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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-19
(45)【発行日】2024-09-30
(54)【発明の名称】化合物、細胞性小胞染色剤および細胞性小胞の蛍光染色方法
(51)【国際特許分類】
C07D 271/12 20060101AFI20240920BHJP
C07D 491/147 20060101ALI20240920BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240920BHJP
G01N 33/533 20060101ALI20240920BHJP
【ＦＩ】
C07D271/12 CSP
C07D491/147
G01N33/53 S
G01N33/533
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2022578274
(86)(22)【出願日】2022-01-19
(86)【国際出願番号】 JP2022001692
(87)【国際公開番号】W WO2022163446
(87)【国際公開日】2022-08-04
【審査請求日】2023-07-19
(31)【優先権主張番号】P 2021012443
(32)【優先日】2021-01-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504139662
【氏名又は名称】国立大学法人東海国立大学機構
(74)【代理人】
【識別番号】100167689
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 征二
(72)【発明者】
【氏名】竹森 洋
(72)【発明者】
【氏名】古田 享史
(72)【発明者】
【氏名】森田 洋子
【審査官】水島 英一郎
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２０／２６２３７４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０２０／２３５４２４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１３／０３５７６７（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ，Ｇ０１Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式（１）で表される化合物。【化1】
【請求項2】
式（１）で表される化合物が、下記式（２）で表される化合物である、請求項１に記載の化合物。
【化2】
【請求項3】
式（１）で表される化合物が、下記式（３）で表される化合物である、請求項１に記載の化合物。
【化3】
【請求項4】
請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の化合物を含む、細胞性小胞染色剤。
【請求項5】
さらに、他の蛍光化合物を含む、請求項４に記載の細胞性小胞染色剤。
【請求項6】
請求項１～請求項３に記載の化合物ならびに請求項４および請求項５に記載の細胞性小胞染色剤からいずれか一つを選択し、細胞性小胞を染色する染色工程と、試料中の染色された細胞性小胞を検出する検出工程と、
を含む、
細胞性小胞の蛍光染色方法。
【請求項7】
請求項１～請求項３に記載の化合物ならびに請求項４および請求項５に記載の細胞性小胞染色剤からいずれか一つを選択し、細胞性小胞を染色する染色工程（ただし、人の生体内の細胞性小胞を染色することを除く。）と、
試料中の染色された細胞性小胞を検出する検出工程と、
検出工程後に、試料を評価する評価工程と、
を含む、
細胞性小胞の蛍光染色方法。
【請求項8】
試料が化粧品を含み、細胞内に取り込まれた細胞性小胞を測定して化粧品を評価する、
請求項７に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
【請求項9】
試料が医薬品を含み、細胞内に取り込まれた細胞性小胞を測定して医薬品を評価する、
請求項７に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
【請求項10】
試料が細胞を含み、細胞内の細胞性小胞を測定して細胞の分化・品質を評価する、
請求項７に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
【請求項11】
試料が食品を含み、食品内の細胞性小胞を測定して食品を評価する、
請求項７に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
【請求項12】
試料が生体から採取された生体組織を含み、採取された生体組織中の細胞性小胞を測定して生体組織を評価する、
請求項７に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願における開示は、化合物、細胞性小胞染色剤および細胞性小胞の蛍光染色方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、細胞外分子を細胞内に取り込む機構であるエンドサイトーシスは、細胞の生理機能や疾患に関与することが知られ、多くの研究が行われている。エンドサイトーシスによる細胞表面の窪みはその後細胞内へ移行しエンドソームを形成する。そのため、エンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれた細胞外部の物質は、エンドソームに蓄積される。また、エンドソームは、細胞外から取り込まれた分子の、その後の行き先を決める重要な細胞内小器官として機能する。
【0003】
また、エンドサイトーシスにより形成されたエンドソームから、細胞外へ放出されるエクソソームが形成される。エクソソームの表面には細胞膜成分が含まれ、内部には細胞内の物質が含まれるため、放出された元の細胞の特徴を反映しており、細胞間の情報伝達に重要な役割を果たしている。さらに、エクソソームは、細胞外へ放出され、体液中に（血液、髄液、尿等）にも存在し、体中を循環している。そのため、エクソソームを疾患等の診断マーカーとして利用することが期待されている。また、エクソソームと同様にエンドソームを由来とする小胞としてメラノソームが知られている。メラノソームは、メラノサイトで生成、放出されてケラチノサイトに輸送され、ケラチノサイトに取り込まれる。このような機序から、ケラチノサイトにおけるメラノソームの蓄積を測定することで、医薬品や化粧品等の評価が行われる。
【0004】
そのため、エンドソーム由来の細胞内小胞や細胞外に放出される小胞の検出・分析は、細胞が外部の物質を取り込むしくみや放出するしくみを理解する上でも重要である。特許文献１には、複数の異常な細胞に由来するエクソソームを分析することが開示されている。また、特許文献２には、蛍光標識したケラチノサイトと非標識メラノサイトを共培養し、これに蛍光標識メラノソーム特異抗体を結合させた後フローサイトメーターを用いて解析する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２０２０－２０４６０４号公報
【文献】特開２００５－２４９３９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
特許文献１、特許文献２には、蛍光色素を用いた蛍光標識によって小胞の検出を行うことが開示されている。蛍光標識は、小胞を回収後に蛍光色素と混合するのみという簡便な方法であることからよく用いられている。しかしながら、蛍光標識後に未反応の蛍光色素を除く作業によりサンプルロスが生じることや蛍光色素同士の凝集でミセルを形成してしまうといった問題がある。そのため、小胞を特異的に染色する新たな染色剤に使用できる化合物が望まれている。
【0007】
そこで、本出願における開示は、細胞内および／または細胞外の小胞に特異的に結合する新たな化合物、細胞性小胞染色剤および細胞性小胞の蛍光染色方法を提供することを課題とする。本出願における開示のその他の任意付加的な効果は、発明を実施するための形態において明らかにされる。
【課題を解決するための手段】
【0008】
［１］下記式（１）で表される化合物。
（式（１）中、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1－Ｃ6のアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基またはカルボキシ基を表す。Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1－Ｃ18のアルキル基、Ｃ1－Ｃ18のアルコキシ基、ハロゲン元素、ＮＯ2またはＮ（ＣＨ3）2を表す。Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。ｌは１または２を表し、ｍは０または１を表し、ｎは１、２または３を表す。Ｚは蛍光基を表す。）
［２］式（１）で表される化合物が、下記式（２）で表される化合物である、
上記［１］に記載の化合物。
（式（２）中、Ｒ1は、ＨまたはＣＨ3を表す。Ｒ2は、Ｈ、ＣＨ3、ＯＣＨ3またはＮ（ＣＨ3）2を表す。Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。Ｒ5は、ＮＯ2、ＳＯ2ＮＨ2またはＳＯ2Ｎ（ＣＨ3）2を表す。ｌは１または２を表し、ｍは０または１を表し、ｎは１、２または３を表す。）
［３］式（１）で表される化合物が、下記式（３）で表される化合物である、
上記［１］に記載の化合物。
（式（３）中、Ｒ1は、ＨまたはＣＨ3を表す。Ｒ2は、Ｈ、ＣＨ3、ＯＣＨ3またはＮ（ＣＨ3）2を表す。Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。ｌは１または２を表し、ｍは０または１を表し、ｎは１、２または３を表す。）
［４］上記［１］～［３］のいずれか一つに記載の化合物を含む、
細胞性小胞染色剤。
［５］さらに、他の蛍光化合物を含む、
上記［４］に記載の細胞性小胞染色剤。
［６］上記［１］～［３］に記載の化合物ならびに上記［４］および［５］に記載の細胞性小胞染色剤からいずれか一つを選択し、細胞性小胞を染色する染色工程と、
試料中の染色された細胞性小胞を検出する検出工程と、
を含む、
細胞性小胞の蛍光染色方法。
［７］検出工程後に、試料を評価する評価工程を含む、
上記［６］に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
［８］試料が化粧品を含み、
細胞内に取り込まれた細胞性小胞を測定して化粧品を評価する、
上記［７］に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
［９］試料が医薬品を含み、
細胞内に取り込まれた細胞性小胞を測定して医薬品を評価する、
上記［７］に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
［１０］試料が細胞を含み、
細胞内の細胞性小胞を測定して細胞の分化・品質を評価する、
上記［７］に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
［１１］試料が食品を含み、
食品内の細胞性小胞を測定して食品を評価する、
上記［７］に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
［１２］試料が生体から採取された生体組織を含み、
採取された生体組織中の細胞性小胞を測定して生体組織を評価する、
上記［７］に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
【化1】
［２］式（１）で表される化合物が、下記式（２）で表される化合物である、
上記［１］に記載の化合物。
【化2】
［３］式（１）で表される化合物が、下記式（３）で表される化合物である、
上記［１］に記載の化合物。
【化3】
［４］上記［１］～［３］のいずれか一つに記載の化合物を含む、
細胞性小胞染色剤。
［５］さらに、他の蛍光化合物を含む、
上記［４］に記載の細胞性小胞染色剤。
［６］上記［１］～［３］に記載の化合物ならびに上記［４］および［５］に記載の細胞性小胞染色剤からいずれか一つを選択し、細胞性小胞を染色する染色工程と、
試料中の染色された細胞性小胞を検出する検出工程と、
を含む、
細胞性小胞の蛍光染色方法。
［７］検出工程後に、試料を評価する評価工程を含む、
上記［６］に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
［８］試料が化粧品を含み、
細胞内に取り込まれた細胞性小胞を測定して化粧品を評価する、
上記［７］に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
［９］試料が医薬品を含み、
細胞内に取り込まれた細胞性小胞を測定して医薬品を評価する、
上記［７］に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
［１０］試料が細胞を含み、
細胞内の細胞性小胞を測定して細胞の分化・品質を評価する、
上記［７］に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
［１１］試料が食品を含み、
食品内の細胞性小胞を測定して食品を評価する、
上記［７］に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
［１２］試料が生体から採取された生体組織を含み、
採取された生体組織中の細胞性小胞を測定して生体組織を評価する、
上記［７］に記載の細胞性小胞の蛍光染色方法。
【発明の効果】
【0009】
標識後に未反応の色素を除く作業が必要ないためサンプルロスを抑制できる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図2】実施例１４の結果を示す図面代用写真。図２ＡはＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤添加前の化合物１が発する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像を示す。図２ＢはＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤添加前の位相差顕微鏡像を示す。図２ＣはＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤添加後の化合物１が発する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像を示す。図２ＤはＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤添加後の位相差顕微鏡像を示す。図２ＥはＰＩＫｆｙｖｅ除去後細胞を３時間培養した後の化合物１が発する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像である。図２ＦはＰＩＫｆｙｖｅ除去後細胞を３時間培養した後の位相差顕微鏡像である。
【図4】実施例１７の結果を示す図面代用写真。図４Ａは化合物１が発する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像を示す。図４Ｂはミトコンドリア染色試薬が発する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像を示す。図４Ｃは核を染色するＤＡＰＩが発する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像を示す。図４Ｄは位相差顕微鏡像を示す。
【図5】化合物１が細胞性小胞に高い特異性を有すること示す例を示した図面代用写真。図５Ａは、実施例１８と比較例１の蛍光顕微鏡像を重ねたものである。図５Ｂは、実施例１８の蛍光顕微鏡像である。図５Ｃは、比較例１の蛍光顕微鏡像である。
【図6】化合物１が細胞性小胞に高い特異性を有すること示す別の例を示した図面代用写真。図６Ａは実施例１９の蛍光顕微鏡像を示す。図６Ｂは実施例１９の位相差顕微鏡像を示す。図６Ｃは比較例２の蛍光顕微鏡像を示す。図６Ｄは比較例２の位相差顕微鏡像を示す。
【図7】エクソソームの蛍光染色の結果を示す図面代用写真。
【図8】エクソソーム検出における検量線を示す図。
【図9】食品中のエクソソーム測定の結果を示す図。
【図10】ラベル化エクソソームの細胞内への取り込みを示す図面代用写真。図１０Ａは化合物１およびＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｍｅｍ Ｄｙｅ－Ｒｅｄの両方が発する蛍光を重ねた蛍光顕微鏡像を示す。図１０Ｂは化合物１が発する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像を示す。図１０ＣはＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｍｅｍ Ｄｙｅ－Ｒｅｄが発する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像を示す。
【図11】ラベル化メラノソームの細胞取り込み阻害の結果を示す図。図１１Ａは、実施例２９の蛍光顕微鏡像および比較例４の位相差顕微鏡像を示す。図１１Ｂは、実施例２９の結果を示す。図１１Ｃは、比較例４の結果を示す。
【図12】細胞性小胞を蛍光染色した結果を示す図面代用写真。図１２Ａは実施例３０の蛍光顕微鏡像を示す。図１２Ｂは実施例３０の位相差顕微鏡像を示す。図１２Ｃは実施例３１の蛍光顕微鏡像を示す。図１２Ｄは実施例３２の蛍光顕微鏡像を示す。図１２Ｅは実施例３３の蛍光顕微鏡像を示す。図１２Ｆは実施例３４の蛍光顕微鏡像を示す。図１２Ｇは実施例３５の蛍光顕微鏡像を示す。図１２Ｈは実施例３６の蛍光顕微鏡像を示す。図１２Ｉは実施例３７の蛍光顕微鏡像を示す。図１２Ｊは実施例３８の蛍光顕微鏡像を示す。図１２Ｋは実施例３９の蛍光顕微鏡像を示す。
【図13】化合物１～化合物７による生細胞と死細胞に対する蛍光強度測定の結果を示す図。
【図14】実施例４７の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【0011】
（化合物の実施形態）
以下に、実施形態に係る化合物について説明する。
以下に、実施形態に係る化合物について説明する。
【0012】
実施形態に係る化合物は、下記式（１）で表される化合物であることを特徴とする。式（１）で表される化合物は、細胞性小胞に特異的に結合し蛍光を発する。本明細書における「細胞性小胞」は、「細胞内小胞」、エクソソーム等の「細胞外小胞」を含む。
【0013】
【化4】
【0014】
式（１）中、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1－Ｃ6のアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基またはカルボキシ基を表す。Ｃ1－Ｃ6のアルキル基は、直鎖、分岐または環状であってもよい。Ｃ1－Ｃ6のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ－ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
【0015】
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1－Ｃ18のアルキル基、Ｃ1－Ｃ18のアルコキシ基、ハロゲン元素、ＮＯ2またはＮ（ＣＨ3）2を表す。Ｃ1－Ｃ18のアルキル基は、直鎖、分岐または環状であってもよい。Ｃ1－Ｃ18のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基、イソヘプチル基、ｓｅｃ－ヘプチル基、ｎ－オクチル基、イソオクチル基、ｓｅｃ－オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基、シクロウンデシル基、シクロドデシル基、シクロトリデシル基、シクロテトラデシル基、シクロペンタデシル基、シクロヘキサデシル基、シクロヘプタデシル基、シクロオクタデシル基等が挙げられる。Ｃ1－Ｃ18のアルコキシ基は、飽和または不飽和でもあってもよく、芳香環を有してもよい。また、Ｃ1－Ｃ18のアルコキシ基は、直鎖、分岐または環状であってもよい。Ｃ1－Ｃ18のアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、シクロプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、オクチルオキシ基、ノナオキシ基、デカンオキシ基、ウンデカンオキシ基、ドデカンオキシ基、トリデカンオキシ基、テトラデカンオキシ基、ペンタデカンオキシ基、ヘキサデカンオキシ基、ヘプタデカンオキシ基、オクタデカンオキシ基、ビニルオキシ基、アリルオキシ基、１－プロペニルオキシ基、イソプロペニルオキシ基、１－ブテニルオキシ基、２－ブテニルオキシ基、３－ブテニルオキシ基、１，３－ブタンジエニルオキシ基、１－ペンテニルオキシ基、２－ペンテニルオキシ基、３－ペンテニルオキシ基、４－ペンテニルオキシ基、ヘキシニルオキシ基、ヘキシジニルオキシ基、ヘプチニルオキシ基、ヘプチジニルオキシ基、オクチニルオキシ基、オクチジニルオキシ基、ノニニルオキシ基、ノニジニルオキシ基、デシニルオキシ基、デシジニルオキシ基、ウンデシニルオキシ基、ウンデシジニルオキシ基、ドデシルオキシ基、ドデシジニルオキシ基、トリデシニルオキシ基、トリデシジニルオキシ基、テトラデシニルオキシ基、テトラデシジニルオキシ基、ペンタデシニルオキシ基、ペンタデシジニルオキシ基、ヘキサデシニルオキシ基、ヘキサデシジニルオキシ基、ヘプタデシニルオキシ基、ヘプタデシジニルオキシ基、オクタデシニルオキシ基、オクタデシジニルオキシ基、フェノキシ基、ナフトキシ基、アンスリルオキシ基、メチルフェノキシ基、ジメチルフェノキシ基、トリメチルフェノキシ基、エチルフェノキシ基、ジエチルフェノキシ基、トリエチルフェノキシ基、プロピルフェノキシ基、ブチルフェノキシ基、メチルナフトキシ基、ジメチルナフトキシ基、トリメチルナフトキシ基、メチルアンスリルオキシ基、エチルアンスリルオキシ基、ベンジルオキシ基、フェネチルオキシ基、ナフチルメチルオキシ基、フルオレニルメチルオキシ基等が挙げられる。ハロゲン元素としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。
【0016】
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立に、ＨまたはＣＨ3を表し、Ｒ3、Ｒ4は同じであってもよく、異なってもよい。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。
【0017】
ｌは１または２を表し、ｍは０または１を表し、ｎは１、２または３を表す。
【0018】
Ｚは蛍光基を表す。式（１）で表される化合物の蛍光基は、蛍光を発するものであれば特に制限はない。蛍光基としては、例えば、ＮＢＤ（ニトロベンゾフラザン）、ＡＢＤ（スルファモイルベンソフラザン）、ＤＢＤ（ジメチルアミノスルホニルベンゾフラザン）、ジメチルアミノベンジリデンロダニン、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ－Ｘ、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ＡＰＣ－ＸＬ、ＡＴＴＯ ３９０、ＡＴＴＯ ４６５、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ４９０ＬＳ、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５４２、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ ６４７、ＡＴＴＯ ６５５、ＡＴＴＯ ６６５、ＡＴＴＯ ６８０、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７４０、Ｃ－ＰＣ（Ｃ－Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＤＹ－４０５、ＤＹ－４１５、ＤＹ－４７５ＸＬ、ＤＹ－４８０ＸＬ、ＤＹ－４８１ＸＬ、ＤＹ－４８５ＸＬ、ＤＹ－４９０、ＤＹ－４９５、ＤＹ－４９５－Ｘ５、ＤＹ－５００ＸＬ、ＤＹ－５０５－Ｘ５、ＤＹ－５１０ＸＬ、ＤＹ－５２０ＸＬ、ＤＹ－５２１ＸＬ、ＤＹ－５４７、ＤＹ－５４８、ＤＹ－５４９、ＤＹ－５５４、ＤＹ－５５５、ＤＹ－５５６、ＤＹ－５６０、ＤＹ－５９０、ＤＹ－６１０、ＤＹ－６１５、ＤＹ－６３０、ＤＹ－６３１、ＤＹ－６３２、ＤＹ－６３３、ＤＹ－６３４、ＤＹ－６３５、ＤＹ－６３６、ＤＹ－６４７、ＤＹ－６４８、ＤＹ－６４９、ＤＹ－６５０、ＤＹ－６５１、ＤＹ－６５２、ＤＹ－６７５、ＤＹ－６７６、ＤＹ－６７７、ＤＹ－６７８、ＤＹ－６８０、ＤＹ－６８１、ＤＹ－６８２、ＤＹ－７００、ＤＹ－７０１、ＤＹ－７３０、ＤＹ－７３１、ＤＹ－７３２、ＤＹ－７３４、ＤＹ－７４９、ＤＹ－７５０、ＤＹ－７５１、ＤＹ－７５２、ＤＹ－７７６、ＤＹ－７７７、ＤＹ－７８０、ＤＹ－７８１、ＤＹ－７８２、ＤｙＬｉｇｈｔ ４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ ５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ ６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４７、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ ７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ ８００、ＥＣＤ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｏｕｒ ４８８、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６８０、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ＴＲ、ＨｉＬｙｔｅ Ｐｌｕｓ ５５５、ＨｉＬｙｔｅ Ｐｌｕｓ ６４７、ＨｉＬｙｔｅ Ｐｌｕｓ ７５０、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ８００、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＭＦＰ４８８、ＭＦＰ５５５、ＭＦＰ５９０、ＭＦＰ６３１、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｇｈｔｓ ４９３、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｇｈｔｓ ５５７、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｇｈｔｓ ６３７、Ｏｙｓｔｅｒ ５００、Ｏｙｓｔｅｒ ５５０、Ｏｙｓｔｅｒ ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ ６４５、Ｏｙｓｔｅｒ ６５０、Ｏｙｓｔｅｒ ６５６、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、Ｂ－ＰＥ、Ｒ－ＰＥ、ＰｅｒＣＰ、Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＰＲＥＸ７１０、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｒｅｄ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＲＯＸ （Ｘ－Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ Ｘ）、Ｒｏｙａｌ Ｂｌｕｅ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｒａｎｇｅ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｔｒｉ－Ｃｏｌｏｒ、ＴＲＩＴＣ等が挙げられる。また、蛍光基Ｚは、式（１）で表される化合物が細胞性小胞を染色した際に蛍光を発することができれば、どのように結合してもよい。
【0019】
式（１）で表される化合物のより具体的な例として、下記式（２）で表される化合物および下記式（３）で表される化合物が挙げられる。
【0020】
【化5】
【0021】
式（２）中、Ｒ1は、ＨまたはＣＨ3を表す。Ｒ2は、Ｈ、ＣＨ3、ＯＣＨ3またはＮ（ＣＨ3）2を表す。Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。Ｒ5は、ＮＯ2、ＳＯ2ＮＨ2またはＳＯ2Ｎ（ＣＨ3）2を表す。ｌは１または２を表し、ｍは０または１を表し、ｎは１、２または３を表す。
【0022】
【化6】
【0023】
式（３）中、Ｒ1は、ＨまたはＣＨ3を表す。Ｒ2は、Ｈ、ＣＨ3、ＯＣＨ3またはＮ（ＣＨ3）2を表す。Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立にＨまたはＣＨ3を表す。但し、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して環を形成してもよく、その場合は、Ｒ3およびＲ4はＣＨ2である。ｌは１または２を表し、ｍは０または１を表し、ｎは１、２または３を表す。
【0024】
式（２）で表される化合物および式（３）で表される化合物の具体例を以下に示すが、これら例示された化合物に制限されるものではない。
【0025】
【化7】
【0026】
式（１）で表される化合物は、エンドソーム由来の細胞性小胞に結合する。そのため、実施形態に係る化合物は、細胞内のエンドソームやメラノソーム、細胞外に放出されたエクソソーム等を蛍光染色できる。また、細胞内小胞を染色する場合、実施形態に係る化合物は、生細胞の細胞内小胞を特異的に蛍光染色できる。さらに、実施形態に係る化合物は細胞性小胞に結合して蛍光を発し、細胞性小胞に結合していない化合物は蛍光を発さない。したがって、細胞性小胞に未結合の化合物を取り除く作業の必要がなく、サンプルロスを抑制できる。
【0027】
（細胞性小胞染色剤の実施形態）
上記の実施形態に係る化合物は、溶媒に溶解して細胞性小胞染色剤として用いることもできる。溶媒は式（１）で表される化合物を溶解できるのであれば、特に制限はない。溶媒としては、例えば、アセトン、ＤＭＳＯ、エタノール、およびこれらの水溶液等が挙げられる。
上記の実施形態に係る化合物は、溶媒に溶解して細胞性小胞染色剤として用いることもできる。溶媒は式（１）で表される化合物を溶解できるのであれば、特に制限はない。溶媒としては、例えば、アセトン、ＤＭＳＯ、エタノール、およびこれらの水溶液等が挙げられる。
【0028】
実施形態に係る細胞性小胞染色剤は、式（１）で表される化合物の他に、例えば、ミトコンドリア、細胞膜等の細胞性小胞と異なる要素を蛍光染色する他の蛍光化合物を任意付加的に含んでもよい。式（１）で表される化合物と蛍光化合物を用いることで、複数の要素を同時に染色できる。また、式（１）で表される化合物と蛍光化合物の相互作用により、式（１）で表される化合物を増感させることや、式（１）で表される化合物の細胞性小胞への特異性を向上させることができる。
【0029】
（細胞性小胞の蛍光染色方法の実施形態）
実施形態に係る細胞性小胞の染色方法は、式（１）で表される化合物または細胞性小胞染色剤を用い細胞性小胞を染色する染色工程と、試料中の染色された細胞性小胞を検出する検出工程と、を少なくとも含み、任意付加的に、検出工程後に試料を評価する評価工程を含む。
実施形態に係る細胞性小胞の染色方法は、式（１）で表される化合物または細胞性小胞染色剤を用い細胞性小胞を染色する染色工程と、試料中の染色された細胞性小胞を検出する検出工程と、を少なくとも含み、任意付加的に、検出工程後に試料を評価する評価工程を含む。
【0030】
染色工程は、式（１）で表される化合物によって細胞性小胞を蛍光染色する。例えば、細胞内小胞の染色を行う場合、細胞が培養されているところへ式（１）で表される化合物を添加すればよい。また、培養された細胞を回収し、回収した細胞へ式（１）で表される化合物を添加してディッシュ等へ捲いてもよい。エクソソーム等の細胞外小胞の染色を行う場合には、細胞外小胞を含む溶液に式（１）で表される化合物を添加すればよい。
【0031】
染色工程において、添加する式（１）で表される化合物の量としては、添加した後の最終濃度が０．０１μＭ～１０μＭの範囲でよく、０．１μＭ～１μＭの範囲が好ましい。
【0032】
検出工程は、式（１）で表される化合物の蛍光基に応じた励起光を照射して、試料中の細胞性小胞に結合した式（１）で表される化合物から発せられる蛍光を検出する。励起光の照射には、一般的な蛍光検出と同様の照射手段を用いればよく、例えば、蛍光顕微鏡が備えるレーザ光源から、必要に応じて所定の波長を選択すればよい。蛍光の検出は、蛍光顕微鏡の鏡筒から行ってもよいし、蛍光顕微鏡に設置されたカメラ等が撮影した画像をモニタ等の表示手段に表示してもよい。式（１）で表される化合物の蛍光基によるが、蛍光顕微鏡の鏡筒から目視によっては十分に蛍光を観察することができない場合があっても、カメラ等による画像の撮影を通じて蛍光を観察することが可能な場合もある。必要に応じて所定の波長を選択的に通過させるフィルタを用いてもよい。
【0033】
また、細胞性小胞の蛍光染色方法は、任意付加的に試料を評価する評価工程を含む。評価工程は、式（１）で表される化合物によって検出された細胞性小胞により試料を評価する。何を評価するかは試料によって異なるが、例えば、化粧品、医薬品、食品等の評価を行うことができる。さらに、細胞内小胞を検出して細胞の分化度合いの評価や体液中のエクソソームを検出し、疾患等を評価することもできる。
【0034】
例えば、化粧品や医薬品を評価する場合、あらかじめ式（１）で表される化合物によって細胞性小胞をラベル化しておき、化粧品や医薬品の存在によって、ラベル化された細胞性小胞の細胞へ取り込みを検出・観察することで、化粧品や医薬品を評価できる。例えば、メラニンを溜め込む小胞であるメラノソームのケラチノサイトへの取り込みから色素沈着や、それに伴う皮膚疾患が評価できる。また、食品中に含まれる細胞性小胞を測定することで、食品の評価もできる。例えば、腸の機能に影響を与える小胞内のｍｉＲＮＡの取り込み効率で、食品機能を予測できる。
【0035】
さらに、細胞における細胞性小胞の分布をみることで細胞の分化度合いを評価することもできる。例えば、メラノソーム含量が多いメラノサイトとメラノソーム含量が少ないメラノサイトは、その分化度合いが異なる。そのため、メラノサイトにおいてメラノソームを検出することで細胞の分化度合いや品質の評価をすることもできる。
【0036】
また、エクソソームは、放出された元の細胞の特徴を反映している。そして、細胞外に放出されるエクソソーム等の細胞性小胞は、生体組織中に含まれる。そのため、生体組織中のエクソソームは、疾患等の診断マーカーとして用いることもできる。したがって、生体から生体組織を採取し、採取された生体組織の細胞性小胞を式（１）で表された化合物を用いて測定することで、疾患等を評価できる。よって、式（１）で表された化合物は、臨床検査機器および試薬の開発へも応用でき、細胞性小胞を測定するキットにも用いることができる。なお、本明細書における「生体組織」は、生体内の体液、細胞、組織を含む。
【0037】
実施形態に係る化合物、細胞性小胞染色剤および細胞性小胞の蛍光染色方法は、以下の効果を奏する。
（１）式（１）で表される化合物は細胞性小胞に特異的に結合する。そして、細胞性小胞に結合しない式（１）で表される化合物は蛍光を発さない。したがって、細胞性小胞を特異的に蛍光染色させたうえで、未結合の式（１）で表される化合物を取り除く作業が必要ないため、サンプルロスを抑制できる。
（２）未結合の式（１）で表される化合物を取り除く作業が必要なく、式（１）で表される化合物を加えるのみで、簡便に細胞性小胞を蛍光染色できる。
（３）細胞性小胞染色剤が、式（１）で表される化合物の他に蛍光化合物を含んだ場合、複数の要素を同時に染色できる。また、式（１）で表される化合物と蛍光化合物の相互作用により、式（１）で表される化合物を増感させることや、式（１）で表される化合物の細胞性小胞への特異性を向上させることができる。
（４）式（１）で表される化合物を用いて細胞性小胞を検出することで、化粧品、医薬品、食品、細胞の分化度合い、疾患等の評価ができる。
（１）式（１）で表される化合物は細胞性小胞に特異的に結合する。そして、細胞性小胞に結合しない式（１）で表される化合物は蛍光を発さない。したがって、細胞性小胞を特異的に蛍光染色させたうえで、未結合の式（１）で表される化合物を取り除く作業が必要ないため、サンプルロスを抑制できる。
（２）未結合の式（１）で表される化合物を取り除く作業が必要なく、式（１）で表される化合物を加えるのみで、簡便に細胞性小胞を蛍光染色できる。
（３）細胞性小胞染色剤が、式（１）で表される化合物の他に蛍光化合物を含んだ場合、複数の要素を同時に染色できる。また、式（１）で表される化合物と蛍光化合物の相互作用により、式（１）で表される化合物を増感させることや、式（１）で表される化合物の細胞性小胞への特異性を向上させることができる。
（４）式（１）で表される化合物を用いて細胞性小胞を検出することで、化粧品、医薬品、食品、細胞の分化度合い、疾患等の評価ができる。
【0038】
以下に実施例を掲げ、本出願で開示する実施形態を具体的に説明するが、この実施例は単に実施形態の説明のためのものである。本出願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【0039】
［化合物１の合成］
＜実施例１＞
以下に記載する手順で、化合物１を合成した。
＜実施例１＞
以下に記載する手順で、化合物１を合成した。
【0040】
【化8】
【0041】
5-(2-bromoethoxy)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one
５－ヒドロキシ－１－インダノン（７４５ｍｇ，５．０３ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１５ｍＬ）に溶解させたのち、酢酸エチル（１５ｍＬ）に懸濁させた炭酸カリウム（２．４５ｇ，１７．７ｍｍｏｌ）、１，２－ジブロモエタン（３．２７ｍＬ，３８．０ｍｍｏｌ）、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（ＢＴＥＡＣ）（１２１ｍｇ，５３１μｍｏｌ）を順次加え、２４時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に氷水に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて精製し、白色固体の5-(2-bromoethoxy)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（１．０６ｇ，４．１６ｍｍｏｌ，８３％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.67 (m, 2H, COCH2), 3.08 (br t, J = 6 Hz, 2H, ArCH2), 3.66 (t, J = 6.4 Hz, 2H, BrCH2), 4.35 (t, J = 6.4 Hz, 2H, OCH2), 6.89-6.93 (br m, 2H, ArH), 7.69 (d, J = 9.2 Hz, 1H, ArH)
５－ヒドロキシ－１－インダノン（７４５ｍｇ，５．０３ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１５ｍＬ）に溶解させたのち、酢酸エチル（１５ｍＬ）に懸濁させた炭酸カリウム（２．４５ｇ，１７．７ｍｍｏｌ）、１，２－ジブロモエタン（３．２７ｍＬ，３８．０ｍｍｏｌ）、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（ＢＴＥＡＣ）（１２１ｍｇ，５３１μｍｏｌ）を順次加え、２４時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に氷水に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて精製し、白色固体の5-(2-bromoethoxy)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（１．０６ｇ，４．１６ｍｍｏｌ，８３％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.67 (m, 2H, COCH2), 3.08 (br t, J = 6 Hz, 2H, ArCH2), 3.66 (t, J = 6.4 Hz, 2H, BrCH2), 4.35 (t, J = 6.4 Hz, 2H, OCH2), 6.89-6.93 (br m, 2H, ArH), 7.69 (d, J = 9.2 Hz, 1H, ArH)
【0042】
5-(2-azidoethoxy)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one
5-(2-Bromoethoxy)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（４１０ｍｇ，１．６１ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）に溶解させ、アジ化ナトリウム（１２９ｍｇ，１．９８ｍｍｏｌ）を加えて３５分間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に水に注ぎ込み、ジエチルエーテルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、赤褐色固体の5-(2-azidoethoxy)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（３４６ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ，９９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.66-2.7 (m, 2H, COCH2), 3.09 (br t, J = 6 Hz, 2H, ArCH2), 3.63 (t, J = 5 Hz, 2H, N3CH2), 4.21 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 6.90-6.94 (br m, 2H, ArH), 7.70 (d, J = 9.2 Hz, 1H, ArH)
5-(2-Bromoethoxy)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（４１０ｍｇ，１．６１ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）に溶解させ、アジ化ナトリウム（１２９ｍｇ，１．９８ｍｍｏｌ）を加えて３５分間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に水に注ぎ込み、ジエチルエーテルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、赤褐色固体の5-(2-azidoethoxy)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（３４６ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ，９９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.66-2.7 (m, 2H, COCH2), 3.09 (br t, J = 6 Hz, 2H, ArCH2), 3.63 (t, J = 5 Hz, 2H, N3CH2), 4.21 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 6.90-6.94 (br m, 2H, ArH), 7.70 (d, J = 9.2 Hz, 1H, ArH)
【0043】
【化9】
【0044】
3-[4-(dimethylamino)phenyl]acrylonitrile
アルゴン雰囲気下、水酸化カリウム（８９０ｍｇ）をアセトニトリル（５．０ｍＬ）に溶解させ、１０分間加熱還流させた。続いて、アセトニトリル（１０．０ｍＬ）に溶解させたｐ－ジメチルアミノベンズアルデヒド（２．０３ｇ，１３．６ｍｍｏｌ）を加え、３時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に水を加え、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をジクロロメタンで抽出し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を乾固しない程度まで減圧濃縮したのち、酢酸エチルを加えて同様に減圧濃縮を２回行い、3-[4-(dimethylamino)phenyl]acrylonitrile（２．４０ｇ）を得た。この化合物は精製せず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、水酸化カリウム（８９０ｍｇ）をアセトニトリル（５．０ｍＬ）に溶解させ、１０分間加熱還流させた。続いて、アセトニトリル（１０．０ｍＬ）に溶解させたｐ－ジメチルアミノベンズアルデヒド（２．０３ｇ，１３．６ｍｍｏｌ）を加え、３時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に水を加え、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をジクロロメタンで抽出し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を乾固しない程度まで減圧濃縮したのち、酢酸エチルを加えて同様に減圧濃縮を２回行い、3-[4-(dimethylamino)phenyl]acrylonitrile（２．４０ｇ）を得た。この化合物は精製せず、そのまま次の反応に用いた。
【0045】
3-[4-(dimethylamino)phenyl]propanenitrile
3-[4-(dimethylamino)phenyl]acrylonitrile（２．４０ｇ）を酢酸エチル（４０．０ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％，２４０ｍｇ）を加え、バルーン圧の水素雰囲気下、室温で５時間３０分反応させた。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）にて精製し、淡黄色結晶の3-[4-(dimethylamino)phenyl]propanenitrile（１．４０ｇ，８．０３ｍｍｏｌ，２段階収率５９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.55 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH2CN), 2.86 (t, J = 7.4 Hz, 2H, ArCH2), 2.92 (s, 6H, N(CH3)2), 6.69 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.09 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH)
3-[4-(dimethylamino)phenyl]acrylonitrile（２．４０ｇ）を酢酸エチル（４０．０ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％，２４０ｍｇ）を加え、バルーン圧の水素雰囲気下、室温で５時間３０分反応させた。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）にて精製し、淡黄色結晶の3-[4-(dimethylamino)phenyl]propanenitrile（１．４０ｇ，８．０３ｍｍｏｌ，２段階収率５９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.55 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH2CN), 2.86 (t, J = 7.4 Hz, 2H, ArCH2), 2.92 (s, 6H, N(CH3)2), 6.69 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.09 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH)
【0046】
4-(3-aminopropyl)-N,N-dimethylaniline
アルゴン雰囲気下、3-[4-(dimethylamino)phenyl]propanenitrile（６０１ｍｇ，３．４５ｍｍｏｌ）をジエチルエーテル（３．５ｍＬ）に溶解させ、氷水浴下、水素化アルミニウムリチウム（３９１ｍｇ，１０．３ｍｍｏｌ）を加え、３時間反応させた。反応混合物にジエチルエーテルを加え、撹拌しながら、水（３９１μＬ）、１５％水酸化ナトリウム水溶液（３９１μＬ）、水（１．１７ｍＬ）をこの順に加えた。反応混合物をセライトろ過した後、ろ液を減圧濃縮し、黄色油状の4-(3-aminopropyl)-N,N-dimethylaniline（５０７ｍｇ）を得た。
アルゴン雰囲気下、3-[4-(dimethylamino)phenyl]propanenitrile（６０１ｍｇ，３．４５ｍｍｏｌ）をジエチルエーテル（３．５ｍＬ）に溶解させ、氷水浴下、水素化アルミニウムリチウム（３９１ｍｇ，１０．３ｍｍｏｌ）を加え、３時間反応させた。反応混合物にジエチルエーテルを加え、撹拌しながら、水（３９１μＬ）、１５％水酸化ナトリウム水溶液（３９１μＬ）、水（１．１７ｍＬ）をこの順に加えた。反応混合物をセライトろ過した後、ろ液を減圧濃縮し、黄色油状の4-(3-aminopropyl)-N,N-dimethylaniline（５０７ｍｇ）を得た。
【0047】
【化10】
【0048】
5-(2-azidoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine
4-(3-aminopropyl)-N,N-dimethylaniline（６７．６ｍｇ，３７９μｍｏｌ）をメタノール（６００μＬ）に溶解させ、5-(2-azidoethoxy)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（４１．２ｍｇ，１９０μｍｏｌ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（２１．２ｍｇ，３３７μｍｏｌ）、酢酸（３０μＬ）をこの順番に加え、１５時間１０分加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、淡黄色油状の5-(2-azidoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（３６．３ｍｇ，９５．６μｍｏｌ，５０％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.75-1.86 (complex, 3H, ArCH2CH 2), 2.35 (m, 1H, ArCH2CH 2), 2.57 (dt, J = 3.2 and 8.0 Hz, 2H, ArCH2), 2.71 (t, J = 7.1, 2H, ArCH2), 2.7-2.8 (m, 1H), 2.90 (s, 6H, N(CH3)2), 2.90-2.99 (m, 1H), 3.56 (t, J = 5 Hz, 2H, N3CH2), 4.12 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.15 (t, J = 6.4 Hz, 1H, ArCHNH), 6.68 (d, J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 6.74 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH), 6.77 (s, 1H, ArH), 7.05 (d, J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 7.20 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH)
4-(3-aminopropyl)-N,N-dimethylaniline（６７．６ｍｇ，３７９μｍｏｌ）をメタノール（６００μＬ）に溶解させ、5-(2-azidoethoxy)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（４１．２ｍｇ，１９０μｍｏｌ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（２１．２ｍｇ，３３７μｍｏｌ）、酢酸（３０μＬ）をこの順番に加え、１５時間１０分加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、淡黄色油状の5-(2-azidoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（３６．３ｍｇ，９５．６μｍｏｌ，５０％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.75-1.86 (complex, 3H, ArCH2CH 2), 2.35 (m, 1H, ArCH2CH 2), 2.57 (dt, J = 3.2 and 8.0 Hz, 2H, ArCH2), 2.71 (t, J = 7.1, 2H, ArCH2), 2.7-2.8 (m, 1H), 2.90 (s, 6H, N(CH3)2), 2.90-2.99 (m, 1H), 3.56 (t, J = 5 Hz, 2H, N3CH2), 4.12 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.15 (t, J = 6.4 Hz, 1H, ArCHNH), 6.68 (d, J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 6.74 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH), 6.77 (s, 1H, ArH), 7.05 (d, J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 7.20 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH)
【0049】
5-(2-azidoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine
5-(2-azidoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（１０．１ｍｇ，２６．６μｍｏｌ）をメタノール（１５０μＬ）に溶解させ、パラホルムアルデヒド（４．９ｍｇ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１９．６ｍｇ，３１２μｍｏｌ）をこの順番に加え、室温で１８時間反応させた。反応液に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、淡黄色油状の5-(2-azidoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（５．４ｍｇ，１４μｍｏｌ，５３％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.72-1.84 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 1.98-2.05 (m, 2H, ArCH2CH 2), 2.15 (s, 3H, NCH3), 2.38-2.45 (m, 1H), 2.44-2.62 (complex, 2H), 2.7-2.8 (m, 1H), 2.89 (br, 8H), 3.57 (t, J = 5.0 Hz, 2H, N3CH2), 4.13 (t, J = 5.0 Hz, 2H, OCH2), 4.35 (t, J = 7.4 Hz, 1H, ArCHN), 6.68 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.75 (s, 1H, ArH), 6.75-6.78 (1H, ArH), 7.05 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.25-7.26 (1H, ArH)
5-(2-azidoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（１０．１ｍｇ，２６．６μｍｏｌ）をメタノール（１５０μＬ）に溶解させ、パラホルムアルデヒド（４．９ｍｇ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１９．６ｍｇ，３１２μｍｏｌ）をこの順番に加え、室温で１８時間反応させた。反応液に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、淡黄色油状の5-(2-azidoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（５．４ｍｇ，１４μｍｏｌ，５３％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.72-1.84 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 1.98-2.05 (m, 2H, ArCH2CH 2), 2.15 (s, 3H, NCH3), 2.38-2.45 (m, 1H), 2.44-2.62 (complex, 2H), 2.7-2.8 (m, 1H), 2.89 (br, 8H), 3.57 (t, J = 5.0 Hz, 2H, N3CH2), 4.13 (t, J = 5.0 Hz, 2H, OCH2), 4.35 (t, J = 7.4 Hz, 1H, ArCHN), 6.68 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.75 (s, 1H, ArH), 6.75-6.78 (1H, ArH), 7.05 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.25-7.26 (1H, ArH)
【0050】
5-(2-aminoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine
5-(2-azidoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２２．４ｍｇ，５７μｍｏｌ）をメタノール（５００μＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％，４．２ｍｇ）を加え、バルーン圧の水素雰囲気下、室温で６時間２０分反応させた。反応混合物をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮して黄色油状の5-(2-aminoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（１７．２ｍｇ）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.7-1.85 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 1.97-2.06 (m, 2H, ArCH2CH 2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.37-2.62 (complex, 4H), 2.7-2.9 (complex, 2H), 2.89 (s, 6H), 3.06 (t, J = 5.0 Hz, 2H, H2NCH2), 3.96 (t, J = 5.0 Hz, 2H, OCH2), 4.31-4.4 (br, 1H, ArCHN), 6.68 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.74 (s, 1H, ArH), 6.74-6.77 (1H, ArH), 7.05 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.25-7.26 (1H, ArH)
5-(2-azidoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２２．４ｍｇ，５７μｍｏｌ）をメタノール（５００μＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％，４．２ｍｇ）を加え、バルーン圧の水素雰囲気下、室温で６時間２０分反応させた。反応混合物をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮して黄色油状の5-(2-aminoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（１７．２ｍｇ）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.7-1.85 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 1.97-2.06 (m, 2H, ArCH2CH 2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.37-2.62 (complex, 4H), 2.7-2.9 (complex, 2H), 2.89 (s, 6H), 3.06 (t, J = 5.0 Hz, 2H, H2NCH2), 3.96 (t, J = 5.0 Hz, 2H, OCH2), 4.31-4.4 (br, 1H, ArCHN), 6.68 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.74 (s, 1H, ArH), 6.74-6.77 (1H, ArH), 7.05 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.25-7.26 (1H, ArH)
【0051】
【化11】
【0052】
化合物１
5-(2-aminoethoxy)-N-(3-(4-(dimethylamino)phenyl)propyl)-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（１７．２ｍｇ，４６．８μｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（５００μＬ）に溶解させたＮＢＤ－Ｆ（９．０ｍｇ，４９μｍｏｌ）を加え、室温で５時間３０分反応させた。反応溶液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、赤褐色油状の化合物１（１９．７ｍｇ，３７μｍｏｌ，７９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ: 1.72-1.83 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 1.98-2.07 (m, 2H, ArCH2CH 2), 2.15 (s, 3H, NCH3), 2.38-2.62 (complex, 3H, NCH2 and ArCH2), 2.71-2.94 (complex, 3H, ArCH2), 2.89 (s, 6H, N(CH3)2), 3.86-3.92 (m, 2H, HNCH 2), 4.30 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.36 (t, J = 6.7 Hz, 1H, ArCHN), 6.28 (d, J = 8.5 Hz, 1H, ArH), 6.52 (br, 1H, ArH), 6.67 (d, J = 8.5 Hz, 2H, ArH), 6.76 (s, 1H, ArH), 6.75-6.78 (1H, ArH), 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 2H, ArH), 8.51 (d, J = 8.5 Hz, 1H, ArH)
5-(2-aminoethoxy)-N-(3-(4-(dimethylamino)phenyl)propyl)-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（１７．２ｍｇ，４６．８μｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（５００μＬ）に溶解させたＮＢＤ－Ｆ（９．０ｍｇ，４９μｍｏｌ）を加え、室温で５時間３０分反応させた。反応溶液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、赤褐色油状の化合物１（１９．７ｍｇ，３７μｍｏｌ，７９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ: 1.72-1.83 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 1.98-2.07 (m, 2H, ArCH2CH 2), 2.15 (s, 3H, NCH3), 2.38-2.62 (complex, 3H, NCH2 and ArCH2), 2.71-2.94 (complex, 3H, ArCH2), 2.89 (s, 6H, N(CH3)2), 3.86-3.92 (m, 2H, HNCH 2), 4.30 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.36 (t, J = 6.7 Hz, 1H, ArCHN), 6.28 (d, J = 8.5 Hz, 1H, ArH), 6.52 (br, 1H, ArH), 6.67 (d, J = 8.5 Hz, 2H, ArH), 6.76 (s, 1H, ArH), 6.75-6.78 (1H, ArH), 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 2H, ArH), 8.51 (d, J = 8.5 Hz, 1H, ArH)
【0053】
［化合物２の合成］
＜実施例２＞
以下に記載する手順で、化合物２を合成した。
＜実施例２＞
以下に記載する手順で、化合物２を合成した。
【0054】
【化12】
【0055】
5-(2-azidoethoxy)-N-(3-phenylpropyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine
３－フェニルプロピルアミン（３９８ｍｇ，２．９４ｍｍｏｌ）をメタノール（６．０ｍＬ）に溶解させ、5-(2-azidoethoxy)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（３２０ｍｇ，１．４７ｍｍｏｌ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１１１ｍｇ，１．７７ｍｍｏｌ）、酢酸（４００μＬ）をこの順番に加え、１８時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、淡黄色油状の5-(2-azidoethoxy)-N-(3-phenylpropyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（１４１ｍｇ，４１９μｍｏｌ，２９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.76-1.88 (complex, 3H, ArCH2CH 2), 2.31-2.43 (m, 1H, ArCH2CH 2), 2.6-2.8 (complex, 4H), 2.91-3.0 (complex, 2H), 3.56 (t, J = 5 Hz, 2H, N3CH2), 4.12 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.15 (t, J = 6 Hz, 1H, ArCHN), 6.74 (dd, J = 8.2 and 2 Hz, 2H, ArH), 7.15-7.22 (complex, 4H, ArH), 7.26 (t, J = 8.4 Hz, 2H, ArH)
３－フェニルプロピルアミン（３９８ｍｇ，２．９４ｍｍｏｌ）をメタノール（６．０ｍＬ）に溶解させ、5-(2-azidoethoxy)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（３２０ｍｇ，１．４７ｍｍｏｌ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１１１ｍｇ，１．７７ｍｍｏｌ）、酢酸（４００μＬ）をこの順番に加え、１８時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、淡黄色油状の5-(2-azidoethoxy)-N-(3-phenylpropyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（１４１ｍｇ，４１９μｍｏｌ，２９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.76-1.88 (complex, 3H, ArCH2CH 2), 2.31-2.43 (m, 1H, ArCH2CH 2), 2.6-2.8 (complex, 4H), 2.91-3.0 (complex, 2H), 3.56 (t, J = 5 Hz, 2H, N3CH2), 4.12 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.15 (t, J = 6 Hz, 1H, ArCHN), 6.74 (dd, J = 8.2 and 2 Hz, 2H, ArH), 7.15-7.22 (complex, 4H, ArH), 7.26 (t, J = 8.4 Hz, 2H, ArH)
【0056】
5-(2-azidoethoxy)-N-methyl-N-(3-phenylpropyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine
5-(2-azidoethoxy)-N-(3-phenylpropyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（７９．０ｍｇ，２３５μｍｏｌ）をメタノール（１．０ｍＬ）に溶解させ、パラホルムアルデヒド（５４．７ｍｇ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（２０．８ｍｇ，３３１μｍｏｌ）をこの順番に加え、室温で１８時間反応させた。反応液に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、淡黄色油状の5-(2-azidoethoxy)-N-methyl-N-(3-phenylpropyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（５１ｍｇ，１４６μｍｏｌ，６２％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.76-1.86 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 1.98-2.05 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.35-2.48 (complex, 2H, NCH2), 2.545-2.91 (complex, 4H, ArCH2), 3.57 (t, J = 5 Hz, 2H, N3CH2), 4.13 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.35 (t, J = 7 Hz, 1H, ArCHN), 6.74-6.78 (br, 2H, ArH), 7.13-7.19 (complex, 3H, ArH), 7.21-7.28 (complex, 3H, ArH)
5-(2-azidoethoxy)-N-(3-phenylpropyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（７９．０ｍｇ，２３５μｍｏｌ）をメタノール（１．０ｍＬ）に溶解させ、パラホルムアルデヒド（５４．７ｍｇ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（２０．８ｍｇ，３３１μｍｏｌ）をこの順番に加え、室温で１８時間反応させた。反応液に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、淡黄色油状の5-(2-azidoethoxy)-N-methyl-N-(3-phenylpropyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（５１ｍｇ，１４６μｍｏｌ，６２％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.76-1.86 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 1.98-2.05 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.35-2.48 (complex, 2H, NCH2), 2.545-2.91 (complex, 4H, ArCH2), 3.57 (t, J = 5 Hz, 2H, N3CH2), 4.13 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.35 (t, J = 7 Hz, 1H, ArCHN), 6.74-6.78 (br, 2H, ArH), 7.13-7.19 (complex, 3H, ArH), 7.21-7.28 (complex, 3H, ArH)
【0057】
5-(2-aminoethoxy)-N-methyl-N-(3-phenylpropyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine
5-(2-azidoethoxy)-N-methyl-N-(3-phenylpropyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２７．４ｍｇ，７８μｍｏｌ）をメタノール（１．０ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％，２．８ｍｇ）を加え、バルーン圧の水素雰囲気下、室温で７時間３０分反応させた。反応混合物をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮して黄色油状の5-(2-aminoethoxy)-N-methyl-N-(3-phenylpropyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２５．３ｍｇ）を得た。
5-(2-azidoethoxy)-N-methyl-N-(3-phenylpropyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２７．４ｍｇ，７８μｍｏｌ）をメタノール（１．０ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％，２．８ｍｇ）を加え、バルーン圧の水素雰囲気下、室温で７時間３０分反応させた。反応混合物をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮して黄色油状の5-(2-aminoethoxy)-N-methyl-N-(3-phenylpropyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２５．３ｍｇ）を得た。
【0058】
化合物２
5-(2-aminoethoxy)-N-methyl-N-(3-phenylpropyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２５．３ｍｇ，７８μｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（５００μＬ）に溶解させたＮＢＤ－Ｆ（１４．５ｍｇ，７９μｍｏｌ）を加え、室温で１５時間反応させた。反応溶液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、化合物２（２４．３ｍｇ，５０μｍｏｌ，６４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.77-1.86 complex, 2H, ArCH2CH 2), 1.98-2.07 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.43 (br t, J = 7 Hz, 2H, NCH2), 2.54-2.92 (complex, 4H, ArCH2), 3.89 (br, 2H, HNCH2), 4.30 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.36 (t, 1H, J = 7 Hz, ArCHN), 6.28 (d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.75-6.78 (br, 2H, ArH), 7.13-7.18 (complex, 4H, ArH), 7.23-7.28 (complex, 1H, ArH), 8.51 (d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH)
5-(2-aminoethoxy)-N-methyl-N-(3-phenylpropyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２５．３ｍｇ，７８μｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（５００μＬ）に溶解させたＮＢＤ－Ｆ（１４．５ｍｇ，７９μｍｏｌ）を加え、室温で１５時間反応させた。反応溶液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、化合物２（２４．３ｍｇ，５０μｍｏｌ，６４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.77-1.86 complex, 2H, ArCH2CH 2), 1.98-2.07 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.43 (br t, J = 7 Hz, 2H, NCH2), 2.54-2.92 (complex, 4H, ArCH2), 3.89 (br, 2H, HNCH2), 4.30 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.36 (t, 1H, J = 7 Hz, ArCHN), 6.28 (d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.75-6.78 (br, 2H, ArH), 7.13-7.18 (complex, 4H, ArH), 7.23-7.28 (complex, 1H, ArH), 8.51 (d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH)
【0059】
［化合物３の合成］
＜実施例３＞
以下に記載する手順で、化合物３を合成した。
＜実施例３＞
以下に記載する手順で、化合物３を合成した。
【0060】
【化13】
【0061】
化合物３
5-(2-aminoethoxy)-N-(3-(4-(dimethylamino)phenyl)propyl)-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２５．０ｍｇ，６８μｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（５００μＬ）に溶解させたＡＢＤ－Ｆ（１５．５ｍｇ，７１μｍｏｌ）を加え、室温で４時間１０分反応させた。反応溶液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、赤褐色油状の化合物３（３２．６ｍｇ，５８μｍｏｌ，８５％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.75-1.84 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 2.0-2.08 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.41-2.6 (complex, 3H, NCH2 and ArCH2), 2.71-2.92 (complex, 3H, ArCH2), 2.89 (s, 6H, N(CH3)2), 3.81 (t, J = 5 Hz, 2H, HNCH 2), 4.27 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.34-4.41 (br, 1H, ArCHN), 6.01 (br t, J = 8.2 Hz, 1H, ArH), 6.20 (d, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6.67 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.76 (s, 1H, ArH), 6.75-6.79 (1H, ArH), 7.04 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.95 (d, J = 8 Hz, 1H, ArH)
5-(2-aminoethoxy)-N-(3-(4-(dimethylamino)phenyl)propyl)-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２５．０ｍｇ，６８μｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（５００μＬ）に溶解させたＡＢＤ－Ｆ（１５．５ｍｇ，７１μｍｏｌ）を加え、室温で４時間１０分反応させた。反応溶液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、赤褐色油状の化合物３（３２．６ｍｇ，５８μｍｏｌ，８５％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.75-1.84 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 2.0-2.08 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.41-2.6 (complex, 3H, NCH2 and ArCH2), 2.71-2.92 (complex, 3H, ArCH2), 2.89 (s, 6H, N(CH3)2), 3.81 (t, J = 5 Hz, 2H, HNCH 2), 4.27 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.34-4.41 (br, 1H, ArCHN), 6.01 (br t, J = 8.2 Hz, 1H, ArH), 6.20 (d, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6.67 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.76 (s, 1H, ArH), 6.75-6.79 (1H, ArH), 7.04 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.95 (d, J = 8 Hz, 1H, ArH)
【0062】
［化合物４の合成］
＜実施例４＞
以下に記載する手順で、化合物４を合成した。
＜実施例４＞
以下に記載する手順で、化合物４を合成した。
【0063】
【化14】
【0064】
5-[2-(2-bromoethoxy)ethoxy]-2,3-dihydro-1H-inden-1-one
5-ヒドロキシ-1-インダノン（４３５ｍｇ，２．９４ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１０ｍＬ）に溶解させたのち、酢酸エチル（１０ｍＬ）に懸濁させた炭酸カリウム（１．４７ｇ，１０．６ｍｍｏｌ）、ビス（２－ブロモエチル）エーテル（１．８２ｍＬ，１４．７ｍｍｏｌ）、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（７６ｍｇ，３３４μｍｏｌ）を順次加え、２４時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に氷水に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて精製し、白色固体の5-[2-(2-bromoethoxy)ethoxy]-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（６５４ｍｇ，２．１９ｍｍｏｌ，７４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.66 (m, 2H, COCH2), 3.07 (br t, J = 6 Hz, 2H, ArCH2), 3.49 (t, J = 6.2 Hz, 2H, BrCH2), 3.88 (t, J = 6.4 Hz, 2H, OCH2), 3.90 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.21 (t, J = 5 Hz, 2H, ArOCH2), 6.89-6.93 (br m, 2H, ArH), 7.68 (d, J = 9.2 Hz, 1H, ArH)
5-ヒドロキシ-1-インダノン（４３５ｍｇ，２．９４ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１０ｍＬ）に溶解させたのち、酢酸エチル（１０ｍＬ）に懸濁させた炭酸カリウム（１．４７ｇ，１０．６ｍｍｏｌ）、ビス（２－ブロモエチル）エーテル（１．８２ｍＬ，１４．７ｍｍｏｌ）、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（７６ｍｇ，３３４μｍｏｌ）を順次加え、２４時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に氷水に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて精製し、白色固体の5-[2-(2-bromoethoxy)ethoxy]-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（６５４ｍｇ，２．１９ｍｍｏｌ，７４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.66 (m, 2H, COCH2), 3.07 (br t, J = 6 Hz, 2H, ArCH2), 3.49 (t, J = 6.2 Hz, 2H, BrCH2), 3.88 (t, J = 6.4 Hz, 2H, OCH2), 3.90 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.21 (t, J = 5 Hz, 2H, ArOCH2), 6.89-6.93 (br m, 2H, ArH), 7.68 (d, J = 9.2 Hz, 1H, ArH)
【0065】
5-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]-2,3-dihydro-1H-inden-1-one
5-[2-(2-bromoethoxy)ethoxy]-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（４０３ｍｇ，１．３５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）に溶解させ、アジ化ナトリウム（１０５ｍｇ，１．６１ｍｍｏｌ）を加えて１時間３０分間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に水に注ぎ込み、ジエチルエーテルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、赤褐色固体の5-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（３４７ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ，９９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.64-2.68 (m, 2H, COCH2), 3.07 (br t, J = 6 Hz, 2H, ArCH2), 3.41 (t, J = 5 Hz, 2H, N3CH2), 3.75 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 3.89 (t, J = 4.6 Hz, 2H, OCH2), 4.21 (t, J = 4.6 Hz, 2H, ArOCH2), 6.89-6.93 (br m, 2H, ArH), 7.67 (d, J = 9.2 Hz, 1H, ArH)
5-[2-(2-bromoethoxy)ethoxy]-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（４０３ｍｇ，１．３５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）に溶解させ、アジ化ナトリウム（１０５ｍｇ，１．６１ｍｍｏｌ）を加えて１時間３０分間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に水に注ぎ込み、ジエチルエーテルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、赤褐色固体の5-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（３４７ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ，９９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.64-2.68 (m, 2H, COCH2), 3.07 (br t, J = 6 Hz, 2H, ArCH2), 3.41 (t, J = 5 Hz, 2H, N3CH2), 3.75 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 3.89 (t, J = 4.6 Hz, 2H, OCH2), 4.21 (t, J = 4.6 Hz, 2H, ArOCH2), 6.89-6.93 (br m, 2H, ArH), 7.67 (d, J = 9.2 Hz, 1H, ArH)
【0066】
【化15】
【0067】
5-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine
4-(3-aminopropyl)-N,N-dimethylaniline（１２０ｍｇ，６７３μｍｏｌ）をメタノール（３．０ｍＬ）に溶解させ、5-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（１０１ｍｇ，３８６μｍｏｌ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（４９．２ｍｇ，７８３μｍｏｌ）、酢酸（１００μＬ）をこの順番に加え、３８時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状の5-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（１０５ｍｇ，２４８μｍｏｌ，６４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.75-1.85 (complex, 3H, ArCH2CH 2), 2.31-2.4 (m, 1H, ArCH2CH 2), 2.57 (dt, J = 3 and 8 Hz, 2H, ArCH2), 2.71 (t, J = 7 Hz, 2H, ArCH2), 2.7-2.8 (m, 1H), 2.90 (s, 6H, N(CH3)2), 2.89-3.0 (m, 1H), 3.40 (t, J = 5 Hz, 2H, N3CH2), 3.74 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 3.84 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.12 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.09-4.18 (complex, 3H, ArOCH2 and ArCHNH), 6.68 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.74 (dd, J = 2 and 8.2 Hz, 1H, ArH), 6.77 (s, 1H, ArH), 7.05 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.18 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH)
4-(3-aminopropyl)-N,N-dimethylaniline（１２０ｍｇ，６７３μｍｏｌ）をメタノール（３．０ｍＬ）に溶解させ、5-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（１０１ｍｇ，３８６μｍｏｌ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（４９．２ｍｇ，７８３μｍｏｌ）、酢酸（１００μＬ）をこの順番に加え、３８時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状の5-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（１０５ｍｇ，２４８μｍｏｌ，６４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.75-1.85 (complex, 3H, ArCH2CH 2), 2.31-2.4 (m, 1H, ArCH2CH 2), 2.57 (dt, J = 3 and 8 Hz, 2H, ArCH2), 2.71 (t, J = 7 Hz, 2H, ArCH2), 2.7-2.8 (m, 1H), 2.90 (s, 6H, N(CH3)2), 2.89-3.0 (m, 1H), 3.40 (t, J = 5 Hz, 2H, N3CH2), 3.74 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 3.84 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.12 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.09-4.18 (complex, 3H, ArOCH2 and ArCHNH), 6.68 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.74 (dd, J = 2 and 8.2 Hz, 1H, ArH), 6.77 (s, 1H, ArH), 7.05 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.18 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH)
【0068】
5-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine
5-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（１３ｍｇ，３１μｍｏｌ）をメタノール（３００μＬ）に溶解させ、パラホルムアルデヒド（１０．７ｍｇ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（９．７ｍｇ，１５４μｍｏｌ）をこの順番に加え、室温で１７時間反応させた。反応液に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、淡黄色油状の5-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)-N-(3-(4-(dimethylamino)phenyl)propyl)-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（９．８ｍｇ，２２μｍｏｌ，７１％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.7-1.82 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 1.96-2.05 (m, 2H, ArCH2CH 2), 2.14 (s, 3H, NCH3), 2.37-2.62 (complex, 4H), 2.7-2.8 (m, 1H), 2.89 (br, 8H), 3.4 (br, 2H, N3CH2), 3.74 (br, 2H, OCH2), 3.85 (br, 2H, OCH2), 4.12 (br, 2H, ArOCH2), 4.34 (m, 1H, ArCHN), 6.67 (br, 2H, ArH), 6.75 (br, 2H, ArH), 6.75-6.78 (1H, ArH), 7.05 (br, 2H, ArH)
5-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（１３ｍｇ，３１μｍｏｌ）をメタノール（３００μＬ）に溶解させ、パラホルムアルデヒド（１０．７ｍｇ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（９．７ｍｇ，１５４μｍｏｌ）をこの順番に加え、室温で１７時間反応させた。反応液に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、淡黄色油状の5-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)-N-(3-(4-(dimethylamino)phenyl)propyl)-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（９．８ｍｇ，２２μｍｏｌ，７１％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.7-1.82 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 1.96-2.05 (m, 2H, ArCH2CH 2), 2.14 (s, 3H, NCH3), 2.37-2.62 (complex, 4H), 2.7-2.8 (m, 1H), 2.89 (br, 8H), 3.4 (br, 2H, N3CH2), 3.74 (br, 2H, OCH2), 3.85 (br, 2H, OCH2), 4.12 (br, 2H, ArOCH2), 4.34 (m, 1H, ArCHN), 6.67 (br, 2H, ArH), 6.75 (br, 2H, ArH), 6.75-6.78 (1H, ArH), 7.05 (br, 2H, ArH)
【0069】
5-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine
5-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（９．８ｍｇ，２２μｍｏｌ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％，３．７ｍｇ）を加え、バルーン圧の水素雰囲気下、室温で６時間２０分反応させた。反応混合物をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮して黄色油状の5-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（８．８ｍｇ）を得た。
5-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（９．８ｍｇ，２２μｍｏｌ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％，３．７ｍｇ）を加え、バルーン圧の水素雰囲気下、室温で６時間２０分反応させた。反応混合物をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮して黄色油状の5-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（８．８ｍｇ）を得た。
【0070】
【化16】
【0071】
化合物４
5-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（８．８ｍｇ，２１μｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（５００μＬ）に溶解させたＮＢＤ－Ｆ（４．２ｍｇ，２３μｍｏｌ）を加え、室温で１５時間反応させた。反応溶液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、赤褐色油状の化合物４（４．３ｍｇ，７．５μｍｏｌ，３６％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ: 1.74-1.85 (br, 2H, ArCH2CH 2), 1.98-2.08 (m, 2H, ArCH2CH 2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.41-2.6 (complex, 4H, NCH2 and ArCH2), 2.7-2.86 (complex, 2H, ArCH2), 2.89 (s, 6H, N(CH3)2), 3.62-3.81 (m, 2H, HNCH 2), 3.88-3.95 (complex, 4H), 4.13 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.39 (br, 1H, ArCHN), 6.18 (d, J = 8.5 Hz, 1H, ArH), 6.61 (br, 1H, ArH), 6.67 (d, J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 6.72 (s, 1H, ArH), 6.71-6.76 (1H, ArH), 7.04 (d, J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 8.44 (d, J = 8.5 Hz, 1H, ArH)
5-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（８．８ｍｇ，２１μｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（５００μＬ）に溶解させたＮＢＤ－Ｆ（４．２ｍｇ，２３μｍｏｌ）を加え、室温で１５時間反応させた。反応溶液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、赤褐色油状の化合物４（４．３ｍｇ，７．５μｍｏｌ，３６％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ: 1.74-1.85 (br, 2H, ArCH2CH 2), 1.98-2.08 (m, 2H, ArCH2CH 2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.41-2.6 (complex, 4H, NCH2 and ArCH2), 2.7-2.86 (complex, 2H, ArCH2), 2.89 (s, 6H, N(CH3)2), 3.62-3.81 (m, 2H, HNCH 2), 3.88-3.95 (complex, 4H), 4.13 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.39 (br, 1H, ArCHN), 6.18 (d, J = 8.5 Hz, 1H, ArH), 6.61 (br, 1H, ArH), 6.67 (d, J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 6.72 (s, 1H, ArH), 6.71-6.76 (1H, ArH), 7.04 (d, J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 8.44 (d, J = 8.5 Hz, 1H, ArH)
【0072】
［化合物５の合成］
＜実施例５＞
以下に記載する手順で、化合物５を合成した。
＜実施例５＞
以下に記載する手順で、化合物５を合成した。
【0073】
【化17】
【0074】
5-(2-azidoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine
４－（ジメチルアミノ）ベンジルアミン二塩酸塩（１５５ｍｇ，６９５μｍｏｌ）をメタノール（３．０ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（２１６μＬ）、5-(2-azidoethoxy)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（１００ｍｇ，４６０μｍｏｌ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（４８．５ｍｇ，７７２μｍｏｌ）、酢酸（１００μＬ）をこの順番に加え、４２時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状の5-(2-azidoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（１３０ｍｇ，３７０μｍｏｌ，８０％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.88-2.0 and 2.35-2.45 (complex, each 1H, ArCH2CH 2), 2.78 (dt, J = 7.8 and 15.8 Hz, 1H, ArCH2), 2.91 (s, 6H, N(CH3)2), 3.0 (ddd, J = 5, 8.5, and 15.8 Hz, 1H, ArCH2), 3.56 (t, J = 5 Hz, 2H, N3CH2), 3.77 and 3.81 (d, J = 12.8 Hz, 2H, ArCH2N), 4.11 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.26 (t, J = 6.4 Hz, 1H, ArCHN), 6.70 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.76 (d, J = 8.3 Hz, 1H, ArH), 6.78 (br s, 1H, ArH), 7.22-7.25 (2H, ArH), 7.27 (d, J = 8.3 Hz, 1H, ArH)
４－（ジメチルアミノ）ベンジルアミン二塩酸塩（１５５ｍｇ，６９５μｍｏｌ）をメタノール（３．０ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（２１６μＬ）、5-(2-azidoethoxy)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one（１００ｍｇ，４６０μｍｏｌ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（４８．５ｍｇ，７７２μｍｏｌ）、酢酸（１００μＬ）をこの順番に加え、４２時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状の5-(2-azidoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（１３０ｍｇ，３７０μｍｏｌ，８０％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.88-2.0 and 2.35-2.45 (complex, each 1H, ArCH2CH 2), 2.78 (dt, J = 7.8 and 15.8 Hz, 1H, ArCH2), 2.91 (s, 6H, N(CH3)2), 3.0 (ddd, J = 5, 8.5, and 15.8 Hz, 1H, ArCH2), 3.56 (t, J = 5 Hz, 2H, N3CH2), 3.77 and 3.81 (d, J = 12.8 Hz, 2H, ArCH2N), 4.11 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.26 (t, J = 6.4 Hz, 1H, ArCHN), 6.70 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.76 (d, J = 8.3 Hz, 1H, ArH), 6.78 (br s, 1H, ArH), 7.22-7.25 (2H, ArH), 7.27 (d, J = 8.3 Hz, 1H, ArH)
【0075】
5-(2-azidoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine
5-(2-azidoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（５７．５ｍｇ，１６４μｍｏｌ）をメタノール（０．８ｍＬ）に溶解させ、パラホルムアルデヒド（２７．１ｍｇ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１６．０ｍｇ，２５５μｍｏｌ）をこの順番に加え、室温で７時間反応させた。反応液に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状の5-(2-azidoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（５８ｍｇ，１５９μｍｏｌ，９７％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.6-1.8 and 2.0-2.11(complex, each 1H, ArCH2CH 2), 2.12 (s, 3H, NCH3), 2.71-2.83 and 2.86-2.95 (complex, each 1H, ArCH2), 2.91(s, 6H, N(CH3)2), 3.32 (d, J = 12.8 Hz, 1H, ArCH2), 3.50 (d, J = 12.8 Hz, 1H, ArCH2), 3.57 (t, J = 5 Hz, 2H, N3CH2), 4.13 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.40 (t, J = 7.1 Hz, 1H, ArCHN), 6.70 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.76 (s, 1H, ArH), 6.78 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH), 7.21 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.33 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH)
5-(2-azidoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（５７．５ｍｇ，１６４μｍｏｌ）をメタノール（０．８ｍＬ）に溶解させ、パラホルムアルデヒド（２７．１ｍｇ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１６．０ｍｇ，２５５μｍｏｌ）をこの順番に加え、室温で７時間反応させた。反応液に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状の5-(2-azidoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（５８ｍｇ，１５９μｍｏｌ，９７％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.6-1.8 and 2.0-2.11(complex, each 1H, ArCH2CH 2), 2.12 (s, 3H, NCH3), 2.71-2.83 and 2.86-2.95 (complex, each 1H, ArCH2), 2.91(s, 6H, N(CH3)2), 3.32 (d, J = 12.8 Hz, 1H, ArCH2), 3.50 (d, J = 12.8 Hz, 1H, ArCH2), 3.57 (t, J = 5 Hz, 2H, N3CH2), 4.13 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.40 (t, J = 7.1 Hz, 1H, ArCHN), 6.70 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.76 (s, 1H, ArH), 6.78 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH), 7.21 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.33 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH)
【0076】
5-(2-aminoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine
5-(2-azidoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２８．７ｍｇ，７９μｍｏｌ）をメタノール（１．５ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％，６．５ｍｇ）を加え、バルーン圧の水素雰囲気下、室温で６時間５０分反応させた。反応混合物をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮して黄色油状の5-(2-aminoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２３．５ｍｇ）を得た。この化合物は精製せず、そのまま次の反応に用いた。
5-(2-azidoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２８．７ｍｇ，７９μｍｏｌ）をメタノール（１．５ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％，６．５ｍｇ）を加え、バルーン圧の水素雰囲気下、室温で６時間５０分反応させた。反応混合物をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮して黄色油状の5-(2-aminoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２３．５ｍｇ）を得た。この化合物は精製せず、そのまま次の反応に用いた。
【0077】
【化18】
【0078】
化合物５
5-(2-aminoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２３．０ｍｇ，６８μｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（５００μＬ）に溶解させたＮＢＤ－Ｆ（１４．４ｍｇ，７９μｍｏｌ）を加え、室温で１時間３０分反応させた。反応溶液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、赤褐色固体の化合物５（１６．１ｍｇ，３２μｍｏｌ，４７％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.0-2.2 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 2.12 (s, 3H, NCH3), 2.71-2.93 (complex, 2H, ArCH2), 2.91(s, 6H, N(CH3)2), 3.31 (d, J = 12.8 Hz, 1H, ArCH2N), 3.49 (d, J = 12.8 Hz, 1H, ArCH2N), 3.89 (br, 2H, HNCH 2), 4.30 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.40 (br, 1H, ArCHN), 6.28 (d, J = 7.8 Hz, 1H, ArH), 6.69 (d, J = 7.8 Hz, 2H, ArH), 6.76 (s, 1H, ArH), 6.74-6.81 (1H, ArH), 7.20 (d, J = 7.8 Hz, 2H, ArH), 7.35 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.51 (d, J = 7.8 Hz, 1H)
5-(2-aminoethoxy)-N-[4-(dimethylamino)benzyl]-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２３．０ｍｇ，６８μｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（５００μＬ）に溶解させたＮＢＤ－Ｆ（１４．４ｍｇ，７９μｍｏｌ）を加え、室温で１時間３０分反応させた。反応溶液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、赤褐色固体の化合物５（１６．１ｍｇ，３２μｍｏｌ，４７％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.0-2.2 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 2.12 (s, 3H, NCH3), 2.71-2.93 (complex, 2H, ArCH2), 2.91(s, 6H, N(CH3)2), 3.31 (d, J = 12.8 Hz, 1H, ArCH2N), 3.49 (d, J = 12.8 Hz, 1H, ArCH2N), 3.89 (br, 2H, HNCH 2), 4.30 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.40 (br, 1H, ArCHN), 6.28 (d, J = 7.8 Hz, 1H, ArH), 6.69 (d, J = 7.8 Hz, 2H, ArH), 6.76 (s, 1H, ArH), 6.74-6.81 (1H, ArH), 7.20 (d, J = 7.8 Hz, 2H, ArH), 7.35 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.51 (d, J = 7.8 Hz, 1H)
【0079】
［化合物６の合成］
＜実施例６＞
以下に記載する手順で、化合物６を合成した。
＜実施例６＞
以下に記載する手順で、化合物６を合成した。
【0080】
【化19】
【0081】
4-(2-bromoethoxy)benzaldehyde
4-ヒドロキシベンズアルデヒド（４０３ｍｇ，３．３０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）に溶解させたのち、1,2-ジブロモエタン（２．８ｍＬ，３３．０ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（８２５ｍｇ，５．９７ｍｍｏｌ）を順次加え、１３時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に氷水に注ぎ込み、ジエチルエーテルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）にて精製し、薄桃色固体の4-(2-bromoethoxy)benzaldehyde（５５９ｍｇ，２．４４ｍｍｏｌ，７４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.66 (t, J = 6.2 Hz, 2H, BrCH2), 4.37 (t, J = 6.2 Hz, 2H, OCH2), 7.01 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.84 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 9.89 (s, 1H, ArCHO)
4-ヒドロキシベンズアルデヒド（４０３ｍｇ，３．３０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）に溶解させたのち、1,2-ジブロモエタン（２．８ｍＬ，３３．０ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（８２５ｍｇ，５．９７ｍｍｏｌ）を順次加え、１３時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に氷水に注ぎ込み、ジエチルエーテルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）にて精製し、薄桃色固体の4-(2-bromoethoxy)benzaldehyde（５５９ｍｇ，２．４４ｍｍｏｌ，７４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.66 (t, J = 6.2 Hz, 2H, BrCH2), 4.37 (t, J = 6.2 Hz, 2H, OCH2), 7.01 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.84 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 9.89 (s, 1H, ArCHO)
【0082】
4-(2-azidoethoxy)benzaldehyde
4-(2-bromoethoxy)benzaldehyde（４０２ｍｇ，１．７５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）に溶解させ、アジ化ナトリウム（１５７ｍｇ，２．４２ｍｍｏｌ）を加えて２０分間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に水に注ぎ込み、ジエチルエーテルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、淡黄色油状の4-(2-azidoethoxy)benzaldehyde（３２５ｍｇ，１．７０ｍｍｏｌ，９７％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.64 (t, J = 4.9 Hz, 2H, N3CH2), 4.22 (t, J = 4.9 Hz, 2H, OCH2), 7.02 (d, J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 7.85 (d, J = 8.9 Hz, 1H, ArH), 9.89 (s, 1H, CHO)
4-(2-bromoethoxy)benzaldehyde（４０２ｍｇ，１．７５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）に溶解させ、アジ化ナトリウム（１５７ｍｇ，２．４２ｍｍｏｌ）を加えて２０分間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に水に注ぎ込み、ジエチルエーテルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、淡黄色油状の4-(2-azidoethoxy)benzaldehyde（３２５ｍｇ，１．７０ｍｍｏｌ，９７％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.64 (t, J = 4.9 Hz, 2H, N3CH2), 4.22 (t, J = 4.9 Hz, 2H, OCH2), 7.02 (d, J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 7.85 (d, J = 8.9 Hz, 1H, ArH), 9.89 (s, 1H, CHO)
【0083】
【化20】
【0084】
4-(3-{[4-(2-azidoethoxy)benzyl]amino}propyl)-N,N-dimethylaniline
4-(3-aminopropyl)-N,N-dimethylaniline（１４３ｍｇ，８０２μｍｏｌ）をメタノール（４ｍＬ）に溶解させ、4-(2-azidoethoxy)benzaldehyde（１００ｍｇ，５２３μｍｏｌ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（６３．３ｍｇ，１．０１ｍｍｏｌ）、酢酸（２００μＬ）をこの順番に加え、３７５時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状の4-(3-{[4-(2-azidoethoxy)benzyl]amino}propyl)-N,N-dimethylaniline（１０５ｍｇ，２９７μｍｏｌ，５７％）を得た。この化合物は精製せず、そのまま次の反応に用いた。
4-(3-aminopropyl)-N,N-dimethylaniline（１４３ｍｇ，８０２μｍｏｌ）をメタノール（４ｍＬ）に溶解させ、4-(2-azidoethoxy)benzaldehyde（１００ｍｇ，５２３μｍｏｌ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（６３．３ｍｇ，１．０１ｍｍｏｌ）、酢酸（２００μＬ）をこの順番に加え、３７５時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状の4-(3-{[4-(2-azidoethoxy)benzyl]amino}propyl)-N,N-dimethylaniline（１０５ｍｇ，２９７μｍｏｌ，５７％）を得た。この化合物は精製せず、そのまま次の反応に用いた。
【0085】
4-(3-{[4-(2-azidoethoxy)benzyl]methylamino}propyl)-N,N-dimethylaniline
4-(3-{[4-(2-azidoethoxy)benzyl]amino}propyl)-N,N-dimethylaniline（１６．２ｍｇ，４６μｍｏｌ）をメタノール（５００μＬ）に溶解させ、パラホルムアルデヒド（１０ｍｇ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（４．７ｍｇ，７５μｍｏｌ）をこの順番に加え、室温で１６時間反応させた。反応液に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状の4-(3-{[4-(2-azidoethoxy)benzyl]methylamino}propyl)-N,N-dimethylaniline（７．８ｍｇ，２１μｍｏｌ，４６％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.79 (quin, J = 7.5 Hz, 2H, CH2CH 2CH2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.39 (t, J = 7.5 Hz, 2H, NCH 2CH2Ar), 2.53 (t, J = 7.5 Hz, 2H, NCH2CH 2Ar), 2.90 (s, 6H, N(CH3)2), 3.42 (s, 2H, ArCH2N), 3.58 (t, J = 5.0 Hz, 2H, N3CH2), 4.14 (t, J = 5 Hz, 2H, ArOCH2), 6.68 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.86 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.05 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.22 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH)
4-(3-{[4-(2-azidoethoxy)benzyl]amino}propyl)-N,N-dimethylaniline（１６．２ｍｇ，４６μｍｏｌ）をメタノール（５００μＬ）に溶解させ、パラホルムアルデヒド（１０ｍｇ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（４．７ｍｇ，７５μｍｏｌ）をこの順番に加え、室温で１６時間反応させた。反応液に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状の4-(3-{[4-(2-azidoethoxy)benzyl]methylamino}propyl)-N,N-dimethylaniline（７．８ｍｇ，２１μｍｏｌ，４６％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.79 (quin, J = 7.5 Hz, 2H, CH2CH 2CH2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.39 (t, J = 7.5 Hz, 2H, NCH 2CH2Ar), 2.53 (t, J = 7.5 Hz, 2H, NCH2CH 2Ar), 2.90 (s, 6H, N(CH3)2), 3.42 (s, 2H, ArCH2N), 3.58 (t, J = 5.0 Hz, 2H, N3CH2), 4.14 (t, J = 5 Hz, 2H, ArOCH2), 6.68 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.86 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.05 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.22 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH)
【0086】
4-(3-{[4-(2-aminoethoxy)benzyl]methylamino}propyl)-N,N-dimethylaniline
4-(3-{[4-(2-azidoethoxy)benzyl]methylamino}propyl)-N,N-dimethylaniline（７．２ｍｇ，２０μｍｏｌ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％，４．７ｍｇ）を加え、バルーン圧の水素雰囲気下、室温で３時間４０分反応させた。反応混合物をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮して黄色油状の4-(3-{[4-(2-aminoethoxy)benzyl]methylamino}propyl)-N,N-dimethylaniline（６．１ｍｇ）を得た。この化合物は精製せず、そのまま次の反応に用いた。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.78 (quin, J = 7.7 Hz, 2H, CH2CH 2CH2), 2.15 (s, 3H, NCH3), 2.38 (t, J = 7.7 Hz, 2H, NCH 2CH2CH2), 2.53 (t, J = 7.7 Hz, 2H, CH2CH2CH 2Ar), 2.90 (s, 6H, N(CH3)2), 3.07 (t, J = 5 Hz, 2H, H2NCH 2), 3.40 (s, 2H, ArCH2N), 3.97 (t, J = 5 Hz, 2H, ArOCH2), 6.68 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.85 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.05 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.20 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH)
4-(3-{[4-(2-azidoethoxy)benzyl]methylamino}propyl)-N,N-dimethylaniline（７．２ｍｇ，２０μｍｏｌ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％，４．７ｍｇ）を加え、バルーン圧の水素雰囲気下、室温で３時間４０分反応させた。反応混合物をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮して黄色油状の4-(3-{[4-(2-aminoethoxy)benzyl]methylamino}propyl)-N,N-dimethylaniline（６．１ｍｇ）を得た。この化合物は精製せず、そのまま次の反応に用いた。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.78 (quin, J = 7.7 Hz, 2H, CH2CH 2CH2), 2.15 (s, 3H, NCH3), 2.38 (t, J = 7.7 Hz, 2H, NCH 2CH2CH2), 2.53 (t, J = 7.7 Hz, 2H, CH2CH2CH 2Ar), 2.90 (s, 6H, N(CH3)2), 3.07 (t, J = 5 Hz, 2H, H2NCH 2), 3.40 (s, 2H, ArCH2N), 3.97 (t, J = 5 Hz, 2H, ArOCH2), 6.68 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.85 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.05 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.20 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH)
【0087】
【化21】
【0088】
化合物６
4-(3-{[4-(2-aminoethoxy)benzyl]methylamino}propyl)-N,N-dimethylaniline（５．９ｍｇ，１７μｍｏｌ）をアセトニトリル（３００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（３００μＬ）に溶解させたＮＢＤ－Ｆ（３．５ｍｇ，１９μｍｏｌ）を加え、室温で１３時間反応させた。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、赤褐色固体の化合物６（６．６ｍｇ，１３μｍｏｌ，７６％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.78 (quin, J = 7.6 Hz, 2H, CH2CH 2CH2), 2.15 (s, 3H, NCH3), 2.39 (t, J = 7.6 Hz, 2H, NCH 2CH2CH2), 2.53 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH2CH2CH 2Ar), 2.89 (s, 6H, N(CH3)2), 3.41 (s, 2H, ArCH2N), 3.86-3.92 (m, 2H, HNCH 2CH2O), 4.31 (t, J = 5 Hz, 2H, ArOCH2), 6.28 (d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.68 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.87 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.04 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 8.51 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH)
4-(3-{[4-(2-aminoethoxy)benzyl]methylamino}propyl)-N,N-dimethylaniline（５．９ｍｇ，１７μｍｏｌ）をアセトニトリル（３００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（３００μＬ）に溶解させたＮＢＤ－Ｆ（３．５ｍｇ，１９μｍｏｌ）を加え、室温で１３時間反応させた。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、赤褐色固体の化合物６（６．６ｍｇ，１３μｍｏｌ，７６％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.78 (quin, J = 7.6 Hz, 2H, CH2CH 2CH2), 2.15 (s, 3H, NCH3), 2.39 (t, J = 7.6 Hz, 2H, NCH 2CH2CH2), 2.53 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH2CH2CH 2Ar), 2.89 (s, 6H, N(CH3)2), 3.41 (s, 2H, ArCH2N), 3.86-3.92 (m, 2H, HNCH 2CH2O), 4.31 (t, J = 5 Hz, 2H, ArOCH2), 6.28 (d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.68 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.87 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.04 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 8.51 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH)
【0089】
［化合物７の合成］
＜実施例７＞
以下に記載する手順で、化合物７を合成した。
＜実施例７＞
以下に記載する手順で、化合物７を合成した。
【0090】
【化22】
【0091】
化合物７
5-(2-aminoethoxy)-N-(3-(4-(dimethylamino)phenyl)propyl)-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（１６．２ｍｇ，４４μｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（５００μＬ）に溶解させたＤＢＤ－Ｆ（１１．７ｍｇ，４８μｍｏｌ）を加え、室温で１５時間２０分反応させた。反応溶液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、赤褐色油状の化合物７（２０．７ｍｇ，３５μｍｏｌ，８０％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.72-1.84 (br m, 2H, ArCH2CH 2), 1.98-2.07 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.36-2.93 (complex, 6H, NCH2 and ArCH2), 2.86 (s, 6H, N(CH3)2), 2.89 (s, 6H, N(CH3)2), 3.80 (m, 2H, HNCH 2), 4.27 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.3-4.4 (br, 1H, ArCHN), 5.99 (br, 1H, ArH), 6.23 (d, J = 7.8 Hz, 1H, ArH), 6.68 (d, J = 8.3 Hz, 2H, ArH), 6.73-6.8 (complex, 2H, ArH), 7.05 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.91 (d, J = 7.8 Hz, 1H, ArH)
5-(2-aminoethoxy)-N-(3-(4-(dimethylamino)phenyl)propyl)-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（１６．２ｍｇ，４４μｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（５００μＬ）に溶解させたＤＢＤ－Ｆ（１１．７ｍｇ，４８μｍｏｌ）を加え、室温で１５時間２０分反応させた。反応溶液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）にて精製し、赤褐色油状の化合物７（２０．７ｍｇ，３５μｍｏｌ，８０％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.72-1.84 (br m, 2H, ArCH2CH 2), 1.98-2.07 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.36-2.93 (complex, 6H, NCH2 and ArCH2), 2.86 (s, 6H, N(CH3)2), 2.89 (s, 6H, N(CH3)2), 3.80 (m, 2H, HNCH 2), 4.27 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.3-4.4 (br, 1H, ArCHN), 5.99 (br, 1H, ArH), 6.23 (d, J = 7.8 Hz, 1H, ArH), 6.68 (d, J = 8.3 Hz, 2H, ArH), 6.73-6.8 (complex, 2H, ArH), 7.05 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.91 (d, J = 7.8 Hz, 1H, ArH)
【0092】
［化合物８の合成］
＜実施例８＞
以下に記載する手順で、化合物８を合成した。
＜実施例８＞
以下に記載する手順で、化合物８を合成した。
【0093】
【化23】
【0094】
5-(2-aminoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine
5-(2-azidoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（３３．４ｍｇ，８８μｍｏｌ）をメタノール（１．５ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％，１３．４ｍｇ）を加え、バルーン圧の水素雰囲気下、室温で６時間２０分反応させた。反応混合物をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮して黄色油状の5-(2-aminoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（３０．３ｍｇ）を得た。この化合物は精製せず、そのまま次の反応に用いた。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.76-1.88 (1H, ArCH2CH 2), 1.80 (quin, J = 7.3 Hz, 2H, ArCH2CH 2), 2.31-2.41 (complex, 1H, ArCH2CH 2), 2.51-2.62 (m, 2H), 2.72 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.72-2.81 (m, 1H), 2.90 (s, 6H, N(CH3)2), 2.9-2.99 (br m, 1H), 3.05 (t, J = 5.0 Hz, 2H, H2NCH2), 3.96 (t, J = 5.0 Hz, 2H, OCH2), 4.12-4.17 (m, 1H, ArCHN), 6.68 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH), 6.73 (d, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6.77 (s, 1H, ArH), 7.06 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH), 7.19 (d, J = 8 Hz, 1H, ArH)
5-(2-azidoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（３３．４ｍｇ，８８μｍｏｌ）をメタノール（１．５ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％，１３．４ｍｇ）を加え、バルーン圧の水素雰囲気下、室温で６時間２０分反応させた。反応混合物をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮して黄色油状の5-(2-aminoethoxy)-N-{3-[4-(dimethylamino)phenyl]propyl}-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（３０．３ｍｇ）を得た。この化合物は精製せず、そのまま次の反応に用いた。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.76-1.88 (1H, ArCH2CH 2), 1.80 (quin, J = 7.3 Hz, 2H, ArCH2CH 2), 2.31-2.41 (complex, 1H, ArCH2CH 2), 2.51-2.62 (m, 2H), 2.72 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.72-2.81 (m, 1H), 2.90 (s, 6H, N(CH3)2), 2.9-2.99 (br m, 1H), 3.05 (t, J = 5.0 Hz, 2H, H2NCH2), 3.96 (t, J = 5.0 Hz, 2H, OCH2), 4.12-4.17 (m, 1H, ArCHN), 6.68 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH), 6.73 (d, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6.77 (s, 1H, ArH), 7.06 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH), 7.19 (d, J = 8 Hz, 1H, ArH)
【0095】
化合物８
5-(2-aminoethoxy)-N-(3-(4-(dimethylamino)phenyl)propyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２８．２ｍｇ，８０μｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（５００μＬ）に溶解させたＮＢＤ－Ｆ（１４．６ｍｇ，８０μｍｏｌ）を加え、室温で３０分反応させた。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣を薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、赤褐色油状の化合物８（２４．３ｍｇ，４７μｍｏｌ，５９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ: 1.7-1.91 (br, 1H, ArCH2CH 2), 1.82 (quin, J = 7.4 Hz, 2H, ArCH2CH 2), 2.32-2.41 (m, 1H, ArCH2CH 2), 2.52-2.6 (complex, 2H, NCH2 and ArCH2), 2.72 (t, J = 7.4 Hz, 2H, ArCH2), 2.74-2.81 (complex, 1H, ArCH2CH 2), 2.88-3.0 (1H), 2.89 (s, 6H, N(CH3)2), 3.86-3.92 (t, J = 5 Hz, 2H, HNCH 2CH2O), 4.19 (t, J = 6.4 Hz, 1H, ArCHN), 4.28 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 6.28 (d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.67 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.74 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.77 (s, 1H, ArH), 7.04 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 8.50 (d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH)
5-(2-aminoethoxy)-N-(3-(4-(dimethylamino)phenyl)propyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine（２８．２ｍｇ，８０μｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（５００μＬ）に溶解させたＮＢＤ－Ｆ（１４．６ｍｇ，８０μｍｏｌ）を加え、室温で３０分反応させた。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣を薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、赤褐色油状の化合物８（２４．３ｍｇ，４７μｍｏｌ，５９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ: 1.7-1.91 (br, 1H, ArCH2CH 2), 1.82 (quin, J = 7.4 Hz, 2H, ArCH2CH 2), 2.32-2.41 (m, 1H, ArCH2CH 2), 2.52-2.6 (complex, 2H, NCH2 and ArCH2), 2.72 (t, J = 7.4 Hz, 2H, ArCH2), 2.74-2.81 (complex, 1H, ArCH2CH 2), 2.88-3.0 (1H), 2.89 (s, 6H, N(CH3)2), 3.86-3.92 (t, J = 5 Hz, 2H, HNCH 2CH2O), 4.19 (t, J = 6.4 Hz, 1H, ArCHN), 4.28 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 6.28 (d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.67 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.74 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.77 (s, 1H, ArH), 7.04 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 8.50 (d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH)
【0096】
［化合物９の合成］
＜実施例９＞
以下に記載する手順で、化合物９を合成した。
＜実施例９＞
以下に記載する手順で、化合物９を合成した。
【0097】
【化24】
【0098】
(E)-4-[2-({3-[4-(dimethylamino)phenyl]allyl}amino)ethyl]phenol
チラミン(６９８ｍｇ，５．０９ｍｍｏｌ)と4-(dimethylamino)cinnamaldehyde（９１０ｍｇ，5.19ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解させ、３Åモレキュラーシーブ（９６９ｍｇ）を加えて室温で２２時間攪拌させた。続いて、反応容器を０℃に冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（３９２ｍｇ，１０．４ｍｍｏｌ）を添加した。さらにメタノール（２６ｍＬ）を反応溶液に加え、室温で４２時間撹拌した。反応混合物をセライトろ過した後、ろ液を減圧濃縮し、黄色固体の(E)-4-[2-({3-[4-(dimethylamino)phenyl]allyl}amino)ethyl]phenol（１．４４ｇ）を得た。この化合物は精製せず、そのまま次の反応に用いた。
チラミン(６９８ｍｇ，５．０９ｍｍｏｌ)と4-(dimethylamino)cinnamaldehyde（９１０ｍｇ，5.19ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解させ、３Åモレキュラーシーブ（９６９ｍｇ）を加えて室温で２２時間攪拌させた。続いて、反応容器を０℃に冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（３９２ｍｇ，１０．４ｍｍｏｌ）を添加した。さらにメタノール（２６ｍＬ）を反応溶液に加え、室温で４２時間撹拌した。反応混合物をセライトろ過した後、ろ液を減圧濃縮し、黄色固体の(E)-4-[2-({3-[4-(dimethylamino)phenyl]allyl}amino)ethyl]phenol（１．４４ｇ）を得た。この化合物は精製せず、そのまま次の反応に用いた。
【0099】
(E)-4-[2-({3-[4-(dimethylamino)phenyl]allyl}(methyl)amino)ethyl]phenol
(E)-4-[2-({3-[4-(dimethylamino)phenyl]allyl}amino)ethyl]phenol（１．４３ｇ）をメタノール（３５ｍＬ）に溶解させ、パラホルムアルデヒド（９３０ｍｇ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（３８９ｍｇ，６．１９ｍｍｏｌ）をこの順番に加え、室温で１７時間反応させた。反応液に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、反応溶液を減圧濃縮した後、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、淡黄色油状の(E)-4-[2-({3-[4-(dimethylamino)phenyl]allyl}(methyl)amino)ethyl]phenol（７９６ｍｇ，２．５６ｍｍｏｌ，２段階収率５０％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.33 (s, 3H, NCH3), 2.62 (dd, J = 6.2 and 9.6 Hz, 2H, NCH2CH 2Ar), 2.74 (dd, J = 6.2 and 9.6 Hz, 2H, NCH 2CH2Ar), 2.94 (s, 6H, N(CH3)2), 3.19 (d, J = 6.9 Hz, 2H, NCH 2CH=CH), 6.05 (dt, J = 6.9 and 16 Hz, 1H, ArCH=CHCH2), 6.41 (d, J = 16 Hz, 1H, ArCH=CH), 6.67 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.71 (d, J = 8.3 Hz, 2H, ArH), 7.04 (d, J = 8.3 Hz, 2H, ArH), 7.26 (2H, ArH).
(E)-4-[2-({3-[4-(dimethylamino)phenyl]allyl}amino)ethyl]phenol（１．４３ｇ）をメタノール（３５ｍＬ）に溶解させ、パラホルムアルデヒド（９３０ｍｇ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（３８９ｍｇ，６．１９ｍｍｏｌ）をこの順番に加え、室温で１７時間反応させた。反応液に１Ｍ塩酸を加えて過剰の水素化物をクエンチした。続いて、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて弱塩基性にし、反応溶液を減圧濃縮した後、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン）にて精製し、淡黄色油状の(E)-4-[2-({3-[4-(dimethylamino)phenyl]allyl}(methyl)amino)ethyl]phenol（７９６ｍｇ，２．５６ｍｍｏｌ，２段階収率５０％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.33 (s, 3H, NCH3), 2.62 (dd, J = 6.2 and 9.6 Hz, 2H, NCH2CH 2Ar), 2.74 (dd, J = 6.2 and 9.6 Hz, 2H, NCH 2CH2Ar), 2.94 (s, 6H, N(CH3)2), 3.19 (d, J = 6.9 Hz, 2H, NCH 2CH=CH), 6.05 (dt, J = 6.9 and 16 Hz, 1H, ArCH=CHCH2), 6.41 (d, J = 16 Hz, 1H, ArCH=CH), 6.67 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.71 (d, J = 8.3 Hz, 2H, ArH), 7.04 (d, J = 8.3 Hz, 2H, ArH), 7.26 (2H, ArH).
【0100】
(E)-4-(3-{[4-(2-bromoethoxy)phenethyl](methyl)amino}prop-1-en-1-yl)-N,N-dimethylaniline
(E)-4-[2-({3-[4-(dimethylamino)phenyl]allyl}(methyl)amino)ethyl]phenol（３９０ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（５．０ｍＬ）に溶解させたのち、酢酸エチル（１２ｍＬ）に懸濁させた炭酸カリウム（６５３ｍｇ，４．７３ｍｍｏｌ）、１，２－ジブロモエタン（６９８μＬ，８．１０ｍｍｏｌ）、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（ＢＴＥＡＣ）（３３．１ｍｇ，１４５μｍｏｌ）を順次加え、１７時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に氷水に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン／酢酸エチル／トリエチルアミン＝１００／１００／３）にて精製し、黄色固体の(E)-4-(3-{[4-(2-bromoethoxy)phenethyl](methyl)amino}prop-1-en-1-yl)-N,N-dimethylaniline（３６１ｍｇ，８６５μｍｏｌ，６９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.33 (s, 3H, NCH3), 2.58-2.64 (m, 2H, NCH 2CH2Ar), 2.71-2.78 (m, 2H, NCH2CH 2Ar), 2.94 (s, 6H, N(CH3)2), 3.19 (d, J = 6.9 Hz, 2H, NCH 2CH=CH), 3.61 (t, J = 6.2 Hz, 2H, BrCH2), 4.25 (t, J = 6.2 Hz, 2H, ArOCH2), 6.05 (dt, J = 6.9 and 16 Hz, 1H, ArCH=CHCH2), 6.41 (d, J = 16 Hz, 1H, ArCH=CH), 6.67 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.73 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH), 7.05 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH), 7.25 (2H, ArH).
(E)-4-[2-({3-[4-(dimethylamino)phenyl]allyl}(methyl)amino)ethyl]phenol（３９０ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（５．０ｍＬ）に溶解させたのち、酢酸エチル（１２ｍＬ）に懸濁させた炭酸カリウム（６５３ｍｇ，４．７３ｍｍｏｌ）、１，２－ジブロモエタン（６９８μＬ，８．１０ｍｍｏｌ）、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（ＢＴＥＡＣ）（３３．１ｍｇ，１４５μｍｏｌ）を順次加え、１７時間加熱還流させた。反応液を室温まで放冷した後に氷水に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン／酢酸エチル／トリエチルアミン＝１００／１００／３）にて精製し、黄色固体の(E)-4-(3-{[4-(2-bromoethoxy)phenethyl](methyl)amino}prop-1-en-1-yl)-N,N-dimethylaniline（３６１ｍｇ，８６５μｍｏｌ，６９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.33 (s, 3H, NCH3), 2.58-2.64 (m, 2H, NCH 2CH2Ar), 2.71-2.78 (m, 2H, NCH2CH 2Ar), 2.94 (s, 6H, N(CH3)2), 3.19 (d, J = 6.9 Hz, 2H, NCH 2CH=CH), 3.61 (t, J = 6.2 Hz, 2H, BrCH2), 4.25 (t, J = 6.2 Hz, 2H, ArOCH2), 6.05 (dt, J = 6.9 and 16 Hz, 1H, ArCH=CHCH2), 6.41 (d, J = 16 Hz, 1H, ArCH=CH), 6.67 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.73 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH), 7.05 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH), 7.25 (2H, ArH).
【0101】
(E)-4-(3-{[4-(2-azidoethoxy)phenethyl](methyl)amino}prop-1-en-1-yl)-N,N-dimethylaniline
(E)-4-(3-{[4-(2-bromoethoxy)phenethyl](methyl)amino}prop-1-en-1-yl)-N,N-dimethylaniline（２９０ｍｇ，６９５μｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３．０ｍＬ）に溶解させ、アジ化ナトリウム（７１．７ｍｇ，１．１０ｍｍｏl）を加えて９０℃で１時間反応させた。反応液を室温まで放冷した後に水に注ぎ込み、ジエチルエーテルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて精製し、黄色固体の(E)-4-(3-{[4-(2-azidoethoxy)phenethyl](methyl)amino}prop-1-en-1-yl)-N,N-dimethylaniline（２０６ｍｇ，５４３μｍｏｌ，７８％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.33 (s, 3H, NCH3), 2.56-2.66 (br, 2H, NCH 2CH2Ar), 2.7-2.8 (br, 2H, NCH 2CH2Ar), 2.94 (s, 6H, N(CH3)2), 3.19 (d, J = 6.9 Hz, 2H, NCH 2CH=CH), 3.57 (t, J = 4.8 Hz, 2H, N3CH2), 4.11 (t, J = 4.8 Hz, 2H, ArOCH2), 6.05 (dt, J = 6.9 and 15.6 Hz, 1H, ArCH=CHCH2), 6.41 (d, J = 15.6 Hz, 1H, ArCH=CH), 6.67 (d, J = 8.5 Hz, 2H, ArH), 6.83 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.11 (d, J = 8.5 Hz, 2H, ArH), 7.25 (2H, ArH).
(E)-4-(3-{[4-(2-bromoethoxy)phenethyl](methyl)amino}prop-1-en-1-yl)-N,N-dimethylaniline（２９０ｍｇ，６９５μｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３．０ｍＬ）に溶解させ、アジ化ナトリウム（７１．７ｍｇ，１．１０ｍｍｏl）を加えて９０℃で１時間反応させた。反応液を室温まで放冷した後に水に注ぎ込み、ジエチルエーテルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて精製し、黄色固体の(E)-4-(3-{[4-(2-azidoethoxy)phenethyl](methyl)amino}prop-1-en-1-yl)-N,N-dimethylaniline（２０６ｍｇ，５４３μｍｏｌ，７８％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.33 (s, 3H, NCH3), 2.56-2.66 (br, 2H, NCH 2CH2Ar), 2.7-2.8 (br, 2H, NCH 2CH2Ar), 2.94 (s, 6H, N(CH3)2), 3.19 (d, J = 6.9 Hz, 2H, NCH 2CH=CH), 3.57 (t, J = 4.8 Hz, 2H, N3CH2), 4.11 (t, J = 4.8 Hz, 2H, ArOCH2), 6.05 (dt, J = 6.9 and 15.6 Hz, 1H, ArCH=CHCH2), 6.41 (d, J = 15.6 Hz, 1H, ArCH=CH), 6.67 (d, J = 8.5 Hz, 2H, ArH), 6.83 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.11 (d, J = 8.5 Hz, 2H, ArH), 7.25 (2H, ArH).
【0102】
4-(3-{[4-(2-aminoethoxy)phenethyl](methyl)amino}propyl)-N,N-dimethylaniline
(E)-4-(3-{[4-(2-azidoethoxy)phenethyl](methyl)amino}prop-1-en-1-yl)-N,N-dimethylaniline（２０．５ｍｇ，５４μｍｏｌ）をメタノール（１．０ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％，５．８ｍｇ）を加え、バルーン圧の水素雰囲気下、室温で１５時間５０分反応させた。反応混合物をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮して黄色油状の4-(3-{[4-(2-aminoethoxy)phenethyl](methyl)amino}propyl)-N,N-dimethylaniline（１７．８ｍｇ，９３％）を得た。この化合物は精製せず、そのまま次の反応に用いた。
(E)-4-(3-{[4-(2-azidoethoxy)phenethyl](methyl)amino}prop-1-en-1-yl)-N,N-dimethylaniline（２０．５ｍｇ，５４μｍｏｌ）をメタノール（１．０ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％，５．８ｍｇ）を加え、バルーン圧の水素雰囲気下、室温で１５時間５０分反応させた。反応混合物をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮して黄色油状の4-(3-{[4-(2-aminoethoxy)phenethyl](methyl)amino}propyl)-N,N-dimethylaniline（１７．８ｍｇ，９３％）を得た。この化合物は精製せず、そのまま次の反応に用いた。
【0103】
【化25】
【0104】
化合物９
4-(3-{[4-(2-aminoethoxy)phenethyl](methyl)amino}propyl)-N,N-dimethylaniline（１７．４ｍｇ，４９μｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（５００μＬ）に溶解させたＮＢＤ－Ｆ（９．９ｍｇ，５５μｍｏｌ）を加え、室温で１時間反応させた。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル，アセトン）で精製し、赤褐色油状の化合物９（１７．３ｍｇ，３３μｍｏｌ，６７％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.69-1.8 (complex, 2H, CH2CH 2CH2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.25-2.44 (complex, 4H, ArCH2 and NCH2), 2.50 (t, J = 7.8 Hz, 2H, ArCH2), 2.67-2.74 (m, 2H), 2.89 (s, 6H, N(CH3)2), 3.85-3.91 (br m, 2H, HNCH 2CH2O), 4.28 (t, J = 5 Hz, 2H, ArOCH2), 6.27 (d, J = 8.5 Hz, 1H, ArH), 6.67 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.84 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.03 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.12 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 8.50 (d, J = 8.5 Hz, 2H, ArH).
4-(3-{[4-(2-aminoethoxy)phenethyl](methyl)amino}propyl)-N,N-dimethylaniline（１７．４ｍｇ，４９μｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解させ、続いて、アセトニトリル（５００μＬ）に溶解させたＮＢＤ－Ｆ（９．９ｍｇ，５５μｍｏｌ）を加え、室温で１時間反応させた。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を減圧濃縮した残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル，アセトン）で精製し、赤褐色油状の化合物９（１７．３ｍｇ，３３μｍｏｌ，６７％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.69-1.8 (complex, 2H, CH2CH 2CH2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.25-2.44 (complex, 4H, ArCH2 and NCH2), 2.50 (t, J = 7.8 Hz, 2H, ArCH2), 2.67-2.74 (m, 2H), 2.89 (s, 6H, N(CH3)2), 3.85-3.91 (br m, 2H, HNCH 2CH2O), 4.28 (t, J = 5 Hz, 2H, ArOCH2), 6.27 (d, J = 8.5 Hz, 1H, ArH), 6.67 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.84 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.03 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.12 (d, J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 8.50 (d, J = 8.5 Hz, 2H, ArH).
【0105】
［化合物１０の合成］
＜実施例１０＞
以下に記載する手順で、化合物１０を合成した。
＜実施例１０＞
以下に記載する手順で、化合物１０を合成した。
【0106】
ＡＴＴＯ５６５（ＮＨＳエステル）Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、5-(2-aminoethoxy)-N-(3-(4-(dimethylamino)phenyl)propyl)-N-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-amineから調製した。１ｍｇのＡＴＴＯ５６５（ＮＨＳエステル）と等ｍｏｌの4-(3-{[4-(2-aminoethoxy)benzyl]methylamino}propyl)-N,N-dimethylanilineを０．１ｍＬのアセトニトリル中で混合し１６時間反応させた。反応溶液を減圧濃縮し、残渣を逆層ＰＬＣ（ＯＤＳ、水／アセトニトリル＝１／５０）で精製し、赤褐色固体の化合物１０を得た。
【0107】
［化合物１１の合成］
＜実施例１１＞
以下に記載する手順で、化合物１１を合成した。
＜実施例１１＞
以下に記載する手順で、化合物１１を合成した。
【0108】
3-(4-methylphenyl)propan-1-amineを用いて、化合物１の合成と同様の手法により化合物１１を合成した。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ: 1.75-1.85 (br, 2H, ArCH2CH 2), 1.96-2.1 (m, 2H, ArCH2CH 2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.30 (s, 3H, ArCH3), 2.37-2.68 (complex, 4H, NCH2 and ArCH2), 2.71-2.93 (complex, 2H, ArCH2), 3.86-3.93 (br, 2H, HNCH 2), 4.30 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.34-4.42 (br, 1H, ArCHN), 6.29 (d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.76 (s, 1H, ArH), 6.76-6.79 (m, 1H, ArH), 7.02-7.09 (complex, 5H, ArH), 8.51(d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ: 1.75-1.85 (br, 2H, ArCH2CH 2), 1.96-2.1 (m, 2H, ArCH2CH 2), 2.16 (s, 3H, NCH3), 2.30 (s, 3H, ArCH3), 2.37-2.68 (complex, 4H, NCH2 and ArCH2), 2.71-2.93 (complex, 2H, ArCH2), 3.86-3.93 (br, 2H, HNCH 2), 4.30 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.34-4.42 (br, 1H, ArCHN), 6.29 (d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.76 (s, 1H, ArH), 6.76-6.79 (m, 1H, ArH), 7.02-7.09 (complex, 5H, ArH), 8.51(d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH).
【0109】
［化合物１２の合成］
＜実施例１２＞
以下に記載する手順で、化合物１２を合成した。
＜実施例１２＞
以下に記載する手順で、化合物１２を合成した。
【0110】
3-(4-methoxyphenyl)propan-1-amineを用いて、化合物１の合成と同様の手法により化合物１２を合成した。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ: 1.7-1.9 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 2.0-2.1 (m, 2H, ArCH2CH 2), 2.21 (s, 3H, NCH3), 2.4-2.67 (complex, 4H, NCH2 and ArCH2), 2.73-2.94 (complex, 2H, ArCH2), 3.77 (s, 3H, OCH3), 3.88-3.93 (br, 2H, HNCH 2), 4.30 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.37-4.48 (m, 1H, ArCHN), 6.29 (d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.76 (s, 1H, ArH), 6.77-6.83 (m, 1H, ArH), 6.8 (d, J = 8.5 Hz, 2H, ArH), 7.04-7.1 (complex, 1H, ArH), 7.07 (d, J = 8.5 Hz, 2H, ArH), 8.51(d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ: 1.7-1.9 (complex, 2H, ArCH2CH 2), 2.0-2.1 (m, 2H, ArCH2CH 2), 2.21 (s, 3H, NCH3), 2.4-2.67 (complex, 4H, NCH2 and ArCH2), 2.73-2.94 (complex, 2H, ArCH2), 3.77 (s, 3H, OCH3), 3.88-3.93 (br, 2H, HNCH 2), 4.30 (t, J = 5 Hz, 2H, OCH2), 4.37-4.48 (m, 1H, ArCHN), 6.29 (d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.76 (s, 1H, ArH), 6.77-6.83 (m, 1H, ArH), 6.8 (d, J = 8.5 Hz, 2H, ArH), 7.04-7.1 (complex, 1H, ArH), 7.07 (d, J = 8.5 Hz, 2H, ArH), 8.51(d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH).
【0111】
［化合物１および抗ＣＤ６３抗体による細胞内小胞の蛍光染色］
＜実施例１３＞
実施例１で合成した化合物１および抗ＣＤ６３抗体によって細胞内小胞の蛍光染色を行った。手順を以下に示す。
（１）ガラスボトムディッシュ（マツナミ）にマウス悪性黒色腫細胞Ｂ１６Ｆ１０（理研細胞バンクより入手）３×１０4個を捲いて、２４時間培養した。培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）のＨｉｇｈグルコース（Ｄ６０４６（Ｍｅｒｃｋ））に１×ペニシリン・ストレプトマイン（２６２５２－９４（ナカライテクス））と１０％牛胎児血清（ニチレイ）を添加したものを用いた。培養は３７℃、５％ＣＯ2で行った。
（２）化合物１を最終濃度が０．３μＭとなるように培地に添加した。
（３）化合物１を添加して５分後に培地を吸引除去し、４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液（０９１５４－１４（ナカライテクス））１ｍＬを添加し、室温で１５分固定した。
（４）４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液を吸引除去後、リン酸緩衝液を１ｍＬ添加した。
（５）ＤＡＰＩ（Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ（登録商標）ＤＡＰＩ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（同仁化学研究所））を１μＬ添加し、１５分放置し核を蛍光染色した。
（６）リン酸緩衝液を吸引除去し、リン酸緩衝液で洗浄する作業を３回行った。
（７）洗浄後、１０％ＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ(ナカライテスク)／リン酸緩衝液に抗ＣＤ６３抗体(Ｄ２６３－３（ＭＢＬ）)を１／１０００希釈した反応液１ｍＬを加え、１時間室温に放置した。
（８）リン酸緩衝液を吸引除去し、リン酸緩衝液で洗浄する作業を３回行った。
（９）洗浄後に、１０％ＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ／リン酸緩衝液に抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ(Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４)(ａｂ１５０１１６（Ａｂｃａｍ)）を１／１０００希釈した反応液１ｍＬを加え、１時間室温に放置した。
（１０）リン酸緩衝液を吸引除去し、リン酸緩衝液で洗浄する作業を４回行った。
（１１）蛍光顕微鏡(ＢＺ－９０００（キーエンス））により測定した。なお、測定において化合物１は４７０ｎｍで励起し、ＣＤ６３に結合した抗体は５４０ｎｍで励起した。また、ＤＡＰＩは３６０ｎｍで励起した。
＜実施例１３＞
実施例１で合成した化合物１および抗ＣＤ６３抗体によって細胞内小胞の蛍光染色を行った。手順を以下に示す。
（１）ガラスボトムディッシュ（マツナミ）にマウス悪性黒色腫細胞Ｂ１６Ｆ１０（理研細胞バンクより入手）３×１０4個を捲いて、２４時間培養した。培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）のＨｉｇｈグルコース（Ｄ６０４６（Ｍｅｒｃｋ））に１×ペニシリン・ストレプトマイン（２６２５２－９４（ナカライテクス））と１０％牛胎児血清（ニチレイ）を添加したものを用いた。培養は３７℃、５％ＣＯ2で行った。
（２）化合物１を最終濃度が０．３μＭとなるように培地に添加した。
（３）化合物１を添加して５分後に培地を吸引除去し、４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液（０９１５４－１４（ナカライテクス））１ｍＬを添加し、室温で１５分固定した。
（４）４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液を吸引除去後、リン酸緩衝液を１ｍＬ添加した。
（５）ＤＡＰＩ（Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ（登録商標）ＤＡＰＩ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（同仁化学研究所））を１μＬ添加し、１５分放置し核を蛍光染色した。
（６）リン酸緩衝液を吸引除去し、リン酸緩衝液で洗浄する作業を３回行った。
（７）洗浄後、１０％ＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ(ナカライテスク)／リン酸緩衝液に抗ＣＤ６３抗体(Ｄ２６３－３（ＭＢＬ）)を１／１０００希釈した反応液１ｍＬを加え、１時間室温に放置した。
（８）リン酸緩衝液を吸引除去し、リン酸緩衝液で洗浄する作業を３回行った。
（９）洗浄後に、１０％ＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ／リン酸緩衝液に抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ(Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４)(ａｂ１５０１１６（Ａｂｃａｍ)）を１／１０００希釈した反応液１ｍＬを加え、１時間室温に放置した。
（１０）リン酸緩衝液を吸引除去し、リン酸緩衝液で洗浄する作業を４回行った。
（１１）蛍光顕微鏡(ＢＺ－９０００（キーエンス））により測定した。なお、測定において化合物１は４７０ｎｍで励起し、ＣＤ６３に結合した抗体は５４０ｎｍで励起した。また、ＤＡＰＩは３６０ｎｍで励起した。
【0112】
図１に結果を示す。図１Ａは、細胞全体の蛍光顕微鏡像である。図１Ｂは、図１Ａの枠で囲まれた箇所を拡大したものである。化合物１は緑色の蛍光を発し、ＣＤ６３に結合した抗体は赤色の蛍光を発した。図１から、化合物１およびＣＤ６３に結合した抗体から蛍光が発せられていることが示された。そして、図１Ａおよび図１Ｂから、化合物１からの蛍光とＣＤ６３に結合した抗体からの蛍光が重なっていた。ＣＤ６３は、エンドソーム由来の細胞性小胞のマーカーである。したがって、図１の結果から、化合物１が、細胞性小胞を蛍光染色できることが示された。
【0113】
［化合物１によるオートファゴソームの検出］
＜実施例１４＞
エンドソーム由来細胞内小胞形成阻害剤（ＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤）を用いてオートファゴソームの検出を行った。手順を以下に示す。
（１）ガラスボトムディッシュにＢ１６Ｆ１０細胞３×１０4個を捲いて、２４時間培養した。
（２）化合物１を最終濃度が３μＭになるように添加した。
（３）蛍光顕微鏡により測定した。なお、測定は４７０ｎｍで励起した。
（４）その後、ＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤（ＨＹ－１３２２８（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ））を最終濃度が１０μＭとなるように培地中へ添加し、１時間培養した。
（５）蛍光顕微鏡により測定した。
（６）ＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤含有培地を吸引除去し、新たな培地で洗浄操作を２回行い、さらに新たな培地で３時間培養した。
（７）蛍光顕微鏡により測定した。
＜実施例１４＞
エンドソーム由来細胞内小胞形成阻害剤（ＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤）を用いてオートファゴソームの検出を行った。手順を以下に示す。
（１）ガラスボトムディッシュにＢ１６Ｆ１０細胞３×１０4個を捲いて、２４時間培養した。
（２）化合物１を最終濃度が３μＭになるように添加した。
（３）蛍光顕微鏡により測定した。なお、測定は４７０ｎｍで励起した。
（４）その後、ＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤（ＨＹ－１３２２８（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ））を最終濃度が１０μＭとなるように培地中へ添加し、１時間培養した。
（５）蛍光顕微鏡により測定した。
（６）ＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤含有培地を吸引除去し、新たな培地で洗浄操作を２回行い、さらに新たな培地で３時間培養した。
（７）蛍光顕微鏡により測定した。
【0114】
図２に結果を示す。図２Ａは、ＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤添加前の化合物１が発する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像である。図２Ｂは、ＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤添加前の位相差顕微鏡像である。図２Ｃは、ＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤添加後の化合物１が発する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像である。図２Ｄは、ＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤添加後の位相差顕微鏡像である。図２Ｅは、ＰＩＫｆｙｖｅ除去後細胞を３時間培養した後の化合物１が発する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像である。図２Ｆは、ＰＩＫｆｙｖｅ除去後細胞を３時間培養した後の位相差顕微鏡像である。図２Ａから細胞内に細胞性小胞が存在し、図２Ｂからメラノソームが細胞内に存在していることがわかる。ＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤を添加すると図２Ｃおよび図２Ｄに示されるように、蛍光強度の低下およびメラノソームの破壊・泡沫化がみられた。このことからＰＩＫｆｙｖｅ依存的な細胞性小胞についても化合物１は蛍光染色できることが示された。そして、図２Ｅおよび図２ＦからＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤を除去した後の細胞では、メラノソームの周りを包むオートファゴソーム膜が化合物１によって蛍光染色された。オートファゴソーム膜はエンドソーム由来である。したがって、ＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤を用いた場合でも化合物１がエンドソーム由来の細胞性小胞を蛍光染色できることが示された。
【0115】
［ヒト細胞における細胞性小胞の蛍光染色］
実施例１３および実施例１４から、化合物１がマウス由来の細胞の細胞性小胞を蛍光染色することが示された。そこで、ヒト由来の細胞についても蛍光染色を行った。
＜実施例１５＞
化合物１を用いてＨＥＫ２９３細胞の細胞性小胞を蛍光染色した。以下に手順を示す。
（１）ガラスボトムディッシュにＨＥＫ２９３Ａ細胞(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ)を捲いて、２４時間培養した。培地はＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｄ６０４６（Ｍｅｒｃｋ））に１０％ＦＣＳ、１×ペニシリンストレプトマイシンを添加しものを用いた。
（２）化合物１を最終濃度が０．３μＭになるように添加した。
（３）蛍光顕微鏡により測定した。なお、測定は４７０ｎｍで励起した。
実施例１３および実施例１４から、化合物１がマウス由来の細胞の細胞性小胞を蛍光染色することが示された。そこで、ヒト由来の細胞についても蛍光染色を行った。
＜実施例１５＞
化合物１を用いてＨＥＫ２９３細胞の細胞性小胞を蛍光染色した。以下に手順を示す。
（１）ガラスボトムディッシュにＨＥＫ２９３Ａ細胞(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ)を捲いて、２４時間培養した。培地はＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｄ６０４６（Ｍｅｒｃｋ））に１０％ＦＣＳ、１×ペニシリンストレプトマイシンを添加しものを用いた。
（２）化合物１を最終濃度が０．３μＭになるように添加した。
（３）蛍光顕微鏡により測定した。なお、測定は４７０ｎｍで励起した。
【0116】
＜実施例１６＞
化合物１を用いてケラチノサイト細胞（ＰＳＶＫ１）の細胞性小胞を蛍光染色した。以下に手順を示す。
（１）ガラスボトムディッシュにＰＳＶＫ１細胞（医薬基盤・健康・栄養研究所 細胞バンクから入手）を捲いて、２４時間培養した。培地はＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ２ Ｋｉｔ（Ｃ－２０１１１（ＴＡＫＡＲＡバイオ））を用いた。
（２）化合物１を最終濃度が０．３μＭになるように添加した。
（３）蛍光顕微鏡により測定した。なお、測定は４７０ｎｍで励起した。
化合物１を用いてケラチノサイト細胞（ＰＳＶＫ１）の細胞性小胞を蛍光染色した。以下に手順を示す。
（１）ガラスボトムディッシュにＰＳＶＫ１細胞（医薬基盤・健康・栄養研究所 細胞バンクから入手）を捲いて、２４時間培養した。培地はＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ２ Ｋｉｔ（Ｃ－２０１１１（ＴＡＫＡＲＡバイオ））を用いた。
（２）化合物１を最終濃度が０．３μＭになるように添加した。
（３）蛍光顕微鏡により測定した。なお、測定は４７０ｎｍで励起した。
【0117】
図３に結果を示す。図３Ａは、実施例１５の蛍光顕微鏡像である。図３Ｂは、実施例１６の蛍光顕微鏡像である。図３Ａおよび図３Ｂから、化合物１がヒト細胞であるＨＥＫ２９３細胞の細胞性小胞およびＰＳＶＫ１細胞の細胞性小胞を蛍光染色できることが示された。
【0118】
［化合物１の細胞性小胞に対する特異性１］
＜実施例１７＞
化合物１による生細胞の細胞性小胞の蛍光染色を行った。以下に手順を示す。
（１）コラーゲンコートガラスボトムディッシュ（マツナミ）にＢ１６Ｆ１０細胞３×１０4個を捲いて、２４時間培養した。
（２）ミトコンドリア染色試薬(ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））を培地に最終濃度が１μＭとなるように添加しミトコンドリアを蛍光染色した。
（３）５分後に培地を吸引除去し、４％パラホルムアルデヒド/リン酸緩衝液を添加し、室温で１５分固定した。
（４）４％パラホルムアルデヒド/リン酸緩衝液を吸引除去し、リン酸緩衝液を１ｍＬ添加した。
（５）ＤＡＰＩを１μＬ添加し、１５分放置し核を蛍光染色した。
（６）リン酸緩衝液を吸引除去し、リン酸緩衝液で洗浄する作業を５回行った。
（７）洗浄後、ＤＭＥＭ培地を２ｍＬ加えた。
（８）新たにＢ１６Ｆ１０細胞３×１０4個を捲いて、２４時間培養した。
（９）化合物１を最終濃度が０．３μＭになるように添加した。
（１０）蛍光顕微鏡により測定した。なお、測定において化合物１は４７０ｎｍで励起し、ミトコンドリア染色試薬は５４０ｎｍで励起し、ＤＡＰＩは３６０ｎｍで励起した。
＜実施例１７＞
化合物１による生細胞の細胞性小胞の蛍光染色を行った。以下に手順を示す。
（１）コラーゲンコートガラスボトムディッシュ（マツナミ）にＢ１６Ｆ１０細胞３×１０4個を捲いて、２４時間培養した。
（２）ミトコンドリア染色試薬(ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））を培地に最終濃度が１μＭとなるように添加しミトコンドリアを蛍光染色した。
（３）５分後に培地を吸引除去し、４％パラホルムアルデヒド/リン酸緩衝液を添加し、室温で１５分固定した。
（４）４％パラホルムアルデヒド/リン酸緩衝液を吸引除去し、リン酸緩衝液を１ｍＬ添加した。
（５）ＤＡＰＩを１μＬ添加し、１５分放置し核を蛍光染色した。
（６）リン酸緩衝液を吸引除去し、リン酸緩衝液で洗浄する作業を５回行った。
（７）洗浄後、ＤＭＥＭ培地を２ｍＬ加えた。
（８）新たにＢ１６Ｆ１０細胞３×１０4個を捲いて、２４時間培養した。
（９）化合物１を最終濃度が０．３μＭになるように添加した。
（１０）蛍光顕微鏡により測定した。なお、測定において化合物１は４７０ｎｍで励起し、ミトコンドリア染色試薬は５４０ｎｍで励起し、ＤＡＰＩは３６０ｎｍで励起した。
【0119】
図４に結果を示す。図４Ａは、化合物１が発する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像である。図４Ｂは、ミトコンドリア染色試薬が発する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像である。図４Ｃは、核を染色するＤＡＰＩが発する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像である。図４Ｄは、位相差顕微鏡像である。図４Ｄから顕微鏡像の全体に細胞は存在しているものの、図４Ａでは、一部の細胞の細胞性小胞しか蛍光染色されていなかった。図４Ｂおよび図４Ｃの矢印にあるように、図４Ａにおいて化合物１によって細胞性小胞が蛍光染色されなかった細胞は、死細胞であった。したがって、化合物１は、生細胞の細胞性小胞を蛍光染色することが示された。
【0120】
［化合物１の細胞性小胞に対する特異性２］
化合物１と他の細胞性小胞染色剤による細胞性小胞の蛍光染色を行い比較した。
化合物１と他の細胞性小胞染色剤による細胞性小胞の蛍光染色を行い比較した。
【0121】
＜実施例１８＞
化合物１により細胞内小胞の蛍光染色を行った。以下に手順を示す。
（１）ガラスボトムディッシュにＢ１６Ｆ１０細胞３×１０4個を捲いて、２４時間培養した。
（２）化合物１を最終濃度が３μＭとなるように培地に添加した。
（３）蛍光顕微鏡により測定した。なお、測定は４７０ｎｍで励起した。
化合物１により細胞内小胞の蛍光染色を行った。以下に手順を示す。
（１）ガラスボトムディッシュにＢ１６Ｆ１０細胞３×１０4個を捲いて、２４時間培養した。
（２）化合物１を最終濃度が３μＭとなるように培地に添加した。
（３）蛍光顕微鏡により測定した。なお、測定は４７０ｎｍで励起した。
【0122】
＜比較例１＞
化合物１に換えてＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｍｅｍ Ｄｙｅ－Ｒｅｄ(３４０－０９６７１（同仁化学研究所））１μＬ／ｍＬを培地に添加し、ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｍｅｍ Ｄｙｅ－Ｒｅｄ添加後、培地を吸引除去し、新たな培地を加え洗浄した以外は、実施例１８と同様である。なお、測定は５４０ｎｍで励起した。
化合物１に換えてＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｍｅｍ Ｄｙｅ－Ｒｅｄ(３４０－０９６７１（同仁化学研究所））１μＬ／ｍＬを培地に添加し、ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｍｅｍ Ｄｙｅ－Ｒｅｄ添加後、培地を吸引除去し、新たな培地を加え洗浄した以外は、実施例１８と同様である。なお、測定は５４０ｎｍで励起した。
【0123】
図５に結果を示す。図５Ａは、実施例１８と比較例１の蛍光顕微鏡像を重ねたものである。図５Ｂは、実施例１８の蛍光顕微鏡像である。図５Ｃは、比較例１の蛍光顕微鏡像である。図５から、実施例１８および比較例１は、細胞性小胞を蛍光染色していることが示された。しかしながら、図５Ａおよび図５Ｂから実施例１８は、細胞性小胞のみを蛍光染色しているのに対し、比較例１は図５Ａの矢印にあるように、染色後に洗浄しているにもかかわらず細胞性小胞以外のごみ等も蛍光染色していた。したがって、化合物１は細胞性小胞に対し高い特異性を有していることが示された。
【0124】
［化合物１の細胞性小胞に対する特異性３］
夾雑物が存在する中で化合物１と他の細胞性小胞染色剤による細胞性小胞の蛍光染色を行い比較した。
夾雑物が存在する中で化合物１と他の細胞性小胞染色剤による細胞性小胞の蛍光染色を行い比較した。
【0125】
＜実施例１９＞
夾雑物が存在した状態で化合物１により細胞内小胞の蛍光染色を行った。以下に手順を示す。
（１）マウスの糞約１００ｍｇを回収し、回収した糞を１０倍量(１ｍＬ)のリン酸緩衝液中に懸濁した。
（２）Ｂ１６Ｆ１０細胞をトリプシン・ＥＤＴＡ(ナカライテクス）にて剥離し回収し、１×１０4個の細胞を１００μLのリン酸緩衝液中に懸濁し、（１）のマウス糞懸濁液１０μＬと混合した。
（３）細胞と糞の懸濁液をガラスボトムディッシュ上に拡げ、３００μＭの化合物１を最終濃度が０．３μＭとなるように加えた。
（４）蛍光顕微鏡で測定した。なお、測定は４７０ｎｍで励起した。
夾雑物が存在した状態で化合物１により細胞内小胞の蛍光染色を行った。以下に手順を示す。
（１）マウスの糞約１００ｍｇを回収し、回収した糞を１０倍量(１ｍＬ)のリン酸緩衝液中に懸濁した。
（２）Ｂ１６Ｆ１０細胞をトリプシン・ＥＤＴＡ(ナカライテクス）にて剥離し回収し、１×１０4個の細胞を１００μLのリン酸緩衝液中に懸濁し、（１）のマウス糞懸濁液１０μＬと混合した。
（３）細胞と糞の懸濁液をガラスボトムディッシュ上に拡げ、３００μＭの化合物１を最終濃度が０．３μＭとなるように加えた。
（４）蛍光顕微鏡で測定した。なお、測定は４７０ｎｍで励起した。
【0126】
＜比較例２＞
化合物１に換えてＣｅｌｌＭａｓｋ試薬(Ｃ１００４５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））１μＬを細胞と糞の懸濁液に添加したこと以外は実施例１９と同様である。なお、測定は５４０ｎｍで励起した。
化合物１に換えてＣｅｌｌＭａｓｋ試薬(Ｃ１００４５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））１μＬを細胞と糞の懸濁液に添加したこと以外は実施例１９と同様である。なお、測定は５４０ｎｍで励起した。
【0127】
図６に結果を示す。図６Ａは、実施例１９の蛍光顕微鏡像である。図６Ｂは、実施例１９の位相差顕微鏡像である。図６Ｃは、比較例２の蛍光顕微鏡像である。図６Ｄは、比較例２の位相差顕微鏡像である。図６Ａおよび図６Ｂから、夾雑物が存在していても実施例１９は、細胞性小胞のみを蛍光染色していることが示された。また、図６Ｃおよび図６Ｄから、比較例２は、細胞性小胞以外の夾雑物まで蛍光染色していた。マウス糞には生きた腸内細菌や食物消化物が大量に含まれるが、化合物１は腸内細菌や食物消化物には反応せず、細胞性小胞を特異的に蛍光染色できることが示された。
【0128】
［エクソソームの蛍光染色］
＜実施例２０＞
細胞外の小胞であるエクソソームの蛍光染色を行った。手順を以下に示す。
（１）ＤＭＳＯに溶解した化合物１を最終濃度が０．３μＭになるようにリン酸緩衝液に溶解した。
（２）化合物１が溶解したリン酸緩衝液にミルクエクソソーム１０ｎｇを添加した。
（３）画像解析装置ＣｈｅｍｉＤｏｃ（バイオラッド）により測定を行った。なお、測定は３０２ｎｍで励起した。
＜実施例２０＞
細胞外の小胞であるエクソソームの蛍光染色を行った。手順を以下に示す。
（１）ＤＭＳＯに溶解した化合物１を最終濃度が０．３μＭになるようにリン酸緩衝液に溶解した。
（２）化合物１が溶解したリン酸緩衝液にミルクエクソソーム１０ｎｇを添加した。
（３）画像解析装置ＣｈｅｍｉＤｏｃ（バイオラッド）により測定を行った。なお、測定は３０２ｎｍで励起した。
【0129】
＜比較例３＞
ミルクエクソソームを添加しなかったこと以外は、実施例２０と同様である。
ミルクエクソソームを添加しなかったこと以外は、実施例２０と同様である。
【0130】
図７に結果を示す。図７に示すように、ミルクエクソソームを添加した実施例２０は、蛍光を発した。一方で、比較例３は、蛍光を発さなかった。したがって、化合物１は、細胞性小胞であるエクソソームに結合することで蛍光を発することが示された。
【0131】
［エクソソーム検出における検量線の作成］
＜実施例２１＞
エクソソーム検出における検量線を作成した。以下に手順を示す。
（１）牛胎児血清５０μＬとリン酸緩衝液５０μＬを混合した溶液を蛍光用９６穴マイクロプレート(３－３３２１－０３（アズワン））のウェルに入れた。
（２）０．１～１ｎｇの範囲でミルクエクソソームを各ウェルに加えた。
（３）蛍光プレートリーダー（ＧｒｏＭａｘ Ｍｕｌｔｉ（プロメガ）)で自家蛍光（励起４８８ｎｍ)を測定した。
（４）各ウェルに化合物１を最終濃度が０．３μＭになるよう添加して、蛍光（励起４８８ｎｍ)を測定した。その際、得られた蛍光強度から自家蛍光強度を引いたものを測定値とした。
＜実施例２１＞
エクソソーム検出における検量線を作成した。以下に手順を示す。
（１）牛胎児血清５０μＬとリン酸緩衝液５０μＬを混合した溶液を蛍光用９６穴マイクロプレート(３－３３２１－０３（アズワン））のウェルに入れた。
（２）０．１～１ｎｇの範囲でミルクエクソソームを各ウェルに加えた。
（３）蛍光プレートリーダー（ＧｒｏＭａｘ Ｍｕｌｔｉ（プロメガ）)で自家蛍光（励起４８８ｎｍ)を測定した。
（４）各ウェルに化合物１を最終濃度が０．３μＭになるよう添加して、蛍光（励起４８８ｎｍ)を測定した。その際、得られた蛍光強度から自家蛍光強度を引いたものを測定値とした。
【0132】
各エクソソーム濃度で蛍光強度を測定し、その結果から作成した検量線を図８に示す。牛胎児血清中にもエクソソームが含まれるが、外部から加えたミルクエクソソーム量に依存して蛍光強度が増加することが示された。したがって、図８の検量線から夾雑物存在下でも１ｎｇのエクソソームを検出できる。
【0133】
［食品中のエクソソーム測定］
実施例２１で得られた検量線を用いて、食品中のエクソソームを測定した。
＜実施例２２＞
ブラックコーヒー中に含まれるエクソソームを測定した。以下に手順を示す。
（１）ブラックコーヒー（ＵＣＣ）５０μＬとリン酸緩衝液５０μＬを混合した溶液を蛍光用９６穴マイクロプレートのウェルに入れた。
（２）蛍光プレートリーダーで自家蛍光（励起４８８ｎｍ)を測定した。
（３）ウェルに化合物１を最終濃度が０．３μＭになるよう添加して、蛍光（励起４８８ｎｍ)を測定した。その際、得られた蛍光強度から自家蛍光強度を引いたものを測定値とした。
実施例２１で得られた検量線を用いて、食品中のエクソソームを測定した。
＜実施例２２＞
ブラックコーヒー中に含まれるエクソソームを測定した。以下に手順を示す。
（１）ブラックコーヒー（ＵＣＣ）５０μＬとリン酸緩衝液５０μＬを混合した溶液を蛍光用９６穴マイクロプレートのウェルに入れた。
（２）蛍光プレートリーダーで自家蛍光（励起４８８ｎｍ)を測定した。
（３）ウェルに化合物１を最終濃度が０．３μＭになるよう添加して、蛍光（励起４８８ｎｍ)を測定した。その際、得られた蛍光強度から自家蛍光強度を引いたものを測定値とした。
【0134】
＜実施例２３＞
ブラックコーヒーに換えてミルク入りコーヒー（アサヒ）としたこと以外は、実施例２２と同様である。
ブラックコーヒーに換えてミルク入りコーヒー（アサヒ）としたこと以外は、実施例２２と同様である。
【0135】
＜実施例２４＞
ブラックコーヒーに換えて乳酸菌飲料（ヤクルト）としたこと以外は、実施例２２と同様である。
ブラックコーヒーに換えて乳酸菌飲料（ヤクルト）としたこと以外は、実施例２２と同様である。
【0136】
＜実施例２５＞
ブラックコーヒーに換えて１％スキムミルク（フジフイルムワコー）としたこと以外は、実施例２２と同様である。
ブラックコーヒーに換えて１％スキムミルク（フジフイルムワコー）としたこと以外は、実施例２２と同様である。
【0137】
＜実施例２６＞
ブラックコーヒーに換えて牛乳（明治）としたこと以外は、実施例２２と同様である。
ブラックコーヒーに換えて牛乳（明治）としたこと以外は、実施例２２と同様である。
【0138】
＜実施例２７＞
ブラックコーヒーに換えて野菜ジュース（カゴメ）としたこと以外は、実施例２２と同様である。
ブラックコーヒーに換えて野菜ジュース（カゴメ）としたこと以外は、実施例２２と同様である。
【0139】
【0140】
［化合物１およびエクソソーム染色試薬によるラベル化エクソソームの細胞内への取り込み］
＜実施例２８＞
化合物１およびエクソソーム染色試薬によって蛍光染色されたラベル化エクソソームの細胞内への取り込みを測定した。手順を以下に示す。
（１）ミルクエクソソーム（ＥＸＯ－ＡＢ－０１（コスモバイオ））を化合物１(最終濃度０．３μＭ)とＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｍｅｍ Ｄｙｅ－Ｒｅｄ(３４０－０９６７１（同仁化学研究所））（１μＬ）で５分間染色した後、ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｍｅｍ Ｄｙｅ－Ｒｅｄに付属のカラムで精製し、ラベル化ミルクエクソソームを作成した。
（２）ＨＥＫ２９３Ａ細胞を培養し、ラベル化ミルクエクソソームを加えた。
（３）ラベル化ミルクエクソソームを加えてから１２時間後に蛍光顕微鏡によって測定した。なお、測定において化合物１は４７０ｎｍで励起し、ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｍｅｍ Ｄｙｅ－Ｒｅｄは５４０ｎｍで励起した。
＜実施例２８＞
化合物１およびエクソソーム染色試薬によって蛍光染色されたラベル化エクソソームの細胞内への取り込みを測定した。手順を以下に示す。
（１）ミルクエクソソーム（ＥＸＯ－ＡＢ－０１（コスモバイオ））を化合物１(最終濃度０．３μＭ)とＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｍｅｍ Ｄｙｅ－Ｒｅｄ(３４０－０９６７１（同仁化学研究所））（１μＬ）で５分間染色した後、ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｍｅｍ Ｄｙｅ－Ｒｅｄに付属のカラムで精製し、ラベル化ミルクエクソソームを作成した。
（２）ＨＥＫ２９３Ａ細胞を培養し、ラベル化ミルクエクソソームを加えた。
（３）ラベル化ミルクエクソソームを加えてから１２時間後に蛍光顕微鏡によって測定した。なお、測定において化合物１は４７０ｎｍで励起し、ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｍｅｍ Ｄｙｅ－Ｒｅｄは５４０ｎｍで励起した。
【0141】
図１０に結果を示す。図１０Ａは、化合物１およびＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｍｅｍ Ｄｙｅ－Ｒｅｄ両方が発する蛍光を重ねた蛍光顕微鏡像である。図１０Ｂは、化合物１が発する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像である。図１０Ｃは、ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｍｅｍ Ｄｙｅ－Ｒｅｄが発する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像である。ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｍｅｍ Ｄｙｅ－Ｒｅｄはエクソソームに結合する蛍光試薬である。図１０Ａから、化合物１の蛍光とＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ Ｍｅｍ Ｄｙｅ－Ｒｅｄの蛍光が重なることから、化合物１はエクソソームについても特異的に結合していることが示された。また、化合物１でラベル化したエクソソームが細胞内に取り込まれることも示された。
【0142】
［ラベル化メラノソームの細胞取り込み阻害］
＜実施例２９＞
メラノソーム取り込み阻害剤の存在下で、メラノソームの細胞への取り込みを測定した。以下に手順を示す。
（１）Ｂ１６Ｆ１０細胞を１０ｍＬの培地で培養した。
（２）Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｆ０８５５（東京化成工業））を最終濃度２０μＭとなるように培地に添加し４８時間培養してメラニン合成誘導した。
（３）培地を吸引除去後、新鮮なＦｏｒｓｋｏｌｉｎ含有培地に交換し、さらに２４時間培養した。
（４）培地を１５ｍＬ遠心管に回収した後、３０００ｒｐｍで５分間遠心して混入細胞を沈殿させて除去し、上清を回収した。
（５）回収した上清を別の１５ｍＬ遠心管に移し、８０００ｒｐｍで１０分間遠心した。
（６）沈殿をリン酸緩衝液１ｍＬに懸濁し、２ｍＬの遠心チューブへ移した。
（７）１２０００ｒｐｍで５分間の遠心し、上清を捨て、沈殿をさらに１ｍＬのリン酸緩衝液で２回洗浄した。
（８）洗浄後の沈殿を１００μＬのリン酸緩衝液に懸濁し、化合物１を最終濃度が３μＭになるように添加して、５分間染色した。
（９）１２０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を捨て、沈殿を１ｍＬのリン酸緩衝液で２回洗浄した。
（１０）洗浄後の沈殿を１００μＬのリン酸緩衝液に懸濁しラベル化メラノサイトを作成した。
（１１）９６穴マイクロプレートのウェルにケラチノサイト細胞５×１０4個を捲いた。
（１２）ラベル化メラノサイト（１０μＬ）とメラノソーム取り込み阻害剤（最終濃度１０μＭ）をウェルに加えた。メラノソーム取り込み阻害剤として６－ショーガオール（１９２－１６１６１（フジフイルムワコー））を用いた。
（１３）１２時間後に細胞をリン酸緩衝液１００μLで２回洗浄した。
（１４）プレートリーダー（ＧｒｏＭａｘ Ｍｕｌｔｉ（プロメガ）)を用い、ラベル化メラノソームを測定した。なお、測定は４８８ｎｍで励起した。
＜実施例２９＞
メラノソーム取り込み阻害剤の存在下で、メラノソームの細胞への取り込みを測定した。以下に手順を示す。
（１）Ｂ１６Ｆ１０細胞を１０ｍＬの培地で培養した。
（２）Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｆ０８５５（東京化成工業））を最終濃度２０μＭとなるように培地に添加し４８時間培養してメラニン合成誘導した。
（３）培地を吸引除去後、新鮮なＦｏｒｓｋｏｌｉｎ含有培地に交換し、さらに２４時間培養した。
（４）培地を１５ｍＬ遠心管に回収した後、３０００ｒｐｍで５分間遠心して混入細胞を沈殿させて除去し、上清を回収した。
（５）回収した上清を別の１５ｍＬ遠心管に移し、８０００ｒｐｍで１０分間遠心した。
（６）沈殿をリン酸緩衝液１ｍＬに懸濁し、２ｍＬの遠心チューブへ移した。
（７）１２０００ｒｐｍで５分間の遠心し、上清を捨て、沈殿をさらに１ｍＬのリン酸緩衝液で２回洗浄した。
（８）洗浄後の沈殿を１００μＬのリン酸緩衝液に懸濁し、化合物１を最終濃度が３μＭになるように添加して、５分間染色した。
（９）１２０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を捨て、沈殿を１ｍＬのリン酸緩衝液で２回洗浄した。
（１０）洗浄後の沈殿を１００μＬのリン酸緩衝液に懸濁しラベル化メラノサイトを作成した。
（１１）９６穴マイクロプレートのウェルにケラチノサイト細胞５×１０4個を捲いた。
（１２）ラベル化メラノサイト（１０μＬ）とメラノソーム取り込み阻害剤（最終濃度１０μＭ）をウェルに加えた。メラノソーム取り込み阻害剤として６－ショーガオール（１９２－１６１６１（フジフイルムワコー））を用いた。
（１３）１２時間後に細胞をリン酸緩衝液１００μLで２回洗浄した。
（１４）プレートリーダー（ＧｒｏＭａｘ Ｍｕｌｔｉ（プロメガ）)を用い、ラベル化メラノソームを測定した。なお、測定は４８８ｎｍで励起した。
【0143】
＜比較例４＞
プレートリーダーでの測定を、４５０ｎｍにおける吸光度で行ったこと以外は、実施例２９と同様である。
プレートリーダーでの測定を、４５０ｎｍにおける吸光度で行ったこと以外は、実施例２９と同様である。
【0144】
結果を図１１に示す。図１１Ａは、実施例２９の蛍光顕微鏡像および比較例４の位相差顕微鏡像である。図１１Ｂは、実施例２９の結果を示す。図１１Ｃは、比較例４の結果を示す。図１１Ａおよび図１１Ｂから、メラノソーム取り込み阻害剤が存在しないと、ラベル化メラノソームは、ケラチノサイト細胞に取り込まれているが、メラノソーム取り込み阻害剤が存在すると、蛍光強度が低下していることからケラチノサイト細胞にラベル化メラノソームの取り込みが阻害されることが示された。一方で、比較例４での吸光度測定では、ケラチノサイトへのメラノソームの取り込みは評価ができなかった。したがって、化合物１を用いたことで、メラノソーム取り込み阻害剤によるケラチノサイトへのメラノソームの取り込みを評価できることが示された。
【0145】
［化合物２～化合物４、化合物６～化合物１２による細胞性小胞の蛍光染色］
＜実施例３０＞
化合物１に換えて化合物２としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
＜実施例３０＞
化合物１に換えて化合物２としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
【0146】
＜実施例３１＞
化合物１に換えて化合物３としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
化合物１に換えて化合物３としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
【0147】
＜実施例３２＞
化合物１に換えて化合物４としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
化合物１に換えて化合物４としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
【0148】
＜実施例３３＞
化合物１に換えて化合物６としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
化合物１に換えて化合物６としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
【0149】
＜実施例３４＞
化合物１に換えて化合物７としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
化合物１に換えて化合物７としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
【0150】
＜実施例３５＞
化合物１に換えて化合物８としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
化合物１に換えて化合物８としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
【0151】
＜実施例３６＞
化合物１に換えて化合物９としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
化合物１に換えて化合物９としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
【0152】
＜実施例３７＞
化合物１に換えて化合物１０とし、測定の際、励起光を５４０ｎｍとしたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
化合物１に換えて化合物１０とし、測定の際、励起光を５４０ｎｍとしたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
【0153】
＜実施例３８＞
化合物１に換えて化合物１１としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
化合物１に換えて化合物１１としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
【0154】
＜実施例３９＞
化合物１に換えて化合物１２としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
化合物１に換えて化合物１２としたこと以外は、実施例１４のＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤非添加と同様である。
【0155】
図１２に結果を示す。図１２Ａは、実施例３０の蛍光顕微鏡像である。図１２Ｂは、実施例３０の位相差顕微鏡像である。図１２Ｃは、実施例３１の蛍光顕微鏡像である。図１２Ｄは、実施例３２の蛍光顕微鏡像である。図１２Ｅは、実施例３３の蛍光顕微鏡像である。図１２Ｆは、実施例３４の蛍光顕微鏡像である。図１２Ｇは、実施例３５の蛍光顕微鏡像である。図１２Ｈは、実施例３６の蛍光顕微鏡像である。図１２Ｉは、実施例３７の蛍光顕微鏡像である。図１２Ｊは、実施例３８の蛍光顕微鏡像である。図１２Ｋは、実施例３９の蛍光顕微鏡像である。図１２Ａ、図１２Ｃ～図１２Ｋより、化合物２～化合物４、化合物６～化合物１２は、化合物１と同様に細胞性小胞を蛍光染色できることが示された。また、図１２Ａの蛍光強度と図１２Ｂの細胞内のメラニン量を測定することで、蛍光強度とメラニン量の相関が判定できる。このことから、細胞の品質評価を行えることが示唆された。
【0156】
［生細胞と死細胞に対する蛍光強度測定］
化合物１～化合物７の各化合物の生細胞と死細胞に対する蛍光強度を測定した。以下に手順を示す。
＜実施例４０＞
（１）Ｂ１６Ｆ１０細胞をトリプシン－ＥＤＴＡではがし、リン酸緩衝液に懸濁した。このとき死細胞作製には、３０％エタノールを加えた。
（２）生細胞懸濁液と死細胞懸濁液それぞれを２０００ｒｍｐで３分間、遠心分離して細胞を落とした。
（３）リン酸緩衝液で２回洗浄し、細胞をカウントした。この時点で生細胞懸濁液から得られた生細胞は７０％の生存率であった。
（４）細胞５×１０4個／１００μＬに最終濃度１μＬとなるように化合物１を添加し、蛍光（励起４８８ｎｍ)を測定した。その際、得られた蛍光強度から自家蛍光強度を引いたものをリン酸緩衝液のみの蛍光強度で割った値を測定値とした。
化合物１～化合物７の各化合物の生細胞と死細胞に対する蛍光強度を測定した。以下に手順を示す。
＜実施例４０＞
（１）Ｂ１６Ｆ１０細胞をトリプシン－ＥＤＴＡではがし、リン酸緩衝液に懸濁した。このとき死細胞作製には、３０％エタノールを加えた。
（２）生細胞懸濁液と死細胞懸濁液それぞれを２０００ｒｍｐで３分間、遠心分離して細胞を落とした。
（３）リン酸緩衝液で２回洗浄し、細胞をカウントした。この時点で生細胞懸濁液から得られた生細胞は７０％の生存率であった。
（４）細胞５×１０4個／１００μＬに最終濃度１μＬとなるように化合物１を添加し、蛍光（励起４８８ｎｍ)を測定した。その際、得られた蛍光強度から自家蛍光強度を引いたものをリン酸緩衝液のみの蛍光強度で割った値を測定値とした。
【0157】
＜実施例４１＞
化合物１に換えて化合物２としたこと以外は、実施例４０と同様である。
化合物１に換えて化合物２としたこと以外は、実施例４０と同様である。
【0158】
＜実施例４２＞
化合物１に換えて化合物３としたこと以外は、実施例４０と同様である。
化合物１に換えて化合物３としたこと以外は、実施例４０と同様である。
【0159】
＜実施例４３＞
化合物１に換えて化合物４としたこと以外は、実施例４０と同様である。
化合物１に換えて化合物４としたこと以外は、実施例４０と同様である。
【0160】
＜実施例４４＞
化合物１に換えて化合物５としたこと以外は、実施例４０と同様である。
化合物１に換えて化合物５としたこと以外は、実施例４０と同様である。
【0161】
＜実施例４５＞
化合物１に換えて化合物６としたこと以外は、実施例４０と同様である。
化合物１に換えて化合物６としたこと以外は、実施例４０と同様である。
【0162】
＜実施例４６＞
化合物１に換えて化合物７としたこと以外は、実施例４０と同様である。
化合物１に換えて化合物７としたこと以外は、実施例４０と同様である。
【0163】
＜比較例５＞
化合物１に換えて下記式で表される蛍光化合物としたこと以外は、実施例４０と同様である。
化合物１に換えて下記式で表される蛍光化合物としたこと以外は、実施例４０と同様である。
【化26】
【0164】
図１３に結果を示す。図１３から実施例４０～実施例４６において、いずれも生細胞の蛍光強度の方が高く、死細胞の蛍光強度との差も大きかった。一方で、比較例５は、生細胞の蛍光強度と死細胞の蛍光強度との差は小さかった。したがって、化合物１～化合物７が、生細胞の細胞性小胞に特異性を有していることが示された。
【0165】
［腫瘍移植マウスの血清中エクソソームの測定］
＜実施例４７＞
メラノーマ細胞を移植したマウスから血清を採取し、血清中のエクソソームを測定した。以下に手順を示す。
（１）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６（８Ｗ オス））の皮下にＢ１６Ｆ１０細胞５×１０4個を移植して、２週間後に腫瘍重量を測定した。
（２）マウスの血清を採取し、血清２０μＬとリン酸緩衝液８０μＬを混合した。
（３）血清とリン酸緩衝液の混合液に化合物１を最終濃度０．３μＭとなるように添加した。
（４）化合物１添加してから１５分後に蛍光顕微鏡で測定した。なお、測定は４８８ｎｍで励起した。
＜実施例４７＞
メラノーマ細胞を移植したマウスから血清を採取し、血清中のエクソソームを測定した。以下に手順を示す。
（１）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６（８Ｗ オス））の皮下にＢ１６Ｆ１０細胞５×１０4個を移植して、２週間後に腫瘍重量を測定した。
（２）マウスの血清を採取し、血清２０μＬとリン酸緩衝液８０μＬを混合した。
（３）血清とリン酸緩衝液の混合液に化合物１を最終濃度０．３μＭとなるように添加した。
（４）化合物１添加してから１５分後に蛍光顕微鏡で測定した。なお、測定は４８８ｎｍで励起した。
【0166】
【0167】
以上の実施例より、本出願で開示する化合物は、細胞性小胞に特異性が高く、細胞性小胞に未反応のものは蛍光を発さないことが示された。したがって、標識後に未反応の化合物を除く作業が必要なくサンプルロスを抑制できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【0168】
細胞性小胞の蛍光染色を行う分野において有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
