特許 7555123 有機溶媒不含かつ劣化剤不含のトランスフェクション・コンピテント・ベシクルを含む組成物及びシステム並びにそれらに関連する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-12

(45)【発行日】2024-09-24

(54)【発明の名称】有機溶媒不含かつ劣化剤不含のトランスフェクション・コンピテント・ベシクルを含む組成物及びシステム並びにそれらに関連する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/88 20060101AFI20240913BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20240913BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240913BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240913BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20240913BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240913BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20240913BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20240913BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20240913BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240913BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20240913BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240913BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240913BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20240913BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20240913BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20240913BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240913BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20240913BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240913BHJP

【ＦＩ】

C12N15/88 Z

A61K9/127

A61K31/7088

A61K31/7105

A61K31/712

A61K31/713

A61K38/00

A61K38/43

A61K47/10

A61K47/18

A61K47/28

A61K48/00

A61P21/00

A61P25/02

A61P25/14

A61P25/16

A61P25/28

A61K49/00

C12N15/09 100

C12N15/09 110

【請求項の数】 33

(21)【出願番号】P 2021517982

(86)(22)【出願日】2019-10-09

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(86)【国際出願番号】 US2019055472

(87)【国際公開番号】W WO2020077007

(87)【国際公開日】2020-04-16

【審査請求日】2022-10-07

(31)【優先権主張番号】62/743,116

(32)【優先日】2018-10-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】502087932

【氏名又は名称】ザ ユニヴァーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リービット，ブレア

(72)【発明者】

【氏名】カリス，ピーター

(72)【発明者】

【氏名】ペトカウ，テリー

(72)【発明者】

【氏名】ヒル，オースティン

(72)【発明者】

【氏名】ワグナー，パメラ

(72)【発明者】

【氏名】クルカーニ，ジェイッシュ

【審査官】上條 のぶよ

(56)【参考文献】

【文献】特表２００９－５１３１５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５２３４１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５０９３８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５２８８９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５１１５８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５３９９１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５０７５３４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／８８

Ａ６１Ｋ ９／１２７

Ａ６１Ｋ ４７／００

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３１／７０８８

Ａ６１Ｋ ３１／７１２

Ａ６１Ｋ ３１／７１３

Ａ６１Ｋ ３１／７１０５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質を含む治療用及び／又は診断用カーゴを、脂質ベースのトランスフェクション・コンピテント・ベシクル（ＴＣＶ）に封入する方法であって、前記方法が、
（ａ）有機溶媒及び界面活性剤を含まず、且つ脂質ベースのＴＣＶを含む水性溶液を提供すること；及び
（ｂ）前記治療用及び／又は診断用カーゴを前記水性溶液中で混合すること；
を含み、
前記脂質ベースのＴＣＶは、２０モル％～３０モル％のカチオン性脂質を含み、前記カチオン性脂質が、１以上のイオン化可能なカチオン性脂質からなり、
前記混合は、有機溶媒又は界面活性剤の不在下で行われる、方法。

【請求項2】

前記脂質ベースのＴＣＶは、２０モル％又は３０モル％のカチオン性脂質を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記１以上のイオン化可能なカチオン性脂質は、１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノ－プロパン（ＤＯＤＭＡ）を含むか、又はＤＯＤＭＡからなる、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記脂質ベースのＴＣＶが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はコレステロールの少なくとも１つを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記脂質ベースのＴＣＶが、１モル％のＰＥＧ－脂質を含むか、又はＰＥＧ－脂質を含まない、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記脂質ベースのＴＣＶが、１以上のイオン化可能なカチオン性脂質、１以上のリン脂質、及びコレステロールの混合物；又は１以上のイオン化可能なカチオン性脂質、１以上のリン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ－脂質の混合物を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記１以上のリン脂質が、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及び／又は１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記脂質ベースのＴＣＶが、
（ｉ）２０／３０／１０／４０モル％のＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／コレステロールの混合物；又は
（ｉｉ）２０／３０／１０／３９／１モル％のＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－脂質の混合物；
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記タンパク質が、
（ｉ）酵素、ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１１、Ｃａｓ１２、若しくはＣｐｆ１を含む：並びに／又は
（ｉｉ）リボ核タンパク質（ＲＮＰ）及び／若しくは核酸タンパク質複合体（ＰＮＡ）の一部である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記治療用及び／又は診断用カーゴが、
（Ａ）Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを含むＲＮＰ：又は、
（Ｂ）（ｉ）Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを含むＲＮＰ並びに（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記治療用及び／又は診断用カーゴが更に核酸を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記核酸が、
（ｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）；
（ｉｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）；
（ｉｉｉ）二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及び／若しくはプライマー；並びに／又は
（ｉｖ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び／若しくはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記水性溶液が、２５ｍＭ～１００ｍＭの酢酸緩衝液を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

（Ａ）前記混合が、
（ｉ－１）千鳥型ヘリンボーンマイクロ混合；及び／若しくは
（ｉ－２）Ｔ分岐ミキサ混合；
を用いて、並びに／又は
（ｉｉ）ピペットの往復動；
によって行われ、
（Ｂ）前記混合が、１０～３０秒間又は１０～１５秒間、室温で行われる、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

治療用及び／又は診断用カーゴが封入された脂質ベースのトランスフェクション・コンピテント・ベシクル（ＴＣＶ）を含む水性溶液を含む組成物であって、
（ａ）前記組成物は、有機溶媒及び界面活性剤を含まず；
（ｂ）前記脂質ベースのＴＣＶは、２０モル％～３０モル％のカチオン性脂質を含み、及び前記カチオン性脂質は、１以上のイオン化可能なカチオン性脂質からなる；並びに
（ｃ）前記治療用及び／又は診断用カーゴがタンパク質を含む、組成物。

【請求項16】

前記脂質ベースのＴＣＶは、２０モル％又は３０モル％のカチオン性脂質を含む、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記１以上のイオン化可能なカチオン性脂質は、１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノ－プロパン（ＤＯＤＭＡ）を含むか、又はＤＯＤＭＡからなる、請求項１５又は１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記脂質ベースのＴＣＶが、ＰＥＧ又はコレステロールの少なくとも１つを含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項19】

前記脂質ベースのＴＣＶが、１モル％のＰＥＧ－脂質を含むか、又はＰＥＧ－脂質を含まない、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項20】

前記脂質ベースのＴＣＶが、１以上のイオン化可能なカチオン性脂質、１以上のリン脂質、及びコレステロールの混合物；又は１以上のイオン化可能なカチオン性脂質、１以上のリン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ－脂質の混合物を含む、請求項１５～１９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項21】

前記１以上のリン脂質が、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及び／又は１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）を含む、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記脂質ベースのＴＣＶが、
（ｉ）２０／３０／１０／４０モル％のＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／コレステロールの混合物；又は
（ｉｉ）２０／３０／１０／３９／１モル％のＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－脂質の混合物；
を含む、請求項１５に記載の組成物。

【請求項23】

前記タンパク質が、
（ｉ）酵素、ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１１、Ｃａｓ１２、若しくはＣｐｆ１を含む：並びに／又は
（ｉｉ）リボ核タンパク質（ＲＮＰ）及び／若しくは核酸タンパク質複合体（ＰＮＡ）の一部である、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項24】

前記治療用及び／又は診断用カーゴが、
（Ａ）Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを含むＲＮＰ：又は、
（Ｂ）（ｉ）Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを含むＲＮＰ並びに（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む、請求項２２に記載の組成物。

【請求項25】

前記治療用及び／又は診断用カーゴが更に核酸を含む、請求項１５～２４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項26】

前記核酸が、
（ｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）；
（ｉｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）；
（ｉｉｉ）二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及び／若しくはプライマー；並びに／又は
（ｉｖ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び／若しくはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
を含む、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

前記水性溶液が、２５ｍＭ～１００ｍＭの酢酸緩衝液を含む、請求項１５～２６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項28】

医薬品で用いるため：
遺伝子治療で用いるため：及び／又は
ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、若しくは脊髄性筋萎縮症の治療で用いるための、請求項１５～２７に記載の組成物。

【請求項29】

（Ｉ）患者の疾患若しくは状態を治療するための医薬品の製造のため；並びに／又は
（ＩＩ）アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、若しくは脊髄性筋萎縮症を治療するための医薬品の製造のため；
の、請求項１５～２７のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【請求項30】

（ａ）容器内の請求項１５～２７のいずれか一項に記載の組成物；及び
（ｂ）治療用又は診断用の使用のための前記組成物の説明書；
を含む、キット。

【請求項31】

前記使用は、
（Ｉ）アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、若しくは脊髄性筋萎縮症の治療のため；
（ＩＩ）患者の疾患若しくは状態を治療するための医薬品の製造のため；並びに／又は
（ＩＩＩ）アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、若しくは脊髄性筋萎縮症を治療するための医薬品の製造のため；
の使用である、請求項３０に記載のキット。

【請求項32】

インビトロで、請求項１５～２７のいずれか一項に記載の組成物で単離された標的細胞をトランスフェクトすることを含む、トランスフェクション方法。

【請求項33】

前記標的細胞が哺乳動物細胞である、請求項３２に記載のトランスフェクション方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月９日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６２／７４３，１１６号の利益を主張し、この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

科学的研究及び医学的治療の重要な領域の１つに、ＲＮＡ、ＤＮＡ、他の核酸及び／又はタンパク質カーゴを特定の標的細胞などの標的部位に選択的かつ効率的に送達したいという要望がある。これは、遺伝子治療などの改善された患者治療、並びに癌及び他の状態の治療を含む様々な理由に役立ち得る。例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症など、ヒトが罹患し得る古典的な最悪の神経障害のいくつかを治療するために、脳及び中枢神経系全体で遺伝子治療を使用することができる可能性がある。現在の遺伝子治療アプローチには、例えば治療用核酸を患者内に運び入れるパッケージングを反復的に投与する必要性及びその毒性のために、特にヒト患者への広範な使用にいくつかの問題がある。本明細書の組成物、方法などは、これら又は他のそのような問題の１つ以上を改善するのに役立つ。

【0003】

脳内の疾患細胞などの標的部位へのＤＮＡ及び他の核酸の送達のより科学的な議論に目を向けると、そのような送達のための既存の方法には、場合によっては脂質ナノ粒子（「ＬＮＰ」）又はリポソームと呼ばれる脂質粒子が含まれる。脂質ナノ粒子又は「ＬＮＰ」という用語は、典型的には核酸を含有し、電子密度の高いコアを有する、ほぼ中性ｐＨの脂質ベースの粒子を説明するために使用される。ベシクルとしても知られるリポソームは、単一の二重層と水性コアとを有する脂質ベースの構造である。ＬＮＰ形成の典型的な確立されたプロセスは、最初のベシクル形成時にベシクルに特定のカーゴをロードする。これらのプロセスは、特殊な器具、有機溶媒及び／又は界面活性剤をさらに使用し、大量の材料を必要とし、処理時間が日単位であり、これらすべてが有用性、利用のしやすさ及び治療の容易さを著しく妨げる。

【0004】

ＬＮＰ及び他の脂質粒子は、典型的には、イオン化可能なカチオン性脂質、１つ以上のリン脂質、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びポリエチレングリコール脂質（ＰＥＧ－脂質）（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）を含む。（特定のシステム、装置、方法、及び他の情報を説明する様々な参考文献が本明細書に記載されている。そのような参考文献はすべて、その全体が、並びにその教示及び開示のすべてについて、その参考文献が本出願のどこに現れるかにかかわらず、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における参照への引用は、そのような参照が本出願に対する先行技術を構成することを認めるものではない。）ＬＮＰ組成物の例は、５０／１０／３８．５／１．５ｍｏｌ％（それぞれ）の比のイオン化可能なカチオン性脂質、リン脂質、コレステロール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質の組み合わせである。この組成物は、静脈内投与後に強力な肝細胞遺伝子サイレンシング（ｓｉＲＮＡ）又は発現（ｍＲＮＡ）を示すことが示されている（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。他の参考文献は、初代神経細胞の培養におけるｓｉＲＮＡ送達として、及び脳への送達のために、イオン化可能なカチオン性脂質、リン脂質、コレステロール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質を５０／１０／３８．５／１．５モル％の比で含むＬＮＰ組成物を記載している（非特許文献１１）。

【0005】

ＬＮＰ配合物は、エタノールに溶解した脂質成分を核酸カーゴからなる酸性水相と迅速に混合することによって生成することができる（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。ＬＮＰ製造のための確立された迅速混合プロセスには、千鳥型ヘリンボーンマイクロミキサ（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｈｅｒｒｉｎｇｂｏｎｅ ｍｉｃｒｏｍｉｘｅｒ：ＳＨＭ）（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）によるマイクロ流体混合、又は特殊なポンプによるＴ字型混合（非特許文献１８）、又は予め形成されたベシクルのエタノール／界面活性剤不安定化ロードのより最新のアプローチ（非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２）が含まれる。３つの方法すべてにおいて、エタノール溶液（又は界面活性剤）は、脂質の再編成及び捕捉が起こるのに十分な膜流動性を提供するために必要であり、ＳＨＭ及びＴ字型法の場合、エタノール溶液を水相に希釈すると粒子形成も起こる（非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５）。しかしながら、得られた懸濁液は、有機溶媒及び酸性ｐＨのために「すぐに使用できる」ものではなく、したがって、得られた懸濁液は、かなりの下流処理を必要とする。材料コスト及び時間の観点から、これらのアプローチは、インビトロ用途のために実験室規模で、又は直接投与のために治療レベルでトランスフェクションコンピテントな配合物を実現することを著しく妨げる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｍａｕｒｅｒ，Ｗｏｎｇら、２００１

【文献】Ｓｅｍｐｌｅ，Ｋｌｉｍｕｋら、２００１

【文献】Ｓｅｍｐｌｅ，Ａｋｉｎｃら、２０１０

【文献】Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｈｕｆｔら、２０１２

【文献】Ｌｅｕｎｇ，Ｈａｆｅｚら、２０１２

【文献】Ｓｕｈｒ，Ｃｏｅｌｈｏら、２０１５

【文献】Ｓｅｍｐｌｅ，Ａｋｉｎｃら、２０１０

【文献】Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｓｅｌｌら、２０１２

【文献】Ｐａｒｄｉ，Ｔｕｙｉｓｈｉｍｅら、２０１５

【文献】Ｓｕｈｒ，Ｃｏｅｌｈｏら、２０１５

【文献】Ｒｕｎｇｔａ，Ｃｈｏｉら、２０１３

【文献】Ｊｅｆｆｓ，Ｐａｌｍｅｒら、２００５

【文献】Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｈｕｆｔら、２０１２

【文献】Ｌｅｕｎｇ，Ｈａｆｅｚら、２０１２

【文献】Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｈｕｆｔら、２０１２

【文献】Ｒｕｎｇｔａ，Ｃｈｏｉら、２０１３

【文献】Ｌｅｕｎｇ，Ｔａｍら、２０１５

【文献】Ｊｅｆｆｓ，Ｐａｌｍｅｒら、２００５

【文献】Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｐａｌｍｅｒら、１９９９

【文献】Ｔａｍ，Ｍｏｎｃｋら、２０００

【文献】Ｍａｕｒｅｒ，Ｗｏｎｇら、２００１

【文献】Ｓｅｍｐｌｅ，Ｋｌｉｍｕｋら、２００１

【文献】Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｈｕｆｔら、２０１２

【文献】Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖ，Ｂｅｌｌｉｖｅａｕら、２０１２

【文献】Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖ，Ｔａｍら、２０１６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

培養された哺乳動物初代細胞（一般に、初代細胞は、標的組織から直接得られる非形質転換非不死化細胞である）を含む哺乳動物細胞に、毒性のない方法で核酸及びタンパク質カーゴを効果的に送達するトランスフェクション試薬が依然として必要とされている。初代細胞を使用することの重要性及び細胞株の使用を上回るそれらの利点は十分に理解されているが、そのような細胞をトランスフェクトする際に遭遇する困難は、選択的遺伝子ノックダウンを必要とするいかなる種類の発見又は検証研究においても、それらの使用をほぼ完全に不可能としている。さらに、個別化医療への移行により、初代患者細胞で機能的ゲノムスクリーニング及び検証を行うことが求められており、これらのトランスフェクト困難な細胞型のための堅牢で毒性のないトランスフェクション方法の必要性が高まっている。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本システム及び方法などは、これらの困難の１つ以上に対する解決策を提供し、及び／又は他の利点を提供する。

【0009】

発明の概要
本明細書におけるシステム、組成物、装置及び方法などは、タンパク質、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、ＲＮＡ、ＤＮＡ及び他の核酸カーゴ及び他の選択カーゴを標的細胞に安全かつ効率的に送達するように構成された、本明細書において典型的にはトランスフェクション・コンピテント・ベシクル（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｖｅｓｉｃｌｅ：ＴＣＶ）と呼ばれる脂質ベースのベシクルを提供する。安全性及び効率はそれぞれ、及び両方とも、ＴＣＶローディングプロセス（すなわち、選択カーゴをＴＣＶに挿入する）、ＴＣＶ貯蔵プロセス、及び／又はＴＣＶ送達プロセスから、エタノールなどの有機溶媒及びドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤などの不安定化剤を除去することによって部分的に達成される。したがって、ＴＣＶは、例えば、不安定化剤不含の懸濁液として、不安定化剤不含の溶液中に維持される。

【0010】

本明細書で使用される場合、ＴＣＶは、脂質ベースであり、不安定化剤を含まず、かつ選択カーゴを内包せずに生成及び／又は貯蔵される、リポソーム又は他のベシクルの一種である。そのようなＴＣＶの利点の１つは、それらが不安定化剤の不在下で溶液中に又は懸濁液として保存可能であり、不安定化剤の不在下で選択カーゴを捕捉することができ、不安定化剤の不在下でそのような選択カーゴを標的細胞に送達することができることである。選択カーゴは、選択カーゴを含有するＴＣＶでトランスフェクトされた標的細胞及び／又は標的患者に対して所望の効果をもたらすＲＮＰ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質などを示す。したがって、文脈から明らかでない限り、本明細書のＴＣＶは、最終選択カーゴを欠いており、いくつかの実施形態では、周囲溶液などを除いて空である。そのようなＴＣＶは、有機溶媒又は他の不安定化剤を使用せずに、核酸及びタンパク質カーゴなどを哺乳動物細胞に安全かつ効率的に送達するように構成されている。

【0011】

ＴＣＶ送達プロセスは、初代細胞などの哺乳動物細胞の選択カーゴによるトランスフェクションを含み得る。カーゴはまた、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）などのタンパク質と複合体化した核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書のシステム、組成物、装置及び方法などは、空のＴＣＶ又はロードされたＴＣＶを提供することができる。

【0012】

いくつかの態様では、本明細書のシステム、組成物、装置及び方法などは、脂質ベシクル又はリポソームにカーゴを捕捉（又はロード）するため及び／又はそのようなベシクルを貯蔵するために従来必要とされていた有機溶媒及び他の不安定化剤を含まないトランスフェクション・コンピテント・ベシクル（ＴＣＶ）を提供する。本明細書の組成物、方法などは、専用の機器を使用せずに使用又は実施することができ、例えば、本明細書の予め形成されたＴＣＶは、ピペットの往復動によって空のＴＣＶ含有懸濁液を様々な種類の選択カーゴと穏やかに混合することによってロードすることができる。本明細書の組成物、方法などは、「ベンチトップローディング」に特に有用であり得、少量又は大量の選択カーゴ材料と共に使用することができる。さらに、空のＴＣＶの単一のバッチに、複数の異なる選択カーゴを並列にベンチトップローディングすることができる。

【0013】

いくつかの実施形態では、本明細書のシステム、組成物、装置及び方法などは、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の空のＴＣＶを提供する。エタノール又は界面活性剤又は他の不安定化剤がＴＣＶ生成に使用されている場合は、透析又は他の適切な方法で除去して、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶ組成物を提供する。ＴＣＶは、ピペット内でのＴＣＶ生成流体の反復手動往復動、ＳＨＭ、Ｔ字型混合もしくは押出方法、又は必要に応じて他のＴＣＶ混合方法などの穏やかな混合を使用してロードすることができる。

【0014】

一態様では、脂質ベースのＴＣＶは、イオン化可能なカチオン性脂質、リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ－脂質の混合物から構成され、ＴＣＶ含有組成物は、有機溶媒及び／又は界面活性剤不含であり、この用語は、その通常の使用において、そのような有機溶媒及び界面活性剤が本質的に存在せず、極めて少量が組成物中に残存している可能性はあるが、有機溶媒及び／又は界面活性剤によって有意な有害作用が引き起こされることはないことを示すために使用される。

【0015】

いくつかの態様では、イオン化可能なカチオン性脂質は、ＴＣＶの脂質成分の２０～５０％を構成する。一態様では、空の脂質ベースのＴＣＶは、２０／３０／１０／３９／１ｍｏｌ％のＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－脂質の比で脂質成分を含有する。別の一態様では、空の脂質ベースのＴＣＶは、２０／３０／１０／４０ｍｏｌ％のＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌの比で脂質成分を含有する。別の一態様では、空の脂質ベースのＴＣＶは、５０／１０／３９／１ｍｏｌ％のＤＯＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－脂質の比で脂質成分を含有する。別の一態様では、空の脂質ベースのＴＣＶは、５０／１０／３９／１ｍｏｌ％のＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌの比で脂質成分を含有する。必要に応じて、さらなる範囲の成分を使用することもできる。いくつかの態様では、イオン化可能なカチオン性脂質の比が減少される。例えば、イオン化可能なカチオン性脂質の比は、約１０ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％又は６０ｍｏｌ％であり得る。

【0016】

一態様では、空の脂質ベースのＴＣＶを、例えば１０～３０秒間など、必要に応じて５秒間、１０秒間、１５秒間、２０秒間、３０秒間、４５秒間、１分間又は２分間、核酸選択カーゴと混合する。次いで、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の環境で保存し、及び／又は有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の環境で、再び哺乳動物細胞などの標的細胞に投与することができる。

【0017】

いくつかの態様では、核酸選択カーゴは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、相補的ＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はそれらの組み合わせであり得る。いくつかの態様では、核酸選択カーゴは、例えば選択カーゴの安定性を改善するために、合成又は化学修飾オリゴヌクレオチドを含み得る。選択カーゴは、核酸と複合体化したタンパク質（ＰＮＡ）であり得る。タンパク質選択カーゴは、遺伝子編集に関与するタンパク質又は細胞標識のレポータとして機能するタンパク質（蛍光マーカなど）であり得る。いくつかの実施形態では、核酸と複合体化したタンパク質ベースの選択カーゴは、リボ核タンパク質である。

【0018】

いくつかの態様では、本システム、装置及び方法などは、選択カーゴを脂質ベースのトランスフェクション・コンピテント・ベシクル（ＴＣＶ）に封入する方法であって、
脂質ベースのＴＣＶを含む水性溶液を提供することであって、水性溶液は不安定化剤不含であり得ることと、
選択カーゴを脂質ベースのＴＣＶ内に封入して、脂質ベースのＴＣＶ封入選択カーゴを提供するのに適した条件下で十分な時間、選択カーゴを溶液中に混合することであって、混合は、有機溶媒又は界面活性剤の不在下で行うことができることと、
を含む方法を提供する。

【0019】

不安定化剤は、有機溶媒又は界面活性剤のうちの少なくとも１つであり得る。有機溶媒は、例えば、メタノール、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はアセトニトリル（ＡＣＮ）であり得る。界面活性剤は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり得る。不安定化剤は、温度であり得る。水性溶液は、２５ｍＭ～１００ｍＭの酢酸緩衝液であり得る。

【0020】

脂質ベースのＴＣＶが封入の前に空であってもよく、本方法は、
溶媒及び界面活性剤を実質的に含まない水性溶液中で脂質ベースのＴＣＶ封入選択カーゴを得ること
をさらに含むことができる。

【0021】

脂質ベースのＴＣＶは、例えばイオン化可能なカチオン性脂質などのカチオン性脂質を含むことができる。脂質ベースのＴＣＶは、約２０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％のカチオン性脂質を含むことができる。イオン化可能なカチオン性脂質は、１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノ－プロパン（ＤＯＤＭＡ）を含むことができる。脂質ベースのＴＣＶは、１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノ－プロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）の混合物を含むことができる。混合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はコレステロールのうちの少なくとも１つをさらに含むことができる。

【0022】

脂質ベースのＴＣＶは、ＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－脂質の混合物を約２０／３０／１０／３９／１ｍｏｌ％含むことができ、ＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌの混合物を約２０／３０／１０／４０ｍｏｌ％含むことができ、ＤＯＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌの混合物を約５０／１０／４０ｍｏｌ％含むことができ、ＤＯＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－脂質の混合物を約５０／１０／３９／１ｍｏｌ％含むことができ、又はＤＯＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧの混合物を約５０／１０／３９／１ｍｏｌ％含むことができる。

【0023】

選択カーゴは、修飾核酸などの核酸であり得る。修飾核酸は、例えば、２’－Ｏ－メチル化（２’－Ｏ－ＭＥ）、ホスホロチオエート又はモルホリノ、ロックド核酸のうちの少なくとも１つを含み得る。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり得る。ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はプラスミドＤＮＡを含むことができる。核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができる。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むことができる。選択カーゴはタンパク質を含むことができる。タンパク質は、機能性リボ核タンパク質であり得るリボ核タンパク質（ＲＮＰ）の一部であり得る。ＲＮＰは、Ｃａｓ９タンパク質又はガイドＲＮＡの少なくとも１つ、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡの両方、あるいはＣａｓ９タンパク質、ガイドＲＮＡ及び一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含むことができる。

【0024】

カーゴは、酵素、ヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼのうちの少なくとも１つ、又はプライマを含むことができる。カーゴは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１１、Ｃａｓ１２、又はＣｐｆ１のうちの少なくとも１つを含むことができる。カーゴは、酵素、ヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼのうちの少なくとも１つ、又はプライマを含むことができる。カーゴは、ヌクレアーゼ又は抗原をコードするｍＲＮＡを含むことができる。

【0025】

方法は、脂質ベースのＴＣＶを選択カーゴと混合することをさらに含むことができ、選択カーゴは、カチオン性脂質１μモル当たり選択カーゴ約０．０２２～０．０５８ｍｇの比で存在し得る核酸であり得る。方法は、脂質ベースのＴＣＶを選択カーゴと混合することをさらに含むことができ、選択カーゴは、カチオン性脂質１μモル当たり選択カーゴ約０．０２９～０．１１６ｍｇの比で存在し得る核酸であり得る。脂質ベースのＴＣＶ及び選択カーゴを、約４６７モル比の脂質ベースのＴＣＶ：選択カーゴで混合することができる。選択カーゴは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）であり得る。脂質ベースのＴＣＶ及び選択カーゴは、約４００～１２００モル比の脂質ベースのＴＣＶ：選択カーゴで混合され得る。脂質ベースのＴＣＶ及び選択カーゴは、約４７３～１１７３モル比の脂質ベースのＴＣＶ：選択カーゴで混合され得る。脂質ベースのＴＣＶ及び選択カーゴは、約３０００～５０００モルまでの比の脂質ベースのＴＣＶ：選択カーゴで混合され得る。

【0026】

脂質ベースのＴＣＶ及び選択カーゴは、約１０～１５秒間、又は約１０～３０秒間、ほぼ室温で混合することができる。混合は、千鳥型ヘリンボーンマイクロ混合又はＴ字型混合を使用して行うことができる。混合は、ピペット内での往復動によって行うことができる。

【0027】

いくつかの態様では、本システム、装置及び方法などは、水性溶液中に脂質ベースのトランスフェクション・コンピテント・ベシクル（ＴＣＶ）を含む組成物を提供する。組成物は、不安定化剤不含、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含であってもよい。組成物及び／又は脂質ベースのＴＣＶは、概要、図面、詳細な説明又は特許請求の範囲で論じられるようにさらに構成することができる。本システム、装置及び方法などは、有機溶媒及び界面活性剤などの不安定化剤を実質的に含まない水性溶液中に脂質ベースのトランスフェクション・コンピテント・ベシクル（ＴＣＶ）封入選択カーゴを含む組成物を提供する。本明細書で論じられる脂質ベースのＴＣＶ封入選択カーゴ。

【0028】

本システム、装置及び方法などはまた、トランスフェクション方法であって、本明細書中で論じられるような脂質ベースのトランスフェクション・コンピテント・ベシクル（ＴＣＶ）封入選択カーゴで標的細胞をトランスフェクトすることを含む方法を提供する。標的細胞は、例えば哺乳動物初代細胞、哺乳動物初代神経細胞、培養哺乳動物細胞、又は哺乳動物患者由来の細胞などの哺乳動物細胞であり得る。

【0029】

本明細書の方法は、例えばベンチトップローディングのために実験室で実施することができる。本方法は、商業量のトランスフェクト細胞を作製するために工場で実施することができる。本方法は、インビボ手順、医療手順、治療手順又は遺伝子治療手順の一部として実施することができる。本方法は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、又は脊髄性筋萎縮症の治療の一部として実施することができる。本方法はさらに、脂質ベースのＴＣＶ封入選択カーゴを患者の脳に送達することを含み得る。

【0030】

いくつかのさらなる態様では、本システム、装置及び方法などは、本明細書の組成物を含むキットを提供する。組成物は容器に入っていてもよく、キットは組成物の使用説明書を含んでもよい。説明書は、本明細書の方法のいずれかによる組成物の使用を指示してもよい。容器は、少なくとも一用量の組成物を哺乳動物に投与するように構成することができ、キットは、投与のための説明書を含む少なくとも１つのラベルをさらに含む。

【0031】

いくつかの態様では、本システム、装置及び方法などは、哺乳動物であり得る患者の疾患又は状態を阻害、予防、又は治療するための医薬品の製造に使用するための本明細書の単離及び精製組成物を提供する。

【0032】

これら及び他の態様、特徴及び実施形態は、以下の詳細な説明及び添付の図面を含む本出願に記載されている。特に明記しない限り、すべての実施形態、態様、特徴などは、任意の所望の方法で混合及び適合され、組み合わせ及び置換され得る。さらに、特定のシステム、装置、方法、及び他の情報を説明する関連出願の相互参照を含む様々な参考文献が本明細書に記載されている。そのような参考文献はすべて、その全体が、並びにその教示及び開示のすべてについて、その参考文献が本出願のどこに現れるかにかかわらず、参照により本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】図１Ａ～図１Ｄは、本明細書の方法に従って作製されたトランスフェクション・コンピテント・ベシクル（ＴＣＶ）は、不死化細胞及び初代ニューロンにおけるノックダウンを示す。図１Ａは、５０％のイオン化可能なカチオン性脂質で構成された、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶによるトランスフェクション後のＨＥＫ－Ｌｕｃ細胞における相対的ルシフェラーゼ発現を示す。図１Ｂは、対照（細胞のみ）ウェルの％としての、図１Ａと同じトランスフェクションセットからの細胞生存率を示す。図１Ｃは、ニューロンへのｓｉＲＮＡ選択カーゴの有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶ媒介トランスフェクション後の初代皮質ニューロンにおけるｈｄｈ ｍＲＮＡの相対的発現を示す。ｓｉＲＮＡ標的ｈｄｈ及びＴＣＶを、図１Ａと同じイオン化可能なカチオン性脂質パネルを使用して生成した。図１Ｄは、オフターゲット（ルシフェラーゼ）ｓｉＲＮＡを送達するための、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを使用した初代皮質ニューロンにおける同等のトランスフェクションのセットのＭＴＴ減少によって測定される細胞生存率を示す。ＨＥＫ－Ｌｕｃ細胞については条件ごとにＮ＝４、初代ニューロンについては条件ごとにＮ＝３ウェル。データは平均±ＳＥＭを表す。対照（細胞のみ）条件と比較した各条件での一方向ＡＮＯＶＡ後のＢｏｎｆｏｒｒｏｎｉ事後分析による^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図2】図２Ａ～図２Ｄは、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶの効力は、空のＴＣＶを生成するために使用される混合方法に依存しない。図２Ａは、５０％のイオン化可能な脂質で構成され、Ｔ字型混合（ＤＯＤＭＡ－５０％）又は押出（ＤＯＤＭＡ－５０％－Ｘ）のいずれかによって形成されたＴＣＶによるトランスフェクション後のＨＥＫ－Ｌｕｃ細胞における相対的ルシフェラーゼ発現を示す。図２Ｂは、対照（細胞のみ）ウェルの％としての、図２Ａと同じトランスフェクションセットからの細胞生存率を示す。図２Ｃは、図２Ａと同じＴＣＶパネルを使用したｈｄｈを標的とするｓｉＲＮＡの有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶ媒介トランスフェクション後の初代皮質ニューロンにおけるｈｄｈ ｍＲＮＡの相対的発現を示す。図２Ｄは、オフターゲット（ルシフェラーゼ）ｓｉＲＮＡを送達するための、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを使用した初代皮質ニューロンへの同等のトランスフェクションセットのＭＴＴ減少によって測定される細胞生存率を示す。ＨＥＫ－Ｌｕｃ細胞については条件ごとにＮ＝４、初代ニューロンについては条件ごとにＮ＝３ウェル。データは平均±ＳＥＭを表す。対照（細胞のみ）条件と比較した各条件での一方向ＡＮＯＶＡ後のＢｏｎｆｏｒｒｏｎｉ事後分析による^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図3】図３Ａ～図３Ｄは、イオン化可能な脂質の含有量が減少した有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の空のＴＣＶは、低毒性の強力なｓｉＲＮＡ送達を促進する。図３Ａは、２０％又は５０％のイオン化可能な脂質１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノ－プロパン（ＤＯＤＭＡ）で構成されたＴＣＶによるトランスフェクション後のＨＥＫ－Ｌｕｃ細胞における相対的ルシフェラーゼ発現を支示す。図３Ｂは、対照（細胞のみ）ウェルの％としての、図３Ａと同じトランスフェクションセットからの細胞生存率を示す。図３Ｃは、図３Ａと同じＴＣＶパネルを使用したｈｄｈを標的とするｓｉＲＮＡの有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶ媒介トランスフェクション後の初代皮質ニューロンにおけるｈｄｈ ｍＲＮＡの相対的発現を示す。図３Ｄは、オフターゲット（ルシフェラーゼ）ｓｉＲＮＡを送達するための、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを使用した初代皮質ニューロンにおける同等のトランスフェクションのセットのＭＴＴ減少によって測定される細胞生存率を示す。ＨＥＫ－Ｌｕｃ細胞については条件ごとにＮ＝４、初代ニューロンについては条件ごとにＮ＝３ウェル。データは平均±ＳＥＭを表す。対照（細胞のみ）条件と比較した各条件での一方向ＡＮＯＶＡ後のＢｏｎｆｏｒｒｏｎｉ事後分析による＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図4】図４Ａ～図４Ｂは、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の空のＴＣＶにＤＯＰＥを組み込んでも、ＴＣＶの形態は変化しない。有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の空のＴＣＶにＤＯＰＥを組み込んでも、ＴＣＶの形態は変化しない。Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ分析を、（Ａ）２０／３０／１０／３９／１ｍｏｌ％のＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－脂質（ＤＯＰＥ＝１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン；ＤＳＰＣ＝１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン；ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール）及び（Ｂ）ＤＯＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－脂質（５０／１０／３９／１ｍｏｌ％）のＴＣＶについて実施した。スケールバー＝１００ｎｍ。

【図5】本明細書の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の空のＴＣＶは、機能性リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を送達するために使用することができる。ＨＥＫ２９３細胞をＣａｓ９ ＲＮＰ及び一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）修復鋳型でトランスフェクトし、双方を、本明細書の方法に従って作製した有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶによって送達した。Ｃａｓ９タンパク質を、ＧＲＮ遺伝子を標的とするガイドに複合体化した。トランスフェクションの４８時間後に細胞からＤＮＡを抽出した。野生型（ＷＴ）ＧＲＮ対立遺伝子又は、送達されたｓｓＯＤＮがＣａｓ９によって生じたＤＮＡ二本鎖切断に相同組換え修復（ＨＤＲ）によって組み込まれた場合にのみ存在する変異型ＧＲＮ対立遺伝子を、ＰＣＲを使用して特異的に検出した。変異型ＧＲＮ対立遺伝子は、Ｃａｓ９ ＲＭＰのＴＣＶ媒介送達後に検出することができるが、対照（Ｃｔｒｌ）細胞には存在しない。

【図6】初代ニューロン内に位置するＣａｓ９の顕微鏡写真である。本明細書に記載の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを介して送達されるＲＮＰは、赤色で示されるＣａｓ９タンパク質に対する蛍光抗体を使用して検出することができる。未処理対照は、そのような赤色蛍光シグナルを有さない。青色シグナル＝核酸（ＤＡＰＩ染色）、緑色シグナル＝ファロイジン（Ｆ－アクチン染色）。

【図7】ＨＥＫ細胞における空の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶへのＲＮＰのベンチトップローディングによって送達されるＲＮＰによる転写ノックダウンを示すグラフである。ＨＥＫ２９３細胞を、ルシフェラーゼを標的とするＣａｓ９ ＲＮＰでトランスフェクトした。（ＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（２０／３０／１０／４０））の配合率のＴＣＶをベンチでロードした。ｑＰＣＲによって測定したＨＥＫ細胞におけるルシフェラーゼｍＲＮＡの相対レベルは、対照（図中では「ｃｔｒｌ」）と比較して有意なノックダウンを示している。群あたりＮ＝３。データは平均±ＳＥＭを表す。スチューデントのｔ検定によりｐ＝０．００１８。

【図8】ＨＥＫ細胞における空の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶへのＲＮＰのベンチトップローディングによって送達されるＲＮＰによるタンパク質ノックダウンを示すグラフである。ＨＥＫ２９３細胞を、ルシフェラーゼを標的とするＣａｓ９ ＲＮＰでトランスフェクトした。（ＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（２０／３０／１０／４０））の配合率のＴＣＶをベンチでロードした。ＯＮＥ－Ｇｌｏによって測定したＨＥＫ細胞におけるルシフェラーゼタンパク質の相対レベルは、対照（図中では「ｃｔｒｌ」）と比較して有意なノックダウンを示している。群あたりＮ＝３。データは平均±ＳＥＭを表す。スチューデントのｔ検定によりｐ＝０．０００３。

【図9】初代皮質ニューロンにおける空の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶへのＲＮＰのベンチトップローディングによって送達されるＲＮＰによる転写ノックダウンを示すグラフである。初代皮質ニューロンを、ヒトハンチンチン（ＨＴＴ）を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰでトランスフェクトした。（ＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（２０／３０／１０／４０））の配合率のＴＣＶをベンチでロードした。ｑＰＣＲによって測定した初代ニューロンにおけるＨＴＴ ｍＲＮＡの相対レベルは、対照（図中では「ｇＬｕｃ」）と比較して有意なノックダウンを示している。群あたりＮ＝３。データは平均±ＳＥＭを表す。スチューデントのｔ検定によりｐ＝０．００３９。

【図10】ＨＥＫ細胞における有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを介して送達されるｍＲＮＡについてのｍＲＮＡ発現を示すグラフである。ルシフェラーゼｍＲＮＡを、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶ（ＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（２０／３０／１０／４０））を介して、様々な比率、すなわち、低＝０．０２９ｍｇのｍＲＮＡ／μｍｏｌ脂質、中＝０．０５８ｍｇのｍＲＮＡ／μｍｏｌ脂質、高＝０．１１６ｍｇのｍＲＮＡ／μｍｏｌ脂質でＨＥＫ細胞に送達した。すべての比率が対照と比較して有意な発現を示し、最も低い比率が最も高い発現を示した。ｍＲＮＡ発現をＯＮＥ－Ｇｌｏ＋Ｔｏｘキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した（条件あたりＮ＝３）。

【図11】初代皮質ニューロンにおける有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを介して送達されるｍＲＮＡについてのｍＲＮＡ発現を示すグラフである。ルシフェラーゼｍＲＮＡを、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶ（ＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（２０／３０／１０／４０））を介して、異なる投与量で初代皮質ニューロンに送達した。すべての投与量が対照と比較して有意な発現を示した。ｍＲＮＡ発現をＯＮＥ－Ｇｌｏ＋Ｔｏｘキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した（条件あたりＮ＝３）。

【図12】ＨＥＫ細胞における有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶにおけるＲＮＰについての細胞生存率を示すグラフである。ＲＮＰを、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶ（ＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（２０／３０／１０／４０））を介して、又は細胞毒性評価のためにＲＮＡｉＭａｘ（図中の「Ｒｍａｘ」；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用してＨＥＫ細胞に送達した。有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶは、ＲＮＡｉＭａｘと比較して有意に毒性が低かった（ｐ＝０．０００２）。ＯＮＥ－Ｇｌｏ＋Ｔｏｘキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を群あたりＮ＝３で用いて毒性を評価した。

【図13】初代ニューロンにおける空の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶへのｓｉＲＮＡのベンチトップローディングについての細胞生存率を示す顕微鏡写真である。ｓｉＲＮＡを、有機溶媒非含かつ界面活性剤不含のＴＣＶ（ＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－脂質（２０／３０／１０／３９／１））を介して、又は市販のＭｉｒｕｓ ＴＫＯシステム（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を使用して、細胞毒性評価のために初代ニューロンに送達した。顕微鏡写真によって示されるように、ベンチトップローディングによって空の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶに送達されたｓｉＲＮＡは、Ｍｉｒｕｓ ＴＫＯシステムと比較して有意に毒性が低かった。

【図14】ＨＥＫ細胞における有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶのノックダウンを示すグラフである。ｓｉＲＮＡを、５０％（「Ｄ－５０％」、Ｔ字型混合によって作製）、５０％（「Ｄ－５０％ Ｅｘ」、押出によって作製）の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶ ＤＯＤＭＡレベルで、市販のＭｉｒｕｓ ＴＫＯシステム（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を使用して送達した。本発明の５０％ＤＯＤＭＡ配合物は約５０％のノックダウンを示したが、Ｍｉｒｕｓ ＴＫＯシステムの性能はより劣っていた。

【発明を実施するための形態】

【0034】

本明細書におけるシステム、組成物、装置及び方法などは、ＤＮＡ及び他の核酸選択カーゴを標的細胞に安全かつ効率的に送達するように構成された、本明細書において典型的にはトランスフェクション・コンピテント・ベシクル（ＴＣＶ）と呼ばれる脂質ベースのベシクルを提供する。安全性及び効率はそれぞれ、及び両方とも、ＴＣＶローディング及び貯蔵プロセス（すなわち、選択カーゴをＴＣＶに挿入する）及び／又はＴＣＶ送達プロセスから、例えばエタノールなどの有機溶媒及びドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤などの破壊剤を除去することによって部分的に達成される。ＴＣＶ送達プロセスは、初代細胞などの哺乳動物細胞の選択カーゴによるトランスフェクションを含み得る。選択カーゴはまた、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）などのタンパク質と複合体化した核酸を含み得る。

【0035】

いくつかの実施形態では、本明細書のシステム、組成物、装置及び方法などは、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の空の脂質ベースのＴＣＶを提供する。ロードされたＴＣＶは、ピペット内のＴＣＶ生成流体の反復手動往復動、ＳＨＭ、Ｔ字型混合もしくは押出方法、又は必要に応じて他のＴＣＶ混合方法などの穏やかな混合を使用して生成することができる。

【0036】

一態様では、脂質ベースのＴＣＶは、イオン化可能なカチオン性脂質、リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ－脂質の混合物から構成され、ＴＣＶ含有組成物は、有機溶媒及び／又は界面活性剤不含である。

【0037】

本明細書で論じる有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶは、例えば遺伝子治療を介して、適切な疾患及び状態の治療に使用することができる。本明細書で論じる有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶは、ヒト患者へのＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＰ遺伝子治療製品の送達を改善する。有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶは、遺伝子治療（ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びＲＮＰを含むがこれらに限定されない）製品を脳細胞又は他の標的細胞に効果的に送達する。多くのヒト障害の根底にある原因は、必要なタンパク質の機能喪失又は変異タンパク質の毒性機能獲得である。これらの原因は、本明細書の有機溶媒不含界面活性剤不含ＴＣＶを使用して治療可能であり、さらには可逆化可能である。

【0038】

そのような治療のいくつかの例には、神経障害（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症などのいくつかの症例）を治療するための中枢神経系における遺伝子治療が含まれる。

【0039】

本明細書で論じる有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶはまた、例えばｓｉＲＮＡもしくはＲＮＰの標的化された安全な送達、ｍＲＮＡによる遺伝子置換療法、又はＲＮＰ媒介遺伝子編集による原因となる天然のＤＮＡ突然変異の修正を介して、突然変異遺伝子／遺伝子産物を遺伝学的に「ノックダウン」することもできる。この方法で標的とすることができるヒト疾患の２つの具体例は、ハンチントン病（ＨＤ）及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）である。

【0040】

ハンチントン病は、優性遺伝パターンを有する進行性の不治の神経変性疾患である。ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子内の伸長したＣＡＧヌクレオチド反復配列がこの疾患の原因である。変異ＨＴＴ遺伝子によってコードされるハンチンチンタンパク質（ＨＴＴ）は、遺伝子産物に毒性機能獲得をもたらす伸長したポリグルタミン反復を含有する。変異ハンチンチンタンパク質の脳レベルを低下させることは、ＨＤにおける疾患進行を遅らせるため又は停止させるために現在追求されている主要な治療戦略であり、本明細書中で論じられるように、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを使用して達成及び改善することができる。ＨＴＴ発現を標的とするｓｉＲＮＡ又はハンチンチン発現もしくは毒性を減少させるように設計されたＲＮＰ選択カーゴをロードしたＴＣＶはＨＤの有効な治療法となる。前頭側頭型認知症には多くの原因があるが、タンパク質プログラニュリン（潜在的脳生存因子）の喪失は１つのよく説明された原因である。本明細書で論じられる有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶは、プログラニュリンｍＲＮＡを送達することができるか、又はプログラニュリンを発現するかもしくはプログラニュリン喪失を引き起こす根底にあるＤＮＡ突然変異を修正するように設計されたＲＮＰ（それぞれ）は、プログラニュリンの脳レベルを増加させ、ＦＴＤの有効な治療法となる。プログラニュリンｍＲＮＡを発現するＴＣＶでプログラニュリンを増加させることはまた、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び筋萎縮性側索硬化症などの多くの一般的な神経疾患の神経保護戦略となり得る。

【0041】

材料及び方法の例

【0042】

材料
１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノ－プロパン（ＤＯＤＭＡ）は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ミシガン州アナーバー）から購入した。１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（アラバマ州アラバスター）から購入した。コレステロールは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。ＰＥＧ－ＤＭＧを、以前に記載されているように（Ａｋｉｎｃ，Ｚｕｍｂｕｅｈｌら、２００８）合成した。すべての脂質をエタノールストックとして維持した。ホタルルシフェラーゼ（ｓｉＬｕｃ）を標的とするｓｉＲＮＡ（Ｂａｓｈａ，Ｏｒｄｏｂａｄｉら、２０１６）を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州コーラルビル）から購入した。マウスｈｄｈに対するｓｉＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎから購入した（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｅ－ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｉＲＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）。

【0043】

トランスフェクション・コンピテント・ベシクル（ＴＣＶ）の調製
脂質成分（イオン化可能なカチオン性脂質、リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ－脂質）を適切な比でエタノールに溶解して、２０～３５ｍＭの総脂質の最終濃度を達成した。ｐＨ４の２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を含有する水相を調製した。２つの確立されたナノ粒子作製技術：高速混合及び押出を使用して、２つの溶液を混合した。

【0044】

高速混合：
脂質を含有する有機相を、ＰＥＥＫ Ｌｏｗ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｔｅｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（１／１６インチ、貫通孔０．０２インチ、部品番号Ｐ－７１２）の仕様を満たすように製造されたＴ分岐ミキサにより、２０ｍＬ／分の最終流速で１：３の有機：水性比（ｖ／ｖ）で水相と混合した（Ｊｅｆｆｓ，Ｐａｌｍｅｒら、２００５；Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ｔａｍら、２０１７；Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ｄａｒｊｕａｎら、２０１８）。得られた懸濁液を１０００倍の体積の２５ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４緩衝液で透析してエタノールを除去した。

【0045】

押出：
脂質をエタノールに溶解して最終濃度を３５ｍＭとした。他の文献に記載されているように（Ｍａｕｒｅｒ，Ｗｏｎｇら、２００１）、エタノール溶液にｐＨ４の２５ｍＭ酢酸ナトリウムを迅速に添加して、エタノールの最終濃度（ｖ／ｖ）を３０％とすることによって、粒子を生成した。得られたナノ粒子懸濁液を、周囲温度で２×８０ｎｍのポリカーボネート膜を通して３回押し出した。押出後、粒子を緩衝液交換してエタノールを除去した。

【0046】

トランスフェクション・コンピテント・ベシクル（ＴＣＶ）の分析
Ｔ－Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用してコレステロール含有量についてアッセイし、他の文献に記載されているように（Ｃｈｅｎ，Ｔａｍら、２０１４）総脂質濃度を外挿することによって、脂質濃度を求めた。核酸捕捉を、以前に記載されているように（Ｃｈｅｎ，Ｔａｍら、２０１４；Ｌｅｕｎｇ，Ｔａｍら、２０１５）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイを使用して求めた。

【0047】

極低温透過型電子顕微鏡法
Ｃｒｙｏ－ＴＥＭを、以前に記載されているように（Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ｄａｒｊｕａｎら、２０１８）実施した。簡潔には、Ａｍｉｃｏｎ遠心濃縮ユニット（１０ｋＤａ ＮＷＣＯ）を使用して、ＴＣＶを約２０ｍｇ／ｍＬの総脂質濃度に濃縮した。少量（３～５ｕＬ）の材料をグロー放電銅グリッドに塗布し、ＦＥＩ Ｍａｒｋ ＩＶ Ｖｉｔｒｏｂｏｔ（オレゴン州ヒルズボロ）を使用してプランジャ凍結させた。グリッドをイメージングまで液体窒素下で保存した。すべてのイメージングは、低線量モードで２００ｋＶで動作するＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２装置を使用して実施した。ＦＥＩ Ｅａｇｌｅ ４ｋ ＣＣＤボトムマウント検出器を使用してイメージをキャプチャした。すべての試料調製及びイメージングは、ＵＢＣ ＢｉｏＩｍａｇｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ブリティッシュコロンビア州バンクーバー、カナダ）で行った。

【0048】

細胞培養及び試薬：
すべてのベース細胞培養培地及びＢ２７神経細胞サプリメントは、Ｇｉｂｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）から購入した。ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、ペニシリン－ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン及びトリプシン溶液をＨｙｃｌｏｎｅ（ユタ州ローガン）から入手した。ＨＥＫ２９３細胞をＣｏｒｎｉｎｇ（ニューヨーク州コーニング）製の透明底白色壁プレートに播種した。初代皮質細胞を、ポリ－Ｄ－リシン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）でコーティングした組織培養処理プレート（Ｆｉｓｈｅｒ）上に播種した。ハイグロマイシンＢをＩｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から入手した。組換えＡｐｏＥ ４をＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（ニュージャージー州ロッキーヒル）から得た。

【0049】

ＨＥＫ２９３細胞における細胞生存率及びルシフェラーゼレベルを測定するために、Ｐｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）製のＯＮＥ－Ｇｌｏ＋Ｔｏｘキットを使用した。初代ニューロンにおける細胞生存率を、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）製のＭＴＴ ｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性キットによって測定した。
ルシフェラーゼレポータＨＥＫ２９３細胞：

【0050】

安定に組み込まれたルシフェラーゼレポータ構築物を有するＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ－Ｌｕｃ細胞）の作製は以前に記載されている（Ｄｅ Ｓｏｕｚａ、Ｉｓｌａｍ他、２０１６）。細胞を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ－グルタミン及び１２５μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを補充したＤＭＥＭ高グルコース中に、９５％の空気、５％のＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃で維持した。細胞を１２，０００～２０，０００細胞／ウェルの密度で白色壁９６ウェルプレートに播種した。

【0051】

初代細胞培養：
皮質培養物を、胚性のＥ１７．５日目のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＦＶＢ．ＹＡＣ１２８マウスから調製した。簡潔には、氷冷ＨＢＳＳ中で皮質を切開し、０．０５％トリプシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）溶液を用いて３７℃で１０分間組織を消化した。次いで、皮質を５ｍＬのピペットで５回トリチュレートし、２００μＬのピペットチップを加えてさらに５～７回トリチュレートした。細胞を８００ｒｐｍで５分間の遠心分離によってペレット化し、ＨＢＳＳで洗浄し、次いで、Ｂ２７、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充した温かい神経基礎培地に再懸濁した。皮質ニューロン培養物を、１．５×１０^５細胞／ウェルの密度でポリ－Ｄリシン被覆２４ウェルプレートに播種した。細胞を、９５％の空気、５％のＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃で維持した。

【0052】

トランスフェクション：
すべての試薬をベンチトップ上で混合した。５０％のカチオン性脂質を含有する空のＴＣＶを、脂質μモル当たり０．０５８ｍｇのｓｉＲＮＡの比でｓｉＲＮＡと混合した。２０％のカチオン性脂質を含有するＴＣＶを、脂質μモル当たり０．０２２ｍｇのｓｉＲＮＡで混合した。ＴＣＶ懸濁液をピペットによってｓｉＲＮＡと短時間混合し、室温で１０分間インキュベートした。

【0053】

ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。ＴＣＶ：ｓｉＲＮＡ混合物に、ｓｉＲＮＡの最終濃度が３．３μｇ／ｍＬとなるように完全ＤＭＥＭ培地を添加し、トランスフェクション時に培地を完全に交換した。

【0054】

初代神経細胞をトランスフェクション前に７日間インビトロで増殖させた。２～６μｇ／ｍＬの組換えＡｐｏＥ４を含む完全な神経基底培地をＴＣＶ：ｓｉＲＮＡ懸濁液に加え、培地の半分を各ウェルから交換した。
ルシフェラーゼアッセイ：

【0055】

トランスフェクションの４８～７２時間後に、ＯＮＥ－Ｇｌｏ＋Ｔｏｘキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の説明書に従って使用して、ＨＥＫ２９３細胞の細胞生存率及び発光をアッセイした。簡潔には、生細胞試薬を各ウェルに添加し、細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。プレートをプレートリーダ（ＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダ、ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）で４００ｎｍの励起でアッセイし、５１０ｎｍの発光波長で読み取った。次いで、ＯＮＥ－Ｇｌｏ試薬を加え、プレートを室温で３分間インキュベートした。発光を、同じプレートリーダのレンズを通した光出力によって測定した。値は％対照として示され、条件ごとにＮ＝４ウェルを表す。

【0056】

ＭＴＴアッセイ：
初代皮質ニューロンの細胞生存率を、２４ウェルプレートでのトランスフェクションの７２時間後にＭＴＴアッセイによってアッセイした。ＭＴＴ試薬（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド、又はＭＴＴ）をＨＢＳＳ中で最終濃度５ｍｇ／ｍＬに再構成し、１０％ｖ／ｖで各ウェルに添加した。細胞を３７度で４時間インキュベートした。培地を除去し、２５０μＬの可溶化溶液を各ウェルに添加した。吸光度を５７０ｎｍで測定した。値は対照％として示され、条件ごとにＮ＝３ウェルを表す。

【0057】

定量ＲＴ－ＰＣＲ
接着性初代皮質細胞を滅菌ＰＢＳ中で一回洗浄した後、１％の２－メルカプトエタノールを含有する６００μＬの溶解緩衝液中でプレートから掻き取り、直ちに－８０℃で凍結した。続いて、製造者の説明書に従って実施したＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡミニキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。すべてのサンプルの逆転写を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用し、ｃＤＮＡ合成のためのインプットとして２５０ηｇの全ＲＮＡ及び定量ＰＣＲ反応のための５ηｇの希釈ＲＮＡを使用して行った。ｈｄｈ ｍＲＮＡレベルの定量化を、標的ｍＲＮＡ及び対照遺伝子を別個のウェルで増幅する標準曲線法で、ＦａｓｔＳｙｂｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、Ｓｔｅｐ－Ｏｎｅ ＡＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。各サンプルをデュプリケートで実行した。各ウェル中のｍＲＮＡの相対量を、ｈｄｈ ｍＲＮＡと対照遺伝子Ｃｓｎｋ２ａ２との比として計算した。値は対照％として示され、条件ごとにＮ＝３ウェルを表す。

【0058】

リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の材料及び生成
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）、及び組換えＣａｓ９タンパク質を含むＲＮＰ配合物のすべての材料を、ＩＤＴ（カリフォルニア州サンノゼ）から入手した。ルシフェラーゼを標的化するために使用されるｇＲＮＡ配列は、ＩＤＴ（カリフォルニア州サンノゼ）によって提供された。ヒトプログラニュリン（ＧＲＮ）を標的とするｇＲＮＡ配列は、遺伝子のエクソン５に結合する。相同組換え修復（ＨＤＲ）に使用されるｓｓＯＤＮ配列を、ＧＲＮのエクソン５に４ｂｐ欠失を導入するように操作した。

【0059】

ＲＮＰの組み立てを、製造業者の仕様に従って行った。簡潔には、例えば１μＭのｔｒａｃｒＲＮＡと１μＭのｇＲＮＡなどの等モル比のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡを９５℃で５分間インキュベートすることによって、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）複合体を形成した。次いで、混合物を室温で２０～３０分間冷却した。続いて、ｇＲＮＡ二重鎖を等モル比でＣａｓ９タンパク質と混合し、混合物を使用前に室温で５分間放置することによってＲＮＰを形成した。

【0060】

核酸による哺乳動物細胞のトランスフェクション：
本明細書で論じられるような、空の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶ及び、比較のための市販の試薬を、ベンチトップ上で選択カーゴと混合した。ＴＣＶを、脂質１μモル当たり核酸０．０１～０．２ｍｇの比の範囲で核酸選択カーゴと混合した。ＴＣＶ懸濁液をピペットによってｓｉＲＮＡと短時間混合し、室温で１０分間インキュベートした。

【0061】

ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。ＴＣＶ：核酸混合物に、ｓｉＲＮＡの最終濃度が０．３３～３．３μｇ／ｍＬ、又はｍＲＮＡが０．１～１μｇ／ｍＬとなるように完全ＤＭＥＭ培地を添加し、トランスフェクション時に培地を完全に交換した。初代神経細胞をトランスフェクション前に７日間インビトロで増殖させた。２～６μｇ／ｍＬの組換えＡｐｏＥ４を含む完全な神経基底培地をＴＣＶ：核酸懸濁液に加え、培地の半分を各ウェルから交換した。

【0062】

細胞を、製造者の説明書に従ってＭｉｒｕｓ ＴｒａｎｓＩＴ－ＴＫＯで処理した。簡潔には、Ｍｉｒｕｓ ＴｒａｎｓＩＴ－ＴＫＯを５μＬのＭｉｒｕｓ／１００μＬの無血清培地の濃度で無血清培地に添加した。次いで、ｓｉＲＮＡをチューブに添加し、穏やかにピペットで混合し、室温で１５～３０分間インキュベートした。次いで、溶液を細胞上に移し、Ｍｉｒｕｓの最終濃度は５μＬ／１ｍＬの完全培地であった。ｓｉＲＮＡの最終濃度は２５ｎＭであった。

【0063】

ＲＮＰによる哺乳動物細胞のトランスフェクション：
０．５～２０ｍＭのＴＣＶ及び０．５～２０μＭのＲＮＰを、４６７～５０００のモル比で混合し、室温で１０分間インキュベートした。別途、ｓｓＯＤＮの１～１０μＭ溶液をＴＣＶと混合し、この混合物を室温で５～１５分間インキュベートした。場合によっては、等モル量のｓｓＯＤＮをＴＣＶの添加前にＲＮＰ複合体溶液に添加した。

【0064】

ＲＮＰを含有するＴＣＶとｓｓＯＤＮ混合物とを混合し、完全培地を添加してＲＮＰ及びｓｓＯＤＮそれぞれの最終濃度を１０～２００ｎＭとした。２４時間前に播種したＨＥＫ細胞に対して完全培地交換を行った。初代神経細胞をトランスフェクション前に５～７日間インビトロで増殖させた。２～６μｇ／ｍＬの組換えＡｐｏＥ４を含む完全な神経基底培地をＴＣＶ：ＲＮＰ混合物に加え、培地の半分を各ウェルから交換した。

【0065】

細胞を、製造者の説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ試薬で処理した。簡潔には、ＲＮＰ複合体を調製し、無血清培地とＲＮＡｉＭＡＸとの混合物に添加し、室温で５分間インキュベートし、播種した細胞に添加した。

【0066】

相同組換え修復の検出のためのＰＣＲ
野生型（ＷＴ）又は変異型ＧＲＮ対立遺伝子のいずれかに特異的なフォワードプライマ及び共通のリバースプライマを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、トランスフェクトＨＥＫ２９３培養物から抽出されたゲノムＤＮＡからＧＲＮエクソン５を増幅した。ＭｙＴａｑ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、米国）を製造者の説明書に従って使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、ＳｙｂｒＳａｆｅで染色した１．５％アガロースゲル上でのゲル電気泳動によって分離し、ＵＶ光下で画像化した。

【0067】

細胞を、３～４％のパラホルムアルデヒド溶液を使用して１５分間固定した。細胞を、０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳ中で１５分間透過処理した。細胞を、抗Ｃａｓ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体の１：１０００混合物を含有するＰＢＳＴと共に４℃で一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで三度洗浄し、各Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４蛍光二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ－ｉＦｌｕｏｒ ４８８ ＣｙｔｏＰａｉｎｔｅｒ抗体（Ａｂｃａｍ）の１：１０００混合物と共に室温で１時間インキュベートし、再び洗浄し、ＤＡＰＩを含有する溶液と共に５分間インキュベートして核を可視化した。

【0068】

統計
すべての統計的比較を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）としてボンフェローニ事後分析と共に行って、個々の平均を対照処理細胞と比較し、多重比較を補正した（Ｐｒｉｓｍ ６、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）。スチューデントのｔ検定を使用して、２つの群のみの場合の個々の平均を比較した。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。

【0069】

結果関連実施例
実施例１：空のトランスフェクション・コンピテント・ベシクル（ＴＣＶ）は有機溶媒なしで核酸を効率的に捕捉する

【0070】

Ｔ字型又はＳＨＭ混合によって生成された空のＴＣＶ配合物は、約８５％以上の捕捉効率を示した。本発明者らは、最初に、イオン化可能なカチオン性脂質で構成されたＴＣＶが有機溶媒又は界面活性剤の助けを借りずに核酸を捕捉する、観察されたインビボ遺伝子サイレンシング効力（ＤＯＤＭＡ＞＞ＤＬｉｎＤＡＰ＞ＤＯＤＡＰ）（「ＤＬｉｎＤＡＰ」は、１，２－ジリノイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパンである）の範囲にわたる能力を試験した。注目すべきことに、これらのいずれもが存在しない場合に、イオン化可能な脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－脂質（５０／１０／３９／１ｍｏｌ％）で構成される配合物は、０．０５８ｍｇのｓｉＲＮＡ／μｍｏｌ脂質の比でｐＨ４で混合し、続いてＰＢＳで中和すると、ｓｉＲＮＡをほぼ完全に（＞８５％）捕捉する（表１）。捕捉判定アッセイは、脂質成分による核酸からのＲＮＡ結合色素の排除に基づく。したがって、捕捉は、一過性の方法以上に外部培地からＲＮＡを捕捉する（すなわち、安定して捕捉する）と考えられる。製造プロセスに有機溶媒又は界面活性剤がないにもかかわらず、得られたＴＣＶ配合物は、驚くべきことに、有機溶媒を使用した迅速混合技術によって生成されたＬＮＰ－ｓｉＲＮＡについて他の文献（Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ、Ｈｕｆｔら、２０１２；Ｃｈｅｎ，Ｔａｍら、２０１４；Ｌｅｕｎｇ，Ｔａｍら、２０１５；Ｃｈｅｎ，Ｔａｍら、２０１６）で報告されたものと同様の捕捉効率を示した。

【0071】

【表1】

【0072】

実施例２：有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の空のＴＣＶ中のｓｉＲＮＡは、不死化細胞及び初代ニューロンにおいてロバストなノックダウンを示す

【0073】

核酸を捕捉し、続いてこれを毒性のない方法で送達する能力には、２つの別個の課題が存在する。上記の非有機溶媒／非界面活性剤脂質ベースのＴＣＶが核酸を効率的に捕捉したと判定した場合に、これらの遺伝子サイレンシング能力及びこれらが細胞生存率に及ぼす効果を、図１Ａ～図１Ｄに示す２つのシナリオで試験した。最初に、空の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを、ベンチトップローディングによりｓｉＬｕｃと混合し、ＨＥＫ－Ｌｕｃ細胞の処理に使用した。驚くべきことに、ＤＯＤＭＡベースのＴＣＶは約５０％のノックダウンを示し、ノックダウンの徴候を示さなかったＤＬｉｎＤＡＰ及びＤＯＤＡＰよりも良好に機能した（図１Ａ）。未処理細胞と比較した細胞生存率によって測定した場合、いずれの配合物も毒性を示さなかった（図１Ｂ）。次に、ｓｉＲＮＡを送達するＴＣＶの有効性及び毒性を、初代マウス皮質ニューロンにおけるｈｄｈ遺伝子で試験した。この場合にも（図１Ｃ）、ＤＯＤＭＡ－ＴＣＶは約５０％の遺伝子ノックダウン有効性を示したが、ＤＬｉｎＤＡＰ－ＴＣＶはより低いノックダウンを示し、ＤＯＤＡＰ－ＴＣＶは未処理細胞との差を示さなかった。一次ニューロンは、現在市販されているものなどの有害なトランスフェクション試薬の毒性影響を非常に受けやすいことに留意すべきである。図１３は、生存率に対する効果の違いを強調している。

【0074】

実施例３：多重混合プロセスは、強力な有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の空のＴＣＶを生成することができる

【0075】

図１に示す効力を達成するための製造プロセスにおいて混合局面が果たす役割及び得られた粒径を判定するために、ＤＯＤＭＡなどのイオン化可能な脂質を含有する有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の脂質ベースの空のＴＣＶを、Ｔ字型混合及び押出の両方によって製造した。図２Ａに示すように、ｓｉＲＮＡを空のＴＣＶにベンチトップでロードした後に両方のプロセスを使用することで、ＨＥＫ－Ｌｕｃ細胞においてルシフェラーゼが有意にノックダウンされた。Ｔ字型又は押出によって生成された粒子で処理した細胞の生存率に有意な差はなかった（図２Ｂ）。次に、初代皮質ニューロンを同じ溶媒不含かつ界面活性剤不含の脂質ベースのＴＣＶ配合物で処理し、両方のプロセスが同様の効力（図２Ｃ）及び同様の細胞生存率（図２Ｄ）を有する粒子をもたらすことが判明した。対照的に、初代培養物における本発明のトランスフェクション方法の毒性（図１３）は、非毒性かつ強力な配合物という目標を損なうものであった。

【0076】

実施例４：イオン化可能な脂質の含有量が減少した有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の空のＴＣＶは、低毒性の強力なｓｉＲＮＡ送達を促進する

【0077】

現在の臨床配合物に使用されている確立された脂質組成物（Ｐａｔｉｓｉｒａｎを参照）は、かなりの量のイオン化可能なカチオン性脂質（５０ｍｏｌ％）を含む（Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｓｅｌｌら、２０１２；Ｓｕｈｒ，Ｃｏｅｌｈｏら、２０１５）。そのような多量の含有は、インビボで５０％の遺伝子サイレンシング（ＥＤ_５０）を達成するための有効用量の改善を可能にするが（Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｓｅｌｌら、２０１２）、投与後の脂質代謝産物の持続性（Ｍａｉｅｒ，Ｊａｙａｒａｍａｎら、２０１３；Ｓａｂｎｉｓ，Ｋｕｍａｒａｓｉｎｇｈｅら、２０１８）及びそれらの分子に関連する毒性のために、高用量のレジメンかつ反復的な（又は感受性細胞型に対する）投与では、配合物が毒性となる。本発明の組成物、ＴＣＶなどは、生分解性であるか又は排出を促進する材料から構成することができる。ここで、本発明の組成物、ＴＣＶなどは、トランスフェクション効力を維持する毒性成分の量を減少させる。

【0078】

ＨＥＫ－Ｌｕｃ細胞においてルシフェラーゼをサイレンシングするためのＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－脂質（それぞれ２０／３０／１０／３９／１ｍｏｌ％）から構成される配合物のトランスフェクション能を試験した。ルシフェラーゼ発現の４０％のノックダウンが観察され（図３Ａ）、有意な毒性は認められなかった（図３Ｂ）。次に、本発明者らは、５０ｍｏｌ％のＤＯＤＭＡ－ＴＣＶと比較した、２０ｍｏｌ％のイオン化可能な脂質を有するＴＣＶがｓｉＲＮＡを初代ニューロンに送達する能力を試験した。すべての配合物がｈｄｈの６０％以下のノックダウンを示し（図３Ｃ）、一方、Ｔ字型混合によって生成されたＤＯＤＭＡ配合物は有意に改善された細胞生存率を示した（図３Ｃ）。

【0079】

実施例５：ＤＯＰＥの組み込みは、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の空のＴＣＶ形態を変化させない

【0080】

核酸送達ビヒクルにおけるＨ_ＩＩ相形成能力の改善は、エンドソームにおける膜融合を促進するための重要な因子であり得る（Ｈａｆｅｚ，Ｍａｕｒｅｒら、２００１）。本アプローチでは、Ｈ_ＩＩ相を採用することができる２つの例示的な脂質は、ＤＯＰＥ（単独）及びＤＯＤＭＡ（プロトン化され、アニオン性脂質と組み合わされる場合）である。有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶへのＤＯＰＥの組み込みが早期のＨ_ＩＩ相形成をもたらしたかどうかを判定するために、２０ｍｏｌ％のＤＯＤＭＡ－ＴＣＶ及び５０ｍｏｌ％のＤＯＤＭＡで構成される等価な配合物に対してＣｒｙｏ－ＴＥＭを実施した。得られた構造（図４Ａ、図４Ｂ）は、Ｈ_ＩＩ相を示さない二重層構造として視覚化されている。

【0081】

他者による以前の研究（Ｌｅｕｎｇ，Ｈａｆｅｚら、２０１２；Ｌｅｕｎｇ，Ｔａｍら、２０１５）は、ｓｉＲＮＡ含有量にかかわらずコアＬＮＰ配合物内にＨ_ＩＩ様の内部構造が存在することを示唆している。ＬＮＰ－ｓｉＲＮＡは、そのような構造を含有せず、むしろ密接に隣接した脂質層（Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ｄａｒｊｕａｎら、２０１８）の間に固定されたｓｉＲＮＡを有し、粒子全体に多層又はタマネギ様の形態を与えることが示されている。ｓｉＲＮＡが存在しない場合、ＬＮＰ配合物は、油相脂質を含有する電子密度の高いコアを採用する。したがって、本明細書の実施例は、ＴＣＶ形態がＬＮＰ系とは劇的に異なるが、依然として非常に効率的なトランスフェクション効力を有することを示す。

【0082】

実施例６：機能性リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を送達するために、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の空のＴＣＶを使用することができる。

【0083】

図５に示すように、本明細書の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の空のＴＣＶが核酸と複合体化したタンパク質選択カーゴを哺乳動物細胞に送達する能力についても試験した。簡潔には、組換えＣａｓ９タンパク質及びプログラニュリン遺伝子のエクソン５を標的とするガイドＲＮＡからなるリボ核タンパク質複合体を構築し、４６７：１（ＴＣＶ：ＲＮＰ複合体）のモル比でベンチトップローディング（ＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／（それぞれ２０／３０／１０／４０ｍｏｌ％）によって空のＴＣＶと組み合わせた。別途、プログラニュリン遺伝子のエクソン５に４ｂｐ欠失を導入するように設計された一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを、４２７５：１（ＴＣＶ：核酸）のモル比でＴＣＶと組み合わせた。それぞれの選択カーゴを含有するＴＣＶの２つの調製物を組み合わせて、最終濃度を１０ｎＭのＲＮＰ及び１０ｎＭのｓｓＯＤＮとし、次いでＨＥＫ細胞に添加した。４８時間後、野生型又は変異対立遺伝子のいずれかに特異的なフォワードプライマを使用したＰＣＲにより、相同組換え修復がプログラニュリン遺伝子標的で起こったか否かを判定した。図５に示すように、リボ核タンパク質複合体のそれぞれを含有するＴＣＶとｓｓＯＤＮとの組み合わせにさらされた細胞は、相同組換え修復（図５の第２のレーン、標識突然変異体）を介して４ｂｐ欠失の挿入をもたらしたが、未処理対照細胞は、プログラニュリン遺伝子のエクソン５部位での遺伝的変化を何らもたらさなかった（図５の第３及び第４レーン）。

【0084】

実施例７：機能性リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を送達するために使用される、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の空のＴＣＶのさらなる例。

【0085】

有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の空のＴＣＶを使用して、上記の方法で機能性リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を送達した。

【0086】

図６は、初代ニューロン内に位置するＣａｓ９の顕微鏡写真である。本明細書で論じられる有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを介して送達されるＲＮＰは、蛍光シグナルとして一次ニューロン内で見ることができるが、未処理対照はそのような蛍光シグナルを有さない。より具体的には、初代神経細胞の免疫細胞化学は、マウス由来の皮質ニューロンの核（青色）内でのＣａｓ９タンパク質（赤色）の局在化を示した。細胞形態を示すために、細胞をファロイジン（緑色）に染色した。

【0087】

図７は、ＨＥＫ細胞における有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを介して送達されるＲＮＰによる遺伝子ノックダウンを示すグラフである。有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを介してＨＥＫ細胞に送達されたＲＮＰは、対照（図中では「ｃｔｒｌ」）と比較してルシフェラーゼ転写物の有意なノックダウンを示している。図８は、ＨＥＫ細胞において、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを介して送達されるＲＮＰによるタンパク質ノックダウンを示すグラフである。有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを介してＨＥＫ細胞に送達されたＲＮＰは、対照（図中では「対照」）と比較してルシフェラーゼタンパク質の有意なノックダウンを示している、ｐ＝０．０００３。

【0088】

図９は、初代ニューロンにおける有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを介して送達されるＲＮＰによる遺伝子ノックダウンを示すグラフである。有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを介して初代皮質ニューロンに送達されたＲＮＰは、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）アッセイによる有意なｍＲＮＡノックダウンを示している、ｐ＝０．００３９。

【0089】

これらの図のいくつかのさらなる考察に目を向けると、図７及び図８は、本明細書における空のＴＣＶのベンチトップローディングによって送達されたＲＮＰが、ＨＥＫ細胞におけるレポータ遺伝子、ルシフェラーゼのロバストなノックダウンを示すことを示す。これは、ルシフェラーゼ出力（機能性タンパク質）並びにルシフェラーゼｍＲＮＡのｍＲＮＡレベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって測定することによって実証された。ＲＮＰ送達のこの同じアプローチを使用して、疾患変異を有する全長ヒトハンチンチン遺伝子を発現するＦＶＢ．ＹＡＣ１２８マウスに由来する皮質ニューロンにおけるハンチンチン遺伝子の発現を破壊した（図９）。ハンチンチンのｍＲＮＡレベルを、ＴＣＶ：ＲＮＰ混合物とのインキュベーションの７２時間後にｑＲＴ－ＰＣＲを使用して初代皮質ニューロンから定量した。

【0090】

実施例８：有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを介して送達されるｍＲＮＡの例

【0091】

上記の方法を使用してｍＲＮＡを送達するために使用される、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の空のＴＣＶのベンチトップローディング。

【0092】

図１０は、ＨＥＫ細胞における、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを介して送達されるｍＲＮＡの発現を示すグラフである。ｍＲＮＡを、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶ（ＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（２０／３０／１０／４０））を介して、様々な比率、すなわち、低＝０．０２９ｍｇのｍＲＮＡ／μｍｏｌ脂質、中＝０．０５８ｍｇのｍＲＮＡ／μｍｏｌ脂質、高＝０．１１６ｍｇのｍＲＮＡ／μｍｏｌ脂質でＨＥＫ細胞に送達した。すべての比率が対照と比較して有意な発現を示し、最も低い比率が最も高い発現を示した。

【0093】

図１１は、初代皮質ニューロンにおける、空の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶのベンチトップローディングによって送達されたｍＲＮＡの発現を示すグラフである。ｍＲＮＡを、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶ（ＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（２０／３０／１０／４０））を介して、様々な投与量で初代皮質ニューロンに送達した。すべての投与量が対照と比較して有意な発現を示した。

【0094】

これらの図のいくつかのさらなる考察に目を向けると、図１０は、本明細書で論じられるような有機溶媒不含かつ界面活性剤不含の空のＴＣＶのベンチトップローディングを使用して、機能性タンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞に送達することができることを実証している。簡潔には、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶを、０．０２９～０．１１６ｍｇの核酸：１μモルの脂質の比の範囲で、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡとピペットを用いて穏やかに混合した。この混合物を室温で５～２０分間インキュベートした後、完全培養培地を添加し、次いで、ＨＥＫ細胞（図１０参照）又は初代皮質ニューロン（図１１）を含むウェルに移した。Ｐｒｏｍｅｇａ製のＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキットを製造者の説明書に従って使用して、ルシフェラーゼ出力を測定した。結果は、選択カーゴ：ＴＣＶ濃度及び用量の範囲にわたって、これらの細胞型内でのルシフェラーゼタンパク質の産生を示す。

【0095】

実施例９：有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶと市販製品との比較

【0096】

空の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶのベンチトップローディングを使用して、上記の方法によりｓｉＲＮＡ又はＲＮＰをＨＥＫ細胞又は初代ニューロンに送達し、次いで、市販のシステムを使用した同等のトランスフェクションと対比した。本明細書の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶは、市販のシステムよりも優れていた。

【0097】

図１２は、ＨＥＫ細胞における有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶについての細胞生存率を示すグラフである。ＲＮＰを、有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶ（ＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（２０／３０／１０／４０））を介して、又は細胞毒性評価のためにＲＮＡｉＭａｘ（図中の「Ｒｍａｘ」；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用してＨＥＫ細胞に送達した。有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶは、ＲＮＡｉＭａｘと比較して有意に毒性が低かった（ｐ＝０．０００２）。

【0098】

図１３は、初代ニューロンにおける空の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶへのｓｉＲＮＡのベンチトップローディングについての細胞生存率を示す顕微鏡写真である。ｓｉＲＮＡを、有機溶媒非含かつ界面活性剤不含のＴＣＶ（ＤＯＤＭＡ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－脂質（２０／３０／１０／３９／１））を介して、又は市販のＭｉｒｕｓ ＴＫＯシステム（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏを使用して、細胞毒性評価のために初代ニューロンに送達した。有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶは、顕微鏡写真によって示されるように、Ｍｉｒｕｓ ＴＫＯシステムと比較して有意に毒性が低かった。

【0099】

図１４は、ＨＥＫ細胞における有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶのノックダウンを示すグラフである。ｓｉＲＮＡを、５０％（「Ｄ－５０％」、Ｔ字型混合によって作製）、５０％（「Ｄ－５０％ Ｅｘ」、押出によって作製）の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶ ＤＯＤＭＡレベルで、市販のＭｉｒｕｓ ＴＫＯシステム（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を使用して送達した。本発明の５０％ＤＯＤＭＡ配合物は約５０％のノックダウンを示したが、Ｍｉｒｕｓ ＴＫＯシステムは著しく劣っていた。

【0100】

これらの図のいくつかのさらなる議論に目を向けると、図１２は、本明細書中で論じられるような空の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶへのｓｉＲＮＡのベンチトップローディングが、マウス及びＨＥＫ細胞株に由来する初代神経細胞において低毒性特性及び効率的な発現ノックダウンを有することを示す。初代皮質ニューロンの処理のために、ＴＣＶをｓｉＲＮＡと約０．０２２～０．０５８ｍｇの核酸：１μｍｏｌの脂質の比で混合し、初代神経細胞を含むウェルに移した。図１３の光学顕微鏡写真は、すべて同じ倍率で撮影されたものであり、対照ウェル及びＴＣＶ処理ウェルでは、細胞は、プロセスが無傷で死細胞が非常に少ない、健康な状態のままであることを示している。Ｍｉｒｕｓ ＴｒａｎｓＩＴ－ＴＫＯ処理ウェルでは、細胞は、細胞プロセスが破壊され、小さく縮んだ（死）細胞の量が多い、かなり不健康な状態であるように見受けられる。

【0101】

図１２では、ＨＥＫ細胞を、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ及びＲＮＰ選択カーゴを含有するＴＣＶで処理した。ＨＥＫ細胞を、最終濃度５～５０ｎＭのＲＮＰ及びＴＣＶ試薬又はＲＮＡｉＭＡＸ試薬のいずれかで処理した。Ｐｒｏｍｅｇａ ＯＮＥ－Ｇｌｏ＋Ｔｏｘキットを用いて細胞生存率を評価し、未処理対照細胞と比較した。ＲＮＡｉＭＡＸで処理したＨＥＫ培養物は、対照ウェル及びＴＣＶ処理ウェルの両方と比較して、全体的な健康状態が有意に低いことを示す。

【0102】

図１４は、ｓｉＲＮＡ選択カーゴを送達する際の、市販の製品Ｍｉｒｕｓ ＬＴ－ＴＫＯと比較した本明細書で論じられる空の有機溶媒不含かつ界面活性剤不含のＴＣＶのベンチトップローディングの有効性を示している。ＴＣＶを、ルシフェラーゼ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡと、室温で５～１０分間、約０．０２２～０．０５８ｍｇの核酸：１μモルの脂質の比でインキュベートした。ＨＥＫ細胞を、製造者の説明書に従ってＭｉｒｕｓ ＬＴ－ＴＫＯで処理した。処理時に、ウェル中の培地を、ｓｉＲＮＡ：ＴＣＶ又はｓｉＲＮＡ：Ｍｉｒｕｓ ＬＴ－ＴＫＯ混合物のいずれかを含有する新鮮な増殖培地で完全に置換した。処理の７２時間後、ＨＥＫ細胞を、Ｐｒｏｍｅｇａ ＯＮＥ－Ｇｌｏ＋Ｔｏｘキットを使用して細胞生存率及びルシフェラーゼ産生についてアッセイし、すべての細胞を未処理対照ウェルと比較した。

【0103】

本明細書で使用されるすべての用語は、文脈又は定義が明らかにそうでないことを示さない限り、それらの通常の意味に従って使用される。また、特に明記しない限り、本明細書では、「又は」の使用は「及び」を含み、逆もまた同様である。非限定的な用語は、明示的に述べられていない限り、又は文脈が明らかに示していない限り、限定的であると解釈されるべきではない（例えば、「を含み、」、「を有し、」及び「を備え、」は、典型的には「限定されないが、」を示す。）。「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの特許請求の範囲を含む単数形は、明示的に述べられていない限り、又は文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形への言及を含む。

【0104】

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【0105】

特に明記しない限り、実施形態の１つ又は複数の特徴の条件又は関係特性を修飾する「実質的に」及び「約」などの本明細書における形容詞は、条件又は特性が、それが意図される用途のための実施形態の動作に許容される許容範囲内で定義されることを示す。

【0106】

本装置、システム及び方法などの範囲は、ミーンズプラスファンクション及びステッププラスファンクションの両方の概念を含む。しかしながら、請求項は、「手段」という語が請求項に具体的に記載されていない限り、「ミーンズプラスファンクション」の関係を示すと解釈されるべきではなく、「手段」という語が請求項に具体的に記載されている場合、「ミーンズプラスファンクション」の関係を示すと解釈されるべきである。同様に、請求項は、「ステップ」という語が請求項に具体的に記載されていない限り、「ステッププラスファンクション」の関係を示すと解釈されるべきではなく、「ステップ」という語が請求項に具体的に記載されている場合、「ステッププラスファンクション」の関係を示すと解釈されるべきである。

【0107】

以上から、例示の目的で特定の実施形態を本明細書で説明したが、本明細書の説明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な修正を行うことができることが理解されよう。したがって、システム及び方法などは、そのような修正、並びに本明細書に記載の主題のすべての置換及び組み合わせを含み、添付の特許請求の範囲又は本明細書の説明及び図において十分な裏付けを有する他の特許請求の範囲による場合を除いて限定されない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】