間が経つにつれて徐々に体重が増加する傾向を示し、マウス犠牲時の重量は３２．５±１．６４であった。肥満糖尿群３グループは、ＰＢＳ投与時に平均２８．９±２．３５、ＳＡＭｉＲＮＡ－Ｃｏｎｔ投与時に平均２７．４±３．９３、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ投与時に平均２９．７±４．１２の体重を示した（図１１）。８週に体重を観察したところ、各グループ間で統計的に有意な差は見られなかったが、正常対照マウスと比較したとき、肥満糖尿群マウスの全てのグループで微小に体重減少傾向を示し、肥満糖尿群マウスの各グループ間の体重で統計的に有意な差は認められなかった。
【0164】
９－２－２．飼料及び飲み水摂取量の変化
マウス飼料摂取量の測定の結果、正常対照群は１日平均飼料摂取量が約４ｇであり、肥満糖尿群の全てのグループでは約８ｇの飼料を摂取して、肥満糖尿群のマウスで飼料摂取量が２倍以上増加することが確認された（図１２）。飲み水摂取量も正常対照のマウスでは約５ｍＬ／ｄａｙであるが、肥満糖尿群のマウスでは２０－３５ｍＬ／ｄａｙで摂取量が著しく高かった（図１３）。
マウス飼料摂取量の測定の結果、正常対照群は１日平均飼料摂取量が約４ｇであり、肥満糖尿群の全てのグループでは約８ｇの飼料を摂取して、肥満糖尿群のマウスで飼料摂取量が２倍以上増加することが確認された（図１２）。飲み水摂取量も正常対照のマウスでは約５ｍＬ／ｄａｙであるが、肥満糖尿群のマウスでは２０－３５ｍＬ／ｄａｙで摂取量が著しく高かった（図１３）。
【0165】
９－３．脂肪重量の変化
脂肪の重量測定のために犠牲にされたマウスから皮下脂肪と内臓脂肪を摘出してその重量を測定し、マウス重量に対する脂肪の割合を評価した。
脂肪の重量測定のために犠牲にされたマウスから皮下脂肪と内臓脂肪を摘出してその重量を測定し、マウス重量に対する脂肪の割合を評価した。
【0166】
皮下脂肪の場合、正常対照群のマウスでは１．５６±０．３６、肥満糖尿群のマウスではＰＢＳ投与群は４．３２±０．７３、ＳＡＭｉＲＮＡ－Ｃｏｎｔ投与群は３．６３±１．８０、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ投与群は３．１５±０．５８を示した。これにより、肥満糖尿群のマウスにおける本発明のアンフィレギュリン発現量の減少により、皮下脂肪の重量が有意に減少する効果を確認することができた（図１４）。
【0167】
内臓脂肪の場合、正常対照群のマウスでは１．２８±０．３１、肥満糖尿群のマウスではＰＢＳ投与群は１．９７±０．２５、ＳＡＭｉＲＮＡ－Ｃｏｎｔ投与群は１．５９±０．３８、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ投与群は０．７６±０．１２を示し、特に、肥満糖尿群のマウスで本発明によるアンフィレギュリン発現量の減少により、内臓脂肪の重量が著しく減少する効果が確認できた（図１５及び図１６）。
【0168】
９－４．空腹時血糖の測定及び血清中のグルコース数値の測定
空腹時血糖の測定（ｍｇ／ｄＬ）は、マウス犠牲の１週間前に簡易血糖計（Ａｃｃｕ－ＣｈｅｋＴＭ Ａｃｔｉｖｅ、Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を通じて測定し、ＫＰ＆Ｔ社に依頼して血清中のグルコース数値を測定した。
空腹時血糖の測定（ｍｇ／ｄＬ）は、マウス犠牲の１週間前に簡易血糖計（Ａｃｃｕ－ＣｈｅｋＴＭ Ａｃｔｉｖｅ、Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を通じて測定し、ＫＰ＆Ｔ社に依頼して血清中のグルコース数値を測定した。
【0169】
血液中の血糖の場合、正常対照群のマウスの血糖は１５３．２±１２．０７であり、肥満糖尿群のマウスのうちＰＢＳ投与群は平均５５１．８±５３．７３、ＳＡＭｉＲＮＡ－Ｃｏｎｔ投与群は平均５７７．３±４０．２５、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ投与群は平均５５５．７±４９．１５を示した（図１７）。
【0170】
血清中のグルコース数値（ｍｇ／ｄＬ）は、正常対照群のマウスの場合は１４９．６±２０．４、肥満糖尿群のマウスのうちＰＢＳ投与群は平均６８９．１±１８５．４、ＳＡＭｉＲＮＡ－Ｃｏｎｔ投与群は平均７５５．５±８９．４、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ投与群は平均８７４．３±１１９．４を示した（図１８）。
【0171】
したがって、肥満糖尿群のマウスにおける本発明によるアンフィレギュリン発現量の減少は、糖尿病動物モデルにおける空腹時血糖や血清中のグルコース数値の調節に大きな効果はないことが確認された。
【0172】
実施例１０．高脂肪食餌肥満モデルを用いた肥満抑制効果の確認
アンフィレギュリン発現抑制剤の肥満抑制効果を確認するために、アンフィレギュリン発現抑制剤としてＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ（ＳＡＭｉ－ｍＡＲＥＧ＃２０）を高脂肪飼料食餌誘導肥満モデルに投与して脂肪減少に対する効果を観察した。食餌誘導５週間、薬物を週３回投与した後にマウスを犠牲にした後、様々な指標を観察した。
アンフィレギュリン発現抑制剤の肥満抑制効果を確認するために、アンフィレギュリン発現抑制剤としてＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ（ＳＡＭｉ－ｍＡＲＥＧ＃２０）を高脂肪飼料食餌誘導肥満モデルに投与して脂肪減少に対する効果を観察した。食餌誘導５週間、薬物を週３回投与した後にマウスを犠牲にした後、様々な指標を観察した。
【0173】
１０－１．高脂肪飼料食餌誘導によるアンフィレギュリン発現量の確認
Ｃ５７ＢＬ／６（ＮＡＲＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ）５週齢マウスの分譲を受けて実験を行った。分譲後、１週間馴化後、６０ ｋｃａｌ％ Ｆａｔ ｄｉｅｔ（Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ、Ｉｎｃ．）を６週間誘導させた後、副精巣脂肪を摘出してｍＲＮＡレベルを確認した。
Ｃ５７ＢＬ／６（ＮＡＲＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ）５週齢マウスの分譲を受けて実験を行った。分譲後、１週間馴化後、６０ ｋｃａｌ％ Ｆａｔ ｄｉｅｔ（Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ、Ｉｎｃ．）を６週間誘導させた後、副精巣脂肪を摘出してｍＲＮＡレベルを確認した。
【0174】
脂肪組織におけるＴｏｔａｌ ＲＮＡ抽出は、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ （ＱＩＡＺＥＮ．，ＧＥＲ）とＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＺＥＮ．，ＧＥＲ）の組み合わせで進行した。１００ｍｇの脂肪組織をＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ １ｍｌに入れて均質化した後、室温で５分間培養した。４℃、１２０００ｇで１０分間遠心分離した後、上部のｆａｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒを避けて下部のサンプルを回収した。２００μｌのクロロフォーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を入れてよく混合して３分間室温に置いた後、４℃、１２０００ｇで３０分間遠心分離した。分離された３フェーズ（ｐｈａｓｅｓ）で最も上層を回収した後、Ｌｙｓａｔｅ：７０％ ＥｔＯＨ＝１：１の割合で入れてよく混ぜてからＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ＫｉｔのＲＮｅａｓｙ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに入れる。その後、製造社のプロトコルに従って進行した。抽出されたＲＮＡは、スペクトロフォトメーターを用いて定量及び純度を評価した。
【0175】
＜表９＞
ｑＰＣＲ用のプライマー配列情報
（Ｆは正方向（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー、Ｒは逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーをそれぞれ意味する）
その結果、高脂肪飼料食餌誘導により、アンフィレギュリン発現量が正常対照群に比べて１２倍増加した（図１９）。
ｑＰＣＲ用のプライマー配列情報
その結果、高脂肪飼料食餌誘導により、アンフィレギュリン発現量が正常対照群に比べて１２倍増加した（図１９）。
【0176】
１０－２．動物実験方法
Ｃ５７ＢＬ／６（ＮＡＲＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ）５週齢のマウスを分譲を受けて実験を進行した。分譲後、１週間馴化後、１週間６０ ｋｃａｌ％ Ｆａｔ ｄｉｅｔ（Ｄ１２４９２，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．）を誘導させた後、次の実験条件に従って実験を進行し、比較のために肥満でない正常対照群も同じ条件で齧歯類の食餌（Ｒｏｄｅｎｔ ｄｉｅｔ、２９１８Ｃ、Ｈａｒｌａｎ、ＵＳＡ）を誘導して、以下の実験条件に従って実験を行った。グループは正常対照群（ＮＤ＋ＰＢＳ）と試験物質投与群（ＨＦＤ＋ＳＡＭｉ－ＡＲＥＧ）はそれぞれ６匹ずつ、陰性対照群（ＨＦＤ＋ＰＢＳ）は５匹ずつ分類して実験を進行した。
Ｃ５７ＢＬ／６（ＮＡＲＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ）５週齢のマウスを分譲を受けて実験を進行した。分譲後、１週間馴化後、１週間６０ ｋｃａｌ％ Ｆａｔ ｄｉｅｔ（Ｄ１２４９２，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．）を誘導させた後、次の実験条件に従って実験を進行し、比較のために肥満でない正常対照群も同じ条件で齧歯類の食餌（Ｒｏｄｅｎｔ ｄｉｅｔ、２９１８Ｃ、Ｈａｒｌａｎ、ＵＳＡ）を誘導して、以下の実験条件に従って実験を行った。グループは正常対照群（ＮＤ＋ＰＢＳ）と試験物質投与群（ＨＦＤ＋ＳＡＭｉ－ＡＲＥＧ）はそれぞれ６匹ずつ、陰性対照群（ＨＦＤ＋ＰＢＳ）は５匹ずつ分類して実験を進行した。
【0177】
正常対照群（ＮＤ＋ＰＢＳ）と陰性対照群（ＨＦＤ＋ＰＢＳ）にはＰＢＳ（ＬＢ ００１－０２， ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）１００ ｕｌを、試験物質投与群（ＨＦＤ＋ＳＡＭｉ－ＡＲＥＧ）にはＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ ５ｍｇ／ｋｇ １００ ｕｌずつ週３回皮下注射方式で投与した。飼育環境温度は２１±２℃、湿度５５±５％、１５～１７／時間、照度１５０～３００ Ｌｕｘ、１２時間周期（点灯 ０６：００、消灯 １８：００）で実験期間中に一定の状態に維持した。５週間、薬物を投与した後、１６時間絶食させ、犠牲にした。
【0178】
１０－３．体重、飼料、飲み水摂取量の測定
体重、飼料及び飲み水摂取量は、測定ごとに一定の時間に測定し、週２回測定した。
体重、飼料及び飲み水摂取量は、測定ごとに一定の時間に測定し、週２回測定した。
【0179】
１０－３－１．体重の変化
マウスの体重（ｇ）は週２回一定の時間毎に測定した。陰性対照群は、ＰＢＳ投与時に時間が経つにつれて高脂肪食餌によって体重が増加する傾向を示し、マウス犠牲時の重量は３７．３±１．２０であった。正常対照群にＰＢＳ投与時に平均２６．５７±０．３６、試験物質投与群にＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ投与時に平均３３．２１±１．１６の体重を示した。４週及び５週で体重を観察したところ、陰性対照群に比べて試験物質投与群において統計的に有意な差が観察された。
マウスの体重（ｇ）は週２回一定の時間毎に測定した。陰性対照群は、ＰＢＳ投与時に時間が経つにつれて高脂肪食餌によって体重が増加する傾向を示し、マウス犠牲時の重量は３７．３±１．２０であった。正常対照群にＰＢＳ投与時に平均２６．５７±０．３６、試験物質投与群にＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ投与時に平均３３．２１±１．１６の体重を示した。４週及び５週で体重を観察したところ、陰性対照群に比べて試験物質投与群において統計的に有意な差が観察された。
【0180】
正常対照群のマウスと比較した場合、高脂肪食餌誘導陰性対照群で体重が有意に増加したが、試験物質投与群ではマウスの体重が減少し、統計的に有意な差が観察された（図２０）。
【0181】
１０－３－２．飼料及び飲み水摂取量の変化
マウス飼料摂取量（ｇ）の測定結果、正常対照群は１日平均飼料摂取量が３．６９±０．１５であり、陰性対照群は２．７６±０．０６であり、試験物質投与群では２．５５±０．０８の飼料を摂取して、正常対照群より高脂肪飼料の摂取量が少なく、陰性対照群と試験物質投与群との有意な飼料摂取量の差はなかった（図２１ａ）。
マウス飼料摂取量（ｇ）の測定結果、正常対照群は１日平均飼料摂取量が３．６９±０．１５であり、陰性対照群は２．７６±０．０６であり、試験物質投与群では２．５５±０．０８の飼料を摂取して、正常対照群より高脂肪飼料の摂取量が少なく、陰性対照群と試験物質投与群との有意な飼料摂取量の差はなかった（図２１ａ）。
【0182】
マウス飲み水摂取量（ｍＬ）の測定結果、正常対照群は１日平均飲み水摂取量が３．２７±０．１０であり、陰性対照群は４．００±０．１２であり、試験物質投与群では４．２２±０．２４の飲み水を摂取して、正常対照群より高脂肪食餌マウスの飲み水摂取量が多く、陰性対照群と試験物質投与群との有意な飲み水摂取量の差はなかった（図２１ｂ）。
【0183】
１０－４．食餌効率（ｆｏｏｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒａｔｉｏ（％））
マウスの体重増加量（ｇ／ｄａｙ）を飼料摂取量（ｇ／ｄａｙ）で割って食餌効率を測定した結果、正常対照群は０．０２±０．００１、陰性対照群は０．１２±０．００７、試験物質投与群では０．０８±０．０１１であって、陰性対照群と試験物質投与群の両方において正常対照群に比べて食事効率は増加したが、試験物質投与群は陰性対照群に比べて食餌効率が有意に低く観察された（図２２）。
マウスの体重増加量（ｇ／ｄａｙ）を飼料摂取量（ｇ／ｄａｙ）で割って食餌効率を測定した結果、正常対照群は０．０２±０．００１、陰性対照群は０．１２±０．００７、試験物質投与群では０．０８±０．０１１であって、陰性対照群と試験物質投与群の両方において正常対照群に比べて食事効率は増加したが、試験物質投与群は陰性対照群に比べて食餌効率が有意に低く観察された（図２２）。
【0184】
１０－５．脂肪重量の変化
脂肪の重量測定のために犠牲にされたマウスから皮下脂肪（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆａｔ ｐａｄ）、副精巣脂肪（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ ｐａｄ）、腎臓周辺脂肪（ｐｅｒｉｒｅｎａｌ ｆａｔ ｐａｄ）、腸間膜脂肪（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｆａｔ ｐａｄ）をマウスの犠牲時に摘出してその重量を測定し、マウス重量に対する脂肪重量の割合を評価した。
脂肪の重量測定のために犠牲にされたマウスから皮下脂肪（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆａｔ ｐａｄ）、副精巣脂肪（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ ｐａｄ）、腎臓周辺脂肪（ｐｅｒｉｒｅｎａｌ ｆａｔ ｐａｄ）、腸間膜脂肪（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｆａｔ ｐａｄ）をマウスの犠牲時に摘出してその重量を測定し、マウス重量に対する脂肪重量の割合を評価した。
【0185】
マウス皮下脂肪の重量（ｇ）の場合、正常対照群は０．３８±０．０２、陰性対照群は１．７４±０．１２、試験物質投与群は１．０５±０．１４を示し、副精巣脂肪の重量（ｇ）の場合、正常対照群は０．５２±０．０３、陰性対照群は２．３２±０．０９、試験物質投与群は１．７９±０．１６を示し、腎臓周辺脂肪の重量（ｇ）の場合、正常対照群は０．２０±０．０２、陰性対照群は０．８６±０．０４、試験物質投与群は０．６７±０．０８を示し、腸間膜脂肪の重量（ｇ）の場合、正常対照群は０．２５±０．０１、陰性対照群は０．６６±０．０９、試験物質投与群は０．４５±０．０４を示した（図２３ａ）。
【0186】
マウス皮下脂肪の重量比率（％）の場合、正常対照群は１．３９±０．０８、陰性対照群は４．６５±０．２３、試験物質投与群は３．１１±０．３５を示し、副精巣脂肪の重量比率（％）の場合、正常対照群は１．９１±０．１０、陰性対照群は６．２３±０．０９、試験物質投与群は５．３６±０．２９を示し、腎臓周辺脂肪の重量比率（％）の場合、正常対照群は０．７３±０．０６、陰性対照群は２．３３±０．１３、試験物質投与群は２．０１±０．１７を示し、腸間膜脂肪の重量比率（％）の場合、正常対照群は０．９１±０．０２、陰性対照群は１．７６±０．１９、試験物質投与群は１．３５±０．０７を示した（図２３ｂ）。
【0187】
マウスの脂肪を皮下脂肪（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆａｔ）と内臓脂肪（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ、Ｐｅｒｉｒｅｎａｌ ｆａｔ、ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｆａｔ）に分けて重量（ｇ）及び重量比率（％）を示した。
【0188】
マウス皮下脂肪の場合、重量は正常対照群は０．３８±０．０２、陰性対照群は１．７４±０．１２、試験物質投与群は１．０５±０．１４を示し、重量比率は正常対照群は１．３９±０．０８、陰性対照群は４．６５±０．２３、試験物質投与群は３．１１±０．３５を示した。
【0189】
内臓脂肪の場合、重量は正常対照群は０．９７±０．０６、陰性対照群は３．８５±０．１８、試験物質投与群は２．９２±０．２７を示し、重量比率は正常対照群は３．５６±０．１７、陰性対照群は１０．３４±０．１６、試験物質投与群は８．７３±０．５０を示した。
【0190】
その結果、正常対照群に比べて陰性対照群において皮下脂肪及び内臓脂肪の重量及び重量比率が有意に増加し、試験物質投与群において陰性対照群におけるこのような増加を有意に減少させる効果を確認することができた（図２４ａ及び図２４ｂ）。
【0191】
１０－６．Ｍｉｃｒｏ ＣＴ分析
マウス脂肪のＭｉｃｒｏ－ＣＴ分析（韓国基礎科学支援研究院、光州センター）のために、各グループで体重が中間値を示す動物２匹を選別した。写真撮影後、皮下脂肪及び内臓脂肪の面積をグラフで示した。
マウス脂肪のＭｉｃｒｏ－ＣＴ分析（韓国基礎科学支援研究院、光州センター）のために、各グループで体重が中間値を示す動物２匹を選別した。写真撮影後、皮下脂肪及び内臓脂肪の面積をグラフで示した。
【0192】
皮下脂肪の場合、面積（ｍｍ３）は正常対照群は１６６１±２８９．５、陰性対照群は６３５６±２１７、試験物質投与群は４０４０±２８４．５を示し、内臓脂肪の場合、面積（ｍｍ３）は正常対照群は１０６９±９０、陰性対照群は３７８２±７、試験物質投与群は２６２３±１６６を示した。
【0193】
その結果、正常対照群に比べて陰性対照群において皮下脂肪及び内臓脂肪の面積が増加し、試験物質投与群において陰性対照群に比べて面積が減少する効果を確認することができた（図２５）。
【0194】
１０－７．脂肪組織の組織病理学的検査
マウスの皮下脂肪（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆａｔ ｐａｄ）、副精巣脂肪（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ ｐａｄ）、腎臓周辺脂肪（Ｐｅｒｉｒｅｎａｌ ｆａｔ ｐａｄ）、腸間膜脂肪（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｆａｔ ｐａｄ）を摘出して、１０％の中性緩衝ホルマリン（１０％ ｎｅｕｔｒａｌ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｆｏｒｍａｌｉｎ、Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０－１－６４０）に２４時間以上固定し、エタノールで脱水した後、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）３段階の透明過程を経た。その後、流動パラフィンで浸透（ｉｎｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）及び包埋（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）過程を経てパラフィンブロックを作製した。その後、５μｍ厚の組織区画を脱パラフィン化及び再水和し、Ｈａｒｒｉｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ染色溶液で５分間核をまず染色した後、Ｅｏｓｉｎ溶液で対照染色を行った。染色が終わったら、ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを落とした後、カバーガラスで覆って固まった。保存液で固まった組織スライドを倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＳ２）を用いて２００倍率で写真撮影を行い、脂肪細胞の面積を計算した。
マウスの皮下脂肪（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆａｔ ｐａｄ）、副精巣脂肪（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ ｐａｄ）、腎臓周辺脂肪（Ｐｅｒｉｒｅｎａｌ ｆａｔ ｐａｄ）、腸間膜脂肪（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｆａｔ ｐａｄ）を摘出して、１０％の中性緩衝ホルマリン（１０％ ｎｅｕｔｒａｌ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｆｏｒｍａｌｉｎ、Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０－１－６４０）に２４時間以上固定し、エタノールで脱水した後、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）３段階の透明過程を経た。その後、流動パラフィンで浸透（ｉｎｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）及び包埋（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）過程を経てパラフィンブロックを作製した。その後、５μｍ厚の組織区画を脱パラフィン化及び再水和し、Ｈａｒｒｉｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ染色溶液で５分間核をまず染色した後、Ｅｏｓｉｎ溶液で対照染色を行った。染色が終わったら、ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを落とした後、カバーガラスで覆って固まった。保存液で固まった組織スライドを倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＳ２）を用いて２００倍率で写真撮影を行い、脂肪細胞の面積を計算した。
【0195】
皮下脂肪の場合、面積（ｍｍ２）は正常対照群は９１３．８±１２９．９、陰性対照群は３５７５．０±３４６．７、試験物質投与群は１３３７．０±２１１．１を示し、副精巣脂肪の場合、面積（ｍｍ２）は正常対照群９５０．６±７３．２、陰性対照群は１５９８．０±９９．６、試験物質投与群は１３４７．０±１００．１を示し、腎臓周辺の場合、面積（ｍｍ２）は正常対照群は１７３４．０±１５８．８、陰性対照群は５３６５．０±１９０．４、試験物質投与群は２５１６．０±２８８．３を示し、腸間膜脂肪の場合、面積（ｍｍ２）は正常対照群は１５５２．０±６８０．３、陰性対照群は３４９５．０±４２５．３、試験物質投与群は１４３６．０±１６３．３を示した。
【0196】
その結果、正常対照群に比べて陰性対照群において脂肪細胞の面積が増加し、試験物質投与群において陰性対照群に比べて面積が減少する効果を確認することができた（図２６）。
【0197】
１０－８．肝組織の組織病理学的検査
マウスの肝を摘出してＨ＆Ｅ染色及びオイルレッド（Ｏｉｌ ｒｅｄ）Ｏ分析のために１０％の中性緩衝ホルマリン（１０％ ｎｅｕｔｒａｌ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｆｏｒｍａｌｉｎ、Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０－１－６４０）に２４時間以上固定した後、検査を行った。
マウスの肝を摘出してＨ＆Ｅ染色及びオイルレッド（Ｏｉｌ ｒｅｄ）Ｏ分析のために１０％の中性緩衝ホルマリン（１０％ ｎｅｕｔｒａｌ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｆｏｒｍａｌｉｎ、Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０－１－６４０）に２４時間以上固定した後、検査を行った。
【0198】
１０－８－１．Ｈ＆Ｅ染色
中性緩衝ホルマリンに固定した後に得られた肝組織の全体的な形態、肝組織内の脂質蓄積の程度を観察するために、Ｈ＆Ｅ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ）染色を行った。組織サンプルはパラフィン浸潤法で作製した。エタノールで脱水した後、キシレン３段階の透明過程を経た。その後、流動パラフィンで浸透及び包埋過程を経てパラフィンブロックを作製した。マイクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて組織ブロックを５μｍ厚の切片にし、スライド乾燥機で１時間乾燥させた後、キシレンでパラフィンを除去し、エタノール段階を経て含水させた。Ｈａｒｒｉｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ染色溶液で５分間核をまず染色した後、Ｅｏｓｉｎ溶液で対照染色を行った。染色が終わったら、ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを落とした後、カバーガラスで覆って固まった。保存液で固まった組織スライドを顕微鏡を用いて観察した。
中性緩衝ホルマリンに固定した後に得られた肝組織の全体的な形態、肝組織内の脂質蓄積の程度を観察するために、Ｈ＆Ｅ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ）染色を行った。組織サンプルはパラフィン浸潤法で作製した。エタノールで脱水した後、キシレン３段階の透明過程を経た。その後、流動パラフィンで浸透及び包埋過程を経てパラフィンブロックを作製した。マイクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて組織ブロックを５μｍ厚の切片にし、スライド乾燥機で１時間乾燥させた後、キシレンでパラフィンを除去し、エタノール段階を経て含水させた。Ｈａｒｒｉｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ染色溶液で５分間核をまず染色した後、Ｅｏｓｉｎ溶液で対照染色を行った。染色が終わったら、ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを落とした後、カバーガラスで覆って固まった。保存液で固まった組織スライドを顕微鏡を用いて観察した。
【0199】
１０－８－２．オイルレッドＯの染色
中性緩衝ホルマリンに固定した後に得られた肝組織を３０％スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）溶液に浸潤させた。ＰＢＳ溶液で水洗した後、水分を除去し、凍結組織包埋剤であるＯｐｔｉｃａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｏ．Ｃ．Ｔ）ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＳＡＫＵＲＡ、ＵＳＡ）に固定させて凍結組織ブロックを作製した。固定組織を凍結切片機（Ｃｒｙｏｓｔａｔ ＣＭ３０５０ Ｓ、Ｌｅｉｃａ）で１４ μｍの厚さに切片して組織サンプルを作製した。脂質成分に特異的に敏感に反応して赤色を示すことにより脂質蓄積の程度を確認できる特殊染色法であるオイルレッドＯ染色を用いてＡＲＥＧの脂質蓄積抑制効果を確認した。１０％の中性緩衝ホルマリン（１０％ ｎｅｕｔｒａｌ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｆｏｒｍａｌｉｎ、Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０－１－６４０）で１０分間固定した後、固定液を除去し、１００％のプロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）を用いて洗浄した後、細胞内に生成された脂質液滴（ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ）と特異的に反応するオイルレッドＯ（Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ、Ｏ９７５５、Ｓｉｇｍａ）溶液を用いて染色した。染色が終わったら、ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを落とした後、カバーガラスで覆って固まった。保存液で固まった組織スライドを顕微鏡を用いて観察した。
中性緩衝ホルマリンに固定した後に得られた肝組織を３０％スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）溶液に浸潤させた。ＰＢＳ溶液で水洗した後、水分を除去し、凍結組織包埋剤であるＯｐｔｉｃａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｏ．Ｃ．Ｔ）ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＳＡＫＵＲＡ、ＵＳＡ）に固定させて凍結組織ブロックを作製した。固定組織を凍結切片機（Ｃｒｙｏｓｔａｔ ＣＭ３０５０ Ｓ、Ｌｅｉｃａ）で１４ μｍの厚さに切片して組織サンプルを作製した。脂質成分に特異的に敏感に反応して赤色を示すことにより脂質蓄積の程度を確認できる特殊染色法であるオイルレッドＯ染色を用いてＡＲＥＧの脂質蓄積抑制効果を確認した。１０％の中性緩衝ホルマリン（１０％ ｎｅｕｔｒａｌ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｆｏｒｍａｌｉｎ、Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０－１－６４０）で１０分間固定した後、固定液を除去し、１００％のプロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）を用いて洗浄した後、細胞内に生成された脂質液滴（ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ）と特異的に反応するオイルレッドＯ（Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ、Ｏ９７５５、Ｓｉｇｍａ）溶液を用いて染色した。染色が終わったら、ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを落とした後、カバーガラスで覆って固まった。保存液で固まった組織スライドを顕微鏡を用いて観察した。
【0200】
１０－８－３．肝脂肪の変化
オイルレッドＯの分析後に定量分析を行った結果、正常対照群に比べて陰性対照群で６．６倍増加した脂肪が生成され、試験物質投与群の場合は正常対照群に比べて２．８倍増加した脂肪が生成された。したがって、試験物質投与群において肝脂肪生成抑制効果があることがわかった（図２７）。
オイルレッドＯの分析後に定量分析を行った結果、正常対照群に比べて陰性対照群で６．６倍増加した脂肪が生成され、試験物質投与群の場合は正常対照群に比べて２．８倍増加した脂肪が生成された。したがって、試験物質投与群において肝脂肪生成抑制効果があることがわかった（図２７）。
【0201】
１０－９．遺伝子発現の分析
マウスの皮下脂肪（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆａｔ ｐａｄ）、副精巣脂肪（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ ｐａｄ）、腎臓周辺脂肪（Ｐｅｒｉｒｅｎａｌ ｆａｔ ｐａｄ）におけるアンフィレギュリンの発現量を測定した。脂肪組織におけるＴｏｔａｌ ＲＮＡ抽出は、ＴＲＩ－Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭＲＣ Ｉｎｃ．，ＵＳ）とＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）の組み合わせで行った。１００ｍｇの脂肪組織をＴｒｉ ｒｅａｇｅｎｔ １ｍｌに入れ、ホモゲン化後、室温で５分間培養した。４℃、１２０００ｇで１０分間遠心分離した後、上部のｆａｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒを避けて下部のサンプルを回収した。２００μｌのクロロフォーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を入れてよく混合した後、３分間室温に置いた後、４℃、１２０００ｇで３０分間遠心分離した。分離された３フェーズで最も上層を回収した後、Ｌｙｓａｔｅ：Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ＝４００：３００の割合で入れてよく混ぜた後、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔのＡｃｃｕＰｒｅｐ（登録商標） Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ－ＩＩＩに入れる。その後、製造社のプロトコルに従って進行した。抽出されたＲＮＡは、スペクトロフォトメーターを用いて定量及び純度を評価し、ＲＮＡゲル電気泳動法（ｇｅｌ－ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を通じて分解の程度を判断した。
マウスの皮下脂肪（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆａｔ ｐａｄ）、副精巣脂肪（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ ｐａｄ）、腎臓周辺脂肪（Ｐｅｒｉｒｅｎａｌ ｆａｔ ｐａｄ）におけるアンフィレギュリンの発現量を測定した。脂肪組織におけるＴｏｔａｌ ＲＮＡ抽出は、ＴＲＩ－Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭＲＣ Ｉｎｃ．，ＵＳ）とＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）の組み合わせで行った。１００ｍｇの脂肪組織をＴｒｉ ｒｅａｇｅｎｔ １ｍｌに入れ、ホモゲン化後、室温で５分間培養した。４℃、１２０００ｇで１０分間遠心分離した後、上部のｆａｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒを避けて下部のサンプルを回収した。２００μｌのクロロフォーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を入れてよく混合した後、３分間室温に置いた後、４℃、１２０００ｇで３０分間遠心分離した。分離された３フェーズで最も上層を回収した後、Ｌｙｓａｔｅ：Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ＝４００：３００の割合で入れてよく混ぜた後、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔのＡｃｃｕＰｒｅｐ（登録商標） Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ－ＩＩＩに入れる。その後、製造社のプロトコルに従って進行した。抽出されたＲＮＡは、スペクトロフォトメーターを用いて定量及び純度を評価し、ＲＮＡゲル電気泳動法（ｇｅｌ－ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を通じて分解の程度を判断した。
【0202】
＜表１０＞
ｑＰＣＲ用のプライマー配列情報
（Ｆは正方向（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー、Ｒは逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーをそれぞれ意味する）
ｑＰＣＲ用のプライマー配列情報
【0203】
１０－９－１．脂肪組織におけるアンフィレギュリンｍＲＮＡレベル
マウスの皮下脂肪（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆａｔ ｐａｄ）の場合、正常対照群に比べで陰性対照群では、アンフィレギュリンｍＲＮＡレベルが１．８倍増加したが、試験物質投与群では陰性対照群に比べてアンフィレギュリンｍＲＮＡレベルが１．６倍減少した。
マウスの皮下脂肪（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆａｔ ｐａｄ）の場合、正常対照群に比べで陰性対照群では、アンフィレギュリンｍＲＮＡレベルが１．８倍増加したが、試験物質投与群では陰性対照群に比べてアンフィレギュリンｍＲＮＡレベルが１．６倍減少した。
【0204】
副精巣脂肪（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ ｐａｄ）の場合、正常対照群に比べて対陰性対照群では、アンフィレギュリンｍＲＮＡレベルが３．２倍増加したが、試験物質投与群では陰性対照 群に比べてアンフィレギュリンｍＲＮＡレベルが１．３倍減少した。
【0205】
腎臓周辺脂肪（Ｐｅｒｉｒｅｎａｌ ｆａｔ ｐａｄ）の場合、正常対照群に比べて陰性対照群では、アンフィレギュリンｍＲＮＡレベルは３．７倍増加したが、試験物質投与群では陰性対照群に比べてアンフィレギュリンｍＲＮＡレベルは１．５倍減少した（図２８）。
【0206】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に説明したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、この具体的な技術は単なる好ましい実施形態に過ぎず、これにより本発明の範囲が限定されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【0207】
本発明による医薬組成物は、皮下脂肪、特に、内臓脂肪の減少効果が優れており、内臓脂肪による合併症が問題となる心血管疾患、代謝疾患、糖尿病及び他の様々な疾患の治療及び予防段階において有用に利用されることができる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21a】
【図21b】
【図22】
【図23a】
【図23b】
【図24a】
【図24b】
【図25】
【図26】
【図27a】
【図27b】
【図28】
【配列表】