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特許7557042ステルスキメラ抗原受容体及び正常細胞への細胞毒性の低減におけるその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-17
(45)【発行日】2024-09-26
(54)【発明の名称】ステルスキメラ抗原受容体及び正常細胞への細胞毒性の低減におけるその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240918BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20240918BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240918BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240918BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240918BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240918BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240918BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240918BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240918BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C07K14/725
C07K16/18
C07K16/30
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/12
C12N15/63 Z
A61P35/00
A61K38/17
A61K48/00
A61K31/7088
C12N5/10
【請求項の数】
29
(21)【出願番号】P 2023503056
(86)(22)【出願日】2021-08-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-17
(86)【国際出願番号】 CN2021113420
(87)【国際公開番号】W WO2022037625
(87)【国際公開日】2022-02-24
【審査請求日】2023-01-30
(31)【優先権主張番号】63/067,870
(32)【優先日】2020-08-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】521442039
【氏名又は名称】山東博安生物技術股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＢＯＡＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３９， Ｋｅｊｉ Ａｖｅｎｕｅ， Ｈｉｇｈ－Ｔｅｃｈ Ｚｏｎｅ， Ｙａｎｔａｉ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】チョウ， リー
(72)【発明者】
【氏名】ハリス， マイケル
【審査官】小倉 梢
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／２４１５４９（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００ － １９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、（１）所定の抗原に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメインであって、ここで、該所定の抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、細胞外リガンド結合ドメインと、
（２）膜貫通（ｔｍ）接続膜近傍（ｊｍ）ドメインであって、
ここで、該膜貫通接続膜近傍ドメインは、ＩＬ２受容体β鎖（ＩＬ２Ｒβ）膜貫通ドメインと、ＩＬ２Ｒβ膜近傍ドメインとを含み、且つ該膜貫通接続膜近傍ドメインはＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）に隣接する、膜貫通接続膜近傍ドメインと、
（３）細胞内ドメインであって、ここで、該細胞内ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインからなる群から選択される一つ又は複数のシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインと
を含み、
該ＣＡＲは、Ｎ－末端からＣ－末端まで、ＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ又はＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含み、
ここで、該ＴＡＡ ｓｃＦｖは、ＣＥＡ ｓｃＦｖ、クローディン１８．２ ｓｃＦｖ及びＨＥＲ２ ｓｃＦｖのうちの一つ又は複数から選択される、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項2】
該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項3】
ＣＥＡ ｓｃＦｖは、ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖであり、又は、クローディン１８．２ ｓｃＦｖは、８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖである、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項4】
ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ、８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ、又はＨＥＲ２ ｓｃＦｖは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、３０又は３１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のＣＡＲ。
【請求項5】
該ＣＡＲのＮ－末端は、リーダー配列及び／又はＨＡ配列をさらに含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項6】
該ＣＡＲは、Ｎ－末端からＣ－末端まで、ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、
ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、又は
ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項7】
該ＣＡＲはＰ２Ａ－ＧＦＰ及び／又はＨＡを含まない、請求項６に記載のＣＡＲ。
【請求項8】
該ＣＡＲは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９、１４、１５、２１、又は２２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６又は７に記載のＣＡＲ。
【請求項9】
該ＣＡＲのアミノ酸配列は、Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、リーダー配列、及び／又はＨＡのアミノ酸配列を含まない、請求項６に記載のＣＡＲ。
【請求項10】
該ＩＬ２Ｒβの膜貫通（ｔｍ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、該ＩＬ２Ｒβの膜近傍（ｊｍ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ＩＬ２Ｒβの膜貫通（ｔｍ）接続膜近傍（ｊｍ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ、８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、ＨＡ、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ３ζ、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＧＦＰ、又はリーダー配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４５又は４６で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は、
該Ｐ２Ａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３又は４４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項11】
二重ＣＡＲであって、請求項１～１０のいずれか一項に記載の第１のＣＡＲと、第２のＣＡＲとを含み、該第２のＣＡＲは、
（１）所定の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖを含む細胞外リガンド結合ドメインと、
（２）膜貫通ドメインと、
（３）細胞内ドメインとを含み、
ここで、該第１のＣＡＲは抗原を標的化するとともに、該第２のＣＡＲは別の抗原を標的化する、二重ＣＡＲ。
【請求項12】
該膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインであり、及び／又は
該細胞内ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインからなる群から選択される一つ又は複数のシグナル伝達ドメインを含む、請求項１１に記載の二重ＣＡＲ。
【請求項13】
該第１のＣＡＲと該第２のＣＡＲはＰ２Ａによって接続される、請求項１１又は１２に記載の二重ＣＡＲ。
【請求項14】
該Ｐ２Ａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３又は４４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の二重ＣＡＲ。
【請求項15】
該二重ＣＡＲは、Ｎ－末端からＣ－末端まで、
ＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－別のＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ又はＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－別のＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含む、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の二重ＣＡＲ。
【請求項16】
該二重ＣＡＲは、Ｎ－末端からＣ－末端まで、８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の二重ＣＡＲ。
【請求項17】
該二重ＣＡＲは（Ｇ
４
Ｓ）
２
－ＧＦＰを含まない、請求項１６に記載の二重ＣＡＲ。
【請求項18】
８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ又はＨＥＲ２ ｓｃＦｖは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０又は３１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の二重ＣＡＲ。
【請求項19】
該二重ＣＡＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の二重ＣＡＲ。
【請求項20】
該二重ＣＡＲのアミノ酸配列は（Ｇ
４
Ｓ）
２
－ＧＦＰ及び／又はリーダー配列のアミノ酸配列を含まない、請求項１８に記載の二重ＣＡＲ。
【請求項21】
核酸であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＡＲ、又は請求項１１～２０のいずれか一項に記載の二重ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸。
【請求項22】
ベクターであって、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＡＲ、又は請求項１１～２０のいずれか一項に記載の二重ＣＡＲ、又は請求項２１に記載の核酸をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項23】
組成物であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＡＲ、又は請求項１１～２０のいずれか一項に記載の二重ＣＡＲ、請求項２１に記載の核酸、又は請求項２２に記載のベクターを含む、組成物。
【請求項24】
それを必要とする被験体における疾患を治療するための医薬であって、有効量の請求項２３に記載の組成物、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＡＲ、又は請求項１１～２０のいずれか一項に記載の二重ＣＡＲを含む、医薬。
【請求項25】
該疾患は癌である、請求項２４に記載の医薬。
【請求項26】
該癌は、血液悪性腫瘍又は固形腫瘍のうちの一つ又は複数から選択される、請求項２５に記載の医薬。
【請求項27】
該固形腫瘍は、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、リンパ腫、食道癌、肺癌、肝臓癌、頭頸部癌、又は胆嚢癌である、請求項２６に記載の医薬。
【請求項28】
ＣＡＲ－Ｔ細胞による正常細胞への細胞毒性を低減するための薬剤であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＡＲ、又は請求項１１～２０のいずれか一項に記載の二重ＣＡＲ、請求項２１に記載の核酸、請求項２２に記載のベクター、又は請求項２３に記載の組成物を含む、薬剤。
【請求項29】
正常細胞への細胞毒性が低減されたＣＡＲ－Ｔ細胞を産生する方法であって、請求項２１に記載の核酸又は請求項２２に記載のベクターを宿主細胞に導入すること（１）と、
導入した後に、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞を単離及び／又は増殖すること（２）とを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２０年８月１９日に提出された、発明の名称が「標的依存性スイッチキメラ抗原受容体」である米国仮特許出願第６３／０６７，８７０号の利益を主張し、該特許の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本出願は、バイオ医薬品分野に関し、且つ特にステルスキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びその関連ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、製造方法と用途に関する。
【背景技術】
【0003】
血液悪性腫瘍治療におけるＣＡＲ Ｔ細胞療法の初歩的な成功は、免疫療法の治療戦略の新しい分野における急速な発展を示した。ＣＡＲは、設計された受容体であり、典型的に、ＣＤ３ζ ＩＴＡＭモチーフから派生したモジュール化活性化ドメインと、例えば、４－１ＢＢ又はＣＤ２８に由来する共刺激ドメインを有する。これらの受容体による標的認識は、代替的な方法も考案されているが、通常、ＣＡＲの細胞外末端のｓｃＦｖドメインにより提供される。
【0004】
安全性は、ＣＡＲ－Ｔ療法の発展を阻害する主な障害である。ＣＡＲ分子は、通常、Ｔ細胞表面上に構成的に発現される。そのため、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、患者体内に注射されると、標的抗原を発現する異なる組織に遊走し、通常、正常な組織及び腫瘍細胞に対して予期しない毒性と損傷を与えることになる。なお、ＣＡＲ分子の構成的発現は、緊張性シグナル伝達とＴ細胞枯渇を促進する。
【0005】
今まで、ＣＡＲ－Ｔ活性を制御するためにいくつかのタイプのスイッチが開発された。これらのスイッチのうちのいくつかのスイッチは、「自殺遺伝子」をＣＡＲ構築体に組み込むことに基づくものである。例えば、ＨＳＶ－ＴＫトランスジェニックは、ガンシクロビルで治療する時の改変細胞の誘導型アポトーシスを可能にするために、すでに養子細胞療法に使用されている。別の方法は、誘導型カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）の使用に依存する。これらのポリシーにおいて、ＣＡＲ－Ｔ細胞自体を標的に除去することによって治療応答を停止させる。
【0006】
他のスイッチシステムは、受容体の改変、例えば、アダプターにより媒介されるＣＡＲ（「汎用ＣＡＲ」とも呼ばれる）に依存する。これらのＣＡＲ Ｔ細胞は、共通の受容体を共有し、該受容体は、該受容体を、ＣＡＲと腫瘍標的の両者を結合するアダプター分子に接続することによって複数の腫瘍標的を認識するように改変することができる。同様に、投与と活性化を制御する手段として、薬物誘導性二量体を介して細胞内シグナル伝達ドメインをＣＡＲの膜貫通成分に集めることが提案されている。現在、臨床的に承認されているＣＡＲが構成的活性を有するように設計されたが、アダプター依存性ＣＡＲ Ｔ細胞は、アダプター投与時にのみ、認識し殺傷することができ、それによってＣＡＲ－Ｔ細胞に対する滴定可能且つ可逆的な制御を可能にする。
【0007】
これらのタイプのスイッチについては、ＣＡＲの発現と機能性は、小分子薬物又は他の治療剤の適用によって外部的に調節される。これらのタイプのスイッチの主な課題は、適用可能な従来のＦＤＡ承認のスイッチ分子の利用可能性、スイッチ分子の安全性、バイオアベイラビリティ、体内分布、及びスイッチ分子とＣＡＲ－Ｔ細胞の複雑な動態と分布によるインビボ調節複雑性を含む。
【0008】
単一の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的化することによる標的細胞群への選択的圧力は、最終的に、標的抗原の下方制御とＣＡＲ Ｔ細胞免疫応答の回避を引き起こす１（ＲｕｅｌｌａとＭａｕｓ，２０１６）。標的抗原発現の喪失は、腫瘍細胞の増殖を緩和せず、最終的に疾患の再発を引き起こす。研究により、一次ＴＡＡの下方制御時、標的細胞は、二次ＴＡＡを上方制御することによって、二回目の治療的介入を可能にする可能性があることが報告されている２（図１）（Ｆｏｕｓｅｋら，２０２０）。理想的には、腫瘍細胞群が二次ＴＡＡを上方制御する時にのみ、治療毒性を低減するために、該二次ＴＡＡを標的化すべきである。
【0009】
高親和性ＩＬ２受容体は、α、βとγ鎖の三つの異なる、非共有結合的に会合した成分で構成される膜貫通受容体である。αとγサブユニットが存在しない場合、β鎖は、構成的にエンドサイトーシスされ且つ分解されることが示されている３（Ｈeｍａｒら，１９９４）。
【0010】
ＬＤＬＲのＣ－末端残基の分析により、エンドソーム選別モチーフＮＤＸＹが存在することが示された。研究により、該モチーフは、ＡＲＨとの相互作用及びＡＰ－２複合体との結合によって、エンドソーム選別メカニズムを間接的に媒介することが示されている４－５（Ｔａｏら，２０１６、Ｆａｓａｎｏら，２００９）。ＳＥＺ６Ｌ２の特徴は、そのｃ－末端領域に二つのエンドソーム標的共有配列が存在することである６（Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら，２００３）。
【0011】
本出願は、正常細胞への細胞毒性を低減するためのステルスＣＡＲを提供することによって、ＣＡＲ－Ｔの安全性問題を解決することを目的とする。
【発明の概要】
【0012】
本出願の斬新なＣＡＲシステムでは、ＣＡＲ分子の発現／安定化は、標的抗原の利用可能性に依存する。利用可能な抗原がない場合、Ｔ細胞表面上に検出可能なＣＡＲが存在しないとともに、ＣＡＲ機能がない。エンジニアリングされたＴ細胞がその標的抗原を認識する時、ＣＡＲは、安定化されるとともに、シグナル伝達を開始することができる。これは標的依存性スイッチである。抗原に応答するＣＡＲ発現を調節することにより、本出願は、ＣＡＲ Ｔ細胞毒性と枯渇を低減することができる。抗原が存在しない場合に、ＣＡＲが「見えない」ため、本出願の発明者は、それを「ステルスＣＡＲ」と名付けることを選択した。ステルスＣＡＲは、単一特異性と二重特異性ＣＡＲの場合、及び自家と同種異系の場合に適用することができる。それは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、γδＴ細胞、及びｉＰＳＣから派生したＴ細胞の背景で適用することができる。
【0013】
エンドサイトーシスステルスＣＡＲシステムは、ＣＡＲ Ｔ療法が直面する特定の課題、即ち「ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ」効果の解決にも適用され得る。ＴＡＡが、腫瘍組織で、通常、上方制御されるが、正常な組織でも低いレベルで発現されるため、ＣＡＲ Ｔ療法は、非癌細胞を標的化する望ましくない効果を有する可能性がある。抗原発現が安定しているＣＡＲにより、高レベルの標的抗原を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）を使用することによって、発明者らのＣＡＲシステムのためにより高い活性化を提供する。そのため、本出願は、ＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍特異的殺傷を促進するとともに、正常な組織への影響を最大限に低減することができる（図２）。組み合わせモデルでは、二つのＣＡＲは、いずれもエンドサイトーシスタイプであってもよく、ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ効果を最大限に低減し、且つ抗原エスケープを解決した。
【0014】
二重特異性の場合にステルスＣＡＲを適用することによって、本出願では、該システムが抗原エスケープ問題の解決に使用できることが期待されている。細胞表面において、一過性にのみ安定なＣＡＲ変異体を発現することによって、本出願は、正常な組織の付随的標的化、損傷を低減するメカニズムを提供した。腫瘍細胞における二次標的抗原の上方制御は、より強いシグナルを提供し、ＣＡＲ表面安定性と下流活性化を促進する。一つのＣＡＲで一次ＴＡＡを標的化し、且つもう一つのステルスＣＡＲで二次ＴＡＡを標的化することによって、本出願は、強い初期腫瘍応答を引き起こすとともに、二次ＴＡＡ上方制御時にのみ、標的の二次応答を引き起こす。
【0015】
本出願の発明者は、改変された膜貫通と膜近傍配列を有するいくつかのＣＡＲ変異体を設計し製造し、これらの配列は、受容体の細胞内輸送を促進する。これらの配列は、ＩＬ２受容体β鎖（ＩＬ２Ｒβ又はＩＬ２Ｒｂ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）及びヒトてんかん発作６様タンパク質２（ＳＥＺ６Ｌ２）から派生したものである。これらの受容体の膜貫通と細胞内配列におけるアミノ酸モチーフは、エンドソーム経路を介して細胞内輸送を促進する。
【0016】
本出願は、正常細胞への細胞毒性を低減し、ＣＡＲ－Ｔ安全性を改善し、構成的ＣＡＲ表面発現による炎症性サイトカインと緊張性シグナル伝達を低減するための斬新なステルスＣＡＲを提供した。本出願は、ステルスＣＡＲと第２のＣＡＲとを含む二重ＣＡＲ、及びステルスＣＡＲ又は二重ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む関連核酸、ベクター、宿主細胞と薬物組成物をさらに提供した。本出願は、それを必要とする被験体における疾患を治療する方法であって、該方法は該被験体に有効量の薬物組成物を投与することを含む方法、ＣＡＲ－Ｔ細胞による正常細胞への細胞毒性を低減する方法、及び正常細胞への細胞毒性が低減されたＣＡＲ－Ｔ細胞を産生する方法をさらに提供した。
【0017】
一つの態様では、本出願は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、該キメラ抗原受容体は、
（１）所定の抗原に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメインであって、ここで、好ましくは、該所定の抗原は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり、さらに好ましくは、該ＴＡＡは、ＣＥＡ、クローディン１８．２、ＣＧＣ３、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ＣＤ４４６、ＣＤ１３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣａｍ、ＧＤ２、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＩＣＡＭ－１、ＩＬ１３Ｒａ２、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＳＣＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１、ＷＴ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＥＢＶ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２５、ＩＬ－２、及びＣＤ３のうちの一つ又は複数から選択される細胞外リガンド結合ドメインと、
（２）膜貫通（ｔｍ）接続膜近傍（ｊｍ）ドメインであって、
ここで、該膜貫通接続膜近傍ドメインは、ＩＬ２受容体β鎖（ＩＬ２Ｒβ）膜貫通ドメインと、ＩＬ２Ｒβ膜近傍ドメインとを含み、且つ該膜貫通接続膜近傍ドメインはＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）に隣接し、ここで、好ましくは、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、該膜貫通接続膜近傍ドメインのＣ－末端にあり、ここで、好ましくは、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ここで、該膜貫通接続膜近傍ドメインは、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）膜貫通ドメインと、ＬＤＬＲ膜近傍ドメインとを含み、又は、
ここで、該膜貫通接続膜近傍ドメインは、てんかん発作６様タンパク質２（ＳＥＺ６Ｌ２）膜貫通ドメインと、ＳＥＺ６Ｌ２膜近傍ドメインとを含む膜貫通接続膜近傍ドメインと、
（３）細胞内ドメインであって、ここで、好ましくは、該細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含み、さらに好ましくは、該シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインからなる群から選択される一つ又は複数のシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。
（１）所定の抗原に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメインであって、ここで、好ましくは、該所定の抗原は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり、さらに好ましくは、該ＴＡＡは、ＣＥＡ、クローディン１８．２、ＣＧＣ３、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ＣＤ４４６、ＣＤ１３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣａｍ、ＧＤ２、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＩＣＡＭ－１、ＩＬ１３Ｒａ２、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＳＣＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１、ＷＴ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＥＢＶ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２５、ＩＬ－２、及びＣＤ３のうちの一つ又は複数から選択される細胞外リガンド結合ドメインと、
（２）膜貫通（ｔｍ）接続膜近傍（ｊｍ）ドメインであって、
ここで、該膜貫通接続膜近傍ドメインは、ＩＬ２受容体β鎖（ＩＬ２Ｒβ）膜貫通ドメインと、ＩＬ２Ｒβ膜近傍ドメインとを含み、且つ該膜貫通接続膜近傍ドメインはＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）に隣接し、ここで、好ましくは、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、該膜貫通接続膜近傍ドメインのＣ－末端にあり、ここで、好ましくは、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ここで、該膜貫通接続膜近傍ドメインは、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）膜貫通ドメインと、ＬＤＬＲ膜近傍ドメインとを含み、又は、
ここで、該膜貫通接続膜近傍ドメインは、てんかん発作６様タンパク質２（ＳＥＺ６Ｌ２）膜貫通ドメインと、ＳＥＺ６Ｌ２膜近傍ドメインとを含む膜貫通接続膜近傍ドメインと、
（３）細胞内ドメインであって、ここで、好ましくは、該細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含み、さらに好ましくは、該シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインからなる群から選択される一つ又は複数のシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。
【0018】
別の態様では、ＣＡＲは、Ｎ－末端からＣ－末端まで、ＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、ＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＬＤＬＲ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、又はＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζを含む。
【0019】
別の態様では、ＴＡＡ ｓｃＦｖは、ＣＥＡ ｓｃＦｖ、クローディン１８．２ ｓｃＦｖ及びＨＥＲ２ ｓｃＦｖのうちの一つ又は複数から選択され、さらに好ましくは、ＣＥＡ ｓｃＦｖは、ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖであり、又は、クローディン１８．２ ｓｃＦｖは、８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖであり、最も好ましくは、ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ、８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ、又はＨＥＲ２ ｓｃＦｖは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、３０又は３１で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0020】
別の態様では、ＣＡＲのＮ－末端は、リーダー配列及び／又はＨＡ配列をさらに含む。
【0021】
別の態様では、ＣＡＲは、Ｎ－末端からＣ－末端まで、
ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、
ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＬＤＬＲ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、又は
ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰを含み、任意選択的に、該ＣＡＲはＰ２Ａ－ＧＦＰ及び／又はＨＡを含まず、
別の態様では、ＣＡＲは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９、１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２又は２４で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択的に、該ＣＡＲのアミノ酸配列は、Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、リーダー配列、及び／又はＨＡのアミノ酸配列を含まない。
ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、
ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＬＤＬＲ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、又は
ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰを含み、任意選択的に、該ＣＡＲはＰ２Ａ－ＧＦＰ及び／又はＨＡを含まず、
別の態様では、ＣＡＲは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９、１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２又は２４で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択的に、該ＣＡＲのアミノ酸配列は、Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、リーダー配列、及び／又はＨＡのアミノ酸配列を含まない。
【0022】
別の態様では、ＣＡＲは、ヒンジドメインを含み、好ましくは、該ヒンジドメインは、細胞外領域から派生したＣＤ８又はＣＤ２８ヒンジ、又はＩｇＧヒンジを含む。
【0023】
別の態様では、本出願は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに提供し、該キメラ抗原受容体は、
（１）所定の抗原に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメインであって、ここで、好ましくは、該所定の抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり、さらに好ましくは、該ＴＡＡは、ＣＥＡ、クローディン１８．２、ＣＧＣ３、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ＣＤ４４６、ＣＤ１３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣａｍ、ＧＤ２、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＩＣＡＭ－１、ＩＬ１３Ｒａ２、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＳＣＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１、ＷＴ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＥＢＶ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２５、ＩＬ－２、及びＣＤ３のうちの一つ又は複数から選択される細胞外リガンド結合ドメインと、
（２）膜貫通ドメインと、
（３）ＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）と、少なくとも一つのシグナル伝達ドメインとを含む細胞質セグメントであって、ここで、好ましくは、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、好ましくは、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は該細胞質セグメントのＣ－末端にある細胞質セグメントとを含む。
（１）所定の抗原に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメインであって、ここで、好ましくは、該所定の抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり、さらに好ましくは、該ＴＡＡは、ＣＥＡ、クローディン１８．２、ＣＧＣ３、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ＣＤ４４６、ＣＤ１３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣａｍ、ＧＤ２、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＩＣＡＭ－１、ＩＬ１３Ｒａ２、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＳＣＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１、ＷＴ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＥＢＶ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２５、ＩＬ－２、及びＣＤ３のうちの一つ又は複数から選択される細胞外リガンド結合ドメインと、
（２）膜貫通ドメインと、
（３）ＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）と、少なくとも一つのシグナル伝達ドメインとを含む細胞質セグメントであって、ここで、好ましくは、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、好ましくは、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は該細胞質セグメントのＣ－末端にある細胞質セグメントとを含む。
【0024】
別の態様では、ＣＡＲは、Ｎ－末端からＣ－末端まで、ＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ＩＬ２Ｒβ ＤＴを含む。
【0025】
別の態様では、ＣＡＲのＮ－末端は、リーダー配列及び／又はＨＡ配列をさらに含む。
【0026】
別の態様では、該ＴＡＡ ｓｃＦｖは、ＣＥＡ ｓｃＦｖであり、さらに好ましくは、該ＴＡＡ ｓｃＦｖは、ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖであり、最も好ましくは、ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、該ＣＡＲは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８又は１６で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択的に、該ＣＡＲのアミノ酸配列は、Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、リーダー配列、及び／又はＨＡのアミノ酸配列含まない。
【0027】
別の態様では、ＩＬ２Ｒβ、ＬＤＬＲ、又はＳＥＺ６Ｌ２の膜貫通（ｔｍ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、３８又は４０で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ＩＬ２Ｒβ、ＬＤＬＲ、又はＳＥＺ６Ｌ２の膜近傍（ｊｍ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、３９又は４１で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ＩＬ２Ｒβ、ＬＤＬＲ、又はＳＥＺ６Ｌ２の膜貫通（ｔｍ）接続膜近傍（ｊｍ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７、２８又は２９で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ、８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ、ＨＡ、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ３ζ、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ８ ｔｍ、ＧＦＰ、又はリーダー配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４２、４５又は４６で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は、
該Ｐ２Ａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３又は４４で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
該ＩＬ２Ｒβ、ＬＤＬＲ、又はＳＥＺ６Ｌ２の膜近傍（ｊｍ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、３９又は４１で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ＩＬ２Ｒβ、ＬＤＬＲ、又はＳＥＺ６Ｌ２の膜貫通（ｔｍ）接続膜近傍（ｊｍ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７、２８又は２９で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ、８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ、ＨＡ、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ３ζ、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ８ ｔｍ、ＧＦＰ、又はリーダー配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４２、４５又は４６で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は、
該Ｐ２Ａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３又は４４で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0028】
別の態様では、本出願は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、該キメラ抗原受容体は、
（１）所定の抗原に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（２）膜貫通（ｔｍ）接続膜近傍（ｊｍ）ドメインであって、
ここで、該膜貫通接続膜近傍ドメインは、ＩＬ２受容体β鎖（ＩＬ２Ｒβ）膜貫通ドメインと、ＩＬ２Ｒβ膜近傍ドメインとを含み、且つ該膜貫通接続膜近傍ドメインはＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）に隣接し、ここで、好ましくは、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、該膜貫通接続膜近傍ドメインのＣ－末端にあり、ここで、好ましくは、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ここで、該膜貫通接続膜近傍ドメインは、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）膜貫通ドメインと、ＬＤＬＲ膜近傍ドメインとを含み、又は、
ここで、該膜貫通接続膜近傍ドメインは、ヒトてんかん発作６様タンパク質２（ＳＥＺ６Ｌ２）膜貫通ドメインと、ＳＥＺ６Ｌ２膜近傍ドメインとを含み、
該ＩＬ２Ｒβ、ＬＤＬＲ、又はＳＥＺ６Ｌ２の膜貫通（ｔｍ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、３８又は４０で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ＩＬ２Ｒβ、ＬＤＬＲ、又はＳＥＺ６Ｌ２の膜近傍（ｊｍ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、３９又は４１で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通接続膜近傍ドメインと、
（３）細胞内ドメインとを含む。
（１）所定の抗原に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（２）膜貫通（ｔｍ）接続膜近傍（ｊｍ）ドメインであって、
ここで、該膜貫通接続膜近傍ドメインは、ＩＬ２受容体β鎖（ＩＬ２Ｒβ）膜貫通ドメインと、ＩＬ２Ｒβ膜近傍ドメインとを含み、且つ該膜貫通接続膜近傍ドメインはＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）に隣接し、ここで、好ましくは、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、該膜貫通接続膜近傍ドメインのＣ－末端にあり、ここで、好ましくは、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ここで、該膜貫通接続膜近傍ドメインは、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）膜貫通ドメインと、ＬＤＬＲ膜近傍ドメインとを含み、又は、
ここで、該膜貫通接続膜近傍ドメインは、ヒトてんかん発作６様タンパク質２（ＳＥＺ６Ｌ２）膜貫通ドメインと、ＳＥＺ６Ｌ２膜近傍ドメインとを含み、
該ＩＬ２Ｒβ、ＬＤＬＲ、又はＳＥＺ６Ｌ２の膜貫通（ｔｍ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、３８又は４０で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ＩＬ２Ｒβ、ＬＤＬＲ、又はＳＥＺ６Ｌ２の膜近傍（ｊｍ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、３９又は４１で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通接続膜近傍ドメインと、
（３）細胞内ドメインとを含む。
【0029】
別の態様では、本出願は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに提供し、該キメラ抗原受容体は、
（１）所定の抗原に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、
（２）膜貫通ドメインと、
（３）ＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）と、少なくとも一つのシグナル伝達ドメインとを含む細胞質セグメントであって、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は該細胞質セグメントのＣ－末端にある細胞質セグメントとを含む。
（１）所定の抗原に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、
（２）膜貫通ドメインと、
（３）ＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）と、少なくとも一つのシグナル伝達ドメインとを含む細胞質セグメントであって、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は該細胞質セグメントのＣ－末端にある細胞質セグメントとを含む。
【0030】
特別な実施例では、Ｎ－末端からＣ－末端までＩＬ２Ｒβ膜貫通（ｔｍ）と、膜近傍（ｊｍ）と、分解配列（ＤＴ）とを含むＣＡＲは、
（１）ＭＬＢ００３ ＣＡＲ：ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９で表されるアミノ酸配列）、
（２）ＭＬＢ０１３ ＣＡＲ：ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５で表されるアミノ酸配列）、
（３）ＭＬＢ０２０ ＣＡＲ：ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４で表されるアミノ酸配列）、
（４）ＭＬＢ０３８ ＣＡＲ：ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１で表されるアミノ酸配列）、又は、
（５）ＭＬＢ０３９ ＣＡＲ：ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２で表されるアミノ酸配列）を含み、
任意選択的に、該ＣＡＲは、Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、リーダー配列、及び／又はＨＡを含まない。
（１）ＭＬＢ００３ ＣＡＲ：ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９で表されるアミノ酸配列）、
（２）ＭＬＢ０１３ ＣＡＲ：ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５で表されるアミノ酸配列）、
（３）ＭＬＢ０２０ ＣＡＲ：ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４で表されるアミノ酸配列）、
（４）ＭＬＢ０３８ ＣＡＲ：ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１で表されるアミノ酸配列）、又は、
（５）ＭＬＢ０３９ ＣＡＲ：ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２で表されるアミノ酸配列）を含み、
任意選択的に、該ＣＡＲは、Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、リーダー配列、及び／又はＨＡを含まない。
【0031】
特別な実施例では、Ｎ－末端からＣ－末端までＬＤＬＲ膜貫通（ｔｍ）と膜近傍（ｊｍ）とを含むＣＡＲは、
（１）ＭＬＢ０４８ ＣＡＲ：ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＬＤＬＲ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８で表されるアミノ酸配列）を含み、
任意選択的に、該ＣＡＲは、Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、リーダー配列、及び／又はＨＡを含まない。
（１）ＭＬＢ０４８ ＣＡＲ：ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＬＤＬＲ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８で表されるアミノ酸配列）を含み、
任意選択的に、該ＣＡＲは、Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、リーダー配列、及び／又はＨＡを含まない。
【0032】
特別な実施例では、Ｎ－末端からＣ－末端までＳＥＺ６Ｌ２膜貫通（ｔｍ）と膜近傍（ｊｍ）とを含むＣＡＲは、
（１）ＭＬＢ０４７ ＣＡＲ：ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７で表されるアミノ酸配列）、
（２）ＭＬＢ０５４ ＣＡＲ：８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９で表されるアミノ酸配列）、又は、
（３）ＭＬＢ０８０ ＣＡＲ：ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４で表されるアミノ酸配列）を含み、
任意選択的に、該ＣＡＲは、Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、リーダー配列、及び／又はＨＡを含まない。
（１）ＭＬＢ０４７ ＣＡＲ：ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７で表されるアミノ酸配列）、
（２）ＭＬＢ０５４ ＣＡＲ：８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９で表されるアミノ酸配列）、又は、
（３）ＭＬＢ０８０ ＣＡＲ：ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４で表されるアミノ酸配列）を含み、
任意選択的に、該ＣＡＲは、Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、リーダー配列、及び／又はＨＡを含まない。
【0033】
特別な実施例では、細胞質セグメント（それは、Ｎ－末端からＣ－末端まで、ＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）と、少なくとも一つのシグナル伝達ドメインとを含む）を含むＣＡＲは、
（１）ＭＬＢ０２５ ＣＡＲ：ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ＩＬ２Ｒβ ＤＴ －Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６で表されるアミノ酸配列）、又は、
（２）ＭＬＢ００２ ＣＡＲ：ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ＩＬ２Ｒβ ＤＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８で表されるアミノ酸配列）を含み、
任意選択的に、該ＣＡＲは、Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、リーダー配列、及び／又はＨＡを含まない。
（１）ＭＬＢ０２５ ＣＡＲ：ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ＩＬ２Ｒβ ＤＴ －Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６で表されるアミノ酸配列）、又は、
（２）ＭＬＢ００２ ＣＡＲ：ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ＩＬ２Ｒβ ＤＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８で表されるアミノ酸配列）を含み、
任意選択的に、該ＣＡＲは、Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、リーダー配列、及び／又はＨＡを含まない。
【0034】
別の態様では、本出願は、二重ＣＡＲをさらに提供し、該二重ＣＡＲは、上記実施例のいずれか一つに記載の第１のＣＡＲと、
第２のＣＡＲとを含み、該第２のＣＡＲは、
（１）所定の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖを含む細胞外リガンド結合ドメインと、
（２）膜貫通ドメインであって、ここで、好ましくは、該膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインである膜貫通ドメインと、
（３）細胞内ドメインであって、ここで、好ましくは、該細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含み、さらに好ましくは、該シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインからなる群から選択される一つ又は複数のシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインとを含み、
ここで、該第１のＣＡＲは抗原を標的化するとともに、該第２のＣＡＲは別の抗原を標的化する。
第２のＣＡＲとを含み、該第２のＣＡＲは、
（１）所定の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖを含む細胞外リガンド結合ドメインと、
（２）膜貫通ドメインであって、ここで、好ましくは、該膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインである膜貫通ドメインと、
（３）細胞内ドメインであって、ここで、好ましくは、該細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含み、さらに好ましくは、該シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインからなる群から選択される一つ又は複数のシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインとを含み、
ここで、該第１のＣＡＲは抗原を標的化するとともに、該第２のＣＡＲは別の抗原を標的化する。
【0035】
別の態様では、第１のＣＡＲと第２のＣＡＲはＰ２Ａによって接続される。
【0036】
別の態様では、該Ｐ２Ａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３又は４４で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0037】
別の態様では、二重ＣＡＲは、Ｎ－末端からＣ－末端まで、
ＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－別のＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－別のＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＬＤＬＲ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－別のＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－別のＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＬＤＬＲ ｔｍ ｊｍ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－別のＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－ＣＤ２８、又はＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－別のＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－ＣＤ３ζを含む。
ＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－別のＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－別のＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＬＤＬＲ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－別のＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－別のＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＬＤＬＲ ｔｍ ｊｍ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－別のＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－ＣＤ２８、又はＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－別のＴＡＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－ＣＤ３ζを含む。
【0038】
別の態様では、二重ＣＡＲは、Ｎ－末端からＣ－末端まで、それぞれ、８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－ＣＤ２８－（Ｇ４Ｓ）２－ＧＦＰ、８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、又は８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－ＣＤ３ζを含み、任意選択的に、該二重ＣＡＲは（Ｇ４Ｓ）２－ＧＦＰを含まず、さらに好ましくは、８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、又はＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０、３１又は３２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、該ＣＡＲは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０、２５又は２６で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択的に、該ＣＡＲ的アミノ酸配列は（Ｇ４Ｓ）２－ＧＦＰ及び／又はリーダー配列のアミノ酸配列を含まない。
【0039】
特別な実施例では、二重ＣＡＲは、Ｎ－末端からＣ－末端まで、
（１）ＭＬＢ０５５ ＣＡＲ：８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－ＣＤ２８－（Ｇ４Ｓ）２－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０で表されるアミノ酸配列）、
（２）ＭＬＢ０４０ ＣＡＲ：８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５で表されるアミノ酸配列）、又は、
（３）ＭＬＢ１０８ ＣＡＲ：８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－ＣＤ３ζ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６で表されるアミノ酸配列）を含み、
任意選択的に、該二重ＣＡＲは（Ｇ４Ｓ）２－ＧＦＰ及び／又はリーダー配列を含まない。
（１）ＭＬＢ０５５ ＣＡＲ：８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－ＣＤ２８－（Ｇ４Ｓ）２－ＧＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０で表されるアミノ酸配列）、
（２）ＭＬＢ０４０ ＣＡＲ：８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５で表されるアミノ酸配列）、又は、
（３）ＭＬＢ１０８ ＣＡＲ：８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－ＣＤ３ζ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６で表されるアミノ酸配列）を含み、
任意選択的に、該二重ＣＡＲは（Ｇ４Ｓ）２－ＧＦＰ及び／又はリーダー配列を含まない。
【0040】
別の態様では、本出願は、上記ＣＡＲ又は二重ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む核酸をさらに提供した。
【0041】
別の態様では、本出願は、上記ＣＡＲ又は二重ＣＡＲをコードする上記ポリヌクレオチドを含むベクターをさらに提供した。
【0042】
別の態様では、本出願は、少なくとも一つの上記核酸又は少なくとも一つの上記ベクターを含む組成物をさらに提供した。
【0043】
別の態様では、本出願は、本出願の一つ又は複数の核酸又はベクター又は組成物を含む宿主細胞をさらに提供した。
【0044】
別の態様では、宿主細胞は、自家細胞又は同種異系細胞である。
【0045】
別の態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくは、霊長類細胞であり、さらに好ましくは、ヒト細胞である。
【0046】
別の態様では、宿主細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ｉＮＫＴ細胞、臍帯血ＮＫ細胞、γδＴ細胞（γδ Ｔ－細胞）、ＴＣＲノックアウトＴ細胞、ウイルス特異的なＴ細胞、単核細胞、マクロファージ、又はｉＰＳＣから派生したＴ細胞から選択される。
【0047】
別の態様では、本出願は、本出願のＣＡＲ又は二重ＣＡＲ、一つ又は複数の核酸、一つ又は複数のベクター、又は宿主細胞を含む薬物組成物をさらに提供した。
【0048】
別の態様では、薬物組成物は、一つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【0049】
別の態様では、本出願は、それを必要とする被験体における疾患を治療する方法に関し、該方法は、該被験体に（例えば、治療有効量の）本出願の薬物組成物、ＣＡＲ、二重ＣＡＲを投与することを含む。
【0050】
別の態様では、疾患は、血液悪性腫瘍又は一つ又は複数の固形腫瘍を含む癌である。
【0051】
別の態様では、癌は、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、リンパ腫、食道癌、肺癌、肝臓癌、頭頸部癌、又は胆嚢癌である。
【0052】
別の態様では、本出願は、本出願のＣＡＲ又は二重ＣＡＲ、核酸、又はベクター、又は組成物を使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞による正常細胞への細胞毒性を低減する方法に関する。
【0053】
一つの態様では、本出願は、正常細胞への細胞毒性が低減されたＣＡＲ－Ｔ細胞を産生する方法に関し、該方法は、
（１）本出願の核酸又はベクターを宿主細胞に導入することと、
（２）導入した後に、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞を単離及び／又は増殖することとを含む。
（１）本出願の核酸又はベクターを宿主細胞に導入することと、
（２）導入した後に、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞を単離及び／又は増殖することとを含む。
【0054】
別の態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくは、霊長類細胞であり、さらに好ましくは、ヒト細胞である。
【0055】
別の態様では、宿主細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ｉＮＫＴ細胞、臍帯血ＮＫ細胞、γδＴ細胞（γδ Ｔ－細胞）、ＴＣＲノックアウトＴ細胞、ウイルス特異的なＴ細胞、単核細胞、マクロファージ、又はｉＰＳＣから派生したＴ細胞から選択される。
【0056】
本出願の技術案は、少なくとも以下の利点を有する。
【0057】
１．上記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、標的依存性スイッチである。標的抗原が存在しない場合、ＣＡＲの表面発現を検出することはできない。該システムは、抗原が存在しない場合に検出可能性が限られているため、本出願では「ステルスＣＡＲ」と呼ばれる。
【0058】
２．ステルスＣＡＲは、ＩＬ２Ｒβ、ＬＤＬＲ、ＳＥＺ６Ｌ２の膜貫通と膜近傍モチーフ及び／又はＩＬ２Ｒβの分解配列（ＰＳＫＦＦＳＱＬ）を使用することによって、正常細胞への細胞毒性を低減し、且つＣＡＲ－Ｔの安全性を向上させることができ、それによって、抗原が存在しない場合、細胞表面でのＣＡＲ発現が大幅に低減するとともに、抗原を発現する標的細胞に応答する下流活性化能力を保持する。
【0059】
３．本出願は、これらの表面が不安定なステルスＣＡＲを発現する初代Ｔ細胞は、抗原依存性標的細胞の殺傷を引き起し得ることを示した。このような方式でＣＡＲの活性を制限することにより、本出願は、治療による毒性とＴ細胞枯渇を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【0060】
本出願の斬新な特徴は、添付の特許請求の範囲において具体的に説明される。以下の発明を実施するための形態において、本出願のいくつかの特徴と利点は、実施例と例の方式で説明される。
【図1】抗原エスケープを解決するためのエンドサイトーシスＣＡＲシステムのスケッチ表示である。一次ＣＡＲ標的を介して一次腫瘍抗原を標的化することによる腫瘍細胞への選択的圧力は、受容体の下方制御と「抗原エスケープ」を引き起こす。そして、二次（エンドサイトーシス）ＣＡＲにより認識された二次腫瘍抗原を介して、生きている腫瘍細胞を標的化することができる。
【図2】ＣＡＲの表面安定性の低下が治療毒性の低減に寄与していることを示すスケッチ表示である。腫瘍抗原は、通常、癌組織上で上方制御するが、正常組織上では、依然として低いレベルで発現されるタンパク質マーカーである。ＣＡＲは、対応抗原が存在する場合にのみＴ細胞表面で安定化し、標的タンパク質をより多く発現する細胞の殺傷を促進する。
【図3】エンドサイトーシスＣＡＲ構築体の概略図である。ＣＡＲ構築体は、二種類の変異体があり、一つはＣＡＲ配列のＣ－末端にあるＰＳＫＦＦＳＱＬ分解配列（ＤＴ）を使用するが、もう一つはＩＬ２Ｒβ膜貫通ドメインと２７個のアミノ酸の膜近傍ドメイン及びＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）をＣＤ８膜貫通ドメインの代わりに使用する。
【図4】Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ ＮＦＡＴレポーター細胞は、エレクトロポレーション後のＣＡＲ発現を示した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡと各ＣＡＲ構築体変異体で電気メッキされ、該変異体は、ＭＮ１４ｏｐ ＣＡＲ（ＬＢＣ００１）、ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＡＲ（ＭＬＢ００１）、ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＡＲ－ＤＴ（ＭＬＢ００２）、及びＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＡＲ－ＩＬ２Ｒｂ－ｔｍ（ＭＬＢ００３）を含む。抗ヒトＦａｂ’（ＡＦ４８８）を用いて受容体の発現を観察した。ＤＡＰＩの組み込みによって死細胞を排除した。
【図5】ＨＡタグと抗ヒトＦａｂ（ＡＦ４８８）染色は直線的な相関を示す。エンドサイトーシスＣＡＲ変異体（ＭＬＢ００２とＭＬＢ００３）を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、ＨＡ（ＰＥ）と人Ｆａｂ（ＡＦ４８８）に対して同時染色し、二種類の染色の間の直線的な関係を示した。代替可能な染色ポリシーを有することにより、パルス追跡実験を行って、受容体内在化速度を測定することが可能になる。
【図6】初代Ｔ細胞におけるエンドサイトーシスＣＡＲ発現である。ドナーＰＢＭＣから派生したＴ（初代Ｔ細胞）細胞に対して、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡと各エンドサイトーシスＣＡＲ構築体変異体（ＭＬＢ００２とＭＬＢ００３）を用いてエレクトロポレーションを行った。抗ヒトＦａｂ’（ＡＦ４８８）染色によって受容体の表面発現を評価した。
【図7】エンドサイトーシスＣＡＲ（ＭＬＢ００２とＭＬＢ００３）は下流応答腫瘍抗原のシグナル伝達を駆動する。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞を、ＣＥＡ標的抗原を発現するＬＯＶＯ細胞と１：１で共培養した。ＬＯＶＯ細胞と共にインキュベートされたＪｕｒｋａｔ細胞はルシフェラーゼ活性を示したが、標的細胞が存在しない（ＬＯＶＯ陰性）場合に成長したＪｕｒｋａｔ細胞は、６時間でレポーター遺伝子の発現が最も少なかった。
【図8】長期刺激は、ＣＡＲ変異体の間の活性が同等であることを示す。エンドサイトーシスＣＡＲ構築体を発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞を、ＣＥＡ抗原を発現するＬＯＶＯ細胞と１：１で共培養した。２４時間の刺激時間帯の後に、受容体を発現するＩＬ２Ｒβ変異体（ＭＬＢ００２とＭＬＢ００３）のＪｕｒｋａｔｓは、元のＭＮ１４ｏｐ－ＣＡＲと同等の活性化を示した。
【図9】エンドサイトーシスＣＡＲ構築体は、Ｋａｔｏ－ＩＩＩ細胞の標的細胞殺傷を誘導する。ドナーから派生した初代Ｔ細胞を、ＣＥＡ抗原を発現するＫａｔｏ－ＩＩＩルシフェラーゼレポーター細胞と、１：１（５ｅ５：５ｅ５）でインキュベートした。２４時間後、発光による細胞毒性測定によって、ＣＡＲの二種類のＩＬ２Ｒβ変異体は、いずれもトランスフェクトされていない対照細胞の抗原特異的細胞毒性よりも高い抗原特異的細胞毒性を誘導できることが示された。
【図10】ＣＡＲ構築体（ＭＬＢ０４７とＭＬＢ０４８）の概略図は、膜貫通と膜近傍配列に対する改変を示した。ＭＬＢ０４７は、ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ＳｃＦｖ抗原を利用してドメインを認識する。ＭＬＢ０４７には、てんかん発作６様タンパク質２（ＳＥＺ６Ｌ２）膜貫通と、膜近傍配列に由来する３３個のアミノ酸が設計されている。ＭＬＢ０４８は、ＬＤＬＲ膜貫通と膜近傍配列を利用する。これらのＣＡＲはＰ２Ａ－ＧＦＰを含まない。
【図11】ＣＡＲ構築体（ＭＬＢ０５４とＭＬＢ０５５）の概略図は、膜貫通と膜近傍配列に対する改変を示した。ＭＬＢ０５４は、８４１クローディン１８．２ ＳｃＦｖ（ＣＮ０２）抗原を利用してドメインを認識する。ＭＬＢ０５４には、てんかん発作６様タンパク質２（ＳＥＺ６Ｌ２）膜貫通と膜近傍配列に由来する３３個のアミノ酸が設計されている。ＭＬＢ０５５は、二成分ＣＡＲ（二重ＣＡＲ）であり、ＭＬＢ０５４クローディン１８．２ ＣＡＲ配列、及び元のＣＡＲと同じであるＣＤ８ヒンジと膜貫通ドメインでＣＤ２８シグナル伝達ドメインにカップリングされる抗ＰＤＬ１に基づく。これらのＣＡＲはＰ２Ａ－ＧＦＰを含まない。
【図12】斬新なステルスＣＡＲ構築体（ＭＬＢ０２５、ＭＬＢ０２０、ＭＬＢ０４８及びＭＬＢ０４７）のモデルＴ細胞系における発現特性である。ＭＬＢ０１０は、対照ＣＡＲ構築体である。ＰｉｇｇｙＢＡＣ ＣＡＲ構築体とＰｉｇｇｙＢＡＣトランスポザーゼｍＲＮＡでＪｕｒｋａｔ細胞を形質導入した。抗ヒトＦ（ａｂ’）２（ＡＦ６４７）で染色することによって、エレクトロポレーション後の１０日目にＣＡＲの発現を評価した。血清のない染色培地において、４°Ｃで３０分間染色した。検出可能な表面染色が存在しない場合、ＧＦＰシグナルを用いて構築体の発現を評価した。
【図13】ステルスＣＡＲ構築体は、ＮＦＡＴ依存性Ｔ細胞の活性化を駆動する。形質導入されてステルスＣＡＲ構築体を発現するＪｕｒｋａｔルシフェラーゼレポーター細胞を、ＣＥＡ陽性ＬｏＶｏ細胞と２４時間共培養し、ＮＦＡＴにより駆動されるルシフェラーゼレポーターの発現によってＴ細胞の活性化を評価した。２５，０００個のＣＡＲ陽性Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を、該アッセイに用いられる標的細胞と１：１で培養した。ＣＡＲベクター上でＧＦＰを共発現することによって、ＣＡＲ陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞の数を確定した。
【図14A-14F】ステルスＣＡＲ形式は、ＣＤ８に基づくＣＡＲ形式より弱い活性化特性を示している。ＭＬＢ０１０、ＭＬＢ０２０、ＭＬＢ０２５、ＭＬＢ０４８及びＭＬＢ０４７を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、ＬｏＶｏ細胞と３時間、６時間又は２４時間共培養し、ＰＥにコンジュゲートした抗ＣＤ６９抗体を用いて、フローサイトメトリーによりＣＤ６９の発現を検出することによってＪｕｒｋａｔ細胞の活性化を測定した。ＧＦＰ発現に基づいてＣＡＲ陽性細胞を検出するとともに、ＣＤ３発現によってＴ細胞を同定することによって、形質導入及び非形質導入集団を描画した。ここでは、ＣＤ６９発現のスキャッタグラムと、対応するヒストグラムが示されている。図１４Ａは、ＭＬＢ０１０（Ｍ１０）とＭＬＢ０２０（Ｍ２０）のＣＡＲ陽性群の結果を示している。図１４Ｂは、ＭＬＢ０２５（Ｍ２５）とＭＬＢ０４８（Ｍ４８）のＣＡＲ陽性群の結果を示している。図１４Ｃは、ＭＬＢ０４７（Ｍ４７）と形質導入されていない（ＵＴＤ）のＣＡＲ陽性群の結果を示している。図１４Ｄは、ＭＬＢ０１０（Ｍ１０）とＭＬＢ０２０（Ｍ２０）の全体的ＣＤ６９上方制御程度の結果を示している。図１４Ｅは、ＭＬＢ０２５（Ｍ２５）とＭＬＢ０４８（Ｍ４８）の全体的ＣＤ６９上方制御程度の結果を示している。図１４Ｆは、ＭＬＢ０４７（Ｍ４７）と形質導入されていない（ＵＴＤ）の全体的ＣＤ６９上方制御程度の結果を示している。
【図15】ＪｕｒｋａｔステルスＣＡＲ活性化の定量は、抗原発現細胞との共培養後に活性化状態の低下を示す。図１５におけるヒストグラムを定量して、ＣＡＲ Ｔ細胞群における活性化細胞のスコアとＣＤ６９発現の程度を得た。活性化細胞スコアから見られるように、発明者らは、抗原に応答する活性化動態が同等であり、しかしながら、ステルスＣＡＲ ＭＬＢ０２０（Ｍ２０）、ＭＬＢ０２５（Ｍ２５）、ＭＬＢ０４８（Ｍ４８）及びＭＬＢ０４７（Ｍ４７）が、元のＭＬＢ０１０（Ｍ１０）ＣＡＲ形式に比べて、遙かに低いＣＤ６９発現を示すことを観察した。
【図16】斬新なステルスＣＡＲ構築体（ＭＬＢ０２０、ＭＬＢ０４７、ＭＬＢ０４８）の初代細胞における発現特性である。初代ヒトＰＢＭＣから派生したＴ細胞を、ＰｉｇｇｙＢＡＣ ＣＡＲ構築体とＰｉｇｇｙＢＡＣトランスポザーゼｍＲＮＡで形質導入した。抗ヒトＦ（ａｂ’）２（ＡＦ６４７）で染色することによって、エレクトロポレーション後の１０日目にＣＡＲの発現を評価した。血清のない染色培地において、４°Ｃで３０分間染色した。検出可能な表面染色が存在しない場合、ＧＦＰシグナルを用いて構築体の発現を評価した。
【図17A-17C】ステルスＣＡＲ（ＭＬＢ０１３、ＭＬＢ０４８、ＭＬＢ０４７）は、標的細胞の抗原発現に依存する、可変細胞により媒介される細胞毒性を駆動する。ＬｏＶｏ（ＣＥＡ高）（図１７Ａ）、Ａ５４９（ＣＥＡ中）（図１７Ｂ）、及びＨＴ２９（ＣＥＡ低）（図１７Ｃ）の三種類の代表的なＣＥＡ陽性標的細胞系を用いて、ステルスＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性ポテンシャルをアッセイした。Ｔ細胞と標的細胞を３：１、１：１と０．３：１（ＣＡＲ＋ Ｔ細胞：標的）の割合で培養し、ここで、標的細胞数／ウェルを１０，０００に固定した。標的細胞は、構成的ルシフェラーゼレポーターを発現するとともに、標的細胞系のみを含むウェルの発光シグナルの低下に対して細胞毒性を評価した。Ｔ細胞陰性対照（Ｅ：Ｔ＝０：１）とＴ細胞のみの対照（Ｅ：Ｔ＝１：０）に基づいて、細胞毒性率を計算した。
【図18A-18C】ステルスＣＡＲ（ＭＬＢ０１３、ＭＬＢ０４８、ＭＬＢ０４７）Ｔ細胞は、炎症性サイトカインの発現特性の大幅な低下を示す。ＬｏＶｏ（ＣＥＡ高）（図１８Ａ）、Ａ５４９（ＣＥＡ中）（図１８Ｂ）、及びＨＴ２９（ＣＥＡ低）（図１８Ｃ）の三種類の代表的なＣＥＡ陽性標的細胞系に対する細胞毒性アッセイからの上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮγ発現を確定した。Ｔ細胞と標的細胞を３：１、１：１と０．３：１（ＣＡＲ＋ Ｔ細胞：標的）の割合で培養し、ここで、標的細胞数／ウェルを１０，０００に固定した。標的細胞は、構成的ルシフェラーゼレポーターを発現するとともに、標的細胞系のみを含むウェルの発光シグナルの低下に対して細胞毒性を評価した。Ｔ細胞陰性対照（Ｅ：Ｔ＝０：１）とＴ細胞のみの対照（Ｅ：Ｔ＝１：０）に基づいて、細胞毒性率を計算した。
【図19】ステルスＣＡＲ（ＭＬＢ０１３、ＭＬＢ０４８、ＭＬＢ０４７）Ｔ細胞は、ＩＬ－２の発現特性の大幅な低下を示す。Ａ５４９（ＣＥＡ中）とＨＴ２９（ＣＥＡ低）の二種類の代表的なＣＥＡ陽性標的細胞系に対する細胞毒性アッセイからの上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－２発現を確定した。Ｔ細胞と標的細胞を３：１、１：１と０．３：１（ＣＡＲ＋ Ｔ細胞：標的）の割合で培養し、ここで、標的細胞数／ウェルを１０，０００に固定した。標的細胞は、構成的ルシフェラーゼレポーターを発現するとともに、標的細胞系のみを含むウェルの発光シグナルの低下に対して細胞毒性を評価した。Ｔ細胞陰性対照（Ｅ：Ｔ＝０：１）とＴ細胞のみの対照（Ｅ：Ｔ＝１：０）に基づいて、細胞毒性率を計算した。
【図20】Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞モデルシステムにおけるクローディン１８．２の特異的ステルスＣＡＲ（ＭＬＢ０２６、ＭＬＢ０５４、ＭＬＢ０５５）Ｔ細胞の発現である。ＬＢＣ０１０、ＭＬＢ０２６、ＭＬＢ０５４、及びＭＬＢ０５５に対するＰｉｇｇｙＢＡＣ ＣＡＲ構築体とＰｉｇｇｙＢＡＣトランスポザーゼｍＲＮＡでＪｕｒｋａｔ細胞を形質導入した。抗ヒトＦ（ａｂ’）２（ＡＦ６４７）で染色することによって、エレクトロポレーション後の１０日目にＣＡＲの発現を評価した。血清のない染色培地において、４°Ｃで３０分間染色した。検出可能な表面染色が存在しない場合、ＧＦＰシグナルを用いて構築体の発現を評価した。ＬＢＣ０１０とＭＬＢ０２６は同じＣＡＲ配列を有するが、ＭＬＢ０２６も、ＣＡＲ構築体においてＧＦＰの組み合わせ発現を有する。表面におけるＭＬＢ０５５のｓｃＦｖの検出は、組み合わせ発現構築体に抗ＰＤ－Ｌ１ドメインが存在するためである。
【図21A-21D】クローディン１８．２ステルスＣＡＲ変異体は、抗原特異的活性化を示す。ＭＬＢ０２６、ＭＬＢ０５４及びＭＬＢ０５５を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｔ－ｃｌｄｎ１８．２、又はＮＵＧＣ４－ｃｌｄｎ１８．２細胞と一晩共培養し、ＰＥにコンジュゲートした抗ＣＤ１９抗体を用いて、フローサイトメトリーによって活性化を測定した。ＣＤ３発現によってＴ細胞を同定した。陰性細胞系に応答するＣＤ６９の上方制御により証明されたように、発明者らは、ＣＤ８ ＣＡＲ形式の緊張性シグナル伝達の増加を観察した。ＭＬＢ０５４とＭＬＢ０５５の両者は、いずれもベースライン活性化の低下と、ＣＤ６９の抗原特異的上方制御を示した。図２１Ａ－２１Ｄは、エンドサイトーシス（ＭＬＢ０５４、ＭＬＢ０５５）と非エンドサイトーシスＣＡＲ（ＭＬＢ０２６）の両者がいずれもＣＤ６９上方制御を有することを示す。図２１Ａ－２１ＢはＣＡＲ陽性群を示すとともに、図２１Ｃ－２１Ｄは全体的なＣＤ６９上方制御の程度を示す。
【図22】ＣＤ６９発現の定量は、ステルスＣＡＲ変異体の活性化の低下を示す。図２２におけるＣＤ６９発現の定量は、ＭＬＢ０５４とＭＬＢ０５５の両者が、いずれもＭＬＢ０２６に対するベースライン活性化の低下を示したが、ＣＡＲ変異体ＭＬＢ０５４とＭＬＢ０５５のＣＤ６９発現が低下するとともに、クローディン１８．２を発現する標的細胞に応答する応答細胞が減少することを示した。図２２の左側はＣＤ６９発現を示すとともに、図２２の右側はＣＤ６９＋％を示す。
【図23】ドナーから派生したＴ細胞を、構築体ＭＬＢ０２６とＭＬＢ０５４を用いてエレクトロポレーションを介して形質導入し、且つエレクトロポレーション後の７日目にＣＡＲの発現を評価した。ＡＦ６４７にコンジュゲートした抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体を用いて、細胞を染色した。
【図24】ＭＬＢ０２６又はＭＬＢ０５４を発現するドナーから派生したＴ細胞を、ＨＥＫｃｌｄｎ１８．２ルシフェラーゼを発現する細胞を２４時間共培養し、その後に等体積のＮｅｏＬｉｔｅ基質を添加することによって発光を定量した。細胞毒性率を、処理されていない対照細胞に対する低下として評価した。
【図25】ＭＬＢ０２６又はＭＬＢ０５４を発現するドナーから派生したＴ細胞を、ＮＵＧＣ４ｃｌｄｎ１８．２ルシフェラーゼを発現する細胞を２４時間共培養し、その後に等体積のＮｅｏＬｉｔｅ基質を添加することによって発光を定量した。細胞毒性率を、処理されていない対照細胞に対する低下として評価した。
【図26】ＨＥＫｃｌｄｎ１８．２ルシフェラーゼを発現する細胞と共培養されたＭＬＢ０２６とＭＬＢ０５４の２４時間細胞毒性アッセイから上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ－γの発現を評価した。
【図27】ＮＵＧＣ４ｃｌｄｎ１８．２ルシフェラーゼを発現する細胞と共培養されたＭＬＢ０２６とＭＬＢ０５４の２４時間細胞毒性アッセイから上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ－γの発現を評価した。
【図28A-28B】ドナーから派生したＴ細胞を、構築体ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、ＭＬＢ０７９、及びＭＬＢ０８０を用いてエレクトロポレーションを介して形質導入し、エレクトロポレーション後の７日目にＣＡＲの発現を評価した。ＡＦ６４７にコンジュゲートした抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体を用いて、細胞を染色した。図２８Ａは、ＵＴＤ、ＭＬＢ０３８、及びＭＬＢ０３９の結果である。図２８Ｂは、ＭＬＢ０７９とＭＬＢ０８０の結果である。
【図29】蛍光コンジュゲートされた抗ヒトＨＥＲ２又は非特異的対照抗体を用いて、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１とＳＫ－ＢＲ－３細胞を染色した。蛍光コンジュゲートされた抗ヒトＨＥＲ２を用いて、ＬｏＶｏ細胞を染色した。全ての染色された細胞を、染色されていない対照と比較した。
【図30】ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、ＭＬＢ０７９、又はＭＬＢ０８０を発現するドナーから派生したＴ細胞を、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ルシフェラーゼを発現する細胞と２４時間共培養し、その後に等体積のＮｅｏＬｉｔｅ基質を添加することによって発光を定量した。細胞毒性率を、処理されていない対照細胞に対する低下として評価した。
【図31】ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、ＭＬＢ０７９、又はＭＬＢ０８０を発現するドナーから派生したＴ細胞を、ＬｏＶｏルシフェラーゼを発現する細胞と２４時間共培養し、その後に等体積のＮｅｏＬｉｔｅ基質を添加することによって発光を定量した。細胞毒性率を、処理されていない対照細胞に対する低下として評価した。
【図32】ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、ＭＬＢ０７９、又はＭＬＢ０８０を発現するドナーから派生したＴ細胞を、ＳＫ－ＢＲ－３ルシフェラーゼを発現する細胞と２４時間共培養し、その後に等体積のＮｅｏＬｉｔｅ基質を添加することによって発光を定量した。細胞毒性率を、処理されていない対照細胞に対する低下として評価した。
【図33】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ルシフェラーゼを発現する細胞と共培養されたＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、ＭＬＢ０７９、又はＭＬＢ０８０の２４時間細胞毒性アッセイから上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ－γの発現を評価した。
【図34】ＬｏＶｏルシフェラーゼを発現する細胞と共培養されたＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、ＭＬＢ０７９、又はＭＬＢ０８０の２４時間細胞毒性アッセイから上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ－γの発現を評価した。
【図35】ＳＫ－ＢＲ－３ルシフェラーゼを発現する細胞と共培養されたＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、ＭＬＢ０７９、又はＭＬＢ０８０の２４時間細胞毒性アッセイから上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ－γの発現を評価した。
【図36】ＨＥＫｃｌｄｎ１８．２ルシフェラーゼを発現する細胞を、抗ヒトＨＥＲ２又はクローディン１８．２に対して染色した。８４１クローンと８０８クローンの両者によってクローディン１８．２を検出した。８４１によりクローディン１８．２を依然として検出することができるが、８０８クローンを使用する時、クローディン１８．２のより強い染色を観察した。クローディン１８．２に対して染色した時、まずコンジュゲートされていないヒト化８４１と８０８抗体を用いて細胞を染色し、且つ蛍光コンジュゲートされたマウス抗ヒトＩｇＧ二次抗体で結合を検出した。
【図37】クローディン１８．２／ＨＥＲ２二重ＣＡＲ構築体と、ＭＬＢ０２６クローディン１８．２単一ＣＡＲ対照との比較の概略図である。ＭＬＢ０２６と同じ優性クローディン１８．２ ＣＡＲと第２の非優性ＣＡＲを用いて、ＭＬＢ１０８をエンジニアリングし、該第２の非優性ＣＡＲは、ハーセプチン抗ＨＥＲ２抗体ドメイン、ＳＥＺ６Ｌ２膜貫通と膜近傍ドメイン、及びＣＤ３ζ ＩＴＡＭシグナル伝達モチーフに基づく。ＭＬＢ０２６と同じ優性クローディン１８．２ ＣＡＲと第２の非優性ＣＡＲを用いて、ＭＬＢ０４０二重ＣＡＲをエンジニアリングし、該第２の非優性ＣＡＲは、ハーセプチン抗ＨＥＲ２抗体ドメイン、ＩＬ２Ｒβの膜貫通と膜近傍ドメイン、ＣＤ２８共受容体シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞内ＩＴＡＭシグナル伝達モチーフに基づく。
【図38】ドナーから派生したＴ細胞を、構築体ＭＬＢ０２６とＭＬＢ１０８を用いてエレクトロポレーションを介して形質導入し、且つエレクトロポレーション後の７日目にＣＡＲの発現を評価した。ＡＦ５９４にコンジュゲートした抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体を用いて、細胞を染色した。
【図39】ＭＬＢ０２６とＭＬＢ１０８を発現するドナーから派生したＴ細胞を、ＨＥＫｃｌｄｎ１８．２ルシフェラーゼを発現する細胞と２４時間共培養し、その後に等体積のＮｅｏＬｉｔｅ基質を添加することによって発光を定量した。細胞毒性率を、処理されていない対照細胞に対する低下として評価した。
【図40】ＨＥＫｃｌｄｎ１８．２ルシフェラーゼを発現する細胞と共培養されたＭＬＢ０２６とＭＬＢ１０８の２４時間細胞毒性アッセイから上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ－γの発現を評価した。
【図41A-41B】ドナーから派生したＴ細胞構築体を、ＭＬＢ０２６、ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、及びＭＬＢ０４０を用いてエレクトロポレーションを介して形質導入し、エレクトロポレーション後の７日目にＣＡＲの発現を評価した。ＡＦ６４７にコンジュゲートした抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体を用いて、細胞を染色した。図４１Ａは、ＵＴＤ、ＭＬＢ０２６、及びＭＬＢ０３８の結果である。図４１Ｂは、ＭＬＢ０３９とＭＬＢ０４０の結果である。
【図42】ＭＬＢ０２６、ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、又はＭＬＢ０４０を発現するドナーから派生したＴ細胞を、ＨＥＫｃｌｄｎ１８．２ルシフェラーゼを発現する細胞と２４時間共培養し、その後に等体積のＮｅｏＬｉｔｅ基質を添加することによって発光を定量した。細胞毒性率を、処理されていない対照細胞に対する低下として評価した。
【図43】ＨＥＫｃｌｄｎ１８．２ルシフェラーゼを発現する細胞と共培養されたＭＬＢ０２６、ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、及びＭＬＢ０４０の２４時間細胞毒性アッセイから上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ－γの発現を評価した。
【図44】ＭＬＢ０２６、ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、又はＭＬＢ０４０を発現するドナーから派生したＴ細胞を、ＳＫ－ＢＲ－３ルシフェラーゼを発現する細胞と２４時間共培養し、その後に等体積のＮｅｏＬｉｔｅ基質を添加することによって発光を定量した。細胞毒性率を、処理されていない対照細胞に対する低下として評価した。
【発明を実施するための形態】
【0061】
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野で一般に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を説明するために、以下の定義が適用され、適切な場合に、単数形で使用される用語は複数も含み、その逆も同様である。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、文脈が別途明確に指示しない限り、単数形の「一個／種（ａ／ａｎ）」と「該（ｔｈｅ）」は、複数形も意味し、例えば、「宿主細胞」を言及する場合、複数のこのような宿主細胞を含む。
【0062】
本明細書で使用されるように、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、所定の抗原に結合できる細胞外ドメインと、シグナル伝達ドメイン含有の細胞内ドメインと、膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質を意味する。「所定の抗原に結合する」という語句は、所定の抗原に特異的に結合できる任意のタンパク質分子またはその一部を意味する。「シグナル伝達ドメイン」は、シグナルを伝達することによって、細胞における生物学的プロセスの活性化または阻害、例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の活性化をもたらすように機能することが知られている任意のオリゴペプチド又はポリペプチドドメインを意味する。例は、４－１ＢＢ、ＣＤ２８及び／又はＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【0063】
本明細書で使用されるように、「ＩＬ２Ｒβ」又は「ＩＬ２Ｒｂ」という用語は、ＩＬ２受容体β鎖を意味する。高親和性ＩＬ２受容体は、α、βとγ鎖の三つの異なる、非共有結合的に会合した成分で構成される膜貫通受容体である。αとγサブユニットが存在しない場合、β鎖は、構成的にエンドサイトーシスされ且つ分解されることが示されている。
【0064】
本明細書で使用されるように、「ステルスＣＡＲ」又は「エンドサイトーシスＣＡＲ」という用語は、最も広義的には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を指し、該ＣＡＲは、（１）所定の抗原に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（２）膜貫通（ｔｍ）接続膜近傍（ｊｍ）ドメインであって、ここで、該膜貫通接続膜近傍ドメインは、ＩＬ２受容体β鎖（ＩＬ２Ｒβ）膜貫通ドメインと、ＩＬ２Ｒβ膜近傍ドメインとを含み、且つ該膜貫通接続膜近傍ドメインはＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）に隣接し、ここで、好ましくは、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、該膜貫通接続膜近傍ドメインのＣ－末端にあり、ここで、好ましくは、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該膜貫通接続膜近傍ドメインは、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）膜貫通ドメインと、ＬＤＬＲ膜近傍ドメインとを含み、又はここで、該膜貫通接続膜近傍ドメインは、てんかん発作６様タンパク質２（ＳＥＺ６Ｌ２）膜貫通ドメインと、ＳＥＺ６Ｌ２膜近傍ドメインとを含む膜貫通接続膜近傍ドメインと、（３）細胞内ドメインであって、ここで、好ましくは、該細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含み、さらに好ましくは、該シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインからなる群から選択される一つ又は複数のシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。又は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、（１）所定の抗原に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメインと、（２）膜貫通ドメインと、（３）ＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）と、少なくとも一つのシグナル伝達ドメインとを含む細胞質セグメントとを含む。ここで、好ましくは、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、好ましくは、該ＩＬ２Ｒβ分解配列は、該細胞質セグメントのＣ－末端にある。又は、二重ＣＡＲであって、該二重ＣＡＲは、上記実施例のいずれか一つに記載の第１のＣＡＲと、第２のＣＡＲとを含む。
【0065】
本明細書で使用されるように、「抗原結合断片」又は「抗原結合分子」という用語は、最も広義的には、抗原決定クラスターに特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片と足場抗原結合タンパク質である。本明細書において、「抗体」という用語は、最も広義的に使用され、複数種の抗体構造を含み、これらの抗体構造は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性と多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むが、これらに限定されず、それらが必要な抗原結合活性を示せばよい。
【0066】
本明細書で使用されるように、「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」という用語は、十から約２５個のアミノ酸の短鎖リンカーペプチドで接続された抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）との融合タンパク質である。該リンカーは、通常、グリシン（柔軟性に対する）、及びセリン又はトレオニン（溶解性に対する）に富むものであるとともに、ＶＨのＮ－末端とＶＬのＣ－末端を接続することができ、又はその逆も可能である。定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、このようなタンパク質は、元の抗体の特異性を保持する。また、単鎖ポリペプチドを含む抗体断片は、ＶＨドメインの特徴を有し、即ちＶＬドメインと共に機能性抗原結合部位にアセンブルすることができ、又は、単鎖ポリペプチドを含むこれらの抗体断片は、ＶＬドメインの特徴を有し、即ちＶＨドメインと共に機能性抗原結合部位にアセンブルすることによって、全長抗体の抗原結合特性を提供することができる。
【0067】
本明細書で使用されるように、薬剤、例えば、薬物組成物の「治療有効量」という用語は、必要な投与量と期間内に、所望の治療結果又は予防結果を効果的に達する量を指す。治療有効量の薬剤は、例えば、疾患の悪い影響を除去、低減、遅延、最小化又は予防する。
【0068】
本明細書で使用されるように、「個体」又は「被験体」という用語は、哺乳動物である。哺乳動物は、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類動物（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類動物）、ウサギ及び齧歯類動物（例えば、マウスとラット）を含むが、これらに限定されない。特に、個体又は被験者は、ヒトである。「薬物組成物」という用語は、それに含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを許容する形式を呈し、且つ製剤が投与される被験体に対して許容されない毒性を有する別の成分を含有しない製剤である。「薬学的に許容される賦形剤」は、薬物組成物における活性成分以外の被験体に対して無毒である成分を指す。薬学的に許容される賦形剤は、緩衝剤、安定剤又は防腐剤を含むが、それらに限らない。
【0069】
本明細書で使用されるように、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（「治療すること（ｔｒｅａｔ又はｔｒｅａｔｉｎｇ）」などのその文法的バリエーション）は、治療される個体の自然経過を変更しようとする試みにおける臨床介入を指し、予防のために実施することもでき、臨床病態の経過において実施することもできる。治療の所望の効果は、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮減、転移の予防、疾患進行の速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解または予後の改善を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施例では、本出願の分子は、疾患の発展を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせることに用いられる。
【0070】
本明細書で使用されるように、「腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）」又は「腫瘍抗原」という用語は、その発現が細胞の悪性変化と関連すると考えられる、抗原性を有する生体分子を意味する。本開示における腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（腫瘍細胞のみに存在するが、他の正常細胞に発見されていない抗原）と、腫瘍関連抗原（他の器官と組織にも存在し、又はヘテロと同種異系の正常細胞における抗原、又は発生及び／又は分化の間に発現する抗原）とを含む。
【0071】
本出願に使用されるように、「アミノ酸」という用語は、天然に存在するカルボキシルα－アミノ酸の群を示し、これらのカルボキシルα－アミノ酸は、アラニン（三文字コード：Ａｌａ、一文字コード：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）を含む。基準ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るために、配列をアライメントし、（必要であれば）ギャップを導入し、どのような保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない場合、基準ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するという目的のために、当分野の技術における種々の方法でアライメントを実現することができ、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いてもよい。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら本明細書における目的のため、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用してアミノ酸配列同一性％の値を生成する。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）によって作成され、そのソースコードは、米国著作権局（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ）（ワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．），２０５５９）において、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されたユーザ文書と共に提出されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、ジェネンテック社（カリフォルニア州サウス、サンフランシスコ）から公開されており、又はソースコードからコンパイルすることができる。ＵＮＩＸオペレーティングシステム（デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含む）上で使用するために、ＡＬＩＧＮ－２プログラムをコンパイルする必要がある。全ての配列比較パラメーターはＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変化しない。
【0072】
「宿主細胞」、「宿主細胞系」及び「宿主細胞培養物」という用語は、交換使用可能であるとともに、外因性核酸が導入された細胞、及びこのような細胞の子孫を指す。宿主細胞は、「形質転換体」と、「形質転換細胞」とを含み、それは、初代形質転換細胞及びそれから派生する子孫を含むが、継代回数とは無関係である。
【0073】
本明細書で使用されるように、「癌」又は「腫瘍」という用語は、増殖性疾患を指し、例えば、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、リンパ腫、リンパ球性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、細気管支肺細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚又は眼内黒色腫、子宮癌、直腸癌、肛門領域癌、胃部癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外膣癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌又は尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆管癌、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽細胞腫、星型細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髓芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫とユーイング肉腫、上記癌のうちのいずれか一つを含む難治性型、又は上記癌のうちの一つ又は複数の組み合わせである。
【0074】
例
例１．エンドサイトーシスＣＡＲ構築体（ＭＬＢ００３とＭＬＢ００２）の設計と産生
ＣＡＲ構築体の製造は、当分野でよく使われる技術方法である。例えば、まず、遺伝子合成技術によってＣＡＲ遺伝子断片を製造し、そしてＣＡＲ ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン発現ベクターを構築し、ＣＡＲ構築体を標的細胞にエレクトロポレーションし、フローサイトメトリー又は総蛋白分析によって構築体発現を評価する。
例１．エンドサイトーシスＣＡＲ構築体（ＭＬＢ００３とＭＬＢ００２）の設計と産生
ＣＡＲ構築体の製造は、当分野でよく使われる技術方法である。例えば、まず、遺伝子合成技術によってＣＡＲ遺伝子断片を製造し、そしてＣＡＲ ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン発現ベクターを構築し、ＣＡＲ構築体を標的細胞にエレクトロポレーションし、フローサイトメトリー又は総蛋白分析によって構築体発現を評価する。
【0075】
本例１において、ＩＬ２Ｒβ鎖膜貫通と膜近傍モチーフに基づく二種類の斬新なＣＡＲ構築体（図３）を設計した。
【0076】
（１）ＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）を含む細胞質セグメントを含むＣＡＲ構築体：
ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ－ＣＡＲ－ＤＴ（ＭＬＢ００２：ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐｓ ｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ＤＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、
（２）ＩＬ２Ｒβ膜貫通ドメイン、ＩＬ２Ｒβ膜近傍ドメインを含み、ＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）をさらに含むＣＡＲ構築体：
ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ－ＣＡＲ－ＩＬ２Ｒｂ－ｔｍ（ＭＬＢ００３：ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
（３）ＣＤ８膜貫通ドメインを使用する元のＣＡＲ構築体：
ＭＮ１４ｏｐ－ＣＡＲ（ＬＢＣ００１：ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ）。
ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ－ＣＡＲ－ＤＴ（ＭＬＢ００２：ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐｓ ｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ＤＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、
（２）ＩＬ２Ｒβ膜貫通ドメイン、ＩＬ２Ｒβ膜近傍ドメインを含み、ＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）をさらに含むＣＡＲ構築体：
ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ－ＣＡＲ－ＩＬ２Ｒｂ－ｔｍ（ＭＬＢ００３：ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
（３）ＣＤ８膜貫通ドメインを使用する元のＣＡＲ構築体：
ＭＮ１４ｏｐ－ＣＡＲ（ＬＢＣ００１：ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ）。
【0077】
（４）ＣＤ８膜貫通ドメインとＨＡ配列を使用する対照ＣＡＲ構築体：
ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＡＲ（ＭＬＢ００１：ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ）。
ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＡＲ（ＭＬＢ００１：ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ）。
【0078】
ｐＭＡＸ－ＧＦＰは、特に蛍光マーカーが試験構築体で利用不可能である場合、エレクトロポレーション効率を確定するための対照プラスミドである。
【0079】
Ｔ細胞活性化アッセイ（ＮＦＡＴレポーターアッセイと細胞毒性アッセイとを含むが、これらに限定されない）によって、機能性効果を評価した。
【0080】
【0081】
例２．トランスポゾン送達ＣＡＲ構築体を使用して初代人Ｔ細胞とＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞を改変する
例１におけるエンドサイトーシスＣＡＲ構築体のトランスポゾン媒介送達：トランスポゾンベクターにおける発明者らのＣＡＲ構築体の発現をＥＦ１αプロモーターで駆動した。
例１におけるエンドサイトーシスＣＡＲ構築体のトランスポゾン媒介送達：トランスポゾンベクターにおける発明者らのＣＡＲ構築体の発現をＥＦ１αプロモーターで駆動した。
【0082】
ＣＡＲ構築体で初代Ｔ細胞とＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞）を形質導入した：ＰＢＭＣから派生したＣＤ３＋精製されたＴ細胞（初代Ｔ細胞）又はＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞を、エレクトロポレーションを使用して発明者らの例１の構築体におけるＣＡＲを運ぶトランスポゾンベクターで形質導入した。
【0083】
例３．エンドサイトーシスＣＡＲ（ＭＬＢ００２とＭＬＢ００３）を発現するＣＡＲ Ｔ細胞の特徴づけ
フローサイトメトリーによって形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞を分析して、構築体と宿主細胞との組み込みを測定した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８（ＡＦ４８８）にコンジュゲートした抗ヒトＦａｂ’を用いて細胞を染色した。また、受容体の検出とパルス追跡実験に役立つために、細胞外Ｎ－末端ＨＡタグでエンドサイトーシスＣＡＲをエンジニアリングした。構築体をＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞にエレクトロポレーションした後、ＣＡＲの表面発現（図４）を検出することができる。図４において、縦座標のＳＳＣは細胞複雑性の相対的測定であるとともに、ｐＭＡＸ－ＧＦＰは、特に蛍光マーカーが試験構築体で利用不可能である場合、エレクトロポレーション効率を確定するための対照プラスミドである。抗ヒトＦａｂ’ ＡＦ４８８とＨＡ染色との間の直線的な相関性（図５）を検出した。抗ヒトＦａｂ’ ＡＦ４８８染色の使用は、発明者らのエンドサイトーシスＣＡＲ構築体の、ドナーＰＢＭＣから派生したＴ細胞における発現も証明した。初代Ｔ細胞とＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞との間の受容体発現の傾向は同等である（図６）。図４－６に示される結論として、ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ－ＣＡＲ－ＩＬ２Ｒｂ－ｔｍ（ＭＬＢ００３）は形質導入されていない（ＵＴＤ）と類似しており、ここで、抗ヒトＦａｂ’ ＡＦ４８８の染色値は対照ＣＡＲ（ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ－ＣＡＲ、ＭＬＢ００１）より低く、これは細胞表面での発現が最も少ないことを示し、それによってＩＬ２Ｒβ鎖膜貫通、膜近傍モチーフとＤＴ配列（ＰＳＫＦＦＳＱＬ）の使用によって良好なエンドサイトーシス作用を取得したことを示した。ＤＴ配列のない構築体（ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ－ＣＡＲ、ＭＬＢ００１）に比べて、ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ－ＣＡＲ－ＤＴ（ＭＬＢ００２）は、発現が低いとともに、ＤＴ配列のない構築体において観察されていないエンドサイトーシスを示した。
フローサイトメトリーによって形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞を分析して、構築体と宿主細胞との組み込みを測定した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８（ＡＦ４８８）にコンジュゲートした抗ヒトＦａｂ’を用いて細胞を染色した。また、受容体の検出とパルス追跡実験に役立つために、細胞外Ｎ－末端ＨＡタグでエンドサイトーシスＣＡＲをエンジニアリングした。構築体をＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞にエレクトロポレーションした後、ＣＡＲの表面発現（図４）を検出することができる。図４において、縦座標のＳＳＣは細胞複雑性の相対的測定であるとともに、ｐＭＡＸ－ＧＦＰは、特に蛍光マーカーが試験構築体で利用不可能である場合、エレクトロポレーション効率を確定するための対照プラスミドである。抗ヒトＦａｂ’ ＡＦ４８８とＨＡ染色との間の直線的な相関性（図５）を検出した。抗ヒトＦａｂ’ ＡＦ４８８染色の使用は、発明者らのエンドサイトーシスＣＡＲ構築体の、ドナーＰＢＭＣから派生したＴ細胞における発現も証明した。初代Ｔ細胞とＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞との間の受容体発現の傾向は同等である（図６）。図４－６に示される結論として、ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ－ＣＡＲ－ＩＬ２Ｒｂ－ｔｍ（ＭＬＢ００３）は形質導入されていない（ＵＴＤ）と類似しており、ここで、抗ヒトＦａｂ’ ＡＦ４８８の染色値は対照ＣＡＲ（ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ－ＣＡＲ、ＭＬＢ００１）より低く、これは細胞表面での発現が最も少ないことを示し、それによってＩＬ２Ｒβ鎖膜貫通、膜近傍モチーフとＤＴ配列（ＰＳＫＦＦＳＱＬ）の使用によって良好なエンドサイトーシス作用を取得したことを示した。ＤＴ配列のない構築体（ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ－ＣＡＲ、ＭＬＢ００１）に比べて、ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ－ＣＡＲ－ＤＴ（ＭＬＢ００２）は、発現が低いとともに、ＤＴ配列のない構築体において観察されていないエンドサイトーシスを示した。
【0084】
例４．エンドサイトーシスＣＡＲ（ＭＬＢ００２とＭＬＢ００３）に対するＮＦＡＴルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＣＡＲ構築体を発現するＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１ ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター細胞と、抗原を発現する標的細胞（ＬｏＶｏ）と１：１で混合し、６時間（図７）又は２４時間（図８）共培養した後にルシフェラーゼ活性を測定した。ＬｏＶｏ陰性は、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞と混合するＬｏＶｏ細胞がないことを指す。ＮＦＡＴは、Ｔ細胞活性化に関連するＴ細胞転写因子である。ＮＦＡＴ活性の増加は、シグナル強度の増加に関連する。そのため、ルシフェラーゼシグナルの増加が見られれば、ＮＦＡＴ活性が増加したとともに、ＣＡＲシグナル強度が増加したことが分かる。図７と８に示すように、標的抗原を発現する細胞において、ＬｏＶｏ標的抗原はＣＥＡであるとともに、ＮＦＡＴにより駆動されるルシフェラーゼ活性を有するエンドサイトーシスＣＡＲ（ＭＬＢ００２又はＭＬＢ００３）は活性化された。エンドサイトーシスＣＡＲの発光値は、形質導入されていない（ＵＴＤ）より高かった。６時間共培養した後にＭＬＢ００２とＭＬＢ００３の発光値が対照群より低いが、２４時間共培養した後に、ＭＬＢ００２とＭＬＢ００３後は対照群より高かった。フローサイトメトリーがエンドサイトーシスＣＡＲ構築体の表面発現（図４と５）を検出できなかったが、エンドサイトーシスＣＡＲ構築体により形質導入された細胞は、ＮＦＡＴにより駆動される遺伝子発現とルシフェラーゼ活性の変化を示し、ＣＡＲの機能性を証明した。
ＣＡＲ構築体を発現するＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１ ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター細胞と、抗原を発現する標的細胞（ＬｏＶｏ）と１：１で混合し、６時間（図７）又は２４時間（図８）共培養した後にルシフェラーゼ活性を測定した。ＬｏＶｏ陰性は、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞と混合するＬｏＶｏ細胞がないことを指す。ＮＦＡＴは、Ｔ細胞活性化に関連するＴ細胞転写因子である。ＮＦＡＴ活性の増加は、シグナル強度の増加に関連する。そのため、ルシフェラーゼシグナルの増加が見られれば、ＮＦＡＴ活性が増加したとともに、ＣＡＲシグナル強度が増加したことが分かる。図７と８に示すように、標的抗原を発現する細胞において、ＬｏＶｏ標的抗原はＣＥＡであるとともに、ＮＦＡＴにより駆動されるルシフェラーゼ活性を有するエンドサイトーシスＣＡＲ（ＭＬＢ００２又はＭＬＢ００３）は活性化された。エンドサイトーシスＣＡＲの発光値は、形質導入されていない（ＵＴＤ）より高かった。６時間共培養した後にＭＬＢ００２とＭＬＢ００３の発光値が対照群より低いが、２４時間共培養した後に、ＭＬＢ００２とＭＬＢ００３後は対照群より高かった。フローサイトメトリーがエンドサイトーシスＣＡＲ構築体の表面発現（図４と５）を検出できなかったが、エンドサイトーシスＣＡＲ構築体により形質導入された細胞は、ＮＦＡＴにより駆動される遺伝子発現とルシフェラーゼ活性の変化を示し、ＣＡＲの機能性を証明した。
【0085】
例５．エンドサイトーシスＣＡＲ（ＭＬＢ００２とＭＬＢ００３）に対する細胞毒性アッセイ
形質導入されて発明者らのＣＡＲ構築体を発現するドナーから派生した初代ＣＤ３＋細胞（初代細胞）を、抗原を発現するルシフェラーゼ＋標的細胞（Ｋａｔｏ－ＩＩＩ、それは標的抗原ＣＥＡを発現する）と１：１で混合し、２４時間共培養した。ルシフェラーゼ活性の増加によって細胞毒性（図９）を測定した。フローサイトメトリーによって初代細胞におけるエンドサイトーシスＣＡＲ（ＭＬＢ００２とＭＬＢ００３）発現（図６）を検出できなかったが、形質導入されていない対照細胞（ＵＴＤ）に比べて、エンドサイトーシスＣＡＲで形質導入された細胞は、増強された細胞媒介殺傷を示した。
形質導入されて発明者らのＣＡＲ構築体を発現するドナーから派生した初代ＣＤ３＋細胞（初代細胞）を、抗原を発現するルシフェラーゼ＋標的細胞（Ｋａｔｏ－ＩＩＩ、それは標的抗原ＣＥＡを発現する）と１：１で混合し、２４時間共培養した。ルシフェラーゼ活性の増加によって細胞毒性（図９）を測定した。フローサイトメトリーによって初代細胞におけるエンドサイトーシスＣＡＲ（ＭＬＢ００２とＭＬＢ００３）発現（図６）を検出できなかったが、形質導入されていない対照細胞（ＵＴＤ）に比べて、エンドサイトーシスＣＡＲで形質導入された細胞は、増強された細胞媒介殺傷を示した。
【0086】
例６．エンドサイトーシスＣＡＲ構築体（ＭＬＢ０２０、ＭＬＢ０１３、ＭＬＢ０２５、ＭＬＢ０４８、ＭＬＢ０４７、ＭＬＢ０５４及びＭＬＢ０５５）を用いて、Ｊｕｒｋａｔと初代ＣＤ３＋ ＰＢＭＣに対して非レンチウィルストランスフェクトを行う
本例６において、ＣＡＲ構築体は以下のように設計された。
本例６において、ＣＡＲ構築体は以下のように設計された。
【0087】
（１）ＩＬ２Ｒβ膜貫通ドメイン、ＩＬ２Ｒβ膜近傍ドメインを含み、ＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）をさらに含むＣＡＲ構築体：
（ａ）ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０２０）、
（ｂ）ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０１３）。
（ａ）ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０２０）、
（ｂ）ＨＡ－ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０１３）。
【0088】
（２）ＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）を含む細胞質セグメントを含むＣＡＲ構築体：
（ａ）ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ＩＬ２Ｒβ ＤＴ －Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０２５）。
（ａ）ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ＩＬ２Ｒβ ＤＴ －Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０２５）。
【0089】
（３）ＬＤＬＲ膜貫通ドメインと、ＬＤＬＲ膜近傍ドメインとを含むＣＡＲ構築体：
（ａ）ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＬＤＬＲ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０４８）。
（ａ）ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＬＤＬＲ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０４８）。
【0090】
（４）ＳＥＺ６Ｌ２膜貫通ドメインと、ＳＥＺ６Ｌ２膜近傍ドメインとを含むＣＡＲ構築体：
（ａ）ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０４７）、
（ｂ）８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０５４）。
（ａ）ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０４７）、
（ｂ）８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０５４）。
【0091】
（５）二重ＣＡＲ構築体：
（ａ）８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－ＣＤ２８－（Ｇ４Ｓ）２－ＧＦＰ（ＭＬＢ０５５）。
（ａ）８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－ＣＤ２８－（Ｇ４Ｓ）２－ＧＦＰ（ＭＬＢ０５５）。
【0092】
（６）ＣＤ８膜貫通ドメインを使用する対照ＣＡＲ構築体：
（ａ）ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ －ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０１０）、
（ｂ）８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０２６）。
（ａ）ＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ －ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０１０）、
（ｂ）８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０２６）。
【0093】
ｐＭＡＸ－ＧＦＰは、特に蛍光マーカーが試験構築体で利用不可能である場合、エレクトロポレーション効率を確定するための対照プラスミドである。
【0094】
【0095】
内在化モチーフは、ボールド体であり、下線が付けられた。
【0096】
ＣＡＲ構築体を発現するために、Ｐｉｇｇｙ Ｂａｃトランスポゾンプラスミド（ＥＦ１αプロモーターにより制御されるＣＡＲ構築体を有し、トランスポザーゼｍＲＮＡを有する）をエレクトロポレーションすることによって、ＮＦＡＴにより駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するＴ細胞系Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１と、ドナーから派生したＴ細胞を誘導した。図１０と１１は、膜貫通と膜近傍配列に対する改変を示すＣＡＲ構築体の二つの概略図を示している。ＣＡＲ ＭＬＢ０４７とＭＬＢ０５４は、それぞれＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ＳｃＦｖと８４１クローディン１８．２ ＳｃＦｖ（ＣＮ０２）抗原を利用してドメインを認識した。これらのＣＡＲには、てんかん発作６様タンパク質２（ＳＥＺ６Ｌ２）膜貫通と、膜近傍配列に由来する３３個のアミノ酸が設計された。ＭＬＢ０４８は、ＬＤＬＲ膜貫通と膜近傍配列を利用した。ＭＬＢ０５５は、二成分ＣＡＲ（二重ＣＡＲ）であり、ＭＬＢ０５４クローディン１８．２ ＣＡＲ配列、及び元のＣＡＲと同じであるＣＤ８ヒンジと膜貫通ドメインでＣＤ２８シグナル伝達ドメインにカップリングされる抗ＰＤＬ１に基づく。
【0097】
ＡＦ６４７にコンジュゲートしたαヒトＦａｂ’抗体染色を用い、フローサイトメトリーによってＣＡＲの表面発現を評価し、Ｐ２Ａ配列でのＧＦＰの共発現によってＣＡＲ構築体の全体的発現を確定した（図１２）。ＩＬ２Ｒβ、ＬＤＬＲとてんかん発作６様タンパク質２膜貫通及び膜近傍ドメインを用いて設計されたＣＡＲ構築体の表面発現を検出できないことに鑑みて、ＧＦＰ発現を用いて、全ての後続のアッセイのＣＡＲ陽性細胞スコアを正規化した。図１２に示すように、ＡＦ６７４染色を使用する時、ＩＬ２Ｒβ、ＬＤＬＲとＳＥＺ６Ｌ２膜貫通及び膜近傍ドメインを使用するＣＡＲ構築体（ＭＬＢ０２５、ＭＬＢ０２０、ＭＬＢ０４８及びＭＬＢ０４７）は、対照ＣＡＲ構築体ＭＬＢ０１０により低い染色値を示し、抗原標的がない時に、エンドサイトーシスＣＡＲが細胞表面で発現しないことを証明した。対照ＣＡＲ構築体ＭＬＢ０１０は、ＡＦ６７４とＧＦＰ染色値が高かった。
【0098】
例７．ルシフェラーゼレポーター活性とＣＤ６９上方制御によってＣＡＲ構築体の活性を評価する
１μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣが存在する場合に、ＣＥＡＣＡＭ－５標的抗原を発現するＬｏＶｏ細胞を、白色で、不透明な平底９６ウェルプレートで培養して、細胞増殖を抑制した。スケジュールアッセイ開始の６－８時間前に、各ウェルに２５，０００個のＬｏＶｏ標的細胞を接種して接着を可能にした。ＣＡＲ＋ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を用いて、１：１のＥ：Ｔ割合でアッセイを行った。８時間インキュベートした後に、ウェルを洗浄し、培地を補充した。発光読み出しの２４、６、３と１時間前に、ウェルを洗浄し、ＣＡＲ構築体を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を各ウェルに添加した。Ｊｕｒｋａｔ細胞の全体的活性化を評価するために、２４時間の期間が終了した時、Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭ試薬（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を各ウェルに添加した（図１３）。
１μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣが存在する場合に、ＣＥＡＣＡＭ－５標的抗原を発現するＬｏＶｏ細胞を、白色で、不透明な平底９６ウェルプレートで培養して、細胞増殖を抑制した。スケジュールアッセイ開始の６－８時間前に、各ウェルに２５，０００個のＬｏＶｏ標的細胞を接種して接着を可能にした。ＣＡＲ＋ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を用いて、１：１のＥ：Ｔ割合でアッセイを行った。８時間インキュベートした後に、ウェルを洗浄し、培地を補充した。発光読み出しの２４、６、３と１時間前に、ウェルを洗浄し、ＣＡＲ構築体を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を各ウェルに添加した。Ｊｕｒｋａｔ細胞の全体的活性化を評価するために、２４時間の期間が終了した時、Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭ試薬（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を各ウェルに添加した（図１３）。
【0099】
発光シグナルに対する観察により、全てのＣＡＲ変異体の活性化動態が、元のＣＡＲ構築体と類似し且つ同等であり、ＮＦＡＴにより駆動される遺伝子発現が活性化の６時間前後で強く発生したことが明らかになった。活性化動態が同等であるが、ＣＡＲの元の（ＭＬＢ０１０）とｃ－末端（ＭＬＢ０２５）のタグ付けバージョンの細胞活性化程度は最も高かった。ＬＤＬＲとＳＥＺ６Ｌ２に基づく変異体（ＭＬＢ０４７とＭＬＢ０４８）の両者は、いずれもはるかに低い全体的活性化レベルを示すとともに、ＩＬ２Ｒβに基づく構築体（ＭＬＢ０２０）は、最も低い発現レベルを示した（図１３）。
【0100】
様々な膜貫通ドメインによるＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の全体的活性化状態への影響をさらに確定するために、発明者らは、第２の共培養アッセイを行って刺激後のＣＤ６９上方制御の程度を確定した。５０，０００個のＬｏＶｏ標的細胞をＪｕｒｋａｔ ＣＡＲ陽性Ｔ細胞と１：１の割合で３、６又は２４時間共培養し、フローサイトメトリーによってＣＤ６９の発現を評価した。ＧＦＰ発現の細胞にゲートすることによって、発明者らは、蛍光強度の評価により、ＣＡＲ陽性群における，ＣＤ６９を発現する細胞のスコアと全体的ＣＤ６９上方制御の程度を確定することができる（図１４Ａ－１４Ｆ）。図１４Ａ－１４Ｆは、エンドサイトーシス（ＭＬＢ０２０、ＭＬＢ０２５、ＭＬＢ０４８及びＭＬＢ０４７）と非エンドサイトーシスＣＡＲ（ＭＬＢ０１０）の両者がいずれもＣＤ６９上方制御を有することを示した。図１４Ａ－１４ＣはＣＡＲ陽性群を示すとともに、図１４Ｄ－１４Ｆは全体的なＣＤ６９上方制御の程度を示す。該情報を用いて、発明者らは、ＣＡＲ陽性細胞の活性化状態を示すグラフを作成して、構築体の間でより良く比較することができる（図１５）。図１４Ａ－１４Ｆと図１５において、Ｍ１０はＭＬＢ０１０を代表し、Ｍ２０はＭＬＢ０２０を代表し、Ｍ２５はＭＬＢ０２５を代表し、Ｍ４８はＭＬＢ０４８を代表するとともに、Ｍ４７はＭＬＢ０４７を代表する。発明者らのデータにより、全てのＣＡＲ構築体の間のＣＤ６９活性化動態が似ているが、ＩＬ２Ｒβ、ＬＤＬＲ又はＳＥＺ６Ｌ２ドメインを発現するそれらの（ＭＬＢ０２０、ＭＬＢ０２５、ＭＬＢ０４８及びＭＬＢ０４７）は、任意の所定の時点にも、応答細胞の数が少なく、全体的ＣＤ６９発現が低かったことが示されている（図１５）。これらの結果により、抗原が存在しない場合にＣＡＲの表面発現が検出されなかったが、斬新な受容体変異体はＴ細胞の活性化を駆動できることが示されている。これらの発見は、さらに、細胞内での受容体の独特な分布に起因して、ＭＬＢ０１０、ＭＬＢ０２０、ＭＬＢ０２５、ＭＬＢ０４７及びＭＬＢ０４８に対する活性化応答が弱まっていたことを示している。
【0101】
例８．ＣＡＲ ＭＬＢ０１３、ＭＬＢ０２０、ＭＬＢ０４７及びＭＬＢ０４８に対する細胞毒性アッセイ
ＩＬ２Ｒβ（ＭＬＢ０１３）、ＳＥＺ６Ｌ２（ＭＬＢ０４７）及びＬＤＬＲ（ＭＬＢ０４８）ドメインによる下流Ｔ細胞活性への影響を評価するために、ＣＥＡＣＡＭ－５陽性標的細胞系ＬｏＶｏ、Ａ５４９とＨＴ－２９に対する細胞毒性アッセイを確立した。これらの標的細胞系を選択するのは、それらがそれぞれ高、中と低レベルのＣＥＡ発現を有するためである。腫瘍組織と非癌組織との間で、ＣＡＲ標的抗原が、通常、可変な発現を有するため、該アッセイは、臨床的に重篤な副作用を引き起こし得る、ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ＣＡＲ活性の可能性を、本発明者らが評価することを可能にした。
ＩＬ２Ｒβ（ＭＬＢ０１３）、ＳＥＺ６Ｌ２（ＭＬＢ０４７）及びＬＤＬＲ（ＭＬＢ０４８）ドメインによる下流Ｔ細胞活性への影響を評価するために、ＣＥＡＣＡＭ－５陽性標的細胞系ＬｏＶｏ、Ａ５４９とＨＴ－２９に対する細胞毒性アッセイを確立した。これらの標的細胞系を選択するのは、それらがそれぞれ高、中と低レベルのＣＥＡ発現を有するためである。腫瘍組織と非癌組織との間で、ＣＡＲ標的抗原が、通常、可変な発現を有するため、該アッセイは、臨床的に重篤な副作用を引き起こし得る、ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ＣＡＲ活性の可能性を、本発明者らが評価することを可能にした。
【0102】
ＰｉｇｇｙＢａｃ発現システムを用いて、ドナーから派生したＣＤ３＋ ＰＢＭＣを形質導入して、ＣＡＲ構築体を発現した。エレクトロポレーション後に、ＣＡＲ発現ベクター上でＧＦＰを共発現することによって、フローサイトメトリーを介してＣＡＲの発現を評価し、該ＣＡＲの発現を用いて、細胞の数を正規化して、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を直接比較した（図１６）。図１６は、ＩＬ２Ｒβ、ＬＤＬＲ及びＳＥＺ６Ｌ２膜貫通と膜近傍ドメインを用いたＭＬＢ０２０、ＭＬＢ０４７、及びＭＬＢ０４８ ＣＡＲ構築体をＡＦ６７４で染色した結果を示し、対照ＣＡＲ構築体ＭＬＢ０１０より低い染色値を示し、抗原標的がない時、エンドサイトーシスＣＡＲが細胞表面上で発現しないことを証明した。対照ＣＡＲ構築体ＭＬＢ０１０は、ＡＦ６７４染色値が高かった。抗原を発現するルシフェラーゼ陽性標的細胞を、１０，０００個の細胞／ウェルの密度で接種し、三種類のＥ：Ｔ割合（３：１、１：１、０．３：１、ＣＡＲ陽性細胞と標的細胞）でアッセイを行った。エフェクター細胞と標的細胞を２４時間共培養し、ルシフェラーゼ活性が低減するとともに、標的細胞が死亡することを細胞毒性として確定した。
【0103】
予想されるように、細胞毒性活性は標的細胞系における抗原発現量と直接関連しており、ＬｏＶｏ細胞に対して検出した細胞毒性の量が最も高いとともに、ＨＴ－２９細胞に対して検出した細胞毒性の量が最も低かった（図１７Ａ－１７Ｃ）。予想されるように、細胞毒性は、エフェクター細胞の数／ウェルに応じて強さが変化し、Ｅ：Ｔ割合が高いと、細胞毒性が強くなった。興味深いこととして、３：１のＥ：Ｔ割合において、標的抗原を高発現する細胞に対するＭＬＢ０１３、ＭＬＢ０４７及びＭＬＢ０４８の表現が親ＣＡＲ（ＭＬＢ０１０とＭＬＢ０１１、ＭＬＢ０１１は、ＭＬＢ０１０のＭＮ１４ｏｐ ＣＥＡ ｓｃＦｖ Ｎ－末端においてＨＡ配列が追加されている）と類似していたが、Ｅ：Ｔ割合の低下につれて、ＭＬＢ０１３、ＭＬＢ０４７及びＭＬＢ０４８変異体の細胞毒性ポテンシャルはより速く低下した。注意すべきこととして、ＳＥＺ６Ｌ２を有するＭＬＢ０４８のみは、低抗原ＨＴ－２９細胞に対する細胞毒性活性を保持した。これらの結果により、ＣＡＲ構築体へのエンドサイトーシス標的モチーフの追加は、ＣＡＲ構築体の治療域を拡大できることが確信されていた。
【0104】
例９．ＣＡＲ ＭＬＢ０１３、ＭＬＢ０４７及びＭＬＢ０４８のサイトカイン発現分析
斬新な膜貫通ＣＡＲ構築体は、抗原を発現する標的細胞に対する細胞毒性活性を保持できることが証明されており、発明者らは、別のＣＡＲ Ｔ細胞の活性読み出しの測定が望まれている。二種類の一般的な活性化マーカーはＩＬ－２とＩＦＮ－γである。サイトカイン分泌をアッセイするために、一晩中の細胞毒性アッセイの後に培地を収集し、ＥＬＩＳＡを介して可溶性サイトカインの発現を確定した。
斬新な膜貫通ＣＡＲ構築体は、抗原を発現する標的細胞に対する細胞毒性活性を保持できることが証明されており、発明者らは、別のＣＡＲ Ｔ細胞の活性読み出しの測定が望まれている。二種類の一般的な活性化マーカーはＩＬ－２とＩＦＮ－γである。サイトカイン分泌をアッセイするために、一晩中の細胞毒性アッセイの後に培地を収集し、ＥＬＩＳＡを介して可溶性サイトカインの発現を確定した。
【0105】
サイトカイン分泌から観察した傾向は、発明者らにより細胞毒性から観察された、高ＣＥＡ標的細胞に対して検出したサイトカイン分泌レベルが最も高いとともに、ＨＴ－２９細胞に対して検出したサイトカイン発現が大幅に低減することを反映した（図１８Ａ－１８Ｃ及び図１９）。興味深いこととして、ＭＬＢ０１３、ＭＬＢ０４７及びＭＬＢ０４８からサイトカイン分泌がほとんど検出できず、ここで、ＭＬＢ０４７は、ＭＬＢ０１３とＭＬＢ０４８に対してやや高いサイトカイン発現を示した。
【0106】
ＣＡＲ Ｔ細胞療法が潜在的な致死性サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を促進することが知られているため、これらの発見は重要である。そのため、これらの結果は、臨床的に重要であるとともに、代替可能な膜貫通と膜近傍ドメインを使用してＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン特性を調節できることを示した。エンドソーム経路を標的化する受容体の膜貫通ドメイン及び関連する輸送モチーフを使用し、その結果に示すように、ＣＡＲ Ｔ細胞の活性を調節することによって、治療域を拡大することができる。
【0107】
例１０．Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞におけるクローディン１８．２の特異的かつ増強されたＣＡＲ Ｔ細胞活性化
ＮＦＡＴにより駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞を、クローディン１８．２特異的ＣＡＲ構築体（ＭＬＢ０２６、ＭＬＢ０５４、ＭＬＢ０５５）を発現するＰｉｇｇｙ ＢａｃベクターとＰｉｇｇｙ ＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡでエレクトロポレーションする。これまでと同様に、ＡＦ６４７にコンジュゲートしたαヒトＦａｂ’抗体で表面染色を行い、Ｐ２Ａ配列を介してＣＡＲベクター上でＧＦＰを共発現することによって、ＣＡＲの発現を評価した（図２０）。これまでと同様に、ＣＡＲ配列にＳＥＺ６Ｌ２膜貫通ドメイン（ＭＬＢ０５４）が含まれることにより、ＣＡＲの表面発現が低減するが、ＧＦＰにより確定された全体的ＣＡＲ発現は依然として高かった。構築体にｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ２８－ＧＦＰ共受容体が存在するため、ＭＬＢ０５５におけるＧＦＰ発現とαヒトＦａｂ’染色との間の強い相関性が観察された。
ＮＦＡＴにより駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞を、クローディン１８．２特異的ＣＡＲ構築体（ＭＬＢ０２６、ＭＬＢ０５４、ＭＬＢ０５５）を発現するＰｉｇｇｙ ＢａｃベクターとＰｉｇｇｙ ＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡでエレクトロポレーションする。これまでと同様に、ＡＦ６４７にコンジュゲートしたαヒトＦａｂ’抗体で表面染色を行い、Ｐ２Ａ配列を介してＣＡＲベクター上でＧＦＰを共発現することによって、ＣＡＲの発現を評価した（図２０）。これまでと同様に、ＣＡＲ配列にＳＥＺ６Ｌ２膜貫通ドメイン（ＭＬＢ０５４）が含まれることにより、ＣＡＲの表面発現が低減するが、ＧＦＰにより確定された全体的ＣＡＲ発現は依然として高かった。構築体にｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ２８－ＧＦＰ共受容体が存在するため、ＭＬＢ０５５におけるＧＦＰ発現とαヒトＦａｂ’染色との間の強い相関性が観察された。
【0108】
ＣＡＲ Ｔ細胞活性をスクリーニングするために、ＣＬＤＮ１８．２（クローディン１８．２）特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を、抗原陰性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又は形質導入されてＣＬＤＮ１８．２（クローディン１８．２）を発現するＨＥＫ２９３Ｔ及びＮＵＧＣ４細胞と共培養した。これまでと同様に、ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔを用いて、１：１の割合で５０，０００個の標的細胞を培養した。αＣＥＡ ＣＡＲ変異体のように（図２１Ａ－２１Ｄ）、ＣＡＲ変異体を発現するＪｕｒｋａｔの抗原特異的活性化が観察され、ここで、ＳＥＺ６Ｌ２膜貫通ドメインを発現する変異体から、低下した活性化が検出された（図２２）。図２１Ａ－２１Ｄは、エンドサイトーシス（ＭＬＢ０５４、ＭＬＢ０５５）と非エンドサイトーシスＣＡＲ（ＭＬＢ０２６）の両者がいずれもＣＤ６９上方制御を有することを示す。図２１Ａ－２１ＢはＣＡＲ陽性群を示すとともに、図２１Ｃ－２１Ｄは全体的なＣＤ６９上方制御の程度を示す。
【0109】
例１１．ＳＥＺ６Ｌ２改変ＣＡＲはクローディン１８．２を標的化するＴ細胞におけるサイトカイン特性を弱めるためのものである
密度勾配遠心（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ）分離によってＰＢＭＣを単離させ、ＣＤ３陰性選択によって精製してＴ細胞群を富化した。ＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５が存在する場合、単離したＴ細胞をＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔ細胞活性化剤（ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８）で三日間刺激し、そして、過剰に活性化されたＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡとＰｉｇｇｙＢａｃベクターＭＬＢ０２６及びＭＬＢ０５４でエレクトロポレーションして、ＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＳＥＺ６Ｌ２膜貫通と膜近傍ドメインに基づくＣＡＲ発現をそれぞれ誘導した。これらのＣＡＲ構築体は、クローディン１８．２に特異的な８４１ ｓｃＦｖを利用した。
密度勾配遠心（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ）分離によってＰＢＭＣを単離させ、ＣＤ３陰性選択によって精製してＴ細胞群を富化した。ＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５が存在する場合、単離したＴ細胞をＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔ細胞活性化剤（ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８）で三日間刺激し、そして、過剰に活性化されたＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡとＰｉｇｇｙＢａｃベクターＭＬＢ０２６及びＭＬＢ０５４でエレクトロポレーションして、ＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＳＥＺ６Ｌ２膜貫通と膜近傍ドメインに基づくＣＡＲ発現をそれぞれ誘導した。これらのＣＡＲ構築体は、クローディン１８．２に特異的な８４１ ｓｃＦｖを利用した。
【0110】
蛍光コンジュゲート抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体で染色することによって、フローサイトメトリーでＣＡＲの表面発現を検証した。ＣＡＲ構築体上で、Ｐ２Ａ配列を介してＧＦＰを組み合わせ発現することによって、形質導入された細胞を同定した。その結果、ＣＤ８α膜貫通配列（ＭＬＢ０２６）を発現するＴ細胞には強い表面染色が存在するが、ＳＥＺ６Ｌ２改変ＣＡＲ（ＭＬＢ０５４）を発現するＴ細胞は無視できる表面染色を有することが分かった（図２３）。
【0111】
抗クローディン１８．２、ＳＥＺ６Ｌ２改変のステルスＣＡＲの機能性能力を試験するために、形質導入されてクローディン１８．２サブタイプ及びルシフェラーゼを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ又はＮＵＧＣ４細胞に対して、ルシフェラーゼに基づく細胞毒性アッセイを行った。フローサイトメトリーによってＣＡＲ陽性細胞の数を評価し、ＣＡＲ陽性細胞の数に対してカウントを正規化した（図２３）。ＨＥＫ－ｃｌｄｎ１８．２ Ｌｕｃ又はＮＵＧＣ４－ｃｌｄｎ１８．２ Ｌｕｃ細胞を、１０，０００個の細胞／ウェルの密度で、不透明な９６ウェル板における１００μＬ ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ培地に接種した。そして、３：１、１：１と０．３：１のエフェクター子：標的（Ｅ：Ｔ）の割合で、ＣＡＲ Ｔ細胞又は形質導入されていない対照細胞を別の１００μＬ培地に添加し、総反応体積を２００μＬにした。そして、３７°Ｃ、５％のＣＯ２で、細胞を２４時間共培養した。該期間が終了した時、サイトカイン分析のために遠心によって１００μＬ培地を収集し、ＮｅｏＬｉｔｅ基質を各ウェルに添加して生細胞率を確定した。特異的細胞開裂率を、治療群の発光シグナル強度の治療されていない対照群に対する低下として確定した。ＭＬＢ０２６又はＭＬＢ０５４で処理された標的細胞は、形質導入されていないＴ細胞で処理された細胞に対して、発光が低下し、細胞毒性の増加を示した。なお、Ｅ：Ｔ割合の低下に伴い、投与量応答は低下した。該傾向は、ＨＥＫ－ｃｌｄｎ１８．２（図２４）とＮＵＧＣ４－ｃｌｄｎ１８．２（図２５）の両者から観察された。該データは、ＳＥＺ６Ｌ２内在化モチーフと膜貫通ドメインを抗クローディン１８．２ ＣＡＲ構築体に添加しても、ＣＡＲの細胞毒性ポテンシャルを弱めないことを示した。
【0112】
共培養上清におけるＣＡＲ Ｔ細胞から産生されるＩＦＮ－γの発現を、サンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。上清を１対３でＥＬＩＳＡ希釈液に希釈するとともに、ＨＲＰ検出基質の比色活性は、ＨＥＫ－ｃｌｄｎ１８．２（図２６）とＮＵＧＣ４－ｃｌｄｎ１８．２（図２７）細胞系に対して、ＳＥＺ６Ｌ２改変ステルスＣＡＲ（ＭＬＢ０５４）がいずれもサイトカイン分泌特性を有することを示した。これらのデータは、これらの細胞の抗原認識と細胞毒性ポテンシャルが保持されるとともに、炎症性応答が低いことを示した。発明者らは、従来のＣＡＲ技術で見られるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の問題を解決する上で、これが望ましいことを予想した。
【0113】
例１２．ＳＥＺ６Ｌ２とＩＬ２Ｒβ改変ＣＡＲ（ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９及びＭＬＢ０８０）はＨＥＲ２を標的化するＴ細胞におけるサイトカイン特性を弱めるためのものである
本例１２では、ＣＡＲ構築体は以下のように設計された。
本例１２では、ＣＡＲ構築体は以下のように設計された。
【0114】
（１）ＩＬ２Ｒβ膜貫通ドメイン、ＩＬ２Ｒβ膜近傍ドメインを含み、ＩＬ２Ｒβ分解配列（ＤＴ）をさらに含むＣＡＲ構築体：
（ａ）ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０３８）、
（ｂ）ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０３９）。
（ａ）ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０３８）、
（ｂ）ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０３９）。
【0115】
（２）ＳＥＺ６Ｌ２膜貫通ドメインと、ＳＥＺ６Ｌ２膜近傍ドメインとを含むＣＡＲ構築体：
（ａ）ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０８０）。
（ａ）ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０８０）。
【0116】
（３）二重ＣＡＲ構築体：
（ａ）８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＭＬＢ０４０）
（ｂ）８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－ＣＤ３ζ（ＭＬＢ１０８）。
（ａ）８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＩＬ２Ｒβ ｔｍ ｊｍ ＤＴ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＭＬＢ０４０）
（ｂ）８４１クローディン１８．２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＳＥＺ６Ｌ２ ｔｍ ｊｍ－ＣＤ３ζ（ＭＬＢ１０８）。
【0117】
（４）ＣＤ８膜貫通ドメインを使用する対照ＣＡＲ構築体：
（ａ）ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０７９）。
（ａ）ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＭＬＢ０７９）。
【0118】
【0119】
内在化モチーフは、ボールド体であり、下線が付けられた。
【0120】
【0121】
密度勾配遠心分離によってＰＢＭＣを単離させ、ＣＤ３陰性選択によって精製してＴ細胞群を富化する。ＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５が存在する場合、単離したＴ細胞をＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔ細胞活性化剤（ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８）で三日間刺激し、そして、過剰に活性化されたＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡとＰｉｇｇｙＢａｃベクターＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、ＭＬＢ０７９及びＭＬＢ０８０でエレクトロポレーションした。ハーセプチン抗体から派生した４Ｄ５Ｖ８ ｓｃＦｖを用いて、全ての四種類のＣＡＲ変異体をエンジニアリングし、該４Ｄ５Ｖ８ ｓｃＦｖはＨＥＲ２（４Ｄ５Ｖ８ Ｈｅｒ２ ｓｃＦｖのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１である）を認識した。ＩＬ２受容体β膜貫通と膜近傍配列に基づいてＭＬＢ０３８とＭＬＢ０３９ ＣＡＲを設計した。ＭＬＢ０３８とＭＬＢ０３９は、その共受容体シグナル伝達ドメインによって区別することができ、ＭＬＢ０３８はＣＤ２８共受容体ドメインで設計されるとともに、ＭＬＢ０３９は４－１ＢＢシグナル伝達ドメインで設計された。この二つの形式も、ＣＤ３ζ細胞内ＩＴＡＭシグナル伝達モチーフを有する。ＭＬＢ０７９はＣＤ８α膜貫通ドメインに対照しかつそれに基づくように設計されたが、ＭＬＢ０８０はＳＥＺ６Ｌ２膜貫通と膜近傍配列でエンジニアリングされた。
【0122】
蛍光コンジュゲート抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体で染色することによって、フローサイトメトリーでＣＡＲの表面発現を検証した。ＣＡＲ構築体上で、Ｐ２Ａ配列を介してＧＦＰを組み合わせ発現することによって、形質導入された細胞を同定した。その結果、ＣＤ８α膜貫通配列を発現するＴ細胞には強い表面染色が存在するが、ＩＬ２Ｒβ又はＳＥＺ６Ｌ２改変ＣＡＲ（ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、ＭＬＢ０８０）を発現するＴ細胞は大幅に減少する表面染色を有し、それらが主に細胞内に局在されることが分かった（図２８Ａ－２８Ｂ）。図２８Ａ－２８Ｂは、ＭＬＢ０７９の対照ＣＡＲのＡＦ６４７染色が増加したが、他のエンドサイトーシスＣＡＲ（ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、ＭＬＢ０８０）のＡＦ６４７染色が増加していなかったことを示し、元のＣＡＲ（ＭＬＢ０７９）の強表面発現及びステルスＣＡＲ（ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、ＭＬＢ０８０）から検出できない表面染色を示した。
【0123】
抗ＨＥＲ２ステルスＣＡＲ変異体の機能性能力を試験するために、細胞系ＳＫ－ＢＲ－３、ＬｏＶｏ及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（臨床的には、トリプルネガティブ乳癌細胞系と記載されている）に対して、ルシフェラーゼに基づく細胞毒性アッセイを行った（図２９）。図２９は、ルシフェラーゼ標的細胞系における異なる程度のＨＥＲ２発現を示した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１は、臨床的には、ＨＥＲ２陰性であり、低ＨＥＲ２染色を示した。ＬｏＶｏ細胞も低レベルのＨＥＲ２抗体染色を示した。ＳＫ－ＢＲ－３細胞は、高レベルのＨＥＲ２染色を示した。標的細胞のＨＥＲ２発現特性の違いにより、発明者らはＨＥＲ２ ＣＡＲ変異体の効果を評価することが可能になる。そして、３：１、１：１と０．３：１のエフェクター子：標的（Ｅ：Ｔ）の割合で、ＣＡＲ Ｔ細胞又は形質導入されていない対照細胞を別の１００μＬ培地に添加し、総反応体積を２００μＬにした。そして、３７°Ｃ、５％のＣＯ２で、細胞を２４時間共培養した。該期間が終了した時、サイトカイン分析のために遠心によって１００μＬ培地を収集し、ＮｅｏＬｉｔｅ基質を各ウェルに添加して生細胞率を確定した。特異的細胞開裂率を、治療群の発光シグナル強度の治療されていない対照群に対する低下として確定した。全ての四種類のＣＡＲ変異体（ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、ＭＬＢ０７９、ＭＬＢ０８０）は、それぞれ全ての三種類の標的細胞系に対し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＬｏＶｏ、ＳＫＢＲ３から、いずれも抗原特異的細胞開裂を検出できるうことを示した（図３０、図３１、図３２）。各ＣＡＲ変異体の細胞毒性活性は、およそ同等であり、投与量依存性を有し、即ちＥ：Ｔ割合の低下に伴って、標的細胞殺傷も低下した。変異体ＭＬＢ０３８とＭＬＢ０３９との比較は、共受容体ドメインがインビトロ殺傷の効率に影響を与えないことを示した。
【0124】
共培養上清におけるＣＡＲ Ｔ細胞から産生されるＩＦＮ－γの発現を、サンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。上清を１対３でＥＬＩＳＡ希釈液に希釈するとともに、ＨＲＰ検出基質の比色活性は、試験対象細胞系に対して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＬｏＶｏ、ＳＫＢＲ３、ステルスＣＡＲ変異体ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９とＭＬＢ０８０が、ＣＤ８α膜貫通対照ＣＡＲ ＭＬＢ０７９に比べて、減少したサイトカイン分泌を有することを示した（図３３、図３４、図３５）。ＨＥＲ２高発現細胞系において、ＩＦＮ－γの、形質導入されてＭＬＢ０８０を発現する細胞における発現は、ＭＬＢ０３８とＭＬＢ０３９との両者より高かったが、依然として元のＣＡＲ形式ＭＬＢ０７９より低かった（図３５）。高腫瘍関連抗原により発現される細胞を標的化する場合、程度が低かったが、ＳＥＺ６Ｌ２改変ＣＡＲは、依然としてサイトカインシグナル伝達を保持することができた。全ての細胞系におけるサイトカインの発現は、Ｅ：Ｔ割合の低下に伴って投与量依存性的に低下した。これらの結果は、ＣＡＲ共受容体シグナル伝達ドメインがサイトカイン発現に大きな影響を与えないとともに、ステルスＣＡＲ（ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９、ＭＬＢ０８０）は、対照ＣＡＲ（ＭＬＢ０７９）に対して低下した炎症性サイトカイン特性を有することを示した。
【0125】
例１３．クローディン１８．２／ＨＥＲ２を標的化する二重ＣＡＲは、一つ又は二つの腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞系に対する細胞毒性ポテンシャル及び増強された機能性を示している
市販されているＨＥＲ２抗体又は内部開発されたクローディン１８．２抗体クローンｈＣＬＤＮ１８．２－８０８抗体（ＶＨのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７であり、ＶＬのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８である）とｈＣＬＤＮ１８．２－８４１抗体（ＶＨのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９であり、ＶＬのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０である）を用いて、ＨＥＫｃｌｄｎ１８．２細胞のＨＥＲ２とクローディン１８．２発現を分析した（図３６）。図３６の左パネルはＨＥＲ２染色を示す。陰性ピークと陽性ピークとの間の距離が小さかったため、ＨＥＲ２の発現は低かった。該データは、強力なクローディン１８．２染色を示し、ＨＥＲ２の発現は低かった。いわゆる「優性ＣＡＲ」と「非優性ＣＡＲ」で二重ＣＡＲを設計し、該「優性ＣＡＲ」は、ＣＤ８α膜貫通ドメインに基づくとともに、クローディン１８．２に対して特異性を有し、該「非優性ＣＡＲ」は、ＳＥＺ６Ｌ２膜貫通と膜近傍ドメインにより改変され、共受容体ドメインを欠くとともに、ＨＥＲ２に対して特異性（ＭＬＢ１０８）を有する。代替可能な非優性ＣＡＲは、ＩＬ２Ｒβ膜貫通と膜近傍配列で設計されるが、ＣＤ２８共受容体ドメイン（ＭＬＢ０４０）を含む（図３７）。二重ＣＡＲの機能性を、クローディン１８．２ ＣＡＲ（ＭＬＢ０２６）と比較した。
市販されているＨＥＲ２抗体又は内部開発されたクローディン１８．２抗体クローンｈＣＬＤＮ１８．２－８０８抗体（ＶＨのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７であり、ＶＬのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８である）とｈＣＬＤＮ１８．２－８４１抗体（ＶＨのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９であり、ＶＬのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０である）を用いて、ＨＥＫｃｌｄｎ１８．２細胞のＨＥＲ２とクローディン１８．２発現を分析した（図３６）。図３６の左パネルはＨＥＲ２染色を示す。陰性ピークと陽性ピークとの間の距離が小さかったため、ＨＥＲ２の発現は低かった。該データは、強力なクローディン１８．２染色を示し、ＨＥＲ２の発現は低かった。いわゆる「優性ＣＡＲ」と「非優性ＣＡＲ」で二重ＣＡＲを設計し、該「優性ＣＡＲ」は、ＣＤ８α膜貫通ドメインに基づくとともに、クローディン１８．２に対して特異性を有し、該「非優性ＣＡＲ」は、ＳＥＺ６Ｌ２膜貫通と膜近傍ドメインにより改変され、共受容体ドメインを欠くとともに、ＨＥＲ２に対して特異性（ＭＬＢ１０８）を有する。代替可能な非優性ＣＡＲは、ＩＬ２Ｒβ膜貫通と膜近傍配列で設計されるが、ＣＤ２８共受容体ドメイン（ＭＬＢ０４０）を含む（図３７）。二重ＣＡＲの機能性を、クローディン１８．２ ＣＡＲ（ＭＬＢ０２６）と比較した。
【0126】
密度勾配遠心分離によってＰＢＭＣを単離させ、ＣＤ３陰性選択によって精製してＴ細胞群を富化した。ＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５が存在する場合、単離したＴ細胞をＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔ細胞活性化剤（ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８）で三日間刺激し、そして、過剰に活性化されたＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡとＰｉｇｇｙＢａｃベクターＭＬＢ０２６及びＭＬＢ１０８でエレクトロポレーションした。蛍光コンジュゲート抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体で染色することによって、フローサイトメトリーでＣＡＲの表面発現を検証した（図３８）。図３８は、形質導入されていない細胞（ＵＴＤ）に比べて、ＭＬＢ１０８染色はＡＦ５９４方向で増加したが、ＭＬＢ０２６染色はＧＦＰとＡＦ５９４の方向で増加したことを示している。図３８は、発明者らが、ＭＬＢ１０８における優性ＣＡＲの表面での発現を検出できることを示している。
【0127】
機能性アッセイは、二重ＣＡＲ ＭＬＢ１０８がＨＥＫｃｌｄｎ１８．２細胞の抗原特異的殺傷を投与量依存的に引き起こし得ることを示している（図３９）。細胞毒性アッセイ上清におけるＩＦＮ－γ放出の比較は、ＭＬＢ１０８二重ＣＡＲを発現する細胞の強ＩＦＮ－γが放出されることを示し、これは、優性ＣＡＲによるクローディン１８．２に対する標的化と一致した（図４０）。
【0128】
別の二重ＣＡＲアッセイにおいて、ＭＬＢ０４０二重ＣＡＲ形式を、クローディン１８．２特異的優性ＣＡＲ（ＭＬＢ０２６）及びＨＥＲ２ステルスＣＡＲ（ＭＬＢ０３８とＭＬＢ０３９）と比較した。密度勾配遠心分離によってＰＢＭＣを単離させ、ＣＤ３陰性選択によって精製してＴ細胞群を富化した。ＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５が存在する場合、単離したＴ細胞をＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔ細胞活性化剤（ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８）で三日間刺激し、そして、過剰に活性化されたＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡとＰｉｇｇｙＢａｃベクターＭＬＢ０２６、ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９及びＭＬＢ０４０でエレクトロポレーションした。蛍光コンジュゲート抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体で染色することによって、フローサイトメトリーでＣＡＲの表面発現を検証した（図４１Ａ－４１Ｂ）。図４１Ａ－４１Ｂは、ＭＬＢ０３８とＭＬＢ０３９がエンドサイトーシス作用を有し、それらが横座標方向のみに染色されたが、エンドサイトーシス作用を持ってないＭＬＢ０２６が横座標と縦座標方向の両方に染色されたことを示している。二重ＣＡＲ ＭＬＢ０４０は、横座標で染色されていなかったが、縦座標のＨＥＲ２方向に染色された。
【0129】
功能性アッセイは、ＨＥＫｃｌｄｎ１８．２細胞に対する細胞毒性がやや増強され、これらのＨＥＫｃｌｄｎ１８．２細胞が、高レベルのクローディン１８．２と低レベルのＨＥＲ２を発現することを示した（図４２）。該アッセイでは、発明者らは、単一クローディン１８．２（ＭＬＢ０２６）と、クローディン１８．２／ＨＥＲ２二重ＣＡＲ（ＭＬＢ０４０）を有するＨＥＲ２ ＣＡＲ構築体の機能性活性を比較した。ＭＬＢ０４０が、優性クローディン１８．２ ＣＡＲ（ＭＬＢ０２６）と、ＣＤ２８共受容体ドメインを有するＩＬ２ＲβステルスＣＡＲ（ＭＬＢ０３９）で構成されるため、発明者らは、ＨＥＫ２９３Ｔｃｌｄｎ１８．２細胞に対して、ＭＬＢ０４０とＭＬＢ０２６、ＭＬＢ０３８及びＭＬＢ０３９の活性を比較して単離と直接接続ＣＡＲ構築体の活性を確定した。発明者らは、単一ＣＡＲ（ＭＬＢ０２６、ＭＬＢ０３８及びＭＬＢ０３９）の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する強細胞毒性を観察し、それはＥ：Ｔ割合の低下に伴って低下し、抗原特異的開裂を示した。なお、発明者らは、ＣＬＤＮ１８．２／ＨＥＲ２二重ＣＡＲ（ＭＬＢ０４０）の全ての試験Ｅ：Ｔ割合での増強した標的細胞殺傷を観察した。これらの結果は、ステルスＣＡＲ（ＭＬＢ０４０）が二重ＣＡＲシステムにおいて、依然として機能性を有することを証明した。細胞毒性アッセイ上清のＥＬＩＳＡ分析は、ＭＬＢ０２６とＭＬＢ０４０との両者から放出されるＩＦＮ－γレベルが同等であり、優性ＣＡＲによるクローディン１８．２に対する標的化と一致した。細胞毒性を検出できたが、ＨＥＲ２単一ステルスＣＡＲ（ＭＬＢ０３８とＭＬＢ０３９）のうちのいずれか一つからサイトカインの放出が検出されなかった（図４３）。ＨＥＲ２高発現細胞系ＳＫ－ＢＲ－３に対して試験する時、ＭＬＢ０３８、ＭＬＢ０３９及びＭＬＢ０４０を発現するＴ細胞により、強い抗原特異的細胞毒性が観察されたが、ＭＬＢ０２６単一ＣＡＲから背景活性化と一致する弱細胞毒性が観察された。これらの結果は、二重標的ＣＡＲがクローディン１８．２とＨＥＲ２の両者を認識し得ることを示した（図４４）。
【0130】
他の実施例
理解すべきこととして、発明を実施するための形態を結び付けながら本開示を記述したが、以上の記述は、本開示の範囲を限定するものではなく、説明することを意図しており、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。その他の態様、利点及び修正は以下の特許請求の範囲内にある。
理解すべきこととして、発明を実施するための形態を結び付けながら本開示を記述したが、以上の記述は、本開示の範囲を限定するものではなく、説明することを意図しており、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。その他の態様、利点及び修正は以下の特許請求の範囲内にある。
【0131】
以上に記述される様々な実施例は、組み合わせて別の実施例を提供することができる。本明細書で言及され及び／又は出願データシートに列記される全ての米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許発行物は、その全てが参照により本明細書に組み込まれる。これらの実施例の各態様は、さらに別の実施例を提供するために、様々な特許、出願、及び刊行物の概念を使用するように修正され得る。
【0132】
これら及び他の変更は上記詳細な記述に鑑みて実施例に対しなされ得る。一般的には、以下の請求項では、使用される用語は請求項を本明細書と特許請求の範囲に開示された特定の実施例に限定するものと解釈すべきではなく、このような特許請求の範囲の権利を付与される等価物の全範囲と共にすべての可能な実施例を含むように解釈すべきである。そのため、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【0133】
引用リスト：
１．Ｒｕｅｌｌａ，Ｍ．，＆ Ｍａｕｓ，Ｍ．Ｖ．（２０１６）．Ｃａｔｃｈ ｍｅ ｉｆ ｙｏｕ ｃａｎ：Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｅｓｃａｐｅ ａｆｔｅｒ ＣＤ１９－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｉｎ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ（Ｖｏｌ．１４，ｐｐ．３５７－３６２）．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｂ．Ｖ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｓｂｊ．２０１６．０９．００３．
２．Ｆｏｕｓｅｋ，Ｋ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｊ．，Ｊｏｓｅｐｈ，Ｓ．Ｋ．，Ｇｅｏｒｇｅ，Ａ．，Ａｎ，Ｘ．，Ｂｙｒｄ，Ｔ．Ｔ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｌｕｏｎｇ，Ａ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｐａｎｉａｇｕａ，Ｍ．Ａ．，Ｓａｎｂｅｒ，Ｋ．，Ｎａｖａｉ，Ｓ．Ａ．，Ｇａｄ，Ａ．Ｚ．，Ｓａｌｓｍａｎ，Ｖ．Ｓ．，Ｍａｔｈｅｗ，Ｐ．Ｒ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｎ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｂｒｕｎｅｔｔｉ，Ｌ．，Ｊａｎｇ，Ａ．，Ｂａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．，…Ａｈｍｅｄ，Ｎ．（２０２０）．ＣＡＲ Ｔ－ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔ ａｃｕｔｅ Ｂ－ｌｉｎｅａｇｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｒｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ＣＤ１９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１，４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１３７５－０２０－０７９２－２．
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４．Ｔａｏ，Ｗ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．，Ｍｅｎｇ，Ｙ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｒ．＆ Ｘｕ，Ｘ．Ｘ．Ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ａｄａｐｔｏｒｓ Ａｒｈ ａｎｄ Ｄａｂ２ ｃｏｎｔｒｏｌ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．５７，８０９－８１７．
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６．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．＆ Ｔｒａｕｂ，Ｌ．Ｍ．Ｓｉｇｎａｌｓ ｆｏｒ ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌ．７２ ３９５－４４７（２００３）．
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３．Ｈｅｍａｒ，Ａ．，Ｌｉｅｂ，Ｍ．，Ｓｕｂｔｉｌ，Ａ．，Ｄｉｓａｎｔｏ，Ｊ．Ｐ．，＆ Ｄａｕｔｒｙ－Ｖａｒｓａｔ，Ａ．（１９９４）．Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ β ｃｈａｉｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｎｅｉｔｈｅｒ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｎｏｒ ｔｈｅ γ ｃｈａｉｎ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２４（９），１９５１－１９５５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｅｊｉ．１８３０２４０９０２．
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５．Ｆａｓａｎｏ，Ｔ．，Ｓｕｎ，Ｘ．Ｍ．，Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｄ．＆ Ｓｏｕｔａｒ，Ａ．Ｋ．Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＤＬＲ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ‘ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ’ＰＣＳＫ９ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ＡＲＨ ｃｅｌｌｓ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２０３，１６６－１７１．
６．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．＆ Ｔｒａｕｂ，Ｌ．Ｍ．Ｓｉｇｎａｌｓ ｆｏｒ ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌ．７２ ３９５－４４７（２００３）．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図14E】
【図14F】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【図21C】
【図21D】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28A】
【図28B】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41A】
【図41B】
【図42】
【図43】
【図44】
【配列表】