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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-18
(45)【発行日】2024-09-27
(54)【発明の名称】腫瘍を治療するための物質および方法
(51)【国際特許分類】
   A61K 39/395 20060101AFI20240919BHJP
   A61P 35/00 20060101ALI20240919BHJP
【FI】
A61K39/395 N ZNA
A61P35/00
【請求項の数】 15
(21)【出願番号】P 2022500131
(86)(22)【出願日】2020-07-03
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-07
(86)【国際出願番号】 CN2020100232
(87)【国際公開番号】W WO2021000953
(87)【国際公開日】2021-01-07
【審査請求日】2023-04-13
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/094751
(32)【優先日】2019-07-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】518320030
【氏名又は名称】江蘇康寧杰瑞生物制薬有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】徐 霆
(72)【発明者】
【氏名】郭 康平
(72)【発明者】
【氏名】汪 ▲シャオ▼▲シャオ▼
(72)【発明者】
【氏名】王 ▲ピー▼琳
(72)【発明者】
【氏名】金 宇▲ハオ▼
(72)【発明者】
【氏名】李 倩
【審査官】川合 理恵
(56)【参考文献】
【文献】欧州特許出願公開第03459597(EP,A1)
(58)【調査した分野】(Int.Cl.,DB名)
A61K
A61P
CAplus/REGISTRY/MEDLINE/EMBASE/BIOSIS(STN)
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
CTLA4結合タンパク質を含有する腫瘍を治療するために使用される医薬組成物であって、
前記CTLA4結合タンパク質は、CTLA4に特異的に結合し、CTLA4への結合がCTLA4リガンドと競合せず
前記CTLA4結合タンパク質は、抗体重鎖可変領域及び抗体Fcドメインを有し、
前記抗体重鎖可変領域は、リンカーを介して前記抗体Fcドメインと融合しており、 前記抗体重鎖可変領域は、配列番号8及び17~20のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有し、
前記抗体FcドメインはIgG抗体に由来するものである、
医薬組成物。
【請求項2】
前記CTLA4のリガンドは、CD80およびCD86から選ばれる、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記CTLA4結合タンパク質は、前記CTLA4への結合ipilimumabである参照抗体と競合しない、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記CTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4およびサルCTLA4に結合する、請求項1~3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記CTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のABEDC”鎖、A’Bループ、C”Dループ、DEループおよび/またはEFループにおける1つまたは複数のアミノ酸に結合または認識する、請求項1~4のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記CTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のC’鎖、C”Dループおよび/またはDEループにおける1つまたは複数のアミノ酸に結合または認識する、請求項1~5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記CTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4におけるE48、V49、D65、L84、D88およびY92からなる群から選ばれるアミノ酸残基を認識または結合する、請求項1~6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記CTLA4結合タンパク質は、さらに、ヒトCTLA4におけるV46、T47、D64、I67およびG83からなる群から選ばれるアミノ酸残基を認識または結合する、請求項7に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記CTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4におけるV46、T47、E48、V49、D64、D65、I67、G83、L84、D88およびY92からなるアミノ酸残基の1つまたは複数を含む配座エピトープを認識または結合する、請求項1~8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記CTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4におけるE48、V49、D65、L84、D88およびY92からなるアミノ酸残基を含む配座エピトープを認識または結合する、請求項1~9のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記CTLA4結合タンパク質は、前記CTLA4への結合を、ヒトCTLA4におけるK95、E97、M99、Y104、L106およびI108からなるアミノ酸残基の1つまたは複数を認識または結合する分子と競合しない、請求項1~10のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記CTLA4結合タンパク質は、前記CTLA4への結合を、CTLA4のF鎖、FGループおよび/またはG鎖の1つまたは複数のアミノ酸を認識または結合する分子と競合しない、請求項1~11のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記CTLA4結合タンパク質は、SEQ ID NO: 8およびSEQ ID NO:17-20 のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する単一ドメイン抗体を含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記CTLA4結合タンパク質は、SEQ ID NO: 9で表されるアミノ酸配列を有する、請求項1~13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記腫瘍は、結腸がん及び黒色腫から選ばれる固形腫瘍である、請求項1~14のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医学の分野に関し、具体的に、CTLA4結合タンパク質を利用することにより腫瘍を治療するための方法および使用に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍免疫応答において、CTLA4媒介性阻害機構は、多くの場合、腫瘍細胞が免疫系から逃げることができる理由のうちの1つであるため、CTLA4が腫瘍免疫療法の重要な標的である。現在承認されたCTLA抗体(lpilimumabなど)は、CTLA4とそのリガンドとの相互作用をブロックすることにより抗腫瘍効果を発揮する。現在承認されたCTLA抗体は、CTLA4タンパク質に結合した場合に、エンドサイトーシス分解によって細胞膜表面のCTLA4タンパク質のレベルを低下させることができるが、これはADCC活性の低下につながる可能性がある。
【0003】
治療効果が乏しく、免疫毒性や薬剤耐性などの考えられる課題を克服するために、他の機構によって抗腫瘍効果を発揮するCTLA4抗体は依然として必要である。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、腫瘍を治療するための医薬品の調製におけるCTLA4結合タンパク質の使用を提供する。本発明に係るCTLA4結合タンパク質は、次の特性:1)CTLA4への特異的結合が可能であるが、上記のCTLA4への結合をCTLA4のリガンドと実質的に競合しないこと、2)上記のCTLA4への結合をipilimumabと実質的に競合しないこと、3)ヒトCTLA4のABEDC”鎖、A’Bループ、C”Dループ、DEループおよび/またはEFループにおける1つまたは複数のアミノ酸を認識または結合することができること、4)上記のCTLA4への結合を、ヒトCTLA4におけるK95、E97、M99、Y104、L106および/またはI108のアミノ酸残基を認識または結合する分子と競合しないこと、5)腫瘍または腫瘍細胞の成長/増殖を抑制することができること、6)CTLA4のエンドサイトーシス分解を引き起こさないことで、CTLA4を発現する293細胞膜の表面におけるCTLA4のエンドサイトーシス分解率が約50%未満になることを1つまたは複数持っている。
【0005】
一方、本発明は、CTLA4に特異的に結合し、かつ上記のCTLA4への結合をCTLA4のリガンドと競合しないCTLA4結合タンパク質の腫瘍を治療するための医薬品の調製における使用を提供する。
【0006】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、CTLA4のそのリガンドへの結合をブロックしない。
【0007】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4のリガンドは、CD80またはその機能的断片およびCD86またはその機能的断片から選ばれる。
【0008】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合をipilimumabである参照抗体と競合しない。
【0009】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4およびサルCTLA4に結合する。
【0010】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のABEDC”鎖、A’Bループ、C”Dループ、DEループおよび/またはEFループにおける1つまたは複数のアミノ酸に結合または認識する。
【0011】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のC’鎖、C”Dループおよび/またはDEループにおける1つまたは複数のアミノ酸に結合または認識する。
【0012】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4におけるE48、V49、D65、L84、D88およびY92からなる群から選ばれるアミノ酸残基を認識または結合する。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、さらに、ヒトCTLA4におけるV46、T47、D64、I67およびG83からなる群から選ばれるアミノ酸残基を認識または結合する。
【0013】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4におけるV46、T47、E48、V49、D64、D65、I67、G83、L84、D88およびY92からなるアミノ酸残基の1つまたは複数を含む配座エピトープを認識または結合する。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4におけるE48、V49、D65、L84、D88およびY92からなるアミノ酸残基を含む配座エピトープを認識または結合する。
【0014】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合を、ヒトCTLA4におけるM3、K95、E97、M99、Y104、L106およびI108からなるアミノ酸残基の1つまたは複数を認識または結合する分子と競合しない。
【0015】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合を、ヒトCTLA4におけるK95、E97、M99、Y104、L106およびI108からなるアミノ酸残基の1つまたは複数を認識または結合する分子と競合しない。
【0016】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合を、CTLA4のF鎖、FGループおよび/またはG鎖の1つまたは複数のアミノ酸を認識または結合する分子と競合しない。
【0017】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 7で表されるVH中の少なくとも1つのCDRを含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 7で表されるVH中のHCDR3を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 7で表されるVH中のHCDR2を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 7で表されるVH中のHCDR1を含む。
【0018】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:1で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖CDR3を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:2で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖CDR3を含む。
【0019】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:3で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖CDR2を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:4で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖CDR2を含む。
【0020】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:5で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖CDR1を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:6で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖CDR1を含む。
【0021】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:27で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖FR1を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:21およびSEQ ID NO:25のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖FR1を含む。
【0022】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:28で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖FR2を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:26のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖FR2を含む。
【0023】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:33で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖FR3を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:23およびSEQ ID NO:35のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖FR3を含む。
【0024】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:34で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖FR4を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:24およびSEQ ID NO:36のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖FR4を含む。
【0025】
いくつかの実施形態において、CTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:7で表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:17-20のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【0026】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、単一ドメイン抗体またはその抗原結合断片を含む。
【0027】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、SEQ ID NO: 7で表されるアミノ酸配列を有する単一ドメイン抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、SEQ ID NO: 8およびSEQ ID NO:17-20のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する単一ドメイン抗体またはその抗原結合断片を含む。
【0028】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、a)2.6×108Mまたはより低いKD値でヒトCTLA4に結合すること、b)腫瘍細胞成長を抑制すること、およびc)細胞膜上で発現するCTLA4タンパク質に対して、エンドサイトーシス分解率を約50%未満に低下させることからなる群から選ばれる特性を持つ。
【0029】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、さらに、抗体Fcドメインを含む。いくつかの実施形態において、上記の抗体Fcドメインは、IgG抗体由来のFcドメインを含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記の抗体Fcドメインおよびそれに直接的または間接的に融合されている上記の抗体重鎖可変領域を含む。
【0030】
他方、本発明は、本発明に係るCTLA4結合タンパク質、および任意で薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【0031】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、CTLA4のそのリガンドへの結合をブロックしない。
【0032】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4のリガンドは、CD80またはその機能的断片およびCD86またはその機能的断片から選ばれる。
【0033】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合を、ipilimumabである参照抗体と競合しない。
【0034】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4およびサルCTLA4に結合する。
【0035】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のC’鎖、C”Dループおよび/またはDEループにおける1つまたは複数のアミノ酸に結合または認識する。
【0036】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4におけるE48、V49、D65、L84、D88およびY92からなる群から選ばれるアミノ酸残基を認識または結合する。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、さらに、ヒトCTLA4におけるV46、T47、D64、I67およびG83からなる群から選ばれるアミノ酸残基を認識または結合する。
【0037】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4におけるV46、T47、E48、V49、D64、D65、I67、G83、L84、D88およびY92からなるアミノ酸残基の1つまたは複数を含む配座エピトープを認識または結合する。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4におけるE48、V49、D65、L84、D88およびY92からなるアミノ酸残基を含む配座エピトープを認識または結合する。
【0038】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合を、ヒトCTLA4におけるM3、K95、E97、M99、Y104、L106およびI108からなるアミノ酸残基の1つまたは複数を認識または結合する分子と競合しない。
【0039】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合を、ヒトCTLA4におけるK95、E97、M99、Y104、L106およびI108からなるアミノ酸残基の1つまたは複数を認識または結合する分子と競合しない。
【0040】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合を、CTLA4のF鎖、FGループおよび/またはG鎖の1つまたは複数のアミノ酸を認識または結合する分子と競合しない。
【0041】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:1で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖CDR3を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:2で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖CDR3を含む。
【0042】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:3で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖CDR2を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:4で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖CDR2を含む。
【0043】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:5で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖CDR1を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:6で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖CDR1を含む。
【0044】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:27で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖FR1を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:21およびSEQ ID NO:25のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖FR1を含む。
【0045】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:28で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖FR2を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:26のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖FR2を含む。
【0046】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:33で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖FR3を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:23およびSEQ ID NO:35のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖FR3を含む。
【0047】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:34で表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖FR4を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:24およびSEQ ID NO:36のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖FR4を含む。
【0048】
いくつかの実施形態において、CTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:7で表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり、かつSEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:17-20のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【0049】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、単一ドメイン抗体またはその抗原結合断片を含む。
【0050】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、SEQ ID NO: 7で表されるアミノ酸配列を有する単一ドメイン抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、SEQ ID NO: 8およびSEQ ID NO:17-20のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する単一ドメイン抗体またはその抗原結合断片を含む。
【0051】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、:a)2.6×108Mまたはより低いKD値でヒトCTLA4に結合すること、b)腫瘍細胞成長を抑制すること、およびc)CTLA4を発現する293細胞膜の表面におけるCTLA4の分解率を約50%未満に低下させることからなる群から選ばれる特性を持つ。
【0052】
いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、さらに、抗体Fcドメインを含む。いくつかの実施形態において、上記の抗体Fcドメインは、IgG抗体由来のFcドメインを含む。いくつかの実施形態において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記の抗体Fcドメインおよびそれに直接的または間接的に融合されている抗体重鎖可変領域を含む。
【0053】
他方、本発明は、本発明に係るCTLA4結合タンパク質を含む医薬組成物(例えば、腫瘍を治療するための医薬組成物)を提供する。
【0054】
他方、本発明は、腫瘍を治療するための医薬品の調製における上記の医薬組成物の使用を提供する。
【0055】
いくつかの実施形態において、上記の腫瘍は固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、上記の腫瘍は、結腸がんと黒色腫から選ばれる。
【0056】
他方、本発明は、腫瘍を治療するための本発明に係るCTLA4結合タンパク質または上記の医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、上記の腫瘍は固形腫瘍である。
【0057】
他方、本発明は、必要のある被験者に、本発明に係るCTLA4結合タンパク質または本発明に係る医薬組成物を投与するステップを含む腫瘍を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記の腫瘍は固形腫瘍である。
当該技術分野における当業者は、以降の詳細な記載からの本開示のその他の側面や利点の把握が容易であろう。以下の詳細な記載では、本開示の例としての実施形態しか表現して記載していない。当該技術分野における当業者にとって、本開示の詳細によって、本発明に係る趣旨や範囲を逸脱しない限り、開示されている具体的な実施形態を変更しても良い。それに応じて、本発明において、図面や明細書の記載があくまでも例であり、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0058】
本発明に係る具体的な特徴は、添付の請求項のように示されたものである。本発明に係る特徴やメリットは、以下詳しく記載されている例示的実施形態や図面を参照することによって、より確実的に把握されるだろう。図面に関しては、以下のように概略的に説明する。
図1図1は、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質の親和性を示す。
図2図2は、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質と細胞表面のCTLA4の結合の効果を示す。
図3図3A~3Bは、細胞表面のCTLA4とそのリガンドの結合に対する本発明に記載のCTLA4結合タンパク質によるブロッキング効果を示す。
図4図4は、CTLA4とCD80の結合に対する本発明に記載のCTLA4結合タンパク質によるブロッキング効果を示す。
図5図5A~5Bは、CTLA4とそのリガンドの結合に対する本発明に記載のCTLA4結合タンパク質によるブロッキング効果を示す。
図6図6A~6Eは、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質がヒトCTLA4への結合をB7-1と競合した結果を示す。
図7図7A~7Bは、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質のCTLA4との結合の種特異性を示す。
図8図8A~8Cは、PBMCに対する本発明に記載のCTLA4結合タンパク質の活性化効果を示す。
図9図9は、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質によるマウスにおける抗腫瘍効果を示す。
図10図10は、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質によるマウスにおける腫瘍再発の抑制効果を示す。
図11図11は、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質によるマウスにおける抗腫瘍効果を示す。
図12図12は、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質による抗腫瘍効果を示す。
図13図13A~13Cは、T細胞集団の割合に対する本発明に記載のCTLA4結合タンパク質の影響を示す。
図14図14A~14Fは、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質のヒトCTLA4への結合を示す。
図15図15A~15Dは、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質をヒトCTLA4に結合することによって形成される複合体の構造を示す。
図16図16は、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質がIL12発現量の上昇を刺激することを示す。
図17図17は、ヒトCTLA4に結合する本発明に記載のCTLA4結合タンパク質の重要なエピトープを示す。
図18図18は、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質のエンドサイトーシス分解によって引き起こされる細胞膜の表面上のCTLA4タンパク質の量の減少を示す。
【発明を実施するための形態】
【0059】
以下、本願発明の実施形態を、所定の具体的な実施例によって説明するが、当業者が、本明細書に開示された内容により、本願発明のその他のメリットや効果を容易に把握することができる。
【0060】
本発明において、「治療」という用語は、通常、疾患または障害の1つまたは複数の症状を予防、緩和、軽減および/または逆転させることを指し、また、疾患または障害の再発を抑制または阻止することを指すこともある。いくつかの場合において、上記の治療は、予防的であってよく(たとえば、疾患の発症を予防または抑制するか、臨床現象またはその不顕性の症状の出現を予防することができる)、または、疾患が現れた後に上記の症状を治療的に抑制または緩和することができる。
【0061】
本発明において、「ブロックしない」という用語は、通常、関連する機能またはプロセスの実行または効果を実質的に防止または破壊しないことを意味する。例えば、特定のタンパク質(例えば、CTLA4)と別のタンパク質(例えば、CD80やCD86などのCTLA4リガンド)との間の相互作用を「ブロックしない」とは、通常、それらの間の相互作用を実質的に防止または破壊しないことを指す。いくつかの場合において、上記の「実質的に防止または破壊しない」とは、関連する機能/プロセスの低下または削減が通常の状況と比較して約35%以下、約30%以下またはそれ以下になることを指す。上記の通常の状況は、介入が全然実行されていない場合でありうる(例えば、本発明のいかなるCTLA4結合タンパク質を投与していない場合)。
【0062】
本発明において、「CTLA4」という用語は、通常、免疫チェックポイントであり、下流の免疫応答を調節するタンパク質受容体である細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(cytotoxic T-lymphocyte-associated 4であり、CTLA4やCD152とも呼ばれる)を指す。CTLA4は、CD28ファミリーに属する免疫抑制受容体の一種である。インビボでは、CTLA4はT細胞(CD4+とCD8+細胞)でのみ発現し、2つのリガンドCD80とCD86(それぞれB7-1とB7-2とも呼ばれる)に結合する。例えば、「CTLA4」という用語は、NCBIアクセッション番号AAL07473.1と少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性を有し、CD80および/またはCD86に特異的に結合するポリペプチドまたはその断片を含み得る。「CTLA4」という用語は、CTLA4受容体全体、その細胞外ドメイン、およびタンパク質ドメインなどの第2の部分に共有結合しているCTLA4の機能的活性部分を含む融合タンパク質を含む。CTLA4の定義には、天然に存在するCTLA4とはアミノ酸配列が異なるが、リガンドCD80および/またはCD86に特異的に結合する能力を保持している変異体も含まれる。CTLA4配列は当該技術分野で知られており、例えば、アクセッション番号1493で提供されている。本明細書で使用される「CTLA4」という用語は、ヒトCTLA4(hCTLA4)、hCTLA4の変異体、異性体および種相同体、ならびにhCTLA4の少なくとも1つのよく見られるエピトープを有する類似体を含む。例えば、「CTLA4」という用語は、また、他の哺乳動物(例えば、ラット、マウス、ウサギ、非ヒト霊長類、ブタまたはウシ)などの他の種からのCTLA4を包含する。全なhCTLA4配列は、GenBankアクセッション番号1493に記載されている。
【0063】
本発明において、「C’鎖」という用語は、通常、ヒトCTLA4の3次元構造の一部を指す。例えば、上記のC’鎖は、ヒトCTLA4(例えば、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO:14で表される)の45-54位のアミノ酸残基を含み得る。
【0064】
本発明において、「C”Dループ」という用語は、通常、ヒトCTLA4の3次元構造の一部を指す。例えば、上記のC”Dループは、ヒトCTLA4(例えば、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO:14で表される)の50-60および67-72位のアミノ酸残基を含み得る。
【0065】
本発明において、「DEループ」という用語は、通常、ヒトCTLA4の3次元構造の一部を指す。例えば、上記のDEループは、ヒトCTLA4(例えば、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO:14で表される)の67-81位のアミノ酸残基を含み得る。
【0066】
本発明において、「N末端」という用語は、通常、タンパク質/ポリペプチドのアミノ酸配列のN末端を指す。例えば、上記のN末端は、タンパク質/ポリペプチドの合成の開始部位であり得る。例えば、上記のN末端は、上記のヒトCTLA4の一次構造のN末端であり得る。
【0067】
本発明において、「F鎖」という用語は、通常、ヒトCTLA4の3次元構造の一部を指す。例えば、上記のF鎖は、ヒトCTLA4(例えば、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO:14で表される)の90-99位のアミノ酸残基を含み得る。
【0068】
本発明において、「FGループ」という用語は、通常、ヒトCTLA4の3次元構造の一部を指す。例えば、上記のFGループは、CDR3類似断片と呼ばれることがある。上記のFGループは、ヒトCTLA4(例えば、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO:14で表される)の105-109および112-115位のアミノ酸残基を含み得る。
【0069】
本発明において、「G鎖」という用語は、通常、ヒトCTLA4の3次元構造の一部を指す。例えば、上記のG鎖は、ヒトCTLA4(例えば、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO:14で表される)の105-109位および112-115位のアミノ酸残基を含み得る。
【0070】
上記のCTLA4の構造情報は、Structural basis for co-stimulation by the human CTLA4/B7-2 complex. (Nature 2001、Schwartz et. Al.)の参考文献、およびCrystal structure of the B7-1/CTLA4complex that inhibits human immune responses (Nature 2001、Stamper et. al)CTLA4とそのリガンドの3D構造が、Protein Data Bank(PDB)データベースに記録されており、そのアクセッション番号は、それぞれ1I85と1I8Lである。
【0071】
本発明において、「CTLA4結合タンパク質」という用語は、通常、CTLA4に特異的に結合可能なタンパク質を指す。例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり得る。
【0072】
本発明において、「特異的結合」という用語は、通常、結合分子(上記のCTLA4結合タンパク質など)の標的分子(CLTA4など)への結合を指し、この結合は、非特異的相互作用とは異なる(上記の非特異的相互作用が、非CTLA4への上記のCTLA4結合タンパク質の結合、例えば、ウシ血清アルブミンまたはカゼインへの結合を含み得る)。本発明において、特異的結合は、コントロール分子(上記の標的分子以外の他の分子)への結合分子の結合に対する標的分子への結合分子の結合によって測定される。いくつかの場合において、上記の結合特異性とは、上記のCTLA4結合タンパク質がCTLA4上の特定のエピトープに特異的に結合し、かついかなる他のタンパク質またはその他のエピトープにも実質的に結合しないことを意味し得る。
【0073】
本発明において、「結合親和性」という用語は、通常、結合分子(上記のCTLA4結合タンパク質など)の単一の結合部位とそれが結合した標的分子(CTLA4など)との間の非共有相互作用の合計の強さを指す。例えば、上記の結合親和性は、上記の結合分子と上記の標的分子との間の線形相互作用の固有の結合親和性を反映し得る。いくつかの場合において、上記の結合親和性のレベルは、Biacore、KinExAまたはFortibio法によって測定される。例えば、高い親和性を持つ上記の結合分子は、より長く結合したままで、解離がより困難である。本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、2.6 x 108Mまたはより低いKD値でヒトCTLA4に結合することができる。
【0074】
本発明において、「サル」という用語は、通常、広鼻小目および狭鼻小目の霊長類に属する動物を指す。本発明において、上記のサルは、カニクイサル(Macaca fascicularis)、またはアカゲサル(Macaca mulatta)であり得る。例えば、上記のサルは、カニクイサル(Macaca fascicularis)であり得る。
【0075】
本発明において、「ネズミ」という用語は、通常、齧歯類ネズミ上科に属する動物を指す。本発明において、上記のネズミは、マウス(Mus musculus)、またはラット(Rattus norvegicus f. domestica)であり得る。例えば、上記のネズミは、ラットであり得る。
【0076】
本発明において、「ipilimumab」という用語は、通常、ヒトCTLA4の細胞外領域に特異的に結合するヒト化IgG1kモノクローナル抗体を指す。その商品名は、Yervoy(商標)(Bristol-Myers Squibb)であり、2011年に黒色腫の治療薬としてFDAに承認された。Ipilimumabは、ヒトCTLA4のそのリガンドB7-1への結合をブロックすることができる。IpilimumabとヒトCTLA4の結合による複合体の具体的構造は、Ramagopal UAら,Structural basis for cancer immunotherapy by the first-in-class checkpoint inhibitor ipilimumab、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2017)を参照してよい。ipilimumabの構造とそのアミノ酸配列情報は、Lipson EJら,Ipilimumab: an anti-CTLA4 antibody for metastatic melanoma、Clin Cancer Res. 2011 Nov 15;17(22):6958-62、または米国特許出願US20020086041における抗体10D1を参照してよい。
【0077】
本発明において、「KN044」という用語は、通常、CTLA4に特異的に結合する免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むCTLA4結合タンパク質を指す。上記のKN044は、CTLA4のCD80への結合をブロックすることができ、また、CTLA4への高い結合親和性を持つ。上記のKN044は、SEQ ID NO.11で表されるアミノ酸配列を有し得る。
【0078】
本発明において、「エンドサイトーシス」という用語は、通常、細胞膜が変形運動によって細胞外物質を細胞内に移すプロセスを指す。上記のエンドサイトーシスは、食作用および飲作用を含み得る。例えば、細胞は、陥入して「小泡」を形成して上記の高分子物質(例えば、タンパク質)が取り込まれるが、細胞膜から離れて細胞の内部に入る。
【0079】
本発明において、「単一ドメイン抗体」という用語は、通常、抗原結合ドメインまたは断片、例えばそれぞれVHHドメイン、VHドメインまたはVLドメインを指す。抗原結合分子または抗原結合タンパク質という用語は、互換的に使用され、また、ナノボディ(Nanobodies)という用語も含まれる。上記の免疫グロブリン単一可変ドメインはさらに、軽鎖可変ドメイン配列(例えば、VL-配列)、または重鎖可変ドメイン配列(例えば、VH-配列)であり、より具体的に、それらは、従来の4本鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列または重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列であり得る。したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ドメイン抗体、またはドメイン抗体として好適に用いられる免疫グロブリン配列、単一ドメイン抗体、または単一ドメイン抗体として好適に用いられる免疫グロブリン配列、“dAbs”またはdAbsとして好適に用いられる免疫グロブリン配列、またはナノボディであってよく、VHH配列を含むがこれに限定されない。免疫グロブリン単一可変ドメインには、全ヒト化、ヒト化、あるいは他の配列の最適化が行われたかまたはキメラの免疫グロブリン配列が含まれる。上記の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび免疫グロブリン単一可変ドメインの構造は、当該技術分野や本明細書でそれぞれ“フレームワーク領域1”または“FR1”、“フレームワーク領域2"または“FR2”、または“フレームワーク領域3”または“FR3”、および“フレームワーク領域4”または“FR4”と呼ばれる4つのフレームワーク領域または“FR”より構成されると見なすことができるが、これらに限定されなく、ここで、フレームワーク領域には、当該技術分野でそれぞれ“相補性決定領域1”または“CDR1”、“相補性決定領域2”または“CDR2”、および“相補性決定領域3”または“CDR3”と呼ばれる3つの相補性決定領域または“CDR”が挿入されている。
【0080】
本発明において、「Fc」という用語は、通常、免疫グロブリン定常領域のヒンジ領域または一部のヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域を含むヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4に由来する定常領域(その定常領域のアミノ酸配列については、それぞれwww.uniprot.orgタンパク質のデータベースにおけるエントリP01857、P01859、P01860、P01861を参照)のFc領域を指す。本発明において、“ヒト免疫グロブリンFc領域”のアミノ酸配列は、Fc媒介ADCCあるいはCDC活性を増加または除去するか、またはFcRnの親和性を増強または低下するように、CH2領域上の1~5つのアミノ酸を変異させ、または、タンパク質の安定性を向上するようにHinge領域の1~4つのアミノ酸を変異させることができる。
【0081】
本発明において、「エピトープ」という用語は、通常、抗原上の抗体結合部位を指す。エピトープは、連続したアミノ酸(線状エピトープ)またはタンパク質の三次折り畳みのために空間的に隣接する連続していないアミノ酸(配座エピトープ)によって形成されてよい。連続したアミノ酸によって形成されたエピトープは、通常、変性溶媒に曝されると保持されるが、三次折り畳みで形成されたエピトープは、通常、変性溶媒で処理されると失われてしまう。エピトープは、一般的に、独特な空間的コンフォメーションで少なくとも3つ、通常はそれ以上、少なくとも5つまたは8~10つのアミノ酸を含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法には、例えば、X線結晶回折と2次元磁気共鳴が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)を参照されたい。本明細書で使用される「配座エピトープ」という用語は、通常、タンパク質の三次折り畳みのために空間的に隣接する抗原(CTLA4抗原など)の連続していないアミノ酸残基を指す。ポリペプチド鎖が折りたたまれて天然タンパク質を形成すると、これらの連続していないアミノ酸残基が表面に蓄積する可能性がある。配座エピトープには、機能的エピトープが含まれるが、これに限定されない。
【0082】
本発明において、「KD」という用語は、「KD」と交換可能に使用することができ、通常、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数を指し、単位はM(mol/L)である。KDは、物質ABおよびそれを解離することによって得られた物質Aと物質Bの濃度から、KD =c(A)*c(B)/c(AB)を算出することができる。この式から、KD値が大きいほど解離が大きく、物質AとBの間の親和性が弱いことを示し、逆に、KD値が小さいほど解離が少なく、物質AとBの親和性が強いことを示していることが分かる。
【0083】
本発明において、「約」という用語は、通常、指定された値より0.5%~10%以上または以下の範囲、例えば指定された値より0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、または10%以上または以下の範囲に変動するものを指す。
【0084】
CTLA4結合タンパク質の医薬品用途
本発明において、一態様では、本発明は、CTLA4に特異的に結合し、かつ上記のCTLA4への結合をCTLA4のリガンドと競合しないCTLA4結合タンパク質の腫瘍を治療するための医薬品の調製における使用を提供する。
【0085】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、CTLA4に特異的に結合することができる。例えば、ELISAによる検出によって、上記のCTLA4結合タンパク質はCTLA4のみに特異的に結合することができることがわかる。例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴(SRP)法で測定されると、CTLA4に結合するKD値が約2.8*10-8以下、約2.6*10-8以下、約2.5*10-8以下、約2.0*10-8以下またはそれ以下であり得る。例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、ELISA法で検出されることによって、CTLA4に結合するEC50値が約2以上、約2.5以上、約3以上、約3.5以上またはそれ以上であり得る。
【0086】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質のCTLA4への特異的結合を検出する方法には、表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイ、Scatchardアッセイ、競合的結合アッセイ(例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素イムノアッセイ(EIA)および/またはサンドイッチ型競合アッセイが含まれる。
【0087】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、CTLA4のそのリガンドへの結合をブロックしないものであってもよい。
【0088】
本発明において、CTLA4のそのリガンドへの結合がブロックされているかどうかの判断は、競合ELISA法、細胞中和アッセイおよびバイオレイヤー干渉(BLI)法からなる群より選択される方法によって行うことができる。例えば、競合ELISA法によって決定されるように、上記のCTLA4結合タンパク質がCD80とCTLA4への結合について競合する実験において、使用するCTLA4結合タンパク質の濃度がCD80タンパク質の濃度の約0.002~約2000倍である場合(例えば、CD80タンパク質の濃度が約50ng/mL、CTLA4結合タンパク質の濃度が約0.01ng/mL~100μg/mLの場合)、または使用するCTLA4結合タンパク質の濃度がCD86タンパク質の濃度の約0.002~約500倍である場合(例えば、CD86タンパク質濃度が約50ng/mL、CTLA4結合タンパク質の濃度が約0.01ng/mL~約25μg/mLの場合)、得られる吸光度の低下は約30%未満である。別の例として、上記のCTLA4結合タンパク質は、競合FACSによって決定されるように、約0.01~約10000nMの範囲の濃度でヒトCTLA4を発現するHEK293細胞への結合についてヒトCD80または約1.6μg/mLのヒトCD86と競合することによって、得られる平均蛍光値の減少が約30%未満である。
【0089】
本発明において、上記の「実質的にブロックしない」は、約0.01~約100000 ng/mLの濃度範囲におけるCTLA4とそのリガンド(CD80またはCD86)との間の相互作用に対する有意な濃度依存性ブロッキング効果が見られないことを意味する。例えば、約0.01~約10000ng/mLの濃度範囲における上記のCTLA4結合タンパク質のCTLA4への結合が、CTLA4とそのリガンドCD80またはCD86への結合(ELISA検出のOD値の変化、または、FACSアッセイのMFIの変化による測定が可能である)に対して及ばす影響は約30%未満であり、かつ有意な濃度依存性がない。いくつかの場合において、上記の「ブロックしない」は、抗原エピトープの研究によっても確認することができる。例えば、CTLA4結合タンパク質により認識される抗原エピトープは、CLTA4がそのリガンド(CD80またはCD86)に互いに結合するエピトープが含まれないか、または、CLTA4がそのリガンド(CD80またはCD86)に互いに結合するエピトープと重複しないか、または、CTLA4結合タンパク質がCLTA4がそのリガンド(CD80またはCD86)に互いに結合するエピトープを認識しない。
【0090】
本発明において、上記のCTLA4のリガンドは、CD80またはその機能的断片およびCD86またはその機能的断片から選ばれ得る。
【0091】
本発明において、上記の機能的断片は、CD80またはCD86の生物学的活性を持つタンパク質の変異体または断片であり得る。例えば、上記のCD80機能的断片は、少なくとも1つのCD80機能的領域を有してよい。上記のCD80機能的領域とは、CD80の全長タンパク質領域、または全領域活性を保持する領域の一部を指す場合がある。例えば、上記のCD80機能的領域は、CD80の機能的V領域(43-123位のアミノ酸)またはその断片を含み得、CD28およびCTLA4に結合する能力を有してよく、および/または、上記のCD80機能的領域は、CD80の完全な細胞外セグメント(35-242位のアミノ酸)またはその断片を含み得る。例えば、上記のCD86機能的断片は少なくとも1つのCD86機能的領域を含み得る。上記のCD86機能的領域は、CD86のV領域(33-131位のアミノ酸)、CD86の完全な細胞外セグメント(24-274位のアミノ酸)などを含み得る。上記のCD80およびCD86の機能的領域のアミノ酸コードはUniprotデータベースの情報を参照する。ここで、CD80はUniprotのアクセッション番号がP33681、CD86はアクセッション番号がP42081である。
【0092】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合を、ipilimumabとKN044から選ばれ得る参照抗体と競合しなくてよい。
【0093】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質の上記のCTLA4への結合は、上記の参照抗体の上記のCTLA4への結合に影響されない場合がある。いくつかの場合において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4上のある位置/エピトープに結合してよく、上記の参照抗体は、上記のCTLA4上の上記の位置/エピトープと異なる別の位置/エピトープに結合してよい。例えば、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質とipilimumabは、それぞれ上記のCTLA4に結合する位置が異なっていてもよく、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合をipilimumabと競合しなくてよい。さらに、例えば、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質とKN044は、それぞれ上記のCTLA4に結合する位置が異なっていてもよく、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合をKN044と競合しなくてよい。
【0094】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4とサルCTLA4に結合することができる。本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、マウスCTLA4またはラットCTLA4に実質的に結合しなくてよい。本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質のCTLA4への結合は種特異的であり得る。
【0095】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のABEDC”鎖、A’Bループ、C”Dループ、DEループおよび/またはEFループにおける1つまたは複数のアミノ酸に結合または認識することができる。
【0096】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のC’鎖、C”Dループおよび/またはDEループにおける1つまたは複数のアミノ酸に結合または認識することができる。
【0097】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のC’鎖におけるE48、V49、V46およびT47の1つまたは複数のアミノ酸に結合または認識することができる。
【0098】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のC”Dループにおけるアミノ酸I67に結合または認識することができる。
【0099】
本発明において、ヒトCTLA4のタンパク質の3D構造は、UniProtデータベースの“structure”部分を参照してよく、ヒトCTLA4のタンパク質は、Protein Data Bank(PDB)データベースにおけるアクセッション番号が1I85である。
【0100】
例えば、本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4におけるE48、V49、D65、L84、D88およびY92からなる群から選ばれるアミノ酸残基を認識または結合することができる。本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、さらに、ヒトCTLA4におけるV46、T47、D64、I67およびG83からなる群から選ばれるアミノ酸残基を認識または結合することができる。
【0101】
例えば、本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4におけるV46、T47、E48、V49、D64、D65、I67、G83、L84、D88およびY92からなるアミノ酸残基の1つまたは複数を含む配座エピトープを認識または結合することができる。
【0102】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4におけるE48、V49、D65、L84、D88およびY92からなるアミノ酸残基を含む配座エピトープを認識または結合することができる。本発明において、ヒトCTLA4のアミノ酸残基E48、V49、D65、L84、D88およびY92の1つまたは複数が変異を引き起こす場合に、上記のCTLA4結合タンパク質がヒトCTLA4に特異的に結合する能力の喪失をもたらし得る(例えば、変異した上記のヒトCTLA4への上記のCTLA4結合タンパク質の結合のKD値の少なくとも約800倍、少なくとも約1000倍、少なくとも約1200倍またはそれ以上までの上昇をもたらし得る)。本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4の上記の配座エピトープを特異的に認識および/または結合し、ヒトCTLA4のアミノ酸残基E48、V49、D65、L84、D88およびY92のいずれか1つまたは複数が変異すると、上記の配座エピトープの配座が変化し得る。
【0103】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合を、ヒトCTLA4におけるK95、E97、M99、Y104、L106およびI108からなるアミノ酸残基の1つまたは複数を認識または結合する分子と競合しなくてよい。
【0104】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合を、CTLA4のF鎖、FGループおよび/またはG鎖の1つまたは複数のアミノ酸を認識または結合する分子と競合しなくてよい。
【0105】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質のCTLA4に対しての認識または結合の位置は、上記のCTLA4のF鎖、FGループおよび/またはG鎖に位置しない場合がある。例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、CTLA4のF鎖、FGループおよび/またはG鎖の1つまたは複数のアミノ酸に結合しなくてよい。他のCTLA4結合タンパク質は、CTLA4のF鎖、FGループおよび/またはG鎖の1つまたは複数のアミノ酸を認識または結合すると、上記の他のCTLA4結合タンパク質のCTLA4への結合は、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質のCTLA4への結合に影響を及ぼさない。
【0106】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のF鎖におけるK95、E97およびM99からなるアミノ酸の1つまたは複数に結合または認識しない場合がある。例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のFGループにおけるL106およびI108からなるアミノ酸の1つまたは複数に結合または認識しない場合がある。
【0107】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 7で表されるVH中の少なくとも1つのCDRを含み得る。
【0108】
QVQLVESGGGX1VQX2GGSLRLSCAASX3X4X5NX6X7X8X9MGWFRQAPGKX10X11ERVAAX12X13X14X15GTX16X17YYADSVKGRFTISRDNX18KNTLX19LQMNSLX20X21EDTAX22YYCX23X24X25X26X27X28X29AWCX30RX31X32X33X34X35X36X37WGQGTX38VTVSX39(SEQ ID NO:7)であり、ここで、X1はSまたはLであり、X2はAまたはPであり、X10はEまたはGであり、X11はRまたはLであり、X18はGまたはSであり、X19はFまたはYであり、X20はKまたはRであり、X21はPまたはAであり、X22はMまたはVであり、X38はQまたはLであり、X39はSであるかまたはアミノ酸がなく、残りのXは任意のアミノ酸である。
【0109】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、任意の方法に従って、上記のSEQ ID NO: 7で表されるVHで定義されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3の少なくとも1つ(例えば、1つ、2つまたは3つであってよい)からなる重鎖CDRを含んでよい。例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、任意の方法に従って、上記のSEQ ID NO: 8で表されるVHで定義されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3の少なくとも1つ(例えば、1つ、2つまたは3つであってよい)を含んでよい。
【0110】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 7で表されるVH中のHCDR3を含んでよい。いくつかの場合において、上記のCTLA4結合タンパク質は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 8で表されるVH中のHCDR3を含んでよい。例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 7で表されるVH中のHCDR2を含んでよい。いくつかの場合において、上記のCTLA4結合タンパク質は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 8で表されるVH中のHCDR3を含んでよい。例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 7で表されるVH中のHCDR1を含んでよい。いくつかの場合において、上記のCTLA4結合タンパク質は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 8で表されるVH中のHCDR3を含んでよい。
【0111】
本発明において、上記のアミノ酸配列がSEQ ID NO: 7で表されるVH中の少なくとも1つのCDR、またはアミノ酸配列がSEQ ID NO: 8で表されるVH中の少なくとも1つのCDRは、ここで、それらの指定は、CDRに関して当該技術分野で知られている任意の指定方法によることができる。
【0112】
例えば、KabatらによるVHドメインの一般的な番号付け方法に従って番号付けすることができ(“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, 公開第91号)、この番号付け方法によれば、
-FR1は1-30位のアミノ酸残基を含み、
-CDR1は31-35位のアミノ酸残基を含み、
-FR2は36-49位のアミノ酸を含み、
-CDR2は50-65位のアミノ酸残基を含み、
-FR3は66-94位のアミノ酸残基を含み、
-CDR3は95-102位のアミノ酸残基を含み、かつ
-FR4は103-113位のアミノ酸残基を含む。
【0113】
抗体のCDRは、当該技術分野において、様々な方法、例えば1)配列変化性に基づくKabat定義(WuおよびKabat、J Exp Med 132:211-50、1970;Kabatら、Sequences ofProteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes ofHealth、Bethesda、Md. 、1991)、2)構造ループ領域の位置に基づくChothia定義(A1- Lazikaniら、JMol Biol 273:927-48、1997)、3)Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアにより用いられる上記の2つの定義の折衷であるAbM定義、4)得られた複合体結晶構造の分析に基づくContact定義によって定義することもできる。これらの方法を用いて本発明に記載のCTLA4結合タンパク質に対するCDRアミノ酸開始/終止部位の指定が以下のように示される。
【0114】
【0115】
ここで、Ha-Hbとは、抗体重鎖のN末端からa~b位までのアミノ酸配列を意味し得る。例えば、H31-H35とは、抗体重鎖がKabat番号付け規則で番号付けされると、Kabat番号付けに基づく31~35位のアミノ酸配列を意味し得る。
【0116】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:1で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖CDR3を含む。X1X2X3X4X5X6X7AWCX8RX9X10X11X12X13X14X15 (SEQ ID NO:1)であり、ここで、X1-X12はすべて任意のアミノ酸である。
【0117】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:2で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖CDR3を含む。
【0118】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:3で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖CDR2を含む。X1 X2 X3 X4GT X5X6(SEQ ID NO:3)であり、ここで、X1-X6はすべて任意のアミノ酸である。
【0119】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:4で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖CDR2を含む。
【0120】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:5で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖CDR1を含む。X1 X2 X3N X4 X5X6 X7(SEQ ID NO:5)であり、ここで、X1-X7はすべて任意のアミノ酸である。
【0121】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:6で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖CDR1を含む。
【0122】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質はFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4で表される構造を含み得る。
【0123】
本発明において、上記の番号付け法に従って指定される構造や番号付けは、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際の番号付けに対応する場合もあれば、対応しない場合もある。
【0124】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつその重鎖CDR1がSEQ ID NO:6で表されるアミノ酸配列を有し、重鎖CDR2がSEQ ID NO:4で表されるアミノ酸配列を有し、重鎖CDR3がSEQ ID NO:2で表されるアミノ酸配列を有し得る。
【0125】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:27で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖FR1を含む。QVQLVESGGG X1VQ X2GGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:27)であり、ここで、X1はSまたはLであり、X2はAまたはPである。
【0126】
本発明において、上記の重鎖FR1は、上記の重鎖CDR1のN末端に位置してよい。例えば、上記の重鎖FR1のC末端は、上記の重鎖CDR1のN末端に直接接続されていてよい。
【0127】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:21およびSEQ ID NO:25のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖FR1を含む。
【0128】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:28で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖FR2を含む。MGWFRQAPGKX1 X2ERVAA(SEQ ID NO:28)であり、ここで、X1はEまたはGであり、X2はRまたはLである。
【0129】
本発明において、上記の重鎖FR2は、上記の重鎖CDR1と上記の重鎖CDR2との間に位置してよい。例えば、上記の重鎖FR2のN末端は、上記の重鎖CDR1のC末端に直接接続されていてよく、上記の重鎖FR2のC末端は、上記の重鎖CDR2のN末端に直接接続されていてよい。
【0130】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:26のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖FR2を含む。
【0131】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:33で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖FR3を含む。YYADSVKGRFTISRDN X1 KNTL X2 LQMNSL X3X4 EDTA X5 YYCであり、ここで、X1はGまたはSであり、X2はFまたはYであり、X3はKまたはRであり、X4はPまたはAであり、X5はMまたはVである。
【0132】
本発明において、上記の重鎖FR3は、上記の重鎖CDR2と上記の重鎖CDR3との間に位置してよい。例えば、上記の重鎖FR3のN末端は、上記の重鎖CDR2のC末端に直接接続されていてよく、上記の重鎖FR3のC末端は、上記の重鎖CDR3のN末端に直接接続されていてよい。
【0133】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:23およびSEQ ID NO:35のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖FR3を含む。
【0134】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:34で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖FR4を含む。WGQGTX1VTVSX2(SEQ ID NO:34)であり、ここで、X1はQまたはLであり、X2はSであるかまたはアミノ酸がない。
【0135】
本発明において、上記の重鎖FR4は、上記の重鎖CDR3のC末端に位置してよい。例えば、上記の重鎖FR4のN末端は上記の重鎖CDR3のC末端に直接接続されていてよい。
【0136】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:24およびSEQ ID NO:36のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖FR4を含む。
【0137】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:7で表されるアミノ酸配列を有し得る重鎖可変領域を含む。
【0138】
QVQLVESGGGX1VQX2GGSLRLSCAASX3X4X5NX6X7X8X9MGWFRQAPGKX10X11ERVAAX12X13X14X15GTX16X17YYADSVKGRFTISRDNX18KNTLX19LQMNSLX20X21EDTAX22YYCX23X24X25X26X27X28X29AWCX30RX31X32X33X34X35X36X37WGQGTX38VTVSX39(SEQ ID NO:7)であり、
ここで、X1はSまたはLであり、X2はAまたはPであり、X10はEまたはGであり、X11はRまたはLであり、X18はGまたはSであり、X19はFまたはYであり、X20はKまたはRであり、X21はPまたはAであり、X22はMまたはVであり、X38はQまたはLであり、X39はSであるかまたはアミノ酸がなく、残りのXはすべてアミノ酸である。
【0139】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:17-20のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する。
【0140】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、単一ドメイン抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:17-20のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する。
【0141】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、重鎖CDR1~重鎖CDR3を含有する抗体138を含むか、またはそれであり、ここで、重鎖CDR1はSEQ ID NO:6で表されるアミノ酸配列を有し得、重鎖CDR2はSEQ ID NO:4で表されるアミノ酸配列を有し得、重鎖CDR3はSEQ ID NO:2で表されるアミノ酸配列を有し得る。本発明において、上記の抗体138は、SEQ ID NO:8で表されるアミノ酸配列を有し得る重鎖可変領域を含み得る。本発明において、上記の抗体138は単一ドメイン抗体またはその抗原結合断片であり、SEQ ID NO:8で表されるアミノ酸配列を有し得る。
【0142】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質はヒト化および改変が可能である。例えば、ユニバーサルヒト化VHHフレームワークhNbBcII10FGLA(PDB番号:3EAK)に従って、ヒト化抗体(PDB番号:1OHQ)を参照し、タンパク質表面のアミノ酸をヒト化し、VHH配列フレームワーク1(framework1、FR1)のアミノ酸VLPの一部、VHH配列フレームワーク2(FR2)のアミノ酸GLの一部、VHH配列フレームワーク3(FR3)のアミノ酸RSKRAAVの一部およびVHH配列フレームワーク4(FR4)のアミノ酸Lを変更することが可能である。
【0143】
例えば、抗体138に対して上記のヒト化および改変を行うことによって、約4種類の138のヒト化変異体(hu138V1~hu138V4)が得られる。
【0144】
ここで、hu138V1は、HFR1-HFR4を含み得、ここで、HFR1はSEQ ID NO.21で表されるアミノ酸配列を有し、HFR2はSEQ ID NO.22で表されるアミノ酸配列を有し、HFR3はSEQ ID NO.23で表されるアミノ酸配列を有し、HFR4はSEQ ID NO.24で表されるアミノ酸配列を有し、hu138V1は、SEQ ID NO.17で表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み得る。
【0145】
ここで、hu138V2は、HFR1-HFR4を含み得、ここで、HFR1はSEQ ID NO.25で表されるアミノ酸配列を有し、HFR2はSEQ ID NO.22で表されるアミノ酸配列を有し、HFR3はSEQ ID NO.23で表されるアミノ酸配列を有し、HFR4はSEQ ID NO.24で表されるアミノ酸配列を有し、hu138V2は、SEQ ID NO.18で表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み得る。
【0146】
ここで、hu138V3は、HFR1-HFR4を含み得、ここで、HFR1はSEQ ID NO.21で表されるアミノ酸配列を有し、HFR2はSEQ ID NO.26で表されるアミノ酸配列を有し、HFR3はSEQ ID NO.23で表されるアミノ酸配列を有し、HFR4はSEQ ID NO.24で表されるアミノ酸配列を有し、hu138V3は、SEQ ID NO.19で表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み得る。
【0147】
ここで、hu138V4は、HFR1-HFR4を含み得、ここで、HFR1はSEQ ID NO.25で表されるアミノ酸配列を有し、HFR2はSEQ ID NO.26で表されるアミノ酸配列を有し、HFR3はSEQ ID NO.23で表されるアミノ酸配列を有し、HFR4はSEQ ID NO.24で表されるアミノ酸配列を有し、hu138V4は、SEQ ID NO.20で表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み得る。
【0148】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:17-20のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する。
【0149】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、単一ドメイン抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:17-20のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する。
【0150】
本発明において、本発明に係るタンパク質、ポリペプチドおよび/またはアミノ酸配列はまた、少なくともこの上記のタンパク質またはポリペプチドと同一または同様の機能を持つ変異体または相同体を含むと理解されるべきである。
【0151】
本発明において、上記の変異体は、上記のタンパク質および/または上記のポリペプチド(上記のCTLA4結合タンパク質など)のアミノ酸配列において1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失または付加されたタンパク質またはポリペプチドであり得る。例えば、上記の機能的変異体は、少なくとも1つ、例えば1-30つ、1-20つまたは1-10つ、さらに、例えば1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのアミノ酸の置換、欠失および/または挿入によるアミノ酸変化を有するタンパク質またはポリペプチドを含み得る。上記の機能的変異体は、変化(例えば置換、欠失または付加)する前の上記のタンパク質または上記のポリペプチドの生物学的特性を実質的に保持することができる。例えば、上記の機能的変異体は、変化する前の上記のタンパク質または上記のポリペプチドの少なくとも60%、70%、80%、90%、または100%の生物学的活性(CTLA4への結合の能力など)を保持することができる。例えば、上記の置換は保存的置換であってよい。
【0152】
本発明において、上記の抗原結合タンパク質のアミノ酸配列は、一部が特定の種由来の抗体中の対応するアミノ酸配列と相同であってもよく、特定のクラスに属していてもよい。例えば、抗体の可変領域と定常部分の両方は、一つの動物種(ヒトなど)の抗体の可変領域と定常領域に由来してよい。本発明において、上記の相同体は、上記のタンパク質および/または上記のポリペプチド(上記のCTLA4結合タンパク質など)のアミノ酸配列と少なくとも約85%(例えば、少なくとも約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%またはそれ以上)の配列相同性を持つタンパク質またはポリペプチドであり得る。
【0153】
本発明において、上記の相同性とは、通常、2個または複数の配列間の相似性、類似性または相関性を指す。「配列相同性パーセンテージ」は、2本の整列しようとする配列を比較ウインドウにわたって比較することにより、2本の配列において同一の核酸塩基(例えば、A、T、C、G、I)或いは同一のアミノ酸残基(例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、CysおよびMet)が存在する位置の数を勘定して、マッチする位置の数を算出し、マッチする位置の数を比較ウインドウにおける位置総数(即ち、ウインドウの大きさ)で除算し、その結果に100を乗算して、配列相同性パーセンテージを得る。配列相同性パーセンテージを特定するための整列は、当該技術分野における周知の様々な手段、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNやMegalign(DNASTAR)ソフトウェアのような公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて実現される。当該技術分野における当業者は、比較される全長配列範囲や、標的配列領域における最大整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めて、配列整列のための適切なパラメータを決定可能である。上記の相同性は、FASTAおよびBLASTアルゴリズムで測定することもできる。FASTAアルゴリズムは、W.R.PearsonおよびD.J.Lipmanの“生物学的配列比較のために改善されたツール”、米国科学アカデミー紀要(Proc.Natl.Acad.Sci.)、85:2444-2448、1988、およびD.J.LipmanおよびW.R.Pearsonの“タンパク質相似性の高速高感度な検索”、Science、227:1435-1441、1989に記載されている。BLASTアルゴリズムは、S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.MyersおよびD.Lipmanの“基本的な局所的整列(alignment)検索ツール”、分子生物学誌、215:403-410、1990に記載されている。
【0154】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、2.6×108Mまたはそれ以下(例えば、2.5×108Mまたはそれ以下、2.0×108Mまたはそれ以下、1.5×108Mまたはそれ以下、1.0×108Mまたはそれ以下または0.5×108Mまたはそれ以下)のKD値でヒトCTLA4に結合することができる。
【0155】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、腫瘍細胞成長を抑制することができる。
【0156】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、CTLA4発現293細胞において約50%未満(例えば、約45%未満、約40%未満、約35%未満、約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満またはそれ以下)のCTLA4エンドサイトーシス分解率を引き起こすことができる。
【0157】
本発明において、上記のエンドサイトーシスによる分解の程度は、「エンドサイトーシス分解率」で評価することができる。細胞との相互作用のある細胞外因性高分子(例えば、一つの可溶性タンパク質)について、上記の高分子物質の「エンドサイトーシス分解率」は、上記の細胞と相互作用する上記の高分子物質の総量(これは一般に、エンドサイトーシス量と上記の細胞の表面に結合した量の合計であってよい)に対する、上記のエンドサイトーシスを介して細胞に取り込まれるこの高分子物質の量の比率(通常、パーセントで表される)を指す場合がある。細胞膜の表面の高分子物質(例えば上記の細胞上のある膜タンパク質)について、上記のある高分子の「エンドサイトーシス分解率」は、上記の細胞上の上記の高分子物質の総量(一般に、これはエンドサイトーシスにより分解された量とエンドサイトーシス分解後に細胞膜表面に残存する量との和であってもよく、あるいは、エンドサイトーシスによる分解がない場合に細胞膜表面上の総量であってもよい)に対する、上記のエンドサイトーシスを介して細胞に取り込まれて分解されるこの高分子物質の量の比率(通常、パーセントで表される)を指す場合がある。
【0158】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、CTLA4発現細胞の表面でエンドサイトーシスによるCTLA4の分解を引き起こさない可能性がある。これは、CTLA4抗体がエンドサイトーシス分解により細胞膜表面のCTLA4レベルを低下させる一般的な経路とは全く異なり、CTLA4レベルの低下は一連の免疫障害をもたらす(dentifying functional defects in patients with immune dysregulation due to LRBA and CTLA4 mutationsを参照)。したがって、本発明に係るCTLA4結合タンパク質は、CTLA4発現細胞の表面上のCTLA4の数を保持し、ADCC活性を向上させることによって、腫瘍に対する殺傷効果を高めると共に、正常組織中のT細胞の表面上のCTLA4の数を保持し、非腫瘍環境におけるCTLA4の機能を維持し、上記のCTLA4結合タンパク質で起こりうる有害作用や免疫毒性を低減または回避することができる。
【0159】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体Fcドメインも含み得る。本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体Fcドメインを含む場合に、上記のCTLA4結合タンパク質が二量体分子を形成することを可能にすると同時に、インビボでの上記の結合タンパク質の半減期を延長することができる。
【0160】
本発明において、上記の抗体Fcドメインは、IgG抗体由来のFcドメインを含み得る。例えば、上記のFcは、異なるサブタイプの免疫グロブリン、例えば、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4サブタイプ)、IgA1、IgA2、IgD、IgEまたはIgMに由来する。
【0161】
本発明において、上記の抗体Fcドメインは、変異が導入されると、関連するFc媒介活性を変化させることができる。例えば、上記の変異は、Fc媒介CDC活性を変化させる変異、Fc媒介ADCC活性を変化させる変異、FcRn媒介インビボ半減期を変化させる変異からなる群から選ばれてよい。本発明において、上記の変異は、CH2領域、CH3領域および/またはヒンジ領域で起こり得るものである。上記のFcの変異部位および/または変異後のFcのアミノ酸配列は、WO2017020802A1に記載されている。本発明において、上記の抗体Fcドメインは、SEQ ID NO:29で表されるアミノ酸配列を有し得る。
【0162】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、直接的または間接的に融合されている上記の抗体Fcドメインと上記の抗体重鎖可変領域を含み得る。例えば、上記の抗体重鎖可変領域は、上記の抗体Fcドメインにリンカーを介して連結し得る。例えば、上記のリンカーは連結ペプチドであってよい。本発明において、上記の連結ペプチドはGGGGS、GSまたはAPであってよい。
【0163】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4結合タンパク質が二量体構造を形成することを可能にする上記の抗体Fcドメインおよび上記の抗体重鎖可変領域を含み得る。例えば、上記の二量体構造はホモ二量体、またはヘテロ二量体であり得る。
【0164】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記の抗体138と上記の抗体Fcドメインを含み得る。例えば、上記の抗体FcドメインはヒトIgGのFcドメインであり得る。いくつかの場合において、上記のCTLA4結合タンパク質は、138-Fcを含むか、またはそれであり、ここで、上記のヒトIgGのFcドメインは、上記の138のC末端に位置してよい。例えば、上記の138-FcはSEQ ID NO. 9で表されるアミノ酸配列を有し得る。いくつかの場合において、上記のCTLA4結合タンパク質は138-FcAGであり、ここで、改変された上記のヒトIgGのFcドメインが上記の138のC末端に位置する。
【0165】
組成物およびその用途
他方、本発明は、本発明に係るCTLA4結合タンパク質を含む医薬組成物(例えば、腫瘍を治療するための医薬組成物)を提供する。
【0166】
本発明において、上記の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【0167】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質はCTLA4に特異的に結合することができる。例えば、ELISA検出により、上記のCTLA4結合タンパク質がCTLA4のみに特異的に結合可能であることを見出すことができる。例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴(SRP)アッセイにより、CTLA4への結合のKD値が約2.8*10-8以下、約2.6*10-8以下、約2.5*10-8以下、約2.0*10-8以下またはそれ以下であってよい。例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、ELISA検出により、CTLA4への結合のEC50値が約2以上、約2.5以上、約3以上、約3.5以上またはそれ以上であってよい。
【0168】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、CTLA4のそのリガンドへの結合をブロックしなくてよい。
【0169】
本発明において、CTLA4のそのリガンドへの結合がブロックされているかどうかの判断は、競合ELISA法、細胞中和アッセイおよびバイオレイヤー干渉(BLI)法からなる群より選択される方法によって行うことができる。例えば、競合ELISA法によって決定されるように、上記のCTLA4結合タンパク質がCD80とCTLA4への結合について競合する実験において、使用するCTLA4結合タンパク質の濃度がCD80タンパク質の濃度の約0.002~約2000倍である場合(例えば、CD80タンパク質の濃度が約50ng/mL、CTLA4結合タンパク質の濃度が約0.01ng/mL~100μg/mLの場合)、または使用するCTLA4結合タンパク質の濃度がCD86タンパク質の濃度の約0.002~約500倍である場合(例えば、CD86タンパク質の濃度が約50ng/mL、CTLA4結合タンパク質の濃度が約0.01ng/mL~約25μg/mLの場合)、得られる吸光度の低下は約30%未満である。別の例として、上記のCTLA4結合タンパク質は、競合FACSによって決定されるように、約0.01~約10000nMの範囲の濃度でヒトCTLA4を発現するHEK293細胞への結合についてヒトCD80または約1.6μg/mLのヒトCD86と競合することによって、得られる平均蛍光値の減少が約30%未満である。
【0170】
本発明において、上記の「実質的にブロックしない」は、約0.01~約100000 ng/mLの濃度範囲におけるCTLA4とそのリガンド(CD80またはCD86)との間の相互作用に対する有意な濃度依存性ブロッキング効果が見られないことを意味する。例えば、約0.01~約10000ng/mLの濃度範囲における上記のCTLA4結合タンパク質のCTLA4への結合が、CTLA4とそのリガンドCD80またはCD86への結合(ELISA検出のOD値の変化、または、FACS検出のMFIの変化による測定が可能である)に対して及ばす影響は約30%未満であり、かつ有意な濃度依存性がない。いくつかの場合において、上記の「ブロックしない」は、抗原エピトープの研究によっても確認することができる。例えば、CTLA4結合タンパク質により認識される抗原エピトープは、CLTA4がそのリガンド(CD80またはCD86)に互いに結合するエピトープが含まれないか、または、CLTA4がそのリガンド(CD80またはCD86)に互いに結合するエピトープと重複しないか、または、CTLA4結合タンパク質がCLTA4がそのリガンド(CD80またはCD86)に互いに結合するエピトープを認識しない。
【0171】
本発明において、上記のCTLA4のリガンドは、CD80またはその機能的断片およびCD86またはその機能的断片から選ばれ得る。
【0172】
本発明において、上記の機能的断片は、CD80またはCD86の生物学的活性を持つタンパク質の変異体または断片であり得る。例えば、上記のCD80機能的断片は、少なくとも1つのCD80機能的領域を有してよい。上記のCD80機能的領域とは、CD80の全長タンパク質領域、または全領域活性を保持する領域の一部を指す場合がある。例えば、上記のCD80機能的領域は、CD80の機能的V領域(43-123位のアミノ酸)またはその断片を含み得、CD28およびCTLA4に結合する能力を有してよく、および/または、上記のCD80機能的領域は、CD80の完全な細胞外セグメント(35-242位のアミノ酸)またはその断片を含み得る。例えば、上記のCD86機能的断片は少なくとも1つのCD86機能的領域を含み得る。上記のCD86機能的領域は、CD86のV領域(33-131位のアミノ酸)、CD86の完全な細胞外セグメント(24-274位のアミノ酸)などを含み得る。上記のCD80およびCD86の機能的領域のアミノ酸コードはUniprotデータベースの情報を参照する。ここで、CD80はUniprotのアクセッション番号がP33681、CD86はアクセッション番号がP42081である。
【0173】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合を、ipilimumabとKN044から選ばれ得る参照抗体と競合しなくてよい。
【0174】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質の上記のCTLA4への結合は、上記の参照抗体の上記のCTLA4への結合に影響されない場合がある。いくつかの場合において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4上のある位置/エピトープに結合してよく、上記の参照抗体は、上記のCTLA4上の上記の位置/エピトープと異なる別の位置/エピトープに結合してよい。例えば、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質とipilimumabは、それぞれ上記のCTLA4に結合する位置が異なっていてもよく、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合をipilimumabと競合しなくてよい。さらに、例えば、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質とKN044は、それぞれ上記のCTLA4に結合する位置が異なっていてもよく、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合をKN044と競合しなくてよい。
【0175】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4とサルCTLA4に結合することができる。本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、マウスCTLA4またはラットCTLA4に実質的に結合しなくてよい。本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質のCTLA4への結合は種特異的であり得る。
【0176】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のABEDC”鎖、A’Bループ、C”Dループ、DEループおよび/またはEFループにおける1つまたは複数のアミノ酸に結合または認識することができる。
【0177】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のC’鎖、C”Dループおよび/またはDEループにおける1つまたは複数のアミノ酸に結合または認識することができる。
【0178】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のC’鎖におけるE48、V49、V46およびT47の1つまたは複数のアミノ酸に結合または認識することができる。
【0179】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のC”Dループにおけるアミノ酸I67に結合または認識することができる。
【0180】
本発明において、ヒトCTLA4のタンパク質の3D構造は、UniProtデータベースの“structure”部分を参照してよく、ヒトCTLA4のタンパク質は、Protein Data Bank(PDB)データベースにおけるアクセッション番号が1I85である。
【0181】
例えば、本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4におけるE48、V49、D65、L84、D88およびY92からなる群から選ばれるアミノ酸残基を認識または結合することができる。本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、さらに、ヒトCTLA4におけるV46、T47、D64、I67およびG83からなる群から選ばれるアミノ酸残基を認識または結合することができる。
【0182】
例えば、本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4におけるV46、T47、E48、V49、D64、D65、I67、G83、L84、D88およびY92からなるアミノ酸残基の1つまたは複数を含む配座エピトープを認識または結合することができる。
【0183】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4におけるE48、V49、D65、L84、D88およびY92からなるアミノ酸残基を含む配座エピトープを認識または結合することができる。本発明において、ヒトCTLA4のアミノ酸残基E48、V49、D65、L84、D88およびY92の1つまたは複数が変異を引き起こす場合に、上記のCTLA4結合タンパク質がヒトCTLA4に特異的に結合する能力の喪失をもたらし得る(例えば、変異した上記のヒトCTLA4への上記のCTLA4結合タンパク質の結合のKD値の少なくとも約800倍、少なくとも約1000倍、少なくとも約1200倍またはそれ以上までの上昇をもたらし得る)。本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4の上記の配座エピトープを特異的に認識および/または結合し、ヒトCTLA4のアミノ酸残基E48、V49、D65、L84、D88およびY92のいずれか1つまたは複数が変異すると、上記の配座エピトープの配座が変化し得る。
【0184】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合を、ヒトCTLA4におけるK95、E97、M99、Y104、L106およびI108からなるアミノ酸残基の1つまたは複数を認識または結合する分子と競合しなくてよい。
【0185】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4への結合を、CTLA4のF鎖、FGループおよび/またはG鎖の1つまたは複数のアミノ酸を認識または結合する分子と競合しなくてよい。
【0186】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質のCTLA4に対しての認識または結合の位置は、上記のCTLA4のF鎖、FGループおよび/またはG鎖に位置しない場合がある。例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、CTLA4のF鎖、FGループおよび/またはG鎖の1つまたは複数のアミノ酸に結合しなくてよい。他のCTLA4結合タンパク質は、CTLA4のF鎖、FGループおよび/またはG鎖の1つまたは複数のアミノ酸を認識または結合すると、上記の他のCTLA4結合タンパク質のCTLA4への結合は、本発明に記載のCTLA4結合タンパク質のCTLA4への結合に影響を及ぼさない。
【0187】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のF鎖におけるK95、E97およびM99からなるアミノ酸の1つまたは複数に結合または認識しない場合がある。例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、ヒトCTLA4のFGループにおけるL106およびI108からなるアミノ酸の1つまたは複数に結合または認識しない場合がある。本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:1で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖CDR3を含む。X1 X2 X3 X4X5 X6 X7AWC X8R X9 X10X11 X12 X13 X14 X15 (SEQ ID NO:1)であり、ここで、X1-X12はすべて任意のアミノ酸である。
【0188】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:2で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖CDR3を含む。
【0189】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:3で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖CDR2を含む。X1 X2 X3 X4GT X5X6(SEQ ID NO:3)であり、ここで、X1-X6はすべて任意のアミノ酸である。
【0190】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:4で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖CDR2を含む。
【0191】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:5で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖CDR1を含む。X1 X2 X3N X4 X5X6 X7(SEQ ID NO:5)であり、ここで、X1-X7はすべて任意のアミノ酸である。
【0192】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:27で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖FR1を含む。QVQLVESGGG X1VQ X2GGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:27)であり、ここで、X1はSまたはLであり、X2はAまたはPである。
【0193】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:21およびSEQ ID NO:25のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖FR1を含む。
【0194】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:28で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖FR2を含む。MGWFRQAPGKX1 X2ERVAA(SEQ ID NO:28)であり、ここで、X1はEまたはGであり、X2はRまたはLである。
【0195】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:26のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖FR2を含む。
【0196】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:33で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖FR3を含む。YYADSVKGRFTISRDNX1KNTLX2LQMNSLX3X4EDTAX5YYCであり、ここで、X1はGまたはSであり、X2はFまたはYであり、X3はKまたはRであり、X4はPまたはAであり、X5はMまたはVである。
【0197】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:23およびSEQ ID NO:35のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖FR3を含む。
【0198】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:34で表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖FR4を含む。WGQGTX1VTVSX2(SEQ ID NO:34)であり、ここで、X1はQまたはLであり、X2はSであるか、またはアミノ酸がない。
【0199】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:24およびSEQ ID NO:36のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有し得る抗体重鎖FR4を含む。
【0200】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:7で表されるアミノ酸配列を有し得る重鎖可変領域を含む。
【0201】
QVQLVESGGGX1VQX2GGSLRLSCAASX3X4X5NX6X7X8X9MGWFRQAPGKX10X11ERVAAX12X13X14X15GTX16X17YYADSVKGRFTISRDNX18KNTLX19LQMNSLX20X21EDTAX22YYCX23X24X25X26X27X28X29AWCX30RX31X32X33X34X35X36X37WGQGTX38VTVSX39(SEQ ID NO:7)であり、ここで、X1はSまたはLであり、X2はAまたはPであり、X10はEまたはGであり、X11はRまたはLであり、X18はGまたはSであり、X19はFまたはYであり、X20はKまたはRであり、X21はPまたはAであり、X22はMまたはVであり、X38はQまたはLであり、X39はSであるか、またはアミノ酸がなく、残りのXはすべてアミノ酸である。
【0202】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:17-20のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する。
【0203】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、単一ドメイン抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれらであり、かつSEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:17-20のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する。
【0204】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、重鎖CDR1~重鎖CDR3を含有する抗体138を含むか、またはそれであり、ここで、重鎖CDR1はSEQ ID NO:6で表されるアミノ酸配列を有し得、重鎖CDR2はSEQ ID NO:4で表されるアミノ酸配列を有し得、重鎖CDR3はSEQ ID NO:2で表されるアミノ酸配列を有し得る。本発明において、上記の抗体138は、SEQ ID NO:8で表されるアミノ酸配列を有し得る重鎖可変領域を含み得る。本発明において、上記の抗体138は単一ドメイン抗体またはその抗原結合断片であり、SEQ ID NO:8で表されるアミノ酸配列を有し得る。
【0205】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体138のヒト化変異体(hu138V1~hu138V4)を含むか、またはそれであり得る。本発明において、上記の抗体138は単一ドメイン抗体またはその抗原結合断片であり、SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:17-20のうちいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有し得る。
【0206】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、2.6×108Mまたはそれ以下(例えば、2.5×108Mまたはそれ以下、2.0×108Mまたはそれ以下、1.5×108Mまたはそれ以下、1.0×108Mまたはそれ以下、あるいは0.5×108Mまたはそれ以下)のKD値でヒトCTLA4に結合することができる。
【0207】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、腫瘍細胞成長を抑制することができる。
【0208】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、CTLA4発現293細胞において約50%未満(例えば、約45%未満、約40%未満、約35%未満、約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満またはそれ以下)のCTLA4エンドサイトーシス分解率を引き起こすことができる。
【0209】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体Fcドメインをさらに含む。本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、抗体Fcドメインを含む場合に、上記のCTLA4結合タンパク質が二量体分子を形成することを可能にすると同時に、インビボでの上記の結合タンパク質の半減期を延長することができる。
【0210】
本発明において、上記の抗体Fcドメインは、IgG抗体由来のFcドメインを含み得る。例えば、上記のFcは、異なるサブタイプの免疫グロブリン、例えば、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4サブタイプ)、IgA1、IgA2、IgD、IgEまたはIgMに由来する。本発明において、上記の抗体Fcドメインは、変異が導入されると、関連するFc媒介活性を変化させることができる。例えば、上記の変異は、Fc媒介CDC活性を変化させる変異、Fc媒介ADCC活性を変化させる変異、FcRn媒介インビボ半減期を変化させる変異からなる群から選ばれてよい。本発明において、上記の変異は、CH2領域、CH3領域および/またはヒンジ領域で起こり得るものである。本発明において、上記の抗体Fcドメインは、SEQ ID NO:29で表されるアミノ酸配列を有し得る。
【0211】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、直接的または間接的に融合されている上記の抗体Fcドメインと上記の抗体重鎖可変領域を含み得る。例えば、上記の抗体重鎖可変領域は、上記の抗体Fcドメインにリンカーを介して連結し得る。例えば、上記のリンカーは連結ペプチドであってよい。本発明において、上記の連結ペプチドはGGGGS、GSまたはAPであってよい。
【0212】
本発明において、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記のCTLA4結合タンパク質が二量体構造を形成することを可能にする上記の抗体Fcドメインおよび上記の抗体重鎖可変領域を含み得る。例えば、上記の二量体構造はホモ二量体、またはヘテロ二量体であり得る。
【0213】
例えば、上記のCTLA4結合タンパク質は、上記の抗体138と上記の抗体Fcドメインを含み得る。例えば、上記の抗体FcドメインはヒトIgGのFcドメインであり得る。いくつかの場合において、上記のCTLA4結合タンパク質は、138-Fcを含むか、またはそれであり、ここで、上記のヒトIgGのFcドメインは、上記の138のC末端に位置してよい。例えば、上記の138-FcはSEQ ID NO. 9で表されるアミノ酸配列を有し得る。いくつかの場合において、上記のCTLA4結合タンパク質は138-FcAGであり、ここで、改変された上記のヒトIgGのFcドメインが上記の138のC末端に位置する。
【0214】
上記の薬学的に許容可能な担体は、通常、医薬組成物または製剤の調製に用いられ、一般的に、安全で、毒性がなく、生物学的にもその他の点でも好ましくないアジュバントを指す。使用されるアジュバントは、通常、ヒトまたは他の哺乳類への投与に適したものである。組成物の調製において、活性成分は通常、アジュバントと混合され、アジュバントによって希釈または封入される。アジュバントが希釈剤として使用される場合、それは抗体の有効成分のメディエーター、担体または媒体として作用する固体、半固体または液体材料であってよい。
【0215】
上記の薬学的に許容可能な担体は、緩衝剤、酸化防止剤、防腐剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、親水ポリマー、アミノ酸、糖、キレート剤、対イオン、金属複合体および/又は非イオン界面活性剤などを含み得る。例えば、上記の薬学的に許容可能な担体は、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌・抗真菌剤、等張化剤および/または吸収遅延剤を含み得る。
【0216】
本発明において、上記の医薬組成物は、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腫瘍部位におけるin situ投与、吸入、直腸投与、膣内投与、経皮投与又は皮下貯蔵部による投与のために調製されることができる。
【0217】
本発明に係る医薬組成物は、予防的および/または治療的に有効な量の上記のCTLA4結合タンパク質を含み得る。上記の予防的および/または治療的に有効な量は、疾患または障害および/または任意の合併症を患っているか、または発症の危険性がある被験者において、予防および/または治療(少なくとも部分的に)するために必要な量である。「有効量」は、通常、必要な用量および時間段階で、少なくとも所望または特定の効果(治療または予防の結果を含む)を達成するのに有効な量を指す。
【0218】
上記の医薬組成物は、腫瘍成長を抑制するために用いられることができる。例えば、本発明の医薬組成物は、疾患の発生または進行を抑制または遅延させることができ、腫瘍のサイズを縮小する(または実質的に排除することさえできる)ことができ、および/または疾患状態を軽減および/または安定化させることができる。上記の医薬組成物における上記のCTLA4結合タンパク質は、実際の用量レベルが特定の被験者、医薬組成物および投与様式に対して所望の治療応答を得るのに有効な量で変動し得る。
【0219】
他方、本発明は、腫瘍を治療するための医薬品の調製における上記の医薬組成物の使用を提供する。
【0220】
本発明において、上記の腫瘍は、固形腫瘍であってよい。いくつかの実施形態において、上記の腫瘍は、結腸がんと黒色腫から選ばれてよい。
【0221】
本発明において、上記の結腸がんは、結腸直腸がんを含み得る。
【0222】
他方、本発明は、腫瘍を治療するための本発明に係るCTLA4結合タンパク質または上記の医薬組成物を提供する。
【0223】
他方、本発明は、必要のある被験者に、本発明に係るCTLA4結合タンパク質または本発明に係る医薬組成物を投与するステップを含む、腫瘍を治療するための方法を提供する。
【0224】
本発明において、上記の方法は、インビボおよび/またはインビトロの方法であり得る。
【0225】
本発明において、上記の方法は、上記の被験者の免疫応答を増強することができる。例えば、上記の被験者のPBMCの活性化を刺激し、および/または、サイトカイン(例えばIL-2)の放出を刺激することができる。
【0226】
本発明において、上記の被験者は、ヒトおよび非ヒト動物からなり、例えば、上記の非ヒト動物は哺乳類からなる場合がある。例えば、上記の被験者は、ヒト及びサルから選択されてもよい。
【0227】
以下の実施例は、いかなる理論によっても限定されることを望むことなく、本発明に係る装置、方法、およびシステムの作用形態を釈明することのみを意図しており、本願発明の範囲を限定するものではない。
【0228】
実施例
実施例1 CTLA4結合タンパク質の調製
CN107400166Aに記載されている方法に従って、CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれSEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 4およびSEQ ID NO: 2で表されるアミノ酸配列を有する抗CTLA4単一ドメイン抗体138を組換え的に発現させた。上記の138抗体のアミノ酸配列はSEQ ID NO:8で表される。
【0229】
上記の138抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO:8で表される。このタンパク質は、本発明ではKN138とも呼ばれる。
【0230】
ヒトIgG1-Fc領域のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 10)は、タンパク質データベースUniprot上のヒト免疫グロブリンγ1(IgG1)の定常領域のアミノ酸配列(P01857)から取得された。逆転写PCRにより、ヒトPBMCの全RNAからヒトIgG1-Fcをコードする核酸断片を得、次いでオーバーラップPCRにより上記の138とFcの融合タンパク質138-Fcのコーディング核酸断片が得られた。次に、ベクターpCDNA4(Invitrogen、Cat V86220)にサブクローニングされた。組換えにより構築された138-FcプラスミドをHEK293細胞にトランスフェクトして抗体を発現させた。組換え発現プラスミドを、Freestyle293培地で希釈して、形質転換に必要なPEI (Polyethylenimine)溶液を加え、各群のプラスミド/PEI混合物をHEK293細胞懸濁液にそれぞれ添加し、50μg/L IGF-1を補充しながら37℃、10% CO2、90rpmで培養した。4時間後にEX293培地、2mM グルタミン、50μg/L IGF-1をさらに添加して、135rpmで培養した。24時間後に3.8mM VPAを加えた。5~6日間培養後、一過性発現培養上清を回収し、Protein Aアフィニティクロマトグラフィーで精製することによって、138-Fc(このタンパク質が本発明ではKN138-Fcとも呼ばれる)が得られた。138-Fcのアミノ酸配列がSEQ ID NO: 9で表される。
【0231】
138-Fcは、CN107849130Aおよび/またはWO2017/020802に記載の方法に従い、ヒト免疫グロブリンFc領域で変異を起こし、Fc領域からADCCおよびCDC活性を除去し(そのFc領域のアミノ酸配列がWO2017/020802を参照し、本発明ではSEQ ID NO:29で表される)、それにより138-FcAGを調製した。
【0232】
抗CTLA4単一ドメイン抗体KN044は、CN107400166Aに記載されている方法に従って組換え的に発現され、そのアミノ酸配列はSEQ ID NO: 11で表される。
【0233】
抗CTLA4抗体ipilimumabは、CN107400166Aに記載されている方法に従って組換え的に発現された。簡単に言えば、抗体遺伝子は、US20020086041A1に記載の抗体10D1の調製方法に従って、クローニングされ、ベクターpCDNA4にクローニングされた。組換えにより構築されたプラスミドは、HEK293細胞を一過性にトランスフェクトすることによって発現され、得られたCTLA4抗体は10D1と改名された(本発明では、10D1はipilimumabと互換的に使用可能であった)。
【0234】
Ipilimumabは、CN107849130Aに記載の方法に従って、ipilimumab-AGに調製された。ここで、ipilimumab-AGは、重鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO: 12で表され、軽鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO: 13で表される。
【0235】
実施例2 CTLA4に対するCTLA4結合タンパク質の結合能
2.1 バイオレイヤー干渉技術によるBLI法
組換えヒトCTLA4に対する実施例1で調製された138-Fcの結合能は、バイオレイヤー干渉法BLIによって検出された。測定はOctet K2機器を用いて行った。組換えラクダ抗ヒトFc抗体は、最初にAHC biosensorに固定化された。次に、ヒトCTLA4(SEQ ID NO: 13)とマウスFcの融合タンパク質CTLA4-muFc(SEQ ID NO: 14)を勾配で希釈し、試料を150s導入し、解離時間を900 sとし、10 mM glycine-HCl(pH1.7)を5s再生した。単純な1対1のLanguir結合モデル(Octet K2 データ分析ソフトウェアバージョン9.0(Data analysis 9.0))で結合速度定数(kon)と解離速度定数(Kdis)を算出した。平衡解離定数(kD)は、kdis/konの比率で算出された。
【0236】
親和性の測定結果を表1と図1に示した。
【0237】
【表1】
【0238】
2.2 細胞表面のCTLA4への結合
ヒトCTLA4タンパク質の完全長の遺伝子を含むプラスミドを含むヒトHEK293-CTLA4細胞は、一過性トランスフェクションによって得られ、ヒトCTLA4は膜上で一過性に発現された。
【0239】
HEK293-CTLA4細胞の密度を3% BSA/PBSで3×106個細胞/mlに調整した。実施例1で調製されたKN044または138-Fcを、3% BSA/PBSで希釈して、様々な濃度にした(1000 nM、250.00nM、62.50nM、15.63nM、3.91nM、0.98nM、0.24nM、0.06nM、0.02nM)。3μg/mLのCTLA4-muFcは、3% BSA/PBSを用いて配合された。
【0240】
1.5ml遠心分離管に、それぞれ50μlの細胞懸濁液、50μl CTLA4-muFC、50μlの濃度の異なるKN044または138-Fcを加えて、氷上で30min静置した。その後、1:100に希釈されたAPC-ヤギ抗マウスIgGを用いて、反応のために氷上で30min静置した。1%BSA/PBSで洗浄して再懸濁後、FACS装置に載せて検出した(Guava easycyte機器を使用)。
【0241】
フローサイトメトリーの結果は、Guava 5.3.1により分析し、検出された各試料の平均蛍光強度(MFI)を算出した。試料濃度に対する得られたMFIのlog値を算出し、GraphPad Prism 6.0を用いて実験結果に対して4パラメータでフィッティングを行った。
【0242】
結果は、図2と表2に示されいる。138-FcおよびKN044は、いずれも細胞表面に発現しているヒトCTLA4に濃度依存的に結合することができた。また、138-Fcは、KN044よりもEC50値がわずかに高かったことから、結合がわずかに低かったことを示した。
【0243】
【表2】
【0244】
実施例3 CTLA4とそのリガンドの相互作用に対するCTLA4結合タンパク質のブロッキング効果
3.1 競合ELISA法
CTLA4-Fc(そのアミノ酸配列がSEQ ID NO:16で表される)の濃度が3μg/ウェルのウェルにCB 3%BSAを添加して、プレートを室温で2時間被覆後、実施例1で調製された138-Fcまたはipilimumabを(陽性対照として)加えた。試料は、緩衝液Aで希釈後、25℃で2時間インキュベートされた。
【0245】
緩衝液Aは、1%BSA、0.05%PBST20と50ng/mLのCD80-muFc(ヒトCD80タンパク質とマウスFc断片の融合タンパク質であり、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO:30で表される)またはCD86-muFc(ヒトCD86タンパク質とマウスFc断片の融合タンパク質であり、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO:31で表される)が含まれている。緩衝液B(1%BSAと0.05%PBST20が含まれる)で1:3000の比率で希釈したヤギ抗マウスIgG1-HRP(Thermo)を加えて、405nmの波長における吸光度値を読み取った。
【0246】
ソフトウェアSotfMax Pro v5.4によるデータ処理およびグラフ解析を行い、4パラメータでフィッティングを行うことにより、CTLA4-CD80に対する138-Fcのブロッキングカーブが得られた。結果は、図3A~3Bに示され、138-FcがCTLA4-CD80(図3A)またはCTLA4-CD86(図3B)の相互作用をブロックしなかったことがわかる。
【0247】
3.2 バイオレイヤー干渉(BLI)法
実験に必要な機器はOctet K2であり、センサーはAMC biosensor (fortebio、18-5088)であり、試薬にはPBST(8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4および0.24g KH2PO4を秤量して800mlの超純水に溶解し、0.5ml Tween20を加えて均一に混合後容量を1Lにした)が含まれている。
【0248】
ヒトCTLA4とマウスFcの融合タンパク質CTLA4-muFc(そのアミノ酸配列がSEQ ID NO:15で表される)を、プローブに固定化し、1つ標的タンパク質P1(実施例1で調製された138-Fc)を最初に結合させ、次に、2つ標的タンパク質P2(実施例1で調製された138-Fc)に結合させ(結果が図4の曲線1に示された)、または、1つ標的タンパク質P1(実施例1で調製された138-Fc)を最初に結合させ、次に、2つ標的タンパク質P2(CD80-Fc、自己調製、ヒトCD80タンパク質とヒトFcタンパク質の融合タンパク質、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO:32で表される)に結合させた(結果が図4の曲線2に示されている)。図4の結果から、CD80-Fcは、138-Fcに既に結合した場合にも、CTLA4タンパク質に十分に結合することができることを示しており、138-FcがCTLA4への結合に関してCD80と競合しないと判断できる。
【0249】
3.3 CTLA4結合タンパク質と細胞発現タンパク質の競合実験
HEK293細胞へ、ヒトCTLA4の完全長の遺伝子を含むプラスミドまたはヒトCD86タンパク質の完全長の遺伝子を含むプラスミドを一過性にトランスフェクトし、HEK293-CTLA4細胞およびHEK293-CD86細胞をそれぞれ得た。HEK293-CTLA4細胞およびHEK293-CD86細胞はそれぞれ膜上でヒトCTLA4またはヒトCD86を一過性に発現し、
HEK293-CTLA4細胞およびHEK293-CD86細胞の密度を3%BSA/PBSで3×106個/mlに調整した。実施例1で調製されたKN044または138-Fcを、3%BSA/PBSで希釈して、様々な濃度にした(1000 nM、250.00nM、62.50nM、15.63nM、3.91nM、0.98nM、0.24nM、0.06nM、0.02nM)。3μg/mL CTLA4-muFcは3%BSA/PBSを用いて配合された。4.8μg/mL CD86-muFcは、3%BSA/PBSを用いて配合された。
【0250】
さまざまな実験要件に従って、1.5ml遠心分離管にそれぞれ以下の画分を添加した:HEK293-CTL4A/CD86-muFcを用いた競合実験:50μl HEK293-CTL4A細胞懸濁液、50μl CD86-muFC、50μlのさまざまな濃度のKN044または138-Fcを、氷上で30min静置した。
【0251】
HEK293-CD86/CTLA4-muFcを用いた競合実験:50μl HEK293-CD86細胞懸濁液、50μl CTLA4-muFC、50μlのさまざまな濃度のKN044または138-Fcを、氷上で30min静置した。
【0252】
次に、1:100に希釈されたAPC-ヤギ抗マウスIgGを用いて、氷上で30min静置しながら反応させた。1%BSA/PBSで洗浄して再懸濁後、FACS装置で検出した(Guava easycyte機器を使用)。
【0253】
フローサイトメトリーの結果をGuava 5.3.1で分析し、検出された各試料の平均蛍光強度(MFI)を算出した。試料濃度に対するMFIのlog値を算出し、GraphPad Prism 6.0を用いて実験結果に対して4パラメータでフィッティングを行った。
【0254】
実験結果は、図5A~5Bを参照して、138-FcがCTLA4-CD80またはCTLA4-CD86の相互作用をブロックしなかったことを示した。
【0255】
3.4 細胞発現CTLA4およびそのリガンドの相互結合に対するCTLA4結合タンパク質のブロッキング効果
ヒトHEK293細胞へ、ヒトhCTLA4-RFPタンパク質遺伝子を含むプラスミドまたはB7-1-GFPタンパク質遺伝子を含むプラスミド(pCDNA4, Invitrogen、Cat V86220)を一過性にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞株293-hCTLA4-RFPと293-B7-1-GFPをそれぞれ得た。それにより、膜上でヒトhCTLA4-RFPタンパク質またはB7-1-GFPタンパク質をそれぞれ一過性に発現した。B7-1-GFPタンパク質はB7-1(すなわちCD80)のC末端がEGFPタンパク質に、ヒトhCTLA4-RFPタンパク質はヒトCTLA4のC末端がRFPタンパク質に融合されているため、膜上のB7-1タンパク質の発現量を緑の蛍光強度、膜上のCTLA4タンパク質の発現量を赤い蛍光強度で調べることができるようになっている。24時間後に蛍光の発現を検出し、その結果を図6Aに示した。
【0256】
細胞株293-hCTLA4-RFPの細胞懸濁液に、それぞれ100nMの様々な抗体(138-Fcについて、ヒトCTLA4タンパク質に結合しないhIgG1を陰性対照、Ipilimumabを陽性対照として同時に設定)を添加して5minインキュベート後、同じ細胞数のB7-1-GFP細胞を加えて、均一に混合して5minインキュベート後、細胞の凝集状態を蛍光顕微鏡で観察した。結果は、図6Bに示されている。結果から、138-Fcの添加は、293-hCTLA4-RFPと293-B7-1-GFPとの間の相互作用に影響を与えないことが判明した。一方、Ipilimumabは、この2種類の細胞の相互作用をブロックした。
【0257】
293-hCTLA4-RFP、293-B7-1-GFP細胞の発現をフローサイトメトリーによりそれぞれ検出し、293-B7-1-GFP:293-hCTLA4-RFPを、細胞数比で5:1に混合して、5minインキュべーし、フローサイトメトリーで検出した。結果は、図6Cに示されている。
【0258】
細胞株293-hCTLA4-RFPの細胞懸濁液に、100nMの様々な抗体(138-Fcについて、hIgG1を陰性対照、Ipilimumabを陽性対照として同時に設定)を添加して5minインキュベート後、293-hCTLA4-RFP細胞に対して5倍量の293-B7-1-GFP細胞を加えて、均一に混合して5minインキュベート後、細胞の凝集状態をフローサイトメトリーで検出し、結果が図6Dに示されている。結果から、138-FcがCTLA4とそのリガンドの相互作用をブロックしなく、一方、IpilimumabがCTLA4とそのリガンドの相互作用をブロックしたことを判明した。
【0259】
細胞株293-hCTLA4-RFPの細胞懸濁液に、濃度の異なる(0nM、0.16nM、0.32nM、0.64nM、1.28nM、2.56nM、5.12nM、10.24nM、20.48nM、40.96nM、81.92nM、163.84nM)様々な抗体(138-Fcについて、hIgG1を陰性対照、Ipilimumabを陽性対照として同時に設定)を添加して5minインキュベート後、293-hCTLA4-RFP細胞に対して5倍量の293-B7-1-GFP細胞を加えて、均一に混合して5minインキュベート後、細胞の凝集状態をフローサイトメトリーで検出した。様々な抗体の様々な用量における293-hCTLA4-RFP細胞の293-B7-1-GFP細胞への結合度を算出した。
【0260】
ここで、結合度=[RFP+GFP+/(RFP+GFP++RFP+GFP-)]*100%。
【0261】
結果は図6Eに示されている。結果から、Ipilimumabを投与するにより293-hCTLA4-RFP細胞と293-B7-1-GFP細胞の結合度を低減し、一方、138-Fcはこの2種類の細胞に影響を与えないことを明らかにした。138-FcはCTLA4とそのリガンドの相互作用をブロックしなかったことがわかる。
【0262】
実施例4 CTLA4結合タンパク質の種特異性
4.1 ヒト、サル、ラットのCTLA4への結合
サルCTLA4タンパク質、ラットCTLA4タンパク質は義翹神州社から購入されたものであった。0.5μg/ウェルのサルCTLA4タンパク質、ラットCTLA4タンパク質またはヒトCTLA4タンパク質を、プレートに4℃で一晩被覆後、実施例1で調製された138-Fcの勾配希釈系列を添加して、室温で2時間反応させた。また、goat anti-human IgG-HRP(Sigma社から購入)を加えて、室温で2時間反応させた。次に、発色液を加え、405nmの波長における吸光度値を読み取った。
【0263】
ソフトウェアSotfMax Pro v5.4によるデータ処理およびグラフ解析を行い、4パラメータでフィッティングを行うことにより、CTLA4に対する親和性を反映するためにサル、ラットまたはヒトのCTLA4に対する138-Fcの結合曲線およびEC50値が得られた。
【0264】
結果は図7Aに示されている。ここで、縦軸はOD405、横軸は138-Fcの濃度(単位ng/mL)を表す。結果から、138-FcはヒトまたはサルのCTLA4タンパク質に効果的に結合することができるが、ラットのCTLA4タンパク質に結合しないことを示している。
【0265】
4.2 マウスのCTLA4への結合
Thermo社によるBiotinlytionキットで、ビオチン化マウスCTLA4タンパク質であるmCTLA-biotinを取得した。
【0266】
0.5μg/ウェルの実施例1で調製された138-Fcタンパク質を、プレートに4℃で一晩被覆後、mCTLA4-biotinの勾配希釈系列を添加して、室温で2時間反応させた。次に、SA-HRP(Sigma社から購入)を加えて、室温で1.5時間反応させた。また、発色液を加え、405nmの波長における吸光度値を読み取った。
【0267】
ソフトウェアSotfMax Pro v5.4によるデータ処理およびグラフ解析を行い、4パラメータでフィッティングを行うことにより、CTLA4に対する親和性を反映するためにサル、ラットまたはヒトのCTLA4に対する138-Fcの結合曲線およびEC50値が得られた。
【0268】
結果は図7Bに示されている。ここで、縦軸はOD405、横軸は138-Fcの濃度(単位ng/mL)を表す。結果から、マウスのCTLA4タンパク質への138-Fcの結合は弱かったことを示している。
【0269】
実施例5 SEB刺激PBMC上のCTLA4結合タンパク質の活性化
末梢血単核細胞(PBMC)は、ヒトリンパ球分離液(Tianjin Haoyang)の密度勾配遠心分離を使用して健康なドナーからの末梢血濃縮白血球から分離された。
【0270】
黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)は、抗原提示細胞上の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスII分子やT細胞受容体の特異的Vβ領域に直接結合することによって、宿主免疫応答を効果的に刺激し、さらに複数の種類のサイトカインの放出を誘導するスーパー抗原であった。SEB刺激ヒトPBMC系は、CTLA4結合タンパク質がPBMCの活性化を促進し、サイトカインIL-2の放出を刺激することを評価することに用いられる。PBMCを、96ウェルプレートに2×105個細胞/ウェルでプレーティングし、実施例1で調製された138-Fcと陽性対照抗体KN044を同時に添加し、一方、陰性対照(標識はSEB only)としてPBSのみの群を加えて60 min反応後、SEBを加えて5日間共培養後、上清中のIL-2含有量をElisaで検出した。
【0271】
実験結果は、図8A~8Cに示されており、スーパー抗原SEB(200 ng/ml)の刺激下で、3つの異なる個体由来のPBMC系のうち、1つの系統の138-Fcが高濃度(200nM)でPBMCからのIL-2分泌を有意に刺激することができ、別の1つの系統が高濃度(100nM)で、ある程度のIL-2分泌も観察され、最後の1つの系統が0.2~200nMの濃度範囲でIL-2分泌が観察されなかったことを示している。一方、陽性対照KN044抗体はすべて、3つの系統においてヒトPBMCからのIL-2分泌を用量依存的に刺激することができた。したがって、138-FcはインビトロでSEB刺激PBMCを活性化させることができるが、その活性化効果はブロッキング活性があるCTLA4結合タンパク質KN044よりも弱かったことがわかった。
【0272】
実施例6 ヒト化マウスにおけるCTLA4結合タンパク質の抗腫瘍効果
6.1担癌マウスモデルにおける抗腫瘍効果
CTLA4ヒト化マウス(すなわちヒトCTLA4タンパク質を発現するマウス)を採取し、5*105 MC38腫瘍細胞を接種した。
【0273】
接種後7、10、13、16日目に、100μgの検出対象試料または等量のヒト免疫グロブリン(マウス体重約20gに基づき、投与量は約5mg/kg)をそれぞれ対照群として腹腔内投与した。腫瘍のサイズは、接種後7日目から28日目まで3日ごとに測定した。ここで、実施例1で調製された用量(nM)の異なる138-Fc、及びBMS社が既に市販しているCTLA4モノクローナル抗体薬ipilimumab(lpilimと略称される)が試料が調べられ、ヒト免疫グロブリン群(hIgと略称される)を陰性対照とした。各処理におけるマウスの数は5匹であった。
【0274】
結果は図9に示されており、ここで、hIgはヒト免疫グロブリンIgG1、lpilimはipilimumabであった。結果から、実施例1で調製された138-Fcは、CTLA4ヒト化マウスにおける抗腫瘍効果が約5mg/kgの用量で、BMSのipilimumabと同等であったことが明らかとなった。
【0275】
6.2担癌マウスモデルにおける抗腫瘍効果再誘発
実施例6.1でipilimumabまたは実施例1で調製された138-Fc抗体で治療後腫瘍退縮をもたらしたCTLA4ヒト化マウス(すなわちヒトCTLA4タンパク質発現マウス)を採取し、最初の腫瘍細胞接種から100日目に、以前の腫瘍発生部位とは異なる箇所に5*105 MC38腫瘍細胞を皮下再注入し、再誘発(rechallenge)マウスモデルを得た。同時に、実験を行っていないCTLA4ヒト化マウスを採取して、5*105 MC38腫瘍細胞を直ちに接種し、MC38腫瘍モデルを陰性対照として構築した。
【0276】
腫瘍のサイズは、接種後7日目から28日目まで3日ごとに測定した。
【0277】
結果は図10に示されており、ここで、hIgはヒト免疫グロブリンIgG1、lpilimはipilimumabであった。結果から、138-Fcで治療後腫瘍退縮をもたらしたマウスは、腫瘍を再移植後、依然として良好な抗腫瘍効果を維持し、かつ、抗腫瘍効果が腫瘍再移植後のipilimumab投与群と同等であった。
【0278】
6.3担癌マウスモデル中の抗腫瘍効果
6~8週齢の雌CTLA4ヒト化マウス(すなわち、ヒトCTLA4タンパク質発現マウス)を採取して、1*106 MC38腫瘍細胞を皮下注入した。
【0279】
腫瘍を皮下接種後0、3、6、9日目に、それぞれ各マウスに、0.8mpkのヒトIgG、ipilimumab、ipilimumab-AG、または0.5 mpkの実施例1で調製された138-Fc、138-FcAGを腹腔内投与した。また、腫瘍体積は、腫瘍を接種後9、12、16、19日目に測定された。
【0280】
結果は図11に示されるように、ヒトIgG、ipilimumab、ipilimumab-AG、138-Fcおよび138-FcAGの処理に対応する腫瘍体積の変化を示している。ここで、群1~5は、上記のヒトIgG対照群(0.8mpkの用量で週2回)、ipilimumab(0.8mpkの用量で週2回)、ipilimumab-AG(0.8mpkの用量で週2回)、138-Fc(0.5mpkの用量で週2回)、138-FcAG(0.5mpkの用量で週2回)の処理に対応する腫瘍抑制効果をそれぞれ順次に示した。結果から、138-Fcの抗腫瘍効果がIpilimumabと同等であったことが明らかとなった。一方、ADCC活性を除去された抗体である138-FcAGとipilimumab-AGは、実験的投与量で、腫瘍成長を抑制する効果が本質的に示されなかった。
【0281】
6.4担癌マウスモデルにおける腫瘍微小環境中の免疫細胞の分析
6~8週齢の雌CTLA4ヒト化マウス(すなわち、ヒトCTLA4タンパク質発現マウス)を採取して、1*106 MC38腫瘍細胞を皮下注入した。
【0282】
皮下注入後0、3、6、9日目に、それぞれ各マウスに、0.8mpkのヒトIgG、ipilimumab、ipilimumab-AG、または0.5 mpkの実施例1で調製された138-Fc、138-FcAGを腹腔内投与した。
【0283】
マウスは、11日目に殺処分され、腫瘍が摘出された。各群のマウスに対応する腫瘍を図12に示した。図中のG1、G2、G5、G6およびG7は、上記のipilimumab、ipilimumab-AG、138-Fc、138-FcAGおよびヒトIgGの処理に対応する腫瘍の形態をそれぞれ順次に示した。
【0284】
腫瘍を粉砕して、その中の免疫細胞を分離した後、CD4、CD8、FOXP3バイオマーカーで染色し、染色状況の異なる細胞をフローサイトメトリーでタイピングした。結果を図13A~13Cに示している。
【0285】
図13A~13Cの結果から、138-Fcおよびipilimumab投与マウスでは、陰性対照群(hIgG群)と比較して、全CD4陽性T細胞に対する制御性T細胞(Treg、抑制性T細胞であり、FOXP3陽性/CD4陽性で表される)の割合、または全T細胞に対する割合が有意に低下し、ADCC活性が除去された138-FcAGおよびipilimumab-AG投与群(すなわちlpl-FcAg)におけるTregの割合は陰性対照群と変わらなかった。同時に、138-Fcおよびipilimumab投与マウスでは、制御性T細胞(Treg、抑制性T細胞であり、FOXP3陽性/CD4陽性で表される)に対するCD8陽性T細胞(一般に特異的に活性化されたキラーT細胞)の割合が陰性対照群(hIgG群)およびADCC活性が除去された138-FcAG(138-FcAgとしても示される)およびipilimumab-AG投与群(すなわちlpl-FcAg)よりも、有意に増加した。一方、ADCC活性が除去された医薬品投与群では、CD8陽性T細胞の割合が陰性対照群と変わらなかった。
【0286】
以上の結果から、ブロッキング活性を持たないCTLA4結合抗体138-FcAGは、マウス腫瘍モデルでブロッキング活性を持つipilimumabと同等の腫瘍抑制効果を示すと共に、ipilimumabと同様に腫瘍におけるTregの割合を減らし、CD8陽性T細胞の割合を増加させることができたことが分かった。上記の効果はFc媒介ADCC活性に関連している。
【0287】
実施例7 結晶構造
図14A~14Fは、それぞれヒトCTLA4に結合している138抗体、10D1(ipilimumab)、B7-1の相対位置を示している。ここで、図14AはヒトCTLA4/B7-1の複合体構造、図14BはヒトCTLA4/ipilimumabの複合体構造、図14CはヒトCTLA4/138抗体の複合体構造、図14DはヒトCTLA4を中心としたヒトCTLA4/ipilimumabとヒトCTLA4/B7-1の複合体の重ね合わせを示し、ヒトCTLA4に結合しているipilimumabとB7-1の相対位置を示し、図14Eは、ヒトCTLA4を中心としたヒトCTLA4/138抗体とヒトCTLA4/B7-1の複合体の重ね合わせを示し、ヒトCTLA4に結合している138抗体とB7-1の相対位置を示し、図14Fは、ヒトCTLA4/138抗体複合体の相互作用の詳細図を示し、CDR1-3の重要なアミノ酸残基部位をマークした。
【0288】
図15Aは、左から順に、ヒトCTLA4/B7-1の複合体、ヒトCTLA4/tremelimumabの複合体、ヒトCTLA4/ipilimumabの複合体とCTLA4/138の複合体の構造を示している。図15Bは、ヒトCTLA4を中心とした、ヒトCTLA4に結合する様々な抗体の複合体の重ね合わせの構造図を示している。図15Cは、それぞれ138と複合体を形成する単量体、二量体ヒトCTLA4の精製図を示しており、ここで、aは単量体ヒトCTLA4と138が形成した複合体の様子、bは二量体ヒトCTLA4と138が形成した複合体の様子を示している。図15Dは、細胞膜表面で二量体ヒトCTLA4と別の細胞膜上のB7-1と138の三者結合の模式図を示している。
【0289】
ヒトCTLA4/138抗体の複合体の結晶構造は具体的に表3に示されている。
【0290】
【表3】
【0291】
表4A、4Bは、ヒトCTLA4/ipilimumabの複合体とCTLA4/138の複合体の相互作用に関与するアミノ酸のリストを順に示している。
【0292】
【表4A】
【0293】
【表4B】
【0294】
実施例8 CTLA4結合タンパク質の細胞レベルでのADCC活性の検証
完全長ヒトCTLA4タンパク質を発現するプラスミドを、構築されたヒトCD20タンパク質を安定して発現するCHO細胞株CHO-CD20に一過性にトランスフェクトし、この細胞株にヒトCD20とヒトCTLA4タンパク質の両方を発現させ、この細胞をCHO-CD20-CTLA4と称した。48h後に細胞を回収し、96ウェル白色プレートに25μlの濃度のそれぞれ異なる(300μg/ml、30μg/ml、3μg/ml、0.3μg/ml、0.03μg/ml)様々な抗体、25μlの標的細胞(CHO-CD20-CTLA4)、25μl Jurkat-CD16a-176V-NFAT-REをそれぞれ加えた(この細胞株は、ATCCから購入のJurkat細胞でヒトCD16aタンパク質とADCC活性関連レポーター遺伝子システムNFAT-REを安定的にトランスフェクトしたものである。標的細胞がADCC効果により活性化されると、このレポーターシステムはルシフェラーゼを発現し、さらに蛍光基質反応による蛍光強度からADCC活性の強さを調べる)。混合溶液を37℃で4hインキュベートし、各ウェルに20μl Luciferase基質を加えて、機器に入れてすぐに検出した。
【0295】
結果は図16に示されており、図中の群1~8がそれぞれKN044-FcAG、138-Fc、138-FcAG、KN044、ヒトIgG1、Rituxanおよび陰性対照(標的細胞添加なし)の結果に対応している。図16の結果から、138-FcとKN044が用量依存的なADCC活性を示し、ここで、138-Fcの活性がKN044よりもわずかに高かった一方で、2つのCTLA4結合タンパク質がいずれもRituxanより活性が低かったことを示している。突然変異後、138-FcAGとKN044-FcAGはADCC活性がほとんど検出されなくなった。
【0296】
実施例9ヒトCTLA4に結合するCTLA4結合タンパク質のエピトープに対するOctet K2による検出
ヒトCTLA4にアミノ酸変異を施し、変異したヒトCTLA4変異体の138-Fcへの結合活性を、特に実施例2.1を参照して、BLI法によって検出した。表5に状況を示した。
【0297】
【表5】
【0298】
図17は、ヒトCTLA4変異体に結合した138-FcのKD値と、ヒトCTLA4(WT)に結合した138-FcのKD値との比を示している。図17の結果から、E48A、V49A、D65A、L84A、D88AおよびY92Aのアミノ酸変異はいずれも変異体のKD値を1000倍以上上昇することができ、それによりヒトCTLA4のE48、VV49、D65、L84、D88およびY92が138-FcのヒトCTLA4に結合するエピトープの構成要素と思われることが示唆された。
【0299】
実施例10:CTLA4結合タンパク質のヒト化
10.1ヒト化配列の取得
ヒト化の方法は、タンパク質表面アミノ酸ヒト化(resurfacing)法またはVHHヒト化ユニバーサルフレームワーク移植法(CDR grafting to a universal framework)を採用することによって達成された。
【0300】
ヒト化のステップは以下の通りである:実施例1で調製された抗体138のホモロジーモデリングを行い、モデリングソフトウェアはModeller9であった。参照相同配列はNbBcII10抗体(PDB番号:3DWT)であり、アミノ酸の相対溶媒接触可能性(relative solvent accessibility)はタンパク質の三次元構造に従って算出された。138のあるアミノ酸が溶媒にさらされると、すべてのアミノ酸が最終的に置換されるまで、参照ヒト抗体10HQ配列の同一位置のアミノ酸に置換された。
【0301】
VHHヒト化ユニバーサルフレームワーク移植法は以下のように行った。まず、Cecile Vinckeらが配列相同性に基づいて設計したVHHヒト化ユニバーサルフレームワークhNbBcII10FGLA(PDB番号:3EAK)を得て、このフレームワークがナノボディNbBcII10抗体(PDB番号:3DWT)、参照ヒト化抗体(PDB番号:1OHQ)に基づいてタンパク質表面のアミノ酸をヒト化する共に、VHH配列フレームワーク1(framework1、すなわちFR1)のアミノ酸VLPの一部、VHH配列フレームワーク2(FR2)のアミノ酸GLの一部、VHH配列フレームワーク3(FR3)のアミノ酸RSKRAAVの一部およびVHH配列フレームワーク4(FR4)のアミノ酸Lを修飾することによって設計された。
【0302】
138のヒト化により、4つの138のヒト化変異体(hu138V1~hu138V4)がそれぞれ得られた。これらのヒト化変異体の配列番号およびその中のアミノ酸残基番号をKabat番号と比較して、ヒト化配列の比較を行った結果を表6に示している。ここで、このアミノ酸残基を有する場合、記号"√"で表示されている。
【0303】
【表6】
【0304】
ここで、hu138V1は、HFR1-HFR4を含み、ここで、HFR1がSEQ ID NO.21で表されるアミノ酸配列、HFR2がSEQ ID NO.22で表されるアミノ酸配列、HFR3がSEQ ID NO.23で表されるアミノ酸配列、HFR4がSEQ ID NO.24で表されるアミノ酸配列を有し、また、hu138V1は、SEQ ID NO.17で表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【0305】
ここで、hu138V2は、HFR1-HFR4を含み、ここで、HFR1がSEQ ID NO.25で表されるアミノ酸配列、HFR2がSEQ ID NO.22で表されるアミノ酸配列、HFR3がSEQ ID NO.23で表されるアミノ酸配列、HFR4がSEQ ID NO.24で表されるアミノ酸配列を有し、また、hu138V2は、SEQ ID NO.18で表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【0306】
ここで、hu138V3は、HFR1-HFR4を含み、ここで、HFR1がSEQ ID NO.21で表されるアミノ酸配列、HFR2がSEQ ID NO.26で表されるアミノ酸配列、HFR3がSEQ ID NO.23で表されるアミノ酸配列、HFR4がSEQ ID NO.24で表されるアミノ酸配列を有し、また、hu138V3は、SEQ ID NO.19で表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【0307】
ここで、hu138V4は、HFR1-HFR4を含み、ここで、HFR1がSEQ ID NO.25で表されるアミノ酸配列、HFR2がSEQ ID NO.26で表されるアミノ酸配列、HFR3がSEQ ID NO.23で表されるアミノ酸配列、HFR4がSEQ ID NO.24で表されるアミノ酸配列を有し、また、hu138V4は、SEQ ID NO.20で表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【0308】
10.2 哺乳動物細胞を用いた融合タンパク質の調製
10.1で得られたヒト化配列は、SYNバイオテック(蘇州)有限公司に、遺伝子合成を行うと共に、両末端に酵素消化部位を付加するように委託された。138のヒト化変異体(hu138V1~hu138V4)を二重酵素消化して、ヒトIgG1 FcをコードするDNA断片に融合させた。融合断片を従来の哺乳動物発現ベクターにクローニングし、ヒト化138-Fc標的タンパク質(hu138V1-Ld-Fc~hu138V4-Ld-Fc)を哺乳動物で発現するための組換えプラスミドを得た。
【0309】
上記の組換えプラスミドをHEK293細胞にトランスフェクトして、抗体を一過性に発現した。組換えプラスミドをFreestyle293培地で希釈して、形質転換に必要なPEI(Polyethylenimine)溶液に加え、各群のプラスミド/PEI混合物をそれぞれHEK293細胞の懸濁液に添加して、37℃、5% CO2、130rpmの条件で培養を行った。4時間後にEXCELL293培地(2mMグルタミン入り)を補充し、130rpmで培養した。24時間後に3.8mM VPAを、72時間後に4g/Lのグルコースを加えた。5~6日間培養後、一過性発現培養上清を回収し、Protein Aアフィニティクロマトグラフィーで精製することによって、標的タンパク質が得られた。標的タンパク質の純度は、SDSPAGEとSECHPLCによって予備的に検討された。発現状況と純度分析を表7に示した。
【0310】
【表7】
【0311】
10.3標的タンパク質の熱安定性の検出
微量体積の10.2で調製された標的タンパク質は、UNCHAINED LABS社のタンパク質熱安定性試験機を用いて測定された。
【0312】
昇温手順:開始温度15℃、昇温速度0.3℃/min、終了温度95℃。各温度、各波長における試料の蛍光吸光度の値を記録した。変性温度Tm値はソフトウェアによって信頼波長BCMの次導関数の最高点として適合され、重合開始温度Tagg値は静的光散乱SLSの473nmにおける次導関数の10分の1の値であった。Tm1の値が高いほど、そのタンパク質は安定であることを意味した。結果は表8に示されている。表8の結果から、これらの標的タンパク質のTm1の値はいずれも60℃より高く、良好な安定性を有していることがわかった。
【0313】
【表8】
【0314】
実施例11:CTLA4結合タンパク質媒介細胞膜表面CTLA4のエンドサイトーシス分解作用
実施例3.3に従ってヒトCTLA4タンパク質発現HEK293-CTLA4細胞を得た。
【0315】
各検出対象のCTLA4結合タンパク質の初期濃度を120nMに調整した。24ウェル培養プレートを取り、各ウェルに100μlの成長培地、100μlの検出対象のCTLA4結合タンパク質を添加した。HEK293-CTLA4細胞の密度を1.2*106個/mlに調整して各ウェルに100μlのHEK293-CTLA4細胞を加えた。次に、37℃で1~6時間インキュベートした。次に、細胞を回収し、上清を捨て、ヒトCTLA4抗体PE-anti-human CD152(1:50に希釈)を50μl加えた。次に、4℃で45minインキュベートし、1%BSA/PBSで細胞を2回洗浄した。細胞を、チューブあたり200μL 1%BSA/PBSを加えて再懸濁し、様々な検出対象のCTLA4結合タンパク質でインキュベートされた後のHEK293-CTLA4の細胞膜上のCTLA4量の変化をFACSにより平均蛍光強度(MFI)で検出した。
【0316】
結果は図18に示されるように、138-FcをHEK293-CTLA4細胞と1~6時間インキュベート後、不活性対照アイソタイプ抗体(human IgG1)や抗体処理を行わない対照群と比較して、細胞表面上のCTLA4の発現量に本質的な違いがなかった。これは、138-Fcを37℃で1~6時間インキュベートした場合、細胞膜表面上のCTLA4分子のエンドサイトーシス分解を起こさないか、または膜表面上のCTLA4分子をさらに安定化させることができることを示唆している。一方、KN044およびipilimumabで処理された細胞は、CTLA4の発現量が有意に低下したことから、KN044またはipilimumabがエンドサイトーシスによって細胞膜表面のCLTA4密度を低下させたことが示唆された。
【0317】
実施例12:免疫再構築マウスにおけるCTLA4結合タンパク質の予備的毒性評価
特性の異なるCTLA4結合タンパク質による免疫毒性を予備的に評価するために、免疫再構築マウス(すなわち、免疫不全マウスにヒト免疫芽細胞を移植し、それによってマウス内のヒト免疫系を再構築したマウス)を選び、対照群として検出されようとするCTLA4結合タンパク質(実施例1で調製された138-Fc、BMS社が既に市販しているCTLA4モノクローナル抗体薬ipilimumab(lpilimと略称))100μgまたは同等体積のPBS(マウス体重約20gに基づいて、投与量が約5mg/kg)を、それぞれ週2回腹腔内投与した。各群のマウスの数は5匹であった。
【0318】
投与してから19日目まで、毎日マウスの様子を観察した。結果から、19日目までにipilimumab投与群ではすべてのマウスがipilimumab投与による急性免疫反応を起こしたのに対し、138-Fc投与群では薬物反応を起こしたマウスがただ2匹いて、対照群ではすべてのマウスが生存していることが判明しました。
【0319】
その結果、138-Fcタンパク質は、ipilimumabより薬理学的毒性が低かったことを示した。
【0320】
以上、詳しい説明は、解釈するか、または例を挙げるように記載されたが、添付の請求項範囲を限定するわけではない。これまで本明細書に記載の実施形態に、多様な変更などがあることが当業者に明らかであり、且つ、添付の請求項とそれに同等する実施形態の範囲に属する。
図1
図2
図3
図4
図5
図6-1】
図6-2】
図7A
図7B
図8
図9
図10
図11
図12
図13
図14
図15
図16
図17
図18
【配列表】
0007557521000001.app