特許 7555334 組み換えＭＶＡ、及び免疫チェックポイントアンタゴニストまたは免疫チェックポイントアゴニストの静脈内投与によって、がんを治療する併用療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-12

(45)【発行日】2024-09-24

(54)【発明の名称】組み換えＭＶＡ、及び免疫チェックポイントアンタゴニストまたは免疫チェックポイントアゴニストの静脈内投与によって、がんを治療する併用療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/76 20150101AFI20240913BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240913BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240913BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240913BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240913BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240913BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240913BHJP

   C12N 15/863 20060101ALN20240913BHJP

【ＦＩ】

A61K35/76 ZNA

A61K39/395 D

A61K39/395 U

A61K48/00

A61K39/00 H

A61K38/17

A61P35/00

A61P43/00 121

C12N15/863 Z

【請求項の数】 26

(21)【出願番号】P 2021518493

(86)(22)【出願日】2019-10-04

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(86)【国際出願番号】 EP2019076947

(87)【国際公開番号】W WO2020070303

(87)【国際公開日】2020-04-09

【審査請求日】2022-09-13

(31)【優先権主張番号】18199002.9

(32)【優先日】2018-10-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】509296443

【氏名又は名称】バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ

(74)【代理人】

【識別番号】100069556

【弁理士】

【氏名又は名称】江崎 光史

(74)【代理人】

【識別番号】100111486

【弁理士】

【氏名又は名称】鍛冶澤 實

(74)【代理人】

【識別番号】100139527

【弁理士】

【氏名又は名称】上西 克礼

(74)【代理人】

【識別番号】100164781

【弁理士】

【氏名又は名称】虎山 一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100221981

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 大成

(72)【発明者】

【氏名】ラウターバッハ・ヘニング

(72)【発明者】

【氏名】メディナ・エチェベルス・ホセ

(72)【発明者】

【氏名】ヒンターベルガー・マリア

【審査官】池上 文緒

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１４／０３７１２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／１２８５４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５３７４１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】Hum. Vaccine. Immunother.，2018年01月，vol.14, no.1，p.140-145

【文献】THOMAS DUSCHEK，THE FUTURE OF VACCINES，[ONLINE]，2018年09月18日，PAGE(S):1-20，http://www.bavarian-nordic.com/media/273243/180918-investordagen-en.pdf

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３５／７６

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ１２Ｎ １５／８６３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させるための組み合わせ物であって、前記組み合わせ物が、
（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、静脈内投与すると、ＴＡＡをコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方が誘導される前記ＭＶＡウイルスと、
（ｂ）抗ＰＤ－１抗体であるＰＤ－１アンタゴニストである、免疫チェックポイント分子の少なくとも１つのアンタゴニストと、
を含み
前記（ａ）及び前記（ｂ）が、併用治療として投与すべきものであり、前記（ａ）及び前記（ｂ）を前記がん患者に投与することにより、前記（ａ）を単独で非ＩＶ投与するかまたは前記（ｂ）を単独で投与する場合と比べて、前記がん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／または生存率が上昇し、
前記（ａ）が静脈内投与される、前記組み合わせ物。

【請求項2】

前記（ｂ）が腹腔内投与される、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項3】

前記ＴＡＡが内因性レトロウイルス抗原である、請求項１または２に記載の組み合わせ物。

【請求項4】

前記ＴＡＡが、チロシン関連タンパク質２（ＴＲＰ２）である、請求項１または２に記載の組み合わせ物。

【請求項5】

さらに、ＴＡＡであるｐ１５ｅまたはＰＲＡＭＥを含む、請求項１、２または４に記載の組み合わせ物。

【請求項6】

前記ＴＡＡが、ＨＥＲ２である、請求項１または２に記載の組み合わせ物。

【請求項7】

前記第１の核酸がさらに、ＴＡＡであるＢｒａｃｈｙｕｒｙをコードする、請求項６に記載の組み合わせ物。

【請求項8】

前記第１の核酸が、ＴＡＡとしてチロシン関連タンパク質２（ＴＲＰ２）とｐ１５ｅをコードするか、あるいはＴＡＡとしてＨＥＲ２とＢｒａｃｈｙｕｒｙをコードする、請求項１または２に記載の組み合わせ物。

【請求項9】

前記ＭＶＡが、ＭＶＡ－ＢＮまたはＭＶＡ－ＢＮの誘導体である、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項10】

前記（ａ）を前記（ｂ）の投与と同時に、または前記（ｂ）の投与前に投与する、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項11】

前記（ａ）及び前記（ｂ）を前記がん患者にプライミング投与で投与してから、前記（ａ）及び前記（ｂ）のブースティング投与を１回以上、前記がん患者に行う、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項12】

前記がん患者が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌または結腸直腸癌からなる群から選択されるがんに罹患しており、及び／または前記がんと診断されている、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項13】

前記乳癌が、ＨＥＲ２を過剰発現する乳癌である、請求項１２に記載の組み合わせ物。

【請求項14】

がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させるための医薬組成物であって、以下の（ａ）：
（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、静脈内投与すると、ＴＡＡをコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方が誘導される前記ＭＶＡウイルス、
を含み、
以下の（ｂ）：
（ｂ）抗ＰＤ－１抗体であるＰＤ－１アンタゴニストである、免疫チェックポイント分子の少なくとも１つのアンタゴニスト、
と組み合わせて使用される、医薬組成物において、
前記（ａ）及び前記（ｂ）が、併用治療として投与すべきものであり、前記（ａ）及び前記（ｂ）を前記がん患者に投与することにより、前記（ａ）を単独で非ＩＶ投与するかまたは前記（ｂ）を単独で投与する場合と比べて、前記がん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／または生存率が上昇し、
前記（ａ）が静脈内投与される、前記医薬組成物。

【請求項15】

前記（ｂ）が腹腔内投与される、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記ＴＡＡが内因性レトロウイルス抗原である、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記ＴＡＡが、チロシン関連タンパク質２（ＴＲＰ２）である、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。

【請求項18】

さらに、ＴＡＡであるｐ１５ｅまたはＰＲＡＭＥを含む、請求項１４、１５または１７に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記ＴＡＡが、ＨＥＲ２である、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。

【請求項20】

前記第１の核酸がさらに、ＴＡＡであるＢｒａｃｈｙｕｒｙをコードする、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記第１の核酸が、ＴＡＡとしてチロシン関連タンパク質２（ＴＲＰ２）とｐ１５ｅをコードするか、あるいはＴＡＡとしてＨＥＲ２とＢｒａｃｈｙｕｒｙをコードする、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。

【請求項22】

前記ＭＶＡが、ＭＶＡ－ＢＮまたはＭＶＡ－ＢＮの誘導体である、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項23】

前記（ａ）を前記（ｂ）の投与と同時に、または前記（ｂ）の投与前に投与する、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項24】

前記（ａ）及び前記（ｂ）を前記がん患者にプライミング投与で投与してから、前記（ａ）及び前記（ｂ）のブースティング投与を１回以上、前記がん患者に行う、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項25】

前記がん患者が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌または結腸直腸癌からなる群から選択されるがんに罹患しており、及び／または前記がんと診断されている、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項26】

前記乳癌が、ＨＥＲ２を過剰発現する乳癌である、請求項２５に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、がんを治療する併用療法に関するものであり、その治療は、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸を含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスを、免疫チェックポイント分子のアンタゴニストまたはアゴニストと組み合わせて静脈内投与することを含む。

【背景技術】

【0002】

組み換えポックスウイルスは、感染性生物に対する免疫療法ワクチンとして、さらに最近では、腫瘍に対する免疫療法ワクチンとして使用されてきた（Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１０５（８）：１０３１－１０３４）。

【0003】

感染症及びがんに対する免疫療法ワクチンとして有用であることが証明されているポックスウイルス株の１つは、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスである。ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞で、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）を５１６代連続継代することによって作られた（論評については、Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３：６－１４を参照されたい）。これらの長期継代により、得られたＭＶＡウイルスのゲノムは、その欠失ゲノム配列が約３１キロベースであったので、トリ細胞での複製に関して、宿主細胞が非常に限られているものとして説明された（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１０３１－１０３８）。様々な動物モデルにおいて、この得られたＭＶＡが、際立って非病原性であることが示された（Ｍａｙｒ ＆ Ｄａｎｎｅｒ（１９７８）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４１：２２５－３４）。より安全な製品（ワクチンまたは医薬など）の開発用に、安全性プロファイルが向上されたＭＶＡ株が説明されてきている。（国際公開第２００２０４２４８０号を参照されたい。例えば、米国特許第６，７６１，８９３号及び同第６，９１３，７５２号も参照されたいが、これらの特許はいずれも、参照により、本明細書に援用される）。このようなバリアントは、非ヒト細胞及び非ヒト細胞株、特にニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）においては、増殖的に複製できるが、ヒト細胞株（特にＨｅＬａ細胞株、ＨａＣａｔ細胞株及び１４３Ｂ細胞株を含む）においては複製能力がない。このような株は、例えば、著しく免疫力が低下しており、複製型ウイルスに対する感受性が高いトランスジェニックマウスモデルＡＧＲ１２９のような特定のマウス株においても、インビボでの増殖的複製が不可能である（米国特許第６，７６１，８９３号を参照されたい）。このようなＭＶＡバリアント及びその誘導体（組み換え体を含む）は、「ＭＶＡ－ＢＮ」と称され、説明されている（国際公開第２００２／０４２４８０号を参照されたい。例えば、米国特許第６，７６１，８９３号及び同第６，９１３，７５２号も参照されたい）。

【0004】

腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードするポックスウイルスベクターを用いると、がん患者の腫瘍サイズを縮小させ、全生存率を向上させる成果が見られることが示されている（例えば、ＷＯ２０１４／０６２７７８を参照されたい）。がん患者に、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＭＵＣ１及び／またはＢｒａｃｈｙｕｒｙのようなＴＡＡをコードするポックスウイルスベクターを投与すると、そのがんと闘うために、その患者で、活発かつ特異的なＴ細胞応答が生じることが示されている（上記文献を参照されたい。Ｇｕａｒｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６９（２４），ｄｏｉ １０．１１５８／０００８－５４７２．ＳＡＢＣＳ－０９－５０８９）、Ｈｅｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ．１：１０８７－９５も参照されたい）。

【0005】

ＭＶＡのようなポックスウイルスは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）のようなＣＤ４０アゴニストと組み合わせると、ＴＡＡによるその効果に加えて、有効性が増強されることが示されている（ＷＯ２０１４／０３７１２４を参照されたい）。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌは、腫瘍壊死因子受容体／腫瘍壊死因子（「ＴＮＦＲ／ＴＮＦ」）スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ４０が、Ｂ細胞、マクロファージ及びＤＣを含む多くの種類の細胞上で構成的に発現するのに対して、そのリガンドであるＣＤ４０Ｌは、主に活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞上に発現する（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１（１１）：５７０７－５７１７、Ｍａ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ（２００９）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１（５）：２６５－２７２を参照されたい）。感染または免疫後の早い段階における、ＤＣとＣＤ４＋ Ｔ細胞との同族相互作用により、ＤＣに、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答をプライミングすることが「許諾」される（Ｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３（６６８４）：４７４－４７８）。ＤＣへの許諾により、共刺激分子がアップレギュレーションし、ＤＣの生存率が上昇し、ＤＣのクロスプレゼンテーション能が向上する。このプロセスは主に、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌの相互作用によって媒介されるが（Ｂｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３（６６８４）：４７８－４８０、Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３（６６８４）：４８０－４８３）、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌに依存しない機序も存在する（ＣＤ７０、ＬＴ．β．Ｒ）。興味深いことに、ＤＣ上に発現したＣＤ４０Ｌと、ＣＤ８＋ Ｔ細胞上に発現したＣＤ４０との直接的な相互作用も示唆されており、ヘルパーに依存しないＣＴＬ応答が生じることに対する考え得る説明が提示されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３０（２）：２１８－２２７）。

【0006】

いくつかの研究により、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体が、ワクチンアジュバントとして有用であり得ることが示されている。加えて、ＣＤ４０Ｌをコードする組み換えアデノウイルス（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（５）：１１３３－１１４１）及び組み換えワクシニアウイルス（Ｂｅｒｅｔａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１１（１２）：８０８－８１８）であって、アジュバント非添加のウイルスよりも、インビトロ及びインビボでの免疫原性が優れたウイルスが作られている。

【0007】

ＣＤ４０Ｌは、ＭＶＡの一部としてコードさせると、疾患関連抗原に対する全体的なＴ細胞応答を誘導及び増強できることが示された（ＷＯ２０１４／０３７１２４）。ＷＯ２０１４／０３７１２４では、ＣＤ４０Ｌと異種抗原とをコードする組み換えＭＶＡが、インビボでＤＣの活性化を増強し、その異種抗原に特異的なＴ細胞応答を増大させ、ＣＤ８ Ｔ細胞の質及び量を向上させることができることが示された（上記文献を参照されたい）。

【0008】

チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストの、がん治療での利用は、ここ数年でかなりの成功を収めてきた。免疫細胞上の抑制性受容体は、がんにおける免疫逃避の極めて重要な制御因子である（Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７２（４）：９１７－２７）。これらの抑制性受容体の中でも、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）は、顕著なオフスイッチとして機能するが、ＰＤ－１（プログラム死１、ＣＤ２７９）及びＬＡＧ－３（リンパ球活性化遺伝子、ＣＤ２２３）などのその他の受容体は、ＣＴＬＡ－４よりも弱い抑制機能を果たすと見られる（上記文献を参照されたい）。

【0009】

ＣＴＬＡ－４は、活性化Ｔ細胞上でアップレギュレートする免疫チェックポイント分子である（Ｍａｃｋｉｅｗｉｃｚ（２０１２）Ｗｓｐｏｌｃｚｅｓｎａ Ｏｎｋｏｌ １６（５）：３６３－３７０）。抗ＣＴＬＡ４ ｍＡｂは、ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０／８６との相互作用をブロックし、免疫抑制の機序をオフにし、ＤＣによるＴ細胞の継続的な刺激を可能にすることができる。メラノーマの患者での臨床試験では、ＣＴＬＡ－４に対する２つのＩｇＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、すなわち、イピリムマブ及びトレメリムマブが用いられている。しかしながら、抗ＣＴＬＡ－４抗体による処置では、高レベルの免疫関連有害事象が見られている（上記文献を参照されたい）。

【0010】

免疫系を調節する別のヒトｍＡｂは、プログラム細胞死－１受容体（ＰＤ－１）に対するＢＭＳ－９３６５５８（ＭＤＸ－１１０６）であり、ＰＤ－１のリガンド（ＰＤ－Ｌ１）をメラノーマ細胞上に直接発現させることができる（上記文献を参照されたい）。ＰＤ－１は、Ｔ細胞の活性化及び寛容性を調節する共刺激分子のＢ７：ＣＤ２８ファミリーの一部であるので、ＰＤ－１抗体のようなＰＤ－１アンタゴニストは、寛容性を破壊する役割を果たすことができる（上記文献を参照されたい）。

【0011】

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路の関与により、Ｔ細胞のエフェクター機能、サイトカインの分泌及び増殖が阻害される（Ｔｕｒｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（７）：１１７２－１１７４）。ＰＤ－１のレベルが高い状態は、疲弊Ｔ細胞、すなわち慢性刺激状態のＴ細胞と関連付けられている（上記文献を参照されたい）。さらに、ＰＤ－１の発現増加は、がん患者の生存率の低下と相関する（上記文献を参照されたい）。

【0012】

現在、がんの治療用に認可されたＰＤ－１抗体及びＰＤ－Ｌ１抗体はいくつか存在する。これらのうちの一部としては、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ及びデュルバルマブが挙げられ、現在開発中のものは、さらに多く存在する（ピジリズマブ、ＡＭＰ－２２４、ＡＭＰ－５１４、ＰＤＲ００１、セミプリマブ、ＢＭＳ－９３６５５９及びＣＫ－３０１２）。

【0013】

別の免疫チェックポイント阻害剤ＬＡＧ－３は、様々な種類のリンパ球細胞の活性化により発現する負の制御分子である（上記文献を参照されたい）。ＬＡＧ－３は、免疫抑制性の内在性Ｔｒｅｇ細胞及び誘導性Ｔｒｅｇ細胞の両方が最適に機能するために必要となる（上記文献を参照されたい）。

【0014】

ＰＤ－１及びＬＡＧ－３をモノクローナル抗体でコンビナトリアルに遮断したところ、確立された腫瘍の成長が相乗的に制限された（Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７２（４）：９１７－２７）。コンビナトリアルな抗ＬＡＧ－３／抗ＰＤ－１免疫療法では、確立されたＳａ１Ｎ腫瘍及びＭＣ３８腫瘍は効果的に除去されたが、この療法は、確立されたＢ１６腫瘍に対しては効果がなかった（上記文献を参照されたい）。Ｔｕｒｎｉｓらにより、彼らの研究において、「併用治療の転帰を予測するのは困難であることが明らかになった」と報告された（Ｔｕｒｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（７）：１１７２－１１７４）。

【0015】

誘導性共刺激分子（ＩＣＯＳ）は、メラノーマ及び卵巣癌を含む様々な腫瘍に浸潤しているＴｒｅｇ上で高度に発現することが報告されている（Ｆａｇｅｔ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：３，ｅ２３１８５）。ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬの相互作用は、乳癌において、腫瘍関連（ＴＡ）ＴｒｅｇとＴＡ－ｐＤＣとの相互作用の最中に生じることも報告されている（上記文献を参照されたい）。ＩＣＯＳに対するアンタゴニスト抗体は、ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳ－Ｌの相互作用を阻害するとともに、ｐＤＣによって誘導されるＴｒｅｇの増殖を妨げるのに用いられている（ＷＯ２０１２／１３１００４を参照されたい）。アンタゴニスト抗体は、乳房腫瘍のマウスモデルにおいて、腫瘍の進行を低減するのに使用された（上記文献を参照されたい）。

【0016】

ＩＣＯＳに対するアゴニスト抗体は、腫瘍の治療の際に、抗ＣＴＬＡ－４ブロッキング抗体及び抗ＰＤ－１ブロッキング抗体と組み合わせると有用であるものとして示唆されている（ＷＯ２０１１／０４１６１３を参照されたい）。

【0017】

能動免疫療法及びがんワクチンを含むさらなるがん治療に対するアンメットメディカルニーズがかなり存在するは明らかである。多くの態様では、本開示の実施形態は、現在利用可能であるがん治療を増加及び改善させる併用療法を提供することによって、これらのニーズに対応する。

【発明の概要】

【0018】

本発明の様々な実施形態では、抗原ＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡは、免疫チェックポイントアンタゴニストまたは免疫チェックポイントアゴニストの投与と組み合わせて、患者に静脈内投与すると、がん患者の治療を増強すること、より具体的には、そのがん患者の腫瘍体積の縮小を大きくし、及び／または生存率を上昇させることが示された。

【0019】

したがって、一実施形態では、本発明は、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させるのに用いる組み合わせ物を含み、その組み合わせ物は、ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、静脈内投与すると、ＴＡＡをコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導する組み換えＭＶＡと、ｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストを含み、ａ）及びｂ）をそのがん患者に投与することにより、ａ）またはｂ）のいずれかを単独で非静脈内投与する場合と比べて、腫瘍サイズが縮小し、及び／またはそのがん患者の生存率が上昇する。

【0020】

追加の実施形態では、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、その方法が、ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、静脈内投与すると、ＴＡＡをコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導する組み換えＭＶＡを、そのがん患者に投与することと、ｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストをそのがん患者に投与することを含み、（ａ）及び（ｂ）が、併用治療として投与すべきものであり、ａ）及びｂ）をそのがん患者に投与することにより、ａ）を単独で非ＩＶ投与するかまたはｂ）を単独で投与する場合と比べて、そのがん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／または生存率が上昇する方法が存在する。

【0021】

好ましい実施形態では、その少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストは、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＰＤ－１アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト、ＬＡＧ－３アンタゴニスト、ＴＩＭ－３アンタゴニストまたはＩＣＯＳアゴニストを含む。より好ましい実施形態では、その少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストは、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＰＤ－１アンタゴニストまたはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストを含む。

【0022】

さらなる実施形態では、その少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストは、その免疫チェックポイント分子の機能をブロックできる抗体を含む。好ましい実施形態では、その抗体はそれぞれ、ＣＴＬＡ－４抗体、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＬＡＧ－３抗体、ＩＣＯＳ抗体及びＴＩＭ－３抗体から選択されている。より好ましい実施形態では、その少なくとも１つのアンタゴニストまたはアゴニストは、ＣＴＬＡ－４抗体、ＰＤ－１抗体またはＰＤ－Ｌ１抗体を含む。

【0023】

さらに追加の実施形態では、そのＴＡＡをコードする第１の核酸は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｍｕｃｉｎ１，細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、抗原Ｂｒａｃｈｙｕｒｙまたはこれらを組み合わせたものからなる群から選択されている。

【0024】

１つ以上の好ましい実施形態では、その組み換えＭＶＡは、ＭＶＡ－ＢＮまたはその誘導体である。

【0025】

本発明のさらなる目的及び利点は、一部が下記の説明に示されており、一部は、その説明から明らかとなるか、または本発明を実施することにより認識し得る。本発明の目的及び利点は、添付の請求項で特に指摘されている要素及び組み合わせによって認識及び実現されることになる。

【0026】

添付の図面は、本明細書に援用され、本明細書の一部を成すが、本発明の１つ以上の実施形態を例示するとともに、その明細と併せて、本発明の原理を説明する役割を果たす。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】ＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）の静脈内（ＩＶ）投与により、ＮＫ細胞の全身的な活性化が、皮下（ＳＣ）投与の場合よりも増強されることを示している。そのＭＶＡがＣＤ４０Ｌをコードするときには（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）、ＮＫ細胞の活性化がさらに増強される。示されているのは、実施例１の結果であり、この図では、ＮＫ細胞の出現頻度、及びＮＫｐ４６^＋ＣＤ３^－細胞における、示されているタンパク質マーカーの発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示されている）を評価するための染色を、脾臓において評価した。Ａ）は、ＮＫｐ４６^＋ ＣＤ３^－細胞であり、Ｂ）はＣＤ６９であり、Ｃ）は、ＮＫＧ２Ｄであり、Ｄ）は、ＦａｓＬであり、Ｅ）は、Ｂｃｌ－Ｘ_Ｌであり、Ｆ）は、ＣＤ７０であり、Ｇ）は、ＩＦＮ－γである。

【図2】ＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）のＩＶ投与により、ＮＫ細胞の全身的な活性化が、ＳＣ投与の場合よりも増強されることを示している。そのＭＶＡが、ＣＤ４０Ｌをコードするときには（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）、ＮＫ細胞の活性化は、さらに増強される。示されているのは、実施例１の結果であり、この図では、ＮＫ細胞の出現頻度、及びＮＫｐ４６^＋ＣＤ３^－細胞における、示されているタンパク質マーカーの発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示されている）を評価するための染色を、肝臓において評価した。Ａ）は、ＮＫｐ４６^＋ ＣＤ３^－細胞であり、Ｂ）はＣＤ６９であり、Ｃ）は、ＮＫＧ２Ｄであり、Ｄ）は、ＦａｓＬであり、Ｅ）は、Ｂｃｌ－Ｘ_Ｌであり、Ｆ）は、ＣＤ７０であり、Ｇ）は、ＩＦＮ－γである。

【図3】ＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）のＩＶ投与により、ＮＫ細胞の全身的な活性化が、ＳＣ投与の場合よりも増強されることを示している。そのＭＶＡがＣＤ４０Ｌをコードするときには（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）、ＮＫ細胞の活性化がさらに増強される。示されているのは、実施例１の結果であり、この図では、ＮＫ細胞の出現頻度、及びＮＫｐ４６^＋ＣＤ３^－細胞における、示されているタンパク質マーカーの発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示されている）を評価するための染色を、肺において評価した。Ａ）は、ＮＫｐ４６^＋ ＣＤ３^－細胞であり、Ｂ）は、ＣＤ６９であり、Ｃ）は、ＮＫＧ２Ｄであり、Ｄ）は、ＦａｓＬであり、Ｅ）は、Ｂｃｌ－Ｘ_Ｌであり、Ｆ）は、ＣＤ７０であり、Ｇ）は、ＩＦＮ－γである。

【図4】ＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０Ｌの静脈内（ＩＶ）投与により、ＮＫ細胞の全身的な活性化が、皮下（ＳＣ）投与の場合よりも増強されることを示している。示されているのは、実施例１の結果であり、この図では、ＮＫ細胞の出現頻度、及びＮＫｐ４６^＋ＣＤ３^－細胞における、示されているタンパク質マーカーの発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示されている）を評価するための染色を、脾臓において評価した。Ａ）は、ＮＫｐ４６^＋ ＣＤ３^－細胞であり、Ｂ）はＣＤ６９であり、Ｃ）は、ＦａｓＬであり、Ｄ）は、Ｂｃｌ－Ｘ_Ｌであり、Ｅ）は、ＣＤ７０であり、Ｆ）は、ＩＦＮ－γである。

【図5】ＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０ＬのＩＶ投与により、ＮＫ細胞の全身的な活性化が、ＳＣ投与の場合よりも増強されることを示している。示されているのは、実施例１の結果であり、この図では、ＮＫ細胞の出現頻度、及びＮＫｐ４６^＋ＣＤ３^－細胞における、示されているタンパク質マーカーの発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示されている）を評価するための染色を、肝臓において評価した。Ａ）は、ＮＫｐ４６^＋ ＣＤ３^－細胞であり、Ｂ）は、ＣＤ６９であり、Ｃ）は、ＦａｓＬであり、Ｄ）は、Ｂｃｌ－Ｘ_Ｌであり、Ｅ）は、ＣＤ７０であり、Ｆ）は、ＩＦＮ－γである。

【図6】ＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０ＬのＩＶ投与により、ＮＫ細胞の全身的な活性化が、ＳＣ投与の場合よりも増強されることを示している。示されているのは、実施例１の結果であり、この図では、ＮＫ細胞の出現頻度、及びＮＫｐ４６^＋ ＣＤ３^－細胞における、示されているタンパク質マーカーの発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示されている）を評価するための染色を、肺において評価した。Ａ）は、ＮＫｐ４６^＋ ＣＤ３^－細胞であり、Ｂ）は、ＣＤ６９であり、Ｃ）は、ＦａｓＬであり、Ｄ）は、Ｂｃｌ－Ｘ_Ｌであり、Ｅ）は、ＣＤ７０であり、Ｆ）は、ＩＦＮ－γである。

【図7】ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）のＩＶ投与により、血清中のＩＬ－１２ｐ７０及びＩＦＮ－γのレベルが上昇することを示している。示されているのは、実施例２の結果である。Ａ）ＩＦＮ－γの濃度は、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌの投与後、ＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）による免疫の場合よりも高かった。Ｂ）ＮＫ細胞活性化サイトカインＩＬ－１２ｐ７０は、ＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌによる免疫後のみに検出可能であった。ＩＦＮ－γの血清レベルが高かったことは、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌで免疫後、ＩＦＮ－γ^＋ ＮＫ細胞（図１Ｇを参照されたい）及び脾臓におけるＣＤ６９^＋グランザイムＢ^＋ ＮＫ細胞（Ｃ）の出現頻度が上昇したことと一致する。同様の応答は、ＮＨＰ（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）でも、ＭＶＡ－ＭＡＲＶ－ＧＰ－ｈｕＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）のＩＶ注射後に見られ、すなわち、ＭＶＡ－ＭＡＲＶ－ＧＰ（ｒＭＶＡ）の場合よりも、ＩＦＮ－γ（Ｄ）及びＩＬ－１２ｐ４０／７０（Ｅ）の血清濃度が上昇し、（Ｋｉ６７^＋）ＮＫ細胞（Ｆ）が増殖した。

【図8】ＩＶ免疫により、ＣＤ８ Ｔ細胞応答の増強が、ＳＣ免疫の場合よりも誘導されることを示している。実施例３に示されているように、０日目及び１５日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＭＶＡ－ＯＶＡでＳＣ免疫またはＩＶ免疫した。Ｈ－２Ｋ^ｂ／ＯＶＡ_{２５７－２６４}デキストラマーで染色後、血液中のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答を評価した。

【図9】ＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌによって、ＣＤ８ Ｔ細胞応答をさらに増強できることを示している。実施例４に示されているように、０日目及び３５日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫した。Ｈ－２Ｋ^ｂ／ＯＶＡ_{２５７－２６４}デキストラマーで染色後、血液中のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答を評価した。

【図10】プライム／ブースト免疫後、ＮＫ細胞の活性化及び増殖が反復されることを示している。実施例５に示されているように、表１に示されているようにして、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫した。２回目及び３回目の免疫から１日後及び４日後に、ＮＫ細胞（ＮＫｐ４６^＋ＣＤ３^－）を血液において、フローサイトメトリーによって解析した。Ａ）は、ＣＤ６９のＧＭＦＩを示しており、Ｂ）は、Ｋｉ６７^＋ ＮＫ細胞の出現頻度を示している。

【図11-1】プライム／ブースト免疫後の全身でのサイトカイン応答を示している。実施例６に示されているように、表１に示されているようにして、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫した。免疫から６時間後に、血清サイトカインレベルを測定した。示されているのは、Ａ）ＩＬ－６、Ｂ）ＣＸＣＬ１０、Ｃ）ＩＦＮ－α、Ｄ）ＩＬ－２２、Ｅ）ＩＦＮ－γ、Ｆ）ＣＸＣＬ１、Ｇ）ＣＣＬ４、Ｈ）ＣＣＬ７）、Ｉ）ＣＣＬ２、Ｊ）ＣＣＬ５、Ｋ）ＴＮＦ－α、Ｌ）ＩＬ－１２ｐ７０及びＭ）ＩＬ－１８の結果である。

【図11-2】プライム／ブースト免疫後の全身でのサイトカイン応答を示している。実施例６に示されているように、表１に示されているようにして、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫した。免疫から６時間後に、血清サイトカインレベルを測定した。示されているのは、Ａ）ＩＬ－６、Ｂ）ＣＸＣＬ１０、Ｃ）ＩＦＮ－α、Ｄ）ＩＬ－２２、Ｅ）ＩＦＮ－γ、Ｆ）ＣＸＣＬ１、Ｇ）ＣＣＬ４、Ｈ）ＣＣＬ７）、Ｉ）ＣＣＬ２、Ｊ）ＣＣＬ５、Ｋ）ＴＮＦ－α、Ｌ）ＩＬ－１２ｐ７０及びＭ）ＩＬ－１８の結果である。

【図12】ＭＶＡ及びＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌによるプライム／ブースト免疫後のＣＤ８エフェクターＴ細胞及びＣＤ４エフェクターＴ細胞の誘導を示している。実施例７に記載されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫した。表現型的に、エフェクターＴ細胞をＣＤ４４の発現及び表面ＣＤ６２Ｌの欠損によって特定した。血液中のＡ）ＣＤ４４^＋ ＣＤ６２Ｌ^－ ＣＤ８ Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４４＋ ＣＤ６２Ｌ－ ＣＤ４ Ｔ細胞をモニタリングした。

【図13】メラノーマモデルにおける異種でのプライムブーストスキームでのｒＭＶＡ－ＣＤ４０ＬによるＩＶ免疫の優れた抗腫瘍作用を示している。実施例８に記載されているように、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）で、ＳＣまたはＩＶによってプライミングした（点線）。プライミングから７日後及び１４日後、マウスに、その後のブースティングをＦＰＶ－ＯＶＡで行った（破線）。腫瘍の成長を等間隔で測定した。示されているのは、Ａ）腫瘍平均体積と、Ｂ）腫瘍を接種してから４５日目までの腫瘍担持マウスの生存率（Ｂ）である。

【図14】ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫を１回行った後に、効率的に腫瘍が制御されたことを示している。実施例９に記載されているように、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＩＶでプライミングするか、ＩＶでプライミング及びブースティングした。腫瘍の成長を等間隔で測定した。示されているのは、腫瘍平均体積である。

【図15】ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌで免疫後、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内のＴ細胞浸潤が増加したことを示している。実施例１０に記載されているように、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫した。７日後、マウスを殺処分した。Ａ）は、脾臓、腫瘍流入リンパ節（ＴＤＬＮ）及び腫瘍組織中のＣＤ４５^＋白血球におけるＣＤ８^＋ Ｔ細胞の出現頻度であり、Ｂ）は、免疫後の様々な器官におけるＯＶＡ_{２５７－２６４}特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の分布であり、Ｃ）は、腫瘍内浸潤しているＯＶＡ_{２５７－２６４}特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞上のＰＤ－１及びＬａｇ３のＧＭＦＩである。

【図16】ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌで免疫後、ＴＭＥ内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が長期的に減少したことを示している。実施例１１に記載されているように、精製されたＯＶＡ特異的なＴＣＲトランスジェニックＣＤ８ Ｔ細胞（ＯＴ－Ｉ）をＢ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスに、腫瘍が触知可能となったらＩＶ移入した。腫瘍の体積が少なくとも６０ｍｍ^３に達したら、マウスをＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）、ＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫した。１７日後、さらなる解析のために、マウスを殺処分した。腫瘍組織中のＣＤ４^＋ Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３^＋ ＣＤ４^＋ Ｔｒｅｇの出現頻度である。

【図17】ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌで免疫後、ＴＭＥにおいて、ＴＡＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が、疲弊化の少ない表現型で持続することを示している。精製されたＯＶＡ特異的なＴＣＲトランスジェニックＣＤ８ Ｔ細胞（ＯＴ－Ｉ）をＢ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスにＩＶ移入した。腫瘍の体積が少なくとも６０ｍｍ^３に達したら、マウスをＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）、ＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫した。１７日後、マウスを殺処分し、Ａ）腫瘍組織中の白血球におけるＣＤ８^＋ Ｔ細胞の出現頻度、Ｂ）ＣＤ８^＋ Ｔ細胞におけるＬａｇ３^＋ ＰＤ１^＋の出現頻度、Ｃ）ＣＤ８^＋ Ｔ細胞におけるＥｏｍｅｓ^＋ ＰＤ１^＋ Ｔ細胞の出現頻度、Ｄ）免疫後のＴＭＥにおけるＯＴ－Ｉ－トランスジェニックＣＤ８^＋ Ｔ細胞の存在、Ｅ）ＯＴ－Ｉ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞におけるＬａｇ３^＋ ＰＤ１^＋疲弊Ｔ細胞の出現頻度、及びＦ）ＯＴ－Ｉ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞におけるＥｏｍｅｓ^＋ ＰＤ１^＋疲弊Ｔ細胞の出現頻度について解析した。

【図18】ＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ＣＤ４０Ｌの導入遺伝子の発現を示している。実施例１２に記載されているように、ＨｅＬａ細胞を未処置のままにするか（モック、内側が灰色で塗りつぶされた線）、ＭＶＡ－ＢＮに感染させるか（内側が黒で塗りつぶされた線）、またはＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ＣＤ４０Ｌに感染させるか（内側が塗りつぶされていない線）した。続いて、Ａ）ＭＶＡ、Ｂ）ＨＥＲ２ｖ１、Ｃ）Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及びＤ）ＣＤ４０Ｌからのタンパク質発現をフローサイトメトリーによって求めた（ヒストグラムを参照されたい）。

【図19】ＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ＣＤ４０Ｌによって、ヒトＤＣの活性化が、ＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－ｂｒａｃｈｙｕｒｙよりも、用量依存的に増強されることを示している。実施例１４に記載されているように、ヒトＰＢＭＣからＣＤ１４^＋単球を濃縮後、単球由来ＤＣを作製し、７日間、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４の存在下で培養した。ＤＣをＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－ｂｒａｃｈｙｕｒｙまたはＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ＣＤ４０Ｌで刺激した。Ａ）ＣＤ４０Ｌ、Ｂ）ＣＤ８６及びＣ）クラスＩＩ ＭＨＣの発現をフローサイトメトリーによって測定した。Ｄ）では、ＩＬ－１２ｐ７０の濃度を定量した。

【図20】ＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０ＬでＩＶ免疫後、腫瘍微小環境において、ＨＥＲ２特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞が産生するＩＦＮ－γの浸潤が増加したことを示している。実施例１６に記載されているように、触知可能なＣＴ２６．ＨＥＲ２腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスをＰＢＳまたはＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０ＬのいずれかでＩＶ免疫した。７日後、脾臓のＣＤ８^＋ Ｔ細胞及び腫瘍に浸潤しているＣＤ８＋ Ｔ細胞を磁気細胞ソーティングによって単離し、ＨＥＲ２ペプチドをロードした樹状細胞の存在下で、５時間培養した。グラフには、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞におけるＣＤ４４^＋ ＩＦＮ－γ^＋細胞のパーセンテージが示されている。

【図21】抗ＰＤ１チェックポイントの遮断と組み合わせて、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０ＬをＩＶ投与したところ、全生存率が上昇し、腫瘍が縮小したことを示している。８５ｍｍ^３のＭＣ３８大腸癌を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＭＶＡ－ＡＨ１Ａ５－ｐ１５ｅ－ＴＲＰ２－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ｐ１５ｅＣＤ４０Ｌとして示されている）でＩＶ免疫するか、またはそのマウスにＰＢＳを投与するかした。実施例１７に記載されているように、その後、免疫後に抗ＰＤ－１抗体を投与した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。示されているのは、腫瘍平均体積（Ａ）及び腫瘍なしの生存率（Ｂ）である。

【図22】抗ＰＤ１剤によるチェックポイントの遮断と組み合わせて、ＭＶＡ－Ｔｗｉｓｔ－Ｈｅｒ２－ＣＤ４０ＬをＩＶ投与したところ、全生存率が上昇し、腫瘍が縮小したことを示している。８５ｍｍ^３のＭＣ３８．ＨＥＲ２大腸癌を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＭＶＡ－Ｔｗｉｓｔ－Ｈｅｒ２ｖ１－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－Ｔｗｉｓｔ－Ｈｅｒ２ｖ１－ＣＤ４０Ｌ及びＰＤ－１、またはＰＤ－１単独でＩＶ免疫するか、そのマウスにＰＢＳを投与するかした。実施例１８に記載されているように、続いて、免疫後、抗ＰＤ－１抗体を投与した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。示されているのは、腫瘍平均体積（Ａ）及び腫瘍なしの生存率（Ｂ）である。

【図23】内因性レトロウイルス抗原Ｇｐ７０をコードするＭＶＡウイルスの静脈内注射の抗腫瘍作用を示している。ＣＴ２６．ｗｔ腫瘍担持Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を群分けし、腫瘍の接種から１２日後、それらのマウスに、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０もしくはＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌを静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。示されているのは、腫瘍平均直径（図２３Ａ）及び腫瘍平均体積（図２３Ｂ）である。免疫から７日後、血液細胞を再刺激し、刺激後の血液中のＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＣＤ４４＋ ＩＦＮ－γ＋細胞のパーセンテージが示されている（図２３Ｃ）。

【図24】内因性レトロウイルス抗原Ｇｐ７０をコードするＭＶＡウイルスの静脈内注射の抗腫瘍作用を示している。Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日後、それらのマウスに、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０もしくはＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌを静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。示されているのは、腫瘍平均体積（図２４Ａ）、及び免疫から７日後に、ｐ１５ｅペプチドで刺激した後の血液中のＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＣＤ４４＋ ＩＦＮ－γ＋細胞のパーセンテージ（図２４Ｂ）である。

【発明を実施するための形態】

【0028】

上記の概要及び下記の詳細な説明のいずれも、例示及び説明のためのものに過ぎず、特許請求されているような本発明を制限するものではないことを理解されたい。

【0029】

ＣＤ４０Ｌは、ＭＶＡの一部としてコードされるときには、疾患関連抗原に対する全体的なＴ細胞応答を誘導及び増強できることが示された。ＷＯ２０１４／０３７１２４。ＷＯ２０１４／０３７１２４では、ＣＤ４０Ｌと異種抗原とをコードする組み換えＭＶＡが、インビボでＤＣの活性化を増強し、その異種抗原に特異的なＴ細胞応答を増大させ、ＣＤ８ Ｔ細胞の質及び量を高めることができることが示された。上記文献を参照されたい。相乗的な抗腫瘍応答を誘導するために、本発明の各種医薬組み合わせ物を開発した。いくつかの態様では、その各種医薬組み合わせ物は、チェックポイントアンタゴニストまたはチェックポイントアゴニストと組み合わせると、腫瘍細胞を殺傷できる高い効果の腫瘍特異的なキラーＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の両方を誘導する。このＮＫ細胞及びＴ細胞の活性化の増強は、チェックポイントアンタゴニストまたはチェックポイントアゴニストと組み合わせると、ＭＶＡによって同様に誘導されるキラーＴ細胞応答の増強と組み合わさって、がんである対象において、相乗的に、腫瘍の縮小を大きくし、全生存率を上昇させることが示されている。

【0030】

一実施形態では、本発明は、ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡの静脈内（ＩＶ）投与と、ｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストを含む組み合わせ物または併用療法である。本明細書に示されているように、様々な実施形態では、その少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストは、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＰＤ－１アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト、ＬＡＧ－３アンタゴニスト、ＴＩＭ－３アンタゴニスト及びＩＣＯＳアゴニストから選択されている。同様に本明細書に示されているように、より好ましい実施形態では、その少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストは、抗体を含む。さらに、より好ましい実施形態では、そのＣＴＬＡ－４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ－４抗体を含み、そのＰＤ－１アンタゴニストは、ＰＤ－１抗体を含み、そのＰＤ－Ｌ１アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１抗体を含み、そのＬＡＧ－３アンタゴニストは、ＬＡＧ－３抗体を含み、そのＴＩＭ－３アンタゴニストは、ＴＩＭ－３抗体を含み、そのＩＣＯＳアゴニストは、ＩＣＯＳ抗体を含む。

【0031】

本願で説明及び例示されているように、本発明の組み合わせ物及び／または併用療法は、がん患者の免疫応答の複数局面を増強する。少なくとも１つの態様では、その組み合わせ物は、自然免疫応答及び適応免疫応答の両方を相乗的に増強し、免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストと組み合わせると、がん患者の腫瘍体積を縮小し、生存率を上昇させる。その組み合わせ物及び／または療法の作用増強が１つ以上、以下に概括されている。

【0032】

組み換えＭＶＡのＩＶ投与により、ＮＫ細胞応答が増強される。
一態様では、本発明は、対象に静脈内投与する組み換えＭＶＡであって、そのＩＶ投与により、その対象において、自然免疫応答の増強、より具体的には、ＮＫ細胞応答の増強が、組み換えＭＶＡをその対象に非ＩＶ投与することにより誘導されるＮＫ細胞応答と比べて誘導される組み換えＭＶＡを含む。図１～７及び１０～１２に示されているように、組み換えＭＶＡのＩＶ投与により、いくつかの区画において、単回ＩＶ投与の場合、及び同種でのプライム－ブーストとして静脈内投与した場合のいずれでも、非ＩＶ投与の場合と比べて、全身での活発なＮＫ細胞応答が誘導された。

【0033】

図１～６に示されているように、ＮＫ細胞応答の質が、非ＩＶ投与の場合よりも高まった。解析したすべての器官（脾臓、肝臓及び肺）で、活性化マーカーＣＤ６９が増加する。脾臓及び肺のいずれでも、ＮＫ細胞の生存性、共刺激ＣＤ７０及びエフェクターサイトカインＩＦＮ－γを増強する抗アポトーシス性のＢｃｌファミリーメンバーＢｃｌ－Ｘ_Ｌが増加した。肝臓及び肺では、ＩＶ後、ＳＣ注射の場合よりも、活性化ナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体の発現が特に増大した。ＮＫＧ２Ｄは、腫瘍細胞上のリガンドに結合して、その腫瘍細胞の除去を促す（Ｇａｒｃｉａ－Ｃｕｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１５。Ｓｐｅａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３で論評）。

【0034】

ＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡのＩＶ投与により、ＮＫ細胞応答がさらに増強される。
本発明の別の態様では、その組み換えＭＶＡに加えて、抗原ＣＤ４０ＬをＩＶ投与したところ、組み換えＭＶＡを単独でＩＶ投与した場合よりも、ＮＫ細胞応答がさらに増強されたことが明らかになった。図１～７及び１０～１２に示されているように、抗原ＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡでは、単回投与の場合、及び同種でのプライミングブーストとして投与した場合のいずれでも、ＣＤ４０Ｌをコードしない組み換えＭＶＡよりも強力なＮＫ細胞応答が誘導された。さらに、組み換えＭＶＡを単独でＩＶ投与した場合よりも、ＮＫ細胞応答の質が高くなった。解析したすべての器官で、ＮＫ細胞による、エフェクターサイトカインＩＦＮ－γの発現の増加が観察された（図１～６、脾臓、肝臓、肺）とともに、解析したすべての器官で、ＮＫ細胞による、ＣＤ６９の発現が観察された（図５Ｃ）。さらに、図７には、マウス及びＮＨＰの両方において、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０ＬでＩＶ免疫してから６時間後に、組み換えＭＶＡの場合と比べて、ＩＦＮ－γの血清レベルが増加したこと、より重要なことには、ＮＫ細胞活性化サイトカインＩＬ－１２ｐ７０の血清レベルが増加したことが示されている。加えて、ＮＫ細胞の増殖（Ｋｉ６７の発現によって示される）の増強が、マウスの全身（図７Ｂ）のみならず、ＮＨＰの末梢血（図６Ｆ）でも観察された。これらの結果から、いくつかの動物研究モデルにおいて、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０ＬでのＩＶ免疫が、ｒＭＶＡの場合よりも、ＮＫ細胞の質を向上させることが示されている。

【0035】

組み換えＭＶＡウイルスは以前に、静脈内投与されたことがあるが（例えば、ＷＯ２００２／４２４８０、ＷＯ２０１４／０３７１２４を参照されたい）、組み換えＭＶＡの投与及び処置は、ＣＤ８ Ｔ細胞応答のような適応免疫応答の増強と関連があることが以前に分かった。例えば、ＷＯ２００２／４２４８０では、１匹のマウス当たり１０^７ ｐｆｕのＭＶＡ－ＢＮをＩＶ投与するか、または１匹のマウス当たり１０^７ ｐｆｕもしくは１０^８ ｐｆｕのＭＶＡ－ＢＮを皮下投与することによって、非組み換えＭＶＡを用いた免疫を行った後、ＣＴＬ応答を測定した。ＷＯ２０１４／０３７１２４では、マウスに、組み換えＭＶＡ、及びＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡを静脈内接種した（ＷＯ２０１４／０３７１２４を参照されたい）。ＣＴＬ応答が増強されたとともに、組み換えＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌの免疫原性の向上が、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞に依存しないが、宿主におけるＣＤ４０に依存することが明らかになった。

【0036】

少なくとも１つの態様では、本発明で見られる、ＮＫ細胞応答の増強は、予想外である。当該技術分野では、ＭＶＡに誘導される、ＮＫ細胞の活性化は、皮下免疫後、リンパ節に常在するＣＤ１６９陽性嚢下洞（ＳＣＳ）マクロファージに依存することが示されたと認識されていたからである（Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ １２０：４７４４－５０）。

【0037】

別の態様では、本発明の医薬組み合わせ物は、同種及び／または異種でのプライム－ブーストレジメンの一部として投与する。図１０～１２に示されているように、ＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡを同種及び／または異種でのプライムブーストレジメンの一部として、対象に投与すると、ＮＫ細胞応答の増強が延長及び再活性化されるとともに、対象のＣＤ８ Ｔ細胞応答及びＣＤ４ Ｔ細胞応答が増大する。

【0038】

本発明の少なくとも１つの態様では、組み換えＭＶＡ及び組み換えＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌの反復ＩＶ投与に起因する、ＮＫ細胞応答の増強は、驚くべきものであった。少なくとも１つの態様では、驚くべきことに、ブーストＩＶ免疫から２４時間後に、ＩＦＮ－αの増加が見られない状態で、ＮＫ細胞の活性化及び増殖の増大が観察された。実際、二次感染症及びがんにおける、ＮＫ細胞の活性化及びプライミングは主に、ＩＦＮ－αによって駆動されることが分かった（例えば、Ｓｔａｃｋａｒｕｋ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ．１２（８）：８７５－８４及びＭｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：３０４を参照されたい）。驚くべきことに、ｒＭＶＡ ｈｏｍ、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ ｈｏｍまたはｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ ｈｅｔでのＩＶブースト免疫から６時間後、ＩＦＮ－αの血清レベルの上昇は観察されなかった（図１１Ｃ）。勘案すると、１つ以上の異種抗原をコードする核酸を含むｒＭＶＡによる、同種または異種で反復ＩＶ免疫を行ったところ、予想外にも、ＩＦＮ－αに依存せずに、ＮＫ細胞の活性化及び増殖が見られた。

【0039】

本発明の以前には、組み換えＭＶＡによってコードされるＣＤ４０Ｌが、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞の代わりとなり得ると理解されていた（Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２５１）。さらに、組み換えＭＶＡによってコードされるＣＤ４０Ｌが、ＣＤ４ Ｔ細胞には作用を及ぼさないことが分かった。予想外にも、我々は、プライム免疫から２５日後に、ＣＤ４^＋メモリーＴ細胞の増加を認め（図１２Ｂ）、この増加は、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ ｈｏｍ及びｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ ｈｅｔ）でブーストＩＶ免疫してから４日後のものと一致する（２１日目。表１を参照されたい）。この知見は、ＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ ｈｏｍ及びＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ ｈｅｔの群でブーストＩＶ免疫してから６時間後に定量した、ＩＬ－２２（ヘルパーＴ細胞応答を示す重要なサイトカイン）の産生の増加によって裏付けられている（図１１Ｄ）。この予想外の観察結果は、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌによる、メモリー応答の維持に関連がある。さらに、ＣＤ４ Ｔ細胞は、腫瘍部位で腫瘍特異的なＣＤ８ Ｔ細胞を補佐し、活性化誘導細胞の死滅を回避し、さらには、ＣＤ４ Ｔ細胞自体が細胞傷害性細胞になることができる（Ｋｅｎｎｅｄｙ ａｎｄ Ｃｅｌｉｓ（２００８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２２２：１２９－４４、Ｋｎｕｔｓｏｎ ａｎｄ Ｄｉｓｉｓ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．５：３６５－７１で論評されている）。これらの結果は、予想外である。アデノウイルス及び単純ヘルペスウイルスのような他のウイルスのベクターは、ブースト免疫の際に、ワクチンによってコードされる抗原に対する免疫応答の誘導を妨げるベクター特異的免疫を誘導するからである（Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８６：２４０１－１０、Ｐｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１８５２６）。

【0040】

ＭＶＡのＩＶ投与により、腫瘍の免疫抑制作用が低下する。
図１３～１５及び１９に示されているように、異種抗原とＣＤ４０Ｌとをコードする組み換えＭＶＡを静脈内投与したところ、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の腫瘍内浸潤が誘導され、複数の免疫抑制作用（典型的には、腫瘍が、免疫系を回避する目的で利用する作用）が低下した。ＣＤ４０Ｌでのチャレンジとともに、またはＣＤ４０Ｌでのチャレンジを行わずに、組み換えＭＶＡを投与したところ、腫瘍で内因性ＣＤ８^＋細胞が増加したのに加えて、脾臓及び腫瘍で、ＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡをＩＶ投与したところ、ＣＤ４０ＬをコードしないＭＶＡよりも、抗原（ＯＶＡ）特異的Ｔ細胞が増加した。加えて、ＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡをＩＶ投与したところ、腫瘍微小環境内で、エフェクターサイトカインＩＦＮ－γを産生する、抗原ＨＥＲ２に特異的なＴ細胞が増強された（図１９）。驚くべきことに、異種抗原とＣＤ４０Ｌとをコードする組み換えＭＶＡを投与したところ、腫瘍微小環境内の免疫抑制性の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）数が減少した（図１６）。

【0041】

ＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡと、チェックポイントアンタゴニストまたはチェックポイントアゴニストとの併用は、がん患者の腫瘍量を減少させ、生存率を上昇させる。
様々な実施形態では、この併用治療は、ａ）ＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡのＩＶ投与と、ｂ）免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストの投与を含む。図２０及び２１に示されているように、本開示の併用治療により、腫瘍体積が縮小し、全生存率が上昇した。両方のベクターにより誘導されるＩ型インターフェロン及びＩＩ型インターフェロン（図１１Ｃ及び１１Ｅ）は、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の発現の既知の誘導因子であることが知られている（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８：２１７１－２１８６で論評されている）。少なくとも１つの態様では、本発明の医薬組み合わせ物の抗腫瘍作用の増強（例えば、腫瘍体積の縮小及び／または生存率の上昇）は、本明細書に記載されている、チェックポイントの遮断、ならびに自然Ｔ細胞応答及び適応Ｔ細胞応答の増強を介して、腫瘍によって誘導される免疫抑制性微小環境に対する対抗作用を相乗的に組み合わせることから実現される。例示的な一実施形態では、これらの増強には、上で列挙したもの、例えば自然（例えばＮＫ細胞）応答の増強、及び適応Ｔ細胞応答の増強のうちの１つ以上が含まれる。

【0042】

定義
本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」の付された単数形には、文脈上明らかに別段に示されていない限り、複数の言及物が含まれる。したがって、例えば、「核酸」という場合には、その核酸が１つ以上含まれ、「その方法」という場合には、当業者に知られている同等の工程及び方法であって、修正可能であるか、または本明細書に記載されている方法と置き換え可能である工程及び方法への言及が含まれる。

【0043】

別段に示されていない限り、一連の要素の前に付された「少なくとも」という用語は、その一連の要素の１つ１つを指すと理解されたい。当業者は、慣用的に過ぎない実験を用いて、本明細書に記載されている発明の具体的実施形態の均等物を数多く認識するか、または確認できるであろう。このような均等物は、本発明に含まれるように意図されている。

【0044】

本明細書及び下記の請求項の全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形語は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、示されている整数もしくは工程、または整数群もしくは工程群を含むことを示唆しているが、いずれかの他の整数もしくは工程、または整数群もしくは工程群を除外しないことを理解されたい。本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、または場合によっては、本明細書で使用する場合、「有する」という用語に置き換えることができる。あまり好ましくはないが、上記の用語（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、有する）のいずれも、本明細書において、本発明の態様または実施形態の関連で使用する場合にはいずれも、「～からなる」という用語に置き換えることができる。本明細書で使用する場合、「～からなる」という場合には、その請求要素に定められていない要素、工程または成分はいずれも除外される。本明細書で使用する場合、「～から本質的になる」という場合には、その請求項の基本的かつ新規な特徴に重大な影響を及ぼさない材料または工程は除外されない。

【0045】

本明細書で使用する場合、示されている複数の要素間に置かれた「及び／または」という接続語は、個々の選択肢、及び選択肢を組み合わせたものの両方を含むものとして理解する。例えば、２つの要素が、「及び／または」によって接続されている場合、第１の選択肢は、その第２の要素を含まずに、その第１の要素を適用可能であることを指す。第２の選択肢は、その第１の要素を含まずに、その第２の要素を適用可能であることを指す。第３の選択肢は、その第１の要素及び第２の要素を併せて適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つが、その意味の範囲内に入り、すなわち、本明細書で使用する場合の「及び／または」という用語の要件を満たすと理解されたい。その選択肢のうちの２つ以上を同時に適用することも、その意味の範囲内に入り、すなわち、「及び／または」という用語の要件を満たすと理解されたい。

【0046】

本明細書に記載されているような「変異」または「改変」タンパク質または抗原は、本明細書では、欠失、付加、挿入及び／または置換のようないずれかの改変を核酸またはアミノ酸に加えたものとして定義する。

【0047】

本明細書で使用する場合、「宿主細胞」とは、外来の分子、ウイルスまたは微生物が導入された細胞である。非限定的な例の１つでは、本明細書に記載されているように、好適な細胞培養液の細胞（例えばＣＥＦ細胞など）に、ポックスウイルス、または他の代替的な実施形態では、外来または異種の遺伝子を含むプラスミドベクターを感染させることができる。したがって、好適な宿主細胞及び細胞培養液は、ポックスウイルス及び／または外来または異種の遺伝子に対する宿主として機能する。

【0048】

本明細書に記載されている核酸配列に関する「配列相同性パーセント（％）または配列同一性パーセント（％）」は、候補配列と参照配列をアラインメントし、必要に応じて、配列同一性パーセントが最大になるように、ギャップを導入した後、いずれの保存的置換も配列同一性としてみなさない場合に、候補配列内のヌクレオチドのうち、参照配列（すなわち、由来元の核酸配列）内のヌクレオチドと同一であるヌクレオチドのパーセンテージとして定義する。ヌクレオチドの配列同一性パーセントまたは配列相同性パーセントを求めるためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）というソフトウェアのような公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当該技術分野の技術の範囲内である様々な方法で行うことができる。当業者は、比較する配列の完全長にわたって、アラインメントを最大限にするのに必要ないずれかのアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを定めることができる。

【0049】

例えば、核酸配列の適切なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９８１），Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９の局所相同性アルゴリズムによって得られる。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３－３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ）によって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ（１９８６），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５－６７６３によって標準化されたスコアリングマトリックスを用いることによって、アミノ酸配列に適用できる。配列の同一性パーセントを求めるための、このアルゴリズムの例示的なインプリメンテーションは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって、「ＢｅｓｔＦｉｔ」というユーティリティアプリケーション内に供給されている。この方法のためのデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）から入手可能）に記述されている。本発明の関連において、同一性パーセントを求めるための好ましい方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有し、Ｊｏｈｎ Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋが開発し、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ）が流通させているプログラムのＭＰＳＲＣＨ パッケージを使用することである。この一連のパッケージから、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを用いることができ、その際、デフォルトパラメーターをスコア表に使用する（例えば、ギャップオープンペナルティー：１２、ギャップエクステンションペナルティー：１、ギャップ：６）。生成されたデータから、「マッチ」値に「配列同一性」が反映される。配列間の同一性パーセントまたは類似性パーセントを算出するための他の好適なプログラムは概して、当該技術分野において知られており、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターで使用するＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは、ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ、ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ、ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ、ｃｕｔｏｆｆ＝６０、ｅｘｐｅｃｔ＝１０、Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ、Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲというデフォルトパラメーターを用いて使用できる。これらのプログラムの詳細は、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／というインターネットアドレスで見ることができる。

【0050】

「プライム－ブーストワクチン接種」または「プライム－ブーストレジメン」という用語は、所定の抗原を標的とするワクチンの１回目のプライミング注射を行ってから、間隔を空けて、同じワクチンのブースティング注射を１回以上行うことを用いるワクチン接種策またはワクチン接種レジメンを指す。プライム－ブーストワクチン接種は、同種であっても異種であってもよい。同種でのプライム－ブーストワクチン接種（本明細書では、「ｈｏｍ」と称する場合もある）では、プライミング注射と１回以上のブースティング注射の両方に、同じ抗原及び同じベクターを含むワクチンを使用する。異種でのプライム－ブーストワクチン接種（本明細書では、「ｈｅｔ」と称する場合もある）では、プライミング注射と１回以上のブースティング注射の両方で、同じ抗原を含むが、プライミング注射と１回以上のブースティング注射で、異なるベクターを含むワクチンを使用する。例えば、同種でのプライム－ブーストワクチン接種では、プライミング注射で、１つ以上の抗原を発現する核酸を含む組み換えポックスウイルスを使用し、１回以上のブースティング注射で、１つ以上の抗原を発現する同じ組み換えポックスウイルスを使用してよい。これに対して、異種でのプライム－ブーストワクチン接種では、プライミング注射で、１つ以上の抗原を発現する核酸を含む組み換えポックスウイルスを使用し、１回以上のブースティング注射で、１つ以上の抗原を発現する異なる組み換えポックスウイルスを使用してよい。

【0051】

「組み換え」という用語は、天然では見られないか、または天然では見られない構成で、別のポリヌクレオチドに連結されている、半合成または合成の供給源のポリヌクレオチド、ウイルスまたはベクターを意味する。

【0052】

本明細書で使用する場合、腫瘍体積の縮小（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）または縮小（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）は、腫瘍体積及び／または腫瘍サイズの縮小として特徴付けることができるが、当該技術分野において理解される臨床試験エンドポイントの観点で特徴付けることもできる。腫瘍体積及び／または腫瘍サイズの縮小と関連付けられた例示的ないくつかの臨床試験エンドポイントとしては、奏効率（ＲＲ）、客観的奏効率（ＯＲＲ）などを挙げることができるが、これらに限らない。

【0053】

本明細書で使用する場合、生存率の上昇は、がん患者の生存率の上昇として特徴付けることができるが、当該技術分野において理解される臨床試験エンドポイントの観点で特徴付けることもできる。生存率の上昇と関連付けられた例示的ないくつかの臨床試験エンドポイントとしては、全生存率（ＯＳ）、無増悪生存率（ＰＦＳ）などが挙げられるが、これらに限らない。

【0054】

本明細書で使用する場合、「導入遺伝子」または「異種」遺伝子は、野生型ポックスウイルスゲノム（例えば、ワクシニア、鶏ポックスまたはＭＶＡ）に存在しない核酸配列またはアミノ酸配列であると理解されたい。「導入遺伝子」または「異種遺伝子」とは、ワクシニアウイルスのようなポックスウイルスに存在するときには、その組み換えポックスウイルスを宿主細胞に投与後、その遺伝子が、対応する異種遺伝子産物として、すなわち「異種抗原」及び￥または「異種タンパク質」として発現するような方法で、そのポックスウイルスゲノムに導入されたものであると当業者は理解する。発現は通常、そのポックスウイルス感染細胞内での発現を可能にする調節エレメントに、その異種遺伝子を機能的に連結することによって行われる。好ましくは、その調節エレメントは、天然または合成のポックスウイルスプロモーターを含む。

【0055】

「ベクター」とは、異種のポリヌクレオチドを含むことができる組み換えＤＮＡプラスミド、組み換えＲＮＡプラスミド、または組み換えウイルスを指す。その異種のポリヌクレオチドは、予防目的または療法目的の、対象とする配列を含んでよく、任意に、発現カセットの形態であってよい。本明細書で使用する場合、ベクターは、最終標的の細胞または対象において複製できる必要はない。この用語には、クローニングベクター及びウイルスベクターが含まれる。

【0056】

組み合わせ物及び方法
様々な実施形態では、本発明は、がん患者において腫瘍体積を縮小させ、及び／または生存率を上昇させることによって、そのがん患者を治療するための組み合わせ物を含む。その組み合わせ物は、ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡであって、静脈内投与すると、ＴＡＡをコードする第１の核酸と、抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸抗原とを含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答よりも、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導する組み換えＭＶＡと、ｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストを含む。

【0057】

ＮＫ細胞応答の増強
一態様では、本開示による、「ＮＫ細胞応答の増強」は、１）ＮＫ細胞出現頻度の上昇、２）ＮＫ細胞の活性化の増大、及び／または３）ＮＫ細胞の増殖の増加のうちの１つ以上によって特徴付けられる。したがって、本開示に従って、ＮＫ細胞応答が増強されたか否かは、ＮＫ細胞出現頻度の上昇、ＮＫ細胞の活性化の増大、及び／またはＮＫ細胞の増殖の増加を示す１つ以上の分子の発現を測定することによって判断できる。ＮＫ細胞の出現頻度及び／または活性を測定するのに有用である例示的なマーカーには、ＮＫｐ４６、ＩＦＮ－γ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＮＫＧ２Ｄ、ＦａｓＬ、グランザイムＢ、ＣＤ５６及び／またはＢｃｌ－Ｘ_Ｌのうちの１つ以上が含まれる。ＮＫ細胞の活性化を測定するのに有用である例示的なマーカーには、ＩＦＮ－γ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＮＫＧ２Ｄ、ＦａｓＬ、グランザイムＢ及び／またはＢｃｌ－Ｘ_Ｌのうちの１つ以上が含まれる。ＮＫ細胞の増殖を測定するのに有用である例示的なマーカーには、Ｋｉ６７が含まれる。これらの分子及びその測定は、当該技術分野において理解されている実証済みのアッセイであり、既知の技法に従って行うことができる。例えば、Ｂｏｒｒｅｇｏ ｅｔ ａｌ．（（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９７：１５９－１６５）を参照されたい。加えて、それらの分子を測定するためのアッセイは、本開示の実施例１～３及び９に見ることができる。少なくとも一態様では、１）ＮＫ細胞出現頻度の上昇は、ＣＤ３^－ＮＫｐ４６^＋細胞が、治療前／ベースラインと比べて、少なくとも２倍増加することとして定義でき、２）ＮＫ細胞の活性化の増大は、ＩＦＮ－γ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＮＫＧ２Ｄ、ＦａｓＬ、グランザイムＢ及び／またはＢｃｌ－Ｘ_Ｌの発現が、治療前／ベースラインの発現と比べて、少なくとも２倍増加することとして定義でき、及び／または３）ＮＫ細胞の増殖の増加は、Ｋｉ６７の発現が、治療前／ベースラインの発現と比べて、少なくとも１．５倍増加することとして定義する。

【0058】

Ｔ細胞応答の増強
本願によれば、「Ｔ細胞応答の増強」は、１）ＣＤ８ Ｔ細胞の出現頻度の上昇、２）ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化の増大、及び／または３）ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖の増加のうちの１つ以上によって特徴付けられる。したがって、本願に従って、Ｔ細胞応答が増強されたか否かは、１）ＣＤ８ Ｔ細胞出現頻度の上昇、２）ＣＤ８ Ｔ細胞活性化の増大、及び／または３）ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖の増加を示す１つ以上の分子の発現を測定することによって判断できる。ＣＤ８ Ｔ細胞の出現頻度、活性化及び増殖を測定するのに有用である例示的なマーカーにはそれぞれ、ＣＤ３、ＣＤ８、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＣＤ６９及び／またはＣＤ４４、ならびにＫｉ６７が含まれる。抗原特異的Ｔ細胞の出現頻度は、ＥＬＩｓｐｏｔまたはＭＨＣマルチマー（ペンタマー、もしくは本願によって示されているようデキストラマーなど）によって測定することができる。このような測定及びアッセイは、当該技術分野において、確立及び理解されている。

【0059】

一態様では、ＣＤ８ Ｔ細胞出現頻度の上昇は、ＩＦＮ－γ及び／またはデキストラマー^＋ＣＤ８ Ｔ細胞が、治療前／ベースラインと比べて、少なくとも２倍増加することによって特徴付けられる。ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化の増大は、ＣＤ６９及び／またはＣＤ４４の発現が、治療前／ベースラインの発現と比べて、少なくとも２倍増大することとして特徴付けられる。ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖の増加は、Ｋｉ６７の発現が、治療前／ベースラインの発現と比べて、少なくとも２倍増加することとして特徴付けられる。

【0060】

代替的な態様では、Ｔ細胞応答の増強は、エフェクターサイトカインの発現の増加、及び／または細胞傷害性エフェクター機能の増加によって特徴付けられる。エフェクターサイトカインの発現の増加は、治療前／ベースラインと比べた場合の、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及び／またはＩＬ－２のうちの１つ以上の発現によって測定できる。細胞傷害性エフェクター機能の増加は、ＣＤ１０７ａ、グランザイムＢ及び／またはパーフォリンのうちの１つ以上の発現、及び／または標的細胞の抗原特異的な殺傷によって測定できる。

【0061】

本明細書に記載されているアッセイ、サイトカイン、マーカー及び分子、ならびにその測定は、当該技術分野において確立及び理解されており、既知の技法に従って行うことができる。加えて、Ｔ細胞応答を測定するためのアッセイは、Ｔ細胞応答を解析した実施例３、７、１０及び１５に見ることができる。

【0062】

本発明によって認識された、Ｔ細胞応答の増強は、ＮＫ細胞応答の増強と組み合わさると特に有益である。Ｔ細胞の増強により、がん患者において、初期の自然免疫応答を回避し、及び／または初期の自然免疫応答に耐えた腫瘍細胞が効果的に標的とされ、殺傷されるからである。さらに、抗体治療では、クラスＩ ＭＨＣによるＴＡＡの提示を増強でき、その結果、ＴＡＡ特異的Ｔ細胞による溶解に対するＴＡＡ発現腫瘍の感受性が高くなる（Ｋｏｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：２５３８－４４）。

【0063】

追加の実施形態では、本発明の組み合わせ物は、少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストをさらに含む。好ましい実施形態では、その少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストは、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＰＤ－１アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト、ＬＡＧ－３アンタゴニスト、ＴＩＭ－３アンタゴニストまたはＩＣＯＳアゴニストを含む。より好ましい実施形態では、その少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストは、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＰＤ－１アンタゴニストまたはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストを含む。

【0064】

さらなる実施形態では、その少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストは、免疫チェックポイント分子の機能をブロックできる抗体を含む。好ましい実施形態では、その抗体はそれぞれ、ＣＴＬＡ－４抗体、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＬＡＧ－３抗体、ＩＣＯＳ抗体及びＴＩＭ－３抗体から選択されている。より好ましい実施形態では、その少なくとも１つのアンタゴニストまたはアゴニストは、ＣＴＬＡ－４抗体、ＰＤ－１抗体またはＰＤ－Ｌ１抗体を含む。

【0065】

さらに追加の実施形態では、本明細書に記載されている組み合わせ物及び方法は、ヒトがん患者の治療に用いるものである。好ましい実施形態では、そのがん患者は、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、尿路上皮、子宮頸部または結腸直腸癌からなる群から選択したがんに罹患しており、及び／またはそのがんと診断されている。さらに追加の実施形態では、本明細書に記載されている組み合わせ物及び方法は、乳癌、結腸直腸癌またはメラノーマ、好ましくはメラノーマ、より好ましくは結腸直腸癌、最も好ましくは結腸直腸癌に罹患しており、及び／またはそのがんと診断されているヒトがん患者の治療に用いるものである。

【0066】

特定の例示的な腫瘍関連抗原
特定の実施形態では、免疫応答は、対象において、細胞関連ポリペプチド抗原に対して起きるものである。特定のこのような実施形態では、細胞関連ポリペプチド抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。

【0067】

「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸が、ペプチド結合または改変ペプチド結合によって互いに連結したポリマーを指す。そのアミノ酸は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、または天然アミノ酸の化学的類似体であってよい。この用語は、タンパク質、すなわち、少なくとも１つのポリペプチドを含む機能性生体分子も指し、少なくとも２つのポリペプチドを含むときには、それらのポリペプチドは、複合体を形成するか、共有結合されているか、または非共有結合されていてよい。タンパク質におけるポリペプチド（複数可）は、糖化及び／または脂質化されていることができ、及び／または補欠分子族を含むことができる。

【0068】

好ましくは、そのＴＡＡには、ＨＥＲ２、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＣＥＡ、ＭＵＣ－１、サバイビン、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２もしくはＢｒａｃｈｙｕｒｙが単独で含まれるか、またはこれらを組み合わせたものが含まれるが、これらに限らない。このような例示的な組み合わせとしては、ＣＥＡ及びＭＵＣ－１（ＣＶ３０１としても知られる）を挙げてよい。他の例示的な組み合わせとしては、ＰＡＰ及びＰＳＡを挙げてよい。

【0069】

数多くのＴＡＡが当該技術分野において知られている。例示的なＴＡＡとしては、５αレダクターゼ、α－フェトプロテイン、ＡＭ－１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、ＢＡＧＥ、β－カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ－ａｂｌ、ＣＡ－１２５、ＣＡＳＰ－８／ＦＬＩＣＥ、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３５、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ｃ－ｍｙｃ、Ｃｏｘ－２、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ａ、ＦＬＫ－１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、ＧＡＧＥファミリー、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２、ＧｎＲＨ、ＧｎＴＶ、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、ｇｐ－１００－ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／ＴＲＰ１、ｈＣＧ、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＭＴＶ、Ｈｓｐ７０、ｈＴＥＲＴ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ－１３Ｒ、ｉＮＯＳ、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ－ｒａｓ、Ｈ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ－ＦＵＴ、ＭＡＧＥファミリー、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、メラン－Ａ／ＭＡＲＴ－１、メソセリン、ＭＩＣ Ａ／Ｂ、ＭＴ－ＭＭＰ、ムチン、ＮＹ－ＥＳＯ－１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ－１、ＰＤＧＦ、ｕＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロジェニポエチン、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ－１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ－１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ－７２、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、サイモシン－β－１５、ＴＮＦ－α、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、ＶＥＧＦ、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限らない。

【0070】

好ましいＰＳＡ抗原は、１５５位におけるイソロイシンのロイシンへのアミノ酸変化を含む。米国特許第７，２４７，６１５号（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい。

【0071】

本発明の１つ以上の好ましい実施形態では、その異種ＴＡＡは、ＨＥＲ２及び／またはＢｒａｃｈｙｕｒｙから選択されている。

【0072】

追加の各種実施形態では、そのＴＡＡには、ＨＥＲ２ｖ１及びＨＥＲ２ｖ２から選択した変異または改変ＨＥＲ２という抗原が含まれてもよい。ＨＥＲ２ｖ１は配列番号１を含み、ＨＥＲ２ｖ２は配列番号３を含む。抗原ＨＥＲ２ｖ１は、配列番号２を含む核酸によってコードしてよく、抗原ＨＥＲ２ｖ２は、配列番号４を含む核酸によってコードしてよい。

【0073】

好ましい実施形態では、抗原ＨＥＲ２は、配列番号１または３との同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む。最も好ましい実施形態では、抗原ＨＥＲ２は、配列番号１または３を含む。

【0074】

追加の実施形態では、そのＴＡＡは、抗原Ｂｒａｃｈｙｕｒｙを含んでよい。好ましい実施形態では、その抗原Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、配列番号５、７、９または１１との同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む。さらに追加の実施形態では、その抗原Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、配列番号５、７、９及び１１から選択されており、配列番号５は、配列番号６を含む核酸によって、配列番号７は、配列番号８を含む核酸によって、配列番号９は、配列番号１０を含む核酸によって、配列番号１１は、配列番号１２を含む核酸によってコードし得る。

【0075】

改変腫瘍関連抗原
特定の実施形態では、細胞関連ポリペプチド抗原は、ポリペプチド抗原に由来するエピトープが、ＡＰＣの表面上のクラスＩ ＭＨＣ分子と会合した状態で提示されると、そのエピトープをその表面上に提示する細胞に対して、ＣＴＬ応答が誘導されるように改変されている。特定のこのような実施形態では、少なくとも１つの第１の外来ＴＨエピトープは、提示されるときには、ＡＰＣの表面上のクラスＩＩ ＭＨＣ分子と会合している。特定のこのような実施形態では、細胞関連抗原は、腫瘍関連抗原である。

【0076】

エピトープを提示できる例示的なＡＰＣとしては、樹状細胞及びマクロファージが挙げられる。追加の例示的なＡＰＣとしては、１）クラスＩ ＭＨＣ分子に結合したＣＴＬエピトープ、及び２）クラスＩＩ ＭＨＣ分子に結合したＴＨエピトープを同時に提示できるいずれかの飲作用ＡＰＣまたは食作用ＡＰＣが挙げられる。

【0077】

特定の実施形態では、ＣＥＡ、ＭＵＣ－１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＨＥＲ２、サバイビン、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２またはＢｒａｃｈｙｕｒｙなど（これらに限らない）のＴＡＡのうちの１つ以上に対する改変は、本明細書に記載されているＴＡＡのうちのその１つ以上と主に反応するポリクローナル抗体が、対象への投与後に誘発されるように行われている。このような抗体は、腫瘍細胞を攻撃及び排除することができるとともに、転移性細胞が発現して転移に至るのを防ぐことができる。この抗腫瘍作用のエフェクター機構は、補体依存性及び抗体依存性の細胞傷害によって媒介されることになる。加えて、誘導された抗体は、成長因子依存性のオリゴ二量化と、受容体のインターナリゼーションの阻害を通じて、がん細胞の成長を阻害することもできる。特定の実施形態では、このような改変ＴＡＡは、腫瘍細胞によって提示される既知のＴＡＡエピトープ及び／または推定ＴＡＡエピトープに対するＣＴＬ応答を誘導できる。

【0078】

特定の実施形態では、改変ＴＡＡポリペプチド抗原は、その細胞関連ポリペプチド抗原のＣＴＬエピトープと、バリエーションを含み、そのバリエーションは、ＣＴＬエピトープまたは外来のＴＨエピトープを少なくとも１つ含む。特定のこのような改変ＴＡＡは、１つの非限定的な例では、ＣＴＬエピトープを少なくとも１つ含む１つ以上のポリペプチド抗原ＨＥＲ２と、外来のＴＨエピトープのＣＴＬエピトープを少なくとも１つ含むバリエーションを含むことができ、このＴＡＡの作製方法は、米国特許第７，００５，４９８号、ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４１９５８号及び同第２００６／０００８４６５号に記載されている。

【0079】

特定のこのような改変ＴＡＡは、１つの非限定的な例では、ＣＴＬエピトープを少なくとも１つ含む１つ以上のポリペプチド抗原ＭＵＣ－１と、外来のエピトープのＣＴＬエピトープを少なくとも１つ含むバリエーションを含むことができ、このＴＡＡの作製方法は、米国特許出願公開第２０１４／０３６３４９５号に記載されている。

【0080】

追加のプロミスキャスなＴ細胞エピトープは、様々なＨＬＡ－ＤＲによってコードされる大部分のＨＬＡ－ＤＲ分子と結合できるペプチドを含む。例えば、ＷＯ９８／２３６３５（Ｆｒａｚｅｒ ＩＨら。Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄに譲渡）、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３ ３３７３、Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：７７８ ７８０、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７８－２２８、Ｃｈｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２７－４７、Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ ７４：１９７－２０３及びＦａｌｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９：２３０－２４２を参照されたい。この最後の参照文献では、ＨＬＡ－ＤＱリガンド及びＨＬＡ－ＤＰリガンドについても論じられている。これらの参照文献に列挙されているすべてのエピトープは、本明細書に記載されているような天然エピトープの候補として関連がある。これらのエピトープ候補と共通のモチーフを共有するエピトープであるからである。

【0081】

特定の他の実施形態では、そのプロミスキャスなＴ細胞エピトープは、ハプロタイプの大部分と結合できる人工のＴ細胞エピトープである。特定のこのような実施形態では、人工のＴ細胞エピトープは、ＷＯ９５／０７７０７及び対応する論文Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１ ７６１に記載されているようなｐａｎ ＤＲエピトープペプチド（「ＰＡＤＲＥ」）である。

【0082】

ＣＤ４０Ｌ
本開示によって示されているように、ＣＤ４０Ｌを組み合わせ物及び関連方法の一部として含めることにより、腫瘍体積の縮小がさらに増大し、無増悪生存期間が長くなり、本発明によって実現する生存率が上昇する。したがって、様々な実施形態では、本発明の併用治療は、ＣＤ４０Ｌをがん患者に投与することをさらに含む。好ましい実施形態では、そのＣＤ４０Ｌは、本明細書に記載されているような組み換えＭＶＡの一部としてコードされる。

【0083】

ＣＤ４０は、Ｂ細胞、マクロファージ及び樹状細胞を含む多くの種類の細胞上に構成的に発現するが、そのリガンドＣＤ４０Ｌは、主に活性化ヘルパーＴ細胞上に発現する。感染または免疫後の早い段階における、樹状細胞とヘルパーＴ細胞との同族相互作用により、樹状細胞に、ＣＴＬ応答をプライミングすることが「許諾」される。樹状細胞への許諾により、共刺激分子がアップレギュレートされ、生存率が上昇し、クロスプレゼンテーション能が向上する。このプロセスは主に、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用によって媒介される。しかしながら、ＣＤ４０Ｌでは、多様な刺激を誘導する、膜結合型の構成から、可溶性（単量体または三量体）の構成まで、様々な構成が説明されており、ＡＰＣの活性化、増殖及び分化を誘導または抑制する。

【0084】

１つ以上の好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、本発明のＭＶＡによってコードされる。１つ以上の他の好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、ヒトＣＤ４０Ｌである。さらに好ましい実施形態では、そのＣＤ４０Ｌは、配列番号１３との同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸を含む。さらに好ましい実施形態では、そのＣＤ４０Ｌは、配列番号１３をコードする核酸を含む。最も好ましい実施形態では、そのＣＤ４０Ｌは、配列番号１３を含む。追加の実施形態では、そのＣＤ４０Ｌは、配列番号１４との同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸によってコードされる。最も好ましい実施形態では、その核酸は、配列番号１４を含む。

【0085】

免疫チェックポイント分子アンタゴニスト
本明細書に記載されているように、少なくとも一態様では、本発明は、免疫チェックポイントアンタゴニストを使用することを含む。このような免疫チェックポイントアンタゴニストは、免疫チェックポイント分子の機能に干渉し、及び／またはその機能をブロックするように機能する。いくつかの好ましい免疫チェックポイントアンタゴニストとしては、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、ならびにＴ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）が挙げられる。

【0086】

加えて、例示的な免疫チェックポイントアンタゴニストとしては、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、Ｉｇドメイン及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、ならびにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）を挙げることができるが、これらに限らない。

【0087】

このような免疫チェックポイント分子アンタゴニストとしては、免疫チェックポイント分子に特異的に結合して、その免疫チェックポイント分子の生物学的な活性及び機能を阻害及び／またはブロックする抗体を挙げることができる。

【0088】

他の免疫チェックポイント分子アンタゴニストとしては、免疫チェックポイント分子の発現に干渉するアンチセンス核酸ＲＮＡ、及び免疫チェックポイント分子の発現に干渉する低分子干渉ＲＮＡを挙げることができる。

【0089】

加えて、アンタゴニストは、免疫チェックポイントの機能を阻害またはブロックする低分子の形態であることができる。これらの低分子のいくつかの非限定的な例としては、ＮＰ１２（Ａｕｒｉｇｅｎｅ）、Ｔｓｉｎｇｈｕａ Ｕｎｉｖによる（Ｄ）ＰＰＡ－１、高親和性ＰＤ－１（Ｓｔａｎｆｏｒｄ）、ＢＭＳ－２０２及びＢＭＳ－８（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ））、ＣＡ１７０／ＣＡ３２７（Ｃｕｒｉｓ／Ａｕｒｉｇｅｎｅ）、ならびにＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３及びＴＩＭ－３の低分子阻害剤が挙げられる。

【0090】

加えて、アンタゴニストは、免疫チェックポイント分子の機能を阻害またはブロックするＡｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）の形態であることができる。例えば、Ｒｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ＢｉｏＤｒｕｇｓ ３２：２３３－２４３を参照されたい。

【0091】

加えて、アンタゴニストは、Ａｆｆｉｍｅｒ（登録商標）の形態であることができることが想定されている。Ａｆｆｉｍｅｒは、免疫チェックポイント分子の機能を阻害またはブロックするＦｃ融合タンパク質である。免疫チェックポイントアンタゴニストとして機能できる他の融合タンパク質は、免疫チェックポイント融合タンパク質（例えば抗ＰＤ－１タンパク質ＡＭＰ－２２４）、及びＵＳ２０１７／０１８９４７６に記載されているような抗ＰＤ－Ｌ１タンパク質である。

【0092】

免疫チェックポイント分子アンタゴニスト候補は、当該技術分野において知られている様々な技法及び／または本願で開示されている様々な技法によって、インビトロまたはマウスモデルで、機能（免疫チェックポイント分子の機能に干渉する能力など）に関してスクリーニングできる。

【0093】

ＩＣＯＳアゴニスト
本発明は、ＩＣＯＳアゴニストをさらに含む。ＩＣＯＳアゴニストは、ＩＣＯＳを活性化する。ＩＣＯＳは、活性化Ｔ細胞上に発現する正の共刺激分子であり、そのリガンドに結合すると、活性化Ｔ細胞の増殖を促す（Ｄｏｎｇ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：９７－１０１）。

【0094】

一実施形態では、そのアゴニストは、ＩＣＯＳの天然のリガンドであるＩＣＯＳ－Ｌである。そのアゴニストは、結合特性及び活性化特性を保持する変異形態のＩＣＯＳ－Ｌであることができる。変異形態のＩＣＯＳ－Ｌは、インビトロで、ＩＣＯＳを刺激する活性についてスクリーニングできる。

【0095】

抗体
一実施形態では、免疫チェックポイント分子アンタゴニスト及び／または免疫チェックポイント分子アゴニストはそれぞれ、抗体を含む。抗体は、合成のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることができ、当該技術分野において周知の技法によって作製できる。このような抗体は、その抗体の抗原結合部位を介して、その免疫チェックポイント分子に、（非特異的結合とは対照的に）特異的に結合する。免疫原と免疫反応する抗体を作製する際には、免疫チェックポイントのペプチド、断片、バリアント、融合タンパク質などをその免疫原として用いることができる。より具体的には、そのポリペプチド、断片、バリアント、融合タンパク質などは、抗体の形成を誘発する抗原決定基、すなわちエピトープを含む。

【0096】

好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ヒトがん患者の治療用として、主権国家の政府から認可されている抗体、または認可プロセスにある抗体である。すでに認可済みであるか、または認可プロセスにあるこれらの抗体のいくつかの非限定的な例としては、ＣＴＬＡ－４（イピリムマブ（登録商標）及びトレメリムマブ）、ＰＤ－１（ペムブロリズマブ、ランブロリズマブ、アンプリミューン－２２４（ＡＭＰ－２２４）、アンプリミューン－５１４（ＡＭＰ－５１４）、ニボルマブ、ＭＫ－３４７５（Ｍｅｒｃｋ）、ＢＩ７５４０９１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ））、ＰＤ－Ｌ１（アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ）、ＭＥＤ１４７３６（ＡＺＮ）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ））、ＬＡＧ－３（ＩＭＰ３２１、ＢＭＳ－９８６０１６、ＢＩ７５４１１１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＬＡＧ５２５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＭＫ－４２８９（Ｍｅｒｃｋ）、ＴＳＲ－０３３（Ｔｅｓａｒｏ））が挙げられる。

【0097】

これらの抗原決定基、すなわちエピトープは、線状エピトープまたは立体構造（不連続）エピトープのいずれであることもできる。線状エピトープは、ポリペプチドのうちの単一のアミノ酸セクションで構成され、立体構造エピトープ、すなわち不連続エピトープは、ポリペプチド鎖の異なる領域に由来する複数のアミノ酸セクションであって、タンパク質フォールディングにより、近接するようになるアミノ酸セクションで構成される（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ，ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ ３：９（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．，２ｎｄ ｅｄ．１９９６））。折り畳まれたタンパク質は、複雑な表面を有するので、利用可能なエピトープの数は非常に多い。しかしながら、タンパク質の立体構造及び立体障害性により、それらのエピトープに実際に結合する抗体の数は、利用可能なエピトープの数よりも少ない（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ，ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ ２：１４（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．，２ｎｄ ｅｄ．１９９６））。エピトープは、当該技術分野において知られている方法のいずれかによって特定できる。

【0098】

ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３もしくはＩＣＯＳのような免疫チェックポイント分子に特異的に結合し、その機能をブロックする抗体（「アンタゴニスト抗体」）またはその機能を増強／活性化する抗体（「アゴニスト抗体」）が、ｓｃＦＶ断片を含め、本発明に含まれる。このような抗体は、従来の手段によって作製できる。

【0099】

一実施形態では、本発明には、免疫チェックポイント分子に対するモノクローナル抗体であって、その免疫チェックポイント分子の機能をブロックする抗体（「アンタゴニスト抗体」）、またはその機能を増強／活性化する抗体（「アゴニスト抗体」）が含まれる。ＰＤ－１に対する例示的なブロッキングモノクローナル抗体は、ＷＯ２０１１／０４１６１３に記載されており、この特許は、参照により、本明細書に援用される。

【0100】

抗体は、その標的に、高いアビディティかつ高い特異性で結合できる。それらの抗体は、その抗体結合部位が、２つのタンパク質（例えば、ＰＤ－１とその標的リガンド）間の相互作用部位に近接すると、それらのタンパク質間の相互作用を立体的に阻害できる比較的大きい分子（約１５０ｋＤａ）である。本発明にはさらに、免疫チェックポイント分子リガンド結合部位のすぐ近くにあるエピトープに結合する抗体が含まれる。

【0101】

様々な実施形態では、本発明には、分子間相互作用（例えばタンパク質間相互作用）に干渉する抗体、及び分子内相互作用（例えば、分子内の立体構造の変化）を妨げる抗体が含まれる。抗体は、免疫チェックポイント分子の生物学的な活性をブロックするか、または増強／活性化する能力についてスクリーニングできる。

【0102】

ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも、従来の技法によって調製できる。

【0103】

例示的な一態様では、免疫チェックポイント分子ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳ、ならびにＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳのアミノ酸配列ベースのペプチドを用いて、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３またはＩＣＯＳに特異的に結合する抗体を調製できる。「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その断片（Ｆ（ａｂ’）２断片及びＦａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体断片（ＶＨＨまたはナノボディ）、二価抗体断片（ダイアボディ）など）、ならびに組み換え及び合成によって作製したいずれかの結合パートナーが含まれるように意図されている。

【0104】

別の例示的な態様では、抗体は、免疫チェックポイント分子に、Ｋ_ｄ約１０^７Ｍ^－１以上で結合する場合には、免疫チェックポイント分子に特異的に結合するものと定義する。結合パートナーまたは抗体の親和性は、従来の技法、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄらが説明した技法（（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０）を用いて、容易に求めることができる。

【0105】

ポリクローナル抗体は、様々な供給源、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットから、当該技術分野において周知である手順を用いて、容易に作製できる。概して、精製したＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳ、またはＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳのアミノ酸配列ベースのペプチドであって、適切にコンジューゲートされているペプチドを宿主動物に、典型的には非経口注射によって投与する。ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳの免疫原性は、アジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバントを用いることを通じて増強できる。ブースター免疫後、少量の血清試料を採取し、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳのポリペプチドに対する反応性について試験する。このような測定に有用である各種アッセイの例としては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８に記載されているアッセイ、ならびに、向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットプロットアッセイ及びサンドイッチアッセイのような手順が挙げられる。米国特許第４，３７６，１１０号及び同第４，４８６，５３０号を参照されたい。

【0106】

モノクローナル抗体は、周知の手順を用いて、容易に調製できる。例えば、米国特許再発行特許第３２，０１１号、米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、同第４，４１１，９９３号、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｍ，ａｎｄ Ｂｅｃｈｔｏｌ（ｅｄｓ．），１９８０に記載されている手順を参照されたい。

【0107】

例えば、マウスのような宿主動物に、単離及び精製した免疫チェックポイント分子を、任意にアジュバントの存在下で、少なくとも１回、好ましくは、約３週間の間隔で少なくとも２回、腹腔内注射できる。続いて、従来のドットプロット法または抗体捕捉（ＡＢＣ）によって、マウス血清をアッセイして、融合するにはどのマウスが最良かを判断する。約２～３週間後、そのマウスに、免疫チェックポイント分子の静脈内ブーストを行う。その後、マウスを殺処分し、確立されたプロトコールに従って、脾臓細胞を市販のミエローマ細胞（Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ）など）と融合する。簡潔に述べると、ミエローマ細胞を培地中で数回洗浄し、１つのミエローマ細胞に対して約３個の脾臓細胞という比率で、マウス脾臓細胞に融合する。融合剤は、当該技術分野において用いられているいずれかの好適な融合剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることができる。融合細胞を選択的に成長させる培地を含むプレートに、融合細胞を播種する。続いて、融合細胞を約８日間成長させることができる。得られたハイブリドーマの上清を回収し、最初にヤギ抗マウスＩｇでコーティングしたプレートに加える。洗浄後、標識免疫チェックポイント分子ポリペプチドのような標識を各ウェルに加えてから、インキュベートする。その後、陽性のウェルを検出することができる。陽性のクローンをバルク培養で成長させることができ、その後、上清をプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製する。

【0108】

本発明のモノクローナル抗体は、Ａｌｔｉｎｇ－Ｍｅｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：１－９，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｒａｐｉｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”に記載されているような代替的な技法を用いて作製でき、この文献は、参照により、本明細書に援用される。同様に、結合パートナーは、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を導入するための組み換えＤＮＡ技法を用いて構築できる。このような技法は、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：３９４）に記載されている。

【0109】

従来の技法によって作製できる、このような抗体の抗原結合断片も、本発明に含まれる。このような断片の例としては、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片が挙げられるが、これらに限らない。遺伝子操作技法によって作製される抗体断片及び誘導体も提供する。

【0110】

本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ヒト化型のマウスモノクローナル抗体が含まれる。このようなヒト化抗体は、既知の技法によって調製でき、その抗体をヒトに投与したときに、免疫原性が低下するという利点をもたらすことができる。一実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体の可変領域（またはその抗原結合部位のみ）と、ヒト抗体に由来する定常領域を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位と、ヒト抗体に由来する可変領域断片（抗原結合部位が欠損している）を含むことができる。キメラ抗体、及びさらに操作されたモノクローナル抗体の作製手順としては、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：３４３９、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４及びＷｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ（１９９３）ＴＩＰＳ １４：１３９に記載されている手順が挙げられる。抗体をトランスジェニックに作製する手順は、ＧＢ２，２７２，４４０、ならびに米国特許第５，５６９，８２５号及び同第５，５４５，８０６号に見ることができ、これらの各特許は、参照により、本明細書に援用される。

【0111】

遺伝子操作法によって作製した抗体（ヒト部分及び非ヒト部分の両方を含むキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体など）であって、標準的な組み換えＤＮＡ技法を用いて作製できる抗体を使用できる。このようなキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野において知られている標準的なＤＮＡ技法を用いる遺伝子操作によって、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの国際公開第８７／０２６７１号、Ａｋｉｒａらの欧州特許出願公開第０１８４１８７号、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉの欧州特許出願公開第０１７１４９６号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎらの欧州特許出願公開第０１７３４９４号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒらの国際公開第８６／０１５３３号、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙらの欧州特許出願公開第０１２５０２３号、Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１－１０４３、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：３４３９－３４４３、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１－３５２６、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：２１４－２１８、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：９９９－１００５、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６－４４９、Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３－１５５９、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－１２０７、Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２－５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４及びＢｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３－４０６０に記載されている方法を用いて作製できる。

【0112】

合成及び半合成の抗体に関しては、そのような用語は、抗体断片、アイソタイプスイッチ抗体、ヒト化抗体（例えば、マウス－ヒト抗体、ヒト－マウス抗体）、ハイブリッド、複数の特異性を有する抗体、及び完全合成の抗体様分子（ただし、これらに限らない）を網羅するように意図されている。

【0113】

治療用途では、患者の、抗体に対する免疫応答を最小限にするために、ヒトの定常領域及び可変領域を有する「ヒト」モノクローナル抗体が好ましい場合が多い。このような抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニック動物を免疫することよって作製できる。Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５２５－５３５を参照されたい。

【0114】

免疫チェックポイント分子に対するヒトモノクローナル抗体は、対象のリンパ球に由来するｍＲＮＡから調製した、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のｃＤＮＡを用いて、ＦａｂファージディスプレイライブラリーまたはｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーのようなコンビナトリアルな免疫グロブリンライブラリーを構築することによって調製することもできる。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７及びＧｒｉｆｆｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５－７３４を参照されたい。加えて、抗体可変領域のコンビナトリアルなライブラリーは、既知のヒト抗体を変異させることによって作製できる。例えば、ランダムに改変された変異誘発済みオリゴヌクレオチドを例えば用いることによって、免疫チェックポイント分子と結合することが知られているヒト抗体の可変領域を変異させて、変異可変領域のライブラリーを作製することができ、続いて、その免疫チェックポイント分子に結合するように、そのライブラリーをスクリーニングできる。免疫グロブリンの重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲ領域内でランダム変異誘発を誘導する方法、ランダム化した重鎖及び軽鎖を掛け合わせて、対を形成する方法、ならびにスクリーニング方法は、例えば、Ｂａｒｂａｓらの国際公開第９６／０７７５４号、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４４５７－４４６１に見ることができる。

【0115】

免疫グロブリンライブラリーは、ディスプレイパッケージの集団、好ましくは、繊維状ファージに由来するディスプレイパッケージの集団によって発現させて、抗体ディスプレイライブラリーを形成することができる。抗体ディスプレイライブラリーを作製する際に用いるのに特に適する方法及び試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号、Ｋａｎｇらの国際公開第９２／１８６１９号、Ｄｏｗｅｒらの国際公開第９１／１７２７１号、Ｗｉｎｔｅｒらの国際公開第９２／２０７９１号、Ｍａｒｋｌａｎｄらの国際公開第９２／１５６７９号、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇらの国際公開第９３／０１２８８号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの国際公開第９２／０１０４７号、Ｇａｒｒａｒｄらの国際公開第９２／０９６９０号、Ｌａｄｎｅｒらの国際公開第９０／０２８０９号、Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０ １３７２、Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１－８５、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ｓｕｐｒａ、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９－８９６、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８、Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：３５７６－３５８０、Ｇａｒｒａｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３－１３７７、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：４１３３－４１３７及びＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：７９７８－７９８２に見ることができる。ディスプレイパッケージ（例えば繊維状ファージ）の表面に提示させたら、その抗体ライブラリーをスクリーニングして、免疫チェックポイント分子と結合する抗体を発現するパッケージを特定及び単離する。

【0116】

組み換えＭＶＡ
本発明のより好ましい実施形態では、本発明で開示されている１つ以上のタンパク質及びヌクレオチドは、組み換えＭＶＡに含まれている。本開示によって説明及び例示されているように、様々な態様において、本開示の組み換えＭＶＡの静脈内投与により、がん患者における免疫応答の増強が誘導される。したがって、１つ以上の好ましい実施形態では、本発明は、本明細書に記載されているＴＡＡのうちの１つ以上をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡを含む。

【0117】

本発明を実施する際に有用であるとともに、ブダペスト条約の規定下で寄託されているＭＶＡウイルス株の例は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４ ０ＪＧ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）に、寄託番号ＥＣＡＣＣ９４０１２７０７で、１９９４年１月２７日に寄託されたＭＶＡ５７２株、及びＥＣＡＣＣ００１２０７０７で、２０００年１２月７日に寄託されたＭＶＡ５７５株であり、２０００年８月３０日に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に、Ｖ０００８３００８という番号で寄託されたＭＶＡ－ＢＮ株及びその誘導体が、追加の例示的な株である。

【0118】

ＭＶＡ－ＢＮの「誘導体」とは、本明細書に記載されているようなＭＶＡ－ＢＮと本質的に同じ複製特性を示すが、そのゲノムの部分の１つ以上が異なるウイルスを指す。ＭＶＡ－ＢＮ及びその誘導体は、複製能力がなく、複製能力がないとは、インビボ及びインビトロで、増殖的に複製できないことを意味する。より具体的には、インビトロのＭＶＡ－ＢＮまたはその誘導体は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）で増殖的に複製できるが、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０６：７６１－７７１）、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ受託番号９１１１２５０２）、ヒト胎児腎細胞株２９３（ＥＣＡＣＣ受託番号８５１２０６０２）及びヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ－２）では増殖的に複製できないものとして説明されている。加えて、ＭＶＡ－ＢＮまたはその誘導体は、Ｈｅｌａ細胞及びＨａＣａＴ細胞株において、ウイルス増幅倍率が、ＭＶＡ－５７５の少なくとも２分の１、より好ましくは３分の１である。ＭＶＡ－ＢＮ及びその誘導体のこれらの特性に関する試験及びアッセイは、ＷＯ０２／４２４８０（米国特許出願公開第２００３／０２０６９２６号）及びＷＯ０３／０４８１８４（米国特許出願公開第２００６／０１５９６９９号）に記載されている。

【0119】

上の段落に記載されているように、インビトロで、ヒト細胞株において「増殖的に複製できない」または「増殖的複製能がない」という用語は、例えば、ＷＯ０２／４２４８０で説明されており、この特許には、上述のような所望の特性を有するＭＶＡを得る方法も教示されている。この用語は、ＷＯ０２／４２４８０または米国特許第６，７６１，８９３号に記載されているアッセイを使用して、感染後４日でインビトロでウイルス増幅率が１未満であるウイルスに当てはまる。

【0120】

「生殖複製の失敗」という用語は、感染後４日で１未満という、前段落に記載されているような、インビトロでのヒト細胞株におけるウイルス増幅率を有するウイルスを指す。ＷＯ０２／４２４８０または米国特許第６，７６１，８９３号に記載されているアッセイは、ウイルス増幅率の決定に適用可能である。

【0121】

前の段落で説明したように、インビトロでのヒト細胞株におけるウイルスの増幅または複製は、通常、「増幅率」と呼ばれる、感染細胞から産生されたウイルス（出力）と、最初の位置で細胞に感染するために最初に使用された量（入力）との比率として表される。増幅率「１」は、感染細胞から産生されるウイルスの量が、細胞に感染するために最初に使用された量と同じである増幅状態を定義し、すなわち、感染細胞とはウイルスの感染及び再生を許容するということである。これに対して、増幅倍率が１未満であること、すなわち、侵入量よりも産生量が少ないことにより、増殖的に複製されていないこと、すなわち、ウイルスの減弱が示される。

【0122】

発現カセット／制御配列
様々な態様では、本明細書に記載されている１つ以上の核酸は、１つ以上の発現カセット内に組み込まれており、このカセットでは、その１つ以上の核酸が、発現制御配列に機能的に連結されている。「機能的に連結された」とは、記載されている構成要素が、意図した形式で機能可能になる関係にあること、例えば、プロモーターに、核酸を転写させて発現させるような関係にあることを意味する。コード配列に機能的に連結された発現制御配列は、そのコード配列の発現が、その発現制御配列と適合する条件下で行われるように連結されている。発現制御配列としては、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの初めにある開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及びフレーム内終止コドンが挙げられるが、これらに限らない。好適なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヒトＣＭＶ前初期Ｉプロモーター、ならびに各種ポックスウイルスプロモーター（３０Ｋプロモーター、Ｉ３プロモーター、ＰｒＳプロモーター、ＰｒＳ５Ｅプロモーター、Ｐｒ７．５Ｋ、ＰｒＨｙｂプロモーター、Ｐｒ１３．５ロングプロモーター、４０Ｋプロモーター、ＭＶＡ－４０Ｋプロモーター、ＦＰＶ ４０Ｋプロモーター、３０ｋプロモーター、ＰｒＳｙｎＩＩｍプロモーター、ＰｒＬＥ１プロモーター及びＰＲ１２３８プロモーターといったワクシニアウイルスまたはＭＶＡ由来のプロモーター及びＦＰＶ由来のプロモーターが挙げられるが、これらに限らない）が挙げられるが、これらに限らない。追加のプロモーターは、ＷＯ２０１０／０６０６３２、ＷＯ２０１０／１０２８２２、ＷＯ２０１３／１８９６１１、ＷＯ２０１４／０６３８３２及びＷＯ２０１７／０２１７７６にさらに記載されており、これらの特許は、参照により、本明細書に全体が援用される。

【0123】

追加の発現制御配列としては、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、ならびに所望の宿主系において、所望の組み換えタンパク質（例えば、ＨＥＲ２、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及び／またはＣＤ４０Ｌ）をコードする核酸配列の適切な転写及びその後に行われる翻訳に必要ないずれかの他の配列が挙げられるが、これらに限らない。本発明のポックスウイルスベクターは、所望の宿主系において、核酸配列を含む発現ベクターの移入及びその後に行われる複製に必要な追加のエレメントも含んでよい。当業者はさらに、このようなベクターが、従来の方法（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ｉｎ“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）を用いて容易に構築されるとともに、市販されていることを理解するであろう。

【0124】

本発明の組み合わせ物の投与方法及び投与レジメン
１つ以上の態様では、本発明の組み合わせ物は、同種及び／または異種でのプライム－ブーストレジメンの一部として投与できる。図１０～１２に示されているように、同種及び／または異種でのプライムブーストレジメンは、ＮＫ細胞応答の増強を延長及び再活性化するとともに、対象の特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答及びＣＤ４ Ｔ細胞応答を増大させる。したがって、１つ以上の実施形態では、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させるための組み合わせ物及び／または方法であって、そのがん患者に、本開示の組み合わせ物を投与することを含み、その組み合わせ物を同種または異種でのプライム－ブーストレジメンの一部として投与する組み合わせ物及び／または方法が存在する。

【0125】

導入遺伝子を含む組み換えＭＶＡウイルスの作製
本発明で提供する組み換えＭＶＡウイルスは、当該技術分野において知られている常法によって作製できる。組み換えポックスウイルスを得るか、または外来のコード配列をポックスウイルスゲノムに挿入するための方法は、当業者に周知である。例えば、ＤＮＡのクローニング、ＤＮＡの単離、ＲＮＡの単離、ウエスタンブロット解析、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲ増幅技法のような標準的な分子生物学的技法の方法は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（２ｎｄ Ｅｄ．）（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載されており、ウイルスの取扱い及び操作の技法は、“Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ”（Ｍａｈｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６））に記載されている。同様に、ＭＶＡの取扱い、操作及び遺伝子組み換えの技法及びノウハウは、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｄａｖｉｓｏｎ ＆ Ｅｌｌｉｏｔｔ（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９３）、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ ９：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｂｙ Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓを参照されたい）及び“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．（１９９８）、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ １６，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＩＶ：“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ”を参照されたい）に記載されている。

【0126】

本発明で開示されている様々な組み換えＭＶＡウイルスの作製には、様々な方法を適用可能である場合がある。ウイルスに挿入されるＤＮＡ配列は、ポックスウイルスのＤＮＡのセクションに相同なＤＮＡが挿入されているＥ．ｃｏｌｉプラスミド構築物に配置されてもよい。これとは別に、挿入するＤＮＡ配列は、プロモーターにライゲーションできる。このプロモーター－遺伝子連結体をプラスミドコンストラクト内に配置して、そのプロモーター－遺伝子連結体の両端が、非必須の座位を含むポックスウイルスＤＮＡ領域に隣接するＤＮＡ配列と相同なＤＮＡと隣接するようにできる。得られたプラスミドコンストラクトは、Ｅ．ｃｏｌｉ菌内で増殖させることによって増幅して、単離することができる。挿入したＤＮＡ遺伝子配列を含む単離プラスミドは、例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の細胞培養物にＭＶＡウイルスを感染させるのと同時、その細胞培養物にトランスフェクションできる。それぞれ、そのプラスミド内の相同なＭＶＡウイルスＤＮＡと、そのウイルスゲノムとの間の組み換えによって、外来ＤＮＡ配列の存在により改変されるポックスウイルスを作製できる。

【0127】

好ましい実施形態によれば、細胞の好適な細胞培養物、例えばＣＥＦ細胞にＭＶＡウイルスを感染させることができる。続いて、感染した細胞に、本開示で提供される１つ以上の核酸などの外来または異種の遺伝子（複数可）を含む第１のプラスミドベクターをトランスフェクトしてもよい（好ましくは、ポックスウイルス発現制御エレメントの転写制御下で）。上で説明したように、そのプラスミドベクターは、そのＭＶＡウイルスゲノムの所定部分への外来配列の挿入を誘導できる配列も含む。任意に、そのプラスミドベクターは、ポックスウイルスプロモーターに機能的に連結されたマーカー遺伝子及び／または選択遺伝子を含むカセットも含む。好適なマーカー遺伝子または選択遺伝子は、例えば、緑色蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、ネオマイシン－ホスホリボシルトランスフェラーゼまたはその他のマーカーをコードする遺伝子である。選択カセットまたはマーカーカセットの使用により、作製した組み換えポックスウイルスの特定及び単離が簡略になる。ただし、組み換えポックスウイルスは、ＰＣＲ技術によっても識別され得る。その後、上記のようにして得た組み換えポックスウイルスを、さらなる細胞に感染させて、その細胞に、第２の外来遺伝子または異種の遺伝子を１つまたは複数含む第２のベクターをトランスフェクションすることができる。念のため、この遺伝子は、そのポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位に導入するべきであり、その第２のベクターにおいても、そのポックスウイルスと相同な配列であって、そのポックスウイルスのゲノムへの１つまたは複数の第２の外来遺伝子の組み込みを誘導する配列が異なる。相同組み換えが行われた後、外来遺伝子または異種遺伝子を２つ以上含む組み換えウイルスを単離できる。追加の外来遺伝子をその組み換えウイルスに導入するには、前の感染工程で単離した組み換えウイルスを用いることによって、かつトランスフェクション用のさらなる外来遺伝子を１つまたは複数含むさらなるベクターを用いることによって、感染及びトランスフェクションの工程を繰り返すことができる。

【0128】

あるいは、上記のような、感染及びトランスフェクションの工程は、置き換えることが可能であり、すなわち、まず、外来遺伝子を含むプラスミドベクターによって、好適な細胞にトランスフェクションしてから、その細胞にポックスウイルスを感染させることができる。さらなる代替策として、各外来遺伝子を異なるウイルスに導入し、得られたすべての組み換えウイルスを細胞に共感染させ、すべての外来遺伝子を含む組み換え体についてスクリーニングすることも可能である。第３の代替策は、ＤＮＡゲノムと外来配列をインビトロでライゲーションし、ヘルパーウイルスを用いて、組み換えワクシニアウイルスＤＮＡゲノムを再構築することである。第４の代替策は、Ｅ．ｃｏｌｉまたは別の細菌種において、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローニングしたＭＶＡウイルスゲノムと、そのＭＶＡウイルスゲノム内の所望の組み込み部位に隣接する配列と相同なＤＮＡ配列に挟まれた線状外来配列との間で相同組み換えを起こすことである。

【0129】

本開示の核酸の１つ以上は、ＭＶＡウイルスまたはＭＶＡウイルスベクターの好適ないずれかの部分に挿入し得る。そのＭＶＡウイルスの好適な部分は、ＭＶＡゲノムの非必須部分である。そのＭＶＡゲノムの非必須部分は、そのＭＶＡゲノムの遺伝子間領域または既知の欠失部位１～６であってよい。この代わりに、またはこれに加えて、その組み換えＭＶＡの非必須部分は、ＭＶＡゲノムのコード領域のうち、ウイルスの成長には必須ではないコード領域であることができる。しかしながら、その挿入部位は、ＭＶＡゲノム内のこれらの好ましい挿入部位に限定されない。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）のような少なくとも１つの細胞培養系において増幅及び増殖できる組み換え体を得ることが可能な限りは、そのウイルスゲノムのいずれの位置にも、本発明の核酸（例えば、ＨＥＲ２、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及びＣＤ４０Ｌ）、ならびに本明細書に記載されているようないずれかの付随のプロモーターを挿入し得ることは、本発明の範囲内であるからである。

【0130】

好ましくは、本発明の核酸は、そのＭＶＡウイルスの遺伝子間領域（ＩＧＲ）の１つ以上に挿入してよい。「遺伝子間領域」という用語は好ましくは、そのＭＶＡウイルスゲノムの隣接する２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の間、好ましくは、そのＭＶＡウイルスゲノムの２つの必須ＯＲＦの間に位置するウイルスゲノム部分を指す。ＭＶＡにおいては、特定の実施形態では、ＩＧＲは、ＩＧＲ０７／０８、ＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、ＩＧＲ１３６／１３７及びＩＧＲ１４８／１４９から選択する。

【0131】

これに加えてまたはこの代わりに、ＭＶＡウイルスでは、ヌクレオチド配列は、そのＭＶＡゲノムの既知の欠失部位、すなわち、欠失部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩのうちの１つ以上に挿入し得る。「既知の欠失部位」という用語は、ＣＥＦ細胞での連続継代を通じて欠失したＭＶＡゲノム部分を指し、この部分は、５１６代目の継代時に、そのＭＶＡの由来元である親ウイルス、特には、例えばＭｅｉｓｉｎｇｅｒ－Ｈｅｎｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８８：３２４９－３２５９に記載されているような親漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ＣＶＡ）のゲノムと比べて特徴付けられたものである。

【0132】

ワクチン
特定の実施形態では、本開示の組み換えＭＶＡは、ワクチンの一部として配合できる。ワクチンの調製の際には、そのＭＶＡウイルスを生理学的に許容可能な形態に変換できる。

【0133】

例示的な調製法は、以下のとおりである。精製ウイルスを５×１０^８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に配合した状態で、－８０℃で保存する。ワクチン注射剤の調製の際には、例えば、１×１０^８～１×１０^９個のウイルス粒子をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、２％のペプトン及び１％のヒトアルブミンの存在下で、アンプル、好ましくはガラスアンプル内で凍結乾燥できる。あるいは、ワクチン注射剤は、ウイルスを調合物中で段階凍結乾燥することによって調製できる。特定の実施形態では、その調合物は、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、ポリビニルピロリドンのような追加の添加剤、またはインビボ投与に適する抗酸化剤、不活性ガス、安定剤、もしくは組み換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）を含む（ただし、これらに限らない）その他の添加剤を含む。続いて、そのアンプルを密閉し、好適な温度、例えば４℃～室温で、数カ月保存することができる。しかしながら、必要がない限りは、そのアンプルは、好ましくは－２０℃未満、最も好ましくは約－８０℃の温度で保存する。

【0134】

ワクチン接種または療法を伴う様々な実施形態では、その凍結乾燥体は、０．１～０．５ｍｌの水溶液、好ましくは、生理食塩水、または１０ｍＭのトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．７）のようなトリス緩衝液に溶解する。本開示の組み換えＭＶＡ、ワクチンまたは医薬組成物は、溶液において、１０^４～１０^１０ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ、１０^５～５×１０^９ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ、１０^６～５×１０^９ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌまたは１０^７～５×１０^９ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度範囲で配合できることが想定されている。ヒトに対して好ましい用量には、１０^６～１０^１０ ＴＣＩＤ_５０が含まれ、１０^６ ＴＣＩＤ_５０、１０^７ ＴＣＩＤ_５０、１０^８ ＴＣＩＤ_５０、５×１０^８ ＴＣＩＤ_５０、１０^９ ＴＣＩＤ_５０、５×１０^９ ＴＣＩＤ_５０または１０^１０ ＴＣＩＤ_５０という用量が含まれる。投与用量及び投与数の最適化は、当業者の技術及び知見の範囲内である。

【0135】

１つ以上の好ましい実施形態では、本明細書に定められているように、本発明の組み換えＭＶＡは、がん患者に静脈内投与する。

【0136】

追加の実施形態では、本発明の免疫チェックポイントアンタゴニストもしくは免疫チェックポイントアゴニスト、または好ましくは抗体は、全身投与または局所投与、すなわち、腹腔内経路、非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、鼻腔内経路、皮内経路または熟練施術者に知られているいずれかの他の投与経路によって投与できる。

【0137】

キット、組成物及び使用方法
様々な実施形態では、本発明には、ａ）本明細書に記載されている核酸を含む組み換えＭＶＡ、及びｂ）本明細書に記載されている１つ以上の抗体を含むキット、医薬組み合わせ物、医薬組成物及び／または免疫原性組み合わせ物が含まれる。

【0138】

そのキット及び／または組成物は、本開示の組み換えポックスウイルスの入った１つまたは複数の容器またはバイアル、本開示の抗体の入った１つ以上の容器またはバイアルを、その組み換えＭＶＡ及び抗体の投与に関する説明とともに含むことができることが想定されている。より具体的な実施形態では、そのキットは、最初のプライミング投与で、その組み換えＭＶＡ及び抗体を投与してから、その後に、その組み換えＭＶＡ及び抗体のブースティング投与を１回以上行うことについての説明を含むことができることが想定されている。

【0139】

本発明で提供するキット及び／または組成物は概して、薬学的に許容可能であり及び／または認可された担体、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤及び／または安定剤を１つ以上含んでよい。このような補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝物質などであることができる。好適な担体は典型的には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質集合体などのようなゆっくり代謝される大きな分子である。

【0140】

特定の例示的な実施形態
実施形態１は、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させるのに用いる組み合わせ物または医薬組み合わせ物であって、その組み合わせ物が、ａ）異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、静脈内投与すると、ＴＡＡをコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導するＭＶＡウイルスと、ｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストを含み、（ａ）及び（ｂ）が、併用治療として投与すべきものであり、ａ）及びｂ）をそのがん患者に投与することにより、ａ）を単独で非ＩＶ投与するかまたはｂ）を単独で投与する場合と比べて、そのがん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／または生存率が上昇する組み合わせ物または医薬組み合わせ物である。

【0141】

実施形態２は、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、ａ）異種のＴＡＡをコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、静脈内投与すると、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸を含む組み換えＭＶＡの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導するＭＶＡウイルスをそのがん患者に投与することと、ｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストをそのがん患者に投与することを含み、（ａ）及び（ｂ）が、併用治療として投与すべきものであり、ａ）及びｂ）をそのがん患者に投与することにより、ａ）を単独で非ＩＶ投与するかまたはｂ）を単独で投与する場合と比べて、そのがん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／または生存率が上昇する方法である。

【0142】

実施形態３は、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させるための併用療法であって、ａ）異種のＴＡＡをコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、静脈内投与すると、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸を含む組み換えＭＶＡの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導するＭＶＡウイルスと、ｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストを含み、（ａ）及び（ｂ）が、併用治療として投与すべきものであり、ａ）及びｂ）をそのがん患者に投与することにより、ａ）を単独で非ＩＶ投与するかまたはｂ）を単独で投与する場合と比べて、そのがん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／または生存率が上昇する併用療法である。

【0143】

実施形態４は、実施形態１～３のいずれか１つに記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストが、その免疫チェックポイント分子の抗体を含む組み合わせ物である。

【0144】

実施形態５は、実施形態１～４のいずれか１つに記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＰＤ－１アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト、ＬＡＧ－３アンタゴニスト、ＴＩＭ－３アンタゴニストまたはＩＣＯＳアゴニストを含む組み合わせ物である。

【0145】

実施形態６は、実施形態１～５のいずれか１つに記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＣＴＬＡ－４抗体、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＬＡＧ－３抗体、ＴＩＭ－３抗体またはＩＣＯＳ抗体を含む組み合わせ物である。

【0146】

実施形態７は、実施形態１～６のいずれか１つに記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＣＴＬＡ－４抗体、ＰＤ－１抗体及び／またはＰＤ－Ｌ１抗体を含む組み合わせ物である。

【0147】

実施形態８は、実施形態１～７のいずれか１つに記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＰＤ－１抗体及び／またはＰＤ－Ｌ１抗体を含む組み合わせ物である。

【0148】

実施形態９は、実施形態１～８に記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、そのｂ）が、ＰＤ－１抗体である組み合わせ物である。

【0149】

実施形態１０は、実施形態１～９のいずれか１つに記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、その組み換えＭＶＡが、異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第２の核酸をさらに含む組み合わせ物である。

【0150】

実施形態１１は、実施形態１～１０に記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、その異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｍｕｃｉｎ１，細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、抗原Ｂｒａｃｈｙｕｒｙまたはこれらを組み合わせたものからなる群から選択されている組み合わせ物である。

【0151】

実施形態１２は、実施形態１～１１に記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、その異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｍｕｃｉｎ１，細胞表面関連（ＭＵＣ－１）からなる群から選択されている組み合わせ物である。

【0152】

実施形態１３は、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、その異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ２）である組み合わせ物である。

【0153】

実施形態１４は、実施形態１～１３に記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、そのＴＡＡが、５－α－レダクターゼ、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＭ－１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（ＢＡＧＥ）、β－カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ－ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ－１２５、カスパーゼ－８（ＣＡＳＰ－８）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体受容体２（ＣＲ２）、ＣＤ２２／ＢＬ－ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体受容体１（ＣＲ１）、ＣＤ４４／ＰＧＰ－１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（ＬＣＡ）、ＣＤ４６／メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ－１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｃ－ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ－２（ｃｏｘ－２）、結腸直腸癌欠失遺伝子（ＤＣＣ）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞成長因子－８ａ（ＦＧＦ８ａ）、線維芽細胞成長因子－８ｂ（ＦＧＦ８ｂ）、ＦＬＫ－１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（ＧＡＧＥファミリー）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（ＧＤ２）／ガングリオシド３（ＧＤ３）／ガングリオシド－モノシアル酸－２（ＧＭ２）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１－６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ→Ｍａｎ（α１－６）］β１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＧｎＴ Ｖ）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ－１００－ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質－１（ｇｐ７５／ＴＲＰ１）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヘパラナーゼ、ＨＥＲ２、ヒト乳房腫瘍ウイルス（ＨＭＴＶ）、７０キロダルトンの熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インスリン様成長因子受容体－１（ＩＧＦＲ－１）、インターロイキン－１３受容体（ＩＬ－１３Ｒ）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ－ｒａｓ、Ｈ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ－ＦＵＴ、メラノーマ抗原コード遺伝子１（ＭＡＧＥ－１）、メラノーマ抗原コード遺伝子２（ＭＡＧＥ－２）、メラノーマ抗原コード遺伝子３（ＭＡＧＥ－３）、メラノーマ抗原コード遺伝子４（ＭＡＧＥ－４）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、メラン－Ａ／Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原－１（ＭＡＲＴ－１）、メソセリン、ＭＩＣ Ａ／Ｂ、ＭＴ－ＭＭＰ、ムチン、精巣特異抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ－１、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロジェニポイエチン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＡＧＥ－１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ－１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ－７２、トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、サイモシン－β－１５、腫瘍壊死因子－α（「ＴＮＦ－α」）、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）からなる群から選択されている組み合わせ物である。

【0154】

実施形態１５は、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、そのＭＶＡが、ＭＶＡ－ＢＮまたはＭＶＡ－ＢＮの誘導体である組み合わせ物である。

【0155】

実施形態１６は、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、ａ）をｂ）と同時に、またはｂ）の前に投与する組み合わせ物である。

【0156】

実施形態１７は、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、ａ）及びｂ）をプライミング投与で、そのがん患者に投与してから、ａ）及びｂ）のブースティング投与を１回以上、そのがん患者に行う組み合わせ物である。

【0157】

実施形態１８は、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、そのがん患者が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌または結腸直腸癌からなる群から選択したがんに罹患しており、及び／またはそのがんと診断されている組み合わせ物である。

【0158】

実施形態１９は、実施形態１８に記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、その乳癌が、ＨＥＲ２を過剰発現する乳癌である組み合わせ物である。

【0159】

実施形態２０は、実施形態１９に記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、その抗原ＨＥＲ２が、配列番号１または配列番号３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である組み合わせ物である。

【0160】

実施形態２１は、実施形態１９に記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、その抗原ＨＥＲ２が、配列番号１または配列番号３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である組み合わせ物である。

【0161】

実施形態２２は、実施形態１９に記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、その抗原ＨＥＲ２が、配列番号１または配列番号３を含む組み合わせ物である。

【0162】

実施形態２３は、実施形態１１～１３に記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、その抗原Ｂｒａｃｈｙｕｒｙが、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む組み合わせ物である。

【0163】

実施形態２４は、がん患者の腫瘍体積を縮小させ、及び／または生存率を上昇させるための医薬または薬剤の調製に、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の組み合わせ物を使用することである。

【0164】

実施形態２５は、
ａ）異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスと、ｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニスト、
を含む医薬組み合わせ物である。

【0165】

実施形態２６は、実施形態２５に記載の組み合わせ物であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＰＤ－１アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト、ＬＡＧ－３アンタゴニスト、ＴＩＭ－３アンタゴニストまたはＩＣＯＳアゴニストを含む組み合わせ物である。

【0166】

実施形態２７は、実施形態２５～２６に記載の組み合わせ物であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＰＤ－１アンタゴニストまたはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストを含む組み合わせ物である。

【0167】

実施形態２８は、実施形態２５～２７に記載の組み合わせ物であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＰＤ－１アンタゴニストまたはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストを含む組み合わせ物である。

【0168】

実施形態２９は、実施形態２５～２８に記載の組み合わせ物であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＰＤ－１アンタゴニストまたはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストを含む組み合わせ物である。

【0169】

実施形態３０は、実施形態２５～２９に記載の組み合わせ物であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストが、抗体を含む組み合わせ物である。

【0170】

実施形態３１は、実施形態２５～３０に記載の組み合わせ物であって、そのＣＴＬＡ－４アンタゴニストが、ＣＴＬＡ－４抗体を含み、そのＰＤ－１アンタゴニストが、ＰＤ－１抗体を含み、そのＰＤ－Ｌ１アンタゴニストが、ＰＤ－Ｌ１抗体を含み、そのＬＡＧ－３アンタゴニストが、ＬＡＧ－３抗体を含み、そのＴＩＭ－３アンタゴニストが、ＴＩＭ－３抗体を含み、そのＩＣＯＳアゴニストが、ＩＣＯＳ抗体を含む組み合わせ物である。

【0171】

実施形態３２は、実施形態２５～３１に記載の組み合わせ物であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＰＤ－１抗体またはＰＤ－Ｌ１抗体を含む組み合わせ物である。

【0172】

実施形態３３は、実施形態２５～３２に記載の組み合わせ物であって、その異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｍｕｃｉｎ１，細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、抗原Ｂｒａｃｈｙｕｒｙまたはこれらを組み合わせたものからなる群から選択されている組み合わせ物である。

【0173】

実施形態３４は、実施形態２５～３３に記載の組み合わせ物であって、その異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｍｕｃｉｎ１，細胞表面関連（ＭＵＣ－１）からなる群から選択されている組み合わせ物である。

【0174】

実施形態３５は、実施形態２５～３４に記載の組み合わせ物であって、その異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ２）である組み合わせ物である。

【0175】

実施形態３６は、実施形態２５～３４に記載の組み合わせ物であって、そのＴＡＡが、５－α－レダクターゼ、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＭ－１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（ＢＡＧＥ）、β－カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ－ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ－１２５、カスパーゼ－８（ＣＡＳＰ－８）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体受容体２（ＣＲ２）、ＣＤ２２／ＢＬ－ＣＡＭ、ＣＤ２３／Ｆ_ｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体受容体１（ＣＲ１）、ＣＤ４４／ＰＧＰ－１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（ＬＣＡ）、ＣＤ４６／メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ－１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｃ－ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ－２（ｃｏｘ－２）、結腸直腸癌欠失遺伝子（ＤＣＣ）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞成長因子－８ａ（ＦＧＦ８ａ）、線維芽細胞成長因子－８ｂ（ＦＧＦ８ｂ）、ＦＬＫ－１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（ＧＡＧＥファミリー）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（ＧＤ２）／ガングリオシド３（ＧＤ３）／ガングリオシド－モノシアル酸－２（ＧＭ２）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ_１Ｍａｎ（α１－６）Ｒ_２［ＧｌｃＮＡｃ→Ｍａｎ（α１－６）］β１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＧｎＴ Ｖ）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ－１００－ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質－１（ｇｐ７５／ＴＲＰ１）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヘパラナーゼ、ＨＥＲ２、ヒト乳房腫瘍ウイルス（ＨＭＴＶ）、７０キロダルトンの熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インスリン様成長因子受容体－１（ＩＧＦＲ－１）、インターロイキン－１３受容体（ＩＬ－１３Ｒ）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ－ｒａｓ、Ｈ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ－ＦＵＴ、メラノーマ抗原コード遺伝子１（ＭＡＧＥ－１）、メラノーマ抗原コード遺伝子２（ＭＡＧＥ－２）、メラノーマ抗原コード遺伝子３（ＭＡＧＥ－３）、メラノーマ抗原コード遺伝子４（ＭＡＧＥ－４）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、メラン－Ａ／Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原－１（ＭＡＲＴ－１）、メソセリン、ＭＩＣ Ａ／Ｂ、ＭＴ－ＭＭＰ、ムチン、精巣特異抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ－１、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロジェニポイエチン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＡＧＥ－１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ－１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ－７２、トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、サイモシン－β－１５、腫瘍壊死因子－α（「ＴＮＦ－α」）、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）からなる群から選択されている組み合わせ物である。

【0176】

実施形態３７は、実施形態２５～３６に記載の組み合わせ物であって、そのＭＶＡが、ＭＶＡ－ＢＮまたはＭＶＡ－ＢＮの誘導体である組み合わせ物である。

【0177】

実施形態３８は、実施形態２５～３７に記載の組み合わせ物であって、ａ）をｂ）と同時に、またはｂ）の後に投与する組み合わせ物である。

【0178】

実施形態３９は、実施形態２５～３６に記載の組み合わせ物であって、ａ）及びｂ）をそのがん患者にプライミング投与で投与してから、ａ）及びｂ）のブースティング投与を１回以上、そのがん患者に行う組み合わせ物である。

【0179】

実施形態４０は、実施形態２５～３９に記載の組み合わせ物であって、そのがん患者が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌または結腸直腸癌からなる群から選択したがんに罹患しており、及び／またはそのがんと診断されている組み合わせ物である。

【0180】

実施形態４１は、実施形態４０に記載の組み合わせ物であって、その乳癌が、ＨＥＲ２を過剰発現する乳癌である組み合わせ物である。

【0181】

実施形態４２は、実施形態１～４０に記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、そのがんが、ＭＵＣ－１を過剰発現するがんである組み合わせ物である。

【0182】

実施形態４３は、実施形態１～４０に記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、そのがんが、ＣＥＡを発現するがんである組み合わせ物である。

【0183】

実施形態４４は、実施形態１～４０に記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、そのがんが、ＰＳＡを発現するがんである組み合わせ物である。

【0184】

実施形態４５は、実施形態１～４０に記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、そのがんが、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙを過剰発現するがんである組み合わせ物である。

【0185】

実施形態４６は、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、そのがん患者が、乳癌、肺癌、メラノーマ、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌または結腸直腸癌からなる群から選択したがんに罹患しており、及び／またはそのがんと診断されている組み合わせ物である。

【0186】

実施形態４７は、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、そのがん患者が、乳癌に罹患しており、及び／または乳癌と診断されている組み合わせ物である。

【0187】

実施形態４８は、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の用途、方法及び／または併用療法のための組み合わせ物であって、そのがん患者が、結腸直腸癌に罹患しており、及び／または結腸直腸癌と診断されている組み合わせ物である。

【0188】

実施形態４９は、実施形態１～２４に記載の用途のための組み合わせ物であって、医薬組み合わせ物である組み合わせ物である。

【0189】

本開示の一部として含まれる参照文献は、参照により、その全体が本明細書に援用され、その参照文献には、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ（２０１３），Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、Ｔｏｒｒｅ（２０１２）ＣＡ：Ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ ６５：ｄｏｉ １０．３３２２／ｃａａｃ．２１２６２，“Ｇｌｏｂａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ”、Ｒｏｓｓ（２００３）Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ８：３０７－３２５，“Ｔｈｅ ＨＥＲ２／ｎｅｕ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ２００３：ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｙ”、Ｐａｌｅｎａ（２００７）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：２４７１－８，“Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｔ－ｂｏｘ ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ ｉｓ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”、Ｈｙｎｅｓ ａｎｄ Ｌａｎｅ（２００５）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ５：３４１－５４，“ＥＲＢＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”、Ｃｈｏ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ ４２１：７５６－６０，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＨＥＲ２ ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂ”、Ｓａｔｙａｎａｒａｙａｎａｊｏｉｓ（２００９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．７４：ｄｏｉ １０．１１１１／ｊ．１７４７－０２８５．２００９．００８５５．ｘ，“Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ Ｄｏｃｋｉｎｇ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＨＥＲ２－Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ ｗｉｔｈ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ”、Ｆｒａｎｋｌｉｎ（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：３１７－２８，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ＥｒｂＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＥｒｂＢ２－ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ｃｏｍｐｌｅｘ”、Ｙａｎｇ（２００９），Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｈｅ Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ ＥＲＢＢ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ａｌｌ Ｔｈｅｓｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｓ（ＥＴＤｓ），Ｐａｐｅｒ ３９１、Ｔａｎ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：１８５８－６７，“ＥｒｂＢ２ ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｓｒｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｓｒｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｅｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ”、Ｒｏｓｋｏｓｋｉ（２０１４）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．８７：４２－５９，“ＥｒｂＢ／ＨＥＲ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”、Ｒｏｓｅｌｌｉ（２０１２）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１８：３８６８－７９，“Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ，ａ ｄｒｉｖｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ， ｉｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｔｕｍｏｒｓ：ａｎ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ”、Ｓｔｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｅｐｓｔｅｉｎ（２００５）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１４：８８５－９２，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｉｎ Ｔｂｘ１ ｔｈａｔ ｉｓ ｄｅｌｅｔｅｄ ｉｎ ＤｉＧｅｏｒｇｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｔｈｅ １２２３ｄｅｌＣ ｍｕｔａｔｉｏｎ”、Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ（２０１３）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２５１，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｄｊｕｖａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＭＶＡ ｗｉｔｈ ＣＤ４０Ｌ Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ”、Ｇｕａｒｄｉｎｏ（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６９（２４ Ｓｕｐｐ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ５０８９），“Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｔｗｏ Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｏｆ ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）－ＨＥＲ２ ｉｎ ＨＥＲ２ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ，”Ｈｅｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ ３（Ｓｕｐｐｌ．２）：Ｐ１３２，“Ｐｈａｓｅ Ｉ，ｄｏｓｅ－ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｏｆ ＭＶＡ－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ＴＲＩＣＯＭ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”、Ｂｒｏｄｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８５：１７６４－７０，“Ａｎｔｉ－ＨＥＲ２／ｎｅｕ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＨＥＲ２／ｎｅｕ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｆｒｏｍ ｐ５３ ｓｔａｔｕｓ”、Ｓｔａｃｋａｒｕｋ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ １２：８７５－８４，“Ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”、Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，“Ｔｙｐｅ Ｉ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ”、Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ６：（ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ １９７７２），“Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｖａｌｕｌａｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｕｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ，”、Ｂｒｏｕｓｓａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８８：３０５－３１７，“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ”、Ｔａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １２：２７９０－９６，“ＴｒｉＫＥｓ ａｎｄ ＢｉＫＥｓ ｊｏｉｎ ＣＡＲｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｈｉｇｈｗａｙ”、Ｋｏｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：２５３８－４４，“Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｃｌａｓｓ Ｉ－Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｈｅｒ２／ｎｅｕ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ”が含まれる。
なお、本願は、特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる用途用の組み合わせ物であって、前記組み合わせ物が、
ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、静脈内投与すると、ＴＡＡをコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方が誘導される前記ＭＶＡウイルスと、
ｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストと、
を含み
前記（ａ）及び前記（ｂ）が、併用治療として投与すべきものであり、前記ａ）及び前記ｂ）を前記がん患者に投与することにより、前記ａ）を単独で非ＩＶ投与するかまたは前記ｂ）を単独で投与する場合と比べて、前記がん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／または生存率が上昇する前記組み合わせ物。
２．前記免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは前記免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＰＤ－１アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト、ＬＡＧ－３アンタゴニスト、ＴＩＭ－３アンタゴニストまたはＩＣＯＳアゴニストを含む、上記１に記載の用途用の組み合わせ物。
３．前記ＣＴＬＡ－４アンタゴニストが、ＣＴＬＡ－４抗体であり、前記ＰＤ－１アンタゴニストが、ＰＤ－１抗体であり、前記ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストが、ＰＤ－Ｌ１抗体であり、前記ＬＡＧ－３アンタゴニストが、ＬＡＧ－３抗体であり、前記ＴＩＭ－３アンタゴニストが、ＴＩＭ－３抗体であり、前記ＩＣＯＳアゴニストが、ＩＣＯＳ抗体である、上記２に記載の用途用の組み合わせ物。
４．前記ＴＡＡが、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｍｕｃｉｎ１，細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、抗原Ｂｒａｃｈｙｕｒｙまたはこれらを組み合わせたものからなる群から選択されている、上記１に記載の用途用の組み合わせ物。
５．前記ＴＡＡが、５－α－レダクターゼ、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＭ－１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（ＢＡＧＥ）、β－カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ－ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ－１２５、カスパーゼ－８（ＣＡＳＰ－８）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体受容体２（ＣＲ２）、ＣＤ２２／ＢＬ－ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体受容体１（ＣＲ１）、ＣＤ４４／ＰＧＰ－１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（ＬＣＡ）、ＣＤ４６／メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ－１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｃ－ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ－２（ｃｏｘ－２）、結腸直腸癌欠失遺伝子（ＤＣＣ）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞成長因子－８ａ（ＦＧＦ８ａ）、線維芽細胞成長因子－８ｂ（ＦＧＦ８ｂ）、ＦＬＫ－１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（ＧＡＧＥファミリー）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（ＧＤ２）／ガングリオシド３（ＧＤ３）／ガングリオシド－モノシアル酸－２（ＧＭ２）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１－６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ→Ｍａｎ（α１－６）］β１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＧｎＴ Ｖ）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ－１００－ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質－１（ｇｐ７５／ＴＲＰ１）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヘパラナーゼ、ＨＥＲ２、ヒト乳房腫瘍ウイルス（ＨＭＴＶ）、７０キロダルトンの熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インスリン様成長因子受容体－１（ＩＧＦＲ－１）、インターロイキン－１３受容体（ＩＬ－１３Ｒ）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ－ｒａｓ、Ｈ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ－ＦＵＴ、メラノーマ抗原コード遺伝子１（ＭＡＧＥ－１）、メラノーマ抗原コード遺伝子２（ＭＡＧＥ－２）、メラノーマ抗原コード遺伝子３（ＭＡＧＥ－３）、メラノーマ抗原コード遺伝子４（ＭＡＧＥ－４）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、メラン－Ａ／Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原－１（ＭＡＲＴ－１）、メソセリン、ＭＩＣ Ａ／Ｂ、ＭＴ－ＭＭＰ、ムチン、精巣特異抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ－１、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロジェニポイエチン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＡＧＥ－１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ－１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ－７２、トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、サイモシン－β－１５、腫瘍壊死因子－α（「ＴＮＦ－α」）、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）からなる群から選択されている、上記１に記載の用途用の組み合わせ物。
６．前記ＭＶＡが、ＭＶＡ－ＢＮまたはＭＶＡ－ＢＮの誘導体である、上記１に記載の用途用の組み合わせ物。
７．前記ａ）を前記ｂ）の投与と同時に、または前記ｂ）の投与前に投与する、上記１に記載の用途用の組み合わせ物。
８．前記ａ）及び前記ｂ）を前記がん患者にプライミング投与で投与してから、前記ａ）及び前記ｂ）のブースティング投与を１回以上、前記がん患者に行う、上記１に記載の用途用の組み合わせ物。
９．前記がん患者が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌または結腸直腸癌からなる群から選択されるがんに罹患しており、及び／または前記がんと診断されている、上記１に記載の用途用の組み合わせ物。
１０．前記乳癌が、ＨＥＲ２を過剰発現する乳癌である、上記９に記載の用途用の組み合わせ物。
１１．がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、その併用方法が、
ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、静脈内投与すると、ＴＡＡをコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方が誘導される前記ＭＶＡウイルスを前記がん患者に投与することと、
ｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストを前記がん患者に投与することと、
を含み、
前記（ａ）及び前記（ｂ）が、併用治療として投与すべきものであり、前記ａ）及び前記ｂ）を前記がん患者に投与することにより、前記ａ）を単独で非ＩＶ投与するかまたは前記ｂ）を単独で投与する場合と比べて、前記がん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／または生存率が上昇する前記方法。
１２．前記免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは前記免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＰＤ－１アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト、ＬＡＧ－３アンタゴニスト、ＴＩＭ－３アンタゴニストまたはＩＣＯＳアゴニストを含む、上記１１に記載の方法。
１３．前記ＣＴＬＡ－４アンタゴニストが、ＣＴＬＡ－４抗体であり、前記ＰＤ－１アンタゴニストが、ＰＤ－１抗体であり、前記ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストが、ＰＤ－Ｌ１抗体であり、前記ＬＡＧ－３アンタゴニストが、ＬＡＧ－３抗体であり、前記ＴＩＭ－３アンタゴニストが、ＴＩＭ－３抗体であり、前記ＩＣＯＳアゴニストが、ＩＣＯＳ抗体である、上記１２に記載の方法。
１４．前記ＴＡＡが、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｍｕｃｉｎ１，細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、抗原Ｂｒａｃｈｙｕｒｙまたはこれらを組み合わせたものからなる群から選択されている、上記１１に記載の方法。
１５．前記ＴＡＡが、５－α－レダクターゼ、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＭ－１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（ＢＡＧＥ）、β－カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ－ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ－１２５、カスパーゼ－８（ＣＡＳＰ－８）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体受容体２（ＣＲ２）、ＣＤ２２／ＢＬ－ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体受容体１（ＣＲ１）、ＣＤ４４／ＰＧＰ－１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（ＬＣＡ）、ＣＤ４６／メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ－１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｃ－ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ－２（ｃｏｘ－２）、結腸直腸癌欠失遺伝子（ＤＣＣ）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞成長因子－８ａ（ＦＧＦ８ａ）、線維芽細胞成長因子－８ｂ（ＦＧＦ８ｂ）、ＦＬＫ－１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（ＧＡＧＥファミリー）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（ＧＤ２）／ガングリオシド３（ＧＤ３）／ガングリオシド－モノシアル酸－２（ＧＭ２）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１－６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ→Ｍａｎ（α１－６）］β１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＧｎＴ Ｖ）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ－１００－ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質－１（ｇｐ７５／ＴＲＰ１）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヘパラナーゼ、ＨＥＲ２、ヒト乳房腫瘍ウイルス（ＨＭＴＶ）、７０キロダルトンの熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インスリン様成長因子受容体－１（ＩＧＦＲ－１）、インターロイキン－１３受容体（ＩＬ－１３Ｒ）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ－ｒａｓ、Ｈ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ－ＦＵＴ、メラノーマ抗原コード遺伝子１（ＭＡＧＥ－１）、メラノーマ抗原コード遺伝子２（ＭＡＧＥ－２）、メラノーマ抗原コード遺伝子３（ＭＡＧＥ－３）、メラノーマ抗原コード遺伝子４（ＭＡＧＥ－４）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、メラン－Ａ／Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原－１（ＭＡＲＴ－１）、メソセリン、ＭＩＣ Ａ／Ｂ、ＭＴ－ＭＭＰ、ムチン、精巣特異抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ－１、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロジェニポイエチン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＡＧＥ－１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ－１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ－７２、トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、サイモシン－β－１５、腫瘍壊死因子－α（「ＴＮＦ－α」）、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）からなる群から選択されている、上記１１に記載の方法。
１６．前記ＭＶＡが、ＭＶＡ－ＢＮまたはＭＶＡ－ＢＮの誘導体である、上記１１に記載の方法。
１７．前記ａ）を前記ｂ）と同時または前記ｂ）の前に投与する、上記１１に記載の方法。
１８．前記ａ）及び前記ｂ）を前記がん患者にプライミング投与で投与してから、前記ａ）及び前記ｂ）のブースティング投与を１回以上、前記がん患者に行う、上記１１に記載の方法。
１９．前記がん患者が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌または結腸直腸癌からなる群から選択したがんに罹患しており、及び／または前記がんと診断されている、上記１１に記載の方法。
２０．がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させるための併用療法剤であって、前記併用療法剤が、
ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、静脈内投与すると、ＴＡＡをコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルス非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方が誘導される前記ＭＶＡウイルスと、
ｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストと、
を含み、
前記（ａ）及び前記（ｂ）が、併用治療として投与すべきものであり、前記ａ）及び前記ｂ）を前記がん患者に投与することにより、前記ａ）を単独で非ＩＶ投与するかまたは前記ｂ）を単独で投与する場合と比べて、前記がん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／または生存率が上昇する前記併用療法剤。
２１．前記免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは前記免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＰＤ－１アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト、ＬＡＧ－３アンタゴニスト、ＴＩＭ－３アンタゴニストまたはＩＣＯＳアゴニストを含む、上記２０に記載の併用療法剤。
２２．前記ＣＴＬＡ－４アンタゴニストが、ＣＴＬＡ－４抗体であり、前記ＰＤ－１アンタゴニストが、ＰＤ－１抗体であり、前記ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストが、ＰＤ－Ｌ１抗体であり、前記ＬＡＧ－３アンタゴニストが、ＬＡＧ－３抗体であり、前記ＴＩＭ－３アンタゴニストが、ＴＩＭ－３抗体であり、前記ＩＣＯＳアゴニストが、ＩＣＯＳ抗体である、上記２０に記載の併用療法剤。
２３．前記ＴＡＡが、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｍｕｃｉｎ１，細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、抗原Ｂｒａｃｈｙｕｒｙまたはこれらを組み合わせたものからなる群から選択されている、上記２０に記載の併用療法剤。
２４．前記ＴＡＡが、５－α－レダクターゼ、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＭ－１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（ＢＡＧＥ）、β－カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ－ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ－１２５、カスパーゼ－８（ＣＡＳＰ－８）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体受容体２（ＣＲ２）、ＣＤ２２／ＢＬ－ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体受容体１（ＣＲ１）、ＣＤ４４／ＰＧＰ－１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（ＬＣＡ）、ＣＤ４６／メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ－１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｃ－ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ－２（ｃｏｘ－２）、結腸直腸癌欠失遺伝子（ＤＣＣ）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞成長因子－８ａ（ＦＧＦ８ａ）、線維芽細胞成長因子－８ｂ（ＦＧＦ８ｂ）、ＦＬＫ－１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（ＧＡＧＥファミリー）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（ＧＤ２）／ガングリオシド３（ＧＤ３）／ガングリオシド－モノシアル酸－２（ＧＭ２）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１－６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ→Ｍａｎ（α１－６）］β１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＧｎＴ Ｖ）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ－１００－ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質－１（ｇｐ７５／ＴＲＰ１）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヘパラナーゼ、ＨＥＲ２、ヒト乳房腫瘍ウイルス（ＨＭＴＶ）、７０キロダルトンの熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インスリン様成長因子受容体－１（ＩＧＦＲ－１）、インターロイキン－１３受容体（ＩＬ－１３Ｒ）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ－ｒａｓ、Ｈ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ－ＦＵＴ、メラノーマ抗原コード遺伝子１（ＭＡＧＥ－１）、メラノーマ抗原コード遺伝子２（ＭＡＧＥ－２）、メラノーマ抗原コード遺伝子３（ＭＡＧＥ－３）、メラノーマ抗原コード遺伝子４（ＭＡＧＥ－４）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、メラン－Ａ／Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原－１（ＭＡＲＴ－１）、メソセリン、ＭＩＣ Ａ／Ｂ、ＭＴ－ＭＭＰ、ムチン、精巣特異抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ－１、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロジェニポイエチン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＡＧＥ－１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ－１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ－７２、トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、サイモシン－β－１５、腫瘍壊死因子－α（「ＴＮＦ－α」）、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）からなる群から選択されている、上記２０に記載の併用療法剤。
２５．前記ＭＶＡが、ＭＶＡ－ＢＮまたはＭＶＡ－ＢＮの誘導体である、上記２０に記載の併用療法剤。
２６．前記ａ）を前記ｂ）と同時または前記ｂ）の前に投与する、上記２０に記載の併用療法剤。
２７．前記ａ）及び前記ｂ）を前記がん患者にプライミング投与で投与してから、前記ａ）及び前記ｂ）のブースティング投与を１回以上、前記がん患者に行う、上記２０に記載の併用療法剤。
２８．前記がん患者が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌または結腸直腸癌からなる群から選択したがんに罹患しており、及び／または前記がんと診断されている、上記２０に記載の併用療法剤。

【実施例】

【0190】

下記の実施例には、本発明が例示されているが、実施例は、いかなる場合も、請求項の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。

【0191】

実施例１：組み換えＭＶＡの静脈内投与により、ＮＫ細胞の活性化が増強される
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡとして示されている）またはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌとして示されている）で皮下（ＳＣ）免疫または静脈内（ＩＶ）免疫した。ＰＢＳをＳＣ注射した。１日後、Ａ）ＮＫｐ４６^＋ ＣＤ３^－細胞、Ｂ）ＣＤ６９、Ｃ）ＮＫＧ２Ｄ、Ｄ）ＦａｓＬ、Ｅ）Ｂｃｌ－Ｘ_Ｌ、Ｆ）ＣＤ７０及びＧ）ＩＦＮ－γに対して染色することによって、脾臓（図１Ａ～１Ｇに示されている）、肝臓（図２Ａ～２Ｇに示されている）、及び肺（図３Ａ～３Ｇに示されている）において、フローサイトメトリーを用いて、ＮＫ細胞の出現頻度及びタンパク質の発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示した）を評価した。

【0192】

加えて、抗原であるＨＥＲ２ｖ１、ＴＷＩＳＴ及びＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡ（ＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０Ｌとして示されている）５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを皮下（ＳＣ）免疫または静脈内（ＩＶ）免疫した。ＰＢＳを皮下（ＳＣ）注射した。１日後、Ａ）ＮＫｐ４６^＋ ＣＤ３^－細胞、Ｂ）ＣＤ６９、Ｃ）ＦａｓＬ、Ｄ）Ｂｃｌ－Ｘ_Ｌ、Ｅ）ＣＤ７０及びＦ）ＩＦＮ－γに対して染色することによって、脾臓（図４Ａ～４Ｆに示されている）、肝臓（図５Ａ～５Ｆに示されている）、及び肺（図６Ａ～６Ｆに示されている）において、フローサイトメトリーを用いて、ＮＫ細胞の出現頻度及びタンパク質の発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示されている）を評価した。

【0193】

図に示されているように、脾臓ＮＫ細胞の出現頻度は、ｒＭＶＡ、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０Ｌの注射後、適用経路にかかわらず、低下または維持された。Ａ）においては、ｒＭＶＡをＩＶ適用した場合、肝臓及び肺におけるＮＫ細胞の出現頻度が、ＳＣ適用よりも上昇した。Ｂ）においては、ＣＤ６９は、ＮＫ細胞に対する刺激受容体であり（Ｂｏｒｒｅｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９９）、ｒＭＶＡ、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０ＬのＩＶ注射後、著しくアップレギュレートするが、ＳＣ注射ではあまりアップレギュレートしない。ＣＤ６９の発現最高値は、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０ＬのＩＶ適用によって誘導された。図１～３のＣ）においては、ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌで免疫後、活性化Ｃ型レクチン様受容体ＮＫＧ２Ｄが、ＰＢＳで処置した場合とよりも、ＮＫ細胞上でアップレギュレートする。図１～３の（Ｄ）及び図４～６の（Ｃ）においては、ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌで免疫後、アポトーシス誘導因子ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ）が、ＰＢＳで処置した場合よりも、ＮＫ細胞上でアップレギュレートする。図１～３の（Ｄ）及び図４～６の（Ｃ）においては、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０ＬのＩＶ注射後、脾臓及び肺でのＦａｓＬの発現が最も高かった。図１～３の（Ｅ）及び４～６の（Ｄ）においては、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０ＬでのＩＶ免疫では、抗アポトーシス性のＢｃｌファミリーメンバーＢｃｌ－ｘ_Ｌの発現も、ＳＣ免疫よりも高くなる。図１～３の（Ｆ）及び４～６の（Ｅ）においては、ｒＭＶＡ、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０ＬのＩＶ注射によって、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーである共刺激分子ＣＤ７０のアップレギュレーションが、特に脾臓ＮＫ細胞において誘導される。図１～３の（Ｇ）及び４～６の（Ｆ）においては、重要なことに、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０ＬでのＩＶ免疫後、脾臓、肺及び肝臓において、エフェクターサイトカインＩＦＮ－γが、最も顕著に発現した。これらのデータから、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０ＬによるＩＶ免疫によって、全身でＮＫ細胞が著しく活性化されるが、ＳＣ免疫ではあまり活性化されないことが示されている。

【0194】

実施例２：組み換えＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌの静脈内投与により、ＮＫ細胞の全身的な活性化が増強される
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）またはＰＢＳでＩＶ免疫した。注射の６時間後、図７Ａ～７Ｆに示されているように、血清サイトカインレベル（（Ａ）ＩＦＮ－γ、（Ｂ）ＩＬ－１２ｐ７０及び（Ｃ）ＣＤ６９^＋グランザイムＢ^＋）をビーズアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）（Ａ及びＢ）ならびにフローサイトメトリー（Ｃ）によって定量した。ＮＫ細胞活性化サイトカインＩＬ－１２ｐ７０は、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌで免疫した後のみに検出可能であった。ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌで免疫後、ＩＦＮ－γの濃度は、ｒＭＶＡで免疫した場合よりも高かった。ＩＦＮ－γの血清レベルの上昇は、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌで免疫してから４８時間後、ＮＫ細胞のＩＦＮ－γのＧＭＦＩが増加したこと（図１Ｇと比較）と、脾臓ＣＤ６９^＋グランザイムＢ^＋ ＮＫ細胞の出現頻度が上昇したことと一致する。

【0195】

同様の応答は、ＮＨＰ（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）でも、ＭＶＡ－ＭＡＲＶ－ＧＰ－ｈｕＣＤ４０ＬのＩＶ注射後に見られ、すなわち、ＭＶＡ－ＭＡＲＶ－ＧＰの場合よりも、ＩＦＮ－γ（Ｄ）及びＩＬ－１２ｐ４０／７０（Ｅ）の血清濃度が上昇し、（Ｋｉ６７^＋）ＮＫ細胞（Ｆ）が増殖した。図７Ｄ～Ｅに示されているこれらのデータによって、ＣＤ４０ＬをコードするＭＶＡワクチンは、マウス及びＮＨＰにおける免疫特性が似通っていることが示されている。

【0196】

実施例３：組み換えＭＶＡの静脈内投与により、強力なＣＤ８ Ｔ細胞応答が誘導される
０日目及び１６日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ＯＶＡで静脈内（ＩＶ）免疫または皮下（ＳＣ）免疫した。７日目及び２２日目に、Ｈ－２Ｋｂ／ＯＶＡ_{２５７－２６４}デキストラマーで染色後、血液中のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答をフローサイトメトリーによって評価した。図８に示されているように、７日目において、ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の出現頻度は、ＳＣ注射の場合よりも９倍高かった。２２日目には、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞は、ＳＣ注射後よりも４倍高かった。

【0197】

実施例４：組み換えＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌの静脈内投与により、ＣＤ８ Ｔ細胞応答がさらに増強される
図９に示されているように、０日目及び３５日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ＯＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌで静脈内免疫した。Ｈ－２Ｋｂ／ＯＶＡ_{２５７－２６４}デキストラマーで染色後、血液中のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答をフローサイトメトリーによって評価した。一次応答（７日目）及び二次応答（３９日目）のピークに関しては、ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の出現頻度は、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌで免疫後、ＭＶＡ－ＯＶＡで免疫した場合よりも、一次応答では４倍、二次応答では２倍増強された（Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１３），ｏｐ．ｃｉｔ．）。

【0198】

実施例５：プライム－ブースト免疫により、ＮＫ細胞の活性化及び増殖の反復が見られる

【0199】

【表1】

【0200】

表１に示されているようにして、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＩＶ免疫した（組み換えＭＶＡの用量は、５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０であった）。「ｈｏｍ」とは、「同種でのプライミング－ブースティング」を指し、「ｈｅｔ」とは、「異種でのプライミング－ブースティング」を指すことに留意されたい。２回目及び３回目の免疫から１日後及び４日後に、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ ＮＫｐ４６＋）を血液において、フローサイトメトリーによって解析した。図１０Ａ及び１０Ｂに示されているのは、ＣＤ６９のＧＭＦＩ（Ａ）と、Ｋｉ６７＋ ＮＫ細胞の出現頻度（Ｂ）である。図１０Ａ及び１０Ｂには、抗ベクター免疫の存在にかかわらず、ＮＫ細胞が、毎回の免疫によって活性化されることが示されている。この予想外の所見により、抗体療法とブースト免疫の併用が、ＮＫ細胞を活性化すると見られることが裏付けられている。すなわち、がん患者を組み換えＭＶＡで複数回処置して、抗ベクター応答が生じるときにも、ＮＫ細胞の活性化は低減されない。対照的に、処置するたびに、デノボでＮＫ細胞が活性化される。

【0201】

実施例６：プライム－ブースト免疫により、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞の誘導が増強される
表１に示されているようにして、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫した（組み換えＭＶＡの用量は、５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０であった）。免疫から６時間後に、血清サイトカインレベルをマルチプレックスビーズアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）によって定量した。示されているのは、１１Ａ）ＩＬ－６、１１Ｂ）ＣＸＣＬ１０、１１Ｃ）ＩＦＮ－α、１１Ｄ）ＩＬ－２２、１１Ｅ）ＩＦＮ－γ、１１Ｆ）ＣＸＣＬ１、１１Ｇ）ＣＣＬ４、１１Ｈ）ＣＣＬ７、１１Ｉ）ＣＣＬ２、１１Ｊ）ＣＣＬ５、１１Ｋ）ＴＮＦ－α、１１Ｌ）ＩＬ－１２ｐ７０及び１１Ｍ）ＩＬ－１８というサイトカインの発現の結果である。

【0202】

図１１Ａ～１１Ｍに示されているように、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ ｈｏｍで処置したマウス（すなわち、同種でのプライミング－ブースティングで処置したマウス）は、サイトカインプロファイルが、ｒＭＶＡでプライミングし、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌでブースティングしたマウス（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ ｈｅｔ）と似通っていた。ｒＭＶＡ ｈｏｍで処置したマウスでは、１回目及び２回目の免疫後、ＩＬ－６、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ－２２、ＩＦＮ－α、ＴＮＦ－α、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１のレベルが、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌでプライミングしたマウスよりも低かった。プライミング後には見られなかったが、２回目及び３回目の免疫後に高度に産生されたサイトカインは、ＩＬ－２２であった。ＩＬ－２２は主に、エフェクターヘルパーＴ細胞、及び自然リンパ球細胞のサブ集団によって産生される。したがって、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ ｈｅｔまたはｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ ｈｏｍで処置したマウスにおけるＩＬ－２２の発現量が多いほど、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌでの免疫によるＣＤ４ Ｔヘルパー応答の誘導が強力であることを示す。総合すると、ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ－ＣＤ４０ＬでのＩＶ免疫により、全身での高度なサイトカイン応答が誘導され、その応答は、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌでプライミングしたマウスで最も高かった。

【0203】

実施例７：プライム－ブースト免疫により、ＣＤ８エフェクターメモリーＴ細胞及びＣＤ４エフェクターメモリーＴ細胞の応答の増強が見られる
表１に示されているようにして、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＩＶ免疫した。その結果は、図１２に示されている。表現型的には、エフェクターＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ４４の発現及び表面ＣＤ６２Ｌの欠損によって特定できる。血液において、ＣＤ４４＋ ＣＤ６２Ｌ－ ＣＤ８ Ｔ細胞（Ａ）及びＣＤ４４＋ ＣＤ６２Ｌ－ ＣＤ４ Ｔ細胞（Ｂ）をモニタリングしたところ、ＩＶ免疫を繰り返すと、エフェクターＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞の増加が誘導されることが示された。興味深いことに、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ ｈｏｍまたはｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ ｈｅｔのいずれかを投与されたマウスは、循環ＣＤ４エフェクターＴ細胞が、ｒＭＶＡでプライミングしたマウスよりも約２．５倍多かった（Ｂ、２５日目）。このことから、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌでの全身プライミングにより、ｒＭＶＡよりも強いＣＤ４ Ｔ細胞応答が誘導されることが示されている。

【0204】

実施例８：メラノーマを治療する際、組み換えＭＶＡの静脈内投与により、強力な抗腫瘍作用が得られる
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍は、外来モデル抗原オボアルブミン（「ＯＶＡ」）を発現する。触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）で、ＩＶまたはＳＣによってプライミングした（点線）（組み換えＭＶＡの用量は、５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０であった）。プライミング免疫から７日後及び１４日後に、マウスに、その後のブースティングをＦＰＶ－ＯＶＡによって、５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０で行った（破線）。腫瘍の成長を等間隔で測定した。図１３に示されているのは、腫瘍平均体積（Ａ）と、腫瘍を接種してから４５日目までの腫瘍担持マウスの生存率（Ｂ）である。すなわち、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスをｒＭＶＡ－ＣＤ４０ＬでＩＶプライミングすると、抗腫瘍作用が、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０ＬによるＳＣ免疫、ｒＭＶＡによるＳＣ免疫、またはｒＭＶＡによるＩＶ免疫のいずれよりも強力になる。

【0205】

実施例９：組み換えＭＶＡの単回静脈内投与により、強力な抗腫瘍作用が得られる

【0206】

【表2】

【0207】

表２に示されているようにして、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにワクチンをＩＶ接種した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。図１４に示されているのは、腫瘍平均体積である。この結果から、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌで治療的免疫を１回行うことは、同種または異種でのプライム／ブースト免疫と同程度の強度があることが示されている。重要なことに、これらのデータから、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌの強力な抗腫瘍活性が明らかになっている。

【0208】

実施例１０：組み換えＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌの静脈内投与により、腫瘍微小環境内のＴ細胞浸潤が増加する
触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、ｒＭＶＡ（ＭＶＡ－ＯＶＡ）またはｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）で静脈内免疫した（組み換えＭＶＡの用量は、５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０であった）。７日後、マウスを殺処分した。図１５Ａ及び１５Ｂに示されているように、脾臓、腫瘍流入リンパ節（ＴＤＬＮ）及び腫瘍組織の白血球において、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞及びＯＶＡ_{２５７－２６４}特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の出現頻度及び分布を解析した。図１５Ｃに示されているように、腫瘍内浸潤しているＯＶＡ_{２５７－２６４}特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞上のＰＤ－１及びＬａｇ３の幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）を解析した。

【0209】

勘案すると、これらのデータから、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌで免疫すると、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内へのＴＡＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤が、ＰＢＳの場合よりも顕著になり、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌで免疫すると、ＰＤ－１及びＬａｇ３の発現が減少することが示されている。

【0210】

実施例１１：組み換えＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌの静脈内投与により、腫瘍微小環境内のＴｒｅｇのレベルが低下した
精製されたＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８ Ｔ細胞（ＯＴ－Ｉ）をＢ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスに、腫瘍が触知可能となったら、静脈内移入した。腫瘍の体積が少なくとも６０ｍｍ３に達したら、マウスをＭＶＡ－ＢＮ、ＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）で免疫した（組み換えＭＶＡの用量は、５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０であった）。１７日後、マウスを殺処分し、腫瘍組織中のＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３＋ ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇの出現頻度について解析した。その結果は、図１６に示されている。勘案すると、これらのデータから、ＴＭＥに長期間暴露された後でも、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌで１回免疫すると、Ｔｒｅｇが、コントロールの処置（ＴＡＡをコードしないＭＶＡ－ＢＮ）またはｒＭＶＡによる免疫の場合よりも減少することが示されている。

【0211】

実施例１２：組み換えＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌの静脈内投与により、腫瘍微小環境へのＴ細胞浸潤の継続時間が長くなった
ＴＣＲトランスジェニックＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞（ＯＴ－Ｉ）をＢ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスに、腫瘍が触知可能となったら、静脈内移入した。腫瘍の体積が少なくとも６０ｍｍ^３に達したら、マウスをＭＶＡ－ＢＮ、ＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）で免疫した（組み換えＭＶＡの用量は、５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０であった）。１７日後、マウスを殺処分し、Ａ）腫瘍組織中の白血球におけるＣＤ８^＋ Ｔ細胞の出現頻度、Ｂ）ＣＤ８^＋ Ｔ細胞におけるＬａｇ３^＋ ＰＤ１^＋の出現頻度、Ｃ）ＣＤ８^＋ Ｔ細胞におけるＥｏｍｅｓ^＋ ＰＤ１^＋ Ｔ細胞の出現頻度、Ｄ）免疫後のＴＭＥにおけるＯＴ－ＩトランスジェニックＣＤ８^＋ Ｔ細胞の存在、Ｅ）ＯＴ－Ｉ^＋ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞におけるＬａｇ３^＋ ＰＤ１^＋疲弊Ｔ細胞の出現頻度、及びＦ）ＯＴ－Ｉ^＋ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞におけるＥｏｍｅｓ^＋ ＰＤ１^＋疲弊Ｔ細胞の出現頻度について解析した。その結果は、図１７に示されている。これらのデータから、ＴＭＥに長期間暴露された後でも、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌで免疫すると、ＴＭＥに動員されるＴＡＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞では、免疫疲弊の徴候が、コントロールの処置（ＴＡＡをコードしないＭＶＡ－ＢＮ）またはｒＭＶＡによる免疫の後よりも少ないことが示されている。

【0212】

図１５及び１７に示されているように、ｒＭＶＡを静脈内投与したところ、ＰＤ１^＋及びＬａｇ３^＋の発現が減少したとともに、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌを静脈内投与したところ、ＰＤ１^＋及びＬａｇ３^＋の発現がさらに減少した。

【0213】

実施例１３：組み換えＭＶＡウイルスＭＶＡ－ｍＢＮ４４５、ＭＶＡ－ｍＢＮ４５１、ＭＶＡ－ｍＢＮｂｃ１９７、ＭＶＡ－ｍＢＮｂｃ１９５、ＭＶＡ－ｍＢＮｂｃ３８８、ＭＶＡ－ｍＢＮｂｃ３８９及びＭＶＡ－ｍＢＮ４８４の構築
本発明の併用療法の要素を実現させる組み換えＭＶＡウイルス（例えば、ＭＶＡ－ｍＢＮ４４５、ＭＶＡ－ｍＢＮ４５１及びＭＶＡ－ｍＢＮ４８４）の作製は、示されている導入遺伝子を、それらのプロモーターとともにベクターＭＶＡ－ＢＮに挿入することによって行った。導入遺伝子及び選択カセットと、ＭＶＡ－ＢＮ内の標的座位と相同な配列とを含む組み換えプラスミドを用いて、導入遺伝子を挿入した。ＭＶＡ－ＢＮに感染させたＣＥＦ細胞に、その組み換えプラスミドをトランスフェクションすることによって、そのウイルスゲノムとその組み換えプラスミドとの間の相同組み換えを生じさせた。続いて、その選択カセットを挟み込んでいるｌｏｘＰ部位を特異的に標的ととし、それにより、その介在配列を切除するＣＲＥ－リコンビナーゼを発現するプラスミドの助けにより、第２の工程中に、その選択カセットを欠失させた。

【0214】

ｍＢＮｂｃ３４６の構築の際には、組み換えプラスミドには、導入遺伝子ＡＨ１Ａ５、ｐ１５ｅ及びＴＲＰ２（それぞれ、その前にはプロモーター配列を配置した）と、そのウイルスゲノムに相同組み換えが生じるように、ＭＶＡ－ＢＮ内の標的挿入部位と同一である配列を含めた。

【0215】

ｍＢＮｂｃ３５４の構築の際には、組み換えプラスミドには、導入遺伝子ＡＨ１Ａ５、ｐ１５ｅ及びＴＲＰ２、ならびにＣＤ４０Ｌ（それぞれ、その前にはプロモーター配列を配置した）と、そのウイルスゲノムに相同組み換えが生じるように、ＭＶＡ－ＢＮ内の標的挿入部位と同一である配列を含めた。

【0216】

ｍＢＮ４５１の構築の際には、組み換えプラスミドには、２つの導入遺伝子ＨＥＲ２ｖ１（配列番号１）及びＢｒａｃｈｙｕｒｙ（配列番号５）（それぞれ、その前にはプロモーター配列を配置した）と、そのウイルスゲノムに相同組み換えが生じるように、ＭＶＡ－ＢＮ内の標的挿入部位と同一である配列を含めた。そのＨＥＲ２のコード配列（すなわちヌクレオチド配列）は、配列番号２であり、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙのコード配列は、配列番号６である。

【0217】

ｍＢＮ４４５の構築の際には、組み換えプラスミドには、３つの導入遺伝子ＨＥＲ２ｖ１（配列番号１）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（配列番号５）及びＣＤ４０Ｌ（配列番号１３）（それぞれ、その前にはプロモーター配列を配置した）と、そのウイルスゲノムに相同組み換えが生じるように、ＭＶＡ－ＢＮ内の標的挿入部位と同一である配列を含めた。そのＨＥＲ２のコード配列（すなわちヌクレオチド配列）は、配列番号２であり、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙのコード配列は、配列番号６であり、ＣＤ４０Ｌのコード配列は、配列番号１４である。

【0218】

ｍＢＮｂｃ３８８の構築の際には、組み換えプラスミドには、３つの導入遺伝子ＨＥＲ２ｖ１（アミノ酸配列番号１）、Ｔｗｉｓｔ（アミノ酸配列番号１５）及びＣＤ４０Ｌ（アミノ酸配列番号１７）（それぞれ、その前にはプロモーター配列を配置した）と、そのウイルスゲノムに相同組み換えが生じるように、ＭＶＡ－ＢＮ内の標的挿入部位と同一である配列を含めた。そのＨＥＲ２ｖ１のコード配列（すなわちヌクレオチド配列）は、配列番号２であり、Ｔｗｉｓｔのコード配列は、配列番号１６であり、ＣＤ４０Ｌのコード配列は、配列番号１８である。

【0219】

ｍＢＮｂｃ３８９の構築の際には、組み換えプラスミドには、２つの導入遺伝子ＨＥＲ２ｖ１（アミノ酸配列番号１）及びＴｗｉｓｔ（アミノ酸配列番号１５）（それぞれ、その前にはプロモーター配列を配置した）と、そのウイルスゲノムに相同組み換えが生じるように、ＭＶＡ－ＢＮ内の標的挿入部位と同一である配列を含めた。そのＨＥＲ２ｖ１のコード配列（すなわちヌクレオチド配列）は、配列番号２であり、Ｔｗｉｓｔのコード配列は、配列番号１６である。

【0220】

ｍＢＮ４８４の構築の際には、組み換えプラスミドには、３つの導入遺伝子ＨＥＲ２ｖ２（アミノ酸配列番号３）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（アミノ酸配列番号５）及びＣＤ４０Ｌ（アミノ酸配列番号１３）（それぞれ、その前にはプロモーター配列を配置した）と、そのウイルスゲノムに相同組み換えが生じるように、ＭＶＡ－ＢＮ内の標的挿入部位と同一である配列を含めた。そのＨＥＲ２ｖ２のコード配列（すなわちヌクレオチド配列）は、配列番号４であり、Ｔｗｉｓｔのコード配列は、配列番号６であり、ＣＤ４０Ｌのコード配列は、配列番号１４である。

【0221】

上記のｍＢＮ ＭＶＡ（例えば、ｍＢＮ４４５、ｍＢＮ４５１及びｍＢＮ４８４）の作製の際には、ＣＥＦ細胞培養物にそれぞれ、ＭＶＡ－ＢＮを接種し、それぞれ、対応する組み換えプラスミドをトランスフェクションした。次に、選択圧をかける薬剤を含む培地中のＣＥＦ培養物に、これらの細胞培養物から得た試料を接種し、蛍光を発現しているウイルスクローンをプラーク精製によって単離した。蛍光タンパク質を含む選択カセットをこれらのウイルスクローンから欠失させるのには、第２の工程において、ＣＲＥを介した組み換え（各コンストラクトにおいて、その選択カセットを挟み込んでいる２つのｌｏｘＰ部位を伴う）を介在させた。その第２の組み換え工程後、ＭＶＡ－ＢＮの標的座位内にプロモーターが挿入された状態で、導入遺伝子配列のみ（例えば、ＨＥＲ２、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及び／またはＣＤ４０Ｌ）が保持された。選択カセットが欠失したプラーク精製済みウイルスのストックを調製した。

【0222】

その後、記載されているコンストラクトを接種した細胞で、その所定の導入遺伝子の発現を証明した（例えば、図１７を参照されたい）。

【0223】

ｍＢＮｂｃ３８８、ｍＢＮｂｃ３８９、ｍＢＮｂｃ３４６及びｍＢＮｂｃ３５４の作製は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）でクローン型のＭＶＡ－ＢＮを用いることによって行った。ｍＢＮｂｃ３８８及びｍＢＮｂｃ３８９、ならびにｍＢＮｂｃ３４６及びｍＢＮｂｃ３５４用の異なる導入遺伝子をそれぞれ含む組み換えプラスミドを使用した。ＭＶＡにも存在することにより、組み込み部位の特異的な標的化を可能にする配列をそれらのプラスミドに含めた。抗原であるＡＨ１Ａ５、ｐ１５ｅ、ＯＶＡ、Ｈｅｒ２ｖ１、Ｔｗｉｓｔ、ＴＲＰ２及び／またはＣＤ４０Ｌをコードするヌクレオチド配列は、ＭＶＡウイルスゲノムへの組み換えを可能にするＭＶＡ配列の間に置いた。したがって、それぞれプロモーターの下流に、ＡＨ１Ａ５、ｐ１５ｅ、ＯＶＡ、ＨＥＲ２ｖ１、Ｔｗｉｓｔ、ＴＲＰ２及び／またはＣＤ４０Ｌのコード配列を含む各コンストラクトに対して、プラスミドを構築した。簡潔に述べると、ＢＡＣ ＤＮＡをＢＨＫ－２１細胞にトランスフェクションし、それらの細胞に、ヘルパーウイルスとしてのショープ線維腫ウイルスを重感染させることによって、感染性ウイルスをＢＡＣから再構築した。ＣＥＦ細胞培養液で３代追加継代した後、ヘルパーウイルスを含まないＭＶＡ－ｍＢＮｂｃ３８８及びＭＶＡ－ｍＢＮｂｃ３８９を得た。例示的なＭＶＡ作製法は、Ｂａｕｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｖｉｒｏｌ．８４：８７４３－５２，“Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｂｒｅａｋｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｓｔｒｏｎｇ ｖｅｃｔｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂ８Ｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”にも見られる。

【0224】

実施例１４：ＭＶＡ－ＨＥＲ２－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ＣＤ４０Ｌの異種発現
ＨｅＬａ細胞を未処置のままにするか（モック）、またはＭＶＡ－ＢＮもしくはＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ＣＤ４０Ｌ（ＭＶＡ－ｍＢＮ４４５）に感染させるかした。一晩培養後、細胞を抗ＨＥＲ２－ＡＰＣ（クローン２４Ｄ２）、抗Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（ウサギポリクローナル）＋抗ウサギＩｇＧ－ＰＥ及び抗ＣＤ４０Ｌ－ＡＰＣ（クローンＴＲＡＰ１）で染色した。図１８Ａ～１８Ｄに示されているように、フローサイトメトリー解析によって、３つのすべての導入遺伝子の発現が明らかになった。

【0225】

実施例１５：ＭＶＡ－ＨＥＲ２－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ＣＤ４０Ｌによる、ヒトＤＣの活性化の増強
プロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、ＭＯ－ＤＣ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ Ｂｏｘ）に従って、ヒトＰＢＭＣから得たＣＤ１４＋単球を濃縮した後、単球由来樹状細胞（ＤＣ）を作製し、７日間、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４の存在下で培養した。ＤＣをＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－ＢｒａｃｈｙｕｒｙまたはＭＶＡ－ＨＥＲ２－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ＣＤ４０Ｌで刺激した。図１９に示されているように、Ａ）ＣＤ４０Ｌ、Ｂ）ＣＤ８６及びＣ）クラスＩＩ ＭＨＣの発現をフローサイトメトリーによって解析した。Ｄ）に示されているように、一晩培養後、上清中のＩＬ－１２ｐ７０の濃度をＬｕｍｉｎｅｘによって定量した。

【0226】

この実験から、ｒＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ＣＤ４０Ｌが、ヒトＤＣを刺激し、ヒトＤＣの活性化を誘導し、その結果、ヒトＤＣが抗原を提示する能力を増強することが示されている。Ｔｈ１の分化を促し、ＮＫ細胞を活性化させるサイトカインＩＬ－１２ｐ７０が、刺激されたヒトＤＣにより産生されることから、ＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ＣＤ４０Ｌが、ヒトＤＣを炎症誘発性表現型の方向に活性化させることが示されている。

【0227】

実施例１６：ＭＶＡ－ＨＥＲ２－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０Ｌ（ｍＢＮｂｃ３８８）の静脈内投与により、ＨＥＲ２特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の腫瘍内浸潤が増強される
ＣＴ２６．ＨＥＲ２腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに、ＰＢＳまたは５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０Ｌのいずれかを静脈内投与した。７日後、マウスを殺処分し、脾臓のＣＤ８＋ Ｔ細胞及び腫瘍内に浸潤しているＣＤ８＋ Ｔ細胞を磁気細胞ソーティングによって単離し、ＨＥＲ２ペプチドをロードした樹状細胞の存在下で、５時間培養した。グラフには、ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＣＤ４４＋ ＩＦＮγ＋細胞のパーセンテージが示されている。結果は、平均±標準誤差として示されている。図２０に示されている結果から、本発明の様々な実施形態が腫瘍特異的であることが示されている。

【0228】

実施例１７：ＰＤ－１チェックポイントアンタゴニストによる遮断と組み合わせて、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０ＬをＩＶ投与した際の全生存率の上昇及び腫瘍の縮小

【0229】

【表3】

【0230】

９０ｍｍ^３のＭＣ３８大腸癌を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ＡＨ１Ａ５－ｐ１５ｅ－ＴＲＰ２－ＣＤ４０Ｌ（図２０には、ｒＭＶＡ－ｐ１５ｅ－ＣＤ４０Ｌとして示されている）でＩＶ免疫した。続いて、表３に示されているように、免疫後、同日に１０ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１抗体またはＰＢＳを投与してから、免疫後２週間以内に追加の抗体投与を３回行った。腫瘍の成長を等間隔で測定した。図２１に示されているのは、腫瘍平均体積（Ａ）及び腫瘍なしの生存率（Ｂ）である。これらのデータから、大腸癌モデルにおいて、ＰＤ－１チェックポイントを遮断すると、腫瘍関連抗原及びＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡで治療的免疫を１回行うことにより得られる抗腫瘍作用が増強されるので、腫瘍拒絶が誘導されることが示されている。

【0231】

実施例１８：ＨＥＲ２を発現する大腸癌において、抗ＰＤ－１チェックポイントによる遮断と組み合わせて、ｒＭＶＡ－ＨＥＲ２－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０ＬをＩＶ投与した際の全生存率の上昇及び腫瘍の縮小
８５ｍｍ３のＭＣ３８．ＨＥＲ２大腸癌を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０ＬでＩＶ免疫するか、またはそのマウスにＰＢＳを投与するかした。続いて、免疫後、ＰＤ－１抗体を投与した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。図２２に示されているのは、腫瘍平均体積（Ａ）及び腫瘍なしの生存率（Ｂ）である。これらのデータから、ＨＥＲ２を発現する大腸癌モデルにおいて、ＰＤ－１チェックポイントを遮断すると、ｒＭＶＡ－ＨＥＲ２ｖ１－Ｔｗｉｓｔ－ＣＤ４０Ｌで治療的免疫を１回行うことにより得られる抗腫瘍作用が増強されるので、腫瘍拒絶が誘導されることが示されている。

【0232】

図２１及び２２の両方に示されているように、驚くべきことに、ＴＡＡ及びＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡに、ＰＤ－１チェックポイントアンタゴニストを加えたところ、抗腫瘍作用の増大が見られた。図１５及び１７に示されているように、ｒＭＶＡの静脈内投与により、ＰＤ１及びＬａｇ３の発現が減少し、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌの静脈内投与により、発現がさらに減少した。

【0233】

Ｂｒａｃｈｙｕｒｙのマウスホモログは、正常なマウス組織でも高度には発現せず、マウス腫瘍組織でも顕著には発現しないので、能動免疫療法の標的としてのＢｒａｃｈｙｕｒｙの有効性は、マウスモデル系では効果的には研究できない（ＷＯ２０１４／０４３５３５（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）。マウスモデルで用いられている、ヒトＢｒａｃｈｙｕｒｙのマウスホモログであるＴｗｉｓｔは、ヒトにおけるＢｒａｃｈｙｕｒｙ機能の予測モデルである。このことは、ＷＯ２０１４／０４３５３５で立証された。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙと同様に、ＥＭＴ制御因子のマウスホモログＴｗｉｓｔは、発生の際に、Ｅ－カドヘリンによって媒介される細胞間接着をダウンレギュレートし、間葉系マーカーをアップレギュレートすることによってＥＭＴを促すとともに、マウス腫瘍組織において主に発現する（例えば、ＷＯ２０１４／０４３５３５の図５及び実施例８を参照されたい）。したがって、Ｔｗｉｓｔ特異的ながんワクチンのマウスにおける試験では、ヒトにおけるＢｒａｃｈｙｕｒｙ特異的ながんワクチンの有効性に関する強力な予測値が得られる可能性が非常に高い。上記文献を参照されたい。

【0234】

実施例１９：ＣＴＬＡ－４チェックポイントの遮断と組み合わせて、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０ＬをＩＶ投与した際の全生存率の上昇及び腫瘍の縮小
８５ｍｍ３のＭＣ３８大腸癌を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＭＶＡ－ＡＨ１Ａ５－ｐ１５ｅ－ＴＲＰ２－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫するか、そのマウスにＰＢＳを投与する。続いて、免疫後、ＣＴＬＡ－４抗体を投与する。腫瘍の成長を等間隔で測定する。

【0235】

実施例２０：Ｌａｇ３チェックポイントの遮断と組み合わせて、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０ＬをＩＶ投与した際の全生存率の上昇及び腫瘍の縮小
８５ｍｍ３のＭＣ３８大腸癌を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＭＶＡ－ＡＨ１Ａ５－ｐ１５ｅ－ＴＲＰ２－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫するか、そのマウスにＰＢＳを投与する。続いて、免疫後、Ｌａｇ３抗体を投与する。腫瘍の成長を等間隔で測定する。

【0236】

実施例２１：ＴＩＭ－３チェックポイントの遮断と組み合わせて、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０ＬをＩＶ投与した際の全生存率の上昇及び腫瘍の縮小
８５ｍｍ３のＭＣ３８大腸癌を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＭＶＡ－ＡＨ１Ａ５－ｐ１５ｅ－ＴＲＰ２－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫するか、またはそのマウスにＰＢＳを投与する。続いて、免疫後、Ｔｉｍ３抗体の投与を行う。腫瘍の成長を等間隔で測定する。

【0237】

実施例２２：組み換えＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌの静脈内投与により、腫瘍微小環境へのＴ細胞浸潤の継続時間が長くなった
ＴＣＲトランスジェニックＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞（ＯＴ－Ｉ）をＢ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスに、腫瘍が触知可能となったら静脈内移入する。腫瘍の体積が少なくとも６０ｍｍ^３に達したら、マウスをＭＶＡ－ＢＮ、ＭＶＡ－ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ）で免疫する（組み換えＭＶＡの用量は、５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０であった）。１７日後、マウスを殺処分し、Ａ）ＣＤ８^＋ Ｔ細胞におけるＬａｇ３^＋の出現頻度、及びＢ）ＴＩＭ３^＋ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の出現頻度について解析する。

【0238】

実施例２３：内因性レトロウイルス抗原Ｇｐ７０及びＣＤ４０ＬをコードするＭＶＡウイルスの静脈内注射がＣＴ２６．ｗｔ腫瘍に及ぼす抗腫瘍作用
共刺激分子ＣＤ４０Ｌとともに、またはＣＤ４０Ｌのコードはなしに、マウス内因性レトロウイルス抗原（ＥＲＶ）タンパク質Ｇｐ７０（マウス白血病ウイルスのエンベロープタンパク質）をコードする組み換えＭＶＡを作製した。ＣＴ２６．ｗｔ大腸癌モデルを用いて、これらのコンストラクトの潜在的な抗腫瘍作用を評価した。ＣＴ２６．ｗｔ細胞は、高レベルのＧｐ７０を発現することが示されている（Ｓｃｒｉｍｉｅｒｉ（２０１３）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ．２：ｅ２６８８９を参照されたい）。

【0239】

腫瘍が少なくとも５×５ｍｍとなったら、ＣＴ２６．ｗｔ腫瘍担持マウスを静脈内免疫した。ＭＶＡ単独による処置では、腫瘍の緩やかな成長遅延が誘導されたが、ＧＰ７０をコードするＭＶＡによる処置では、５匹のうち３匹の腫瘍が完全に拒絶された（図２３Ａ及びＢ）。ＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌで処置した場合には、５匹のうち４匹の腫瘍の拒絶という、さらに顕著な結果が得られた（図２３Ａ及びＢ）。

【0240】

免疫後、抗腫瘍応答とＧｐ７０特異的Ｔ細胞の誘導が相関するか判断するために、Ｈ－２Ｋｄ拘束性ｇｐ７０エピトープＡＨ１を用いて、血液の再刺激を行った。その結果から、ＭＶＡ－Ｇｐ７０で処置したマウス及びＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌで処置したマウスにおいて、Ｇｐ７０特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答が強力に誘導されたことが示されている（図２３Ｃ）。

【0241】

実施例２４：内因性レトロウイルス抗原Ｇｐ７０及びＣＤ４０ＬをコードするＭＶＡウイルスの静脈内注射がＢ１６．Ｆ１０腫瘍に及ぼす抗腫瘍作用
Ｂ１６．Ｆ１０は、Ｃ５７ＢＬ／６に由来するメラノーマ細胞株である。ＣＴ２６．ｗｔ細胞と同様に、Ｂ１６．Ｆ１０細胞は、高レベルのＧｐ７０を発現する（Ｓｃｒｉｍｉｅｒｉ（２０１３）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ．２：ｅ２６８８９を参照されたい）。Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍担持マウスを作製し、そのマウスを用いて、ＣＤ４０Ｌとともに、またはＣＤ４０Ｌのコードなしに、ｇｐ７０をコードするＭＶＡ（それぞれ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－ｇｐ７０とした）の抗腫瘍作用をさらに評価した。

【0242】

ＭＶＡ単独（「ＭＶＡ－ＢＮ」）で処置したところ、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍の多少の成長遅延が見られ、その作用は、ＭＶＡ－Ｇｐ７０の作用（図２４Ａ）と同程度であったが、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌでは、さらに強い抗腫瘍作用が得られた。ＣＤ８ Ｔ細胞応答の評価により、ＣＤ４０Ｌをコードさせた場合に観察された、Ｔ細胞応答の増大は、有意ではなかった（図２４Ｂ）。

【0243】

本明細書に記載されている方法または組成物の正確な詳細は、記載されている発明の趣旨から逸脱せずに変更または修正してよいことは明らかであろう。我々は、後述の請求項の範囲及び趣旨の範囲内である上記のような修正形態または変更形態のすべてを特許請求する。

【0244】

配列表
付随の配列表に列挙されている核酸配列アミノ酸配列は、米国特許法施行規則１．８２２に定義されているように、ヌクレオチド塩基については標準的な略記、アミノ酸については、１文字表記または３文字表記のいずれかを用いて示されている。各核酸配列の１本の鎖のみが示されているが、示されている鎖に言及することによっていずれも、その相補鎖が含まれるものとして理解されたい。

【0245】

配列番号１
合成Ｈｅｒ２ｖ１アミノ酸配列（１，１４５アミノ酸）：

【化1】

【0246】

配列番号２
合成Ｈｅｒ２ｖ１ヌクレオチド配列（３４４１ヌクレオチド）：

【化2】

【0247】

配列番号３
合成Ｈｅｒ２ｖ２アミノ酸配列（１，１４５アミノ酸）：

【化3】

【0248】

配列番号４
合成Ｈｅｒ２ｖ２ヌクレオチド配列（３４４１ヌクレオチド）：

【化4】

【0249】

配列番号５
合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙアミノ酸配列（４２７アミノ酸ヌクレオチド）：

【化5】

【0250】

配列番号６
合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙヌクレオチド配列（１，２８７ヌクレオチド）：

【化6】

【0251】

配列番号７（４３５ａａ）
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号０１５１７８．１のＢｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質アイソフォーム１

【化7】

【0252】

配列番号８（１３０８ｎｔ）
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号０１５１７８．１のＢｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質アイソフォーム１のコード配列

【化8】

【0253】

配列番号９（４３５ａａ）
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質アイソフォーム１（Ｌ２５４Ｖ）

【化9】

【0254】

配列番号１０（１３０８ｎｔ）
Ｌ２５４Ｖを有するＢｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質アイソフォーム１をコードするコード配列

【化10】

【0255】

配列番号１１（４４９ａａ）
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－Ｉ３融合タンパク質

【化11】

【0256】

配列番号１２（１３５０ｎｔ）
配列番号９のＩ３ Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ融合タンパク質をコードするコード配列

【化12】

【0257】

配列番号１３
ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００００６５．１のｈＣＤ４０Ｌ（２６１アミノ酸）

【化13】

【0258】

配列番号１４
ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００００６５．１のｈＣＤ４０Ｌ（７８９ヌクレオチド）
ｎｔ配列：

【化14】

【0259】

配列番号１５
合成Ｔｗｉｓｔアミノ酸配列（２０５アミノ酸）：

【化15】

【0260】

配列番号１６
合成Ｔｗｉｓｔヌクレオチド配列（６１８ヌクレオチド）：

【化16】

【0261】

配列番号１７
合成マウスＣＤ４０Ｌアミノ酸配列（２６０アミノ酸）：

【化17】

【0262】

配列番号１８
合成マウスＣＤ４０Ｌヌクレオチド配列（７８６ヌクレオチド）：

【化18】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

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