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▶ インスティテュート デ パトロジア エ イムノロジーア ダ ユニバーシダーデ ド ポルト （アイピーエーティーアイエムユーピー）の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-17
(45)【発行日】2024-09-26
(54)【発明の名称】マイクロサテライト不安定性の抗原バイオマーカー
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20240918BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20240918BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 S
G01N33/53 P
G01N33/53 Y
G01N33/574 B
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2020560961
(86)(22)【出願日】2019-05-03
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-09-02
(86)【国際出願番号】 PT2019050009
(87)【国際公開番号】W WO2019212373
(87)【国際公開日】2019-11-07
【審査請求日】2022-05-02
(31)【優先権主張番号】110722
(32)【優先日】2018-05-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】PT
(73)【特許権者】
【識別番号】519331590
【氏名又は名称】インスティテュート デ パトロジア エ イムノロジーア ダ ユニバーシダーデ ド ポルト （アイピーエーティーアイエムユーピー）
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】アルバカーキー レイス，セルソ
(72)【発明者】
【氏名】メライター，シュテファン
(72)【発明者】
【氏名】ロドリゲス ライト デ マガリャインシュ，アナ マリア
(72)【発明者】
【氏名】ポロム，キャロル
(72)【発明者】
【氏名】ロビエロ，フランコ
【審査官】三木 隆
(56)【参考文献】
【文献】Stefan Mereiter，The Thomsen-Friedenreich Antigen: A Highly Sensitive and Specific Predictor of Microsatellite Instability in Gastric Cancer，J. Clin. Med.，2018年09月05日，Vol.7 No.9，Page.256
【文献】Beatriz Leao，Expression of Thomsen-Friedenreich Antigen in Colorectal Cancer and Association with Microsatellite Instability，Int. J. Mol. Sci.，2021年01月29日，Vol.22 No.3，Page.1340
【文献】岡部篤史，エピジェネティクスと病理 胃癌とエピジェネティクス異常，病理と臨床，2022年02月01日，Vol.40 No.2，Page.0116-0122
【文献】Taranpreet Kaur，An Insight into Tumor Markers in Oral Cancer: A Review，A Review. Arch Cancer Res.，2018年01月29日，Vol.6 No.1，Page.3
【文献】Hui Meng，Loss of ZG16 is associated with molecular and clinicopathological phenotypes of colorectal cancer，BMC Cancer，2018年04月16日，Vol.18，Page.433
【文献】佐久間信至，レクチン固定化蛍光ナノスフェアを用いた大腸がんの超早期診断法の開発，Drug Delivery System，2010年，25-4，Pgae.403-410
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｇ０１Ｎ ３３／５７４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）のインビトロ診断用試薬としての、Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（ＴＦ）抗原に対する親和性を有する抗体の使用。
【請求項2】
ＴＦ抗原に対する親和性を有する抗体を含む、ＭＳＩのインビトロ診断用試薬組成物。
【請求項3】
ＴＦ抗原に対するマウスモノクローナル抗体を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
抗ＴＦ抗原抗体Ａ６８／Ｂ－Ａ１１を含むことを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項5】
抗ＴＦ抗原抗体Ａ７８／Ｇ－Ａ７を含むことを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項6】
前記抗体の可変ドメインの断片を含むことを特徴とする、請求項２～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
ＴＦ抗原に対する親和性を有するレクチンであるジャカリンを含むことを特徴とする、ＭＳＩのインビトロ診断用試薬組成物。
【請求項8】
さらに、以下の成分、すなわち、緩衝液、遮断剤、保存剤またはそれらの混合物のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項２～７に記載の組成物。
【請求項9】
請求項２～８のいずれか一項に記載の組成物の少なくとも１つを含む、ＭＳＩのインビトロ診断用キット。
【請求項10】
さらに、ＴＦ抗原を発現する対照組織および／またはキャリブレーター組織あるいは細胞生物学的試料を含む、請求項９に記載のキット。
【請求項11】
インビトロでの生物学的試料からのＭＳＩのインビトロ診断のための方法であって、以下の工程：ａ）インビトロで得られた生物学的試料であるホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロックを３μｍの切片に切片化することと、スライドガラスにマウントすることと、１００％キシレンで脱ろうすることと、１００％、９５％、７０％、５０％の濃度の異なるエタノールでの順次洗浄および蒸留水への水浸で再水和することと、
ｂ）３％過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）含有メタノールで内在性ペルオキシダーゼを不活性化させることと、
ｃ）１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ中で正常ウサギ血清を用いて３０分間ブロッキングすることと、
ｄ）請求項２～８に記載の組成物を接触させることと、前記切片を２５℃～４℃の温度でそれぞれ１時間または一晩インキュベートすることと、
ｅ）ビオチン標識二次抗体で３０分間インキュベートすることと、
ｆ）ＡＢＣキットでさらに３０分インキュベートすることと、
ｇ）前記切片を３，３'－ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）で染色することと、ギルヘマトキシリン染色液で対比染色することと、封入剤の上にカバースリップを付けることと、
ｈ）光学顕微鏡を使用して切片を調べることと、ＴＦ染色のがん細胞陽性の５％～２５％のカットオフで、陽性または陰性のＭＳＩ診断に分類するために腫瘍内の陽性がん細胞の割合を推定することと、
を含むこと特徴とする、方法。
【請求項12】
前記ｄ）において前記切片を４℃で一晩インキュベートし、前記ｈ）においてカットオフとして５％を用いること特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
生物学的試料が、液状化検体細胞診、胃洗浄液、膀胱洗浄液もしくは尿、腹水胸水もしくは脳脊髄液中、または希釈した糞便試料中の凍結された組織もしくは細胞を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項14】
インビトロでの生物学的試料からのＭＳＩのインビトロ診断のための方法であって、以下の工程：血清または血漿のインビトロの生物学的試料を用いて、
請求項２～８に記載の組成物のうちの１つを使用することにより、ＴＦ抗原を検出するための酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を実施することと、を含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）のインビトロ診断用組成物における、Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（ＴＦ）抗原に対して親和性を有する抗体または他の薬剤の使用であって、かかる組成物を、抗ＴＦ抗原抗体を用いてインキュベートすることと、生物学的試料におけるＴＦ抗原の発現を評価することとを含む方法を介して行う、使用に言及する。本発明の方法を実行することによってＭＳＩを検出するための、上記組成物を含むキットも開示する。
【0002】
本発明の使用、組成物、方法およびキットは、がん患者において、治療に対する反応の診断、予後または予測のために、胃、直腸結腸および他の組織のがん腫に対して有利に適用され得、単一マーカーによる短時間の高感度かつ特異的な抗体アッセイを介して、ＭＳＩの臨床環境での同定を顕著に容易にする。
【0003】
したがって、本発明は、医学、薬剤学および生化学の技術分野内である。
【背景技術】
【0004】
胃がんは、集学的治療を要する異質性疾患である［１］。現在、胃がんのための新たな分子分類がＴＣＧＡ（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）およびＡＣＲＧ（Ａｓｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ）によって提案されており、それらにおいて、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）は別個のサブグループとして記載されている［１、２］。
【0005】
したがって、ＭＳＩは胃がんの別個の分子サブタイプであり、ＴＣＧＡによれば、ＭＳＩサブグループは、超変異、胃のＣｐＧアイランドメチル化形質、ＭＬＨ１サイレンシング、および有糸分裂経路と関連している［１］。
【0006】
近年、ＭＳＩの臨床経過およびこの特異ながんのサブタイプを標的とする治療機会が明らかになってきた。多くの刊行物で、ＭＳＩは、全胃がんの５．６％～３３．３％に見られること、ならびに女性、高齢、腸の組織型、胃の位置が中位／低位、Ｎ０の状態、およびＴＮＭ病期がＩ／ＩＩであり全生存が良好である、ということが強く関連していることが臨床的見地から記載されている［１～５］。
【0007】
ＭＳＩは均質な群ではないことを強調することが重要であり、ＭＳＩが、腫瘍局在およびＬａｕｒｅｎ分類と関連することから、予後因子であることが示されている［６］。
【0008】
さらに、ＭＳＩはＰＤ－Ｌ１発現と関連していることが分かっており、現在、いくつかの特定の薬物は、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイント経路を標的とする、胃がんの臨床管理に使用されている［７］。
【0009】
ＭＳＩ胃がんの診断は、特に集学的治療の前には、最も重要である。ＭＳＩ胃がんは、術前補助化学療法に対する反応が異なり、同時性転移では特定の外科治療を必要とし、個別のリンパ節切除の可能性が含まれ、また標的療法の適用に関して層別化される［３、８］。
【0010】
上皮細胞の形質転換は、タンパク質のグリコシル化機構におけるいくつかの変化を伴い、細胞のグリコシル化の異常、例えば、Ｏ－結合型グリカンの切断およびシアロフコシル化グリカンエピトープの発現などをもたらす［９］。Ｏ－結合型グリカンの切断は、さまざまな胃腸がんにおいて広く記述されおり、短いＯ－グリカン、例えば、Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（ＴＦまたはＴ、Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃα１）抗原、Ｔｈｏｍｓｅｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ（Ｔｎ、ＧａｌＮＡｃα１）およびそのシアリル化型であるシアリルＴｎ（ＳＴｎ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３ＧａｌＮＡｃα１）などのｄｅ ｎｏｖｏ発現を生じさせる［９］。さらに、複雑なシアロフコシル化構造、例えば、シアリル－ルイスＡ（ＳＬｅａ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３［Ｆｕｃα１－４］ＧｌｃＮＡｃβ－）およびシアリル－ルイスＸ（ＳＬｅｘ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－４［Ｆｕｃα１－３］ＧｌｃＮＡｃβ－）などの発現が胃腫瘍において高い頻度で記述されており、がんの進行および転移形成において重要な役割を有する［９］。
【0011】
コア１構造としても知られるＴＦ抗原は、ゴルジ体内でムチン型Ｏ－グリカンが成熟する際の中間構造である。生理学的条件下では、ＴＦ抗原は、さらなる糖類で修飾されている上、周囲のより大きいグリカンのためにアクセス不可能であることから検出限界を下回る［１０、１１］。それは、膵管、腎臓遠位尿細管および腎臓集合管の管腔表面にしか見られない［１１］。さらに、胸腺、脾臓およびリンパ節のマクロファージはＴＦ抗原を持っており、これは、免疫学的役割の可能性を示唆している［１１］。重要なことには、ＴＦ抗原は、健康な胃上皮にも胃の前悪性状態にも見られない［１２］。胃がんでは、ＴＦ抗原は、腫瘍の約２１％においてかなりの量で発現され、より高い免疫応答と関連している［１２］。
【0012】
循環中に分泌される分子として、および悪性細胞に対するそれらの発現特異性のため、異常なグリカンおよび複合糖質には、がんバイオマーカーとしての長い歴史がある［１３］。
【0013】
ＴＦ抗原には、健康な状態でも他の病的状態でもヒト組織ではほとんど発現しないことから、血清学的バイオマーカー用途としての使用を可能にすると考えられる、さらなるいくつかの利点がある［１１、１４］。第２に、曝露ＴＦの基底レベルは、自然に循環している抗ＴＦ ＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体、ならびに末端がガラクトシル化された複合糖質の肝臓による迅速なクリアランスのため、血流中では非常に低い［１５］。最後に、ムチン型Ｏ－グリコシル化として、ＴＦ抗原は胃がんで過剰発現されるＭＵＣ１またはＣＤ４４などの広範囲の分泌糖タンパク質によって運搬され得る。
【0014】
通常、ＭＳＩ／ｄＭＭＲステータスは、リンチ症候群のリスク上昇にある患者の同定、ならびに予後層別化のため、結腸直腸がん検体でも試験される。しかしながら、最近出たデータによれば、ＭＳＩ／ｄＭＭＲは、がんの起源組織を問わず、免疫チェックポイント阻害薬治療についての予測値を有し得ることが示された［１６］。事実、前治療後に進行した、ＭＳＩ／ｄＭＭＲを伴う任意の固形腫瘍において、ペンブロリズマブ（抗プログラム細胞死タンパク質－１（ＰＤ－１））を使用できることがアメリカ食品医薬品局によって承認された。
【0015】
現在、ＭＳＩアッセイを実施する１つの方法は、腫瘍および生来の(constitutional)ＤＮＡ抽出によって実施される。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製ＡＢＩ ＰＲＩＳＭなどの機器で、蛍光標識した、ＢＡＴ－２６、ＮＲ－２１、ＢＡＴ－２５、ＮＲ－２７およびＮＲ－２４についてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを用いてモノヌクレオチドリピートを評価する。Ｑｉａｇｅｎにより開示されているマルチプレックスＰＣＲのプロトコルを使用してペンタプレックスＰＣＲで各患者の腫瘍および一致した生来のＤＮＡでリピートを共増幅させる。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製自動ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒによってアレルプロファイルを検出し、がんのＭＳＩの検出および家族性素因に関するＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのガイドラインに従ってＭＳＩステータスを決定し、５つの遺伝子座のうち２つ以上マーカーが不安定性を示す場合は常に、その腫瘍は、ＭＳＩが高いとみなされる。対照的に、１つの遺伝子座が不安定である、または不安定な遺伝子座がない場合は、それぞれ、ＭＳＩが低い、またはマイクロサテライト安定性と診断される。
【0016】
ミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）検査は、腫瘍細胞核における４つのＭＭＲタンパク質（ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６）の発現を評価する市販の抗体を使用するパラフィン切片の免疫組織化学によっても実施され得る。
【0017】
したがって、現在のＭＳＩ／ｄＭＭＲ分析は、５つのＭＳＩマーカーの腫瘍ＰＣＲプロファイルを評価し、それらを一致する正常なＤＮＡのプロファイルと比較するか、または４つの核発現マーカーのうちの少なくとも１つが腫瘍切片にないことを評価する資源集約型の手順である。
【0018】
全体として、患者の層別化にはＭＳＩが重要であるにもかかわらず、ＭＳＩの診断に必要な時間および資源は依然として障害となっており、この特徴を検出する単一バイオマーカーに基づくアッセイが当技術分野で知られている。
【発明の概要】
【0019】
本発明は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）のインビトロ診断用試薬としての、Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（ＴＦ）抗原に対する親和性を有する抗体の使用に言及する。
【0020】
本発明の別の実施形態は、ＴＦ抗原に対する親和性を有する抗体を含む、ＭＳＩのインビトロ診断用試薬組成物に言及する。
【0021】
一実施形態では、組成物は、抗ＴＦ抗原抗体３Ｃ９を含む。
【0022】
別の実施形態では、組成物は、抗ＴＦ抗原抗体ＳＰＭ３２０を含む。
【0023】
別の実施形態では、組成物は、抗ＴＦ抗原抗体Ａ６８／Ｂ－Ａ１１を含む。
【0024】
別の実施形態では、組成物は、抗ＴＦ抗原抗体Ａ７８／Ｇ－Ａ７を含む。
【0025】
別の実施形態では、組成物は、抗ＴＦ抗原抗体Ｂ７９－Ｈ／Ｂ８を含む。
【0026】
別の実施形態では、組成物は、抗ＴＦ抗原抗体Ｃ８０－Ｉ／Ｃ９を含む。
【0027】
別の実施形態では、組成物は、抗ＴＦ抗原抗体Ａ６８－Ｂ／Ａ１１を含む。
【0028】
別の実施形態では、組成物は、前述の抗ＴＦ抗体の可変ドメインの断片を含む。
【0029】
別の実施形態では、組成物は、ＴＦ抗原に対する親和性を有するレクチン、例えば、ジャカリンを含む。
【0030】
別の実施形態では、組成物はさらに、以下の成分、すなわち、緩衝液、遮断剤、保存剤またはそれらの混合物のうちの少なくとも１つを含む。
【0031】
本発明の別の実施形態は、上記の組成物のうちの少なくとも１つを含む、ＭＳＩのインビトロ診断用キットに言及する。
【0032】
上記キットはさらに、ＴＦ抗原を発現する対照組織および／またはキャリブレーター組織あるいは細胞生物学的試料を含む。
【0033】
本発明の別の実施形態は、生物学的試料からのＭＳＩのインビトロ診断の方法であって、以下の工程：
ａ）ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロックなどのインビトロで得られた生物学的試料を３μｍの切片に切片化することと、スライドガラスにマウントすることと、１００％キシレンで脱ろうすることと、１００％、９５％、７０％、５０％のエタノールでの洗浄および蒸留水への水浸で再水和することと、
ｂ）３％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）含有メタノールで内在性ペルオキシダーゼを不活性化させることと、
ｃ）１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ中で正常ウサギ血清を用いて３０分間ブロッキングすることと、
ｄ）請求項２～１２に記載の組成物を接触させることと、前記切片を２５℃～４℃の温度でそれぞれ１時間または一晩、最も好ましくは４℃で一晩インキュベートすることと、
ｅ）ビオチン標識二次抗体で３０分間インキュベートすることと、
ｆ）Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ製のＡＢＣキット、またはそのような他のキットでさらに３０分インキュベートすることと、
ｇ）上記切片を３，３’－ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）で染色することと、ギルヘマトキシリン染色液で対比染色することと、封入剤の上にカバースリップを付けることと、
ｈ）顕微鏡を使用して切片を調べることと、ＴＦ染色のがん細胞陽性の５％～２５％、最も好ましくは５％のカットオフで、陽性または陰性のＭＳＩ診断に分類するために、腫瘍内の陽性がん細胞の割合を推定することと、を含むこと特徴とする、方法に言及する。
ａ）ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロックなどのインビトロで得られた生物学的試料を３μｍの切片に切片化することと、スライドガラスにマウントすることと、１００％キシレンで脱ろうすることと、１００％、９５％、７０％、５０％のエタノールでの洗浄および蒸留水への水浸で再水和することと、
ｂ）３％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）含有メタノールで内在性ペルオキシダーゼを不活性化させることと、
ｃ）１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ中で正常ウサギ血清を用いて３０分間ブロッキングすることと、
ｄ）請求項２～１２に記載の組成物を接触させることと、前記切片を２５℃～４℃の温度でそれぞれ１時間または一晩、最も好ましくは４℃で一晩インキュベートすることと、
ｅ）ビオチン標識二次抗体で３０分間インキュベートすることと、
ｆ）Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ製のＡＢＣキット、またはそのような他のキットでさらに３０分インキュベートすることと、
ｇ）上記切片を３，３’－ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）で染色することと、ギルヘマトキシリン染色液で対比染色することと、封入剤の上にカバースリップを付けることと、
ｈ）顕微鏡を使用して切片を調べることと、ＴＦ染色のがん細胞陽性の５％～２５％、最も好ましくは５％のカットオフで、陽性または陰性のＭＳＩ診断に分類するために、腫瘍内の陽性がん細胞の割合を推定することと、を含むこと特徴とする、方法に言及する。
【0034】
別の実施形態では、上記方法により試験されるインビトロでの生物学的試料は、液状化検体細胞診、胃洗浄液、膀胱洗浄液もしくは尿、腹水胸水もしくは脳脊髄液中、または希釈した糞便試料中の凍結された組織もしくは細胞を含む。
【0035】
別の実施形態では、インビトロでの生物学的試料からのＭＳＩのインビトロ診断のための方法は、以下の工程：
ａ）血清または血漿のインビトロの生物学的試料を得ることと、
ｂ）請求項２～１２に記載の組成物のうちの１つを使用することにより、ＴＦ抗原を検出するための酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を実施することと、を含むことを特徴とする。
ａ）血清または血漿のインビトロの生物学的試料を得ることと、
ｂ）請求項２～１２に記載の組成物のうちの１つを使用することにより、ＴＦ抗原を検出するための酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を実施することと、を含むことを特徴とする。
【0036】
別の実施形態では、上記ＥＬＩＳＡは、ＴＦ抗原に対する自己抗体のレベルの検出を対象とすることを特徴とする。
【0037】
本発明の使用、組成物、方法およびキットは、免疫療法の治療に対する反応の診断、予後または予測のために、単一マーカーによる簡便で迅速な高感度かつ特異的な抗体アッセイを介して、臨床環境でのＭＳＩのインビトロ診断を顕著に容易にするために、胃および直腸結腸のがん腫が挙げられるがこれに限定されないがん患者に有利に適用され得る。
【発明を実施するための形態】
【0038】
本発明は、ＭＳＩが高い（陽性）およびＭＳＩが低いまたは安定ステータス（陰性）のがん腫におけるＴＦ抗原、中でも、５つのがん関連グリカンエピトープの発現の分析を開示し、正常または非悪性病変における望ましくない検出をせずに（図１）、ＴＦ抗原の発現とＭＳＩステータスとの間の新規かつ極めて重要な関連（表１および表２）を明らかにする。
【0039】
したがって、本発明は、胃がんが挙げられるがこれに限定されない腫瘍組織試料のマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を検出するための方法もしくはキットで使用される組成物における、ＴＦ抗原に対する抗体またはＴＦ抗原に対して親和性を有する他の薬剤の使用を開示する。
【0040】
その目的に使用することができる考えられる特定の抗体は、ＴＦ抗原抗体である３Ｃ９、ＳＰＭ３２０、Ａ６８／Ｂ－Ａ１１、Ａ７８／Ｇ－Ａ７、Ｂ７９－Ｈ／Ｂ８、Ｃ８０－Ｉ／Ｃ９、Ａ６８－Ｂ／Ａ１１を含み、いずれも、ＴＦ抗原に対する親和性を有することを特徴とし、商業的供給源、例えば、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ ｔｈｅ Ａｂｃａｍ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｈｉｓｔｏｓｅａｒｃｈ、Ｌｉｆｅ Ｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓなど、または他の企業、例えば、Ａｂｎｏｖａ、Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ、ＮＳＪ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌおよびＰｒｏｇｅｎなどから入手することができる。
【0041】
本発明の他の実施形態では、上記抗体の可変ドメインの断片を本発明のために使用することができる。
【0042】
本発明の他の実施形態では、ＴＦ抗原に対して高親和性であるレクチン、例えば、ジャカリンを本発明のために使用することができる。
【0043】
上記抗体、抗体断片またはレクチンは、ＭＳＩ検出用組成物に使用される。
【0044】
本発明の一実施形態では、上記ＭＳＩ検出用組成物は、ＴＦ抗原に対して親和性を有する特定の抗体、抗体断片またはレクチンを、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に５～５０マイクログラムの範囲の量、最も好ましくは３３マイクログラムの量で希釈することによって調製される。
【0045】
上記組成物を使用して、ＴＦ抗原の発現に基づいた（図１）ＭＳＩのインビトロ診断のための方法に言及する本発明の実施形態を開発することが可能であり、かかる方法は、以下の工程：
ａ）ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロックなどのインビトロで得られた生物学的試料を３μｍの切片に切片化し、スライドガラスにマウントし、１００％キシレンを使用して脱ろうし、１００％、９５％、７０％、５０％のエタノールでの洗浄および蒸留水への水浸で再水和することと、
ｂ）３％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）含有メタノールで内在性ペルオキシダーゼを不活性化させることと、
ｃ）組織切片を、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ中で正常ウサギ血清を用いて３０分間ブロッキングすることと、
ｄ）ＴＦ抗原に対して特異的な抗体、抗体断片またはレクチンを含む上記組成物を、上記組織切片と接触させて、２５℃～４℃の温度でそれぞれ１時間または一晩、最も好ましくは４℃で一晩インキュベートすることと、
ｅ）ビオチン標識二次抗体を３０分間適用することと、
ｆ）Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ製のＡＢＣキット、またはそのような種類のキットをさらに３０分間適用することと、
ｇ）切片を３，３’－ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）で染色し、ギルヘマトキシリン染色液で対比染色することと、
ｈ）顕微鏡下でスライドを調べ、ＴＦのがん細胞陽性の５％～２５％、最も好ましくは５％のカットオフで、ＭＳＩ陽性またはＭＳＩ陰性のカテゴリーに分類するために、腫瘍内の陽性がん細胞の割合を推定することと、を含む。
ａ）ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロックなどのインビトロで得られた生物学的試料を３μｍの切片に切片化し、スライドガラスにマウントし、１００％キシレンを使用して脱ろうし、１００％、９５％、７０％、５０％のエタノールでの洗浄および蒸留水への水浸で再水和することと、
ｂ）３％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）含有メタノールで内在性ペルオキシダーゼを不活性化させることと、
ｃ）組織切片を、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ中で正常ウサギ血清を用いて３０分間ブロッキングすることと、
ｄ）ＴＦ抗原に対して特異的な抗体、抗体断片またはレクチンを含む上記組成物を、上記組織切片と接触させて、２５℃～４℃の温度でそれぞれ１時間または一晩、最も好ましくは４℃で一晩インキュベートすることと、
ｅ）ビオチン標識二次抗体を３０分間適用することと、
ｆ）Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ製のＡＢＣキット、またはそのような種類のキットをさらに３０分間適用することと、
ｇ）切片を３，３’－ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）で染色し、ギルヘマトキシリン染色液で対比染色することと、
ｈ）顕微鏡下でスライドを調べ、ＴＦのがん細胞陽性の５％～２５％、最も好ましくは５％のカットオフで、ＭＳＩ陽性またはＭＳＩ陰性のカテゴリーに分類するために、腫瘍内の陽性がん細胞の割合を推定することと、を含む。
【0046】
胃がん腫の３０症例（現在のＰＣＲを用いた分析による、ＭＳＩ陽性１３症例およびＭＳＩ陰性１７症例）でこの方法を使用することにより、ＴＦの発現とＭＳＩステータスとの間の顕著で極めて重要な関連が得られる（ｐ＜０．００１；フィッシャーの直接確率検定）。ＴＦ陽性１０症例中、９症例がＭＳＩ陽性であり、これは、この胃がん分子サブタイプに対するＴＦ抗原の前例なき特異性を示唆している（表１）。この方法を使用した結果は、ＴＦ陰性２０症例中１６症例がＭＳＩ陰性であったことから、ＴＦ抗原が感度に関しても優れていることを示す（表１）。これは、感度および特異性の値がそれぞれ、６９．２％（９／１３）および９４．１％（１６／１７）という結果になる。陽性および陰性の予測因子の値はそれぞれ、９０％（９／１０）および８０％（１６／２０）である。
【0047】
この方法の別の利点は、正常な腺および高度の炎症領域、ならびに腸の化生および異形成を含め、腫瘍に隣接する粘膜は完全に陰性である点であり、非悪性および前悪性の状態ではこのグリカンマーカーが存在しないことをはっきり示している（図１ａ～図１ｃ）。陽性症例のうち、染色は、典型的には膜性であり、その腫瘍の全がん細胞の平均約３０％において見られる。高分化型の胃がん腫では、染色は、典型的に、頂端部細胞膜においてであり、分泌が含まれた（図１ｄ～図１ｆ）。低分化型の胃がん腫における細胞内局在は、典型的には細胞質へシフトした（図１ｇ～図１ｊ）。ＴＦの発現は、患者の予後良好と関連するように思われ、患者生存中央値の増加（８８か月対３１．５か月）および診断５年後の生存患者の高割合によって反映される（７０％対３０％）（表２）。この予後改善は、ＭＳＩ患者では概して生存良好が生じることが知られていることから、予測と一致している。
【0048】
ＭＳＩを検出する本発明の方法の他の実施形態では、上記生物学的試料は、液状化検体細胞診、胃洗浄液、膀胱洗浄液もしくは尿、腹水胸水もしくは脳脊髄液中、または希釈した糞便試料中の凍結された組織もしくは腫瘍細胞を含み得る。
【0049】
本発明はさらに、本発明の方法を実行することによってＭＳＩを検出するための上記組成物を含むキットに言及する。
【0050】
本発明の一実施形態では、上記キットはさらに、ＴＦ抗原を発現している対照組織および／またはキャリブレーター組織あるいは細胞生物学的試料を含む。
【0051】
以上をまとめると、本発明の使用、組成物、方法およびキットは、がん患者の治療に対する反応の予後または予測のために、単一マーカーによる迅速な高感度かつ特異的な抗体アッセイを介して、この異なるがんサブタイプの臨床環境での同定を顕著に改善するために、胃、直腸結腸および他の組織のがん腫においてＭＳＩのインビトロ診断に有利に適用され得る。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図A】表１．異常なグリカンエピトープとＭＳＩステータスのアソシエーション分析を記載する。Ａ）異常なグリコシル化についての５つのマーカー、すなわち、Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（ＴＦ、Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃα１）抗原、Ｔｈｏｍｓｅｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ（Ｔｎ、ＧａｌＮＡｃα１）およびそのシアリル化型－シアリルＴｎ（ＳＴｎ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３ＧａｌＮＡｃα１）、シアリル－ルイスＡ（ＳＬｅａ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３［Ｆｕｃα１－４］ＧｌｃＮＡｃβ－）ならびにシアリル－ルイスＸ（ＳＬｅｘ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－４［Ｆｕｃα１－３］ＧｌｃＮＡｃβ－）の発現を、ＭＳＩ陽性１３症例およびＭＳＩ陰性１７症例の胃がん腫で評価した。Ｂ）フィッシャーの直接確率検定を使用してＭＳＩのマーカーの統計解析を実施し、ＴＦとＭＳＩの極めて重要な関連を明らかにした（＊＊）。欠測値は（／）で示されている。
【0053】
【図B】表２．ＴＦ抗原ステータスに従って胃がん患者の臨床病理学的分析を記載する。ＴＦ陽性患者（１０）およびＴＦ陰性患者（２０）を含む合計３０人の患者のコホート、および臨床病理学的特徴のあるＴＦステータス（陰性／陽性）の比較。臨床病理学的群と２つのＴＦマーカーステータス群の間の関連を、２つのカテゴリーを有する特徴にはフィッシャーの直接確率検定を、また３つ以上のカテゴリーを有する特徴にはΧ２検定を使用して計算した。ＴＦステータス群の診断（月数）は、マン－ホイットニー－ウィルコクソン検定を使用して統計的に評価したため、年齢および生存の中央値において差がある。Ｐ値≦０．０５を統計学的に有意であるとみなした（＊＊）。
【0054】
【図C】図１．ヒト胃組織試料におけるＴｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（ＴＦ）抗原発現の代表的染色画像。（ａ）胃粘膜はＴＦ陰性であり、ここでは、ＭＳＩ陽性およびＴＦ陽性の腫瘍に隣接する組織学的に正常な粘膜で代表される。（ｂ）一般的には切断型Ｏ－グリカン担体に富んでいる杯細胞でさえもＴＦ陰性であったことを示す腸の化生の代表的染色画像。（ｃ）ＴＦ陽性がん腫の隣のＴＦ陰性の異形成であり、悪性細胞に対するＴＦの特異性を示す。（ｄ～ｆ）高分化型胃がん腫は、粘液性分泌を含め、頂端部表面において典型的な膜性ＴＦ染色を示す。（ｇ～ｉ）低分化型胃がん腫は細胞質染色で占められた。（ｉ）浸潤血管内のＴＦ陽性がん腫細胞。
【実施例】
【0055】
実施例１－ＴＦ抗原に対する抗体を含むＭＳＩ検出用組成物の調製
本発明の一実施形態では、ＭＳＩのインビトロ診断用組成物は、ＴＦ抗原に対する抗体を、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に、５～１００マイクログラムの範囲の量で希釈することによって生成される。
本発明の一実施形態では、ＭＳＩのインビトロ診断用組成物は、ＴＦ抗原に対する抗体を、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に、５～１００マイクログラムの範囲の量で希釈することによって生成される。
【0056】
実施例２－抗体または抗原レセプターの断片を含むＭＳＩ検出用組成物の調製
本発明の一実施形態では、ＭＳＩのインビトロ診断用組成物は、免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変鎖、ならびにＴ細胞受容体の可変鎖が挙げられるがこれらに限定されない、ＴＦ抗原を標的とする可変領域の断片を含む。
本発明の一実施形態では、ＭＳＩのインビトロ診断用組成物は、免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変鎖、ならびにＴ細胞受容体の可変鎖が挙げられるがこれらに限定されない、ＴＦ抗原を標的とする可変領域の断片を含む。
【0057】
実施例３－レクチンを含むＭＳＩ検出用組成物の調製
本発明の一実施形態では、ＭＳＩのインビトロ診断用組成物は、ジャカリンが挙げられるがこれに限定されない、ＴＦ抗原に対して高親和性であるレクチン、およびその混合物を含む。
本発明の一実施形態では、ＭＳＩのインビトロ診断用組成物は、ジャカリンが挙げられるがこれに限定されない、ＴＦ抗原に対して高親和性であるレクチン、およびその混合物を含む。
【0058】
実施例４－ＦＦＰＥ組織試料でのＭＳＩのインビトロ診断のための方法
一例では、先行実施例に記載のように調製される組成物を使用する方法は、以下の工程：
ａ）ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロックなどのインビトロで得られた生物学的試料を３μｍの切片に切片化し、スライドガラスにマウントし、１００％キシレンで脱ろうし、１００％、９５％、７０％、５０％のエタノールでの洗浄および蒸留水への水浸で再水和することと、
ｂ）３％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）含有メタノールで内在性ペルオキシダーゼを不活性化させることと、
ｃ）１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ中で正常ウサギ血清を用いて３０分間ブロッキングすることと、
ｄ）請求項２～１２に記載の組成物を接触させ、上記切片を２５℃～４℃の温度でそれぞれ１時間または一晩、最も好ましくは４℃で一晩インキュベートすることと、
ｅ）ビオチン標識二次抗体で３０分間インキュベートすることと、
ｆ）Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ製のＡＢＣキット、またはそのような他のキットでさらに３０分間インキュベートすることと、
ｇ）上記切片を３，３’－ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）で染色し、ギルヘマトキシリン染色液で対比染色し、封入剤の上にカバースリップを付けることと、
ｈ）顕微鏡を使用してスライドを調べ、ＴＦ抗原染色のがん細胞陽性の５％超のカットオフで、陽性または陰性のＭＳＩ診断に分類するために、腫瘍内の陽性がん細胞の割合を推定することと、を含む。
一例では、先行実施例に記載のように調製される組成物を使用する方法は、以下の工程：
ａ）ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロックなどのインビトロで得られた生物学的試料を３μｍの切片に切片化し、スライドガラスにマウントし、１００％キシレンで脱ろうし、１００％、９５％、７０％、５０％のエタノールでの洗浄および蒸留水への水浸で再水和することと、
ｂ）３％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）含有メタノールで内在性ペルオキシダーゼを不活性化させることと、
ｃ）１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ中で正常ウサギ血清を用いて３０分間ブロッキングすることと、
ｄ）請求項２～１２に記載の組成物を接触させ、上記切片を２５℃～４℃の温度でそれぞれ１時間または一晩、最も好ましくは４℃で一晩インキュベートすることと、
ｅ）ビオチン標識二次抗体で３０分間インキュベートすることと、
ｆ）Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ製のＡＢＣキット、またはそのような他のキットでさらに３０分間インキュベートすることと、
ｇ）上記切片を３，３’－ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）で染色し、ギルヘマトキシリン染色液で対比染色し、封入剤の上にカバースリップを付けることと、
ｈ）顕微鏡を使用してスライドを調べ、ＴＦ抗原染色のがん細胞陽性の５％超のカットオフで、陽性または陰性のＭＳＩ診断に分類するために、腫瘍内の陽性がん細胞の割合を推定することと、を含む。
【0059】
この方法の利点は、単一マーカーとしてのＴＦ抗原の発現を介して、がんにおける信頼性の高いＭＳＩステータス予測因子が実現されることであり、そのため、ＴＦ抗原測定の適用は、時間および費用の点で効率的なＭＳＩ患者の層別化に大きな可能性を有する。
【0060】
実施例５－細胞試料でのＭＳＩのインビトロ診断のための方法
別の例では、先行実施例に記載の方法に使用される生物学的試料は、凍結組織であり得るか、または液状化検体細胞診、胃洗浄、膀胱洗浄液もしくは尿、腹水胸水もしくは脳脊髄液中から、もしくは希釈した糞便試料から得られた、スライドガラス上に刷り込まれ固定された細胞を含む。この細胞試料の利点は、それらが、組織生検または外科標本を得るための手術を必要としない、最小侵襲手順により得られ得ることである。
別の例では、先行実施例に記載の方法に使用される生物学的試料は、凍結組織であり得るか、または液状化検体細胞診、胃洗浄、膀胱洗浄液もしくは尿、腹水胸水もしくは脳脊髄液中から、もしくは希釈した糞便試料から得られた、スライドガラス上に刷り込まれ固定された細胞を含む。この細胞試料の利点は、それらが、組織生検または外科標本を得るための手術を必要としない、最小侵襲手順により得られ得ることである。
【0061】
実施例６－ＭＳＩのインビトロ診断のための血清学的方法
別の例は、ＴＦ抗原を検出するＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）に基づく血清学的アッセイのＭＳＩサブタイプ診断への適用可能性に関し、臨床環境における潜在的有用性を有する。
別の例は、ＴＦ抗原を検出するＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）に基づく血清学的アッセイのＭＳＩサブタイプ診断への適用可能性に関し、臨床環境における潜在的有用性を有する。
【0062】
したがって、別の実施形態では、ＭＳＩのインビトロ診断のための方法は、以下の工程：
ａ）血清または血漿のインビトロの生物学的試料を得ることと、
ｂ）請求項２～１２に記載の組成物のうちの１つを使用して、ＴＦ抗原を検出するためのＥＬＩＳＡを実施することと、を含むよう開発され得る。
ａ）血清または血漿のインビトロの生物学的試料を得ることと、
ｂ）請求項２～１２に記載の組成物のうちの１つを使用して、ＴＦ抗原を検出するためのＥＬＩＳＡを実施することと、を含むよう開発され得る。
【0063】
実施例７－ＭＳＩインビトロ診断のための血清学的方法
別の実施形態では、先行実施例に記載の血清学的方法は、ＭＳＩステータスの指標となる特性を有し得る、ＴＦに対する自己抗体レベルの上昇の検出などの戦略に従うことができる。
別の実施形態では、先行実施例に記載の血清学的方法は、ＭＳＩステータスの指標となる特性を有し得る、ＴＦに対する自己抗体レベルの上昇の検出などの戦略に従うことができる。
【0064】
参考文献
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2. Cristescu, R., Lee, J., Nebozhyn, M., Kim, K. M., Ting, J. C., Wong, S. S., Liu, J., Yue, Y. G., Wang, J., Yu, K., Ye, X. S., Do, I. G., Liu, S., Gong, L., Fu, J., Jin, J. G., Choi, M. G., Sohn, T. S., Lee, J. H., Bae, J. M., Kim, S. T., Park, S. H., Sohn, I., Jung, S. H., Tan, P., Chen, R., Hardwick, J., Kang, W. K., Ayers, M., Hongyue, D., Reinhard, C., Loboda, A., Kim, S. and Aggarwal, A. (2015) Molecular analysis of gastric cancer identifies subtypes associated with distinct clinical outcomes. Nature medicine. 21, 449-456
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リスボン ２０１９年５月３日
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リスボン ２０１９年５月３日
【図A】
【図B】
【図C】
