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▶ リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-18
(45)【発行日】2024-09-27
(54)【発明の名称】治療用モノクローナル抗体の品質特性の定量化及びモデル化
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20240919BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240919BHJP
A61K 39/395 20060101ALN20240919BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
C07K16/18
A61K39/395 N
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2023086606
(22)【出願日】2023-05-26
(62)【分割の表示】P 2020539270の分割
【原出願日】2019-01-31
(65)【公開番号】P2023113739
(43)【公開日】2023-08-16
【審査請求日】2023-06-26
(31)【優先権主張番号】62/625,219
(32)【優先日】2018-02-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】507302748
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】スー シャオビン
(72)【発明者】
【氏名】ホアン ユー
【審査官】高田 亜希
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５３６９３５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０３５９８５３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Bing Cai et al，C-terminal lysine processing of human immunoglobulin G2 heavy chain in vivo，Biotechnology and Bioengineering，2011年，108(2)，404-412
【文献】灘井雅行，薬物動態学の基礎と薬物投与設計への応用，日本小児腎臓病学会雑誌，2006年，19(2)，P47-59
【文献】小田裕，麻酔薬の薬物動態，日本臨床麻酔学会誌，2005年09月，25(5)，447-454
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８ －３３／９８
Ｃ０７Ｋ １／００ －１９／００
Ａ６１Ｋ ３９／００ －５１／１２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗体の製品品質特性（ＰＱＡ）の許容範囲を特定する方法であって、（ａ）抗体の単回投与後の、ＰＱＡを伴う前記抗体のインビボ血清中濃度を、
（ｉ）ＰＱＡを伴う前記抗体のパーセンテージを、前記ＰＱＡに対して特定されるインビボ速度定数を用いて予測すること、及び
（ｉｉ）ＰＱＡを伴う前記抗体の前記予測されたパーセンテージに、前記抗体の全インビボ濃度を掛けて、ＰＱＡを伴う前記抗体の濃度を特定すること、およびそれにより単回投与モデルを作製すること；
により予測し、
（ｂ）工程（ａ）を少なくとも1回繰り返し、それにより、1つ以上の追加の単回投与モデルを作製すること；
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）の複数の単回投与モデルを重ね合わせること、およびそれにより複数回投与モデルを作製すること；
（ｄ）複数回投与モデルを使用して、初期ＰＱＡレベルと、抗体の複数回投与後のＰＱＡレベルの間の関係を特定すること；ならびに
（ｅ）前記関係を使用して、抗体のＰＱＡの許容範囲を特定すること、
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記ＰＱＡについての前記インビボ速度定数が、前記ＰＱＡのパーセンテージを時間の関数として定量化すること、及び
前記ＰＱＡの前記定量化されたパーセンテージを、方程式
によって特定され、
式中、ＰＰＱＡ（ｔ）は、時間の関数としての前記ＰＱＡの割合であり、Ｐ0は、ＰＱＡの初期パーセンテージであり、ｋＰＱＡは、前記ＰＱＡの速度定数である、
請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＰＱＡを伴う前記抗体への曝露を特定することをさらに含み、前記ＰＱＡを伴う前記抗体への曝露を特定することが、前記ＰＱＡを伴う前記抗体の濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）を特定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記抗体の前記血清中濃度が、２コンパートメント薬物動態モデルの方程式Ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔで示され、式中、Ａ及びＢは、それぞれ、α及びβがハイブリッド一次定数である場合のハイブリッド係数である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
抗体のＰＱＡの許容範囲が、抗体の複数回投与後のＰＱＡレベルが、実質的に前記初期ＰＱＡレベルに対して非感受性であるＰＱＡレベルの範囲を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
抗体のＰＱＡの許容範囲が、抗体の複数回投与後の前記ＰＱＡを伴う前記抗体への曝露が、実質的に前記初期ＰＱＡレベルに対して非感受性であるＰＱＡレベルの範囲を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
抗体のＰＱＡの許容範囲が、約０％及び約１０％の間、約０％及び８％の間、約０％及び約５％の間、約０％及び約４％の間、約０％及び約３％の間、約０％及び約２％の間、約０％及び約１％の間、約０％及び約０.５％の間、約０％及び約０.２％の間、または約０％及び約０.１％の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記抗体が、治療用組み換えモノクローナル抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記ＰＱＡが、薬物の安定性、安全性、及び／または有効性に影響を与え得る、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記ＰＱＡが、脱アミド化、酸化、糖化、ジスルフィド形成、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、Ｃ末端リジン除去、及び高マンノースグリコシル化のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
（i）薬物動態濃度とＰＱＡバリアントの割合との相関をモデル化すること、（ii）単回投与レジメンまたは複数回投与レジメンのいずれかでの代表的なＰＱＡへの対象の曝露を定量的に評価及び予測すること、
（iii）複数回投与レジメンで観察される最大及び最小のＰＱＡレベルを予測すること、および／または
（iv）対象への抗体の投与後の、対象における抗体の全インビボ濃度を特定すること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記ＰＱＡを伴う抗体の投与前インビボ濃度を予測することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
定常状態での前記ＰＱＡを伴う抗体の投与前インビボ濃度を予測することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ＰＱＡを伴う抗体の投与後インビボ濃度を予測することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
定常状態での前記ＰＱＡを伴う抗体の投与後インビボ濃度を予測することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表
本出願は、２０１９年１月３１日に作成され、５１４バイトを含む１０４２１ＷＯ０１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照することにより組み込む。
本出願は、２０１９年１月３１日に作成され、５１４バイトを含む１０４２１ＷＯ０１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照することにより組み込む。
【0002】
発明の分野
本発明は、バイオ医薬品に関し、また、治療用抗体のインビボ翻訳後修飾の予測及びモデル化に関する。
本発明は、バイオ医薬品に関し、また、治療用抗体のインビボ翻訳後修飾の予測及びモデル化に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、哺乳類細胞で産生される異種分子であり、翻訳後修飾（ＰＴＭ）に起因するバリアント等、多くの製品バリアントを含む。ＰＴＭを介して産生されるバリアントは、製造中、精製中、保存中、及び投与後のｍＡｂの存続期間を通して生じ得る。これらバリアントまたは製品関連の修飾は、製品品質特性（ＰＱＡ）とも呼ばれる。事前に定義された許容基準内でＰＱＡを制御することは、一貫した製品品質を保証し、薬物の安全性と有効性への潜在的な影響を低減することから、バイオ医薬品業界にとって不可欠である。薬物の製造及び保存中に生じる修飾は、多くの場合、確実に監視及び制御することができる。しかしながら、薬物の投与後、製剤緩衝液に対して著しく異なる血流の環境のため、さらなる修飾が生じ得る。ｍＡｂのインビボ修飾は、通常、監視が困難であり、あまり研究されていない。ＰＴＭのインビボでの変化の評価及び予測は、製品のリスク評価における品質特性の重要度の理解を促進するだけでなく、製品の設計及び開発チームが、インビボでの安定性が向上したｍＡｂ薬物候補を設計するのにも役立つ。
治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、哺乳類細胞で産生される異種分子であり、翻訳後修飾（ＰＴＭ）に起因するバリアント等、多くの製品バリアントを含む。ＰＴＭを介して産生されるバリアントは、製造中、精製中、保存中、及び投与後のｍＡｂの存続期間を通して生じ得る。これらバリアントまたは製品関連の修飾は、製品品質特性（ＰＱＡ）とも呼ばれる。事前に定義された許容基準内でＰＱＡを制御することは、一貫した製品品質を保証し、薬物の安全性と有効性への潜在的な影響を低減することから、バイオ医薬品業界にとって不可欠である。薬物の製造及び保存中に生じる修飾は、多くの場合、確実に監視及び制御することができる。しかしながら、薬物の投与後、製剤緩衝液に対して著しく異なる血流の環境のため、さらなる修飾が生じ得る。ｍＡｂのインビボ修飾は、通常、監視が困難であり、あまり研究されていない。ＰＴＭのインビボでの変化の評価及び予測は、製品のリスク評価における品質特性の重要度の理解を促進するだけでなく、製品の設計及び開発チームが、インビボでの安定性が向上したｍＡｂ薬物候補を設計するのにも役立つ。
【0004】
食品医薬品局の業界向けガイダンスでは、インビボ環境内での修飾に対する治療用タンパク質の感受性をスポンサーが評価するべきであることを推奨している（Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．２０１４参照）。結果として、脱アミド化（例えば、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５；７７：１４３２－９、Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１３；５：４３２－４４、Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３；３０：１６７－７８、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０参照）、酸化（例えば、Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３；３０：１６７－７８、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０参照）、糖化（例えば、Ｇｏｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２；２２：２２１－３４参照）、グリコシル化（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｇｏｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１；２１：９４９－５９、Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１２；４：５０９－２０．参照）、ジスルフィド（例えば、Ｌｉ Ｙｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００８；２８３：２９２６６－７２参照）、Ｎ末端ピログルタミン酸（例えば、Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３；３０：１６７－７８、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１；２８６：１１２１１－７参照）、及びＣ末端リジン除去（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２０１１；１０８：４０４－１２参照）を含めた多くのＰＱＡのインビボでの挙動が動物またはヒトサンプルで調べられている。血清サンプルから治療用ｍＡｂを抽出し、分析での内因性タンパク質バックグラウンドの干渉を低減するため、親和性精製がしばしば使用される（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０参照）。動物での試験の場合、抗ヒトＦｃ抗体または抗原が、捕捉試薬として容易に使用され得る。ヒトでの試験の場合、当該治療用ｍＡｂ固有の相補性決定領域（ＣＤＲ）を特異的に認識する抗原または抗体が、捕捉試薬として使用され得る。親和性精製後、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）ペプチドマッピングが、ＰＴＭ製品バリアントの相対存在量を定量化するためにしばしば使用される。最近、単回投与レジメンにおいて、インビボＰＴＭ定量を薬物動態（ＰＫ）モデルと組み合わせ、ＰＴＭ製品バリアントの形成及び排除を評価し、当該対象のＰＱＡへの曝露を定量的に評価し（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｇｏｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１０；２：５００－７参照）、製品リスク評価のためのＰＱＡの重要度の確立を支援している。しかしながら、複数回投与レジメンにおいてＰＴＭのインビボでの進行及び対象のＰＱＡへの曝露をシミュレートし、ＰＱＡの重要度を定量的に評価するモデル化は試みられていない。
【発明の概要】
【0005】
１つの態様では、本発明は、抗体の単回投与後の、目的の翻訳後修飾を伴う該抗体のインビボ血清中濃度を予測する方法を提供し、該方法は、（ａ）目的の翻訳後修飾を伴う抗体のパーセンテージを、該翻訳後修飾に対して特定されるインビボ速度定数を用いて予測すること、及び（ｂ）目的の翻訳後修飾を伴う抗体の該予測パーセンテージに、該抗体のインビボ濃度を掛け、目的の翻訳後修飾を伴う抗体の濃度を特定することを含む。場合によっては、次の方程式が計算に使用される：ＣＰＴＭ（ｔ）＝Ｃ（ｔ）・Ｐ（ｔ）、式中、ＣＰＴＭ（ｔ）は、目的の翻訳後修飾を伴う抗体の血清中濃度であり、Ｃ（ｔ）は、抗体の血清中濃度であり、Ｐ（ｔ）は、目的の翻訳後修飾のパーセンテージである。
【0006】
いくつかの実施形態では、翻訳後修飾についてのインビボ速度定数は、目的の翻訳後修飾のパーセンテージを時間の関数として定量化すること、及び目的の該翻訳後修飾の定量化されたパーセンテージを、方程式
にフィットさせることによって特定される。式中、ＰＰＴＭ（ｔ）は、時間の関数としての翻訳後修飾の割合であり、Ｐ０は、翻訳後修飾の初期パーセンテージであり、ｋＰＴＭは、翻訳後修飾の速度定数である。
【0007】
いくつかの実施形態では、該方法は、さらに、目的の翻訳後修飾を伴う抗体への対象の曝露を特定することを含む。場合によっては、目的の翻訳後修飾を伴う抗体への対象の曝露を特定することには、目的の翻訳後修飾を伴う抗体の濃度（ＣＰＴＭ（ｔ））の曲線下面積（ＡＵＣ）を特定することが含まれる。
【0008】
いくつかの実施形態では、該抗体の血清中濃度は、２コンパートメント薬物動態モデルの方程式Ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔで示される。式中、Ａ及びＢは、それぞれ、α及びβがハイブリッド一次定数である場合のハイブリッド係数である。
【0009】
いくつかの実施形態では、該方法はさらに、該抗体の複数回投与後に、目的の翻訳後修飾を伴う該抗体のインビボ血清中濃度を予測することを含む。場合によっては、該抗体の複数回投与後に目的の翻訳後修飾を伴う該抗体のインビボ血清中濃度を予測することには、複数の単回投与モデルを重ね合わせることが含まれ、この場合、各投与での該抗体の血清中濃度は、２コンパートメント薬物動態モデルの方程式Ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔによって個々に示され、式中、Ａ及びＢは、それぞれ、α及びβがハイブリッド一次定数である場合のハイブリッド係数である。
【0010】
該方法の様々な実施形態では、該抗体は、治療用組み換えモノクローナル抗体を含む。場合によっては、該翻訳後修飾は、薬物の安定性、安全性、及び／または有効性に影響を与え得る製品品質特性を含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、該方法は、モノクローナル抗体の翻訳後修飾プロファイルを予測的に監視する。
【0012】
いくつかの実施形態では、該方法はさらに、翻訳後修飾のインビボでの進行及び製品品質特性への対象の曝露についての予測モデルを作製することを含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、該方法はさらに、ＰＫ濃度と翻訳後修飾バリアントの割合との相関をモデル化することを含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、該方法はさらに、単回及び複数回投与の両レジメンでの代表的な翻訳後修飾への該対象の曝露を定量的に評価及び予測することを含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、該方法はさらに、複数回投与レジメンで観察される最大及び最小の翻訳後修飾レベルを予測することを含む。
【0016】
別の態様では、本発明は、当該対象への投与後の、治療用組み換えモノクローナル抗体のバリアントへの対象の曝露を予測する方法を提供し、この場合、該方法は、（ａ）バリアントの形成を引き起こす翻訳後修飾（ＰＴＭ）プロセスについての速度定数を特定すること、（ｂ）時間の関数としての該バリアントの予測割合を計算すること、（ｃ）該バリアントの該予測割合に基づいて、時間の関数としての該対象における該バリアントの予測血清中濃度を計算すること、及び（ｄ）該バリアントの予測血清中濃度に基づいて、該抗体の投与後、該バリアントへの該対象の曝露を予測することを含む。
【0017】
該方法のいくつかの実施形態では、時間の関数としての該バリアントの予測割合の計算は、次式を介して行われる：
式中、ＰＰＴＭ（ｔ）は、時間の関数としての該バリアントの割合であり、Ｐ０は、投与時点での該バリアントの初期レベルであり、ｋＰＴＭは、該ＰＴＭプロセスについての速度定数であり、ｔは時間である。
【0018】
該方法のいくつかの実施形態では、時間の関数としての該対象における該バリアントの予測血清中濃度の計算は、次式を介して行われる：ＣＰＴＭ（ｔ）＝Ｃ（ｔ）・ＰＰＴＭ（ｔ）、式中、ＣＰＴＭ（ｔ）は、該バリアントの血清中濃度であり、Ｃ（ｔ）は、該抗体の血清中濃度であり、ＰＰＴＭ（ｔ）は、時間ｔでの該バリアントの割合である。
【0019】
いくつかの実施形態では、該方法はさらに、該抗体を該対象に投与することを含む。
【0020】
該方法のいくつかの実施形態では、該抗体はｍＡｂである。
【0021】
いくつかの実施形態では、該方法はさらに、該対象における該抗体の全インビボ濃度を特定することを含む。
【0022】
別の態様では、本発明は、当該対象に治療用組み換えモノクローナル抗体を複数回投与した後の、該抗体のバリアントへの対象の曝露を予測する方法を提供し、この場合、該方法は、（ａ）上記で直接論じた方法を行うこと、（ｂ）該バリアントの予測割合を、投与間隔に基づいて該抗体の各後続投与の前後に計算すること、（ｃ）該バリアントの該予測割合に基づいて、該対象における該バリアントの予測血清中濃度を投与間隔ごとに計算すること、及び（ｄ）該バリアントの予測血清中濃度に基づいて、該抗体の２回以上の投与にわたる該バリアントへの該対象の曝露を予測することを含む。
【0023】
上記にまたは本明細書で論じる方法の様々な実施形態では、該翻訳後修飾は、脱アミド化、酸化、糖化、ジスルフィド形成、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、Ｃ末端リジン除去、及び高マンノースグリコシル化のうちの１つ以上を含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、該方法はさらに、該抗体を該対象に投与することを含む。
【0025】
該方法のいくつかの実施形態では、該抗体はｍＡｂである。
【0026】
いくつかの実施形態では、該方法はさらに、該対象における該抗体の全インビボ濃度を特定することを含む。
【0027】
上記にまたは本明細書で論じる様々な態様または実施形態のいずれも、別の実施形態と組み合わせてもよく、その各々が本開示の範囲に包含される。
[本発明1001]
抗体の単回投与後の、目的の翻訳後修飾を伴う前記抗体のインビボ血清中濃度を予測する方法であって、
目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体のパーセンテージを、前記翻訳後修飾に対して特定されるインビボ速度定数を用いて予測すること、及び
目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体の前記予測されたパーセンテージに、前記抗体の全インビボ濃度を掛けて、目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体の濃度を特定すること（ＣＰＴＭ（ｔ）＝Ｃ（ｔ）・Ｐ（ｔ）、ここで、ＣＰＴＭ（ｔ）は、目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体の血清中濃度であり、Ｃ（ｔ）は、前記抗体の血清中濃度であり、Ｐ（ｔ）は、目的の前記翻訳後修飾のパーセンテージである）
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記翻訳後修飾についての前記インビボ速度定数が、
目的の前記翻訳後修飾のパーセンテージを時間の関数として定量化すること、及び
目的の前記翻訳後修飾の前記定量化されたパーセンテージを、方程式
にフィットさせること
によって特定され、
式中、ＰＰＴＭ（ｔ）は、時間の関数としての前記翻訳後修飾の割合であり、Ｐ0は、翻訳後修飾の初期パーセンテージであり、ｋＰＴＭは、前記翻訳後修飾の速度定数である、
本発明1001の方法。
[本発明1003]
目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体への前記対象の曝露を特定することをさらに含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体への前記対象の曝露を特定することが、目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体の濃度（ＣＰＴＭ（ｔ））の曲線下面積（ＡＵＣ）を特定することを含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記抗体の前記血清中濃度が、2コンパートメント薬物動態モデルの方程式Ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔで示され、式中、Ａ及びＢは、それぞれ、α及びβがハイブリッド一次定数である場合のハイブリッド係数である、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記抗体の複数回投与後の、目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体の前記インビボ血清中濃度を予測することをさらに含む、本発明1001～1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記抗体の複数回投与後の、目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体のインビボ血清中濃度を予測することが、複数の単回投与モデルを重ね合わせることを含み、この場合、各投与での前記抗体の前記血清中濃度は、2コンパートメント薬物動態モデルの方程式Ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔによって個々に示され、式中、Ａ及びＢは、それぞれ、α及びβがハイブリッド一次定数である場合のハイブリッド係数である、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記抗体が、治療用組み換えモノクローナル抗体を含む、本発明1001～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記翻訳後修飾が、薬物の安定性、安全性、及び／または有効性に影響を与え得る製品品質特性を含む、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
モノクローナル抗体の翻訳後修飾プロファイルを予測的に監視する、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
翻訳後修飾のインビボでの進行及び製品品質特性への対象の曝露についての予測モデルを作製することをさらに含む、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記翻訳後修飾が、脱アミド化、酸化、糖化、ジスルフィド形成、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、Ｃ末端リジン除去、及び高マンノースグリコシル化のうちの1つ以上を含む、本発明1001～1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
ＰＫ濃度と翻訳後修飾バリアントの割合との相関をモデル化することをさらに含む、本発明1001～1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
単回及び複数回投与の両レジメンでの代表的な翻訳後修飾への前記対象の曝露を定量的に評価及び予測することをさらに含む、本発明1001～1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記複数回投与レジメンで観察される最大及び最小の翻訳後修飾レベルを予測することをさらに含む、本発明1001～1013のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記対象に前記抗体を投与することをさらに含む、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記抗体がｍＡｂである、本発明1001～1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記対象における前記抗体の全インビボ濃度を特定することをさらに含む、本発明1001～1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
対象に治療用組み換えモノクローナル抗体を投与した後の、前記抗体のバリアントへの前記対象の曝露を予測する方法であって、
バリアントの形成を引き起こす翻訳後修飾（ＰＴＭ）プロセスについての速度定数を特定すること、
時間の関数としての前記バリアントの予測割合を計算すること、
前記バリアントの前記予測割合に基づいて、時間の関数としての前記対象における前記バリアントの予測血清中濃度を計算すること、及び
前記バリアントの前記予測血清中濃度に基づいて、前記抗体の投与後の前記バリアントへの前記対象の曝露を予測すること
を含む、前記方法。
[本発明1020]
時間の関数としての前記バリアントの前記予測割合を計算することが、次式
によって行われ、
式中、ＰＰＴＭ（ｔ）は、時間の関数としての前記バリアントの割合であり、Ｐ0は、投与時点での前記バリアントの初期レベルであり、ｋＰＴＭは、ＰＴＭプロセスについての速度定数であり、ｔは時間である、
本発明1019の方法。
[本発明1021]
時間の関数としての前記対象における前記バリアントの前記予測血清中濃度を計算することが、次式
ＣＰＴＭ（ｔ）＝Ｃ（ｔ）・ＰＰＴＭ（ｔ）
によって行われ、
式中、ＣＰＴＭ（ｔ）は、前記バリアントの血清中濃度であり、Ｃ（ｔ）は、前記抗体の血清中濃度であり、ＰＰＴＭ（ｔ）は、時間ｔでの前記バリアントの割合である、
本発明1019または1020の方法。
[本発明1022]
対象に治療用組み換えモノクローナル抗体を複数回投与した後の、前記抗体のバリアントへの前記対象の曝露を予測する方法であって、
本発明1019～1021のいずれかの方法を実行すること、
投与間隔に基づいて、前記抗体の後続の各投与の前後の前記バリアントの予測割合を計算すること、
各投与間隔での前記バリアントの前記予測割合に基づいて、前記対象における前記バリアントの予測血清中濃度を計算すること、及び
前記バリアントの前記予測血清中濃度に基づいて、前記抗体の2回以上の投与にわたる前記バリアントへの前記対象の曝露を予測すること
を含む、前記方法。
[本発明1023]
前記翻訳後修飾が、脱アミド化、酸化、糖化、ジスルフィド形成、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、Ｃ末端リジン除去、及び高マンノースグリコシル化のうちの1つ以上を含む、本発明1019～1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記対象に前記抗体を投与することをさらに含む、本発明1019～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記抗体がｍＡｂである、本発明1018～1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記対象における前記抗体の全インビボ濃度を特定することをさらに含む、本発明1018～1025のいずれかの方法。
[本発明1001]
抗体の単回投与後の、目的の翻訳後修飾を伴う前記抗体のインビボ血清中濃度を予測する方法であって、
目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体のパーセンテージを、前記翻訳後修飾に対して特定されるインビボ速度定数を用いて予測すること、及び
目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体の前記予測されたパーセンテージに、前記抗体の全インビボ濃度を掛けて、目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体の濃度を特定すること（ＣＰＴＭ（ｔ）＝Ｃ（ｔ）・Ｐ（ｔ）、ここで、ＣＰＴＭ（ｔ）は、目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体の血清中濃度であり、Ｃ（ｔ）は、前記抗体の血清中濃度であり、Ｐ（ｔ）は、目的の前記翻訳後修飾のパーセンテージである）
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記翻訳後修飾についての前記インビボ速度定数が、
目的の前記翻訳後修飾のパーセンテージを時間の関数として定量化すること、及び
目的の前記翻訳後修飾の前記定量化されたパーセンテージを、方程式
によって特定され、
式中、ＰＰＴＭ（ｔ）は、時間の関数としての前記翻訳後修飾の割合であり、Ｐ0は、翻訳後修飾の初期パーセンテージであり、ｋＰＴＭは、前記翻訳後修飾の速度定数である、
本発明1001の方法。
[本発明1003]
目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体への前記対象の曝露を特定することをさらに含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体への前記対象の曝露を特定することが、目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体の濃度（ＣＰＴＭ（ｔ））の曲線下面積（ＡＵＣ）を特定することを含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記抗体の前記血清中濃度が、2コンパートメント薬物動態モデルの方程式Ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔで示され、式中、Ａ及びＢは、それぞれ、α及びβがハイブリッド一次定数である場合のハイブリッド係数である、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記抗体の複数回投与後の、目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体の前記インビボ血清中濃度を予測することをさらに含む、本発明1001～1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記抗体の複数回投与後の、目的の前記翻訳後修飾を伴う前記抗体のインビボ血清中濃度を予測することが、複数の単回投与モデルを重ね合わせることを含み、この場合、各投与での前記抗体の前記血清中濃度は、2コンパートメント薬物動態モデルの方程式Ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔによって個々に示され、式中、Ａ及びＢは、それぞれ、α及びβがハイブリッド一次定数である場合のハイブリッド係数である、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記抗体が、治療用組み換えモノクローナル抗体を含む、本発明1001～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記翻訳後修飾が、薬物の安定性、安全性、及び／または有効性に影響を与え得る製品品質特性を含む、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
モノクローナル抗体の翻訳後修飾プロファイルを予測的に監視する、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
翻訳後修飾のインビボでの進行及び製品品質特性への対象の曝露についての予測モデルを作製することをさらに含む、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記翻訳後修飾が、脱アミド化、酸化、糖化、ジスルフィド形成、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、Ｃ末端リジン除去、及び高マンノースグリコシル化のうちの1つ以上を含む、本発明1001～1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
ＰＫ濃度と翻訳後修飾バリアントの割合との相関をモデル化することをさらに含む、本発明1001～1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
単回及び複数回投与の両レジメンでの代表的な翻訳後修飾への前記対象の曝露を定量的に評価及び予測することをさらに含む、本発明1001～1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記複数回投与レジメンで観察される最大及び最小の翻訳後修飾レベルを予測することをさらに含む、本発明1001～1013のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記対象に前記抗体を投与することをさらに含む、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記抗体がｍＡｂである、本発明1001～1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記対象における前記抗体の全インビボ濃度を特定することをさらに含む、本発明1001～1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
対象に治療用組み換えモノクローナル抗体を投与した後の、前記抗体のバリアントへの前記対象の曝露を予測する方法であって、
バリアントの形成を引き起こす翻訳後修飾（ＰＴＭ）プロセスについての速度定数を特定すること、
時間の関数としての前記バリアントの予測割合を計算すること、
前記バリアントの前記予測割合に基づいて、時間の関数としての前記対象における前記バリアントの予測血清中濃度を計算すること、及び
前記バリアントの前記予測血清中濃度に基づいて、前記抗体の投与後の前記バリアントへの前記対象の曝露を予測すること
を含む、前記方法。
[本発明1020]
時間の関数としての前記バリアントの前記予測割合を計算することが、次式
式中、ＰＰＴＭ（ｔ）は、時間の関数としての前記バリアントの割合であり、Ｐ0は、投与時点での前記バリアントの初期レベルであり、ｋＰＴＭは、ＰＴＭプロセスについての速度定数であり、ｔは時間である、
本発明1019の方法。
[本発明1021]
時間の関数としての前記対象における前記バリアントの前記予測血清中濃度を計算することが、次式
ＣＰＴＭ（ｔ）＝Ｃ（ｔ）・ＰＰＴＭ（ｔ）
によって行われ、
式中、ＣＰＴＭ（ｔ）は、前記バリアントの血清中濃度であり、Ｃ（ｔ）は、前記抗体の血清中濃度であり、ＰＰＴＭ（ｔ）は、時間ｔでの前記バリアントの割合である、
本発明1019または1020の方法。
[本発明1022]
対象に治療用組み換えモノクローナル抗体を複数回投与した後の、前記抗体のバリアントへの前記対象の曝露を予測する方法であって、
本発明1019～1021のいずれかの方法を実行すること、
投与間隔に基づいて、前記抗体の後続の各投与の前後の前記バリアントの予測割合を計算すること、
各投与間隔での前記バリアントの前記予測割合に基づいて、前記対象における前記バリアントの予測血清中濃度を計算すること、及び
前記バリアントの前記予測血清中濃度に基づいて、前記抗体の2回以上の投与にわたる前記バリアントへの前記対象の曝露を予測すること
を含む、前記方法。
[本発明1023]
前記翻訳後修飾が、脱アミド化、酸化、糖化、ジスルフィド形成、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、Ｃ末端リジン除去、及び高マンノースグリコシル化のうちの1つ以上を含む、本発明1019～1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記対象に前記抗体を投与することをさらに含む、本発明1019～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記抗体がｍＡｂである、本発明1018～1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記対象における前記抗体の全インビボ濃度を特定することをさらに含む、本発明1018～1025のいずれかの方法。
【図面の簡単な説明】
【0028】
（図１）親和性精製によるＭＡＢ１タンパク質の回収を示す一連のトレースである。ＭＡＢ１の親和性精製の回収率は＞９９．５％であり、フロースルーには合計＜０．５％のＭＡＢ１が検出された。回収率の計算は、実施例１の材料及び方法の節に記載した。既知量の高分子量標準（「上側マーカー」として示す）を、内部正規化対照として各サンプルと一緒に流した。各サンプルにおける上側マーカーのピーク面積に対するＭＡＢ１のピーク面積の比率を計算し、分析ごとのばらつきを補正した。
（図２）図２Ａ及び図２Ｂは、ペプチド同定のＭＳ／ＭＳスペクトルの例（図２Ａ）ならびにペプチドピーク積分及びＰＴＭ定量（図２Ｂ）の抽出イオンクロマトグラムの例である。（図２Ａ）Ｍｅｔが酸化されたペプチドＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１）の例のＭＳ／ＭＳスペクトル（上部パネル）及び野生型ペプチドＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１）の例のＭＳ／ＭＳスペクトル（下部パネル）。（図２Ｂ）Ｍｅｔが酸化されたペプチドＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１）の抽出イオンクロマトグラフ（上部パネル）及び野生型ペプチドＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１）の抽出イオンクロマトグラフ（下部パネル）。
（図３）図３Ａ及び図３Ｂは、単回投与ＰＫ試験（図３Ａ）及び複数回投与ＰＫ試験（図３Ｂ）によるＭＡＢ１のＦｃ領域の３つのＡｓｎ部位の各々での脱アミド化の相対存在量を示すグラフである。（図３Ａ）単回投与試験では、３つのＡｓｎ部位の各々での脱アミド化の相対存在量は、一次反応速度式
に従う異なる速度で経時的に増加した。非線形回帰を使用して、Ａｓｎ部位１、Ａｓｎ部位２、及びＡｓｎ部位３でのインビボ脱アミド化速度定数は、それぞれ、０．００３５２３％日－１、０．５３９４％日－１、及び０．１５４６％日－１と特定された。（図Ｂ）複数回投与試験では、３つのＡｓｎ部位の各々での脱アミド化の相対存在量は、該一次反応速度式に従って、各投与間隔の間に経時的に増加したが、各後続の投与後には、新たに投与された未修飾のＭＡＢ１による希釈のために急激に減少し、上昇傾向の鋸歯状パターンを示した。各投与時点は矢印「↑」で示されている。
（図４）図４Ａ及び図４Ｂは、単回投与ＰＫ試験（図４Ａ）及び複数回投与ＰＫ試験（図４Ｂ）によるＭＡＢ１のＦｃ領域の３つのＭｅｔ部位の各々での酸化の相対存在量を示すグラフである。（図４Ａ）単回投与試験では、Ｍｅｔ酸化の相対存在量はわずかに変動したが、３つ部位のすべてでほとんど変化しないままであった。（図４Ｂ）複数回投与試験では、Ｍｅｔ部位１での酸化の相対存在量は、各投与間隔の間にわずかに減少し、各投与後わずかに増加した。Ｍｅｔ部位２及び３での酸化の相対存在量は、安定した状態を保った。各投与時点は矢印「↑」で示されている。
（図５）図５Ａ及び図５Ｂは、単回投与ＰＫ試験（図５Ａ）及び複数回投与ＰＫ試験（図５Ｂ）によるＮ末端ピログルタミン酸の相対存在量を示すグラフである。（図５Ａ）単回投与試験では、Ｎ末端ピログルタミン酸の相対存在量は、経時的に増加した。（図５Ｂ）複数回投与試験では、Ｎ末端ピログルタミン酸の相対存在量は、各投与間隔の間に増加したが、各後続のＭＡＢ１投与後には、新たに投与された未修飾のＭＡＢ１による希釈のために急激に減少し、上昇傾向の鋸歯状パターンを示した。各投与時点は矢印「↑」で示されている。
（図６）図６Ａ及び図６Ｂは、単回投与ＰＫ試験（図６Ａ）及び複数回投与ＰＫ試験（図６Ｂ）による重鎖Ｃ末端リジンを有するＭＡＢ１の相対存在量を示すグラフである。単回投与及び複数回投与の両試験で、Ｃ末端リジンは、各投与後１日以内に急速に除去された。各投与時点は矢印「↑」で示されている。
（図７）図７Ａ及び図７Ｂは、単回投与ＰＫ試験（図７Ａ）及び複数回投与ＰＫ試験（図７Ｂ）によるマンノース５グリコフォームの相対存在量を示すグラフである。（図７Ａ）単回投与試験では、マンノース５の相対存在量は、６週間以内に０．５％から検出不能まで減少した。（図７Ｂ）複数回投与試験では、マンノース５の相対存在量は、各投与間隔の間に減少したが、各後続の新たな投与時には、新たに投与された高レベルのマンノース５を有するＭＡＢ１のために急激に増加し、下落傾向の鋸歯状パターンを示した。各投与時点は矢印「↑」で示されている。
（図８）図８Ａは、単回投与ＰＫ試験による全ＭＡＢ１への対象の曝露を示すグラフである。２コンパートメント薬物動態モデルの方程式Ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔによって示されるＭＡＢ１の血清中濃度－時間曲線（黒線）を、ＥＬＩＳＡで測定されたＭＡＢ１の血清中濃度（黒点）にフィットさせた。Ｃ（ｔ）のＡＵＣによって表される、５６日間にわたる全ＭＡＢ１への対象の曝露は、４３０２．０μｇ／ｍＬ・日と特定された。図８Ｂは、単回投与試験によるＰＱＡでのＭＡＢ１への対象の曝露を示すグラフである。脱アミド化を伴うＭＡＢ１の血清中濃度－時間曲線は、ＣＰＱＡ（ｔ）＝Ｃ（ｔ）・ＰＰＱＡ（ｔ）で示され、ＣＰＱＡ（ｔ）曲線のＡＵＣは、ＰＱＡでのＭＡＢ１への該対象の曝露に相当する。Ａｓｎ部位２での脱アミド化を伴うＭＡＢ１への５６日間にわたる対象の曝露は、４２６．７μｇ／ｍＬ・日（実線）と特定された。Ａｓｎ部位３での脱アミド化を伴うＭＡＢ１への５６日間にわたる対象の曝露は、１５２．５μｇ／ｍＬ・日（破線）と特定された。Ｎ末端ピログルタミン酸を伴うＭＡＢ１への５６日間にわたる対象の曝露は、１９１．５μｇ／ｍＬ・日（点線）と特定された。
（図９）図９Ａは、複数回投与ＰＫ試験による全ＭＡＢ１及びＡｓｎ部位２またはＡｓｎ部位３での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の血清中濃度のモデル予測及び実験測定値を示すグラフである。全ＭＡＢ１及びＡｓｎ部位２またはＡｓｎ部位３での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の投与前及び投与後の予測血清中濃度は、実験測定値とよく一致している。全ＭＡＢ１及びＡｓｎ部位２またはＡｓｎ部位３での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の投与前及び投与後の濃度は、長期の投与後に定常状態のレベルに近づく。図９Ｂは、Ａｓｎ部位２またはＡｓｎ部位３での脱アミド化の相対存在量のモデル予測及び実験測定値を示すグラフである。予測されたレベルは、実験値とよく一致している。Ａｓｎ部位２またはＡｓｎ部位３での脱アミド化の投与前及び投与後の相対存在量は、長期の投与後に定常状態のレベルに近づく。各投与時点は矢印「↑」で示されている。
（図１０）図１０Ａは、複数回投与ＰＫ試験によるＮ末端ピログルタミン酸を伴うＭＡＢ１の血清中濃度のモデル予測及び実験測定値を示すグラフである。Ｎ末端ピログルタミン酸を伴うＭＡＢ１の投与前及び投与後の予測血清中濃度は、実験測定値とよく一致している。Ｎ末端ピログルタミン酸を伴うＭＡＢ１の投与前及び投与後の濃度は、長期の投与後に定常状態のレベルに近づく。図１０Ｂは、Ｎ末端ピログルタミン酸の相対存在量のモデル予測及び実験測定値を示すグラフである。予測されたレベルは、実験値とよく一致している。Ｎ末端ピログルタミンの投与前及び投与後の相対存在量は、長期の投与後に定常状態のレベルに近づく。各投与時点は矢印「↑」で示されている。
（図１１）図１１Ａ及び図１１Ｂは、単回投与試験（図１１Ａ）及び複数回投与試験（図１１Ｂ）における、１日－１当たりのインビボ脱アミド化率２．５％及び初期脱アミド化レベル０％、１０％、及び２０％の仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化への対象の曝露のモデル化を示すグラフである。（図１１Ａ）単回投与試験において、初期脱アミド化０％、１０％、及び２０％の仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化バリアントへの５６日間にわたる対象の曝露は、それぞれ、１３８５μｇ／ｍＬ・日、１６５３μｇ／ｍＬ・日、及び１９２１μｇ／ｍＬ・日であり、全ｍＡｂに対する対象の曝露のそれぞれ、３２．５％、３８．８％、及び４５．１％を占めている。（図１１Ｂ）複数回投与試験において、初期脱アミド化０％、１０％、及び２０％の仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化バリアントへの５回の投与（５６日間）にわたる対象の曝露は、それぞれ、１０８６μｇ／ｍＬ・日、１４７８μｇ／ｍＬ・日、及び１８７１μｇ／ｍＬ・日であり、全ｍＡｂに対する対象の曝露のそれぞれ、２１．７％、２９．５％、及び３７．３％を占めている。各投与時点は矢印「↑」で示されている。
（図１２）本開示の態様を実施するために使用することができるコンピュータシステムのブロック図である。
（図１３）本開示の態様を実施することができる分散コンピューティング環境の図である。
（図２）図２Ａ及び図２Ｂは、ペプチド同定のＭＳ／ＭＳスペクトルの例（図２Ａ）ならびにペプチドピーク積分及びＰＴＭ定量（図２Ｂ）の抽出イオンクロマトグラムの例である。（図２Ａ）Ｍｅｔが酸化されたペプチドＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１）の例のＭＳ／ＭＳスペクトル（上部パネル）及び野生型ペプチドＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１）の例のＭＳ／ＭＳスペクトル（下部パネル）。（図２Ｂ）Ｍｅｔが酸化されたペプチドＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１）の抽出イオンクロマトグラフ（上部パネル）及び野生型ペプチドＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１）の抽出イオンクロマトグラフ（下部パネル）。
（図３）図３Ａ及び図３Ｂは、単回投与ＰＫ試験（図３Ａ）及び複数回投与ＰＫ試験（図３Ｂ）によるＭＡＢ１のＦｃ領域の３つのＡｓｎ部位の各々での脱アミド化の相対存在量を示すグラフである。（図３Ａ）単回投与試験では、３つのＡｓｎ部位の各々での脱アミド化の相対存在量は、一次反応速度式
（図４）図４Ａ及び図４Ｂは、単回投与ＰＫ試験（図４Ａ）及び複数回投与ＰＫ試験（図４Ｂ）によるＭＡＢ１のＦｃ領域の３つのＭｅｔ部位の各々での酸化の相対存在量を示すグラフである。（図４Ａ）単回投与試験では、Ｍｅｔ酸化の相対存在量はわずかに変動したが、３つ部位のすべてでほとんど変化しないままであった。（図４Ｂ）複数回投与試験では、Ｍｅｔ部位１での酸化の相対存在量は、各投与間隔の間にわずかに減少し、各投与後わずかに増加した。Ｍｅｔ部位２及び３での酸化の相対存在量は、安定した状態を保った。各投与時点は矢印「↑」で示されている。
（図５）図５Ａ及び図５Ｂは、単回投与ＰＫ試験（図５Ａ）及び複数回投与ＰＫ試験（図５Ｂ）によるＮ末端ピログルタミン酸の相対存在量を示すグラフである。（図５Ａ）単回投与試験では、Ｎ末端ピログルタミン酸の相対存在量は、経時的に増加した。（図５Ｂ）複数回投与試験では、Ｎ末端ピログルタミン酸の相対存在量は、各投与間隔の間に増加したが、各後続のＭＡＢ１投与後には、新たに投与された未修飾のＭＡＢ１による希釈のために急激に減少し、上昇傾向の鋸歯状パターンを示した。各投与時点は矢印「↑」で示されている。
（図６）図６Ａ及び図６Ｂは、単回投与ＰＫ試験（図６Ａ）及び複数回投与ＰＫ試験（図６Ｂ）による重鎖Ｃ末端リジンを有するＭＡＢ１の相対存在量を示すグラフである。単回投与及び複数回投与の両試験で、Ｃ末端リジンは、各投与後１日以内に急速に除去された。各投与時点は矢印「↑」で示されている。
（図７）図７Ａ及び図７Ｂは、単回投与ＰＫ試験（図７Ａ）及び複数回投与ＰＫ試験（図７Ｂ）によるマンノース５グリコフォームの相対存在量を示すグラフである。（図７Ａ）単回投与試験では、マンノース５の相対存在量は、６週間以内に０．５％から検出不能まで減少した。（図７Ｂ）複数回投与試験では、マンノース５の相対存在量は、各投与間隔の間に減少したが、各後続の新たな投与時には、新たに投与された高レベルのマンノース５を有するＭＡＢ１のために急激に増加し、下落傾向の鋸歯状パターンを示した。各投与時点は矢印「↑」で示されている。
（図８）図８Ａは、単回投与ＰＫ試験による全ＭＡＢ１への対象の曝露を示すグラフである。２コンパートメント薬物動態モデルの方程式Ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔによって示されるＭＡＢ１の血清中濃度－時間曲線（黒線）を、ＥＬＩＳＡで測定されたＭＡＢ１の血清中濃度（黒点）にフィットさせた。Ｃ（ｔ）のＡＵＣによって表される、５６日間にわたる全ＭＡＢ１への対象の曝露は、４３０２．０μｇ／ｍＬ・日と特定された。図８Ｂは、単回投与試験によるＰＱＡでのＭＡＢ１への対象の曝露を示すグラフである。脱アミド化を伴うＭＡＢ１の血清中濃度－時間曲線は、ＣＰＱＡ（ｔ）＝Ｃ（ｔ）・ＰＰＱＡ（ｔ）で示され、ＣＰＱＡ（ｔ）曲線のＡＵＣは、ＰＱＡでのＭＡＢ１への該対象の曝露に相当する。Ａｓｎ部位２での脱アミド化を伴うＭＡＢ１への５６日間にわたる対象の曝露は、４２６．７μｇ／ｍＬ・日（実線）と特定された。Ａｓｎ部位３での脱アミド化を伴うＭＡＢ１への５６日間にわたる対象の曝露は、１５２．５μｇ／ｍＬ・日（破線）と特定された。Ｎ末端ピログルタミン酸を伴うＭＡＢ１への５６日間にわたる対象の曝露は、１９１．５μｇ／ｍＬ・日（点線）と特定された。
（図９）図９Ａは、複数回投与ＰＫ試験による全ＭＡＢ１及びＡｓｎ部位２またはＡｓｎ部位３での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の血清中濃度のモデル予測及び実験測定値を示すグラフである。全ＭＡＢ１及びＡｓｎ部位２またはＡｓｎ部位３での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の投与前及び投与後の予測血清中濃度は、実験測定値とよく一致している。全ＭＡＢ１及びＡｓｎ部位２またはＡｓｎ部位３での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の投与前及び投与後の濃度は、長期の投与後に定常状態のレベルに近づく。図９Ｂは、Ａｓｎ部位２またはＡｓｎ部位３での脱アミド化の相対存在量のモデル予測及び実験測定値を示すグラフである。予測されたレベルは、実験値とよく一致している。Ａｓｎ部位２またはＡｓｎ部位３での脱アミド化の投与前及び投与後の相対存在量は、長期の投与後に定常状態のレベルに近づく。各投与時点は矢印「↑」で示されている。
（図１０）図１０Ａは、複数回投与ＰＫ試験によるＮ末端ピログルタミン酸を伴うＭＡＢ１の血清中濃度のモデル予測及び実験測定値を示すグラフである。Ｎ末端ピログルタミン酸を伴うＭＡＢ１の投与前及び投与後の予測血清中濃度は、実験測定値とよく一致している。Ｎ末端ピログルタミン酸を伴うＭＡＢ１の投与前及び投与後の濃度は、長期の投与後に定常状態のレベルに近づく。図１０Ｂは、Ｎ末端ピログルタミン酸の相対存在量のモデル予測及び実験測定値を示すグラフである。予測されたレベルは、実験値とよく一致している。Ｎ末端ピログルタミンの投与前及び投与後の相対存在量は、長期の投与後に定常状態のレベルに近づく。各投与時点は矢印「↑」で示されている。
（図１１）図１１Ａ及び図１１Ｂは、単回投与試験（図１１Ａ）及び複数回投与試験（図１１Ｂ）における、１日－１当たりのインビボ脱アミド化率２．５％及び初期脱アミド化レベル０％、１０％、及び２０％の仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化への対象の曝露のモデル化を示すグラフである。（図１１Ａ）単回投与試験において、初期脱アミド化０％、１０％、及び２０％の仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化バリアントへの５６日間にわたる対象の曝露は、それぞれ、１３８５μｇ／ｍＬ・日、１６５３μｇ／ｍＬ・日、及び１９２１μｇ／ｍＬ・日であり、全ｍＡｂに対する対象の曝露のそれぞれ、３２．５％、３８．８％、及び４５．１％を占めている。（図１１Ｂ）複数回投与試験において、初期脱アミド化０％、１０％、及び２０％の仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化バリアントへの５回の投与（５６日間）にわたる対象の曝露は、それぞれ、１０８６μｇ／ｍＬ・日、１４７８μｇ／ｍＬ・日、及び１８７１μｇ／ｍＬ・日であり、全ｍＡｂに対する対象の曝露のそれぞれ、２１．７％、２９．５％、及び３７．３％を占めている。各投与時点は矢印「↑」で示されている。
（図１２）本開示の態様を実施するために使用することができるコンピュータシステムのブロック図である。
（図１３）本開示の態様を実施することができる分散コンピューティング環境の図である。
【発明を実施するための形態】
【0029】
発明の詳細な説明
本方法を説明する前に、本発明が、特定の方法、及び記載される実験条件に限定されず、かかる方法及び条件は変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するものとしては意図されないことも理解されたい。
本方法を説明する前に、本発明が、特定の方法、及び記載される実験条件に限定されず、かかる方法及び条件は変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するものとしては意図されないことも理解されたい。
【0030】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料と同様または同等の任意の方法及び材料を本発明の実践または試験において使用することもできるが、好ましい方法及び材料をここに記載する。本明細書で引用されるすべての特許、出願及び非特許出版物は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
【0031】
本明細書で使用される略語
Ａｓｎ：アスパラギン
ＡＵＣ：曲線下面積
ＣＤＲ：相補性決定領域
ＣＶ：変動係数
ＥＩＣ：抽出イオンクロマトグラフ
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＤＡ：食品医薬品局
ＨＣ：重鎖
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＬＣ：軽鎖
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
ＭＡＢ１：実施例１で使用される治療用ヒトモノクローナル抗体
Ｍｅｔ：メチオニン
ＰＫ：薬物動態
ＰＱＡ：製品品質特性
ＰＴＭ：翻訳後修飾
ＲＰ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ：逆相液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析
Ａｓｎ：アスパラギン
ＡＵＣ：曲線下面積
ＣＤＲ：相補性決定領域
ＣＶ：変動係数
ＥＩＣ：抽出イオンクロマトグラフ
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＤＡ：食品医薬品局
ＨＣ：重鎖
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＬＣ：軽鎖
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
ＭＡＢ１：実施例１で使用される治療用ヒトモノクローナル抗体
Ｍｅｔ：メチオニン
ＰＫ：薬物動態
ＰＱＡ：製品品質特性
ＰＴＭ：翻訳後修飾
ＲＰ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ：逆相液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析
【0032】
定義
本明細書で使用される、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された、４本のポリペプチド鎖、すなわち、２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子（すなわち、「完全な抗体分子」）、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合断片を指すことを意図している。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）ならびに重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインからなる）からなる。様々な実施形態では、該重鎖は、ＩｇＧアイソタイプであり得る。場合によっては、該重鎖はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される。いくつかの実施形態では、該重鎖は、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４のものであり、任意にアイソタイプＩｇＧ１／ＩｇＧ２またはＩｇＧ４／ＩｇＧ２のキメラヒンジ領域を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「ＶＬ」）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。該ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域に細分される。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと、次の順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化及び非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、組み換え手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体分子、例えば、該抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体を含む。抗体構造の総説については、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，２７（１）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５－７７（２００３）、及びＭ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，２（１）Ｓｕｒｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２７－４２（１９８３）を参照されたい。
本明細書で使用される、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された、４本のポリペプチド鎖、すなわち、２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子（すなわち、「完全な抗体分子」）、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合断片を指すことを意図している。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）ならびに重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインからなる）からなる。様々な実施形態では、該重鎖は、ＩｇＧアイソタイプであり得る。場合によっては、該重鎖はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される。いくつかの実施形態では、該重鎖は、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４のものであり、任意にアイソタイプＩｇＧ１／ＩｇＧ２またはＩｇＧ４／ＩｇＧ２のキメラヒンジ領域を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「ＶＬ」）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。該ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域に細分される。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと、次の順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化及び非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、組み換え手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体分子、例えば、該抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体を含む。抗体構造の総説については、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，２７（１）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５－７７（２００３）、及びＭ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，２（１）Ｓｕｒｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２７－４２（１９８３）を参照されたい。
【0033】
抗体という用語はまた、「二重特異性抗体」も包含し、これには、複数の異なるエピトープに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンが含まれる。１本の重鎖及び１本の軽鎖ならびに６つのＣＤＲを含む二重特異性抗体の半分は、１つの抗原またはエピトープに結合し、該抗体の残りの半分は、異なる抗原またはエピトープに結合する。場合によっては、該二重特異性抗体は、同じ抗原に結合することができるが、異なるエピトープまたは非オーバーラップエピトープにおいてである。場合によっては、該二重特異性抗体の半分は両方とも、同一の軽鎖を有しながら二重特異性を保持している。二重特異性抗体は、概して米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号（２０１０年１２月３０日）に記載されている。
【0034】
抗体の「抗原結合部分」（または「抗体断片」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価の断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ２４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）単離されたＣＤＲ、ならびに（ｖｉｉ）合成リンカーによって結合され、ＶＬ及びＶＨ領域が組み合わさって一価分子を形成する１本のタンパク質鎖を形成するＦｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨからなるｓｃＦｖが挙げられる。一本鎖抗体の他の形態、例えば、ダイアボディもまた、「抗体」という用語に包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｔ．（１９９３）９０ ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．６４４４－６４４８、及びＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｔ．（１９９４）２ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１２１－１１２３参照）。
【0035】
さらに、抗体及びその抗原結合断片は、当技術分野で一般に知られている標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９参照）。
【0036】
「Ｆｃ融合タンパク質」は、２つ以上のタンパク質の一部またはすべてを含み、そのうちの１つは、本来は一緒に見出されない免疫グロブリン分子のＦｃ部分である。抗体由来のポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分に融合したある特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製については、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｔ．，（１９９１）８８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５３５、Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｔ．，（１９９０）３４４ Ｎａｔｕｒｅ ６７７、及びＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｔ．，（１９９２）“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ １０．１９．１－１０．１９．１１によって記載されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部分に結合された受容体の１つ以上の細胞外ドメインを含み、これは、いくつかの実施形態では、ヒンジ領域を含み、その後に免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３ドメインが続く。いくつかの実施形態では、該Ｆｃ融合タンパク質は、１つ以上のリガンドに結合する２つ以上の別個の受容体鎖を含む。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、トラップ、例えば、ＩＬ－１トラップ（例えば、リロナセプト、これは、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＩＬ－１Ｒ１の細胞外領域に融合ＩしたＩＬ－１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含む。米国特許第６，９２７，００４号参照）、またはＶＥＧＦトラップ（例えば、アフリバーセプト、これは、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含む。米国特許第７，０８７，４１１号（２００６年８月８日発行）及び米国特許第７，２７９，１５９号（２００７年９月９日発行）参照）である。
【0037】
「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する抗体を含むことを意図している。本発明のヒトｍＡｂは、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異により、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）を、例えば、ＣＤＲに、及び特にＣＤＲ３に含み得る。しかしながら、本明細書で使用される、「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列にグラフトされたｍＡｂを含むことを意図しない。該用語は、非ヒト哺乳類で、または非ヒト哺乳類の細胞で組み換え的に産生される抗体を含む。該用語は、ヒト対象から単離される、またはヒト対象で生成される抗体を含むことを意図しない。
【0038】
本明細書で使用される、「対象」という用語は、例えば、疾患または障害の改善、予防及び／または治療を必要とする動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指す。
【0039】
本明細書で使用される、「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語は、治療薬、例えば、本発明の抗体を、それを必要とする対象に投与することに起因する、少なくとも１つの症状または兆候の重症度の低減または改善を指す。該用語には、疾患の進行の阻害が含まれる。該治療薬は、治療用量で該対象に投与され得る。
【0040】
「翻訳後修飾」（ＰＴＭ）とは、タンパク質生合成後のタンパク質の共有結合修飾を指す。翻訳後修飾は、アミノ酸の側鎖で生じる場合もあれば、タンパク質のＣ末端またはＮ末端で生じる場合もある。抗体の例示的な翻訳後修飾としては、脱アミド化、酸化、糖化、ジスルフィド形成、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、Ｃ末端リジン除去、及びグリコシル化が挙げられる。
【0041】
概要
哺乳類細胞で産生される治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）の結果として異成分からなる。治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＰＴＭは、薬物の安定性、安全性、及び有効性に影響を与える可能性がある重要な製品品質特性（ＰＱＡ）である（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ２０１７；３：２１－５）。ＰＴＭは、ｍＡｂの製造、精製、保存、及び投与後の過程で生じ得る（Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｖｉｅｗｓ ２００６；５８：７０７－２２、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００８；９７：２４２６－４７、Ｇｏｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１０；２：５００－７、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００７；９６：１－２６）。薬物の製造及び保存中に生じる修飾は、確実に監視及び制御することができる。しかしながら、薬物の投与後、ｍＡｂがインビトロに対してインビボで遭遇する異なる環境を受け、さらなる修飾が生じ得る。ｍＡｂのＰＴＭは、インビトロ条件と比較して、血流への投与後に著しく変化する。従って、ｍＡｂのインビボＰＴＭ変化の監視は、製品のリスク評価の過程でＰＱＡの重要度を評価するのに役立つ。さらに、ＰＴＭバリアントへの対象の曝露の定量的評価は、治療用ｍＡｂの安全性及び有効性にＰＴＭが与える影響を評価するのに役立つ。インビボで生じ得るＰＴＭの評価及び予測は、製品のリスク評価における品質特性の重要度の理解を促進するだけでなく、製品の開発チームが、インビボでの安定性が向上したｍＡｂ薬物候補を設計するのにも役立つ。
哺乳類細胞で産生される治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）の結果として異成分からなる。治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＰＴＭは、薬物の安定性、安全性、及び有効性に影響を与える可能性がある重要な製品品質特性（ＰＱＡ）である（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ２０１７；３：２１－５）。ＰＴＭは、ｍＡｂの製造、精製、保存、及び投与後の過程で生じ得る（Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｖｉｅｗｓ ２００６；５８：７０７－２２、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００８；９７：２４２６－４７、Ｇｏｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１０；２：５００－７、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００７；９６：１－２６）。薬物の製造及び保存中に生じる修飾は、確実に監視及び制御することができる。しかしながら、薬物の投与後、ｍＡｂがインビトロに対してインビボで遭遇する異なる環境を受け、さらなる修飾が生じ得る。ｍＡｂのＰＴＭは、インビトロ条件と比較して、血流への投与後に著しく変化する。従って、ｍＡｂのインビボＰＴＭ変化の監視は、製品のリスク評価の過程でＰＱＡの重要度を評価するのに役立つ。さらに、ＰＴＭバリアントへの対象の曝露の定量的評価は、治療用ｍＡｂの安全性及び有効性にＰＴＭが与える影響を評価するのに役立つ。インビボで生じ得るＰＴＭの評価及び予測は、製品のリスク評価における品質特性の重要度の理解を促進するだけでなく、製品の開発チームが、インビボでの安定性が向上したｍＡｂ薬物候補を設計するのにも役立つ。
【0042】
本明細書に開示の通り、本発明者らは、治療用モノクローナル抗体に存在する製品品質特性（ＰＱＡ）の詳細な分析及び特定に着手した。モデルとして治療用モノクローナル抗体ＭＡＢ１を使用し、本発明者らは、例えば、脱アミド化、酸化、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、及びＣ末端リジン除去を含めた、多くの翻訳後修飾を評価した。本明細書に開示の通り、本発明者らは、単回及び複数回投与のサルの薬物動態（ＰＫ）試験において、治療用ｍＡｂであるＭＡＢ１のＰＴＭ（例えば、脱アミド化、酸化、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、Ｃ末端リジン除去、及び高マンノースグリコシル化）を特定した。得られたデータを例として使用して、本発明者らは、単回及び複数回投与レジメンにおいて、３つの一般的なＰＴＭを用いて、ＰＱＡのインビボ血清中濃度、ＰＱＡへの対象の曝露、及びＰＱＡの相対存在量を計算するためのモデル化方程式を構築した。該モデル予測は実験結果との一致を示した。該モデルの適用例は、仮説に基づいたＰＴＭを使用して解明された。該モデルは、高度なＰＫモデルが利用できない場合に、ＰＱＡの重要度を定量的に評価するための簡略化されたモデル化ツールを生化学分析化学者に提供する。以下の実施例で詳述するように、単回及び複数回投与ＰＫ試験によるサル血清サンプルを、親和性精製に続いてＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析し、ＭＡＢ１のいくつかの翻訳後特性を特定した。本分析から得られたデータを使用し、本発明者らは、抗体の翻訳後修飾のインビボでの進行の数学的モデル及び／またはシミュレーションを構築して、治療用抗体の製品品質特性に対する対象の曝露を予測することができた。該シミュレーションは、ＰＱＡの重要度を評価するための定量的アプローチを提供する。
【0043】
ＭＡＢ１のＰＱＡの単回投与ＰＫ試験に基づいて、本発明者らには、ＰＴＭバリアントのＰＫ濃度及び割合をモデル化すること、ならびに代表的なＰＴＭ特性（例えば、アスパラギンの脱アミド化）への対象の曝露を定量的に評価すること及び予測することが、単回及び複数回の両投与レジメンで可能であった。該モデルは、複数回投与レジメンで観察された最大及び最小ＰＴＭレベルも予測した。このモデル化アプローチは、生化学分析化学者に対して、治療用ｍＡｂのＰＱＡの重要度を定量的に評価するための新たなツールを提供する。該モデルを使用して、初期ＰＱＡレベル（Ｐ０）を調整することにより、プロセスの変更やロット間の変動によって引き起こされるＰＱＡの影響を評価することができた。該モデル化により、ＰＱＡの進行または該ＰＱＡへの対象の曝露が、ＰＱＡの初期レベルに非感受性であることが示された場合、該ＰＱＡの許容範囲を広げて該プロセスの変更を採用することができる。
【0044】
該モデルを使用して、投与期間（ｔ）を延長すること、または投与間隔（τ）を変更することにより、対象の曝露をシミュレートし、前臨床及び臨床試験でのＰＱＡへの対象の曝露の定量的評価を提供することもできる。ＰＱＡへの対象の曝露の定量的評価は、該ＰＱＡに関連するリスクの評価に役立つ。ＰＫ試験の過程で高曝露レベルを有すると特定された既知の有害な免疫反応を伴うＰＱＡは、高い潜在的リスクを有するであろう。かかる場合には、ある特定の戦略（例えば、インビボでの安定性を高めるためのタンパク質再設計）を実行し、該ＰＱＡのレベルを排除または低減することができる。
【0045】
抗体製品の品質特性への曝露の予測方法
本明細書に開示するのは、対象への抗体（例えば、治療用モノクローナル抗体）の投与後に、目的の翻訳後修飾を伴う該抗体のインビボ血清中濃度を予測する方法である。本開示の方法は、目的の翻訳後修飾を伴う抗体のパーセンテージを、目的の翻訳後修飾に対して特定されるインビボ速度定数を用いて予測することを含む。翻訳後修飾を伴う抗体のパーセンテージに、任意の時点での該抗体の全インビボ濃度を掛けて、目的の翻訳後修飾を伴う該抗体のその時点での濃度を特定することができる。例えば、方程式ＣＰＴＭ（ｔ）＝Ｃ（ｔ）・Ｐ（ｔ）を用いて、式中、Ｃ（ｔ）は、抗体の血清中濃度であり、Ｐ（ｔ）は、目的の翻訳後修飾のパーセンテージである。目的の翻訳後修飾を伴う抗体の血清中濃度（ＣＰＴＭ（ｔ））を特定することができる。換言すれば、目的の翻訳後修飾を伴う抗体の血清中濃度は、その翻訳後修飾を有する全抗体のパーセンテージである。本明細書に開示の通り、該抗体の血清中濃度は、２コンパートメント薬物動態モデルの方程式Ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔで示される場合があり、式中、Ａ及びＢは、それぞれ、α及びβがハイブリッド一次定数である場合のハイブリッド係数である。
本明細書に開示するのは、対象への抗体（例えば、治療用モノクローナル抗体）の投与後に、目的の翻訳後修飾を伴う該抗体のインビボ血清中濃度を予測する方法である。本開示の方法は、目的の翻訳後修飾を伴う抗体のパーセンテージを、目的の翻訳後修飾に対して特定されるインビボ速度定数を用いて予測することを含む。翻訳後修飾を伴う抗体のパーセンテージに、任意の時点での該抗体の全インビボ濃度を掛けて、目的の翻訳後修飾を伴う該抗体のその時点での濃度を特定することができる。例えば、方程式ＣＰＴＭ（ｔ）＝Ｃ（ｔ）・Ｐ（ｔ）を用いて、式中、Ｃ（ｔ）は、抗体の血清中濃度であり、Ｐ（ｔ）は、目的の翻訳後修飾のパーセンテージである。目的の翻訳後修飾を伴う抗体の血清中濃度（ＣＰＴＭ（ｔ））を特定することができる。換言すれば、目的の翻訳後修飾を伴う抗体の血清中濃度は、その翻訳後修飾を有する全抗体のパーセンテージである。本明細書に開示の通り、該抗体の血清中濃度は、２コンパートメント薬物動態モデルの方程式Ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔで示される場合があり、式中、Ａ及びＢは、それぞれ、α及びβがハイブリッド一次定数である場合のハイブリッド係数である。
【0046】
実施形態では、目的の翻訳後修飾についてのインビボ速度定数は、単回投与後の目的の翻訳後修飾のパーセンテージを、時間の関数として定量化すること、及び目的の該翻訳後修飾の定量化されたパーセンテージを、方程式
にフィットさせることによって特定される。式中、ＰＰＴＭ（ｔ）は、時間の関数としての目的の翻訳後修飾の割合であり、Ｐ０は、目的の翻訳後修飾の初期パーセンテージであり、ｋＰＴＭは、目的の翻訳後修飾に対する該翻訳後修飾の速度定数である。目的の翻訳後修飾の測定されたパーセンテージに曲線をフィットさせることにより、速度定数ｋＰＴＭを、例えば、非線形回帰または他の数学的フィッティングアルゴリズムを用いて特定することができる。
【0047】
実施形態では、該方法は、目的の翻訳後修飾を伴う抗体の量に対する該対象の曝露を特定することも含み得る。例えば、目的の期間、例えば、数日、数週間または数か月にわたる、目的の翻訳後修飾を伴う抗体の濃度（ＣＰＴＭ（ｔ））の曲線下面積（ＡＵＣ）分析を使用することで、目的の翻訳後修飾を有する抗体の量に対する該対象の全曝露の値が得られる。
【0048】
同時に複数の部位に注目することも可能である。例えば、ある特定の部位での翻訳後修飾を伴う抗体の割合は、一次反応速度
によって示すことができ、ここで、ＰＰＴＭ＿部位＿ｉ（ｔ）は、部位ｉでの時間の関数としての翻訳後修飾の割合であり、Ｐ０は、部位ｉの初期の翻訳後修飾レベルであり、ｋＰＴＭ＿部位＿ｉは、部位ｉでの翻訳後修飾の速度定数である。従って、翻訳後修飾された抗体内のある特定の部位ｉを備えた抗体のＰＫ濃度は、ＣＰＴＭ＿部位＿ｉ（ｔ）＝Ｃ（ｔ）・ＰＰＴＭ＿部位＿ｉ（ｔ）で示すことができる。ＣＰＴＭ＿部位＿ｉ（ｔ）プロットの曲線下面積（ＡＵＣ）は、品質特性への対象の曝露を示す。さらに、例えば、１、２、３、またはそれ以上の異なる翻訳後修飾を有する、抗体バリアントの各々の種のおおよその濃度を計算することができる。
【0049】
脱アミド化に関する以下の実施例で論じる通り、モデルを複数回投与に拡張することにより、本明細書に開示の方法を使用して、当該抗体の複数回投与後の目的の翻訳後修飾を伴う該抗体のインビボ血清中濃度を予測してもよい。例えば、当該抗体の複数回投与後の目的の翻訳後修飾を伴う該抗体のインビボ血清中濃度を予測することには、複数の単回投与モデルを重ね合わせることが含まれる場合があり、この場合、各投与での該抗体の血清中濃度は、２コンパートメント薬物動態モデルの方程式Ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔによって個々に示され、式中、Ａ及びＢは、それぞれ、α及びβがハイブリッド一次定数である場合のハイブリッド係数である。
【0050】
ｍ回目の投与の直前の目的の翻訳後修飾を伴う抗体の血清中濃度は、以下の通りに示すことができる：
ＣＰＴＭ，ｍ，投与前（ｍ・τ）＝ＰＰＴＭ［（ｍ－１）・τ］Ｃ［（ｍ－１）・τ］＋…＋ＰＰＴＭ（１・τ）Ｃ（１・τ）
ＣＰＴＭ，ｍ，投与前（ｍ・τ）＝ＰＰＴＭ［（ｍ－１）・τ］Ｃ［（ｍ－１）・τ］＋…＋ＰＰＴＭ（１・τ）Ｃ（１・τ）
【0051】
ｍ回目の投与の直後の目的の翻訳後修飾を伴う抗体の血清中濃度は、以下の通りに示すことができる：
ＣＰＴＭ，ｍ，投与後（ｍ・τ）＝ＰＰＴＭ［（ｍ－１）・τ］Ｃ［（ｍ－１）・τ］＋…＋ＰＰＴＭ（１・τ）Ｃ（１・τ）＋ＰＰＴＭ（０）Ｃ（０）
ここで、ＰＰＴＭ（ｔ）は、単回投与について記載した一次反応方程式である。従って、ｍ回目の投与の直前の目的の翻訳後修飾を伴う抗体の割合は、以下の通りに示すことができる：
ＣＰＴＭ，ｍ，投与後（ｍ・τ）＝ＰＰＴＭ［（ｍ－１）・τ］Ｃ［（ｍ－１）・τ］＋…＋ＰＰＴＭ（１・τ）Ｃ（１・τ）＋ＰＰＴＭ（０）Ｃ（０）
ここで、ＰＰＴＭ（ｔ）は、単回投与について記載した一次反応方程式である。従って、ｍ回目の投与の直前の目的の翻訳後修飾を伴う抗体の割合は、以下の通りに示すことができる：
【0052】
ｍ回目の投与の直後の目的の翻訳後修飾を伴う抗体の割合は、以下の通りに示すことができる：
【0053】
ｍが無限大に近づくと、Ｐ脱アミド化，ｍ，投与前とＰＰＴＭ，ｍ，投与後はプラトーに達し、これは以下のように示すことができる：
従って：
【0054】
該方程式の定数Ａ、Ｂ、α、β、及びｋは、最初の投与間隔で得られた実験結果に該方程式をフィットさせることによって解くことができる。
【0055】
様々な実施形態では、該翻訳後修飾は、薬物の安定性、安全性、及び／または有効性に潜在的に影響を与え得る製品品質特性を含む。ある特定の実施形態では、該方法は、モノクローナル抗体、例えば、治療用組み換えモノクローナル抗体のインビボ翻訳後修飾プロファイルを監視するために使用される。場合によっては、該方法はさらに、翻訳後修飾のインビボでの進行及び製品品質特性への対象の曝露についての予測モデルを作製することを含む。いくつかの実施形態では、該翻訳後修飾は、脱アミド化、酸化、糖化、ジスルフィド形成、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、Ｃ末端リジン除去、及び／または高マンノースグリコシル化のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、ＰＫ濃度と翻訳後修飾バリアントの割合との相関をモデル化することを含む。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、単回及び複数回投与の両レジメンでの代表的な翻訳後修飾への対象の曝露を定量的に評価及び予測することを含む。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、複数回投与レジメンで観察される最大及び最小の翻訳後修飾レベルを予測することを含む。
【0056】
例示的なコンピュータシステム
図１２を参照すると、本開示の方法を実施するための例示的なコンピュータシステムは、処理装置１２１、システムメモリ１２２、及び該システムメモリを含めた様々なシステムコンポーネントを処理装置１２１に結合するシステムバス１２３を含むコンピュータ１２０（例えば、パーソナルコンピュータ、ラップトップ、パームトップ、セットトップ、サーバ、メインフレーム、ハンドヘルドデバイス、及び他の種類のコンピュータ）を含む。該処理装置としては、様々な市販のプロセッサのいずれかでよく、ＩＮＴＥＬ（登録商標）ｘ８６、ＰＥＮＴＩＵＭ（登録商標）、ならびにＩＮＴＥＬ（登録商標）とＣｙｒｉｘ、ＡＭＤ、及びＮｅｘｇｅｎを含めた他社の互換性のあるマイクロプロセッサ、Ｄｉｇｉｔａｌ製Ａｌｐｈａ、ＭＩＰＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＥＣ、ＩＤＴ（登録商標）、Ｓｉｅｍｅｎｓ、及び他社製ＭＩＰＳ、ならびにＩＢＭ（登録商標）及びＭｏｔｏｒｏｌａ製ＰｏｗｅｒＰＣが挙げられる。デュアルマイクロプロセッサ及びその他のマルチプロセッサアーキテクチャもまた、処理装置１２１として使用することができる。
図１２を参照すると、本開示の方法を実施するための例示的なコンピュータシステムは、処理装置１２１、システムメモリ１２２、及び該システムメモリを含めた様々なシステムコンポーネントを処理装置１２１に結合するシステムバス１２３を含むコンピュータ１２０（例えば、パーソナルコンピュータ、ラップトップ、パームトップ、セットトップ、サーバ、メインフレーム、ハンドヘルドデバイス、及び他の種類のコンピュータ）を含む。該処理装置としては、様々な市販のプロセッサのいずれかでよく、ＩＮＴＥＬ（登録商標）ｘ８６、ＰＥＮＴＩＵＭ（登録商標）、ならびにＩＮＴＥＬ（登録商標）とＣｙｒｉｘ、ＡＭＤ、及びＮｅｘｇｅｎを含めた他社の互換性のあるマイクロプロセッサ、Ｄｉｇｉｔａｌ製Ａｌｐｈａ、ＭＩＰＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＥＣ、ＩＤＴ（登録商標）、Ｓｉｅｍｅｎｓ、及び他社製ＭＩＰＳ、ならびにＩＢＭ（登録商標）及びＭｏｔｏｒｏｌａ製ＰｏｗｅｒＰＣが挙げられる。デュアルマイクロプロセッサ及びその他のマルチプロセッサアーキテクチャもまた、処理装置１２１として使用することができる。
【0057】
該システムバスは、メモリバスまたはメモリコントローラ、周辺機器用バス、及び様々な従来のバスアーキテクチャ、例えば、数例を挙げると、ＰＣＩ、ＶＥＳＡ、ＡＧＰ、ＭｉｃｒｏＣｈａｎｎｅｌ、ＩＳＡ、及びＥＩＳＡのいずれかを使用するローカルバスを含めた、いくつかのタイプのバス構造のいずれかであり得る。例えば、起動時にコンピュータ１２０内の要素間で情報を転送するのに役立つ基本ルーティンを含む基本入力／出力システム（ＢＩＯＳ）は、ＲＯＭ１２４に格納される。システムメモリは、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）１２４及びランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）１２５を含む。コンピュータ１２０はさらに、ハードディスクドライブ１２７、例えば、リムーバブルディスク１２９から読み取るためまたはそこに書き込むための磁気ディスクドライブ１２８、及び、例えば、ＣＤ－ＲＯＭディスク１３１を読み取るため、または他の光媒体から読み取るためもしくはそこに書き込むための光ディスクドライブ１３０を含み得る。ハードディスクドライブ１２７、磁気ディスクドライブ１２８、及び光ディスクドライブ１３０は、それぞれ、ハードディスクドライブインタフェース１３２、磁気ディスクドライブインタフェース１３３、及び光学ドライブインタフェース１３４によってシステムバス１２３に接続される。これらのドライブ及び関連するコンピュータ可読媒体は、コンピュータ１２０に対して、データの不揮発性ストレージ、データ構造（データベース）、コンピュータ実行可能命令等を提供する。上記のコンピュータ可読媒体の説明は、ハードディスク、リムーバブル磁気ディスク及びＣＤに言及しているが、当業者には、コンピュータ可読の他のタイプの媒体、例えば、磁気カセット、フラッシュメモリカード、デジタルビデオディスク、ベルヌーイカートリッジ等もまた、例示的な動作環境で使用することができることを理解されたい。
【0058】
オペレーティングシステム１３５、１つ以上のアプリケーションプログラム１３６、他のプログラムモジュール１３７、及びプログラムデータ１３８等のデータは、これらのドライブ及びＲＡＭ１２５に格納することができる。ユーザーは、様々な入力装置、例えば、キーボード１４０及びポインティングデバイス、例えば、マウス１４２を使用して、コンピュータ１２０にコマンド及び情報を入力することができる。他の入力装置（図示せず）としては、マイクロフォン、衛星放送受信アンテナ、スキャナ等を挙げることができる。これら及び他の入力装置は、多くの場合、システムバスに結合されるシリアルポートインタフェース１４６を介して処理装置１２１に接続されるが、他のインタフェース、例えば、パラレルポート、ゲームポートまたはユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）によって接続することもできる。モニタ１４７または他のタイプの表示装置もまた、ビデオアダプタ１４８等のインタフェースを介してシステムバス１２３に接続される。モニタに加えて、コンピュータは通常、プリンタ等の他の周辺出力装置（図示せず）を含む。代替的に、表示媒体は、プリントアウトまたは他の有形的表現媒体である。出力情報は、保存及び／またはその後の使用または表示用に、コンピュータ可読媒体に保存することもできる。
【0059】
コンピュータ１２０は、１つ以上の他のコンピュータシステム、例えば、コンピュータ１０２への論理結合を使用してネットワーク化された環境で操作することができる。該他のコンピュータシステムは、サーバ、ルータ、ピアデバイスまたは他の共通ネットワークノードでもよく、通常、コンピュータ１２０に関して示される要素の多くまたはすべてを含むが、図１２には、記憶装置１４９のみが示されている。図１２に示す論理結合は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）１５１及び広域ネットワーク（ＷＡＮ）１５２を含む。かかるネットワーク環境は、オフィス、企業規模のコンピュータネットワーク、イントラネット、及びインターネットで共通である。
【0060】
ＬＡＮネットワーク環境で使用される場合、コンピュータ１２０は、ネットワークインタフェースまたはアダプタ１５３を介してローカルネットワーク１５１に接続される。ＷＡＮネットワーク環境で使用される場合、コンピュータ１２０は通常、インターネット等の広域ネットワーク１５２を介して通信を確立するため（例えば、ＬＡＮ１５１及びゲートウェイまたはプロキシサーバ１５５を介して）のモデム１５４または他の手段を含む。モデム１５４は、内蔵でも外付けでもよいが、シリアルポートインタフェース１４６を介してシステムバス１２３に接続される。ネットワーク化された環境では、コンピュータ１２０またはその一部に関して示されているプログラムモジュールは、遠隔記憶装置に格納することができる。示されているネットワーク接続は例示であり、コンピュータシステム間の通信リンクを確立する他の手段（イーサネットカード、ＩＳＤＮターミナルアダプタ、ＡＤＳＬモデム、１０ＢａｓｅＴアダプタ、１００ＢａｓｅＴアダプタ、ＡＴＭアダプタ等を含む）を使用してもよいことが理解されよう。
【0061】
該方法が含む上記の実行及び操作を含めた該方法は、コンピュータ１２０によって行われる場合もあれば、本開示の方法を行うために特異的にプログラムされた、または特化された機器もしくは他の装置によって行われる場合もある。従って、該方法は、特殊な機械、例えば、汎用コンピュータ以外の装置で実施され得る。かかる実行及び操作は、コンピュータで実行されると表現されることがある。該実行及び象徴的に表現される操作としては、データビットを表す電気信号の処理装置１２１による操作が挙げられ、結果として、該電気信号表現の変化または減少、及び該記憶装置（システムメモリ１２２、ハードドライブ１２７、フロッピーディスク１２９、及びＣＤ－ＲＯＭ１３１を含む）の記憶場所でのデータビットの維持をもたらし、それにより、該コンピュータシステムの操作、及び他の信号の処理を再構成または変更することが理解されよう。データビットが維持されるメモリの場所は、該データビットに対応する特定の電気的、磁気的、または光学的特性を有する物理的な位置である。
【0062】
例示的な分散コンピューティング環境
図１３は、本開示の方法を実行するために使用されるソフトウェア及び／またはデータベース要素が存在し得る分散コンピューティング環境を示す。分散コンピューティング環境２００は、接続媒体２０６によって接続される２つのコンピュータシステム２０２、２０４を含むが、本開示の方法は、接続媒体２０６によって接続される任意の多数のコンピュータシステムに等しく適用可能である。コンピュータシステム２０２、２０４は、パーソナルコンピュータ、マルチプロセッサシステム、ハンドヘルドデバイス等を含めた、いくつかのタイプのコンピュータシステム構成のいずれかであり得る。他のコンピュータシステムとの論理的関係の観点から、あるコンピュータシステムは、クライアント、サーバ、ルータ、ピアデバイス、または他の共通ネットワークノードであり得る。追加のコンピュータシステム２０２または２０４は、任意の数の接続媒体２０６によって接続され得る。接続媒体２０６は、イーサネット、企業規模のコンピュータネットワーク、イントラネット及びインターネットが挙げられるがこれらに限定されない、任意のローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、または他のコンピュータネットワークを含むことができる。
図１３は、本開示の方法を実行するために使用されるソフトウェア及び／またはデータベース要素が存在し得る分散コンピューティング環境を示す。分散コンピューティング環境２００は、接続媒体２０６によって接続される２つのコンピュータシステム２０２、２０４を含むが、本開示の方法は、接続媒体２０６によって接続される任意の多数のコンピュータシステムに等しく適用可能である。コンピュータシステム２０２、２０４は、パーソナルコンピュータ、マルチプロセッサシステム、ハンドヘルドデバイス等を含めた、いくつかのタイプのコンピュータシステム構成のいずれかであり得る。他のコンピュータシステムとの論理的関係の観点から、あるコンピュータシステムは、クライアント、サーバ、ルータ、ピアデバイス、または他の共通ネットワークノードであり得る。追加のコンピュータシステム２０２または２０４は、任意の数の接続媒体２０６によって接続され得る。接続媒体２０６は、イーサネット、企業規模のコンピュータネットワーク、イントラネット及びインターネットが挙げられるがこれらに限定されない、任意のローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、または他のコンピュータネットワークを含むことができる。
【0063】
ソフトウェア及びデータ格納用のデータベースの一部は、単一のコンピュータシステム２０２または２０４に組み入れることができ、アプリケーションは後に、分散コンピューティング環境２００における他のコンピュータシステム２０２、２０４に分散される。ソフトウェアの一部は、分散コンピューティング環境２００で実行してもよく、ここでは、通信ネットワークを介してアクセスされる遠隔処理装置として機能する単一のコンピュータシステム２０２または２０４によってタスクが実行され、分散アプリケーションは後に、分散コンピューティング環境２００における他のコンピュータシステムに分散される。ネットワーク化された環境では、プログラムモジュール及びデータ格納用のデータベースは、複数のコンピュータシステム２０２または２０４に配置することができる。分散コンピューティングネットワーク内のコンピュータシステム間の通信は、有利には、通信されたデータの暗号化を含み得る。
【実施例】
【0064】
以下の実施例は、当業者に対して、本発明の方法及び組成物の作製及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために提示されており、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定することを意図しない。使用される数値（例えば、量、温度等）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくらかの実験誤差及び偏差を考慮されたい。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、室温は約２５℃であり、圧力は大気圧であるか、またはそれに近い。
【0065】
実施例１
単回及び複数回投与のサルの薬物動態試験における治療用モノクローナル抗体の製品品質特性の定量化及びモデル化
本実施例は、単回及び複数回投与ＰＫ試験によるサル血清サンプルを使用して、治療用モノクローナル抗体ＭＡＢ１のＰＱＡの数の調査について記載する。親和性精製とそれに続くＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより、脱アミド化、酸化、Ｎ末端ピログルタミン酸、Ｃ末端リジン除去、及び高マンノースグリコシル化を含めたいくつかのＭＡＢ１のＰＴＭ特性を評価した。さらに、ＰＱＡの重要度を評価するための定量的アプローチを提供するＰＴＭのインビボでの進行及びＰＱＡへの対象の曝露をシミュレートするモデルを構築した。アスパラギンの脱アミド化を代表的なＰＴＭ特性として使用し、これらのモデルを評価した。本開示のモデルによってシミュレートされた脱アミド化されたＭＡＢ１への対象の曝露は、単回及び複数回投与の両試験の実験結果とよく一致した。
単回及び複数回投与のサルの薬物動態試験における治療用モノクローナル抗体の製品品質特性の定量化及びモデル化
本実施例は、単回及び複数回投与ＰＫ試験によるサル血清サンプルを使用して、治療用モノクローナル抗体ＭＡＢ１のＰＱＡの数の調査について記載する。親和性精製とそれに続くＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより、脱アミド化、酸化、Ｎ末端ピログルタミン酸、Ｃ末端リジン除去、及び高マンノースグリコシル化を含めたいくつかのＭＡＢ１のＰＴＭ特性を評価した。さらに、ＰＱＡの重要度を評価するための定量的アプローチを提供するＰＴＭのインビボでの進行及びＰＱＡへの対象の曝露をシミュレートするモデルを構築した。アスパラギンの脱アミド化を代表的なＰＴＭ特性として使用し、これらのモデルを評価した。本開示のモデルによってシミュレートされた脱アミド化されたＭＡＢ１への対象の曝露は、単回及び複数回投与の両試験の実験結果とよく一致した。
【0066】
材料及び方法
材料
本試験で使用したヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体（ＭＡＢ１）及び抗ヒト抗体は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）で製造された。ＭＡＢの平均半減期はおよそ１１．５日であった。特に明記しない限り、試薬はすべてＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から入手した。
材料
本試験で使用したヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体（ＭＡＢ１）及び抗ヒト抗体は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）で製造された。ＭＡＢの平均半減期はおよそ１１．５日であった。特に明記しない限り、試薬はすべてＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から入手した。
【0067】
前臨床サンプルの情報
前臨床血清サンプルは、単回投与または複数回投与のいずれかのカニクイザルＰＫ試験から得た。ＭＡＢ１を対象の静脈内に（ＩＶ）投与した。単回投与試験では、動物に１０ｍｇ／ｋｇを投与し、血清サンプルを８週間（５６日間）にわたって指定の時点（投与前、５分、４時間、１２時間、１日、３日、７日、１４日、１８日、３０日、４２日、及び５６日）で採取した。複数回投与試験では、２週間（１４日間）おきに動物に３ｍｇ／ｋｇを投与し、血清サンプルを８週間（５６日間）にわたって、第一の投与間隔内の指定の時点（投与前、１時間、４時間、１日、３日、７日）、及び新たな投与の各々の前後（１４日、２８日、４２日、５６日）で採取した。血清サンプルは、分析まで－８０℃で保存した。各採取時点でのＭＡＢ１の血清中濃度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。簡潔には、ＭＡＢ１を、薬物標的でコーティングしたマイクロタイタープレートに捕捉した。プレートに捕捉されたＭＡＢ１は、ビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体に続いて西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（ＮｅｕｔｒａＡｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）を使用して検出した。次に、ペルオキシダーゼに特異的なルミノール系基質を加えて、ＭＡＢ１の濃度に比例する信号強度を得た。
前臨床血清サンプルは、単回投与または複数回投与のいずれかのカニクイザルＰＫ試験から得た。ＭＡＢ１を対象の静脈内に（ＩＶ）投与した。単回投与試験では、動物に１０ｍｇ／ｋｇを投与し、血清サンプルを８週間（５６日間）にわたって指定の時点（投与前、５分、４時間、１２時間、１日、３日、７日、１４日、１８日、３０日、４２日、及び５６日）で採取した。複数回投与試験では、２週間（１４日間）おきに動物に３ｍｇ／ｋｇを投与し、血清サンプルを８週間（５６日間）にわたって、第一の投与間隔内の指定の時点（投与前、１時間、４時間、１日、３日、７日）、及び新たな投与の各々の前後（１４日、２８日、４２日、５６日）で採取した。血清サンプルは、分析まで－８０℃で保存した。各採取時点でのＭＡＢ１の血清中濃度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。簡潔には、ＭＡＢ１を、薬物標的でコーティングしたマイクロタイタープレートに捕捉した。プレートに捕捉されたＭＡＢ１は、ビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体に続いて西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（ＮｅｕｔｒａＡｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）を使用して検出した。次に、ペルオキシダーゼに特異的なルミノール系基質を加えて、ＭＡＢ１の濃度に比例する信号強度を得た。
【0068】
血清サンプルからのＭＡＢ１の親和性精製
ＭＡＢ１は、採取したサルの血清サンプルから親和性精製により精製した。簡潔には、ビオチン化抗ヒト抗体を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に室温で１０分間コンジュゲートした。コンジュゲートしたビーズを血清サンプルとともに室温で３０分間インキュベートした。このビーズをＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）で洗浄し、次いで０．１％ギ酸及び５０％アセトニトリルで溶出した。バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、親和性精製でのＭＡＢ１の回収率を評価した。既知量のＡｇｉｌｅｎｔ製２３０ｋＤａ高分子量標準（「上側マーカー」として示す）を、内部正規化対照として各サンプルと一緒に流した。各サンプルにおける上側マーカーのピーク面積に対するＭＡＢ１のピーク面積の比率を計算し、分析ごとのばらつきを補正した。親和性精製でのＭＡＢ１の回収率は、次式を使用して計算した：
ＭＡＢ１は、採取したサルの血清サンプルから親和性精製により精製した。簡潔には、ビオチン化抗ヒト抗体を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に室温で１０分間コンジュゲートした。コンジュゲートしたビーズを血清サンプルとともに室温で３０分間インキュベートした。このビーズをＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）で洗浄し、次いで０．１％ギ酸及び５０％アセトニトリルで溶出した。バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、親和性精製でのＭＡＢ１の回収率を評価した。既知量のＡｇｉｌｅｎｔ製２３０ｋＤａ高分子量標準（「上側マーカー」として示す）を、内部正規化対照として各サンプルと一緒に流した。各サンプルにおける上側マーカーのピーク面積に対するＭＡＢ１のピーク面積の比率を計算し、分析ごとのばらつきを補正した。親和性精製でのＭＡＢ１の回収率は、次式を使用して計算した：
【0069】
トリプシン消化
精製したＭＡＢ１サンプルを、真空濃縮器（ＬＡＢＣＯＮＣＯ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を使用して乾燥させた。乾燥した試料を、８Ｍ尿素及び１０ｍＭのＴＣＥＰ中に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。還元システイン残基を、１０ｍＭのヨードアセトアミドにより、暗所にて室温で３０分間アルキル化した。アルキル化後、消化前に尿素濃度を１．２５Ｍに希釈した。トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を、サンプルに対して酵素：基質比１：１０で加え、３７℃で４時間インキュベートした。消化は、２０％ギ酸（ＦＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の添加により停止させた。消化したサンプルを分析まで－８０℃で保存した。
精製したＭＡＢ１サンプルを、真空濃縮器（ＬＡＢＣＯＮＣＯ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を使用して乾燥させた。乾燥した試料を、８Ｍ尿素及び１０ｍＭのＴＣＥＰ中に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。還元システイン残基を、１０ｍＭのヨードアセトアミドにより、暗所にて室温で３０分間アルキル化した。アルキル化後、消化前に尿素濃度を１．２５Ｍに希釈した。トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を、サンプルに対して酵素：基質比１：１０で加え、３７℃で４時間インキュベートした。消化は、２０％ギ酸（ＦＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の添加により停止させた。消化したサンプルを分析まで－８０℃で保存した。
【0070】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ及びデータ分析
トリプシン消化によって生じたペプチドを、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ及び質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に接続したＡｃｑｕｉｔｙ Ｉ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）にて、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８ １．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して分離した。移動相Ａは０．１％ＦＡ水溶液であり、移動相Ｂは０．１％ＦＡのアセトニトリル溶液であった。ペプチド分離には、流量０．２５ｍＬ／分にて、５６分間の移動相Ｂ２％から移動相Ｂ３０％への勾配を使用した。ＭＳの取得は、フルマススキャンに続いて、各フルスキャンの上位５つの最高強度イオンのタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）スキャンで構成した。ペプチド及びＰＴＭの同定は、Ｂｙｏｎｉｃ（バージョン２．１６．１１、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）によって行い、手作業で検証した。ＰＴＭの相対存在量を定量化するため、修飾ペプチド及び天然ペプチドの両方の最初の同位体ピークのｍ／ｚに基づく抽出イオンクロマトグラムを生成し、５ｐｐｍの質量ウィンドウを使用して、抽出したピーク面積をＳｋｙｌｉｎｅ－ｄａｉｌｙ（バージョン４．１．１．１８１５１）を使用して統合した。各ＰＴＭバリアントのパーセンテージは、この抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）の修飾ペプチドと天然ペプチドのピーク面積の合計に対する修飾ペプチドのピーク面積を使用して計算した。
トリプシン消化によって生じたペプチドを、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ及び質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に接続したＡｃｑｕｉｔｙ Ｉ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）にて、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８ １．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して分離した。移動相Ａは０．１％ＦＡ水溶液であり、移動相Ｂは０．１％ＦＡのアセトニトリル溶液であった。ペプチド分離には、流量０．２５ｍＬ／分にて、５６分間の移動相Ｂ２％から移動相Ｂ３０％への勾配を使用した。ＭＳの取得は、フルマススキャンに続いて、各フルスキャンの上位５つの最高強度イオンのタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）スキャンで構成した。ペプチド及びＰＴＭの同定は、Ｂｙｏｎｉｃ（バージョン２．１６．１１、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）によって行い、手作業で検証した。ＰＴＭの相対存在量を定量化するため、修飾ペプチド及び天然ペプチドの両方の最初の同位体ピークのｍ／ｚに基づく抽出イオンクロマトグラムを生成し、５ｐｐｍの質量ウィンドウを使用して、抽出したピーク面積をＳｋｙｌｉｎｅ－ｄａｉｌｙ（バージョン４．１．１．１８１５１）を使用して統合した。各ＰＴＭバリアントのパーセンテージは、この抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）の修飾ペプチドと天然ペプチドのピーク面積の合計に対する修飾ペプチドのピーク面積を使用して計算した。
【0071】
単回投与ＰＫ試験における品質特性への対象の曝露の計算
単回投与ＰＫ試験における品質特性への対象の曝露の定量的評価は、Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．によって以前に記載された（Ｇｏｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１０；２：５００－７）。ＭＡＢ１の血清中濃度－時間方程式は、２コンパートメントモデルで示すことができる（Ｒｏｗｌａｎｄ ａｎｄ Ｔｏｚｅｒ Ｗｏｌｔｅｒｓ Ｋｌｕｗｅｒ Ｈｅａｌｔｈ／Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０１１）：
式中、Ｃ（ｔ）はＭＡＢ１の血清中濃度であり、Ｃ１、Ｃ２、λ１、及びλ１はハイブリッド定数である。
単回投与ＰＫ試験における品質特性への対象の曝露の定量的評価は、Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．によって以前に記載された（Ｇｏｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１０；２：５００－７）。ＭＡＢ１の血清中濃度－時間方程式は、２コンパートメントモデルで示すことができる（Ｒｏｗｌａｎｄ ａｎｄ Ｔｏｚｅｒ Ｗｏｌｔｅｒｓ Ｋｌｕｗｅｒ Ｈｅａｌｔｈ／Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０１１）：
【0072】
読みやすくするために、以下の形式を採用した：
式中、Ａ及びＢは、ゼロ時間切片（ハイブリッド係数）であり、α及びβは、それぞれ、ハイブリッド一次定数である。この方程式を、採取した時点のＥＬＩＳＡで測定したＭＡＢ１の血清中濃度にフィットさせ、最良フィットパラメータを見出した。このフィッティングの拘束は：Ｃ（０）が最初の投与後のＥＬＩＳＡで測定されるＭＡＢ１の血清中濃度より高くなくてはならないこと、Ｃ（無限大）定数が０であること、Ａ及びＢが０より大きくなくてはならないことである。Ｒ二乗は、当てはまりの良さを定量化するために使用し、Ｒ二乗が０．９５を超えた場合に良好なフィットと見なした。
【0073】
部位特異的Ａｓｎでの脱アミド化を伴うＭＡＢ１の相対存在量は、一次速度定数の方程式によって示すことができる：
式中、Ｐ脱アミド化（ｔ）は脱アミド化の割合であり、Ｐ０は、０日目における初期の脱アミド化レベルであり、ｋ脱アミド化は、脱アミド化速度定数である。
【0074】
特定のＡｓｎ部位での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の血清中濃度は、次のように示すことができる：
式中、Ｃ脱アミド化（ｔ）は、特定のＡｓｎ部位での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の血清中濃度である。Ｃ脱アミド化（ｔ）の曲線下面積（ＡＵＣ）は、この品質特性（すなわち、特定のＡｓｎ部位での脱アミド化を伴うＭＡＢ１）への対象の曝露を表す。Ｃ（ｔ）とＰ脱アミド化（ｔ）を示す方程式を、ＪＭＰ（バージョン１３．２．１、ＳＡＳ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用した非線形回帰で解いた。Ｃ脱アミド化（ｔ）は、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を使用して計算し、ＪＭＰを使用してプロットした。Ｃ脱アミド化（ｔ）のＡＵＣで表される対象の曝露は、ＪＭＰを使用して計算した。
【0075】
複数回投与ＰＫ試験における品質特性への対象の曝露の計算
複数回投与ＰＫ試験における品質特性への対象の曝露のモデル化を、複数の単回投与の線形累積として重ね合わせの原理を使用し、数学的に単純化した。各投与後のＭＡＢ１の血清中濃度は、上記の単回投与ＰＫ試験で論じた２コンパートメントモデルで示した。ｍ回目の投与の直前のＭＡＢ１の血清中濃度は、以下の通りに示すことができる：
式中、ｍは投与回数であり、τは投与間の時間間隔である。
複数回投与ＰＫ試験における品質特性への対象の曝露のモデル化を、複数の単回投与の線形累積として重ね合わせの原理を使用し、数学的に単純化した。各投与後のＭＡＢ１の血清中濃度は、上記の単回投与ＰＫ試験で論じた２コンパートメントモデルで示した。ｍ回目の投与の直前のＭＡＢ１の血清中濃度は、以下の通りに示すことができる：
【0076】
ｍ回目の投与の直後のＭＡＢ１の血清中濃度は、以下の通りに示すことができる：
【0077】
ｍが無限大に近づくと、Ｃｍ，投与前及びＣｍ，投与後は以下の通りに示される定常状態の濃度に近づく：
【0078】
ｍ回目の投与の直前に特定のＡｓｎ部位での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の血清中濃度は、以下の通りに示すことができる：
【0079】
ｍ回目の投与の直後に特定された特定のＡｓｎ部位での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の血清中濃度は、以下の通りに示すことができる：
ここで、Ｐ脱アミド化（ｔ）は、上記の単回投与ＰＫ試験で論じた一次反応方程式である。
【0080】
従って、ｍ回目の投与の直前に特定のＡｓｎ部位での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の相対存在量は、以下の通りに示すことができる：
【0081】
ｍ回目の投与の直後に特定のＡｓｎ部位での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の相対存在量は、以下の通りに示すことができる：
【0082】
ｍが無限大に近づくと、Ｐ脱アミド化，ｍ，投与前及びＰ脱アミド化，ｍ，投与後は以下の通りに示される定常状態のレベルに近づく：
【0083】
総和項の計算が収束するため、定常状態での投与前の脱アミド化のレベルは、以下の通りに簡略化することができる：
【0084】
従って、定常状態での投与後の脱アミド化のレベルは、以下の通りに簡略化することができる：
この式の定数Ａ、Ｂ、α、β、及びｋは、最初の投与間隔内での実験結果にこの式をフィットさせることによって解いた。このシミュレーション値及び予測値を、Ｅｘｃｅｌを使用して計算し、ＪＭＰを使用してプロットした。対象の曝露（すなわち、ＡＵＣ）は、ＪＭＰを使用して計算した。
【0085】
結果
インビボでのＭＡＢ１の翻訳後修飾の定量化
様々なＰＴＭを伴うＭＡＢ１バリアントのインビボ動態を、単回及び複数回投与の両方のサルＰＫ試験で評価した。
インビボでのＭＡＢ１の翻訳後修飾の定量化
様々なＰＴＭを伴うＭＡＢ１バリアントのインビボ動態を、単回及び複数回投与の両方のサルＰＫ試験で評価した。
【0086】
ストレプトアビジン磁気ビーズにコンジュゲートしたビオチン化抗ヒトＦｃ抗体を使用して、サルの血清サンプルからＭＡＢ１を抽出した。ＭＡＢ１の親和性精製による回収率は＞９９．５％であり（図１）、これは親和性精製アプローチが、本来のＭＡＢ１とそのＰＴＭバリアントの両方を完全に抽出することができることを示し、各ＰＴＭの相対的なＰＴＭ存在量の正確な定量を保証した。
【0087】
図２Ａは、野生型Ｆｃトリプシンペプチド「ＤＴＬＭＩＳＲ」（配列番号１）（下部パネル）及び対応するメチオニン（Ｍｅｔ）酸化ペプチド（上部パネル）の同定の例示的なタンデムＭＳスペクトルを示す。図２Ｂは、野生型ペプチド（下部パネル）及び対応するＭｅｔ酸化ペプチド（上部パネル）の抽出イオンクロマトグラフのピーク面積を示す。
【0088】
アスパラギン（Ａｓｎ）の脱アミド化は、ｍＡｂｓの高度に保存された結晶化可能断片（Ｆｃ）領域では一般的なＰＴＭである（Ｃｈｅｌｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５；７７：６００４－１１、Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ：ａ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００９；１８：１５７３－８４）。３つの一般的な脱アミド化部位、すなわち、ＣＨ２ドメインの「ＮＧ」（Ａｓｎ部位１）、ＣＨ３ドメインのＰＥＮＮＹペプチドの「ＮＧ」（Ａｓｎ部位２）及び「ＮＮ」（Ａｓｎ部位３）を本試験では測定した。本試験では、Ａｓｎの３つの脱アミド化部位、すなわち、ＣＨ２ドメインの「ＮＧ」（Ａｓｎ部位１）、ＣＨ３ドメインの「ＮＧ」（Ａｓｎ部位２）及び「ＮＮ」（Ａｓｎ部位３）を測定した。単回投与ＰＫ試験では、Ａｓｎ部位１での脱アミド化の相対存在量は、５６日間にわたって約０．２％の低レベルでほとんど変化しなかった（図３Ａ）。Ａｓｎ部位２及びＡｓｎ部位３の脱アミド化の相対存在量は、５６日間で、それぞれ、約１％から、２５．５％及び９．１％に増加した（図３Ａ）。脱アミド化率は、一次アミノ酸配列、タンパク質構造、ｐＨ、温度、及び緩衝剤組成に依存する（Ｃｈｅｌｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５；７７：６００４－１１、Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ：ａ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００９；１８：１５７３－８４、Ｋｏｓｓｉａｋｏｆｆ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８；２４０：１９１－４、Ａｔｈｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００２；２７７：３０５０２－７、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９９９；８８：８－１３、Ｗｅａｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９８９；５：８－１２、Ｃａｐａｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ １９９９；５４：３７７－８２、Ｓｏｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００１；９０：１４１－５６、Ｗａｋａｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００６；９５：２３２１－３６、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２００６；３０８：４６－５１、Ｐａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１３；１０２：１７１２－２３）。一次アミノ酸配列内のグリシン（Ｇｌｙ）またはセリン（Ｓｅｒ）が後に続くＡｓｎ残基は、特に脱アミド化を受けやすい（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９０；７：７８７－９３、Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８９；２６４：６１６４－７０；ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２００１；９８：９４４－９、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００４；６３：４２６－３６）。「ＮＧ」及び「ＮＮ」部位は完全に溶媒にさらされるため、ＣＨ２ドメインの「ＮＧ」部位（ＤｅＬａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００；２８７：１２７９－８３）より脱アミド化を受けやすい（ＤｅＬａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００；２８７：１２７９－８３）。
【0089】
脱アミド化率は、以前に確立された一次速度方程式を使用して示すことができる（Ｇｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８７；２６２：７８５－９４）。この速度方程式は
で表すことができ、ここで、Ｐ脱アミド化（ｔ）は、材料及び方法に記載の通り、時間の関数としての脱アミド化の割合であり、Ｐ０は、初期の脱アミド化のレベルであり、ｋ脱アミド化は、脱アミド化速度定数である。この方程式を、単回投与試験においてＬＣ－ＭＳで測定した脱アミド化のレベルに非線形的にフィットさせ、最良フィットパラメータを特定した（図３Ａ及び表１）。Ａｓｎ部位１、Ａｓｎ部位２、及びＡｓｎ部位３のインビボ脱アミド化速度定数を非線形的にフィットさせて、それぞれ、Ｒ２が０．９９４６、０．９８６６、及び０．８９４１でそれぞれ、０．００３２７８％日－１、０．５３８４％日－１、及び０．１５６６％日－１であった（表１）。
【0090】
（表１）単回投与ＰＫ試験による修飾速度方程式における最良フィットパラメータ値
ここで、Ｐ０は、０日目における初期の脱アミド化レベルであり、ｋ脱アミド化は、脱アミド化速度定数である。
【0091】
複数回投与試験では、Ａｓｎ部位１での脱アミド化は、５６日間にわたる５回の隔週投与後、約０．５％の低レベルでほとんど変化しなかった（図３Ｂ）。Ａｓｎ部位２及び３の脱アミド化の相対存在量は、各投与間隔内に蓄積したが、新たに投与された非脱アミド化ＭＡＢ１による希釈のため、新たな投与の各々の後に急激に低下した（図３Ｂ）。脱アミド化ＭＡＢ１の蓄積により、投与前及び投与後の脱アミド化レベルは、各投与後に徐々に上昇した。５６日目の５回目の投与の前、Ａｓｎ部位２での脱アミド化の投与前レベルは１４．２％に上昇したが、投与後レベルは７．９％に下がった（図３Ｂ）。５６日目の５回目の投与の前、Ａｓｎ部位３での脱アミド化の投与前レベルは６．２％に上昇したが、投与後レベルは３．６％に下がった（図３Ｂ）。結果として、Ａｓｎ部位２及びＡｓｎ部位３での脱アミド化の相対存在量は、経時的に増加傾向の鋸歯状のパターンを示した（図３Ｂ）。図３Ｂはまた、投与前及び投与後の両脱アミド化レベルが、有限の投与回数後に定常状態に近づくことを示唆している。脱アミノ化の定常状態レベルを予測するため、ＭＡＢ１濃度の２コンパートメントモデルを構築し、これを以下のモデル化の節で論じる。Ｍｅｔ酸化はｍＡｂｓの別の一般的なＰＴＭである（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３；３０：１６７－７８、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１；２８６：１１２１１－７１８）。Ｆｃ領域でのＭｅｔ酸化は、Ｆｃ受容体の結合に影響を与えることが分かっている（Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ：ａ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００９；１８：４２４－３３）。本試験では、Ｆｃ領域の３つの一般的なＭｅｔ酸化部位、すなわち、ＣＨ２ドメインのＭｅｔ部位１、ならびにＣＨ３ドメインのＭｅｔ部位２及び３を評価した。単回投与試験では、Ｍｅｔ部位１、２、及び３での酸化の相対存在量は、それぞれ、約８．０％、約２．０％、及び約５．０％のレベルで５６日間にわたって比較的変化しなかった（図４Ａ）。複数回投与試験では、Ｍｅｔ部位１での酸化レベルは、各投与間隔の間にわずかに低下し、各投与後にわずかに上昇し、約７．０％～約９．０％の間で変動する鋸歯状のパターンを示した。Ｍｅｔ部位２及び３での酸化レベルは、複数回投与試験では、それぞれ、約１．０％及び４．０％のレベルで安定したままであった（図４Ｂ）。
【0092】
ｍＡｂのＮ末端でのＮ末端グルタミン及びグルタミン酸は、化学的または酵素的環化を通じてピログルタミン酸を形成する傾向がある。グルタミンの変換は、グルタミン酸の変換よりはるかに速く行われる（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３；３０：１６７－７８、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１；２８６：１１２１１－７１８）。Ｎ末端環化タンパク質は、アミノペプチダーゼによる消化に対する耐性を示し、分解を防ぐ。この変換を触媒する酵素であるグルタミニルシクラーゼは、ヒトの血液に含まれ（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００８；３８９：９８３－９１）、インビボでのｍＡｂのグルタミン酸からのピログルタミン酸の形成は、主にｐＨ依存性の非酵素的反応であり、インビトロのＰＢＳ中で同じ速度定数を有する（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３；３０：１６７－７８、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１；２８６：１１２１１－７）。単回投与試験では、Ｎ末端ピログルタミン酸は、５６日間で０．７％から１１．７％に増加した（図５Ａ）。インビボでのＮ末端ピログルタミン酸形成率は、ＬＣ－ＭＳで測定されたＮ末端ピログルタミン酸レベルへの非線形フィッティングを使用して、Ｒ２が０．９９７０で０．２２０１％日－１と特定された。複数回投与試験では、Ｎ末端ピログルタミン酸形成は、Ａｓｎの脱アミド化と同様の鋸歯状パターンに似ていた（図５Ｂ）。ピログルタミン酸のレベルは、各投与間隔の間に上昇したが、新たに投与された未修飾のＭＡＢ１による希釈を受け、新たな投与の各々の後に急激に低下した。５６日目の５回目の投与の前、ピログルタミン酸のレベルは７．６％に上昇し、５回目の投与後に４．２％に下がった（図５Ｂ）。
【0093】
ｍＡｂの重鎖のＣ末端のリジン残基は、タンパク質発現の過程で塩基性カルボキシペプチダーゼによって除去されやすい（Ｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２００８；１００：１１３２－４３）。Ｃ末端のリジンの部分的な除去により、電荷が不均一になる。投与前、Ｃ末端のリジンを含むＭＡＢ１製剤の割合は約２．０％であった。単回及び複数回投与の両試験で、Ｃ末端のリジンは、各投与後１日以内に急速に除去された（図６）。これらの観察は、以前に報告された試験と一致する。
【0094】
Ｆｃ領域でのＮ結合型グリコシル化は、一般に観察されるｍＡｂのＰＱＡである。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）で発現されるｍＡｂのＮ結合型グリコフォームの主要な構造は、通常、１つ以上のさらなる単糖が結合したコアの二分岐五糖構造からなる。複雑な二分岐オリゴ糖構造に加えて、高マンノースグリコフォーム（例えば、マンノース５）もまた、ＣＨＯで発現される抗体において観察され得る。単回投与試験では、主要なグリコフォーム（フコシル化複合体の二分岐）の相対存在量は５６日間にわたって変化しなかった。しかしながら、マンノース５のグリコフォームの相対存在量は、６週間以内に０．５％から検出不能まで減少した（図６Ａ）。この知見は、高マンノース受容体を介したクリアランス経路による高マンノースグリコフォームのより速い血清クリアランスと一致する（Ｇｏｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１；２１：９４９－５９、Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１２；４：５０９－２０）。複数回投与試験では、マンノース５のレベルは、各投与間隔の間に低下し、新たな投与の各々の直後に、新たに投与された高レベルのマンノース５を有するＭＡＢ１との混合により評価され、鋸歯状パターンを示した（図６Ｂ）。５回目の投与を施す前、マンノース５のレベルは０．１％に低下した。５回目の投与を施した後、マンノース５のレベルは０．４％に上昇した。
【0095】
単回投与試験におけるＭＡＢ１のＰＱＡへの対象の曝露のモデル化
ｍＡｂの品質特性への対象の曝露の定量的評価は、品質特性が薬物の安全性及び有効性に与える影響を評価するのに役立つ。材料及び方法の節で記載したように、ある特定のＰＴＭを伴うｍＡｂのインビボ血清中濃度は、ＣＰＴＭ（ｔ）＝Ｃ（ｔ）・Ｐ（ｔ）で示すことができる。ＣＰＴＭ（ｔ）の曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＰＴＭを伴うｍＡｂへの対象の曝露に相当する（Ｇｏｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１０；２：５００－７）。本試験では、Ａｓｎ部位２及びＡｓｎ部位３での脱アミド化ならびにＮ末端ピログルタミン酸形成を例として使用して、単回投与試験でのＰＱＡへの対象の曝露のモデル化を示した。Ｍｅｔ酸化がインビボで変化しなかった（図４）ため、本明細書で論じる他のＰＴＭではモデル化は行わず、Ｃ末端のリジンは、投与後数時間で急速に除去され（図６）、マンノース５及びＡｓｎ部位１での脱アミド化のレベルは極端に低かった（０．５％未満、図３及び図７）ため、これらのＰＴＭのモデル化が実質的に意味のないものである可能性が生じた。
ｍＡｂの品質特性への対象の曝露の定量的評価は、品質特性が薬物の安全性及び有効性に与える影響を評価するのに役立つ。材料及び方法の節で記載したように、ある特定のＰＴＭを伴うｍＡｂのインビボ血清中濃度は、ＣＰＴＭ（ｔ）＝Ｃ（ｔ）・Ｐ（ｔ）で示すことができる。ＣＰＴＭ（ｔ）の曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＰＴＭを伴うｍＡｂへの対象の曝露に相当する（Ｇｏｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１０；２：５００－７）。本試験では、Ａｓｎ部位２及びＡｓｎ部位３での脱アミド化ならびにＮ末端ピログルタミン酸形成を例として使用して、単回投与試験でのＰＱＡへの対象の曝露のモデル化を示した。Ｍｅｔ酸化がインビボで変化しなかった（図４）ため、本明細書で論じる他のＰＴＭではモデル化は行わず、Ｃ末端のリジンは、投与後数時間で急速に除去され（図６）、マンノース５及びＡｓｎ部位１での脱アミド化のレベルは極端に低かった（０．５％未満、図３及び図７）ため、これらのＰＴＭのモデル化が実質的に意味のないものである可能性が生じた。
【0096】
ＭＡＢ１の血清中濃度－時間プロファイルは、２コンパートメント薬物動態モデルの方程式Ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔで示された式であった。式中、Ａ及びＢは、α及びβがハイブリッド一次定数である場合のハイブリッド係数である。単回投与ＰＫ試験による実験的なＭＡＢ１血清中濃度は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して特定した。モデル化方程式は、Ｒ２が０．９９１６でのＥＬＩＳＡで測定されたＭＡＢ１血清中濃度に非線形フィットさせることによって解いた（図８Ａ）。モデル化方程式の最良フィットパラメータ値を表２に示す。Ｃ（ｔ）のＡＵＣで表される５６日間にわたる全ＭＡＢ１への対象の曝露は、４３０２．０μｇ／ｍＬ・日であった（図８Ａ）。
【0097】
Ａｓｎ部位２での脱アミド化の速度方程式は、上記前節でＰ脱アミド化－Ａｓｎ２（ｔ）＝１－（１－０．０１１４３）・ｅ－０．００５３９４ｔとして特定された。Ａｓｎ部位２での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の血清中濃度－時間方程式Ｃ脱アミド化－Ａｓｎ２（ｔ）＝Ｃ（ｔ）・Ｐ脱アミド化－Ａｓｎ２（ｔ）は、従って、Ｃ（ｔ）とＰ脱アミド化－Ａｓｎ２（ｔ）の乗算によって解くことができる。Ｃ脱アミド化－Ａｓｎ２（ｔ）の曲線を図８Ｂにプロットした。Ｃ脱アミド化（ｔ）のＡＵＣで表されるＡｓｎ部位２での脱アミド化を伴うＭＡＢ１への５６日間にわたる対象の曝露は、４２６．７μｇ／ｍＬ・日と計算され（図８Ｂ）、全ＭＡＢ１への５６日間にわたる対象の暴露の９．９％を占めていた。
【0098】
同様に、Ａｓｎ部位３での脱アミド化の速度方程式は、上記前節でＰ脱アミド化－Ａｓｎ３（ｔ）＝１－（１－０．００８８４８）・ｅ－０．００１５４６ｔとして特定された。Ａｓｎ部位３での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の血清中濃度－時間方程式Ｃ脱アミド化－Ａｓｎ３（ｔ）＝Ｃ（ｔ）・Ｐ脱アミド化－Ａｓｎ３（ｔ）は、従って、Ｃ（ｔ）とＰ脱アミド化－Ａｓｎ３（ｔ）の乗算によって解くことができる。Ｃ脱アミド化－Ａｓｎ３（ｔ）の曲線を図８Ｂにプロットした。Ｃ脱アミド化－Ａｓｎ３（ｔ）のＡＵＣで表されるＡｓｎ部位３での脱アミド化を伴うＭＡＢ１への５６日間にわたる対象の曝露は、１５２．５μｇ／ｍＬ・日と計算され（図８Ｂ）、全ＭＡＢ１への５６日間にわたる対象の暴露の３．５％を占めていた。
【0099】
Ｎ末端ピログルタミン酸形成の速度方程式は、上記前節でＰＰｙｒｏＥ（ｔ）＝１－（１－０．００６８６８）・ｅ－０．００２２０１ｔとして特定された。Ｎ末端ピログルタミン酸を伴うＭＡＢ１の血清中濃度－時間方程式ＣＰｙｒｏＥ（ｔ）＝Ｃ（ｔ）・ＰＰｙｒｏＥ（ｔ）は、従って、Ｃ（ｔ）とＰＰｙｒｏＥ（ｔ）の乗算によって解くことができる。ＣＰｙｒｏＥ（ｔ）の曲線を図８Ｂにプロットした。ＣＰｙｒｏＥ（ｔ）のＡＵＣで表されるＮ末端ピログルタミン酸を伴うＭＡＢ１への５６日間にわたる対象の曝露は、１９１．５μｇ／ｍＬ・日であり（図８Ｂ）、全ＭＡＢ１への５６日間にわたる対象の暴露の４．５％を占めていた。
【0100】
（表２）単回投与ＰＫ試験及び複数回投与ＰＫ試験の最初の投与間隔からのＭＡＢ１血清中濃度－時間方程式における最良フィットパラメータ値
【0101】
複数回投与試験におけるＭＡＢ１のＰＱＡへの対象の曝露のモデル化
全ＭＡＢ１及び特定の特性（例えば、Ａｓｎ脱アミド化）を有するＭＡＢ１の両方への対象の曝露は、濃度－時間曲線下面積を使用して、任意の所定の時間間隔に対して計算することができる。予測及び実験的全ＭＡＢ１血清中濃度－時間曲線のＡＵＣは、規定の時間間隔にわたる全ＭＡＢ１への対象の曝露を表す。予測及び実験的ＭＡＢ１血清中濃度－時間曲線（図９Ａ）に基づいて、５回の投与（５６日間）にわたる全ＭＡＢ１への予測及び実験的に特定された対象の曝露は、それぞれ、５０１３μｇ／ｍＬ・日及び４７８９μｇ／ｍＬ・日であった。予測値と実験値の差は４．７％である。同様に、Ａｓｎ部位２での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の予測及び実験的に特定された濃度－時間曲線のＡＵＣは、規定の時間間隔にわたるＡｓｎ部位２での脱アミド化を伴うＭＡＢ１への対象の曝露を表す。Ａｓｎ部位２で脱アミド化されたＭＡＢ１への５回の投与（５６日間）にわたる予測及び実験的に特定された対象の曝露は、それぞれ、３８１．５μｇ／ｍＬ・日及び３５２．６μｇ／ｍＬ・日であった（図９Ａ）。Ａｓｎ部位２で脱アミド化されたＭＡＢ１への予測及び実験的に特定された対象の曝露は、５６日間にわたる全ＭＡＢ１への対象の曝露の割合として、それぞれ、７．０％及び７．９％であり、これらのモデルが実験結果を正確に予測することができることを示した。
全ＭＡＢ１及び特定の特性（例えば、Ａｓｎ脱アミド化）を有するＭＡＢ１の両方への対象の曝露は、濃度－時間曲線下面積を使用して、任意の所定の時間間隔に対して計算することができる。予測及び実験的全ＭＡＢ１血清中濃度－時間曲線のＡＵＣは、規定の時間間隔にわたる全ＭＡＢ１への対象の曝露を表す。予測及び実験的ＭＡＢ１血清中濃度－時間曲線（図９Ａ）に基づいて、５回の投与（５６日間）にわたる全ＭＡＢ１への予測及び実験的に特定された対象の曝露は、それぞれ、５０１３μｇ／ｍＬ・日及び４７８９μｇ／ｍＬ・日であった。予測値と実験値の差は４．７％である。同様に、Ａｓｎ部位２での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の予測及び実験的に特定された濃度－時間曲線のＡＵＣは、規定の時間間隔にわたるＡｓｎ部位２での脱アミド化を伴うＭＡＢ１への対象の曝露を表す。Ａｓｎ部位２で脱アミド化されたＭＡＢ１への５回の投与（５６日間）にわたる予測及び実験的に特定された対象の曝露は、それぞれ、３８１．５μｇ／ｍＬ・日及び３５２．６μｇ／ｍＬ・日であった（図９Ａ）。Ａｓｎ部位２で脱アミド化されたＭＡＢ１への予測及び実験的に特定された対象の曝露は、５６日間にわたる全ＭＡＢ１への対象の曝露の割合として、それぞれ、７．０％及び７．９％であり、これらのモデルが実験結果を正確に予測することができることを示した。
【0102】
Ａｓｎ部位３で脱アミド化されたＭＡＢ１への５回の投与（５６日間）にわたる予測及び実験的に特定された対象の曝露は、それぞれ、１７２．８μｇ／ｍＬ・日及び１５８．８μｇ／ｍＬ・日であった（図９Ａ）。Ａｓｎ部位３で脱アミド化されたＭＡＢ１への予測及び実験的に特定された対象の曝露は、５６日間にわたる全ＭＡＢ１への対象の曝露の割合として、それぞれ、３．４％及び３．３％であった。
【0103】
Ｎ末端ピログルタミン酸を伴うＭＡＢ１への５回の投与（５６日間）にわたる予測及び実験的に特定された対象の曝露は、それぞれ、２１８．５μｇ／ｍＬ・日及び２３１．８μｇ／ｍＬ・日であった（図１０Ａ）。Ｎ末端ピログルタミン酸を伴うＭＡＢ１への予測及び実験的に特定された対象の曝露は、５６日間にわたる全ＭＡＢ１への対象の曝露の割合として、それぞれ、４．３％及び４．８％であった。
【0104】
複数回投与試験におけるＭＡＢ１のＰＱＡのインビボでの相対存在量のモデル化
これらモデルを使用し、複数回投与試験の間の任意の所与の投与におけるｍＡｂのＰＱＡの投与前及び投与後のレベルを式１２及び式１３をそれぞれ用いることによって予測することもできる。例えば、５６日目における、Ａｓｎ部位２での脱アミド化の投与前及び投与後の脱アミド化の予測レベルは、それぞれ、１４．２％及び７．９％である。この予測値は、５６日目にＬＣ／ＭＳで測定された、それぞれ、１５．０％と７．９％であった投与前及び投与後と一致する。他のすべての予測脱アミド化レベル（図９Ｂ、中空円）は、実験測定値（図９Ｂ、中実点）とよく一致する。複数回投与試験における投与前及び投与後のＰＴＭレベルは、投与前及び投与後のｍＡｂの血清中濃度が定常状態濃度に達するのと同様に、定常状態に達するであろう（図９Ｂ）。ＰＱＡの投与前及び投与後の予測定常状態レベル（すなわち、プラトーレベル）は、複数回投与試験におけるインビボでのこのＰＱＡの最大及び最小レベルに相当する。式１６及び式１７を使用して、Ａｓｎ部位２での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の投与前及び投与後の定常状態レベルは、それぞれ、１７．９％及び９．７％であると特定された。
これらモデルを使用し、複数回投与試験の間の任意の所与の投与におけるｍＡｂのＰＱＡの投与前及び投与後のレベルを式１２及び式１３をそれぞれ用いることによって予測することもできる。例えば、５６日目における、Ａｓｎ部位２での脱アミド化の投与前及び投与後の脱アミド化の予測レベルは、それぞれ、１４．２％及び７．９％である。この予測値は、５６日目にＬＣ／ＭＳで測定された、それぞれ、１５．０％と７．９％であった投与前及び投与後と一致する。他のすべての予測脱アミド化レベル（図９Ｂ、中空円）は、実験測定値（図９Ｂ、中実点）とよく一致する。複数回投与試験における投与前及び投与後のＰＴＭレベルは、投与前及び投与後のｍＡｂの血清中濃度が定常状態濃度に達するのと同様に、定常状態に達するであろう（図９Ｂ）。ＰＱＡの投与前及び投与後の予測定常状態レベル（すなわち、プラトーレベル）は、複数回投与試験におけるインビボでのこのＰＱＡの最大及び最小レベルに相当する。式１６及び式１７を使用して、Ａｓｎ部位２での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の投与前及び投与後の定常状態レベルは、それぞれ、１７．９％及び９．７％であると特定された。
【0105】
同様に、Ａｓｎ部位３での投与前及び投与後の予測脱アミド化レベル（図９Ｂ、中空三角形）は、実験測定値（図９Ｂ、中実三角形）とよく一致する。Ａｓｎ部位３での脱アミド化を伴うＭＡＢ１の投与前及び投与後の定常状態レベルは、それぞれ、８．４％及び４．６％であると特定された。
【0106】
投与前及び投与後の予測Ｎ末端ピログルタミン酸レベル（図１０Ｂ、中空円）は、実験測定値（図１０Ｂ、中実点）とよく一致する。Ｎ末端ピログルタミン酸を伴うＭＡＢ１の投与前及び投与後の定常状態レベルは、それぞれ、８．１％及び４．５％であると特定された。
【0107】
モデルの適用例
治療用タンパク質のインビボでのＰＱＡの定量的評価は重要であり、これは、それがインビトロでは特定されない潜在的な重要品質特性（ＣＱＡ）を特定するのに役立つからであり、製品のリスク評価及び制御戦略に影響を及ぼす。本明細書に記載するモデルは、多くの用途でＰＱＡの定量的評価に使用することができる。第一に、単回及び複数回投与レジメンにおけるＰＱＡのインビボでの進行ならびに該ＰＱＡへの対象の曝露を、これらモデルを用いて計算することができる。モデル予測と実験測定値の間の良好な一致は、上記の節で実証された（図８、９、及び１０）。第二に、これらモデルを使用して、投与期間（ｔ）の延長による対象の曝露を予測すること、ならびにＰＱＡの投与前及び投与後の定常状態の濃度／レベルを特定すること（図９及び１０）ができ、前臨床及び臨床試験に対する知見をもたらす。第三に、これらモデルを使用して、プロセス変更またはロット間変動に起因するＰＱＡの初期レベルの変化の影響を、これらモデル化方程式でのＰＱＡの初期レベル（Ｐ０）を調整することによって評価することができる。これは、ＰＱＡがＣＤＲの修飾である場合に特に意味がある。本試験で使用したＭＡＢ１には、本モデル化適用に適したＣＤＲ修飾がないため、１日－１当たり２．５％のインビボ脱アミド化率の仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化を、ＣＤＲ脱アミド化の初期レベルがＰＱＡへの対象の曝露に与える影響を評価するためにこれらモデルを使用する例として使用した。仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化の初期レベルが、それぞれ、０％、１０％、及び２０％である製剤の３つのバッチが存在する場合。これらバッチの経時的なインビボでの仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化は、それぞれ、Ｐ脱アミド化（ｔ）＝１－（１－０）・ｅ－０．０２５ｔ、Ｐ脱アミド化（ｔ）＝１－（１－０．１）・ｅ－０．０２５ｔ、及びＰ脱アミド化（ｔ）＝１－（１－０．２）・ｅ－０．０２５ｔで示すことができる。上記のモデルを使用して、単回投与試験において、初期脱アミド化０％、１０％、及び２０％の仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化バリアントへの５６日間にわたる対象の曝露は、それぞれ、１３８５μｇ／ｍＬ・日、１６５３μｇ／ｍＬ・日、及び１９２１μｇ／ｍＬ・日であり、全ｍＡｂに対する対象の曝露のそれぞれ、３２．５％、３８．８％、及び４５．１％を占めている（図１１Ａ）。複数回投与試験の場合、初期脱アミド化０％、１０％、及び２０％の仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化バリアントへの５回の投与（５６日間）にわたる対象の曝露は、それぞれ、１０８６μｇ／ｍＬ・日、１４７８μｇ／ｍＬ・日、及び１８７１μｇ／ｍＬ・日であり、全ｍＡｂに対する対象の曝露のそれぞれ、２１．７％、２９．５％、及び３７．３％を占めている（図１１Ｂ）。従って、プロセス制御がこの仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化の初期レベルの±１０％をもたらした場合、このＣＤＲ脱アミド化ｍＡｂへの対象の曝露は、５６日間にわたる単回または複数回投与試験において約６～８％変動する。該モデル化により、この仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化への対象の曝露が、ＰＱＡの初期レベルに非感受性であることが示されるため、該ＰＱＡの許容範囲を広げてプロセスのリスク評価の正当化を可能にすることができる。効力アッセイによって測定される効力に対してＣＤＲ修飾が与える影響と組み合わせて、これらのモデル化の結果を使用し、初期のＣＤＲ修飾の変化がプロセス制御またはロット間変動に起因する場合に、有効な薬物への対象の曝露を評価し、製品のリスク評価に重要な情報をもたらすことができる。
治療用タンパク質のインビボでのＰＱＡの定量的評価は重要であり、これは、それがインビトロでは特定されない潜在的な重要品質特性（ＣＱＡ）を特定するのに役立つからであり、製品のリスク評価及び制御戦略に影響を及ぼす。本明細書に記載するモデルは、多くの用途でＰＱＡの定量的評価に使用することができる。第一に、単回及び複数回投与レジメンにおけるＰＱＡのインビボでの進行ならびに該ＰＱＡへの対象の曝露を、これらモデルを用いて計算することができる。モデル予測と実験測定値の間の良好な一致は、上記の節で実証された（図８、９、及び１０）。第二に、これらモデルを使用して、投与期間（ｔ）の延長による対象の曝露を予測すること、ならびにＰＱＡの投与前及び投与後の定常状態の濃度／レベルを特定すること（図９及び１０）ができ、前臨床及び臨床試験に対する知見をもたらす。第三に、これらモデルを使用して、プロセス変更またはロット間変動に起因するＰＱＡの初期レベルの変化の影響を、これらモデル化方程式でのＰＱＡの初期レベル（Ｐ０）を調整することによって評価することができる。これは、ＰＱＡがＣＤＲの修飾である場合に特に意味がある。本試験で使用したＭＡＢ１には、本モデル化適用に適したＣＤＲ修飾がないため、１日－１当たり２．５％のインビボ脱アミド化率の仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化を、ＣＤＲ脱アミド化の初期レベルがＰＱＡへの対象の曝露に与える影響を評価するためにこれらモデルを使用する例として使用した。仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化の初期レベルが、それぞれ、０％、１０％、及び２０％である製剤の３つのバッチが存在する場合。これらバッチの経時的なインビボでの仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化は、それぞれ、Ｐ脱アミド化（ｔ）＝１－（１－０）・ｅ－０．０２５ｔ、Ｐ脱アミド化（ｔ）＝１－（１－０．１）・ｅ－０．０２５ｔ、及びＰ脱アミド化（ｔ）＝１－（１－０．２）・ｅ－０．０２５ｔで示すことができる。上記のモデルを使用して、単回投与試験において、初期脱アミド化０％、１０％、及び２０％の仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化バリアントへの５６日間にわたる対象の曝露は、それぞれ、１３８５μｇ／ｍＬ・日、１６５３μｇ／ｍＬ・日、及び１９２１μｇ／ｍＬ・日であり、全ｍＡｂに対する対象の曝露のそれぞれ、３２．５％、３８．８％、及び４５．１％を占めている（図１１Ａ）。複数回投与試験の場合、初期脱アミド化０％、１０％、及び２０％の仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化バリアントへの５回の投与（５６日間）にわたる対象の曝露は、それぞれ、１０８６μｇ／ｍＬ・日、１４７８μｇ／ｍＬ・日、及び１８７１μｇ／ｍＬ・日であり、全ｍＡｂに対する対象の曝露のそれぞれ、２１．７％、２９．５％、及び３７．３％を占めている（図１１Ｂ）。従って、プロセス制御がこの仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化の初期レベルの±１０％をもたらした場合、このＣＤＲ脱アミド化ｍＡｂへの対象の曝露は、５６日間にわたる単回または複数回投与試験において約６～８％変動する。該モデル化により、この仮説に基づいたＣＤＲ脱アミド化への対象の曝露が、ＰＱＡの初期レベルに非感受性であることが示されるため、該ＰＱＡの許容範囲を広げてプロセスのリスク評価の正当化を可能にすることができる。効力アッセイによって測定される効力に対してＣＤＲ修飾が与える影響と組み合わせて、これらのモデル化の結果を使用し、初期のＣＤＲ修飾の変化がプロセス制御またはロット間変動に起因する場合に、有効な薬物への対象の曝露を評価し、製品のリスク評価に重要な情報をもたらすことができる。
【0108】
考察
ｍＡｂのクリアランス、除去、及び分解をもたらす循環血流の動的なインビボ環境は、ＰＢＳまたは血清のインビトロでのｍＡｂの静的インキュベーションと比較して、患者のＰＱＡの変化を評価するのに、はるかに意味がある（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３；３０：１６７－７８）。従って、インビボでのＰＱＡの定量化及びモデル化は、ＰＱＡの重要度を評価するための、インビトロ試験からは得られない重要な情報を提供する。例えば、本明細書に示すこれらの結果（図６）及び以前の研究（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２０１１；１０８：４０４－１２）は、インビボにおいてＣ末端のリジンが１日以内に急速に除去されることを示している。同様に、トリスルフィド結合は、インビボでは急速にジスルフィド結合に変換されることが分かっている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０）。本明細書に示す結果（図４）及び以前の研究（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０）は、メチオニン酸化のレベルが、多くの場合、インビボ投与後に影響を受けないことを実証した。従って、Ｃ末端リジン除去、トリスルフィド結合、及びメチオニン酸化は、ＣＱＡと見なされる可能性が低い。対照的に、脱アミド化は、単回及び複数回投与レジメン（図３）ならびに以前の研究（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０）において、インビボで蓄積することが分かった。ＣＤＲ領域で生じ、蓄積する脱アミド化は、薬効に影響を与える可能性（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００９；９８：３５０９－２１、Ｈａｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１４；６：３２７－３９）またはオフターゲット結合を引き起こす可能性がある。従って、本明細書に記載の式を使用したインビボでのＣＤＲ脱アミド化のモデル化により、上記（図１１）で実証したように、ＣＤＲ脱アミド化が対象の曝露に与える影響を定量的に評価することができる。
ｍＡｂのクリアランス、除去、及び分解をもたらす循環血流の動的なインビボ環境は、ＰＢＳまたは血清のインビトロでのｍＡｂの静的インキュベーションと比較して、患者のＰＱＡの変化を評価するのに、はるかに意味がある（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３；３０：１６７－７８）。従って、インビボでのＰＱＡの定量化及びモデル化は、ＰＱＡの重要度を評価するための、インビトロ試験からは得られない重要な情報を提供する。例えば、本明細書に示すこれらの結果（図６）及び以前の研究（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２０１１；１０８：４０４－１２）は、インビボにおいてＣ末端のリジンが１日以内に急速に除去されることを示している。同様に、トリスルフィド結合は、インビボでは急速にジスルフィド結合に変換されることが分かっている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０）。本明細書に示す結果（図４）及び以前の研究（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０）は、メチオニン酸化のレベルが、多くの場合、インビボ投与後に影響を受けないことを実証した。従って、Ｃ末端リジン除去、トリスルフィド結合、及びメチオニン酸化は、ＣＱＡと見なされる可能性が低い。対照的に、脱アミド化は、単回及び複数回投与レジメン（図３）ならびに以前の研究（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１６：０）において、インビボで蓄積することが分かった。ＣＤＲ領域で生じ、蓄積する脱アミド化は、薬効に影響を与える可能性（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００９；９８：３５０９－２１、Ｈａｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２０１４；６：３２７－３９）またはオフターゲット結合を引き起こす可能性がある。従って、本明細書に記載の式を使用したインビボでのＣＤＲ脱アミド化のモデル化により、上記（図１１）で実証したように、ＣＤＲ脱アミド化が対象の曝露に与える影響を定量的に評価することができる。
【0109】
本試験では、アスパラギンの脱アミド化及びＮ末端ピログルタミン酸形成を、我々のモデルの有効性を示すための代表的なＰＴＭとして使用した。我々のモデルは、増加傾向または減少傾向のいずれかを示す他のＰＴＭにも適用することができる。例えば、マンノース５の酵素ベースのクリアランスのため、モデルを適用して、三次反応速度を採用することによりマンノース５のクリアランスを評価した。マンノース５の相対存在量が経時的に１．０％未満に減少したにもかかわらず、予測値は実験データとよく一致した（データは示さず）。我々のモデルを使用して他のパラメータを計算し、複数回投与試験における所与の特性またはＰＴＭを評価することができる。これらのパラメータには、定常状態への累積率、定常状態での平均レベル、及び定常状態でのＰＴＭの変動率が含まれる。
【0110】
要約すれば、本発明者らは、治療用ｍＡｂ（ＭＡＢ１）の一般的なインビボでのＰＴＭの変化を特徴づけ、単回及び複数回投与の両試験レジメンに関してＰＴＭのインビボ挙動をモデル化し、インビボでのＰＴＭの影響を評価した。ＭＡＢ１のＦｃ領域にある３つのアスパラギン残基は、異なる脱アミド化率を示した。ＭＡＢ１のＦｃ領域の３つのメチオニン残基での酸化のレベルは、インビボで経時的に変化を示さなかった。Ｎ末端ピログルタミン酸は、インビボで急速に生じた。Ｃ末端のリジンは、１日以内に完全に除去された。高マンノースグリコシル化を有するＭＡＢ１は、加速クリアランスを示した。我々は、代表的なＰＱＡとして、２つのＡｓｎ脱アミド化及びＮ末端ピログルタミン酸形成を使用し、ＰＱＡの血清中濃度、ＰＱＡへの対象の曝露、及びＰＱＡのインビボでの相対存在量を単回及び複数回投与の両レジメンで計算するためのモデル化方程式を構築した。これらのモデル予測を、実験的測定によって検証した。従って、これらモデルを使用して、単回及び複数回投与の両レジメンにおけるインビボでのＰＱＡの進行とＰＱＡへの対象の曝露をシミュレートすることができ、治療用ｍＡｂにおける重要度評価のＰＱＡに対する定量的なアプローチを提供する。
【0111】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際、本明細書に記載のものに加えて、本発明の様々な変更が、上記の説明及び添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【0112】
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
<120> QUANTITATION AND MODELING OF QUALITY ATTRIBUTES OF THERAPEUTIC
MONOCLONAL ANTIBODIES
<150> US 62/625,219
<151> 2018-02-01
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Met oxidized peptide
<400> 1
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
1 5
SEQUENCE LISTING
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
<120> QUANTITATION AND MODELING OF QUALITY ATTRIBUTES OF THERAPEUTIC
MONOCLONAL ANTIBODIES
<150> US 62/625,219
<151> 2018-02-01
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Met oxidized peptide
<400> 1
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】