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特許7556619脳疾患の治療のための医薬組成物、ニューロンの移動促進剤およびその利用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-17
(45)【発行日】2024-09-26
(54)【発明の名称】脳疾患の治療のための医薬組成物、ニューロンの移動促進剤およびその利用
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20240918BHJP
A61K 31/351 20060101ALI20240918BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240918BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240918BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00 ZNA
A61K31/351
A61P9/10
A61P43/00 107
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2023557745
(86)(22)【出願日】2023-09-08
(86)【国際出願番号】 JP2023032912
(87)【国際公開番号】W WO2024058077
(87)【国際公開日】2024-03-21
【審査請求日】2023-09-20
(31)【優先権主張番号】P 2022144880
(32)【優先日】2022-09-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和４年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、革新的先端研究開発支援事業、「ニューロン移動による傷害脳の適応・修復機構とその操作技術」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】506218664
【氏名又は名称】公立大学法人名古屋市立大学
(74)【代理人】
【識別番号】100179578
【弁理士】
【氏名又は名称】野村 和弘
(74)【代理人】
【識別番号】100195062
【弁理士】
【氏名又は名称】野村 涼子
(72)【発明者】
【氏名】澤本 和延
(72)【発明者】
【氏名】松本 真実
【審査官】菊池 美香
(56)【参考文献】
【文献】特開平１１－３１０６０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／１６５２６７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Acta Neurologica Belgica，2021年，Vol. 121，pp. 1863-1865
【文献】インフルエンザ脳症の診療戦略，［オンライン］，2018年，［検索日2023.11.28］，インターネット<URL:https://www.childneuro.jp/uploads/files/about/influenzaencephalopathy2018.pdf>
【文献】Internal Mdicine，2020年，Vol. 59，pp. 2321-2326
【文献】Chemical Papers，2021年，Vol. 75，pp. 5323-5337
【文献】Onco Targets and Therapy，2014年，Vol. 7，pp. 117-134
【文献】PLOS ONE，2016年，11(1), e0146398，pp. 1-12
【文献】Frontiers in Cellular Neuroscience，2022年05月26日，Vol. 16, Article 917884，pp. 1-13
【文献】Cell Death and Disease，2014年，Vol 5, e1381，pp. 1-11
【文献】PLOS ONE，11(10), e0165257，pp. 1-13
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｋ ３１／３５１
Ａ６１Ｐ ９／１０
Ａ６１Ｐ ４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
脳梗塞の治療のための医薬組成物であって、ノイラミニダーゼ阻害物質を含み、
前記ノイラミニダーゼ阻害物質は、Ｎｅｕ１の発現を阻害するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと、Ｎｅｕ４の発現を阻害するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと、ザナミビルと、の少なくとも一つを含む、
医薬組成物。
【請求項2】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記脳梗塞の発症から１０日経過する前までに投与が開始され、毎日投与される、
医薬組成物。
【請求項3】
請求項２に記載の医薬組成物において、１０日間以上投与される、
医薬組成物。
【請求項4】
請求項１または請求項２に記載の医薬組成物において、注射薬の形態によって投与される、
医薬組成物。
【請求項5】
ノイラミニダーゼ阻害物質を含み、前記ノイラミニダーゼ阻害物質は、Ｎｅｕ１の発現を阻害するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと、Ｎｅｕ４の発現を阻害するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと、ザナミビルと、の少なくとも一つを含む、
脳梗塞治療又は予防用ニューロン移動促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、脳疾患の治療のための医薬組成物およびニューロンの移動促進剤に関する。本出願は、２０２２年９月１２日に出願された日本国特許出願第２０２２－１４４８８０号に基づくもので、ここにその記載内容を援用する。
【背景技術】
【0002】
脳梗塞等の脳疾患を根本的に治療するためには、失われた神経細胞を再生させて脳機能を回復させる技術が必要となる。そのような技術として、例えば、特許文献１に示すような、ｉＰＳ細胞から誘導した細胞を移植する方法が知られている。また、特許文献２に示すように、内在性の神経幹細胞から産生される神経細胞を傷害部位へ誘導することによって再生を促進する方法が知られている。特許文献２では、Ｎ－カドヘリン等を固定またはコーティングしたスポンジ状の材料を用いることにより、脳の表層に生じる損傷組織においてニューロン（神経細胞）の移動を促進させている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】国際公開第２０１３／０６９６６１号
【文献】特開２０２０－０１８７９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
特許文献１に記載されているような、ｉＰＳ細胞から作製された神経細胞等を傷害部位へ移植した場合、脳への侵襲を伴うとともに、移植された細胞が脳内で腫瘍を形成する懸念がある。また、内在性の神経幹細胞から産生される神経細胞を傷害部位へ誘導するために、特許文献２のようなバイオマテリアル等の人工足場を移植する技術によれば、脳外科手術による侵襲を伴う。このため、臨床的に脳疾患の再生医療として利用するには、改善の余地があった。このため、ニューロンの移動および再生を促進できる他の技術が求められていた。そこで、本願発明者らは、鋭意研究を進めることにより、ニューロンの移動および再生を促進できる他の技術を発明するに至った。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、以下の形態として実現することが可能である。
本発明の一形態によれば、医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、脳梗塞の治療のための医薬組成物であって、ノイラミニダーゼ阻害物質を含み、前記ノイラミニダーゼ阻害物質は、Ｎｅｕ１の発現を阻害するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと、Ｎｅｕ４の発現を阻害するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと、ザナミビルと、の少なくとも一つを含む。
本発明の他の形態によれば、ノイラミニダーゼ阻害物質を含み、前記ノイラミニダーゼ阻害物質は、Ｎｅｕ１の発現を阻害するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと、Ｎｅｕ４の発現を阻害するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと、ザナミビルと、の少なくとも一つを含む、脳梗塞治療又は予防用ニューロン移動促進剤が提供される。
その他、本発明は、以下の形態として実現することが可能である。
本発明の一形態によれば、医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、脳梗塞の治療のための医薬組成物であって、ノイラミニダーゼ阻害物質を含み、前記ノイラミニダーゼ阻害物質は、Ｎｅｕ１の発現を阻害するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと、Ｎｅｕ４の発現を阻害するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと、ザナミビルと、の少なくとも一つを含む。
本発明の他の形態によれば、ノイラミニダーゼ阻害物質を含み、前記ノイラミニダーゼ阻害物質は、Ｎｅｕ１の発現を阻害するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと、Ｎｅｕ４の発現を阻害するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと、ザナミビルと、の少なくとも一つを含む、脳梗塞治療又は予防用ニューロン移動促進剤が提供される。
その他、本発明は、以下の形態として実現することが可能である。
【0006】
（１）本発明の一形態によれば、脳疾患の治療のための医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、ノイラミニダーゼ阻害物質を含む。この形態の医薬組成物によれば、ノイラミニダーゼ阻害物質を含むことによってニューロンの移動を促進させることができるので、脳疾患の治療に用いることができる。
【0007】
（２）上記（１）に記載の医薬組成物において、前記ノイラミニダーゼ阻害物質は、Ｎｅｕ１とＮｅｕ４とのうちの少なくとも一方を阻害してもよい。この形態の医薬組成物によれば、ノイラミニダーゼ阻害物質がＮｅｕ１とＮｅｕ４とのうちの少なくとも一方を阻害するので、ニューロンの移動を効果的に促進することができる。
【0008】
（３）上記（１）または上記（２）に記載の医薬組成物において、前記脳疾患の発症から１０日経過する前までに投与が開始され、毎日投与されてもよい。この形態の医薬組成物によれば、脳疾患の発症から１０日経過する前までに投与が開始されて毎日投与されるので、ニューロンの移動を効果的に促進することができる。
【0009】
（４）上記（３）に記載の医薬組成物において、１０日間以上投与されてもよい。この形態の医薬組成物によれば、１０日間以上の期間に亘って毎日投与されるので、ニューロンの移動をより効果的に促進することができる。
【0010】
（５）上記（１）から上記（４）までのいずれか一項に記載の医薬組成物において、注射薬の形態によって投与されてもよい。この形態の医薬組成物によれば、注射薬の形態によって投与されるので、侵襲を抑制できる。
【0011】
（６）本発明の他の形態によれば、ニューロンの移動促進剤が提供される。このニューロンの移動促進剤は、ノイラミニダーゼ阻害物質を含む。この形態のニューロンの移動促進剤によれば、ノイラミニダーゼ阻害物質を含むことによってニューロンの移動を促進させることができる。
【0012】
（７）上記（６）に記載のニューロンの移動促進剤において、前記ノイラミニダーゼ阻害物質は、Ｎｅｕ１とＮｅｕ４とのうちの少なくとも一方を阻害してもよい。この形態のニューロンの移動促進剤によれば、ノイラミニダーゼ阻害物質がＮｅｕ１とＮｅｕ４とのうちの少なくとも一方を阻害するので、ニューロンの移動を効果的に促進することができる。
【0013】
（８）本発明の他の形態によれば、脳疾患の治療方法が提供される。この方法は、ノイラミニダーゼ阻害物質を脳疾患患者に投与する工程を含む。この形態の方法によれば、ノイラミニダーゼ阻害物質を脳疾患患者に投与する工程を含むので、ニューロンの移動を促進させることができ、この結果として、脳疾患の治療に用いることができる。
【0014】
（９）本発明の他の形態によれば、ニューロンの移動を促進させる方法が提供される。この方法は、ノイラミニダーゼ阻害物質を前記ニューロンに接触させるための工程を含む。この形態の方法によれば、ノイラミニダーゼ阻害物質をニューロンに接触させるための工程を含むので、ニューロンの移動を促進させることができる。
【0015】
（１０）本発明の他の形態によれば、ノイラミニダーゼ阻害物質の、脳疾患を治療するための利用が提供される。
【0016】
なお、本開示は、種々の形態で実現することが可能であり、例えば、新生ニューロンの移動促進剤、ニューロンの移動促進キット、医薬組成物を含むキット、ニューロンの移動促進剤の製造方法、医薬組成物の製造方法、新生ニューロンの移動促進方法、脳の損傷組織の再生を補助するための方法、脳疾患の治療方法、ニューロンの移動促進剤としての利用、ニューロンの移動を促進させるための利用、ニューロンの移動促進剤を製造するためのノイラミニダーゼ阻害物質の利用、脳疾患治療薬を製造するためのイラミニダーゼ阻害物質の利用等の形態で実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】ノイラミニダーゼがＰＳＡ－ＮＣＡＭを切断する様子を模式的に示す説明図。
【図2】脳疾患の治療方法を示す工程図。
【図3】ニューロンの移動を促進させる方法を示す工程図。
【図4】実験１におけるＳＢＦ－ＳＥＭの画像データを示す説明図。
【図5】実験１の結果としての細胞接着の割合を説明する説明図。
【図6】実験２における顕微鏡画像を示す説明図。
【図7】実験２におけるＰＳＡ－ＮＣＡＭの蛍光強度を示す説明図。
【図8】実験３における顕微鏡画像を示す説明図。
【図9】実験３の結果としての細胞接着の割合を説明する説明図。
【図10】正常脳と傷害脳とにおけるＮｅｕ１～４の発現レベルを示す説明図。
【図11】傷害脳におけるＮｅｕ１～４の発現レベルを比較して示す説明図。
【図12】実験５におけるマウスの脳損傷部位を模式的に示す説明図。
【図13】実験５における顕微鏡画像を示す説明図。
【図14】実験５におけるシグナル強度を示す説明図。
【図15】実験６における顕微鏡画像を示す説明図。
【図16】実験６におけるシグナル強度を示す説明図。
【図17】実験７における顕微鏡画像を示す説明図。
【図18】実験７における二重陽性細胞の数を示す説明図。
【図19】ＦＦＴの様子を示す説明図。
【図20】実験８の結果を示す説明図。
【図21】実験９においてシアル酸の定量に用いた脳領域を模式的に示す説明図。
【図22】実験９におけるシアル酸の定量結果を示す説明図。
【図23】実験１０の概要を示す説明図。
【図24】実験１０における顕微鏡画像の代表例を示す説明図。
【図25】実験１０におけるＰＳＡシグナル強度を示す説明図。
【図26】実験１０におけるタイムラプスイメージングの結果を示す説明図。
【図27】実験１０におけるニューロンの移動速度を示す説明図。
【図28】実験１１における顕微鏡画像の代表例を示す説明図。
【図29】実験１１における二重陽性細胞の数を示す説明図。
【図30】実験１２の結果を示す説明図。
【図31】実験１３における顕微鏡画像の代表例を示す説明図。
【図32】実験１３におけるＰＳＡ－ＮＣＡＭの蛍光強度を示す説明図。
【図33】実験１３における損傷部位からの距離を示す説明図。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本開示の一実施形態によれば、ニューロンの移動促進剤が提供される。このニューロンの移動促進剤は、ノイラミニダーゼ阻害物質を含む。
【0019】
ニューロンとしては、特に限定されないが、例えば、内在性の神経幹細胞から産生される新生ニューロンが挙げられる。その他のニューロンとしては、例えば、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）やＥＳ細胞（胚性幹細胞）等の多能性幹細胞から分化誘導されたニューロン等が挙げられる。対象としては、特に限定されないが、例えば、ヒトを含む哺乳動物、ならびにサル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、およびブタ等の非ヒト哺乳動物が含まれる。
【0020】
ノイラミニダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）は、ポリシアル酸（ＰＳＡ）を切断する酵素である。ノイラミニダーゼとしては、エキソ型（酵素番号ＥＣ ３．２．１．１８）とエンド型（酵素番号ＥＣ ３．２．１．１２９）とが知られている。なお、ノイラミニダーゼは、シアリダーゼ（Ｓｉａｌｉｄａｓｅ）とも呼ばれる。哺乳動物由来のノイラミニダーゼとしては、Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、Ｎｅｕ３、Ｎｅｕ４の、４つのサブタイプが知られている。ヒト由来Ｎｅｕ１のReference Sequence RNAは、ＮＭ＿０００４３４である。ヒト由来Ｎｅｕ２のReference Sequence RNAは、ＮＭ＿００５３８３である。ヒト由来Ｎｅｕ３のReference Sequence RNAは、ＮＭ＿００６６５６である。ヒト由来Ｎｅｕ４のReference Sequence RNAは、ＮＭ＿０８０７４１である。
【0021】
ノイラミニダーゼ阻害物質には、ノイラミニダーゼの活性を阻害する物質と、ノイラミニダーゼの発現を阻害する物質とが含まれ得る。ノイラミニダーゼ阻害物質としては、特に限定されないが、例えば、２，３－デヒドロ－２－デオキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＤＡＮＡ）、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビル、ラニナミビル、ノイラミニダーゼの発現を阻害するｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡ等が挙げられる。後述する実施例に示されるように、ノイラミニダーゼ阻害物質は、Ｎｅｕ１とＮｅｕ４とのうちの少なくとも一方を阻害することが好ましい。このため、ヒトＮｅｕ１特異的阻害剤（例えば、Magesh et al., 2008）や、Ｎｅｕ４特異的阻害剤を含むことが好ましい。また、臨床薬の中では、ヒトのノイラミニダーゼのうち少なくともＮｅｕ２、Ｎｅｕ３、Ｎｅｕ４に阻害効果が報告されている観点から、ザナミビルが好ましい。
【0022】
ノイラミニダーゼ阻害物質を含むことによってニューロンの移動が促進されるメカニズムについては、定かではないが、後述する実施例に示される結果から、以下のような推定メカニズムが想定される。
【0023】
図１は、ノイラミニダーゼがＰＳＡ－ＮＣＡＭを切断する様子を模式的に示す説明図である。なお、ＮＣＡＭ（neural cell adhesion molecule）は、細胞接着分子である。ポリシアル酸は、嵩高い構造を有することによって、排他的空間を生み出していると考えられる。ここで、脳傷害後に、脳室下帯に存在する神経幹細胞が産生する神経細胞が傷害部へと移動する過程において、ノイラミニダーゼによって神経細胞表面の糖鎖ポリシアル酸が切断される現象が生じていると本願発明者らは考えた。糖鎖ポリシアル酸の切断によって、神経細胞同士の過剰な細胞接着が引き起こされ、神経細胞の移動が抑制されることが想定される。このため、ノイラミニダーゼ阻害物質によって糖鎖ポリシアル酸が切断されることを抑制し、この結果として過剰な細胞接着を抑制することによって、神経細胞の移動を促進できると本願発明者らは考えた。また、傷害部に多くの神経細胞を移動させることが可能となる結果、より多くの幼若な神経細胞が傷害部に到達し、それらが神経細胞に分化・成熟することが期待される。この結果として、神経細胞の再生が促進されるので、脳疾患によって低下した脳機能や運動機能を回復させることも可能となると考えられる。
【0024】
本実施形態のニューロンの移動促進剤は、疾患または状態の治療または予防のために用いられてもよい。疾患または状態としては、特に限定されないが、例えば、低酸素性虚血性脳症、脳梗塞、脳出血、脳血管障害、中枢神経疾患、アルツハイマー病、認知障害、外傷等が挙げられる。このため、本開示の他の形態によれば、脳疾患の治療のための医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、ノイラミニダーゼ阻害物質を含む。
【0025】
ニューロンの移動促進剤および医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでいてもよい。本明細書において「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。このような担体としては、特に限定されないが、例えば、溶媒、賦形剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤、ヒト血清アルブミン等が挙げられる。溶媒は、例えば、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、または薬学的に許容される有機溶剤のいずれであってもよい。水溶液としては、特に限定されないが、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。補助剤としては、特に限定されないが、例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。
【0026】
賦形剤としては、特に限定されないが、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリンおよび多糖類のような糖、金属塩、クエン酸、酒石酸、グリシン、ポリエチレングリコール、プルロニック（登録商標）、カオリン、ケイ酸、またはそれらの組み合わせが挙げられる。充填剤としては、特に限定されないが、例えば、ワセリン、前記糖および／またはリン酸カルシウム等が挙げられる。乳化剤としては、特に限定されないが、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル等が挙げられる。流動添加調節剤および滑沢剤としては、特に限定されないが、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩またはポリエチレングリコール等が挙げられる。上記の他にも、必要であれば医薬において通常用いられる可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、無痛化剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、湿潤剤、吸着剤、矯味矯臭剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、防腐剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、等張化剤等を適宜含むこともできる。
【0027】
本実施形態にかかるニューロンの移動促進剤の剤形は、特に限定されないが、対象の脳内において性質を失活させることなく目的の部位にまで送達できる形態であることが好ましい。ニューロンの移動促進剤の剤形としては、特に限定されないが、例えば、液剤、粉剤、顆粒剤、錠剤等が挙げられる。ニューロンの移動促進剤の剤形は、対象の脳内の目的の部位に送達させやすくする観点から、液剤であることが好ましい。液剤としては、特に限定されないが、例えば、注射剤や点滴等の注射薬の形態が挙げられる。注射薬としては、特に限定されないが、ニューロンの移動促進剤を目的の部位に送達させやすくする観点から、動脈注射や筋肉注射であることが好ましい。このような形態によれば、侵襲を抑制できる。また、このような形態によれば、対象の脳内においてニューロンの移動を容易に促進できる。また、細胞や足場材料の局所的移植等と比較して、低侵襲で安全な技術によって、ニューロンの移動を促進できる。また、細胞や足場材料の局所的移植等と比較して、脳内の広範囲に及ぶ傷害に対して神経細胞を再生させることができる。また、ニューロンの移動促進剤は、脳内に直接投与されてもよく、足場材料等に含侵されて脳内に移植されてもよい。また、ニューロンの移動促進剤は、徐放性を有していてもよく、対象の脳内の目的の部位に滞留することによって、数時間、数日、数週間等の期間に亘ってノイラミニダーゼ阻害物質が徐放される形態であってもよい。なお、ニューロンの移動促進剤は、上記の安定剤やｐＨ調節剤、賦形剤等と適宜組み合わせて製剤化されていてもよく、投与に使用するための注射器等の器具と組み合わされてキット化されていてもよい。
【0028】
本実施形態におけるニューロンの移動促進剤および医薬組成物の投与タイミングおよび投与量は、投与する対象や疾患または状態に応じて、適宜決定することができる。投与タイミングとしては、特に限定されないが、例えば、ニューロンの移動を促進させたい期間、持続投与されることが望ましい。持続投与としては、３日に１回以上投与されることが好ましく、２日に１回以上投与されることがより好ましく、１日１回、すなわち毎日投与されることがさらに好ましい。また、投与の開始タイミングとしては、特に限定されないが、例えば、ニューロンが移動を開始するタイミングまたはニューロンが移動を開始する前のタイミングであることが好ましい。投与の開始タイミングは、特に限定されないが、例えば、ニューロンの移動を効果的に促進する観点から、脳疾患の発症から２０日経過する前であることが好ましく、１５日経過する前であることがより好ましく、１２日経過する前であることがさらに好ましく、１０日経過する前であることがより一層好ましく、８日経過する前であることが特に好ましい。また、投与の開始タイミングは、特に限定されないが、例えば、ニューロンの移動を効果的に促進する観点から、脳疾患の発症から３日経過以降であることが好ましく、５日経過以降であることがより好ましく、７日経過以降であることがさらに好ましい。投与期間としては、特に限定されないが、例えば、ニューロンの移動を効果的に促進する観点から、５日間以上であることが好ましく、７日間以上であることがより好ましく、１０日間以上であることがさらに好ましく、１２日間以上であることがより一層好ましく、１４日間以上であることが特に好ましい。脳疾患の発症から３日経過以降１０日経過前までに投与を開始して１０日間以上毎日投与されることが好ましく、脳疾患の発症から５日経過以降８日経過前までに投与を開始して１４日間以上投与されることがより好ましい。例えば、脳疾患の発症から７日後に投与を開始して１４日間投与されてもよい。投与量は、脳疾患の重症度や、患者の性別、年齢および体重等により異なるが、例えば、ノイラミニダーゼ阻害物質１～９０ｍｇ／ｋｇ体重／日であり得る。
【0029】
本開示の他の形態によれば、脳疾患の治療方法が提供される。図２は、脳疾患の治療方法を示す工程図である。この方法は、ノイラミニダーゼ阻害物質を脳疾患患者に投与する工程（Ｐ１１０）を含む。この工程は、上述の投与タイミングおよび投与量に沿って実施されてもよい。また、脳疾患の治療方法は、ノイラミニダーゼ阻害物質を脳疾患患者に投与する工程の前に、ノイラミニダーゼ阻害物質の投与量を決定する工程をさらに含んでいてもよい。この工程では、例えば、脳疾患の重症度や、患者の性別、年齢および体重に応じて投与量を決定してもよい。また、脳疾患の治療方法は、ノイラミニダーゼ阻害物質を脳疾患患者に投与する工程の後に、投与による効果を確認する工程をさらに含んでいてもよい。この工程では、例えば、行動テストによって効果を確認してもよい。
【0030】
本開示の他の形態によれば、ニューロンの移動を促進させる方法が提供される。図３は、ニューロンの移動を促進させる方法を示す工程図である。この方法は、ノイラミニダーゼ阻害物質をニューロンに接触させるための工程（Ｐ２１０）を含む。ノイラミニダーゼ阻害物質をニューロンに接触させるための工程は、ノイラミニダーゼ阻害物質を対象に投与することによって実現されてもよい。また、この投与は、上述の投与タイミングおよび投与量に沿って実施されてもよい。なお、ノイラミニダーゼ阻害物質をニューロンに接触させるための工程は、ヒトに対する医療行為を含まないものであってもよい。
【実施例】
【0031】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0032】
１．試料および方法
（１）試料
野生型（ＷＴ）の雄および雌のＣ５７ＢＬ/６Ｊマウスを、日本エスエルシー株式会社から購入した（RRID:IMSR_JAX:000664）。Ｄｃｘ－ＧＦＰマウスは、Gong et al., Nature 425, p.917－925（2003）に記載の方法によって得た。Ｎｅｓｔｉｎ－ＣｒｅＥＲＴ２;ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）－ジフテリア毒素フラグメントＡ（ＤＴＡ）マウスは、Nat.Neurosci.11, 1153-61 (2008) に記載の方法によって得た。コモンマーモセット（Callithrix jacchus）は、飼育動物コロニーの交配ペアから得たものを用いた。タモキシフェンの投与は、Nat.Neurosci.11, 1153-61 (2008)に記載の方法により行なった。
（１）試料
野生型（ＷＴ）の雄および雌のＣ５７ＢＬ/６Ｊマウスを、日本エスエルシー株式会社から購入した（RRID:IMSR_JAX:000664）。Ｄｃｘ－ＧＦＰマウスは、Gong et al., Nature 425, p.917－925（2003）に記載の方法によって得た。Ｎｅｓｔｉｎ－ＣｒｅＥＲＴ２;ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）－ジフテリア毒素フラグメントＡ（ＤＴＡ）マウスは、Nat.Neurosci.11, 1153-61 (2008) に記載の方法によって得た。コモンマーモセット（Callithrix jacchus）は、飼育動物コロニーの交配ペアから得たものを用いた。タモキシフェンの投与は、Nat.Neurosci.11, 1153-61 (2008)に記載の方法により行なった。
【0033】
（２）大脳皮質損傷の誘発
傷害脳として、マウスの大脳皮質の損傷を人為的に誘発した。大脳皮質損傷の誘発は、以下に示すように、Ｗａｔｓｏｎらによって報告された(Watson et al., 1985)光刺激による虚血性脳傷害モデル（Photothrombosis）作製法を改良して行った。８～１２週齢のマウスに対し、吸入マスクを用いて酸素／イソフルラン混合ガス（９７．５／２．５％）を投与することによって麻酔し、その後、３７℃の加熱ベッドに寝かせた。頭皮を切開して頭蓋骨表面を露出させ、ブレグマおよび標的部位を明らかにした。光照射のための光源（ＭＳＧ６‐１１００Ｓ、モリテックス社製）に接続した直径８ｍｍの光ファイバーケーブルを、ブレグマの１ｍｍ前、２．７ｍｍ横に定位固定して頭蓋骨上に配置した。０．９％ ＮａＣｌ溶液中における光感受性ローズベンガル色素（３０ｍｇ／ｋｇ、３３００００－１Ｇ、Sigma-Aldrich社製）を活性化することにより、大脳皮質虚血傷害を誘発した。ローズベンガルは、静脈から注入した。ＭＨＡＡ－１００Ｗ－１００Ｖ（Moritex社製）を用いて、波長５３３ｎｍ、１５０ｍＷの条件で、頭蓋骨を１０分間照明した。コモンマーモセットに対しては、PLoS One.8, e60037 (2013)の記載に準じて、光刺激による虚血性脳傷害モデル（Photothrombosis）作製法を改良したものを用いた。コモンマーモセット（３か月齢）の脳虚血は、深麻酔下にローズベンガル（３０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射し、緑色光（５３３ｎｍ、メタルハライドランプ、PCS-MH357RC、日本ピーアイ社製）を５～１０分間照射することにより、血管内血栓症を誘発した。すべての手術は、メデトミジン（０．０４ｍｇ／ｋｇ）、ミダゾラム（０．４ｍｇ／ｋｇ）およびブトルファノール（０．４ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射により誘発された全身麻酔下で行われ、イソフルランにより維持され、アチパメゾール（０．１５ｍｇ／ｋｇ）により拮抗した。頭皮を切開して頭蓋骨表面を露出させ、洗浄してブレグマおよび標的部位を明らかにした。光照射のための光源（PLG-1-1000-3R-UX350、日本ピーアイ社製）に接続した直径１２ｍｍの光ファイバーケーブルを、頭蓋骨の前５ｍｍ、ブレグマの外側６ｍｍに定位固定して頭蓋骨上に配置した。
傷害脳として、マウスの大脳皮質の損傷を人為的に誘発した。大脳皮質損傷の誘発は、以下に示すように、Ｗａｔｓｏｎらによって報告された(Watson et al., 1985)光刺激による虚血性脳傷害モデル（Photothrombosis）作製法を改良して行った。８～１２週齢のマウスに対し、吸入マスクを用いて酸素／イソフルラン混合ガス（９７．５／２．５％）を投与することによって麻酔し、その後、３７℃の加熱ベッドに寝かせた。頭皮を切開して頭蓋骨表面を露出させ、ブレグマおよび標的部位を明らかにした。光照射のための光源（ＭＳＧ６‐１１００Ｓ、モリテックス社製）に接続した直径８ｍｍの光ファイバーケーブルを、ブレグマの１ｍｍ前、２．７ｍｍ横に定位固定して頭蓋骨上に配置した。０．９％ ＮａＣｌ溶液中における光感受性ローズベンガル色素（３０ｍｇ／ｋｇ、３３００００－１Ｇ、Sigma-Aldrich社製）を活性化することにより、大脳皮質虚血傷害を誘発した。ローズベンガルは、静脈から注入した。ＭＨＡＡ－１００Ｗ－１００Ｖ（Moritex社製）を用いて、波長５３３ｎｍ、１５０ｍＷの条件で、頭蓋骨を１０分間照明した。コモンマーモセットに対しては、PLoS One.8, e60037 (2013)の記載に準じて、光刺激による虚血性脳傷害モデル（Photothrombosis）作製法を改良したものを用いた。コモンマーモセット（３か月齢）の脳虚血は、深麻酔下にローズベンガル（３０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射し、緑色光（５３３ｎｍ、メタルハライドランプ、PCS-MH357RC、日本ピーアイ社製）を５～１０分間照射することにより、血管内血栓症を誘発した。すべての手術は、メデトミジン（０．０４ｍｇ／ｋｇ）、ミダゾラム（０．４ｍｇ／ｋｇ）およびブトルファノール（０．４ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射により誘発された全身麻酔下で行われ、イソフルランにより維持され、アチパメゾール（０．１５ｍｇ／ｋｇ）により拮抗した。頭皮を切開して頭蓋骨表面を露出させ、洗浄してブレグマおよび標的部位を明らかにした。光照射のための光源（PLG-1-1000-3R-UX350、日本ピーアイ社製）に接続した直径１２ｍｍの光ファイバーケーブルを、頭蓋骨の前５ｍｍ、ブレグマの外側６ｍｍに定位固定して頭蓋骨上に配置した。
【0034】
（３）連続ブロック表面走査型電子顕微鏡（ＳＢＦ－ＳＥＭ）
サンプル調製、ＳＢＦ－ＳＥＭ（Serial block-face scanning electron microscopy）による観察、取得データの解析は、若干の修正を加えた上で、既存の方法に沿って行った（Kaneko et al, 2018; Nguyen et al, 2016; Sawada et al, 2018; Thai et al, 2016）。成体の野生型マウスの脳を、２．５％グルタルアルデヒド（ＧＡ）および２％ＰＦＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で、４℃にて灌流固定し、同じ固定液を用いて４℃にて一晩さらに固定した。固定したＲＭＳ組織もしくは脳傷害近傍組織を、２％ ＯｓＯ４および１．５％ヘキサシアノ鉄酸カリウムを含むＰＢＳ中で４℃にて１時間処理した。その後、１％チオカルボヒドラジン中で室温にて２０分間処理した後、２％ＯｓＯ４水溶液中で室温にて３０分間処理し、その後、アスパラギン酸鉛水溶液中で６５℃にて３０分間処理した。その後，ＲＭＳ組織をエタノール段階希釈にて脱水し、脱水アセトンを用いて処理した後、Ｋｅｔｊｅｎ ｂｌａｃｋ ｐｏｗｄｅｒを含むＤｕｒｃｕｐａｎ樹脂に、９５℃で３時間埋め込んで重合した。3View in-chamber ultramicrotome system（Gatan社製）を搭載したＭｅｒｌｉｎおよびＳｉｇｍａ走査型電子顕微鏡（Carl Zeiss社製）を用いて、正常脳におけるＲＭＳ組織および傷害脳におけるＲＭＳ組織のＳＢＦ－ＳＥＭ観察を行った。連続画像は、幅４０．９６×４０．９６μｍ（５．０ｎｍ／ｐｉｘｅｌ）、深さ８０μｍ以上、８０ｎｍステップで作成された。また、連続画像は、ＦＩＪＩで処理された。細胞膜、核、遠心球のセグメンテーションは、Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｉｍａｇｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ（Belevich et al., 2016）を用いて行った。手動セグメンテーションは、全てのスライスで行った。移動する新生ニューロンおよびその細胞内器官の三次元再構成は、公知の方法によって、Ａｍｉｒａソフトウェア（Maxnet社製）を用いて行った（Kaneko et al., 2018; Sawada et al., 2018; Matsumoto et al., 2019）。
サンプル調製、ＳＢＦ－ＳＥＭ（Serial block-face scanning electron microscopy）による観察、取得データの解析は、若干の修正を加えた上で、既存の方法に沿って行った（Kaneko et al, 2018; Nguyen et al, 2016; Sawada et al, 2018; Thai et al, 2016）。成体の野生型マウスの脳を、２．５％グルタルアルデヒド（ＧＡ）および２％ＰＦＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で、４℃にて灌流固定し、同じ固定液を用いて４℃にて一晩さらに固定した。固定したＲＭＳ組織もしくは脳傷害近傍組織を、２％ ＯｓＯ４および１．５％ヘキサシアノ鉄酸カリウムを含むＰＢＳ中で４℃にて１時間処理した。その後、１％チオカルボヒドラジン中で室温にて２０分間処理した後、２％ＯｓＯ４水溶液中で室温にて３０分間処理し、その後、アスパラギン酸鉛水溶液中で６５℃にて３０分間処理した。その後，ＲＭＳ組織をエタノール段階希釈にて脱水し、脱水アセトンを用いて処理した後、Ｋｅｔｊｅｎ ｂｌａｃｋ ｐｏｗｄｅｒを含むＤｕｒｃｕｐａｎ樹脂に、９５℃で３時間埋め込んで重合した。3View in-chamber ultramicrotome system（Gatan社製）を搭載したＭｅｒｌｉｎおよびＳｉｇｍａ走査型電子顕微鏡（Carl Zeiss社製）を用いて、正常脳におけるＲＭＳ組織および傷害脳におけるＲＭＳ組織のＳＢＦ－ＳＥＭ観察を行った。連続画像は、幅４０．９６×４０．９６μｍ（５．０ｎｍ／ｐｉｘｅｌ）、深さ８０μｍ以上、８０ｎｍステップで作成された。また、連続画像は、ＦＩＪＩで処理された。細胞膜、核、遠心球のセグメンテーションは、Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｉｍａｇｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ（Belevich et al., 2016）を用いて行った。手動セグメンテーションは、全てのスライスで行った。移動する新生ニューロンおよびその細胞内器官の三次元再構成は、公知の方法によって、Ａｍｉｒａソフトウェア（Maxnet社製）を用いて行った（Kaneko et al., 2018; Sawada et al., 2018; Matsumoto et al., 2019）。
【0035】
（４）免疫組織化学と画像取得
マウス脳切片における免疫組織化学は、公知の方法に準じて実施した（Ota et al., 2014; Sawada et al., 2018）。より具体的には、マウス成体の脳を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）を用いて灌流固定し、同じ固定液を用いて４℃にて一晩さらに固定した。ビブラトーム（ＶＴ－１２００Ｓ、Ｌｅｉｃａ社製）を用いて５０μｍ厚の浮遊冠状断および矢状断を作成し、１０％正常ロバ血清（ＮＤＳ）および０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳをブロッキング溶液として、室温にて３０分間インキュベートした。これらの切片を、一次抗体とともにブロッキング溶液中で４℃にて一晩インキュベートし、その後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８／５６８／６４７標識二次抗体（１：１，０００、Invitrogen社製）とともにブロッキング溶液中で室温にて２時間インキュベートした。一次抗体としては、以下の抗体を用いた。ウサギ抗ダブルコルチン（Ｄｃｘ）（１：１，０００、４６０４Ｓ、Cell Signaling Technology社製；RRID:AB_10693771）、ウサギ抗ＤｓＲｅｄ（１：１，０００、６３２４９６、Clontech社製；RRID:AB_10013483）、マウスＩｇＭ抗ポリシアル化神経細胞接着分子（ＰＳＡ－ＮＣＡＭ）（１：１０００、東京医科大学 石 龍徳 名誉教授提供）（Seki and Arai, 1991）、ウサギ抗ＮｅｕＮ（１：１０００、ａｂ１７７４８７、Abcam社製）。コモンマーモセット脳切片の免疫組織化学は、Cereb.Cortex.30, 4092-4109 (2020)に記載の方法に沿って行なった。より具体的には、成体脳を０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流固定し、同じ固定液にて４℃で一晩さらに固定した。ビブラトーム（ＶＴ－１２００Ｓ、Ｌｅｉｃａ社製）を用いて厚さ６０μｍの冠状切片と矢状切片を作製し、ブロッキング液中で室温にて１時間インキュベートした。これらの切片を、ブロッキング液中で一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートし、その後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８／６４７標識二次抗体（１：１，０００、Invitrogen社製）とともにブロッキング液中で室温にて３時間インキュベートした。一次抗体として、モルモット抗Ｄｃｘ（１：４００、ＡＢ２２５３、Millipore社製；RRID:AB_1586992）および、マウスＩｇＭ抗ＰＳＡ－ＮＣＡＭ（１：４００）抗体を用いた。
マウス脳切片における免疫組織化学は、公知の方法に準じて実施した（Ota et al., 2014; Sawada et al., 2018）。より具体的には、マウス成体の脳を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）を用いて灌流固定し、同じ固定液を用いて４℃にて一晩さらに固定した。ビブラトーム（ＶＴ－１２００Ｓ、Ｌｅｉｃａ社製）を用いて５０μｍ厚の浮遊冠状断および矢状断を作成し、１０％正常ロバ血清（ＮＤＳ）および０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳをブロッキング溶液として、室温にて３０分間インキュベートした。これらの切片を、一次抗体とともにブロッキング溶液中で４℃にて一晩インキュベートし、その後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８／５６８／６４７標識二次抗体（１：１，０００、Invitrogen社製）とともにブロッキング溶液中で室温にて２時間インキュベートした。一次抗体としては、以下の抗体を用いた。ウサギ抗ダブルコルチン（Ｄｃｘ）（１：１，０００、４６０４Ｓ、Cell Signaling Technology社製；RRID:AB_10693771）、ウサギ抗ＤｓＲｅｄ（１：１，０００、６３２４９６、Clontech社製；RRID:AB_10013483）、マウスＩｇＭ抗ポリシアル化神経細胞接着分子（ＰＳＡ－ＮＣＡＭ）（１：１０００、東京医科大学 石 龍徳 名誉教授提供）（Seki and Arai, 1991）、ウサギ抗ＮｅｕＮ（１：１０００、ａｂ１７７４８７、Abcam社製）。コモンマーモセット脳切片の免疫組織化学は、Cereb.Cortex.30, 4092-4109 (2020)に記載の方法に沿って行なった。より具体的には、成体脳を０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流固定し、同じ固定液にて４℃で一晩さらに固定した。ビブラトーム（ＶＴ－１２００Ｓ、Ｌｅｉｃａ社製）を用いて厚さ６０μｍの冠状切片と矢状切片を作製し、ブロッキング液中で室温にて１時間インキュベートした。これらの切片を、ブロッキング液中で一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートし、その後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８／６４７標識二次抗体（１：１，０００、Invitrogen社製）とともにブロッキング液中で室温にて３時間インキュベートした。一次抗体として、モルモット抗Ｄｃｘ（１：４００、ＡＢ２２５３、Millipore社製；RRID:AB_1586992）および、マウスＩｇＭ抗ＰＳＡ－ＮＣＡＭ（１：４００）抗体を用いた。
【0036】
画像は、２０×対物レンズを装着したＬＳＭ ７００共焦点レーザースキャン顕微鏡（Carl Zeiss社製）を用いて、２μｍ間隔でスキャンすることにより取得した。Ｄｃｘ＋細胞（Ｄｃｘ陽性細胞）におけるＰＳＡ－ＮＣＡＭの蛍光強度は、ＺＥＮソフトウェア（Carl Zeiss社製）を用いて定量化した。５０μｍ厚の冠状断切片の６枚ごとに、傷害脳内のＤｃｘ陽性細胞またはＤｃｘ陽性ＮｅｕＮ陽性細胞を数えた。その合計に６を乗じることにより、半球あたりの総数を推定した。
【0037】
（５）リアルタイムＰＣＲ
正常脳および傷害脳におけるＮｅｕ１～Ｎｅｕ４のｍＲＮＡレベルを調べるために、深麻酔下において、正常または傷害７日後の野生型マウスの脳を頭蓋骨から速やかに取り出し、正常脳または傷害脳における皮質（Ｃｔｘ）、脳梁（ＣＣ）および線条体（Ｓｔ）を剥離した。以下の説明では、皮質と脳梁とを合わせて「Ｃｔｘ、ＣＣ」とも記載する。採取したサンプルからＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出には、ＲＮＡ抽出キット（CellAmp Direct RNA prep kit、Takara社製）を用いた。正常脳の皮質、脳梁、線条体または傷害脳の皮質、脳梁、線条体におけるＮｅｕ１～Ｎｅｕ４のｍＲＮＡレベルを調べるために、組織からＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen社製）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡは、SuperScript IV Reverse Transcriptase (Invitrogen社製)を用いて合成した。定量的ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置（Applied Biosystems社製）を用いて、公知の方法に沿って実施した（LS Zheng et al, 2015）。リアルタイムＰＣＲには、以下のプライマーを使用した。すなわち、５２ｂｐのＮｅｕ１産物を増幅するためのＮｅｕ１フォワードプライマー 5'-TGCCAGCCCTACGAGCTT-3'（配列番号１）およびＮｅｕ１リバースプライマー 5'-TGGTTCCGGCGTTGAT-3'（配列番号２）、６１ｂｐのＮｅｕ２産物を増幅するためのＮｅｕ２フォワードプライマー 5'-CCCTGGCGTGTATCAGAA-3'（配列番号３）、およびＮｅｕ２リバースプライマー 5'-AGCACAGCCGTGTGACATTAAC-3'（配列番号４）、６０ｂｐのＮｅｕ３産物を増幅するためのＮｅｕ３フォワードプライマー 5'-GGCTGGACGGCTGGTA-3'（配列番号５）およびＮｅｕ３リバースプライマー 5'-TCGAAATCGGCTTGGTGTTC-3'（配列番号６）、６１ｂｐのＮｅｕ４産物を増幅するためのＮｅｕ４フォワードプライマー 5'-AAGGCACGTCCTTCCTACCA-3'（配列番号７）およびＮｅｕ４リバースプライマー 5'-GCAACCACGAGCCGTCTCT-3'（配列番号８）、内在性コントロールとしての５５ｂｐのＧＡＰＤＨ産物を増幅するためのＧＡＰＤＨフォワードプライマー 5'-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3'（配列番号９）およびＧＡＰＤＨリバースプライマー 5'-CACGTCAGATCCA-3'（配列番号１０）を用いた。
正常脳および傷害脳におけるＮｅｕ１～Ｎｅｕ４のｍＲＮＡレベルを調べるために、深麻酔下において、正常または傷害７日後の野生型マウスの脳を頭蓋骨から速やかに取り出し、正常脳または傷害脳における皮質（Ｃｔｘ）、脳梁（ＣＣ）および線条体（Ｓｔ）を剥離した。以下の説明では、皮質と脳梁とを合わせて「Ｃｔｘ、ＣＣ」とも記載する。採取したサンプルからＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出には、ＲＮＡ抽出キット（CellAmp Direct RNA prep kit、Takara社製）を用いた。正常脳の皮質、脳梁、線条体または傷害脳の皮質、脳梁、線条体におけるＮｅｕ１～Ｎｅｕ４のｍＲＮＡレベルを調べるために、組織からＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen社製）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡは、SuperScript IV Reverse Transcriptase (Invitrogen社製)を用いて合成した。定量的ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置（Applied Biosystems社製）を用いて、公知の方法に沿って実施した（LS Zheng et al, 2015）。リアルタイムＰＣＲには、以下のプライマーを使用した。すなわち、５２ｂｐのＮｅｕ１産物を増幅するためのＮｅｕ１フォワードプライマー 5'-TGCCAGCCCTACGAGCTT-3'（配列番号１）およびＮｅｕ１リバースプライマー 5'-TGGTTCCGGCGTTGAT-3'（配列番号２）、６１ｂｐのＮｅｕ２産物を増幅するためのＮｅｕ２フォワードプライマー 5'-CCCTGGCGTGTATCAGAA-3'（配列番号３）、およびＮｅｕ２リバースプライマー 5'-AGCACAGCCGTGTGACATTAAC-3'（配列番号４）、６０ｂｐのＮｅｕ３産物を増幅するためのＮｅｕ３フォワードプライマー 5'-GGCTGGACGGCTGGTA-3'（配列番号５）およびＮｅｕ３リバースプライマー 5'-TCGAAATCGGCTTGGTGTTC-3'（配列番号６）、６１ｂｐのＮｅｕ４産物を増幅するためのＮｅｕ４フォワードプライマー 5'-AAGGCACGTCCTTCCTACCA-3'（配列番号７）およびＮｅｕ４リバースプライマー 5'-GCAACCACGAGCCGTCTCT-3'（配列番号８）、内在性コントロールとしての５５ｂｐのＧＡＰＤＨ産物を増幅するためのＧＡＰＤＨフォワードプライマー 5'-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3'（配列番号９）およびＧＡＰＤＨリバースプライマー 5'-CACGTCAGATCCA-3'（配列番号１０）を用いた。
【0038】
（６）ウイルスベクターおよびプラスミド
Ｎｅｕ１ノックダウンプラスミドおよびＮｅｕ４ノックダウンプラスミドの生成は、公知の方法に沿って行った（Ota et al, 2014）。より具体的には、マウスＮｅｕ１、Ｎｅｕ４、およびＬａｃＺ（比較例）遺伝子の標的配列を、ＤｓＲｅｄ－ｅｘｐｒｅｓｓを含む改変Ｂｌｏｃｋ－ｉＴ Ｐｏｌ ＩＩ ｍｉＲ ＲＮＡｉ発現ベクターに挿入した。Ｇａｔｅｗａｙシステム（Invitrogen社製）を用いて、以下のｐＣＳＩＩレンチウイルス発現ベクターを作製した（CSII-EF-DsRed-miR-Neu1、CSII-EF-DsRed-miR-Neu4、CSII-EF-DsRed-miR-LacZ ｍｉＲＮＡ）。これらのベクターにおけるノックダウン（ＫＤ）効率は、ウェスタンブロッティングにより評価した。なお、用いたｍｉＲＮＡの配列は、以下のとおりである。Ｎｅｕ１をノックダウンするためのｍｉＲＮＡインサート：TGCTGATAAGGAACACTATCCCTGTGGTTTTGGCCACTGACTGACCACAGGGAGTGTTCCTTAT（配列番号１１）、Ｎｅｕ４をノックダウンするためのｍｉＲＮＡインサート：TGCTGTTCATAGGAAGTCCTGGTCCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGGACCAGCTTCCTATGAA（配列番号１２）
Ｎｅｕ１ノックダウンプラスミドおよびＮｅｕ４ノックダウンプラスミドの生成は、公知の方法に沿って行った（Ota et al, 2014）。より具体的には、マウスＮｅｕ１、Ｎｅｕ４、およびＬａｃＺ（比較例）遺伝子の標的配列を、ＤｓＲｅｄ－ｅｘｐｒｅｓｓを含む改変Ｂｌｏｃｋ－ｉＴ Ｐｏｌ ＩＩ ｍｉＲ ＲＮＡｉ発現ベクターに挿入した。Ｇａｔｅｗａｙシステム（Invitrogen社製）を用いて、以下のｐＣＳＩＩレンチウイルス発現ベクターを作製した（CSII-EF-DsRed-miR-Neu1、CSII-EF-DsRed-miR-Neu4、CSII-EF-DsRed-miR-LacZ ｍｉＲＮＡ）。これらのベクターにおけるノックダウン（ＫＤ）効率は、ウェスタンブロッティングにより評価した。なお、用いたｍｉＲＮＡの配列は、以下のとおりである。Ｎｅｕ１をノックダウンするためのｍｉＲＮＡインサート：TGCTGATAAGGAACACTATCCCTGTGGTTTTGGCCACTGACTGACCACAGGGAGTGTTCCTTAT（配列番号１１）、Ｎｅｕ４をノックダウンするためのｍｉＲＮＡインサート：TGCTGTTCATAGGAAGTCCTGGTCCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGGACCAGCTTCCTATGAA（配列番号１２）
【0039】
レンチウイルス粒子を作製するために、レンチウイルスベクターとパッケージングベクター（pCAG-HIVgpおよびpCMV-VSV-G-RSV-Rev）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから３日後、ＭＸ－３０７微量冷却遠心機（Tomy社製）を用いて８０００ｒｐｍ、４℃で１６時間遠心分離し、培養上清を濃縮した。レンチウイルス懸濁液２μＬを、脳傷害７日後（ｄｐｉ）のマウスの損傷部位の周囲（１．８、１．６、１．４、１．２、１．０、０．８、０．５ｍｍ前方、ラムダ側方、１．５－２．０ｍｍ深さ）に、定位的に注入した。
【0040】
（７）Ｖ－ＳＶＺ由来新生ニューロンのＢＶ２細胞との共培養
Ｖ－ＳＶＺ由来の新生ニューロンのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養とタイムラプスイメージングを、J. Neurosci.39, 9967-9988 (2019)に記載の方法に準じて行なった。より具体的には、Ｐ０－Ｐ３雌雄野生型マウスのＶ－ＳＶＺ組織を解剖し、トリプシン－ＥＤＴＡ（Invitrogen社製）で解離した。４０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉ（Roche Diagnostics社製）を含むＬ－１５培地（Invitrogen社製）で細胞を洗浄し、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＶシステム（Lonza Walkersville社製）を用いてプラスミドｐＣＡＧＧＳ－ＥＧＦＰでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Thermo Fisher Scientific社製）に集められ、再凝集された。これらの細胞凝集塊を、６０％マトリゲル（BD Biosciences社製）に包埋したＢＶ２細胞（名古屋市立大学、植木孝俊博士より提供）の単層上に置き、２％ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ－２１（Invitrogen社製）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Invitrogen社製）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン-ストレプトマイシン（Invitrogen社製）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地で２日間培養し、タイムラプスイメージングを行なった。リポ多糖（ＬＰＳ；１００ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ）による細胞の処理は、ノイラミニダーゼ阻害剤（ＤＡＮＡまたはＺａｎａｍｉｖｉｒ；終濃度１ｍＭ）を併用または非併用で、J. Biol.Chem.290, 13202-14 (2015)に記載の方法に準じて行なった。蛍光顕微鏡（KEYENCE社製）および２０倍の対物レンズを用いて、無作為に選んだＥＧＦＰ発現新生ニューロンのタイムラプスイメージングを行なった。
Ｖ－ＳＶＺ由来の新生ニューロンのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養とタイムラプスイメージングを、J. Neurosci.39, 9967-9988 (2019)に記載の方法に準じて行なった。より具体的には、Ｐ０－Ｐ３雌雄野生型マウスのＶ－ＳＶＺ組織を解剖し、トリプシン－ＥＤＴＡ（Invitrogen社製）で解離した。４０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉ（Roche Diagnostics社製）を含むＬ－１５培地（Invitrogen社製）で細胞を洗浄し、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＶシステム（Lonza Walkersville社製）を用いてプラスミドｐＣＡＧＧＳ－ＥＧＦＰでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Thermo Fisher Scientific社製）に集められ、再凝集された。これらの細胞凝集塊を、６０％マトリゲル（BD Biosciences社製）に包埋したＢＶ２細胞（名古屋市立大学、植木孝俊博士より提供）の単層上に置き、２％ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ－２１（Invitrogen社製）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Invitrogen社製）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン-ストレプトマイシン（Invitrogen社製）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地で２日間培養し、タイムラプスイメージングを行なった。リポ多糖（ＬＰＳ；１００ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ）による細胞の処理は、ノイラミニダーゼ阻害剤（ＤＡＮＡまたはＺａｎａｍｉｖｉｒ；終濃度１ｍＭ）を併用または非併用で、J. Biol.Chem.290, 13202-14 (2015)に記載の方法に準じて行なった。蛍光顕微鏡（KEYENCE社製）および２０倍の対物レンズを用いて、無作為に選んだＥＧＦＰ発現新生ニューロンのタイムラプスイメージングを行なった。
【0041】
（８）ＥｎｄｏＮ処理方法およびノイラミニダーゼ阻害薬の投与方法
１μlのＰＢＳまたはＥｎｄｏＮ（１０ ｕｎｉｔｓ／μｌ）を側脳室（ブレグマから－０．２ｍｍ前方、０．６ｍｍ側方、２．０ｍｍ深部）に定位注入した。ノイラミニダーゼの阻害には、ＤＡＮＡ（N-Acetyl-2,3-didehydro-2-deoxyneuraminic acid）（５０ｍｇ／ｋｇ）、ザナミビル（５０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（コントロール）を、マウスでは７－２１ｄｐｉに、コモンマーモセットでは７－２８ｄｐｉに、毎日腹腔内に注射した。
１μlのＰＢＳまたはＥｎｄｏＮ（１０ ｕｎｉｔｓ／μｌ）を側脳室（ブレグマから－０．２ｍｍ前方、０．６ｍｍ側方、２．０ｍｍ深部）に定位注入した。ノイラミニダーゼの阻害には、ＤＡＮＡ（N-Acetyl-2,3-didehydro-2-deoxyneuraminic acid）（５０ｍｇ／ｋｇ）、ザナミビル（５０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（コントロール）を、マウスでは７－２１ｄｐｉに、コモンマーモセットでは７－２８ｄｐｉに、毎日腹腔内に注射した。
【0042】
（９）シアル酸の定量
解剖したマウスの脳サンプルを、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、プロテアーゼ阻害剤カクテル（１μｇ／ｍＬ アプロチニン、１μｇ／ｍＬ ロイペプチン、１μｇ／ｍＬ ペプスタチン、２μｇ／ｍＬアンチペイン）、および５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むＰＢＳでホモジナイズし、氷上で１時間インキュベートした。ホモジネートを遠心分離し、上清のタンパク質濃度をビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイで評価した。各サンプル中のシアル酸（Ｓｉａ）を、ＤＭＢ誘導体化法を用いて定量した。より詳細には、１μｌの脳ホモジネートを、０．２Ｍトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で８０℃にて２時間インキュベートして加水分解した。ＤＭＢ誘導体化のために、２０μｌの０．０１Ｍ ＴＦＡと２０μｌのＤＭＢ溶液とを乾燥試料に加え、５０℃で２時間インキュベートした。蛍光ＨＰＬＣ分析では、サンプルを１０倍に希釈し、ＪＡＳＣＯインテリジェント不活性サンプラー（ＡＳ－４０５０）からＨａｎｄｙ ＯＤＳカラム（２５０×４．６ｍｍ ｉ．ｄ.）（和光社製）に注入し、メタノール／アセトニトリル／水（７／９／８４、ｖ／ｖ／ｖ）で溶出した。ＨＰＬＣシステムは、ＪＡＳＣＯポンプ（ＰＵ－４１８０）、ＪＡＳＣＯ蛍光検出器（ＦＰ－２０２５ ｐｌｕｓ、励起波長３７３ｎｍ、発光波長４４８ｎｍ）、Chromato-PRO Integrator（Run Time Corporation社製）で構成された。
解剖したマウスの脳サンプルを、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、プロテアーゼ阻害剤カクテル（１μｇ／ｍＬ アプロチニン、１μｇ／ｍＬ ロイペプチン、１μｇ／ｍＬ ペプスタチン、２μｇ／ｍＬアンチペイン）、および５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むＰＢＳでホモジナイズし、氷上で１時間インキュベートした。ホモジネートを遠心分離し、上清のタンパク質濃度をビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイで評価した。各サンプル中のシアル酸（Ｓｉａ）を、ＤＭＢ誘導体化法を用いて定量した。より詳細には、１μｌの脳ホモジネートを、０．２Ｍトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で８０℃にて２時間インキュベートして加水分解した。ＤＭＢ誘導体化のために、２０μｌの０．０１Ｍ ＴＦＡと２０μｌのＤＭＢ溶液とを乾燥試料に加え、５０℃で２時間インキュベートした。蛍光ＨＰＬＣ分析では、サンプルを１０倍に希釈し、ＪＡＳＣＯインテリジェント不活性サンプラー（ＡＳ－４０５０）からＨａｎｄｙ ＯＤＳカラム（２５０×４．６ｍｍ ｉ．ｄ.）（和光社製）に注入し、メタノール／アセトニトリル／水（７／９／８４、ｖ／ｖ／ｖ）で溶出した。ＨＰＬＣシステムは、ＪＡＳＣＯポンプ（ＰＵ－４１８０）、ＪＡＳＣＯ蛍光検出器（ＦＰ－２０２５ ｐｌｕｓ、励起波長３７３ｎｍ、発光波長４４８ｎｍ）、Chromato-PRO Integrator（Run Time Corporation社製）で構成された。
【0043】
２．実験内容および結果
＜実験１：新生ニューロンの形態および細胞接着の確認＞
正常脳および傷害脳における新生ニューロンのｃｈａｉｎの形態および細胞接着を、ＳＢＦ－ＳＥＭを用いて観察した。また、細胞接着の割合を、ＳＢＦ－ＳＥＭの結果に基づき定量した。図４は、実験１におけるＳＢＦ－ＳＥＭの画像データを示す説明図である。図４の紙面上側は正常脳（Ｎｏｒｍａｌ）を示し、紙面下側は傷害脳（Ｉｎｊｕｒｙ）を示している。また、図４の紙面左側は細胞の鎖状の集団（ｃｈａｉｎ）を示しており、各細胞が色分けされている。図４の紙面右側は細胞接着の状態を示しており、薄い灰色で示される領域は、新生ニューロン同士が接着していることを示し、濃い灰色で示される領域は、ニューロン間の間隙（ｏｐｅｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐａｃｅ）を示している。
＜実験１：新生ニューロンの形態および細胞接着の確認＞
正常脳および傷害脳における新生ニューロンのｃｈａｉｎの形態および細胞接着を、ＳＢＦ－ＳＥＭを用いて観察した。また、細胞接着の割合を、ＳＢＦ－ＳＥＭの結果に基づき定量した。図４は、実験１におけるＳＢＦ－ＳＥＭの画像データを示す説明図である。図４の紙面上側は正常脳（Ｎｏｒｍａｌ）を示し、紙面下側は傷害脳（Ｉｎｊｕｒｙ）を示している。また、図４の紙面左側は細胞の鎖状の集団（ｃｈａｉｎ）を示しており、各細胞が色分けされている。図４の紙面右側は細胞接着の状態を示しており、薄い灰色で示される領域は、新生ニューロン同士が接着していることを示し、濃い灰色で示される領域は、ニューロン間の間隙（ｏｐｅｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐａｃｅ）を示している。
【0044】
新生ニューロンは、脳内においてｃｈａｉｎを形成しながら移動する。図４の紙面左側に示されるように、正常脳内のｃｈａｉｎは、細胞の向きが揃っており、それぞれの新生ニューロンがスムーズな形態を示している。これに対し、傷割脳内のｃｈａｉｎは、細胞の向きが不均一であり、それぞれの新生ニューロンの形態もイレギュラーであることがわかる。
【0045】
図５は、実験１の結果としての細胞接着の割合を説明する説明図である。図５では、図４の紙面右側と同様に、新生ニューロン同士が接着している領域（Ｎｅｗ ｎｅｕｒｏｎｓ）が薄い灰色で示され、ニューロン間の間隙が濃い灰色で示され、その他の細胞と接着している領域が白色で示されている。図５の縦軸は、各領域の面積の割合（Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）を百分率（％）で示している。図４の紙面右側および図５に示されるように、傷害脳では、正常脳と比較して、ニューロン間の間隙が有意に少なく、新生ニューロン同士が接着している領域の面積の割合が有意に大きかった。ニューロン間の間隙は、集団で移動する新生ニューロンの特徴として知られている。このため、傷害脳内を移動する新生ニューロンでは、正常脳よりも細胞接着が過剰になり、この結果として移動障害が生じていることが示唆された。
【0046】
＜実験２：正常脳と傷害脳における新生ニューロンのＰＳＡシグナル強度の比較＞
正常脳内を移動する新生ニューロンの表面には、ポリシアル酸（ＰＳＡ）が存在する。また、ＰＳＡは、新生ニューロンのマーカーとしても幅広く使用されている。しかしながら、傷害脳内を移動する新生ニューロンのＰＳＡの詳細は、これまで明らかされていなかった。そこで、本願発明者らは、正常脳と傷害脳における新生ニューロンのＰＳＡシグナル強度を比較した。
正常脳内を移動する新生ニューロンの表面には、ポリシアル酸（ＰＳＡ）が存在する。また、ＰＳＡは、新生ニューロンのマーカーとしても幅広く使用されている。しかしながら、傷害脳内を移動する新生ニューロンのＰＳＡの詳細は、これまで明らかされていなかった。そこで、本願発明者らは、正常脳と傷害脳における新生ニューロンのＰＳＡシグナル強度を比較した。
【0047】
図６は、実験２における顕微鏡画像を示す説明図である。図６の紙面上側は正常脳（Ｎｏｒｍａｌ）を示し、紙面下側は傷害脳（Ｉｎｊｕｒｙ）を示している。また、図６の紙面左側はＤｃｘの発現を示し、図６の紙面右側はＰＳＡ－ＮＣＡＭの発現を示している。なお、Ｄｃｘは、幼若ニューロンのマーカーであり、ＰＳＡ－ＮＣＡＭは、ポリシアル化された神経細胞接着分子である。図７は、実験２におけるＰＳＡ－ＮＣＡＭの蛍光強度を示す説明図である。図７では、Ｄｃｘ陽性細胞におけるＰＳＡ－ＮＣＡＭの蛍光強度が示されている。
【0048】
図６および図７に示す結果から、以下のことがわかった。すなわち、傷害脳の新生ニューロンにおいてもＰＳＡの発現が認められたが、そのシグナル強度は、正常脳の新生ニューロンと比べて有意に低下することがわかった。この結果は、傷害脳内において、移動する新生ニューロン同士の接着が過剰となることについて、ＰＳＡレベルの減少が関与していることを示唆している。
【0049】
＜実験３：ＰＳＡ分解酵素の投与によるニューロン間接着への影響の確認＞
ＰＳＡの存在が新生ニューロンの接着に影響を与えるか否かを調べるために、正常脳内にＰＳＡの分解酵素であるｅｎｄｏｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅＮ（ｅｎｄｏＮ）を投与し、新生ニューロンにおけるＰＳＡの除去を行なった。具体的には、Ｄｃｘ－ＧＦＰマウスの側室脳に、１μＬのＰＢＳ（phosphate-buffered saline、比較例）または１μＬのｅｎｄｏＮ（１０ｕｎｉｔｓ／μＬ）を注射した。３日後に固定し、免疫組織化学による観察およびＳＢＦ－ＳＥＭによる観察を行った。
ＰＳＡの存在が新生ニューロンの接着に影響を与えるか否かを調べるために、正常脳内にＰＳＡの分解酵素であるｅｎｄｏｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅＮ（ｅｎｄｏＮ）を投与し、新生ニューロンにおけるＰＳＡの除去を行なった。具体的には、Ｄｃｘ－ＧＦＰマウスの側室脳に、１μＬのＰＢＳ（phosphate-buffered saline、比較例）または１μＬのｅｎｄｏＮ（１０ｕｎｉｔｓ／μＬ）を注射した。３日後に固定し、免疫組織化学による観察およびＳＢＦ－ＳＥＭによる観察を行った。
【0050】
図８は、実験３における顕微鏡画像を示す説明図である。図８の紙面上側は比較例（Ｃｔｒｌ）を示し、紙面下側はｅｎｄｏＮ投与群（ＥｎｄｏＮ）を示している。また、図８の紙面左側はＤｃｘの発現を示し、紙面中央はＰＳＡ－ＮＣＡＭの発現を示し、紙面右側はＳＢＦ－ＳＥＭ画像を示している。ＳＢＦ－ＳＥＭ画像において、薄い灰色で示される領域は、新生ニューロン同士が接着していることを示し、濃い灰色で示される領域は、ニューロン間の間隙を示している。図９は、実験３の結果としての細胞接着の割合を説明する説明図である。図９では、図４の紙面右側および図８の紙面右側と同様に、新生ニューロン同士が接着している領域が薄い灰色で示され、ニューロン間の間隙が濃い灰色で示され、その他の細胞と接着している領域が白色で示されている。図９の縦軸は、各領域の面積の割合を百分率（％）で示している。
【0051】
図８の紙面中央に示されるように、ｅｎｄｏＮ投与群では、比較例と比べて、ＰＳＡのシグナル強度が著しく減少していた。図８の紙面右側および図９に示されるように、ＳＢＦ－ＳＥＭによる細胞接着の三次元的な観察によれば、ｅｎｄｏＮ投与群では、ニューロン間の間隙の割合が有意に減少するとともに、ニューロン間の接着の割合が増加していることが明らかとなった。図８および図９に示される結果によれば、傷害脳内では、ＰＳＡが減少することによって過剰な細胞接着が引き起こされていることが示唆された。
【0052】
＜実験４：ＰＳＡの減少にノイラミニダーゼが関与する可能性の検討＞
傷害脳内を移動する新生ニューロンにおけるＰＳＡの低下に、シアル酸を加水分解する酵素であるノイラミニダーゼ（Ｎｅｕ）が関与する可能性について検討した。正常脳と傷害脳とについて、皮質（Cerebral cortex：Ｃｔｘ）および脳梁（corpus callosum：ＣＣ）、線条体（striatum：Ｓｔ）におけるＮｅｕ１～４の発現レベル（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）を、リアルタイムＰＣＲを用いて定量した。
傷害脳内を移動する新生ニューロンにおけるＰＳＡの低下に、シアル酸を加水分解する酵素であるノイラミニダーゼ（Ｎｅｕ）が関与する可能性について検討した。正常脳と傷害脳とについて、皮質（Cerebral cortex：Ｃｔｘ）および脳梁（corpus callosum：ＣＣ）、線条体（striatum：Ｓｔ）におけるＮｅｕ１～４の発現レベル（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）を、リアルタイムＰＣＲを用いて定量した。
【0053】
図１０は、正常脳と傷害脳とにおけるＮｅｕ１～４の発現レベルを示す説明図である。図１０のグラフでは、正常脳における結果が白色で示され、傷害脳における結果が黒色で示され、皮質と脳梁とにおける発現量がまとめて示されている。図１０の縦軸は、正常脳の皮質と脳梁とにおける発現量の合計を１とした場合の、相対的な発現レベルを示している。
【0054】
図１０の結果から、以下のことがわかった。すなわち、傷害脳においては、線条体におけるＮｅｕ１の発現レベルと、全領域におけるＮｅｕ４の発現レベルとが、正常脳の発現レベルと比較して上昇していることが確認された。特に、Ｎｅｕ４については、傷害脳では正常脳と比較して発現レベルが２倍以上上昇していた。
【0055】
図１１は、傷害脳におけるＮｅｕ１～４の発現レベルを比較して示す説明図である。図１１のグラフでは、皮質と脳梁とにおける発現量がまとめて示されており、図１１の縦軸は、発現量が最も低い線条体におけるＮｅｕ３の発現量を１とした場合の、相対的な発現レベルを示している。
【0056】
図１１の結果から、以下のことがわかった。すなわち、皮質および脳梁、線条体のいずれにおいても、Ｎｅｕ１およびＮｅｕ４の発現レベルが高かった。図１０および図１１に示される結果から、傷害脳におけるＰＳＡの減少には、Ｎｅｕ１およびＮｅｕ４が主に関与していることが示唆された。
【0057】
＜実験５：Ｎｅｕ１およびＮｅｕ４の発現抑制による影響の確認＞
Ｎｅｕ１およびＮｅｕ４に関して、傷害脳における新生ニューロンのＰＳＡレベルと移動に対する影響を調べるために、傷害周囲の細胞にｍｉＮｅｕ１、ｍｉＮｅｕ４を発現するウイルスを感染させて遺伝子の発現を抑制した。比較例としては、ＬａｃＺ遺伝子をノックダウンするノックダウンベクターを用いた。脳傷害７日後にウイルスに感染させ、脳傷害２１日後に固定し、免疫組織化学による観察および解析を行った。
Ｎｅｕ１およびＮｅｕ４に関して、傷害脳における新生ニューロンのＰＳＡレベルと移動に対する影響を調べるために、傷害周囲の細胞にｍｉＮｅｕ１、ｍｉＮｅｕ４を発現するウイルスを感染させて遺伝子の発現を抑制した。比較例としては、ＬａｃＺ遺伝子をノックダウンするノックダウンベクターを用いた。脳傷害７日後にウイルスに感染させ、脳傷害２１日後に固定し、免疫組織化学による観察および解析を行った。
【0058】
図１２は、実験５におけるマウスの脳損傷部位を模式的に示す説明図である。図１３は、実験５における顕微鏡画像を示す説明図である。図１３の紙面左側はコントロール群を示し、紙面中央はＮｅｕ１ノックダウン群を示し、紙面右側はＮｅｕ４ノックダウン群を示している。また、紙面上側の画像では、ＤｓＲｅｄ、ＤｃｘおよびＰＳＡ－ＮＣＡＭが示されるとともに、脳損傷部位が破線で示され、傷害部に移動する新生ニューロンが矢印で示されている。紙面下側におけるＤｃｘの発現を示す画像およびＰＳＡ－ＮＣＡＭの発現を示す画像では、紙面上側の画像における四角の枠で囲んだ領域を拡大して示している。図１４は、実験５におけるシグナル強度を示す説明図である。図１４の紙面左側は、ＰＳＡ－ＮＣＡＭのシグナル強度を示し、図１４の紙面右側は、脳損傷部位に局在するＤｃｘ陽性細胞のシグナル強度を示している。
【0059】
図１３および図１４に示す結果から、以下のことがわかった。すなわち、Ｎｅｕ１ノックダウン群およびＮｅｕ４ノックダウン群では、コントロール群に比べて、傷害部へ向かう新生ニューロンのＰＳＡシグナル強度が有意に増加していた。さらに、Ｎｅｕ１ノックダウン群およびＮｅｕ４ノックダウン群では、コントロール群に比べて、傷害部へ移動する新生ニューロンが有意に増加していた。以上の結果から、傷害脳におけるＮｅｕ１の発現抑制およびＮｅｕ４の発現抑制は、新生ニューロンにおけるＰＳＡの維持をもたらし、傷害部への新生ニューロンの移動を促進できることが示唆された。
【0060】
＜実験６：ノイラミニダーゼ阻害剤投与による新生ニューロン移動促進の確認＞
より広範囲における脳組織中のノイラミニダーゼを阻害するために、ノイラミニダーゼ阻害剤として、N-Acetyl-2,3-didehydro-2-deoxyneuraminic Acid（ＤＡＮＡ）または抗インフルエンザ薬のザナミビル（Ｚａｎａｍｉｖｉｒ）を、５０ｍｇ／ｋｇの条件で、脳傷害７日後から２１日後まで、１４日間連続で腹腔内注射によって投与した。コントロール群には、ＰＢＳを同条件で腹腔内注射によって投与した。脳傷害２１日後に固定し、免疫組織化学による観察および解析を行った。
より広範囲における脳組織中のノイラミニダーゼを阻害するために、ノイラミニダーゼ阻害剤として、N-Acetyl-2,3-didehydro-2-deoxyneuraminic Acid（ＤＡＮＡ）または抗インフルエンザ薬のザナミビル（Ｚａｎａｍｉｖｉｒ）を、５０ｍｇ／ｋｇの条件で、脳傷害７日後から２１日後まで、１４日間連続で腹腔内注射によって投与した。コントロール群には、ＰＢＳを同条件で腹腔内注射によって投与した。脳傷害２１日後に固定し、免疫組織化学による観察および解析を行った。
【0061】
図１５は、実験６における顕微鏡画像を示す説明図である。図１５の紙面左側はコントロール群を示し、紙面中央はＤＡＮＡ投与群を示し、紙面右側はザナミビル投与群を示している。また、紙面上側の画像では、脳梁、線条体および脳室に亘る比較的広範囲の領域が示されており、紙面下側には、Ｄｃｘの発現を示す画像およびＰＳＡ－ＮＣＡＭの発現を示す画像の代表例が示されている。図１６は、実験６におけるシグナル強度を示す説明図である。図１６の紙面左側は、ＰＳＡ－ＮＣＡＭのシグナル強度を示し、図１６の紙面右側は、脳損傷部位を取り囲むＤｃｘ陽性細胞のシグナル強度を示している。
【0062】
図１５および図１６に示す結果から、以下のことがわかった。すなわち、ノイラミニダーゼ阻害剤投与群では、コントロール群に比べて、傷害部へ向かう新生ニューロンのＰＳＡシグナル強度が有意に増加していた。さらに、ノイラミニダーゼ阻害剤投与群では、コントロール群に比べて、傷害部へ移動する新生ニューロンが有意に増加していた。これらの結果は、ノイラミニダーゼ阻害剤投与によって、新生ニューロンにおけるＰＳＡの維持および傷害部への移動が促進されることを示唆している。
【0063】
＜実験７：ノイラミニダーゼ阻害剤投与によるニューロン再生促進の確認＞
ノイラミニダーゼ阻害剤の投与がニューロン再生に寄与するか否かを調べるために、ノイラミニダーゼ阻害剤としてのＤＡＮＡを、５０ｍｇ／ｋｇの条件で、脳傷害７日後から２１日後まで、１４日間連続で腹腔内注射によって投与した。コントロール群には、ＰＢＳを同条件で腹腔内注射によって投与した。脳傷害３５日後に固定し、免疫組織化学による観察および解析を行った。
ノイラミニダーゼ阻害剤の投与がニューロン再生に寄与するか否かを調べるために、ノイラミニダーゼ阻害剤としてのＤＡＮＡを、５０ｍｇ／ｋｇの条件で、脳傷害７日後から２１日後まで、１４日間連続で腹腔内注射によって投与した。コントロール群には、ＰＢＳを同条件で腹腔内注射によって投与した。脳傷害３５日後に固定し、免疫組織化学による観察および解析を行った。
【0064】
図１７は、実験７における顕微鏡画像を示す説明図である。図１７の紙面左側はコントロール群を示し、紙面右側はＤＡＮＡ投与群を示している。また、紙面上側の画像では、Ｄｃｘおよび成熟ニューロンのマーカーであるＮｅｕＮが示されている。紙面下側におけるＤｃｘおよびＮｅｕＮの発現を示す画像およびＤｃｘの発現のみを示す画像では、紙面上側の画像における四角の枠で囲んだ領域を拡大して示している。図１７では、Ｄｃｘ陽性ＮｅｕＮ陽性細胞、すなわちＤｃｘおよびＮｅｕＮの二重陽性細胞が、矢印で示されている。図１８は、実験７における二重陽性細胞の数を示す説明図である。図１８では、側脳室－脳室下帯（ventricular-subventricular zone：Ｖ－ＳＶＺ）から６００μｍ以下の距離に位置する二重陽性細胞の数と、６００μｍよりも離れて位置する二重陽性細胞の数とがそれぞれ示されている。
【0065】
図１７および図１８に示す結果から、以下のことがわかった。すなわち、ノイラミニダーゼ阻害剤投与群では、コントロール群に比べて、傷害周囲にＮｅｕＮを発現する新生ニューロンが有意に増加することが明らかとなった。さらに、ノイラミニダーゼ阻害剤投与群では、コントロール群に比べて、新生ニューロンが産生される脳室下帯から６００μｍ以上離れた位置に分布する二重陽性細胞の数が有意に増加することが明らかとなった。これらの結果から、ノイラミニダーゼ阻害剤投与によって新生ニューロンの移動が促進されるとともに、新生ニューロンが傷害部位に到達して成熟することが示唆された。
【0066】
＜実験８：ノイラミニダーゼ阻害剤投与による運動機能の回復の確認＞
ノイラミニダーゼ阻害剤投与が、傷害によって失われた運動機能の回復に寄与するか否かを調べた。ノイラミニダーゼ阻害剤としてのＤＡＮＡまたはザナミビルを、５０ｍｇ／ｋｇの条件で、新生ニューロンの移動が開始すると想定される脳傷害７日後から、２１日後まで１４日間連続で腹腔内注射によって投与した。コントロール群には、ＰＢＳを同条件で腹腔内注射によって投与した。脳傷害前、脳傷害７日後、脳傷害３５日後に、Foot Fault Test（ＦＦＴ）を行った。新生ニューロンの移動のピークが終了して新生ニューロンが成熟を始めると想定される脳傷害３５日後に運動機能の解析を行った。
ノイラミニダーゼ阻害剤投与が、傷害によって失われた運動機能の回復に寄与するか否かを調べた。ノイラミニダーゼ阻害剤としてのＤＡＮＡまたはザナミビルを、５０ｍｇ／ｋｇの条件で、新生ニューロンの移動が開始すると想定される脳傷害７日後から、２１日後まで１４日間連続で腹腔内注射によって投与した。コントロール群には、ＰＢＳを同条件で腹腔内注射によって投与した。脳傷害前、脳傷害７日後、脳傷害３５日後に、Foot Fault Test（ＦＦＴ）を行った。新生ニューロンの移動のピークが終了して新生ニューロンが成熟を始めると想定される脳傷害３５日後に運動機能の解析を行った。
【0067】
図１９は、ＦＦＴの様子を示す説明図である。ＦＦＴは、行動テストの一つであり、網の上をマウスに歩行させることで、マウス手足の網からの滑落の頻度を左右で比較し、歩行機能を評価するテストである。ＦＦＴは、公知の方法に修正を加えて行った（Hernandez et al., 1988）。具体的には、マウスを幅４０ｍｍの開口部を持つ高架のワイヤー製六角格子上に置き、自由に歩き回れるようにした。マウスが滑ったり、手足がグリッドの隙間に落ちたりして転倒した場合、フットフォールトとしてミスステップを記録した。各肢のフットフォールト数を１０分間数え、４肢の合計数に対する対側（左）の前肢と後肢のフォールト数の比率をパーセンテージで求めた。
【0068】
図２０は、実験８の結果を示す説明図である。図２０の縦軸は、左側手足が網から落ちる割合を示している。図２０に示す結果から、以下のことがわかった。すなわち、左側手足が網から落ちる割合は、ノイラミニダーゼ阻害剤投与群とコントロール群とにおいて、傷害前にはいずれも５０％程度であり、傷害７日後には、その割合が両群ともに傷害前より増加した。これに対して、傷害３５日後には、コントロール群よりもノイラミニダーゼ阻害剤投与群において、左側滑落割合が有意に減少した。以上の結果から、脳梗塞等によって失われた運動機能は、新生ニューロンの移動が活発な期間にノイラミニダーゼ阻害剤を投与することによって、回復が促進されることが示唆された。
【0069】
＜実験９：傷害脳におけるシアル酸の定量＞
実験６の追加実験として、正常脳のＲＭＳ（rostral migratory stream：吻側移動流）と、傷害部位からの距離が異なる領域１および領域２とにおけるシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の濃度を、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いて定量的に分析した。ＤＡＮＡ投与群およびザナミビル投与群のｎ数はそれぞれ４とし、ノイラミニダーゼ阻害剤に代えてＰＢＳを投与したコントロール群のｎ数は３とし、多重比較にはＴｕｋｅｙ検定を用いた。なお、エラーバーは平均値±平均値の標準誤差を示す。
実験６の追加実験として、正常脳のＲＭＳ（rostral migratory stream：吻側移動流）と、傷害部位からの距離が異なる領域１および領域２とにおけるシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の濃度を、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いて定量的に分析した。ＤＡＮＡ投与群およびザナミビル投与群のｎ数はそれぞれ４とし、ノイラミニダーゼ阻害剤に代えてＰＢＳを投与したコントロール群のｎ数は３とし、多重比較にはＴｕｋｅｙ検定を用いた。なお、エラーバーは平均値±平均値の標準誤差を示す。
【0070】
図２１は、実験９においてシアル酸の定量に用いた脳領域を模式的に示す説明図である。図２２は、実験９におけるシアル酸の定量結果を示す説明図である。図２２において、紙面左側はＲＭＳと傷害脳領域との比較を示し、紙面中央は領域１における各群の比較を示し、紙面右側は領域２における各群の比較を示している。図２２に示す結果から、以下のことがわかった。すなわち、傷害脳領域（領域１および領域２）におけるシアル酸濃度は、正常なＲＭＳにおけるシアル酸濃度と比較して、有意に低下していた。また、ノイラミニダーゼ阻害剤の投与により、領域１および領域２の両領域において、シアル酸が増加した。これらの結果によれば、傷害によってＰＳＡが減少するが、いずれの傷害領域においても、ノイラミニダーゼ阻害剤投与によって、シアル酸が増加することが明らかとなった
【0071】
＜実験１０：Ｖ－ＳＶＺ由来新生ニューロンのＢＶ２細胞との共培養＞
図２３は、実験１０の概要を示す説明図である。ノイラミニダーゼ阻害剤投与により、ニューロンの移動が促進されるかどうかを調べるために、傷害を受けた脳を模倣するｉｎ ｖｉｔｒｏ系として、新生ニューロン細胞とミクログリア細胞株ＢＶ２の共培養を行なった。ミクログリア細胞株ＢＶ２は、ＬＰＳ刺激によってノイラミニダーゼを放出することが報告されている（J. Biol.Chem.290, 13202-14 (2015)）。そこで、共培養を行なって、ＬＰＳ添加後のＰＳＡシグナル強度を調べるとともに、タイムラプスイメージングにより新生ニューロンの移動速度を調べた。以下の説明において、「ＬＰＳ－」はＬＰＳ非添加のコントロールを示し、「ＬＰＳ＋」はＬＰＳを添加したことを示している。ＰＳＡシグナル強度の解析では、コントロール（ＬＰＳ－）のｎ数は６とし、ＰＢＳ（ＬＰＳ＋）、ＤＡＮＡ（ＬＰＳ＋）、Ｚａｎａｍｉｖｉｒ（ＬＰＳ＋）のｎ数はいずれも１０とした。タイムラプスイメージングでは、コントロール（ＬＰＳ－）のｎ数は８とし、ＰＢＳ（ＬＰＳ＋）、ＤＡＮＡ（ＬＰＳ＋）、Ｚａｎａｍｉｖｉｒ（ＬＰＳ＋）のｎ数はいずれも３０とした。いずれも、多重比較にはＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いた。なお、エラーバーは平均値±平均値の標準誤差を示す。
図２３は、実験１０の概要を示す説明図である。ノイラミニダーゼ阻害剤投与により、ニューロンの移動が促進されるかどうかを調べるために、傷害を受けた脳を模倣するｉｎ ｖｉｔｒｏ系として、新生ニューロン細胞とミクログリア細胞株ＢＶ２の共培養を行なった。ミクログリア細胞株ＢＶ２は、ＬＰＳ刺激によってノイラミニダーゼを放出することが報告されている（J. Biol.Chem.290, 13202-14 (2015)）。そこで、共培養を行なって、ＬＰＳ添加後のＰＳＡシグナル強度を調べるとともに、タイムラプスイメージングにより新生ニューロンの移動速度を調べた。以下の説明において、「ＬＰＳ－」はＬＰＳ非添加のコントロールを示し、「ＬＰＳ＋」はＬＰＳを添加したことを示している。ＰＳＡシグナル強度の解析では、コントロール（ＬＰＳ－）のｎ数は６とし、ＰＢＳ（ＬＰＳ＋）、ＤＡＮＡ（ＬＰＳ＋）、Ｚａｎａｍｉｖｉｒ（ＬＰＳ＋）のｎ数はいずれも１０とした。タイムラプスイメージングでは、コントロール（ＬＰＳ－）のｎ数は８とし、ＰＢＳ（ＬＰＳ＋）、ＤＡＮＡ（ＬＰＳ＋）、Ｚａｎａｍｉｖｉｒ（ＬＰＳ＋）のｎ数はいずれも３０とした。いずれも、多重比較にはＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いた。なお、エラーバーは平均値±平均値の標準誤差を示す。
【0072】
図２４は、実験１０における顕微鏡画像の代表例を示す説明図である。図２４の紙面上側はＤｃｘおよびＰＳＡ－ＮＣＡＭの発現を示す画像であり、紙面下側はＰＳＡ－ＮＣＡＭの発現のみを示す画像である。図２５は、実験１０におけるＰＳＡシグナル強度を示す説明図である。図２４および図２５に示す結果から、以下のことがわかった。すなわち、コントロール（ＬＰＳ－）とＰＢＳ（ＬＰＳ＋）との比較からわかるように、ＬＰＳ刺激によってＰＳＡシグナルが低下するが、ノイラミニダーゼ阻害剤としてのＤＡＮＡやＺａｎａｍｉｖｉｒを添加することによって、ＰＳＡシグナル強度が維持されることがわかった。
【0073】
図２６は、実験１０におけるタイムラプスイメージングの結果を示す説明図である。図２６において、各タイムラプス画像の上側に付された数字は、最初の撮像フレームから何分後に撮影されたかを示している。また、図２６では、新生ニューロンの位置を矢頭（arrowhead）で示している。図２７は、実験１０におけるニューロンの移動速度を示す説明図である。図２６および図２７に示す結果から、以下のことがわかった。すなわち、ＬＰＳ刺激によってニューロンの移動速度が低下するが、ノイラミニダーゼ阻害剤を添加することによって、ニューロンの移動速度が回復することが明らかとなった。以上の結果から、ノイラミニダーゼ阻害剤を投与することによって新生ニューロンにおけるＰＳＡが維持され、ニューロンの移動が促進されることが示唆された。
【0074】
＜実験１１：ノイラミニダーゼ阻害剤投与によるニューロン再生促進の確認＞
実験７の追加実験として、ノイラミニダーゼ阻害剤としてのＤＡＮＡおよびザナミビルを用いた実験を行なった。脳傷害７日後から１４日間、ノイラミニダーゼ阻害剤を５０ｍｇ／ｋｇの条件で腹腔内注射によって投与し、脳傷害から３５日後に固定し、免疫組織化学による観察および解析を行なった。
実験７の追加実験として、ノイラミニダーゼ阻害剤としてのＤＡＮＡおよびザナミビルを用いた実験を行なった。脳傷害７日後から１４日間、ノイラミニダーゼ阻害剤を５０ｍｇ／ｋｇの条件で腹腔内注射によって投与し、脳傷害から３５日後に固定し、免疫組織化学による観察および解析を行なった。
【0075】
図２８は、実験１１における顕微鏡画像の代表例を示す説明図である。図２８の紙面左側はコントロール群を示し、紙面中央はＤＡＮＡ投与群を示し、紙面右側はザナミビル投与群を示している。また、紙面上側の画像では、ＤｃｘおよびＮｅｕＮが示されている。紙面下側におけるＤｃｘおよびＮｅｕＮの発現を示す画像およびＤｃｘの発現のみを示す画像では、紙面上側の画像における四角の枠で囲んだ領域を拡大して示している。図２８では、ＤｃｘおよびＮｅｕＮの二重陽性細胞が、矢印で示されている。なお、ＤｃｘおよびＮｅｕＮの二重陽性細胞は、枝分かれした長い突起を持つ成熟した形態を示している。図２９は、実験１１における二重陽性細胞の数を示す説明図である。図２９では、Ｖ－ＳＶＺから６００μｍ以下の距離に位置する二重陽性細胞の数と、６００μｍよりも離れて位置する二重陽性細胞の数とがそれぞれ示されている。
【0076】
図２８および図２９に示す結果から、以下のことがわかった。すなわち、実験７と同様に、ノイラミニダーゼ阻害剤投与群では、コントロール群に比べて、傷害周囲にＮｅｕＮを発現する新生ニューロンが有意に増加していた。また、実験７と同様に、ノイラミニダーゼ阻害剤投与群では、コントロール群に比べて、Ｖ－ＳＶＺから６００μｍ以上離れた位置に分布する二重陽性細胞の数が有意に増加していた。実験１１の結果からも、ノイラミニダーゼ阻害剤投与によって、傷害脳における新生ニューロンの移動が促進され、損傷部位に到達して成熟することが示された。
【0077】
＜実験１２：運動機能の回復がニューロン再生に起因するかについての確認＞
上述の実験８によれば、ノイラミニダーゼ阻害剤の投与によって運動機能の回復が確認された。このため、次に、阻害剤投与動物で観察された機能回復が、Ｖ－ＳＶＺ由来ニューロンの再生によるものかどうかを調べるために、新生ニューロンを特異的に除去するシステム（Ｎｅｓｔｉｎ－ＣｒｅＥＲＴ２；ＮＳＥ－ＤＴＡ）を使用した。Ｎｅｓｔｉｎ－ＣｒｅＥＲＴ２；ＮＳＥ－ＤＴＡマウスに、傷害の２０日前からタモキシフェンを８回注射することにより、ニューロン特異的にジフテリア毒素を発現し、細胞死を起こさせた。その後、脳傷害を行なった。傷害７日後からザナミビルを５０ｍｇ／ｋｇの条件で腹腔内注射によって１４日間投与し、ザナミビル投与終了１４日後に、行動テスト（ＦＦＴ）を行なうとともに、ＤｃｘおよびＮｅｕＮの二重陽性細胞の解析を行なった。なお、コントロールとして、ＮＳＥ－ＤＴＡマウスを用いた。各群のｎ数は３とし、ｔ検定を用いた。なお、エラーバーは平均値±平均値の標準誤差を示す。
上述の実験８によれば、ノイラミニダーゼ阻害剤の投与によって運動機能の回復が確認された。このため、次に、阻害剤投与動物で観察された機能回復が、Ｖ－ＳＶＺ由来ニューロンの再生によるものかどうかを調べるために、新生ニューロンを特異的に除去するシステム（Ｎｅｓｔｉｎ－ＣｒｅＥＲＴ２；ＮＳＥ－ＤＴＡ）を使用した。Ｎｅｓｔｉｎ－ＣｒｅＥＲＴ２；ＮＳＥ－ＤＴＡマウスに、傷害の２０日前からタモキシフェンを８回注射することにより、ニューロン特異的にジフテリア毒素を発現し、細胞死を起こさせた。その後、脳傷害を行なった。傷害７日後からザナミビルを５０ｍｇ／ｋｇの条件で腹腔内注射によって１４日間投与し、ザナミビル投与終了１４日後に、行動テスト（ＦＦＴ）を行なうとともに、ＤｃｘおよびＮｅｕＮの二重陽性細胞の解析を行なった。なお、コントロールとして、ＮＳＥ－ＤＴＡマウスを用いた。各群のｎ数は３とし、ｔ検定を用いた。なお、エラーバーは平均値±平均値の標準誤差を示す。
【0078】
図３０は、実験１２の結果を示す説明図である。図３０において、紙面左側は、二重陽性細胞の数を示しており、紙面右側は、ＦＦＴの結果を示している。図３０に示すように、Ｎｅｓｔｉｎ－ＣｒｅＥＲＴ２；ＮＳＥ－ＤＴＡ群では、ＮＳＥ－ＤＴＡ群とは異なり、ノイラミニダーゼ阻害剤を投与してもＤｃｘおよびＮｅｕＮの二重陽性細胞が減少していた。さらに、Ｎｅｓｔｉｎ－ＣｒｅＥＲＴ２；ＮＳＥ－ＤＴＡ群では、ＮＳＥ－ＤＴＡ群とは異なり、ザナミビルの投与によっても、ＦＦＴにおける左側滑落割合の改善は認められなかった。これらの結果は、ノイラミニダーゼ阻害剤を投与したマウスの損傷脳で再生したＶ－ＳＶＺ由来ニューロンが、機能回復に寄与していることを示している。
【0079】
＜実験１３：霊長類におけるノイラミニダーゼ阻害剤投与による効果の確認＞
実験６の追加実験として、傷害脳内におけるノイラミニダーゼ阻害剤投与のニューロン再生効果が、よりヒトに近い動物種でも認められるかを確認した。霊長類であるコモンマーモセットに脳傷害を与え、傷害７日後から２１日間、ザナミビルを５０ｍｇ／ｋｇの条件で腹腔内注射によって投与した。脳傷害から２８日後に固定し解析を行なった。免疫染色において、正常ＲＭＳ群、ザナミビル投与群およびコントロール群のｎ数は、いずれも１５とし、多重比較にはＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いた。損傷部位からのＤｃｘ陽性細胞の脳内移動距離の解析において、コントロール群のｎ数は１４８とし、ザナミビル投与群のｎ数は１４０とし、多重比較にはＷｉｌｃｏｘｏｎ符号順位検定を用いた。なお、エラーバーは平均値±平均値の標準誤差を示す。
実験６の追加実験として、傷害脳内におけるノイラミニダーゼ阻害剤投与のニューロン再生効果が、よりヒトに近い動物種でも認められるかを確認した。霊長類であるコモンマーモセットに脳傷害を与え、傷害７日後から２１日間、ザナミビルを５０ｍｇ／ｋｇの条件で腹腔内注射によって投与した。脳傷害から２８日後に固定し解析を行なった。免疫染色において、正常ＲＭＳ群、ザナミビル投与群およびコントロール群のｎ数は、いずれも１５とし、多重比較にはＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いた。損傷部位からのＤｃｘ陽性細胞の脳内移動距離の解析において、コントロール群のｎ数は１４８とし、ザナミビル投与群のｎ数は１４０とし、多重比較にはＷｉｌｃｏｘｏｎ符号順位検定を用いた。なお、エラーバーは平均値±平均値の標準誤差を示す。
【0080】
図３１は、実験１３における顕微鏡画像の代表例を示す説明図である。図３１では、コントロール群とザナミビル投与群のそれぞれについて、紙面左上側には、Ｄｃｘの発現およびＰＳＡ－ＮＣＡＭの発現が示され、紙面左下側には、ＰＳＡ－ＮＣＡＭの発現が示され、紙面右上側には、Ｄｃｘで染色したコモンマーモセット脳切片の代表画像が示され、紙面右下側には、紙面右上側の画像における四角の枠で囲んだ領域が拡大して示されている。図３２は、実験１３におけるＰＳＡ－ＮＣＡＭのシグナル強度を示す説明図である。図３２では、正常ＲＭＳと、傷害脳のコントロール群およびザナミビル投与群とにおける、Ｄｃｘ陽性細胞のＰＳＡ－ＮＣＡＭ蛍光強度が示されている。図３３は、損傷部位からのＤｃｘ陽性細胞の脳内移動距離を示す説明図である。
【0081】
図３１～図３３に示す結果から、以下のことがわかった。すなわち、コントロール（ザナミビル非投与群）では、ＲＭＳに局在する新生ニューロンのＰＳＡシグナル強度に比べ、傷害側の線条体に局在する新生ニューロンのＰＳＡシグナル強度が低下するが、ザナミビルの投与によって、傷害側の線条体に局在する新生ニューロンのＰＳＡシグナル強度が維持されることが明らかとなった。さらに、ザナミビルの投与によって、より傷害部の近くまで新生ニューロンが局在することが明らかとなった。これらの結果によれば、霊長類でもマウスと同様に脳傷害部へ移動する新生ニューロンにおいて、ノイラミニダーゼ阻害剤投与により、ＰＳＡが維持され、傷害部へのニューロン移動が促進されることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【0082】
本発明によれば、ニューロンの移動を促進させることができるので、傷害部位へと移動するニューロンの数を増加させることができ、傷害部位に到達して分化・成熟した神経細胞によって脳機能を改善させる効果が期待できる。このため、例えば、脳梗塞等の脳疾患患者に投与することで、内在性神経幹細胞から産生される神経細胞の移動を促進するために用いることができる。また、例えば、細胞移植手術を受けた患者に投与することで、移植された神経細胞の移動を促進するために用いることができる。また、例えば、バイオマテリアル等の技術と併用することによって、神経細胞の移動・再生を促進するために用いることができる。また、例えば、脳疾患モデル動物等の実験動物に神経細胞移動促進剤として投与し、研究に用いることができる。
【0083】
本発明は、上述の実施形態に限られるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において種々の構成で実現することができる。例えば、発明の概要の欄に記載した各形態中の技術的特徴に対応する実施形態、実施例中の技術的特徴は、上述の課題の一部または全部を解決するために、あるいは、上述の効果の一部または全部を達成するために、適宜、差し替えや、組み合わせを行うことが可能である。また、その技術的特徴が本明細書中に必須なものとして説明されていなければ、適宜、削除することが可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【配列表】