ホーム > 特許ランキング > ポーラ化成工業株式会社
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-17
(45)【発行日】2024-09-26
(54)【発明の名称】上皮系細胞を用いた人工多能性幹細胞の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240918BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240918BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240918BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12N15/12
C12N15/113 110Z
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2024504540
(86)(22)【出願日】2023-12-26
(86)【国際出願番号】 JP2023046566
【審査請求日】2024-02-28
(31)【優先権主張番号】P 2023008217
(32)【優先日】2023-01-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2023085614
(32)【優先日】2023-05-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 電気通信回線を通じた公開１［ウェブサイトの掲載日］２０２３年６月７日［ウェブサイトのアドレス］ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｓｃｒ．ｊｕｎｏｌｉｖｅ．ｃｏ／ＡＭ２３／ｄｉｒｅｃｔｏｒｉｅｓ／ａｂｓｔｒａｃｔｂｏｏｋ
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 学会による公開１［開催日］２０２３年６月１６日（日本時間 午後２２：３０～午後２３：１５）※学会開催地では２０２３年６月１６日（午前９：３０～午前１０：１５）※学会開催期間：２０２３年６月１４日～１７日［集会名］Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＩＳＳＣＲ）２０２３［会場］ボストン・コンベンション＆エキシビジョン・センター ４１５サマーストリートボストン，ＭＡ，０２２１０米国
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 電気通信回線を通じた公開２［ウェブサイトの掲載日］２０２３年６月２２日［ウェブサイトのアドレス］ｈｔｔｐｓ：／／ｓｙｎｏｓｉｓ．ｃｏｍ／ｐｄｆ／ｊｓｃｂ２０２３＿ａｂｓｔｒａｃｔｓ－２３０６２２＿００１．ｐｄｆ
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 学会による公開２［開催日］２０２３年６月２９日（学会開催期間：２０２３年６月２８日～３０日）［集会名］第７５回日本細胞生物学会［会場］奈良県奈良市三条大路１丁目６９１－１ 奈良県コンベンションセンター
【早期審査対象出願】
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000113470
【氏名又は名称】ポーラ化成工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110004163
【氏名又は名称】弁理士法人みなとみらい特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】久下 貴之
(72)【発明者】
【氏名】岩永 知幸
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１２／１３７９７０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】LIM, S. J. et al.，Induced pluripotent stem cells from human hair follicle keratinocytes as a potential source for vitro hair follicle cloning，PeerJ，2016年，4:e2695，pp.1-17，DOI:10.7717/peerj.2695
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ １５／１２
Ｃ１２Ｎ １５／１１３
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
核の初期化を行うリプログラム遺伝子又はその翻訳産物を、上皮系細胞に導入することを含む初期化工程と、前記初期化工程を経た細胞を、ラミニン又はその断片でコートされた培養面上で付着培養する付着培養工程と、
を備え、
前記上皮系細胞が、抜毛により取得された、外毛根鞘を含む組織を培養し得られたものであり、
前記リプログラム遺伝子が、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を含み、
前記ラミニン及びラミニン断片は、インテグリン結合部位を有し、
前記初期化工程において、ｐ５３の機能を阻害することを含み、
前記初期化工程において前記リプログラム遺伝子又はその翻訳産物を導入した後の細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養することを含む、上皮系細胞を用いた人工多能性幹細胞の製造方法。
【請求項2】
さらに、前記初期化工程で使用する上皮系細胞を培養する培養工程を含み、前記培養工程は、外毛根鞘を含む組織を培養し、上皮系細胞を増殖させる工程を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
前記外毛根鞘を含む組織は、毛に付着した状態で培養される、請求項２に記載の製造方法。
【請求項4】
前記ｐ５３の機能阻害は、下記（ａ）～（ｃ）から選ばれる１又は２以上の物質により誘導される、請求項１に記載の製造方法：（ａ）ｐ５３の化学的阻害物質；
（ｂ）ｐ５３のドミナントネガティブ変異体及びそれをコードする核酸；並びに
（ｃ）ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びそれらをコードするＤＮＡ。
【請求項5】
前記培養工程は、得られた前記外毛根鞘を含む組織を、培養前に消毒液に１分未満の間接触させる工程を含む、請求項２に記載の製造方法。
【請求項6】
前記培養工程は、細胞外基質をコーティングしたプレートに、得られた前記外毛根鞘を含む組織を播種する工程と、
培地の全量交換を行わずに新鮮な培地を補充しながら、前記プレートに播種した前記外毛根鞘を含む組織を１～３日間培養した後、前記外毛根鞘を含む組織を培地の交換及び補充せず２～７日間静置培養することで、上皮系細胞を増殖させる工程と、を含む、請求項２に記載の製造方法。
【請求項7】
前記インテグリンが、インテグリンα６β１である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項8】
前記ラミニンはラミニン５１１である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項9】
前記ラミニンはラミニン５１１であり、前記ラミニンの断片は、ラミニン５１１Ｅ８フラグメントである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項10】
前記リプログラム遺伝子は、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子又はＬ－Ｍｙｃ遺伝子、並びにＬｉｎ２８遺伝子を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項11】
前記上皮系細胞は、ケラチノサイトである、請求項１～１０の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項12】
前記培養工程において使用する培地は、無血清及び／又はゼノフリーである、請求項２に記載の製造方法。
【請求項13】
前記培養工程は、幹細胞用培地で培養する工程を含む、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項14】
前記培養工程は、前記幹細胞用培地での培養後、上皮細胞用培地で培養する工程を含む、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項15】
前記培養工程は、カルシウム濃度が０．２～４．０ｍＭである高カルシウム培地で培養する工程と、前記高カルシウム培地での培養後、カルシウム濃度が４０～８０μＭである低カルシウム培地で培養する工程を含む、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項16】
前記外毛根鞘を含む組織の播種前に、前記外毛根鞘を含む組織における細胞外マトリックスの構成成分を分解する分解工程を含まない、請求項２～１０、１２～１５の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項17】
前記分解工程が、前記外毛根鞘を含む組織をトリプシン、コラゲナーゼ及びディスパーゼから選択される１種又は２種以上で処理する工程である、請求項１６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、上皮系細胞を用いた人工多能性幹細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell，ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞は、再生医療のための医薬品又は医薬原料等として広く研究が進められている。ｉＰＳ細胞は、２００６年には初めてマウス体細胞を用いて樹立され（非特許文献１）、翌年にはヒトｉＰＳの樹立も報告された（非特許文献２）。
現在、末梢血又は臍帯血由来単核球細胞等の血球細胞、線維芽細胞等の体細胞を用いたｉＰＳ細胞の樹立方法が開発されており、京都大学等によりプロトコルが公開されている。
現在、末梢血又は臍帯血由来単核球細胞等の血球細胞、線維芽細胞等の体細胞を用いたｉＰＳ細胞の樹立方法が開発されており、京都大学等によりプロトコルが公開されている。
【0003】
さらに、非侵襲に取得可能な体細胞を用いてｉＰＳ細胞を効率よく製造する方法も検討されている。例えば、特許文献１には、尿から回収したヒト剥離近位尿細管上皮細胞（ＨＥＰＴＥＣ）等の尿由来細胞を用いて、ｉＰＳ細胞を誘導する方法が開示されている。
【0004】
また、毛包の外毛根鞘由来のケラチノサイトからｉＰＳ細胞を誘導する方法も開示されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２０１７－１６９５７４号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】Cell. 2006;126(4):663-676
【文献】Cell. 2007;131(5):861-872
【文献】Nat Protoc. 2010 Feb;5(2):371-82.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記先行技術のあるところ、本発明は、ケラチノサイト等の上皮系細胞を用いてｉＰＳ細胞を製造することができる、新規な技術を提供することを第１の課題とする。
【0008】
また、本発明は、毛包等の上皮系細胞を含む組織から、上皮系細胞を取得するための、新規な培養方法を提供することを第２の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記第１の課題を解決する本発明は、核の初期化を行うリプログラム遺伝子又はその翻訳産物を、上皮系細胞に導入することを含む初期化工程と、
前記初期化工程を経た細胞を、ラミニン又はその断片でコートされた培養面上で付着培養する付着培養工程と、
を備える、上皮系細胞を用いた人工多能性幹細胞の製造方法である。
上記の本発明の製造方法は、初期化工程にてラミニン又はその断片でコートされた培養面上で細胞を付着培養することで、ｉＰＳ細胞の樹立効率が高いという利点を有する。
前記初期化工程を経た細胞を、ラミニン又はその断片でコートされた培養面上で付着培養する付着培養工程と、
を備える、上皮系細胞を用いた人工多能性幹細胞の製造方法である。
上記の本発明の製造方法は、初期化工程にてラミニン又はその断片でコートされた培養面上で細胞を付着培養することで、ｉＰＳ細胞の樹立効率が高いという利点を有する。
【0010】
本発明の好ましい形態では、前記上皮系細胞は、外毛根鞘由来である。
非侵襲的方法により入手が可能な外毛根鞘由来の上皮系細胞を用いるため、ドナー個体からのｉＰＳドナー細胞の取得が容易となる。
非侵襲的方法により入手が可能な外毛根鞘由来の上皮系細胞を用いるため、ドナー個体からのｉＰＳドナー細胞の取得が容易となる。
【0011】
本発明の好ましい形態では、前記上皮系細胞は、抜毛により取得された組織に由来する。
抜毛により取得された組織に由来する上皮系細胞を用いることで、ｉＰＳ細胞を効率よく製造することができる。
抜毛により取得された組織に由来する上皮系細胞を用いることで、ｉＰＳ細胞を効率よく製造することができる。
【0012】
本発明の好ましい形態では、さらに、前記初期化工程で使用する上皮系細胞を培養する培養工程を含み、
前記培養工程は、外毛根鞘を含む組織を培養し、上皮系細胞を増殖させる工程を含む。
上記培養工程を実施することにより、非侵襲的方法により外毛根鞘由来の上皮系細胞を得ることができ、ドナー個体からのｉＰＳドナー細胞の取得が容易となる。
前記培養工程は、外毛根鞘を含む組織を培養し、上皮系細胞を増殖させる工程を含む。
上記培養工程を実施することにより、非侵襲的方法により外毛根鞘由来の上皮系細胞を得ることができ、ドナー個体からのｉＰＳドナー細胞の取得が容易となる。
【0013】
本発明の好ましい形態では、前記外毛根鞘を含む組織は、毛に付着した状態で培養される。
本発明によれば、毛から外毛根鞘を含む組織を取り出すといったサンプル処理の手間が省け、工程を簡素化することができる。
本発明によれば、毛から外毛根鞘を含む組織を取り出すといったサンプル処理の手間が省け、工程を簡素化することができる。
【0014】
本発明の好ましい形態では、前記外毛根鞘を含む組織は、抜去により取得した毛から得たものである。
非侵襲的方法である抜毛により容易に培養サンプルを取得することができるため、サンプル取得時のドナー個体の負担を軽減することができる。
非侵襲的方法である抜毛により容易に培養サンプルを取得することができるため、サンプル取得時のドナー個体の負担を軽減することができる。
【0015】
本発明の好ましい形態では、前記初期化工程において、ｐ５３の機能を阻害することを含む。
細胞のリプログラム時にｐ５３の機能を阻害することで、ｉＰＳ細胞の樹立効率をより高めることができる。
細胞のリプログラム時にｐ５３の機能を阻害することで、ｉＰＳ細胞の樹立効率をより高めることができる。
【0016】
本発明の好ましい形態では、前記ｐ５３の機能阻害は、下記（ａ）～（ｃ）から選ばれる１又は２以上の物質により誘導される。
（ａ）ｐ５３の化学的阻害物質；
（ｂ）ｐ５３のドミナントネガティブ変異体及びそれをコードする核酸；並びに
（ｃ）ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びそれらをコードするＤＮＡ。
（ａ）ｐ５３の化学的阻害物質；
（ｂ）ｐ５３のドミナントネガティブ変異体及びそれをコードする核酸；並びに
（ｃ）ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びそれらをコードするＤＮＡ。
【0017】
本発明の好ましい形態では、前記初期化工程において前記リプログラム遺伝子又はその翻訳産物を導入した後の細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養することを含む。
上記形態とすることにより、ｉＰＳ細胞の樹立効率をより高めることができる。
上記形態とすることにより、ｉＰＳ細胞の樹立効率をより高めることができる。
【0018】
本発明の好ましい形態では、前記培養工程は、得られた前記外毛根鞘を含む組織を、培養前に消毒液に１分未満の間接触させる工程を含む。
上記工程とすることにより、サンプルの毛の培養器材への接着性を改善し、外毛根鞘から上皮系細胞を効率よく取得することができる。
上記工程とすることにより、サンプルの毛の培養器材への接着性を改善し、外毛根鞘から上皮系細胞を効率よく取得することができる。
【0019】
本発明の好ましい形態では、前記培養工程は、
細胞外基質をコーティングしたプレートに、得られた前記外毛根鞘を含む組織を播種する工程と、
培地の全量交換を行わずに新鮮な培地を補充しながら、前記プレートに播種した前記外毛根鞘を含む組織を１～３日間培養した後、前記外毛根鞘を含む組織を培地の交換及び補充せず２～７日間静置培養することで、上皮系細胞を増殖させる工程と、を含む。
上記特徴を備えた培養工程を実施することで、少ない本数の毛から効率よく多量の上皮系細胞を得ることができる。
細胞外基質をコーティングしたプレートに、得られた前記外毛根鞘を含む組織を播種する工程と、
培地の全量交換を行わずに新鮮な培地を補充しながら、前記プレートに播種した前記外毛根鞘を含む組織を１～３日間培養した後、前記外毛根鞘を含む組織を培地の交換及び補充せず２～７日間静置培養することで、上皮系細胞を増殖させる工程と、を含む。
上記特徴を備えた培養工程を実施することで、少ない本数の毛から効率よく多量の上皮系細胞を得ることができる。
【0020】
本発明の好ましい形態では、前記ラミニンはラミニン５１１である。
ラミニン５１１を用いることで、ｉＰＳ細胞の樹立効率を高めることができる。
ラミニン５１１を用いることで、ｉＰＳ細胞の樹立効率を高めることができる。
【0021】
本発明の好ましい形態では、前記リプログラム遺伝子は、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、及びＳｏｘ２遺伝子を含む。
【0022】
本発明の好ましい形態では、前記リプログラム遺伝子は、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子又はＬ－Ｍｙｃ遺伝子を含む。
【0023】
本発明の好ましい形態では、前記上皮系細胞は、ケラチノサイトである。
【0024】
本発明の好ましい形態では、前記培養工程において使用する培地は、無血清及び／又はゼノフリーである。
【0025】
本発明の好ましい形態では、前記培養工程は、幹細胞用培地で培養する工程を含む。
幹細胞用培地で培養する工程を含むことで、無血清及び／又はゼノフリーの条件下であっても、上皮系細胞を効率よく増殖させることができる。
幹細胞用培地で培養する工程を含むことで、無血清及び／又はゼノフリーの条件下であっても、上皮系細胞を効率よく増殖させることができる。
【0026】
本発明の好ましい形態では、前記培養工程は、前記幹細胞用培地での培養後、上皮細胞用培地で培養する工程を含む。
上記形態とすることで、上皮系細胞を優先的に増殖させることができる。
上記形態とすることで、上皮系細胞を優先的に増殖させることができる。
【0027】
本発明の好ましい形態では、カルシウム濃度が０．２～４．０ｍＭである高カルシウム培地で培養する工程と、
前記高カルシウム培地での培養後、カルシウム濃度が４０～８０μＭである低カルシウム培地で培養する工程を含む。
上記形態とすることで、無血清及び／又はゼノフリーの条件下であっても、上皮系細胞を効率よく増殖させることができる。
前記高カルシウム培地での培養後、カルシウム濃度が４０～８０μＭである低カルシウム培地で培養する工程を含む。
上記形態とすることで、無血清及び／又はゼノフリーの条件下であっても、上皮系細胞を効率よく増殖させることができる。
【0028】
本発明の好ましい形態では、前記幹細胞用培地及び／又は前記高カルシウム培地は、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＴＧＦβ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β１）、Ｌ－アスコルビン酸、セレン及びインスリンを含む。
上記形態とすることで、無血清及び／又はゼノフリー条件において、上皮性組織から上皮系細胞を効率よく取得することができる。
上記形態とすることで、無血清及び／又はゼノフリー条件において、上皮性組織から上皮系細胞を効率よく取得することができる。
【0029】
本発明の好ましい形態では、前記上皮細胞用培地及び／又は前記低カルシウム培地は、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）、ヒドロコルチゾン、及びトランスフェリンを含む。
上記形態とすることで、無血清及び／又はゼノフリー条件において、外毛根鞘を含む組織から上皮系細胞を効率よく取得することができる。
上記形態とすることで、無血清及び／又はゼノフリー条件において、外毛根鞘を含む組織から上皮系細胞を効率よく取得することができる。
【0030】
本発明の好ましい形態では、前記外毛根鞘を含む組織の播種前に、前記外毛根鞘を含む組織における細胞外マトリックスの構成成分を分解する分解工程を含まない。
上記形態とすることで、サンプル処理の手間が省けるとともに、サンプルのダメージを最小限とし、外毛根鞘を含む組織から上皮系細胞を効率よく増殖させることができる。
上記形態とすることで、サンプル処理の手間が省けるとともに、サンプルのダメージを最小限とし、外毛根鞘を含む組織から上皮系細胞を効率よく増殖させることができる。
【0031】
本発明の好ましい形態では、前記分解工程が、前記サンプルをトリプシン、コラゲナーゼ及びディスパーゼから選択される１種又は２種以上で処理する工程である。
【0032】
上記第１の課題を解決する本発明は、以下の通りである。
［１］核の初期化を行うリプログラム遺伝子又はその翻訳産物を、上皮系細胞に導入することを含む初期化工程と、
前記初期化工程を経た細胞を、ラミニン又はその断片でコートされた培養面上で付着培養する付着培養工程と、
を備える、上皮系細胞を用いた人工多能性幹細胞の製造方法。
［２］前記上皮系細胞は、外毛根鞘由来である、［１］に記載の製造方法。
［３］前記上皮系細胞は、抜毛により取得された組織に由来する、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］さらに、前記初期化工程で使用する上皮系細胞を培養する培養工程を含み、
前記培養工程は、外毛根鞘を含む組織を培養し、上皮系細胞を増殖させる工程を含む、［１］～［３］の何れか一つに記載の製造方法。
［５］前記外毛根鞘を含む組織は、毛に付着した状態で培養される、［４］に記載の製造方法。
［６］前記外毛根鞘を含む組織は、抜去により取得した毛から得たものである、［４］又は［５］に記載の製造方法。
［７］前記初期化工程において、ｐ５３の機能を阻害することを含む、［１］～［６］の何れか一つに記載の製造方法。
［８］前記ｐ５３の機能阻害は、下記（ａ）～（ｃ）から選ばれる１又は２以上の物質により誘導される、［７］に記載の製造方法：
（ａ）ｐ５３の化学的阻害物質；
（ｂ）ｐ５３のドミナントネガティブ変異体及びそれをコードする核酸；並びに
（ｃ）ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びそれらをコードするＤＮＡ。
［９］前記初期化工程において前記リプログラム遺伝子又はその翻訳産物を導入した後の細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養することを含む、［１］～［８］の何れか一つに記載の製造方法。
［１０］前記培養工程は、得られた前記外毛根鞘を含む組織を、培養前に消毒液に１分未満の間接触させる工程を含む、［４］～［９］の何れか一つに記載の製造方法。
［１１］前記培養工程は、細胞外基質をコーティングしたプレートに、得られた前記外毛根鞘を含む組織を播種する工程と、
培地の全量交換を行わずに新鮮な培地を補充しながら、前記プレートに播種した前記外毛根鞘を含む組織を１～３日間培養した後、前記外毛根鞘を含む組織を培地の交換及び補充せず２～７日間静置培養することで、上皮系細胞を増殖させる工程と、を含む、［４］～［１０］の何れか一つに記載の製造方法。
［１２］前記ラミニンはラミニン５１１である、［１］～［１１］の何れか一つに記載の製造方法。
［１３］前記リプログラム遺伝子は、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、及びＳｏｘ２遺伝子を含む、［１］～［１２］の何れか一つに記載の製造方法。
［１４］前記リプログラム遺伝子は、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子又はＬ－Ｍｙｃ遺伝子を含む、［１］～［１３］の何れか一つに記載の製造方法。
［１５］前記上皮系細胞は、ケラチノサイトである、［１］～［１４］の何れか一つに記載の製造方法。
［１６］前記培養工程において使用する培地は、無血清及び／又はゼノフリーである、［４］～［１５］の何れか一つに記載の製造方法。
［１７］前記培養工程は、幹細胞用培地で培養する工程を含む、［１６］に記載の製造方法。
［１８］前記培養工程は、前記幹細胞用培地での培養後、上皮細胞用培地で培養する工程を含む、［１７］に記載の製造方法。
［１９］前記培養工程は、カルシウム濃度が０．２～４．０ｍＭである高カルシウム培地で培養する工程と、
前記高カルシウム培地での培養後、カルシウム濃度が４０～８０μＭである低カルシウム培地で培養する工程を含む、［１６］～［１８］の何れか一つに記載の製造方法。
［２０］前記幹細胞用培地及び／又は前記高カルシウム培地は、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＴＧＦβ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β１）、Ｌ－アスコルビン酸、セレン及びインスリンを含む、［１７］～［１９］の何れか一つに記載の製造方法。
［２１］前記上皮細胞用培地及び／又は前記低カルシウム培地は、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）、ヒドロコルチゾン、及びトランスフェリンを含む、［１８］～［２０］の何れか一つに記載の製造方法。
［２２］前記外毛根鞘を含む組織の播種前に、前記外毛根鞘を含む組織における細胞外マトリックスの構成成分を分解する分解工程を含まない、［４］～［２１］の何れか一つに記載の製造方法。
［２３］前記分解工程が、前記サンプルをトリプシン、コラゲナーゼ及びディスパーゼから選択される１種又は２種以上で処理する工程である、［２２］に記載の製造方法。
［１］核の初期化を行うリプログラム遺伝子又はその翻訳産物を、上皮系細胞に導入することを含む初期化工程と、
前記初期化工程を経た細胞を、ラミニン又はその断片でコートされた培養面上で付着培養する付着培養工程と、
を備える、上皮系細胞を用いた人工多能性幹細胞の製造方法。
［２］前記上皮系細胞は、外毛根鞘由来である、［１］に記載の製造方法。
［３］前記上皮系細胞は、抜毛により取得された組織に由来する、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］さらに、前記初期化工程で使用する上皮系細胞を培養する培養工程を含み、
前記培養工程は、外毛根鞘を含む組織を培養し、上皮系細胞を増殖させる工程を含む、［１］～［３］の何れか一つに記載の製造方法。
［５］前記外毛根鞘を含む組織は、毛に付着した状態で培養される、［４］に記載の製造方法。
［６］前記外毛根鞘を含む組織は、抜去により取得した毛から得たものである、［４］又は［５］に記載の製造方法。
［７］前記初期化工程において、ｐ５３の機能を阻害することを含む、［１］～［６］の何れか一つに記載の製造方法。
［８］前記ｐ５３の機能阻害は、下記（ａ）～（ｃ）から選ばれる１又は２以上の物質により誘導される、［７］に記載の製造方法：
（ａ）ｐ５３の化学的阻害物質；
（ｂ）ｐ５３のドミナントネガティブ変異体及びそれをコードする核酸；並びに
（ｃ）ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びそれらをコードするＤＮＡ。
［９］前記初期化工程において前記リプログラム遺伝子又はその翻訳産物を導入した後の細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養することを含む、［１］～［８］の何れか一つに記載の製造方法。
［１０］前記培養工程は、得られた前記外毛根鞘を含む組織を、培養前に消毒液に１分未満の間接触させる工程を含む、［４］～［９］の何れか一つに記載の製造方法。
［１１］前記培養工程は、細胞外基質をコーティングしたプレートに、得られた前記外毛根鞘を含む組織を播種する工程と、
培地の全量交換を行わずに新鮮な培地を補充しながら、前記プレートに播種した前記外毛根鞘を含む組織を１～３日間培養した後、前記外毛根鞘を含む組織を培地の交換及び補充せず２～７日間静置培養することで、上皮系細胞を増殖させる工程と、を含む、［４］～［１０］の何れか一つに記載の製造方法。
［１２］前記ラミニンはラミニン５１１である、［１］～［１１］の何れか一つに記載の製造方法。
［１３］前記リプログラム遺伝子は、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、及びＳｏｘ２遺伝子を含む、［１］～［１２］の何れか一つに記載の製造方法。
［１４］前記リプログラム遺伝子は、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子又はＬ－Ｍｙｃ遺伝子を含む、［１］～［１３］の何れか一つに記載の製造方法。
［１５］前記上皮系細胞は、ケラチノサイトである、［１］～［１４］の何れか一つに記載の製造方法。
［１６］前記培養工程において使用する培地は、無血清及び／又はゼノフリーである、［４］～［１５］の何れか一つに記載の製造方法。
［１７］前記培養工程は、幹細胞用培地で培養する工程を含む、［１６］に記載の製造方法。
［１８］前記培養工程は、前記幹細胞用培地での培養後、上皮細胞用培地で培養する工程を含む、［１７］に記載の製造方法。
［１９］前記培養工程は、カルシウム濃度が０．２～４．０ｍＭである高カルシウム培地で培養する工程と、
前記高カルシウム培地での培養後、カルシウム濃度が４０～８０μＭである低カルシウム培地で培養する工程を含む、［１６］～［１８］の何れか一つに記載の製造方法。
［２０］前記幹細胞用培地及び／又は前記高カルシウム培地は、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＴＧＦβ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β１）、Ｌ－アスコルビン酸、セレン及びインスリンを含む、［１７］～［１９］の何れか一つに記載の製造方法。
［２１］前記上皮細胞用培地及び／又は前記低カルシウム培地は、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）、ヒドロコルチゾン、及びトランスフェリンを含む、［１８］～［２０］の何れか一つに記載の製造方法。
［２２］前記外毛根鞘を含む組織の播種前に、前記外毛根鞘を含む組織における細胞外マトリックスの構成成分を分解する分解工程を含まない、［４］～［２１］の何れか一つに記載の製造方法。
［２３］前記分解工程が、前記サンプルをトリプシン、コラゲナーゼ及びディスパーゼから選択される１種又は２種以上で処理する工程である、［２２］に記載の製造方法。
【0033】
上記第２の課題を解決するための本発明は、無血清及び／又はゼノフリー条件で組織から上皮系細胞を増殖させる方法である。
上記本発明の好ましい形態は、以下の通りである。
上記本発明の好ましい形態は、以下の通りである。
【0034】
［１］上皮性組織を含むサンプルを無血清及び／又はゼノフリー条件で培養することを含む、上皮系細胞の培養方法。
【0035】
［２］前記上皮系細胞は、ケラチノサイトである、［１］に記載の培養方法。
【0036】
［３］前記ケラチノサイトが、毛包ケラチノサイトである、［２］に記載の培養方法。
【0037】
［４］前記サンプルは、外毛根鞘を含む、［１］～［３］の何れか一つに記載の培養方法。
【0038】
［５］前記外毛根鞘は、前記毛に付着した状態である、［４］に記載の培養方法。
【0039】
［６］前記サンプルは、抜去により取得した毛から得たものである、［１］～［５］の何れか一つに記載の培養方法。
【0040】
［７］幹細胞用培地で前記サンプルを培養する工程を含む、［１］～［６］の何れか一つに記載の培養方法。
【0041】
［８］前記幹細胞用培地は、カルシウム濃度が０．２～４．０ｍＭである、［７］に記載の培養方法。
【0042】
［９］前記幹細胞用培地での培養後、前記サンプルを上皮細胞用培地で培養する工程を含む、［７］又は［８］に記載の培養方法。
【0043】
［１０］カルシウム濃度が０．２～４．０ｍＭである高カルシウム培地で前記サンプルを培養する工程と、
前記高カルシウム培地での培養後、カルシウム濃度が４０～８０μＭである低カルシウム培地で前記サンプルを培養する工程を含む、［１］～［９］の何れか一つに記載の培養方法。
前記高カルシウム培地での培養後、カルシウム濃度が４０～８０μＭである低カルシウム培地で前記サンプルを培養する工程を含む、［１］～［９］の何れか一つに記載の培養方法。
【0044】
［１１］前記高カルシウム培地は、幹細胞用培地である、［１０］に記載の培養方法。
【0045】
［１２］前記低カルシウム培地は、上皮細胞用培地である、［１０］又は［１１］に記載の培養方法。
【0046】
［１３］前記幹細胞用培地及び／又は前記高カルシウム培地は、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＴＧＦβ１、Ｌ－アスコルビン酸、セレン及びインスリンを含む、［７］～［１２］の何れか一つに記載の培養方法。
【0047】
［１４］前記上皮細胞用培地及び／又は前記低カルシウム培地が、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）、ヒドロコルチゾン、及びトランスフェリンを含む、［９］～［１３］の何れか一つに記載の培養方法。
【0048】
［１５］無血清かつゼノフリー条件で前記サンプルを培養する、［１］～［１４］の何れか一つに記載の培養方法。
【0049】
［１６］前記の培養方法は、初代培養の方法である、［１］～［１５］の何れか一つに記載の培養方法。
【0050】
［１７］前記サンプルの播種前に、前記サンプルにおける細胞外マトリックスの構成成分を分解する分解工程を含まない、［１］～［１６］の何れか一つに記載の培養方法。
【0051】
［１８］前記分解工程が、前記サンプルをトリプシン、コラゲナーゼ及びディスパーゼから選択される１種又は２種以上で処理する工程である、［１７］に記載の培養方法。
【0052】
［１９］前記サンプルを、培養前に消毒液に１分未満の間接触させる工程を含む、［１］～［１８］の何れか一つに記載の培養方法。
【0053】
［２０］細胞外基質をコーティングしたプレートに、得られた前記サンプルを播種する工程と、
培地の全量交換を行わずに新鮮な培地を補充しながら、前記プレートに播種した前記サンプルを１～３日間培養した後、前記サンプルを培地の交換及び補充せず２～７日間静置培養することで、上皮系細胞を増殖させる静置培養工程と、を含む、［１］～［１９］の何れか一つに記載の培養方法。
培地の全量交換を行わずに新鮮な培地を補充しながら、前記プレートに播種した前記サンプルを１～３日間培養した後、前記サンプルを培地の交換及び補充せず２～７日間静置培養することで、上皮系細胞を増殖させる静置培養工程と、を含む、［１］～［１９］の何れか一つに記載の培養方法。
【0054】
［２１］前記静置培養工程で使用する培地は、前記幹細胞用培地である、［２０］に記載の培養方法。
【0055】
［２２］前記幹細胞用培地は、カルシウム濃度が０．２～４．０ｍＭである、［２１］に記載の培養方法。
【発明の効果】
【0056】
本発明の製造方法によれば、上皮系細胞由来のｉＰＳ細胞を効率よく製造することができる。
【0057】
また、本発明の製造方法によれば、無血清及び／又はゼノフリー条件で、毛包等の上皮系細胞を含む組織から、上皮系細胞を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【0058】
【図1】本発明の一実施形態にかかる、上皮系細胞を用いたｉＰＳ細胞の製造工程を説明するための工程図である。
【図2】実施例１における、外毛根鞘から増殖した上皮系細胞の様子を示す、明視野写真である。スケールバーは１ｍｍである。
【図3】実施例１における、形質転換後の継代２０日後のｉＰＳ細胞の増殖の様子を示す、明視野写真である。スケールバーは２００μｍである。
【図4】実施例１における、誘導したｉＰＳ細胞のｉＰＳ細胞マーカー（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＴＲＡ１－８１）の細胞免疫染色結果を示す、蛍光写真である。スケールバーは２００μｍである。
【図5】実施例２における、外毛根鞘から増殖した上皮系細胞の様子を示す、明視野写真である。スケールバーは３００μｍである。
【図6】実施例２における、上皮系細胞から誘導したｉＰＳ細胞の増殖の様子を示す、明視野写真である。スケールバーは１００μｍである。
【図7】実施例２における、誘導したｉＰＳ細胞のｉＰＳ細胞マーカー（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＴＲＡ１－８１）の細胞免疫染色結果を示す、蛍光写真である。スケールバーは１００μｍである。
【図8】実施例３における、実施例１で取得した上皮系細胞の上皮細胞マーカー（ＫＲＴ１４及びＣＤ２００）の細胞免疫染色結果を示す、蛍光写真である。スケールバーは５００μｍである。
【発明を実施するための形態】
【0059】
＜上皮系細胞を用いた人工多能性幹細胞の製造方法＞
本発明の上皮系細胞を用いた人工多能性幹細胞の製造方法の好ましい一実施形態について、図１を参照し説明する。
なお、本発明は、本実施形態に限定されるものではなく、適宜設計変更が可能である。
本発明の上皮系細胞を用いた人工多能性幹細胞の製造方法の好ましい一実施形態について、図１を参照し説明する。
なお、本発明は、本実施形態に限定されるものではなく、適宜設計変更が可能である。
【0060】
図１にかかる製造方法は、上皮系細胞を培養する培養工程Ｓ１、得られた上皮系細胞の初期化を行う初期化工程Ｓ２、及び、ラミニン又はその断片でコートされた培養面上で前記上皮系細胞を付着培養し、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を誘導する付着培養工程Ｓ３を含む。
【0061】
ここで、本発明において人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）とは、体細胞に後述するリプログラム因子を作用させることにより人工的に作製された、分化多能性及び増殖能を有する細胞をいう。
【0062】
以下、本発明にかかる各工程について、詳細に説明を加える。
【0063】
（１）培養工程Ｓ１
培養工程Ｓ１は、初期化工程Ｓ２で使用する上皮系細胞を培養する工程である。
培養工程Ｓ１は、初期化工程Ｓ２で使用する上皮系細胞を培養する工程である。
【0064】
本発明で用いる上皮系細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト等）由来のものを使用することができる。本発明ではヒト由来の上皮系細胞を培養することが好ましい。
【0065】
本発明において、上皮系細胞とは、上皮性の組織に由来する細胞のことをいい、上皮性組織を含むサンプルを培養して得ることができる。本発明における上皮系細胞は、上皮性組織を培養することにより得られる細胞集団であってもよく、上皮細胞マーカーを発現する上皮細胞（例えば、ケラチノサイト）、及び、上皮幹細胞マーカーを発現する幹細胞（例えば、毛包幹細胞（ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ （ＨＦＳＣ））を含むことができる。
本発明では、上皮系細胞としてケラチノサイトを用いることができ、中でも毛包ケラチノサイトを好適に使用できる。
本発明では、上皮系細胞としてケラチノサイトを用いることができ、中でも毛包ケラチノサイトを好適に使用できる。
【0066】
本発明で使用する上皮系細胞は、上皮細胞を有するもの、つまり皮膚および皮膚付属器等の検体を培養し、取得することができる。本発明では、侵襲性の理由から毛の外毛根鞘の細胞を培養することが好ましい。
本発明の好ましい実施の形態では、非侵襲的方法により入手可能な毛の外毛根鞘由来の上皮系細胞を利用するため、ドナー個体からｉＰＳ細胞誘導用のサンプルを採取する際の負担を軽減することができる。
本発明の好ましい実施の形態では、非侵襲的方法により入手可能な毛の外毛根鞘由来の上皮系細胞を利用するため、ドナー個体からｉＰＳ細胞誘導用のサンプルを採取する際の負担を軽減することができる。
【0067】
上皮系細胞を取得するための組織を採取する個体（具体的には、哺乳動物個体）は特に制限されない。例えば、ドナー個体の化粧品効果、薬剤感受性や副作用の有無等を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとしてｉＰＳ細胞を使用する場合には、ドナー本人またはドナーと薬剤感受性等と相関する遺伝子多型が同一である他人から上皮系細胞を採取することが好ましい。
また、患者への移植等へ用いる場合には、患者等のドナー本人またはドナーとＨＬＡの型が同一もしくは実質的に同一である他人から上皮系細胞を採取することが好ましい。これにより、拒絶反応のリスクが回避されるため、作製したｉＰＳ細胞を再生医療用途に好適に利用できる。
ここでＨＬＡの型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤などの使用により、該体細胞由来のｉＰＳ細胞から分化誘導することにより得られた細胞をドナー個体に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にＨＬＡの型が一致していることをいう。例えば、ＨＬＡ（例えばＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－ＤＲの３遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる。
また、患者への移植等へ用いる場合には、患者等のドナー本人またはドナーとＨＬＡの型が同一もしくは実質的に同一である他人から上皮系細胞を採取することが好ましい。これにより、拒絶反応のリスクが回避されるため、作製したｉＰＳ細胞を再生医療用途に好適に利用できる。
ここでＨＬＡの型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤などの使用により、該体細胞由来のｉＰＳ細胞から分化誘導することにより得られた細胞をドナー個体に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にＨＬＡの型が一致していることをいう。例えば、ＨＬＡ（例えばＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－ＤＲの３遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる。
【0068】
上皮系細胞の培養に使用する培地は特に限定されず、ケラチノサイト等の上皮細胞の培養に適した公知の培地を用いて培養することができる。このような培地としては、例えば、ＥｐｉＬｉｆｅＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）、角化細胞増殖培地（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ）、約５～２０％の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地などが挙げられるが、それらに限定されない。また、適宜ケラチノサイトの培養に適切な成分（カルシウム、成長因子等）を添加してもよい。
本発明では、４０～４００μＭのカルシウム塩を含有する培地を用いることが好ましい。
また、導入効率の低下を防ぐため、初期化工程Ｓ２前には、無血清培地に交換しておくことが好ましい。
本発明では、４０～４００μＭのカルシウム塩を含有する培地を用いることが好ましい。
また、導入効率の低下を防ぐため、初期化工程Ｓ２前には、無血清培地に交換しておくことが好ましい。
【0069】
上皮系細胞の培養は、細胞が接着可能な培養器を用いて、付着培養とすることが好ましい。
付着培養を行う際に用いられる培養器は、培養スケール、培養条件及び培養期間に応じて適宜適切な培養器を選択することができる。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理された培養器が挙げられ、具体的には表面加工された培養器や、内部がコーティング剤でコートされた培養器が挙げられる。
付着培養を行う際に用いられる培養器は、培養スケール、培養条件及び培養期間に応じて適宜適切な培養器を選択することができる。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理された培養器が挙げられ、具体的には表面加工された培養器や、内部がコーティング剤でコートされた培養器が挙げられる。
【0070】
本発明では、上皮系細胞の培養は、コーティング剤でコートされた培養器を用いることが好ましい。
コーティング剤としては、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外基質等や、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等が挙げられる。本発明では、細胞外基質を用いることが好ましく、コラーゲンＩを用いることが好ましい。
また、本発明では、コーティング剤としてラミニン又はその断片を用いることも好ましい。好ましいラミニン又はその断片の形態は、後述の付着培養工程Ｓ３に記載の通りである。
コーティング剤としては、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外基質等や、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等が挙げられる。本発明では、細胞外基質を用いることが好ましく、コラーゲンＩを用いることが好ましい。
また、本発明では、コーティング剤としてラミニン又はその断片を用いることも好ましい。好ましいラミニン又はその断片の形態は、後述の付着培養工程Ｓ３に記載の通りである。
【0071】
また、培養器の具体的な形態としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿（ディッシュ）、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、マイクロキャリア、ビーズ、スタックプレート、スピナーフラスコ又はローラーボトルが挙げられる。
【0072】
続いて、培養工程Ｓ１の具体的な手順として、毛を用いた上皮系細胞の分離培養方法について説明する。
【0073】
初めに、外毛根鞘を含む組織を取得する。外毛根鞘は、毛包の上皮性毛根鞘を構成する層であり、ドナー個体の毛を引き抜くことによって、当該外毛根鞘を含む組織を取得することができる。本発明で使用する毛の本数は、少なくとも１本以上であればよく、好ましくは２本以上、より好ましくは５本以上である。具体的には、１～１０本の毛を用いることが好ましい。そして、ドナー個体から採取した毛の下部を切り出し、外毛根鞘を含む組織を取得する。取得する組織の大きさは２～３ｍｍ以上であることが好ましい。また、取得する組織は、外毛根鞘が毛に付着したままの形態であってもよい。すなわち、抜去した毛について外毛根鞘を含む部分を切り出し、毛に付着した状態の外毛根鞘を含む毛包を取得する形態であってもよい。
【0074】
抜去により得た毛は、毛球よりも上の領域に外毛根鞘が付着している。本発明で培養する抜去により取得された組織は、バルジ領域に存在した細胞を含んでいてもよい。
【0075】
次いで、得られた外毛根鞘を含む組織（サンプル）を、消毒液に接触させる。消毒液に接触させる方法は特に限定されず、サンプルを消毒液に浸漬させることが好ましく挙げられる。
消毒液へ接触させる時間は、好ましくは１分未満であり、より好ましくは３０秒未満であり、さらに好ましくは１０秒未満であり、特に好ましくは５秒未満である。
消毒液に接触させる時間を上記範囲内とすることで、毛へのダメージを軽減し、毛の培養器材への接着性を改善することにより、外毛根鞘を含む組織から上皮系細胞を効率よく取得することができる。
消毒液へ接触させる時間は、好ましくは１分未満であり、より好ましくは３０秒未満であり、さらに好ましくは１０秒未満であり、特に好ましくは５秒未満である。
消毒液に接触させる時間を上記範囲内とすることで、毛へのダメージを軽減し、毛の培養器材への接着性を改善することにより、外毛根鞘を含む組織から上皮系細胞を効率よく取得することができる。
【0076】
本発明で使用する消毒液は、抗生物質を添加した溶液であることが好ましい。好ましい抗生物質としては、細胞壁合成阻害薬、タンパク質合成阻害薬、細胞膜機能阻害薬から選ばれる１種又は２種以上である。より好ましくは、細胞壁合成阻害薬、タンパク質合成阻害薬及び細胞膜機能阻害薬の各々から１種以上の抗生物質を選択する。
【0077】
細胞壁合成阻害薬としては、βラクタム系抗生物質が好ましく挙げられる。βラクタム系の細胞壁合成阻害薬としては、ペニシリン、アンピシリン、カルベニシリンナトリウム等が例示でき、本発明ではペニシリンを用いることが好ましい。
タンパク質合成阻害薬としては、アミノグリコシド系抗生物質が好ましく挙げられる。
アミノグリコシド系のタンパク質合成阻害薬としては、カナマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、トブラマイシン等が例示でき、本発明ではストレプトマイシンを用いることが好ましい。
細胞膜機能阻害薬としては、ポリエン系抗生物質が好ましく挙げられる。ポリエン系の細胞膜機能阻害薬としては、アムホテリシンＢ、ナイスタチン、ナタマイシン等が例示でき、本発明では特にアムホテリシンＢを用いることが好ましい。
本発明にかかる消毒液は、抗生物質としてペニシリン、ストレプトマイシン及びアムホテリシンＢを含む溶液であることが好ましい。
タンパク質合成阻害薬としては、アミノグリコシド系抗生物質が好ましく挙げられる。
アミノグリコシド系のタンパク質合成阻害薬としては、カナマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、トブラマイシン等が例示でき、本発明ではストレプトマイシンを用いることが好ましい。
細胞膜機能阻害薬としては、ポリエン系抗生物質が好ましく挙げられる。ポリエン系の細胞膜機能阻害薬としては、アムホテリシンＢ、ナイスタチン、ナタマイシン等が例示でき、本発明では特にアムホテリシンＢを用いることが好ましい。
本発明にかかる消毒液は、抗生物質としてペニシリン、ストレプトマイシン及びアムホテリシンＢを含む溶液であることが好ましい。
【0078】
続いて、コーティング剤をコートしたプレートに、得られた消毒済みのサンプルを播種し、一定期間培養することにより、上皮系細胞の増殖を行う。
使用するプレートは、細胞培養用の１２ｗｅｌｌプレート又は２４ｗｅｌｌプレートであることが好ましく、２４ｗｅｌｌプレートであることがより好ましい。また、消毒済みのサンプルを１ｗｅｌｌあたり１個ずつ播種することが好ましい。
使用するプレートは、細胞培養用の１２ｗｅｌｌプレート又は２４ｗｅｌｌプレートであることが好ましく、２４ｗｅｌｌプレートであることがより好ましい。また、消毒済みのサンプルを１ｗｅｌｌあたり１個ずつ播種することが好ましい。
【0079】
播種時の培地の量は、切り出したサンプルの組織全体が浸り、かつ液面が当該組織全体の上部１ｍｍ以下となる量であることが好ましい。播種時の培地を上記量とすることで、毛包組織をプレートへ効率よく接着させることができる。
【0080】
好ましい実施の形態では、外毛根鞘を含むサンプルの培養は、以下の３ステップを順に実施する。
第１ステップＳ１１では、播種したサンプルを培地の全量交換を行わずに新鮮な培地を補充しながら培養する。補充する培地の回数は好ましくは１～３回、より好ましくは２回である。
第１ステップＳ１１では、播種したサンプルを培地の全量交換を行わずに新鮮な培地を補充しながら培養する。補充する培地の回数は好ましくは１～３回、より好ましくは２回である。
【0081】
第１ステップＳ１１において補充する培地の量は、切り出したサンプルの組織全体が浸り、かつ液面が当該組織全体の上部２ｍｍ以下、より好ましくは１．５ｍｍ以下となる量であることが好ましい。
また、補充する培地の量は、サンプルの播種時の０．５～３倍であることが好ましく、１～３倍であることがより好ましく、１～２倍であることがさらに好ましい。培地の補充回数を２回以上とする場合、１回目の培地の補充量よりも２回目以降の培地の補充量を多くすることが好ましい。かかる場合、２回目以降の培地の補充量は、１回目の培地の補充量の好ましくは１．２～３倍、より好ましくは１．５～２．５倍、さらに好ましくは２～２．５倍である。また、２回目以降の培地の補充量は、切り出した組織全体が浸り、かつ液面が当該組織全体の上部１～２ｍｍ、より好ましくは１～１．５ｍｍとなる量であることが好ましい。
また、第１ステップＳ１１における培養期間は、好ましくは１～３日間である。
また、補充する培地の量は、サンプルの播種時の０．５～３倍であることが好ましく、１～３倍であることがより好ましく、１～２倍であることがさらに好ましい。培地の補充回数を２回以上とする場合、１回目の培地の補充量よりも２回目以降の培地の補充量を多くすることが好ましい。かかる場合、２回目以降の培地の補充量は、１回目の培地の補充量の好ましくは１．２～３倍、より好ましくは１．５～２．５倍、さらに好ましくは２～２．５倍である。また、２回目以降の培地の補充量は、切り出した組織全体が浸り、かつ液面が当該組織全体の上部１～２ｍｍ、より好ましくは１～１．５ｍｍとなる量であることが好ましい。
また、第１ステップＳ１１における培養期間は、好ましくは１～３日間である。
【0082】
第１ステップＳ１１の具体的な形態として、補充する培地の回数は２回、培養期間は３日間であり、サンプルの播種後２４時間～４８時間の間に１回、播種時と等量（１倍）の培地を補充し、サンプルの播種後４８時間～７２時間の間に１回、播種時の２倍の培地を補充する形態が好ましく例示できる。
【0083】
第２ステップＳ１２では、第１ステップＳ１１で培地を補充した後、培地の交換及び補充せずに静置培養を行い、上皮系細胞を増殖させる。培養期間は、好ましくは２～７日間、より好ましくは３～５日間、さらに好ましくは３～４日間である。具体的には、３日間であることが好ましい。
このような静置培養を行うことで、外毛根鞘からの上皮系細胞の増殖を促進することができる。
このような静置培養を行うことで、外毛根鞘からの上皮系細胞の増殖を促進することができる。
【0084】
また、第２ステップＳ１２にて、播種した外毛根鞘から上皮系細胞の細胞集団の伸展が確認できる。外毛根鞘から増殖した上皮系細胞の伸展距離が、毛幹から好ましくは０．８ｍｍ以上、より好ましくは１ｍｍ以上、具体的には１～２ｍｍとなっていることが好ましい。
なお、第１ステップＳ１１、第２ステップＳ１２を順に行うステップは、本発明において静置培養工程ともいう。
なお、第１ステップＳ１１、第２ステップＳ１２を順に行うステップは、本発明において静置培養工程ともいう。
【0085】
第３ステップＳ１３では、培地の交換を行い、外毛根鞘から伸展した細胞の培養を継続する。培地は、第２ステップＳ１２後の初回では培地の全量を交換し、その後は、培地の補充と交換を繰り返すことが好ましい。培地の補充と交換は、好ましくは４５時間～５５時間、より好ましくは４８～５０時間の間隔で交互に行うことが好ましく、具体的には１日おきに交互に行うことが好ましい。
【0086】
第３ステップＳ１３において、培地交換時の培地の添加量は、好ましくは第１ステップＳ１１前におけるサンプルの播種時の０．５～３倍であることが好ましく、１～２倍であることがより好ましく、１．５～２倍であることがさらに好ましい。
また、培地の補充量は、第３ステップＳ１３の培地交換時の培地の添加量の０．５～２倍であることが好ましく、１～１．５倍であることがより好ましく、等量（１倍）であることがさらに好ましい。
第３ステップＳ１３の具体的な形態として、培地の全量交換を行ってサンプルの播種時の２倍量の培地を添加し、その２日後に培地交換時の培地の添加量と等量（１倍）の培地を添加し、培養を行う形態が好ましく例示できる。
また、培地の補充量は、第３ステップＳ１３の培地交換時の培地の添加量の０．５～２倍であることが好ましく、１～１．５倍であることがより好ましく、等量（１倍）であることがさらに好ましい。
第３ステップＳ１３の具体的な形態として、培地の全量交換を行ってサンプルの播種時の２倍量の培地を添加し、その２日後に培地交換時の培地の添加量と等量（１倍）の培地を添加し、培養を行う形態が好ましく例示できる。
【0087】
第３ステップＳ１３は、増殖した細胞が５０～８０％コンフルエントとなるまで継続することが好ましい。培地の補充及び交換による培養期間は、７～２８日間であることが好ましく、１４～２１日間であることがより好ましい。
【0088】
また、第３ステップＳ１３では、外毛根鞘から増殖した細胞の展開領域において細胞が過密になる前に継代することが好ましい。例えば、１２ウェルプレート（ウェル底直径２１ｍｍ～２２．３ｍｍ）で培養を行う場合には、増殖した細胞が５０～８０％コンフルエントとなった段階で、継代を行うことが好ましい。継代後５０～８０％コンフルエントとなった細胞を、続く初期化工程Ｓ２において好適に使用することができる。
継代後の培養期間は、３～７日間であることが好ましく、４～６日間であることがより好ましい。また、継代後は毎日培地交換を行うことが好ましく、交換時の培地の量は、上記の第３ステップＳ１３の培地の交換時における培地の添加量の０．５～２倍であることが好ましく、１～１．５倍であることがより好ましく、等量（１倍）であることがさらに好ましい。
継代後の培養期間は、３～７日間であることが好ましく、４～６日間であることがより好ましい。また、継代後は毎日培地交換を行うことが好ましく、交換時の培地の量は、上記の第３ステップＳ１３の培地の交換時における培地の添加量の０．５～２倍であることが好ましく、１～１．５倍であることがより好ましく、等量（１倍）であることがさらに好ましい。
【0089】
上記の３ステップを採用することにより、少ない本数の毛から、ｉＰＳ細胞の誘導に十分な量の上皮系細胞を得ることができる。そのため、本発明を用いれば、ドナー個体からサンプルを採取する際の負担を軽減することができる。
【0090】
一つの実施形態において、第１ステップＳ１１及び第２ステップＳ１２では、カルシウム含有培地とＭＥＦ馴化培地を混合して用いることが好ましく、具体的にはＥｐｉＬｉｆｅＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ（６０μＭカルシウム入り、Ｇｉｂｃｏ）及びＥｍｂｒｙｏＭａｘ ＭＥＦ馴化培地（メルク）の混合培地を挙げることができる。また、第１ステップＳ１１及び第２ステップＳ１２で使用する培地のカルシウム塩の濃度は、６０～４００μＭであることが好ましい。
また、第３ステップＳ１３では、カルシウム含有培地を用いることが好ましく、具体的にはＥｐｉＬｉｆｅＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ（６０μＭカルシウム入り、Ｇｉｂｃｏ）を挙げることができる。第３ステップＳ１３で使用する培地のカルシウム塩の濃度は、４０～８０μＭであることが好ましい。
また、第３ステップＳ１３では、カルシウム含有培地を用いることが好ましく、具体的にはＥｐｉＬｉｆｅＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ（６０μＭカルシウム入り、Ｇｉｂｃｏ）を挙げることができる。第３ステップＳ１３で使用する培地のカルシウム塩の濃度は、４０～８０μＭであることが好ましい。
【0091】
また、第１ステップＳ１１～第３ステップＳ１３で用いる培地は、ウシ下垂体抽出物（Ｂｏｖｉｎｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔ，ＢＰＥ）、組換えヒトインスリン様成長因子－Ｉ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－Ｉ）、ヒドロコルチゾン、ウシトランスフェリン及びヒト上皮細胞成長因子（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を含むことが好ましい。
【0092】
また、外毛根鞘から伸展した細胞の大きさが規定以下、例えば１ｍｍ以下である場合、第３ステップＳ１３に移行する前に、ＭＥＦ順化培地を用いて培養する工程を含むことが好ましい。この場合、ＭＥＦ順化培地はウシ下垂体抽出物（Ｂｏｖｉｎｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔ，ＢＰＥ）、組換えヒトインスリン様成長因子－Ｉ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－Ｉ）、ヒドロコルチゾン、ウシトランスフェリン及びヒト上皮細胞成長因子（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を含むことが好ましい。
【0093】
別の実施形態では、培養工程Ｓ１で使用する培地は、無血清培地、又はゼノフリー（ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ）であることが好ましい。より好ましくは、培養工程Ｓ１で使用する培地は、無血清かつゼノフリーの培地であることが好ましい。
【0094】
無血清及び／又はゼノフリー培地は、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）、ヒドロコルチゾン及びトランスフェリンから選択される１種又は２種以上の添加物を含むことが好ましく、上記４種の全てを含むことがより好ましい。
これらの成分を含むことで、上皮系細胞を効率よく増殖させることができる。
これらの成分を含むことで、上皮系細胞を効率よく増殖させることができる。
【0095】
ＥＧＦの濃度は、好ましくは５～５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０～３０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１５～２５ｎｇ／ｍｌであり、具体的には２０ｎｇ／ｍｌが好ましく挙げられる。
また、ＥＧＦは、ヒト上皮細胞成長因子であることが好ましい。
また、ＥＧＦは、ヒト上皮細胞成長因子であることが好ましい。
【0096】
ＩＧＦ－Ｉの濃度は、好ましくは５～５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０～３０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１５～２５ｎｇ／ｍｌであり、具体的には２０ｎｇ／ｍｌが好ましく挙げられる。
また、ＩＧＦ－Ｉは、組換えヒトインスリン様成長因子であることが好ましい。
また、ＩＧＦ－Ｉは、組換えヒトインスリン様成長因子であることが好ましい。
【0097】
ヒドロコルチゾンの濃度は、好ましくは５０～５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１００～３００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１５０～２５０ｎｇ／ｍｌであり、具体的には２００ｎｇ／ｍｌが好ましく挙げられる。
【0098】
トランスフェリンの濃度は、好ましくは１～５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは３～３０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５～２０μｇ／ｍｌであり、具体的には１０μｇ／ｍｌが好ましく挙げられる。
また、トランスフェリンは、ヒトトランスフェリンであることが好ましい。
また、トランスフェリンは、ヒトトランスフェリンであることが好ましい。
【0099】
また、無血清及び／又はゼノフリー培地は、任意の上皮細胞用増殖添加物を含むことができる。上皮細胞添加物は、ゼノフリーの成分であることが好ましく、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｓ７（Ｇｉｂｃｏ）が好ましく例示できる。
【0100】
また、無血清及び／又はゼノフリー培地を用いる場合、培養工程Ｓ１は、幹細胞用培地で培養する工程を含むことが好ましい。
使用する幹細胞用培地としては、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８、ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、又はＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社製）等が好適に挙げられ、中でもＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８を用いることが好ましい。
幹細胞用培地には、任意で、抗生物質、血清、成長因子、ホルモン等の添加物を加えることができる。
使用する幹細胞用培地としては、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８、ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、又はＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社製）等が好適に挙げられ、中でもＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８を用いることが好ましい。
幹細胞用培地には、任意で、抗生物質、血清、成長因子、ホルモン等の添加物を加えることができる。
【0101】
さらに好ましくは、幹細胞用培地で培養後、上皮細胞用培地で培養する工程を含むことが好ましい。
使用する上皮細胞用培地としては、培養工程Ｓ１にて記載した上皮細胞の培養に適した培地を好適に用いることができ、ＥｐｉＬｉｆｅＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ）を用いることが好ましく、ＥｐｉＬｉｆｅＴＭ Ｍｅｄｉｕｍを用いることがより好ましい。上皮細胞用培地には、任意で、抗生物質、血清、成長因子、ホルモン、カルシウム等の添加物を加えることができる。
使用する上皮細胞用培地としては、培養工程Ｓ１にて記載した上皮細胞の培養に適した培地を好適に用いることができ、ＥｐｉＬｉｆｅＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ）を用いることが好ましく、ＥｐｉＬｉｆｅＴＭ Ｍｅｄｉｕｍを用いることがより好ましい。上皮細胞用培地には、任意で、抗生物質、血清、成長因子、ホルモン、カルシウム等の添加物を加えることができる。
【0102】
また、無血清及び／又はゼノフリー培地を用いる場合、培養工程Ｓ１は、高カルシウム濃度の培地（高カルシウム培地）で培養する工程を含むことが好ましい。
【0103】
また、無血清及び／又はゼノフリー培地を用いる場合、カルシウム濃度の異なる２種の培地を用いることが好ましい。一実施形態では、高カルシウム培地で培養後、低カルシウム濃度の培地（低カルシウム培地）で培養することが好ましい。
【0104】
高カルシウム培地は、カルシウム濃度が、好ましくは０．２ｍＭ以上、より好ましくは０．５ｍＭ以上、さらに好ましくは０．８ｍＭ以上、より好ましくは１．０ｍＭ以上である。
また、高カルシウム培地は、カルシウム濃度が、好ましくは４．０ｍＭ以下、より好ましくは３．５ｍＭ以下、より好ましくは３．０ｍＭ以下である。
高カルシウム培地のカルシウム濃度を上記範囲とすることで、播種後の外毛根鞘から効率よく上皮系細胞を増殖させることができる。
高カルシウム培地の濃度は、具体的には、０．２～４．０ｍＭ、より好ましくは０．５～３．５ｍＭ、さらに好ましくは１．０～３．５ｍＭ、より好ましくは１．０～３．０ｍＭとすることができる。
また、高カルシウム培地は、カルシウム濃度が、好ましくは４．０ｍＭ以下、より好ましくは３．５ｍＭ以下、より好ましくは３．０ｍＭ以下である。
高カルシウム培地のカルシウム濃度を上記範囲とすることで、播種後の外毛根鞘から効率よく上皮系細胞を増殖させることができる。
高カルシウム培地の濃度は、具体的には、０．２～４．０ｍＭ、より好ましくは０．５～３．５ｍＭ、さらに好ましくは１．０～３．５ｍＭ、より好ましくは１．０～３．０ｍＭとすることができる。
【0105】
低カルシウム培地は、カルシウム濃度が、好ましくは４０μＭ以上、より好ましくは４５μＭ以上、さらに好ましくは５０μＭ以上である。
また、低カルシウム培地は、カルシウム濃度が、好ましくは８０μＭ以下、より好ましくは７５μＭ以下、さらに好ましくは７０μＭ以下である。
低カルシウム培地のカルシウム濃度を上記範囲とすることで、高カルシウム培地で培養することにより増殖した細胞から、目的の上皮系細胞を効率よく増殖させることができる。
低カルシウム培地の濃度は、具体的には、４０～８０μＭ、より好ましくは４５～７５μＭ、さらに好ましくは５０～７０μＭとすることができる。
また、低カルシウム培地は、カルシウム濃度が、好ましくは８０μＭ以下、より好ましくは７５μＭ以下、さらに好ましくは７０μＭ以下である。
低カルシウム培地のカルシウム濃度を上記範囲とすることで、高カルシウム培地で培養することにより増殖した細胞から、目的の上皮系細胞を効率よく増殖させることができる。
低カルシウム培地の濃度は、具体的には、４０～８０μＭ、より好ましくは４５～７５μＭ、さらに好ましくは５０～７０μＭとすることができる。
【0106】
続いて、無血清かつゼノフリー培地の好ましい実施形態について、具体例を挙げて説明を加える。本実施形態では、培養工程Ｓ１は、高カルシウム培地でありかつ幹細胞用培地である一次培地を用いて培養する一次培養工程と、低カルシウム培地でありかつ上皮細胞用培地である二次培地を用いて培養する二次培養工程を含む。
【0107】
一次培地は、基礎培地がＤＭＥＭ／Ｆ１２であることが好ましい。また、一次培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及び／又はＴＧＦβ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β１）を含むことが好ましい。このような成分を含むことで、毛の外毛根鞘から細胞を効率よく増殖させることができる。
さらに、一次培地は、Ｌ－アスコルビン酸、セレン、トランスフェリン及びインスリンを含むことが好ましい。このような成分を含む培地としては、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８が挙げられる。
さらに、一次培地は、Ｌ－アスコルビン酸、セレン、トランスフェリン及びインスリンを含むことが好ましい。このような成分を含む培地としては、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８が挙げられる。
【0108】
一次培地は、上記の培地に、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）、ヒドロコルチゾン及びトランスフェリンから選択される１種又は２種以上の添加物を含むことが好ましく、上記４種の全てを含むことがより好ましい。当該添加物の好ましい形態は、上記の通りである。
本発明では、一次培地は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８に上記４種の添加物を追加したものとすることができる。好ましいカルシウム濃度は、高カルシウム培地の条件にて記載した通りである。
本発明では、一次培地は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８に上記４種の添加物を追加したものとすることができる。好ましいカルシウム濃度は、高カルシウム培地の条件にて記載した通りである。
【0109】
二次培地は、上皮細胞用培地としてＥｐｉＬｉｆｅＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ（６０μＭカルシウム入り、Ｇｉｂｃｏ）を用いることが好ましい。
二次培地は、上記の培地に、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）、ヒドロコルチゾン及びトランスフェリンから選択される１種又は２種以上の添加物を含むことが好ましく、上記４種の全てを含むことがより好ましい。当該添加物の好ましい形態は、上記の通りである。
二次培地は、上記の培地に、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）、ヒドロコルチゾン及びトランスフェリンから選択される１種又は２種以上の添加物を含むことが好ましく、上記４種の全てを含むことがより好ましい。当該添加物の好ましい形態は、上記の通りである。
【0110】
一次培養工程では、一次培地を用いて、上記の第１ステップＳ１１及び第２ステップＳ１２を実施することが好ましい。第１ステップＳ１１及び第２ステップＳ１２の好ましい形態は、上記の通りである。
【0111】
一次培養工程では、第２ステップＳ１２の実施後、一次培地にて培地交換を行い、培養を継続することが好ましい。一次培地における培地交換では、培地の交換量は、播種時の添加量の０．５～２倍であることが好ましく、１～１．５倍であることがより好ましく、等量（１倍）であることがさらに好ましい。
【0112】
一次培養工程の培養期間は、１０日以上であることが好ましく、１４日以上であることがより好ましく、１８日以上であることがさらに好ましい。また、一次培養工程の培養期間は、３０日以下であることが好ましく、２５日以下であることがより好ましく、２２日以下であることがさらに好ましい。
一次培養工程の培養期間を上記の範囲とすることで、外毛根鞘を含む組織からの上皮系細胞を効率よく取得することができる。
例えば、一次培養工程の培養期間は、１０～３０日間、より好ましくは１４～２５日間、さらに好ましくは１８～２２日間することができる。
一次培養工程の培養期間を上記の範囲とすることで、外毛根鞘を含む組織からの上皮系細胞を効率よく取得することができる。
例えば、一次培養工程の培養期間は、１０～３０日間、より好ましくは１４～２５日間、さらに好ましくは１８～２２日間することができる。
【0113】
二次培養工程では、一次培養工程後、二次培地を用いて培養を行う。
好ましくは、一次培養工程において、外毛根鞘から伸展した細胞が規定の大きさ、例えば１ｍｍ以上、好ましくは１ｍｍ～２ｍｍに成長後、二次培養工程を実施する。
好ましくは、一次培養工程において、外毛根鞘から伸展した細胞が規定の大きさ、例えば１ｍｍ以上、好ましくは１ｍｍ～２ｍｍに成長後、二次培養工程を実施する。
【0114】
二次培養工程では、二次培地を用いて、上記の第３ステップＳ１３を実施することが好ましい。
【0115】
二次培養工程の培養期間は、５日以上であることが好ましく、７日以上であることがより好ましく、１０日以上であることがさらに好ましい。また、二次培養工程の培養期間は、２０日以下であることが好ましく、１８日以下であることがより好ましく、１６日以下であることがさらに好ましい。
二次培養工程の培養期間を上記の範囲とすることで、外毛根鞘からのケラチノサイトを効率よく取得することができる。
例えば、二次培養工程の培養期間は、５～２０日間、より好ましくは７～１８日間、さらに好ましくは１０～１６日間とすることができる。
二次培養工程の培養期間を上記の範囲とすることで、外毛根鞘からのケラチノサイトを効率よく取得することができる。
例えば、二次培養工程の培養期間は、５～２０日間、より好ましくは７～１８日間、さらに好ましくは１０～１６日間とすることができる。
【0116】
二次培養工程は、細胞の増殖に合わせ、培地の交換及び補充を行うことが好ましい。
また、二次培養工程は、継代を行うステップを含んでもよい。
培地の交換及び補充、並びに継代の好ましい実施形態は、上記の第３ステップＳ１３における記載の通りである。なお、二次培養工程における第３ステップＳ１３は、培養液の補充ではなく、全量交換を行う形態も好ましい。
また、二次培養工程は、継代を行うステップを含んでもよい。
培地の交換及び補充、並びに継代の好ましい実施形態は、上記の第３ステップＳ１３における記載の通りである。なお、二次培養工程における第３ステップＳ１３は、培養液の補充ではなく、全量交換を行う形態も好ましい。
【0117】
また、本発明は、外毛根鞘を含む組織を播種する前に、サンプルついて細胞外マトリックスの構成成分を分解する分解工程を含まないことが好ましい。
本発明では、上皮性組織を含むサンプルを播種する前に、サンプルをトリプシン、コラゲナーゼ及びディスパーゼから選択される１種又は２種以上で処理する工程を含まない形態が好ましく、トリプシン、コラゲナーゼ及びディスパーゼで処理する工程を含まない形態がより好ましい。
このような細胞外マトリックスの分解を行わないことで、サンプル処理の手間が省けるとともに、サンプルのダメージを最小限とし、本発明にかかる上皮系細胞を、外毛根鞘を含む組織から効率よく増殖させることができる。
本発明では、上皮性組織を含むサンプルを播種する前に、サンプルをトリプシン、コラゲナーゼ及びディスパーゼから選択される１種又は２種以上で処理する工程を含まない形態が好ましく、トリプシン、コラゲナーゼ及びディスパーゼで処理する工程を含まない形態がより好ましい。
このような細胞外マトリックスの分解を行わないことで、サンプル処理の手間が省けるとともに、サンプルのダメージを最小限とし、本発明にかかる上皮系細胞を、外毛根鞘を含む組織から効率よく増殖させることができる。
【0118】
なお、上記実施形態では上皮系細胞を培養する培養工程Ｓ１を含む形態を例示したが、本発明は、後述する（２）の初期化工程Ｓ２から実施してもよい。この場合、市販されたケラチノサイト等の上皮系細胞をｉＰＳ細胞の誘導に用いることができる。このようなケラチノサイトとしては、正常ヒト表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocytes：ＮＨＥＫ）（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）、毛包ケラチノサイト（Hair Follicular Keratinocytes：ＨＨＦＫ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）等が挙げられる。
【0119】
（２）初期化工程Ｓ２
初期化工程Ｓ２は、核の初期化を行うリプログラム遺伝子又はその翻訳産物を上皮系細胞に導入する工程と、リプログラム遺伝子等の導入後の細胞を培養する工程を含む。
初期化工程Ｓ２は、核の初期化を行うリプログラム遺伝子又はその翻訳産物を上皮系細胞に導入する工程と、リプログラム遺伝子等の導入後の細胞を培養する工程を含む。
【0120】
本発明におけるリプログラム遺伝子とは、体細胞からｉＰＳ細胞を誘導することができるタンパク性因子（リプログラム因子）をコードする遺伝子をいう。かかるリプログラム遺伝子は、例えば、Ｏｃｔファミリー、Ｋｌｆファミリー、Ｓｏｘファミリー、Ｍｙｃファミリー、ＬｉｎファミリーおよびＧｌｉｓファミリーのメンバーからなる群より選択される１以上の遺伝子である。
【0121】
本発明にかかるリプログラム遺伝子は、少なくともＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２を含むことが好ましい。さらに、ｃ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８及びＬｉｎ２８ｂから選ばれる１種又は２種以上を含むことが好ましく、より好ましくはｃ－Ｍｙｃ又はＬ－Ｍｙｃと、Ｌｉｎ２８又はＬｉｎ２８ｂをさらに組み合わせることが好ましい。
本発明の好ましい形態では、リプログラム遺伝子の組み合わせは、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ及びＬｉｎ２８である。
本発明の好ましい形態では、リプログラム遺伝子の組み合わせは、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ及びＬｉｎ２８である。
【0122】
本発明では、リプログラム遺伝子をコードする核酸を上皮系細胞へ導入してもよいし、リプログラム遺伝子の翻訳産物（タンパク質）を上皮系細胞へ導入してもよい。また、リプログラム遺伝子をコードする核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡの何れの形態であってもよい。
【0123】
上皮系細胞へのリプログラム遺伝子又はその翻訳産物の導入方法は、特に限定されない。導入方法としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターの感染、各種ベクター（プラスミドベクター、エピソーマルベクター、ＲＮＡベクター等）のリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等による遺伝子導入、マイクロインジェクションによる直接導入等が挙げられる。
本発明では、エピソーマルベクターを用いてリプログラム遺伝子をコードするＤＮＡを導入することが好ましい。また、エピソーマルベクターの導入は、リポフェクション法により行うことが好ましい。
本発明では、エピソーマルベクターを用いてリプログラム遺伝子をコードするＤＮＡを導入することが好ましい。また、エピソーマルベクターの導入は、リポフェクション法により行うことが好ましい。
【0124】
初期化工程Ｓ２では、リプログラム遺伝子等の導入と共に、ｐ５３の機能を阻害することが好ましい。
本発明において「ｐ５３の機能を阻害する」とは、ｐ５３タンパク質に直接的に作用してその機能を阻害することや、ｐ５３タンパク質のシグナル伝達に関与する因子に作用することによりｐ５３タンパク質の機能やｐ５３遺伝子の発現を阻害することをいう。
本発明において「ｐ５３の機能を阻害する」とは、ｐ５３タンパク質に直接的に作用してその機能を阻害することや、ｐ５３タンパク質のシグナル伝達に関与する因子に作用することによりｐ５３タンパク質の機能やｐ５３遺伝子の発現を阻害することをいう。
【0125】
ｐ５３の機能の阻害は、ｐ５３の化学的阻害物質、ｐ５３のドミナントネガティブ変異体、抗ｐ５３アンタゴニスト抗体、ｐ５３応答エレメントのコンセンサス配列を含むデコイ核酸、ｐ５３経路を阻害する物質などを細胞と接触させる方法が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明では、ｐ５３の機能の阻害は、（ａ）ｐ５３の化学的阻害物質、（ｂ）ｐ５３のドミナントネガティブ変異体及びそれをコードする核酸、及び（ｃ）ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びそれらをコードするＤＮＡから選ばれる１又は２以上の物質を導入することにより誘導することができる。
ｐ５３の機能阻害物質の具体例、それらの取得方法および体細胞との接触方法については、ＷＯ ２００９／１５７５９３等を参照することができる。
本発明では、ｐ５３の機能の阻害は、（ａ）ｐ５３の化学的阻害物質、（ｂ）ｐ５３のドミナントネガティブ変異体及びそれをコードする核酸、及び（ｃ）ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びそれらをコードするＤＮＡから選ばれる１又は２以上の物質を導入することにより誘導することができる。
ｐ５３の機能阻害物質の具体例、それらの取得方法および体細胞との接触方法については、ＷＯ ２００９／１５７５９３等を参照することができる。
【0126】
（ａ）ｐ５３の化学的阻害物質としては、Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ－α（ＰＦＴ－α）等の低分子が挙げられる。
（ｂ）ｐ５３のドミナントネガティブ変異体としては、マウスｐ５３の１４－３０１位（ヒトｐ５３では１１－３０４位に対応）のアミノ酸を欠失させたｐ５３ＤＤ（Bowman, T., Genes Develop., 10, 826-835 (1996)）が好ましく挙げられる。
（ｃ）ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡは、マウスまたはヒトのｐ５３ ｃＤＮＡ配列情報に基づいて、既存の方法により設計することができる。
（ｂ）ｐ５３のドミナントネガティブ変異体としては、マウスｐ５３の１４－３０１位（ヒトｐ５３では１１－３０４位に対応）のアミノ酸を欠失させたｐ５３ＤＤ（Bowman, T., Genes Develop., 10, 826-835 (1996)）が好ましく挙げられる。
（ｃ）ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡは、マウスまたはヒトのｐ５３ ｃＤＮＡ配列情報に基づいて、既存の方法により設計することができる。
【0127】
本発明では、上記（ｂ）ｐ５３のドミナントネガティブ変異体及びそれをコードする核酸、及び（ｃ）ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びそれらをコードするＤＮＡから選ばれる１又は２以上の物質を導入することにより、ｐ５３の機能を阻害することが好ましい。
【0128】
より好ましい実施形態では、上記（ｂ）ｐ５３のドミナントネガティブ変異体をコードするＤＮＡ、又は（ｃ）ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを組み込んだベクターを細胞に導入することにより、ｐ５３の機能を阻害する。
なお、本発明では、ｐ５３関連の遺伝子配列と上記リプログラム遺伝子の配列を１つのベクターにコードしていてもよいし、ｐ５３関連の遺伝子配列とリプログラム遺伝子の配列が異なるベクターにコードされていてもよい。後者の場合、ｐ５３関連の遺伝子配列がコードされたベクターとリプログラム遺伝子の配列がコードされたベクターは、混合して同時に細胞内に導入されることが好ましい。
なお、本発明では、ｐ５３関連の遺伝子配列と上記リプログラム遺伝子の配列を１つのベクターにコードしていてもよいし、ｐ５３関連の遺伝子配列とリプログラム遺伝子の配列が異なるベクターにコードされていてもよい。後者の場合、ｐ５３関連の遺伝子配列がコードされたベクターとリプログラム遺伝子の配列がコードされたベクターは、混合して同時に細胞内に導入されることが好ましい。
【0129】
また、本発明では、ｐ５３のドミナントネガティブ変異体（ｐ５３ＤＤ）をコードするＤＮＡ配列を有するエピソーマルベクターを用いることが好ましい。
ここで、好ましい実施の形態では、用いるエピソーマルベクターは、ＥＢＮＡ－１遺伝子配列を含む。さらに、リプログラム因子及びｐ５３ＤＤは、ＣＡＧプロモーターにより制御されることが好ましい。
ここで、好ましい実施の形態では、用いるエピソーマルベクターは、ＥＢＮＡ－１遺伝子配列を含む。さらに、リプログラム因子及びｐ５３ＤＤは、ＣＡＧプロモーターにより制御されることが好ましい。
【0130】
また、本発明で使用するエピソーマルベクターは、１種のリプログラム遺伝子又は複数のリプログラム遺伝子の組み合わせを含む発現カセットを搭載したベクターであることが好ましい。当該発現カセットは、（ｉ）Ｏｃｔ３／４をコードする核酸を含む発現カセット、（ｉｉ）Ｓｏｘ２をコードする核酸及びＫｌｆ４をコードする核酸を含む発現カセット、（ｉｉｉ）Ｌ－Ｍｙｃをコードする核酸及びＬｉｎ２８をコードする核酸を含む発現カセット、並びに（ｉＶ）ｍｍｐ５３ＤＤをコードする核酸を含む発現カセットが好ましく例示できる。当該発現カセットを搭載したベクターとしては、ヒトＯＣＴ３／４をコードしたｐＣＥ－ｈＯＣＴ３／４やｐＣＥ－ｈＯＣＴ３／４－ｓｈｐ５３－Ｆ、ヒトＳｏｘ２とヒトＫｌｆ４をコードしたｐＣＥ－ｈＳＫ、ヒトＬ－ＭｙｃとヒトＬＩＮ２８をコードしたｐＣＥ－ｈＵＬ、マウスｐ５３ＤＤをコードしたｐＣＥ－ｍｐ５３ＤＤ等が好ましく例示できる。本発明では、上記（ｉ）～（ｉＶ）の発現カセットをコードした４種のベクターを全て細胞へ導入することが好ましい。
さらに、本発明で使用するエピソーマルベクターは、リプログラム因子及びｐ５３ＤＤ等をコードせずＥＢＮＡ－１遺伝子配列をコードしたベクター、例えばｐＣＸＢ－ＥＢＮＡ１を含むことが好ましい。
このようなベクターとしては、Ｈｕｍａｎ ｉＰＳ Ｃｅｌｌ ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＴＭ Ｅｐｉｓｏｍａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社製）を好ましく例示できる。
さらに、本発明で使用するエピソーマルベクターは、リプログラム因子及びｐ５３ＤＤ等をコードせずＥＢＮＡ－１遺伝子配列をコードしたベクター、例えばｐＣＸＢ－ＥＢＮＡ１を含むことが好ましい。
このようなベクターとしては、Ｈｕｍａｎ ｉＰＳ Ｃｅｌｌ ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＴＭ Ｅｐｉｓｏｍａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社製）を好ましく例示できる。
【0131】
初期化工程Ｓ２において、上皮系細胞へのリプログラム遺伝子又はその翻訳産物の導入、及び／又はその後の上皮系細胞の培養は、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行うことが好ましい。使用するＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものであれば特に限定されず、例えば、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７、Ｈ－１１５２、Ｗｆ－５３６及びそれらの誘導体、並びにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。
本発明では、１種または２種以上のＲＯＣＫ阻害剤を用いてもよい。
本発明では、１種または２種以上のＲＯＣＫ阻害剤を用いてもよい。
【0132】
本発明では、ＲＯＣＫ阻害剤としてＹ－２７６３２を用いることが好ましい。
使用するＹ－２７６３２の濃度は、例えば、１００ｎＭ～５０μＭ、好ましくは１～３０μＭの範囲で設定することができるがこれに限定されない。本発明では、好ましくは、１０μＭである。
使用するＹ－２７６３２の濃度は、例えば、１００ｎＭ～５０μＭ、好ましくは１～３０μＭの範囲で設定することができるがこれに限定されない。本発明では、好ましくは、１０μＭである。
【0133】
また、初期化工程Ｓ２における上皮系細胞へのリプログラム遺伝子又はその翻訳産物の導入から、付着培養工程Ｓ３までの間の培養は、コーティング剤でコートされた培養面上での付着培養であることが好ましい。
使用するコーティング剤は特に限定されず、上記培養工程Ｓ１で用いた方法を採用することができる。本発明では、コラーゲンＩを用いることが好ましい。
使用するコーティング剤は特に限定されず、上記培養工程Ｓ１で用いた方法を採用することができる。本発明では、コラーゲンＩを用いることが好ましい。
【0134】
（３）付着培養工程Ｓ３
付着培養工程Ｓ３は、初期化工程Ｓ２を経た上皮系細胞を、細胞外基質でコートされた培養面上で、付着培養する工程である。
付着培養工程Ｓ３は、初期化工程Ｓ２を経た上皮系細胞を、細胞外基質でコートされた培養面上で、付着培養する工程である。
【0135】
付着培養工程Ｓ３では、初めに、細胞外基質で表面がコートされた培養器の中に、上皮系細胞を接着させる。
使用する細胞外基質は、ラミニン又はその断片である。用いるラミニンとしては、ラミニンα５β１γ１（ラミニン５１１）、ラミニンα５β２γ１（ラミニン５２１）、ラミニンα４β１γ１（ラミニン４１１）、ラミニンα２β１γ１（ラミニン２１１）、これらのラミニン断片を好適に挙げることができ、ラミニン５１１又はラミニン５２１を用いることがより好ましい。このようなラミニン及びラミニン断片は、組換え体を用いることもできる。
使用する細胞外基質は、ラミニン又はその断片である。用いるラミニンとしては、ラミニンα５β１γ１（ラミニン５１１）、ラミニンα５β２γ１（ラミニン５２１）、ラミニンα４β１γ１（ラミニン４１１）、ラミニンα２β１γ１（ラミニン２１１）、これらのラミニン断片を好適に挙げることができ、ラミニン５１１又はラミニン５２１を用いることがより好ましい。このようなラミニン及びラミニン断片は、組換え体を用いることもできる。
【0136】
上記のラミニン又はラミニン断片は、インテグリン結合部位を有することが好ましい。
また、ラミニン断片は、ヘテロ３量体を形成していることがより好ましい。
ラミニン又はラミニン断片が結合するインテグリンの種類は、インテグリンα６β１、インテグリンα６β４、インテグリンα３β１、インテグリンα７β１であることが好ましく、インテグリンα６β１であることがより好ましい。インテグリンα６β１と結合するラミニン又はラミニン断片を用いることで、ｉＰＳ細胞の増殖を促進させることができる。
これらのインテグリンと結合活性を有するラミニン断片としては、ラミニン５１１、ラミニン５２１、ラミニン４１１およびラミニン２１１から選択される少なくとも１種由来のラミニン断片が好ましく例示でき、ラミニン５１１又はラミニン５２１由来のラミニン断片であることがより好ましく、ラミニン５１１由来のラミニン断片であることがより好ましい。このようなラミニン断片としては、ラミニンをエラスターゼにて消化して得られるＥ８フラグメントや、Ｅ８フラグメントの組み換え体が好ましく挙げられる。
本発明では、ラミニン５１１Ｅ８を用いることがより好ましい。ラミニン５１１Ｅ８としては、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（株式会社ニッピ製）等の市販品を用いることができる。
また、ラミニン断片は、ヘテロ３量体を形成していることがより好ましい。
ラミニン又はラミニン断片が結合するインテグリンの種類は、インテグリンα６β１、インテグリンα６β４、インテグリンα３β１、インテグリンα７β１であることが好ましく、インテグリンα６β１であることがより好ましい。インテグリンα６β１と結合するラミニン又はラミニン断片を用いることで、ｉＰＳ細胞の増殖を促進させることができる。
これらのインテグリンと結合活性を有するラミニン断片としては、ラミニン５１１、ラミニン５２１、ラミニン４１１およびラミニン２１１から選択される少なくとも１種由来のラミニン断片が好ましく例示でき、ラミニン５１１又はラミニン５２１由来のラミニン断片であることがより好ましく、ラミニン５１１由来のラミニン断片であることがより好ましい。このようなラミニン断片としては、ラミニンをエラスターゼにて消化して得られるＥ８フラグメントや、Ｅ８フラグメントの組み換え体が好ましく挙げられる。
本発明では、ラミニン５１１Ｅ８を用いることがより好ましい。ラミニン５１１Ｅ８としては、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（株式会社ニッピ製）等の市販品を用いることができる。
【0137】
付着培養を行う際に用いられる培養器は、細胞が接着可能なものであれば特に限定されず、上記の培養工程Ｓ１にかかる培養器と同様のものを採用できる。
【0138】
付着培養は、最初の継代後、無血清培地を用いて行うことが好ましい。無血清培地として、好ましくはＫＳＲ、又はＢ２７を含む無血清培地、又は、ゼノフリー条件の培地が挙げられる。ここで「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分が排除された条件を意味する。
一方、初期化工程Ｓ２後、最初の継代前は、ウシ下垂体抽出物（Ｂｏｖｉｎｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔ，ＢＰＥ）、組換えヒトインスリン様成長因子－Ｉ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－Ｉ）、ヒドロコルチゾン、ウシトランスフェリン及びヒト上皮細胞成長因子（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を含む培地で培養することが好ましい。
一方、初期化工程Ｓ２後、最初の継代前は、ウシ下垂体抽出物（Ｂｏｖｉｎｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔ，ＢＰＥ）、組換えヒトインスリン様成長因子－Ｉ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－Ｉ）、ヒドロコルチゾン、ウシトランスフェリン及びヒト上皮細胞成長因子（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を含む培地で培養することが好ましい。
【0139】
また、無血清かつゼノフリーの条件下で取得した上皮系細胞を用いる場合には、初期化工程Ｓ２後、最初の継代前は、二次培地を用いて培養することが好ましい。
【0140】
付着培養工程Ｓ３における培養は、フィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）で行われることが好ましい。未分化維持培地として用いられるフィーダーフリー培地は、市販品を用いることができ、例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ１ （ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ２ （ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、又はＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社製）が挙げられる。
なお、フィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）とは、フィーダー細胞を実質的に含まない（例えば、全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が３％以下の）条件を意味する。
なお、フィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）とは、フィーダー細胞を実質的に含まない（例えば、全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が３％以下の）条件を意味する。
【0141】
付着培養工程Ｓ３では、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８を用いることが好ましい。
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に、添加剤として、Ｌ－ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ－２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ、ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｕｍ、ｉｎｓｕｌｉｎ、ＮａＨＣＯ３、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、ｂＦＧＦ、及びＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質（ＴＧＦβ１またはＮｏｄａｌ）を含む。
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に、添加剤として、Ｌ－ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ－２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ、ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｕｍ、ｉｎｓｕｌｉｎ、ＮａＨＣＯ３、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、ｂＦＧＦ、及びＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質（ＴＧＦβ１またはＮｏｄａｌ）を含む。
【0142】
付着培養は、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行うことが好ましい。付着培養で使用するＲＯＣＫ阻害剤、及びその好ましい形態は、上述の初期化工程Ｓ２と同様である。
【0143】
また、付着培養工程Ｓ３においても、初期化工程Ｓ２と同様、ｐ５３の機能を阻害することが好ましい。ｐ５３の機能阻害の手段は、初期化工程Ｓ２で記載した手法を適宜採用することができる。
【0144】
付着培養の期間は、好ましくは５日以上、より好ましくは１０日以上、さらに好ましくは１５日以上である。
付着培養を継続することで、細胞コロニーの出現を確認することができる。その後、既存の手法を用いて、ｉＰＳ細胞の候補コロニーを選択することが好ましい。
ｉＰＳ細胞の候補コロニーの選択は、目視による形態観察、ＴＲＡ１－６０、ＳＳＥＡ４等のｉＰＳ細胞特異的な表面抗原の発現確認等により実施することもできる。
付着培養を継続することで、細胞コロニーの出現を確認することができる。その後、既存の手法を用いて、ｉＰＳ細胞の候補コロニーを選択することが好ましい。
ｉＰＳ細胞の候補コロニーの選択は、目視による形態観察、ＴＲＡ１－６０、ＳＳＥＡ４等のｉＰＳ細胞特異的な表面抗原の発現確認等により実施することもできる。
【0145】
初期化工程Ｓ２及び付着培養工程Ｓ３では、ｉＰＳ細胞の樹立効率をより高めるため、樹立効率改善作用を有する公知の物質を用いてもよい。
このような物質としては、例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ １２９３、Ｍ３４４等のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、５’－アザシチジン等のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ＢＩＸ－０１２９４等のＧ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、Ｂａｙｋ８６４４等のＬ－チャネルカルシウムアゴニスト、ｐ３８阻害剤、ＵＴＦ１、Ｗｎｔシグナリングアクチベーター、ＰＳ４８等の３’－ホスホイノシチド－依存性キナーゼ－１（ＰＤＫ１）アクチベーター等が挙げられるが、それらに限定されない。
このような物質としては、例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ １２９３、Ｍ３４４等のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、５’－アザシチジン等のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ＢＩＸ－０１２９４等のＧ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、Ｂａｙｋ８６４４等のＬ－チャネルカルシウムアゴニスト、ｐ３８阻害剤、ＵＴＦ１、Ｗｎｔシグナリングアクチベーター、ＰＳ４８等の３’－ホスホイノシチド－依存性キナーゼ－１（ＰＤＫ１）アクチベーター等が挙げられるが、それらに限定されない。
【0146】
本発明により製造されたｉＰＳ細胞は、医薬原料やスクリーニング材料等、種々の方法で利用することができる。例えば、既存の分化誘導法を利用して、ｉＰＳ細胞から筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞、上皮細胞等の種々の細胞を製造することができる。また、分化させた細胞を用いて、医薬候補化合物の薬効や毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングを行うこともできる。
さらに、被検者のサンプル（例えば、毛）を用いてｉＰＳ細胞を樹立し、被検者固有のｉＰＳ細胞から分化させた皮膚組織等を用いることで、各被検者に応じた医薬品・化粧料等の有効性を確認することができる。
さらに、被検者のサンプル（例えば、毛）を用いてｉＰＳ細胞を樹立し、被検者固有のｉＰＳ細胞から分化させた皮膚組織等を用いることで、各被検者に応じた医薬品・化粧料等の有効性を確認することができる。
【0147】
また、本発明の一実施形態では、培養工程Ｓ１、初期化工程Ｓ２及び付着培養工程Ｓ３の何れも、無血清かつゼノフリー条件で実施することが可能である。すなわち、本発明は、一連の製造工程を、無血清かつゼノフリー条件で実施することができる。
【0148】
＜上皮系細胞の培養方法＞
本発明は、上皮性組織を含むサンプルを、無血清及び／又はゼノフリー条件で培養することを含む、上皮系細胞の培養方法にも関する。
本発明の上皮系細胞の培養方法（以下、本発明の培養方法という）は、無血清及び／又はゼノフリー条件下の培養により、上皮系細胞を取得するものである。そして、本発明の培養方法は、上記の＜上皮系細胞を用いた人工多能性幹細胞の製造方法＞における培養工程Ｓ１の無血清及び／又はゼノフリー条件での培養方法にかかるものである。
本発明は、上皮性組織を含むサンプルを、無血清及び／又はゼノフリー条件で培養することを含む、上皮系細胞の培養方法にも関する。
本発明の上皮系細胞の培養方法（以下、本発明の培養方法という）は、無血清及び／又はゼノフリー条件下の培養により、上皮系細胞を取得するものである。そして、本発明の培養方法は、上記の＜上皮系細胞を用いた人工多能性幹細胞の製造方法＞における培養工程Ｓ１の無血清及び／又はゼノフリー条件での培養方法にかかるものである。
【0149】
本発明の培養方法において培養する「上皮系細胞」は、上皮性組織を含むサンプルを培養し得られる細胞集団であり、上皮細胞マーカーを発現する上皮細胞（例えば、ケラチノサイト）や、上皮幹細胞マーカーを発現する幹細胞（例えば、毛包幹細胞（ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ （ＨＦＳＣ））を含む。
本発明では、上皮系細胞は、ケラチノサイトを含むことができ、好ましくは毛包ケラチノサイトを含む。
本発明では、上皮系細胞は、ケラチノサイトを含むことができ、好ましくは毛包ケラチノサイトを含む。
【0150】
また、本発明の培養方法は、好ましくは、初代培養のための培養方法である。
本発明における初代培養とは、採取したサンプルを播種した後の培養のことをいう。
本発明における初代培養とは、採取したサンプルを播種した後の培養のことをいう。
【0151】
本発明にかかる上皮性組織は、本発明の培養方法の目的物である上皮系細胞を含む組織であることが好ましい。
本発明で使用する上皮性組織を含むサンプルは、上皮系組織から取得されたものであれば特に限定されず、例えば毛包の上皮性組織を使用できる。本発明では、上皮性組織を含むサンプルとして、外毛根鞘を含む組織を用いることが好ましい。また、本発明で使用する上皮性組織を含むサンプルは、バルジ領域に存在した細胞を含むことができる。
本発明で使用する上皮性組織を含むサンプルは、上皮系組織から取得されたものであれば特に限定されず、例えば毛包の上皮性組織を使用できる。本発明では、上皮性組織を含むサンプルとして、外毛根鞘を含む組織を用いることが好ましい。また、本発明で使用する上皮性組織を含むサンプルは、バルジ領域に存在した細胞を含むことができる。
【0152】
上皮性組織を含むサンプルは、哺乳動物（例えば、ヒト等）から採取したものを使用することができる。本発明の培養方法では、ヒトから採取した組織を用いることが好ましい。
【0153】
使用する組織の取得方法は、既存の組織採取法を採用することができる。外毛根鞘を含むサンプルを採取する場合、バイオプシー又は毛を抜去することにより、行うことができる。非侵襲性の観点から、毛を抜去することにより、サンプルを取得することが好ましい。
【0154】
抜去により取得した毛は、毛球より上部に外毛根鞘が付着している。本発明では、外毛根鞘を含むサンプルは、毛に付着した状態で培養されることが好ましい。
【0155】
本発明の培養方法の好ましい実施の形態（任意の消毒工程、第１ステップＳ１１～第３ステップＳ１３による培養等）は、上記の＜上皮系細胞を用いた人工多能性幹細胞の製造方法＞における培養工程Ｓ１の記載を援用する。この場合、「外毛根鞘を含む組織（サンプル）」は、適宜「上皮性組織を含むサンプル」と読み替えることができる。
【実施例】
【0156】
以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、以下の実施例に限定されない。
【0157】
＜実施例１＞
（１）使用試薬等
（ａ）ＥｐｉＬｉｆｅ培地
５００ｍｌ容量のＥｐｉＬｉｆｅＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ， ｗｉｔｈ ６０μＭ ｃａｌｃｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）にＨｕｍａｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＨＫＧＳ、Ｇｉｂｃｏ）の全量（５ｍＬ）、ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（ナカライテスク）を５ｍＬ、Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ－Ｂを５００μＬ加え、混合した。
（ｂ）ＭＥＦ－Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地
ＥｍｂｒｙｏＭａｘ（登録商標）ＭＥＦ順化培地（メルク）１０ｍＬに対して、ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（ナカライテスク）を０．１ｍＬ、Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ－Ｂを１０μＬ、ＨＫＧＳ（Ｇｉｂｃｏ）を０．１ｍＬ加え、混合した。
（ｃ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｉｘ
２４７ｍｌのＨＢＳＳを滅菌容器に移し、２．５ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（終濃度１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）、２５０μＬのＡｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（終濃度２５０ｎｇ／ｍｌ）を加えた。
（ｄ）形質転換溶液
Ｈｕｍａｎ ｉＰＳ Ｃｅｌｌ ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＴＭ Ｅｐｉｓｏｍａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ）とＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を混合し、さらにＦｕＧＥＮＥ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（プロメガ）を加えて室温で２０分間静置した。形質転換の直前に、ＥｐｉＬｉｆｅ培地を加えた。
（ｅ）コラーゲンコーティング
コラーゲン酸性溶液Ｉ－ＰＣ（アテロコラーゲン）５ｍｇ／ｍＬを１ｍＭ塩酸で１０倍希釈し、希釈したコラーゲン溶液を、細胞培養用の１２ｗｅｌｌプレートの場合は４００μＬ／ｗｅｌｌ、６ｗｅｌｌプレートの場合は１０００μＬ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で１時間以上静置した後、アスピレーターで除去した。その後、ＰＢＳで３回洗浄してから使用した。
（ｆ）ｉＭａｔｒｉｘコーティング
ＤＰＢＳ（－／－）１ｍＬに対してｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ニッピ）４．５μＬで希釈し、希釈液を細胞培養用の１２ｗｅｌｌプレートに５００μＬ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で１時間又は４℃で一晩静置した。その後、希釈液を除去して使用した。
（１）使用試薬等
（ａ）ＥｐｉＬｉｆｅ培地
５００ｍｌ容量のＥｐｉＬｉｆｅＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ， ｗｉｔｈ ６０μＭ ｃａｌｃｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）にＨｕｍａｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＨＫＧＳ、Ｇｉｂｃｏ）の全量（５ｍＬ）、ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（ナカライテスク）を５ｍＬ、Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ－Ｂを５００μＬ加え、混合した。
（ｂ）ＭＥＦ－Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地
ＥｍｂｒｙｏＭａｘ（登録商標）ＭＥＦ順化培地（メルク）１０ｍＬに対して、ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（ナカライテスク）を０．１ｍＬ、Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ－Ｂを１０μＬ、ＨＫＧＳ（Ｇｉｂｃｏ）を０．１ｍＬ加え、混合した。
（ｃ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｉｘ
２４７ｍｌのＨＢＳＳを滅菌容器に移し、２．５ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（終濃度１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）、２５０μＬのＡｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（終濃度２５０ｎｇ／ｍｌ）を加えた。
（ｄ）形質転換溶液
Ｈｕｍａｎ ｉＰＳ Ｃｅｌｌ ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＴＭ Ｅｐｉｓｏｍａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ）とＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を混合し、さらにＦｕＧＥＮＥ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（プロメガ）を加えて室温で２０分間静置した。形質転換の直前に、ＥｐｉＬｉｆｅ培地を加えた。
（ｅ）コラーゲンコーティング
コラーゲン酸性溶液Ｉ－ＰＣ（アテロコラーゲン）５ｍｇ／ｍＬを１ｍＭ塩酸で１０倍希釈し、希釈したコラーゲン溶液を、細胞培養用の１２ｗｅｌｌプレートの場合は４００μＬ／ｗｅｌｌ、６ｗｅｌｌプレートの場合は１０００μＬ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で１時間以上静置した後、アスピレーターで除去した。その後、ＰＢＳで３回洗浄してから使用した。
（ｆ）ｉＭａｔｒｉｘコーティング
ＤＰＢＳ（－／－）１ｍＬに対してｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ニッピ）４．５μＬで希釈し、希釈液を細胞培養用の１２ｗｅｌｌプレートに５００μＬ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で１時間又は４℃で一晩静置した。その後、希釈液を除去して使用した。
【0158】
（２）上皮系細胞の培養
対象者（ヒト）の毛髪を５本抜いた後、直ぐにＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｉｘに一瞬浸した。次いで、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｉｘ内で毛の外毛根鞘を含む部分を１～２ｍｍ切り出し、コラーゲン溶液（コラーゲン酸性溶液Ｉ－ＰＣ、終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ（アテロコラーゲン））でコートされた１２ｗｅｌｌプレートの混合培地（ＥｐｉＬｉｆｅ＋ＭＥＦ－Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地＋Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｉｘ）２５０μＬ中に１ｗｅｌｌあたり１サンプルずつ播種した。
対象者（ヒト）の毛髪を５本抜いた後、直ぐにＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｉｘに一瞬浸した。次いで、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｉｘ内で毛の外毛根鞘を含む部分を１～２ｍｍ切り出し、コラーゲン溶液（コラーゲン酸性溶液Ｉ－ＰＣ、終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ（アテロコラーゲン））でコートされた１２ｗｅｌｌプレートの混合培地（ＥｐｉＬｉｆｅ＋ＭＥＦ－Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地＋Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｉｘ）２５０μＬ中に１ｗｅｌｌあたり１サンプルずつ播種した。
【0159】
播種１日後又は２日後に上記混合培地を２５０μＬ補充し、さらに播種３日後に上記混合培地を５００μＬ補充した。そして、播種３日後の時点で培地の総液量が０．７５ｍＬ程度であることを確認し、播種６日後まで静置培養した。
【0160】
播種６日後の時点で、増殖した細胞が毛幹を中心に半径１～２ｍｍ以上伸長していない場合、混合培地を２５０μＬ除き、ＭＥＦ－Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地を２５０μＬ補充した。このＭＥＦ－Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地の交換は、細胞が半径１～２ｍｍ以上の大きさとなるまで行った。
【0161】
次いで、増殖した細胞が毛幹を中心に半径１～２ｍｍ以上伸展していることを確認後、培地の交換を行った。培地交換では、上記の混合培地を全て取り除き、ＥｐｉＬｉｆｅ培地を５００μＬ加えた。なお、播種６日後の時点で細胞が毛幹を中心に半径１～２ｍｍ以上伸展していた場合、上記のＭＥＦ－Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地の交換を行わずに、ＥｐｉＬｉｆｅ培地による培地交換を実施した。
【0162】
培地交換の２日後に、再度ＥｐｉＬｉｆｅ培地５００μＬを補充し、この培地補充の２日後にＥｐｉＬｉｆｅ培地５００μＬで培地を交換した。そして、２日に１回の頻度で同様に培地の補充及び交換を継続した。
【0163】
外毛根鞘から増殖した細胞の展開領域において、細胞が過密になる前に、具体的には５０～８０％コンフルエントとなったら、ＥｐｉＬｉｆｅ培地を除去してＤＰＢＳで洗浄した。次いで、ＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ）を０．５ｍＬ加えて３７℃インキュベーターに静置後、ピペッティングにより細胞をプレートから剥がし、細胞を１５ｍＬチューブに回収した。回収した細胞を遠心分離後、上清を除去してＭＥＦ－Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地１ｍＬに懸濁した。
次いで、コラーゲン溶液（コラーゲン酸性溶液Ｉ－ＰＣ、終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ（アテロコラーゲン））でコートされた６ｗｅｌｌプレートに、５万／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種し、３７℃インキュベーターで培養した。５００μＬのＥｐｉＬｉｆｅ培地による培地交換を行いつつ、５０～８０％コンフルエントとなるまで継続した。５０～８０％コンフルエントとなった段階で、ｉＰＳ細胞の誘導を実施した。
次いで、コラーゲン溶液（コラーゲン酸性溶液Ｉ－ＰＣ、終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ（アテロコラーゲン））でコートされた６ｗｅｌｌプレートに、５万／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種し、３７℃インキュベーターで培養した。５００μＬのＥｐｉＬｉｆｅ培地による培地交換を行いつつ、５０～８０％コンフルエントとなるまで継続した。５０～８０％コンフルエントとなった段階で、ｉＰＳ細胞の誘導を実施した。
【0164】
（３）ｉＰＳ細胞の誘導
初めに、ＥｐｉＬｉｆｅ培地を形質転換溶液に交換し、３７℃インキュベーターで４時間静置後、１０μＭのＹ２７６３２を含むＥｐｉＬｉｆｅ培地（Ｙ２７６３２含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地）２ｍＬに培地を交換して培養した。
翌日、培地を除去してＤＰＢＳ（－／－）で洗浄後、ＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔを１ｍＬ加えて３７℃インキュベーターに静置し、ピペッティングにより細胞をプレートから剥がした。さらにトリプシン中和液（クラボウ）を２ｍＬ加えた後、Ｙ２７６３２含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地を３ｍＬ加え、細胞を１５ｍＬチューブに回収した。回収した細胞を遠心分離後、上清を除去して、Ｙ２７６３２含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地１ｍＬに懸濁した。
初めに、ＥｐｉＬｉｆｅ培地を形質転換溶液に交換し、３７℃インキュベーターで４時間静置後、１０μＭのＹ２７６３２を含むＥｐｉＬｉｆｅ培地（Ｙ２７６３２含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地）２ｍＬに培地を交換して培養した。
翌日、培地を除去してＤＰＢＳ（－／－）で洗浄後、ＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔを１ｍＬ加えて３７℃インキュベーターに静置し、ピペッティングにより細胞をプレートから剥がした。さらにトリプシン中和液（クラボウ）を２ｍＬ加えた後、Ｙ２７６３２含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地を３ｍＬ加え、細胞を１５ｍＬチューブに回収した。回収した細胞を遠心分離後、上清を除去して、Ｙ２７６３２含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地１ｍＬに懸濁した。
【0165】
次いで、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ニッピ）をコーティングした１２ｗｅｌｌプレートに対して１万細胞／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種し、３７℃インキュベーターで培養した（継代０日目）。継代１～３日後は、毎日、１０μＭ Ｙ２７６３２を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地（Ｙ２７６３２含有Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８）を加えた。継代４日後にはＹ２７６３２含有Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８で培地を全量交換し、その後は各日で培地交換を行った。
【0166】
（４）免疫組織染色
継代１日後に、ｉＰＳ細胞マーカー遺伝子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＴＲＡ１－８１）の細胞免疫染色を以下の手順で実施した。
継代１日後に、ｉＰＳ細胞マーカー遺伝子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＴＲＡ１－８１）の細胞免疫染色を以下の手順で実施した。
【0167】
初めに、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含むＰＢＳを添加し１０分間静置することで透過処理を行い、さらに１０％ヤギ血清を含むＰＢＳで３０分間ブロッキングを行った。
【0168】
続いて、細胞をＰＢＳで洗浄後、一次抗体を添加して４℃で一晩静置した。再度ＰＢＳで洗浄後、蛍光標識された二次抗体（Ａｌｅｘａ６４７又はＡｌｅｘａ４８８）とＤａｐｉを添加して３０分間静置した。ＰＢＳで洗浄後、蛍光顕微鏡により蛍光画像を取得した。
【0169】
（５）結果
図２は、（２）上皮系細胞の培養において、１２ｗｅｌｌプレート播種１２日後における、外毛根鞘から伸長した上皮系細胞の状態を示す。図２に示す通り、外毛根鞘周辺から、上皮系細胞が多数増殖していることが確認された。
図２は、（２）上皮系細胞の培養において、１２ｗｅｌｌプレート播種１２日後における、外毛根鞘から伸長した上皮系細胞の状態を示す。図２に示す通り、外毛根鞘周辺から、上皮系細胞が多数増殖していることが確認された。
【0170】
また、図３は、（３）ｉＰＳ細胞の誘導における、継代２０日後の細胞の様子を示す。
図３に示す通り、実施例１の製造方法を実施することにより、ｉＰＳ細胞のコロニーが多数確認された。
さらに、図４より、増殖した細胞がｉＰＳ細胞マーカーを発現しており、多能性を獲得したｉＰＳ細胞を製造できたことが示された。
図３に示す通り、実施例１の製造方法を実施することにより、ｉＰＳ細胞のコロニーが多数確認された。
さらに、図４より、増殖した細胞がｉＰＳ細胞マーカーを発現しており、多能性を獲得したｉＰＳ細胞を製造できたことが示された。
【0171】
＜比較例１＞
実施例１の（３）ｉＰＳ細胞の誘導において、使用する細胞外基質をビトロネクチンに変更した以外は、実施例１と同様の手順でｉＰＳ細胞の誘導を実施した。
結果、ビトロネクチンをコーティングしたプレートを使用した比較例１は、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１をコーティングしたプレートを使用した実施例１と異なり、アポトーシスが誘導され、継代１週間後にはほぼ全ての細胞が死滅した。
実施例１の（３）ｉＰＳ細胞の誘導において、使用する細胞外基質をビトロネクチンに変更した以外は、実施例１と同様の手順でｉＰＳ細胞の誘導を実施した。
結果、ビトロネクチンをコーティングしたプレートを使用した比較例１は、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１をコーティングしたプレートを使用した実施例１と異なり、アポトーシスが誘導され、継代１週間後にはほぼ全ての細胞が死滅した。
【0172】
＜比較例２＞
実施例１の（３）ｉＰＳ細胞の誘導において、使用するエピソーマルベクターを、ｐ５３阻害活性を持たないＥｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に変更した。その際、用いるベクター以外は、実施例１と同様の手順でｉＰＳ細胞の誘導を実施して、ｉＰＳ細胞のコロニー形成数を確認した。
その結果、比較例２に比べて、実施例１におけるｉＰＳ細胞のコロニー形成率が格段に優れていることがわかった。
実施例１の（３）ｉＰＳ細胞の誘導において、使用するエピソーマルベクターを、ｐ５３阻害活性を持たないＥｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に変更した。その際、用いるベクター以外は、実施例１と同様の手順でｉＰＳ細胞の誘導を実施して、ｉＰＳ細胞のコロニー形成数を確認した。
その結果、比較例２に比べて、実施例１におけるｉＰＳ細胞のコロニー形成率が格段に優れていることがわかった。
【0173】
＜考察＞
上記実施例１、及び比較例１～２の結果より、本発明の製造方法である実施例１を用いれば、ｉＰＳ細胞のコロニーを効率よく取得することができることが明らかになった。具体的には、比較例１の結果から、ｉＰＳ細胞の付着培養時、ｉＭａｔｒｉｘ等のラミニン断片がコートされた接着面上で培養することにより、細胞のアポトーシスが抑制され、ｉＰＳ細胞の増殖が促進されることが明らかとなった。
また、比較例２の結果より、リプログラム因子の導入時にｐ５３の機能阻害を行うことで、ｉＰＳ細胞コロニーの形成が促進させることが示された。すなわち、リプログラム因子の発現時、同時にｐ５３の機能阻害を行うことで、ｉＰＳ細胞コロニーの形成を促進させ、ｉＰＳ細胞の製造効率を向上させることができるといえる。
上記実施例１、及び比較例１～２の結果より、本発明の製造方法である実施例１を用いれば、ｉＰＳ細胞のコロニーを効率よく取得することができることが明らかになった。具体的には、比較例１の結果から、ｉＰＳ細胞の付着培養時、ｉＭａｔｒｉｘ等のラミニン断片がコートされた接着面上で培養することにより、細胞のアポトーシスが抑制され、ｉＰＳ細胞の増殖が促進されることが明らかとなった。
また、比較例２の結果より、リプログラム因子の導入時にｐ５３の機能阻害を行うことで、ｉＰＳ細胞コロニーの形成が促進させることが示された。すなわち、リプログラム因子の発現時、同時にｐ５３の機能阻害を行うことで、ｉＰＳ細胞コロニーの形成を促進させ、ｉＰＳ細胞の製造効率を向上させることができるといえる。
【0174】
＜実施例２＞
（１）使用試薬等
実施例１と重複する試薬については、適宜省略する。
（ａ）混合培地Ａ（一次培地）
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加済み）を９０％、ＣＴＳ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＳＲ ＸｅｎｏＦｒｅｅ（Ｇｉｂｃｏ）を１０％含む培地に、ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（終濃度がペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌとなるように投入、ナカライテスク）、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｓ７（Ｇｉｂｃｏ、終濃度は原液の１００倍希釈）、ＥＧＦ（上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ヒト、富士フイルム和光純薬）を２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＧＦ－Ｉ（インスリン様成長因子１）を２０ｎｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾンを２００ｎｇ／ｍｌ、及びトランスフェリンを１０μｇ／ｍｌ加えた。
（ｂ）混合培地Ｂ（二次培地）
混合培地ＡのＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地を、ＥｐｉＬｉｆｅＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ，ｗｉｔｈ ６０μＭ ｃａｌｃｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）に換え、それ以外の条件は混合培地Ａと同様にして、混合培地Ｂを作製した。
（１）使用試薬等
実施例１と重複する試薬については、適宜省略する。
（ａ）混合培地Ａ（一次培地）
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加済み）を９０％、ＣＴＳ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＳＲ ＸｅｎｏＦｒｅｅ（Ｇｉｂｃｏ）を１０％含む培地に、ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（終濃度がペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌとなるように投入、ナカライテスク）、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｓ７（Ｇｉｂｃｏ、終濃度は原液の１００倍希釈）、ＥＧＦ（上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ヒト、富士フイルム和光純薬）を２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＧＦ－Ｉ（インスリン様成長因子１）を２０ｎｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾンを２００ｎｇ／ｍｌ、及びトランスフェリンを１０μｇ／ｍｌ加えた。
（ｂ）混合培地Ｂ（二次培地）
混合培地ＡのＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地を、ＥｐｉＬｉｆｅＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ，ｗｉｔｈ ６０μＭ ｃａｌｃｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）に換え、それ以外の条件は混合培地Ａと同様にして、混合培地Ｂを作製した。
【0175】
（２）上皮系細胞の培養
上記実施例１と同様の手順で、対象者（ヒト）から抜去により毛を取得し、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｉｘで消毒した。次いで、コラーゲンでコーティングした１２ｗｅｌｌプレートの混合培地Ａ２５０μＬ中に、１ｗｅｌｌあたり１サンプルずつ播種した。
上記実施例１と同様の手順で、対象者（ヒト）から抜去により毛を取得し、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｉｘで消毒した。次いで、コラーゲンでコーティングした１２ｗｅｌｌプレートの混合培地Ａ２５０μＬ中に、１ｗｅｌｌあたり１サンプルずつ播種した。
【0176】
播種１日後又は２日後に混合培地Ａを２５０μＬ補充し、さらに播種３日後に混合培地Ａを２５０μＬ補充した。そして、播種３日後の時点で培地の総液量が０．７５ｍＬ程度であることを確認し、播種６日後まで静置培養した。
【0177】
播種６日後、培地２５０μＬを除き、新たに２５０μＬの混合培地Ａと交換した。細胞が毛幹を中心に半径１～２ｍｍ以上伸展するまで、１日おきに、混合培地Ａで同様に培地交換を行った。混合培地Ａを用いた培養は、２～３週間行った。
【0178】
次いで、増殖した細胞が毛幹を中心に半径１～２ｍｍ以上伸展していることを確認後、混合培地Ｂによる培地交換を行った。混合培地Ｂの交換では、混合培地Ａを全て取り除き、混合培地Ｂを５００μＬ加えた。
【0179】
培地交換の２日後に、５００μＬの混合培地Ｂで全量培地交換した。その後は、２日に１回の頻度で同様に培地の全量交換を継続した。
【0180】
混合培地Ｂにて１～２週間培養後、外毛根鞘から増殖した細胞の展開領域において、細胞が過密になる前に、具体的には５０～８０％コンフルエントとなったら、培地を除去してＤＰＢＳで洗浄した。次いで、ＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ）を０．５ｍＬ加えて３７℃インキュベーターに静置後、ピペッティングにより細胞をプレートから剥がし、細胞を１５ｍＬチューブに回収した。回収した細胞を遠心分離後、上清を除去して１ｍＬの混合培地Ｂに懸濁した。
次いで、コラーゲン溶液でコートされた６ｗｅｌｌプレートに、５万／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種し、３７℃インキュベーターで培養した。５００μＬの混合培地Ｂによる培地交換を行いつつ、５０～８０％コンフルエントとなるまで継続した。５０～８０％コンフルエントとなった段階で、ｉＰＳ細胞の誘導を実施した。
次いで、コラーゲン溶液でコートされた６ｗｅｌｌプレートに、５万／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種し、３７℃インキュベーターで培養した。５００μＬの混合培地Ｂによる培地交換を行いつつ、５０～８０％コンフルエントとなるまで継続した。５０～８０％コンフルエントとなった段階で、ｉＰＳ細胞の誘導を実施した。
【0181】
（３）ｉＰＳ細胞の誘導
形質転換後の培養で使用するＹ２７６３２含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地を、１０μＭのＹ２７６３２を含む混合培地Ｂにした以外は、実施例１と同様の手順でｉＰＳ細胞の誘導を実施した。得られた細胞を実施例１と同様に免疫組織染色を行ったところ、ｉＰＳ細胞マーカーを発現していることが確認された。また、取得した細胞の三胚葉分化能が確認された。
形質転換後の培養で使用するＹ２７６３２含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地を、１０μＭのＹ２７６３２を含む混合培地Ｂにした以外は、実施例１と同様の手順でｉＰＳ細胞の誘導を実施した。得られた細胞を実施例１と同様に免疫組織染色を行ったところ、ｉＰＳ細胞マーカーを発現していることが確認された。また、取得した細胞の三胚葉分化能が確認された。
【0182】
実施例２の結果より、無血清かつゼノフリーの条件下で、抜毛により取得した組織から上皮系細胞を取得できることが示された（図５参照）。そして、当該上皮系細胞を用いて、無血清かつゼノフリーの条件でｉＰＳ細胞を誘導することができた。すなわち、本発明によれば、無血清かつゼノフリー条件で、抜毛により取得した組織を用いてｉＰＳ細胞を製造できる。
【0183】
また、図６は実施例２で得たｉＰＳ細胞の様子を示し、図７は図６のｉＰＳ細胞における、ｉＰＳ細胞マーカー遺伝子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＴＲＡ１－８１）の細胞免疫染色の結果を示す。これにより、増殖したｉＰＳ細胞が複数のｉＰＳ細胞マーカーを発現し、多能性を有することが確認された。
【0184】
［実施例３］上皮系細胞のマーカー発現
実施例１の（２）上皮系細胞の培養において得られた上皮系細胞について、上皮細胞マーカーの発現を確認した。上皮細胞マーカーは、１２ｗｅｌｌプレート播種７日後の細胞を用いて、上記（４）免疫組織染色と同様の手順で、一次抗体としてケラチン１４（Ｋｅｒａｔｉｎ－１４；ＫＲＴ１４）及びＣＤ２００、二次抗体としてＡｌｅｘａ６４７又はＡｌｅｘａ４８８を用いて実施した。
結果、得られた細胞は、ＫＲＴ１４及びＣＤ２００を何れも発現した上皮細胞であることが確認された（図８）。
実施例１の（２）上皮系細胞の培養において得られた上皮系細胞について、上皮細胞マーカーの発現を確認した。上皮細胞マーカーは、１２ｗｅｌｌプレート播種７日後の細胞を用いて、上記（４）免疫組織染色と同様の手順で、一次抗体としてケラチン１４（Ｋｅｒａｔｉｎ－１４；ＫＲＴ１４）及びＣＤ２００、二次抗体としてＡｌｅｘａ６４７又はＡｌｅｘａ４８８を用いて実施した。
結果、得られた細胞は、ＫＲＴ１４及びＣＤ２００を何れも発現した上皮細胞であることが確認された（図８）。
【産業上の利用可能性】
【0185】
本発明は、ｉＰＳ細胞の誘導方法の効率化、ｉＰＳ細胞を用いた医薬製剤の開発等に応用することができる。
【符号の説明】
【0186】
Ｓ１ 培養工程
Ｓ１１ 第１ステップ
Ｓ１２ 第２ステップ
Ｓ１３ 第３ステップ
Ｓ２ 初期化工程
Ｓ３ 付着培養工程
Ｓ１１ 第１ステップ
Ｓ１２ 第２ステップ
Ｓ１３ 第３ステップ
Ｓ２ 初期化工程
Ｓ３ 付着培養工程
【要約】
本発明は、ケラチノサイト等の上皮系細胞を用いてｉＰＳ細胞を製造することができる、新規な技術を提供することを第１の課題とする。
上記課題を解決するための本発明は、核の初期化を行うリプログラム遺伝子又はその翻訳産物を、上皮系細胞に導入することを含む初期化工程と、
前記初期化工程を経た細胞を、ラミニン又はその断片でコートされた培養面上で付着培養する付着培養工程と、
を備える、上皮系細胞を用いた人工多能性幹細胞の製造方法である。
上記課題を解決するための本発明は、核の初期化を行うリプログラム遺伝子又はその翻訳産物を、上皮系細胞に導入することを含む初期化工程と、
前記初期化工程を経た細胞を、ラミニン又はその断片でコートされた培養面上で付着培養する付着培養工程と、
を備える、上皮系細胞を用いた人工多能性幹細胞の製造方法である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】