知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-12
(45)【発行日】2024-09-24
(54)【発明の名称】糖尿病を治療するための幹細胞薬
(51)【国際特許分類】
A61K 35/34 20150101AFI20240913BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240913BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240913BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240913BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240913BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240913BHJP
【ＦＩ】
A61K35/34
A61P3/00
A61P3/04
A61P3/10
A61P43/00 121
A61K45/00
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2022565625
(86)(22)【出願日】2021-04-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-06
(86)【国際出願番号】 CN2021088209
(87)【国際公開番号】W WO2021218687
(87)【国際公開日】2021-11-04
【審査請求日】2022-12-01
(31)【優先権主張番号】202010340419.7
(32)【優先日】2020-04-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】520292855
【氏名又は名称】スーチョウ、ユニバーシティー
【氏名又は名称原語表記】ＳＯＯＣＨＯＷ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】シー，ユーファン
(72)【発明者】
【氏名】カオ，リジュアン
(72)【発明者】
【氏名】ファン，ジアンカイ
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ヨンジン
(72)【発明者】
【氏名】ワン，イン
【審査官】柴原 直司
(56)【参考文献】
【文献】特表平０６－５１０５２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】Artif. Cells Nanomed. Biotechnol.，2018年，46, [Suppl.3]，p.S328-S335
【文献】Stem Cell Res. Ther.，2017年，8，Article.86(p.1-14)
【文献】Stem Cell Rep.，2015年，5, [4]，p.621-632
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８
Ａ６１Ｋ ３６／０６－３６／０６８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
肥満または代謝障害を予防、軽減および／または治療するための医薬組成物を製造するために用いられる、筋幹細胞の使用であって；
前記筋幹細胞は、マウス由来の筋幹細胞、またはヒト由来の筋幹細胞であって；
前記ヒト由来の筋幹細胞は、ＣＤ３１ － 、ＣＤ３４ － 、ＣＤ４５ － 、ＣＤ２９ ＋ 、ＥＧＦＲ ＋ およびＰＡＸ７ ＋ 細胞であり；
前記マウス由来の筋幹細胞は、ＣＤ３１ － 、ＣＤ３４ － 、ＣＤ４５ － 、ＣＤ２９ ＋ 、ＥＧＦＲ ＋ およびＰＡＸ７ ＋ 細胞であることを特徴とする、前記筋幹細胞の使用。
【請求項2】
前記医薬組成物は、（ａ）体重を減らす；
（ｂ）耐糖能および／またはインスリン抵抗性を改善する；
（ｃ）血糖値を下げる；
（ｄ）インスリン感受性を高める；
（ｅ）脂肪含有量を減らす；
（ｆ）脂肪細胞の重量を減らす；
（ｇ）脂肪細胞の体積を減らす；
（ｈ）総コレステロールを下げる；
（ｉ）脂肪発現に関連する遺伝子の発現レベルを差別的に調節する；
（ｊ）褐色脂肪発現に関連する遺伝子の発現レベルを増加させる；
（ｋ）白色脂肪発現に関連する遺伝子の発現レベルを低下させる；
（ｌ）脂肪組織の恒常性を維持する；
（ｍ）肝臓組織の重量を減らす；
（ｎ）肝臓組織の脂肪浸潤を減少させる；
（ｏ）脂肪肝病変の程度を軽減する；
（ｐ）体内の炎症レベルを下げる；
（ｑ）体内のＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βの発現を減少させる；
（ｒ）体内のＩＬ－１０の発現を増加させる；
（ｓ）体の代謝を改善する；
（Ｘ）筋肉の体積と力を増加させる；
ことからなる群から選択される１つまたは複数の用途にも用いられることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記代謝障害は、糖尿病、脂肪肝、高コレステロール血症、インスリン抵抗性疾患、高血糖症からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項4】
前記筋幹細胞は、横紋筋細胞に分化することができ、星状細胞の特性を有する筋由来の幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項5】
前記代謝障害は糖尿病であり、前記糖尿病は１型糖尿病、２型糖尿病からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項6】
前記筋肉の体積と力を増加させることは、筋肉支持力の促進および運動能力の向上からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項7】
前記筋幹細胞は、自己由来、同種異系、または異種由来であることができることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項8】
前記筋幹細胞は、体の四肢または体幹の筋肉から抽出され、セルソーティングによって得られることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項9】
（ｉ）第１の活性成分としての筋幹細胞と、（ｉｉ）糖代謝を調節する第２の活性成分と、
（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含み；
前記筋幹細胞は、マウス由来の筋幹細胞、またはヒト由来の筋幹細胞であり；
前記ヒト由来の筋幹細胞は、ＣＤ３１ － 、ＣＤ３４ － 、ＣＤ４５ － 、ＣＤ２９ ＋ 、ＥＧＦＲ ＋ およびＰＡＸ７ ＋ 細胞であり；
前記マウス由来の筋幹細胞は、ＣＤ３１ － 、ＣＤ３４ － 、ＣＤ４５ － 、ＣＤ２９ ＋ 、ＥＧＦＲ ＋ およびＰＡＸ７ ＋ 細胞であることを特徴とする、
ヒトまたは動物用の医薬組成物。
【請求項10】
（ａ）体重を減らす；（ｂ）耐糖能および／またはインスリン抵抗性を改善する；
（ｃ）血糖値を下げる；
（ｄ）インスリン感受性を高める；
（ｅ）脂肪含有量を減らす；
（ｆ）脂肪細胞の重量を減らす；
（ｇ）脂肪細胞の体積を減らす；
（ｈ）腹部脂肪の蓄積を減らす；
（ｉ）総コレステロールを下げる；
（ｊ）脂肪発現に関連する遺伝子の発現レベルを差別的に調節する；
（ｋ）褐色脂肪発現に関連する遺伝子の発現レベルを増加させる；
（ｌ）白色脂肪発現に関連する遺伝子の発現レベルを低下させる；
（ｍ）脂肪組織の恒常性を維持する；
（ｎ）肝臓組織の脂肪浸潤を減少させる；
（ｏ）脂肪肝病変の程度を軽減する；
（ｐ）体内の炎症レベルを下げる；
（ｑ）体内のＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βの発現を減少させる；
（ｒ）体内のＩＬ－１０の発現を増加させる；
（ｓ）体の代謝を改善する；
（ｔ）肥満を予防、緩和および／または治療する；
（ｕ）糖尿病を予防、緩和および／または治療する；
（ｖ）インスリン抵抗性を予防、緩和および／または治療する；
（ｗ）代謝障害を予防、緩和および／または治療する；
（Ｘ）筋肉の体積と力を増加させる；
ことからなる群から選択される１種以上の用途に用いられることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記第２の活性成分は、ビグアニド系薬、スルホニル尿素系薬、非スルホニル尿素系インスリン分泌促進剤、チアゾリジンジオン系インスリン増感剤、グリコシダーゼ阻害剤、インスリン、グルカゴン様ペプチド－１アナログまたはアゴニストからなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記医薬組成物は、１型および２型糖尿病の予防および／または治療するための薬であることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記医薬組成物の剤形は、注射剤または凍結乾燥製剤であることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、糖尿病を治療するための薬の製造における幹細胞薬の使用に関し、生物医学技術の分野に属する。
【背景技術】
【0002】
社会経済の発展、人々のライフスタイルの変化（エネルギー摂取量の増加、運動量の減少など）、人口の高齢化に伴い、２型糖尿病の発症率は世界的に年々増加し、特に発展途上国では増加のスピードが速く（現在から２０２５年までに１７０％増加する可能性があると予想される）、大流行の様相を呈している。現在、糖尿病は心血管疾患と腫瘍に続き、人口の健康と生命を脅かす３番目の非伝染性疾患に浮上する。体の肥満は、脂肪組織の増加、または肝臓、筋肉、その他の組織への脂肪の浸潤を引き起こし、体の組織は、炎症を抑制する状態から炎症を促進する状態に変化し、それによって組織の恒常性が破壊される。組織の炎症が発生すると、インスリンに対する組織の感受性が低下し、抵抗性が生じ、炎症状態が悪化し続けると、インスリン抵抗性が高まり、体が血糖値を調節する能力を失い、徐々に２型糖尿病に発展する。
【0003】
骨格筋は人体最大の組織器官で、体重の約３５％を占める。個々の運動に必要な動力を提供し、体のエネルギー代謝と体温の正確な調節にも関与している。血液や組織液中のブドウ糖が上昇すると、インスリンは肝臓、脂肪、筋肉などの組織を刺激してブドウ糖を吸収させる。骨格筋は、ブドウ糖を消費する最大の組織器官である。筋肉、肝臓、脂肪のインスリン抵抗性は、代謝障害や２型糖尿病を誘発する最も重要な要因である。肥満またはインスリン抵抗性の体の筋肉および脂肪では、マクロファージの浸潤が著しく増加する。肥満が増えると、脂肪細胞と筋線維の間にマクロファージが蓄積しる。１型マクロファージは、炎症を促進し、ＴＮＦ－αやＩＬ－１βなどのさまざまな因子を分泌しる。インビトロ実験では、ＴＮＦは筋肉細胞の炎症性シグナル伝達経路を刺激する可能性があり、これはインスリンシグナル伝達経路の感受性の低下に直接つながる。
【0004】
骨格筋は可塑性と再生性に優れている。その高い可塑性は、各骨格筋が異なるサイズと異なる収縮性を持つ６００以上の筋繊維を持っているためであることは理解に難くない。これらの筋線維は共同で体の運動、姿勢の維持、力や細かい動作、さらには呼吸に対する保障を提供する。骨格筋損傷の修復機能において、サテライト細胞、すなわち筋幹細胞は非常に重要な仲介役を果たしている。正常な状態では、サテライト細胞は静止状態にあり、損傷または成長のシグナルを受け取ると、サテライト細胞は急速に活性化され、損傷した領域に広く移動し、そこで増殖、分化、融合して新しい筋線維芽細胞になる。筋肉損傷の修復後、一部の衛星細胞は分化に抵抗し、静止状態とホーミングに戻る。重要なことに、衛星細胞の運命は内因性と外因性の両方の要因に大きく影響される。衛星細胞の活性化は、炎症細胞、間質細胞、栄養シグナル、およびそれらの環境における細胞外マトリックスの組成に関連している。
【0005】
人々の生活水準が継続的に向上するにつれて、高脂肪、高糖分、高塩分の食事が原因の慢性疾患がますます増えている。糖尿病は、人の生命健康に深刻な影響を与える疾患の１つであり、世界の人々の生活の質を深刻に脅かしている。中国には現在、９，２４０ 万人の成人糖尿病患者がおり、世界第１位である。２型糖尿病体では、肥満によって誘発された脂肪浸潤筋組織が炎症を増加させ、一方ではインスリン抵抗性を高め、他方では安静状態のサテライト細胞に活性化効果をもたらす。
【0006】
当分野では、２型糖尿病に対する有効な薬の開発が急がれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、筋肉量および機能を増強し、代謝障害（例えば、２型糖尿病）を予防、緩和および／または治療するための医薬組成物の製造における筋幹細胞の用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の第１の態様は、
（ａ）体重を減らす；
（ｂ）耐糖能および／またはインスリン抵抗性を改善する；
（ｃ）血糖値を下げる；
（ｄ）インスリン感受性を高める；
（ｅ）脂肪含有量を減らす；
（ｆ）脂肪細胞の重量を減らす；
（ｇ）脂肪細胞の体積を減らす；
（ｈ）総コレステロールを下げる；
（ｉ）脂肪に発現する関連遺伝子の発現レベルを差別的に調節する；
（ｊ）褐色脂肪細胞に発現する関連遺伝子の発現レベルを増加させる；
（ｋ）白色脂肪に発現する関連遺伝子の発現レベルを低下させる；
（ｌ）脂肪組織の恒常性を維持する；
（ｍ）肝臓組織の重量を減らす；
（ｎ）肝臓組織の脂肪浸潤を減少させる；
（ｏ）脂肪肝病変の程度を軽減する；
（ｐ）体内の炎症レベルを下げる；
（ｑ）体内のＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βの発現を減少させる；
（ｒ）体内のＩＬ－１０の発現を増加させる；
（ｓ）体の新陳代謝を改善する；
（ｔ）肥満を予防、緩和および／または治療する；
（ｕ）糖尿病を予防、緩和および／または治療する；
（ｖ）インスリン抵抗性を予防、緩和および／または治療する；
（ｗ）代謝障害を予防、緩和および／または治療する；
（Ｘ）筋肉支持力を改善する；
（Ｙ）運動能力を向上する；
ことからなる群から選択される１つまたは複数の用途にも使用される筋幹細胞の使用を提供する。
（ａ）体重を減らす；
（ｂ）耐糖能および／またはインスリン抵抗性を改善する；
（ｃ）血糖値を下げる；
（ｄ）インスリン感受性を高める；
（ｅ）脂肪含有量を減らす；
（ｆ）脂肪細胞の重量を減らす；
（ｇ）脂肪細胞の体積を減らす；
（ｈ）総コレステロールを下げる；
（ｉ）脂肪に発現する関連遺伝子の発現レベルを差別的に調節する；
（ｊ）褐色脂肪細胞に発現する関連遺伝子の発現レベルを増加させる；
（ｋ）白色脂肪に発現する関連遺伝子の発現レベルを低下させる；
（ｌ）脂肪組織の恒常性を維持する；
（ｍ）肝臓組織の重量を減らす；
（ｎ）肝臓組織の脂肪浸潤を減少させる；
（ｏ）脂肪肝病変の程度を軽減する；
（ｐ）体内の炎症レベルを下げる；
（ｑ）体内のＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βの発現を減少させる；
（ｒ）体内のＩＬ－１０の発現を増加させる；
（ｓ）体の新陳代謝を改善する；
（ｔ）肥満を予防、緩和および／または治療する；
（ｕ）糖尿病を予防、緩和および／または治療する；
（ｖ）インスリン抵抗性を予防、緩和および／または治療する；
（ｗ）代謝障害を予防、緩和および／または治療する；
（Ｘ）筋肉支持力を改善する；
（Ｙ）運動能力を向上する；
ことからなる群から選択される１つまたは複数の用途にも使用される筋幹細胞の使用を提供する。
【0009】
別の好ましい例では、前記医薬はヒトまたは動物に使用される。
別の好ましい例では、前記脂肪減少量は、皮下脂肪含有量の減少、腹部脂肪含有量の減少、肝臓組織重量の減少、体重の減少を含む。
別の好ましい例では、前記インスリン抵抗性の改善は、対象のインスリンに対する感受性を改善することである。
別の好ましい例では、前記脂肪減少量は、皮下脂肪含有量の減少、腹部脂肪含有量の減少、肝臓組織重量の減少、体重の減少を含む。
別の好ましい例では、前記インスリン抵抗性の改善は、対象のインスリンに対する感受性を改善することである。
【0010】
別の好ましい例では、前記褐色脂肪に発現する関連遺伝子はｕｃｐ１．ｔｂｘｃ１．ｐｇｃ１α、ｔｍｅｍ２６、ｐｒｄｍ１６、ｃｉｄｅａ、ｐｇｃ１β、ｃｐｔ１α、ｃｐｔ１βからなる群から選択される。
別の好ましい実施形態では、前記白色脂肪に発現する関連遺伝子は、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、ｆａｂｐ４、ｐｐａｒγ、ｃ／ｅｂｐα、ｃ／ｅｂｐβ、ｃ／ｅｂｐγ、ｇｌｕｔ４、ｆａｓｎ、およびアディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）からなる群から選択される。
別の好ましい実施形態では、前記白色脂肪に発現する関連遺伝子は、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、ｆａｂｐ４、ｐｐａｒγ、ｃ／ｅｂｐα、ｃ／ｅｂｐβ、ｃ／ｅｂｐγ、ｇｌｕｔ４、ｆａｓｎ、およびアディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）からなる群から選択される。
【0011】
別の好ましい実施形態において、前記筋幹細胞は、マウス由来の筋幹細胞、ヒト由来の筋幹細胞、サル由来の筋幹細胞、イヌ由来の筋幹細胞、ネコ由来の筋幹細胞、ウマ由来の筋幹細胞、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい実施形態において、前記マウス筋幹細胞は、ＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、Ｖｃａｍ１＋、インターグリン－α７＋およびＰＡＸ７＋細胞である。
別の好ましい実施形態において、前記マウス筋幹細胞は、ＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、Ｖｃａｍ１＋、インターグリン－α７＋およびＰＡＸ７＋細胞である。
【0012】
別の好ましい実施形態において、前記ヒト由来の筋幹細胞は、ＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、ＣＤ２９＋、ＥＧＦＲ＋およびＰＡＸ７＋細胞である。
好ましい実施形態において、前記他の非げっ歯類由来および非ヒト筋幹細胞は、いずれもＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、ＣＤ２９＋、ＥＧＦＲ＋およびＰＡＸ７＋細胞である。
好ましい実施形態において、前記他の非げっ歯類由来および非ヒト筋幹細胞は、いずれもＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、ＣＤ２９＋、ＥＧＦＲ＋およびＰＡＸ７＋細胞である。
【0013】
別の好ましい実施形態において、前記代謝障害は、糖尿病、脂肪肝、高コレステロール血症、インスリン抵抗性、および高血糖症からなる群から選択される。
別の好ましい実施形態において、前記糖尿病は、１型糖尿病および２型糖尿病からなる群から選択される。
別の好ましい実施形態において、前記糖尿病は、１型糖尿病および２型糖尿病からなる群から選択される。
【0014】
別の好ましい実施形態において、前記筋幹細胞は、横紋筋細胞に分化することができ、星状細胞のいくつかの特性を有する幹細胞である。
別の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、筋肉支持力の低下および運動能力低下の予防および／または治療する。
別の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、筋肉支持力の低下および運動能力低下の予防および／または治療する。
【0015】
好ましい実施形態において、前記筋幹細胞は、自己由来であることができ、同種異系、または異種由来であることができる。
別の好ましい実施形態において、前記筋幹細胞は、四肢の骨格筋および体幹の骨格筋からなる群から選択される部位から得られる。
別の好ましい実施形態において、前記筋幹細胞は、四肢の骨格筋および体幹の骨格筋からなる群から選択される部位から得られる。
【0016】
別の好ましい実施形態において、前記医薬組成物の剤形は、新鮮培養筋幹細胞の注射剤、または冷凍保存からの解凍筋幹細胞の注射剤からなる群から選択される。
別の好ましい実施形態において、前記筋幹細胞は、体の筋肉から抽出され、細胞選別および増殖によって得られる。
別の好ましい実施形態において、前記筋幹細胞は、体の筋肉から抽出され、細胞選別および増殖によって得られる。
【0017】
別の好ましい実施形態において、前記筋幹細胞は体の四肢または体幹の筋肉から抽出され、セルソーティングによって得られる。
別の好ましい実施形態において、前記筋幹細胞は、横紋筋細胞に分化することができ、星状細胞の特性を有する筋由来の幹細胞である。
別の好ましい実施形態において、前記筋幹細胞は、横紋筋細胞に分化することができ、星状細胞の特性を有する筋由来の幹細胞である。
【0018】
別の好ましい実施形態において、前記医薬組成物の剤形は注射剤である。
好ましい実施形態において、前記身体代謝の改善には、体内ブドウ糖代謝の改善、体脂肪代謝の改善、体血脂質代謝の改善、またはそれらの組み合わせが含まれる。
好ましい実施形態において、前記身体代謝の改善には、体内ブドウ糖代謝の改善、体脂肪代謝の改善、体血脂質代謝の改善、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【0019】
本発明の第２の態様では、
（ｉ）第１の活性成分としての筋幹細胞と、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む
ヒトまたは動物用の医薬組成物を提供する。
前記医薬組成物は、
（ａ）体重を減らす；
（ｂ）耐糖能および／またはインスリン抵抗性を改善する；
（ｃ）血糖値を下げる；
（ｄ）インスリンに対する感受性を高める；
（ｅ）脂肪含有量を減らす；
（ｆ）脂肪細胞重量の減少する；
（ｇ）脂肪細胞の体積を減らす；
（ｈ）腹部脂肪の蓄積を減らす；
（ｉ）総コレステロールを下げる；
（ｊ）脂肪に発現する関連遺伝子の発現レベルを差別的に調節する；
（ｋ）褐色脂肪に発現する関連遺伝子の発現レベルを増加させる；
（ｌ）白色脂肪に発現する関連遺伝子の発現レベルを低下させる；
（ｍ）脂肪組織の恒常性を維持する；
（ｎ）肝臓組織の脂肪浸潤を減少させる；
（ｏ）脂肪肝病変の程度を軽減する；
（ｐ）体内の炎症レベルを下げる；
（ｑ）体内のＴＮＦ－αの発現を低下させる；
（ｒ）体内のＩＬ－１０の発現を増加させる；
（ｓ）体の代謝を改善する；
（ｔ）肥満を予防、緩和および／または治療する；
（ｕ）糖尿病を予防、緩和および／または治療する；
（ｖ）インスリン抵抗性を予防、緩和および／または治療する；
（ｗ）代謝障害を予防、緩和および／または治療する；
（Ｘ）筋肉支持力を改善する；
（Ｙ）運動能力を向上する；
ことからなる群から選択される１種以上の用途に使用される。
（ｉ）第１の活性成分としての筋幹細胞と、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む
ヒトまたは動物用の医薬組成物を提供する。
前記医薬組成物は、
（ａ）体重を減らす；
（ｂ）耐糖能および／またはインスリン抵抗性を改善する；
（ｃ）血糖値を下げる；
（ｄ）インスリンに対する感受性を高める；
（ｅ）脂肪含有量を減らす；
（ｆ）脂肪細胞重量の減少する；
（ｇ）脂肪細胞の体積を減らす；
（ｈ）腹部脂肪の蓄積を減らす；
（ｉ）総コレステロールを下げる；
（ｊ）脂肪に発現する関連遺伝子の発現レベルを差別的に調節する；
（ｋ）褐色脂肪に発現する関連遺伝子の発現レベルを増加させる；
（ｌ）白色脂肪に発現する関連遺伝子の発現レベルを低下させる；
（ｍ）脂肪組織の恒常性を維持する；
（ｎ）肝臓組織の脂肪浸潤を減少させる；
（ｏ）脂肪肝病変の程度を軽減する；
（ｐ）体内の炎症レベルを下げる；
（ｑ）体内のＴＮＦ－αの発現を低下させる；
（ｒ）体内のＩＬ－１０の発現を増加させる；
（ｓ）体の代謝を改善する；
（ｔ）肥満を予防、緩和および／または治療する；
（ｕ）糖尿病を予防、緩和および／または治療する；
（ｖ）インスリン抵抗性を予防、緩和および／または治療する；
（ｗ）代謝障害を予防、緩和および／または治療する；
（Ｘ）筋肉支持力を改善する；
（Ｙ）運動能力を向上する；
ことからなる群から選択される１種以上の用途に使用される。
【0020】
別の好ましい実施形態では、医薬組成物は、ブドウ糖代謝を調節するための第２の活性成分をさらに含有し、好ましくは、第２の活性成分は、ビグアニド系薬、スルホニル尿素系薬、非スルホニル尿素インスリン分泌促進剤、チアゾリジンジオンインスリン系増感剤、グリコシダーゼ阻害剤、インスリン、グルカゴン様ペプチド－１類似体またはアゴニストからなる群から選択される。
【0021】
別の好ましい例では、前記筋幹細胞は、マウス筋幹細胞であり、好ましくはＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、Ｖｃａｍ１＋、インターグリン－α７＋の細胞である。
別の好ましい例では、前記筋幹細胞は、好ましくはヒト由来筋幹細胞であり、ＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、ＣＤ２９＋、ＥＧＦＲ＋、およびＰＡＸ７＋の細胞である。
別の好ましい例では、前記筋幹細胞は、好ましくはヒト由来筋幹細胞であり、ＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、ＣＤ２９＋、ＥＧＦＲ＋、およびＰＡＸ７＋の細胞である。
【0022】
別の好ましい例では、前記筋幹細胞は非げっ歯類動物由来筋幹細胞であり、好ましくはＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、ＣＤ２９＋、ＥＧＦＲ＋、およびＰＡＸ ７＋の細胞である。
別の好ましい例では、前記医薬組成物は抗１型糖尿病薬である。
別の好ましい例では、前記医薬組成物は抗２型糖尿病薬である。
別の好ましい例では、前記医薬組成物は抗１型糖尿病薬である。
別の好ましい例では、前記医薬組成物は抗２型糖尿病薬である。
【0023】
別の好ましい例では、前記医薬組成物は体の糖代謝を改善する薬である。
別の好ましい例では、前記医薬組成物は、筋肉減少及び力不足を予防及び／又は治療するための薬である。
別の好ましい例では、前記医薬組成物は、体の白色脂肪組織の恒常性を維持する薬である。
別の好ましい例では、前記医薬組成物は、筋肉減少及び力不足を予防及び／又は治療するための薬である。
別の好ましい例では、前記医薬組成物は、体の白色脂肪組織の恒常性を維持する薬である。
【0024】
別の好ましい例では、前記医薬組成物は、体の炎症環境を軽減する薬である。
別の好ましい例では、医薬組成物は脂肪肝病変の程度を低下させる薬である。
別の好ましい例では、医薬組成物は、筋肉支持力低下の予防および／または治療する。
別の好ましい例では、医薬組成物は脂肪肝病変の程度を低下させる薬である。
別の好ましい例では、医薬組成物は、筋肉支持力低下の予防および／または治療する。
【0025】
別の好ましい例では、医薬組成物は、運動能力低下を予防および／または治療する。
別の好ましい実施形態では、前記医薬組成物の剤形は、新鮮または冷凍の筋幹細胞注射剤、および冷凍乾燥製剤からなる群から選択される。
別の好ましい実施形態では、前記医薬組成物の剤形は、新鮮または冷凍の筋幹細胞注射剤、および冷凍乾燥製剤からなる群から選択される。
【0026】
本発明の第３の態様では、本発明の第２の態様による筋幹細胞、収集物、冷凍保存および医薬組成物、または筋幹細胞または医薬組成物を含む製剤、またはそれらの組み合わせのような筋幹細胞を必要な対象に投与することを含む代謝障害を予防、緩和および／または治療する方法が提供される。
【0027】
本発明の範囲内において、上述した本発明の技術的特徴と、以下に具体的に説明する技術的特徴（実施の形態等）とを組み合わせて、新しいまたは好ましい技術的態様を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは一々説明しない。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】Ａ．マウス由来の筋幹細胞の形態は紡錘形である。スケールバー（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ）＝５００μｍ；Ｂ．マウス筋幹細胞で特異的に発現するタンパク質ＰＡＸ７のフロー分析；Ｃ．染色によるマウス筋幹細胞の表面マーカーの同定。細胞表面マーカータンパク質ＣＤ３１－ＡＰ、ＣＤ３４－ＰｅｒＣＰ－ｃｙ５．５、ＣＤ４５－ＡＰＣ、ＣＤ１０６（Ｖｃａｍ－１）－Ｖ４５０およびＩｎｔｅｒｇｒｉｎ－α７－ＦＩＴＣを使用して識別を染色する；Ｄ．免疫蛍光染色によるマウス筋幹細胞特異的分化成熟タンパク質サルコプラスミン重鎖（ＭＨＣ）を同定する。赤は、ミオシン重鎖であり、青は、細胞核である。ここで、ＭＨＣはミオシン重鎖染色、Ｈｏｃｈｅｓｔは核染色、Ｍｅｒｇｅはオーバーレイである。スケールバー＝５０μｍ。
【図2】マウスの体重増加の傾向曲線を示す。ＮＤは通常の食事を与えたマウス群であり、マウスには、１０％Ｋｃａｌの通常の固形飼料を与え、ＨＦＤは、高脂肪食のマウス群であり、マウスには６０％Ｋｃａｌの高脂肪食を与え、ＨＦＤ＋ＭｕＳＣは、マウス筋幹細胞を高脂肪食のマウスに注射するマウス群である。１２週目に、マウスに筋肉内幹細胞注射を行う
【図3】Ａ．耐糖能試験により、マウスの血糖降下能力を確認する。マウスを１５時間絶食させ、空腹時血糖値を測定する。１ｇ／Ｋｇマウスの比率に従ってマウスにブドウ糖を腹腔内注射し、当該マウスの血糖値を注射後１５分、３０分、４５分、６０分、および１２０分でそれぞれ検出し、血糖曲線を形成する；Ｂ．インスリン抵抗性試験により、マウスの血糖降下能力を検出する。各群のマウスの血糖値を測定する。インスリンをマウスに０．７５Ｕ／Ｋｇの比率で腹腔内注射し、注射後１５分、３０分、４５分、６０分、および１２０分でマウスの血糖値をそれぞれ検出し、血糖曲線を形成する；ここで、ＮＤは、通常の食事をしているマウス群であり、マウスには、１０％Ｋｃａｌの通常の固形飼料を与え、ＨＦＤは、高脂肪食のマウス群であり、マウスには、６０％Ｋｃａｌの高脂肪食を与え、ＨＦＤ＋ＭｕＳＣは、マウス筋幹細胞を高脂肪食のマウスに注射したマウス群である。
【図4】Ａ．各群のマウスの皮下脂肪組織を採取し、重量を測定して比較した；Ｂ． マウスの各群の肝臓組織を採取し、肝臓組織の重量を測定して比較した；Ｃ．キットを使用して各群のマウスの末梢血血清中の総コレステロールを検出し、比較した；ここで、ＮＤは、通常食のマウスの群であり、マウスには１０％Ｋｃａｌの通常食を与え、ＨＦＤはマウスの高脂肪食群であり、マウスには６０％Ｋｃａｌの高脂肪食を与え、ＨＦＤ＋ＭｕＳＣは、マウス筋幹細胞を高脂肪食のマウスに注射したマウスの群である。
【図5】Ａ．ヒト筋幹細胞の形状は紡錘形である。スケールバー（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ）＝５００μｍ；Ｂ．ヒト筋幹細胞によって発現される特定の核因子ＰＡＸ７のフローサイトメトリーによる同定。細胞を透過処理して固定する後、筋幹細胞をＰＡＸ７タンパク質抗体で染色し、励起光波長６４７の蛍光二次抗体で染色し、細胞をフローサイトメーターで分析する；Ｃ．ヒト由来筋幹細胞によって発現される表面マーカーのフローサイトメトリーによる同定。分離された筋幹細胞は、抗マウスフロー抗体ＣＤ３１－ＰＥ、ＣＤ３４－ＰＥ、ＣＤ４５－ＰＥ、ＣＤ２９－ＡＰＣ、ＥＧＦＲ－ＢＶ４２１を使用して表面マーカーを染色し、フローサイトメトリーで分析する；Ｄ．ヒト筋幹細胞特異的分化および成熟タンパク質ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）の免疫蛍光染色であり。赤は、ミオシン重鎖であり、青は、核である。スケールバー＝２５μｍ；ここで、ＭＨＣ はミオシン重鎖染色、Ｈｏｃｈｅｓｔ は核染色、Ｍｅｒｇｅはオーバーレイである。
【図6】マウスの体重増加の傾向曲線を示し、ＮＤは１０％Ｋｃａｌの通常食を与えたマウスの通常食群であり、ＨＦＤは６０％Ｋｃａｌの高脂肪食を与えたマウスの高脂肪食群であり、マウスには６０％Ｋｃａｌの高脂肪食を与え、ＨＦＤ＋ヒトＭｕＳＣは、高脂肪食を与えたマウスにヒト由来の筋幹細胞を注射したマウスの群であり、高脂肪食のマウスの体重が大幅に増加した。高脂肪食の２か月後、ヒト筋幹細胞の外因性投与により、低体重マウスの体重増加が大幅に抑制された。
【図7】耐糖能試験によってマウスの血糖降下能力を検出する。各群のマウスは、１５時間絶食後、空腹時血糖値を測定する。ブドウ糖は、１ｇ／Ｋｇマウスの比率でマウスに腹腔内注射され、注射後１５分、３０分、４５分、６０分、１２０分に当該マウスの血糖値を検出し、血糖曲線を作成する；Ｂ．マウスの血糖降下能力を検出するためのインスリン抵抗性試験。各群のマウスの血糖値を測定する。０．７５Ｕ／Ｋｇマウスの比率に従って、マウスにインスリンを腹腔内注射し、注射後１５分、３０分、４５分、６０分、および１２０分でマウスの血糖値を検出して、血液曲線を形成する；Ｃ．インスリンＥＬＩＳＡキットを使用して、マウス血清中のインスリンの発現を検出する；Ｄ．総コレステロール（Ｔ－ＣＨＯ）検出キットを使用して、マウス血清中の総コレステロールの含有量を検出する。ここで、ＮＤは、通常食のマウス群であり、マウスには１０％Ｋｃａｌの通常食を与え、ＨＦＤは、マウスの高脂肪食群であり、マウスには６０％Ｋｃａｌの高脂肪食を与えた。ＨＦＤ＋Ｈｕｍａｎ ＭｕＳＣ（ＨＦＤ＋ＨｕＳＣ）は、高脂肪食のマウスにヒト由来の筋幹細胞を注射したマウスの群である。
【図8】Ａ．各群のマウスの腹部皮下脂肪を採取し、マウスの皮下脂肪組織の重量を測定した；Ｂ．マウスの腹腔および精巣上体の脂肪組織の含有量を測定した； Ｃ、Ｄ．マウスの脂肪組織切片は、体積と統計を比較した。脂肪組織の脱水と固定後、パラフィン包埋切片を作成した。ヘマトキシリン・エオジン染色液で切片を染色した。スケールバー＝７５μｍ；Ｅ、Ｆ、Ｇ．マウス脂肪組織における白色脂肪関連遺伝子ｐｐａｒ Ｙ、レプチン、およびｆａｂｐ４の発現をＱＰＣＲによって検出した；Ｈ、Ｉ、Ｊ．マウス脂肪組織における褐色脂肪関連遺伝子ｕｃｐ １．ｔｂｘｃ１およびｐｇｃ１ａの発現は、ＱＰＣＲ によって検出された。ここで、ＮＤは、通常食のマウス群であり、マウスには１０％Ｋｃａｌの通常食を与え、ＨＦＤは、マウスの高脂肪食群であり、マウスには６０％Ｋｃａｌの高脂肪食を与え、ＨＦＤ＋ＨｕＳＣは、高脂肪食のマウスにヒト由来の筋幹細胞を注射したマウスの群である。
【図9】Ａ．マウスの各群の肝臓組織を取得し、マウスの肝臓組織の重量を測定して比較する；Ｂ．得られたマウス肝臓組織の写真を撮り、肝臓組織の外観を比較する；Ｃ．肝組織のパラフィン包埋切片をヘマトキシリン・エオジン染色し、染色切片の脂肪肝病変の程度を比較した。スケールバー＝７５μｍ；ここで、ＮＤは、通常の食事をしているマウス群であり、マウスには、１０％Ｋｃａｌを含む通常の固形飼料を与えた。ＨＦＤは、高脂肪食のマウス群であり、マウスには６０％Ｋｃａｌの高脂肪食を与え、ＨＦＤ＋ＨｕＳＣは、高脂肪食のマウスにヒト由来の筋幹細胞を注射したマウス群である。
【図10】Ａ．各群のマウスの血清中のＴＮＦ－αの発現レベルを検出し、ＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡキットを使用して比較する；Ｂ．ＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡキットを使用して、各群のマウスの血清中のＩＬ－１０ の含有量を検出し、それらを比較する。ＮＤは、通常の食事を与えられたマウス群であり、マウスには、１０％Ｋｃａｌの通常の固形飼料を与えた。ＨＦＤは、高脂肪食のマウス群であり、マウスには６０％Ｋｃａｌの高脂肪食を与え、ＨＦＤ＋ＨｕＳＣは、高脂肪食のマウスにヒト由来の筋幹細胞を注射したマウス群である。
【図11】Ａ．サル由来の筋幹細胞の形状は紡錘形である；Ｂ．サル由来の筋幹細胞の筋幹細胞特異的核因子ＰＡＸ７の染色および同定；Ｃ．サル由来の筋幹細胞の細胞表面マーカータンパク質の同定。ＣＤ３１－ＰＥ、ＣＤ３４－ＰＥ、ＣＤ４５－ＰＥ、ＣＤ２９－ＡＰＣ、ＣＤ５６－Ｖ４５０、およびＥＧＦＲ－Ｖ４５０抗体を使用して、筋幹細胞を染色および識別する；Ｄ．サル由来の筋幹細胞の特異的分化および成熟タンパク質ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）の免疫蛍光染色の同定をし、赤はミオシン重鎖、青は、細胞核である。スケールバー＝ ５０μｍ。Ｅ． 自然発症高血糖症のサルに自家筋幹細胞を静脈内注入する前後の４匹の実験サル（実験サルのラベルはそれぞれ０７１７３０，０７１７３８，０７０６７８および０６００４２）の空腹時血糖値の変化。細胞注入量は２．５×１０６細胞／Ｋｇ実験サルで、細胞注入サイクルは２ 週間に１回、合計３～６回注入する。ここで、ＭＨＣはミオシン重鎖染色、Ｈｏｃｈｅｓｔは核染色、Ｍｅｒｇｅはオーバーレイである。前記すべての結果において、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図12】Ａ．マウスの体重増加傾向曲線；Ｂ．耐糖能試験により、マウスの血糖降下能力が確認し、マウスを１５時間絶食させ、空腹時血糖値を測定する。１ｇ／Ｋｇマウスの比率に従ってマウスにブドウ糖を腹腔内注射し、マウスの血糖値を注射後１５分、３０分、４５分、６０分、および１２０分で検出し、血糖曲線を形成する；Ｃ．インスリン抵抗性試験により、マウスの血糖降下能力が検出する。各群のマウスの血糖値を測定する。０．７５Ｕ／Ｋｇマウスの比率に従って、インスリンをマウスに腹腔内注射し、注射後１５分、３０分、４５分、６０分、および１２０分でマウスの血糖値を検出して、血糖曲線を形成する；Ｄ．マウスの腹腔内および精巣上体脂肪組織含有量を測定する；Ｅ．各群のマウスの腹部皮下脂肪を採取し、マウスの皮下脂肪組織の重量を測定する；Ｆ．マウス肝臓組織の重量を測定して比較する；Ｇ．ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキットを使用して、各群のマウスの血清中のＴＮＦ－αの発現レベルを検出および比較する；Ｈ．ＩＬ－１β ＥＬＩＳＡキットを使用して、各群のマウスの血清中のＩＬ－１０の含有量を検出し、それらを比較する。ここで、ＮＤは、通常の食事をしているマウス群であり、マウスには、１０％Ｋｃａｌの通常の固形飼料を与え、ＨＦＤは、高脂肪食のマウス群であり、マウスには６０％Ｋｃａｌの高脂肪食を与え、ＨＦＤ＋ＭｕＳＣはＢａｌｂ／Ｃマウス由来筋幹細胞を高脂肪食のマウスに注射する。１４週目に、マウスに筋肉内幹細胞注射を行う。前記すべての結果において、＊Ｐ＜０．０５； ＊＊Ｐ＜０．０１； ＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本発明者は広く深く研究した結果、活性化されたサテライト細胞は、肥満による炎症反応を抑制し、それによって炎症レベルを低下させ、インスリンに対する組織の感受性を高め、組織代謝を調節し、血糖値を下げ、脂肪の拡大と浸潤を減らし、２型糖尿病の治療的役割を果たすことを初めて意外に発見した。具体的には、本発明は、高脂肪食によって誘発されたインスリン抵抗性のマウスモデルを選択し、代謝障害（例えば、２型糖尿病）を予防、緩和および／または治療するための医薬組成物の製造におけるヒト由来筋幹細胞の用途が研究された。マウスに注入されたヒト由来細胞は、短期間で体から排除され、レシピエントでの細胞のコロニー形成、増殖、分化の可能性を排除する。
【0030】
本発明では、筋幹細胞を、高脂肪食により誘導されたインスリン抵抗性マウスの尾静脈に注射する。実験の結果、モデル群と比較して、治療群はマウスのブドウ糖代謝を大幅に改善し、白色脂肪組織を減少させ、脂肪細胞の肥大を緩和し、白色脂肪組織の恒常性を改善し、マウスの炎症環境を緩和し、脂肪肝疾患の程度を軽減することができることを示しした。本発明はこれに基づいて完成されたものである。
【0031】
用語
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、具体的に列挙された値に関して使用される場合、「約」という用語は、その値が列挙された値から１％を超えて変化しないことを意味する。例えば、本明細書で使用される「約１００」という表現は、９９と１０１の間のすべての値および（例えば、９９．１、９９．２．９９．３、９９．４など）を含む。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、具体的に列挙された値に関して使用される場合、「約」という用語は、その値が列挙された値から１％を超えて変化しないことを意味する。例えば、本明細書で使用される「約１００」という表現は、９９と１０１の間のすべての値および（例えば、９９．１、９９．２．９９．３、９９．４など）を含む。
【0032】
本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができ、好ましい方法および材料は、本明細書に例示されている。
【0033】
筋幹細胞
マウロ（Ｍａｕｒｏ）は、１９６１年にカエルの骨格筋における筋幹細胞の前駆細胞である筋サテライト細胞の発見を最初に提案した。続いて、成体哺乳類の骨格筋にも少数の筋幹細胞が存在し、その数は年齢とともに徐々に減少することがますます多くの研究で示された。筋衛星細胞は、骨格筋基底膜と筋線維細胞膜の間に位置する筋原性幹細胞であり、筋サテライト細胞は生理状態では静止した未分化状態で存在し、傷害や炎症などの刺激を受けると活性化されて紡錘状の筋幹細胞に分裂し、互いに融合して多核筋管へと分化を続け、最後に、筋原性繊維を形成するか、損傷した筋肉組織に統合され、骨格筋の成長、損傷の修復、機能の維持、および組織の再生に重要な役割を果たす。
マウロ（Ｍａｕｒｏ）は、１９６１年にカエルの骨格筋における筋幹細胞の前駆細胞である筋サテライト細胞の発見を最初に提案した。続いて、成体哺乳類の骨格筋にも少数の筋幹細胞が存在し、その数は年齢とともに徐々に減少することがますます多くの研究で示された。筋衛星細胞は、骨格筋基底膜と筋線維細胞膜の間に位置する筋原性幹細胞であり、筋サテライト細胞は生理状態では静止した未分化状態で存在し、傷害や炎症などの刺激を受けると活性化されて紡錘状の筋幹細胞に分裂し、互いに融合して多核筋管へと分化を続け、最後に、筋原性繊維を形成するか、損傷した筋肉組織に統合され、骨格筋の成長、損傷の修復、機能の維持、および組織の再生に重要な役割を果たす。
【0034】
本発明の好ましい一実施形態において、筋幹細胞は、マウス筋幹細胞、ヒト由来筋幹細胞、サル由来筋幹細胞、イヌ由来筋幹細胞、ネコ由来筋幹細胞、ウマ由来筋幹細胞などからなる群から選択される。
本発明の好ましい一実施形態において、マウス筋幹細胞は、ＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、Ｖｃａｍ １＋、Ｉｎｔｅｒｇｒｉｎ－α７＋細胞である。
本発明の好ましい一実施形態において、マウス筋幹細胞は、ＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、Ｖｃａｍ １＋、Ｉｎｔｅｒｇｒｉｎ－α７＋細胞である。
【0035】
本発明の好ましい一実施形態において、ヒト由来の筋幹細胞は、ＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、ＣＤ２９＋、ＥＧＦＲ＋、およびＰＡＸ７＋細胞である。
他の非げっ歯類由来の筋幹細胞は、ＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、ＣＤ２９＋、ＥＧＦＲ＋、およびＰＡＸ７＋細胞である。
他の非げっ歯類由来の筋幹細胞は、ＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、ＣＤ２９＋、ＥＧＦＲ＋、およびＰＡＸ７＋細胞である。
【0036】
本発明の好ましい一実施形態において、前記筋幹細胞は、横紋筋細胞に分化できる筋肉由来の幹細胞であり、星状細胞のいくつかの特性を有する。
本発明の好ましい一実施形態において、前記筋幹細胞は、自己由来であることができ、同種異系、または異種由来であることができる。
本発明の好ましい一実施形態において、前記筋幹細胞は、自己由来であることができ、同種異系、または異種由来であることができる。
【0037】
本発明の好ましい一実施形態において、筋幹細胞は、四肢の骨格筋および体幹の骨格筋からなる群から選択される部位から得られる。
本発明の好ましい一実施形態において、前記筋幹細胞は、体の筋肉からから抽出され、フローサイトメトリーにより選別、増殖されて得られる。
本発明の好ましい一実施形態において、前記筋幹細胞は、体の筋肉からから抽出され、フローサイトメトリーにより選別、増殖されて得られる。
【0038】
本発明の好ましい一実施形態において、前記筋幹細胞は体の四肢や体幹の筋肉から抽出され、フローサイトメトリーによって選別されて得られる。
【0039】
筋肉由来間葉系幹細胞
間葉系幹細胞は、骨格筋と平滑筋の両方に存在する。筋肉損傷の修復と再生の主役は筋幹細胞であるが、炎症細胞などの他の種類の細胞もあり、血管内皮細胞と筋肉由来間葉系幹細胞は、筋肉損傷の修復と再生の全過程において、細かい調節と調整に関与する。例えば、繊維脂肪生成前駆細胞は、筋間質内の間葉系幹細胞の一種であり、その役割は、筋幹細胞の分化を支持力し、筋肉組織の修復と再生を促進することである。
代謝障害
間葉系幹細胞は、骨格筋と平滑筋の両方に存在する。筋肉損傷の修復と再生の主役は筋幹細胞であるが、炎症細胞などの他の種類の細胞もあり、血管内皮細胞と筋肉由来間葉系幹細胞は、筋肉損傷の修復と再生の全過程において、細かい調節と調整に関与する。例えば、繊維脂肪生成前駆細胞は、筋間質内の間葉系幹細胞の一種であり、その役割は、筋幹細胞の分化を支持力し、筋肉組織の修復と再生を促進することである。
代謝障害
【0040】
代謝障害とは、身体による物質の吸収、消化、排泄に病的な障害があり、需要と供給のバランスが崩れた状態である。１つまたは複数の物質障害として現れることがある。各種代謝状態の障害はそれぞれ異なる。糖代謝障害は糖尿病、脂質代謝障害は高脂血症、尿酸代謝の障害は痛風などを引き起こした。電解質も代謝障害を引き起こし、高カリウム血症、低カリウム血症などの対応する障害を引き起こした。慢性高血糖を特徴とする代謝性疾患は、臨床現場で脂質代謝障害と組み合わされることが多く、糖尿病の主要な合併症の１つになるが、脂質代謝障害の直接的な症状は、体の総コレステロール指数の上昇である。
【0041】
本発明の好ましい実施形態では、前記代謝障害疾患は、糖尿病、脂肪肝、高コレステロール血症、インスリン抵抗性疾患、および高血糖症からなる群から選択される。
本発明の別の好ましい実施形態において、糖尿病は、１型糖尿病および２型糖尿病からなる群から選択される。
本発明の別の好ましい実施形態において、糖尿病は、１型糖尿病および２型糖尿病からなる群から選択される。
【0042】
医薬組成物
本発明は組成物も提供する。好ましい例において、組成物は、前記筋幹細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。一般に、これらの物質は、無毒で不活性で薬学的に許容される水性担体媒体で処方することができ、ここで、ｐＨは通常約５～８、好ましくは約６～８であるが、調製される物質の性質および治療される状態に応じてｐＨは変化し得る。調製された医薬組成物は、経口、呼吸器、腫瘍内、腹腔内、静脈内、または局所投与が含まれる従来の経路によって投与することができるが、これらに限らない。
本発明は組成物も提供する。好ましい例において、組成物は、前記筋幹細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。一般に、これらの物質は、無毒で不活性で薬学的に許容される水性担体媒体で処方することができ、ここで、ｐＨは通常約５～８、好ましくは約６～８であるが、調製される物質の性質および治療される状態に応じてｐＨは変化し得る。調製された医薬組成物は、経口、呼吸器、腫瘍内、腹腔内、静脈内、または局所投与が含まれる従来の経路によって投与することができるが、これらに限らない。
【0043】
本発明の医薬組成物は、治療（例えば、代謝障害の治療）のために直接使用することができ、さらに、他の治療薬を同時に使用することができる。
【0044】
本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０．００１～９９重量％、好ましくは０．０１～９０重量％。より好ましくは０．１～８０重量％）の本発明の前記筋幹細胞および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。これらの担体には、生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。医薬製剤は、投与方法と一致しなければならない。本発明の医薬組成物は、注射剤の形態で製造することができ、例えば、生理食塩水またはブドウ糖および他の補助剤を含む水溶液を用いて常法により製造することができる。注射剤や溶液剤などの医薬組成物は、無菌条件下で製造することが好ましい。活性成分は、治療有効量、例えば、１日当たり約１μｇ／Ｋｇ体重から約１０ｍｇ／Ｋｇ体重で投与される。さらに、本発明の筋幹細胞は、他の治療剤と共に使用することもできる。
【0045】
医薬組成物を使用する場合、安全で有効な量の筋幹細胞が哺乳動物に投与され、安全で有効な量は、一般に少なくとも約１０μｇ／Ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約８ｍｇ／Ｋｇ以下である。好ましくは、投与量は、約１０μｇ／Ｋｇ体重～約１ｍｇ／Ｋｇ体重である。もちろん、特定の投与量は、投与経路、患者の健康、および他の要因も考慮に入れるべきであり、これらはすべて当業者の技術の範囲内である。
【0046】
本発明の好ましい実施形態では、前記医薬組成物は、
（ｉ）活性成分としての筋幹細胞、および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む。
（ｉ）活性成分としての筋幹細胞、および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む。
【0047】
前記医薬組成物は、
（ａ）体重を減らす；
（ｂ）耐糖能および／またはインスリン抵抗性を改善する；
（ｃ）血糖値を下げる；
（ｄ）インスリン感受性を高める；
（ｅ）脂肪含有量を減らす；
（ｆ）脂肪細胞の重量を減らす；
（ｇ）脂肪細胞の体積を減らす；
（ｈ）腹部脂肪の蓄積を減らす；
（ｉ）総コレステロールを下げる；
（ｊ）脂肪に発現する関連遺伝子の発現レベルを差別的に調節する；
（ｋ）褐色脂肪細胞に発現する関連遺伝子の発現レベルを増加させる；
（ｌ）白色脂肪に発現する関連遺伝子の発現レベルを低下させる；
（ｍ）脂肪組織の恒常性を維持する；
（ｎ）肝臓組織の脂肪浸潤を減少させる；
（ｏ）脂肪肝病変の程度を軽減する；
（ｐ）体内の炎症レベルを下げる；
（ｑ）体内のＴＮＦ－αおよびＩＬ－１の発現を減少させる；
（ｒ）体内のＩＬ－１０の発現を増加させる；
（ｓ）体の代謝を改善する；
（ｔ）肥満を予防、緩和および／または治療する；
（ｕ）糖尿病を予防、緩和および／または治療する；
（ｖ）インスリン抵抗性を予防、緩和および／または治療する；
（ｗ）代謝障害を予防、緩和および／または治療する；
（Ｘ）筋肉支持力を改善する；
（Ｙ）運動能力を向上する；
ことからなる群から選択される１種以上の用途に使用される。
（ａ）体重を減らす；
（ｂ）耐糖能および／またはインスリン抵抗性を改善する；
（ｃ）血糖値を下げる；
（ｄ）インスリン感受性を高める；
（ｅ）脂肪含有量を減らす；
（ｆ）脂肪細胞の重量を減らす；
（ｇ）脂肪細胞の体積を減らす；
（ｈ）腹部脂肪の蓄積を減らす；
（ｉ）総コレステロールを下げる；
（ｊ）脂肪に発現する関連遺伝子の発現レベルを差別的に調節する；
（ｋ）褐色脂肪細胞に発現する関連遺伝子の発現レベルを増加させる；
（ｌ）白色脂肪に発現する関連遺伝子の発現レベルを低下させる；
（ｍ）脂肪組織の恒常性を維持する；
（ｎ）肝臓組織の脂肪浸潤を減少させる；
（ｏ）脂肪肝病変の程度を軽減する；
（ｐ）体内の炎症レベルを下げる；
（ｑ）体内のＴＮＦ－αおよびＩＬ－１の発現を減少させる；
（ｒ）体内のＩＬ－１０の発現を増加させる；
（ｓ）体の代謝を改善する；
（ｔ）肥満を予防、緩和および／または治療する；
（ｕ）糖尿病を予防、緩和および／または治療する；
（ｖ）インスリン抵抗性を予防、緩和および／または治療する；
（ｗ）代謝障害を予防、緩和および／または治療する；
（Ｘ）筋肉支持力を改善する；
（Ｙ）運動能力を向上する；
ことからなる群から選択される１種以上の用途に使用される。
【0048】
本発明の好ましい実施形態において、前記マウス筋幹細胞は、ＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、Ｖｃａｍ１＋、インターグリン－α７＋細胞である。
別の好ましい実施形態では、前記ヒト由来の筋幹細胞は、ＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、ＣＤ２９＋、ＥＧＦＲ＋およびＰＡＸ７＋細胞である。
別の好ましい実施形態では、前記ヒト由来の筋幹細胞は、ＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、ＣＤ２９＋、ＥＧＦＲ＋およびＰＡＸ７＋細胞である。
【0049】
他の非げっ歯類由来の筋幹細胞は、いずれもＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、ＣＤ２９＋、ＥＧＦＲ＋、およびＰＡＸ７＋細胞である。
本発明の好ましい実施形態では、前記医薬組成物は抗１型糖尿病薬である。
本発明の好ましい実施形態では、前記医薬組成物は抗１型糖尿病薬である。
【0050】
本発明の好ましい実施形態では、前記医薬組成物は抗２型糖尿病薬である。
本発明の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、体のブドウ糖代謝を改善する薬である。
本発明の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、体のブドウ糖代謝を改善する薬である。
【0051】
別の好ましい実施形態では、前記医薬組成物は、筋肉支持低下の予防および／または治療する薬である。
別の好ましい実施形態では、前記医薬組成物は、運動能力低下を予防および／または治療する。
別の好ましい実施形態では、前記医薬組成物は、運動能力低下を予防および／または治療する。
【0052】
本発明の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、体内の白色脂肪組織の恒常性を維持するための薬である。
本発明の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、体内の炎症環境を軽減するための医薬である。
本発明の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、体内の炎症環境を軽減するための医薬である。
【0053】
本発明の好ましい実施形態において、医薬組成物は、脂肪肝疾患の程度を軽減するための医薬である。
本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物の剤形は、注射剤および冷凍乾燥製剤からなる群から選択される。
本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物の剤形は、注射剤および冷凍乾燥製剤からなる群から選択される。
【0054】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗２型糖尿病薬の剤形は、新鮮に培養された筋幹細胞注射剤、または冷凍保存から解凍された筋幹細胞注射剤である。
本発明の好ましい例において、前記抗２型糖尿病薬は、マウスのブドウ糖代謝を有意に改善し、血糖を低下させることができる。
本発明の好ましい例において、前記抗２型糖尿病薬は、マウスのブドウ糖代謝を有意に改善し、血糖を低下させることができる。
【0055】
本発明の好ましい例において、前記抗２型糖尿病薬は、白色脂肪組織の重量を減少させ、脂肪細胞肥大を緩和し、白色脂肪組織の恒常性を改善することができる。
本発明の好ましい実施形態において、前記抗２型糖尿病薬は、マウスにおける炎症のレベルを低下させることができる。
本発明の好ましい例において、前記抗２型糖尿病薬は、脂肪肝疾患の程度を軽減することができる。
本発明の好ましい実施形態において、前記抗２型糖尿病薬は、マウスにおける炎症のレベルを低下させることができる。
本発明の好ましい例において、前記抗２型糖尿病薬は、脂肪肝疾患の程度を軽減することができる。
【0056】
本発明の主な利点は次のとおりである。
（１）本発明は、高脂肪食によって誘導されたインスリン抵抗性マウスの尾静脈に筋幹細胞を注射することにより、代謝障害の治療における筋幹細胞の効果を十分に研究した。
（１）本発明は、高脂肪食によって誘導されたインスリン抵抗性マウスの尾静脈に筋幹細胞を注射することにより、代謝障害の治療における筋幹細胞の効果を十分に研究した。
【0057】
（２）本発明は非常に意外にも筋幹細胞が以下の機能を備えることを発見した。
１．マウスの糖代謝能力を改善する。
２．空腹時血糖を下げる。
３．白色脂肪の量を減らし、脂肪細胞肥大を緩和し、脂肪組織の恒常性を維持する。
４．体内の炎症レベルを下げる。
５．肝脂肪化病変の程度を軽減する。
６．体内の筋肉状態などの各生理機能を改善する。
１．マウスの糖代謝能力を改善する。
２．空腹時血糖を下げる。
３．白色脂肪の量を減らし、脂肪細胞肥大を緩和し、脂肪組織の恒常性を維持する。
４．体内の炎症レベルを下げる。
５．肝脂肪化病変の程度を軽減する。
６．体内の筋肉状態などの各生理機能を改善する。
【0058】
（３）本発明は、限られた回数の筋肉内幹細胞注射によって比較的長期の治療効果を達成することができ、以下の利点をもたらす。
１．細胞注射の回数が減り、体が痛む回数が減り、体のＱＯＬが向上する。
２．細胞の注入回数が少ないほど、長期的な効果が得られ、時間と労力を節約できる。
１．細胞注射の回数が減り、体が痛む回数が減り、体のＱＯＬが向上する。
２．細胞の注入回数が少ないほど、長期的な効果が得られ、時間と労力を節約できる。
【0059】
（４）１回の分離で長期冷凍保存ができ、何度も使用できる。
本発明は、特定の実施形態に関連して以下でさらに説明される。これらの実施形態は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するためには使用されないと理解されたい。以下の実施例で未受領の特定の条件の実験方法は、通常は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら 、分子クローニングなどの従来の条件、実験室マニュアル（ニューヨーク： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載されている条件、または製造元が推奨する条件に従って実施される。特に明記されない限り、パーセンテージと部数とは、重量で計算される。本発明に含まれる実験材料は、特に明記しない限り、市販経路から得ることができる。
本発明は、特定の実施形態に関連して以下でさらに説明される。これらの実施形態は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するためには使用されないと理解されたい。以下の実施例で未受領の特定の条件の実験方法は、通常は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら 、分子クローニングなどの従来の条件、実験室マニュアル（ニューヨーク： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載されている条件、または製造元が推奨する条件に従って実施される。特に明記されない限り、パーセンテージと部数とは、重量で計算される。本発明に含まれる実験材料は、特に明記しない限り、市販経路から得ることができる。
【0060】
実施例１ マウス筋幹細胞の抽出、増殖、同定及び分化
（一）マウス由来筋幹細胞の抽出
１．Ｃ５７／ＢＬマウス（以下、特記のない限りＣ５７／ＢＬマウスとする）の後肢筋組織ブロックを採取し、細断して組織スラリーを形成し、１０ｍＬのコラゲナーゼタイプＩＩ（７５０Ｕ／ｍＬ）を加え、恒温シェーカーに入れ、３７℃で６０分間インキュベートし、シェーカーの速度は、７０ｒｐｍである。
（一）マウス由来筋幹細胞の抽出
１．Ｃ５７／ＢＬマウス（以下、特記のない限りＣ５７／ＢＬマウスとする）の後肢筋組織ブロックを採取し、細断して組織スラリーを形成し、１０ｍＬのコラゲナーゼタイプＩＩ（７５０Ｕ／ｍＬ）を加え、恒温シェーカーに入れ、３７℃で６０分間インキュベートし、シェーカーの速度は、７０ｒｐｍである。
【0061】
２．インキュベーション消化の終了後、完全培地（１０％ＦＢＳを含む）で中和し、遠心分離によって上清を吸引した。
３．沈殿した細胞塊に再びＩＩ型コラーゲン（１００Ｕ／ｍＬ）と分散酵素（１．１Ｕ／ｍＬ）の混合消化液１０ｍＬを加え、細胞沈殿を再懸濁した。
３．沈殿した細胞塊に再びＩＩ型コラーゲン（１００Ｕ／ｍＬ）と分散酵素（１．１Ｕ／ｍＬ）の混合消化液１０ｍＬを加え、細胞沈殿を再懸濁した。
【0062】
４．培養および消化のために細胞懸濁液を再び恒温シェーカーに入れ、インキュベーション条件は３７℃で６０分間、シェーカー速度は７０ｒｐｍであった。
５．インキュベーション後、中和液を加えて消化を停止し、得られた液を５分間遠心分離し、上清を吸引して細胞ペレットを得た。
５．インキュベーション後、中和液を加えて消化を停止し、得られた液を５分間遠心分離し、上清を吸引して細胞ペレットを得た。
【0063】
６．細胞ペレットを再懸濁し、マウス筋肉サテライト細胞分離キットで磁気ビーズで標識されたモノクローナル抗体混合物を３０分間インキュベートし、非標的細胞は抗体に直接結合し、中和溶液で洗浄し、磁気ビーズによってネガティブソーティングされた。
７．磁気ビーズを選別した後、完全細胞培地（８０％Ｆ１２培地、２０％ウシ胎児血清、１％Ｐ／Ｓ、１００ｎｇ／ｍＬＴＮＦ－α、１００ｎｇ／ｍＬＩＦＮ－γ、５０ｎｇ／ｍＬＩＬ－１α、５０ｎｇ／ｍＬＩＬ－１３）を添加した。あらかじめコラーゲンをコーティングした培養皿に移し、インキュベーターに入れて培養した。
７．磁気ビーズを選別した後、完全細胞培地（８０％Ｆ１２培地、２０％ウシ胎児血清、１％Ｐ／Ｓ、１００ｎｇ／ｍＬＴＮＦ－α、１００ｎｇ／ｍＬＩＦＮ－γ、５０ｎｇ／ｍＬＩＬ－１α、５０ｎｇ／ｍＬＩＬ－１３）を添加した。あらかじめコラーゲンをコーティングした培養皿に移し、インキュベーターに入れて培養した。
【0064】
（二）マウス筋幹細胞の増殖と同定
１．細胞が７０％のコンフルエンスまで増殖したら、それらを消化して継代し、細胞を新しい細胞外マトリックス（ＥＣＭ）でコーティングされた皿に培養した。
２．マウス筋幹細胞は、フロースルー抗体ＣＤ３１－－ＰＥ、ＣＤ３４－－ＰＥ、ＣＤ４５－－ＰＥ、Ｖｃａｍ１＋－ＢＶ４２１およびＩｎｔｅｒｇｒｉｎ－α７＋－ＢＶ４２１で染色することにより同定された。
１．細胞が７０％のコンフルエンスまで増殖したら、それらを消化して継代し、細胞を新しい細胞外マトリックス（ＥＣＭ）でコーティングされた皿に培養した。
２．マウス筋幹細胞は、フロースルー抗体ＣＤ３１－－ＰＥ、ＣＤ３４－－ＰＥ、ＣＤ４５－－ＰＥ、Ｖｃａｍ１＋－ＢＶ４２１およびＩｎｔｅｒｇｒｉｎ－α７＋－ＢＶ４２１で染色することにより同定された。
【0065】
（三）マウス筋幹細胞の分化
１．細胞が完全にコンフルエントになるまで、コラーゲンコート培養プレートで筋幹細胞を培養した。
２．細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で３回洗浄した後、筋幹細胞分化培地（ＤＭＥＭ培地＋２％ウマ血清）に切り替えて培養を継続した。分化培養の初日、細胞は伸長し始め、細胞間で融合した。２～３日目に細胞融合がピークに達し、ほとんどの細胞が筋管への分化過程を完了した。この時点で、ヒト筋幹細胞特異的分化成熟タンパク質サルコプラスミン重鎖（ＭｙＨＣ）の免疫蛍光染色を行って、分離された細胞が幹細胞の分化特性を有することを決定するための実験を特定した。結果を図１に示す。
１．細胞が完全にコンフルエントになるまで、コラーゲンコート培養プレートで筋幹細胞を培養した。
２．細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で３回洗浄した後、筋幹細胞分化培地（ＤＭＥＭ培地＋２％ウマ血清）に切り替えて培養を継続した。分化培養の初日、細胞は伸長し始め、細胞間で融合した。２～３日目に細胞融合がピークに達し、ほとんどの細胞が筋管への分化過程を完了した。この時点で、ヒト筋幹細胞特異的分化成熟タンパク質サルコプラスミン重鎖（ＭｙＨＣ）の免疫蛍光染色を行って、分離された細胞が幹細胞の分化特性を有することを決定するための実験を特定した。結果を図１に示す。
【0066】
図１：分離された細胞は、筋幹細胞マーカーＰＡＸ７の高発現を示す。分離された細胞は、内皮細胞マーカーＣＤ３１が陰性の細胞、造血母細胞マーカーＣＤ３４が陰性の細胞、白血球マーカーＣＤ４５が陰性の細胞である。また、当該細胞は上皮成長因子受容体Ｖｃａｍ １（ＣＤ 10１０６）とＩｎｔｅｒｇｒｉｎ－α７を９０％まで高発現した。したがって、当該分離された細胞は、ＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、Ｖｃａｍ １＋およびＩｎｔｅｒｇｒｉｎ－α７＋筋幹細胞である。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養および増殖された筋幹細胞は、幹細胞表面マーカーおよび核特異的因子ＰＡＸ７の発現を十分に維持でき、成熟した機能的な筋線維構造に分化でき、前記系で培養された筋幹細胞は、優れた幹細胞性と筋線維生成能を有することが示された。
【0067】
実施例２マウスにおける高脂肪食誘発インスリン抵抗性モデルとマウス筋幹細胞の移植
マウスモデルの構築
４週齢のオスのＣ５７／ＢＬマウスを無作為に群分けし、１０％Ｋａｌ脂肪を含む通常食と６０％Ｋａｌ脂肪を含む高脂肪食をそれぞれ与えた。マウスの体重を毎日記録し、体重変化曲線を作成した。モデリングの２～３か月後、体重約４０グラムのマウスが実験用に選択された。高脂肪食を与えられたマウスは、肥満によるインスリン抵抗性を発症し、２型糖尿病のモデルとして役立つ。
マウスモデルの構築
４週齢のオスのＣ５７／ＢＬマウスを無作為に群分けし、１０％Ｋａｌ脂肪を含む通常食と６０％Ｋａｌ脂肪を含む高脂肪食をそれぞれ与えた。マウスの体重を毎日記録し、体重変化曲線を作成した。モデリングの２～３か月後、体重約４０グラムのマウスが実験用に選択された。高脂肪食を与えられたマウスは、肥満によるインスリン抵抗性を発症し、２型糖尿病のモデルとして役立つ。
【0068】
（二）マウス由来筋幹細胞の生体内移植
１．モデルが構築された後、マウスは実験群に分け、それらを対照群（通常食群）、モデル群（高脂肪食群）、治療群（高脂肪食マウスにマウス筋幹細胞を注射した群）に分け、全部で３群である。すぐに実験を行うことができる。
２．対照群とモデル群には尾静脈注射により毎週無菌ＰＢＳを注射し、注射システムは２００μＬとした。治療群にはマウス筋幹細胞を注射し、注射量はマウス１匹あたり１～５×１０５細胞、注射システムは２００μＬとした。注射周期は週１回、合計６回注射する。
１．モデルが構築された後、マウスは実験群に分け、それらを対照群（通常食群）、モデル群（高脂肪食群）、治療群（高脂肪食マウスにマウス筋幹細胞を注射した群）に分け、全部で３群である。すぐに実験を行うことができる。
２．対照群とモデル群には尾静脈注射により毎週無菌ＰＢＳを注射し、注射システムは２００μＬとした。治療群にはマウス筋幹細胞を注射し、注射量はマウス１匹あたり１～５×１０５細胞、注射システムは２００μＬとした。注射周期は週１回、合計６回注射する。
【0069】
結果を図２に示す。
図２：高脂肪食を与えられたマウスは、通常の食事を与えられたマウスよりも大幅に体重が増えた。１２週間のモデリングの後、モデルグループと治療群の高脂肪食マウスの体重は４０グラムに達し、継続的な高脂肪食により、マウスの体重はさらに増加した。通常食の対照群のマウスの平均体重は８週間で２５ｇであり、さらに給餌すると体重は３５ｇに増加し、その後体重プラトーに入った。モデル群と比較して、治療群のマウスの体重は、マウスへの筋幹細胞（すなわちＭｕＳＣ）の介入後に大幅に減少した。
図２：高脂肪食を与えられたマウスは、通常の食事を与えられたマウスよりも大幅に体重が増えた。１２週間のモデリングの後、モデルグループと治療群の高脂肪食マウスの体重は４０グラムに達し、継続的な高脂肪食により、マウスの体重はさらに増加した。通常食の対照群のマウスの平均体重は８週間で２５ｇであり、さらに給餌すると体重は３５ｇに増加し、その後体重プラトーに入った。モデル群と比較して、治療群のマウスの体重は、マウスへの筋幹細胞（すなわちＭｕＳＣ）の介入後に大幅に減少した。
【0070】
実施例３ マウス由来筋幹細胞の糖代謝調節効果
耐糖能（ＧＴＴ）の検出
１．検出の１５時間前に、実施例２のモデルマウスを絶食および水で処置した。
２．マウスの空腹時血糖は、バイヌオ血糖測定器と血糖テストストリップを使用して検出され、Ｇ０と記録した。
耐糖能（ＧＴＴ）の検出
１．検出の１５時間前に、実施例２のモデルマウスを絶食および水で処置した。
２．マウスの空腹時血糖は、バイヌオ血糖測定器と血糖テストストリップを使用して検出され、Ｇ０と記録した。
【0071】
３．マウスにブドウ糖を腹腔内注射し、注射量は１ｇ／ｇマウスであった。注入直後、直ちにこの時点をＴ０と記録した。
マウスの血糖は、それぞれ１５分後（Ｔ１５）、３０分後（Ｔ３０）、４５分後（Ｔ４５）、６０分後（Ｔ６０）、１２０分後（Ｔ１２０）に再度測定し、それぞれＧ１５、Ｇ３０、Ｇ４５、Ｇ６０、Ｇ１２０と記録した。
マウスの血糖は、それぞれ１５分後（Ｔ１５）、３０分後（Ｔ３０）、４５分後（Ｔ４５）、６０分後（Ｔ６０）、１２０分後（Ｔ１２０）に再度測定し、それぞれＧ１５、Ｇ３０、Ｇ４５、Ｇ６０、Ｇ１２０と記録した。
【0072】
（二）インスリン抵抗性（ＩＴＴ）の検査
１． Ｂａｉｎｕｏ血糖計と血糖テストストリップを使用して、マウスの空腹時血糖を検出し、Ｇ０と記録した。
２．マウスには短時間作用型インスリンを腹腔内注射し、注射量は０．１Ｕ／ｇマウスとした。注入直後、直ちにこの時点をＴ０と記録した。
１． Ｂａｉｎｕｏ血糖計と血糖テストストリップを使用して、マウスの空腹時血糖を検出し、Ｇ０と記録した。
２．マウスには短時間作用型インスリンを腹腔内注射し、注射量は０．１Ｕ／ｇマウスとした。注入直後、直ちにこの時点をＴ０と記録した。
【0073】
３．マウスの血糖は、それぞれ１５分後（Ｔ１５）、３０分後（Ｔ３０）、４５分後（Ｔ４５）、６０分後（Ｔ６０）、１２０分後（Ｔ１２０）に再度測定し、それぞれＧ１５、Ｇ３０、Ｇ４５、Ｇ６０、Ｇ１２０と記録した。
マウスのブドウ糖低下能力は、マウスのブドウ糖代謝レベルを評価するために、耐糖能およびインスリン抵抗性実験によって検出された。
マウスのブドウ糖低下能力は、マウスのブドウ糖代謝レベルを評価するために、耐糖能およびインスリン抵抗性実験によって検出された。
【0074】
結果を図３に示す。
図３：マウス由来の筋幹細胞の尾静脈注射は、高脂肪食を与えられたマウスの空腹時血糖を大幅に低下させることができる。ブドウ糖溶液の腹腔内注射後、モデル群のマウスの血糖値は急速に上昇し、長時間ずっと高い血糖値を維持した。しかし、対照群と治療群のマウスの血糖値はゆっくりと上昇し、急速に正常値まで低下した。体の自己代謝により、治療群のマウスの血糖降下率はモデル群よりも有意に高く、治療群のマウスがより優れた血糖降下能力を持っていることを示す。マウスに短時間作用型インスリンを注射した後、対照群と治療群のマウスの血糖値は急速に低下し、治療群のマウスは、モデル群のマウスよりもインスリンに対する感受性が高く、インスリンの血糖降下作用に迅速に反応できることを示す。要約すると、ヒト由来の筋幹細胞は、マウスのブドウ糖代謝の改善に優れた効果を発揮する。
図３：マウス由来の筋幹細胞の尾静脈注射は、高脂肪食を与えられたマウスの空腹時血糖を大幅に低下させることができる。ブドウ糖溶液の腹腔内注射後、モデル群のマウスの血糖値は急速に上昇し、長時間ずっと高い血糖値を維持した。しかし、対照群と治療群のマウスの血糖値はゆっくりと上昇し、急速に正常値まで低下した。体の自己代謝により、治療群のマウスの血糖降下率はモデル群よりも有意に高く、治療群のマウスがより優れた血糖降下能力を持っていることを示す。マウスに短時間作用型インスリンを注射した後、対照群と治療群のマウスの血糖値は急速に低下し、治療群のマウスは、モデル群のマウスよりもインスリンに対する感受性が高く、インスリンの血糖降下作用に迅速に反応できることを示す。要約すると、ヒト由来の筋幹細胞は、マウスのブドウ糖代謝の改善に優れた効果を発揮する。
【0075】
実施例４脂質代謝に対するマウス由来筋幹細胞の調節効果
脂肪組織重量測定
実施例２のモデルマウスの各群の皮下脂肪組織を分離し、体重を測定し、各群の脂肪組織の重量を比較する。
肝臓組織重量測定
肥満が原因の２型糖尿病体では、肝組織に脂肪浸潤が合併し、脂肪肝となる。マウスの肝臓組織を取り出し、重量を量り、試験し、各群の肝臓組織の重量を比較する。
脂肪組織重量測定
実施例２のモデルマウスの各群の皮下脂肪組織を分離し、体重を測定し、各群の脂肪組織の重量を比較する。
肝臓組織重量測定
肥満が原因の２型糖尿病体では、肝組織に脂肪浸潤が合併し、脂肪肝となる。マウスの肝臓組織を取り出し、重量を量り、試験し、各群の肝臓組織の重量を比較する。
【0076】
（三）マウス代謝物検出
１．マウスの末梢血を採取し、３０分静置後、遠心分離を行い、遠心条件を３００ｇで３０分間とした。
２．総コレステロール検出キットを使用して、マウスの総コレステロール含有量の一般的な状況を検出した。
１．マウスの末梢血を採取し、３０分静置後、遠心分離を行い、遠心条件を３００ｇで３０分間とした。
２．総コレステロール検出キットを使用して、マウスの総コレステロール含有量の一般的な状況を検出した。
【0077】
結果を図４に示す。
図４：マウス由来の筋幹細胞は、治療群のマウスの皮下脂肪含有量と肝臓組織重量を大幅に減らすことができる。それだけでなく、末梢血では、ヒト由来の筋幹細胞が総コレステロールの量を減らすことができる。したがって、マウス由来の筋幹細胞は、マウスの脂質代謝と血中脂質代謝を改善することができる。
図４：マウス由来の筋幹細胞は、治療群のマウスの皮下脂肪含有量と肝臓組織重量を大幅に減らすことができる。それだけでなく、末梢血では、ヒト由来の筋幹細胞が総コレステロールの量を減らすことができる。したがって、マウス由来の筋幹細胞は、マウスの脂質代謝と血中脂質代謝を改善することができる。
【0078】
実施例５ ヒト由来筋幹細胞の抽出、増幅、同定および分化
（一）ヒト由来筋幹細胞の抽出
１．病院からヒト由来の筋組織ブロックを入手し、細かく切り分けて組織原液とし、５０ｍＬ遠心管に入れる。
２．１０ｍＬのＩＩ型コラゲナーゼ（７５０Ｕ／ｍＬ）を元の組織スラリーに加え、恒温シェーカーに入れ、３７℃で６０分間インキュベートする。シェーカーの速度は７０ｒｐｍである。
（一）ヒト由来筋幹細胞の抽出
１．病院からヒト由来の筋組織ブロックを入手し、細かく切り分けて組織原液とし、５０ｍＬ遠心管に入れる。
２．１０ｍＬのＩＩ型コラゲナーゼ（７５０Ｕ／ｍＬ）を元の組織スラリーに加え、恒温シェーカーに入れ、３７℃で６０分間インキュベートする。シェーカーの速度は７０ｒｐｍである。
【0079】
３．インキュベーションと消化の後、完全培地（１０％ＦＢＳを含む）を使用して中和し、遠心分離して上清を除去する。
４．沈殿した細胞ペレットにコラゲナーゼタイプＩＩ（１００Ｕ／ｍＬ）とディスパーゼ（１．１Ｕ／ｍＬ）の混合消化液１０ｍＬを再度加え、細胞ペレットを再懸濁する。
５．細胞懸濁液を再び定温シェーカーに入れ、インキュベートおよび消化し、インキュベーション条件は、３７℃で６０分間であり、シェーカー速度は７０ｒｐｍである。
４．沈殿した細胞ペレットにコラゲナーゼタイプＩＩ（１００Ｕ／ｍＬ）とディスパーゼ（１．１Ｕ／ｍＬ）の混合消化液１０ｍＬを再度加え、細胞ペレットを再懸濁する。
５．細胞懸濁液を再び定温シェーカーに入れ、インキュベートおよび消化し、インキュベーション条件は、３７℃で６０分間であり、シェーカー速度は７０ｒｐｍである。
【0080】
６．インキュベーション後、中和用の完全培地１０ｍＬを加え、４０μｍの細胞メッシュでろ過する。
７．濾過後、得られた液を５００ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引して細胞ペレットを得た。
８．細胞ペレットを６００μＬの完全培地で再懸濁し、フローソーティングを実行した。
７．濾過後、得られた液を５００ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引して細胞ペレットを得た。
８．細胞ペレットを６００μＬの完全培地で再懸濁し、フローソーティングを実行した。
【0081】
９．コントロールとして１９０μＬの完全培地を含むフロー チューブに１０μＬの細胞懸濁液をピペットで移した。
１０．残りの細胞懸濁液をフローソーティング抗体で染色し、標識抗体は、ＣＤ３１－ＰＥ、ＣＤ３４－ＰＥ、ＣＤ４５－ＰＥ、ＣＤ２９－ＡＰＣ、およびＥＧＦＲ－ＢＶ４２１で３０分間染色した。染色が完了した後、完全培地を洗浄して遠心分離し、最終的に細胞を完全培地２００μＬに再懸濁した。
１１． マシンでストリーミングソートを実行した。
１０．残りの細胞懸濁液をフローソーティング抗体で染色し、標識抗体は、ＣＤ３１－ＰＥ、ＣＤ３４－ＰＥ、ＣＤ４５－ＰＥ、ＣＤ２９－ＡＰＣ、およびＥＧＦＲ－ＢＶ４２１で３０分間染色した。染色が完了した後、完全培地を洗浄して遠心分離し、最終的に細胞を完全培地２００μＬに再懸濁した。
１１． マシンでストリーミングソートを実行した。
【0082】
（二）ヒト筋幹細胞の増殖と培養
１．すべての細胞懸濁液を選別した後、２５０ｇで５分間遠心分離し、洗浄液から上清を取り除き、筋幹細胞増殖培地（２０％ＦＢＳ、４０％ＤＭＥＭ／ＬＯＷ、４０％ＭＣＤＢ１３１．１％Ｐ／Ｓ、１％インスリン トランスフェリンセレン（ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｓｅｌｅｎｉｕｍ）を添加し、１０μＭＰ３８阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で再懸濁した後、培養拡大のために細胞外マトリックスでコーティングされた培養皿（Ｅｘｔｒａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭで２４時間コーティング）に移した。
１．すべての細胞懸濁液を選別した後、２５０ｇで５分間遠心分離し、洗浄液から上清を取り除き、筋幹細胞増殖培地（２０％ＦＢＳ、４０％ＤＭＥＭ／ＬＯＷ、４０％ＭＣＤＢ１３１．１％Ｐ／Ｓ、１％インスリン トランスフェリンセレン（ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｓｅｌｅｎｉｕｍ）を添加し、１０μＭＰ３８阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で再懸濁した後、培養拡大のために細胞外マトリックスでコーティングされた培養皿（Ｅｘｔｒａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭで２４時間コーティング）に移した。
【0083】
２．細胞コンフルエンスが ６０～７０％に達するまで、２日ごとに新鮮な培地を交換する。
３．トリプシンを使用して筋幹細胞を継代し、子孫細胞を新しいＥＣＭでコーティングされた培養皿に植えて、培養の拡大を続ける。
３．トリプシンを使用して筋幹細胞を継代し、子孫細胞を新しいＥＣＭでコーティングされた培養皿に植えて、培養の拡大を続ける。
【0084】
（三）ヒト筋幹細胞の同定
１．細胞を７０％コンフルエンスまで増殖させ、トリプシン消化により目的の細胞を得ることができた。
２．ヒト筋幹細胞の表面に発現するマーカータンパク質をフローサイトメトリーで同定し、ヒト筋幹細胞の特異的核因子ＰＡＸ７をフローサイトメトリーで同定した。
ヒト由来筋幹細胞の凍結保存、（二）増殖させた筋幹細胞は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結液中、液体窒素中で長期保存が可能である。
１．細胞を７０％コンフルエンスまで増殖させ、トリプシン消化により目的の細胞を得ることができた。
２．ヒト筋幹細胞の表面に発現するマーカータンパク質をフローサイトメトリーで同定し、ヒト筋幹細胞の特異的核因子ＰＡＸ７をフローサイトメトリーで同定した。
ヒト由来筋幹細胞の凍結保存、（二）増殖させた筋幹細胞は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結液中、液体窒素中で長期保存が可能である。
【0085】
（四）ヒト由来筋幹細胞の筋分化能力の同定
１．筋幹細胞は、細胞が完全にコンフルエントになるまで、コラーゲンでコーティングされたプレートで培養された。
２．細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で３回洗浄した後、筋幹細胞分化培地（ＤＭＥＭ培地＋２％ウマ血清）に切り替えて培養を継続した。分化培養の初日、細胞は伸長し始め、細胞間で融合した。２～３日目に細胞融合がピークに達し、ほとんどの細胞が筋管への分化過程を完了した。この時点で、ヒト筋幹細胞特異的分化成熟タンパク質サルコプラスミン重鎖（ＭｙＨＣ）の免疫蛍光染色を行って、分離された細胞が幹細胞の分化特性を有することを決定するための実験を特定した。
１．筋幹細胞は、細胞が完全にコンフルエントになるまで、コラーゲンでコーティングされたプレートで培養された。
２．細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で３回洗浄した後、筋幹細胞分化培地（ＤＭＥＭ培地＋２％ウマ血清）に切り替えて培養を継続した。分化培養の初日、細胞は伸長し始め、細胞間で融合した。２～３日目に細胞融合がピークに達し、ほとんどの細胞が筋管への分化過程を完了した。この時点で、ヒト筋幹細胞特異的分化成熟タンパク質サルコプラスミン重鎖（ＭｙＨＣ）の免疫蛍光染色を行って、分離された細胞が幹細胞の分化特性を有することを決定するための実験を特定した。
【0086】
結果を図５に示す。
図５：本発明の分離された細胞は、筋幹細胞マーカーＰＡＸ７を高発現した。分離された細胞は、内皮細胞マーカーＣＤ３１が陰性の細胞、造血母細胞マーカーＣＤ３４が陰性の細胞、白血球マーカーＣＤ４５が陰性の細胞である。当該分離された細胞は、幹細胞マーカー ＣＤ２９を高発現し、発現率は１００％である。また、細胞は上皮成長因子受容体ＥＧＦＲを９０％まで高発現した。したがって、当該分離された細胞は、ＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、ＣＤ２９＋、ＥＧＦＲ＋、およびＰＡＸ７＋筋幹細胞である。ｉｎｖｉｔｒｏで培養および増殖された筋幹細胞は、幹細胞表面マーカーおよび核特異的因子ＰＡＸ７の発現を十分に維持でき、成熟した機能的な筋線維構造に分化でき、前記系で培養された筋幹細胞は、優れた幹細胞性と筋線維生成能を有することが示された。
図５：本発明の分離された細胞は、筋幹細胞マーカーＰＡＸ７を高発現した。分離された細胞は、内皮細胞マーカーＣＤ３１が陰性の細胞、造血母細胞マーカーＣＤ３４が陰性の細胞、白血球マーカーＣＤ４５が陰性の細胞である。当該分離された細胞は、幹細胞マーカー ＣＤ２９を高発現し、発現率は１００％である。また、細胞は上皮成長因子受容体ＥＧＦＲを９０％まで高発現した。したがって、当該分離された細胞は、ＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、ＣＤ２９＋、ＥＧＦＲ＋、およびＰＡＸ７＋筋幹細胞である。ｉｎｖｉｔｒｏで培養および増殖された筋幹細胞は、幹細胞表面マーカーおよび核特異的因子ＰＡＸ７の発現を十分に維持でき、成熟した機能的な筋線維構造に分化でき、前記系で培養された筋幹細胞は、優れた幹細胞性と筋線維生成能を有することが示された。
【0087】
実施例６高脂肪食誘発インスリン抵抗性モデルとヒト筋幹細胞移植
マウスモデルの構築
４週齢のオスの Ｃ５７／ＢＬマウスを無作為に群分けし、１０％Ｋａｌ 脂肪を含む通常食と６０％Ｋａｌ脂肪を含む高脂肪食をそれぞれ与えた。マウスの体重を毎日記録し、体重変化曲線を作成した。モデリングの ２～３か月後、体重約４０グラムのマウスが実験用に選択され、各マウスの体重を連続的に記録した。高脂肪食を与えられたマウスは、肥満によるインスリン抵抗性を発症し、２型糖尿病のモデルとして役立つ。
マウスモデルの構築
４週齢のオスの Ｃ５７／ＢＬマウスを無作為に群分けし、１０％Ｋａｌ 脂肪を含む通常食と６０％Ｋａｌ脂肪を含む高脂肪食をそれぞれ与えた。マウスの体重を毎日記録し、体重変化曲線を作成した。モデリングの ２～３か月後、体重約４０グラムのマウスが実験用に選択され、各マウスの体重を連続的に記録した。高脂肪食を与えられたマウスは、肥満によるインスリン抵抗性を発症し、２型糖尿病のモデルとして役立つ。
【0088】
（二）ヒト筋幹細胞の生体内移植
１．モデルが構築された後、マウスは実験群に分け、それらを対照群（通常食群）、モデル群（高脂肪食群）、治療群（高脂肪食マウスにマウス筋幹細胞を注射した群）に分け、全部で３群である。
２．対照群とモデル群には尾静脈注射により毎週無菌ＰＢＳを注射し、注射システムは２００μＬとした。治療群にはマウス筋幹細胞（Ｈｕｍａｎ ＭｕＳＣ，即ちＨｕＳＣ）を注射し、注射量はマウス１匹あたり１～５×１０５細胞、注射システムは２００μＬとした。注射周期は週１回、合計６回注射する。
１．モデルが構築された後、マウスは実験群に分け、それらを対照群（通常食群）、モデル群（高脂肪食群）、治療群（高脂肪食マウスにマウス筋幹細胞を注射した群）に分け、全部で３群である。
２．対照群とモデル群には尾静脈注射により毎週無菌ＰＢＳを注射し、注射システムは２００μＬとした。治療群にはマウス筋幹細胞（Ｈｕｍａｎ ＭｕＳＣ，即ちＨｕＳＣ）を注射し、注射量はマウス１匹あたり１～５×１０５細胞、注射システムは２００μＬとした。注射周期は週１回、合計６回注射する。
【0089】
結果を図６に示す。
図６：モデル群と高脂肪食の治療群のマウスの体重増加率は、通常食の対照群のマウスよりも有意に高かった。そして、８週間のモデリングの後、モデル群と治療群の高脂肪食マウスは約４０グラムの体重に達し、継続的な高脂肪食により、マウスの体重は増加し続けた。通常の食事を与えられた対照群のマウスは、８週間後に平均体重が２５グラムになり、さらに給餌すると、体重は３５グラムに増加し、体重のプラトーに入った。
図６：モデル群と高脂肪食の治療群のマウスの体重増加率は、通常食の対照群のマウスよりも有意に高かった。そして、８週間のモデリングの後、モデル群と治療群の高脂肪食マウスは約４０グラムの体重に達し、継続的な高脂肪食により、マウスの体重は増加し続けた。通常の食事を与えられた対照群のマウスは、８週間後に平均体重が２５グラムになり、さらに給餌すると、体重は３５グラムに増加し、体重のプラトーに入った。
【0090】
実施例７ マウスのブドウ糖代謝におけるヒト由来筋幹細胞の改善
（一）耐糖能（ＧＴＴ）の検出
１．検出の１５時間前に、実施例6のモデルマウスを絶食および水で処置した。
２．マウスの空腹時血糖は、バイヌオ血糖測定器と血糖テストストリップを使用して検出され、Ｇ０と記録した。
（一）耐糖能（ＧＴＴ）の検出
１．検出の１５時間前に、実施例6のモデルマウスを絶食および水で処置した。
２．マウスの空腹時血糖は、バイヌオ血糖測定器と血糖テストストリップを使用して検出され、Ｇ０と記録した。
【0091】
３．マウスにブドウ糖を腹腔内注射し、注射量は１ｇ／ｇマウスであった。注入直後、直ちにこの時点をＴ０と記録した。
４．マウスの血糖は、それぞれ１５分後（Ｔ１５）、３０分後（Ｔ３０）、４５分後（Ｔ４５）、６０分後（Ｔ６０）、１２０分後（Ｔ１２０）に再度測定し、それぞれＧ１５、Ｇ３０、Ｇ４５、Ｇ６０、Ｇ１２０と記録した。
４．マウスの血糖は、それぞれ１５分後（Ｔ１５）、３０分後（Ｔ３０）、４５分後（Ｔ４５）、６０分後（Ｔ６０）、１２０分後（Ｔ１２０）に再度測定し、それぞれＧ１５、Ｇ３０、Ｇ４５、Ｇ６０、Ｇ１２０と記録した。
【0092】
（二）インスリン抵抗性（ＩＴＴ）の検査
１．マウスの空腹時血糖は、バイヌオ血糖測定器と血糖テストストリップを使用して検出され、Ｇ０と記録した。
２．マウスにブドウ糖を腹腔内注射し、注射量は0.1ｇ／ｇマウスであった。注入直後、直ちにこの時点をＴ０と記録した。
３．マウスの血糖は、それぞれ１５分後（Ｔ１５）、３０分後（Ｔ３０）、４５分後（Ｔ４５）、６０分後（Ｔ６０）、１２０分後（Ｔ１２０）に再度測定し、それぞれＧ１５、Ｇ３０、Ｇ４５、Ｇ６０、Ｇ１２０と記録した。
１．マウスの空腹時血糖は、バイヌオ血糖測定器と血糖テストストリップを使用して検出され、Ｇ０と記録した。
２．マウスにブドウ糖を腹腔内注射し、注射量は0.1ｇ／ｇマウスであった。注入直後、直ちにこの時点をＴ０と記録した。
３．マウスの血糖は、それぞれ１５分後（Ｔ１５）、３０分後（Ｔ３０）、４５分後（Ｔ４５）、６０分後（Ｔ６０）、１２０分後（Ｔ１２０）に再度測定し、それぞれＧ１５、Ｇ３０、Ｇ４５、Ｇ６０、Ｇ１２０と記録した。
【0093】
（三）マウス血清中の代謝物検出
１．マウスの血液を採取し、３０分間静置後、遠心分離を行い、遠心条件を３００ｇ、３０分間とし、上澄み血清を採取して予備した。
２．ＥＬＩＳＡキットを使用して、マウスの末梢血血清中のインスリンと総コレステロールの含有量を検出した。
以上の数値に基づいて分析比較を行った結果を図７に示す。
１．マウスの血液を採取し、３０分間静置後、遠心分離を行い、遠心条件を３００ｇ、３０分間とし、上澄み血清を採取して予備した。
２．ＥＬＩＳＡキットを使用して、マウスの末梢血血清中のインスリンと総コレステロールの含有量を検出した。
以上の数値に基づいて分析比較を行った結果を図７に示す。
【0094】
図７：高脂肪食を与えられたマウスの空腹時血糖を大幅に低下させることができる。ブドウ糖溶液の腹腔内注射後、マウスの血糖値はすべて上昇した。体の自己代謝により、治療群のマウスの血糖降下率はモデル群よりも有意に高く、治療群のマウスがより優れた血糖降下能力を持っていることを示す。マウスに短時間作用型インスリンを注射した後、対照群と治療群のマウスの血糖値は急速に低下し、ゆっくりと回復し、２つの群は基本的に同じでした。しかし、モデル群のマウスの血糖値はゆっくりと減少し、その後急速に上昇し、治療群のマウスは、モデル群のマウスよりもインスリンに対する感受性が高く、インスリンの血糖降下作用に迅速に反応でき、インスリンに対する処置マウスの感受性は、対照マウスの感受性と類似することを示す。それだけでなく、末梢血では、ヒト由来の筋幹細胞がインスリン含有量を増加させることができる。
【0095】
このようにヒト由来の筋幹細胞は、マウスの糖代謝を改善するよい効果がある。
末梢血内では、治療群の総コレステロール値は予モデル群に比べて著しく低下しており、ヒト由来筋干細胞が血脂代謝に一定の調節机能を持っていることがわかった。
末梢血内では、治療群の総コレステロール値は予モデル群に比べて著しく低下しており、ヒト由来筋干細胞が血脂代謝に一定の調節机能を持っていることがわかった。
【0096】
実施例８ マウス脂肪組織恒常性の検出
（一）脂肪組織重量の比較
実施例６で構築したモデルマウスの重量を測定し、皮下白色脂肪組織の重量と腹部白色脂肪組織の重量をそれぞれ測定した。計量値に応じて計算・分析する。
（一）脂肪組織重量の比較
実施例６で構築したモデルマウスの重量を測定し、皮下白色脂肪組織の重量と腹部白色脂肪組織の重量をそれぞれ測定した。計量値に応じて計算・分析する。
【0097】
（二）脂肪細胞の肥大度比較
１．麻酔によりマウスを屠殺し、腹部脂肪組織を採取し、組織を４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）に浸して固定し、固定時間は、２４時間以上とした。
２．脂肪組織を脱水し、パラフィン包埋し、パラフィンで厚さ３μｍに薄切した。
１．麻酔によりマウスを屠殺し、腹部脂肪組織を採取し、組織を４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）に浸して固定し、固定時間は、２４時間以上とした。
２．脂肪組織を脱水し、パラフィン包埋し、パラフィンで厚さ３μｍに薄切した。
【0098】
３．パラフィン切片をＨＥ染色し、ガムで封をして顕微鏡で観察し、写真撮影した。
４．Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏソフトウェアを使用して写真を分析した。
４．Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏソフトウェアを使用して写真を分析した。
【0099】
（三）褐色脂肪遺伝子と白色脂肪遺伝子の発現変化
１．マウスの腹膜組織を採取し、豆の大きさをとり、ＥＰチューブに入れ、Ｔｒｉｚｏｌを加えた。
２．組織ホモジナイザーを使用して組織ブロックを粉砕し、粉砕が完了したら、ＥＰチューブを直接－８０℃の冷蔵庫に入れ、凍結した。
１．マウスの腹膜組織を採取し、豆の大きさをとり、ＥＰチューブに入れ、Ｔｒｉｚｏｌを加えた。
２．組織ホモジナイザーを使用して組織ブロックを粉砕し、粉砕が完了したら、ＥＰチューブを直接－８０℃の冷蔵庫に入れ、凍結した。
【0100】
３．凍結保存したＥＰチューブを取り出し、上部の白色脂肪塊をかき取り、トリゾールを解凍後、サンプル中のＲＮＡを抽出した。
４．回収したＲＮＡは逆転写キットを用いて逆転写し、標的遺伝子のＱＰＣＲと比較解析を行った。
４．回収したＲＮＡは逆転写キットを用いて逆転写し、標的遺伝子のＱＰＣＲと比較解析を行った。
【0101】
結果を図８に示す。
図８：モデル群と比較して、治療群のマウスの皮下脂肪重量と副睾丸脂肪重量は有意に減少した。そして、ヒト由来の筋幹細胞は、脂肪組織内の単一の脂肪細胞の面積を大幅に減らすことができた。モデル群と比較して、筋幹細胞治療群では褐色脂肪発現関連遺伝子ｕｃｐ１．ｔｂｘｃ１．ｐｇｃ１αの発現が増加し、白色脂肪発現関連遺伝子のレプチン、ｆａｂｐ４、ｐｐａｒγの発現が減少した。
図８：モデル群と比較して、治療群のマウスの皮下脂肪重量と副睾丸脂肪重量は有意に減少した。そして、ヒト由来の筋幹細胞は、脂肪組織内の単一の脂肪細胞の面積を大幅に減らすことができた。モデル群と比較して、筋幹細胞治療群では褐色脂肪発現関連遺伝子ｕｃｐ１．ｔｂｘｃ１．ｐｇｃ１αの発現が増加し、白色脂肪発現関連遺伝子のレプチン、ｆａｂｐ４、ｐｐａｒγの発現が減少した。
【0102】
実施例９ マウス肝組織の脂肪病変の検出
（一）肝組織の重量および外観の比較
実施例６で構築したモデルマウス肝臓組織の重量をそれぞれ秤量し、各群のマウスの肝臓組織を撮影した。
（一）肝組織の重量および外観の比較
実施例６で構築したモデルマウス肝臓組織の重量をそれぞれ秤量し、各群のマウスの肝臓組織を撮影した。
【0103】
（二）肝臓の組織脂肪浸潤程度の検出
１．マウス肝組織を採取、固定、脱水、パラフィン包埋、パラフィン切片を行う。
２．パラフィン切片をＨＥ染色し、ガムで封をして顕微鏡で観察し、写真撮影した。
１．マウス肝組織を採取、固定、脱水、パラフィン包埋、パラフィン切片を行う。
２．パラフィン切片をＨＥ染色し、ガムで封をして顕微鏡で観察し、写真撮影した。
【0104】
検出結果を図９に示す。
図９：ヒト由来の筋幹細胞の介入後、治療群のマウスの肝臓組織重量が大幅に減少した。また、肝臓組織の写真は、モデル群の肝臓組織が明らかに脂肪であることが示されたが、治療群のマウスの肝臓組織の脂肪組織の程度は改善された。同様に、肝臓切片の染色は、ヒト由来の筋幹細胞が肝臓組織の脂肪浸潤を減らし、脂肪肝病変の程度を減らすことができることを示した。
図９：ヒト由来の筋幹細胞の介入後、治療群のマウスの肝臓組織重量が大幅に減少した。また、肝臓組織の写真は、モデル群の肝臓組織が明らかに脂肪であることが示されたが、治療群のマウスの肝臓組織の脂肪組織の程度は改善された。同様に、肝臓切片の染色は、ヒト由来の筋幹細胞が肝臓組織の脂肪浸潤を減らし、脂肪肝病変の程度を減らすことができることを示した。
【0105】
実施例１０ マウス体内の炎症レベルの検出
実施例６で構築したモデルマウスの末梢血を採取し、３０分間静置後遠心し、遠心条件は３００ｇで３０分間とした。遠心分離後、血清を吸引した。血清中のＴＮＦ－αおよびＩＬ－１０の含有量は、ＥＬＩＳＡ試薬の指示に従って検出された。
実施例６で構築したモデルマウスの末梢血を採取し、３０分間静置後遠心し、遠心条件は３００ｇで３０分間とした。遠心分離後、血清を吸引した。血清中のＴＮＦ－αおよびＩＬ－１０の含有量は、ＥＬＩＳＡ試薬の指示に従って検出された。
【0106】
結果を図１０に示す。
図１０：モデル群のマウスの末梢血では、炎症因子であるＴＮＦ－αとＩＬ－１の発現が高かった。筋幹細胞の外因性投与後、ＴＮＦ－αレベルは有意に減少した。しかし、免疫調節機能を持つ抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の場合、ＩＬ－１０の発現レベルは、ヒト筋幹細胞の注入後に有意に増加した。これらの結果は、ヒト由来の筋幹細胞が体内のＴＮＦ－αの発現を低下させ、ＩＬ－１０のレベルを上昇させ、それによって体内の炎症のレベルを低下させることができることを示した。
図１０：モデル群のマウスの末梢血では、炎症因子であるＴＮＦ－αとＩＬ－１の発現が高かった。筋幹細胞の外因性投与後、ＴＮＦ－αレベルは有意に減少した。しかし、免疫調節機能を持つ抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の場合、ＩＬ－１０の発現レベルは、ヒト筋幹細胞の注入後に有意に増加した。これらの結果は、ヒト由来の筋幹細胞が体内のＴＮＦ－αの発現を低下させ、ＩＬ－１０のレベルを上昇させ、それによって体内の炎症のレベルを低下させることができることを示した。
【0107】
実施例１１ 自己筋幹細胞の高血糖症サルに対する血糖調節効果
サル由来筋幹細胞の抽出、増殖および同定
１．自発的の高血糖のサルを取得し、サルを麻酔し、後肢の筋肉組織を取り、組織サイズ１ｃｍ×１ｃｍ×１ｃｍの筋肉組織をフローサイトメトリーで抽出し、サル由来の筋幹細胞を得た。
サル由来筋幹細胞の抽出、増殖および同定
１．自発的の高血糖のサルを取得し、サルを麻酔し、後肢の筋肉組織を取り、組織サイズ１ｃｍ×１ｃｍ×１ｃｍの筋肉組織をフローサイトメトリーで抽出し、サル由来の筋幹細胞を得た。
【0108】
２．抽出した筋幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖、培養、拡大した。
３．増殖細胞を幹細胞表面特性抗体ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ２９、ＥＧＦＲおよび細胞内幹細胞特性タンパク質ＰＡＸ７で染色し、フローサイトメトリーで分析および同定した。
３．増殖細胞を幹細胞表面特性抗体ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ２９、ＥＧＦＲおよび細胞内幹細胞特性タンパク質ＰＡＸ７で染色し、フローサイトメトリーで分析および同定した。
【0109】
（二）サル由来筋幹細胞の自己注入
１．幹細胞製剤の静脈内注入であり、細胞注入用量は、１～５×１０６細胞／Ｋｇ実験サルである。
２．細胞注入後３日ごとに、各サルの空腹時血糖を測定し、各サルの血糖変動を記録した。
３．筋幹細胞注入の頻度は、２週間に１回、合計３～６回注入した。
１．幹細胞製剤の静脈内注入であり、細胞注入用量は、１～５×１０６細胞／Ｋｇ実験サルである。
２．細胞注入後３日ごとに、各サルの空腹時血糖を測定し、各サルの血糖変動を記録した。
３．筋幹細胞注入の頻度は、２週間に１回、合計３～６回注入した。
【0110】
【0111】
図１１：分離されたサル由来筋幹細胞高発現筋幹細胞マーカーＰＡＸ７を示している。分離された細胞は内皮細胞マーカーＣＤ３１陰性の細胞であり、造血幹細胞マーカーＣＤ３４陰性の細胞であり、白血球マーカーＣＤ４５陰性の細胞である。分離された当該細胞は幹細胞マーカーＣＤ２９を高発現し、発現率は１００％であった。そして、この細胞は表皮成長因子受容体ＥＧＦＲを９０％に高発現し、ＣＤ５６の発現率は１００％であった。したがって、分離された細胞はＣＤ３１－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、ＣＤ２９＋、ＥＧＦＲ＋、ＣＤ５６＋及びＰＡＸ７＋の筋幹細胞であり、各試験サルの血糖値を縦方向に比較し、長い間高血糖試験サルを維持し、自家筋幹細胞を注入するたびに空腹血糖を低下させることができた、自発性糖尿病サルに３～６回自家筋幹細胞を連続注入した後、実験サルの空腹血糖値は正常レベルを維持した。筋幹細胞の注入を停止した場合でも、実験サルは長期的に正常な血糖レベルを維持することができる。したがって、サル自家筋幹細胞は体の糖代謝レベルを著しく改善し、自発性高血糖疾患を治療し、長期的な治療効果を維持することができる。
【0112】
実施例１２ 高脂肪食誘発糖尿病マウスに対する同種マウス幹細胞の治療効果
（一）高脂肪食糖尿病マウスモデルの構築とＢａｌｂ／Ｃマウス由来筋幹細胞のｉｎ ｖｉｖｏ移植
１．四週齢のオスのＣ５７／ＢＬマウスをランダムに群分けし、１０％Ｋａｌ脂肪を含む通常食と６０％Ｋａｌ脂肪を含む高脂肪食を与え、マウスの体重を記録して体重変化曲線を作成した。２～３か月のモデリングの後、体重約４０グラムのマウスを群分けと実験のために選択し、各マウスの体重を継続的に記録した。高脂肪食を与えられたマウスは、肥満によるインスリン抵抗性を発生し、ヒトの２型糖尿病モデルを模倣した。
（一）高脂肪食糖尿病マウスモデルの構築とＢａｌｂ／Ｃマウス由来筋幹細胞のｉｎ ｖｉｖｏ移植
１．四週齢のオスのＣ５７／ＢＬマウスをランダムに群分けし、１０％Ｋａｌ脂肪を含む通常食と６０％Ｋａｌ脂肪を含む高脂肪食を与え、マウスの体重を記録して体重変化曲線を作成した。２～３か月のモデリングの後、体重約４０グラムのマウスを群分けと実験のために選択し、各マウスの体重を継続的に記録した。高脂肪食を与えられたマウスは、肥満によるインスリン抵抗性を発生し、ヒトの２型糖尿病モデルを模倣した。
【0113】
２．モデルが構築された後、対照群（通常の食事グループ）、モデル群（高脂肪食グループ）、および治療群（Ｂａｌｂ／Ｃマウス筋幹細胞を注射した高脂肪食マウスグループ）とマウスを３つの群に分けた。ランダムに実験を行うことができる。
３．対照群とモデル群には尾静脈注射により毎週無菌ＰＢＳを注射し、注射システムは２００μＬとした。治療群にはＢａｌｂ／Ｃマウス由来の筋幹細胞を注射し、注射量はマウス１匹あたり１～５×１０５細胞とし、注射システムは２００μＬとした。注射周期は週１回、計６回である。
３．対照群とモデル群には尾静脈注射により毎週無菌ＰＢＳを注射し、注射システムは２００μＬとした。治療群にはＢａｌｂ／Ｃマウス由来の筋幹細胞を注射し、注射量はマウス１匹あたり１～５×１０５細胞とし、注射システムは２００μＬとした。注射周期は週１回、計６回である。
【0114】
（二）耐糖能（ＧＴＴ）の検出
４．検出の１５時間前に、マウスに絶食と水処理を施しました。
５．マウスの空腹時血糖は、バイヌオ血糖測定器と血糖テストストリップを使用して検出され、Ｇ０と記録した。
４．検出の１５時間前に、マウスに絶食と水処理を施しました。
５．マウスの空腹時血糖は、バイヌオ血糖測定器と血糖テストストリップを使用して検出され、Ｇ０と記録した。
【0115】
６．マウスにブドウ糖を腹腔内注射し、注射量はマウス１ｇ／ｇマウスであった。
マウスの血糖は、それぞれ１５分後（Ｔ１５）、３０分後（Ｔ３０）、４５分後（Ｔ４５）、６０分後（Ｔ６０）、１２０分後（Ｔ１２０）に再度測定し、それぞれＧ１５、Ｇ３０、Ｇ４５、Ｇ６０、Ｇ１２０と記録した。
マウスの血糖は、それぞれ１５分後（Ｔ１５）、３０分後（Ｔ３０）、４５分後（Ｔ４５）、６０分後（Ｔ６０）、１２０分後（Ｔ１２０）に再度測定し、それぞれＧ１５、Ｇ３０、Ｇ４５、Ｇ６０、Ｇ１２０と記録した。
【0116】
（三）インスリン抵抗性（ＩＴＴ）の検査
１．マウスの空腹時血糖は、バイヌオ血糖測定器と血糖テストストリップを使用して検出され、Ｇ０と記録した。
２．マウスには短時間作用型インスリンを腹腔内注射し、注射量は０．１Ｕ／ｇマウスとした。注入直後、直ちにこの時点をＴ０と記録した。
１．マウスの空腹時血糖は、バイヌオ血糖測定器と血糖テストストリップを使用して検出され、Ｇ０と記録した。
２．マウスには短時間作用型インスリンを腹腔内注射し、注射量は０．１Ｕ／ｇマウスとした。注入直後、直ちにこの時点をＴ０と記録した。
【0117】
３．マウスの血糖は、それぞれ１５分後（Ｔ１５）、３０分後（Ｔ３０）、４５分後（Ｔ４５）、６０分後（Ｔ６０）、１２０分後（Ｔ１２０）に再度測定し、それぞれＧ１５、Ｇ３０、Ｇ４５、Ｇ６０、Ｇ１２０と記録した。
マウスのブドウ糖低下能力は、マウスのブドウ糖代謝レベルを評価するために、耐糖能およびインスリン耐性実験によって検出された。
マウスのブドウ糖低下能力は、マウスのブドウ糖代謝レベルを評価するために、耐糖能およびインスリン耐性実験によって検出された。
【0118】
（四）脂肪組織重量の測定 脂肪組織重量の測定
マウスの各群の皮下脂肪組織を分離し、重量を測定して検出し、各群の脂肪組織の重量を比較した。
（五）肝組織重量の測定
肥満が原因の２型糖尿病体では、肝組織に脂肪浸潤が伴われて脂肪肝となる。マウスの肝臓組織を取り出し、重量を測定して検出し、各群の肝臓組織の重量を比較した。
マウスの各群の皮下脂肪組織を分離し、重量を測定して検出し、各群の脂肪組織の重量を比較した。
（五）肝組織重量の測定
肥満が原因の２型糖尿病体では、肝組織に脂肪浸潤が伴われて脂肪肝となる。マウスの肝臓組織を取り出し、重量を測定して検出し、各群の肝臓組織の重量を比較した。
【0119】
（六）マウス代謝物の検出
１．マウスの末梢血を採取し、３０分間静置後遠心分離し、遠心条件は３００ｇで３０分間とした。
２．炎症性因子ＩＬ－６およびＩＬ－１βキットを使用して、マウスの炎症レベルを検出した。
その結果を図１２に示す。
１．マウスの末梢血を採取し、３０分間静置後遠心分離し、遠心条件は３００ｇで３０分間とした。
２．炎症性因子ＩＬ－６およびＩＬ－１βキットを使用して、マウスの炎症レベルを検出した。
その結果を図１２に示す。
【0120】
図１２：Ｂａｌｂ／Ｃマウス由来筋幹細胞の尾静脈注射は、高脂肪食を与えられたマウスの体重と空腹時血糖を大幅に低下させることができる。ブドウ糖溶液の腹腔内注射後、マウスの血糖値はすべて上昇した。体の自己代謝により、治療群のマウスの血糖降下率はモデル群よりも有意に高く、治療群のマウスがより優れた血糖降下能力を持っていることを示す。Ｂａｌｂ／Ｃマウス由来の筋幹細胞の介入により、高脂肪食により誘発された高血糖マウスの空腹時血糖が低下し、モデルマウスの糖代謝が亢進した。Ｂａｌｂ／Ｃマウス由来の筋幹細胞は、肥満マウスの皮下脂肪、精巣上体および鼠径部脂肪、肝臓組織の重量を減少させた。それだけでなく、末梢血では、Ｂａｌｂ／Ｃマウス由来の筋幹細胞を注入した後、モデルマウスの末梢炎症のレベルが大幅に低下した。
【0121】
本明細書で言及されるすべての文献は、あたかも各文献が参照により個別に引用されるように、参照により本出願に引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は、本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの等価物も本出願の添付の特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることが理解されたい。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
