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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-12
(45)【発行日】2024-09-24
(54)【発明の名称】神経芽腫の微小残存病変マーカーを用いた生体試料の分析方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20240913BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z ZNA
【請求項の数】
21
(21)【出願番号】P 2021530741
(86)(22)【出願日】2020-07-10
(86)【国際出願番号】 JP2020027110
(87)【国際公開番号】W WO2021006345
(87)【国際公開日】2021-01-14
【審査請求日】2023-06-28
(31)【優先権主張番号】P 2019129601
(32)【優先日】2019-07-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504150450
【氏名又は名称】国立大学法人神戸大学
(74)【代理人】
【識別番号】100124431
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 順也
(74)【代理人】
【識別番号】100174160
【弁理士】
【氏名又は名称】水谷 馨也
(74)【代理人】
【識別番号】100175651
【弁理士】
【氏名又は名称】迫田 恭子
(72)【発明者】
【氏名】西村 範行
【審査官】坂井田 京
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第１８／１２３７６４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１２－２０５５９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－０４９２１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Oncol. Lett.，2016年，Vol.12，p.1119-1123
【文献】Oncol. Rep.，2013年，Vol.29，p.1629-1636
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経芽腫の微小残存病変の病勢、治療効果又は再発を評価すべき生体試料から、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨからなる神経芽腫の微小残存病変の７遺伝子マーカー各々の発現量Ａ１～Ａ７をデジタルＰＣＲにより測定する工程１と、前記発現量Ａ１～Ａ７の各々に対し、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々のデジタルＰＣＲによる発現量の統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を加味した重み付けを行うことで、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７を取得し、前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７の幾何平均又は総和を評価値として得る工程２と、
前記評価値を、神経芽腫の微小残存病変の有無に関するカットオフ値と比較し、前記評価値が前記カットオフ値を上回れば、前記生体試料について前記神経芽腫の微小残存病変陽性と判断する工程３と、
を含む、神経芽腫の微小残存病変マーカーを用いる生体試料の分析方法。
【請求項2】
前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７が、前記発現量Ａ１～Ａ７各々から統計学的数値Ｂ１～Ｂ７各々を差し引いて得られ（但し、差し引いた結果１未満の数値となる場合の前記重み付き発現量は１とする）、前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７の幾何平均を前記評価値として得る、請求項１に記載の生体試料の分析方法。
【請求項3】
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の１パーセンタイル以上の共通する特定のパーセンタイルにおける発現量であり、前記特定のパーセンタイルにおいて、前記７遺伝子マーカーの少なくともいずれかが検出される、請求項２に記載の生体試料の分析方法。
【請求項4】
前記生体試料が骨髄試料であり、前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の６～９２パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、請求項３に記載の生体試料の分析方法。
【請求項5】
前記生体試料が骨髄試料であり、前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、それぞれ、コントロールにおける、
ＣＲＭＰ１の３８～４４パーセンタイル、ＤＢＨの５３～６６パーセンタイル、ＤＤＣの５５～６３パーセンタイル、ＧＡＰ４３の４９～６５パーセンタイル、ＩＳＬ１の４０～５６パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの５１～７１パーセンタイル、ＴＨの５１～７１パーセンタイル；
ＣＲＭＰ１の３８～４４パーセンタイル、ＤＢＨの１～５２パーセンタイル、ＤＤＣの１～５４パーセンタイル、ＧＡＰ４３の８５～８６パーセンタイル、ＩＳＬ１の９２～９４パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの１～５０パーセンタイル、ＴＨの５１～７１パーセンタイル：又は、
ＣＲＭＰ１の８３パーセンタイル、ＤＢＨの１～５２パーセンタイル、ＤＤＣの１～５４パーセンタイル、ＧＡＰ４３の８５～８６パーセンタイル、ＩＳＬ１の９２～９４パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの１～５０パーセンタイル、及びＴＨの１～５０パーセンタイル
における発現量である、請求項２に記載の生体試料の分析方法。
【請求項6】
前記生体試料が末梢血試料であり、前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の６５～９９パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、請求項２に記載の生体試料の分析方法。
【請求項7】
前記生体試料が末梢血幹細胞試料であり、前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の２１～９９パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、請求項３に記載の生体試料の分析方法。
【請求項8】
前記生体試料が末梢血幹細胞試料であり、前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、それぞれ、末梢血試料のコントロールにおける、
ＣＲＭＰ１の９１～９９パーセンタイル、ＤＢＨの９１～９２パーセンタイル、ＤＤＣの９２～９５パーセンタイル、ＧＡＰ４３の９１～９２パーセンタイル、ＩＳＬ１の９８～９９パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの８７～９２パーセンタイル、ＴＨの８２～９３パーセンタイル
における発現量である、請求項２に記載の生体試料の分析方法。
【請求項9】
前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７が、前記発現量Ａ１～Ａ７各々から統計学的数値Ｂ１～Ｂ７各々を差し引いて得られ（但し、差し引いた結果負の数値となる場合の前記重み付き発現量は０とする）、前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７の総和を前記評価値として得る、請求項１に記載の生体試料の分析方法。
【請求項10】
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の１パーセンタイル以上の共通する特定のパーセンタイルにおける発現量であり、前記特定のパーセンタイルにおいて、前記７遺伝子マーカーの少なくともいずれかが検出される、請求項９に記載の生体試料の分析方法。
【請求項11】
前記生体試料が骨髄試料であり、前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の６～９３パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、請求項１０に記載の生体試料の分析方法。
【請求項12】
前記生体試料が末梢血試料であり、前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の２１～９９パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、請求項１０に記載の生体試料の分析方法。
【請求項13】
前記生体試料が末梢血幹細胞試料であり、前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の２１～９９パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、請求項１０に記載の生体試料の分析方法。
【請求項14】
前記生体試料が骨髄試料、末梢血試料又は末梢血幹細胞試料であり、前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、それぞれ、コントロールにおける前記７遺伝子マーカーの各パーセンタイルにおける発現量のうち、前記７遺伝子マーカー各々の前記微小残存病変の有無に関するカットオフ値に最も近い発現量である、請求項９に記載の生体試料の分析方法。
【請求項15】
前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７が、前記発現量Ａ１～Ａ７各々を統計学的数値Ｂ１～Ｂ７（但し、Ｂ１～Ｂ７はいずれも０でない）各々で除して得られ、前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７の総和を前記評価値として得る、請求項１に記載の生体試料の分析方法。
【請求項16】
前記生体試料が骨髄試料であり、前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の５４パーセンタイル以上のうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、請求項１５に記載の生体試料の分析方法。
【請求項17】
前記生体試料が末梢血試料であり、前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の９０パーセンタイル以上のうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、請求項１５に記載の生体試料の分析方法。
【請求項18】
前記生体試料が末梢血幹細胞試料であり、前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の９０パーセンタイル以上のうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、請求項１５に記載の生体試料の分析方法。
【請求項19】
前記生体試料が骨髄試料であり、前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、それぞれ、コントロールにおける、
ＣＲＭＰ１の３８～４４パーセンタイル、ＤＢＨの７７～８３パーセンタイル、ＤＤＣの７４～７９パーセンタイル、ＧＡＰ４３の３８～４８パーセンタイル、ＩＳＬ１の５７～６８パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの７２～７７パーセンタイル、ＴＨの７８～８３パーセンタイル；又は、
ＣＲＭＰ１の９２パーセンタイル、ＤＢＨの９１～９２パーセンタイル、ＤＤＣの９９パーセンタイル、ＧＡＰ４３の９３パーセンタイル、ＩＳＬ１の９６パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの９２～９３パーセンタイル、及びＴＨの８４～８７パーセンタイル
における発現量である、請求項１５に記載の生体試料の分析方法。
【請求項20】
前記生体試料が末梢血幹細胞試料であり、前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、それぞれ、末梢血試料のコントロールにおける、
ＣＲＭＰ１の９８～９９パーセンタイル、ＤＢＨの９０パーセンタイル、ＤＤＣの９８～９９パーセンタイル、ＧＡＰ４３の９２～９３パーセンタイル、ＩＳＬ１の９９パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの９０パーセンタイル、ＴＨの９０～９２パーセンタイル
における発現量である、請求項１５に記載の生体試料の分析方法。
【請求項21】
前記生体試料における前記７遺伝子マーカー各々の発現量Ａ１～Ａ７と、前記コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々のデジタルＰＣＲによる発現量とが、いずれも、少なくともレファレンス遺伝子の発現量で除した値であり、前記レファレンス遺伝子が、ＨＰＲＴ１、ＨＭＢＳ、ＧＵＳＢ、及びＴＢＰからなる群より選択される、請求項１～２０のいずれかに記載の生体試料の分析方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、神経芽腫の微小残存病変マーカーを用いた生体試料の分析方法に関する。より具体的には、本発明は、神経芽腫の微小残存病変の予測方法に関する。
【背景技術】
【0002】
神経芽腫は、神経堤細胞由来の難治性小児がんであり、小児がんの約１０％を占める。これは、脳腫瘍に次いで高い頻度である。また神経芽腫は、小児がん死亡原因の約１５％を占める。
神経芽腫は、５つの予後因子（病期、病理、年齢、ＭＹＣＮ増幅、ＤＮＡプロイディー）を用いて、低・中間・高リスク群に分類されるが、５０％を超える患者が高リスク群に分類される。そして、高リスク群患者の５０％超で再発する。
神経芽腫は、５つの予後因子（病期、病理、年齢、ＭＹＣＮ増幅、ＤＮＡプロイディー）を用いて、低・中間・高リスク群に分類されるが、５０％を超える患者が高リスク群に分類される。そして、高リスク群患者の５０％超で再発する。
【0003】
したがって、神経芽腫の予後改善、特に高リスク群患者の予後改善には、再発の起源と考えられる微小残存病変（ＭＲＤ）を正しく評価することが不可欠である。腫瘍細胞にのみに検出される遺伝子が同定されていない神経芽腫では、正常細胞に比して腫瘍細胞で高発現するいくつかの遺伝子をマーカーとすることで、ＭＲＤの検出が試みられてきた。
【0004】
神経芽腫のＭＲＤの遺伝子マーカーとして、非特許文献１で最初にＴＨが報告され、その後、非特許文献２でＰＨＯＸ２Ｂが報告された。さらに、非特許文献３では、ＣＨＧＡ、ＤＣＸ、ＤＤＣ、ＰＨＯＸ２Ｂ、およびＴＨの５種の遺伝子マーカーが報告されている。非特許文献４では、Ｂ４ＧＡＬＮＴ（GD2 synthase）、ＣＣＮＤ１、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂの４種の遺伝子マーカーが報告されている。非特許文献５では、ＣＨＲＮＡ３、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＰＨＯＸ２Ｂ、およびＴＨの５種の遺伝子マーカーが報告されている。
【0005】
一方、非特許文献６では、それまでの遺伝子マーカー探索において通常に用いられてきた接着培養したパレンタル神経芽腫細胞ではなく、生体内でＭＲＤを構成するがん幹細胞が濃縮されるように浮遊培養したスフェアー神経芽腫細胞を検証し、ＣＨＲＮＡ３、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＣＸ、ＤＤＣ、ＧＡＢＲＢ３、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＫＩＦ１Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、およびＴＨの１１種の遺伝子マーカーのうちいずれかが正常範囲を超えて発現している場合にＭＲＤ陽性とスコアするＭＲＤ検出プロトコールが提唱されている。非特許文献７では、２症例において、再発/再増殖の臨床診断よりも早期に、当該１１種の遺伝子マーカーによりＭＲＤ陽性と評価することが報告されている。上述の非特許文献６および非特許文献７では、遺伝子マーカーの測定にリアルタイムＰＣＲが用いられている。
【0006】
さらに、特許文献１では、神経芽腫のＭＲＤの検出能力が特に高い特定の７種の遺伝子マーカーとして、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨを見出している。この７種の遺伝子マーカーは、わずか７個の組み合わせでありながら、それぞれの遺伝子マーカーが神経芽腫のＭＲＤにおける検出能力に優れている。さらに、それぞれの遺伝子に対応するプライマーペア全てのアニーリング温度が揃い易いため、７種の遺伝子マーカーのいずれであっても同様に効率良く増幅させることができる。したがって、特許文献１では、同様に効率良く増幅されるこれら７種の遺伝子マーカーのうち１種以上の発現量が閾値以上であれば、神経芽腫のＭＲＤを陽性と判断する手法が開示されている。さらに、特許文献１では、神経芽腫のＭＲＤの正確な評価には、極めて微量な遺伝子マーカーの発現を検出する手段であるデジタルＰＣＲを用いることが望ましいことが開示されている。
【0007】
また、非特許文献８では、神経芽腫関連遺伝子としてＣＨＧＡ、ＤＣＸ、ＤＤＣ、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨの５種を用い、これら５種の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ量の幾何平均値と、再発性/難治性神経芽細胞腫における無増悪生存期間とが相関することが開示されている。また、幾何平均値を用いた予後予測のＡＵＣが０．６２２であったことが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】国際公開第２０１８／１２３７６４号
【非特許文献】
【0009】
【文献】International Journal of Cancer (1994) 57: 671-675.
【文献】Journal of Clinical Oncology (2008) 26: 5443-5449.
【文献】Lancet Oncology (2013) 14: 999-1008.
【文献】Journal of Clinical Oncology (2015) 33:755-763.
【文献】European Journal of Cancer (2016) 54: 149-158.
【文献】Oncology Reports (2013) 29: 1629-1636.
【文献】Oncology Letters (2016) 12: 1119-1123.
【文献】Clinical Cancer Research; (2017) 23 5374-5383.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明者は、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨからなる７個の神経芽腫のＭＲＤマーカー（以下において、「７遺伝子マーカー」とも記載する。）を用いたデジタルＰＣＲによって、健常コントロール検体および高リスク神経芽腫患者の保存検体を検証した。
【0011】
通常、マーカーを用いた分析において、疾患検体については数多く分析されるが、コントロールとして用いられる検体については数多く分析されることはない。しかしながら、本発明者がデジタルＰＣＲによって多数の健常コントロール検体を検証した結果、健常コントロール検体における７遺伝子マーカーの発現量の変動（バラツキ）が大きいという問題に直面した。これに付随して、神経芽腫診断時の検体と健常コントロール検体との間にさえ、７遺伝子マーカーの発現量に重なりがあることが明らかになった。
【0012】
これらの問題は、７遺伝子マーカーが低発現であることと、定量手段が、汎用されているｑＰＣＲではなく極めて高感度であるデジタルＰＣＲであることとに起因している。つまり、上記の問題は、当該７遺伝子マーカーの定量にデジタルＰＣＲ測定を用いる方法に特有のものとして見出された。従って、７遺伝子マーカーを用いた神経芽腫のＭＲＤ分析においては、通常のカットオフ値の設定方法では高感度且つ高特異度での分析を行うことができない。
【0013】
上記の点に鑑み、本発明は、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨからなる７遺伝子マーカーの定量にデジタルＰＣＲ測定を用いる神経芽腫のＭＲＤ分析法であって、分析の感度及び特異度を総合的に向上できる新たな手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者は、健常コントロール検体における７遺伝子マーカーを統計的に調べたところ、各７遺伝子マーカーの発現態様がそれぞれに異なることを見出した。例えば、ＣＲＭＰ１のように低いパーセンタイルから比較的多く発現するマーカーもあれば、ＤＢＨのように高いパーセンタイルに至るまで比較的発現量が低いままのマーカーもあることが判明した。当該７遺伝子マーカーは、多様性が著しい神経芽腫のＭＲＤにおいて特に検出能力に優れているとして厳選された精鋭マーカーであるが、この７遺伝子マーカーの間でも、さらに、重要度の低いもの（例えば、ＣＲＭＰ１のように健常コントロール検体においても比較的検出されやすいもの）、及び重要度の高いもの（例えば、ＤＢＨのように健常コントロール検体においても比較的検出されにくいもの）といった、重要度の違いが存在することが判明した。
【0015】
そこで、本発明者は、７遺伝子マーカー各々について、コントロールにおけるデジタルＰＣＲによる発現量の統計学的数値（例えば、特定のパーセンタイルにおける発現量）を、マーカーの非重要度を示す量として使用することを着想し、分析すべき検体における７遺伝子マーカーのデジタルＰＣＲによる発現量それぞれを、コントロールにおける当該統計学的数値（非重要度）を加味した重み付けを行うことで補正するという斬新な手法に思い至った。更に、重み付けにより補正した７遺伝子マーカーの発現量を幾何平均した値又は総計した値を評価値として用い、当該評価値をＭＲＤ有無のカットオフ値と比較することで、分析の感度及び特異度を総合的に向上できることを見出した。本発明は、この知見に基づいて、さらに検討を重ねることにより完成したものである。
【0016】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
＜項１＞
神経芽腫の微小残存病変の病勢、治療効果又は再発を評価すべき生体試料から、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨからなる神経芽腫の微小残存病変の７遺伝子マーカー各々の発現量Ａ１～Ａ７をデジタルＰＣＲにより測定する工程１と、
前記発現量Ａ１～Ａ７の各々に対し、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々のデジタルＰＣＲによる発現量の統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を加味した重み付けを行うことで、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７を取得し、前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７の幾何平均又は総和を評価値として得る工程２と、
前記評価値を、神経芽腫の微小残存病変の有無に関するカットオフ値と比較する工程３と、
を含む、神経芽腫の微小残存病変マーカーを用いる生体試料の分析方法。
＜項２＞
［減法による重み付き発現量の幾何平均］（項目２－３－１）
前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７が、前記発現量Ａ１～Ａ７各々から統計学的数値Ｂ１～Ｂ７各々を差し引いて得られ（但し、差し引いた結果１未満の数値となる場合の前記重み付き発現量は１とする）、前記重み付き発現量ＡＢ～ＡＢ７の幾何平均を前記評価値として得る、項１に記載の生体試料の分析方法。
＜項３＞
［減法による重み付き発現量の幾何平均－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－１）
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の１パーセンタイル以上の共通する特定のパーセンタイルにおける発現量であり、
前記特定のパーセンタイルにおいて、前記７遺伝子マーカーの少なくともいずれかが検出される、項２に記載の生体試料の分析方法。
＜項４＞
［減法による重み付き発現量の幾何平均－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－１）
前記生体試料が骨髄試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の６～９２パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項３に記載の生体試料の分析方法。
＜項５＞
［減法による重み付き発現量の幾何平均－可変パーセンタイル使用］（項目２－３－１）
前記生体試料が骨髄試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、それぞれ、コントロールにおける、
ＣＲＭＰ１の３８～４４パーセンタイル、ＤＢＨの５３～６６パーセンタイル、ＤＤＣの５５～６３パーセンタイル、ＧＡＰ４３の４９～６５パーセンタイル、ＩＳＬ１の４０～５６パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの５１～７１パーセンタイル、ＴＨの５１～７１パーセンタイル；
ＣＲＭＰ１の３８～４４パーセンタイル、ＤＢＨの１～５２パーセンタイル、ＤＤＣの１～５４パーセンタイル、ＧＡＰ４３の８５～８６パーセンタイル、ＩＳＬ１の９２～９４パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの１～５０パーセンタイル、ＴＨの５１～７１パーセンタイル：又は、
ＣＲＭＰ１の８３パーセンタイル、ＤＢＨの１～５２パーセンタイル、ＤＤＣの１～５４パーセンタイル、ＧＡＰ４３の８５～８６パーセンタイル、ＩＳＬ１の９２～９４パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの１～５０パーセンタイル、及びＴＨの１～５０パーセンタイル
における発現量である、項２に記載の生体試料の分析方法。
＜項６＞
［減法による重み付き発現量の幾何平均－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－１）
前記生体試料が末梢血試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の６５～９９パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項２に記載の生体試料の分析方法。
＜項７＞
［減法による重み付き発現量の幾何平均－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－１）
前記生体試料が末梢血幹細胞試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の２１～９９パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項３に記載の生体試料の分析方法。
＜項８＞
［減法による重み付き発現量の幾何平均－可変パーセンタイル使用］（項目２－３－１）
前記生体試料が末梢血幹細胞試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、それぞれ、末梢血試料のコントロールにおける、
ＣＲＭＰ１の９１～９９パーセンタイル、ＤＢＨの９１～９２パーセンタイル、ＤＤＣの９２～９５パーセンタイル、ＧＡＰ４３の９１～９２パーセンタイル、ＩＳＬ１の９８～９９パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの８７～９２パーセンタイル、ＴＨの８２～９３パーセンタイル
における発現量である、項２に記載の生体試料の分析方法。
＜項９＞
［減法による重み付き発現量の総和］（項目２－３－２－１）
前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７が、前記発現量Ａ１～Ａ７各々から統計学的数値Ｂ１～Ｂ７各々を差し引いて得られ（但し、差し引いた結果負の数値となる場合の前記重み付き発現量は０とする）、前記重み付き発現量ＡＢ～ＡＢ７の総和を前記評価値として得る、項１に記載の生体試料の分析方法。
＜項１０＞
［減法による重み付き発現量の総和－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－２－１）
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の１パーセンタイル以上の共通する特定のパーセンタイルにおける発現量であり、
前記特定のパーセンタイルにおいて、前記７遺伝子マーカーの少なくともいずれかが検出される、項９に記載の生体試料の分析方法。
＜項１１＞
［減法による重み付き発現量の総和－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－２－１）
前記生体試料が骨髄試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の６～９３パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項１０に記載の生体試料の分析方法。
＜項１２＞
［減法による重み付き発現量の総和－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－２－１）
前記生体試料が末梢血試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の２１～９９パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項１０に記載の生体試料の分析方法。
＜項１３＞
［減法による重み付き発現量の総和－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－２－１）
前記生体試料が末梢血幹細胞試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の２１～９９パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項１０に記載の生体試料の分析方法。
＜項１４＞
［減法による重み付き発現量の総和－可変パーセンタイル使用］（項目２－３－２－１）
前記生体試料が骨髄試料、末梢血試料又は末梢血幹細胞試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、それぞれ、コントロールにおける前記７遺伝子マーカーの各パーセンタイルにおける発現量のうち、前記７遺伝子マーカー各々の前記微小残存病変の有無に関するカットオフ値に最も近い発現量である、項９に記載の生体試料の分析方法。
＜項１５＞
［除法による重み付き発現量の総和］（項目２－３－２－２）
前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７が、前記発現量Ａ１～Ａ７各々を統計学的数値Ｂ１～Ｂ７（但し、Ｂ１～Ｂ７はいずれも０でない）各々で除して得られ、前記重み付き発現量ＡＢ～ＡＢ７の総和を前記評価値として得る、項１に記載の生体試料の分析方法。
＜項１６＞
［除法による重み付き発現量の総和－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－２－２）
前記生体試料が骨髄試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の５４パーセンタイル以上のうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項１５に記載の生体試料の分析方法。
＜項１７＞
［除法による重み付き発現量の総和－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－２－２）
前記生体試料が末梢血試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の９０パーセンタイル以上のうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項１５に記載の生体試料の分析方法。
＜項１８＞
［除法による重み付き発現量の総和－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－２－２）
前記生体試料が末梢血幹細胞試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の９０パーセンタイル以上のうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項１５に記載の生体試料の分析方法。
＜項１９＞
［除法による重み付き発現量の総和－可変パーセンタイル使用］（項目２－３－２－２）
前記生体試料が骨髄試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、それぞれ、コントロールにおける、
ＣＲＭＰ１の３８～４４パーセンタイル、ＤＢＨの７７～８３パーセンタイル、ＤＤＣの７４～７９パーセンタイル、ＧＡＰ４３の３８～４８パーセンタイル、ＩＳＬ１の５７～６８パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの７２～７７パーセンタイル、ＴＨの７８～８３パーセンタイル；又は、
ＣＲＭＰ１の９２パーセンタイル、ＤＢＨの９１～９２パーセンタイル、ＤＤＣの９９パーセンタイル、ＧＡＰ４３の９３パーセンタイル、ＩＳＬ１の９６パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの９２～９３パーセンタイル、及びＴＨの８４～８７パーセンタイル
における発現量である、項１５に記載の生体試料の分析方法。
＜項２０＞
［除法による重み付き発現量の総和－可変パーセンタイル使用］（項目２－３－２－２）
前記生体試料が末梢血幹細胞試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、それぞれ、末梢血試料のコントロールにおける、
ＣＲＭＰ１の９８～９９パーセンタイル、ＤＢＨの９０パーセンタイル、ＤＤＣの９８～９９パーセンタイル、ＧＡＰ４３の９２～９３パーセンタイル、ＩＳＬ１の９９パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの９０パーセンタイル、ＴＨの９０～９２パーセンタイル
における発現量である、項１５に記載の生体試料の分析方法。
＜項２１＞
前記生体試料における前記７遺伝子マーカー各々の発現量Ａ１～Ａ７と、前記コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々のデジタルＰＣＲによる発現量とが、いずれも、少なくともレファレンス遺伝子の発現量で除した値であり、前記レファレンス遺伝子が、ＨＰＲＴ１、ＨＭＢＳ、ＧＵＳＢ、及びＴＢＰからなる群より選択される、項１～２０のいずれかに記載の生体試料の分析方法。
＜項１＞
神経芽腫の微小残存病変の病勢、治療効果又は再発を評価すべき生体試料から、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨからなる神経芽腫の微小残存病変の７遺伝子マーカー各々の発現量Ａ１～Ａ７をデジタルＰＣＲにより測定する工程１と、
前記発現量Ａ１～Ａ７の各々に対し、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々のデジタルＰＣＲによる発現量の統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を加味した重み付けを行うことで、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７を取得し、前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７の幾何平均又は総和を評価値として得る工程２と、
前記評価値を、神経芽腫の微小残存病変の有無に関するカットオフ値と比較する工程３と、
を含む、神経芽腫の微小残存病変マーカーを用いる生体試料の分析方法。
＜項２＞
［減法による重み付き発現量の幾何平均］（項目２－３－１）
前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７が、前記発現量Ａ１～Ａ７各々から統計学的数値Ｂ１～Ｂ７各々を差し引いて得られ（但し、差し引いた結果１未満の数値となる場合の前記重み付き発現量は１とする）、前記重み付き発現量ＡＢ～ＡＢ７の幾何平均を前記評価値として得る、項１に記載の生体試料の分析方法。
＜項３＞
［減法による重み付き発現量の幾何平均－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－１）
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の１パーセンタイル以上の共通する特定のパーセンタイルにおける発現量であり、
前記特定のパーセンタイルにおいて、前記７遺伝子マーカーの少なくともいずれかが検出される、項２に記載の生体試料の分析方法。
＜項４＞
［減法による重み付き発現量の幾何平均－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－１）
前記生体試料が骨髄試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の６～９２パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項３に記載の生体試料の分析方法。
＜項５＞
［減法による重み付き発現量の幾何平均－可変パーセンタイル使用］（項目２－３－１）
前記生体試料が骨髄試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、それぞれ、コントロールにおける、
ＣＲＭＰ１の３８～４４パーセンタイル、ＤＢＨの５３～６６パーセンタイル、ＤＤＣの５５～６３パーセンタイル、ＧＡＰ４３の４９～６５パーセンタイル、ＩＳＬ１の４０～５６パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの５１～７１パーセンタイル、ＴＨの５１～７１パーセンタイル；
ＣＲＭＰ１の３８～４４パーセンタイル、ＤＢＨの１～５２パーセンタイル、ＤＤＣの１～５４パーセンタイル、ＧＡＰ４３の８５～８６パーセンタイル、ＩＳＬ１の９２～９４パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの１～５０パーセンタイル、ＴＨの５１～７１パーセンタイル：又は、
ＣＲＭＰ１の８３パーセンタイル、ＤＢＨの１～５２パーセンタイル、ＤＤＣの１～５４パーセンタイル、ＧＡＰ４３の８５～８６パーセンタイル、ＩＳＬ１の９２～９４パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの１～５０パーセンタイル、及びＴＨの１～５０パーセンタイル
における発現量である、項２に記載の生体試料の分析方法。
＜項６＞
［減法による重み付き発現量の幾何平均－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－１）
前記生体試料が末梢血試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の６５～９９パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項２に記載の生体試料の分析方法。
＜項７＞
［減法による重み付き発現量の幾何平均－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－１）
前記生体試料が末梢血幹細胞試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の２１～９９パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項３に記載の生体試料の分析方法。
＜項８＞
［減法による重み付き発現量の幾何平均－可変パーセンタイル使用］（項目２－３－１）
前記生体試料が末梢血幹細胞試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、それぞれ、末梢血試料のコントロールにおける、
ＣＲＭＰ１の９１～９９パーセンタイル、ＤＢＨの９１～９２パーセンタイル、ＤＤＣの９２～９５パーセンタイル、ＧＡＰ４３の９１～９２パーセンタイル、ＩＳＬ１の９８～９９パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの８７～９２パーセンタイル、ＴＨの８２～９３パーセンタイル
における発現量である、項２に記載の生体試料の分析方法。
＜項９＞
［減法による重み付き発現量の総和］（項目２－３－２－１）
前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７が、前記発現量Ａ１～Ａ７各々から統計学的数値Ｂ１～Ｂ７各々を差し引いて得られ（但し、差し引いた結果負の数値となる場合の前記重み付き発現量は０とする）、前記重み付き発現量ＡＢ～ＡＢ７の総和を前記評価値として得る、項１に記載の生体試料の分析方法。
＜項１０＞
［減法による重み付き発現量の総和－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－２－１）
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の１パーセンタイル以上の共通する特定のパーセンタイルにおける発現量であり、
前記特定のパーセンタイルにおいて、前記７遺伝子マーカーの少なくともいずれかが検出される、項９に記載の生体試料の分析方法。
＜項１１＞
［減法による重み付き発現量の総和－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－２－１）
前記生体試料が骨髄試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の６～９３パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項１０に記載の生体試料の分析方法。
＜項１２＞
［減法による重み付き発現量の総和－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－２－１）
前記生体試料が末梢血試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の２１～９９パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項１０に記載の生体試料の分析方法。
＜項１３＞
［減法による重み付き発現量の総和－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－２－１）
前記生体試料が末梢血幹細胞試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の２１～９９パーセンタイルのうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項１０に記載の生体試料の分析方法。
＜項１４＞
［減法による重み付き発現量の総和－可変パーセンタイル使用］（項目２－３－２－１）
前記生体試料が骨髄試料、末梢血試料又は末梢血幹細胞試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、それぞれ、コントロールにおける前記７遺伝子マーカーの各パーセンタイルにおける発現量のうち、前記７遺伝子マーカー各々の前記微小残存病変の有無に関するカットオフ値に最も近い発現量である、項９に記載の生体試料の分析方法。
＜項１５＞
［除法による重み付き発現量の総和］（項目２－３－２－２）
前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７が、前記発現量Ａ１～Ａ７各々を統計学的数値Ｂ１～Ｂ７（但し、Ｂ１～Ｂ７はいずれも０でない）各々で除して得られ、前記重み付き発現量ＡＢ～ＡＢ７の総和を前記評価値として得る、項１に記載の生体試料の分析方法。
＜項１６＞
［除法による重み付き発現量の総和－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－２－２）
前記生体試料が骨髄試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の５４パーセンタイル以上のうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項１５に記載の生体試料の分析方法。
＜項１７＞
［除法による重み付き発現量の総和－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－２－２）
前記生体試料が末梢血試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の９０パーセンタイル以上のうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項１５に記載の生体試料の分析方法。
＜項１８＞
［除法による重み付き発現量の総和－固定パーセンタイル使用］（項目２－３－２－２）
前記生体試料が末梢血幹細胞試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、いずれも、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々の９０パーセンタイル以上のうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量である、項１５に記載の生体試料の分析方法。
＜項１９＞
［除法による重み付き発現量の総和－可変パーセンタイル使用］（項目２－３－２－２）
前記生体試料が骨髄試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、それぞれ、コントロールにおける、
ＣＲＭＰ１の３８～４４パーセンタイル、ＤＢＨの７７～８３パーセンタイル、ＤＤＣの７４～７９パーセンタイル、ＧＡＰ４３の３８～４８パーセンタイル、ＩＳＬ１の５７～６８パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの７２～７７パーセンタイル、ＴＨの７８～８３パーセンタイル；又は、
ＣＲＭＰ１の９２パーセンタイル、ＤＢＨの９１～９２パーセンタイル、ＤＤＣの９９パーセンタイル、ＧＡＰ４３の９３パーセンタイル、ＩＳＬ１の９６パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの９２～９３パーセンタイル、及びＴＨの８４～８７パーセンタイル
における発現量である、項１５に記載の生体試料の分析方法。
＜項２０＞
［除法による重み付き発現量の総和－可変パーセンタイル使用］（項目２－３－２－２）
前記生体試料が末梢血幹細胞試料であり、
前記統計学的数値Ｂ１～Ｂ７が、それぞれ、末梢血試料のコントロールにおける、
ＣＲＭＰ１の９８～９９パーセンタイル、ＤＢＨの９０パーセンタイル、ＤＤＣの９８～９９パーセンタイル、ＧＡＰ４３の９２～９３パーセンタイル、ＩＳＬ１の９９パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂの９０パーセンタイル、ＴＨの９０～９２パーセンタイル
における発現量である、項１５に記載の生体試料の分析方法。
＜項２１＞
前記生体試料における前記７遺伝子マーカー各々の発現量Ａ１～Ａ７と、前記コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々のデジタルＰＣＲによる発現量とが、いずれも、少なくともレファレンス遺伝子の発現量で除した値であり、前記レファレンス遺伝子が、ＨＰＲＴ１、ＨＭＢＳ、ＧＵＳＢ、及びＴＢＰからなる群より選択される、項１～２０のいずれかに記載の生体試料の分析方法。
【発明の効果】
【0017】
本発明によって、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨからなる７遺伝子マーカーの定量にデジタルＰＣＲ測定を用いる神経芽腫のＭＲＤ分析法であって、分析の感度及び特異度を総合的に向上できる新たな手法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】コントロール（Control）及び診断時（Diagnosis）の神経芽腫患者の、骨髄検体（BM）における７遺伝子マーカー（ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨ）それぞれの発現量（relative copy number）を表す。
【図2】コントロール（Control）及び診断時（Diagnosis）の神経芽腫患者の、末梢血検体（PB）における７遺伝子マーカー（ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨ）それぞれの発現量（relative copy number）を表す。
【図3A】成人コントロールの骨髄１０３検体におけるデジタルＰＣＲによる７遺伝子マーカー（ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨ）の発現量を、小さい方から並べ１００等分した値（１～５０パーセンタイルにおける値）を示す。
【図3B】成人コントロールの骨髄１０３検体におけるデジタルＰＣＲによる７遺伝子マーカー（ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨ）の発現量を、小さい方から並べ１００等分した値（５１～１００パーセンタイルにおける値）を示す。
【図4A】成人コントロールの末梢血１０７検体におけるデジタルＰＣＲによる７遺伝子マーカー（ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨ）の発現量を、小さい方から並べ１００等分した値（１～５０パーセンタイルにおける値）を示す。
【図4B】成人コントロールの末梢血１０７検体におけるデジタルＰＣＲによる７遺伝子マーカー（ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨ）の発現量を、小さい方から並べ１００等分した値（５１～１００パーセンタイルにおける値）を示す。
【図5A】神経芽腫患者の各病期における骨髄検体（ＢＭ）の７遺伝子マーカーの発現量を、図３Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量を用いて重み付けし、更に総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）として導出した評価値の、各病期における分布を示す。
【図5B】神経芽腫患者の各病期における末梢血検体（ＰＢ）の７遺伝子マーカーの発現量を、図４Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量を用いて重み付けし、更に総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）として導出した評価値の、各病期における分布を示す。
【図6A】神経芽腫患者の各採取時期における骨髄検体（ＢＭ）の７遺伝子マーカーの発現量を、図３Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量を用いて重み付けし、更に総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）として導出した評価値の、各採取時期における分布を示す。
【図6B】神経芽腫患者の各採取時期における末梢血検体（ＰＢ）の７遺伝子マーカーの発現量を、図４Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量を用いて重み付けし、更に総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）として導出した評価値の、各採取時期における分布を示す。
【図7】高リスク神経芽腫患者の診断時（Diagnosis）及び治療後のフォローアップ中（Post-treatment）に採取した骨髄検体の７遺伝子マーカーの発現量を、図３Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量を用いて重み付けし、更に総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）として導出した評価値の、再発患者（Relapse）－非再発患者（Non-relapse）間での比較を示す。
【図8】治療後のフォローアップ中に採取した骨髄７３（再発１７、非再発５６）検体の７遺伝子マーカーの発現量の総和（non-weighted sum）と、当該発現量を、図３Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量を用いて重み付けし、更に総和（90 percentile weighted sum）として導出した評価値について、再発予測に関するＲＯＣ解析を行った結果を示す。
【図9】治療後のフォローアップ中に採取した骨髄７３（再発１７、非再発５６）検体について、図３Ａ及び図３Ｂに示す６パーセンタイル以上のそれぞれのパーセンタイルにおける発現量を用いて、減法による重み付けを行った７遺伝子マーカーの発現量の幾何平均（ddPCR_geometric mean (subtraction-weighted)）を評価値とし、予後予測（再発予測）についてのＡＵＣを最大化させる固定パーセンタイルを調べた結果を示す。
【図10】治療後のフォローアップ中に採取した骨髄７３（再発１７、非再発５６）検体について、図３Ａ及び図３Ｂに示す６パーセンタイル以上のそれぞれのパーセンタイルにおける発現量を用いて、減法による重み付けを行った７遺伝子マーカーの発現量の総和（ddPCR_sum (subtraction-weighted)）を評価値とし、予後予測（再発予測）についてのＡＵＣを最大化させる固定パーセンタイルを調べた結果を示す。
【図11】治療後のフォローアップ中に採取した骨髄７３（再発１７、非再発５６）検体について、図３Ａ及び図３Ｂに示す５４パーセンタイル以上のそれぞれのパーセンタイルにおける発現量を用いて、除法による重み付けを行った７遺伝子マーカーの発現量の総和（ddPCR_sub (division-weighted)）を評価値とし、予後予測（再発予測）についてのＡＵＣを最大化させる固定パーセンタイルを調べた結果を示す。
【図12】治療後のフォローアップ中に採取した末梢血２１（再発４、非再発１７）検体について、図４Ａ及び図４Ｂに示す５２パーセンタイル以上のそれぞれのパーセンタイルにおける発現量を用いて、減法による重み付けを行った７遺伝子マーカーの発現量の幾何平均（ddPCR_geometric mean (subtraction-weighted)）を評価値とし、予後予測（再発予測）についてのＡＵＣを最大化させる固定パーセンタイルを調べた結果を示す。
【図13】治療後のフォローアップ中に採取した末梢血２１（再発４、非再発１７）検体について、図４Ａ及び図４Ｂに示す２１パーセンタイル以上のそれぞれのパーセンタイルにおける発現量を用いて、減法による重み付けを行った７遺伝子マーカーの発現量の総和（ddPCR_sum (subtraction-weighted)）を評価値とし、予後予測（再発予測）についてのＡＵＣを最大化させる固定パーセンタイルを調べた結果を示す。
【図14】治療後のフォローアップ中に採取した末梢血２１（再発４、非再発１７）検体について、図４Ａ及び図４Ｂに示す９１パーセンタイル以上のそれぞれのパーセンタイルにおける発現量を用いて、除法による重み付けを行った７遺伝子マーカーの発現量の総和（ddPCR_sub (division-weighted)）を評価値とし、予後予測（再発予測）についてのＡＵＣを最大化させる固定パーセンタイルを調べた結果を示す。
【図15】治療中に採取した末梢血幹細胞２０（再発１１、非再発９）検体について、図４Ａ及び図４Ｂに示す２１パーセンタイル以上のそれぞれのパーセンタイルにおける発現量を用いて、減法による重み付けを行った７遺伝子マーカーの発現量の幾何平均（ddPCR_geometric mean (subtraction-weighted)）を評価値とし、予後予測（再発予測）についてのＡＵＣを最大化させる固定パーセンタイルを調べた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明の神経芽腫の微小残存病変マーカーを用いる生体試料の分析方法は、神経芽腫の微小残存病変の病勢、治療効果又は再発を評価すべき生体試料から、特定の７遺伝子マーカー各々の発現量Ａ１～Ａ７をデジタルＰＣＲで測定する工程１と；前記発現量Ａ１～Ａ７の各々に対し、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々のデジタルＰＣＲでの発現量の統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を加味した重み付けを行うことで、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７を取得し、前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７の幾何平均又は総和を評価値として得る工程２と；前記評価値を、神経芽腫の微小残存病変の有無のカットオフ値と比較する工程３と、を含む。以下、本発明の神経芽腫の微小残存病変マーカーを用いる生体試料の分析方法について詳述する。
【0020】
［１．工程１］
工程１では、神経芽腫の微小残存病変の再発を評価すべき生体試料から、特定の７遺伝子マーカー各々の発現量Ａ１～Ａ７をデジタルＰＣＲで測定する。
工程１では、神経芽腫の微小残存病変の再発を評価すべき生体試料から、特定の７遺伝子マーカー各々の発現量Ａ１～Ａ７をデジタルＰＣＲで測定する。
【0021】
［１－１．生体試料］
神経芽腫の微小残存病変の病勢、治療効果又は再発を評価すべき生体試料は、被験者である神経芽腫患者に由来する試料である。神経芽腫患者としては、病勢、治療効果又は再発を評価すべき患者であれば特に限定されない。具体的には、病勢を評価（具体的には、病勢の進行をモニター、又は１回目の治療介入が必要なレベルの病勢を診断）すべき患者としては、初診から治療介入までの経過観察中の患者が挙げられ、治療効果を評価すべき患者としては治療中の患者が挙げられ、再発を評価（具体的には、再増殖をモニター、又は再度の治療加入が必要なレベルの再発を診断）すべき患者としては治療後（経過観察時、及び再発診断時）の患者が挙げられる。当該治療としては特に限定されず、化学療法、手術、及び放射線治療が挙げられる。なお、化学療法としては、寛解導入療法（大量化学療法を行うまでの化学療法）、自家造血幹細胞移植を併用した大量化学療法、大量ＭＩＢＧ治療、並びに、大量化学療法後に行われる分化誘導療法及び免疫療法（抗ＧＤ２抗体）等が挙げられる。これらの神経芽腫患者のうち、好ましくは、治療効果を評価すべき患者、及び再発を評価すべき患者が挙げられ、より好ましくは、再発を評価すべき患者が挙げられる。再発を評価すべき患者の中でも、特に好ましくは、国際神経芽腫リスク分類（ＩＮＲＧリスク分類）における高リスク群患者が挙げられる。
神経芽腫の微小残存病変の病勢、治療効果又は再発を評価すべき生体試料は、被験者である神経芽腫患者に由来する試料である。神経芽腫患者としては、病勢、治療効果又は再発を評価すべき患者であれば特に限定されない。具体的には、病勢を評価（具体的には、病勢の進行をモニター、又は１回目の治療介入が必要なレベルの病勢を診断）すべき患者としては、初診から治療介入までの経過観察中の患者が挙げられ、治療効果を評価すべき患者としては治療中の患者が挙げられ、再発を評価（具体的には、再増殖をモニター、又は再度の治療加入が必要なレベルの再発を診断）すべき患者としては治療後（経過観察時、及び再発診断時）の患者が挙げられる。当該治療としては特に限定されず、化学療法、手術、及び放射線治療が挙げられる。なお、化学療法としては、寛解導入療法（大量化学療法を行うまでの化学療法）、自家造血幹細胞移植を併用した大量化学療法、大量ＭＩＢＧ治療、並びに、大量化学療法後に行われる分化誘導療法及び免疫療法（抗ＧＤ２抗体）等が挙げられる。これらの神経芽腫患者のうち、好ましくは、治療効果を評価すべき患者、及び再発を評価すべき患者が挙げられ、より好ましくは、再発を評価すべき患者が挙げられる。再発を評価すべき患者の中でも、特に好ましくは、国際神経芽腫リスク分類（ＩＮＲＧリスク分類）における高リスク群患者が挙げられる。
【0022】
生体試料としては、被験者の核酸を含む試料であれば特に限定されない。核酸としては、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＲＮＡが挙げられる。また、生体試料としては、好ましくは。被験者から採取された骨髄液から調製された骨髄試料（以下において、骨髄検体とも記載する）、及び被験者から採取された末梢血から調製された末梢血試料（以下において、末梢血検体とも記載する）、被験者から採取された末梢血幹細胞から調製された末梢血幹細胞試料（以下において、末梢血幹細胞検体とも記載する）等が挙げられる。末梢血幹細胞試料については、自家移植（患者自身の末梢血幹細胞を事前に採取しておき、大量化学療法の後に体内に戻す処置）のために採取しておいた検体から調製することができる。これら骨髄試料、末梢血試料、及び末梢血幹細胞試料の調製は、核酸の取得が可能な常法、例えばｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡなどに従って行えばよい。
【0023】
［１－２．神経芽腫の微小残存病変の７遺伝子マーカー］
本発明で用いる遺伝子マーカーは、ＣＲＭＰ１として記載される遺伝子、ＤＢＨとして記載される遺伝子、ＤＤＣとして記載される遺伝子、ＧＡＰ４３として記載される遺伝子、ＩＳＬ１として記載される遺伝子、ＰＨＯＸ２Ｂとして記載される遺伝子およびＴＨとして記載される遺伝子（以下、それぞれ単に、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨと記載する。）の７種で構成される。これら７遺伝子マーカーそれぞれは、神経芽腫の微小残存病変が存在する場合に発現量が増加し、遺伝子マーカーの発現量は、神経芽腫の微小残存病変の発生レベルと相関（正の相関）する。
本発明で用いる遺伝子マーカーは、ＣＲＭＰ１として記載される遺伝子、ＤＢＨとして記載される遺伝子、ＤＤＣとして記載される遺伝子、ＧＡＰ４３として記載される遺伝子、ＩＳＬ１として記載される遺伝子、ＰＨＯＸ２Ｂとして記載される遺伝子およびＴＨとして記載される遺伝子（以下、それぞれ単に、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨと記載する。）の７種で構成される。これら７遺伝子マーカーそれぞれは、神経芽腫の微小残存病変が存在する場合に発現量が増加し、遺伝子マーカーの発現量は、神経芽腫の微小残存病変の発生レベルと相関（正の相関）する。
【0024】
これら７遺伝子マーカーの組み合わせは、神経芽腫の微小残存病変の検出感度が高く、神経芽腫の微小残存病変の偽陰性が少ない。このため、神経芽腫の微小残存病変の指標として有用である。したがって、これら７遺伝子マーカーの発現量をデジタルＰＣＲで測定することにより、神経芽腫の微小残存病変を感度よく検出することができる。
【0025】
これら７遺伝子マーカーは、それぞれが単一マーカーでも神経芽腫の微小残存病変を検出する性能を有し、わずか７個の組み合わせでありながら、神経芽腫特有の著しい多様性（ヘテロジェナイティー）に対応するスクリーニング感度を有する。この７個という遺伝子マーカー数は、レファレンス遺伝子の数を含めても、多くの核酸増幅装置において同時に遺伝子増幅できる数であるため、臨床への適用が容易である。
【0026】
ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨの７遺伝子マーカーの組み合わせは、検出対象である生体試料が末梢血試料及び骨髄試料のいずれであっても有用である。
【0027】
本発明における遺伝子マーカーそれぞれの配列情報の詳細は、公知のデータベースにおいて取得することができる。たとえば;
・ＣＲＭＰ１(collapsin response mediator protein 1)として、アメリカ合衆国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）のRefSeqデータベースにおけるアクセッション番号NM_001014809に相当するもの、
・ＤＢＨ(dopamine β-hydroxylase)として、同アクセッション番号NM_000787に相当するもの、
・ＤＤＣ(dopa decarboxylase)として、同アクセッション番号NM_000790に相当するもの、
・ＧＡＰ４３(growth-associated protein 43)として、同アクセッション番号NM_001130064に相当するもの、
・ＩＳＬ１(ISL LIM homeobox 1)として、同アクセッション番号NM_002202に相当するもの、
・ＰＨＯＸ２Ｂ(paired-like homeobox 2b)として、同アクセッション番号NM_003924に相当するもの、
・ＴＨ(tyrosine hydroxylase)として、同アクセッション番号NM_199292に相当するものが挙げられる。
・ＣＲＭＰ１(collapsin response mediator protein 1)として、アメリカ合衆国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）のRefSeqデータベースにおけるアクセッション番号NM_001014809に相当するもの、
・ＤＢＨ(dopamine β-hydroxylase)として、同アクセッション番号NM_000787に相当するもの、
・ＤＤＣ(dopa decarboxylase)として、同アクセッション番号NM_000790に相当するもの、
・ＧＡＰ４３(growth-associated protein 43)として、同アクセッション番号NM_001130064に相当するもの、
・ＩＳＬ１(ISL LIM homeobox 1)として、同アクセッション番号NM_002202に相当するもの、
・ＰＨＯＸ２Ｂ(paired-like homeobox 2b)として、同アクセッション番号NM_003924に相当するもの、
・ＴＨ(tyrosine hydroxylase)として、同アクセッション番号NM_199292に相当するものが挙げられる。
【0028】
本発明における遺伝子マーカーをコードする具体的なヌクレオチド配列としては、以下の配列が挙げられる。すなわち；
・ＣＲＭＰ１としては配列番号１で表されるものが挙げられ、
・ＤＢＨとしては配列番号２で表されるものが挙げられ、
・ＤＤＣとしては配列番号３で表されるものが挙げられ、
・ＧＡＰ４３としては配列番号４で表されるものが挙げられ、
・ＩＳＬ１としては配列番号５で表されるものが挙げられ、
・ＰＨＯＸ２Ｂとしては配列番号６で表されるものが挙げられ、
・ＴＨとしては配列番号７で表されるものが挙げられる。
・ＣＲＭＰ１としては配列番号１で表されるものが挙げられ、
・ＤＢＨとしては配列番号２で表されるものが挙げられ、
・ＤＤＣとしては配列番号３で表されるものが挙げられ、
・ＧＡＰ４３としては配列番号４で表されるものが挙げられ、
・ＩＳＬ１としては配列番号５で表されるものが挙げられ、
・ＰＨＯＸ２Ｂとしては配列番号６で表されるものが挙げられ、
・ＴＨとしては配列番号７で表されるものが挙げられる。
【0029】
本発明における遺伝子マーカーをコードするヌクレオチド配列は、神経芽腫の微小残存病変の指標となる限り、上記の各配列と相同性を有するものであってもよい。好ましくは、上述の配列番号１から配列番号７でそれぞれ表されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有し、かつ機能的に同等なポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。ポリヌクレオチドは、好ましはＤＮＡ又はＲＮＡである。以下においても同様。）からなってよい。このようなポリヌクレオチドの配列相同性は、より好ましくは７５％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
【0030】
なお、７遺伝子マーカーそれぞれに関して機能的に同等とは、上述の配列番号１から配列番号７でそれぞれ表されるヌクレオチド配列を有する特定のポリヌクレオチドと同等に、神経芽腫の微小残存病変が存在する場合に発現量が増加するものである。具体的には、機能同等性は、神経芽腫の微小残存病変が存在する場合及び存在しない場合において、ポリヌクレオチドの発現量に有意差があり、当該発現量がいずれの場合においても上記特定のポリヌクレオチドの発現量の８０～１２０％、好ましくは９０～１１０％であることをいう。
【0031】
また、上述のヌクレオチド配列の相同性は、公知の手法によって決定されるものである（以下においても同様）。このような手法の具体例としては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３－５８７７（１９９３）〕等が挙げられる。また、このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されており〔Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３－４１０（１９９０）〕、本発明においても利用することができる。さらに、他の好ましい手法としては、遺伝情報処理ソフトウェア ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）を用いる手法が挙げられる。ＧＥＮＥＴＹＸを用いる場合には、ＢＬＡＳＴによる解析のほかにＬｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法によるホモロジー解析を行うことができ、本発明における相同性決定において有利に利用することができる。
【0032】
上述の７遺伝子マーカーは、神経芽腫の微小残存病変の検出感度が高く、神経芽腫の微小残存病変のレベルが増加する場合に発現量が増加する。つまり、当該発現量と神経芽腫の微小残存病変の発生レベルとが相関する。したがって、これら７遺伝子マーカー全ての発現量を測定することで、得られた発現量から神経芽腫の微小残存病変を評価することができる。
【0033】
［１－３．レファレンス遺伝子］
上記７遺伝子マーカーのレファレンス遺伝子としては、たとえば、ＨＰＲＴ１として記載される遺伝子、ＨＭＢＳとして記載される遺伝子、ＧＵＳＢとして記載される遺伝子、及びＴＢＰとして記載される遺伝子（以下、それぞれ単に、ＨＰＲＴ１、ＨＭＢＳ、ＧＵＳＢ、及びＴＢＰと記載する。）が挙げられる。これらの中から少なくとも１のレファレンス遺伝子を選択することができる。
上記７遺伝子マーカーのレファレンス遺伝子としては、たとえば、ＨＰＲＴ１として記載される遺伝子、ＨＭＢＳとして記載される遺伝子、ＧＵＳＢとして記載される遺伝子、及びＴＢＰとして記載される遺伝子（以下、それぞれ単に、ＨＰＲＴ１、ＨＭＢＳ、ＧＵＳＢ、及びＴＢＰと記載する。）が挙げられる。これらの中から少なくとも１のレファレンス遺伝子を選択することができる。
【0034】
これらのレファレンス遺伝子は、その発現量が適度に低度であることで遺伝子マーカー発現量が少ない検体であってもより感度よいＭＲＤ検出を可能とする。さらにこの中でも、レファレンス遺伝子としては、骨髄検体および末梢血検体における発現量の変動（ばらつき）が小さいことで骨髄に由来する生体試料に対しても末梢血に由来する生体試料に対しても有用性が高い点で、ＨＰＲＴ１遺伝子であることが最も好ましい。
【0035】
レファレンス遺伝子の配列情報の詳細は、公知のデータベースにおいて取得することができる。たとえば；
・ＨＰＲＴ１(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1)として、アメリカ合衆国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）のRefSeqデータベースにおけるアクセッション番号NM_000194に相当するもの、
・ＨＭＢＳ（Hydroxymethylbilane synthase）として、同データベースにおけるアクセッション番号NM_000190に相当するもの、
・ＧＵＳＢ（Glucuronidase Beta）として、同データベースにおけるアクセッション番号NM_000181に相当するもの、
・ＴＢＰ（TATA-binding protein）として、同データベースにおけるアクセッション番号NM_003194に相当するもの、が挙げられる。
・ＨＰＲＴ１(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1)として、アメリカ合衆国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）のRefSeqデータベースにおけるアクセッション番号NM_000194に相当するもの、
・ＨＭＢＳ（Hydroxymethylbilane synthase）として、同データベースにおけるアクセッション番号NM_000190に相当するもの、
・ＧＵＳＢ（Glucuronidase Beta）として、同データベースにおけるアクセッション番号NM_000181に相当するもの、
・ＴＢＰ（TATA-binding protein）として、同データベースにおけるアクセッション番号NM_003194に相当するもの、が挙げられる。
【0036】
レファレンス遺伝子をコードする具体的なヌクレオチド配列としては、以下の配列が挙げられる。すなわち；
・ＨＰＲＴ１としては配列番号８で表されるものが挙げられ、
・ＨＭＢＳとしては配列番号９で表されるものが挙げられ、
・ＧＵＳＢとしては配列番号１０で表されるものが挙げられ、
・ＴＢＰとしては配列番号１１で表されるものが挙げられる。
・ＨＰＲＴ１としては配列番号８で表されるものが挙げられ、
・ＨＭＢＳとしては配列番号９で表されるものが挙げられ、
・ＧＵＳＢとしては配列番号１０で表されるものが挙げられ、
・ＴＢＰとしては配列番号１１で表されるものが挙げられる。
【0037】
レファレンス遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、内在性コントロールとなる限り、上記の配列と相同性を有するものであってもよい。好ましくは、上述のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有し、かつ上述の遺伝子それぞれと機能的に同等なポリヌクレオチドからなってよい。このようなポリヌクレオチドの配列相同性は、より好ましくは７５％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
【0038】
なお、レファレンス遺伝子それぞれに関して機能的に同等とは、上述の配列番号８から配列番号１１で表されるヌクレオチド配列を有する特定のポリヌクレオチドと同等に検体間で測定値のばらつきが少なく発現量が適度に低度であり、ＨＰＲＴ１にあっては、さらに骨髄検体および末梢血検体の間で測定値のばらつきが少ないものである。具体的には、機能同等性は、同数の母集団における標準偏差が上記特定のポリヌクレオチドの標準偏差の８０～１２０％、好ましくは９０～１１０％であり、ポリヌクレオチドの発現量が上記特定のポリヌクレオチドの発現量の８０～１２０％、好ましくは９０～１１０％であることをいう。
【0039】
［１－４．デジタルＰＣＲ］
工程１では、デジタルＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって、上記の７遺伝子マーカー各々の発現量Ａ１～Ａ７を取得する。７遺伝子マーカーそれぞれの発現量Ａ１～Ａ７は、絶対量であってもよいし、レファレンス遺伝子の発現量に対する相対量（つまり、７遺伝子マーカーそれぞれの発現量を少なくともレファレンス遺伝子の発現量で除した値）であってもよい。より正確な分析を行う観点からは、マーカーそれぞれの発現量Ａ１～Ａ７は、レファレンス遺伝子の発現量に対する相対量であることが好ましい。
工程１では、デジタルＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって、上記の７遺伝子マーカー各々の発現量Ａ１～Ａ７を取得する。７遺伝子マーカーそれぞれの発現量Ａ１～Ａ７は、絶対量であってもよいし、レファレンス遺伝子の発現量に対する相対量（つまり、７遺伝子マーカーそれぞれの発現量を少なくともレファレンス遺伝子の発現量で除した値）であってもよい。より正確な分析を行う観点からは、マーカーそれぞれの発現量Ａ１～Ａ７は、レファレンス遺伝子の発現量に対する相対量であることが好ましい。
【0040】
デジタルＰＣＲは、遺伝子マーカーの発現量が少ない検体であっても感度よく検出することができる点で神経芽腫の微小残存病変の検出に特に適している。それだけでなく、デジタルＰＣＲは、分析主体、分析時期、分析機器、プロトコル（反応時間、反応温度等）等が異なっても測定結果のばらつきが少なく、正確に神経芽腫の微小残存病変を検出することもできる点でも有効である。従って、デジタルＰＣＲは、神経芽腫の微小残存病変の評価における汎用性の高さおよび信頼性の高さ等の点でも優れた手法である。デジタルＰＣＲにおいて、以下のプライマーペアを用いることにより、若しくは更に以下のプローブを用いることにより、７遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ７を取得することができる。
【0041】
［１－４－１．プライマーペア］
本発明で用いられるプライマーペアは、上述の遺伝子マーカーをコードするヌクレオチド配列を増幅しうる一対のポリヌクレオチド分子である。つまり、本発明においては７遺伝子マーカーＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨそれぞれに対する合計７対のプライマーペアが用いられる。
本発明で用いられるプライマーペアは、上述の遺伝子マーカーをコードするヌクレオチド配列を増幅しうる一対のポリヌクレオチド分子である。つまり、本発明においては７遺伝子マーカーＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨそれぞれに対する合計７対のプライマーペアが用いられる。
【0042】
このようなプライマーペアは、上述の遺伝子マーカーをコードするヌクレオチド配列を増幅できるようにそれぞれ設計されたセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む。アンチセンスプライマーは、増幅対象のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子であり、センスプライマーは、増幅対象のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子である。具体的なプライマーペアの設計は、増幅対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜行うことができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【0043】
本発明では、上述の７遺伝子マーカーを選択することにより、７遺伝子マーカーそれぞれに対応するプライマーペア全てのアニーリング温度を良好に揃えることができる。このため、７遺伝子マーカーを同一熱源で同時測定する場合に増幅対象領域の増幅効率を良好に揃えることができる。７遺伝子マーカーのいずれであっても効率良く増幅されることで、遺伝子発現量が少ない検体であっても微小残存病変測定感度を向上させることができる。
【0044】
プライマーの長さおよび具体的配列は特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。たとえば、７遺伝子マーカー全部の同時測定のために、アニーリング温度条件が揃うＴｍ値となるよう設計することができる。
【0045】
プライマーの長さは、たとえば１８ヌクレオチド以上３０ヌクレオチド以下、好ましくは１８ヌクレオチド以上２６ヌクレオチド以下であってよい。
【0046】
プライマーの具体的配列としては、たとえば以下が挙げられる。
・ＣＲＭＰ１に対するプライマー
5'-ccaatccctttatgctgacg-3' (sense) （配列番号１３）
5'-ggaacgattaagttctctcctatttg-3' (antisense) （配列番号１４）
・ＤＢＨに対するプライマー
5'-tggggacactgcctattttg-3' (sense) （配列番号１５）
5'-ttctggggtcctctgcac-3' (antisense) （配列番号１６）
・ＤＤＣに対するプライマー
5'-ctggagaagggggaggagt-3' (sense) （配列番号１７）
5'-gccgatggatcactttggt-3' (antisense) （配列番号１８）
・ＧＡＰ４３に対するプライマー
5'-gaggatgctgctgccaag-3' (sense) （配列番号１９）
5'-ggcactttccttaggtttggt-3' (antisense) （配列番号２０）
・ＩＳＬ１に対するプライマー
5'-aaggacaagaagcgaagcat-3' (sense) （配列番号２１）
5'-ttcctgtcatcccctggata-3' (antisense) （配列番号２２）
・ＰＨＯＸ２Ｂに対するプライマー
5'-ctaccccgacatctacactcg-3' (sense) （配列番号２３）
5'-ctcctgcttgcgaaacttg-3' (antisense) （配列番号２４）
・ＴＨに対するプライマー
5'-tcagtgacgccaaggaca-3' (sense) （配列番号２５）
5'-gtacgggtcgaacttcacg-3' (antisense) （配列番号２６）
・ＣＲＭＰ１に対するプライマー
5'-ccaatccctttatgctgacg-3' (sense) （配列番号１３）
5'-ggaacgattaagttctctcctatttg-3' (antisense) （配列番号１４）
・ＤＢＨに対するプライマー
5'-tggggacactgcctattttg-3' (sense) （配列番号１５）
5'-ttctggggtcctctgcac-3' (antisense) （配列番号１６）
・ＤＤＣに対するプライマー
5'-ctggagaagggggaggagt-3' (sense) （配列番号１７）
5'-gccgatggatcactttggt-3' (antisense) （配列番号１８）
・ＧＡＰ４３に対するプライマー
5'-gaggatgctgctgccaag-3' (sense) （配列番号１９）
5'-ggcactttccttaggtttggt-3' (antisense) （配列番号２０）
・ＩＳＬ１に対するプライマー
5'-aaggacaagaagcgaagcat-3' (sense) （配列番号２１）
5'-ttcctgtcatcccctggata-3' (antisense) （配列番号２２）
・ＰＨＯＸ２Ｂに対するプライマー
5'-ctaccccgacatctacactcg-3' (sense) （配列番号２３）
5'-ctcctgcttgcgaaacttg-3' (antisense) （配列番号２４）
・ＴＨに対するプライマー
5'-tcagtgacgccaaggaca-3' (sense) （配列番号２５）
5'-gtacgggtcgaacttcacg-3' (antisense) （配列番号２６）
【0047】
本発明では、上述の７遺伝子マーカーを増幅しうるプライマーペアに加え、上述のレファレンス遺伝子を増幅しうるプライマーペアを含んでよい。
【0048】
レファレンス遺伝子を増幅しうるプライマーの長さおよび具体的配列も特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。たとえば、７種の遺伝子マーカーのうち複数、好ましくは全部の同時測定のために、上記の７種の遺伝子マーカーとアニーリング温度条件が揃うＴｍ値となるよう設計してよい。
【0049】
プライマーの長さは、たとえば１８ヌクレオチド以上３０ヌクレオチド以下、好ましくは１８ヌクレオチド以上２６ヌクレオチド以下であってよい。
【0050】
レファレンス遺伝子用のプライマーの具体的配列としてはたとえば以下が挙げられる。
・ＨＰＲＴ１に対するプライマー
5'-tgaccttgatttattttgcatacc-3' (sense) （配列番号２７）
5'-cgagcaagacgttcagtcct-3' (antisense) （配列番号２８）
・ＨＭＢＳに対するプライマー
5'-ctgaaagggccttcctgag-3' (sense) （配列番号２９）
5'-cagactcctccagtcaggtaca-3' (antisense) （配列番号３０）
・ＧＵＳＢに対するプライマー
5'-cgccctgcctatctgtattc-3' (sense) （配列番号３１）
5'-tccccacagggagtgtgtag-3' (antisense) （配列番号３２）
・ＴＢＰに対するプライマー
5'-gaacatcatggatcagaacaaca-3' (sense) （配列番号３３）
5'-atagggattccgggagtcat-3' (antisense) （配列番号３４）
・ＨＰＲＴ１に対するプライマー
5'-tgaccttgatttattttgcatacc-3' (sense) （配列番号２７）
5'-cgagcaagacgttcagtcct-3' (antisense) （配列番号２８）
・ＨＭＢＳに対するプライマー
5'-ctgaaagggccttcctgag-3' (sense) （配列番号２９）
5'-cagactcctccagtcaggtaca-3' (antisense) （配列番号３０）
・ＧＵＳＢに対するプライマー
5'-cgccctgcctatctgtattc-3' (sense) （配列番号３１）
5'-tccccacagggagtgtgtag-3' (antisense) （配列番号３２）
・ＴＢＰに対するプライマー
5'-gaacatcatggatcagaacaaca-3' (sense) （配列番号３３）
5'-atagggattccgggagtcat-3' (antisense) （配列番号３４）
【0051】
プライマーは、増幅対象の検出に適した付加的配列（具体的にはゲノムDNAと相補的でない配列）、例えばリンカー配列をさらに含んでいてもよい。
また、プライマーは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（たとえば、125I、131I、3H、14Cなど）、酵素（たとえば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、蛍光物質（たとえば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート、Cy3、Cy5など）、発光物質（たとえば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）などで標識されていてもよい。さらに、プライマーは、各々別個に、または各々の機能を損なわなければ混合した状態で、水または適当な緩衝液（たとえば、TEバッファー、Tris-HClバッファーなど）中に適当な濃度（たとえば、２×以上２０×以下の濃度で１μＭ以上５０μＭ以下など）となるように溶解し、約－２０℃で保存することができる。
また、プライマーは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（たとえば、125I、131I、3H、14Cなど）、酵素（たとえば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、蛍光物質（たとえば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート、Cy3、Cy5など）、発光物質（たとえば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）などで標識されていてもよい。さらに、プライマーは、各々別個に、または各々の機能を損なわなければ混合した状態で、水または適当な緩衝液（たとえば、TEバッファー、Tris-HClバッファーなど）中に適当な濃度（たとえば、２×以上２０×以下の濃度で１μＭ以上５０μＭ以下など）となるように溶解し、約－２０℃で保存することができる。
【0052】
［１－４－２．プローブ］
プローブは、本発明で用いる遺伝子マーカーを指標として神経芽腫の微小残存病変を検出するための、上述の遺伝子マーカーをコードする配列又はその相補鎖配列を検出しうるポリヌクレオチド分子である。具体的には、プローブとして、上述の遺伝子マーカーを構成するポリヌクレオチド又はその相補鎖なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズうるポリヌクレオチド分子が挙げられる。
プローブは、本発明で用いる遺伝子マーカーを指標として神経芽腫の微小残存病変を検出するための、上述の遺伝子マーカーをコードする配列又はその相補鎖配列を検出しうるポリヌクレオチド分子である。具体的には、プローブとして、上述の遺伝子マーカーを構成するポリヌクレオチド又はその相補鎖なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズうるポリヌクレオチド分子が挙げられる。
【0053】
プローブとしては、更に、レファレンス遺伝子をコードする配列又はその相補鎖配列を検出しうるポリヌクレオチド分子が挙げられる。具体的には、プローブとして、上述のレファレンス遺伝子を構成するポリヌクレオチド又はその相補鎖なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズうるポリヌクレオチド分子が挙げられる。
【0054】
相補的とは、２つのヌクレオチドがハイブリダイゼーション条件下において、対合しうるものであることを意味し、例えば、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）との関係、シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との関係をいう。
【0055】
ハイブリダイズするとは、ポリヌクレオチド分子が通常のハイブリダイゼーション条件下（つまり通常のＰＣＲにおけるアニーリング条件下）、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で遺伝子マーカーまたはレファレンス遺伝子にハイブリダイズし、遺伝子マーカーまたはレファレンス遺伝子以外のポリヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。
【0056】
ストリンジェントな条件とは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 6.3.1-6.3.6, 1999に記載される条件、例えば、6×ＳＳＣ（sodium chloride/sodium citrate）／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×ＳＳＣ／0.1％ＳＤＳ／50～65℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。
【0057】
また、本発明で用いる遺伝子マーカーまたはレファレンス遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチド分子は、遺伝子特異的なハイブリダイズが可能であれば、その遺伝子マーカーまたはそのレファレンス遺伝子に対して完全に相補的である必要はないが、好ましくは、その遺伝子マーカーまたはそのレファレンス遺伝子に相補的なポリヌクレオチド分子の全部または一部の配列を含んで構成されるものとする。
【0058】
プローブは、市販のオリゴヌクレオチド合成機等を用いて合成オリゴヌクレオチドとして作製してもよいし、あるいは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製してもよい。
【0059】
プローブの鎖長は、たとえば１８ヌクレオチド以上３０ヌクレオチド以下、好ましくは１８ヌクレオチド以上２６ヌクレオチド以下であってよい。
【0060】
プローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（たとえば、125I、131I、3H、14Cなど）、酵素（たとえば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、蛍光物質（たとえば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート、Cy3、Cy5など）、発光物質（たとえば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）などで標識されていてもよい。あるいは、プローブは、蛍光物質（たとえば、FAM、VICなど）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（たとえば、MGB、TAMRAなど）がさらに結合されていてもよい。より具体的には、蛍光物質が５’末端に付され、クエンチャーが３’末端に付され、さらに３’末端がリン酸化されて構成されるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）として構成されてもよい。この場合、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
【0061】
［１－４－３．デジタルＰＣＲ操作］
デジタルＰＣＲでは、まず、大きな容量の開始試料が複数のより小さな部分容量の試料（分割試料）に分割される。当該分割試料は、平均で単一コピーの標的を含むように調製される。このように分割試料中に存在するポリヌクレオチド分子が０分子（陰性）または１分子（陽性）となることにより、デジタル性が達成される。分割試料における陽性を計数することにより、開始試料中の標的の開始コピー数を推定することができる。従って、デジタルＰＣＲでは、生体試料中の標的が低い濃度であっても、標的の定量が可能となる。なお、分割試料をデジタル性が達成される適正濃度とするためには、開始試料の複数連続希釈法を用いることができ、その容量は用いるＰＣＲ装置に応じて決定することができる。このようにして、増幅対象（標的）である遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ７を定量することができる。
デジタルＰＣＲでは、まず、大きな容量の開始試料が複数のより小さな部分容量の試料（分割試料）に分割される。当該分割試料は、平均で単一コピーの標的を含むように調製される。このように分割試料中に存在するポリヌクレオチド分子が０分子（陰性）または１分子（陽性）となることにより、デジタル性が達成される。分割試料における陽性を計数することにより、開始試料中の標的の開始コピー数を推定することができる。従って、デジタルＰＣＲでは、生体試料中の標的が低い濃度であっても、標的の定量が可能となる。なお、分割試料をデジタル性が達成される適正濃度とするためには、開始試料の複数連続希釈法を用いることができ、その容量は用いるＰＣＲ装置に応じて決定することができる。このようにして、増幅対象（標的）である遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ７を定量することができる。
【0062】
デジタルＰＣＲとしては、好ましくは、液滴ベースのデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が挙げられる。ｄｄＰＣＲ法は、具体的には、液滴生成工程、ＰＣＲ増幅工程、検出工程、及び分析工程を含む。液滴生成工程では、核酸増幅に必要な試薬を含む複数の液滴を生成する。ＰＣＲ増幅工程ではそれらの液滴（または当該液滴が入っているより大きな反応体積を有する試料）を標的の増幅に適切な熱サイクリング条件に付す。検出工程では、ＰＣＲ産物を含む液滴（又は当該液滴が入っているより大きな反応体積を有する試料）と含まない液滴（又は当該液滴が入っているより大きな反応体積を有する試料）との特定を行う。分析工程では、標的の発現量Ａ１～Ａ７を導出する。
【0063】
さらにデジタルＰＣＲでは、上述のプローブを生体試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を含んでもよい。たとえば、増幅産物の検出を標識に基づいて行う場合に、上述の標識されたプローブを用いてよい。一例としてＴａｑＭａｎプローブを用いる場合、遺伝子マーカーにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの消光作用から開放されることで蛍光を発する。
【0064】
７遺伝子マーカーそれぞれの発現量Ａ１～Ａ７は、好ましくはｍＲＮＡへの転写量（つまりコピー数）として定量化することができる。７遺伝子マーカーそれぞれの発現量Ａ１～Ａ７は、絶対コピー数であってもよいし、レファレンス遺伝子のコピー数に対する相対量（つまり、７遺伝子マーカーそれぞれのコピー数をレファレンス遺伝子のコピー数で除した値）であってもよい。より正確な分析を行う観点からは、マーカーそれぞれの発現量Ａ１～Ａ７は、レファレンス遺伝子のコピー数に対する相対量であることが好ましい。更に分析値の取扱いを容易にする観点から、当該相対量は、７遺伝子マーカーそれぞれのコピー数をレファレンス遺伝子のコピー数で除し且つ１０，０００を乗じて得た値であることが好ましい。
【0065】
［２．工程２］
工程２では、工程１で得られた発現量Ａ１～Ａ７の各々に対し、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々のデジタルＰＣＲによる発現量の統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を加味した重み付けを行うことで、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７を取得し、前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７の幾何平均又は総和を評価値として得る。
工程２では、工程１で得られた発現量Ａ１～Ａ７の各々に対し、コントロールにおける前記７遺伝子マーカー各々のデジタルＰＣＲによる発現量の統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を加味した重み付けを行うことで、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７を取得し、前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７の幾何平均又は総和を評価値として得る。
【0066】
［２－１．コントロールにおける７遺伝子マーカー各々のデジタルＰＣＲによる発現量の統計学的数値Ｂ１～Ｂ７］
７遺伝子マーカーは、健常コントロールにおける発現態様がそれぞれに異なる。具体的には、健常コントロール（ｎ＞１００）における７遺伝子マーカーのデジタルＰＣＲによる発現量の統計において、発現量を小さい方からで並べて１００等分すると、遺伝子マーカーが初めて検出されるパーセンタイル及び遺伝子マーカーの発現量が、それぞれのマーカーで様々に異なっている。図３Ａ及び図３Ｂ、並びに、図４Ａ及び図４Ｂに、当該統計の例を示す。
７遺伝子マーカーは、健常コントロールにおける発現態様がそれぞれに異なる。具体的には、健常コントロール（ｎ＞１００）における７遺伝子マーカーのデジタルＰＣＲによる発現量の統計において、発現量を小さい方からで並べて１００等分すると、遺伝子マーカーが初めて検出されるパーセンタイル及び遺伝子マーカーの発現量が、それぞれのマーカーで様々に異なっている。図３Ａ及び図３Ｂ、並びに、図４Ａ及び図４Ｂに、当該統計の例を示す。
【0067】
図３Ａ及び図３Ｂは、成人コントロールの骨髄１０３検体における、デジタルＰＣＲによる発現量の統計結果を表している。なお、デジタルＰＣＲの方法としては、上述の生体試料から７遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ７を得る方法と同様である。各発現量は、７遺伝子マーカーそれぞれの発現量をレファレンス遺伝子の発現量で除し且つ１０，０００を乗じて得た値として示している。図３Ａ及び図３Ｂに示すように、例えば、７遺伝子マーカーのうちＣＲＭＰ１とＤＢＨとを挙げると、ＣＲＭＰ１は比較的低い６パーセンタイルから検出される一方でＤＢＨは５２パーセンタイルから検出され、９０パーセンタイルにおける発現量を比較するとＤＢＨよりＣＲＭＰ１の方ではるかに発現量が高い。
【0068】
つまり、上記のコントロールにおける７遺伝子マーカー各々のデジタルＰＣＲによる発現量の統計に鑑みると、７遺伝子マーカーはそれぞれに重みつまり重要度が異なっている（さらに言い換えると非重要度が異なっている）といえる。例えば、ＣＲＭＰ１とＤＢＨとを比較すると、コントロールにおいて比較的検出されやすく検出量も比較的大きいＣＲＭＰ１の方で重要度がより低い（非重要度がより高い）といえる。このような重要度の違い（非重要度の違い）は、７遺伝子マーカーそれぞれの間で存在する。
【0069】
図４Ａ及び図４Ｂは、成人コントロールの末梢血１０７検体における、デジタルＰＣＲによる発現量の統計結果を表している。図４Ａ及び図４Ｂにおいても同様に、７遺伝子マーカーそれぞれの間で重要度の違い（非重要度の違い）が存在する。
【0070】
本発明では、７遺伝子マーカーそれぞれの非重要度を意味する数値として、コントロールにおける７遺伝子マーカー各々のデジタルＰＣＲによる発現量の統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を用いる。
【0071】
なお、発現量Ａ１～Ａ７が絶対量である場合は、コントロールにおける７遺伝子マーカーのデジタルＰＣＲによる発現量も絶対量であることが好ましく、発現量Ａ１～Ａ７が特定のレファレンス遺伝子の発現量に対する相対量である場合は、コントロールにおける７遺伝子マーカーのデジタルＰＣＲによる発現量も当該特定のレファレンス遺伝子の発現量に対する相対量であることが好ましい。図３Ａ及び図３Ｂ並びに図４Ａ及び図４Ｂで示される発現量は、レファレンス遺伝子の発現量に対する相対量である。
【0072】
本発明で用いられるコントロールにおける統計学的数値Ｂ１～Ｂ７としては、以下に述べるとおり、固定パーセンタイルにおける発現量と、可変パーセンタイルにおける発現量とが挙げられる。
【0073】
［２－１－１．固定パーセンタイルにおける発現量の統計学的数値Ｂ１～Ｂ７］
固定パーセンタイルを用いる場合、コントロールにおける７遺伝子マーカーの少なくともいずれか（好ましくは２マーカー以上、より好ましくは３マーカー以上、さらに好ましくは４マーカー以上、一層好ましくは５マーカー以上、特に好ましくは６マーカー以上、最も好ましくは７マーカー全て）が検出される特定のパーセンタイルであれば、コントロールにおける７遺伝子マーカー各々の１パーセンタイル以上の共通する特定のパーセンタイルにおける発現量を、７遺伝子マーカーの非重要度を表すコントロールにおける統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として用いることができる。
固定パーセンタイルを用いる場合、コントロールにおける７遺伝子マーカーの少なくともいずれか（好ましくは２マーカー以上、より好ましくは３マーカー以上、さらに好ましくは４マーカー以上、一層好ましくは５マーカー以上、特に好ましくは６マーカー以上、最も好ましくは７マーカー全て）が検出される特定のパーセンタイルであれば、コントロールにおける７遺伝子マーカー各々の１パーセンタイル以上の共通する特定のパーセンタイルにおける発現量を、７遺伝子マーカーの非重要度を表すコントロールにおける統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として用いることができる。
【0074】
図３Ａ及び図３Ｂの統計に示されるとおり、骨髄検体の場合、コントロールの６パーセンタイル以上で７遺伝子マーカーのうち少なくともいずれかが検出され、３７パーセンタイル以上で２マーカー以上が検出され、３９パーセンタイル以上で３マーカー以上が検出され、５１パーセンタイル以上で５マーカー以上が検出され、５２パーセンタイル以上で６マーカー以上が検出され、５４パータイル以上で７遺伝子マーカー全てが検出される。従って、骨髄検体の場合、コントロールにおける７遺伝子マーカー各々の６パーセンタイル以上、好ましくは３７パーセンタイル以上、より好ましくは３９パーセンタイル以上、一層好ましくは５１パーセンタイル以上、特に好ましくは５２パーセンタイル以上、最も好ましくは５４パーセンタイル以上のうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量を、７遺伝子マーカーの非重要度を表すコントロールにおける統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として用いることができる。
【0075】
また、図４Ａ及び図４Ｂの統計に示されるとおり、末梢血検体の場合、コントロールの２１パーセンタイル以上で７遺伝子マーカーのうち少なくともいずれかが検出され、３３パーセンタイル以上で２マーカー以上が検出され、６６パーセンタイル以上で３マーカー以上が検出され、７６パーセンタイル以上で４マーカー以上が検出され、７９パーセンタイル以上で５マーカー以上が検出され、８３パーセンタイル以上で６マーカー以上が検出され、９０パーセンタイル以上で７遺伝子マーカー全てが検出される。従って、末梢血検体の場合、コントロールにおける７遺伝子マーカー各々の２１パーセンタイル以上、好ましくは３３パーセンタイル以上、より好ましくは６６パーセンタイル以上、さらに好ましくは７６パーセンタイル以上、一層好ましくは７９パーセンタイル以上、特に好ましくは８３パーセンタイル以上、最も好ましくは９０パーセンタイル以上のうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量を、７遺伝子マーカーの非重要度を表すコントロールにおける統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として用いることができる。
【0076】
なお、末梢血幹細胞検体の場合、骨髄検体及び末梢血検体と同様に健常コントロールにおける７遺伝子マーカー各々のデジタルＰＣＲによる発現量の統計を取って、当該末梢血幹細胞検体のコントロールにおける発現量を統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として用いてもよい。一方で、末梢血幹細胞検体については健常コントロールの取得が倫理的観点から困難であるため、末梢血検体のコントロールにおける発現量を統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として用いることもできる。本発明の方法はＭＲＤ分析の感度及び特異度に優れるため、生体試料として末梢血幹細胞検体を用いる場合に、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として末梢血検体のコントロールにおける発現量を用いても、優れた感度及び特異度でＭＲＤ分析を行うことができる。従って、末梢血幹細胞検体の場合、コントロールにおける７遺伝子マーカー各々の２１パーセンタイル以上、好ましくは３３パーセンタイル以上、より好ましくは６６パーセンタイル以上、さらに好ましくは７６パーセンタイル以上、一層好ましくは７９パーセンタイル以上、特に好ましくは８３パーセンタイル以上、最も好ましくは９０パーセンタイル以上のうちの共通する特定のパーセンタイルにおける発現量を、７遺伝子マーカーの非重要度を表すコントロールにおける統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として用いることができる。
【0077】
これらの場合、７遺伝子マーカー間で選択されるパーセンタイルが共通しているため、選択されるパーセンタイルを「固定パーセンタイル」とも記載する。
【0078】
一例として、図３Ｂにおいて、９０パーセンタイル（共通する特定のパーセンタイルの例）における発現量をコントロールにおける統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として用いる場合を挙げると、ＣＲＭＰ１については統計学的数値Ｂ１として６６．２、ＤＢＨについては統計学的数値Ｂ２として７．１、ＤＤＣについては統計学的数値Ｂ３として１０．０、ＧＡＰ４３については統計学的数値Ｂ４として８．６、ＩＳＬ１については統計学的数値Ｂ５として７．９、ＰＨＯＸ２Ｂについては統計学的数値Ｂ６として７．４、ＴＨについては統計学的数値Ｂ７として６．１が用いられる。
【0079】
神経芽腫の微小残存病変の病勢、治療効果又は再発の判別の正確性を向上させる観点からの好ましい固定パーセンタイルは、重み付けの手法として、後述する除法による重み付けを行うか減法による重み付けを行うか、並びに、評価値として、重み付き発現量の幾何平均を採用するか重み付き発現量の総和を採用するか、によって異なり得る。具体的な好ましい固定パーセンタイルについては、後述する項目２－３の評価値の欄において詳述する。
【0080】
固定パーセンタイルは、後述の可変パーセンタイルのように７遺伝子マーカーについてそれぞれ個別に最適なパーセンタイルの探索を行わなくとも、容易に、正確な神経芽腫の微小残存病変の有無の判別を行うことができる点で好ましい。
【0081】
［２－１－２．可変パーセンタイルにおける発現量の統計学的数値Ｂ１～Ｂ７］
また、コントロールにおける７遺伝子マーカーの各パーセンタイルにおける発現量のうち、任意のパーセンタイルにおける発現量を、非重要度を表す統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として用いることができる。７遺伝子マーカー間で選択されるパーセンタイルが異なりうるため、選択されるパーセンタイルを「可変パーセンタイル」とも記載する。
また、コントロールにおける７遺伝子マーカーの各パーセンタイルにおける発現量のうち、任意のパーセンタイルにおける発現量を、非重要度を表す統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として用いることができる。７遺伝子マーカー間で選択されるパーセンタイルが異なりうるため、選択されるパーセンタイルを「可変パーセンタイル」とも記載する。
【0082】
神経芽腫の微小残存病変の病勢、治療効果又は再発の判別の正確性を向上させる観点からの好ましい可変パーセンタイルは、重み付けの手法として、後述する除法による重み付けを行うか減法による重み付けを行うか、並びに、評価値として、重み付き発現量の幾何平均を採用するか重み付き発現量の総和を採用するかによって異なり得る。具体的な好ましい可変パーセンタイルについては、後述する項目２－３の評価値の欄において詳述する。
【0083】
可変パーセンタイルの決定方法の例としては、例えば、コントロールにおける前記７遺伝子マーカーの各パーセンタイルにおける発現量のうち、前記７遺伝子マーカー各々の前記微小残存病変の有無に関するカットオフ値に最も近い発現量を示すパーセンタイルを選択する方法が挙げられる。本発明において、神経芽腫の微小残存病変の有無とは、具体的には、進行（Progression）病期の微小残存病変の有無（つまり、微小残存病変の病勢の進行又は再増殖の有無）、１回目の治療介入をすべきレベルの神経芽腫の微小残存病変の有無（つまり、初めての治療介入をすべきレベルの神経芽腫の微小残存病変における病勢（有）とコントロールにおける病勢（無））、神経芽腫の微小残存病変に対する治療効果の有無、又は神経芽腫の微小残存病変の再発の有無（つまり、治療により寛解した後、微小残存病変が再発した場合の病勢（有）と再発しない場合の病勢（無））等をいう。カットオフ値は、有無を判断すべき病態（つまり、診断の目的）に応じて得ることができる。つまり、カットオフ値は、有無の対象となる病態によって異なりうる。７遺伝子マーカー各々の微小残存病変の有無に関するカットオフ値は、当業者に公知の方法によって取得することができる。好ましくは、７遺伝子マーカーのそれぞれについて、微小残存病変の有無のＲＯＣ(receiver operating characteristic)解析を行い、ＡＵＣ(area under the curve)を最大化する発現量をカットオフ値として取得することができる。
【0084】
一例として、骨髄試料において、ＣＲＭＰ１について８３パーセンタイル、ＤＢＨについて７９パーセンタイル、ＤＤＣについて６７パーセンタイル、ＧＡＰ４３について９０パーセンタイル、ＩＳＬ１について５１パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂについて７６パーセンタイル、ＴＨについて８１パーセンタイルにおける発現量をコントロールにおける統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として用いる場合を挙げると、ＣＲＭＰ１については統計学的数値Ｂ１として４２．２、ＤＢＨについては統計学的数値Ｂ２として３．７、ＤＤＣについては統計学的数値Ｂ３として２.７、ＧＡＰ４３については統計学的数値Ｂ４として８．６、ＩＳＬ１については統計学的数値Ｂ５として２．３、ＰＨＯＸ２Ｂについては統計学的数値Ｂ６として３.１、ＴＨについては統計学的数値Ｂ７として４．２が用いられる。
【0085】
可変パーセンタイルの決定方法の他の例としては、本発明の方法による神経芽腫の微小残存病変の有無についてのＡＵＣを最大化する発現量を示す固定パーセンタイルを導出し、当該固定パーセンタイルから各遺伝子マーカーのパーセンタイルを個別に変化させることで、当該固定パーセンタイルによるＡＵＣを超える最適なパーセンタイルの組み合わせを見出す方法が挙げられる。
【0086】
可変パーセンタイルは、７遺伝子マーカーについて個別に最適なパーセンタイルの探索が必要となるものの、固定パーセンタイルを用いる場合の本発明によるＡＵＣを超える最適なパーセンタイルの組み合わせを見出すことで、固定パーセンタイルよりも正確に神経芽腫の微小残存病変の有無の判別を行うことが可能な場合がある点で好ましい。
【0087】
［２－２．重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７］
本発明においては、工程１で得られた発現量Ａ１～Ａ７の各々に対して、上述のコントロールにおける統計学的数値Ｂ１～Ｂ７（非重要度）を加味した重み付けを行うことで補正し、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７を得る。言い換えると、工程１で得られた発現量Ａ１～Ａ７の各々を、コントロールにおける統計学的数値Ｂ１～Ｂ７（非重要度）に基づく補正量で相殺することによって重み付けを行うことで、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７を得る。例えば、発現量Ａ１をＣＲＭＰ１の発現量とすると、ＣＲＭＰ１がコントロールにおいて比較的検出されやすく検出量も比較的大きいことを加味して、発現量Ａ１から、非重要度に基づくより大きい補正量を減じるように補正する。また、発現量Ａ２をＤＢＨの発現量とすると、ＤＢＨがコントロールにおいて比較的検出されにくく検出量も比較的小さいことを加味して、発現量Ａ２から、非重要度に基づくより小さい補正量を減じるように補正する。
本発明においては、工程１で得られた発現量Ａ１～Ａ７の各々に対して、上述のコントロールにおける統計学的数値Ｂ１～Ｂ７（非重要度）を加味した重み付けを行うことで補正し、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７を得る。言い換えると、工程１で得られた発現量Ａ１～Ａ７の各々を、コントロールにおける統計学的数値Ｂ１～Ｂ７（非重要度）に基づく補正量で相殺することによって重み付けを行うことで、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７を得る。例えば、発現量Ａ１をＣＲＭＰ１の発現量とすると、ＣＲＭＰ１がコントロールにおいて比較的検出されやすく検出量も比較的大きいことを加味して、発現量Ａ１から、非重要度に基づくより大きい補正量を減じるように補正する。また、発現量Ａ２をＤＢＨの発現量とすると、ＤＢＨがコントロールにおいて比較的検出されにくく検出量も比較的小さいことを加味して、発現量Ａ２から、非重要度に基づくより小さい補正量を減じるように補正する。
【0088】
非重要度に基づく補正量を減じる重み付けの方法としては、以下に述べるとおり、除法により重み付けを行う方法と、減法により重み付けを行う方法とが挙げられる。
【0089】
［２－２－１．除法による重み付け］
除法により重み付けを行う場合、具体的には、発現量Ａ１～Ａ７各々を統計学的数値Ｂ１～Ｂ７で除して、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７を得る。例えば、重み付き発現量ＡＢ１は｛Ａ１／Ｂ１｝、重み付き発現量ＡＢ２は｛Ａ２／Ｂ２｝、・・・、重み付き発現量ＡＢ７は｛Ａ７／Ｂ７｝として得られる。統計学的数値Ｂ１～Ｂ７は、いずれも０でないことを条件として、上記の固定パーセンタイルにおける発現量及び可変パーセンタイルにおける発現量のいずれも用いることができる。
除法により重み付けを行う場合、具体的には、発現量Ａ１～Ａ７各々を統計学的数値Ｂ１～Ｂ７で除して、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７を得る。例えば、重み付き発現量ＡＢ１は｛Ａ１／Ｂ１｝、重み付き発現量ＡＢ２は｛Ａ２／Ｂ２｝、・・・、重み付き発現量ＡＢ７は｛Ａ７／Ｂ７｝として得られる。統計学的数値Ｂ１～Ｂ７は、いずれも０でないことを条件として、上記の固定パーセンタイルにおける発現量及び可変パーセンタイルにおける発現量のいずれも用いることができる。
【0090】
本発明においては、神経芽腫の有無の判別の正確性をより一層向上させる観点から、重み付けの方法として、除法により重み付けを行うことがより好ましい場合がある。例えば、後述の評価値として、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７の総和をとる場合は、神経芽腫の有無の判別の正確性をより一層向上させる観点から、除法により重み付けを行うことがより好ましい。
【0091】
［２－２－２．減法による重み付け］
減法により重み付けを行う場合、具体的には、発現量Ａ１～Ａ７各々から統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を差し引いて、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７を得る。例えば、重み付き発現量ＡＢ１は｛Ａ１－Ｂ１｝、重み付き発現量ＡＢ２は｛Ａ２－Ｂ２｝、・・・、重み付き発現量ＡＢ７は｛Ａ７－Ｂ７｝として得られる。統計学的数値Ｂ１～Ｂ７は、上記の固定パーセンタイルにおける発現量及び可変パーセンタイルにおける発現量のいずれも用いることができる。
減法により重み付けを行う場合、具体的には、発現量Ａ１～Ａ７各々から統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を差し引いて、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７を得る。例えば、重み付き発現量ＡＢ１は｛Ａ１－Ｂ１｝、重み付き発現量ＡＢ２は｛Ａ２－Ｂ２｝、・・・、重み付き発現量ＡＢ７は｛Ａ７－Ｂ７｝として得られる。統計学的数値Ｂ１～Ｂ７は、上記の固定パーセンタイルにおける発現量及び可変パーセンタイルにおける発現量のいずれも用いることができる。
【0092】
減法による重み付けの具体的な取扱いとしては、後述の評価値を、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７の幾何平均として得るか、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７の総和として得るかで異なる。
【0093】
後述の評価値を、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７の幾何平均として得る場合については、発現量Ａ１～Ａ７各々から統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を差し引いた結果１未満となるものがある場合、その重み付き発現量は１とする。例えば、｛Ａ１－Ｂ１｝＞１、｛Ａ２－Ｂ２｝＜１、・・・、｛Ａ７－Ｂ７｝＞１である場合、重み付き発現量ＡＢ１は｛Ａ１－Ｂ１｝、重み付き発現量ＡＢ２は１、・・・重み付き発現量ＡＢ７は｛Ａ７－Ｂ７｝となる。
【0094】
後述の評価値を、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７の総和として得る場合については、発現量Ａ１～Ａ７各々から統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を差し引いた結果負の数値となるものがある場合、その重み付き発現量は０とする。例えば、｛Ａ１－Ｂ１｝＞０、｛Ａ２－Ｂ２｝＜０、・・・、｛Ａ７－Ｂ７｝＞０である場合、重み付き発現量ＡＢ１は｛Ａ１－Ｂ１｝、重み付き発現量ＡＢ２は０、・・・重み付き発現量ＡＢ７は｛Ａ７－Ｂ７｝となる。
【0095】
［２－３．評価値］
本発明では、７遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ７に、コントロールにおける統計学的数値Ｂ１～Ｂ７（非重要度）を加味した重み付けを行うことで補正して得られた重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７の幾何平均又は総和を、評価値として得る。
本発明では、７遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ７に、コントロールにおける統計学的数値Ｂ１～Ｂ７（非重要度）を加味した重み付けを行うことで補正して得られた重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ７の幾何平均又は総和を、評価値として得る。
【0096】
［２－３－１．重み付き発現量の幾何平均］
発現量ＡＢ１～ＡＢ７の幾何平均である評価値は、減法により重み付けを行った場合では、｛Π［ｉ＝１→７］（Ａｉ－Ｂｉ）｝1/7（但し、Ａｉ－Ｂｉ＜１の場合、Ａｉ－Ｂｉ＝１とする。）で表される。以下、減法による重み付き発現量の幾何平均を評価値として用いる場合において、重み付けに用いられる統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を与えるパーセンタイルの例を述べる。
発現量ＡＢ１～ＡＢ７の幾何平均である評価値は、減法により重み付けを行った場合では、｛Π［ｉ＝１→７］（Ａｉ－Ｂｉ）｝1/7（但し、Ａｉ－Ｂｉ＜１の場合、Ａｉ－Ｂｉ＝１とする。）で表される。以下、減法による重み付き発現量の幾何平均を評価値として用いる場合において、重み付けに用いられる統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を与えるパーセンタイルの例を述べる。
【0097】
骨髄試料において、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として図３Ａ及び図３Ｂの統計に基づいた固定パーセンタイル（１パーセンタイル以上のいずれかにおける共通するパーセンタイル）における発現量を用いる場合、神経芽腫の微小残存病変の有無に関する判別の正確性を向上させる観点から、好ましい固定パーセンタイルとしては、６～９２パーセンタイルが挙げられ、より好ましくは６～５５パーセンタイル、さらに好ましくは３０～５５パーセンタイルが挙げられる（図９参照）。
【0098】
また、骨髄試料において、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として図３Ａ及び図３Ｂの統計に基づいた可変パーセンタイルにおける発現量を用いる場合、神経芽腫の微小残存病変の有無に関する判別の正確性を向上させる観点から、好ましいパーセンタイルの組み合わせの例としては、ＣＲＭＰ１については３８～４４パーセンタイル、ＤＢＨについては５３～６６パーセンタイル、ＤＤＣについては５５～６３パーセンタイル、ＧＡＰ４３については４９～６５パーセンタイル、ＩＳＬ１については４０～５６パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂについては５１～７１パーセンタイル、ＴＨについては５１～７１パーセンタイル；又は、ＣＲＭＰ１については３８～４４パーセンタイル、ＤＢＨについては１～５２パーセンタイル、ＤＤＣについては１～５４パーセンタイル、ＧＡＰ４３については８５～８６パーセンタイル、ＩＳＬ１については９２～９４パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂについては１～５０パーセンタイル、ＴＨについては５１～７１パーセンタイルが挙げられる。より好ましい可変パーセンタイルの組み合わせの例としては、ＣＲＭＰ１については８３パーセンタイル、ＤＢＨについては１～５２パーセンタイル、ＤＤＣについては１～５４パーセンタイル、ＧＡＰ４３については８５～８６パーセンタイル、ＩＳＬ１については９２～９４パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂについては１～５０パーセンタイル、ＴＨについては１～５０パーセンタイルが挙げられる（実施例の表９（ｄ１２）参照）。
【0099】
末梢血試料において、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として図４Ａ及び図４Ｂの統計に基づいた固定パーセンタイルにおける発現量を用いる場合、神経芽腫の微小残存病変の有無に関する判別の正確性を向上させる観点から、好ましい固定パーセンタイルとしては、５２～９９パーセンタイル、より好ましくは６８～９９パーセンタイルが挙げられる（図１２参照）。
【0100】
末梢血幹細胞試料において、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として図４Ａ及び図４Ｂの統計に基づいた固定パーセンタイル（２１パーセンタイル以上のいずれかにおける共通するパーセンタイル）における発現量を用いる場合、神経芽腫の微小残存病変の有無に関する判別の正確性を向上させる観点から、好ましい固定パーセンタイルとしては、２１～９９パーセンタイル、より好ましくは７９～９５パーセンタイルが挙げられる（図１５参照）。
【0101】
また、末梢血幹細胞試料において、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として図４Ａ及び図４Ｂの統計に基づいた可変パーセンタイルにおける発現量を用いる場合、神経芽腫の微小残存病変の有無に関する判別の正確性を向上させる観点から、好ましいパーセンタイルの組み合わせの例としては、ＣＲＭＰ１については９１～９９パーセンタイル、ＤＢＨについては９１～９２パーセンタイル、ＤＤＣについては９２～９５パーセンタイル、ＧＡＰ４３については９１～９２パーセンタイル、ＩＳＬ１については９８～９９パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂについては８７～９２パーセンタイル、ＴＨについては８２～９３パーセンタイルが挙げられる（実施例の表１２（ｄ１２）参照）。
【0102】
［２－３－２．重み付き発現量の総和］
［２－３－２－１．減法により重み付けを行った場合］
発現量ＡＢ１～ＡＢ７の総和である評価値は、減法により重み付けを行った場合では、Σ［ｋ＝１→７］（Ａｋ－Ｂｋ）（但し、Ａｋ－Ｂｋ＜０の場合、Ａｋ－Ｂｋ＝０とする。）で表される。以下、減法による重み付き発現量の総和を評価値として用いる場合において、重み付けに用いられる統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を与えるパーセンタイルの例を述べる。
［２－３－２－１．減法により重み付けを行った場合］
発現量ＡＢ１～ＡＢ７の総和である評価値は、減法により重み付けを行った場合では、Σ［ｋ＝１→７］（Ａｋ－Ｂｋ）（但し、Ａｋ－Ｂｋ＜０の場合、Ａｋ－Ｂｋ＝０とする。）で表される。以下、減法による重み付き発現量の総和を評価値として用いる場合において、重み付けに用いられる統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を与えるパーセンタイルの例を述べる。
【0103】
骨髄試料において、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として図３Ａ及び図３Ｂの統計に基づいた固定パーセンタイル（６パーセンタイル以上のいずれかにおける共通するパーセンタイル）における発現量を用いる場合、神経芽腫の微小残存病変の有無に関する判別の正確性を向上させる観点から、好ましい固定パーセンタイルとしては、６～９３パーセンタイル、より好ましくは６６～８０パーセンタイル、さらに好ましくは７５パーセンタイルが挙げられる（図１０参照）。
【0104】
また、骨髄試料において、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として図３Ａ及び図３Ｂの統計に基づいた可変パーセンタイルにおける発現量を用いる場合、神経芽腫の微小残存病変の有無に関する判別の正確性を向上させる観点から、好ましい可変パーセンタイルとしては、上記項目の２－１－２で述べた、カットオフ値に最も近い発現量を示すコントロールでの可変パーセンタイル（実施例の表９（ｄ２２）参照）が挙げられる。
【0105】
末梢血試料において、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として図４Ａ及び図４Ｂの統計に基づいた固定パーセンタイルにおける発現量を用いる場合、神経芽腫の微小残存病変の有無に関する判別の正確性を向上させる観点から、好ましい固定パーセンタイルとしては、２１～９９パーセンタイル、より好ましくは９３～９９パーセンタイルが挙げられる（図１３参照）。
【0106】
また、末梢血試料において、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として図４Ａ及び図４Ｂの統計に基づいた固定パーセンタイルにおける発現量を用いる場合、神経芽腫の微小残存病変の有無に関する判別の正確性を向上させる観点から、好ましい可変パーセンタイルとしては、上記項目の２－１－２で述べた、カットオフ値に最も近い発現量を示すコントロールでの可変パーセンタイルが挙げられる。
【0107】
末梢血幹細胞試料において、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として図４Ａ及び図４Ｂの統計に基づいた固定パーセンタイル（２１パーセンタイル以上のいずれかにおける共通するパーセンタイル）における発現量を用いる場合、神経芽腫の微小残存病変の有無に関する判別の正確性を向上させる観点から、好ましい固定パーセンタイルとしては、２１～９９パーセンタイル、より好ましくは６９～９３パーセンタイル、さらに好ましくは９２パーセンタイルが挙げられる（図１６参照）。
【0108】
また、末梢血幹細胞試料において、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として図４Ａ及び図４Ｂの統計に基づいた可変パーセンタイルにおける発現量を用いる場合、神経芽腫の微小残存病変の有無に関する判別の正確性を向上させる観点から、好ましい可変パーセンタイルの組み合わせとしては、ＣＲＭＰ１については９１～９９パーセンタイル、ＤＢＨについては９１パーセンタイル、ＤＤＣについては９５パーセンタイル、ＧＡＰ４３については８８～９９パーセンタイル、ＩＳＬ１については９８～９９パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂについては７９パーセンタイル、ＴＨについては８９～９３パーセンタイルが挙げられる（実施例の表１２（ｄ２２）参照）。
【0109】
［２－３－２－２．除法により重み付けを行った場合］
発現量ＡＢ１～ＡＢ７の総和である評価値は、除法により重み付けを行った場合では、Σ［ｋ＝１→７］Ａｋ／Ｂｋで表される。以下、除法による重み付き発現量の総和を評価値として用いる場合において、重み付けに用いられる統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を与えるパーセンタイルの例を述べる。
発現量ＡＢ１～ＡＢ７の総和である評価値は、除法により重み付けを行った場合では、Σ［ｋ＝１→７］Ａｋ／Ｂｋで表される。以下、除法による重み付き発現量の総和を評価値として用いる場合において、重み付けに用いられる統計学的数値Ｂ１～Ｂ７を与えるパーセンタイルの例を述べる。
【0110】
骨髄試料において、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として図３Ａ及び図３Ｂの統計に基づいた固定パーセンタイルにおける発現量を用いる場合、コントロールにおける７遺伝子マーカー全ての発現量が０でない、５４パーセンタイル以上の固定パーセンタイルにおける発現量を用いる。神経芽腫の微小残存病変の有無に関する判別の正確性を向上させる観点から、好ましい固定パーセンタイルとしては、５４～９９パーセンタイル、より好ましくは５５～９９パーセンタイルが挙げられる（図１１参照）。
【0111】
また、骨髄試料において、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として図３Ａ及び図３Ｂの統計に基づいた可変パーセンタイルにおける発現量を用いる場合、神経芽腫の微小残存病変の有無に関する判別の正確性を向上させる観点から、好ましい可変パーセンタイルの組み合わせとしては、ＣＲＭＰ１については３８～４４パーセンタイル、ＤＢＨについては７７～８３パーセンタイル、ＤＤＣについては９７４～７９パーセンタイル、ＧＡＰ４３については３８～４８パーセンタイル、ＩＳＬ１については５７～６８パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂについては７２～７７パーセンタイル、ＴＨについては７８～８３パーセンタイルが挙げられる。より好ましい可変パーセンタイルの組み合わせとしては、ＣＲＭＰ１については９２パーセンタイル、ＤＢＨについては９１～９２パーセンタイル、ＤＤＣについては９９パーセンタイル、ＧＡＰ４３については９３パーセンタイル、ＩＳＬ１については９６パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂについては９２～９３パーセンタイル、ＴＨについては８４～８７パーセンタイルが挙げられる（実施例の表９（ｄ３２）参照）。
【0112】
末梢血試料において、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として図４Ａ及び図４Ｂの統計に基づいた固定パーセンタイルにおける発現量を用いる場合、コントロールにおける７遺伝子マーカー全ての発現量が０でない、９０パーセンタイル以上の固定パーセンタイルにおける発現量を用いる。神経芽腫の微小残存病変の有無に関する判別の正確性を向上させる観点から、好ましい固定パーセンタイルとしては、９１～９９パーセンタイル、より好ましくは９４～９７パーセンタイルが挙げられる（図１４参照）。
【0113】
末梢血幹細胞試料において、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として図４Ａ及び図４Ｂの統計に基づいた固定パーセンタイルにおける発現量を用いる場合、コントロールにおける７遺伝子マーカー全ての発現量が０でない、９０パーセンタイル以上の固定パーセンタイルにおける発現量を用いる。神経芽腫の微小残存病変の有無に関する判別の正確性を向上させる観点から、好ましい固定パーセンタイルとしては、９０～９９パーセンタイルが挙げられる（図１７参照）。
【0114】
また、末梢血幹細胞試料において、統計学的数値Ｂ１～Ｂ７として図４Ａ及び図４Ｂの統計に基づいた可変パーセンタイルにおける発現量を用いる場合、神経芽腫の微小残存病変の有無に関する判別の正確性を向上させる観点から、好ましい可変パーセンタイルの組み合わせとしては、ＣＲＭＰ１については９８～９９パーセンタイル、ＤＢＨについては９０パーセンタイル、ＤＤＣについては９８～９９パーセンタイル、ＧＡＰ４３については９２～９３パーセンタイル、ＩＳＬ１については９９パーセンタイル、ＰＨＯＸ２Ｂについては９０パーセンタイル、ＴＨについては９０～９２パーセンタイルが挙げられる（実施例の表１２（ｄ３２）参照）。
【0115】
［２－３－３．評価値と病状との関係］
評価値は、神経芽腫患者の病期、つまり寛解（Remission）、安定（Stable）、及び進行（Progression）を有意に区別することができる。また、評価値は、神経芽腫患者の検体採取時期、つまり診断（Diagnosis）、治療中（Treatment）、治療後フォローアップ中（Post-treatment）、及び再発（Relapse）による腫瘍量の違いを有意に反映する。このため、評価値は、神経芽腫に対する病勢の評価、治療効果の有無、又は再発の有無の判断に効果的に利用することができる。
評価値は、神経芽腫患者の病期、つまり寛解（Remission）、安定（Stable）、及び進行（Progression）を有意に区別することができる。また、評価値は、神経芽腫患者の検体採取時期、つまり診断（Diagnosis）、治療中（Treatment）、治療後フォローアップ中（Post-treatment）、及び再発（Relapse）による腫瘍量の違いを有意に反映する。このため、評価値は、神経芽腫に対する病勢の評価、治療効果の有無、又は再発の有無の判断に効果的に利用することができる。
【0116】
［３．工程３］
神経芽腫の微小残存病変の評価は、評価値を、神経芽腫の微小残存病変の有無に関するカットオフ値と比較することにより行う。神経芽腫の微小残存病変の有無とは、上述のとおり、進行（Progression）病期の微小残存病変の有無、神経芽腫の微小残存病変に対する治療効果の有無、又は神経芽腫の微小残存病変の再発の有無をいう。評価値がカットオフ値以上の場合、病勢が進行段階にある、治療効果が無い、又は再発が有ると判断することができる。従って、評価値がカットオフ値以上の場合、生体試料の由来元となる患者について、神経芽腫の微小残存病変について、病勢が進行段階にある、治療効果が無い、又は再発が有ると診断することができる。
神経芽腫の微小残存病変の評価は、評価値を、神経芽腫の微小残存病変の有無に関するカットオフ値と比較することにより行う。神経芽腫の微小残存病変の有無とは、上述のとおり、進行（Progression）病期の微小残存病変の有無、神経芽腫の微小残存病変に対する治療効果の有無、又は神経芽腫の微小残存病変の再発の有無をいう。評価値がカットオフ値以上の場合、病勢が進行段階にある、治療効果が無い、又は再発が有ると判断することができる。従って、評価値がカットオフ値以上の場合、生体試料の由来元となる患者について、神経芽腫の微小残存病変について、病勢が進行段階にある、治療効果が無い、又は再発が有ると診断することができる。
【0117】
カットオフ値は、上述の手法により予め測定することで経験的に収集した評価値を参照し、公知の統計手法により設定することができる。カットオフ値の具体的な設定手法としては、たとえば、ＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic)分析法などが挙げられる。
【0118】
本発明においては、高感度であるデジタルＰＣＲの特有の課題に鑑みて、７遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ７に、コントロールにおける統計学的数値Ｂ１～Ｂ７（非重要度）を加味した重み付けを行う独自の補正を行って幾何平均又は総和をとることにより、いずれか１個のマーカーが陽性であることにより神経芽腫の微小残存病変を陽性とする手法、それぞれのマーカー発現量の幾何平均がカットオフ値以上であることにより神経芽腫の微小残存病変を陽性とする手法、それぞれのマーカー発現量の総和がカットオフ値以上であることにより神経芽腫の微小残存病変を陽性とする手法のいずれに比べても、神経芽腫の微小残存病変の有無をより正確に判別することができる。
【0119】
本発明によって、神経芽腫の微小残存病変を検出する正確性（神経芽腫の微小残存病変の有無に関するＡＵＣ）を総合的に向上させることができるため、病勢・治療効果のモニター又は再発予測の信頼性を向上させることができる。例えば、病勢・治療効果のモニターにおいては、病勢の悪化・治療効果が無い、又は病勢の改善・治療効果が有るを正確に判断することにより、治療方法についてより的確な臨床判断を行い、予後改善を図ることができる。また、再発予測においては、再発が有る（つまり治療介入の必要があること）又は無い（引き続き経過観察を行ってよいこと）を正確に判断することにより、治療介入についてより的確な臨床判断を行い、予後改善を図ることができる。特に、再発率の高い高リスク群患者に対してこのような的確な臨床判断を行うことは、これまで発見出来なかった段階で治療介入することが可能となるため、生存率の改善が期待できる。
【実施例】
【0120】
以下に実施例を示し本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。以下の実施例では、ＭＲＤ遺伝子マーカーとして、ＣＲＭＰ１（配列番号１）、ＤＢＨ（配列番号２）、ＤＤＣ（配列番号３）、ＧＡＰ４３（配列番号４）、ＩＳＬ１（配列番号５）、ＰＨＯＸ２Ｂ（配列番号６）およびＴＨ（配列番号７）を用い、レファレンス遺伝子としてＨＰＲＴ１（配列番号８）を用いた。
【0121】
［１］検体背景
［１－１］コントロール検体
コントロール（non-NB control）検体として、健常成人からの骨髄１０３検体をコマーシャルソースから入手し、健常成人からの末梢血１０７検体を日本赤十字社から入手した。献血の使用は神戸大学医学部附属病院および日本赤十字社検討委員会により承認された。
［１－１］コントロール検体
コントロール（non-NB control）検体として、健常成人からの骨髄１０３検体をコマーシャルソースから入手し、健常成人からの末梢血１０７検体を日本赤十字社から入手した。献血の使用は神戸大学医学部附属病院および日本赤十字社検討委員会により承認された。
【0122】
［１－２］神経芽腫患者検体
神経芽腫患者（NB patient）検体として、国際神経芽腫リスク分類（ＩＮＲＧリスク分類）における高リスク神経芽腫患者２０名から、神戸大学病院小児科及び兵庫県立こども病院血液腫瘍科において診断及び／又は治療のために採取した検体残余として、骨髄（ＢＭ）２０８検体、末梢血（ＰＢ）６７検体、及び末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）２０検体を入手した。これらの検体は、高リスク神経芽腫患者それぞれについて神経芽腫治療の全過程（診断時（Diagnosis）、治療介入時（Treatment）、治療介入後（Post-treatment）、及び再発時（Relapse））を通じてできるだけ頻繁に採取したものである。検体は、書面によるインフォームドコンセントを得て採取した。本研究は、神戸大学大学院医学研究科および兵庫県立こども病院の倫理委員会の承認を得て、神戸大学医学研究科臨床研究ガイドラインに沿って実施した。
神経芽腫患者（NB patient）検体として、国際神経芽腫リスク分類（ＩＮＲＧリスク分類）における高リスク神経芽腫患者２０名から、神戸大学病院小児科及び兵庫県立こども病院血液腫瘍科において診断及び／又は治療のために採取した検体残余として、骨髄（ＢＭ）２０８検体、末梢血（ＰＢ）６７検体、及び末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）２０検体を入手した。これらの検体は、高リスク神経芽腫患者それぞれについて神経芽腫治療の全過程（診断時（Diagnosis）、治療介入時（Treatment）、治療介入後（Post-treatment）、及び再発時（Relapse））を通じてできるだけ頻繁に採取したものである。検体は、書面によるインフォームドコンセントを得て採取した。本研究は、神戸大学大学院医学研究科および兵庫県立こども病院の倫理委員会の承認を得て、神戸大学医学研究科臨床研究ガイドラインに沿って実施した。
【0123】
全ての骨髄検体、末梢血検体及び末梢血幹細胞検体を採取した時点での患者の疾患状態に関しては、J Clin Oncol 1993, 11:1466-1477.及びCancer 2017, 123:1095-1105.を参照し、国際神経芽腫反応基準（INRC反応基準）に従って、完全寛解（CR）または非常に良好な部分寛解（VGPR）に対応する「寛解（remission）」、部分寛解（PR）、混合反応（MR）、又は無反応（NR）に対応する「安定（stable）」、及び進行性疾患（PD）に対応する「進行（progression）」のいずれの病期に相当するかを評価した。全ての検体の背景（病期（Disease status）及び採取時期（Collection time point））を下記表に示す。下記表における数値は、当該病期又は採取時期に該当する検体数／患者数を表している。
【0124】
【表1】
【0125】
［２］７遺伝子マーカーの測定
以下の手法で、遺伝子マーカー（ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨ）の測定を行った。
１）抗凝固剤（EDTAまたはヘパリン）を含む検体2 ml～5 mlから、モノ・ポリ分離溶液（DSファーマバイオメディカル社製）を用いて有核細胞を遠心分離した。
２）得られた有核細胞から、TRIZOL PLUS RNA Purification kit（ライフテクノロジー社製）を用いてtotal RNAを抽出し、使用するまで－８０℃で保存した。
３）Nanodrop 2000分光光度計（ThermoFisher Scientific社）によってRNA濃度を測定し、Total RNAの品質について、2100 Bioanalyzer（アジレントテクノロジー社製）を用いてその完全性を評価した。
４）品質を評価したtotal RNA 1.0 μgからQuantiTect Reverse Transcription kit（キアジェン社製）を用いてcDNAを合成し、total 80μlとなるようにTE bufferで希釈した。
以下の手法で、遺伝子マーカー（ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨ）の測定を行った。
１）抗凝固剤（EDTAまたはヘパリン）を含む検体2 ml～5 mlから、モノ・ポリ分離溶液（DSファーマバイオメディカル社製）を用いて有核細胞を遠心分離した。
２）得られた有核細胞から、TRIZOL PLUS RNA Purification kit（ライフテクノロジー社製）を用いてtotal RNAを抽出し、使用するまで－８０℃で保存した。
３）Nanodrop 2000分光光度計（ThermoFisher Scientific社）によってRNA濃度を測定し、Total RNAの品質について、2100 Bioanalyzer（アジレントテクノロジー社製）を用いてその完全性を評価した。
４）品質を評価したtotal RNA 1.0 μgからQuantiTect Reverse Transcription kit（キアジェン社製）を用いてcDNAを合成し、total 80μlとなるようにTE bufferで希釈した。
【0126】
５）QX200 Droplet Digital PCR System（バイオラッド社製）を用いて、７種の遺伝子マーカー全てを１回の操作で同時にddPCR（デジタルＰＣＲ）反応に供し、それぞれの遺伝子マーカーの発現量の解析を行った。
具体的には、各遺伝子マーカー（ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨ）およびレファレンス遺伝子（ＨＰＲＴ１）のプライマーとしては、それぞれ、配列番号１３から配列番号２６および配列番号２７から２８に示す配列を有するものを使用し、プローブとしては、 Universal Probe Library（ロッシュ社製）#65 (CRMP1マーカー用)、#3 (DBHマーカー用)、#49（DDCマーカー用）、 #26 (GAP43マーカー用)、#66 (ISL1マーカー用)、#17 (PHOX2Bマーカー用)、#42 (THマーカー用)、#73 (HPRT1マーカー用)を使用した。
鋳型cDNA 1.0 μl(total RNA 12.5 ng相当)、2 x ddPCR Supermix for Probes（バイオラッド）10μl、Sense primer (それぞれfinal 500 nM)、Antisense primer (それぞれfinal 500 nM)、Universal Probe Library（ロッシュ社製）(それぞれfinal 250 nM)を含む全量20 μlの反応液を調製した。
QX200 Droplet Generator (バイオラッド社製)を用いて反応液のドロップレットを作製し、各cDNAをC1000 Touch Thermal Cycler（バイオラッド社製）で増幅した。熱サイクル条件は、９５℃で１０分間の予備サイクル、９４℃で３０秒及び５６℃１分３０秒を１サイクルとして４０サイクル、及び９８℃で１０分間のポストサイクリングであった。温度上昇速度は２℃／秒であった。
ddPCR増幅後、液滴をQX200 Droplet Reader(バイオラッド社製)で測定し、標的コピー数をQuantaSoft（バージョン1.6.6、バイオラッド社製）によって分析した。非テンプレート対照（ＮＴＣ）反応を用い、陽性および陰性液滴集団の閾値を手動で設定した。全ＲＮＡの量およびｃＤＮＡ合成効率の違いを補正するために、標的コピー数を、レファレンス遺伝子ＨＰＲＴ１を用いて標準化した。
なお、再現性のあるddPCR反応を確実にするために、１滴あたり最低０．０４５コピーのＨＰＲＴ１ ｍＲＮＡが得られたｃＤＮＡのみを選択し、選択したｃＤＮＡをさらに２～８倍希釈して１滴あたり最大０．４５コピーとなるように調整した。結果として、ddPCR反応は、神経芽腫患者およびコントロールからのすべての試料について２～３回繰り返された。この研究は、デジタルMIQEガイドラインに従って実施された。
具体的には、各遺伝子マーカー（ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨ）およびレファレンス遺伝子（ＨＰＲＴ１）のプライマーとしては、それぞれ、配列番号１３から配列番号２６および配列番号２７から２８に示す配列を有するものを使用し、プローブとしては、 Universal Probe Library（ロッシュ社製）#65 (CRMP1マーカー用)、#3 (DBHマーカー用)、#49（DDCマーカー用）、 #26 (GAP43マーカー用)、#66 (ISL1マーカー用)、#17 (PHOX2Bマーカー用)、#42 (THマーカー用)、#73 (HPRT1マーカー用)を使用した。
鋳型cDNA 1.0 μl(total RNA 12.5 ng相当)、2 x ddPCR Supermix for Probes（バイオラッド）10μl、Sense primer (それぞれfinal 500 nM)、Antisense primer (それぞれfinal 500 nM)、Universal Probe Library（ロッシュ社製）(それぞれfinal 250 nM)を含む全量20 μlの反応液を調製した。
QX200 Droplet Generator (バイオラッド社製)を用いて反応液のドロップレットを作製し、各cDNAをC1000 Touch Thermal Cycler（バイオラッド社製）で増幅した。熱サイクル条件は、９５℃で１０分間の予備サイクル、９４℃で３０秒及び５６℃１分３０秒を１サイクルとして４０サイクル、及び９８℃で１０分間のポストサイクリングであった。温度上昇速度は２℃／秒であった。
ddPCR増幅後、液滴をQX200 Droplet Reader(バイオラッド社製)で測定し、標的コピー数をQuantaSoft（バージョン1.6.6、バイオラッド社製）によって分析した。非テンプレート対照（ＮＴＣ）反応を用い、陽性および陰性液滴集団の閾値を手動で設定した。全ＲＮＡの量およびｃＤＮＡ合成効率の違いを補正するために、標的コピー数を、レファレンス遺伝子ＨＰＲＴ１を用いて標準化した。
なお、再現性のあるddPCR反応を確実にするために、１滴あたり最低０．０４５コピーのＨＰＲＴ１ ｍＲＮＡが得られたｃＤＮＡのみを選択し、選択したｃＤＮＡをさらに２～８倍希釈して１滴あたり最大０．４５コピーとなるように調整した。結果として、ddPCR反応は、神経芽腫患者およびコントロールからのすべての試料について２～３回繰り返された。この研究は、デジタルMIQEガイドラインに従って実施された。
【0127】
６）サンプルの各MRD遺伝子マーカーの発現量として、MRD遺伝子マーカーのコピー数(copies per well)とレファレンス遺伝子のコピー数(copies per well)とから以下の式によりコピー数(Copies per sample)を算出した。つまり、サンプルの各MRD遺伝子マーカーの発現量を、レファレンス遺伝子に対する相対発現量（相対コピー数；relative copy number）として得た。
【0128】
【数1】
【0129】
［３］コントロールにおける７遺伝子マーカーの発現量
［３－１］コントロールと神経芽腫患者の診断時検体における７遺伝子マーカーの発現量
コントロール（Control）及び診断時（Diagnosis）の神経芽腫患者の、骨髄検体（BM）における７遺伝子マーカーの発現量（relative copy number）を図１に、末梢血検体（PB）おける７遺伝子マーカーの発現量（relative copy number）を図２に示す。図１及び図２に示すように、神経芽腫患者の診断時検体とコントロール検体との間で、７遺伝子マーカーのデジタルＰＣＲによる発現量に重なりが存在することを確認した。このような重なりは、デジタルＰＣＲよりも感度の低いｑＰＣＲで測定した場合には見られない。つまり、神経芽腫患者の診断時検体とコントロール検体との間で確認される発現量の重なりは、感度の優れたデジタルＰＣＲを用いることに特有の現象であることが分かった。
［３－１］コントロールと神経芽腫患者の診断時検体における７遺伝子マーカーの発現量
コントロール（Control）及び診断時（Diagnosis）の神経芽腫患者の、骨髄検体（BM）における７遺伝子マーカーの発現量（relative copy number）を図１に、末梢血検体（PB）おける７遺伝子マーカーの発現量（relative copy number）を図２に示す。図１及び図２に示すように、神経芽腫患者の診断時検体とコントロール検体との間で、７遺伝子マーカーのデジタルＰＣＲによる発現量に重なりが存在することを確認した。このような重なりは、デジタルＰＣＲよりも感度の低いｑＰＣＲで測定した場合には見られない。つまり、神経芽腫患者の診断時検体とコントロール検体との間で確認される発現量の重なりは、感度の優れたデジタルＰＣＲを用いることに特有の現象であることが分かった。
【0130】
［３－２］コントロール検体における７遺伝子マーカーの検出率
全コントロール検体中でデジタルＰＣＲにより７遺伝子マーカーそれぞれが検出された検体数（Detectable）及びその確率（％）を下記表に示す。
全コントロール検体中でデジタルＰＣＲにより７遺伝子マーカーそれぞれが検出された検体数（Detectable）及びその確率（％）を下記表に示す。
【0131】
【表2】
【0132】
上記表が示すとおり、デジタルＰＣＲによって解析される７遺伝子マーカーを多数のコントロール検体で統計すると、ｑＰＣＲで解析される場合とは大きく異なり、高い確率で７遺伝子が検出された。
【0133】
［３－３］コントロール検体における７遺伝子マーカー発現量のパーセンタイル統計
コントロール骨髄１０３検体における、デジタルＰＣＲによる７遺伝子マーカーの発現量の統計結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ａ及び図３Ｂに示すとおり、デジタルＰＣＲによる７遺伝子マーカーの発現量を小さい方からで並べて１００等分すると、遺伝子マーカーが初めて検出されるパーセンタイル及び遺伝子マーカーの発現量はそれぞれのマーカーで様々に異なり、同じパーセンタイルで比較しても、７遺伝子マーカーの発現量は様々に異なる。つまり、７遺伝子マーカーはそれぞれ重要度にばらつきがある（非重要度にばらつきがある）ことが判った。
コントロール骨髄１０３検体における、デジタルＰＣＲによる７遺伝子マーカーの発現量の統計結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ａ及び図３Ｂに示すとおり、デジタルＰＣＲによる７遺伝子マーカーの発現量を小さい方からで並べて１００等分すると、遺伝子マーカーが初めて検出されるパーセンタイル及び遺伝子マーカーの発現量はそれぞれのマーカーで様々に異なり、同じパーセンタイルで比較しても、７遺伝子マーカーの発現量は様々に異なる。つまり、７遺伝子マーカーはそれぞれ重要度にばらつきがある（非重要度にばらつきがある）ことが判った。
【0134】
コントロール末梢１０７検体における、デジタルＰＣＲによる７遺伝子マーカーの発現量の統計結果を同様に図４Ａ及び図４Ｂに示す。図４Ａ及び図４Ｂも図３Ａ及び図３Ｂと同様に、７遺伝子マーカーはそれぞれ重要度にばらつきがある（非重要度にばらつきがある）ことが判った。
【0135】
［試験例１：除法による７マーカー重み付き発現量の総和による診断能と単一マーカー陽性による診断能との対比］
コントロール骨髄（ＢＭ）検体群及び診断時に採取した神経芽腫患者の骨髄（ＢＭ）検体群と、コントロール末梢血（ＰＢ）検体群及び診断時に採取した神経芽腫患者の末梢血（ＰＢ）検体群とについて、上記［２］の方法で７遺伝子マーカーそれぞれの発現量を測定した。７遺伝子マーカーそれぞれ（Ｅａｃｈ ＮＢ－ｍＲＮＡ）の発現量と、図３Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量（ＢＭの場合）、又は図４Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量（ＰＢの場合）を統計学的数値（非重要度）として用い、７遺伝子マーカーそれぞれの発現量を統計学数値で除することで重み付き発現量に補正し、重み付き発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）として得た評価値と、について、コントロール骨髄検体群と診断時に採取した神経芽腫患者の骨髄検体群との間のカットオフ値（閾値：TV）、感度（sensitivity）、特異度（specificity）、及びＲＯＣ曲線下面積（AUC）を解析した。結果を下記表に示す。
コントロール骨髄（ＢＭ）検体群及び診断時に採取した神経芽腫患者の骨髄（ＢＭ）検体群と、コントロール末梢血（ＰＢ）検体群及び診断時に採取した神経芽腫患者の末梢血（ＰＢ）検体群とについて、上記［２］の方法で７遺伝子マーカーそれぞれの発現量を測定した。７遺伝子マーカーそれぞれ（Ｅａｃｈ ＮＢ－ｍＲＮＡ）の発現量と、図３Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量（ＢＭの場合）、又は図４Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量（ＰＢの場合）を統計学的数値（非重要度）として用い、７遺伝子マーカーそれぞれの発現量を統計学数値で除することで重み付き発現量に補正し、重み付き発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）として得た評価値と、について、コントロール骨髄検体群と診断時に採取した神経芽腫患者の骨髄検体群との間のカットオフ値（閾値：TV）、感度（sensitivity）、特異度（specificity）、及びＲＯＣ曲線下面積（AUC）を解析した。結果を下記表に示す。
【0136】
【表3】
【0137】
【表4】
【0138】
上記表３及び表４に示されるとおり、７遺伝子マーカーそれぞれにカットオフを設定して、カットオフを超えるマーカーを少なくとも１つ認めると陽性と判断する手法（単一マーカー陽性による診断）では、それぞれのマーカーのＡＵＣ値のばらつきが大きく、ＡＵＣ値が低いマーカーも散見される。この傾向は、末梢血において特に顕著である。このため、単一マーカー陽性による診断よりも、７遺伝子マーカーの発現量にコントロールでの発現量（統計学的数値）を加味して重み付けをした評価値（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）を用いる手法の方が、骨髄及び末梢血に関わらず常にＡＵＣ値が大きい（感度及び特異度が総合的に優れている）ため、より正確な診断が可能であることが示された。
【0139】
［試験例２：除法による７マーカー重み付き発現量の総和と病勢との関係］
神経芽腫患者の各病期における骨髄検体（ＢＭ）及び末梢血検体（ＰＢ）について、上記［２］の方法で測定した７遺伝子マーカー発現量（relative copy number）それぞれに、図３Ｂ及び図４Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量を統計学的数値（非重要度）として用い、除法による重み付き発現量に補正し、重み付き発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）を評価値として導出した。各病期における当該評価値の分布を、それぞれ、図５Ａ及び図５Ｂに示す。また、病期間での評価値の有意差を解析した結果を下記表に示す。
神経芽腫患者の各病期における骨髄検体（ＢＭ）及び末梢血検体（ＰＢ）について、上記［２］の方法で測定した７遺伝子マーカー発現量（relative copy number）それぞれに、図３Ｂ及び図４Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量を統計学的数値（非重要度）として用い、除法による重み付き発現量に補正し、重み付き発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）を評価値として導出した。各病期における当該評価値の分布を、それぞれ、図５Ａ及び図５Ｂに示す。また、病期間での評価値の有意差を解析した結果を下記表に示す。
【0140】
【表5】
【0141】
上記表に示されるとおり、７遺伝子マーカーの重み付き発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）として得られる評価値は、神経芽腫患者の各病期間で有意差を認めた。すなわち、当該評価値は、神経芽腫患者の病期、つまり寛解（Remission）、安定（Stable）、進行（Progression）の違いを反映しており、特に、進行（Progression）と他の病期との違いを良好に反映していることが分かった。つまり、７遺伝子マーカーの重み付け発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）によって、病勢の診断、特に治療介入が必要な病態の診断と、治療中における寛解の診断とが可能であることが示された。
【0142】
［試験例３：除法による７マーカー重み付き発現量の総和と検体採取時期（診断・治療中・フォローアップ中・再発）との関係］
神経芽腫患者の各採取時期における骨髄検体（ＢＭ）について、上記［２］の方法で測定した７遺伝子マーカー発現量それぞれに、図３Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量を統計学的数値（非重要度）として用い、除法による重み付き発現量に補正し、重み付き発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）を評価値として導出した。各採取時期における当該評価値の分布を図６Ａに示す。また、採取時期間（Collection time point）での評価値の有意差を解析した結果を下記表に示す。
神経芽腫患者の各採取時期における骨髄検体（ＢＭ）について、上記［２］の方法で測定した７遺伝子マーカー発現量それぞれに、図３Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量を統計学的数値（非重要度）として用い、除法による重み付き発現量に補正し、重み付き発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）を評価値として導出した。各採取時期における当該評価値の分布を図６Ａに示す。また、採取時期間（Collection time point）での評価値の有意差を解析した結果を下記表に示す。
【0143】
【表6】
【0144】
神経芽腫患者の各採取時期における末梢血検体（ＰＢ）について、上記［２］の方法で測定した７遺伝子マーカー発現量それぞれに、図４Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量を統計学的数値（非重要度）として用い、除法による重み付き発現量に補正し、重み付き発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）を評価値として導出した。各採取時期における当該評価値の分布を図６Ｂに示す。また、採取時期間（Collection time point）での評価値の有意差を解析した結果を下記表に示す。
【0145】
【表7】
【0146】
上記表６及び図６Ａ並びに上記表７及び図６Ｂに示されるとおり、７遺伝子マーカーの重み付き発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）として得られる評価値は、神経芽腫患者の各検体採取時期間で有意差を認めた。すなわち、当該評価値は、神経芽腫患者の検体採取時期、つまり診断（Diagnosis）、治療中（Treatment）、治療後フォローアップ中（Post-treatment）、再発（Relapse）による腫瘍量の違いを忠実に反映していた。特に再発（Relapse）と他の期間との腫瘍量の違いを好ましく反映していることから、７遺伝子マーカーの重み付け発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）によって、再発の予後予測が可能であることが示された。
【0147】
［試験例４：除法による７マーカー重み付き発現量の総和による予後診断］
高リスク神経芽腫患者の診断時（Diagnosis）及び治療後のフォローアップ中（Post-treatment）に採取した骨髄検体について、上記［２］の方法で測定した７遺伝子マーカー発現量それぞれに、図３Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量を統計学的数値（非重要度）として用い、除法による重み付き発現量に補正し、重み付き発現量の総和（90 percentile weighted sum）を評価値として導出した。当該評価値を、再発患者（Relapse）と非再発患者（Non-relapse）との間で比較した。結果を図７に示す。また、本試験例で対象となった検体の背景を下記表に示す。
高リスク神経芽腫患者の診断時（Diagnosis）及び治療後のフォローアップ中（Post-treatment）に採取した骨髄検体について、上記［２］の方法で測定した７遺伝子マーカー発現量それぞれに、図３Ｂにおける９０パーセンタイルでの発現量を統計学的数値（非重要度）として用い、除法による重み付き発現量に補正し、重み付き発現量の総和（90 percentile weighted sum）を評価値として導出した。当該評価値を、再発患者（Relapse）と非再発患者（Non-relapse）との間で比較した。結果を図７に示す。また、本試験例で対象となった検体の背景を下記表に示す。
【0148】
【表8】
【0149】
図７及び表８より、診断時に採取した骨髄２４（再発１７、非再発７）検体では、再発患者と非再発患者の間では、評価値である７遺伝子マーカーの重み付け発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）に有意差を認めなかった。一方、治療中に採取した骨髄８９（再発５５、非再発３４）検体及び治療後のフォローアップ中に採取した骨髄７３（再発１７、非再発５６）検体では、再発患者と非再発患者の間に７マーカー重み付け総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）の有意差を認めた。つまり、７遺伝子マーカーの重み付け発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）によって、再発の予後予測が可能であることが示された。
【0150】
［試験例５：除法による７マーカー重み付き発現量の総和による診断能と７マーカーの単純総和による診断能との対比］
治療後のフォローアップ中に採取した骨髄７３（再発１７、非再発５６）検体について、上記［２］の方法で測定した７遺伝子マーカー発現量それぞれに、図３Ｂにおける９０パーセンタイルでの７遺伝子マーカー発現量を統計学的数値（非重要度）として用い、除法による重み付き発現量に補正し、重み付き発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ(90 percentile weighted sum)）を評価値として導出した。また、重み付けを行わず７遺伝子マーカーの発現量の単純総和（non-weighted sum）を導出した。重み付けを行った評価値（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ(90 percentile weighted sum)）及び重み付けを行わなかった評価値（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ(non-weighted sum)）について、神経芽腫患者の予後予測つまり再発予測に関するＲＯＣ解析を行った。結果を図８に示す。
治療後のフォローアップ中に採取した骨髄７３（再発１７、非再発５６）検体について、上記［２］の方法で測定した７遺伝子マーカー発現量それぞれに、図３Ｂにおける９０パーセンタイルでの７遺伝子マーカー発現量を統計学的数値（非重要度）として用い、除法による重み付き発現量に補正し、重み付き発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ(90 percentile weighted sum)）を評価値として導出した。また、重み付けを行わず７遺伝子マーカーの発現量の単純総和（non-weighted sum）を導出した。重み付けを行った評価値（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ(90 percentile weighted sum)）及び重み付けを行わなかった評価値（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ(non-weighted sum)）について、神経芽腫患者の予後予測つまり再発予測に関するＲＯＣ解析を行った。結果を図８に示す。
【0151】
図８に示されるとおり、７遺伝子マーカーの発現量の単純総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ(non-weighted sum)）を用いる場合は重み付けを行わず各遺伝子マーカーを等価に扱うため、７遺伝子マーカーの発現量にコントロールでの発現量（統計学的数値）を加味して重み付けをした評価値（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ(90 percentile weighted sum)）を用いる場合の方が、よりＡＵＣ値が大きく、つまりより正確な予後予測（再発予測）が可能であることが示された。
【0152】
また、７遺伝子マーカーの発現量にコントロールでの発現量（統計学的数値）を加味して重み付けをした評価値（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ(90 percentile weighted sum)）を用いた予後予測のＡＵＣは、非特許文献８で報告されている、神経芽腫診断のための５遺伝子マーカーを用いた予後予測のＡＵＣである０．６２２を上回っていた。つまり、本発明の方法は、現時点で世界で最も正確に神経芽腫患者の予後予測（再発予測）を可能にする方法であると考えられる。それだけでなく、本試験例によるＡＵＣは、Moderate accuracyの基準とされる０．７をも上回っている点でも優れていた。
【0153】
［試験例６：再発予測のＡＵＣを最大化させる固定パーセンタイルの探索（骨髄）］
治療後のフォローアップ中に採取した骨髄７３（再発１７、非再発５６）検体について、上記［２］のｄｄＰＣＲ測定による方法で７遺伝子マーカーの発現量を測定した。図３Ａ及び図３Ｂから選択される固定パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、以下の（i）、（ii）、及び（iii）の手法に基づいて、再発予測に関するＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を解析した。
治療後のフォローアップ中に採取した骨髄７３（再発１７、非再発５６）検体について、上記［２］のｄｄＰＣＲ測定による方法で７遺伝子マーカーの発現量を測定した。図３Ａ及び図３Ｂから選択される固定パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、以下の（i）、（ii）、及び（iii）の手法に基づいて、再発予測に関するＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を解析した。
【0154】
（i）７遺伝子マーカーの減法による重み付け幾何平均
図３Ａ及び図３Ｂから選択される固定パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれから、当該統計学的数値（非重要度）を差し引くことにより減法による重み付き発現量に補正し（但し、差し引いた結果重み付け発現量が１未満となる場合は、当該重み付け発現量は「１」とした。）、得られた重み付き発現量の幾何平均を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。固定パーセンタイルとＡＵＣとの関係を図９に示す。
図３Ａ及び図３Ｂから選択される固定パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれから、当該統計学的数値（非重要度）を差し引くことにより減法による重み付き発現量に補正し（但し、差し引いた結果重み付け発現量が１未満となる場合は、当該重み付け発現量は「１」とした。）、得られた重み付き発現量の幾何平均を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。固定パーセンタイルとＡＵＣとの関係を図９に示す。
【0155】
図９に示すように、固定パーセンタイルとして６～９２パーセンタイルをそれぞれ用いた場合にＡＵＣが非特許文献８で報告されている０．６２２を上回り、固定パーセンタイルとして６～５５パーセンタイルをそれぞれ用いた場合にＡＵＣがModerate accuracyの基準とされる０．７を上回り、さらに固定パーセンタイルとして３０～５５パーセンタイルをそれぞれ用いた場合にＡＵＣが一層良好であった。また、固定パーセンタイルとして５０パーセンタイルを用いた場合にＡＵＣが最大（０．７２９）となった。
【0156】
（ii）７遺伝子マーカーの減法による重み付け総和
図３Ａ及び図３Ｂから選択される固定パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれから、当該統計学的数値（非重要度）を差し引くことにより減法による重み付き発現量に補正し（但し、差し引いた結果重み付け発現量が０未満となる場合は、当該重み付け発現量は「０」とした。）、得られた重み付き発現量の総和を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。固定パーセンタイルとＡＵＣとの関係を図１０に示す。
図３Ａ及び図３Ｂから選択される固定パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれから、当該統計学的数値（非重要度）を差し引くことにより減法による重み付き発現量に補正し（但し、差し引いた結果重み付け発現量が０未満となる場合は、当該重み付け発現量は「０」とした。）、得られた重み付き発現量の総和を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。固定パーセンタイルとＡＵＣとの関係を図１０に示す。
【0157】
図１０に示すように、固定パーセンタイルとして６～９３パーセンタイルをそれぞれ用いた場合にＡＵＣが非特許文献８で報告されている０．６２２を上回り、さらに固定パーセンタイルとして６６～８０パーセンタイルをそれぞれ用いた場合にＡＵＣが一層良好であった。また、固定パーセンタイルとして７５パーセンタイルを用いた場合にＡＵＣが最大（０．６８８）となった。
【0158】
（iii）７遺伝子マーカーの除法による重み付け総和
図３Ａ及び図３Ｂから選択される固定パーセンタイル（５４パーセンタイル以上）における発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれを、当該統計学的数値（非重要度）で除することにより除法による重み付き発現量に補正し、得られた重み付き発現量の総和を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。固定パーセンタイルとＡＵＣとの関係を図１１に示す。
図３Ａ及び図３Ｂから選択される固定パーセンタイル（５４パーセンタイル以上）における発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれを、当該統計学的数値（非重要度）で除することにより除法による重み付き発現量に補正し、得られた重み付き発現量の総和を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。固定パーセンタイルとＡＵＣとの関係を図１１に示す。
【0159】
図１１に示すように、固定パーセンタイルとして５４～１００パーセンタイルをそれぞれ用いた場合に、非特許文献８で報告されている０．６２２及びModerate accuracyの基準とされるＡＵＣ０．７を上回った。また、固定パーセンタイルとして９９パーセンタイルを用いた場合にＡＵＣが最大（０．７２８）となった。
【0160】
［試験例７：様々な重み付け手法による再発予測（骨髄）］
治療後のフォローアップ中に採取した骨髄７３（再発１７、非再発５６）検体について、上記［２］のｄｄＰＣＲ測定による方法で７遺伝子マーカーの発現量を測定した。また、同検体について、ｑＰＣＲ測定による方法で７遺伝子マーカーの発現量を測定した。以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ１１）、（ｄ１２）、（ｄ２１）、（ｄ２２）、（ｄ３１）及び（ｄ３２）の手法に基づいて再発予測に関するＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）及びカットオフ値（閾値：ＴＶ）を解析した。
治療後のフォローアップ中に採取した骨髄７３（再発１７、非再発５６）検体について、上記［２］のｄｄＰＣＲ測定による方法で７遺伝子マーカーの発現量を測定した。また、同検体について、ｑＰＣＲ測定による方法で７遺伝子マーカーの発現量を測定した。以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ１１）、（ｄ１２）、（ｄ２１）、（ｄ２２）、（ｄ３１）及び（ｄ３２）の手法に基づいて再発予測に関するＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）及びカットオフ値（閾値：ＴＶ）を解析した。
【0161】
（ａ）ｑＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの単純幾何平均
ｑＰＣＲ測定によって７遺伝子マーカーのコピー数を測定した。ｑＰＣＲ測定においては、７遺伝子マーカーについてのプライマーとしては上記［２］のｄｄＰＣＲ測定において用いられたものと同じプライマーを用い、レファレンス遺伝子としてはＢ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ１を用い、Ｂ２Ｍのプライマーとしては配列番号３５、３６に示す配列を有するもの、ＧＡＰＤＨとしては配列番号３７（sense）、配列番号３８（anti-sense）に示す配列を有するもの、ＰＧＫ１としては配列番号３９（sense）、配列番号４０（anti-sense）に示す配列を有するものを用いた。７遺伝子マーカーそれぞれのＣｔ値の幾何平均から、３つのレファレンス遺伝子それぞれのＣｔ値の幾何平均を減じた値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの発現量の幾何平均値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。
ｑＰＣＲ測定によって７遺伝子マーカーのコピー数を測定した。ｑＰＣＲ測定においては、７遺伝子マーカーについてのプライマーとしては上記［２］のｄｄＰＣＲ測定において用いられたものと同じプライマーを用い、レファレンス遺伝子としてはＢ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ１を用い、Ｂ２Ｍのプライマーとしては配列番号３５、３６に示す配列を有するもの、ＧＡＰＤＨとしては配列番号３７（sense）、配列番号３８（anti-sense）に示す配列を有するもの、ＰＧＫ１としては配列番号３９（sense）、配列番号４０（anti-sense）に示す配列を有するものを用いた。７遺伝子マーカーそれぞれのＣｔ値の幾何平均から、３つのレファレンス遺伝子それぞれのＣｔ値の幾何平均を減じた値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの発現量の幾何平均値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。
【0162】
（ｂ）ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの単純幾何平均
測定された７遺伝子マーカーの発現量の幾何平均を導出し、導出された幾何平均値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの発現量の幾何平均値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。
測定された７遺伝子マーカーの発現量の幾何平均を導出し、導出された幾何平均値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの発現量の幾何平均値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。
【0163】
（ｃ）ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの単純総和
測定された７遺伝子マーカーの発現量の総和を導出し、導出された総和について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの発現量の総和がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。
測定された７遺伝子マーカーの発現量の総和を導出し、導出された総和について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの発現量の総和がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。
【0164】
（ｄ１１）ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの減法（固定パーセンタイル使用）による重み付け幾何平均
図３Ａから、表９に示す固定パーセンタイル（試験例６で見出した、再発予測のＡＵＣを最大化させるパーセンタイル）における発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれから、当該統計学的数値（非重要度）を差し引くことにより減法による重み付き発現量に補正し（但し、差し引いた結果重み付け発現量が１未満となる場合は、当該重み付け発現量は「１」とした。）、得られた重み付き発現量の幾何平均を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。
図３Ａから、表９に示す固定パーセンタイル（試験例６で見出した、再発予測のＡＵＣを最大化させるパーセンタイル）における発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれから、当該統計学的数値（非重要度）を差し引くことにより減法による重み付き発現量に補正し（但し、差し引いた結果重み付け発現量が１未満となる場合は、当該重み付け発現量は「１」とした。）、得られた重み付き発現量の幾何平均を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。
【0165】
（ｄ１２）ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの減法（可変パーセンタイル使用）による重み付け幾何平均
図３Ａ及び図３Ｂから、表９に示す可変パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれから、当該統計学的数値（非重要度）を差し引くことにより減法による重み付き発現量に補正し（但し、差し引いた結果重み付け発現量が１未満となる場合は、当該重み付け発現量は「１」とした。）、得られた重み付き発現量の幾何平均を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。なお、表９に示す可変パーセンタイルにおける発現量は、（ｄ１１）で用いられた固定パーセンタイルから各遺伝子マーカーのパーセンタイルを任意に変化させて、（ｄ１１）よりも高いＡＵＣを探索して見出された。
図３Ａ及び図３Ｂから、表９に示す可変パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれから、当該統計学的数値（非重要度）を差し引くことにより減法による重み付き発現量に補正し（但し、差し引いた結果重み付け発現量が１未満となる場合は、当該重み付け発現量は「１」とした。）、得られた重み付き発現量の幾何平均を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。なお、表９に示す可変パーセンタイルにおける発現量は、（ｄ１１）で用いられた固定パーセンタイルから各遺伝子マーカーのパーセンタイルを任意に変化させて、（ｄ１１）よりも高いＡＵＣを探索して見出された。
【0166】
（ｄ２１）ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの減法（固定パーセンタイル使用）による重み付け総和
図３Ｂから、表９に示す固定パーセンタイル（試験例６で見出した、再発予測のＡＵＣを最大化させるパーセンタイル）における発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれから、当該統計学的数値（非重要度）を差し引くことにより減法による重み付き発現量に補正し（但し、差し引いた結果重み付け発現量が０未満となる場合は、当該重み付け発現量は「０」とした。）、得られた重み付き発現量の総和を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。
図３Ｂから、表９に示す固定パーセンタイル（試験例６で見出した、再発予測のＡＵＣを最大化させるパーセンタイル）における発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれから、当該統計学的数値（非重要度）を差し引くことにより減法による重み付き発現量に補正し（但し、差し引いた結果重み付け発現量が０未満となる場合は、当該重み付け発現量は「０」とした。）、得られた重み付き発現量の総和を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。
【0167】
（ｄ２２）ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの減法（可変パーセンタイル使用）による重み付け総和
図３Ａ及び図３Ｂから、表９に示す可変パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれから、当該統計学的数値（非重要度）を差し引くことにより減法による重み付き発現量に補正し（但し、差し引いた結果重み付け発現量が０未満となる場合は、当該重み付け発現量は「０」とした。）、得られた重み付き発現量の総和を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。なお、表９に示す可変パーセンタイルにおける発現量は、図３Ａ及び図３Ｂに示す７遺伝子マーカーの各パーセンタイルにおける発現量のうち、７遺伝子マーカー各々の微小残存病変の有無に関するカットオフ値に最も近い発現量として選択された。
図３Ａ及び図３Ｂから、表９に示す可変パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれから、当該統計学的数値（非重要度）を差し引くことにより減法による重み付き発現量に補正し（但し、差し引いた結果重み付け発現量が０未満となる場合は、当該重み付け発現量は「０」とした。）、得られた重み付き発現量の総和を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。なお、表９に示す可変パーセンタイルにおける発現量は、図３Ａ及び図３Ｂに示す７遺伝子マーカーの各パーセンタイルにおける発現量のうち、７遺伝子マーカー各々の微小残存病変の有無に関するカットオフ値に最も近い発現量として選択された。
【0168】
（ｄ３１）ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの除法（固定パーセンタイル使用）による重み付け総和
図３Ｂから、表９に示す固定パーセンタイル（試験例６で見出した、再発予測のＡＵＣを最大化させるパーセンタイル）における発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれを、当該統計学的数値（非重要度）で除することにより除法による重み付き発現量に補正し、得られた重み付き発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。
図３Ｂから、表９に示す固定パーセンタイル（試験例６で見出した、再発予測のＡＵＣを最大化させるパーセンタイル）における発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれを、当該統計学的数値（非重要度）で除することにより除法による重み付き発現量に補正し、得られた重み付き発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。
【0169】
（ｄ３２）ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの除法（可変パーセンタイル使用）による重み付け総和
図３Ａ及び図３Ｂから、表９に示す可変パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれを、当該統計学的数値（非重要度）で除することにより除法による重み付き発現量に補正し、得られた重み付き発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。なお、表９に示す可変パーセンタイルにおける発現量は、（ｄ３１）で用いられた固定パーセンタイルから各遺伝子マーカーのパーセンタイルを任意に変化させて、（ｄ３１）よりも高いＡＵＣを探索して見出された。
図３Ａ及び図３Ｂから、表９に示す可変パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量それぞれを、当該統計学的数値（非重要度）で除することにより除法による重み付き発現量に補正し、得られた重み付き発現量の総和（７ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）を評価値として導出した。導出された評価値について、再発の有無でＲＯＣ解析を行ってカットオフ値を設定した。測定された７遺伝子マーカーの当該評価値がカットオフ値を上回れば陽性と判断した。なお、表９に示す可変パーセンタイルにおける発現量は、（ｄ３１）で用いられた固定パーセンタイルから各遺伝子マーカーのパーセンタイルを任意に変化させて、（ｄ３１）よりも高いＡＵＣを探索して見出された。
【0170】
【表9】
【0171】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ１１）、（ｄ１２）、（ｄ２１）、（ｄ２２）、（ｄ３１）、及び（ｄ３２）の方法に基づいた再発予測についてのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）及びカットオフ値（閾値：ＴＶ）を下記表に示す。
【0172】
【表10】
【0173】
表１０の結果に示されるとおり、ｑＰＣＲ測定による発現量を単純に幾何平均した（ａ）と比べて、ｄｄＰＣＲ測定による発現量を単純に幾何平均した（ｂ）では、ＡＵＣが向上したため、より正確に再発の予後予測ができることが分かった。更に、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量にコントロールでの発現量（統計学的数値）を加味して幾何平均した（ｄ１１）及び（ｄ１２）においては、ＡＵＣがより一層向上したため、より一層正確に再発の予後予測ができることが分かった。
【0174】
また、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量を単純に総和した（ｃ）と比べて、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量にコントロールでの発現量（統計学的数値）を加味して総和した（ｄ２１）、（ｄ２２）、（ｄ３１）及び（ｄ３２）においては、ＡＵＣがより一層向上したため、より一層正確に再発の予後予測ができることが分かった。
【0175】
さらに、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量にコントロールでの発現量（統計学的数値）を加味して総和した（ｄ２１）、（ｄ２２）、（ｄ３１）及び（ｄ３２）の中でも、減法による重み付けを行った（ｄ２１）及び（ｄ２２）に比べて、除法による重み付けを行った（ｄ３１）及び（ｄ３２）の方が、ＡＵＣをより一層向上できることが分かった。
【0176】
［試験例８：再発予測のＡＵＣを最大化させる固定パーセンタイルの探索（末梢血）］
治療後のフォローアップ中に採取した末梢血２１（再発４、非再発１７）検体について、上記［２］のｄｄＰＣＲ測定による方法で７遺伝子マーカーの発現量を測定した。図４Ａ及び図４Ｂから選択される固定パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択したことを除いて、試験例６の（i）（７遺伝子マーカーの減法による重み付け幾何平均）、（ii）（７遺伝子マーカーの減法による重み付け総和）及び（iii）（７遺伝子マーカーの除法による重み付け総和）と同様にして、再発予測に関するＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を解析した。それぞれの結果を図１２～図１４に示す。
治療後のフォローアップ中に採取した末梢血２１（再発４、非再発１７）検体について、上記［２］のｄｄＰＣＲ測定による方法で７遺伝子マーカーの発現量を測定した。図４Ａ及び図４Ｂから選択される固定パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択したことを除いて、試験例６の（i）（７遺伝子マーカーの減法による重み付け幾何平均）、（ii）（７遺伝子マーカーの減法による重み付け総和）及び（iii）（７遺伝子マーカーの除法による重み付け総和）と同様にして、再発予測に関するＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を解析した。それぞれの結果を図１２～図１４に示す。
【0177】
図１２（減法による重み付け幾何平均）に示されるとおり、７遺伝子マーカーの減法による重み付け幾何平均によれば、固定パーセンタイルとして５２パーセンタイル以上をそれぞれ用いた場合にＡＵＣが非特許文献８で報告されている０．６２２を上回り、固定パーセンタイルとして６８パーセンタイル以上をそれぞれ用いた場合にＡＵＣがModerate accuracyの基準とされる０．７以上となった。また、１００パーセンタイルを除く固定パーセンタイルのうち、９９パーセンタイルを用いた場合にＡＵＣが最大（０．８２４）となった。
【0178】
図１３（減法による重み付け総和）に示されるとおり、７遺伝子マーカーの減法による重み付け総和によれば、すべての固定パーセンタイルを用いた場合に、ＡＵＣが非特許文献８で報告されている０．６２２及びModerate accuracyの基準とされる０．７を上回り、さらに固定パーセンタイルとして９３～９９パーセンタイルをそれぞれ用いた場合にＡＵＣが一層良好であった。また、９９パーセンタイルを用いた場合にＡＵＣが最大（０．８３８）となった。
【0179】
図１４（除法による重み付け総和）に示されるとおり、７遺伝子マーカーの除法による重み付け総和によれば、固定パーセンタイルとして９１パーセンタイル以上をそれぞれ用いた場合に、ＡＵＣが非特許文献８で報告されている０．６２２を上回り、固定パーセンタイルとして９４～９７パーセンタイルをそれぞれ用いた場合にＡＵＣがModerate accuracyの基準とされる０．７以上となった。また、固定パーセンタイルのうち、９７パーセンタイルを用いた場合にＡＵＣが最大（０．７０６）となった。
【0180】
［試験例９：様々な重み付け手法による再発予測（末梢血）］
治療後のフォローアップ中に採取した末梢血２１（再発４、非再発１７）検体について、上記［２］のｄｄＰＣＲ測定による方法で７遺伝子マーカーの発現量を測定した。試験例８で導出したＡＵＣを最大化させるパーセンタイルをそれぞれ用いたことを除いて試験例７の（ｄ１１）、（ｄ２１）、及び（ｄ３１）と同様にして行った各重み付け手法による、再発予測に関するＡＵＣ及びカットオフ値（閾値：ＴＶ）を下記表に示す。
治療後のフォローアップ中に採取した末梢血２１（再発４、非再発１７）検体について、上記［２］のｄｄＰＣＲ測定による方法で７遺伝子マーカーの発現量を測定した。試験例８で導出したＡＵＣを最大化させるパーセンタイルをそれぞれ用いたことを除いて試験例７の（ｄ１１）、（ｄ２１）、及び（ｄ３１）と同様にして行った各重み付け手法による、再発予測に関するＡＵＣ及びカットオフ値（閾値：ＴＶ）を下記表に示す。
【0181】
【表11】
【0182】
［試験例１０：再発予測のＡＵＣを最大化させる固定パーセンタイルの探索（末梢血幹細胞）
治療中に採取した末梢血幹細胞検体２０（再発１１、非再発９）検体について、上記［２］のｄｄＰＣＲ測定による方法で７遺伝子マーカーの発現量を測定した。図４Ａ及び図４Ｂから選択されるパーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択したことを除いて試験例６の（ｉ）、（ii）及び（iii）と同様にして、再発予測に関するＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を解析した。固定パーセンタイルとＡＵＣとの関係をそれぞれ図１５（減法による重み付け幾何平均）、図１６（減法による重み付け総和）、図１７（除法による重み付け総和）に示す。
治療中に採取した末梢血幹細胞検体２０（再発１１、非再発９）検体について、上記［２］のｄｄＰＣＲ測定による方法で７遺伝子マーカーの発現量を測定した。図４Ａ及び図４Ｂから選択されるパーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択したことを除いて試験例６の（ｉ）、（ii）及び（iii）と同様にして、再発予測に関するＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を解析した。固定パーセンタイルとＡＵＣとの関係をそれぞれ図１５（減法による重み付け幾何平均）、図１６（減法による重み付け総和）、図１７（除法による重み付け総和）に示す。
【0183】
図１５（減法による重み付け幾何平均）に示すように、固定パーセンタイルとして２１～９９パーセンタイルをそれぞれ用いた場合にＡＵＣが非特許文献８で報告されている０．６２２を上回り（０．６２６～０．８０８）、固定パーセンタイルとして４４～５５パーセンタイル及び６９～９５パーセンタイルをそれぞれ用いた場合にＡＵＣがModerate accuracyの基準とされる０．７とほぼ同等（０．６９７）またはそれを上回り、さらに、固定パーセンタイルとして７９～９５パーセンタイルをそれぞれ用いた場合にＡＵＣが一層良好であった。また、固定パーセンタイルとして９２パーセンタイルを用いた場合にＡＵＣが最大（０．８０８）となった。
【0184】
図１６（減法による重み付け総和）に示すように、固定パーセンタイルとして２１～９９パーセンタイルをそれぞれ用いた場合にＡＵＣが非特許文献８で報告されている０．６２２を上回り（０．６６７～０．７８８）、固定パーセンタイルとして３４～９５パーセンタイル及び９８パーセンタイルをそれぞれ用いた場合にＡＵＣがModerate accuracyの基準とされる０．７を上回り、さらに、固定パーセンタイルとして６９～９３パーセンタイルをそれぞれ用いた場合にＡＵＣが一層良好であった。また、固定パーセンタイルとして９２パーセンタイルを用いた場合にＡＵＣが最大（０．７８８）となった。
【0185】
図１７（除法による重み付け総和）に示すように、固定パーセンタイルとし９０～９９パーセンタイルをそれぞれ用いた場合にＡＵＣがModerate accuracyの基準とされる０．７を上回った（０．７０７～０．７６８）。また、固定パーセンタイルとして９０パーセンタイルを用いた場合にＡＵＣが最大（０．７６８）となった。
【0186】
［試験例１１：様々な重み付け手法による再発予測（末梢血幹細胞）］
治療中に採取した末梢血幹細胞検体２０（再発１１、非再発９）検体について、上記［２］のｄｄＰＣＲ測定による方法で７遺伝子マーカーの発現量を測定した。以下の（ｂ）、（ｃ）、（ｄ１１－１）、（ｄ１１－２）、（ｄ１２）、（ｄ２１－１）、（ｄ２１－２）、（ｄ２２）、（ｄ３１－１）、（ｄ３１－２）及び（ｄ３２）の手法に基づいて再発予測に関するＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）及びカットオフ値（閾値：ＴＶ）を解析した。
治療中に採取した末梢血幹細胞検体２０（再発１１、非再発９）検体について、上記［２］のｄｄＰＣＲ測定による方法で７遺伝子マーカーの発現量を測定した。以下の（ｂ）、（ｃ）、（ｄ１１－１）、（ｄ１１－２）、（ｄ１２）、（ｄ２１－１）、（ｄ２１－２）、（ｄ２２）、（ｄ３１－１）、（ｄ３１－２）及び（ｄ３２）の手法に基づいて再発予測に関するＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）及びカットオフ値（閾値：ＴＶ）を解析した。
【0187】
（ｂ）ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの単純幾何平均
試験例７の（ｂ）と同様の手法で分析した。
試験例７の（ｂ）と同様の手法で分析した。
【0188】
（ｃ）ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの単純総和
試験例７の（ｃ）と同様の手法で分析した。
試験例７の（ｃ）と同様の手法で分析した。
【0189】
（ｄ１１－１）及び（ｄ１１－２）ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの減法（固定パーセンタイル使用）による重み付け幾何平均
図４Ａ及び図４Ｂから、表１２に示す固定パーセンタイル（試験例１０で見出した、再発予測のＡＵＣを最大化させるパーセンタイル、又は適宜選択した５０パーセンタイル）における発現量を統計学的数値（非重要度）として選択したことを除いて、試験例７の（ｄ１１）と同様の手法で分析した。
図４Ａ及び図４Ｂから、表１２に示す固定パーセンタイル（試験例１０で見出した、再発予測のＡＵＣを最大化させるパーセンタイル、又は適宜選択した５０パーセンタイル）における発現量を統計学的数値（非重要度）として選択したことを除いて、試験例７の（ｄ１１）と同様の手法で分析した。
【0190】
（ｄ１２）ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの減法（可変パーセンタイル使用）による重み付け幾何平均
図４Ｂから、表１２に示す可変パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、試験例７の（ｄ１２）と同様の手法で分析した。なお、表１２に示す可変パーセンタイルにおける発現量は、（ｄ１１－１）で用いられた再発予測のＡＵＣを最大化させる固定パーセンタイルから各遺伝子マーカーのパーセンタイルを任意に変化させて、（ｄ１１－１）よりも高いＡＵＣを探索して見出された。
図４Ｂから、表１２に示す可変パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、試験例７の（ｄ１２）と同様の手法で分析した。なお、表１２に示す可変パーセンタイルにおける発現量は、（ｄ１１－１）で用いられた再発予測のＡＵＣを最大化させる固定パーセンタイルから各遺伝子マーカーのパーセンタイルを任意に変化させて、（ｄ１１－１）よりも高いＡＵＣを探索して見出された。
【0191】
（ｄ２１－１）及び（ｄ２１－２）ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの減法（固定パーセンタイル使用）による重み付け総和
図４Ａ及び図４Ｂから、表１２に示す固定パーセンタイル（試験例１０で見出した、再発予測のＡＵＣを最大化させるパーセンタイル、又は適宜選択した５０パーセンタイル）における発現量を統計学的数値（非重要度）として選択したことを除いて、試験例７の（ｄ２１）と同様の手法で分析した。
図４Ａ及び図４Ｂから、表１２に示す固定パーセンタイル（試験例１０で見出した、再発予測のＡＵＣを最大化させるパーセンタイル、又は適宜選択した５０パーセンタイル）における発現量を統計学的数値（非重要度）として選択したことを除いて、試験例７の（ｄ２１）と同様の手法で分析した。
【0192】
（ｄ２２）ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの減法（可変パーセンタイル使用）による重み付け総和
図４Ｂから、表１２に示す可変パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、試験例７の（ｄ２２）と同様の手法で分析した。なお、表１２に示す可変パーセンタイルにおける発現量は、（ｄ２１－１）で用いられた再発予測のＡＵＣを最大化させる固定パーセンタイルから各遺伝子マーカーのパーセンタイルを任意に変化させて、（ｄ２１－１）よりも高いＡＵＣを探索して見出された。
図４Ｂから、表１２に示す可変パーセンタイルにおける発現量を統計学的数値（非重要度）として選択し、試験例７の（ｄ２２）と同様の手法で分析した。なお、表１２に示す可変パーセンタイルにおける発現量は、（ｄ２１－１）で用いられた再発予測のＡＵＣを最大化させる固定パーセンタイルから各遺伝子マーカーのパーセンタイルを任意に変化させて、（ｄ２１－１）よりも高いＡＵＣを探索して見出された。
【0193】
（ｄ３１－１）及び（ｄ３１－２）ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの除法（固定パーセンタイル使用）による重み付け総和
図４Ｂから、表１２に示す固定パーセンタイル（試験例１０で見出した、再発予測のＡＵＣを最大化させるパーセンタイル、又は適宜選択した５０パーセンタイル）における発現量を統計学的数値（非重要度）として選択したことを除いて、試験例７の（ｄ３１）と同様の手法で分析した。なお、表１２に示す可変パーセンタイルにおける発現量は、（ｄ３１－１）で用いられた再発予測のＡＵＣを最大化させる固定パーセンタイルから各遺伝子マーカーのパーセンタイルを任意に変化させて、（ｄ３１－１）よりも高いＡＵＣを探索して見出された。
図４Ｂから、表１２に示す固定パーセンタイル（試験例１０で見出した、再発予測のＡＵＣを最大化させるパーセンタイル、又は適宜選択した５０パーセンタイル）における発現量を統計学的数値（非重要度）として選択したことを除いて、試験例７の（ｄ３１）と同様の手法で分析した。なお、表１２に示す可変パーセンタイルにおける発現量は、（ｄ３１－１）で用いられた再発予測のＡＵＣを最大化させる固定パーセンタイルから各遺伝子マーカーのパーセンタイルを任意に変化させて、（ｄ３１－１）よりも高いＡＵＣを探索して見出された。
【0194】
【表12】
【0195】
（ｂ）、（ｃ）、（ｄ１１－１）、（ｄ１１－２）、（ｄ１２）、（ｄ２１－１）、（ｄ２１－２）、（ｄ２２）、（ｄ３１－１）、（ｄ３１－２）及び（ｄ３２）の方法に基づいた再発予測についてのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）及びカットオフ値（閾値：ＴＶ）を下記表に示す。
【0196】
【表13】
【0197】
【表14】
【0198】
表１３の結果に示されるとおり、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量を単純に幾何平均した（ｂ）と比べて、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量にコントロールでの発現量（統計学的数値）を加味して幾何平均した（ｄ１１－１）、（ｄ１１－２）及び（ｄ１２）においては、ＡＵＣがより一層向上したため、より一層正確に再発の予後予測ができることが分かった。
【0199】
また、表１４の結果に示されるとおり、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量を単純に総和した（ｃ）と比べて、ｄｄＰＣＲ測定による７遺伝子マーカーの発現量にコントロールでの発現量（統計学的数値）を加味して総和した（ｄ２１－１）、（ｄ２１－２）、（ｄ２２）、（ｄ３１－１）、（ｄ３１－２）及び（ｄ３２）においては、ＡＵＣがより一層向上したため、より一層正確に再発の予後予測ができることが分かった。
【配列表フリーテキスト】
【0200】
配列番号１３から配列番号４０はプライマーである。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】