特許 7555598 合成ペプチド免疫原のための免疫刺激薬としての人工無差別Ｔヘルパー細胞エピトープ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-13

(45)【発行日】2024-09-25

(54)【発明の名称】合成ペプチド免疫原のための免疫刺激薬としての人工無差別Ｔヘルパー細胞エピトープ

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20240917BHJP

   C07K 14/045 20060101ALI20240917BHJP

   C07K 14/05 20060101ALI20240917BHJP

   C07K 14/11 20060101ALI20240917BHJP

   C07K 14/28 20060101ALI20240917BHJP

   C07K 14/33 20060101ALI20240917BHJP

   C07K 14/445 20060101ALI20240917BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20240917BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20240917BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20240917BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20240917BHJP

   A61P 31/22 20060101ALI20240917BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20240917BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240917BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240917BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240917BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240917BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20240917BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240917BHJP

   A61K 39/135 20060101ALI20240917BHJP

   A61K 39/187 20060101ALI20240917BHJP

   A61K 39/245 20060101ALI20240917BHJP

   A61K 39/21 20060101ALI20240917BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20240917BHJP

   C07K 14/235 20060101ALI20240917BHJP

   C07K 14/155 20060101ALN20240917BHJP

   C07K 14/09 20060101ALN20240917BHJP

   C07K 14/035 20060101ALN20240917BHJP

   C07K 14/185 20060101ALN20240917BHJP

   C07K 14/08 20060101ALN20240917BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20240917BHJP

   C07K 14/54 20060101ALN20240917BHJP

   C07K 5/10 20060101ALN20240917BHJP

   C07K 5/08 20060101ALN20240917BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

C07K14/045 ZNA

C07K14/05

C07K14/11

C07K14/28

C07K14/33

C07K14/445

C07K14/435

C07K7/06

C07K7/08

C07K14/195

A61P31/22

A61P31/18

A61P31/14

A61P37/04

A61P35/00

A61P37/02

A61K39/39

A61K39/00 G

A61K39/00 H

A61K39/135

A61K39/187

A61K39/245

A61K39/21

A61K47/64

C07K14/235

C07K14/155

C07K14/09

C07K14/035

C07K14/185

C07K14/08

C07K14/47

C07K14/54

C07K5/10

C07K5/08

【請求項の数】 40

(21)【出願番号】P 2021535938

(86)(22)【出願日】2019-12-19

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-14

(86)【国際出願番号】 US2019067532

(87)【国際公開番号】W WO2020132275

(87)【国際公開日】2020-06-25

【審査請求日】2022-12-19

(31)【優先権主張番号】62/782,253

(32)【優先日】2018-12-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】591015142

【氏名又は名称】ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＴＥＤ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100094640

【弁理士】

【氏名又は名称】紺野 昭男

(74)【代理人】

【識別番号】100103447

【弁理士】

【氏名又は名称】井波 実

(74)【代理人】

【識別番号】100111730

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 武泰

(74)【代理人】

【識別番号】100180873

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 慶政

(72)【発明者】

【氏名】ワン、チャン イ

【審査官】阪▲崎▼ 裕美

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１７－２２６６４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００５－１１２８６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００２－５１８４６１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ

Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の式で表される、ペプチド免疫原構築物：
（Ａ）_ｎ－（標的抗原部位）－（Ｂ）_ｏ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－Ｘ
または
（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ｂ）_ｏ－（標的抗原部位）－（Ａ）_ｎ－Ｘ
または
（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ｂ）_ｏ－（標的抗原部位）－（Ｂ）_ｏ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－Ｘ
または
｛（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｐ－（Ｂ）_ｏ－（標的抗原部位）－（Ｂ）_ｏ－（Ｔｈ）_ｐ－（Ａ）_ｎ－Ｘ｝_ｍ
（式中、
各Ａは、独立して、アミノ酸であり、
各Ｂは、独立して、異種スペーサーであり、
各Ｔｈは、独立して、配列番号１～５２からなる群から選ばれる無差別人工Ｔｈエピトープであり、
前記標的抗原部位は、
（ａ）配列番号５６、５７、５８、５９、または６０のアミノ酸配列を有するＡβペプチド、
（ｂ）配列番号６１のアミノ酸配列を有するアルファ－シンペプチド、
（ｃ）配列番号６２のアミノ酸配列を有するＩｇＥ ＥＭＰＤペプチド、
（ｄ）配列番号６３、６９、７０、または７１のアミノ酸配列を有するＴａｕペプチド、
（ｅ）配列番号６４または７２のアミノ酸配列を有するＩＬ－３１ペプチド、及び
（ｆ）配列番号１４５のアミノ酸配列を有するＩＬ－６ペプチド
からなる群より選択されるＢ細胞エピトープであり、
Ｘは、アミノ酸、α－ＣＯＯＨ、またはα－ＣＯＮＨ_２であり、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、１、２、３、または４であり、
ｏは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｐは、１、２、３、または４である）。

【請求項2】

前記異種スペーサーが、アミノ酸、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号５３）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－εＮＬｙｓ（配列番号５４）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号５５）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される請求項１に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項3】

前記異種スペーサーが、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号５３）、及びＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－εＮＬｙｓ（配列番号５４）からなる群より選択される請求項１に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項4】

前記異種スペーサーがε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号５３）又はＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－εＮＬｙｓ（配列番号５４）である請求項１に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項5】

Ｔｈエピトープが配列番号６、７、１１～１７、１９～２８、３２～３８、４０及び４３～５２からなる群から選択される請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項6】

Ｔｈエピトープが配列番号３２～５２からなる群から選択される請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項7】

Ｔｈエピトープが配列番号３４及び３６～５２からなる群から選択される請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項8】

Ｔｈエピトープが配列番号３２～３８、４０及び４３～５２からなる群から選択される請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項9】

Ｔｈエピトープが配列番号３４、３６～３８、４０及び４３～５２からなる群から選択される請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項10】

Ｔｈエピトープが配列番号３４、３６、３８、４１、及び４２からなる群から選択される請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項11】

前記標的抗原部位が、
（ｂ）配列番号６１のアミノ酸配列を有するアルファ－シンペプチド、
（ｃ）配列番号６２のアミノ酸配列を有するＩｇＥ ＥＭＰＤペプチド、
（ｄ）配列番号６３、６９、７０、または７１のアミノ酸配列を有するＴａｕペプチド、
（ｅ）配列番号６４または７２のアミノ酸配列を有するＩＬ－３１ペプチド、及び
（ｆ）配列番号１４５のアミノ酸配列を有するＩＬ－６ペプチド
からなる群より選択される請求項１～１０のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項12】

前記標的抗原部位が、
（ｂ）配列番号６１のアミノ酸配列を有するアルファ－シンペプチド、
（ｃ）配列番号６２のアミノ酸配列を有するＩｇＥ ＥＭＰＤペプチド、及び
（ｆ）配列番号１４５のアミノ酸配列を有するＩＬ－６ペプチド
からなる群より選択される請求項１～１０のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項13】

前記標的抗原部位が（ｂ）配列番号６１のアミノ酸配列を有するアルファ－シンペプチドである請求項１～１０のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項14】

前記標的抗原部位が（ｂ）配列番号６１のアミノ酸配列を有するアルファ－シンペプチドであり、Ｔｈエピトープが配列番号１３、１６、１７、３３、３６、４１、及び４２からなる群から選択される請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項15】

配列番号１４９、１５１、１５９、１６１、１６７、１６９及び１７０からなる群から選択される配列を有する請求項１に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項16】

前記標的抗原部位が（ｃ）配列番号６２のアミノ酸配列を有するＩｇＥ ＥＭＰＤペプチドである請求項１～１０のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項17】

前記標的抗原部位が（ｃ）配列番号６２のアミノ酸配列を有するＩｇＥ ＥＭＰＤペプチドであり、Ｔｈエピトープが配列番号１３、１６、１７、２４、２８、３３、３６、３８、及び４１からなる群から選択される請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項18】

配列番号１７８、１７９、１８０、１８８、１９０、１９１、１９６、１９９、及び２０１からなる群から選択される配列を有する請求項１に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項19】

前記標的抗原部位が（ｆ）配列番号１４５のアミノ酸配列を有するＩＬ－６ペプチドである請求項１～１０のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項20】

前記標的抗原部位が（ｆ）配列番号１４５のアミノ酸配列を有するＩＬ－６ペプチドであり、Ｔｈエピトープが配列番号１６、１７、２８、３４、及び３８からなる群から選択される請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項21】

配列番号２０７、２０８、２０９、２２６、及び２３０からなる群から選択される配列を有する請求項１に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項22】

前記標的抗原部位が（ｅ）配列番号６４または７２のアミノ酸配列を有するＩＬ－３１ペプチドである請求項１～１０のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項23】

前記標的抗原部位が（ｅ）配列番号６４または７２のアミノ酸配列を有するＩＬ－３１ペプチドであり、Ｔｈエピトープが配列番号１６、１７、２８、３４、及び３８からなる群から選択される請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項24】

前記標的抗原部位が（ｄ）配列番号６３、６９、７０、または７１のアミノ酸配列を有するＴａｕペプチドである請求項１～１０のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項25】

前記標的抗原部位が（ｄ）配列番号６３、６９、７０、または７１のアミノ酸配列を有するＴａｕペプチドであり、Ｔｈエピトープが配列番号１６、１７、２８、３４、及び３８からなる群から選択される請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項26】

前記標的抗原部位が（ａ）配列番号５６、５７、５８、５９、または６０のアミノ酸配列を有するＡβペプチドであり、Ｔｈエピトープが配列番号３２～５２からなる群から選択される請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項27】

前記標的抗原部位が（ａ）配列番号５６、５７、５８、５９、または６０のアミノ酸配列を有するＡβペプチドであり、Ｔｈエピトープが配列番号１６、１７、２８、３４、及び３８からなる群から選択される請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物。

【請求項28】

請求項１～２７のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物を含む、医薬組成物。

【請求項29】

請求項１３～１５のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物、及び医薬上許容可能なアジュバント又は担体を含む医薬組成物。

【請求項30】

パーキンソン病を予防するか及び／又は処置する請求項２９に記載の医薬組成物。

【請求項31】

請求項１６～１８のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物、及び医薬上許容可能なアジュバント又は担体を含む医薬組成物。

【請求項32】

アレルギー疾患を予防するか及び／又は処置する請求項３１に記載の医薬組成物。

【請求項33】

請求項１９～２１のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物、及び医薬上許容可能なアジュバント又は担体を含む医薬組成物。

【請求項34】

自己免疫疾患を予防するか及び／又は処置する請求項３３に記載の医薬組成物。

【請求項35】

自己免疫疾患が関節リウマチである請求項３４に記載の医薬組成物。

【請求項36】

請求項２２又は２３に記載のペプチド免疫原構築物、及び医薬上許容可能なアジュバント又は担体を含む医薬組成物。

【請求項37】

アトピー性皮膚炎を予防するか及び／又は処置する請求項３６に記載の医薬組成物。

【請求項38】

請求項２４～２７のいずれか一項に記載のペプチド免疫原構築物、及び医薬上許容可能なアジュバント又は担体を含む医薬組成物。

【請求項39】

タウ異常症を予防するか及び／又は処置する請求項３８に記載の医薬組成物。

【請求項40】

タウ異常症がアルツハイマー病である請求項３９に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

本出願は、２０１８年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／７８２，２５３号の利益を主張するＰＣＴ国際出願であり、これは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

免疫応答は、抗原提示細胞及びＴヘルパー（Ｔｈ）細胞間の共同的相互作用を必要とする。有効な抗体応答の誘発は、抗原提示細胞が主題の免疫原の標的抗原性部位を認識すること、及び、Ｔヘルパー細胞がＴヘルパー細胞エピトープを認識することを必要とする。一般に、主題の免疫原上のＴヘルパーエピトープは、そのＢ細胞エピトープ（複数可）または関連エフェクターＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球またはＣＴＬ）エピトープ（複数可）とは異なる。Ｂ細胞及び関連エフェクターＴ細胞エピトープは、Ｂ細胞及び関連細胞によって認識される所望の標的免疫原上の部位であり、これにより、所望の標的部位に対する抗体またはサイトカインの産生がもたらされる。標的の自然なコンフォメーションにより、抗体または関連エフェクターＴ細胞が直接結合する部位が決定される。Ｔｈ細胞応答の誘発は、標的タンパク質のプロセシングされたペプチドフラグメント及び関連クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）間に形成される抗原提示細胞の膜上の複合体を認識するＴｈ細胞受容体を要求する。従って、標的タンパク質のペプチドプロセシング及び３方向認識が、Ｔｈ細胞応答のために要求される。１）重要なＭＨＣクラスＩＩ接触残基が様々なＭＨＣ結合ペプチド（Ｔｈエピトープ）内に可変的に配置されており、２）異なるＭＨＣ結合ペプチドが可変長及び異なるアミノ酸配列を有し、３）ＭＨＣクラスＩＩ分子が宿主の遺伝的構成に依存して非常に多様であり得るので、３つの部分の複合体を規定するのは困難である。特定のＴｈエピトープに対する免疫応答は、部分的には、宿主のＭＨＣ遺伝子によって決定され、Ｔｈエピトープの反応性は、集団の個体間で異なる。単一種内の種及び個体間で反応するＴｈエピトープ（すなわち、無差別Ｔｈエピトープ）は、同定が困難である。

【0003】

抗原プロセシング細胞による適切なペプチドプロセシング、遺伝的に決定されたクラスＩＩＭＨＣ分子によるペプチドの提示、ならびにＴｈ細胞上の受容体によるＭＨＣ分子及びペプチド複合体の認識などのＴ細胞認識の各成分ステップのために、複数の要因が要求される。幅広い応答性を提供するための無差別Ｔｈエピトープ認識の要件は、決定するのが困難であり得る。

【0004】

免疫応答に対する抗体及び関連サイトカインの誘導のために、免疫原が、Ｂ細胞エピトープ／エフェクターＴ細胞エピトープ及びＴｈ細胞決定基（複数可）の両方を含まなければならないことは明らかである。一般に、担体タンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン；ＫＬＨ）は、標的免疫原の免疫原性を増加させるために、標的免疫原に結合して、Ｔｈ応答を得る。しかし、標的免疫原の免疫原性を強化するために大きなキャリアタンパク質を使用することには、多くの欠点がある。特に、（ａ）化学結合がサイズ及び組成の不均一をもたらし得る反応、例えば、グルタルアルデヒドとのコンジュゲーションを含むので（Borras-Cuesta et al., Eur J Immunol, 1987; 17: 1213-1215）；（ｂ）担体タンパク質がアレルギー反応及び自己免疫反応などの望ましくない免疫応答の可能性をもたらし（Bixler et al., WO89/06974）；（ｃ）大きなペプチド担体タンパク質が標的部位ではなく担体タンパク質に主に誤った方向に向けられた無関係な免疫応答を誘発し（Cease et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1987; 84: 4249-4253）；（ｄ）担体タンパク質が以前に同じキャリアタンパク質を含む免疫原で免疫された宿主におけるエピトープ抑制の可能性も導入するので、明確な安全で効果的なペプチド－担体タンパク質複合体を製造することは困難である。続いて、宿主が同じ担体タンパク質が別のハプテンに結合している別の免疫原で免疫される時、得られた免疫応答は、担体タンパク質の場合に強化され、ハプテンの場合に抑制される（Schutze et al., J Immunol, 1985; 135: 2319-2322）。

【0005】

上記のリスクを回避するために、従来のキャリアタンパク質を使用せずにＴ細胞の援助を誘発することが望ましい。

【発明の概要】

【0006】

本開示は、予防的及び治療的使用のための標的抗原に対する機能的部位特異的抗体を刺激するための無差別人工Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープを提供する。本開示はまた、Ｔｈエピトープを含有するペプチド免疫原構築物、Ｔｈエピトープを含有する組成物、Ｔｈエピトープを製造及び使用する方法、ならびにＴｈエピトープを含有するペプチド免疫原構築物で作製された抗体に関する。

【0007】

開示された人工Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープは、ペプチド免疫原構築物を生成するために、任意のスペーサーを介してＢ細胞エピトープ（複数可）及び／またはエフェクターＴ細胞エピトープ（複数可）（「標的抗原部位（複数可）」）に結合することができる。開示されたＴｈエピトープは、標的抗原部位に対する高レベルの抗体及び／または細胞性応答の産生を伴う強力なＴヘルパー細胞媒介性免疫応答を誘導する能力をペプチド免疫原に与える。開示されたペプチド免疫原構築物は、ペプチド免疫原における大きな担体タンパク質及び病原体由来のＴヘルパー細胞部位の、標的抗原部位の免疫原性を改善するように特別に設計された開示の人工Ｔｈエピトープとの有利な置換を提供する。開示のＴｈエピトープを含有する比較的短いペプチド免疫原構築物は、Ｔｈエピトープに対する著しい炎症反応または免疫反応を引き起こすことなく、特定の標的抗原部位に対する高レベルの抗体及び／またはエフェクター細胞関連サイトカインを誘発する。

【0008】

ペプチド免疫原構築物により誘発される免疫応答（抗体力価、Ｃ_ｍａｘ、抗体産生の開始、応答期間などを含む）は、以下を変化させることによって調節することができる：（ａ）Ｂ細胞エピトープに化学結合しているＴｈエピトープの選択、（ｂ）Ｂ細胞エピトープの長さ、（ｃ）ペプチド免疫原構築物を含有する製剤に使用されるアジュバント、ならびに／または、（ｄ）免疫化あたり投薬量を含む投与計画ならびに各免疫化に対する初回免疫及び追加免疫の時点。それ故、標的抗原部位に対する特異的免疫応答は、開示されたＴｈエピトープを使用して設計することができ、これにより、任意の患者または対象の個々の特性に個別化医療を調整することが容易になり得る。

【0009】

本発明の開示された人工Ｔｈエピトープを含有するペプチド免疫原構築物は、以下の式によって表すことができる：
（Ａ）_ｎ－（標的抗原部位）－（Ｂ）_ｏ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－Ｘ
または
（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ｂ）_ｏ－（標的抗原部位）－（Ａ）_ｎ－Ｘ
または
（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ｂ）_ｏ－（標的抗原部位）－（Ｂ）_ｏ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－Ｘ
または
｛（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｐ－（Ｂ）_ｏ－（標的抗原部位）－（Ｂ）_ｏ－（Ｔｈ）_ｐ－（Ａ）_ｎ－Ｘ｝_ｍ
（式中、
各Ａは、独立して、アミノ酸であり、
各Ｂは、独立して、異種スペーサーであり、
各Ｔｈは、独立して、人工Ｔｈエピトープであり、
標的抗原部位は、Ｂ細胞エピトープ、ＣＴＬエピトープ、ペプチドハプテン、非ペプチドハプテン、またはそれらの免疫学的な反応性アナログであり、
Ｘは、アミノ酸、α－ＣＯＯＨ、またはα－ＣＯＮＨ_２であり、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、１、２、３、または４であり、
ｏは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｐは、０、１、２、３、または４である）。

【0010】

標的抗原部位としてのペプチドハプテンの例は、ベータアミロイド（Ａβ）タンパク質（Ａβ_１－１４）（配列番号５６）のアミノ酸１～１４である。非ペプチドハプテンの例としては、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）または小分子薬物が含まれる。

【0011】

本開示はまた、人工Ｔｈエピトープを含有するペプチド免疫原構築物を含む組成物に関する。そのような組成物は、所望の標的抗原部位に対する免疫化宿主の抗体応答を誘発することができる。標的抗原部位は、病原性生物、通常免疫サイレントである自己抗原、または腫瘍関連標的に由来してもよい。

【0012】

開示の組成物は、感染症からの保護免疫を提供するワクチン、正常な生理学的プロセスの機能不全に起因する障害の処置のための免疫療法、がんの処置のための免疫療法、望ましくは、正常な生理学的プロセスに介入及び改変する薬剤を含む、多くの多様な医学及び獣医学的用途において有用である。

【0013】

本発明のＴｈエピトープに共有結合し得る標的抗原の一部には、数例として、アルツハイマー病の処置用のベータ－アミロイド（Ａβ）、パーキンソン病の処置用のアルファ－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ）、アレルギー性疾患の処置用の膜結合ＩｇＥの外膜近位ドメイン（またはＩｇＥ ＥＭＰＤ）、アルツハイマー病を含むタウオパチーの処置用のＴａｕ、及びアトピー性皮膚炎の処置用のインターロイキン３１（ＩＬ－３１）の部分が含まれる。より具体的には、標的抗原には、Ａβ_１－１４（米国特許第９，１０２，７５２号に記載）、α－Ｓｙｎ_{１１１－１３２}（国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３７９３８号に記載）、ＩｇＥ ＥＭＰＤ_１－３９（国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６９１７４号に記載）、Ｔａｕ_{３７９－４０８}（国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５７８４０号に記載）、及びＩＬ－３１_{９７－１４４}（国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６５０２５号に記載）、ならびに、表３Ａ及び表３Ｂに記載の標的抗原部位が含まれる。

【0014】

本開示はまた、ペプチド免疫原構築物（開示の人工Ｔｈエピトープ及び抗原提示エピトープを含む）を、それを必要とする対象に投与することにより、対象の疾患または状態を予防及び／または処置するための方法を提供する。一部の実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、実施例１２に示されるように、陽性対照の免疫原性炎症性応答よりも少なくとも約３倍低い免疫原性炎症性応答を対象に生じさせる。

【0015】

本開示はまた、開示の人工Ｔｈエピトープを含有するペプチド免疫原構築物により産生される抗体に関する。ペプチド免疫原構築物により産生される抗体は、人工Ｔｈエピトープに対してではなく、標的抗原部位に高度に特異的である。

【0016】

参考文献：
本出願において引用された各特許、刊行物、及び非特許文献は、あたかもそれぞれが個別に参照により組み込まれたかのように、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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31. WANGによる国際PCT出願PCT/US2018/065025, “Peptide Immunogens of IL-31 and Formulations Thereof for the Treatment and/or Prevention of Atopic Dermatitis” (filed 2018-12-11).

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】本明細書に記載のＴヘルパー細胞エピトーププラットフォームの例示的な製剤及び特徴を示す概略図。Ａは、ＵＢＩＴｈ（登録商標）を含む、Ｔｈエピトープ担体を含有するペプチド免疫原を有する製剤に含まれ得る構成要素を要約した概略図である。Ｂは、ＵＢＩＴｈ（登録商標）を含む、本明細書に記載のＴヘルパー細胞エピトーププラットフォームのいくつかの特徴及び技術的利点をまとめる。

【図2】本明細書に記載のＴヘルパー細胞エピトーププラットフォームを使用して得ることができる理論上の結果を示すグラフ。

【図3】アルファシヌクレイン（上部パネル）及びＩｇＥ ＥＭＰＤ（下部パネル）に由来する短い非免疫原性Ｂエピトープペプチドを含む、選択された個々のＴｈエピトープペプチドによるペプチド免疫原構築物の免疫原性の強化。アルファシヌクレイン（上部パネル）の棒グラフの下の数字は、表５に記載のペプチド免疫原構築物に対応し、ＩｇＥ ＥＭＰＤ（下部パネル）の棒グラフの下の数字は、表６に記載のペプチド免疫原構築物に対応する。

【図4A】表８に示される個々のＴｈエピトープに共有結合しているα－Ｓｙｎ（Ｇ１１１－Ｇ１３２）、ＩｇＥ－ＥＭＰＤ（Ｇ１－Ｃ３９）、及びＩＬ－６（Ｃ７３－Ｃ８３）を含有する別々の３つのペプチド免疫原構築物の混合物でモルモットを免疫した後に得られたＥＬＩＳＡによる抗α－シヌクレイン抗体力価を示すグラフである。これらのグラフで評価された特定のα－シヌクレインペプチド免疫原構築物が表５にまとめられる。図４Ａは、評価されたペプチド免疫原構築物の全てに対する抗体力価データを含有する。

【図4B】表８に示される個々のＴｈエピトープに共有結合しているα－Ｓｙｎ（Ｇ１１１－Ｇ１３２）、ＩｇＥ－ＥＭＰＤ（Ｇ１－Ｃ３９）、及びＩＬ－６（Ｃ７３－Ｃ８３）を含有する別々の３つのペプチド免疫原構築物の混合物でモルモットを免疫した後に得られたＥＬＩＳＡによる抗α－シヌクレイン抗体力価を示すグラフである。これらのグラフで評価された特定のα－シヌクレインペプチド免疫原構築物が表５にまとめられる。図４Ｂは、ペプチド免疫原構築物が異なる速度で同様のＣ_ｍａｘ値に達することができることを強調するために、図４Ａに示されるデータのサブセットを含有する。

【図5】表８に示される個々のＴｈエピトープに共有結合しているα－Ｓｙｎ（Ｇ１１１－Ｇ１３２）、ＩｇＥ－ＥＭＰＤ（Ｇ１－Ｃ３９）、及びＩＬ－６（Ｃ７３－Ｃ８３）を含有する別々の３つのペプチド免疫原構築物の混合物でモルモットを免疫した後に得られたＥＬＩＳＡによる抗ＩｇＥ ＥＭＰＤ抗体力価を示すグラフ。これらのグラフで評価された特定のＩｇＥ ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、表６にまとめられる。

【図6】表８に示される個々のＴｈエピトープに共有結合しているα－Ｓｙｎ（Ｇ１１１－Ｇ１３２）、ＩｇＥ－ＥＭＰＤ（Ｇ１－Ｃ３９）、及びＩＬ－６（Ｃ７３－Ｃ８３）を含有する別々の３つのペプチド免疫原構築物の混合物でモルモットを免疫した後に得られたＥＬＩＳＡによる抗ＩＬ－６抗体力価を示すグラフ。これらのグラフで評価された特定のＩＬ－６ペプチド免疫原構築物は、表７にまとめられる。

【図7】表９に示されるペプチド免疫原構築物でモルモットを免疫した後に得られたＥＬＩＳＡによる抗ＤＰＲ（ジペプチドリピート）抗体力価を示すグラフ。

【図8】２つのペプチド免疫原Ａβ_１－１４－εＫ－ＫＫＫ－ＭｖＦ５ Ｔｈ（配列番号６７）及びＡβ_１－１４－εＫ－ＨＢｓＡｇ３ Ｔｈ（配列番号６８）を含有する異なる量のＡβワクチン（ＵＢ－３１１）でモルモットを免疫した後に得られたＥＬＩＳＡによる抗Ａβ_１－２８力価を示すグラフ。

【図9】２つのペプチド免疫原Ａβ_１－１４－εＫ－ＫＫＫ－ＭｖＦ５ Ｔｈ（配列番号６７）及びＡβ_１－１４－εＫ－ＨＢｓＡｇ３ Ｔｈ（配列番号６８）を含有するＡβワクチン（ＵＢ－３１１）の異なる初回免疫投薬量及び追加免疫投薬量でモルモットを免疫した後に得られたＥＬＩＳＡによる抗Ａβ_１－２８力価を示すグラフ。

【図10】３ヶ月の追加免疫療法（上部パネル）中にＡβワクチン（ＵＢ－３１１）で、または６ヶ月の追加免疫療法（下部パネル）中にヒト対象をＡβワクチン（ＵＢ－３１１）で免疫した後に得られたＥＬＩＳＡによる抗Ａβ_１－２８抗体力価を示すグラフ。各グラフのボックス部分は、研究の全てのヒト対象の平均力価を強調する。

【図11】ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５０Ｖをアジュバントとして使用した、異なる量の、表１０に示されるＬＨＲＨペプチド免疫原構築物（配列番号２３９～２４１）の混合物でブタを免疫した後に得られた抗ＬＨＲＨ抗体力価及びテストステロン濃度を示すグラフ。図１１Ａは、１００μｇ量のＬＨＲＨ製剤でラットを免疫した後に得られた抗体力価及びテストステロン濃度を示す。図１１Ｂは、３００μｇ量のＬＨＲＨ製剤でラットを免疫した後に得られた抗体力価及びテストステロン濃度を示す。

【図12】異なるアジュバント（すなわち、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１またはＡＤＪＵＰＨＯＳ）を含有する製剤中の配列番号２４３の異なる量のＩＬ－６ペプチド免疫原構築物またはプラセボ対照でラットを免疫した後に得られたＥＬＩＳＡによる抗ＩＬ－６抗体力価を示すグラフ。

【図13】異なる量の配列番号１７８のＩｇＥ－ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物でマカクを免疫した後に得られた抗ＩｇＥ－ＥＭＰＤ抗体力価を示すグラフ。図１３Ａは、ＣｐＧ３を使用して安定化免疫刺激複合体として製剤化された、アジュバントとしてＡＤＪＵＰＨＯＳを使用して得られた抗体力価を示す。図１３Ｂは、ＣｐＧ３を使用して安定化免疫刺激複合体として製剤化された、アジュバントとしてＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１を使用して得られた抗体力価を示す。

【図14】異なるアジュバントを使用して表１０に示されるＬＨＲＨペプチド免疫原構築物（配列番号２３９～２４１）の混合物の異なる量でブタを免疫した後に得られた抗ＬＨＲＨ抗体力価及びテストステロン濃度を示すグラフ。図１４Ａは、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ Ｄをアジュバントとして使用して得られた抗体力価を示す。図１４Ｂは、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５０Ｖをアジュバントとして使用して得られた抗体力価を示す。

【図15】正常ドナーのナイーブ末梢血単核細胞における無差別及び人工Ｔｈペプチド応答性Ｔ細胞の検出。

【図16】腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）：ＧＤ３、ＧＤ２、Ｇｌｏｂｏ－Ｈ、ＧＭ２、フルコシルＧＭ１、ＰＳＡ、Ｌｅ^ｙ、Ｌｅ^ｘ、ＳＬｅ^ｘ、ＳＬｅ^ａ、及びＳＴｎの構造。

【図17】グリカン結合ＵＢＩＴｈ（登録商標）ペプチドの固相ペプチド合成スキームによる例示的な段階的合成。

【図18】グリカン結合ＵＢＩＴｈ（登録商標）ペプチドの固相ペプチド合成スキームによる例示的な段階的合成。

【図19】グリカン結合ＵＢＩＴｈ（登録商標）ペプチドの固相ペプチド合成スキームによる例示的な段階的合成。

【図20】グリカン結合ＵＢＩＴｈ（登録商標）ペプチドの固相ペプチド合成スキームによる例示的な段階的合成。

【図21】グリカン結合ＵＢＩＴｈ（登録商標）ペプチドの固相ペプチド合成スキームによる例示的な段階的合成。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本開示は、予防的及び治療的使用のための標的抗原に対する機能的部位特異的抗体を刺激するための無差別人工Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープを提供する。本開示はまた、Ｔｈエピトープを含有するペプチド免疫原構築物、Ｔｈエピトープを含有する組成物、Ｔｈエピトープを製造及び使用する方法、ならびにＴｈエピトープを含有するペプチド免疫原構築物により作製された抗体に関する。

【0019】

開示の人工Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープは、ペプチド免疫原構築物を生成するために、任意のスペーサーを介してＢ細胞エピトープ及び／またはエフェクターＴ細胞エピトープ（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞；ＣＴＬ）（「標的抗原部位（複数可）」）に結合させることができる。開示のＴｈエピトープは、治療効果のための標的抗原部位に対する高レベルの抗体及び／または細胞性応答（例えば、サイトカイン）の産生を伴う強力なＴヘルパー細胞媒介性免疫応答を誘導する能力をペプチド免疫原に与える。開示されたペプチド免疫原構築物は、ペプチド免疫原における大きな担体タンパク質及び病原体由来のＴヘルパー細胞部位の、標的抗原部位の免疫原性を改善するように特別に設計された開示の人工Ｔｈエピトープとの有利な置換を提供する。開示のＴｈエピトープを含有する比較的短いペプチド免疫原構築物は、Ｔｈエピトープに対する著しい炎症反応または免疫反応を引き起こすことなく、特定の標的抗原部位に対する高レベルの抗体及び／またはエフェクター細胞関連サイトカインを誘発する。

【0020】

ペプチド免疫原構築物により誘発される免疫応答（抗体力価、Ｃ_ｍａｘ、抗体産生の開始、応答期間などを含む）は、以下を変化させることによって調節することができる：（ａ）Ｂ細胞エピトープに化学結合しているＴｈエピトープの選択、（ｂ）Ｂ細胞エピトープの長さ、（ｃ）ペプチド免疫原構築物を含有する製剤に使用されるアジュバント、ならびに／または、（ｄ）免疫化あたり投薬量を含む投与計画ならびに各免疫化に対する初回免疫及び追加免疫の時点。それ故、標的抗原部位に対する特異的免疫応答は、開示されたＴｈエピトープを使用して設計することができ、これにより、任意の患者または対象の個々の特性に個別化医療を調整することが容易になり得る。

【0021】

人工Ｔｈエピトープを含有する開示のペプチド免疫原構築物は、免疫化された宿主において、所望の標的抗原部位に対する抗体及び／またはサイトカイン応答を誘発することができる。標的抗原部位は、特定のタンパク質、がん抗原関連炭水化物、小分子薬物化合物、または任意の標的ペプチドもしくはタンパク質に由来する任意のアミノ酸配列であり得る。一部の実施形態では、本開示は、アミロイドβ（Ａβ）、口蹄疫（ＦＭＤ）カプシドタンパク質、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）由来の糖タンパク質、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、及び他の任意のペプチドまたはタンパク質配列に標的化された抗体を誘発するペプチド免疫原を提供するために使用することができる無差別人工Ｔｈエピトープについて記載する。

【0022】

特定の実施形態では、標的抗原部位は、通常は免疫サイレントである自己抗原または腫瘍関連新抗原標的（例えば、Ａβ、Ｔａｕ、アルファシヌクレイン、ジペプチドタンパク質、ＩｇＥ ＥＭＰＤ、ＩＬ－６、ＣＧＲＰ、アミリン、ＩＬ－３１、新抗原など）から取得される。自己抗原及び腫瘍関連新抗原部位の非限定的で代表的な配列が表３Ａに示される。他の実施形態では、標的抗原部位は、病原性生物（例えば、ＦＭＤＶ、ＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶ、ＨＩＶ、ＨＳＶなど）から取得される。病原性抗原部位の非限定的で代表的な配列が表３Ｂに示される。

【0023】

本発明のペプチドまたは標的抗原部位は、医学及び獣医学用途に有用であり得る。例えば、開示の人工Ｔｈエピトープを含有するペプチド免疫原構築物は、感染症もしくは神経変性疾患に対する防御免疫を提供するワクチン組成物、または正常な生理学的プロセスの機能不全から生じた障害を処置する医薬組成物、がん、２型糖尿病を処置するための免疫療法において、または正常な生理学的プロセスに介入する薬剤として使用することができる。

【0024】

一般
本明細書で使用されるセクションの見出しは、単に構成上の目的のためのものであり、記載の主題を制限するものとして解釈されるべきではない。本出願で引用される全ての参考文献または参考文献の一部は、いかなる目的においても、全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0025】

別途説明のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈が別途明確に示さない限り、複数の指示対象が含まれる。同様に、「または」という語は、文脈が別途明示しない限り、「及び」が含まれることが意図される。従って、「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、もしくはＢ、またはＡ及びＢを含むことを意味する。ポリペプチドについて与えられた全てのアミノ酸サイズ、及び全ての分子量または分子質量の値は概算であり、説明のために提供されることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法及び材料が開示の方法の実践または試験に使用することができるが、好適な方法及び材料は、以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合は、用語の説明を含む本明細書が優先されることになる。加えて、材料、方法、及び例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。

【0026】

ペプチド免疫原構築物
本明細書で使用される「ペプチド免疫原」または「ペプチド免疫原構築物」という用語は、単一のより大きなペプチドを形成するために、共有結合（例えば、従来のペプチド結合またはチオエステル）を通して、異種スペーサーを含んでまたは含まずに、標的抗原部位に共有結合している人工Ｔｈエピトープを含む分子を指す。通常、ペプチド免疫原構築物は、（ａ）異種無差別人工Ｔｈエピトープ；（ｂ）Ｂ細胞エピトープまたはエフェクターＴ細胞エピトープ（例えば、ＣＴＬ）などの標的抗原部位；及び、（ｃ）任意の異種スペーサー、を含有する。

【0027】

ペプチド免疫原に無差別人工Ｔｈエピトープが存在すると、ペプチド免疫原で免疫化した後の動物の標的抗原部位に対する強いＴｈ細胞媒介免疫応答及び高レベルの抗体が誘導され得る。開示されたペプチド免疫原構築物は、ペプチド免疫原における大きな担体タンパク質及び病原体由来のＴヘルパー細胞部位の、標的抗原部位の免疫原性を改善するように特別に設計された開示の人工Ｔｈエピトープとの有利な置換を提供する。開示のＴｈエピトープを含有する比較的短いペプチド免疫原構築物は、Ｔｈエピトープに対する著しい炎症反応または免疫反応を引き起こすことなく、特定の標的抗原部位に対する高レベルの抗体及び／またはエフェクター細胞関連サイトカインを誘発する。

【0028】

本発明の開示された人工Ｔｈエピトープを含有するペプチド免疫原構築物は、以下の式によって表すことができる：
（Ａ）_ｎ－（標的抗原部位）－（Ｂ）_ｏ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－Ｘ
または
（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ｂ）_ｏ－（標的抗原部位）－（Ａ）_ｎ－Ｘ
または
（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ｂ）_ｏ－（標的抗原部位）－（Ｂ）_ｏ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－Ｘ
または
｛（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｐ－（Ｂ）_ｏ－（標的抗原部位）－（Ｂ）_ｏ－（Ｔｈ）_ｐ－（Ａ）_ｎ－Ｘ｝_ｍ
（式中、
各Ａは、独立して、アミノ酸であり、
各Ｂは、独立して、異種スペーサーであり、
各Ｔｈは、独立して、人工Ｔｈエピトープであり、
標的抗原部位は、Ｂ細胞エピトープ、ＣＴＬエピトープ、ペプチドハプテン、非ペプチドハプテン、またはそれらの免疫学的な反応性アナログであり、
Ｘは、アミノ酸、α－ＣＯＯＨ、またはα－ＣＯＮＨ_２であり、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、１、２、３、または４であり、
ｏは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｐは、０、１、２、３、または４である）。

【0029】

本開示のペプチド免疫原は、約２０～約１００のアミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００のアミノ酸残基を含有する。

【0030】

開示のＩＬ－３１ペプチド免疫原構築物の様々な構成要素が以下に記載される。

【0031】

Ａ－アミノ酸
本開示の免疫原性ペプチドにおける各Ａは、独立して、異種アミノ酸である。

【0032】

本明細書で使用される「異種」という用語は、標的抗原部位（例えば、Ｂ細胞エピトープ）の野生型アミノ酸配列の一部でないか、またはそれと相同でないアミノ酸配列を指す。従って、Ａの異種アミノ酸配列は、標的抗原部位のタンパク質またはペプチドに天然には見られないアミノ酸配列を含有する。構成要素Ａの配列が標的抗原部位に対して異種であるので、標的抗原部位の天然のアミノ酸配列は、構成要素Ａが標的抗原部位に共有結合している場合、Ｎ末端またはＣ末端方向のいずれにも延長されない。

【0033】

一部の実施形態では、各Ａは、独立して、非天然または天然アミノ酸である。

【0034】

天然アミノ酸には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンが含まれる。

【0035】

非天然アミノ酸には、ε－Ｎリジン、β－アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ－アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、アミノ安息香酸、６－アミノカプロン酸（Ａｃａ；６－アミノヘキサン酸）、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、３－ニトロチロシン、ピログルタミン酸などが含まれるが、これらに限定されない。

【0036】

一部の実施形態では、ｎは、０であり、アミノ酸が式中のその位置に付加されないことを示す。他の実施形態では、ｎは、１であり、任意の天然または非天然アミノ酸から選択される。特定の実施形態では、ｎは、１より大きく、各Ａは、独立して、同じアミノ酸である。他の実施形態では、ｎは、１より大きく、各Ａは、独立して、異なるアミノ酸である。

【0037】

Ｂ－任意の異種スペーサー
本開示の免疫原性ペプチドにおける各Ｂは、任意の異種スペーサーである。構成要素Ｂの任意の異種スペーサーは、独立して、アミノ酸、－ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＯ－、－ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＯ（εＮ）Ｌｙｓ－、－ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２Ｓ－スクシンイミジル（εＮ）Ｌｙｓ－、－ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２Ｓ－（スクシンイミジル）－、及び／またはそれらの任意の組み合わせである。スペーサーは、構成要素Ａについて上に記載される１つ以上の天然または非天然アミノ酸残基を含有し得る。

【0038】

上述のように、「異種」という用語は、標的抗原部位（例えば、Ｂ細胞エピトープ）の野生型アミノ酸配列の一部でないか、またはそれと相同でないアミノ酸を指す。従って、スペーサーがアミノ酸である場合、スペーサーは、標的抗原部位のタンパク質またはペプチドに天然には見られないアミノ酸配列を含有する。構成要素Ｂの配列が標的抗原部位に対して異種であるので、標的抗原部位の天然のアミノ酸配列は、構成要素Ｂが標的抗原部位に共有結合している場合、Ｎ末端またはＣ末端方向のいずれにも延長されない。

【0039】

スペーサーは、Ｔｈエピトープと標的抗原部位の分離を強化する柔軟なヒンジスペーサーであり得る。一部の実施形態では、柔軟なヒンジ配列は、プロリンリッチであり得る。特定の実施形態では、柔軟なヒンジは、配列Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号５５）を有し、これは、免疫グロブリン重鎖に見られる柔軟なヒンジ領域からモデル化される。式中、Ｘａａは、任意のアミノ酸であり得る。一部の実施形態では、Ｘａａは、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、スペーサーによって提供されたコンフォメーションの間隔は、提示されたペプチド免疫原と適切なＴｈ細胞及びＢ細胞の間のより効率的な相互作用を可能し得る。Ｔｈエピトープに対する免疫応答は、免疫反応性を改善するために強化することができる。

【0040】

ｏ＞１である場合、各Ｂは、独立して、同じかまたは異なる。一部の実施形態では、Ｂは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号５５）、εＮＬｙｓ、εＮＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号５３）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－εＮＬｙｓ（配列番号５４）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ、－ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＯ－、－ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＯ（εＮＬｙｓ）－、－ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２Ｓ－スクシンイミジル－εＮＬｙｓ－、もしくは－ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２Ｓ－（スクシンイミジル）－、及び／またはそれらの任意の組み合わせである。例示的な異種スペーサーが表２に示される。

【0041】

標的抗原部位
標的抗原部位には、外来もしくは自己ペプチドもしくはタンパク質、Ｂ細胞エピトープ、ＣＴＬエピトープ、ペプチドハプテン、非ペプチドハプテン、またはそれらの免疫学的な反応性アナログを含む任意の標的ペプチドまたはタンパク質由来の任意のアミノ酸配列が含まれ得る。標的抗原部位は、特定のタンパク質、がん抗原関連炭水化物、小分子薬物化合物、または任意の標的ペプチドもしくはタンパク質に由来する任意のアミノ酸配列であり得る。一部の実施形態では、本開示は、アミロイドβ（Ａβ）、口蹄疫（ＦＭＤ）カプシドタンパク質、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）由来の糖タンパク質、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、及び他の任意のペプチドまたはタンパク質配列に標的化された抗体を誘発するペプチド免疫原を提供するために使用することができる無差別人工Ｔｈエピトープについて記載する。

【0042】

特定の実施形態では、標的抗原部位は、通常は免疫サイレントである自己抗原または腫瘍関連新抗原標的（例えば、Ａβ、Ｔａｕ、アルファシヌクレイン、ジペプチドタンパク質、ＩｇＥ ＥＭＰＤ、ＩＬ－６、ＣＧＲＰ、アミリン、ＩＬ－３１、新抗原など）から取得される。自己抗原及び腫瘍関連新抗原部位の非限定的で代表的な配列が表３Ａに示される。他の実施形態では、標的抗原部位は、病原性生物（例えば、ＦＭＤＶ、ＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶ、ＨＩＶ、ＨＳＶなど）から取得される。病原性抗原部位の非限定的で代表的な配列が表３Ｂに示される。

【0043】

特定の実施形態では、標的抗原部位は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）（例えば、米国特許第６，０２５，４６８号、同第６，２２８，９８７号、同第６，５５９，２８２号、及び米国特許公報第ＵＳ２０１７／０２１６４１８号）；アミロイドβ（Ａβ）（例えば、米国特許第６，９０６，１６９号、同第７，９５１，９０９号、同第８，２３２，３７３号、及び同第９，１０２，７５２号）；口蹄疫カプシドタンパク質（例えば、米国特許第６，０４８，５３８号、同第６，１０７，０２１号、及び米国特許公報第２０１５／０３０６２０３号）；ＨＩＶ感染の予防及び処置のためのＨＩＶビリオンエピトープ（例えば、米国特許第５，９１２，１７６号、同第５，９６１，９７６号、及び同第６，０９０，３８８号）；ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）由来のカプシドタンパク質（例えば、米国特許公報第２０１３／０２３６４８７号）、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）由来の糖タンパク質（例えば、米国特許公報第２０１４／０３３５１１８号）、ＩｇＥ（例えば、米国特許第７，６４８，７０１号及び同第６，８１１，７８２号）、アルファ－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ）（国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３７９３８号）、膜結合型ＩｇＥの細胞外膜近接ドメイン（またはＩｇＥ ＥＭＰＤ）（国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６９１７４号）、Ｔａｕ（国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５７８４０号）、及びインターロイキン－３１（ＩＬ－３１）（国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６５０２５号）、マラリアの予防用のプラスモディウムのＣＳ抗原；動脈硬化の予防及び処置用のＣＥＴＰ；２型糖尿病の予防及び処置用のＩＡＰＰ（Ａｍｙｌｉｎ）、ならびに他の任意のペプチドまたはタンパク質配列の一部に由来する。全ての特許及び特許刊行物は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0044】

他の実施形態では、標的抗原部位は、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）及び小分子薬物化合物を含む非ペプチドハプテンである。ＴＡＣＡＳの例としては、さらに実施例１１ならびに図１６及び１７に考察されるようなＧＤ３、ＧＤ２、Ｇｌｏｂｏ－Ｈ、ＧＭ２、フコシルＧＭ１、ＧＭ２、ＰＳＡ、Ｌｅ^ｙ、Ｌｅ^ｘ、ＳＬｅ^ｘ、ＳＬｅ^ａ、Ｔｎ、ＴＦ、及びＳＴｎが挙げられる。

【0045】

Ｔｈ－Ｔヘルパーエピトープ
ペプチド免疫原構築物中の無差別人工Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープは、標的抗原部位の免疫原性を強化し、これにより、合理的な設計で最適化された標的Ｂ細胞エピトープに対する特定の高力価抗体の産生が促進される。

【0046】

本明細書で使用される「無差別」という用語は、種間及び単一種の個体間で反応性であるＴｈエピトープを指す。

【0047】

Ｔｈエピトープと関連して使用される「人工」という用語は、自然界には見られないアミノ酸配列を指す。従って、本開示の人工Ｔｈエピトープは、標的抗原部位に対する異種配列を有する。上述のように、「異種」という用語は、標的抗原部位の野生型配列の一部ではない、またはそれと相同でないアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を指す。従って、異種Ｔｈエピトープは、標的抗原部位に天然には見られないアミノ酸配列に由来するＴｈエピトープである。Ｔｈエピトープが標的抗原部位に対して異種であるので、標的抗原部位の天然のアミノ酸配列は、異種Ｔｈエピトープが標的抗原部位に共有結合している場合、Ｎ末端またはＣ末端方向のいずれにも延長されない。

【0048】

Ｔｈエピトープは、任意の種（例えば、ヒト、ブタ、ウシ、イヌ、ラット、マウス、モルモットなど）に由来するアミノ酸配列を有し得る。Ｔｈエピトープは、複数の種のＭＨＣクラスＩＩ分子への無差別結合モチーフも有し得る。特定の実施形態では、Ｔｈエピトープは、免疫応答の開始及び調節につながるＴヘルパー細胞の最大活性化を可能にする複数の無差別ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフを含む。Ｔｈエピトープは、好ましくは、それ自体が免疫サイレントであり、すなわち、ペプチド免疫原構築物により生成された抗体は、たとえあったとしても、Ｔｈエピトープにほとんど向けられず、それにより、標的抗原部位に向けられた非常に集中的な免疫応答を可能にする。

【0049】

エピトープは、サイズが約１５～約５０アミノ酸残基の範囲に及び得る。一部の実施形態では、Ｔｈエピトープは、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０のアミノ酸残基を有し得る。エピトープは、共通の構造的特徴及び特定のランドマーク配列を共有し得る。一部の実施形態では、Ｔｈエピトープは、両親媒性ヘリックス、すなわち、周囲の面を占めるヘリックス荷電極性残基の一面を占める疎水性アミノ酸残基を有するアルファ－ヘリックス構造を有する。

【0050】

ＷＯ１９９９／０６６９５７のＴｈエピトープ及び開示、ならびに対応する米国特許第６，７１３，３０１号は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0051】

無差別Ｔｈ決定基は、免疫原性の低いペプチドを増強するのに効果的であり得る。うまく設計された無差別Ｔｈ／Ｂ細胞エピトープキメラペプチドは、遺伝的に多様な集団のほとんどのメンバーのＢ細胞部位を標的とした抗体応答を伴うＴｈ応答を誘発することができる。一部の実施形態では、Ｔｈ細胞は、十分に特性決定された無差別Ｔｈ決定基にペプチド担体を共有結合させることにより、標的抗原ペプチドに供給することができる。

【0052】

無差別Ｔｈエピトープは、追加の１次アミノ酸パターンを含有し得る。一部の実施形態では、無差別Ｔｈエピトープは、Ｒｏｔｈｂａｒｄ配列を含有し得、無差別Ｔｈエピトープは、荷電残基（例えば、－Ｇｌｙ－）、続いて、２～３つの疎水性残基、続いて、荷電または極性残基（Ｒｏｔｈｂａｒｄ ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ，ＥＭＢＯ Ｊ，１９８８；７：９３－１０１）を含有する。無差別Ｔｈエピトープは、１、４、５、８規則に従い得、正荷電残基に４、５、及び８位の疎水性残基が続き、同じ面に位置する１、４、５、及び８位を有する両親媒性ヘリックスと一致する。一部の実施形態では、疎水性及び荷電及び極性アミノ酸の１、４、５、８パターンは、単一のＴｈエピトープ内で繰り返すことができる。一部の実施形態では、無差別Ｔ細胞エピトープは、Ｒｏｔｈｂａｒｄ配列または１、４、５、８規則に従うエピトープのうちの少なくとも１つを含有し得る。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、複数のＲｏｔｈｂａｒｄ配列を含有する。

【0053】

病原体に由来する無差別Ｔｈエピトープには、Ｂ型肝炎表面Ｔｈ細胞エピトープ（ＨＢｓＡｇ Ｔｈ）、Ｂ型肝炎コア抗原Ｔｈ細胞エピトープ（ＨＢｃ Ｔｈ）、百日咳毒素Ｔｈ細胞エピトープ（ＰＴ Ｔｈ）、破傷風毒素Ｔｈ細胞エピトープ（ＴＴ Ｔｈ）、麻疹ウイルスＦタンパク質Ｔｈ細胞エピトープ（ＭＶＦ Ｔｈ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ主要外膜タンパク質Ｔｈ細胞エピトープ（ＣＴ Ｔｈ）、ジフテリア毒素Ｔｈ細胞エピトープ（ＤＴ Ｔｈ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ スポロゾイト周囲Ｔｈ細胞エピトープ（ＰＦ Ｔｈ）、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉトリオースリン酸イソメラーゼＴｈ細胞エピトープ（ＳＭ Ｔｈ）、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴｒａＴ Ｔｈ細胞エピトープ（ＴｒａＴ Ｔｈ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、コレラ毒素、インフルエンザＭＰ１、インフルエンザＮＳＰ１、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）が含まれるが、これらに限定されない。本開示で使用されるＴｈエピトープの例が表１に示される。

【0054】

一部の実施形態では、本開示のＴｈエピトープは、類似のアミノ酸配列を含有するペプチドの混合物を含有するコンビナトリアルＴｈエピトープであり得る。コンビナトリアル人工Ｔｈエピトープとも呼ばれる構造化合成抗原ライブラリー（ＳＳＡＬ）は、特定の位置で置換された不変残基の構造フレームワークの周りに構成されたアミノ酸配列を有する多数のＴｈエピトープを含む。ＳＳＡＬエピトープの配列は、多様なＭＨＣ制限要素の認識を得るために、比較的不変の残基を保持し、他の残基を変化させることにより決定される。ＳＳＡＬエピトープの配列は、無差別Ｔｈの１次アミノ酸配列をアラインさせ、骨格フレームワークとしてＴｈペプチドの固有な構造に関与する残基を選択して保持し、既知のＭＨＣ制限要素に従って残りの残基を変化させることによって決定することができる。ＭＨＣ制限要素の好ましいアミノ酸を有する不変及び可変位置は、ＭＨＣ結合モチーフを得るために使用することができ、これは、ＴｈエピトープのＳＳＡＬを設計するために使用することができる。

【0055】

コンビナトリアル配列として提示された異種Ｔｈエピトープペプチドは、その特定のペプチドの相同体の可変残基に基づいて、ペプチドフレームワーク内の特定の位置に表されるアミノ酸残基の混合物を含有する。一部の実施形態では、Ｔｈエピトープライブラリ配列は、無差別Ｔｈエピトープの構造モチーフを維持し、ハプロタイプの広い範囲に対する反応性に適応するように設計される。一部の実施形態では、ＳＳＡＬのメンバーは、縮重のＴｈエピトープＳＳＡＬ１ Ｔｈ１とし得、麻疹ウイルスのＦタンパク質から取得される無差別エピトープ（例えば、配列番号１～５）からモデル化される。他の実施形態では、ＳＳＡＬの部材は、縮重ＴｈエピトープＳＳＡＬ２ Ｔｈ２であり得、ＨＢｓＡｇ１から取得される無差別エピトープ（例えば、配列番号１９～２４）からモデル化した。

【0056】

合成後のコンビナトリアル人工Ｔｈエピトープ（またはＳＳＡＬ）の混合物中に存在するペプチドの総数は、各可変位置で利用可能な選択肢の数を掛け合わせることによって計算することができる。例えば、配列番号１６は、５つの可変位置を含有し、各可変位置が２つの異なる残基の選択肢を有するので、３２の異なるペプチドの組み合わせを表す（すなわち、２ｘ２ｘ２ｘ２ｘ２＝２^５＝３２）。同様に、配列番号５は、５２４，２８８の異なるペプチドの組み合わせを表す（すなわち、２ｘ４ｘ２ｘ４ｘ２ｘ４ｘ４ｘ４ｘ２ｘ４ｘ２ｘ４＝２^５ｘ４^７＝５２４，２８８）。コンビナトリアル人工Ｔｈエピトープ配列には、（ａ）可変配列に包含される全てのペプチドの混合物、及び、（ｂ）組み合わせ内に単一配列を含有する個々の各ペプチド、が含まれる。

【0057】

一部の実施形態では、荷電残基ＧｌｕまたはＡｓｐは、Ｔｈの疎水面を囲む電荷を増加するために、１位に付加させることができる。一部の実施形態では、両親媒性ヘリックスの疎水面は、２、５、８、９、１０、１３、及び１６の疎水性残基により維持することができる。一部の実施形態では、２、５、８、９、１０、及び１３のアミノ酸残基は、広範囲のＭＨＣ制限要素に結合する能力を有するファサードを提供するために変更することができる。一部の実施形態では、アミノ酸残基の変化は、人工Ｔｈエピトープの免疫応答性の範囲を拡大し得る。

【0058】

人工Ｔｈエピトープは、既知の無差別Ｔｈエピトープの全ての特性及び特徴を組み込み得る。一部の実施形態では、人工Ｔｈエピトープは、ＳＳＡＬのメンバーである。一部の実施形態では、人工Ｔｈ部位は、部位特異的標的に対する抗体応答の強化を提供するために、自己抗原及び外来抗原から取得されたペプチド配列と組み合わすことができる。一部の実施形態では、人工Ｔｈエピトープ免疫原は、有効且つ安全な抗体応答を提供し、高い免疫効力を示し、広範な反応応答性を示し得る。

【0059】

理想化人工Ｔｈエピトープも提供される。これらの理想化人工Ｔｈエピトープは、ＷＯ９５／１１９９８に開示される既知の２つの天然Ｔｈエピトープ及びＳＳＡＬペプチドプロトタイプに基づいてモデル化される。ＳＳＡＬＳは、遺伝的に多様な集団のメンバー間で広範な免疫応答を誘発することを意図されるコンビナトリアルＭＨＣ分子結合モチーフ（Ｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５）を組み込む。麻疹ウイルス及びＢ型肝炎ウイルス抗原のＴｈエピトープに基づいて、ＳＳＡＬペプチドプロトタイプを設計し、複数のＭＨＣ結合モチーフを導入することによって変更した。複数のＭＨＣ結合モチーフを単純化、追加、及び／または変更することにより、他のＴｈエピトープの設計を、他の既知のＴｈエピトープからモデル化して、一連の新規人工Ｔｈエピトープを生成した。様々な標的抗原部位を有する合成ペプチド免疫原に、無差別人工Ｔｈ部分を組み込んだ。得られたキメラペプチドは、標的抗原部位に対する有効な抗体応答を刺激することができた。

【0060】

表１に「ＳＳＡＬ１ Ｔｈ１」と示されるプロトタイプの人工ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープ、４つのペプチド（配列番号１～４）の混合物は、麻疹ウイルスのＦタンパク質の無差別Ｔｈエピトープからモデル化された理想化Ｔｈエピトープである（Ｐａｒｔｉｄｏｓ ｅｔ ａｌ．１９９１）。表１に「ＭＶＦ Ｔｈ（ＵＢＩＴｈ（登録商標）５）」（配列番号６）と示されるモデルＴｈエピトープは、麻疹ウイルスＦタンパク質の残基２８８～３０２に対応する。「Ｒｏｔｈｂａｒｄ規則」に従い、エピトープの疎水面を囲む電荷を増加させるために荷電残基Ｇｌｕ／Ａｓｐを１位に付加すること；４、６、１２、及び１４位に荷電残基またはＧｌｙを付加または保持すること；ならびに、７及び１１位に荷電残基またはＧｌｙを付加または保持することによって、ＭＶＦ Ｔｈ（配列番号６）をＳＳＡＬ１ Ｔｈ１プロトタイプ（配列番号１～４）に改変した。Ｔｈエピトープの疎水面は、２、５、８、９、１０、１３、及び１６の位置に残基を含む。無差別エピトープと一般的に関連する疎水性残基を、これらの位置で置換して、コンビナトリアルＴｈ ＳＳＡＬエピトープ、ＳＳＡＬ１ Ｔｈ１（配列番号１～４）を得た。プロトタイプＳＳＡＬ１ Ｔｈ１（配列番号１～４）の別の重要な特徴は、１及び４位が、ＭＨＣ結合モチーフを模倣するために、９位のいずれかの側のパリンドロームとして不完全に繰り返されることである。さらに、ＳＳＡＬ１ Ｔｈ１のこの「１、４、９」パリンドロームパターンを、配列番号２（表１）において改変して、元のＭｖＦモデルＴｈ（配列番号６）の配列をより厳密に反映した。

【0061】

コンビナトリアル人工Ｔｈエピトープは、一連の単一配列エピトープを提供するために単純化することができる。例えば、配列番号５のコンビナトリアル配列は、配列番号１～４で表される単一配列のＴｈエピトープに単純化することができる。これらの単一配列Ｔｈエピトープは、免疫原性の強化を提供するために標的抗原部位に結合させることができる。

【0062】

一部の実施形態では、Ｔｈエピトープの免疫原性は、非極性及び極性非荷電アミノ酸、例えば、Ｉｌｅ及びＳｅｒで、Ｎ末端を伸長すること、ならびに、荷電及び疎水性アミノ酸、例えば、Ｌｙｓ及びＰｈｅで、Ｃ末端を延長することによって改善されてもよい。加えて、Ｔｈエピトープへのリジン残基または複数のリジン残基（例えば、ＫＫＫ）の付加は、水中のペプチドの溶解度を改善し得る。さらなる改変には、共通のＭＨＣ結合モチーフＡｘＴｘＩＬによるＣ末端の置換が含まれていた（Ｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ、１９９５）。

【0063】

人工Ｔｈエピトープは、既知の天然ＴｈエピトープまたはＳＳＡＬペプチドプロトタイプであり得る。一部の実施形態では、ＳＳＡＬ由来のＴｈエピトープは、遺伝的に多様な集団のメンバー間で広範な免疫応答を誘発することが意図されたコンビナトリアルＭＨＣ分子結合モチーフを組み込み得る。一部の実施形態では、複数のＭＨＣ結合モチーフを導入することによって修飾されたＳＳＡＬペプチドプロトタイプは、麻疹ウイルス及びＢ型肝炎ウイルス抗原のＴｈエピトープに基づいて設計することができる。一部の実施形態では、人工Ｔｈエピトープは、一連の新規人工Ｔｈエピトープを生成するために、複数のＭＨＣ結合モチーフを単純化、付加、及び／または修飾することができる。一部の実施形態では、新たに適合させた無差別人工Ｔｈ部位は、様々な標的抗原部位を有する合成ペプチド免疫原に組み込むことができる。一部の実施形態では、得られる生じるキメラペプチドは、標的抗原部位に対する有効な抗体応答を刺激し得る。

【0064】

本開示の人工Ｔｈエピトープは、クラスＩＩ ＭＨＣ分子の結合部位を含む天然または非天然アミノ酸の連続配列であり得る。一部の実施形態では、人工Ｔｈエピトープは、標的抗原部位に対する抗体応答を強化または刺激することができる。一部の実施形態では、Ｔｈエピトープは、連続または不連続アミノ酸セグメントで構成され得る。一部の実施形態では、Ｔｈエピトープの全てのアミノ酸が、ＭＨＣ認識に関与しているわけではない。一部の実施形態では、本発明のＴｈエピトープは、免疫強化ホモログ、交差反応性ホモログ、及びそれらのセグメントなどの免疫学的に機能的なホモログを含み得る。一部の実施形態では、機能的Ｔｈホモログは、さらに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失、及び挿入を含み、ＴｈエピトープのＴｈ刺激機能を提供し得る。

【0065】

エピトープは、標的部位に直接結合させることができる。一部の実施形態では、Ｔｈエピトープは、任意の異種スペーサー、例えば、Ｇｌｙ－Ｇｌｙまたは（ε－Ｎ）Ｌｙｓなどのペプチドスペーサーを介して、標的部位に結合させることができる。スペーサーは、Ｂ細胞エピトープからＴｈエピトープを物理的に分離し、Ｔｈエピトープまたは機能的ホモログを標的抗原部位と結合させることによって作成された任意の人工２次構造の形成を破壊して、Ｔｈ及び／またはＢ細胞応答との干渉を排除し得る。

【0066】

表１に示されるように、Ｔｈエピトープには、理想化人工Ｔｈエピトープ及びコンビナトリアル理想化人工Ｔｈエピトープが含まれる。一部の実施形態では、Ｔｈエピトープは、配列番号１～５２の無差別Ｔｈ細胞エピトープ、その任意の相同体、及び／またはその任意の免疫学的アナログである。Ｔｈエピトープには、Ｔｈエピトープの免疫学的アナログも含まれる。免疫学的Ｔｈアナログには、免疫強化アナログ、交差反応性アナログ、及び標的抗原部位に対する免疫応答を強化または刺激するのに十分なこれらのＴｈエピトープのいずれかのセグメントが含まれる。

【0067】

Ｔｈエピトープペプチドの機能的免疫学的アナログも有効であり、本発明の一部として含まれる。機能的免疫学的Ｔｈアナログには、ＴｈエピトープのＴｈ刺激機能を本質的に改変しないＴｈエピトープ中の１～約５つのアミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失、及び挿入が含まれ得る。保存的置換、付加、及び挿入は、標的抗原部位について上述したように、天然または非天然アミノ酸を用いて達成することができる。表１は、Ｔｈエピトープペプチドに対する機能的アナログの別のバリエーションを同定する。特に、ＭｖＦ１及びＭｖＦ２ Ｔｈの配列番号６及び７は、Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれの２つのアミノ酸の欠失（配列番号６及び７）または組み入れ（配列番号１６及び１７）によりアミノ酸フレームが異なるという点で、ＭｖＦ４及びＭｖＦ５の配列番号１６及び１７の機能的アナログである。これらの２つの一連のアナログ配列間の違いは、これらの配列内に含有されるＴｈエピトープの機能に影響を与えない。従って、機能的免疫学的Ｔｈアナログには、麻疹ウイルス融合タンパク質ＭｖＦ１－４ Ｔｈ（配列番号６～１８）及び肝炎表面タンパク質ＨＢｓＡｇ １－３ Ｔｈ（配列番号１９～３１）に由来する、いくつかのバージョンのＴｈエピトープが含まれる。

【0068】

ペプチド免疫原構築物中のＴｈエピトープは、キメラＴｈ／Ｂ細胞部位ペプチド免疫原を産生するために、標的抗原部位のＮ末端またはＣ末端のいずれかに共有結合させることができる。一部の実施形態では、Ｔｈエピトープは、化学的カップリングまたは直接合成によって標的抗原部位に共有結合させることができる。一部の実施形態では、Ｔｈエピトープは、標的抗原部位のＮ末端に共有結合している。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、標的抗原部位のＣ末端に共有結合している。特定の実施形態では、複数のＴｈエピトープは、標的抗原部位に共有結合している。複数のＴｈエピトープが標的抗原部位に結合している場合、各Ｔｈエピトープは、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有し得る。加えて、複数のＴｈエピトープが標的抗原部位に結合している場合、Ｔｈエピトープは、任意の順序で配置することができる。例えば、Ｔｈエピトープが、標的抗原部位のＮ末端に連続的に結合させることができるか、もしくは標的抗原部位のＣ末端に連続的に結合させることができるか、または、Ｔｈエピトープが、標的抗原部位のＮ末端に共有結合させることができるが、別のＴｈエピトープが、標的抗原部位のＣ末端に共有結合している。標的抗原部位に関して、Ｔｈエピトープの配置に制限はない。

【0069】

一部の実施形態では、Ｔｈエピトープは、標的抗原部位に直接共有結合している。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、以下にさらに詳細に記載される異種スペーサーを介して標的抗原部位に共有結合している。

【0070】

合成方法
本開示のペプチド免疫原は、化学的方法を使用して合成することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチド免疫原は、固相ペプチド合成を使用して合成することができる。一部の実施形態では、本発明のペプチドは、α－ＮＨ_２または側鎖アミノ酸を保護するために、ｔ－ＢｏｃまたはＦｍｏｃを使用する自動Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄペプチド固相合成法を使用して合成される。

【0071】

コンビナトリアル配列として提示される異種Ｔｈエピトープペプチドは、その特定のペプチドの相同体の可変残基に基づいて、ペプチドフレームワーク内に特定の位置に表されるアミノ酸残基の混合物を含有する。コンビナトリアルペプチドの集合体は、合成プロセス中に指定位置に、１つの特定のアミノ酸の代わりに、指定された保護アミノ酸の混合物を付加することによって、１つのプロセスで合成することができる。そのようなコンビナトリアル異種Ｔｈエピトープペプチドアセンブリは、多様な遺伝的背景を有する動物の広いＴｈエピトープカバレッジを可能にすることができる。異種Ｔｈエピトープペプチドの代表的なコンビナトリアル配列には、表１に示される配列番号５、１０、１３、１６、２４、及び２７が含まれる。本発明のエピトープペプチドは、遺伝的に多様な集団からの動物及び患者に幅広い反応性及び免疫原性を提供する。

【0072】

興味深いことに、Ｔｈエピトープ、Ｂ細胞エピトープ、及び／またはＴｈエピトープ及びＢ細胞エピトープを含有するペプチド免疫原構築物の合成中に導入され得る不整合及び／またはエラーは、ほとんどの場合、処置された動物の所望の免疫応答を妨げないか、または阻止しない。実際、ペプチド合成中に導入され得る不整合／エラーにより、標的ペプチド合成とともに複数のペプチドアナログが生成される。これらのアナログには、アミノ酸の挿入、欠失、置換、及び早期終結が含まれ得る。上記のように、そのようなペプチドアナログは、免疫診断のための固相抗原として、またはワクチン接種のための免疫原として、免疫学的用途で使用される場合、抗原性及び免疫原性への寄与因子としてペプチド調製物に適する。

【0073】

Ｔｈエピトープを含むペプチド免疫原構築物は、標的抗原部位と並行して、単一の固相ペプチド合成で同時に生成される。Ｔｈエピトープには、Ｔｈエピトープの免疫学的アナログも含まれる。免疫学的Ｔｈアナログには、免疫強化アナログ、交差反応性アナログ、及び標的抗原部位に対する免疫応答を強化または刺激するのに十分なこれらのＴｈエピトープのいずれかのセグメントが含まれる。

【0074】

所望のペプチド免疫原の完全な組み立て後、固相樹脂は、樹脂からペプチドを切断し、アミノ酸側鎖上の官能基を除去するために処理することができる。遊離ペプチドは、ＨＰＬＣで精製し、生化学的に特性決定することができる。一部の実施形態では、遊離ペプチドは、アミノ酸分析を使用して生化学的に特性決定される。一部の実施形態では、遊離ペプチドは、ペプチド配列を使用して特性決定される。一部の実施形態では、遊離ペプチドは、質量分析法を使用して特性決定される。

【0075】

本発明のペプチド免疫原は、チオエーテル結合の形成を通してハロアセチル化及びシステイン化ペプチドを使用して合成することができる。一部の実施形態では、システインは、Ｔｈ含有ペプチドのＣ末端に付加することができ、システイン残基のチオール基は、Ｎ^αクロロアセチル変性基またはリジン残基のマレイミド誘導体化α基もしくはε－ＮＨ_２基などの求電子性基への共有結合を形成するために使用することができる。得られる合成中間体は、標的抗原部位ペプチドのＮ末端に結合させることができる。

【0076】

より長い合成ペプチドコンジュゲートは、核酸クローニング手法を使用して合成することができる。一部の実施形態では、本発明のＴｈエピトープは、組み換えＤＮＡ及びＲＮＡを発現することによって合成することができる。本発明のＴｈ／標的抗原部位ペプチドを発現する遺伝子を構築するために、アミノ酸配列は、核酸配列に逆翻訳することができる。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、遺伝子が発現される生物に最適化されたコドンを使用して、核酸配列に逆翻訳される。ペプチドをコードする遺伝子を作成することができる。一部の実施形態では、ペプチドをコードする遺伝子は、ペプチド及び必要な調節エレメントをコードする重複オリゴヌクレオチドを合成することによって作製することができる。合成遺伝子は、所望の発現ベクターに組み立てて挿入することができる。

【0077】

本開示の合成核酸配列には、ペプチドまたはコードされたＴｈエピトープの免疫学的特性を変更しない非コード配列の変化で特性決定される、本発明のＴｈエピトープをコードする核酸配列、Ｔｈエピトープを含むペプチド、その疫学的に機能的な相同体、及び核酸構築物が含まれ得る。合成遺伝子は、好適なクローニングベクターに挿入することができ、組み換え体が得ることができ、特性決定することができる。次に、Ｔｈエピトープ及びＴｈエピトープを含むペプチドは、選択された発現系及び宿主に適切な条件下で発現させることができる。Ｔｈエピトープまたはペプチドは、精製及び特性決定することができる。

【0078】

医薬組成物
本開示は、本開示のペプチド免疫原を含む医薬組成物についても記載する。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、ペプチド免疫原の投与のための薬学的に許容される送達システムとして使用することができる。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、免疫学的に有効な量の１つ以上のペプチド免疫原を含み得る。

【0079】

本発明のペプチド免疫原は、免疫原性組成物として製剤化することができる。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、ワクチン組成物中の、日常的に提供されるアジュバント、乳化剤、薬学的に許容される担体、または他の成分を含み得る。本発明で使用することができるアジュバントまたは乳化剤には、ミョウバン、不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＩＦＡ）、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、ＱＳ２１、及びＩＳＡ７２０、ＩＳＡ５１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６、及び他の有効なアジュバント及び乳化剤が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物は、即時放出用に製剤化することができる。一部の実施形態では、本発明の組成物は、持続放出用に製剤化することができる。

【0080】

医薬組成物に使用されるアジュバントには、油、アルミニウム塩、ビロソーム、リン酸アルミニウム（例えば、ＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標））、水酸化アルミニウム（例えば、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ＱＳ２１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６、ＩＳＡ５０Ｖ、ＩＳＡ５１、ＩＳＡ７２０、ならびに他のアジュバント及び乳化剤が含まれ得る。

【0081】

一部の実施形態では、医薬組成物は、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１（油中水型エマルションを生成するための植物油及びオレイン酸マンニドからなる油アジュバント組成物）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリソルベート８０またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレアートとしても知られる）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、及び／またはそれらの任意の組み合わせを含有する。他の実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとしてＥＭＵＬＳＩＧＥＮまたはＥＭＵＬＳＩＧＥＮ Ｄを含む水中油中水型（すなわち、ｗ／ｏ／ｗ）エマルションである。

【0082】

図１Ａは、ＵＢＩＴｈ（登録商標）を含む、Ｔｈエピトープ担体を含有するペプチド免疫原を有する製剤に含まれ得る構成要素を要約した概略図である。図１Ａに示される例示的製剤としては、２つの別々のペプチド免疫原構築物が挙げられる。各ペプチド免疫原構築物は、（ａ）所望のエピトープに対する高度に標的化された抗体を誘発するように設計されるカスタム機能Ｂ細胞エピトープ、（ｂ）免疫原性を強化するために免疫系へのＢ細胞エピトープの提示を最適化するのに役立つリンカー、及び（ｃ）それ自体が免疫サイレントであるが、Ｂ細胞エピトープに対する強力な応答を促進するのに役立つＴｈエピトープを含有する。製剤は、組成物が使用される特定の用途に適する薬学的に許容されるアジュバントまたは担体も含有する。さらに、組成物は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを使用して安定化免疫刺激複合体に製剤化することができる（さらに以下に説明）。

【0083】

図１Ｂは、ＵＢＩＴｈ（登録商標）を含む、本明細書に記載のＴヘルパー細胞エピトーププラットフォームのいくつかの特徴及び技術的利点をまとめる。例えば、本明細書に記載のＴｈエピトーププラットフォームは、長時間作用型であるが、追加免疫がない状態で可逆的である。Ｔｈエピトーププラットフォームは、Ｂ細胞エピトープに対する特異性の高い抗体を生成し、リンカーまたはＴｈエピトープ配列に対して生成される抗体は、たとえあったとしても、ほとんどない。さらに、Ｔｈエピトーププラットフォームは、様々なＢ細胞エピトープとともに使用することができ、これにより、ペプチド免疫原構築物の無限の組み合わせが可能になる。

【0084】

一部の実施形態では、組成物は、ワクチンとして使用するために製剤化される。ワクチン組成物は、皮下、経口、筋肉内、腹腔内、非経口、または経腸投与を含む任意の便利な経路によって投与することができる。一部の実施形態では、免疫原は、単回投与で投与される。一部の実施形態では、免疫原は、複数回投与にわたって投与される。

【0085】

医薬組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能なものとして調製することができる。ｔａｕペプチド免疫原構築物を含有する液体ビヒクルは、注射前に調製することもできる。医薬組成物は、好適な任意の適用様式、例えば、ｉ．ｄ．、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、鼻腔内、経口、皮下などで、及び好適な送達デバイス中で、投与することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内投与のために製剤化される。経口及び鼻腔内適用を含む、他の投与様式に適する医薬組成物を調製することもできる。

【0086】

本発明の組成物は、有効量の１つ以上ペプチド免疫原及び薬学的に許容される担体を含み得る。一部の実施形態では、好適な投薬単位形態の組成物は、対象の体重１ｋｇあたり、約０．５μｇ～約１ｍｇのペプチド免疫原を含有し得る。一部の実施形態では、好適な投薬単位形態の組成物は、対象の体重１ｋｇあたり、約１０μｇ、約２０μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０μｇ、約６０μｇ、約７０μｇ、約８０μｇ、約９０μｇ、約１００μｇ、約２００μｇ、約３００μｇ、約４００μｇ、約５００μｇ、約６００μｇ、約７００μｇ、約８００μｇ、約９００μｇ、または約１０００μｇのペプチド免疫原を含有し得る。一部の実施形態では、好適な剤形の組成物は、対象の体重１ｋｇあたり、約１００μｇ、約１５０μｇ、約２００μｇ、約２５０μｇ、約３００μｇ、約３５０μｇ、約４００μｇ、約４５０μｇ、または約５００μｇのペプチド免疫原を含有し得る。一部の実施形態では、好適な投薬単位形態の組成物は、対象の体重１ｋｇあたり、約０．５μｇ～約１ｍｇのペプチド免疫原を含有し得る。一部の実施形態では、好適な投薬単位形態の組成物は、約１０μｇ、約２０μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０μｇ、約６０μｇ、約７０μｇ、約８０μｇ、約９０μｇ、約１００μｇ、約２００μｇ、約３００μｇ、約４００μｇ、約５００μｇ、約６００μｇ、約７００μｇ、約８００μｇ、約９００μｇ、または約１０００μｇのペプチド免疫原を含有し得る。一部の実施形態では、好適な剤形の組成物は約１００μｇ、約１５０μｇ、約２００μｇ、約２５０μｇ、約３００μｇ、約３５０μｇ、約４００μｇ、約４５０μｇ、または約５００μｇのペプチド免疫原を含有し得る。

【0087】

複数回投与で送達される場合、組成物は、１回の投与毎に適切量に分割することができる。一部の実施形態では、用量は、約０．２ｍｇ～約２．５ｍｇである。一部の実施形態では、用量は、約１ｍｇである。一部の実施形態では、用量は、約１ｍｇであり、注射で投与される。一部の実施形態では、用量は、約１ｍｇであり、筋肉内投与される。一部の実施形態では、投与後に、反復（追加免疫）投与が続き得る。投薬量は、対象の年齢、体重、及び全体的な健康状態に応じて最適化することができる。

【0088】

ペプチド免疫原の混合物を含むワクチンは、より広範な集団において免疫有効性の強化を提供し得る。一部の実施形態では、ペプチド免疫原の混合物は、ＭＶＦ Ｔｈ及びＨＢｓＡｇ Ｔｈに由来するＴｈ部位を含む。一部の実施形態では、ペプチド免疫原の混合物を含むワクチンは、標的抗原部位に対する免疫応答の改善を提供し得る。

【0089】

Ｔｈ／標的抗原部位コンジュゲートに対する免疫応答は、生分解性マイクロ粒子の中または上への捕捉による送達で改善することができる。一部の実施形態では、ペプチド免疫原は、アジュバントを含んでまたは含まずにカプセル化することができ、そのようなマイクロ粒子は、免疫刺激アジュバントを運び得る。一部の実施形態では、マイクロ粒子は、免疫応答を増強するために、ペプチド免疫原と同時投与することができる。

【0090】

免疫刺激複合体
本開示は、また、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとの免疫刺激複合体の形態のｔａｕペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物に関する。そのような免疫刺激複合体は、アジュバント及びペプチド免疫原安定剤として機能するように特別に適合される。免疫刺激複合体は、免疫応答を生じさせるために、免疫系の細胞へのｔａｕペプチド免疫原を効率的に提示し得る微粒子の形態である。免疫刺激複合体は、非経口投与用の懸濁液として製剤化されてもよい。免疫刺激複合体は、また、経口投与後の宿主の免疫系の細胞にｔａｕペプチド免疫原を効率的に送達するための無機塩またはｉｎ－ｓｉｔｕゲル化ポリマーと組み合わせた懸濁液として、ｗ／ｏエマルションの形態で製剤化されてもよい。

【0091】

安定化免疫刺激複合体は、静電結合を介して、陰イオン分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせと、ｔａｕペプチド免疫原構築物を複合化することによって形成することができる。安定化免疫刺激複合体は、免疫原送達システムとして医薬組成物に組み込まれてもよい。

【0092】

特定の実施形態では、ｔａｕペプチド免疫原構築物は、５．０～８．０の範囲のｐＨで正荷電の陽イオン部分を含有するように設計される。ｔａｕペプチド免疫原構築物、または構築物の混合物の陽イオン部分の正味電荷は、配列内の、各リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）に対して＋１の電荷を、各アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）に対して－１の電荷を、他のアミノ酸に対して０の電荷を割り当てることによって計算される。電荷は、ｔａｕペプチド免疫原構築物の陽イオン部分内で合計され、正味の平均電荷として表される。好適なペプチド免疫原は、正味の平均正電荷が＋１である陽イオン部分を有する。好ましくは、ペプチド免疫原は、＋２より大きい範囲の正味の正電荷を有する。一部の実施形態では、ｔａｕペプチド免疫原構築物の陽イオン部分は、異種スペーサーである。特定の実施形態では、ｔａｕペプチド免疫原構築物の陽イオン部分は、スペーサー配列が（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号５３）、またはＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号５４）である場合、＋４の電荷を有する。

【0093】

本明細書に記載の「陰イオン分子」は、５．０～８．０の範囲のｐＨで負電荷を有する任意の分子を指す。特定の実施形態では、陰イオン分子は、オリゴマーまたはポリマーである。オリゴマーまたはポリマーの正味の負電荷は、オリゴマーの各ホスホジエステルまたはホスホロチオエート基に－１電荷を割り当てることによって計算される。好適な陰イオンオリゴヌクレオチドは、８～６４ヌクレオチド塩基を有する一本鎖ＤＮＡ分子であり、ＣｐＧモチーフのリピート数は、１～１０の範囲である。好ましくは、ＣｐＧ免疫刺激一本鎖ＤＮＡ分子は、１８～４８ヌクレオチド塩基を含有し、ＣｐＧモチーフのリピート数は、３～８の範囲である。

【0094】

より好ましくは、陰イオンオリゴヌクレオチドは、式：５’Ｘ^１ＣＧＸ^２３’（式中、Ｃ及びＧは、メチル化されておらず、Ｘ１は、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、及びＴ（チミン）からなる群から選択され、Ｘ^２は、Ｃ（シトシン）またはＴ（チミン）である）で表される。または、陰イオンオリゴヌクレオチドは、式：５’（Ｘ^３）_２ＣＧ（Ｘ^４）_２３’（式中、Ｃ及びＧは、非メチル化され、Ｘ^３は、Ａ、Ｔ、またはＧからなる群より選択され、Ｘ^４は、ＣまたはＴである）で表される。特定の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧ１（配列番号１４６）、ＣｐＧ２（配列番号１４７）、またはＣｐＧ３（配列番号１４８）であり得る。

【0095】

得られる免疫刺激複合体は、通常、１～５０ミクロンの範囲のサイズを有する粒子の形態であり、相互作用種の相対的な電荷の化学量論及び分子量を含む多くの因子の関数である。微粒子化された免疫刺激複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏでの特定の免疫応答のアジュバント化及び上方調節を提供するという利点を有する。さらに、安定化免疫刺激複合体は、油中水型エマルション、無機塩懸濁液、及びポリマーゲルを含む様々なプロセスによる医薬組成物の調製に適する。

【0096】

用途
本開示の人工Ｔｈエピトープを含有するペプチド免疫原は、医学及び獣医学用途に有用であり得る。一部の実施形態では、ペプチド免疫原は、感染症に対する防御免疫を得るワクチン、正常な生理学的プロセスの機能不全から生じる障害を処置するための免疫療法、がんを処置するための免疫療法、及び正常な生理学的プロセスに介入またはこれを改変する薬剤として使用することができる。

【0097】

本開示の人工Ｔｈエピトープは、様々な微生物、タンパク質、またはペプチドの標的Ｂ細胞エピトープと組み合わせる場合、免疫応答を誘発し得る。一部の実施形態では、本開示の人工Ｔｈエピトープは、１つの標的抗原部位に結合することができる。一部の実施形態では、本開示の人工Ｔｈエピトープは、２つの標的抗原部位に結合することができる。

【0098】

本開示の人工Ｔｈエピトープは、様々な疾患及び状態を予防及び／または処置するために、標的抗原部位に結合することができる。一部の実施形態では、本発明の組成物は、神経変性疾患、感染性疾患、動脈硬化症、前立腺癌、雄臭の予防、動物のイムノキャストレーション、子宮内膜症の処置、乳癌及び性腺ステロイドホルモンの影響を受ける他の婦人科癌の予防及び／または処置に、ならびに男性及び女性の避妊に使用することができる。例えば、人工Ｔｈエピトープは、以下のタンパク質の抗原部位に結合することができる：
ａ．家畜の成長を促進するソマトスタチン。
ｂ．アレルギー疾患を処置するＩｇＥ。
ｃ．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症及び免疫障害を処置及び／または予防するＴｈ細胞のＣＤ４受容体。
ｄ．口蹄疫（ＦＭＤ）を予防するＦＭＤウイルスカプシドタンパク質。
ｅ．ＨＩＶ感染を予防及び処置するＨＩＶビリオンエピトープ。
ｆ．マラリアを予防及び処置するＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト周囲抗原。
ｇ．動脈硬化を予防及び処置するＣＥＴＰ。
ｈ．アルツハイマー病を処置またはそれに対して予防接種するＡβ。
ｉ．パーキンソン病を処置またはそれに対して予防接種するアルファ－シヌクレイン。
ｊ．アルツハイマー病を含むタウ異常症を処置及びそれに対して予防接種するＴａｕ。
ｋ．アトピー性皮膚炎を処置するＩＬ－３１。
ｌ．片頭痛を予防及び処置するＣＧＲＰ。
ｍ．２型糖尿病を予防及び処置するＩＡＰＰ（アミリン）。

【0099】

異種人工Ｔｈエピトープの使用は、神経変性疾患に関与するタンパク質（例えば、Ａβ、アルファ－シヌクレイン、Ｔａｕ）を標的とするために特に重要であることが判明している。具体的には、対象に投与される時、標的とされた神経変性タンパク質の内因性Ｔｈエピトープを含有するペプチド免疫原は、脳の炎症を引き起こし得る。対照的に、神経変性タンパク質の抗原部位に結合している異種人工Ｔｈエピトープを含有するペプチド免疫原構築物は、脳の炎症を引き起こさない。

【0100】

図２は、本出願に記載のＴｈエピトーププラットフォームを使用して得ることができる理論的な結果を示すグラフである。グラフは、ＴｈエピトープにコンジュゲートされたＢ細胞エピトープを含有するペプチド免疫原構築物は、開始時間が早く、Ｃ_ｍａｘにすばやく到達することを示す。Ｃ_ｍａｘは、最小有効濃度（ＭＥＣ）及び最小治療濃度（ＭＴＣ）間にある治療範囲内にある。以下の実施例は、使用されるＴｈエピトープ、ペプチド免疫原構築物の投薬量、及びアジュバントを変化させることにより、Ｃ_ｍａｘ、作用持続時間、開始時間、及びｔ_ｍａｘは、全て、制御及び／または調整することができることを示す。

【0101】

アミロイドβ
Ａβペプチドは、アルツハイマー病の発症及び進行の中心であると考えられる。Ａβオリゴマー及びＡβ原線維の有毒な形態は、アルツハイマー病及び認知症の病態につながるシナプス及びニューロンの死に関与していることが示唆される。良好なアルツハイマー病の疾患修飾療法には、脳内のＡβの性質に影響を与える製品が含まれ得る。

【0102】

本開示のペプチド免疫原は、Ｔｈ細胞エピトープ及びＡβ標的化ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、Ｔｈ細胞エピトープは、Ｔｈ１またはＴｈ２である。一部の実施形態では、ペプチド免疫原は、Ｔｈ１及びＴｈ２を含み得る。Ａβ標的ペプチド、またはＢ細胞エピトープは、Ａβ_１－１４、Ａβ_１－１６、Ａβ_１－２８、Ａβ_{１７－４２}、またはＡβ_１－４２であり得る。一部の実施形態では、Ａβ標的化ペプチドは、Ａβ_１－１４である。本明細書で使用される場合、Ａβ_ｘ-ｙという用語は、全長野生型Ａβタンパク質のアミノ酸ｘからアミノ酸ｙまでのＡβ配列を指す。

【0103】

本開示のペプチド免疫原は、複数のＡβ標的化ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ペプチド免疫原は、２つのＡβ標的化ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ペプチド免疫原は、１つのＡβ_１－１４及び１つのＡβ_１－４２ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ペプチド免疫原は、２つのＡβ_１－１４標的化ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ペプチド免疫原は、２つのＡβ_１－１４標的化ペプチドを含み得、それぞれは、キメラペプチドとして異なるＴｈ細胞エピトープに結合している。

【0104】

本開示は、２つのＡβ_１－１４標的化ペプチドを含むＡβ_１－１４ペプチドワクチンも提供し、それぞれは、キメラペプチドとして異なるＴｈ細胞エピトープに結合している。一部の実施形態では、キメラＡβ_１－１４ペプチドは、Ｔ細胞の炎症反応性を最小限にするために、Ｔｈ１バイアス送達システムで製剤化することができる。一部の実施形態では、キメラＡβ_１－１４ペプチドは、Ｔ細胞の炎症反応性を最小限にするために、Ｔｈ２バイアス送達システムで製剤化することができる。

【0105】

特定の実施形態
（１）配列番号３２～５２からなる群より選択される無差別人工Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープ。

【0106】

（２）以下の式で表されるペプチド免疫原構築物：
（Ａ）_ｎ－（標的抗原部位）－（Ｂ）_ｏ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－Ｘ
または
（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ｂ）_ｏ－（標的抗原部位）－（Ａ）_ｎ－Ｘ
または
（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ｂ）_ｏ－（標的抗原部位）－（Ｂ）_ｏ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－Ｘ
または
｛（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｐ－（Ｂ）_ｏ－（標的抗原部位）－（Ｂ）_ｏ－（Ｔｈ）_ｐ－（Ａ）_ｎ－Ｘ｝_ｍ
（式中、
各Ａは、独立して、アミノ酸であり、
各Ｂは、独立して、異種スペーサーであり、
各Ｔｈは、独立して、（１）に記載の無差別人工Ｔｈエピトープであり、
前記標的抗原部位は、外来抗原タンパク質、自己抗原タンパク質、またはそれらの免疫学的な反応性アナログ由来のＢ細胞エピトープであり、
Ｘは、アミノ酸、α－ＣＯＯＨ、またはα－ＣＯＮＨ_２であり、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、１、２、３、または４であり、
ｏは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｐは、０、１、２、３、または４である）。

【0107】

（３）前記標的抗原部位が、口蹄疫（ＦＭＤ）カプシドタンパク質、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）由来の糖タンパク質、豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）からなる群より選択される外来抗原タンパク質由来のＢ細胞エピトープである、（２）に記載のペプチド免疫原構築物。

【0108】

（４）前記標的抗原部位が、
（ａ）配列番号５６、５７、５８、５９、または６０のアミノ酸配列を有するＡβペプチド、
（ｂ）配列番号６１のアミノ酸配列を有するアルファ－シンペプチド、
（ｃ）配列番号６２のアミノ酸配列を有するＩｇＥ ＥＭＰＤペプチド、
（ｄ）配列番号６３、６９、７０、または７１のアミノ酸配列を有するＴａｕペプチド、
（ｅ）配列番号６４または７２のアミノ酸配列を有するＩＬ－３１ペプチド、及び
（ｆ）配列番号１４５のアミノ酸配列を有するＩＬ－６ペプチド
からなる群より選択される自己抗原タンパク質由来のＢ細胞エピトープである、（２）に記載のペプチド免疫原構築物。

【0109】

（５）構成要素Ｂの前記異種スペーサーが、アミノ酸、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号５３）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－εＮＬｙｓ（配列番号５４）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号５５）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、（２）に記載のペプチド免疫原構築物。

【0110】

（６）前記異種スペーサーが、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号５３）、及びＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－εＮＬｙｓ（配列番号５４）からなる群より選択される、（２）に記載のペプチド免疫原構築物。

【0111】

（７）（２）に記載のペプチド免疫原構築物を含む医薬組成物。

【0112】

（８）薬学的に有効な量の（７）に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象の疾患、状態、または病気を予防及び／または処置する方法。

【0113】

（９）前記標的抗原部位が、口蹄疫（ＦＭＤ）カプシドタンパク質、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）由来の糖タンパク質、豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）からなる群より選択される外来抗原タンパク質由来のＢ細胞エピトープである、（８）に記載の方法。

【0114】

（１０）前記標的抗原部位が、
（ａ）配列番号５６、５７、５８、５９、または６０のアミノ酸配列を有するＡβペプチド、
（ｂ）配列番号６１のアミノ酸配列を有するアルファ－シンペプチド、
（ｃ）配列番号６２のアミノ酸配列を有するＩｇＥ ＥＭＰＤペプチド、
（ｄ）配列番号６３、６９、７０、または７１のアミノ酸配列を有するＴａｕペプチド、
（ｅ）配列番号６４または７２のアミノ酸配列を有するＩＬ－３１ペプチド、及び
（ｆ）配列番号１４５のアミノ酸配列を有するＩＬ－６ペプチド
からなる群より選択される自己抗原タンパク質由来のＢ細胞エピトープである、（８）に記載の方法。

【0115】

（１１）以下の式で表されるペプチド免疫原構築物：
（Ａ）_ｎ－（標的抗原部位）－（Ｂ）_ｏ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－Ｘ
または
（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ｂ）_ｏ－（標的抗原部位）－（Ａ）_ｎ－Ｘ
または
（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ｂ）_ｏ－（標的抗原部位）－（Ｂ）_ｏ－（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－Ｘ
または
｛（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｐ－（Ｂ）_ｏ－（標的抗原部位）－（Ｂ）_ｏ－（Ｔｈ）_ｐ－（Ａ）_ｎ－Ｘ｝_ｍ
（式中、
各Ａは、独立して、アミノ酸であり、
各Ｂは、独立して、異種スペーサーであり、
各Ｔｈは、独立して、配列番号１～５２からなる群より選択される無差別人工Ｔｈエピトープであり、
前記標的抗原部位は、ＣＴＬエピトープ、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）、新抗原由来のＢ細胞エピトープ、小分子薬物、またはそれらの免疫学的な反応性アナログであり、
Ｘは、アミノ酸、α－ＣＯＯＨ、またはα－ＣＯＮＨ_２であり、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、１、２、３、または４であり、
ｏは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｐは、０、１、２、３、または４である）。

【0116】

（１２）前記標的抗原部位が、配列番号７６～１４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＣＴＬエピトープである、（１１）に記載のペプチド免疫原。

【0117】

（１３）前記標的抗原部位が、配列番号７６～８２からなる群より選択されるＨＩＶ由来のＣＴＬエピトープである、（１２）に記載のペプチド免疫原。

【0118】

（１４）前記標的抗原部位が、配列番号８３～１０６からなる群より選択されるＨＳＶ由来のＣＴＬエピトープである、（１２）に記載のペプチド免疫原。

【0119】

（１５）前記標的抗原部位が、配列番号１０７～１２３からなる群より選択されるＦＭＤＶ由来のＣＴＬエピトープである、（１２）に記載のペプチド免疫原。

【0120】

（１６）前記標的抗原部位が、配列番号１２４～１４２からなる群より選択されるＰＲＲＳＶ由来のＣＴＬエピトープである、（１２）に記載のペプチド免疫原。

【0121】

（１７）前記標的抗原部位が、配列番号１４３～１４４からなる群より選択されるＣＳＦＶ由来のＣＴＬエピトープである、（１２）に記載のペプチド免疫原。

【0122】

（１８）前記標的抗原部位は、ＧＤ３、ＧＤ２、Ｇｌｏｂｏ－Ｈ、ＧＭ２、フコシルＧＭ１、ＧＭ２、ＰＳＡ、Ｌｅ^ｙ、Ｌｅ^ｘ、ＳＬｅ^ｘ、ＳＬｅ^ａ、Ｔｎ、ＴＦ、及びＳＴｎからなる群より選択されるＴＡＣＡである、（１１）に記載のペプチド免疫原。

【0123】

（１９）前記標的抗原部位が、配列番号７３～７５からなる群より選択される新抗原由来のＢ細胞エピトープである、（１１）に記載のペプチド免疫原。

【0124】

（２０）前記標的抗原部位が、小分子薬物である、（１１）に記載のペプチド免疫原。

【0125】

（２１）構成要素Ｂの前記異種スペーサーが、アミノ酸、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号５３）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－εＮＬｙｓ（配列番号５４）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号５５）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、（１１）に記載のペプチド免疫原構築物。

【0126】

（２２）前記異種スペーサーが、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号５３）、及びＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－εＮＬｙｓ（配列番号５４）からなる群より選択される、（１１）に記載のペプチド免疫原構築物。

【0127】

（２３）（１１）に記載のペプチド免疫原構築物を含む医薬組成物。

【0128】

（２４）薬学的に有効な量の（２３）に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象の疾患、状態、または病気を予防及び／または処置する方法。

【0129】

（２５）前記疾患、状態、または病気が、ＨＩＶであり、前記標的抗原部位が、配列番号７６～８２からなる群より選択されるＨＩＶ由来のＣＴＬエピトープである、（２４）に記載の方法。

【0130】

（２６）前記疾患、状態、または病気が、ＨＳＶであり、前記標的抗原部位が、配列番号８３～１０６からなる群より選択されるＨＳＶ由来のＣＴＬエピトープである、（２４）に記載の方法。

【0131】

（２７）前記疾患、状態、または病気が、ＦＭＤＶであり、前記標的抗原部位が、配列番号１０７～１２３からなる群より選択されるＦＭＤＶ由来のＣＴＬエピトープである、（２４）に記載の方法。

【0132】

（２８）前記疾患、状態、または病気が、ＰＲＲＳＶであり、前記標的抗原部位が、配列番号１２４～１４２からなる群より選択されるＰＲＲＳＶ由来のＣＴＬエピトープである、（２４）に記載の方法。

【0133】

（２９）前記疾患、状態、または病気が、ＣＳＦＶであり、前記標的抗原部位が、配列番号１４３～１４４からなる群より選択されるＣＳＦＶ由来のＣＴＬエピトープである、（２４）に記載の方法。

【0134】

（３０）前記疾患、状態、または病気が、ＣＳＦＶであり、前記標的抗原部位が、配列番号１４３～１４４からなる群より選択されるＣＳＦＶ由来のＣＴＬエピトープである、（２４）に記載の方法。

【0135】

（３１）前記疾患、状態、または病気が、がんであり、前記標的抗原部位は、ＧＤ３、ＧＤ２、Ｇｌｏｂｏ－Ｈ、ＧＭ２、フコシルＧＭ１、ＧＭ２、ＰＳＡ、Ｌｅｙ、Ｌｅｘ、ＳＬｅｘ、ＳＬｅａ、Ｔｎ、ＴＦ、及びＳＴｎからなる群より選択されるＴＡＣＡである、（２４）に記載の方法。

【0136】

（３２）前記疾患、状態、または病気ががんであり、前記標的抗原部位が、配列番号７３～７５からなる群より選択される新抗原由来のＢ細胞エピトープである、（２４）に記載の方法。

【0137】

（３３）対象の免疫応答を調整するための方法であって、
（ａ）前記標的抗原部位が、一定のままであり、各ペプチド免疫原構築物上の前記Ｔｈエピトープが異なる、（１１）に記載の複数のペプチド免疫原構築物を調製すること、
（ｂ）複数の医薬組成物を調製することであって、このそれぞれが、（ａ）で調製された前記ペプチド免疫原構築物の１つ及び薬学的に許容されるアジュバントまたは担体を含む、前記複数の医薬組成物を調製すること、
（ｃ）異なる対象に（ｂ）で調製された前記各医薬組成物を投与すること、
（ｄ）前記対象のそれぞれの免疫応答を監視すること、ならびに
（ｅ）所望の免疫応答を生じる前記医薬組成物を選択すること、
を含む、前記方法。

【0138】

（３４）前記各医薬組成物中の前記薬学的に許容されるアジュバントまたは担体が同じである、（３３）に記載の方法。
（３５）前記各医薬組成物中の前記薬学的に許容されるアジュバントまたは担体が異なる、（３３）に記載の方法。

【実施例】

【0139】

実施例１
ペプチド及びペプチド免疫原構築物の調製
ペプチド免疫原構築物を含むペプチドは、自動固相合成を使用して合成し、分取ＨＰＬＣで精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析、アミノ酸分析、及び逆相ＨＰＬＣで特性決定した。

【0140】

Ａβワクチン（ＵＢ－３１１）は、２つのペプチド免疫原を含み、それぞれが、Ｎ末端Ａβ_１－１４ペプチドを有し、アミノ酸スペーサーを介して、２つの病原体タンパク質であるＢ型肝炎表面抗原及び麻疹ウイルス融合タンパク質に由来する異なるＴｈ細胞エピトープペプチド（ＵＢＩＴｈ（登録商標）エピトープ）に合成的に結合している。具体的には、麻疹ウイルス融合タンパク質に結合しているペプチド免疫原は、Ａβ_１－１４－εＫ－ＫＫＫ－ＭｖＦ５ Ｔｈ（配列番号６７）であり、Ｂ型肝炎表面抗原に結合しているペプチド免疫原は、Ａβ_１－１４－εＫ－ＨＢｓＡｇ３ Ｔｈ（配列番号６８）であった。

【0141】

ＵＢ－３１１は、ミョウバン含有Ｔｈ２バイアス送達システムに製剤化し、等モル比でペプチドＡβ_１－１４－εＫ－ＨＢｓＡｇ３及びＡβ_１－１４－εＫ－ＫＫＫ－ＭｖＦ５ Ｔｈを含有していた。２つのＡβ免疫原をポリアニオン性ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合して、ミクロンサイズの粒子の安定した免疫刺激複合体を形成した。等張化用の塩化ナトリウム及び防腐剤としての０．２５％の２－フェノキシエタノールとともに、アルミニウム無機塩（ＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標））を最終製剤に添加した。

【0142】

いくつかの例示的な標的抗原部位（Ｂ細胞エピトープ及びＣＴＬエピトープ）の配列が、それぞれ、表３Ａ及び３Ｂに示される。Ｔｈエピトープに共有結合している標的抗原部位として、Ａβ_１－１４、ラットＩＬ－６_{７２－８２}、及びＩｇＥ－ＥＭＰＤ_１－３９を含有するいくつかの例示的なペプチド免疫原構築物の配列が表４に示される。様々なＴｈエピトープに共有結合しているα－シヌクレイン_{１１１－１３２}を含有するペプチド免疫原構築物の配列が表５に示される。様々なＴｈエピトープに共有結合しているＩｇＥ－ＥＭＰＤ_{Ｇ１－Ｃ３９}を含有するペプチド免疫原構築物の配列が表６に示される。様々なＴｈエピトープに共有結合しているヒトＩＬ－６_{７３－８３}を含有するペプチド免疫原構築物の配列が表７に示される。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１に共有結合しているジペプチドリピート（ＤＰＲ）配列を含有するペプチド免疫原構築物の配列が表９に示される。様々なＴｈエピトープに共有結合しているＬＨＲＨを含有するペプチド免疫原構築物の配列が表１０に示される。

【0143】

実施例２
病原体由来の異種Ｔヘルパーエピトープの評価、ならびに、選択されたＢエピトープペプチドの免疫原性を強化するアルファ－シヌクレイン_{１１１－１３２}、ＩｇＥ ＥＭＰＤ_１－３９、及びＩＬ－６_{７３－８３}ペプチド免疫原構築物の設計へのそれらの組込み
ａ．ペプチド免疫原合成
機能特性について広範に特性決定されている、アルファ－シヌクレイン（ＡＡ １１１－１３２；配列番号６１）；ＩｇＥ ＥＭＰＤ（ＡＡ １－３９；配列番号６２）；及びＩＬ－６（ＡＡ ７３－８３；配列番号１４５）由来の３つの短いＢ細胞エピトープペプチドを、代表的な標的抗原部位として使用した。これらの３つのＢ細胞エピトープを、以下に示される式に従うペプチド免疫原構築物にして、代表的な無差別人工Ｔｈエピトープ（配列番号１～５２から選択）が３つの個々の標的抗原部位を免疫原性にする能力を評価した。
（Ｔｈ）_ｍ－（Ｂ）_ｏ－（標的抗原部位）－Ｘ
（式中、
Ｔｈは、本明細書に開示の人工Ｔｈエピトープから選択され、ｍは、１であり、
（Ｂ）_ｏは、配列番号５３または５４のアミノ酸配列を有するスペーサーであり、
標的抗原部位は、配列番号６１、６２、または１４５のＢ細胞エピトープであり、
Ｘは、アミノ酸－ＣＯＮＨ_２であった）。

【0144】

生成されたα－シヌクレイン、ＩｇＥ ＥＭＰＤ、及びＩＬ－６ペプチド免疫原構築物のアミノ酸配列が、それぞれ、表５、６、及び７に示される。

【0145】

ｂ．ペプチド免疫原構築物を含有する製剤及び免疫化
代表的な免疫原性研究をモルモットで行い、表１に示されるそれぞれの異種Ｔヘルパーエピトープの相対的な有効性を評価した。様々なα－シヌクレイン、ＩｇＥ ＥＭＰＤ、及びＩＬ－６ペプチド免疫原が生成された後、同じＴｈエピトープ配列を含有する構築物を、表８に示される１：１：１の比で一緒に混合した。例えば、表８に示される配合物番号１を調製するために、ＵＢＩＴＨ（登録商標）１エピトープ（配列番号１４９、１７８、及び２０７）を含有するα－シヌクレイン、ＩｇＥ ＥＭＰＤ、及びＩＬ－６構築物を一緒に混合した。α－シヌクレイン、ＩｇＥ ＥＭＰＤ、及びＩＬ－６ペプチド免疫原構築物の混合物を、アジュバントＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５０Ｖ２と混合し、次に、ＣｐＧ３オリゴヌクレオチドを使用して安定化免疫刺激複合体として製剤化した。表８に示される２９の製剤のそれぞれは、０．５ｍＬの容量に合計１３５μｇのペプチド（ペプチドあたり４５μｇ）を含有した。

【0146】

筋肉内（ｉ．ｍ．）注射により、初回免疫の０、３、及び６週間後（ｗｐｉ）に、製剤をモルモット（群あたり３匹）に投与した。抗体力価レベルを評価するために、血清サンプルを、０、３、６、及び８ｗｐｉに採取した。

【0147】

ｃ．免疫原性の結果
初回免疫の８週間後（８ｗｐｉ）に得られた結果を使用して、異なるα－シヌクレイン（図３上部パネル）、ＩｇＥ（図３下部パネル）、及びＩＬ－６（表１５）ペプチド免疫原構築物を評価した。α－シヌクレインの研究を通じて得られた免疫原性データを含有するグラフが図４Ａに示され；ＩｇＥ－ＥＭＰＤが図５に示され；ＩＬ－６が図６に示される。

【0148】

全てのＴｈエピトープは、３つの短いＢ細胞エピトープペプチドの免疫原性を様々な程度に強化することができた。具体的には、Ｔｈエピトープ：ＫＫＫＭｖＦ３ Ｔｈ（配列番号１３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ ＴＴ２ Ｔｈ（配列番号３６）、ＥＢＶ ＥＢＮＡ－１ Ｔｈ（配列番号４２）、ＭｖＦ５ Ｔｈ；ＵＢＩＴｈ（登録商標）１（配列番号１７）、ＥＢＶ ＢＨＲＦ１ Ｔｈ（配列番号４１）、ＭｖＦ４ Ｔｈ；ＵＢＩＴｈ（登録商標）３（配列番号１６）、及びコレラ毒素Ｔｈ（配列番号３３）により、α－シヌクレインペプチド（配列番号６１）の免疫原性が他のＴｈエピトープよりも強化された（図３上部パネル及び図４Ａ）。これらのペプチド免疫原構築物は、表５中、それぞれ、製剤番号１３、２２、２１、０１、１９、０３、及び１１で表される。

【0149】

ＩｇＥ ＥＭＰＤペプチド（配列番号６２）では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ ＴＴ４ Ｔｈ（配列番号３８）、ＵＢＩＴｈ（登録商標）１（配列番号１７）、ＵＢＩＴｈ（登録商標）３（配列番号１６）、ＨＢｓＡｇ１ Ｔｈ；ＳＳＡＬ２ Ｔｈ２（配列番号２４）、ＫＫＫＭｖＦ３ Ｔｈ（配列番号１３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ ＴＴ２ Ｔｈ（配列番号３６）、コレラ毒素Ｔｈ（配列番号３３）、ＥＢＶ ＢＨＲＦ１ Ｔｈ（配列番号４１）、及びＨＢｓＡｇ３ Ｔｈ；ＵＢＩＴＨ（登録商標）２（配列番号２８）のＴｈエピトープにより、ＩｇＥ ＥＭＰＤの免疫原性が他のＴｈエピトープよりも強化された（図３の下部パネル及び図５）。これらのペプチド免疫原構築物は、表６中、それぞれ、製剤番号２４、０１、０３、１４、１３、２２、１１、１９、及び０２で表される。

【0150】

ＩＬ－６_{７３－８３}環状ペプチド（配列番号１４５）では、ＨＢｓＡｇ３ Ｔｈ；ＵＢＩＴＨ（登録商標）２（配列番号２８）、ＵＢＩＴｈ（登録商標）１（配列番号１７）、ＵＢＩＴｈ（登録商標）３（配列番号１６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ ＴＴ１ Ｔｈ（配列番号３４）、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ ＴＴ４ Ｔｈ（配列番号３８）のＴｈエピトープは、ＩＬ－６の得られる免疫原性を強化するのに最も強力であることが判明した（表１５及び図６）。これらのペプチド免疫原構築物は、表７中に、それぞれ製剤番号０２、０１、０３、２０、及び２４で表される。

【0151】

これらの結果は、本明細書に開示の異なる人工Ｔｈエピトープを使用する場合、単一の標的Ｂ細胞エピトープに対する異なる免疫原性を得ることができることを示す。霊長類を含む異なる種における各ペプチド免疫原構築物の免疫原性の慎重な較正が、最終的なＴｈペプチドの選択及び最終ワクチン製剤の開発における成功を保証するために必要である。

【0152】

ｃ．Ｃ _ｍａｘ までの速度
異なるＴｈエピトープに共有結合しているα－シヌクレインペプチド免疫原構築物の免疫原性データのさらなる分析により、いかにＴｈエピトープが利用されるかに応じて、特定のＣ_ｍａｘが異なる速度で達成することができることを明らかになる。図４Ｂには、図４Ａで報告された免疫原性データのサブセットが含有される。具体的には、α－シヌクレインペプチド（配列番号６１）に共有結合しているＫＫＫＭｖＦ３ Ｔｈ（配列番号１３）及びＥＢＶ ＥＢＮＡ－１ Ｔｈ（配列番号４２）のＴｈエピトープを含有する製剤番号１３及び２１で免疫化されたモルモットは、８ｗｐｉまで同じＣ_ｍａｘを達成するが、異なる速度で達成する。特に、ＫＫＫＭｖＦ３ Ｔｈ（配列番号１３）を含有するα－シヌクレインペプチド免疫原構築物は、ＥＢＶ ＥＢＮＡ－１Ｔｈ（配列番号４２）を含有するα－シヌクレインペプチド免疫原構築物よりも速く、Ｃ_ｍａｘに到達する。同様に、ＵＢＩＴｈ（登録商標）１（配列番号１７）を含有するα－シヌクレインペプチド免疫原構築物は、ＥＢＶ ＢＨＲＦ１ Ｔｈ（配列番号４１）を含有するα－シヌクレインペプチド免疫原構築物よりも速く、Ｃ_ｍａｘに到達し；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ ＴＴ１ Ｔｈ（配列番号３４）を含有するα－シヌクレインペプチド免疫原構築物は、インフルエンザＭＰ１＿１ Ｔｈ（配列番号４８）を含有するα－シヌクレインペプチド免疫原構築物よりも速く、Ｃ_ｍａｘに到達する。図４Ｂに示される結果は、Ｔｈエピトープの選択が、抗体力価がＣ_ｍａｘに到達する速度に影響を及ぼし得ることを示す。

【0153】

ｄ．概要
この実験の結果は、ペプチド免疫原構築物により誘発される免疫応答（抗体力価、Ｃ_ｍａｘ、抗体産生の開始、応答期間などを含む）は、Ｂ細胞のエピトープに化学結合しているＴｈエピトープの選択により調節することができることを示す。それ故、標的抗原部位に対する特異的免疫応答は、ペプチド免疫原構築物中のＢ細胞エピトープにコンジュゲートされるＴｈエピトープを変化させることによって設計することができ、これにより、任意の患者または対象の個々の特性に個別化医療を調整することが容易になり得る。

【0154】

実施例３
ペプチド免疫原構築物の免疫原性は、Ｂ細胞エピトープ配列の長さに依存して変動し得る
３つのジペプチドリピート（ＤＰＲ）ペプチド免疫原構築物の免疫化及び評価は、以下に詳細に記載される。

【0155】

ａ．予防接種及び血清の収集
表９に示される配列番号２３６、２３７、及び２３８のアミノ酸配列を有する３つのＤＰＲペプチド免疫原構築物を生成した。各ペプチド免疫原をＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１及びＣｐＧで製剤化して、初回免疫として４００μｇ／ｍｌの用量で、ならびに注射の３、６、９、及び１２週間後（ＷＰＩ）に追加免疫用量として１００μｇ／ｍｌでモルモットを免疫化した（１群あたり３匹のモルモット）。

【0156】

ｂ．抗体力価の評価
ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、デザイナーＤＰＲペプチド免疫原構築物の免疫原性を評価した。ＤＰＲ Ｂ細胞エピトープペプチドまたはペプチド免疫原構築物を使用して、標的ペプチドとして役立つプレートウェルをコーティングした。モルモットの免疫血清を、１０倍段階希釈により１：１００から１：１００，０００に希釈した。カットオフＡ_４５０を０．５に設定したＡ４５０ｎｍの線形回帰分析により、Ｌｏｇ１０として表される試験された血清の力価を計算した。全てのペプチド免疫原は、プレートウェルでコーティングされたＢエピトープペプチドに対して強い免疫原性力価を誘導した。

【0157】

ｃ．抗体特異性分析のためのペプチドベースのＥＬＩＳＡ試験
免疫血清試料を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイを、以下のように開発した。

【0158】

１０ｍＭのＮａＨＣＯ_３緩衝液ｐＨ９．５中２μｇ／ｍＬで動物を免疫するために使用された１００μＬの同じＤＰＲペプチド免疫原構築物（すなわち、配列番号２３６、２３７、または２３８）で９６ウェルプレートのウェルを３７℃で１時間、個別にコーティングした。

【0159】

ｄ．ＥＬＩＳＡ試験によるＤＰＲに対する抗体反応性の評価
非特異的タンパク質結合部位をブロックするために１時間３７℃で、ＰＢＳ中の３重量％ゼラチン２５０μＬとともに、ペプチドでコーティングされたウェルをインキュベートし、続いて、０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、乾燥させた。分析されるべき血清を、２０体積％の正常なヤギ血清、１重量％のゼラチン、及び０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有するＰＢＳで（別途記載のない限り）１：２０に希釈した。希釈された標本（例えば、血清、血漿）の１００マイクロリットル（１００μＬ）を各ウェルに添加し、３７℃で６０分間反応させた。次に、未結合抗体を除去するために、ＰＢＳ中０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０で、ウェルを６回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート種（例えば、マウス、モルモット、またはヒト）特異的ヤギ抗ＩｇＧを標識トレーサーとして使用して、陽性ウェルで形成された抗体／ペプチド抗原複合体と結合させた。予め滴定された最適の希釈の、ＰＢＳ中０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む１体積％の正常ヤギ血清中の、１００マイクロリットルのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ＩｇＧを、各ウェルに添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０でウェルを６回洗浄し、未結合抗体を除去し、クエン酸ナトリウム緩衝液中の０．０４重量％の３’，３’，５’，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及び０．１２体積％の過酸化水素を含有する基質混合物１００μＬとさらに１５分間反応させた。この基質混合物を使用して、着色生成物を形成することによってペルオキシダーゼ標識を検出した。１．０ＭのＨ_２ＳＯ_４ １００μＬを添加することによって、反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度（Ａ_４５０）を決定した。様々なＤＰＲ由来ペプチド免疫原を投与された免疫動物の抗体力価の決定のために、１：１００から１：１０，０００への血清の１０倍段階希釈を試験し、カットオフＡ_４５０を０．５に設定したＡ_４５０の線形回帰分析で、Ｌｏｇ_１０として表される試験血清の力価を計算した。

【0160】

ｅ．免疫原性の評価
動物由来の免疫前及び免疫血清試料を実験免疫化プロトコールに従って収集し、５６℃で３０分間加熱して、血清補体因子を不活性化した。ＤＰＲペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物の投与後、プロトコールに従って血液試料を得、特定の標的部位（複数可）に対する免疫原性を評価した。連続希釈した血清を試験し、陽性力価を逆希釈のＬｏｇ_１０として表した。所望のＢ細胞応答の強化を提供するために利用されるＴｈエピトープに対する低い～無視できる抗体反応性を維持しながら、標的抗原内の所望のエピトープ特異性に対する高力価のＢ細胞抗体応答を誘発する能力について、特定の医薬組成物の免疫原性を評価した。

【0161】

ｆ．マウス免疫血清中のＤＰＲレベルのイムノアッセイ
抗ＤＰＲ抗体を捕捉抗体として、ビオチン標識抗ＤＰＲ抗体を検出抗体として使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｃｌｏｕｄ－ｃｌｏｎ、ＳＥＢ２２２Ｍｕ）によって、ＤＰＲ由来ペプチド免疫原を投与されたマウスの血清ＤＰＲレベルを測定した。要約すると、抗体を、９６ウェルプレート上、コーティング緩衝液（１５ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３、３５ｍＭのＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．６）中の１００ｎｇ／ウェルで固定し、４℃で一晩インキュベートした。２００μＬ／ウェルのアッセイ希釈剤（ＰＢＳ中の０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、０．０２％のＰｒｏＣｌｉｎ３００）を用いて、コーティングされたウェルを室温で１時間ブロックした。プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。精製された組み換えＤＰＲを使用して、５％のマウス血清を含むアッセイ希釈液に標準曲線（２倍連続希釈により１５６～１，２５０ｎｇ／ｍＬの範囲に及ぶ）を作成した。５０マイクロリットル（５０μＬ）の希釈した血清（１：２０）及び標準液をコーティングされたウェルに添加した。インキュベーションを室温で１時間実施した。全てのウェルを吸引し、２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で６回洗浄した。捕捉されたＤＰＲを、１００μＬの検出抗体溶液（アッセイ希釈液中５０ｎｇ／ｍｌのビオチン標識ＨＰ６０２９）とともに室温で１時間インキュベートした。次に、ストレプトアビジンポリ－ＨＲＰ（１：１０，０００希釈、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、結合したビオチン－ＨＰ６０２９を１時間（１００μＬ／ウェル）検出した。全てのウェルを吸引し、２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で６回洗浄し、１００μＬ／ウェルの１ＭのＨ_２ＳＯ_４を加えることによって反応を停止した。４つのパラメーターロジスティック曲線フィットを生成するＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用することによって標準曲線を作成して、全ての試験された試料中のＤＰＲの濃度を計算するために使用した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用することによって、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定を使用して、データを比較した。

【0162】

ｇ．抗ＤＰＲ抗体の精製
アフィニティーカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を使用することによって、異なる配列（配列番号２３６、２３７、または２３８）のペプチドを含有するＤＰＲペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットまたはマウスの注射の３～１５週間後（ＷＰＩ）に収集された血清から抗ＤＰＲ抗体を精製した。簡潔には、緩衝液（０．１Ｍのリン酸及び０．１５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）で平衡化した後、４００μＬの血清をＮａｂプロテインＧスピンカラムに添加し、１０分間エンド－オーバー－エンド混合し、１分間５，８００ｘｇの遠心分離を行った。カラムを結合緩衝液（４００μＬ）で３回洗浄した。その後、溶出緩衝液（４００μＬ、０．１ＭのグリシンｐＨ２．０）をスピンカラムに添加して、５，８００ｘｇで１分間遠心分離した後に抗体を溶出させた。溶出した抗体を中和緩衝液（４００μＬ、０．１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０）と混合し、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を標準として用いてＯＤ２８０のＮａｎ－Ｄｒｏｐを使用することによって、これらの精製抗体の濃度を測定した。

【0163】

ｈ．結果
免疫化されたモルモット血清由来のＤＰＲペプチドまたはペプチド免疫原に対する免疫原性力価をＥＬＩＳＡにより評価した。

【0164】

図７は、３つの異なるＤＰＲペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの１５週間にわたる抗血清の特性を示す。０、３、６、９、１２、及び１５ｗｐｉのモルモットの抗血清を１０倍段階希釈で希釈した。ＥＬＩＳＡプレートをＤＰＲペプチドまたはペプチド免疫原でコーティングした。カットオフＡ_４５０を０．５に設定したＡ４５０ｎｍの線形回帰分析により、Ｌｏｇ_１０として表される試験血清の力価を計算した。

【0165】

次に、ポリＧＡペプチド（配列番号２３６、２３７、及び２３８）を含有するＤＰＲペプチド免疫原構築物のＥＬＩＳＡデータを、図７に示されるグラフとしてプロットし、動物を免疫するために使用された同じペプチド免疫原を分析用のＥＬＩＳＡプレートに結合させた。全てのＤＰＲ免疫原構築物は、対応するＤＰＲペプチドまたはペプチド免疫原に対して高い免疫原性を示した。ＥＬＩＳＡの結果は、検出可能な抗体力価が、０週目の免疫化の前に、各群で観察されなかったことを示した。データは、ＤＰＲペプチド免疫原構築物中のジペプチドリピートの長さが、抗体力価に中程度の影響を与え得ることを示す。具体的には、図７に示されるように、ポリＧＡ１０、１５、及び２５リピート構築物（それぞれ、配列番号２３６、２３７、及び２３８）は、互いに比較して異なる免疫原性を有する。

【0166】

興味深いことに、Ｂ細胞エピトープペプチドの長さは、ペプチド免疫原構築物の免疫原性プロファイルに影響を有し得る。図７（左のグラフ）は、ＧＡ_１０ペプチド免疫原構築物（配列番号２３６）の免疫原性が定期的な追加免疫で経時的に着実に増加することを示すが、図７（中央のグラフ）は、ＧＡ_１５ペプチド免疫原構築物（配列番号２３７）の免疫原性が減少前の約９ｗｐｉにピークに達することを示し、図７（右のグラフ）は、ＧＡ_２５ペプチド免疫原構築物（配列番号２３８）の免疫原性が定期的な追加免疫で経時的に着実に増加することを示す。

【0167】

図７の結果は、免疫応答が、ペプチド免疫原構築物で使用されるＢ細胞エピトープの長さに応じて影響を受け得ることを示す。

【0168】

ｉ．概要
この実験の結果は、ペプチド免疫原構築物で誘発される免疫応答（抗体力価、Ｃ_ｍａｘ、抗体産生の開始、応答期間などを含む）が、ペプチド免疫原構築物で使用されるＢ細胞エピトープの長さで調節することができることを示す。それ故、標的抗原部位に対する特異的免疫応答は、ペプチド免疫原構築物中のＢ細胞エピトープの長さを変化させることによって設計することができ、これにより、任意の患者または対象の個々の特性に個別化医療を調整することが容易になり得る。

【0169】

実施例４
ペプチド免疫原構築物の免疫原性は、投与されたペプチドの量及び投与レジメンに依存して変動し得る
様々な用量の免疫化及び評価、ならびにペプチド免疫原構築物の投与計画は、以下に詳細に記載される。

【0170】

ａ．ＵＢ－３１１ワクチン（Ａβペプチド免疫原）
Ａβワクチン（ＵＢ－３１１）は、２つのペプチド免疫原を含み、それぞれが、Ｎ末端Ａβ_１－１４ペプチドを有し、アミノ酸スペーサーを介して、２つの病原体タンパク質であるＢ型肝炎表面抗原及び麻疹ウイルス融合タンパク質に由来する異なるＴｈ細胞エピトープペプチド（ＵＢＩＴｈ（登録商標）エピトープ）に合成的に結合している。具体的には、麻疹ウイルス融合タンパク質に結合しているペプチド免疫原は、Ａβ_１－１４－εＫ－ＫＫＫ－ＭｖＦ５ Ｔｈ（配列番号６７）であり、Ｂ型肝炎表面抗原に結合しているペプチド免疫原は、Ａβ_１－１４－εＫ－ＨＢｓＡｇ３ Ｔｈ（配列番号６８）であった。

【0171】

ＵＢ－３１１は、ミョウバン含有Ｔｈ２バイアス送達システムに製剤化し、等モル比でペプチドＡβ_１－１４－εＫ－ＨＢｓＡｇ３及びＡβ_１－１４－εＫ－ＫＫＫ－ＭｖＦ５ Ｔｈを含有していた。２つのＡβ免疫原をポリアニオン性ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合して、ミクロンサイズの粒子の安定した免疫刺激複合体を形成した。等張化用の塩化ナトリウム及び防腐剤としての０．２５％の２－フェノキシエタノールとともに、アルミニウム無機塩（ＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標））を最終製剤に添加した。

【0172】

ｂ．モルモットにおける異なる用量のＵＢ－３１１
０μｇ、１μｇ、３μｇ、１０μｇ、３０μｇ、１００μｇ、３００μｇ、６００μｇ、及び１，０００μｇの総ペプチド免疫原構築物を含有する用量で、０、３、及び６ｗｐｉに、Ａβワクチン（ＵＢ－３１１）をモルモットに投与した。血清サンプルを、０、３、５、７、及び９ｗｐｉに採取して、抗体力価を評価した。

【0173】

図８は、各免疫投与について得られた抗体力価の結果を示すグラフである。結果は、免疫化に使用されるペプチドの量が抗体力価にかなりの影響を与え得ることを示すが、最適な技術的効果は、各用量について評価すべきである。具体的には、図８は、投与されたペプチドの用量を０μｇから６００μｇに増加させることが、免疫原性の増加に直接対応することを示す。しかし、１，０００μｇのペプチド免疫原が投与される場合、免疫原性は、ペプチド免疫原構築物の低用量と比較して、実質的に低減され得る（３００μｇ及び６００μｇを１，０００μｇと比較）。従って、ペプチド免疫原構築物により得られる最適な免疫原性は直線的ではなく、各ペプチド免疫原構築物について慎重に評価すべきである。

【0174】

ｃ．モルモットにおけるＵＢ－３１１の異なる投与計画は、免疫原性に影響を与え得る
Ａβワクチン（ＵＢ－３１１）の投与計画を評価して、初回免疫投与量及び追加免疫投与量として投与されたペプチド免疫原構築物の量が組成物の全体的な免疫原性に影響を及ぼし得るかどうかを判定した。

【0175】

ＵＢ－３１１ワクチンを、投与された異なる初回免疫及び追加免疫投与量で、０、３、及び６ｗｐｉにモルモットに投与した。具体的には、動物の第１群を、０週ＷＰＩにＵＢ－３１１の１００μｇの用量で初回免疫し、ＵＢ－３１１の４００μｇの２回用量で追加免疫したが、動物の第２群を、０週ｗｐｉにＵＢ－３１１の４００μｇの用量で初回免疫し、ＵＢ－３１１の１００μｇの２回用量で追加免疫した。この実験の結果が図９に示される。

【0176】

図９は、投与計画がＵＢ－３１１組成物の免疫原性（Ｃ_ｍａｘ及び持続時間）に影響を及ぼし得ることを示す。具体的には、低用量（１００μｇのＵＢ－３１１）で初回免疫し且つ高用量（４００μｇのＵＢ－３１１）で追加免疫した動物は、高用量（４００μｇのＵＢ－３１１）で初回免疫し且つ低用量（１００μｇのＵＢ－３１１）で追加免疫した動物と比較してより高く長いＣ_ｍａｘを達成した。

【0177】

この研究の結果は、投与計画がペプチド免疫原構築物の免疫原性に影響を与え得ることを示す。

【0178】

図１０は、投与計画がペプチド免疫原構築物の免疫原性に影響を及ぼし得るさらなる実施例を提供する。具体的には、図１０（上部パネル）は、Ａβワクチン（ＵＢ－３１１）を用いる３ヶ月の追加免疫計画（上部パネル）または６ヶ月の追加免疫計画（下部パネル）で３００μｇのＡβワクチン（ＵＢ－３１１）でヒト対象を免疫化した後に得られたＥＬＩＳＡによる抗Ａβ_１－２８抗体力価を示す。各グラフのボックス部分は、研究の全てのヒト対象の平均力価を強調する。

【0179】

図１０の結果は、異なる免疫原性プロファイルが、対象に提供される投与計画に応じて達成することができることを示す。

【0180】

ｄ．ラットにおけるＬＨＲＨペプチド免疫原構築物の異なる投与計画
異なる量のＬＨＲＨペプチド免疫原構築物を含有する製剤の投与計画を評価して、ペプチド免疫原構築物の総量が製剤の免疫原性に影響を及ぼし得るかどうかを判定した。

【0181】

具体的には、３匹のラットを、表１０に示される３つのペプチドを含有するＬＨＲＨ組成物で免疫した。ラットの第１群を、１００μｇの３つのＬＨＲＨペプチド免疫原で免疫した一方、ラットの第２群を、３００μｇの３つのＬＨＲＨペプチド免疫原で免疫した。免疫原性及びテストステロン濃度を評価し、図１１Ａ及び１１Ｂに報告される。

【0182】

図１１Ａは、１００μｇ量のＬＨＲＨ製剤でラットを免疫した後に得られた抗体力価及びテストステロン濃度を示す。図１１Ｂは、３００μｇ量のＬＨＲＨ製剤でラットを免疫した後に得られた抗体力価及びテストステロン濃度を示す。図１１Ａ及び１１Ｂは、ＬＨＲＨペプチド免疫原構築物では、３００μｇの高用量が、低用量のＬＨＲＨペプチド免疫原構築物と比較して、より高い抗ＬＨＲＨ力価及びテストステロン濃度のより高い低減をもたらすことを示す。

【0183】

それ故、図１１Ａ及び１１Ｂの結果は、ペプチド免疫原構築物の投薬量レベル及び達成される技術的効果間に直接的な相関関係があることを示す。

【0184】

ｅ．概要
この実験の結果は、ペプチド免疫原構築物により誘発される免疫応答（抗体力価、Ｃ_ｍａｘ、抗体産生の開始、応答の持続時間などを含む）は、異なる投与計画を使用することによって調節することができることを示す。それ故、標的抗原部位に対する特異的免疫応答は、患者または対象の投与計画を変化させることによって設計することができ、これにより、任意の患者または対象の個々の特性に個別化医療を調整することが容易になり得る。

【0185】

実施例５
ペプチド免疫原構築物の免疫原性は、使用されるアジュバントに依存して変動し得る
異なるアジュバントで製剤化されたＩＬ－６、ＩｇＥ ＥＭＰＤ、及びＬＨＲＨペプチド免疫原構築物の免疫化及び評価を以下に記載されるように評価した。

【0186】

ａ．ＩＬ－６ペプチド免疫原構築物
異なるアジュバントを利用するＩＬ－６ペプチド免疫原構築物を含有する製剤の免疫原性を評価した。ＣＩＡラットでのＰＯＣ研究は、関節リウマチ及び他の自己免疫疾患における潜在的な免疫療法への適用を意味するＩＬ－６誘導病因に対して高い免疫原性及び治療有効性を有する設計されたペプチド免疫原構築物を示した。以下の研究は、ペプチド免疫原構築物の最適化及びアジュバントの選択ならびにＣＩＡ Ｌｅｗｉｓラットの用量決定に焦点を当てた。

【0187】

同じペプチド免疫原（配列番号２４３）及びＣｐＧでそれぞれ製剤化された異なるアジュバントとしてのＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１及びＡＤＪＵ－ＰＨＯＳをラットＣＩＡ免疫化研究で評価した。５群のそれぞれに割り当てられた５匹のラットは、２つのアジュバント製剤のうちの１つを投与され、合計１０群は、これら２つの異なるアジュバントを投与された。－７、７、１４、２１、及び２８日目に初回免疫ならびに追加免疫で、ｉ．ｍ．経路により、０．５ｍｌ中の５、１５、４５、１５０μｇの異なる用量を処置群の全ての動物に注射し、３５日目まで臨床観察を行った。ペプチド免疫原を含まない２つの異なるアジュバントプラセボ群に、製剤中のアジュバントビヒクルのみを注射した。

【0188】

プレートウェル中でコーティングされたラットＩＬ－６組み換えタンパク質に対して、ＥＬＩＳＡにより、抗ＩＬ－６力価を測定した。結果は、２つの異なるアジュバントビヒクルを注射された２つのプラセボ群のいずれも検出可能な抗ＩＬ－６抗体力価が見られなかったことを示したが、両方のアジュバント製剤でＩＬ－６免疫原構築物（配列番号２４３）で免疫した全ての処置群は、ＥＬＩＳＡによるラットＩＬ－６に対する抗体を生じた。一般的に言えば、結果は、特に、ＩＳＡ ５１製剤を用いた群について、用量依存的な様式が観察されたことを示した（図１２）。ＩＳＡ ５１製剤は、免疫ラットにおいてＡＤＪＵＰＨＯＳ製剤よりも高い免疫応答を誘導し、ＡＤＪＵＰＨＯＳアジュバントで調製された製剤について免疫原性が４（ｌｏｇ_１０）以下であったのと比べ、ＩＳＡ ５１製剤の免疫原性は全ての投与からそれぞれ４を超えるｌｏｇ_１０値を有していた。

【0189】

図１２は、ＩＳＡ５１／ＣｐＧまたはＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ／ＣｐＧのいずれかで製剤化された異なる用量の配列番号２４３で免疫化されたラットにおける４３日間にわたる抗体応答の動態を示す。ＥＬＩＳＡプレートを組み換えラットＩＬ－６でコーティングした。血清を、４倍段階希釈により１：１００から１：４．１９ｘ１０^８に希釈した。各血清試料の４パラメーターのロジスティック曲線に非線形回帰で０．４５のカットオフを組み込むことによってＬｏｇ_１０として表される試験された血清の力価を計算した。

【0190】

この実験の結果は、アジュバントの選択がペプチド免疫原構築物の免疫原性に重要な技術的影響を有し得ることを示す。

【0191】

ｂ．ＩｇＥ ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物
異なるアジュバントを利用するＩｇＥ ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する製剤の免疫原性を評価した。マカクにおけるＰＯＣ研究は、ＩｇＥ ＥＭＰＤに対し高い免疫原性及び治療有効性を有する設計されたペプチド免疫原構築物が、潜在的な免疫療法用途を暗示する病因を誘導したことを示していた。以下の研究は、ＩｇＥ ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を使用して、ペプチド免疫原構築物の最適化及びアジュバントの選択に焦点を当てた。

【0192】

同じＩｇＥ ＥＭＰＤペプチド免疫原（配列番号１７８）及びＣｐＧで製剤化された異なるアジュバントとしてのＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ及びＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ ５１を、マカク免疫化研究で評価した。

【0193】

図１３Ａ及び１３Ｂは、異なるアジュバント中の様々な量の配列番号１７８のＩｇＥ－ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物でマカクを免疫した後に得られた抗ＩｇＥ－ＥＭＰＤ抗体力価を示すグラフを示す。図１３Ａは、ＣｐＧ３を使用する安定化免疫刺激複合体として製剤化されたアジュバントとしてＡＤＪＵＰＨＯＳを使用して得られた抗体力価を示す一方、図１３Ｂは、ＣｐＧ３を使用して安定化された免疫刺激複合体として製剤化されたアジュバントとしてＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１を使用して得られた抗体力価を示す。

【0194】

この実験の結果は、異なるアジュバントで製剤化されたＩｇＥ ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物が、ＡＤＪＵＰＨＯＳを含有する製剤と比較して、ＭＯＮＴＡＮＴＩＤＥ ＩＳＡ５１と併用した場合、より免疫原性が高いことを示す（図１３Ａ及び１３Ｂ）。それ故、異なるアジュバントの使用は、ペプチド免疫原構築物の異なる技術的効果（免疫原性）を生じ得る。

【0195】

ｃ．ＬＨＲＨペプチド免疫原構築物
異なるアジュバントを利用するＬＨＲＨペプチド免疫原構築物を含有する製剤の免疫原性を評価した。ブタにおけるＰＯＣ研究は、ＬＨＲＨに対する高い免疫原性及び治療有効性を有する設計されたペプチド免疫原構築物が、潜在的な免疫療法用途を暗示する病因を引き起こしたことを示した。以下の研究は、ペプチド免疫原構築物の最適化及びＬＨＲＨペプチド免疫原構築物を使用してアジュバントの選択に焦点を当てた。

【0196】

同じ濃度の同じＬＨＲＨペプチド免疫原（配列番号２３９～２４１）で製剤化された異なるアジュバントとしてのＥｍｕｌｓｉｇｅｎ Ｄ及びＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５０Ｖを、ブタの免疫化研究で評価した。

【0197】

図１４Ａ及び１４Ｂは、異なるアジュバント中の配列番号２３９～２４１の様々な量のＬＨＲＨペプチド免疫原構築物でブタを免疫した後に得られた抗ＬＨＲＨ抗体力価を示すグラフを示す。図１４Ａは、アジュバントとしてＥｍｕｌｓｉｇｅｎ Ｄを使用して得られた抗体力価を示す一方、図１４Ｂは、アジュバントとしてＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５０Ｖを使用して得られた抗体力価を示す。

【0198】

この実験の結果は、異なるアジュバントで製剤化されたＬＨＲＨペプチド免疫原構築物が、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ Ｄを含有する製剤と比較して、ＭＯＮＴＡＮＴＩＤＥ ＩＳＡ５０Ｖで製剤化された場合、異なる技術的効果（テストステロン濃度の低減）を有することを示す（図１５Ａ及び１４Ｂ）。それ故、異なるアジュバントの使用は、ペプチド免疫原構築物の異なる技術的効果（効果の持続時間、すなわち、この場合、イムノキャストレーション）を生じ得る。

【0199】

ｄ．概要
この実験の結果は、ペプチド免疫原構築物で誘発される免疫応答（抗体力価、Ｃ_ｍａｘ、抗体産生の開始、応答期間などを含む）が、同じ濃度のペプチド免疫原構築物を含有する製剤に使用されるアジュバントの選択で調節することができることを示す。それ故、標的抗原部位に対する特異的免疫応答は、Ｂ細胞エピトープに化学的に結合しているＴｈエピトープまたは製剤に使用されるアジュバントのいずれかを変化させることによって設計することができ、これにより、任意の患者または対象の個々の特性に個別化医療を調整することが容易になり得る。

【0200】

実施例６
Ａβペプチドを標的とするがＴｈエピトープを標的としないモルモットにおけるペプチド免疫原構築物の排他的免疫原性
０及び４週目に、ペプチド免疫構築物である等モル比で一緒に製剤化されたＡβ_１－１４－εＫ－ＫＫＫ－ＭｖＦ５（配列番号６７）及びＡβ_１－１４－εＫ－ＨＢｓＡｇ３（配列番号６８）で６匹のモルモットを免疫した。８週目に、動物から採血し、血清試料を採取して、ＥＬＩＳＡ試験により抗Ａβペプチド及び抗Ｔｈエピトープ抗体力価（ｌｏｇ_１０）を決定した。６匹のモルモット全ての抗体応答は、表１１に示されるように、２つの人工Ｔｈエピトープ（ＭｖＦ５ Ｔｈ及びＨＢｓＡｇ３ Ｔｈ）ではなくＡβ_１－４２ペプチドを特異的に標的した。

【0201】

実施例７
ＵＢ－３１１ワクチンで免疫した動物由来のヒヒ及びマカクの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）培養物における細胞性免疫応答
ＵＢ－３１１で免疫されたヒヒ及びカニクイザル由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離で分離した。ペプチド誘導性増殖及びサイトカイン産生では、細胞（ウェルあたり２×１０^５）を単独で、または添加された個々のペプチドドメイン（Ａβ_１－１４、Ａβ_１－４２、ＵＢＩＴｈ（登録商標）、及び非関連ペプチドを含む）とともに培養した。マイトジェン（ＰＨＡ、ＰＷＭ、Ｃｏｎ Ａ）を陽性対照として使用した（１％ｖ／ｖの培養液で１０μｇ／ｍＬ）。６日目に、１μＣｉの３Ｈ－チミジン（３Ｈ－ＴｄＲ）を、３つの複製培養ウェルのそれぞれに添加した。１８時間のインキュベーション後、細胞を採取し、３Ｈ－ＴｄＲの組み込みを測定した。刺激指数（Ｓ．Ｉ．）は、抗原の不存在下でのｃｐｍで除した抗原の存在下でのｃｐｍを表し；Ｓ．Ｉ．＞３．０は、有意と考えられた。

【0202】

カニクイザルＰＭＢＣ培養物由来のサイトカイン分析（ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＴＮＦα、ＩＦＮγ）を、培地のアリコート単独で、またはペプチドドメインもしくはマイトジェンの存在下で実施した。サル特異的サイトカインサンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｕ－ＣｙＴｅｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、キットの使用説明書に従って個々のサイトカインの濃度を決定した。

【0203】

免疫化された動物の１５、２１、及び２５．５週目にマカクから収集された全血から、ＰＭＢＣを単離した。様々なＡβペプチド（Ａβ_１－１４及びＡβ_１－４２）の存在下で、単離ＰＢＭＣを培養した。

【0204】

Ａβ_１－１４ペプチドを培地に添加した時、リンパ球による増殖応答は観察されなかった。しかし、Ａβ_１－４２ペプチドをＰＢＭＣ培養物に添加した時、陽性の増殖応答が見られた。

【0205】

１５、２１、及び２５．５週目に収集されたＰＢＭＣ試料を、ＡβペプチドまたはＰＨＡマイトジェンの存在下でのサイトカイン分泌についても試験した。表１２に示されるように、３つのサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦα）は、Ａβ_１－１４ペプチドではなく、全長Ａβ_１－４２ペプチドに応答して検出可能な分泌を示し、サイトカイン分泌の上方調節は、プラセボワクチン試料と比較した場合ＵＢＩＴｈ（登録商標）ＡＤワクチン処置試料で検出されなかった。Ａβペプチドの存在下で試験された他の３つのサイトカイン（ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮγ）は、全てのＰＢＭＣ培養物でアッセイ検出限界を下回った。

【0206】

Ａβ_{１７－４２}ペプチドドメインを有さず、外来Ｔヘルパーエピトープを有するＮ末端Ａβ_１－１４ペプチド免疫原のみを有するＵＢ－３１１ワクチンでマカクを免疫した。これにより、Ａβ_１－４２ペプチドの存在下、ＰＢＭＣ培養物で示される陽性増殖結果が、ＵＢ－３１１ワクチン応答とは関連しなかったが、むしろネイティブ全長Ａβに対するバックグラウンド応答であったことが示される。

【0207】

これらの結果は、Ａβ_１－１４及び外来Ｔヘルパーエピトープのみを有するＵＢ－３１１ワクチンの安全性を支持し、これにより、正常なマカクのネイティブ全長Ａβペプチドに対して潜在的な炎症性抗自己細胞媒介性免疫応答を生じないことが示される。対照的に、ＡＮ－１７９２ワクチンの臨床試験研究における脳炎と関連する有害事象は、一部では、そのワクチンの単量体または原線維／凝集Ａβ_１－４２免疫原内にＴ細胞エピトープが包含されることによるものであった。

【0208】

実施例８
ＵＢ３１１ワクチンで免疫化されたアルツハイマー病患者由来のＰＢＭＣのリンパ球増殖分析及びサイトカイン分析。
アルツハイマー病患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離で単離した。ペプチド誘導性増殖及びサイトカイン産生のために、細胞（ウェルあたり２．５ｘ１０^５）を、単独で、またはＡβ_１－１４（配列番号５６）、Ａβ_１－１６（配列番号５７）、Ａβ_１－２８（配列番号５９）、Ａβ_{１７－４２}（配列番号５８）、Ａβ_１－４２（配列番号６０）、及び無関連の３８ｍｅｒペプチド（ｐ１４１２）を含む、個々のペプチドドメインを（１０μｇ／ｍＬの最終濃度で）添加して３連で培養した。培養物を５％のＣＯ_２、３７℃で７２時間インキュベートし、次に、１００μＬの上清を各ウェルから除去し、サイトカイン分析のために－７０℃で凍結した。０．５μＣｉの^３Ｈ－チミジン（^３Ｈ－ＴｄＲ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号ＴＲＫ６３７）を含有する培地１０μｌを各ウェルに添加し、１８時間インキュベートし、続いて、液体シンチレーション計数によって放射性同位元素の組み込みを検出した。マイトジェンフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を、リンパ球増殖の陽性対照として使用した。ＡβペプチドまたはＰＨＡマイトジェンなしで単独で培養された細胞を、陰性対照及び陽性対照として使用した。３連の陰性対照培養の１分あたりの平均カウント数（ｃｐｍ）で除した、Ａβペプチドを含む３連の実験培養の平均ｃｐｍとして、刺激指数（ＳＩ）を計算し、ＳＩ＞３．０は、有意な増殖応答と考えられた。

【0209】

ａ．増殖分析
ＵＢ－３１１ワクチンで接種されたアルツハイマー病患者由来の０週目（ベースライン）及び１６週目（３回目の投与の４週間後）に収集された全血から末梢血単核細胞試料を単離し、次に、様々なＡβペプチドの不存在下または存在下で培養した。表１３に示されるように、Ａβ_１－１４、他のＡβペプチド、またはｐ１４１２（関連しない対照ペプチド）が培地に添加された場合、リンパ球による有意な増殖応答が観察されなかった。予想通り、ＰＨＡマイトジェンが培地に添加された場合、陽性増殖応答が示された。ＵＢ－３１１免疫（Ｐ＝０．８７）前後のＰＨＡと同様の応答の観察結果は、研究対象者の免疫機能の有意な変化を示唆していない（表１３）。

【0210】

統計分析。０週目及び１６週目間のリンパ球増殖の差を、対応のあるｔ検定で調べた。統計的有意性レベルが、両側検定で決定された（ｐ＜０．０５）。Ｒバージョン２．１４．１を、全ての統計分析に使用した。

【0211】

ｂ．サイトカイン分析
細胞単独を含むか、またはＡβペプチドドメインもしくはＰＨＡの存在下での培養物のアリコートで、ＰＢＭＣ培養物のサイトカイン分析（ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ）を実施した。ヒト特異的サイトカインサンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｕ－ＣｙＴｅｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、製造者の指示に従って、個々のサイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を決定した（Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（１）：７８－８１（１９９８））。

【0212】

０週目及び１６週目でＵＢ－３１１ワクチンを投与されたアルツハイマー病患者から採取されたＰＢＭＣ試料を、３日間培養された後の細胞単独（陰性対照）を含むか、またはＡβペプチド、ｐ１４１２（非関連ペプチド）もしくはＰＨＡマイトジェン（陽性対照）の存在下でのサイトカイン分泌についても試験した。キットの定量化可能な範囲は、５～３２０ｐｇ／ｍＬである。５ｐｇ／ｍＬ未満または３２０ｐｇ／ｍＬを超える任意の測定濃度は、それぞれ、定量限界未満（ＢＱＬ）または定量限界超（ＡＱＬ）と示された。しかし、統計的に考慮して、ＢＱＬまたはＡＱＬを、それぞれ、下限定量限界（５ｐｇ／ｍＬ）または上限定量限界（３２０ｐｇ／ｍＬ）と置き換えた。０週目及び１６週目の各サイトカインの平均濃度が表１４に示される。予想通り、ＩＬ－２を除いて、陽性対照であるＰＨＡの存在下でサイトカイン産生が有意に増加させた。Ａβ_１－１４または他のＡβペプチドによる刺激に応答したサイトカインの産生は、ベースライン（０週目）及び１６週目で観察されたが、ほとんどの値は、対応する陰性対照（細胞単独）と同様であった。

【0213】

免疫後の細胞性免疫応答の変化を評価するために、１６週目のベースラインからの平均サイトカイン濃度の変化は、陰性対照と比較して、対応のあるＷｉｌｃｏｘｏｎ符号順位検定で調べた。４つのサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α）は、全長Ａβ_１－４２ペプチドに応答して分泌の顕著な増加を示し；この観察は、Ａβ_１－４２凝集体の配座エピトープによるものであり得る。サイトカイン分泌の上方調節は、Ａβ_１－１４または他のＡβペプチドでは検出されなかった。

【0214】

ｃ．概要
ＵＢ－３１１ワクチンは、２つのペプチド免疫原を含有し、その各々は、Ｎ末端Ａβ_１－１４ペプチドが、それぞれ、ＭｖＦ５ Ｔｈ及びＨＢｓＡｇ３ Ｔｈエピトープに合成的に結合している。Ｉｎ ｖｉｔｒｏリンパ球増殖及びサイトカイン分析を使用して、細胞性免疫応答に対するＵＢ－３１１ワクチンの免疫化の影響を評価した。表１３に示されるように、Ａβ_１－１４ペプチドまたは他のＡβペプチドを培地に添加した場合、リンパ球による増殖応答が観察されなかった。ＵＢ－３１１ワクチンで免疫された患者のリンパ球によるサイトカイン分泌の上方調節は、Ａβ_１－１４及びＡβ_１－４２を除く他のＡβペプチドによる処置では検出されず、これは、処置前の０週レベルと比較した時の１６週目でのＵＢ－３１１免疫化後の４つのサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α）の相当の増加を誘発した（表１４）。Ｔｈ２タイプＴ細胞応答によるサイトカイン放出の増加は、上方調節がＡβ_１－１４単独では検出されなかったので、ＵＢ－３１１ワクチン応答とは無関係である可能性が高い。Ａβ_１－４２に対する応答は、Ａβ_１－４２で同定されるネイティブＴヘルパーエピトープと関連し得るネイティブＡβに対するバックグラウンド応答であると推測される。ＰＨＡに応答したＩＬ－２産生の欠如が観察され、これは、正常ヒトＰＢＭＣを用いる類似の実験条件下で、Ｋａｔｉａｌ ＲＫ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；５：７８－８１より報告された結果と一致している。結論として、これらの結果は、ＵＢ－３１１ワクチンが、第Ｉ相臨床試験に参加した軽度から中等度のアルツハイマー病患者において潜在的炎症性抗自己細胞性免疫応答を生じなかったことを示し、それにより、さらに、ＵＢ－３１１ワクチン安全性が示された。

【0215】

実施例９
無差別人工Ｔｈ応答性細胞を、陰性対照と比較して中程度の免疫原性炎症応答で正常献血者のナイーブ末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）で検出することができる
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、正常献血者のナイーブ末梢血単核細胞で無差別人工Ｔｈ応答細胞を検出して、強力なマイトジェンフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及び陰性対照と比較した場合の炎症性応答を誘発する能力を評価した。

【0216】

ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）手法を用いる。Ｔ細胞活性化の検出のために、分析物としてＩＦＮ－γまたは関連サイトカインが検出された。選択された分析物に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを、ＰＶＤＦ（ビニリデンジフルオリド）で裏打ちされたマイクロプレートにプレコートした。適切に刺激された細胞を、ウェルにピペットし、指定された期間、加湿された３７℃のＣＯ_２インキュベーターにマイクロプレートを配置した。このインキュベーション期間中、分泌細胞の直近の固定された抗体は、分泌された分析物に結合した。あらゆる細胞及び未結合物質を洗い流した後、選択分析物に特異的なビオチン化ポリクローナル抗体をウェルに添加した。あらゆる未結合ビオチン化抗体を洗浄して除去した後、ストレプトアビジンにコンジュゲートしているアルカリホスファターゼを添加した。続いて、未結合酵素を洗浄により除去し、基質溶液（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を添加した。青黒色の沈殿物が形成され、サイトカインの局在部位にスポットとして現れた。個々の各スポットは、分析物を分泌する個々の細胞を表す。スポットは、自動ＥＬＩＳｐｏｔリーダーシステムで、または実体顕微鏡を使用して手動で、計数した。

【0217】

実施されたｉｎ ｖｉｔｒｏ研究では、１０μｇ／ｍＬの培養物のＰＨＡを、陽性対照として使用した。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１（配列番号１７）及びＵＢＩＴｈ（登録商標）５（配列番号６）ペプチドを、通常の正常献血者の末梢血単核細胞に存在する応答細胞の数について試験した。配列番号３３～５２の無差別人工Ｔｈエピトープペプチドの混合物を別の陽性対照として調製した。標準的なＴ細胞刺激細胞培養条件では、培地のみを陰性対照として使用した。要約すると、マイトジェン（１０μｇ／ｍＬのＰＨＡ）、またはＴｈ抗原（１０μｇ／ｍＬのＵＢＩＴｈ（登録商標）１、ＵＢＩＴｈ（登録商標）５、またはマルチＴｈの混合物）で刺激された１００μＬ／ウェルのＰＢＭＣ（２ｘ１０^５細胞）を、ＣＯ_２インキュベーター内、３７℃で４８時間インキュベートした。ウェル／プレートの上清を収集した。プレート上の細胞を洗浄し、標的分析物であるＩＦＮ－γの検出のために処理した。

【0218】

図１５に示されるように、無差別人工ＵＢＩＴｈ（登録商標）１またはＵＢＩＴｈ（登録商標）５エピトープペプチドに対する応答性細胞について、代表的なドナー１、２、及び３を試験した。圧倒的なＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴ数は、常に、ナイーブドナー（ＰＨＡで培養されたＰＢＭＣ；数が多すぎて計数できず）で検出されたが、対照培地で培養されたＰＢＭＣは、５～５０のバックグラウンドＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ数を与えた。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１またはＵＢＩＴｈ（登録商標）５で培養されたナイーブドナーＰＢＭＣの場合、２０～約１２０の中程度のＥＬＩＳＰＯＴ数が検出された。配列番号３３～５２を有する複数のＴｈペプチドの混合物もまた、予想通り２０～約３００になるＥＬＩＳＰＯＴ数との比較のためにナイーブドナーＰＢＭＣとともに培養した。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１またはＵＢＩＴｈ（登録商標）５ペプチドで引き起こされるそのような刺激応答は、陰性対照と比較して約３～５倍である。

【0219】

要約すれば、無差別人工Ｔｈ応答細胞は、シグネチャーサイトカインを分泌することによって、Ｂ細胞抗体産生及び対応するエフェクターＴ細胞応答を助ける免疫応答を開始させるように準備ができているナイーブドナーＰＢＭＣで容易に検出することができる。本明細書では、これらのＴｈエピトープペプチドのこの刺激的性質を説明するために、一例としてＩＦＮ－γを使用した。しかし、そのような刺激性炎症応答は、ワクチン接種プロセス中に望ましくない炎症性病態生理学的応答を引き起こさないために、好適なエフェクター細胞応答（抗体産生のためのＢ細胞、標的抗原細胞の殺傷のための細胞傷害性Ｔ細胞）を開始させるのに十分に中程度である。

【0220】

実施例１０
個別化がん免疫療法のためのネオエピトープベースのペプチド免疫原構築物及びその製剤
本発明者らは、がん処置におけるＴ細胞の大変革の真っ只中にいる。ここ数年、免疫チェックポイント阻害薬（ＩＣＩ）などの新しい治療法及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ－Ｔ）などの養子細胞治療は、がんに罹患する何百万人もの人々に新たな希望をもたらしている。ＩＣＩ薬物は、自身の免疫系、特に、自身のＴ細胞が、がんと戦うことを阻止するがんにより作られた自然の障壁の克服を助ける。例えば、ＣＡＲ－Ｔ療法は、特定の腫瘍細胞に対する免疫応答を開始させるように、患者のＴ細胞を操作する。これらの新しい治療法は、より正確に腫瘍を攻撃するようＴ細胞を「教育」するように設計された将来の治療法をもたらす。

【0221】

がんに罹患する何百万人もの人々に新たな希望を与える方法として、個別化された、または新抗原のがんワクチンに関して、期待感が高まっている。新抗原は、個別化された腫瘍変異であり、ほとんどの個体の免疫系で異物と見なされる。それ故、個別化ワクチンは、これらの新抗原を標的とし、これは、腫瘍を見つけて殺すように免疫系を教育する。

【0222】

生物情報科学、プロテオミクス、細胞ベースのアッセイ、及び非標準的な方法は、真の新抗原の効率的な同定に広く適用されている。マイクロサテライト及びエクソンのミススプライシングにおける、ＩＮＤＥＬ、すなわち、短い挿入及び欠失、により形成されるＲＮＡフレームシフト（ＦＳ）バリアントは、高い免疫原性の新抗原の豊富な供給源である。

【0223】

全ての可能な（例えば、４００Ｋ）ＦＳ（フレームシフト）腫瘍由来ペプチドを含有するアレイは、患者の血液１滴からの抗体反応性の検出に適用させることができ、それにより、がんの診断及び新抗原ＣＴＬエピトープの同定用の優れたツールが提供される。

【0224】

ＭＨＣタイピングは、ＲＮＡｓｅｑを使用して実施することができるが、ＮｅｔＭＨＣ及びＮｅｔＭＨＣｐａｎは、新抗原結合親和性を予測するために使用することができる。

【0225】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＨＬＡにとらわれないアッセイでは、患者の腫瘍由来の同定された各変異を表すポリペプチドは、それ自体の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に個別に送達され、次に、これは、プロセシングされ、様々なエフェクターＴ細胞により認識される細胞表面上にペプチドを提示される。Ｔ細胞がペプチドを認識して結合する場合、サイトカイン応答が引き起こされるであろう。真の抗原は、測定し、「良い」（すなわち、もしくは刺激性）または「悪い」（すなわち、抑制性）ことが決定される。患者のＴ細胞、すなわちＣＤ４^＋（ヘルパーＴ細胞）及びＣＤ８^＋（キラーＴ細胞）の両方が応答する実際の抗原は、ネオエピトープペプチド免疫原構築物の設計のためのネオエピトープとして同定及び選択することができる。

【0226】

それ故、患者が既存の応答を有する実験的に確認された新抗原を含むことにより、患者の免疫系が既に初回免疫されている個別化がんワクチンが開発される。

【0227】

要約すると、本開示に記載の設計原理を用いる、ＢまたはＣＴＬネオエピトープを含む特定の実験的に確認された新抗原に由来するネオエピトープペプチドには、高度に免疫原性を付与することができる。選択されたネオエピトープに共有結合している無差別人工Ｔｈエピトープの関与により、そのようなネオエピトープペプチド免疫原構築物は、新抗原に対する抗体の誘導及び維持ならびにエフェクターＣＴＬ機能の誘導、ならびに持続性Ｂ及びＣＴＬ応答ならびに強力な抗腫瘍免疫をもたらすＢ及びＣＴＬ記憶細胞の生成を促進し得る。

【0228】

メラノーマ新抗原に対する選択された標的エピトープ配列、神経膠腫に対するヒストン３バリアントＨ３．３Ｋ２７Ｍ、及び結腸直腸癌に対するＫＲＡＳ（ＤからＧへの変異体）を有する代表的な公知の新抗原は、表３Ａのそれぞれ配列番号７３、７４、及び７５として示される。

【0229】

本開示の設計されたネオエピトープペプチド免疫原構築物及びその製剤は、さらに、安全性、免疫原性、及び有効性について臨床試験で評価することができ、これは、以下の３つの部分からなる：
１）疾患の証拠はないが再発のリスクが高いがん患者における、単剤療法としての安全性及び免疫原性の研究。
２）進行性または転移性固形腫瘍患者における、ＦＤＡ承認の免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせたネオエピトープワクチンの安全性、免疫原性、及び有効性の研究。
３）免疫チェックポイント阻害薬を用いる処置後に、それに応答することができないか、またはがんが進行している、再発性または難治性固形腫瘍患者における、単剤療法としてのネオエピトープワクチンの安全性、免疫原性、及び有効性の研究。

【0230】

皮膚メラノーマ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部の扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、または尿路上皮癌に対する処置（例えば、外科的切除、ネオアジュバント、及び／もしくはアジュバント化学療法、ならびに／または放射線療法）が完了しており且つＣＴまたはＭＲＩで疾患の証拠を示さない適格患者は、これらの癌免疫療法に参加し得る。

【0231】

実施例１１
がん免疫療法のための腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）－Ｂエピトープ免疫原構築物及びその製剤
腫瘍細胞は、表面オリゴ糖の不均一性、切断、及び過剰発現をもたらす異常なグリコシル化パターンにより特性決定される。糖類構造の３つの主要なカテゴリーは、図１６に示されるように、ＧＤ３、ＧＤ２、Ｇｌｏｂｏ－Ｈ、ＧＭ２、フコシルＧＭ１、ＰＳＡ、Ｌｅ^ｙ、Ｌｅ^ｘ、ＳＬｅ^ｘ、ＳＬｅ^ａ、及びＳＴｎとして示される潜在的な腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）と同定されている。
（１）ムチン関連ｏ－グリカン：Ｔｎ、ＴＦ、及びＳＴｎ
（２）ガングリオシドＧＭ３、ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、及び中性グロボシドｇｌｏｂｏｌ Ｈを含むスフィンゴ脂質
（３）血液型抗原：ＳＬｅ^ｘ、Ｌｅ^ｙＬｅ^ｘ、ＳＬｅ^ａ、及びＬｅ^ｙ

【0232】

Ｇｌｏｂｏｌ Ｈは、糖脂質として乳癌細胞表面に発現し、魅力的な腫瘍マーカーである。オリゴ糖合成へのグリカルアセンブリアプローチを使用して、Ｇｌｏｂｏｌ Ｈ六糖を合成した。Ｇｌｏｂａ Ｈは、Ｂ－ハプテンとして機能し、免疫原性ペプチド構築物を形成するために、表２に示されるＴｈヘルパーペプチドとの共有結合固定化を可能にするために、還元末端に官能基を与えることができる。このタイプの用途における開示のＴｈエピトープの使用は、Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ及びＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎにより以前に記載される、ＫＬＨまたは他の従来のキャリアタンパク質を使用する他のアプローチよりもはるかに用途が広い（ウェブサイト：ｇｌｙｃｏｐｅｄｉａ．ｅｕ／Ｈｅｔｅｒｏ－ＴＡＣＡ－ｖａｃｃｉｎｅｓ－ｂａｓｅｄ－ｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃａｒｒｉｅｒｓ）。

【0233】

各ポリペプチドのＮ末端またはタンパク質のリジン（Ｋ）残基の側鎖にある１級アミンは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド脱離基の放出を伴って安定したアミド結合を形成するために、ｐＨ７～９で、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）タイプの架橋リンカー試薬の標的として利用可能である。加えて、異なる鎖長のリンカーとともに、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）（Ｈ．Ｌ．Ｃｈｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１２ ３０（５２），７５７３－７５８１）、ｐ－ニトロフェニルエステル（ＰＮＰ）（Ｓ．Ｊ．Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０１５，４８（３），６４３－６５２）は、表２に示されるＴｈヘルパーペプチドへの重要なＴＡＣＡコンジュゲートリンカーとして機能することもできる。

【0234】

本開示の人工Ｔｈエピトープは、以下を含むがんワクチン組成物で使用することができる：（ａ）本質的にＧｌｏｂｏｌ Ｈまたはその免疫原性フラグメントのグリカンを含む免疫原性組成物；（ｂ）表２に示される無差別人工Ｔヘルパーエピトープペプチドに共有結合している免疫原性フラグメント。表２に示されるエピトープペプチド（例えば、ＵＢＩＴｈ（登録商標））は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）及びＣ末端からＮ末端への脱保護／カップリングを伴うＦｍｏｃ化学により段階的に個別に調製される。標的ペプチド配列は、それに従って構築された。

【0235】

グリカンは、固相樹脂上で直接アミド結合を形成することにより、スペーサーを含んでまたは含まずに、人工Ｔｈエピトープペプチドに結合させることができ、カップリング反応は、Ｋａｉｓｅｒ試験で監視される。２つの方策が、このカップリングに利用することができる：（１）活性化脱離基を有するグリカン誘導体の調製、続く、樹脂結合スペーサー結合Ｔｈペプチドのカップリング（Ｎ末端は、遊離アミンを有する）、または、（２）活性化エステルとなる樹脂結合Ｎ末端アミン基の変換、続く、グリカンとのカップリング反応。樹脂結合及びスペーサーＴｈペプチドにグリカンを直接カップリングすると、樹脂結合遊離アミン基上の活性化基とのより効率的なカップリング反応、続いて、標準的な樹脂が遊離する切断反応による、カップリングされたグリカンペプチドの樹脂からの放出が可能になるであろう。多糖及び長鎖ペプチドなどの２つの遊離大型分子間の立体障害は、グリカン－ペプチドカップリング反応をより困難にし、それにより、より低い効率になり、収率が低くなる。

【0236】

一部の態様では、Ｂ－ハプテン結合Ｔヘルパー担体は、表２に記載のスペーサー結合Ｔｈ－ペプチドである。

【0237】

一部の実施形態では、リンカーは、ｐ－ニトロフェニルリンカー、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドリンカー、ｐ－ニトロフェニルエステル（ＰＮＰエステル）、またはＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）である。ＮＨＳエステルは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド脱離基の放出とともに、安定したアミド結合を形成するために、ｐＨ７～９で１級アミンと反応し得る。

【0238】

以下の略語が、この実施例で使用される：ＰＮＰ：ｐ－ニトロフェニルエステル；ＮＰＣ：Ｎ－ニトロフェニルクロロホルマート；ＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベラート）；及びＮＨＳ：Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド；ＭＢＳ：ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル。

【0239】

様々な実施形態を実証する化学反応及び調製の以下のステップが含まれる（図１７～２１）。

【0240】

１．ｐ－ニトロフェニル（ＰＮＰ）基を有する活性化ＵＢＩＴｈ（登録商標）の調製
人工Ｔｈエピトープ（例えば、ＵＢＩＴｈ（登録商標））担体は、自動固相合成及びＦｍｏｃ化学で合成することができる。伸長ペプチド鎖上のＮ末端アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護後に、遊離アミノ基は、１０％のトリエチルアミンを含有するＤＭＦ溶液中の４－ニトロフェニルクロロホルマート（ＮＰＣ、１０当量）で処理することにより、活性４－ニトロフェニル基に変換することができる。得られたペプチド－樹脂混合物は、試薬及び４－ニトロフェノール残留物を除去するために、ＤＣＭ溶液で洗浄することができる。ｐ－ニトロフェニル基を有する所望の活性化ＵＢＩＴｈ（登録商標）は、グリカンとのさらなるコンジュゲーションのために得ることができる。

【0241】

２．Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を有する活性化ＵＢＩＴｈ（登録商標）の調製
ＵＢＩＴｈ（登録商標）ペプチド担体は、自動固相合成及びＦｍｏｃ化学を使用して合成することができる。伸長ペプチド鎖上のＮ末端アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護後に、遊離アミノ基は、ＤＭＦ溶液中のＤＳＳで処理することによって、活性Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドに変換することができる。得られるペプチド－樹脂は、試薬の残留物を除去するために、ＤＣＭ溶液で洗浄することができる。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基を有する所望の活性化ＵＢＩＴｈ（登録商標）は、グリカンとのさらなるコンジュゲーションのために得ることができる。

【0242】

３．Ｇｌｏｂｏｌ ＨコンジュゲートＵＢＩＴｈ（登録商標）ペプチドの合成
末端アミン基を有するＧｌｏｂｏｌ Ｈ六糖アナログ（２）の調製は、ワンポット合成方策に従って行うことができる（Ｃ．Ｙ．Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００６，１０３，１５－２０）。要約すると、Ｇｌｏｂｏｌ Ｈの溶液は、活性化ＵＢＩＴｈ（登録商標）樹脂に導入することができ、次に、穏やかに３時間混合する。樹脂からの切断及び完全な脱保護の後、粗Ｇｌｏｂｏｌ ＨコンジュゲートＵＢＩＴｈ（登録商標）ペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析計及び逆相ＨＰＬＣ分析で特性決定することができる。

【0243】

４．Ｇｌｏｂｏｌ Ｈ活性化エステルの調製
Ｇｌｏｂｏｌ Ｈヘキシルアミン（２）は、無水ＤＭＦ溶液に溶解させることができる。次に、ｐ－ニトロフェニルアジパートジエステルは、添加し、室温で２～４時間撹拌することができる。反応は、遊離アミン基の消失を確認するために、ＴＬＣ及びＫａｉｓｅｒ試験で監視することができる。ＤＭＦ溶媒は、加熱せずに減圧下で除去することができ、次に、得られた残留物は、ジクロロメタン及び０．５％の酢酸を含む水で３回抽出することができる。得られた水溶液は、濃縮し、逆相カラム（ＲＰ－Ｃ１８）クロマトグラフィー（１％の酢酸を含むＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏを用いた定組成溶出）で精製することができる。

【0244】

５．ＧＭ３活性エステルの調製
ＧＭ３ガングリオシドアナログの合成及び精製は、以前に記載されている（Jacques S, et al., J. Am. Chem. Soc., 2012 134 (10): 4521-4）。ＧＭ３アナログアミンＸ（４．５ｍｇ；５．２μｍｏｌ）は、ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（３．０当量）を添加することができる。次に、ｐ－ニトロフェニルアジパートジエステル（１０．０当量）を添加することができる。反応は、ＴＬＣ（ＣＨ_２Ｃｌ_２－ＭｅＯＨ－Ｈ_２Ｏ－ＡｃＯＨ；４：５：１：０．５）で監視して、完了させることができる。反応物のｐＨは、酢酸で５．０に調整し、続いて、トルエン（３×）と共蒸発させることができる。残留物は、濃縮することができ、得られた残留物は、１％の酢酸を含有するＭｅＯＨ－Ｈ_２Ｏの勾配を使用するＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃ１８－シリカセミ分取カラム）で精製することができる。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、ＣＤ_３ＯＤで取得することができる。

【0245】

６．Ｔｎ活性エステルの調製
糖類Ｔｎは、以前の報告（T. Toyokuni, et al., Bioorg Med Chem. 1994, 11, 1119-32；及びS. D. Scott, et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120 (48), 12474-85）に基づいて合成することができる。乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（２５ｍＬ）中のＴｎアナログ６（ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（１６０ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）、及びＥＤＣ（２６８ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）は、室温で１時間撹拌することができる。混合物は、無色シロップとしてスクシンイミド－エステル誘導体（７）を得るために、予冷Ｈ_２Ｏ（３×３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濃縮することができる。

【0246】

７．シアリルＬｅｗｉｓ ｘ（ｓＬｅ ^ｘ ）活性エステル（９）の調製
ｓＬｅ^ｘ四糖誘導体（８）の調製は、公開された合成方策（G. Kuznik, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 7 (5): 577-580, 1997）で達成することができる。ＮＰＣ（２当量）のＤＭＦ／ＤＣＭ溶液に添加された化合物（８）は、室温に温め、さらに３０分間撹拌した。濃縮された粗混合物は、ＤＣＭ及び水溶液で洗浄することができる。得られた水溶液は、減圧下で処理し、ＲＰ Ｃ１８カラムで精製することができる。

【0247】

８．糖複合体を生成する基本手順
個々の樹脂結合スペーサー組み込みＴｈペプチド上の個々のグリカンの標準カップリング反応は、カルボジイミドカップリング反応を介して、標準の固相ペプチド合成装置（複数可）により施された標準ペプチド結合形成カップリング手順に従う。

【0248】

樹脂結合グリカン－ペプチドは、標準ペプチド合成手順に従い、樹脂から取り除き、回収し、沈殿させ、凍結乾燥させることができる。

【0249】

Ｔ細胞ペプチドエピトープ（例えば、ＵＢＩＴｈ（登録商標））担体は、自動固相合成及びＦｍｏｃ化学で合成することができる。伸長ペプチド鎖上のＮ末端アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護後に、遊離アミノ基は、さらなるコンジュゲーション反応に利用可能にすることができる。活性化脱離基修飾を伴う、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＴＮ、ＧＭ３、ＳＬｅ^ｘなどの合成糖アナログは、ＤＭＦ溶液中に溶解し、ＵＢＩＴｈ（登録商標）ペプチドのＮ末端アミンとの反応のためにＳＰＰＳ系に添加することができる。反応は、Ｋａｉｓｅｒ試験で監視することができる。樹脂からの切断及び完全な脱保護の後、糖コンジュゲートＵＢＩＴｈ（登録商標）ペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析計及び逆相ＨＰＬＣ分析で特性決定することができる。

【0250】

要約すれば、この実施例では、個々のグリカンの表２に示される個々のＴｈヘルパーエピトープペプチドへの効果的なコンジュゲーションが、詳細に記載され、そのような炭水化物－ペプチド免疫原構築物が、その後のワクチン製剤のために効率的に調製されることが可能になる。人工Ｔｈエピトープを使用するこれらの炭水化物ワクチン製剤は、臨床プロトコールでのがん患者の免疫療法を可能にするために、通常がん細胞上に存在する標的化炭水化物抗原に対する集中的な抗体応答を提供し得る。

【0251】

実施例１２
ウイルス感染症に対するユニバーサルＴ細胞ワクチンの開発のための無差別人工Ｔヘルパーエピトープ（複数可）の、エフェクター細胞エピトープ（例えば、ＣＴＬエピトープ）との結合によるエフェクターＴ細胞機能の強化及びその製剤
緒言
Ｔヘルパー細胞は、表面マーカーＣＤ４を運び、ポリペプチドヘテロダイマー（例えば、α／βと称される）で構成されるＴ細胞受容体として既知の表面受容体を発現する。Ｔヘルパー細胞は、通常、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上にある、クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質と会合してウイルスペプチドを認識する。これらの相互作用により、十分に高い結合親和性を提供するＴヘルパー細胞の活性化、増殖、及び分化がもたらされる。

【0252】

Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）は、エフェクター機能を誘発及び調節する先天性免疫系及び適応免疫系の両方の細胞に、可溶性メディエーター及び受容体－リガンドの相互作用を提供する。これらの細胞は、不均一な集団であり、現在まで、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、及びＴ濾胞性ヘルパー（Ｔｆｈ）細胞を含むいくつかのサブセットが特性決定されている。Ｔ細胞ヘルパー及び細胞傷害性サブセットの成長及び機能を抑制する調節性ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）も存在する。

【0253】

エフェクターＴ細胞の各タイプは、重要な転写調節因子で制御され、細胞表面分子の異なるアレイを発現し、「シグネチャー」サイトカインを分泌し、これらは、ともに、免疫系のアーム内でそのＴ細胞サブセットの特定の役割を促進する。

【0254】

Ｔｆｈ細胞は、Ｂ細胞濾胞を目標にする固有の能力により、他のヘルパーのサブセットと区別され、Ｉｇ Ｖ領域遺伝子の体細胞超変異（ＳＨＭ）を受けており且つ抗原に対する親和性を変化させている抗原特異的Ｂ細胞への支援を提供する。Ｔｆｈ細胞は、Ｂ細胞の分化のため及びウイルスに対する高親和性のアイソタイプスイッチ抗体応答を生じるために不可欠なサイトカインＩＬ－２１を分泌する。Ｔｆｈ媒介性シグナルにより、免疫化抗原に対する親和性が高いＢ細胞が確実に選択され、次に、これは、長寿の形質細胞または記憶Ｂ細胞になるように分化し得る。ＳＨＭのプロセスを通して自己反応性Ｂ細胞クローンの出現の可能性及び選択されたクローンの寿命のために、Ｔｆｈ細胞からＢ細胞への正の選択シグナルの送達を制御するために、厳格な耐性メカニズムが存在することが最も重要である。

【0255】

Ｔｈ１細胞は、主に、細胞傷害性応答の増強に関与する。これらの細胞は、サイトカインＩＬ－２及びＩＦＮ－γの分泌を部分的に介して、細胞傷害性Ｔ細胞前駆体の成熟を刺激することによって、ウイルス感染症に対する細胞性応答を促進する。Ｔｈ１細胞は、また、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を分泌し、遅延型過敏性反応を媒介し、ＩｇＧ２ａ抗体の産生を促進する。Ｔｈ１細胞は、ウイルス感染症の部位のマクロファージ及び他のＴ細胞を活性化することによって、免疫応答を大幅に増強する。この応答は、多くのウイルス感染症の病因の認識された部分である遅延型過敏性反応の基礎である。

【0256】

Ｔｈ２及びＴｈ１７細胞を含む他のＴｈ細胞は、また、炎症または特定の抗体アイソタイプの生成を促進することによって、ウイルス感染症に対する免疫応答に寄与する。

【0257】

一部のＴ細胞は、他のＴ細胞及び／またはＢ細胞応答を下方調節し得る。調節性Ｔ細胞（Ｔ－ｒｅｇ）として既知のＣＤ４^＋Ｔ細胞の異なるサブセット。Ｔ－ｒｅｇの２つの基本タイプがある：（１）負の選択時に胸腺で産生され、主に自己免疫疾患の制御に関与すると考えられるｔＴｒｅｇ、及び、（２）免疫応答中に誘導され、免疫応答の終了及び免疫系のホメオスタシスへの回復に関与するｉＴｒｅｇ。Ｔ－ｒｅｇ細胞は、また、防御及び免疫媒介性病態間のバランスを維持するのに役立ち得る。

【0258】

ペプチドワクチン接種におけるヘルパーＴ細胞の影響は絶大である。活性化時のＣＤ４^＋Ｔヘルパー細胞は、同族Ｔヘルパーエピトープを含むことによって、強力な持続可能なＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を提供し得る。ＣＤ４ Ｔ細胞の局所免疫調節機能の観点から、標的化されたウイルスまたは腫瘍の抗原に由来する標的組織において同族の援助を活性化することが好ましい。外来抗原、さらに腫瘍関連タンパク質は多くの場合、免疫系のホットスポットとして機能する免疫原性ストレッチ（Ｔｈエピトープ）を含有する。ＢまたはエフェクターＴ細胞を標的とする選択された無差別人工Ｔｈエピトープ（例えば、ＣＴＬエピトープ）の共有結合を通してこの本発明に設計及び記載されるペプチド免疫原構築物は、最適で保護的なＣＤ８ Ｔ細胞応答の誘導用のＡＰＣ、ＣＤ４、及びＣＤ８ Ｔ細胞の密接な相互作用を促進し得る。

【0259】

ウイルス特異的ユニバーサルＴ細胞ワクチンに組み込むための標的抗原部位としてのＣＴＬエピトープペプチドの例
１．ＨＩＶ ＣＴＬワクチン構成要素：
抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）にもかかわらず、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）－１は、主に休止記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞で、安定した潜伏保有宿主中で持続する。この保有宿主は、ＨＩＶ－１感染症の治癒に対する主要な障壁を提示する。保有宿主を一掃するために、潜伏ＨＩＶ－１の薬理学的再開が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で試験されている。残っている重要な問題は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含むウイルス特異的免疫機構が、潜伏が反転した後、ＡＲＴ処置患者の感染細胞を除去し得るかどうかである。大規模なデータマイニングの後、ユニバーサルＨＩＶ Ｔ細胞ワクチンの設計に組み込まれる、表３Ｂに示されるＣＴＬエピトープを代表する特定のペプチド（配列番号７６～８２）を用いて、試験されたあらゆる慢性的に感染した患者の未変異潜伏ＨＩＶ－１からエピトープを認識し得るＣＴＬを同定した。慢性的に感染した患者は、広域スペクトルのウイルス特異的ＣＴＬ応答を保持する。本発明の無差別人工Ｔｈエピトープ（配列番号１～５２）との個別に共有結合を有するこれらのＣＴＬエピトープペプチドを組み込むこのＨＩＶユニバーサルＴ細胞ワクチンを通してこの応答の適切な追加免疫は、潜伏保有宿主の消失をもたらすことが予想される。

【0260】

２．ＨＳＶ ＣＴＬワクチン構成要素
単純ヘルペスウイルスは、高い割合の世界人口に感染し、ウイルスゲノムが感覚ニューロンに保持される潜伏感染を確立するが、ビリオンが生成されない。この潜伏状態のウイルスの周期的復活は、口及び唇の粘膜表面、生殖管、ならびに眼の角膜、少ない頻度で、皮膚及び脳に影響し得る病変をもたらす。ＨＳＶ－２は、産道からそれに罹患する新生児を死に至らしめ得；角膜ＨＳＶ－１感染症は、失明の主要な感染源であり；脳ＨＳＶ－１感染症は、致死的になり得るウイルス性脳炎の症例の約４分の１を占める。臨床試験に進んでいるＨＳＶ－１ワクチンは、主に、Ａｂ産生に設計しており、大部分の効果がなかった。証拠は、マウス及びヒトの両方においてＨＳＶ感染症を制御する上でＣＤ８^＋ Ｔ細胞の重要な役割を示唆する。

【0261】

ＨＳＶ１型（ＨＳＶ－１）は、前初期（α）、早期（β）、漏出性後期（γ１）、及び真性後期（γ２）と順番に遺伝子を発現し、ウイルスＤＮＡ合成は、γ２遺伝子発現のみに絶対的な前提条件である。γ１タンパク質糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）は、急性感染三叉神経節（ＴＧ）のＣＤ８^＋ エフェクターＴ細胞及び潜伏感染したＴＧのＣＤ８^＋メモリＴ細胞の両方の５０％が認識される強い免疫優性ＣＤ８^＋ Ｔ細胞エピトープ（ｇＢ_{４９８－５０５}）を含有する。

【0262】

大規模なデータマイニング及び完全なデータ分析により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＨＳＶ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞レパートリー全体が、ＨＳＶ ＣＴＬワクチン設計の検討に含まれていた。さらに、ＨＳＶ－１ ｇＢエピトープの異なるセットが、症状のある個体対無症状の個体のＣＤ４^＋ Ｔ細胞により認識されることが判明している。これらのうち、ｇＢ_{１６６－１８０}、ｇＢ_{６６１－６７５}、及びｇＢ_{６６６－６８０}は、自己ＨＳＶ－１及びワクシニアウイルス（ｇＢ［ＶＶｇＢ］を発現）に感染したＬＣＬを溶解させるＣＤ４^＋ ＣＴＬにより標的とされた。ｇＢ_{１６６－１８０}及びｇＢ_{６６６－６８０}は、ＨＳＶ－１－血清陽性の健康な「無症候性」個体由来のＣＤ４^＋ Ｔ細胞で優先的に認識されるようにみえたが、ｇＢ_{６６１－６７５}は、重篤な「症候性」個体由来のＣＤ４^＋ Ｔ細胞で優先的に認識されるようにみえた。効果的な免疫療法ヘルペスワクチンは、潜在的な「症候性」ｇＢ_{６６１－６７５}エピトープを除外するであろう。加えて、無症候性の個体で高度に認識される３つのＶＰ１１／１２ ＣＤ８^＋エピトープも同定し、これは、眼ヘルペスの「ヒト化」ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１トランスジェニックマウスモデルで、強力な防御免疫を誘発することが判明した。

【0263】

一連のＨＳＶ ＣＴＬエピトープは、ユニバーサルマルチエピトープベースのＨＳＶ Ｔ細胞ワクチンの開発のための、この本発明の設計に組み込まれる、表３Ｂ（配列番号８３～１０６）に示されるＣＴＬエピトープを代表する特定のペプチドを用いて同定される。

【0264】

３．ブタ産業におけるＦＭＤＶ、ＰＲＲＳＶ、及びＣＳＦＶユニバーサルＴ細胞ワクチン
口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、及びブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）は、ブタ業界で衰弱させるように働く病原体である。これらの病原体に対する効果的なワクチンの開発は、ブタ産業において実質的に重要なものである。

【0265】

ワクチン接種時に誘導された中和抗体は、疾患及びウイルス透過の制御に非常に効果的であるが、クロスサブタイプ保護を付与せず、抗原の変化により効果がなくなることがある。細胞性免疫応答、特に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の産生は、様々なウイルスに対する効率的で交差防御的なペプチドワクチンの開発における潜在力のために、多くの注目を集めている。例えば、ＣＴＬエピトープペプチドは、組み換えウイルスベクター及びペプチドワクチンを含む交差防御ヒトインフルエンザワクチンの開発に使用することができ、ＦＭＤＶ血清型Ｏについて同定されたＣＴＬエピトープペプチドは、他のＦＭＤＶ血清型に対して交差反応性であった。しかし、ほとんどの分析は、特定のウイルスタンパク質に限定され、ごく少ないＣＴＬエピトープしか同定することができなかった。

【0266】

大規模なデータマイニング、設計、合成、労働集約的で時間のかかる免疫原性及び機能アッセイ手順の後、デザイナーＣＴＬペプチドの大規模なセットの評価により、様々なＦＭＤＶ、ＰＲＲＳＶ、及びＣＳＦＶウイルスタンパク質に由来する選択されたウイルス特異的ＣＴＬエピトープの検証が可能になっている。これらのエピトープを代表する選択されたＣＴＬペプチドは、配列番号１０７～１４５を含む表３Ｂに示される。

【0267】

本発明者らの選択及び同定のプロセスでは、一部の課題を解決するために、以下のいくつかの課題：（１）遺伝的変異、（２）特定の表面タンパク質からの不完全なスクリーニング、及び（３）非ブタ白血球抗原に基づく不適切な予測を解決するようにブタウイルス配列の分析のためにバイオインフォマティクスのパイプラインが統合された。この本発明のペプチド免疫原構築物をもたらす、無差別人工Ｔｈエピトープペプチドの適切な結合による、これらのＣＴＬエピトープペプチドの組み込みは、持続的な記憶及び長い持続時間のＣＴＬ応答を有するＴ細胞ワクチンの開発につながるであろう。頻繁に豚産業を破壊するＦＭＤＶ、ＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶ、及び他のウイルス感染に対するそのような高精度の有効なペプチドベースのブタワクチン商業的開発は、畜産業界にとって最も重要であろう。

【0268】

【表1】

【0269】

【表2】

【0270】

【表3】

【0271】

【表4】

【0272】

【表5】

【0273】

【表6】

【0274】

【表7】

【0275】

【表8】

【0276】

【表9】

【0277】

【表10】

【0278】

【表11】

【0279】

【表12】

【0280】

【表13】

【0281】

【表14】

【0282】

【表15】

【0283】

【表16】

【0284】

【表17】

【0285】

【表18】

【0286】

【表19】

【0287】

【表20】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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