特許 7555166 電気化学式免疫センサー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-12

(45)【発行日】2024-09-24

(54)【発明の名称】電気化学式免疫センサー

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/416 20060101AFI20240913BHJP

   G01N 27/327 20060101ALI20240913BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20240913BHJP

【ＦＩ】

G01N27/416 336B

G01N27/327 357

G01N33/543 521

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2024108487

(22)【出願日】2024-07-04

【審査請求日】2024-07-04

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】519450891

【氏名又は名称】株式会社イムノセンス

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】井手 明日香

(72)【発明者】

【氏名】山村 航太郎

【審査官】大瀧 真理

(56)【参考文献】

【文献】特許第７４７０４６１（ＪＰ，Ｂ１）

【文献】特許第６７１４２５６（ＪＰ，Ｂ１）

【文献】特開２０２０－１９０５５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／１１７５６２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１１－１３７８１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００２－５２２７４８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２７／３２７

Ｇ０１Ｎ ２７／４１６

Ｇ０１Ｎ ３３／５４３

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験物質を含む試料溶液が移動可能な流路を備えるケースと、
前記試料溶液と接触可能に前記流路内に配置された電極と、
前記被験物質に特異的に結合する第１の結合物質が結合した金属微粒子を有する標識体を含む標識部と、
を備え、
前記電極は、電極部を備え、
前記電極部は、
前記第１の結合物質とは異なる前記被験物質上の部位に特異的に結合する第２の結合物質と、
前記標識部と、
を備えた、
電気化学式免疫センサー。

【請求項2】

前記電極は、作用電極と対極と参照電極とを備え、
前記第２の結合物質と標識部は、前記作用電極の表面に少なくとも備わる、
請求項１に記載の電気化学式免疫センサー。

【請求項3】

前記流路は、
上流流路と、
前記上流流路よりも下流側に位置する下流流路と、
を備え、
前記上流流路は、電極区画を備え、
前記電極区画は、前記電極部が配置されている、
請求項１に記載の電気化学式免疫センサー。

【請求項4】

前記下流流路は、前記試料溶液を吸収する吸収体を備える、請求項３に記載の電気化学式免疫センサー。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、電気化学的手法における被検物質を測定するための電気化学式免疫センサーに関する。

【背景技術】

【0002】

試験溶液中の微量物質を簡便且つ高感度に測定する方法の１つとして、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が知られている。免疫測定法としては、酵素で標識した抗体を用い、酵素反応に由来する発色や発光等の信号を得ることにより被検物質の検知や濃度測定を行うＥＬＩＳＡ法が、幅広い分野で採用されている。しかしながら、ＥＬＩＳＡ法では、発色や発光等の信号検出時に光学系を必要とするため、大型の測定機が必要となる。また、正確な定量を行う場合には、発色等の測定結果を電気的な信号に変換する作業が必要となる等、複雑な処理を行う必要がある。

【0003】

そこで、発色標識や蛍光標識のような汎用の標識物質を用いた免疫測定法等において、検出に際して電気化学的測定法を利用する方法が提案されている。電気化学的測定に用いる装置はＥＬＩＳＡ等に用いられる機器に比べて小型化が可能であることから、測定機器の小型化と検出感度の向上との両立が期待される。

【0004】

特許文献１は、樹脂製シートの支持体に、電極部と、電極部からの電流を伝える導電部と、この電流値を測定する電気測定器に接続する接続部とを配するとともに、前記支持体上に複数のパッド類を一部分積層配置して、試料溶液を複数のパッド類に渡って流れさせて行き、前記電極部５の位置で流れを制御して電気化学的検出を行う方法が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特許第６７１４２５６号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、特許文献１が開示する測定方法は、パッド類を使うと測定結果にばらつきがあった。特に、特許文献１が開示する技術は、金コロイド標識抗体を担持したコンジュケーションパッドが必須であり、製造工程および組立工程において工数が多く、原価に対して支配的であった。

【0007】

本発明者らは、コンジュケーションパッドを使用せず、金コロイド標識抗体を流路内に固定して電気化学式免疫法を実行した。

【0008】

しかしながら、コンジュケーションパッドを除いただけでは測定が困難であった。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、鋭意研究の結果、被験物質に特異的に結合する第１の結合物質が結合した金属微粒子を有する標識体を含む標識部と被験物質に特異的に結合する第２の結合物質の両方を備える電極部を使用することによってコンジュケーションパッドを使用せず、金コロイド標識抗体を流路内に固定して電気化学式免疫法を実行することができることを明らかにし、本発明は完成した。

【0010】

［１］
本発明の目的は、
被験物質を含む試料溶液が移動可能な流路を備えるケースと、
上記試料溶液と接触可能に上記流路内に配置された電極と、
上記被験物質に特異的に結合する第１の結合物質が結合した金属微粒子を有する標識体を含む標識部と、
を備え、
上記電極は、電極部を備え、
上記電極部は、
上記第１の結合物質とは異なる上記被験物質上の部位に特異的に結合する第２の結合物質と、
上記標識部と、
を備えた、
電気化学式免疫センサー
を提供することである。

【0011】

本発明にかかる電気化学式免疫センサーを用いることによって、コンジュケーションパッドを使用せず、金コロイド標識抗体を流路内に固定して電気化学式免疫法を実行することができる。

【0012】

［２］
［１］に記載の電気化学式免疫センサーにおいて、上記電極は、作用電極と対極と参照電極とを備えていてもよく、上記第２の結合物質と標識部は、上記作用電極の表面に少なくとも備わっていてもよい。

【0013】

［３］
［１］に記載の電気化学式免疫センサーにおいて、上記流路は、
上流流路と、
上記上流流路よりも下流側に位置する下流流路と、
を備えていてもよく、
上記上流流路は、電極区画を備えていてもよく、
上記電極区画は、上記電極部が配置されていてもよい。

【0014】

［４］
［３］に記載の電気化学式免疫センサーにおいて、上記下流流路は、上記試料溶液を吸収する吸収体を備えていてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1A】図１Ａは、本実施形態にかかる電気化学式免疫センサー１に関する平面斜視図を示している。

【図1B】図１Ｂは、蓋５０を備えた電気化学式免疫センサー１に関する平面斜視図を示している。

【図2A】図２Ａ（ａ）は、本実施形態にかかる電気化学式免疫センサー１の平面図を示し、図２Ａ（ｂ）は、図２Ａ（ａ）のＡ－Ａ線における電気化学式免疫センサー１の断面図を示している。

【図2B】図２Ｂ（ａ）は、蓋５０を備えた電気化学式免疫センサー１の平面図を示し、図２Ｂ（ｂ）は、図２Ｂ（ａ）のＡ－Ａ線における蓋５０を備えた電気化学式免疫センサー１の断面図を示している。

【図3】図３は、本実施形態にかかる電気化学式免疫センサー１に関する展開図を示している。

【図4A】図４Ａは、電極２０の詳細とその配置並びに標識部４１の位置を示している。

【図4B】図４Ｂは、図４Ａに示す標識部４１とは異なる位置に配置された標識部４１’を示している。

【図5】図５は、実施例１並びに比較例１及び２の平均（ａｖｅ）ピーク値に関するグラフを示している。

【発明を実施するための形態】

【0016】

定義
便宜上、本願で使用される特定の用語は、ここに集めている。別途規定されない限り、本願で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。文脈で別途明記されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の言及を含む。

【0017】

本発明で示す数値範囲及びパラメーターは、近似値であるが、特定の実施例に示されている数値は可能な限り正確に記載している。しかしながら、いずれの数値も本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含んでいる。また、本明細書で使用する「約」という用語は、一般に、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％以内を意味する。或いは、用語「約」は、当業者が考慮する場合、許容可能な標準誤差内にあることを意味する。

【0018】

以下、本発明の実施形態について説明する。以下の実施形態は、例示であって、本発明の範囲は、以下の実施形態で示すものに限定されない。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑をさけるために、摘示説明を省略する。

【0019】

実施形態
図１Ａは、本実施形態にかかる電気化学式免疫センサー１に関する平面斜視図を示している。図１Ａは、蓋５０を備える電気化学式免疫センサー１に関する平面斜視図を示している。図２Ａ（ａ）は、本実施形態にかかる電気化学式免疫センサー１の平面図を示し、図２Ａ（ｂ）は、図２Ａ（ａ）のＡ－Ａ線における電気化学式免疫センサー１の断面図を示している。図２Ｂ（ａ）は、蓋５０を備えた電気化学式免疫センサー１の平面図を示し、図２Ｂ（ｂ）は、図２Ｂ（ａ）のＡ－Ａ線における蓋５０を備えた電気化学式免疫センサー１の断面図を示している。図３は、本実施形態にかかる電気化学式免疫センサー１に関する展開図を示している。図４Ａは、電極２０の詳細とその配置並びに標識部４１の位置を示している。図４Ｂは、図４Ａに示す標識部４１とは異なる位置に配置された標識部４１’を示している。図４Ａ及びＢにおける破線は、標識部（４１及び４１’）によって隠れる電極部２１を便宜的に示している。

【0020】

電気化学式免疫センサー１
本実施形態にかかる電気化学式免疫センサー１は、被験物質を含む試料溶液（第一溶液）が移動可能な流路１００を備えるケース１０と、試料溶液と接触可能に流路１００内に配置された電極２０と、被験物質に特異的に結合する第１の結合物質が結合した金属微粒子を有する標識体を含む標識部４１と、を備える。

【0021】

ケース１０
ある実施形態において、流路１００は、ケース１０に形成された凹部である。ある実施形態において、ケース１０は、流路１００の形状（流路の長さ、幅及び深さなど）を規定する型プレート１１と型プレート１１を収容する容器部１２を備えている。型プレート１１は、容器部１２から取り外し可能であってもよく、任意の結合手段（接着剤及び溶接など）を介して容器部１２に結合していてもよい。電気化学式免疫センサー１は、流路１００を少なくとも覆う形状を有するカバー５０を備えていてもよい。

【0022】

電極２０
電極２０は、第１の結合物質とは異なる被験物質上の部位に特異的に結合する第２の結合物質と標識部４１の両方を備える電極部２１を備える。

【0023】

ある実施形態において、電極２０は、電極部２１からの電流の電流値を測定する電気測定器に接続する接続部２２と、電極部２１と接続部２２の間に位置し電極部２１から接続部２２へ電流を伝える導電部２３と、を更に備える。

【0024】

ある実施形態において、電極部２１は、作用電極２１ａと対極２１ｂと参照電極２１ｃとを備える。作用電極２１ａは、作用電極用導電部２３ａと接続し、対極２１ｂは、対極用導電部２３ｂと接続し、参照電極２１ｃは、参照電極用導電部２３ｃと接続する。ある実施形態において、第１の結合物質は、作用電極２１ａの表面に備わる。

【0025】

電極２０の接続部２２は、ケース１０の下流Ｄ側において突出するように構成されているが、このような構成は必須ではなく、接続部２２は、ケース１０内に配置されていてもよい。

【0026】

流路１００
流路１００は、上流流路１１０と、上流流路１１０よりも下流Ｄ側に位置する下流流路１２０と、を備える。ある実施形態において、下流流路１２０は、第一下流流路１３０と第一下流流路１３０よりも下流Ｄ側に位置する第二下流流路１４０とを備える。ある実施形態において、流路１００は、撥水性を有する。別の実施形態において、第一下流流路１３０は、撥水領域を備える。ある実施形態において、流路１００は、親水性を有する。別の実施形態において、第一下流流路１３０は、親水性領域を備える。本実施形態にかかる流路１００は、流路幅が一定であるが、第一下流流路１３０は、上流Ｕから下流Ｄにかけて幅が広がっている形状（テーパー形状）を有していてもよい。ある実施形態において、第二下流流路１４０の幅は、上流流路１１０の幅よりも広い。ある実施形態において、第二下流流路１４０の幅は、一定であってもよい。ある実施形態において、第一下流流路１３０の上流側幅は、上流流路１１０の下流側幅と同じであり、第一下流流路１３０の下流側幅は、第二下流流路１４０の幅と同じである。

【0027】

上流流路１１０
上流流路１１０は、上流区画１１１と電極区画１１２と下流区画１１３を備える。電極区画１１２は、上流区画１１１よりも下流Ｄ側に位置し、電極部２１が配置される。下流区画１１３は、電極区画１１２よりも下流Ｄ側に位置し、下流流路１２０と接続する。

【0028】

ある実施形態において、上流区画１１１は、試料溶液が導入される導入区画１１４と、導入区画１１４よりも下流Ｄ側に位置し且つ電極区画１１２よりも上流Ｕ側に位置する移行区画１１６を備える。

【0029】

下流区画１１３は、電極部２１から下流流路１２０へ流れた試料溶液を分断する区画であり、試料溶液が分断されることにより、電極部２１に滞留した試料溶液を第二溶液（洗浄液や電気化学的測定用の溶液などの）により十分に置換することができる。

【0030】

標識部４１
標識部４１は、電極部２１に備わる（と接している）。ある実施形態において、標識部４１は、作用電極２１ａに少なくとも備わる。ある実施形態において、標識部４１は、電極部２１において作用電極２１ａにのみ備わる。言い換えれば、標識部４１は、作用電極２１ａに備わり、対極２１ｂと参照電極２１ｃには備わらない。標識部４１は、標識体を含む溶液を電極部２１上で乾燥させることで電極部２１に標識体を固定することができる。

【0031】

下流流路１２０
ある実施形態において、下流流路１２０は、試料溶液を吸収する吸収体３０を備える。別の実施形態において、第二下流流路１４０は、試料溶液を吸収する吸収体３０を備える。吸収体３０は、例えば、ニトロセルロースからできていてもよい。吸収体３０は、下流流路１
２０の内壁とは接していないことが好ましい。

【0032】

カバー５０
カバー５０は、ケース１０を覆う又は部分的に覆うことができる。カバー５０は、流路１００を少なくとも覆う形状を有する。ある実施形態において、カバー５０は、型プレート１１を覆う又は部分的に覆う形状を有する。別の実施形態において、カバー５０は、容器１２を覆う又は部分的に覆う形状を有する。カバー５０が流路１００を覆うことによって、流路１００がトンネル構造となり、流路１００が外部環境から保護される。カバー５０は、外部環境と上流区画１１３が流体連通することを可能にするサンプル孔５１を備え、サンプル孔５１を通じて試料溶液を上流区画１１３に導入することができる。カバー５０の表面５２は、フラット形状であってもよく、カバー５０の裏面（不図示）は、フラット形状であってもよい。

【0033】

電気化学的処理
先ず、電気化学的測定において用いる電極２０の未処理の作用電極２１ａの表面に、被検物質に対する第２の結合物質（例えば、一次抗体）を固定しておく。未処理の作用電極２１ａは、第２の結合物質が固定されていない作用電極２１ａであり、第２の結合物質と作用電極２１ａとの固定を容易にする要素を備えていてもよい。次に、作用電極２１ａの表面は非特異吸着を防ぐためにブロッキングする。

【0034】

また、第２の結合物質（例えば、一次抗体）とは異なる被検物質上の部位を認識する第１の結合物質（例えば、二次抗体）に金属微粒子を標識することにより標識体を作成する。次に、標識体を含む溶液を電極部２１上で乾燥させることで電極部２１に標識体を塗布（固定）する

【0035】

ケース１０に電極２０をセットし、アッセンブルされた電気化学式免疫センサー１を電気測定器にセットする。

【0036】

導入区画１１４に試料溶液を導入する。導入区画１１４に導入された試料溶液は、毛細管現象や重力によって下流Ｄ側に流れ、電極区画１１２の標識部４１に到達する。

【0037】

第１の結合物質と結合する被験物質が試料溶液中に含まれる場合、被験物質－第１の結合物質－金属微粒子複合体が形成される。次に、試料溶液中の当該複合体は、電極２０の作用電極２１ａと接触する。

【0038】

上記複合体中の被検物質が作用電極２１ａ上の第２の結合物質と接触すると、作用電極２１ａ上で抗原抗体反応が起きる。標識体が被検物質を介して第２の結合物質に結合することにより、被検物質の濃度に対応した量の金属微粒子が作用電極２１ａの近傍に集められた状態となる。操作時間を短くする目的で、抗原抗体反応は、試料溶液が作用電極２１ａ上を通過しながら行われることが好ましいが、試料溶液の流れを止めた状態で抗原抗体反応を行うことを排除するものではない。

【0039】

試料溶液は、下流区画１１３を通過して下流流路１２０に流入し、下流流路１２０に配置された吸収体３０に吸収される。試料溶液は、第一下流流路１３０によって、上流流路１１０から下流流路１２０へ速やかに排出され、洗浄液や電気化学的測定用の溶液などの第二溶液を迅速に導入することができるようになる。なお、作用電極２１ａは第二溶液で洗浄されるため、作用電極２１ａ上を覆う程度に試料溶液が作用電極２１ａ上に残っていてもよい。

【0040】

本発明においては、生体物質、合成物質等のあらゆる物質を被検物質とすることができる。被検物質に特異的に結合する結合物質（第１の結合物質、第２の結合物質）には、被験物質に応じて適切なものを選択する。被検物質に応じた量の金属微粒子を集めるために、本実施形態では抗原と抗体との特異的結合を利用しているが、物質間で特異的に結合するものであればこの組合せに限らず、例えば、核酸－核酸、核酸－核酸結合タンパク質、レクチン－糖鎖、又はレセプター－リガンドの特異的結合を利用してもよい。被検物質－特異的結合物質の関係の順序は、上記と逆でもよい。

【0041】

標識物質として用いられる金属微粒子としては特に制限されないが、例えば金、白金、銀、銅、ロジウム、パラジウム等の微粒子やそれらのコロイド粒子、量子ドット等を用いることができる。なかでも粒径１０ｎｍ～１００ｎｍの金微粒子、特に粒径４０ｎｍ程度の金微粒子を用いることが好ましい。

【0042】

試料溶液が下流流路１２０へ排出された後、導入区画１１４に第二溶液を導入し、作用電極２１ａの表面を洗浄する。更に、導入区画１１４に第二溶液を導入してもよく、異なる種類の第二溶液を導入してもよい。電気化学的測定のために、作用電極２１ａと対極２１ｂと参照電極２１ｃ上を覆う程度に第二溶液が作用電極２１ａと対極２１ｂと参照電極２１ｃ上に残った状態にさせる。

【0043】

金属微粒子を電気化学的に酸化させる。例えば、参照電極２１ｃに対する作用電極２１ａの電位を、金属微粒子が電気化学的に酸化する電位に所定時間保持する。このことにより、作用電極２１ａの表面近傍に集めた金属微粒子を完全に酸化する。

【0044】

金属微粒子を電気化学的に酸化させた後、酸化した金属を還元する際に生じるピーク電流値に基づいて、被検物質の有無又は濃度を測定する。具体的には、例えば、作用電極２１ａの電位を負方向に変化させていき、電位変化に伴う電流変化を測定する。電極電位を負方向に変化させていくと、前述の電位制御により酸化溶出した金属が還元されることにより還元電流が流れるので、これを測定する。試験溶液中の被検物質が多く、作用電極２１ａの近傍に集められた金属微粒子が多いほど還元電流強度も大きくなることから、これに基づいて被検物質の定量又は検出が実現される。例えば、還元電流値と既知濃度の被検物質と関係を予め求めておき、測定された還元電流値と比較することにより、被検物質濃度を求めることができる。また、得られる還元電流値から試験溶液中の被検物質の有無を知ることができる。

【0045】

作用電極２１ａの電位制御及び電気化学測定の際に用いる溶液としては、金属微粒子を容易に電気化学的に酸化させることができることから、酸性溶液を用いることが好ましい。酸性溶液としては、金属微粒子の種類等に応じて適宜選択すればよいが、例えば塩酸、硝酸、酢酸、リン酸、クエン酸、硫酸等を含む水溶液を用いることができる。金属微粒子の電気化学的酸化のし易さを考慮すると、０．０５規定～２規定の塩酸水溶液を用いることが好ましく、０．１規定～０．５規定の塩酸水溶液を用いることがより好ましい。

【0046】

一方、作用電極２１ａの電位制御及び電気化学測定の際に用いる溶液としては、酸性溶液の他、塩素を含む中性溶液を用いることも可能である。塩素を含む中性溶液を用いることにより、酸性溶液を用いる場合に比べて大きな電流変化量が得られ、結果として、より高感度な測定が達成される。また、酸性溶液を用いる場合、例えば低電位側における還元ピークの裾が上昇する等のようにピーク形状が非対称となったり、例えば０．１Ｖ付近においてノイズが発生することがある。これに対して、塩素を含む中性溶液を用いることで、還元ピークの裾が平坦となるとともに、上記ノイズ発生が抑えられるので、還元ピーク強度検出が簡便となる。さらに、酸性溶液やアルカリ溶液のような取扱いの難しい溶液の使用を回避することができ、測定操作を安全且つ簡便に実施することができる。塩素を含む中性溶液としては、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ等を用いたときに上記の効果を得られるが、特にＫＣｌを用いたときに効果が大きい。

【0047】

金属微粒子を酸化させるに際して、作用電極２１ａの電位は、金属微粒子が酸化可能な電位とする。具体的には、作用電極２１ａの電位は、使用する金属微粒子の種類に応じて適宜最適な値に設定する必要があるが、例えば、銀塩化銀参照電極２１ｃに対して＋１～＋２Ｖとすることが好ましい。作用電極２１ａの電位を上記範囲内にすることにより、作用電極２１ａの表面近傍に集めた金属微粒子を完全に酸化溶出させることができ、被検物質の検出感度を確実に向上させることができる。作用電極２１ａの電位を上記範囲未満とした場合、測定時に還元電流のピークが現れないおそれがあり、逆に上記範囲を超えた場合、酸化させた金属微粒子の泳動による拡散が起こり、作用電極２１ａ近傍における酸化物の濃度が低下してしまい、これにより還元電流のピークが小さくなるおそれがある。より好ましい範囲は、＋１．２Ｖ～＋１．６Ｖである。

【0048】

金属微粒子を電気化学的に酸化させる具体的な手段としては、作用電極２１ａの電位を金属微粒子が酸化する電位に所定時間保持することが挙げられる。上記電位を所定時間保持する操作は、金属微粒子を十分に酸化させられるため、好ましい方法である。また、作用電極２１ａに金属微粒子が電気化学的に酸化する電位を印加するに際しては、前述したように作用電極２１ａの電位を所定の電位に保持する方法の他、例えばサイクリックボルタンメトリー等によって、作用電極２１ａの電位を時間経過に伴い変化させてもよい。作用電極２１ａの電位を時間経過に伴って変化させる場合には、金属微粒子が酸化する電位の範囲内（例えば、銀塩化銀参照電極２１ｃに対し＋１～＋２Ｖ）において、作用電極２１ａの電位を変化させることが好ましい。さらに、金属微粒子を酸化させるに際しては、金属微粒子が電気化学的に酸化する電位を作用電極２１ａに複数回印加してもよい。

【0049】

なお、金属微粒子として粒径１０ｎｍ～６０ｎｍの金微粒子を使用する場合、金微粒子を電気化学的に酸化させるに際して、０．１規定～０．５規定の塩酸溶液中で、銀塩化銀参照電極２１ｃに対する上記作用電極２１ａの電位を＋１．２Ｖ～＋１．６Ｖとすることが好ましい。

【0050】

ここで、金属微粒子を十分に酸化させるに際しては、金属微粒子の量に応じて最適な電荷量を与えるように注意する必要がある。電荷量は電流を積分した値であるため、作用電極２１ａに印加する電位が比較的低い電位であれば、金属微粒子を十分に酸化させるためには当該電位を長時間印加する必要がある。一方、作用電極２１ａに印加する電位が比較的高い電位であれば、金属微粒子を十分に酸化させるために必要な時間は短時間でよい。

【0051】

金属微粒子が電気化学的に酸化する電位に作用電極２１ａの電位を保持する時間を１秒以上とすることで、金属微粒子を十分に酸化させることができ、検出感度を確実に向上させることができる。一方、印加時間を１００秒以上としても得られる電流値は殆ど変わらない。したがって、１秒以上１００秒以下が好ましい。上記電位の保持時間のさらに好ましい範囲は、４０秒以上１００秒以下である。

【0052】

酸化した金属を電気化学的に還元する際に生じる電流を測定する方法としては、例えば、微分パルスボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー等のボルタンメトリー、アンペロメトリー、クロノメトリー等が挙げられる。

【0053】

以上のような実施形態においては、作用電極２１ａ上で抗原抗体反応等を行って作用電極２１ａの表面近傍に金属微粒子を集め、標識体に含まれる金属微粒子に由来する還元ピーク電流を測定するので、簡便且つ高感度に試験溶液中の被検物質を測定することができる。

【0054】

別の実施形態においては、被検物質に応じた量の金属微粒子を作用電極２１ａの表面近傍に集めるために、被検物質に対する２種類の結合物質を用意し、一方（第１の結合物質）を磁性微粒子の表面に固定化しておくとともに、他方（第２の結合物質）を金属微粒子で標識して標識体を形成しておき、標識体と反応させた後の磁性微粒子を作用電極２１ａの表面に集めてもよい。

【0055】

なお、以上の説明においては、被検物質量に対応する量の金属微粒子を集める方法として、非競合反応を利用して被検物質量に対応する量の金属微粒子を集める方法を例に挙げたが、競合反応を利用して被検物質量に対応する量の金属微粒子を集める方法を採用しても構わない。

【実施例】

【0056】

以下、本発明の実施例について、実験結果を参照して説明する（実験装置、方法、条件及び試薬の詳細は、ＷＯ２００７／１１６８１１を参照）。

【0057】

（実験１）
１．作用電極への抗体の固定化
本実験では、作用電極の表面に一次抗体（抗ｈＣＧ抗体）を固定化した印刷電極を用いて、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）で希釈したヒトゴナドトロピン（ｈＣＧ）の測定を試みた。ｈＣＧは妊娠診断用マーカーの一種である。金コロイド標識二次抗体（標識体）としては、金コロイド標識抗ｈαＳ抗体を用いた。

【0058】

被検物質測定用の電極デバイスとしては、図１Ａ及び１Ｂに示す電気化学式免疫センサー１及び図４Ａに示す電極２０（印刷電極）を用いた。電極の電極部は、カーボンペーストで形成した作用電極及び対極と、カーボンペーストで形成したリードと、銀／塩化銀で形成した参照電極とを絶縁支持体上に有するものであり、作用電極、対極及び参照電極の表面の一部が絶縁層で被覆されることにより、有効な電極面積が規定されている。

【0059】

濃度１００μｇ／ｍＬに調製した抗ｈＣＧ抗体（一次抗体）溶液を作用電極上に２μＬ滴下し、４℃の冷暗所で１２時間以上静置することにより抗ｈＣＧ抗体を作用電極の表面に固定した。ＰＢＳを用いて印刷電極デバイスを洗浄後、０．１％の牛血清アルブミンでブロッキングを行った。

【0060】

２．電極上への金コロイド標識二次抗体の乾燥担持
金コロイド標識二次抗体として金コロイド標識抗ｈαＳ抗体を以下に示す電極上の位置に乾燥により担持させた。
実施例１（作用電極直上）：作用電極上の位置
比較例１（作用電極上流）：作用電極よりも上流の位置
比較例２（作用電極下流）：作用電極よりも下流の位置

【0061】

３．被検物質の測定
被検物質としてのｈＣＧをＰＢＳ（リン酸緩衝液）で希釈することにより、ｈＣＧ濃度が０ｎｇ／ｍＬ又は１００ｎｇ／ｍＬとなるように溶液を調製した。その溶液をサンプル孔を通じて印刷電極デバイスに４．５μＬ滴下した。溶液が電極部を通過した後、ＰＢＳを用いて電極部を洗浄した。

【0062】

洗浄後、０．１Ｍ塩酸水溶液の３０μＬを、作用電極、参照電極及び対極の全面が完全に覆われるように上述処理した印刷電極デバイスに導入し、銀塩化銀参照電極に対する作用電極の電位を＋１．２Ｖに保持した。保持時間は４０秒間とした。

【0063】

次に、微分パルスボルタンメトリーにより、作用電極の電位を０．８Ｖから－０．１Ｖへ変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。ボルタンメトリーの条件は電位増加０．００４Ｖ、パルス振幅０．０５Ｖ、パルス幅０．０５Ｓ、パルス期間０．２Ｓとした。結果を表１に示す。

【0064】

【表1】

【0065】

図５は、実施例１並びに比較例１及び２の平均（ａｖｅ）ピーク値に関するグラフを示している。図５に示す通り、作用電極の直上に金コロイド標識体を乾燥担持させても還元ピーク電流を計測することができた。

【符号の説明】

【0066】

１ 電気化学式免疫センサー
１０ ケース
１１ 型プレート
１２ 容器部
２０ 電極
２１ 電極部
２１ａ 作用電極
２１ｂ 対極
２１ｃ 参照電極
２２ 接続部
２３ 導電部
２３ａ 作用電極用導電部
２３ｂ 対極用導電部
２３ｃ 参照電極用導電部
３０ 吸収体
４１、４１’ 標識部
５０ カバー
５１ サンプル孔
５２ 表面
１００ 流路
１１０ 上流流路
１１１ 上流区画
１１２ 電極区画
１１３ 下流区画
１１４ 導入区画
１１６ 移行区画
１２０ 下流流路
１３０ 第一下流流路
１４０ 第二下流流路
Ｕ 上流
Ｄ 下流

【要約】

【課題】従来技術は、金コロイド標識抗体を担持したコンジュケーションパッドが必須であり、製造工程および組立工程において工数が多く、原価に対して支配的であった。
【解決手段】本発明の目的は、被験物質を含む試料溶液が移動可能な流路を備えるケースと、上記試料溶液と接触可能に上記流路内に配置された電極と、上記被験物質に特異的に結合する第１の結合物質が結合した金属微粒子を有する標識体を含む標識部と、を備え、上記電極は、電極部を備え、上記電極部は、上記第１の結合物質とは異なる上記被験物質上の部位に特異的に結合する第２の結合物質と、上記標識部と、を備えた、電気化学式免疫センサーを提供することである。
【選択図】図１Ａ

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】