特許 7555924 ヒアルロン酸架橋物、ヒアルロン酸水和ゲル、及びそれらの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-13

(45)【発行日】2024-09-25

(54)【発明の名称】ヒアルロン酸架橋物、ヒアルロン酸水和ゲル、及びそれらの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C08B 37/08 20060101AFI20240917BHJP

   C08J 3/12 20060101ALI20240917BHJP

   A61L 27/20 20060101ALN20240917BHJP

【ＦＩ】

C08B37/08 Z

C08J3/12 Z CEP

A61L27/20

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2021532294

(86)(22)【出願日】2019-12-06

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-31

(86)【国際出願番号】 KR2019017210

(87)【国際公開番号】W WO2020116999

(87)【国際公開日】2020-06-11

【審査請求日】2022-09-21

(31)【優先権主張番号】10-2018-0156801

(32)【優先日】2018-12-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2019-0161388

(32)【優先日】2019-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】516132149

【氏名又は名称】ハンミ ファーマシューティカルズ カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ソ・ジン・キム

(72)【発明者】

【氏名】セ・クウォン・キム

(72)【発明者】

【氏名】チュン・ロル・シン

(72)【発明者】

【氏名】ヒョ・スン・パク

(72)【発明者】

【氏名】ヨン・ウ・キム

(72)【発明者】

【氏名】バク・ホ・イ

(72)【発明者】

【氏名】ジュン・ヨン・キム

【審査官】鳥居 福代

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５２３３０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１３１２９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】韓国公開特許第１０－２００８－００７３４１９（ＫＲ，Ａ）

【文献】韓国公開特許第１０－２００７－０００４１５９（ＫＲ，Ａ）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１５－０００８５５６（ＫＲ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０８Ｂ ３７／０８

Ｃ０８Ｊ ３／１２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液を製造する段階と、
前記水溶液に架橋剤を添加し、ヒアルロン酸を４ないし６時間架橋反応させる段階と、
前記架橋剤の添加によってヒアルロン酸が架橋している水溶液にエタノールを添加し、ヒアルロン酸を粒子に固体化させる段階と、
ヒアルロン酸粒子を含む前記水溶液を６ないし２４時間架橋する段階
を含み、
前記水溶液にエタノールを添加する間、前記エタノールは、２０ｍＬ／ｍｉｎないし１，０００ｍＬ／ｍｉｎの速度で添加され、
ヒアルロン酸架橋物が、Ｄ９０が８０μｍ以下である粒度分布を示し、
前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、弾性が３０ないし２００Ｐａであり、粘性が１０ないし１００Ｐａである、
粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造する方法。

【請求項2】

前記エタノールを添加する間、混合液全体体積に対するエタノールの体積変化速度は、０．５％（ｖ／ｖ）／ｍｉｎないし３５％（ｖ／ｖ）／ｍｉｎである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項3】

前記架橋剤を、ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物１ｇに対し、１０μＬないし５００μＬの量で含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記水溶液と、該水溶液に添加されるエタノールとの体積比は、１：１ないし１０である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

製造されたヒアルロン酸架橋物をエタノール、またはエタノールを含む溶液で洗浄する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記ヒアルロン酸架橋物は、
Ｄ１０が２．５μｍないし６μｍ、Ｄ５０が８μｍないし２０μｍ、及びＤ９０が２５μｍないし８０μｍである粒度分布を示す、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液を製造する段階と、
前記水溶液に架橋剤を添加し、ヒアルロン酸を４ないし６時間架橋反応させる段階と、
前記架橋剤の添加によってヒアルロン酸が架橋している水溶液にエタノールを添加し、ヒアルロン酸を粒子に固体化させる段階と、
前記ヒアルロン酸粒子を含む水溶液の架橋反応を６ないし２４時間持続させ、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造する段階と、
前記製造された粉末状のヒアルロン酸架橋物を水和させる段階と、を含み、
前記水溶液にエタノールを添加する間、前記エタノールは、２０ｍＬ／ｍｉｎないし１，０００ｍＬ／ｍｉｎの速度で添加され、
前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルが、Ｄ９０が２４０μｍ以下である粒度分布を示し、
前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、弾性が３０ないし２００Ｐａであり、粘性が１０ないし１００Ｐａである、
架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの製造方法。

【請求項8】

前記水和させる段階は、
前記粉末状のヒアルロン酸架橋物を、水、または水を含む溶液に添加する、請求項７に記載の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの製造方法。

【請求項9】

前記粉末状のヒアルロン酸架橋物は、水、または水を含む溶液１ｍＬに対し、５ｍｇないし１５ｍｇに添加される、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを、フィルタを使用して濾過する段階をさらに含む、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、
Ｄ１０が２５μｍないし４０μｍ、Ｄ５０が７０μｍないし１１０μｍ、Ｄ９０が１９０μｍないし２４０μｍである粒度分布を示す、請求項７に記載の方法。

【請求項12】

架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの製造方法であって、前記方法は、
ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液を製造する段階と、
前記水溶液に架橋剤を添加し、ヒアルロン酸を４ないし６時間架橋反応させる段階と、
前記架橋剤の添加によってヒアルロン酸が架橋している水溶液にエタノールを添加し、ヒアルロン酸を粒子に固体化させる段階と、
前記ヒアルロン酸粒子を含む水溶液の架橋反応を６ないし２４時間持続させ、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造する段階と、
前記粉末状のヒアルロン酸架橋物を水和させて架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを得る段階と、
前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを濾過する段階と、を含み、
前記水溶液にエタノールを添加するとき、前記エタノールは、２０ｍＬ／ｍｉｎないし１，０００ｍＬ／ｍｉｎの速度で添加され、
濾過後に得られた前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルが、Ｄ９０が１２０μｍ以下である粒度分布を示し、
濾過後に得られた前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、弾性が３０ないし２００Ｐａであり、粘性が１０ないし１００Ｐａである、
架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの製造方法。

【請求項13】

濾過後に得られた架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、Ｄ１０が１０μｍないし３０μｍ、Ｄ５０が３５μｍないし６５μｍ、Ｄ９０が８０μｍないし１２０μｍである粒度分布を示す、請求項１２に記載の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの製造方法。

【請求項14】

前記架橋剤は、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、またはそれらの混合物である、請求項１２に記載の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒアルロン酸架橋物、ヒアルロン酸水和ゲル、及びそれらの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒアルロン酸は、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンとＤ－グルクロン酸とからなる反復単位（repeating unit）が線形で連結されている生体高分子物質であり、動物の胎盤、眼球の遊離液、関節の滑液、または鶏の鶏冠などに多く存在することと知られている。また、ヒアルロン酸は、ストレプトコッカス属微生物（例：Streptococcus equi. Streptococcus zooepidemecus）またはストレプトコッカス属微生物による発酵によっても生産されることが知られている。

【0003】

現在、米国では、１回投与だけで、６ヵ月間効果が持続されるヒアルロン酸架橋物注射剤であるＳｙｎｖｉｓｃ－ｏｎｅ（登録商標）が市販されている。Ｓｙｎｖｉｓｃ－ｏｎｅ（登録商標）は、鶏冠のヒアルロン酸を、ホルマリン含有水溶液で抽出しながら得られたヒアルロン酸架橋物を含み、ヒアルロン酸に連結されたタンパク質が、ホルマリンによって弱く架橋され、低い粘弾性を有する（特許文献１）。前述の弱く架橋されたヒアルロン酸は、さらに、架橋剤ジビニルスルホン（ＤＶＳ）によってさらに架橋され、増大された粘弾性を有するヒアルロン酸架橋物と組み合わされ、人体の関節腔に適用するのに適する粘弾性を有する複合ヒアルロン酸架橋物（Ｓｙｎｖｉｓｃ－ｏｎｅ（登録商標））を構成する。

【0004】

しかし、従来のヒアルロン酸架橋物の場合、濾過を行うことができず、ゲルに含まれた異物の除去に多くの努力が必要となり、該架橋剤の洗浄のために、大量の洗浄バッファが要求された。それに加え、従来のヒアルロン酸架橋物は、製造バッチごとに製造されたヒアルロン酸の粘弾性のような流変学的特性において、偏差が甚だしく、品質の均一性に多くの問題があった。従って、品質管理が容易ではなく、量産のために複雑な工程が必要であり、多くの費用が必要となった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】米国特許第４，７１３，４４８号明細書

【文献】大韓民国公開公報１０－２０１７－００９０９６５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の一態様は、経済的であり、量産に最適化された粉末状のヒアルロン酸架橋物の製造方法に係わるものである。

【0007】

本発明は、他の一態様は、経済的であり、量産に最適化された粉末状のヒアルロン酸架橋物に係わるものである。

【0008】

本発明のさらに他の一態様は、すぐれた流変学（レオロジー）的特性を示し、品質均一性にすぐれる架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの製造方法に係わるものである。

【0009】

本発明のさらに他の一態様は、すぐれた流変学的特性を示し、品質均一性にすぐれる架橋されたヒアルロン酸水和ゲルに係わるものである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、経済的であり、量産に最適化された粉末状のヒアルロン酸架橋物の製造方法を提供する。

【0011】

本発明の前記粉末状のヒアルロン酸架橋物の製造方法は、
ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液を製造する段階と、
前記水溶液に架橋剤を添加し、ヒアルロン酸を架橋反応させる段階と、
前記水溶液にエタノールを添加し、ヒアルロン酸を粒子に固体化させる段階と、を含む。

【0012】

一具体例において、前記架橋反応は、ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液に架橋剤を添加し、１０℃ないし４０℃、例えば、２５℃ないし３５℃で、２ないし８時間、例えば、４ないし６時間、５０ないし３５０ｒｐｍ、例えば、１５０ないし３５０ｒｐｍ、例えば、２５０ｒｐｍで撹拌しながら、架橋反応させるものでもある。

【0013】

本発明の前記方法において、前記水溶液にエタノールを添加するとき、前記エタノールの投入速度は、２０ｍＬ／ｍｉｎないし１，０００ｍＬ／ｍｉｎでもある。

【0014】

本発明の前記方法において、前記水溶液上にエタノールを添加する間、混合液全体体積に対するエタノールの体積変化速度は、０．５％（ｖ／ｖ）／ｍｉｎないし３５％（ｖ／ｖ）／ｍｉｎでもある。

【0015】

本発明の実施例において、前記水溶液は、架橋剤を、ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物１ｇに対し、１０μｌないし５００μｌの量で含んでもよい。

【0016】

本発明の実施例において、前記水溶液と、該水溶液に添加されるエタノールとの体積比は１：１ないし１０でもある。

【0017】

本発明の実施例において、ヒアルロン酸粒子を含む水溶液を架橋反応させる段階を追加して含んでもよい。前記段階は、水溶液の中に添加された架橋剤による架橋反応を持続させる段階でもある。前記段階において、ヒアルロン酸の粒子を含む水溶液は、水溶液内で反応して残った架橋剤と追加して架橋反応することができる。

【0018】

一具体例において、前記追加の架橋反応は、ヒアルロン酸の粒子を含む水溶液を、１５ないし３０℃、例えば、２５℃で、２４時間以下の間、５０ないし３５０ｒｐｍ、例えば、２５０ｒｐｍで撹拌しながら、架橋反応させるものでもある。前記追加の架橋反応における撹拌速度は、エタノール添加前の、架橋反応における撹拌速度と同一にすることができる。

【0019】

本発明の実施例において、前記架橋反応後、ヒアルロン酸粒子に固体化させて得たヒアルロン酸架橋物、または水溶液中に残った架橋剤と追加して架橋反応させて得たヒアルロン酸架橋物を、エタノール、またはエタノールを含む溶液で洗浄する段階をさらに含んでもよい。

【0020】

本発明の実施例において、前記粉末状のヒアルロン酸架橋物は、Ｄ９０が８０μｍ以下である粒度分布を示すことができる。

【0021】

本発明の実施例において、前記粉末状のヒアルロン酸架橋物は、Ｄ１０が２．５μｍないし６μｍ、Ｄ５０が８μｍないし２０μｍ及びＤ９０が２５μｍないし８０μｍである粒度分布を示すことができる

【0022】

本発明は、前述の方法によって製造された粉末状のヒアルロン酸架橋物を提供する。

【0023】

本発明の実施例において、前記ヒアルロン酸架橋物は、市販製品、例えば、Ｓｙｎｖｉｓｃ－ｏｎｅ（登録商標）と類似した粘弾性を示し、同等以上の安定性、及び同等以上の架橋変形率（ＭｏＤ：degree of modification）を示すことができる。本発明の実施例において、前記ヒアルロン酸架橋物は、天然ヒアルロン酸（ＨＡ）またはＳｙｎｖｉｓｃ－ｏｎｅ（登録商標）より、ペンダント架橋変形率（pendant ＭｏＤ）（％）、交差結合架橋変形率（crosslink ＭｏＤ）（％）及び総架橋変形率（total ＭｏＤ）（％）の上昇を示すことができる。

【0024】

本発明の実施例において、ヒアルロン酸（ＨＡ）の架橋変形率（ＭｏＤ：degree of modification）分析は、ＨＰＬＣシステムを利用することができる。前記分析方法において、多糖類（polysaccharide）であるＨＡ（グルクロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンとの反復構造）が、ヒアルロン酸分解酵素（hyaluronidase）によって分解され、さらに小さいポリマー（polymer）が形成され、架橋剤によって変形されたＨＡと、未変形のＨＡは、クロマトグラム差と変形率とを相対比較して区分することができる。前記分析方法において、ヒアルロン酸分解酵素（Streptomyces hyalurolyticusから得たヒアルロニダーゼ（hyaluronidase））を利用し、ｐＨ５．０、３６℃条件において、ヒアルロン酸（ＨＡ）を分解（digestion）した後、Dionex CarboPac ＰＡ１００（Thermo Scientific社）ＨＰＬＣカラムを利用し、ＵＶ吸光度（２３２ｎｍ）で分解された糖ユニット（saccharide unit）を測定することができる。ヒアルロン酸が分解酵素によって完全分解されれば、四量体（tetramer）と六量体（hexamer）とになり、架橋結合されたヒアルロン酸は、四量体及び六量体より若干大きい糖ユニット、そしてそれ以上のオリゴマー（oligomer）に分離され、クロマトグラムを示すことができる。各クロマトグラムの面積でもって、変形率（ＭｏＤ）を求めることができ、八量体（octamer）以上のオリゴマーのピークは、交差結合架橋変形率（crosslink ＭｏＤ）（％）で区分することができ、四量体と六量体との主ピークを除いた八量体より小さいオリゴマーのピークは、ペンダント架橋変形率（pendant ＭｏＤ）（％）で区分することができ、この二つを合わせ、総架橋変形率（total ＭｏＤ）（％）とすることができる。

【0025】

該ヒアルロン酸架橋物は、架橋反応が多く起こるほど、架橋変形率（ＭｏＤ：degree of modification）（％）の上昇を示すことができ、また過多な架橋反応によって製造されたヒアルロン酸は、十分な水を吸収することができない構造にもなる。本発明の実施例において、前記ヒアルロン酸架橋物は、０．１％ないし１０％の総架橋変形率（total ＭｏＤ）（％）を示すことができる。また、前記架橋変形率を満足するヒアルロン酸架橋物は、十分な水を吸収することができる構造を有し、十分な水和を示すことができる粘弾性値を示すことができる。

【0026】

本発明は、すぐれた流変学的特性を示しながら、品質均一性にすぐれる架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの製造方法を提供する。

【0027】

本発明の前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの製造方法は、
ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液を製造する段階と、
前記水溶液に架橋剤を添加し、ヒアルロン酸を架橋反応させる段階と、
前記水溶液にエタノールを添加し、ヒアルロン酸を粒子に固体化させる段階と、
前記ヒアルロン酸の粒子を含む水溶液の架橋反応を持続させ、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造する段階と、
前記製造された粉末状のヒアルロン酸架橋物を水和させる段階と、を含む。

【0028】

本発明の前記方法において、前記水溶液上に前記エタノール添加するとき、エタノールの投入速度が２０ｍＬ／ｍｉｎないし１，０００ｍＬ／ｍｉｎになるようにも添加される。

【0029】

本発明の前記方法において、前記水溶液上にエタノールを添加する間、混合液全体体積に対するエタノールの体積濃度変化速度は、０．５％（ｖ／ｖ）／ｍｉｎないし３５％（ｖ／ｖ）／ｍｉｎでもある。

【0030】

本発明の実施例において、前記水和させる段階は、前記粉末状のヒアルロン酸架橋物を水、または水を含む溶液に添加する段階でもある。

【0031】

本発明の実施例において、前記粉末状のヒアルロン酸架橋物は、水、または水を含む溶液１ｍＬに対し、５ｍｇないし１５ｍｇで添加されうる。

【0032】

本発明の実施例において、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、Ｄ９０が２４０μｍ以下である粒度分布を示すことができる。

【0033】

本発明の実施例において、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、Ｄ１０が２５μｍないし４０μｍ、Ｄ５０が７０μｍないし１１０μｍ、Ｄ９０が１９０μｍないし２４０μｍである粒度分布を示すことができる。

【0034】

本発明の実施例において、前記方法は、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを、フィルタを使用して濾過する段階をさらに含んでもよい。

【0035】

本発明の実施例において、前記濾過後の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、Ｄ９０が１２０μｍ以下である粒度分布を示すことができる。

【0036】

本発明の実施例において、前記濾過後の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、Ｄ１０が１０μｍないし３０μｍ、Ｄ５０が３５μｍないし６５μｍ、Ｄ９０が８０μｍないし１２０μｍである粒度分布を示すことができる。

【0037】

本発明は、前述の方法によって製造された架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを提供する。

【0038】

本発明の実施例において、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、弾性が３０ないし２００Ｐａであり、粘性が１０ないし１００Ｐａでもある。

【0039】

本発明は、無定形の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを提供する。前記ヒアルロン酸水和ゲルは、Ｘ線粉末回折パターン（ＸＲＤ）が、図５の通りでもある。

【0040】

本発明の実施例において、前記ヒアルロン酸水和ゲルは、Ｄ９０が１２０μｍ以下である粒度分布を示すことができる。

【0041】

本発明の実施例において、前記ヒアルロン酸水和ゲルの粒度分布は、Ｄ１０が１０μｍないし３０μｍであり、Ｄ５０が３５μｍないし６５μｍであり、Ｄ９０が８０μｍないし１２０μｍでもある。

【0042】

本発明の実施例において、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、弾性が３０ないし２００Ｐａであり、粘性が１０ないし１００Ｐａでもある。

【0043】

本発明の実施例において、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、弾性が１００ないし１５０Ｐａであり、粘性が１０ないし６０Ｐａでもある。

【0044】

本発明の実施例において、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、２５℃で、８ヵ月保管するとき、弾性低下率が３０％以下でもある。本発明の実施例において、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、３０℃で、８ヵ月保管するとき、弾性低下率が２５％以下でもある。本発明の実施例において、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、４０℃で、８ヵ月保管するとき、弾性低下率が４０％以下でもある。本発明の実施例において、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、６０℃で、８ヵ月保管するとき、弾性低下率が９０％以下でもある。

【0045】

本発明の実施例において、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、２５℃で、８ヵ月保管するとき、粘性低下率が３５％以下でもある。本発明の実施例において、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、３０℃で、８ヵ月保管するとき、粘性低下率が２０％以下でもある。本発明の実施例において、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、４０℃で、８ヵ月保管するとき、粘性低下率が１８％以下でもある。本発明の実施例において、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、６０℃で、８ヵ月保管するとき、粘性低下率が５０％以下でもある。

【0046】

ヒアルロン酸は、温度、酵素のような要因により、重合体鎖（polymer chain）が分解、低減され、粘弾性、流変学的特性（rheological properties）が低減され、それにより、粘性補充（viscosupplementation）性能が低下してしまう。それと比べ、架橋されたヒアルロン酸は、分解抵抗性が向上され、非架橋ヒアルロン酸対比で、体内維持期間が向上されうる。本発明の実施例において、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、ヒアルロン酸対比で、分解抵抗性が向上され、非架橋ヒアルロン酸対比で、分解抵抗性が向上されうる。

【発明の効果】

【0047】

本発明の粉末状のヒアルロン酸架橋物は、架橋程度が均一であり、少量の洗浄液で容易に洗浄が可能であり、品質均一性にすぐれる。また、前記粉末状のヒアルロン酸架橋物を使用して製造された架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、小さい気孔サイズを有するフィルタを使用して濾過が可能であり、異物を容易に除去することができ、品質均一性にすぐれる。従って、本発明による粉末状のヒアルロン酸架橋物、及びそれを使用して製造された架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、量産に適して経済的である。

【図面の簡単な説明】

【0048】

【図1】原料物質であるヒアルロン酸ナトリウム、及び実施例１－１ないし１－３による粉末状態のヒアルロン酸架橋物の粒度分布を示す図である。図１において、縦軸は、重量密度（％）であり、横軸は、粒度（μｍ）を示す。

【図2】実施例６及び実施例１０による架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの粒度分布を示す図である。図２において、縦軸は、チャネル（％）であり、横軸は、粒度（μｍ）を示す。

【図3】実施例２による粉末状態のヒアルロン酸架橋物のＸ線粉末回折分析結果を示す図である。図３において、縦軸は、強度（ｃｐｓ）を示し、横軸は、２θ（°）を示す。

【図4】実施例６による架橋されたヒアルロン酸水和ゲルのＸ線粉末回折分析結果を示す図である。図４において、縦軸は、強度（ｃｐｓ）を示し、横軸は、２θ（°）を示す。

【図5】実施例１０による濾過後の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルのＸ線粉末回折分析結果を示す図である。図５において、縦軸は、強度（ｃｐｓ）を示し、横軸は、２θ（°）を示す。

【図6】実施例１２によるヒアルロン酸水和ゲルについて測定した時間及び温度変化による弾性（２．５Ｈｚ、２５℃におけるＰａ）を示す。

【図7】実施例１２によるヒアルロン酸水和ゲルについて測定した時間及び温度変化による粘性（２．５Ｈｚ、２５℃におけるＰａ）を示す。

【図8】実施例１３によるヒアルロン酸水和ゲルについて測定した時間及び温度変化による弾性（２．５Ｈｚ、２５℃におけるＰａ）を示す。

【図9】実施例１３によるヒアルロン酸水和ゲルについて測定した時間及び温度変化による粘性（２．５Ｈｚ、２５℃におけるＰａ）を示す。

【図10】比較製品（Ｓｙｎｖｉｓｃ－ｏｎｅ（登録商標））について測定した時間及び温度変化による弾性（２．５Ｈｚ、２５℃におけるＰａ）を示す。

【図11】比較製品（Ｓｙｎｖｉｓｃ－ｏｎｅ（登録商標））について測定した時間及び温度変化による粘性（２．５Ｈｚ、２５℃におけるＰａ）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0049】

以下、本発明についてさらに詳細に説明する。

【0050】

本発明で使用される全ての技術用語は、異なって定義されない以上、本発明の関連分野で当業者が一般的に理解するような意味で使用される。また、本明細書には、望ましい方法や試料が記載されるが、それと類似しているか、あるいは同等なものも、本発明の範疇に含まれる。本明細書に参考文献として記載される全ての刊行物の内容全部は、本明細書に参照により援用される。

【0051】

本明細書において、ＤＸがＹであるというのは、粉末状のヒアルロン酸、ヒアルロン酸ゲル、または架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの粒子サイズを、累積曲線によって示すとき、粒子サイズが小さい順に累積し、Ｘ％（％は、数、体積または重量を基準に計算される）になる点の粒子サイズがＹであるということを意味する。例えば、Ｄ１０は、粉末状のヒアルロン酸、ヒアルロン酸ゲル、または架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの粒子サイズを小さい順に累積し、１０％になる点の粒子の粒子サイズを表現し、Ｄ５０は、粉末状のヒアルロン酸、ヒアルロン酸ゲル、または架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの粒子サイズを小さい順に累積し、５０％になる点の粒子の粒子サイズを表現し、Ｄ９０は、粉末状のヒアルロン酸、ヒアルロン酸ゲル、または架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの粒子サイズを小さい順に累積し、９０％になる点の粒子の粒子サイズを表現する。

【0052】

粒子サイズ分布ＤＸが、数、体積または重量のうちいずれを基準に、全体累積粒子中の百分率を示すかということは、該粒子サイズ分布測定に使用する方法によって異なる。該粒子サイズ分布を測定する方法と、それに係わる百分率の類型は、当該分野の当業者に公知である。例えば、周知のレーザ回折法によって粒子サイズ分布を測定する場合、ＤＸにおけるＸ値は、体積平均によって計算された百分率を示すことができる。特定方法によって得られた粒子サイズ分布測定結果は、一般的な実験により、経験を基にし、他の技術から得たところと相関関係にもあるということは、当該分野の当業者であるならば、熟知しているであろう。例えば、該レーザ回折法は、粒子の体積に感応し、体積平均粒度を提供するが、それは、密度が一定である場合、重量平均粒度に相当する。

【0053】

本明細書において粘弾性は、保存弾性率（Ｇ’（storage modulus））と損失弾性率（Ｇ”（loss modulus））とを意味する。前記粘弾性は、回転型レオメータで測定され、動的粘弾性測定は、直径が２０ｍｍであるジオメトリを利用し、該ジオメトリとプレート（plate）との測定距離（ＧＡＰ）は、０．５ｍｍであり、温度は、２５℃に分析終了前まで一定に維持し、コントロールプログラム（control program）でもって周波振動（frequency oscillation）を利用し、周波数の範囲を０．１～１０Ｈｚに設定し、保存弾性率及び損失弾性率を測定する。本明細書においては、保存弾性率（Ｇ’（storage modulus））で弾性で表記し、損失弾性率（Ｇ”（loss modulus））は、損失されたエネルギーを粘性で示すことができる。

【0054】

本発明の粉末状のヒアルロン酸架橋物の製造方法は、
ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液を製造する段階と、
前記水溶液に架橋剤を添加し、ヒアルロン酸を架橋反応させる段階と、
前記水溶液にエタノールを添加し、ヒアルロン酸を粒子に固体化させる段階と、を含む。

【0055】

前記方法において、水溶液にエタノールを添加するとき、前記エタノールは、一定時間にわたって徐々に添加される。

【0056】

本発明の製造方法によれば、水溶液にエタノールを一定時間にかけて徐々に添加することにより、均一な粒子サイズを有する微細な粒子状の固体ヒアルロン酸が形成され、前記固体状態のヒアルロン酸粒子が架橋剤と反応し、均一な架橋反応が進められる。それにより、架橋度が均一である粉末状のヒアルロン酸架橋物が形成され、それぞれの製造工程において、粉末レベルの微細粒子サイズを有しながら、粒子サイズ（粒度）、粘性及び弾性のような物理的物性に適し、均一なヒアルロン酸架橋物が得られるのである。その結果、最適の効果を示す粒度、粘性及び弾性を有するヒアルロン酸架橋物を再現性あるように反復して量産されるのである。

【0057】

前記水溶液にエタノールを投入する速度は、エタノール添加によって生成される固体のヒアルロン酸が粒子状に生成されうるようにも調整される。具体的には、前記エタノール投与速度による全体反応液のエタノール濃度変化速度を調節し、所望する固体のヒアルロン酸粒子サイズ及び物理的特性を有するヒアルロン酸架橋物を生産することができる。

【0058】

本発明の実施例において、前述のヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液を製造する段階は、前述のヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を塩基性物質を含むアルカリ水溶液に添加しても製造される。

【0059】

本明細書において、前記ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸自体、ヒアルロン酸の塩、またはそれらの混合物を称するのである。従って、ヒアルロン酸を含む水溶液は、ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液を意味しうる。また、ヒアルロン酸粒子は、ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を使用して形成された粒子を意味しうる。

【0060】

前記ヒアルロン酸の塩は、生体適用に適する任意の塩形態でもあり、具体的には、アルカリ塩、アルカリ土類金属塩、アミノ酸塩、有機塩基との塩、またはそれらの混合物でもある。例えば、ヒアルロン酸の塩は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸コバルト、ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム塩、ヒアルロン酸ジエタノールアミン、ヒアルロン酸シクロヘキシルアミン、及びそれらの任意の組み合わせによって構成された群のうちからも選択される。一具体例において、前記ヒアルロン酸の塩は、ヒアルロン酸ナトリウムでもある。

【0061】

前記ヒアルロン酸またはその塩の分子量は、約１００，０００Ｄａないし約６，０００，０００Ｄａでもあり、一具体例において、前述のヒアルロン酸またはヒアルロン酸ナトリウムの分子量は、約１００，０００Ｄａないし約６，０００，０００Ｄａ、具体的には、約５００，０００Ｄａないし約６，０００，０００Ｄａ、さらに具体的には、約１，０００，０００Ｄａないし約４，０００，０００Ｄａでもある。

【0062】

前記ヒアルロン酸は、当該技術分野に公知された任意のヒアルロン酸を含み、任意の原料から得たヒアルロン酸を利用することができる。前記ヒアルロン酸は、動物（例：動物胎盤、鶏冠）由来のでもあり、発酵時、ヒアルロン酸を生産することができる任意の微生物（例：ブドウ球菌属（Staphylococcus）微生物、ストレプトコッカス属（Streptococcus）微生物）由来のヒアルロン酸でもある。

【0063】

一具体例において、前記ヒアルロン酸は、微生物由来のヒアルロン酸であり、例えば、ストレプトコッカス属（Streptococcus）微生物由来のヒアルロン酸である。微生物由来のヒアルロン酸は、動物起源ヒアルロン酸のウイルス問題、あるいは原料品質の均一性問題から自由でもあり、医薬品として製造するとき、品質管理の側面ですぐれるという長所がある。

【0064】

ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液は、ヒアルロン酸架橋物の製造にも使用されることが公知である任意の塩基性物質を含むアルカリ水溶液でもある。例えば、前記アルカリ水溶液は、ｐＨ９～１３のアルカリ水溶液でもあり、前記アルカリ水溶液は、水酸化ナトリウム含有水溶液、水酸化カリウム含有水溶液またはアンモニア含有水溶液でもあり、一具体例において、前記アルカリ水溶液は、水酸化ナトリウム含有水溶液でもある。

【0065】

本発明の実施例において、ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液は、ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を、水溶液全体体積を基準に、約０．５％（ｗ／ｖ）ないし５％（ｗ／ｖ）になるように含んでもよく、具体的には、約１％（ｗ／ｖ）ないし４％（ｗ／ｖ）になるように含んでもよい。一具体例において、前述のヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液は、ヒアルロン酸ナトリウムを、約２％（ｗ／ｖ）になるように含んでもよい。

【0066】

本発明の実施例において、前記水溶液が、塩基性物質として水酸化ナトリウムを含み、ヒアルロン酸ナトリウムを添加して製造される場合、前記水溶液は、ナトリウムイオンを０．２Ｍ以上含んでもよい。

【0067】

本発明の実施例において、前記水溶液は、架橋剤をさらに含んでもよい。前記架橋剤は、１以上の官能基を有する化合物であり、具体的には、１以上のアルデヒド基、カルボジイミド基、エポキシ基またはビニルスルホン基を有する化合物でもある。さらに具体的には、前記架橋剤は、２以上のエポキシ基を有する化合物、またはジビニルソルホンでもある。例えば、前記架橋剤は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ）、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリノエチル）カルボジイミド－メト－ｐ－トルエンスルホネート、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリノエチル）カルボジイミドヒドロクロリド、グルタルアルデヒド、ジビニルスルホン（divinyl sulfone）、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ：１，４－butanediol diglycidyl ether）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ：ethylene glycol diglycidyl ether：）、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（１，６－hexanediol diglycidyl ether）、プロピレングリコールジグリシジルエーテル（propylene glycol diglycidyl ether）、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（polypropylene glycol diglycidyl ether）、ポリテトラメチレングリコールジグリシジルエーテル（polytetramethylene glycol diglycidyl ether）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（neopentyl glycol diglycidyl ether）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（polyglycerol polyglycidyl ether）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（diglycerol polyglycidyl ether）、グリセロールポリグリシジルエーテル（glycerol polyglycidyl ether）、トリメチルプロパンポリグリシジルエーテル（tri-methylpropane polyglycidyl etheｒ）、ビスエポキシプロポキシエチレン（1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene）、ペンタエリトリトールポリグリシジルエーテル（pentaerythritol polyglycidyl ether）、ソルビトールポリグリシジルエーテル（sorbitol polyglycidyl ether）、またはそれらの混合物でもあり、一具現例として、前記架橋剤は、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ジビニルスルホン、またはそれらの混合物でもある。一具現例として、前記架橋剤は、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）でもある。一具現例として、前記架橋剤は、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）でもある。

【0068】

本発明の実施例において、前記水溶液は、架橋剤を、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、またはそれらの混合物１モルに対し、０．００５モルないし１モル、具体的には、０．０１モルないし０．８モルで含んでもよい。

【0069】

本発明の実施例において、前記水溶液は、架橋剤を、ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物１ｇに対し、約１０μｌ～５００μｌ、具体的には、約５０μｌ～４００μｌで含んでもよい。

【0070】

本発明の実施例において、前記水溶液にエタノールを添加し、固体のヒアルロン酸粒子を含む混合液を製造する段階において、前記エタノールは、ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液１体積に対し、約１ないし約１０体積で添加されうる。具体的には、前記混合液の製造時、前記水溶液と添加されるエタノールの体積比は、約１：１ないし１０、さらに具体的には、約１：２ないし８でもある。前記範囲でエタノールが添加されることにより、前記固体形態のヒアルロン酸粒子を使用して製造されたヒアルロン酸ゲルに、すぐれた流変学的特性を示すことができ、関節炎の治療または予防に優秀な効果を示すことができる。

【0071】

本発明の実施例において、前述のヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液にエタノールを添加するとき、該エタノールの投入速度は、一定でもあり、あるいは変動されもする。具体的には、エタノール投入速度は、一定でもある。

【0072】

本発明の実施例において、前述のヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液にエタノールを添加する工程の間、前記水溶液とエタノールとの混合液は、継続して撹拌されうる。具体的には、前記エタノール添加工程の間、該混合液は、約５０ｒｐｍないし３００ｒｐｍ、さらに具体的には、約５０ｒｐｍないし２５０ｒｐｍで撹拌されうる。

【0073】

本発明の実施例において、前記混合液の撹拌速度は、一定でもあり、あるいは変動されもする。具体的には、前記混合液の撹拌速度は、一定でもある。

【0074】

本発明の実施例において、前記水溶液にエタノールを添加するとき、前記エタノールは、徐々に一定時間にわたっても添加される。ヒアルロン酸は、線形の高分子に、エタノールによって脱水されながら、糸（糸束）のような形態に抽出される特性がある。具体的には、前記水溶液に、エタノールは、纎維状（糸束）のヒアルロン酸固体、または塊状のヒアルロン酸固体が形成されないほど、徐々に添加されうる。さらに具体的には、水溶液に、エタノールは、ヒアルロン酸が粉末のように、微細粒子の形態に析出されうるように、徐々に添加されうる。前記エタノール添加速度が下記範囲を超える場合、纎維状のヒアルロン酸に抽出され、洗浄時、ｐＨ調節が不可能であり、洗浄が容易ではなく、最終生成物質が褐変されたり、粘弾性が低くなったりし、液体状態に生産されてしまう。前記水溶液にエタノールを添加するとき、前記エタノールの投入速度は、約２０ｍＬ／ｍｉｎないし１，０００ｍＬ／ｍｉｎでもある。具体的には、前記エタノールの投入速度は、約２０ｍＬ／ｍｉｎないし７００ｍＬ／ｍｉｎでもあり、さらに具体的には、前記エタノールの投入速度は、約２０ｍＬ／ｍｉｎないし５００ｍＬ／ｍｉｎでもある。前記速度でエタノールを投入するとき、ヒアルロン酸が塊にならず、粉末のように、微細粒子状に析出されうる。

【0075】

本発明の実施例において、前記エタノールの添加時、ヒアルロン酸含有水溶液及びエタノールを含む混合液の体積に対するエタノールの体積変化速度が、約０．５％（ｖ／ｖ）／ｍｉｎないし３５％（ｖ／ｖ）／ｍｉｎになるようにも添加される。

【0076】

そのように、エタノールが、徐々に一定時間にわたって添加される場合、均一な微細粒子の形態で、ヒアルロン酸粒子が析出されうる。

【0077】

また、均一な微細粒子の形態で得られたヒアルロン酸は、架橋反応後、エタノール、またはエタノールを含む溶液で洗浄が可能であり、洗浄の間、粉末状のヒアルロン酸架橋物が膨潤される現象がほとんどないか、あるいはそれを最小化させることができる。従って、架橋剤または不純物の洗浄時、少量の洗浄液でも洗浄が十分に可能であり、ヒアルロン酸架橋物物性の均質性を向上させることができ、量産が可能であり、経済的である。

【0078】

本発明の実施例において、前記固体ヒアルロン酸の粒子と架橋剤が反応し、架橋反応が進められ、前記架橋反応により、微細な粒子である粉末状のヒアルロン酸架橋物が形成されうる。前記微細な粒子である粉末状のヒアルロン酸架橋物は、均一な粒子サイズを有し、架橋度が均一でもある。

【0079】

本発明の実施例において、前記固体状態のヒアルロン酸粒子と、前記架橋剤との架橋反応は、約２０℃ないし４０℃で、約６ないし２４時間行われうる。前述のような反応条件により、ヒアルロン酸の分解を最小化させることができ、鎖長が長いヒアルロン酸架橋物が形成されうる。また、関節炎治療に適する架橋度を示し、すぐれた物性を有するヒアルロン酸架橋物が形成されうる。

【0080】

本発明の実施例において、微細粉末状のヒアルロン酸架橋物は、Ｄ９０が約８０μｍ以下でもある。

【0081】

本発明の実施例において、前記均一な微細粉末状のヒアルロン酸架橋物は、Ｄ１０が約２．５μｍないし６μｍであり、Ｄ５０が約８μｍないし２０μｍであり、Ｄ９０が約２５μｍないし８０μｍでもある。

【0082】

本発明の実施例において、前記微細粉末状であるヒアルロン酸架橋物の粒度は、レーザ粒度分析法によって測定され、具体的には、乾式法によっても遂行される。

【0083】

本発明の実施例において、前記粉末状のヒアルロン酸架橋物は、無定形でもあり、Ｘ線粉末回折分析パターンがハローパターンを示すことができる。具体的には、前記粉末状のヒアルロン酸架橋物は、Ｘ線粉末回折パターン（ＸＲＤ）が、図３の通りでもある。

【0084】

本発明の実施例において、前記粉末状のヒアルロン酸架橋物は、無定形であり、前記架橋物の粒子は、Ｄ１０が約２．５μｍないし６μｍであり、Ｄ５０が約８μｍないし２０μｍであり、Ｄ９０が約２５μｍないし８０μｍでもある。

【0085】

本発明の実施例において、前記架橋反応遂行後、混合液のｐＨを９未満に調節し、架橋反応を終了させることができる。例えば、前記架橋反応遂行後、塩酸（ＨＣｌ）を添加し、混合液のｐＨを６以上９未満に調整し、架橋反応を終了させることができる。

【0086】

本発明の実施例において、前記架橋反応終了後、前記微細粒子である粉末状のヒアルロン酸架橋物は、濾過を介しても得られる。すなわち、本発明の粉末状のヒアルロン酸架橋物は、粉末形態を有するので、撹拌しない場合、溶液内に沈んでおり、単純な濾過工程を介して、容易に粉末状のヒアルロン酸架橋物を液体から分離して得られる。

【0087】

本発明の実施例において、前記方法は、粉末状のヒアルロン酸架橋物を洗浄する段階をさらに含んでもよい。前記洗浄により、粉末状のヒアルロン酸架橋物に残留している架橋剤及び不純物が除去されうる。前記洗浄は、エタノール、またはエタノールを含む溶液を使用し、１回以上行われ、例えば、前記洗浄は、約７０％（ｗ／ｗ）、約９５％（ｗ／ｗ）のエタノール水溶液を使用し、数回行われる。例えば、前記得られた粉末状のヒアルロン酸架橋物は、約７０％（ｗ／ｗ）、約９５％（ｗ／ｗ）のエタノール水溶液を、互いに交換しながら、３回ないし５回にわたっても洗浄される。

【0088】

本発明の実施例において、前記洗浄段階は、ｐＨ９未満の条件下で遂行され、具体的には、ｐＨ６以上ｐＨ９未満の条件下でも遂行される。

【0089】

本発明の前記洗浄段階は、従来方法と比較し、純粋な水、またはリン酸緩衝液のような水溶液緩衝液ではなく、エタノールまたはエタノール水溶液のようなエタノールを含む溶液を使用することにより、ヒアルロン酸架橋物が洗浄される間に膨潤される現象を抑制することができ、品質管理が容易であり、洗浄段階の間、膨潤がほとんどならないか、あるいは最小化され、少量の洗浄液で、十分に架橋剤及び不純物を除去することができ、容易に量産が可能である。

【0090】

本発明の実施例において、前記方法は、洗浄後、前記粉末状のヒアルロン酸架橋物を乾燥させる段階をさらに含んでもよい。前記乾燥は、真空乾燥でもあり、約３５℃ないし約７０℃で、約１０ないし４０時間行われうる。

【0091】

本発明は、
ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液を製造する段階と、
前記水溶液に架橋剤を添加し、ヒアルロン酸を架橋反応させる段階と、
前記水溶液にエタノールを添加し、ヒアルロン酸を粒子に固体化させる段階と、を含み、
前記エタノールは、前記水溶液に、一定時間にわたり、徐々に添加される方法によって製造された粉末状のヒアルロン酸架橋物を提供する。

【0092】

前記方法は、ヒアルロン酸粒子を含む水溶液を架橋反応させる段階を追加して含むものでもある。前記段階は、ヒアルロン酸粒子を含む水溶液の架橋反応を持続させるものでもある。

【0093】

前記方法によって製造された粉末状のヒアルロン酸架橋物は、微細粒子であり、取り扱いが容易であり、架橋度が均質である。また、洗浄段階の間、膨潤されず、粉末のように、微細粒子状をそのまま維持しており、洗浄が容易であり、量産が可能である。

【0094】

また、洗浄段階の間、粉末状態の架橋物に対するＮａＯＨ、未反応物ＢＤＤＥのような架橋剤の洗浄が容易であり、ｐＨ調節が可能であり、追って、最終ゲルの適切な粘弾性を誘導することができ、ｐＨによるヒアルロン酸架橋物の変性である褐変反応を最小化させ、かつ抑制することができる。

【0095】

本発明の粉末状のヒアルロン酸架橋物の粒度分布は、Ｄ９０が約８０μｍ以下である粒度分布を示すことができる。

【0096】

本発明の前記均一な微細粉末状のヒアルロン酸架橋物は、Ｄ１０が約２．５μｍないし６μｍ、Ｄ５０が約８μｍないし２０μｍ、Ｄ９０が約２５μｍないし８０μｍである粒度分布を示すことができる。

【0097】

本発明の実施例において、前記微細粉末状のヒアルロン酸架橋物の粒度は、レーザ粒度分析法によって測定され、具体的には、乾式法によっても遂行される。

【0098】

本発明の粉末状のヒアルロン酸架橋物は、無定形でもあり、Ｘ線粉末回折分析パターンがハローパターンを示すことができる。具体的には、前記粉末状のヒアルロン酸架橋物は、Ｘ線粉末回折パターン（ＸＲＤ）が、図３の通りでもある。

【0099】

前記粉末状のヒアルロン酸架橋物の製造方法、及び前記ヒアルロン酸架橋物の物性は、前述の通りである。

【0100】

本発明は、すぐれた流変学的特性を示し、異物除去が容易であり、経済的であり、量産に最適化された架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの製造方法を提供する。

【0101】

本発明の前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの製造方法は、
ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液を製造する段階と、
前記水溶液に架橋剤を添加し、ヒアルロン酸を架橋反応させる段階と、
前記水溶液にエタノールを添加し、ヒアルロン酸を粒子に固体化させる段階と、
前記ヒアルロン酸の粒子を含む水溶液の架橋反応を持続させ、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造する段階と、
前記粉末状のヒアルロン酸架橋物を水和させる段階と、を含む。

【0102】

前記方法で水溶液にエタノールを添加するとき、前記エタノールは、前記水溶液に、一定時間にわたり、徐々に添加される。

【0103】

前記粉末状のヒアルロン酸架橋物の製造方法、及びヒアルロン酸架橋物の物性は、前述の通りである。

【0104】

本発明の製造方法によって製造された架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、関節炎の予防または治療に最適化された流変学的特性を示す。また、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、フィルタで濾過が可能であるので、異物除去が容易であり、医薬品に製剤化するとき、不純物管理が容易であり、経済性及び量産面で顕著にすぐれた長所を有する。また前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、品質均一性にすぐれ、バッチ別に製造された架橋されたヒアルロン酸ゲルの流変学的特性がほぼ同一であり、均質した物性を示し、再現性にすぐれる。

【0105】

本発明の実施例において、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの弾性率（Ｇ’（storage modulus））及び粘性率Ｇ”（loss modulus））は、人体関節補充液としての使用に適する範囲を示すことができる。

【0106】

前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、弾性は、約３０ないし２００Ｐａであり、粘性は、約１０ないし１００Ｐａでもあり、具体的には、弾性は、約１００ないし１５０Ｐａであり、粘性は、約１０ないし６０Ｐａでもある。本発明の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、弾性は、約３０ないし２００Ｐａであり、粘性は、約１０ないし１００Ｐａでもあり、フィルタを介する濾過工程遂行が可能である。

【0107】

本発明の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、弾性は、約３０ないし２００Ｐａであり、粘性は、約１０ないし１００Ｐａでもあり、粒度は、Ｄ９０が２４０μｍ以下でもあり、さらに具体的には、Ｄ１０が約２５μｍないし４０μｍ、Ｄ５０が約７０μｍないし１１０μｍ、Ｄ９０が約１９０μｍないし２４０μｍである粒度分布、あるいはＤ１０が約１０μｍないし３０μｍ、Ｄ５０が約３５μｍないし６５μｍ、Ｄ９０が約８０μｍないし１２０μｍである粒度分布を示すことができ、フィルタを介する濾過工程遂行が可能である。

【0108】

前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの製造方法において、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造する段階は、前述の通りである。

【0109】

本発明の実施例において、前記粉末状のヒアルロン酸架橋物を水和させる段階は、前記粉末状のヒアルロン酸架橋物を、水、または水を含む溶液と混合する段階でもある。ここで、前記水を含む溶液は、緩衝液でもあり、具体的には、リン酸緩衝液でもある。

【0110】

前記粉末状のヒアルロン酸架橋物は、前述の水、または水を含む溶液に対し、約５ｍｇ／ｍＬないし約１５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加されうる。前記粉末状のヒアルロン酸架橋物が、水、または水を含む溶液に前述の濃度で添加される場合、架橋されたヒアルロン酸ゲルが関節炎治療に適する粘性及び弾性を示し、濾過可能なほどの流変学的特性を示し、異物除去が容易であり、それによる品質管理が容易であり、注射器充填時、適切な注射圧力を示すことができる。

【0111】

本発明の実施例において、前記方法は、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを均質化させる段階をさらに含んでもよい。前記均質化は、均質器を利用して行われ、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、均質器を利用し、約７，０００ｒｐｍ以下、例えば、約２，０００ないし約７，０００ｒｐｍで、約３分間ないし約２０分間均質化されうる。

【0112】

本発明の実施例において、前記方法は、架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを、約５μｍないし３０μｍの気孔サイズ（pore size）を有するフィルタで濾過する段階をさらに含んでもよい。前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、小さい気孔サイズを有するフィルタを介して濾過することができ、ヒアルロン酸水和ゲルから異物を容易に除去することができ、品質管理が容易であり、異物飽和による危険性を低くすることができ、水和ゲルの物理的な特徴が大きく変化されずに維持されながら、粒度及び粒度分布の均質性を向上させることができ、高い品質向上を示すことができる。

【0113】

本発明の実施例において、前記フィルタを利用した濾過は、減圧状態または真空状態で行われ、具体的には、約８０ｋＰａから２０ｋＰａまでの圧力下でも行われる。

【0114】

本発明の実施例において、前記フィルタを利用した濾過は、１回以上行われ、具体的には、１回または２回行われうる。フィルタを介する濾過工程の遂行回数が増加しても、ヒアルロン酸水和ゲルの特性は、同一に維持され、粒度が低下されうる。

【0115】

本発明の実施例において、前記フィルタを介する濾過工程遂行前のヒアルロン酸水和ゲルは、Ｄ９０が約２４０μｍ以下である粒度分布を示すことができる。

【0116】

本発明の実施例において、フィルタを介する濾過工程遂行前のヒアルロン酸水和ゲルは、Ｄ１０が約２５μｍないし４０μｍ、Ｄ５０が約７０μｍないし１１０μｍ、Ｄ９０が約１９０μｍないし２４０μｍである粒度分布を示すことができる。

【0117】

本発明の実施例において、前記フィルタを介する濾過工程遂行前の架橋化されたヒアルロン酸水和ゲルは、無定形でもあり、Ｘ線粉末回折分析パターンがハローパターンを示すことができる。具体的には、前記ヒアルロン酸水和ゲルは、Ｘ線粉末回折パターン（ＸＲＤ）が、図４の通りでもある。

【0118】

本発明の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、無定形であり、Ｘ線粉末回折パターン（ＸＲＤ）が、図４の通りであり、Ｄ９０が２４０μｍ以下である粒度分布を示すことができ、さらに具体的には、Ｄ１０が約２５μｍないし４０μｍ、Ｄ５０が約７０μｍないし１１０μｍ、Ｄ９０が約１９０μｍないし２４０μｍである粒度分布を示すことができる。前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、フィルタを介する濾過工程遂行が可能である。

【0119】

本発明の実施例において、前記フィルタを利用した濾過工程後の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、Ｄ９０が約１２０μｍ以下である粒度分布を示すことができる。

【0120】

本発明の実施例において、前記フィルタを利用した濾過工程後のヒアルロン酸水和ゲルは、Ｄ１０が約１０μｍないし３０μｍ、Ｄ５０が約３５μｍないし６５μｍ、Ｄ９０が約８０μｍないし１２０μｍである粒度分布を示すことができる。

【0121】

本発明の実施例において、前記フィルタを介する濾過工程遂行後の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、無定形でもあり、Ｘ線粉末回折分析パターンがハローパターンを示すことができる。具体的には、前記ヒアルロン酸水和ゲルは、Ｘ線粉末回折パターン（ＸＲＤ）が、図５の通りでもある。

【0122】

本発明の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、無定形であり、Ｘ線粉末回折パターン（ＸＲＤ）が、図５の通りであり、Ｄ９０が１２０μｍ以下である粒度分布を示すことができ、さらに具体的には、Ｄ１０が約１０μｍないし３０μｍ、Ｄ５０が約３５μｍないし６５μｍ、Ｄ９０が約８０μｍないし１２０μｍである粒度分布を示すことができる。前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、フィルタを介する濾過工程遂行が可能である。

【0123】

本発明において前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの粒度は、レーザ粒度分析法によって測定されたものでもある。

【0124】

本発明において、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの粒度は、湿式法によって測定されたものでもある。

【0125】

本発明の実施例において、前記濾過する段階は、均質化させる段階後にも遂行される。

【0126】

本発明の実施例において、前記方法は、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを滅菌する段階をさらに含んでもよい。前記滅菌は、約１００℃以上で約１０分以上行われ、具体的には、約１２１℃以上で約１５分以上行われうる。

【0127】

本発明の実施例において、前記滅菌は、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを注射器に充填する前に行われるか、あるいは注射器に充填した後に行われ、具体的には、前記架橋されたヒアルロン酸ゲルを注射器に充填した後にも行われる。

【0128】

本発明は、
ヒアルロン酸、その塩、またはそれらの混合物を含む水溶液を製造する段階と、
前記水溶液に架橋剤を添加し、ヒアルロン酸を架橋反応させる段階と、
前記水溶液にエタノールを添加し、ヒアルロン酸を粒子に固体化させる段階と、
前記ヒアルロン酸の粒子を含む水溶液の架橋反応を持続させ、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造する段階と、
前記粉末状のヒアルロン酸架橋物を水和させる段階と、を含む方法によって製造された架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを提供する。

【0129】

前記方法により、水溶液上にエタノールを添加するとき、前記エタノールは、前記水溶液上に、一定時間にわたり、徐々に添加されうる。

【0130】

前記ヒアルロン酸水和ゲルは、退行性関節炎による痛症の緩和、予防及び治療に最適化された流変学的特性を示す。また、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、小さい気孔サイズを有するフィルタで濾過が可能であるので、異物除去が容易であり、医薬品及び医療機器に対して製剤化するとき、不純物管理が容易であり、経済性及び量産面で顕著にすぐれた長所を有する。また、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、品質均一性にすぐれ、バッチ別に製造された架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの流変学的特性がほぼ同一であり、均質した物性を示し、再現性にすぐれる。

【0131】

本発明の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、Ｄ９０が約２４０μｍ以下である粒度分布を示すことができる。

【0132】

本発明の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、Ｄ１０が約２５μｍないし４０μｍ、Ｄ５０が約７０μｍないし１１０μｍ、Ｄ９０が約１９０μｍないし２４０μｍである粒度分布を示すことができる。

【0133】

本発明の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、無定形でもあり、Ｘ線粉末回折分析パターンがハローパターンを示すことができる。具体的には、前記ヒアルロン酸水和ゲルは、Ｘ線粉末回折パターン（ＸＲＤ）が、図４の通りでもある。

【0134】

本発明の実施例によれば、架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、約５μｍないし３０μｍの気孔サイズ（pore size）を有するフィルタによっても濾過される。

【0135】

本発明の濾過後の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、Ｄ９０が約１２０μｍ以下である粒度分布を示すことができる。

【0136】

本発明の濾過後の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、Ｄ１０が約１０μｍないし３０μｍ、Ｄ５０が約３５μｍないし６５μｍ、Ｄ９０が約８０μｍないし１２０μｍである粒度分布を示すことができる。

【0137】

本発明の濾過後の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、無定形でもあり、Ｘ線粉末回折分析パターンがハローパターンを示すことができる。具体的には、前記濾過の後のヒアルロン酸水和ゲルは、Ｘ線粉末回折パターン（ＸＲＤ）が、図５の通りでもある。

【0138】

本発明において、前記粉末状のヒアルロン酸架橋物粒子、及び架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの製造方法、並びに粉末状のヒアルロン酸架橋物粒子の物性、及び架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの物性は、前述の通りである。

【0139】

本発明の実施例において、前記濾過段階後に得られたヒアルロン酸水和ゲルは、弾性は、３０ないし２００Ｐａであり、粘性は、１０ないし１００Ｐａでもあり、具体的には、弾性は、１００ないし１５０Ｐａであり、粘性は、１０ないし６０Ｐａでもある。

【0140】

本発明は、前記架橋されたヒアルロン酸水和ゲルが充填された注射器を提供する。前記注射器は、人体に適用するとき、注射に適する圧力を示すことができ、架橋されたヒアルロン酸ゲルのすぐれた流変学的特性により、退行性関節炎による痛症の緩和、予防及び治療のすぐれた効果を示すことができる。

【実施例】

【0141】

以下、下記実施例により、本発明についてさらに詳細に説明するが、下記実施例は、本発明について説明するためのものであるのみ、本発明の範囲は、それらに限定されるものではない。

【0142】

実施例１
実施例１－１
０．２～０．３Ｍ ＮａＯＨ水溶液（ｐＨ＞９）に、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ：butanediol diglycidyl ether）を混合し、ヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ、分子量：１．０～４．０ＭＤａ）の濃度が２％（ｗ／ｖ）になるように反応物を製造した。このとき、ＢＤＤＥとヒアルロン酸ナトリウムとの比率は、１００μｌ（ＢＤＤＥ）／１ｇ（ＨＡ）であった。

【0143】

前記反応物を常温で撹拌し、ヒアルロン酸ナトリウムを溶解させ、ヒアルロン酸ナトリウム含有水溶液（Ｎａ－ＨＡ solution）２５０ｍＬを製造し、２５ないし３５℃で、４ないし６時間２５０ｒｐｍで撹拌しながら、架橋反応させた。前記ヒアルロン酸ナトリウム含有水溶液に、ヒアルロン酸ナトリウム含有水溶液とエタノールとの体積比が１：５になるまでエタノールを添加し、このとき、エタノールをヒアルロン酸ナトリウムが塊にならないように、２０ｍＬ／ｍｉｎ速度で添加した。

【0144】

該ヒアルロン酸ナトリウムが粉末状に析出された後、２５℃で、２４時間以下の間、２５０ｒｐｍで撹拌しながら、架橋反応させた。この架橋反応後、２．０Ｍ以下のＨＣｌ溶液を投入し、ｐＨを調整（ｐＨ６．０～９．０未満）し、反応を終了させた。フィルタリングを介し、固形化されたヒアルロン酸架橋物を回収した。固形化されたヒアルロン酸架橋物に対し、９５％（ｗ／ｗ）エタノールと７０％（ｗ／ｗ）エタノールとを交互に交換して数回洗浄した。洗浄後、回収された架橋されたヒアルロン酸は、６０℃以下で、２４時間以下の間、真空乾燥させ、エタノール及び水分を除去し、粉末状のヒアルロン酸架橋物を得た。

【0145】

実施例１－２
ヒアルロン酸ナトリウム含有水溶液に、エタノールを８０ｍＬ／ｍｉｎの速度で添加したことを除いては、実施例１－１と同一方法で、粉末状のヒアルロン酸架橋物を得た。

【0146】

実施例１－３
ヒアルロン酸ナトリウム含有水溶液に、エタノールを２００ｍＬ／ｍｉｎの速度で添加したことを除いては、実施例１－１と同一方法で、粉末状のヒアルロン酸架橋物を得た。
実施例２
ヒアルロン酸ナトリウム含有水溶液とエタノールとの体積比が１：３になるまで、ヒアルロン酸ナトリウム含有水溶液に、エタノールを添加した点を除いては、実施例１－１と同一方法で、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造した。

【0147】

実施例３
ヒアルロン酸ナトリウム含有水溶液とエタノールとの体積比が１：７になるまで、ヒアルロン酸ナトリウム含有水溶液に、エタノールを添加した点を除いては、実施例１－１と同一方法で、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造した。

【0148】

実施例４
架橋剤として、ＢＤＤＥの代わりに、ＤＶＳを、１００μｌ（ＤＶＳ）／１ｇ（ＨＡ）になるように添加し、ヒアルロン酸ナトリウム含有水溶液とエタノールとの体積比が１：３になるまで、ヒアルロン酸ナトリウム含有水溶液に、エタノールを添加した点を除いては、実施例１－１と同一方法で、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造した。

【0149】

実施例５
実施例１－１で製造された粉末状のヒアルロン酸架橋物を、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）に１０～１５ｍｇ／ｍＬで添加して水和ゲルを得た。前記水和ゲルを均質器で、７，０００ｒｐｍ以下にて均質化した。前記均質化されたゲルに対し、１２１℃で、２０分以下で滅菌を進め、架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを得た。

【0150】

実施例６
実施例２で製造された粉末状のヒアルロン酸架橋物をＰＢＳ（phosphate buffered saline）に１０～１５ｍｇ／ｍＬに溶解させて水和ゲルを得た。前記水和ゲルを均質器で、７，０００ｒｐｍ以下にて均質化した。前記均質化されたゲルに対して１２１℃で、２０分以下で滅菌を進め、架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを得た。
実施例７
実施例３で製造された粉末状の架橋ヒアルロン酸を、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）に１０～１５ｍｇ／ｍＬに溶解させて水和ゲルを得た。前記ゲルを均質器で、７，０００ｒｐｍ以下にて均質化した。前記均質化された水和ゲルに対し、１２１℃で、２０分以下で滅菌を進め、架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを得た。

【0151】

実施例８
実施例４で製造された粉末状の架橋ヒアルロン酸を、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）に１０～１５ｍｇ／ｍＬに溶解させて水和ゲルを得た。前記ゲルを均質器で、７，０００ｒｐｍ以下に均質化した。前記均質化された水和ゲルに対し、１２１℃で、２０分以下で滅菌を進め、架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを得た。

【0152】

実施例９
実施例２で製造された粉末状の架橋ヒアルロン酸を、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）に６～８ｍｇ／ｍＬに溶解させて水和ゲルを得た。前記ゲルを均質器で、７，０００ｒｐｍ以下に均質化した。前記均質化された水和ゲルに対し、１２１℃で、２０分以下で滅菌を進め、架橋されたヒアルロン酸ゲルを得た。

【0153】

実施例１０
実施例２と同一方法で、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造した。
製造された粉末状のヒアルロン酸架橋物を、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）に１０～１５ｍｇ／ｍＬに溶解させて水和ゲルを得た。前記ゲルを均質器で、７，０００ｒｐｍ以下にて均質化した。前記均質化された水和ゲルを、減圧濾過装置においてＳ．Ｓ濾過装置（solid suspension filtering with joint）を使用して濾過し、このとき、フィルタは、２５μｍ以下のnylon filter paperを使用し、約８０ｋＰａ圧力以下で濾過を進めた。濾過された水和ゲルに対し、２０分以下で滅菌を進め、架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを得た。

【0154】

実施例１１
実施例２と同一方法で、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造した。
製造された粉末状のヒアルロン酸架橋物を、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）に１０～１５ｍｇ／ｍＬに溶解させて水和ゲルを得た。前記均質化された水和ゲルを減圧濾過装置においてＳ．Ｓ濾過装置（solid suspension filtering with joint）を使用し、２回順に濾過し、このとき、フィルタは、２５μｍ以下のnylon filter paperを使用し、約８０ｋＰａ圧力以下で濾過を進めた。濾過された水和ゲルに対し、１２１℃で、２０分以下で滅菌を進め、架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを得た。

【0155】

比較例１
８～１２％（ｗ／ｗ）の比率で、エタノールを含む０．８～１．２％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液に、ヒアルロン酸ナトリウムを加えて完全に溶解させた後、ＢＤＤＥを、５０～１００μｌ／ヒアルロン酸ナトリウム１ｇの比率で加えて混合した。前記混合が完了すれば、反応温度約４０～５０℃、反応時間約６時間以下で、架橋反応を行った。反応が完了したヒドロゲル形態のヒアルロン酸架橋物を、ＰＢＳ溶液（phosphate buffered saline）で透析した。透析後に得られたヒドロゲルを、ＢＤＤＥを除去するために、蒸溜水で洗浄し、中性化されたヒドロゲルを、９５％（ｗ／ｗ）エタノール水溶液で抽出し、粉末上のヒアルロン酸一次架橋物を得た。

【0156】

前記ヒアルロン酸一次架橋物に対し、二次架橋反応を行った。前記粉末上のヒアルロン酸一次架橋物は、０．８～１．２％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液中に、１：４～６の重量比で混合し、完全に溶解させた。得られた反応混合物に、ＢＤＤＥを５０～１００μｌ／一次架橋物１ｇの比率で加えて混合した。前記混合が完了すれば、反応温度４０～５０℃で、約１２時間以下で、架橋反応を行った。反応が完了した後、生成された二次架橋物を、ＰＢＳ溶液で約１２～２４時間透析した。透析後に得られた粒子を、ＢＤＤＥを除去するために、蒸溜水で洗浄し、中性化されたヒドロゲルを、９５％（ｗ／ｗ）エタノール水溶液で抽出し、粉末上のヒアルロン酸二次架橋物を得た。

【0157】

前記ヒアルロン酸一次架橋物及びヒアルロン酸二次架橋物を、ＰＢＳ中で、９：１の重量比で、最終濃度が２％（ｗ／ｗ）になるように、ゲル製造した後、前記ゲルに対し、物理的力を加え、５００μｍのメッシュシーブを通過させて粉砕する工程を遂行することにより、最終的なヒアルロン酸架橋物を得た。

【0158】

実験例１：ヒアルロン酸水和ゲルの粘弾性測定（１）
前述の実施例で製造された架橋されたヒアルロン酸水和ゲルに対し、粘弾性を測定した。該粘弾性は、回転型レオメータであるKinexus Pro Rheometer（Malvern、Worchestershire、英国）を利用して測定した。

【0159】

動的粘弾性測定のために、直径が２０ｍｍであるジオメトリを利用し、該ジオメトリとプレート（Plate）との測定距離（ＧＡＰ）は、０．５ｍｍであり、温度は、２５℃であり、分析終了前まで一定に維持した。コントロールプログラム（control program）でもって、周波振動（frequency oscillation）を利用し、周波数の範囲を０．１～１０Ｈｚに設定し、２．５Ｈｚに該当する保存弾性率（Ｇ’（storage modulus））、損失弾性率（Ｇ”（loss modulus））を測定した。

【0160】

実施例による水和ゲルの粘弾性測定結果は、表１の通りであり、前記表１において、弾性は、保存弾性率（Ｇ’（storage modulus））を意味し、粘性は、損失弾性率（Ｇ”（loss modulus））を意味する。

【0161】

【表1】

【0162】

実験例２：ヒアルロン酸水和ゲルの粘弾性測定（２）
実施例１０及び比較例１の方法によって架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを、３回別途に製造した。前記それぞれの架橋されたヒアルロン酸水和ゲルに対し、実験例１のように粘弾性を測定し、その平均値及び標準偏差を下記表２に示した。

【0163】

【表2】

【0164】

前記表２から確認されるように、実施例１０の方法によれば、架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの弾性及び粘性は、標準偏差がかなり低い値を示し、各バッチごとに、ほぼ一定の物性を示した。一方、比較例１の方法によれば、架橋されたヒアルロン酸ゲルの弾性及び粘性は、製造時ごとに大きい差を示した。」

【0165】

それにより、本発明によれば、均一な物性を有する架橋されたヒアルロン酸水和ゲルが製造されうるということが分かる。

【0166】

実験例３：粉末状のヒアルロン酸架橋物の粒度分析
実施例１－１ないし実施例１－３で使用された原料物質である粉末状のヒアルロン酸ナトリウム（分子量：１．０～４．０ＭＤａ）、及び実施例１－１ないし実施例１－３による粉末状のヒアルロン酸架橋物の粒度を、粒度分析器（Mastersizer ３０００、Malvern社、英国）を利用し、乾式法で分析し、その結果は、前述の図１及び表３の通りである。

【0167】

【表3】

【0168】

前述の図１及び表３から確認されるように、実施例１－１ないし１－３による粉末状態のヒアルロン酸架橋物は、原料物質であるヒアルロン酸ナトリウムよりさらに微細な粉末状態の架橋物として得られた。

【0169】

また、エタノール投入速度が速いほど、粒度が上昇する傾向を示し、粒度分布において、Ｄ９０値が上昇することを確認することができる。

【0170】

実験例４：架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの粒度分析
実施例６、実施例１０、実施例１１の架橋されたヒアルロン酸水和ゲルに対し、粒度分析器（Microtrac、Montgomeryville、ＰＡ）を利用し、湿式法で粒度を測定し、その結果を図２及び表４に示した。

【0171】

【表4】

【0172】

前述の図２及び表４によれば、架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、濾過が可能であり、濾過を介して粒度が低下され、より均一な粒度分布を示した。

【0173】

それにより、濾過工程を介して架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、さらに均質化され、粒度均一性が向上されるということが分かる。

【0174】

実験例５：架橋されたヒアルロン酸ゲルのＸＲＤ構造分析
実施例２による粉末状態のヒアルロン酸架橋物と、実施例６及び１０による架橋されたヒアルロン酸水和ゲルとの物理的な状態を、Ｘ線回折分析を介して確認した。測定されたＸＲＤスペクトルから求めた面間距離（ｄ）と、比例反射強度（Ｉ／Ｉｏ）とを比較し、ＲＩＲ（semi-quantitative）法により、結晶構造のピークを比較した。

【0175】

Ｘ線回折スペクトル測定の機器及び条件は、次の通りである：
＜粉末Ｘ線回折スペクトル測定方法＞
- 製造社：ＰＡNalytical社（Almelo、オランダ）
- モデル：Ｘ’ｐｅｒｔ ｐｒｏ ＭＰＤ
- Ｘ線波長：ＣｕＫγの１．５４０５Å

【0176】

前記Ｘ線回折分析結果は、図３ないし図５に示した。

【0177】

前述の図３ないし図５から確認されるように、実施例２による粉末状態のヒアルロン酸架橋物と、実施例６及び１０による架橋されたヒアルロン酸水和ゲルとが、いずれも無定形状態であるということを確認することができた。

【0178】

実施例２による粉末状態のヒアルロン酸架橋物は、２θ値が約２２°～２３°である位置において、緩慢なピークを示し、実施例６及び１０による架橋されたヒアルロン酸水和ゲルは、２θ値が約２８°である位置において、緩慢なピークを示した。

【0179】

実施例１２
１％ ＮａＯＨ水溶液にエタノールを同量添加し、そこに、ヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ、分子量：１．０～４．０ＭＤａ）を添加し、混合物の濃度が３％（ｗ／ｖ）になるように混合した。そこに、ＢＤＤＥを添加し、反応物を製造した。このとき、ＢＤＤＥとヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ）との比率は、１００μＬ（ＢＤＤＥ）／１ｇ（ＨＡ）であった。

【0180】

前記反応物を、３０℃で、２００ｒｐｍ以下の速度で撹拌し、５時間架橋反応させた。そこに、反応物とエタノールとの体積比が１：５になるまで、１００ｍＬ／ｍｉｎ以下の速度でエタノールを投入した。ヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ）が粉末状に析出された後、沈澱された状態で１６時間さらに架橋反応させた。該架橋反応後、１．２Ｍ ＨＣｌ溶液を投入し、ｐＨを調整（ｐＨ８以下）して反応を終了させ、エタノールで数回洗浄した。

【0181】

洗浄後、乾燥減量１０％以下に乾燥させ、粉末状のヒアルロン酸架橋物を得た。ＰＢＳ（phosphate buffered saline）に、前記ヒアルロン酸架橋物を、１０ｍｇ／ｍＬになるように添加して水和ゲルを得た。前記水和ゲルを均質器で、７，０００ｒｐｍ以下にて均質化した。前記均質化されたゲルに対し、１２１℃で、２０分以下で滅菌を進め、架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを得た。

【0182】

実施例１３
１％ＮａＯＨ水溶液とエタノールとの混合液に、ヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ）を添加し、混合物の濃度が２％（ｗ／ｖ）になるように混合し、そこに、ＢＤＤＥを、ヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ）に対し、比率１２５μｌ（ＢＤＤＥ）／１ｇ（ＨＡ）で添加して反応物を製造したことを除いては、実施例１２と同一方法で、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造した。

【0183】

実験例６：架橋されたヒアルロン酸水和ゲルの保管安定性評価、粘弾性測定（３）
実施例１２及び１３で製造された架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを、それぞれ２５℃、３０℃、４０℃、６０℃で、８ヵ月間保管し、１ヵ月ごとに、周期的に粘弾性を測定した。該粘弾性の測定は、回転型レオメータであるKinexus Pro Rheometer（Malvern、Worchestershire、英国）を利用し、実験例１と同一条件で測定した。また、市販されているヒアルロン酸架橋物注射剤であるＳｙｎｖｉｓｃ－ｏｎｅ（登録商標）（サノフィ社）を比較製品として使用し、同一条件で粘弾性を測定した。表５及び表６において、実験が終わって測定されていない（空欄＝測定されず）の場合、＊で表示した。
実施例１２及び１３、または比較製品による水和ゲルの弾性及び粘性の測定結果は、表５ないし表７と、図６ないし図１１とに示した。

【0184】

【表5】

【0185】

【表6】

【0186】

【表7】

【0187】

表５において弾性は、保存弾性率（Ｇ’（storage modulus）、２．５ＨｚにおけるＰａ）を意味し、表６において、粘性は、損失弾性率（Ｇ”（loss modulus）、２．５ＨｚにおけるＰａ）を意味する。表７は、実施例１２及び１３、または比較製品による水和ゲルを、それぞれ２５℃、３０℃、４０℃、６０℃で、８ヵ月間保管した後で測定した弾性低下率及び粘性低下率を示す。

【0188】

前述の表５及び表６、並びに図６ないし図１１でのように、実施例１２及び１３による水和ゲルは、比較製品（Ｓｙｎｖｉｓｃ－ｏｎｅ（登録商標））対比で、同等以上の安定性を示した。また、実施例１２及び１３、または比較製品による水和ゲルにおいて、保管条件の温度が高いほど粘弾性が低下する傾向を示し、粘性より弾性の低下率が高かった。

【0189】

実施例１４
実施例１４－１
１％ ＮａＯＨ水溶液に、エタノールを６：４の比率で添加し、そこに、ヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ、分子量：１．０～４．０ＭＤａ）を添加し、混合物の濃度が２．５％（ｗ／ｖ）になるように混合した。そこに、ＢＤＤＥを添加し、反応物を製造した。このとき、ＢＤＤＥとヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ）との比率は、１００μｌ（ＢＤＤＥ）／１ｇ（ＨＡ）であった。

【0190】

前記反応物を３０℃で、１７０ｒｐｍの速度で撹拌し、５時間架橋反応させた。そこに、反応物とエタノールとの体積比が１：５になるまで、１００ｍＬ／ｍｉｎ以下の速度でエタノールを投入した。ヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ）が粉末状態に析出された後、沈澱された状態で１６時間さらに架橋反応させた。該架橋反応後、１．２Ｍ ＨＣｌ溶液を投入し、ｐＨを調整（ｐＨ８以下）して反応を終了させ、エタノールで数回洗浄した。

【0191】

洗浄後、乾燥減量１０％以下に乾燥させ、粉末状のヒアルロン酸架橋物を得た。ＰＢＳ（phosphate buffered saline）に、前記ヒアルロン酸架橋物を１０ｍｇ／ｍＬになるように添加して水和ゲルを得た。前記水和ゲルを均質器で、７，０００ｒｐｍ以下にて均質化した。前記均質化されたゲルに対し、１２１℃で、２１分以下で滅菌を進め、架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを得た。

【0192】

実施例１４－２
ＢＤＤＥを、ヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ）に対し、比率１２０μｌ（ＢＤＤＥ）／１ｇ（ＨＡ）で添加して反応物を製造したことを除いては、実施例１４－１と同一方法で、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造した。

【0193】

実施例１４－２
ＢＤＤＥを、ヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ）に対し、比率１４０μｌ（ＢＤＤＥ）／１ｇ（ＨＡ）で添加して反応物を製造したことを除いては、実施例１４－１と同一方法で、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造した。

【0194】

実施例１５
実施例１５－１
１％ ＮａＯＨ水溶液に、エタノールを６：４比率で添加し、そこに、ヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ、分子量：１．０～４．０ＭＤａ）を添加し、混合物の濃度が２．５％（ｗ／ｖ）になるように混合した。そこに、ＢＤＤＥを添加し、反応物を製造した。このとき、ＢＤＤＥとヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ）との比率は、１２０μｌ（ＢＤＤＥ）／１ｇ（ＨＡ）であった。

【0195】

前記反応物を、２５℃で、１７０ｒｐｍの速度で撹拌し、５時間架橋反応させた。そこに、反応物とエタノールとの体積比が１：５になるまで、１００ｍＬ／ｍｉｎ以下の速度でエタノールを投入した。ヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ）が粉末状態に析出された後、沈澱された状態で、１６時間さらに架橋反応させた。この架橋反応後、１．２ＭＨＣｌ溶液を投入し、ｐＨを調整（ｐＨ８以下）して反応を終了させ、エタノールで数回洗浄した。

【0196】

洗浄後、乾燥減量１０％以下に乾燥させ、粉末状のヒアルロン酸架橋物を得た。ＰＢＳ（phosphate buffered saline）に、前記ヒアルロン酸架橋物を１０ｍｇ／ｍＬになるように添加して水和ゲルを得た。前記水和ゲルを均質器で、７，０００ｒｐｍ以下にて均質化した。前記均質化されたゲルに対し、１２１℃で、２１分以下で滅菌を進め、架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを得た。

【0197】

実施例１５－２
反応温度を３０℃にし、反応物を架橋反応させたことを除いては、実施例１５－１と同一方法で、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造した。

【0198】

実施例１５－３
反応温度を３５℃にし、反応物を架橋反応させたことを除いては、実施例１５－１と同一方法で、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造した。

【0199】

実施例１６
実施例１６－１
１％ ＮａＯＨ水溶液に、エタノールを６：４比率で添加し、そこに、ヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ、分子量：１．０～４．０ＭＤａ）を添加し、混合物の濃度が２．５％（ｗ／ｖ）になるように混合した。そこに、ＢＤＤＥを添加し、反応物を製造した。このとき、ＢＤＤＥとヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ）との比率は、１２０μｌ（ＢＤＤＥ）／１ｇ（ＨＡ）であった。

【0200】

前記反応物を、３０℃で、５０ｒｐｍの速度で撹拌し、５時間架橋反応させた。そこに、反応物とエタノールとの体積比が１：５になるまで、１００ｍＬ／ｍｉｎ以下の速度でエタノールを投入した。ヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ－ＨＡ）が粉末状態に析出された後、沈澱された状態で、１６時間さらに架橋反応させた。該架橋反応後、１．２Ｍ ＨＣｌ溶液を投入し、ｐＨを調整（ｐＨ８以下）して反応を終了させ、エタノールで数回洗浄した。

【0201】

洗浄後、乾燥減量１０％以下に乾燥させ、粉末状のヒアルロン酸架橋物を得た。ＰＢＳ（phosphate buffered saline）に、前記ヒアルロン酸架橋物を１０ｍｇ／ｍＬになるように添加して水和ゲルを得た。前記水和ゲルを均質器で、７，０００ｒｐｍ以下に均質化した。前記均質化されたゲルに対し、１２１℃で、２１分以下で滅菌を進め、架橋されたヒアルロン酸水和ゲルを得た。

【0202】

実施例１６－２
反応物の撹拌速度を１３０ｒｐｍにしたことを除いては、実施例１６－１と同一方法で、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造した。

【0203】

実施例１６－３
反応物の撹拌速度を２００ｒｐｍにしたことを除いては、実施例１６－１と同一方法で、粉末状のヒアルロン酸架橋物を製造した。

【0204】

実験例７：ヒアルロン酸架橋物の架橋度分析
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、グルクロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンとの反復結合された多糖類（polysaccharide）であり、ヒアルロン酸を、ストレプトマイセスヒアルロニダーゼ（Streptomyces hyaluronidase）で処理すれば、還元末端（non-reducing end）に、４，５－不飽和グルクロノシル残基（４，５－unsaturated glucuronosyl residue）を有するオリゴ糖（oligosaccharide）に分解されることが知られている。完全分解（complete digestion）された未変形ＨＡは、テトラサッカライド（tetrasaccharide）（四量体（tetramer））とヘキササッカライド（hexasaccharide）（六量体（hexamer））との２つの生成物になり、オクタサッカライド（octasaccharide）（八量体（octamer））は、酵素分解の最小サイズ基質である。酵素分解が進められることにより、小単位のオリゴ糖にＨＡが分解されるが、ＢＤＤＥなどの架橋剤によって変形されたＨＡは、酵素によって分解されても、架橋剤が結合されたオリゴ糖（ＨＡ－ＢＤＤＥ－ＨＡ、ＨＡ－ＢＤＤＥ）形態が生成されるので、ＨＰＬＣ分析時、未変形ＨＡと、維持時間（retention time）に差が生じる。

【0205】

従って、ヒアルロン酸に架橋剤が結合して変形された程度を、架橋変形率（ＭｏＤ：dgree of modification）とし、架橋剤の双方にヒアルロン酸が架橋されたもの（ＨＡ－ＢＤＤＥ－ＨＡ）を、交差結合架橋変形率（crosslink ＭｏＤ）とし、架橋剤の一方にヒアルロン酸が架橋されたもの（ＨＡ－ＢＤＤＥ）をペンダント架橋変形率（pendant ＭｏＤ）とした。

【0206】

ヒアルロン酸（ＨＡ）の分解（digestion）に使用されたヒアルロン酸分解酵素（Streptomyces hyalurolyticusから得たヒアルロニダーゼ）はＭｅｒｃｋ（Sigma Aldrich）社の製品を使用した。ＨＰＬＣ分析のためのカラムは、Dionex CarboPac ＰＡ１００（Thermo Scientific社）を使用した。

【0207】

架橋剤によって変形されたＨＡは、ヒアルロン酸分解酵素を利用し、ｐＨ５．０、３６℃条件で分解された。分解されたＨＡは、ＨＰＬＣシステムを利用し、四量体（tetramer）、六量体（hexamer）、そしてそれ以上のオリゴマー（oligomer）を明確に分離することができた。２３２ｎｍで、ＵＶ吸光度を介し、それぞれ分離されたピークの大きさを比較した。ヒアルロン酸が分解酵素によって完全分解されれば、四量体と六量体とになり、架橋結合されたヒアルロン酸は、四量体及び六量体より若干大きい糖ユニット、そしてそれ以上のオリゴマーなどに分離されたクロマトグラムを示す。各クロマトグラムの面積により、変形率（ＭｏＤ）を求めることができ、八量体（octamer）以上のオリゴマーのピークは、交差結合架橋変形率（crosslink ＭｏＤ）（％）、四量体（tetramer）と六量体（ｈｅｘａｍｅｒ）との主ピークを除いた八量体より小さいオリゴマーのピークは、ペンダント架橋変形率（pendant ＭｏＤ）（％）に区分し、その二つを合わせ、総架橋変形率（total ＭｏＤ）（％）として求めた。

【0208】

実施例１２で製造したヒアルロン酸架橋物、比較製品として使用したＳｙｎｖｉｓｃ－ｏｎｅ（登録商標）（Sanofi社）、及び天然ヒアルロン酸（ＨＡ）の架橋度を分析し、表８に示した。また、実施例１４－１～１６－３で製造したヒアルロン酸架橋物の架橋度を分析し、表９に示した。

【0209】

【表8】

【0210】

【表9】

【0211】

前記表８に示すように、実施例１２で製造したヒアルロン酸架橋物は、比較製品として使用したＳｙｎｖｉｓｃ－ｏｎｅ（登録商標）と類似した粘弾性を示し、同等以上の安定性を示した。また、実施例１２で製造したヒアルロン酸架橋物は、天然ヒアルロン酸（ＨＡ）より、ペンダント架橋変形率（pendant ＭｏＤ）（％）、交差結合架橋変形率（crosslink ＭｏＤ）（％）及び総架橋変形率（total ＭｏＤ）（％）の上昇を示した。また、実施例１２で製造したヒアルロン酸架橋物は、Ｓｙｎｖｉｓｃ－ｏｎｅ（登録商標）と同等以上のペンダントＭｏＤ（％）、交差結合ＭｏＤ（％）及び総ＭｏＤ（％）を示した。

【0212】

前記表９に示すように、架橋反応が多く起こるほど、架橋変形率（ＭｏＤ：degree of modification）（％）の上昇を示した。一般的に、該架橋反応は、架橋剤投入量（ＢＤＤＥ：ＨＡモル比）が多いほど増大し、架橋反応が増大するほど、架橋変形率（または、変形度、架橋度）（ＭｏＤ）（％）の上昇を示した。例えば、架橋剤（例えば、ＢＤＤＥ）濃度を異にさせて製造した実施例１４－１～１４－３によるヒアルロン酸架橋物の架橋度分析結果、架橋剤濃度が上昇するほど、架橋変形率（ＭｏＤ）（％）の上昇を示した。

【0213】

また、前記表９に示すように、異なる反応温度で製造した実施例１５－１～１５－３によるヒアルロン酸架橋物の架橋度分析結果、反応温度が上昇するほど、架橋変形率（ＭｏＤ）（％）の上昇を示した。一方、架橋反応時、撹拌速度（ＢＤＤＥ投入後、５時間以下）を異にさせて製造した実施例１６－１～１６－３によるヒアルロン酸架橋物の架橋度分析結果、撹拌速度による架橋変形率（ＭｏＤ）（％）差は、大きくなかった。

【0214】

一般的に、架橋変形率（ＭｏＤ）（％）値が大きいほど、粘弾性、すなわち、保存弾性率（Ｇ’（storage modulus）、２．５ＨｚにおけるＰａ）によって表現される弾性と、損失弾性率（Ｇ”（loss modulus）、２．５ＨｚにおけるＰａ）によって表現される粘性とが高くしめされるが、粘弾性値は、剤形のような他の要因にも影響を受けるために、常時一定傾向を示さなかった。

【0215】

以上、本発明につき、その望ましい実施例を中心に説明した。本発明が属する技術分野において当業者であるならば、本発明が、本発明の本質的な特性から外れない範囲で変形された形態に具現されうるということを理解することができるであろう。従って、該開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点から考慮されなければならない。本発明の範囲は、前述の説明ではなく、特許請求の範囲に示されており、それと同等な範囲内にある全ての差異は、本発明に含まれるものであると解釈されなければならないのである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】