特許 7558160 抗ＣＤ７９ｂ抗体、その薬物複合体及びその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-19

(45)【発行日】2024-09-30

(54)【発明の名称】抗ＣＤ７９ｂ抗体、その薬物複合体及びその応用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/30 20060101AFI20240920BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240920BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240920BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 51/10 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 38/05 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 31/535 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240920BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20240920BHJP

【ＦＩ】

C07K16/30 ZNA

C07K16/46

C12N15/63 Z

A61K39/395 Y

A61K47/68

A61P35/00

A61P35/02

A61K38/02

A61K51/10 100

A61K31/704

A61K38/05

A61K31/535

C12N15/13

C12P21/08

【請求項の数】 23

(21)【出願番号】P 2021523617

(86)(22)【出願日】2019-10-31

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-17

(86)【国際出願番号】 CN2019114676

(87)【国際公開番号】W WO2020088587

(87)【国際公開日】2020-05-07

【審査請求日】2022-10-18

(31)【優先権主張番号】201811296100.8

(32)【優先日】2018-11-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】517399413

【氏名又は名称】ニューバイオ セラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001999

【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】ハン，ニアンヘ

(72)【発明者】

【氏名】ソン，リウェイ

(72)【発明者】

【氏名】アン，デキアン

(72)【発明者】

【氏名】ゼン，ディ

(72)【発明者】

【氏名】リ，フアリ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，チュン

【審査官】野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１０－５３３４９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５０５８４９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下のものを含むことを特徴とする抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメント。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ１；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ２；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ１；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されたアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ２；及び
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されたアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ３。

【請求項2】

上記の抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメントのＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示され、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されることを特徴とする請求項１に記載された抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項3】

上記の抗ＣＤ７９ｂ抗体は、モノクローナル抗体であり、及び／又は
上記の抗ＣＤ７９ｂ抗体は、ヒト化抗体又はキメラ抗体である
ことを特徴とする請求項１又は２に記載された抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

上記の抗ＣＤ７９ｂ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又は１１に示され、及び／又は上記の抗ＣＤ７９ｂ抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又は１２に示される；又は
上記の抗ＣＤ７９ｂ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３－１７のいずれか一つの配列に示されたアミノ酸配列から選ばれ、及び／又は上記の抗ＣＤ７９ｂ抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８－２２のいず
れか一つの配列に示されたアミノ酸配列から選ばれる
ことを特徴とする請求項１に記載された抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項5】

上記の抗ＣＤ７９ｂ抗体の重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、２７、２９、３１と３３のいずれか一つの配列に示されたアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選ばれ、及び／又は上記の抗ＣＤ７９ｂ抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２８、３０、３２と３４のいずれか一つの配列に示されたアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選ばれることを特徴とする請求項１に記載された抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項6】

上記の抗ＣＤ７９ｂ抗体は、以下の抗体から選ばれることを特徴とする請求項１に記載された抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメント：
（１）重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示され、軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示された抗体；
（２）重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示され、軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示された抗体；
（３）重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示され、軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示された抗体；
（４）重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示され、軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示された抗体；及び
（５）重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示され、軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示された抗体。

【請求項7】

複合体は、請求項１－６のいずれか一つに記載された抗体又はその抗原結合フラグメントと細胞毒性剤との複合体であることを特徴とする抗体－薬物複合体。

【請求項8】

上記の複合体の構造は、以下に示されたことを特徴とする請求項７に記載された抗体－薬物複合体：
Ａ－（Ｖ－Ｌ－Ｄ）ｎ
ただし、
Ａは、抗体である；
Ｖ－Ｌは、リンカーであり、Ｖは存在するかまたは存在しなく、ビスマレイミド又はテトラマレイミドリンカーコンポーネントであり、Ｌは存在するかまたは存在しなく、切断可能なリンカー又は切断不可能なリンカーである；ＶとＬの少なくとも１つが存在する；
Ｄは、興味ある細胞毒性剤である；及び
ｎは１－４の整数である。

【請求項9】

細胞毒性剤は、化学療法薬物、成長阻害剤、毒素又は放射性同位体であることを特徴とする請求項７又は８に記載された抗体－薬物複合体。

【請求項10】

請求項１－６のいずれか一つに記載された抗体又はそれと薬物の複合体、及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする薬物組成物。

【請求項11】

上記の薬物組成物は、請求項７－９のいずれか一つに記載された抗体－薬物複合体を含むことを特徴とする請求項１０に記載された薬物組成物。

【請求項12】

請求項１－６のいずれか一つに記載された抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列、又は該ポリヌクレオチド配列と相補する配列からなるポリヌク
レオチド分子。

【請求項13】

上記のポリヌクレオチド配列は、以下から選ばれることを特徴とする請求項１２に記載されたポリヌクレオチド分子。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６－３９のいずれか一つに示されたポリヌクレオチド配列；及び
（ｂ）（ａ）に記載されたポリヌクレオチド配列と相補する配列。

【請求項14】

請求項１－６のいずれか一つに記載された抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列又はその相補配列を含むベクター；ただし、上記のベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターである。

【請求項15】

請求項１－６のいずれか一つに記載された抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメント、又は上記の抗体又はその抗原結合フラグメントと薬物との複合体の、ＣＤ７９ｂに仲介された疾患を治療又は予防する薬物の調製における用途。

【請求項16】

前記複合体が、請求項７－９のいずれか一つに記載のものである、請求項１５に記載の用途のための抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項17】

前記疾患が造血系のがんである、請求項１５に記載の用途のための抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項18】

前記疾患がＢ細胞増殖性疾患である、請求項１５に記載の用途のための抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項19】

前記疾患がリンパ腫又は白血病である、請求項１５に記載の用途のための抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項20】

前記疾患が、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、攻撃性ＮＨＬ、再発性攻撃性ＮＨＬ、再発性無痛性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬ、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）又は急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）から選択される、請求項１５に記載の用途のための抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項21】

請求項１－６のいずれか一つに記載された抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメントの、ＣＤ７９ｂを発現する細胞の増加に関連する細胞増殖性疾患の診断試薬の調製における用途。

【請求項22】

第１の容器を有する製品であって、上記の第１の容器は、組成物を含み、当該組成物は、請求項１－６のいずれか一つに記載された抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメント、又は当該抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメントと薬物との複合体、又は上記の抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメント又は上記の複合体の薬物組成物を含む。

【請求項23】

製品は、さらに、第２の容器を含み、第２の容器には、薬学的に許容される緩衝液を収納する；又は
上記の組成物は、請求項１－６のいずれか一つに記載された抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、上記の製品は、さらに検出用の希釈剤、緩衝剤又はコントロール抗体を収納する容器を含む
ことを特徴とする請求項２２に記載された製品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本発明は、抗ＣＤ７９ｂ抗体、その薬物複合体及びその応用に関わる。

【背景技術】

【0002】

背景技術
ＣＤ７９ｂ（すなわち、ＩｇβまたはＢ２９）は、Ｂ細胞受容体のシグナル成分であり、ＣＤ７９ａ（すなわち、Ｉｇαまたはｍｂ－１）との共有結合ヘテロダイマーとして機能する。ＣＤ７９ｂは、細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ７９ｂの表面発現は、フローサイトメトリーを使用して、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）のほぼすべての患者で検出された。シグナル伝達機能に加えて、Ｂ細胞受容体と架橋すると、それは、Ｂ細胞によるクラスＩＩ抗原提示の一部として、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体コンパートメント（リソソーム様コンパートメント）に標的されている。

【0003】

ＣＤ７９ｂに対する抗体が内在化され、細胞毒性薬を放出できるプロテアーゼを含むことが知られているリソソームコンパートメントに送達されるため、ＣＤ７９ｂ生物学のこの特徴により、ＣＤ７９ｂは抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）の標的になる。抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）は、薬物を腫瘍へ標的化的に送達し、かつその中に細胞内蓄積を起こすことができる。ＡＤＣの治療指数（つまり、最高の有効性と最低の毒性）を向上するための努力は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の特異性、ならびに薬物連結特性と薬物放出特性に焦点を合わせてきた。

【0004】

ＮＨＬを臨床的に効果的に治療できるさまざまなＡＤＣ（ヒト化抗ＣＤ７９ｂ抗体（ヒト化ＳＮ８）がプロテアーゼ切断可能リンカーを介してモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）と結合してなるものなど）が調製された。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

発明の内容
本明細書が、抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその機能的フラグメント、その薬物組成物又は薬物複合体、及び血液腫瘍治療中におけるその使用を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

一方、本明細書が、以下を含む抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ１；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ２；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ３；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ１；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されたアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ２；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されたアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ３。

【0007】

一つまたは複数の実施の形態において、本明細書に記載された抗ＣＤ７９ｂ抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。

【0008】

一つまたは複数の実施の形態において、本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合
フラグメントのＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示され、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される；ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される；ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される。

【0009】

一つまたは複数の実施の形態において、本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又は１１に示され、及び／又は本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又は１２に示される。

【0010】

一つまたは複数の実施の形態において、本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３－１７のいずれか一つの配列に示されたアミノ酸配列から選べられ、及び／又は本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８－２２のいずれか一つの配列に示されたアミノ酸配列から選べられる。

【0011】

一つまたは複数の実施の形態において、本明細書の抗ＣＤ７８ｂ抗体は、以下を含む：（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、２７、２９、３１又は３３と少なくとも９０％、好ましくに少なくとも９５％、さらに好ましくに少なくとも９８％の配列同一性を有する重鎖；（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２８、３０、３２又は３４と少なくとも９０％、好ましくに少なくとも９５％、さらに好ましくに少なくとも９８％の配列同一性を有する軽鎖；又は（ｃ）（ａ）に記載された重鎖と（ｂ）に記載された軽鎖。

【0012】

一つまたは複数の実施の形態において、本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体の重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、２７、２９、３１と３３のいずれか一つの配列に示されたアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくに少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選べられ、及び／又は本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２８、３０、３２と３４のいずれか一つの配列に示されたアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくに少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選べられる。

【0013】

一つまたは複数の実施の形態において、本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体は、以下の抗体から選べられる：
（１）重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示され、軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示された抗体；
（２）重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示され、軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示された抗体；
（３）重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示され、軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示された抗体；
（４）重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示され、軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示された抗体；及び
（５）重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示され、軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示された抗体。

【0014】

もう一つの態様では、本明細書が、本明細書に記載された抗体と細胞毒性剤との複合体である抗体－薬物複合体を提供する。

【0015】

一つまたは複数の実施の形態において、上記の細胞毒性剤は、化学療法薬物、成長阻害剤、毒素又は放射性同位体である。

【0016】

もう一つの態様では、本明細書が、薬物組成物を提供し、上記の薬物組成物は、本明細書に記載された抗体又は抗体－薬物複合体、及び薬学的に許容される担体を含む。

【0017】

もう一つの態様では、本明細書が、容器と当該容器に収納された組成物を含む製品を提供し、ただし、上記の組成物は、一つ又は複数の本明細書に記載されたＣＤ７９ｂ抗体を含む。ある実施の形態において、上記の製品は、キットであって、それが、以下を含む：一つ又は複数の本明細書に記載されたＣＤ７９ｂ抗体を含む組成物を収納している第１の容器；及びバッファーを収納している第２の容器。

【0018】

もう一つの態様では、本明細書が、ＣＤ７９ｂに仲介された疾患を治療又は予防するための薬物の調製における本明細書に記載されたＣＤ７９ｂ抗体又はその抗原結合フラグメントの用途を提供する。ある実施の形態において、上記の疾患は、血液腫瘍、特にＢ細胞増殖性疾患である。ある実施の形態において、上記の疾患は、リンパ腫又は白血病である。ある実施の形態において、上記の疾患は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、攻撃性ＮＨＬ、再発性攻撃性ＮＨＬ、再発性無痛性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬ、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）又は急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）である。

【0019】

もう一つの態様では、本明細書が、ＣＤ７９ｂを発現する細胞の成長を抑制する方法を提供し、上記の方法は、上記の細胞を、本明細書に記載された抗体又は抗体－薬物複合体に接触させ、そして上記の細胞の成長に対する抑制を引き起こすことを含む。ある実施の形態において、上記の細胞は、Ｂ細胞である。

【0020】

もう一つの態様では、本明細書が、ＣＤ７９ｂに仲介された疾患を治療する方法を提供し、上記の方法は、必要とする哺乳動物に、治療有効量の本明細書に記載された抗体又は抗体－薬物複合体を投与することを含む。ある実施の形態において、上記のＣＤ７９ｂに仲介された疾患は、癌症である。

【0021】

もう一つの態様では、本明細書が、さらに、ＣＤ７９ｂを含む疑いのあるサンプルにおけるＣＤ７９ｂの存在状況を測定する方法を提供し、上記の方法は、上記のサンプルを、本明細書に記載された抗体に暴露させ、かつ上記のサンプル中のＣＤ７９ｂへ上記の抗体の結合を測定することを含み、ただし、上記のサンプル中のＣＤ７９ｂへ上記の抗体の結合が、上記のサンプル中の上記のタンパク質の存在を指示している。

【0022】

もう一つの態様では、本明細書が、ＣＤ７９ｂを発現する細胞（例えばＢ細胞）の増加に関連する細胞増殖性疾患を診断する方法を提供し、上記の方法は、以下を含む：生物学的サンプル中の試験細胞を本明細書に記載された抗体に接触すること；ＣＤ７９ｂへ上記の抗体の結合を検出することで、上記のサンプル中の試験細胞に結合する抗体のレベルを測定すること；及び、コントロールサンプル中の細胞に結合する抗体のレベルを比較し、ただし、試験サンプルとコントロールサンプル中にＣＤ７９ｂを発現した細胞の数に対し、結合した抗体のレベルを正規化し、かつその場合、コントロールサンプルと比べて、試験サンプル中の結合した抗体のレベルの方が高いことは、ＣＤ７９ｂを発現する細胞に関連する細胞増殖性疾患の存在を指示する。ある実施の形態において、上記の生物学的サンプルは、血液又は血清である。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１：ヒト化抗体の親和性試験結果。

【図2】図２：ヌードマウスのヒトＢ細胞リンパ腫Ｒａｍｏｓ皮下移植腫瘍に対するＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００１、００２、００４の治療効果。

【図3】図３：ヌードマウスのヒトＢ細胞リンパ腫Ｒａｍｏｓ皮下移植腫瘍に対するＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－０１０、００１２、０１１、００８の治療効果。

【図4】図４：ヌードマウスのヒトリンパ腫Ｇｒａｎｔａ－５１９皮下移植腫瘍に対するＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００１、００２、００４の治療効果。

【図5】図５：ヌードマウスのヒトリンパ腫Ｇｒａｎｔａ－５１９皮下移植腫瘍に対するＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００１、００１２、０１１、０１０の治療効果。

【図6】図６：ヌードマウスのヒトリンパ腫ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２皮下移植腫瘍に対するＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００１、００４の治療効果。

【図7】図７：ヌードマウスのヒトリンパ腫ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２皮下移植腫瘍に対するＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００１、００１２、０１１、０１０の治療効果。

【発明を実施するための形態】

【0024】

具体的な実施形態
本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴および以下に具体的に記載される技術的特徴（実施例など）を互いに組み合わせて、新しい技術を形成することができることを理解すべきである。

【0025】

別段の定義がない限り、本発明の実施は、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を使用し、これらはすべて当技術分野の技術的範囲内にある。これらの技術は、文献で完全に説明され、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験マニュアル）、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（オリゴヌクレオチド合成）（Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ編集、１９８４年）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（動物細胞培養）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集、１９８７年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（酵素学の方法） （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （分子生物学の現在のプロトコル） （Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌなど編集、１９８７年、かつ定期更新）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応），（Ｍｕｌｌｉｓなど編集、１９９４年） ；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ 分子クローニングの実用ガイド） （Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．，１９８８年） ；Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （ファージディスプレイ：実験マニュアル） （Ｂａｒｂａｓなど、２００１年）。

【0026】

本明細書中、「単離」した抗体とは、同定され、かつその自然環境の一つの成分から分離された抗体を指す。好ましい実施の形態において、抗体を（１）Ｌｏｗｒｙ法の測定によって、抗体の重量は、９５％を超え、最も好ましくに、重量は９９％を超える；（２）ローターカップシーケンサーの使用で、少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を取得するのに十分な程度；又は（３）還元または非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクマシーブルーまたは好ましくに銀染色の使用によれば、均質性が達成される；まで精製する。

【0027】

用語「ＣＤ７９ｂ」とは、特に明記しない限り、任意の脊椎動物（霊長類（例えば、ヒト、マカク）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む）から由来の任意の天然ＣＤ７９ｂを指す。用語「ＣＤ７９ｂ」とは、「全長」、未処理のＣＤ７９ｂ、および細胞から処理された任意の形態のＣＤ７９ｂを包含する。この用語は、スプライスバリアント、対立遺伝子バリアント、アイソフォームなどのＣＤ７９ｂの天然に存在するバリアントも含む。本明細書に記載されたＣＤ７９ｂポリペプチドは、ヒト組織型または他の由来などの様々な由来から単離することができ、或いは組換えまたは合成
方法によって調製することができる。「天然配列ＣＤ７９ｂポリペプチド」は、自然由来の対応するＣＤ７９ｂポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ＣＤ７９ｂポリペプチドは、自然から単離することができ、或いは組換えまたは合成の方法によって調製することができる。用語「天然配列ＣＤ７９ｂポリペプチド」とは、特定のＣＤ７９ｂポリペプチドの天然に存在する短縮型または分泌型（例えば細胞外ドメイン配列）、当該ポリペプチドの天然に存在する変異型（例えば選択的スプライシング形態）、および天然に存在する対立遺伝子バリアントを明確に包含する。

【0028】

ＣＤ７９ｂポリペプチドの「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」は、ＣＤ７９ｂポリペプチドが膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを実質的に含まない形態を指す。一般に、ＣＤ７９ｂポリペプチドＥＣＤは、１％未満のこのような膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを有し、好ましくに、０．５％未満のこのようなドメインを有する。膜貫通ドメインの精確な境界は変動でき、好ましくに、ＣＤ７９ｂポリペプチドの細胞外ドメインは、実施例または明細書で同定された膜貫通ドメイン／細胞外ドメイン境界のいずれかの側に約５個または５個以下のアミノ酸を含んでも良い。ある実施の形態において、本明細書に記載されたＣＤ７９ｂ ＥＣＤのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示された。

【0029】

用語「抗体」は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、ポリエピトープの特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、二重抗体と一本鎖分子、及び抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、とＦｖ）を含む。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）と「抗体」は、交換可能に使用される。

【0030】

用語「ＣＤ７９ｂ抗体」または類似の用語とは、十分な親和性でＣＤ７９ｂに結合することができる抗体を指す。好ましくに、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の測定によって、無関係な非ＣＤ７９ｂタンパク質へのＣＤ７９ｂ抗体の結合程度は、ＣＤ７９ｂへの該抗体の結合の約１０％未満である。ある実施の形態において、ＣＤ７９ｂに結合する抗体の解離定数（Ｋｄ）は、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．１ｎＭである。ある実施の形態において、抗ＣＤ７９ｂ抗体は、異なる種のＣＤ７９ｂ間で保存されているＣＤ７９ｂエピトープに結合する。

【0031】

抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖と軽鎖の可変ドメインは、それぞれに「ＶＨ」と「ＶＬ」と呼ばれる。これらのドメインは、通常に、抗体の最も変化可能な部分であり（同じタイプの他の抗体と比較して）、かつ抗原結合部位を含む。

【0032】

用語「可変」とは、可変ドメインの特定のセグメントが抗体配列において大きく異なる状況を指す。可変ドメインは、抗原結合を仲介し、かつ特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を限定する。ただし、変動性は、可変ドメインにまたがる１１０個のアミノ酸に均等に分布していない。実際に、可変領域は、１５～３０個アミノ酸の長さのフレーム領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的に不変的なセグメントと、フレーム領域を分離する９～１２個アミノ酸の長さをもつ「高度可変領域」と呼ばれる極端に変動的な短い領域とからなる。天然の重鎖と軽鎖の可変ドメインにはそれぞれ４つのＦＲ領域が含まれ、それらのほとんどはβシートコンフォメーションを取っている。各鎖のＨＶＲは、ＦＲ領域によって非常に密接に保持されており、かつ他の鎖のＨＶＲと一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接に関与しないが、さまざまなエフェクター機能を示している。

【0033】

本明細書において、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体集団から得
られる抗体、すなわち、集団を構成する各抗体が、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する突然変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて、同じであることを意味する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を標的とする。ポリクローナル抗体製剤（通常、異なるエピトープに対する異なる抗体が含まれる）と比較し、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を標的とする。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の利点は、それらがハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンによって汚染されないことである。「モノクローナル」は、抗体が実質的に均質な抗体集団から得られることを示し、特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に使用されるモノクローナル抗体は、様々な技術によって製造することができ、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５－９７（１９７５））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４－６２８（１９９１））、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部または全部を有する動物からヒトまたはヒト様抗体を生成するための技術（たとえば、ＷＯ１９９８ ／ ２４８９３）を含む。

【0034】

用語「全長抗体」、「インタクトな抗体」または「完全抗体」とは交換可能に使用され、抗原結合部位およびＣＬ、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む抗体を指す。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであっても良い。場合によっては、完全抗体が１つまたは複数のエフェクター機能を持っても良い。

【0035】

「抗体フラグメント」は、完全抗体の一部、好ましくに完全な抗体の抗原結合領域および／または可変領域を含む。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ ′、Ｆ（ａｂ′）２およびＦｖフラグメント；二重抗体；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号を参照）；一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）分子；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含む。抗体をパパインで消化すると、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同じ抗原結合フラグメントと、一つの残りの「Ｆｃ」フラグメントを生成する。Ｆａｂフラグメントは、完全な軽鎖および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、一つの重鎖第１定常ドメイン（ＣＨ１）で構成される。抗原結合の点から、各Ｆａｂフラグメントは、一価であり、つまり、単一の抗原結合部位を有する。ペプシン処理された抗体は、より大きなＦ（ａｂ′）２フラグメントを生成し、それは、ジスルフィド結合で接続された２つのＦａｂフラグメントとほぼ同等であり、異なる抗原結合活性を有すると同時に、抗原を架橋することができる。Ｆａｂ′フラグメントは、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの追加の残基（抗体のヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む）が添加されたので、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆ（ａｂ ′）２抗体フラグメントは、最初にＦａｂ′フラグメントのペアとして生成され、Ｆａｂ′フラグメント間に、ヒンジシステインがある。抗体フラグメントの他の化学的複合も公知なものである。Ｆｃフラグメントは、ジスルフィド結合によって一緒に保持している２つの重鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、特定のタイプの細胞に見られるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される領域であるＦｃ領域の配列によって決定される。

【0036】

本明細書では、「Ｆｃ領域」またはＦｃフラグメントは、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用され、天然配列Ｆｃ領域および変異Ｆｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動できるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常に、そのＣｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基からカルボキシル末端までのセグメントとして定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによると残基４４７）は、例えば、抗体の産生または精製の過程で、または抗体の重鎖をコードする核酸の組換え工程によって除去することができる。したがって、完全抗体の複合体は
、Ｋ４４７残基のすべてが除去された抗体複合体、Ｋ４４７残基が一つも除去されていない抗体複合体、またはＫ４４７残基を有する抗体とＫ４４７残基を有しない抗体を混合してなる抗体複合体を含んでも良い。「機能性Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域のエフェクター機能を有する。例示的なエフェクター機能は、Ｃｌｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーションなどを含む。「天然配列Ｆｃ領域」は、自然界に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域；及び天然に存在するそれらのバリアントを含む。「変異Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾（好ましくは１つ以上のアミノ酸置換）のために天然配列Ｆｃ領域とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較すると、変異Ｆｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、例えば、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域には、約１から約１０個のアミノ酸置換があり、好ましくに約１から約５個のアミノ酸置換がある。本明細書では、変異Ｆｃ領域は、好ましくに、天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性を有し、最も好ましくに少なくとも約９０％の相同性を有し、さらに好ましくに少なくとも約９５％の相同性を有する。

【0037】

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識・結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。このフラグメントは、緊密に非共有結合している重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインのダイマーで構成される。これらの２つのドメインの折り畳みから、６つの高度可変ループ（重鎖と軽鎖にそれぞれに３つのループ）が突き出て、これらが、抗原結合アミノ酸残基を提供し、かつ抗体に抗原結合特異性を与える。ただし、親和性が完全な結合部位よりも低い場合でも、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むの半分のＦｖ）でさえ、抗原を認識・結合する能も持つ。

【0038】

「一本鎖Ｆｖ」は「ｓｃＦｖ」と略記することもでき、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインが１つのポリペプチド鎖に接続されている抗体フラグメントである。好ましくに、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、その結果として、ｓＦｖは、所望の抗原結合構造を形成する。

【0039】

「二重抗体」は、２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントを指し、当該フラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）に、接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ＶＨドメインとＶＬドメインの間に、短いリンカー（約５～１０個の残基）を使用して、ｓｃＦｖフラグメントを構築することによって、小さな抗体フラグメントを調製し、リンカーが短いため、可変ドメインは鎖内ペアリングではなく鎖間ペアリングを実行し、その結果は、２価のフラグメント、つまり２つの抗原結合部位を持つフラグメントを生成する。二重抗体は、二価または二重特異性であっても良い。二重特異性の二重抗体は、２つの「クロスオーバー」ｓｃＦｖフラグメントのヘテロダイマーであり、ただし、２つの抗体のＶＨドメインとＶＬドメインが、異なるポリペプチド鎖に存在する。

【0040】

本明細書に記載された抗体の「機能性フラグメント」または「抗原結合フラグメント」は、完全な抗体の一部を含み、通常、該完全な抗体の抗原結合領域または可変領域、或いは修飾されたＦｃＲ結合能を保存または具備する抗体のＦｃ領域を含む。抗体の機能性フラグメントの例は、線状抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体、特にＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆａｂ′、ｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメントまたは二重抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、或いは化学修飾またはリポソームへの取り込みによって半減期を延ばすことができるはずのフラグメントのいずれかを指し、上記の化学修飾は、ポリエチレングリコールなどのポリ（アルキレン）グリコ
ールの付加、すなわちポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化修飾（Ｆｖ－ＰＥＧ、ｓｃＦｖ－ＰＥＧ、Ｆａｂ－ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ′）２－ＰＥＧまたはＦａｂ′－ＰＥＧと呼ばれるポリエチレングリコール化フラグメント）を含み、上記のフラグメントはＣＤ７９ｂ結合活性を有する。

【0041】

好ましくに、本明細書に記載された抗体の機能性フラグメントは、それが由来する抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の部分配列から構成されるか、またはそれらを含み、上記の部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性と十分な親和性を保持するのに十分である。このような機能性フラグメントは、最低５つのアミノ酸、好ましくにそれが由来する抗体配列の１０、１５、２５、５０および１００個の連続するアミノ酸を含む。

【0042】

本明細書では、モノクローナル抗体は、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む。キメラ抗体では、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種から由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、他の部分は、別の種から由来する、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である。

【0043】

「ヒト化抗体」は「キメラ抗体」の特定のカテゴリーである。非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態とは、非ヒト抗体から由来する配列を最小限に含むキメラ抗体を指す。かなりの程度で、ヒト化抗体とは、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）の高度可変領域残基が、所望の抗体特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体、例えばマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類動物など）の高度可変領域残基によって置き換えられた免疫グロブリンを指す。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレーム領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。なお、ヒト化抗体は、受容体抗体またはドナー抗体には見られない残基を含んでも良い。これらの修飾は、抗体の性能をさらに向上させるために行われる。一般的に言えば、ヒト化抗体は、以下の可変ドメインの少なくとも１つ、通常は２つ、実質的にすべてを含み、ただし、高度可変ループのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのループに対応し、かつＦＲのすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。任意的に、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常にヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。ヒト化抗体は、ファージディスプレイ技術と組み合わせたコンピューターシミュレーション設計により、免疫化されたマウスによって産生されたマウス由来抗体から得られる。

【0044】

「ヒト抗体」とは、ヒトから産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、および／またはヒト抗体を産生するための当技術分野で知られている任意の技術を使用して産生される抗体を指す。ヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野で知られている様々な技術を使用して生成することができる。

【0045】

「結合親和性」は、一般に、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間のすべての非共有結合性相互作用の合計の強さを指す。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合ペアのメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのパートナーＹへの親和性は、通常に、解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。低親和性抗体は、一般に抗原にゆっくりと結合し、かつ容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般に抗原に速く結合し、長期間に結合を保持する傾向がある。親和性は、放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）を含む当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。

【0046】

「制御配列」とは、特定の宿主生物体において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物に適した制御配列は、プロモーター、任意のオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。

【0047】

核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係にある場合、「作動可能に連結」されている。例えば、リーダー配列または分泌リーダーのＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、それは、該ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーが、コード配列の転写に影響を与える場合、それはその配列に作動可能に連結されている；あるいは、リボソーム結合部位の位置が翻訳を促進する場合、それはコード配列に作動可能に連結されている。一般的に言えば、「作動可能に連結」は、連結されたＤＮＡ配列が隣接していることを意味し、かつ分泌リーダーの場合、それらが隣接し、読み取り状態にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要がない。連結は、便利な制限サイトで連結することで実現できる。そのようなサイトがない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の慣行に従って使用される。

【0048】

本明細書では、「ベクター」は、それに連結された他の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは別のＤＮＡセグメントとライゲートできる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。もう一つのタイプのベクターは、ファージベクターである。もう一つのタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、別のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができる。あるベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自主的に複製することができる（例えば、細菌の複製起点を持つ細菌のベクターとエピゾーマル哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピゾーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入された後、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主のゲノムとともに複製することができる。なお、あるベクターは、それらに作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では、「組換え発現ベクター」（または単に「組換えベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形式を取る。プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」は交換可能に使用される。

【0049】

本明細書では、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、交換可能に使用され、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドまたは塩基および／またはそれらの類似体、或いはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって、または合成反応によってポリマーに組み込むことができる任意の基質であっても良い。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの修飾されたヌクレオチドを含んでも良い。もしあれば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に行うことができる。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されても良い。ポリヌクレオチドは、標識との複合などによって、合成後にさらに修飾することができる。

【0050】

「オリゴヌクレオチド」は、一般に、短いポリヌクレオチドを指し、通常に、一本鎖で、合成され、しかし必ずしもではないが長さが約２００個のヌクレオチド未満であるポリヌクレオチドを指す。

【0051】

本明細書では、用語「腫瘍」とは、通常、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的障害を指す。腫瘍は、良性腫瘍と悪性腫瘍に分けられ、悪性腫瘍はがんとも呼ばれる。腫瘍は、固形腫瘍または血液腫瘍に分けられる。ある実施の形態において、本発明は
、特に、造血系のがんまたは血液関連のがんの治療に関する。本明細書では、「造血系」は、胸腺、骨髄、および末梢リンパ組織（例えば、脾臓、リンパ節）、粘膜に関連するリンパ組織（例えば、腸関連リンパ組織）、扁桃腺、ペイアースポット及び他の粘膜関連付属器およびリンパ組織（例えば、気管支ライニング）を含む。したがって、本明細書に記載された造血系のがんまたは血液関連のがんは、リンパ腫、白血病、骨髄腫、またはリンパ系悪性腫瘍を含み、ならびに脾臓のがんおよびリンパ節のがんも含む。造血系のがんまたは血液関連のがんのより具体的な例は、以下を含む：例えば、高悪性度、中悪性度、および低悪性度のリンパ腫を含むＢ細胞関連のがん、Ｂ細胞リンパ腫を含み、例えば、粘膜関連リンパ組織Ｂ細胞リンパ腫と非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫とホジキンリンパ腫およびＴ細胞リンパ腫）；続発性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む白血病、例えば、Ｂ細胞白血病（ＣＤ５＋Ｂリンパ球）、急性骨髄性白血病などの骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）などのリンパ性白血病および骨髄異形成症候群；および他の血液学および／またはＢ細胞またはＴ細胞関連のがん。造血系のがんまたは血液関連のがんは、他の造血細胞のがんを含み、上記の造血細胞は、好塩基球、好酸球、好中球および単球などの多形核白血球、樹状細胞、血小板、赤血球、およびナチュラルキラー細胞を含む。具体的に、以下から選べられるがん性Ｂ細胞増殖性疾患を含んでも良い：非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、攻撃性ＮＨＬ、再発性攻撃性ＮＨＬ、再発性無痛性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）とマントル細胞リンパ腫。

【0052】

本明細書では、がんは、がん腫、芽細胞腫および肉腫も含む。したがって、がんの他の例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、肝肉腫、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、およびさまざまな種類の頭頸部がんなどを含む。

【0053】

「治療」または「緩和」とは、標的とされる病理学的状況または障害を軽減（緩和）または治癒することを指す。本明細書に記載された方法に従って治療量の抗ＣＤ７９ｂ抗体を投与した後、患者が以下の１つまたは複数で観察可能および／または測定可能な低下または消失を示す場合、受験者はＣＤ７９ｂポリペプチドを発現する腫瘍（特にがん）を成功に「治療」した：腫瘍細胞の数が減少するか、腫瘍細胞が消失すること；腫瘍の体積が減少すること；腫瘍細胞の浸潤が阻害されること；腫瘍の転移が阻害されること；腫瘍の成長がある程度阻害されること；および／または特定の腫瘍に関連する１つまたは複数の症状がある程度軽減されること；罹患率と死亡率の低下；及び生活の質の改善。抗ＣＤ７９ｂ抗体が腫瘍細胞の増殖を防ぎ、および／または既存の腫瘍細胞を殺すことができる限り、それは阻害性細胞および／または毒性細胞である可能性がある。これらの症候や症状の軽減は、患者にも感じられても良い。

【0054】

「治療有効量」とは、それが投与される対象にその利益を示すのに十分な用量を指す。実際に投与される量、及び投与の速度と時間経過は、治療される者の状態および重篤度に依存する。治療の処方（例えば投与量の決定など）は、最終的には、一般開業医や他の医師の責任であり、彼らが決定を下すのに依存する；通常に、治療する病気、個々の患者の状態、送達場所、投与方法、および医師が既知する他の要因を考えている。腫瘍の場合、薬物の治療有効量が、腫瘍細胞の数を減らす；腫瘍の体積を減らす；周囲の臓器への癌細胞の浸潤を阻害する；腫瘍の転移を阻害する；腫瘍の成長をある程度阻害する；および／または腫瘍に関連する１つまたは複数の症状をある程度軽減する。「予防有効量」とは、必要な用量および時間で、所望の予防効果を達成するのに有効な量を指す。必ずしもでは
ないが、通常、予防用量は、疾患の発症前または疾患の初期段階で受験者に適用されるため、予防有効量は、治療有効量よりも低くなる。

【0055】

抗ＣＤ７９ｂ抗体の「増殖阻害量」とは、インビトロまたはインビボで、細胞、特にのがん細胞などの腫瘍の増殖を阻害することができる量を指す。腫瘍細胞の増殖を阻害するための抗ＣＤ７９ｂ抗体の「増殖阻害量」は、経験的かつ従来の方法で決定することができる。

【0056】

抗ＣＤ７９ｂ抗体の「細胞毒性量」は、インビトロまたはインビボで、細胞、特にがん細胞などの腫瘍細胞の破壊を引き起こすことができる量を指す。腫瘍細胞の増殖を阻害するための抗ＣＤ７９ｂ抗体の「細胞毒性量」は、経験的かつ従来の方法で決定することができる。

【0057】

本明細書では、「個体」または「対象」は脊椎動物を指す。ある実施の形態において、脊椎動物は哺乳動物を指す。哺乳動物は、家畜（牛など）、スポーツ動物、ペット（猫、犬、馬など）、霊長類、マウス、ラットを含むが、これらに限定されない。好ましくに、哺乳動物はヒトを指す。

【0058】

１つまたは複数の他の治療剤と「組み合わせて」投与することは、同時（併用）投与および任意の順序での連続投与を含む。

【0059】

参照ポリペプチド配列の「配列同一性」は、最大パーセントの配列同一性を得るように配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後、かつ保存的置換を配列同一性の一部として考慮しなかった際に、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当技術分野の範囲内で様々な方法で実施することができ、たとえば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般的に公開されているコンピューターソフトウェアを使用する。本明細書は、本明細書に記載された抗体の軽鎖可変領域、重鎖可変領域、または重鎖および軽鎖（特に本明細書に具体的に記載されている各配列）と少なくとも８０％の配列同一性、例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、本明細書に記載された抗ＣＤ７９ｂ抗体において突然変異がなされても良く、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載されているものなどの保存的および非保存的突然変異のための任意の技術およびガイドラインを使用しても良い。ある実施の形態において、本明細書のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－６に示されたＣＤＲには、突然変異が発生しない。突然変異は、抗体またはポリペプチドをコードする１つまたは複数のコドンの置換、欠失、または挿入であっても良く、天然配列抗体に対するアミノ酸配列の変化をもたらす。任意的に、突然変異は、抗ＣＤ７９ｂ抗体の１つまたは複数のドメインの少なくとも１つのアミノ酸を他の任意のアミノ酸で置き換えることによるものである。抗ＣＤ７９ｂ抗体の配列を相同な既知のタンパク質分子の配列と比較し、高相同領域で行われるアミノ酸配列の変更の数を最小限に抑えることにより、目的の活性に悪影響を与えることなく、どのアミノ酸残基を挿入、置換、または削除できるかを決定するためのガイドラインを見つけることができる。

【0060】

アミノ酸置換は、一つのアミノ酸を、類似の構造および／または化学的性質を有する別のアミノ酸で置換すること（例えば、ロイシンをセリンで置換すること、いわゆる、保存的アミノ酸置換）の結果である。挿入または欠失は、任意的に、約１～５個のアミノ酸の範囲であっても良い。配列にアミノ酸の挿入、置換、または欠失を体系的に行い、かつ得
られたバリアントに対して、完全長または成熟した天然配列に示される活性をテストすることによって、許容される突然変異を確定できる。

【0061】

突然変異は、オリゴヌクレオチドに仲介された（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニング、およびＰＣＲ突然変異誘発などの当技術分野で知られている方法を使用して実施することができる。クローン化されたＤＮＡは、部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、制限選択的突然変異誘発、または他の既知の技術に供されて、抗ＣＤ７９ｂ抗体バリアントＤＮＡを生成することができる。

【0062】

抗ＣＤ７９ｂ抗体の正しいコンフォメーションの維持に関与していないシステイン残基も、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐために、（通常はセリンで）置き換えることができる。逆に、システイン結合を抗ＣＤ７９ｂ抗体に添加することで、その安定性を向上することができる（特に抗体は、Ｆｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）。

【0063】

ある実施の形態において、代替バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の高度可変領域残基の置換を関する。一般に、さらなる開発のために選択して得られるバリアントは、それらが産生された親抗体と比較して改善された生物学的特性を有する。このような代替バリアントを生成する便利な方法の１つは、ファージディスプレイを使用した親和性成熟である。要するに、高度可変領域のいくつかの部位（例えば、６～７個の部位）を突然変異させ、各部位で可能なすべてのアミノ酸置換を生成する。このように生成された抗体バリアントは、各粒子にパッケージされたＭ１３遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として繊維状ファージ粒子上に一価の形で表示される。次に、ファージに表示されたバリアントを生物学的活性（結合親和性など）についてスクリーニングする。修飾のための候補高度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に重要な寄与を有する高度可変領域残基を同定することができる。または／なお、抗原－抗体複合体の結晶構造を分析し、抗体とＣＤ７９ｂポリペプチドとの間の接触点を特定する。そのような接触残基および近接残基は、本明細書に詳述される技術による置換の候補部位である。そのようなバリアントが生成されると、当該バリアントのグループを、本明細書に記載されるようにスクリーニングし、１つまたは複数の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択することができる。「細胞毒性剤」は、細胞の機能を阻害または防止する、および／または細胞破壊を引き起こす物質を指す。当該用語は、以下のものを含む：Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｌｕ放射性同位体などの放射性同位体；メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ビンカアルカロイド（Ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄｓ）（ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）など）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、メルファラン（Ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、マイトマイシンＣ（ＭｉｔｏｍｙｃｉｎＣ）、クロラムブシル（Ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）またはダウノルビシン（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）などの化学療法薬；核酸分解酵素などの酵素およびそのフラグメント；抗生物質；細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素毒素などの毒素（そのフラグメント及び／又はバリアントを含む）；及び、当技術分野で知られている抗腫瘍薬または抗癌薬。

【0064】

「薬物組成物」は、特定の目的を達成するために一緒に組み合わされた、少なくとも１つの薬物と、任意的な薬学的に許容される担体または補助原料との組み合わせを意味する。ある実施の形態において、上記の薬物組成物は、本発明の目的を達成するために一緒に効くことができる限り、時間および／または空間で分離された組み合わせを含む。例えば、薬物組成物に含まれる成分（例えば本明細書に記載の抗体、核酸分子、核酸分子の組み
合わせおよび／または複合体）は、対象に全体的に、または別々に投与することができる。上記の薬物組成物に含まれる成分が対象に別々に投与される場合、上記の成分は、同時にまたは連続して対象に投与されても良い。好ましくは、薬学的に許容される担体は、水、緩衝水溶液、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）などの等張塩溶液、グルコース、マンニトール、デキストロース、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセリン、ヒアルロン酸、エタノール、またはポリプロピレングリコール、トリグリセリドなどのポリアルキレングリコールである。使用される薬学的に許容される担体のタイプは、特に、本発明による組成物が経口、鼻腔、皮内、皮下、筋肉内または静脈内投与用に処方されるかどうかに依存する。本発明による組成物は、添加剤として、湿潤剤、乳化剤または緩衝液物質を含んでも良い。

【0065】

本発明による医薬組成物は、経口、鼻腔、皮内、皮下、筋肉内または静脈内投与などの任意の適切な経路によって投与することができる。

【0066】

本発明は、抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその機能的フラグメント、その薬物組成物又は抗体－薬物複合体、及び造血腫瘍治療におけるその使用方法を提供する。

【0067】

本明細書の抗体は、腫瘍治療に使用されるＣＤ７９ｂに特異的に結合する任意の抗体であり、モノクローナル抗体、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）_２とＦｖフラグメントを含む）、二重抗体、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体又は対応する抗原性エピトープへの抗ＣＤ７９ｂポリペプチド抗体の結合を競合的に阻害する抗体であっても良い。本発明の抗体は、任意的に、毒素などの細胞毒性剤（例えば、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、メイタンシノイド（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、ドラスタチン（Ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）誘導体またはカリケアマイシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、抗生物質、放射性同位体、核酸分解酵素を含む）に複合されてもよい。本発明の抗体は、任意的に、ＣＨＯ細胞または細菌細胞で産生されても良く、好ましくに、それらが結合する細胞の死を誘導する。検出の目的で、本発明の抗体は、検出可能に標識されてもよく、固体支持体に付着させても良い。

【0068】

本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－６に示されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つすべてを含む。ある実施の形態において、本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－３からのいずれか一つ、いずれか二つ又は全ての三つを含み、及び／又はその軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４－６中いずれか一つ、いずれか二つ又は全ての三つを含む。ある実施の形態において、本明細書のＣＤ７９ｂ抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－３に示されたアミノ酸配列を含み、及び／又はその軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４－６に示されたアミノ酸配列を含む。ある実施の形態において、本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－３に示されたアミノ酸配列を含み、その軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４－６に示されたアミノ酸配列を含む。ある実施の形態において、本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体は、以下を含む：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたアミノ酸配列を含有するＨＣＤＲ３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されたアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ２； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されたアミノ酸配列を含有するＬＣＤＲ３。ある実施の形態において、本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－６に示されたＣＤＲ配列を含む。

【0069】

ある実施の形態において、本明細書の抗体は、マウス抗体１０４Ｅ１であり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されても良く、及び／又はその
軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されても良い。

【0070】

ある実施の形態において、本明細書の抗体は、ヒト化抗体であり、当該ヒト化抗体には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－６からの少なくとも一つ、少なくとも二つ、少なくとも三つ、少なくとも四つ、少なくとも五つ又は全ての六つで、ヒト抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域における対応するＣＤＲ領域を置き換えても良い。ある実施の形態において、ヒト化抗体の重鎖可変領域を調製するためのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されてもよく、ヒト化抗体の軽鎖可変領域を調製するためのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されても良い。ある実施の形態において、本明細書に記載されたヒト化抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示され、及び／又は上記のヒト化抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示される。

【0071】

ある実施の形態において、抗体親和性に重要な役割を果たすマウスＦＲ領域のアミノ酸部位を見つけるために、本明細書に記載のマウス抗体１０４Ｅ１に類似した結晶構造についてＰＤＢデータベースを検索した結果は、１０４Ｅ１抗体配列と７７％の相同性を持ち、十分に高い分解能を持つ抗ポリシアル酸抗体Ａｂ７３５のｓｃＦｖ結晶構造を発見した。本明細書では、この結晶を構造テンプレートとして、２つの配列を比較し、１０４Ｅ１抗体の３ＷＢＤｓｃＦｖのホモロジーモデルを確立し、当該ホモロジーモデルに従って、１０４Ｅ１配列のＦＲ領域内の、ＣＤＲドメインによって囲まれるまたはＣＤＲドメインから５A以内のアミノ酸部位を見つけ、そして抗体の親和性に重要な役割を果たす可能性のあるこれらのアミノ酸部位を、ＣＤＲグラフト配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）で復帰突然変異する同時に、グリコシル化、脱アミド化、酸化部位などを回避する。重鎖可変領域には、復帰突然変異される必要が有る可能性がある部位を１５個見つけ、Ａ２４Ｔ、ＲＶ６７ＫＡ、Ｓ８４Ｒ、Ｔ９８Ｋ、Ｋ１２Ａ、Ｓ１６Ａ、Ｖ２０Ｌ、Ａ２４Ｔ、Ｒ３８Ｋ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６８Ａ、Ｉ７０Ｌ、Ｙ９５Ｆ、Ｔ９８ＫとＶ１１３Ｌを含む；軽鎖可変領域には、復帰突然変異される必要が有る可能性がある部位を７個見つけ、Ｖ３Ｌ、Ｆ４１Ｙ、ＲＲ５０ＫＬ、ＦＱ４１ＹＬ、Ｒ５１Ｌ、Ｖ８８ＬとＶ１０９Ｌを含む。次に、ジェンスクリプト（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）の標準操作手順に従ってＦａｂライブラリーを確立し、ファージディスプレイプラットフォームでスクリーニングした。マウス１０４Ｅ１抗体より高い親和性を有するヒト化配列をスクリーニングし、シーケンシングで配列を確認した。したがって、ある実施の形態において、本明細書に記載された抗ＣＤ７９ｂ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３－１７からのいずれか一つの配列に示されたアミノ酸配列から選べられてもよく、及び／又はその軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８－２２からのいずれか一つの配列に示されたアミノ酸配列から選べられる。本発明は、これらの重鎖可変領域と少なくとも９０％、好ましくに少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列、及びこれらの軽鎖可変領域と少なくとも９０％、好ましくに少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列を含む。ある実施の形態において、重鎖可変領域と軽鎖可変領域における突然変異は、ＦＲに発生するが、ＣＤＲに発生しない。

【0072】

本発明の抗体は、定常領域を含んでも良い。定常領域は、ヒトのＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡとＩｇＥの定常領域であっても良い。例えば、定常領域は、ヒトのＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌ又はＩｇＡ２の定常領域であっても良い。ある実施の形態において、本明細書に記載された抗ＣＤ７９ｂ抗体の重鎖は、本明細書に記載された重鎖可変領域と重鎖Ｆｃ領域を含み、軽鎖は、本明細書に記載された軽鎖可変領域と軽鎖Ｆｃ領域を含む。例示的な重鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されてもよく、例示的な軽鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されても良い。ある実施の形態において、本発明に適する重鎖Ｆｃ領域は、さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されたアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくに少
なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖Ｆｃ領域を含み、及び／又は本発明に適する軽鎖Ｆｃ領域は、さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されたアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくに少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖Ｆｃ領域を含む。好ましくは、重鎖及び／又は軽鎖Ｆｃ領域に、本分野に公知されるＦｃ領域のエフェクター機能を変われる突然変異が発生しても良い。例えば、エフェクター機能が低下したＦｃ領域では、その残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９のうちの１つまたは複数に置換突然変異が発生する（ＵＳ６，７３７，０５６を参照）。ＡＤＣＣが改善された１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｆｃ領域の残基２９８、３３３、および／または３３４で発生しても良い（残基にはＥＵナンバリングに従って番号が付けられる）。

【0073】

ある実施の形態において、本明細書に記載された抗ＣＤ７９ｂ抗体の重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、２７、２９、３１と３３のいずれか一つの配列に示されたアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくに少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選べられてもよく、及び／又はその軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２８、３０、３２と３４のいずれか一つの配列に示されたアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくに少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選べられる。

【0074】

したがって、ある実施の形態において、本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体は、以下の抗体から選べられる：（１）重鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示され、軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示された抗体；（２）重鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示され、軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示された抗体；（３）重鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示され、軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示された抗体；（４）重鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示され、軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示された抗体；と（５）重鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示され、軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示された抗体。

【0075】

本明細書は、さらに本明細書に記載されたＣＤＲ、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖及び重鎖のコーディング配列及びその相補配列（核酸配列）、上記のコーディング配列又はその相補配列を有する担体、及び上記の核酸又は担体を含む宿主細胞を提供する。例示性なコーディング配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３７、３８と３９に示され、それらは、それぞれにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、３４、７と８のコーディング配列である。

【0076】

標準的な組換え技術を使用し、本明細書に記載された抗体またはその機能的フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離され、シーケンスされても良い。あるいは、ヌクレオチドシンセサイザーまたはＰＣＲ技術を使用し、ポリヌクレオチドを合成することができる。得られたら、ポリペプチドをコードする配列を、原核生物宿主において異種ポリヌクレオチドを複製および発現することができる組換えベクターに挿入する。本明細書の目的のために、当技術分野で利用可能で既知の様々なベクターを使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸のサイズおよびベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存する。その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅または発現、あるいはその両方）およびそれが存在する特定の宿主細胞との適合性に応じて、各ベクターは様々なコンポーネントを含む。

【0077】

ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であってもよい。適切な核酸配列は、様々な方法によってベクターに挿入することができる。一般に、目的のＤＮＡ配列は、当技術分野で既知の技術を使用して、適切な制限エンド
ヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクターのコンポーネントは、一般に、以下のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。当業者に既知の標準的なライゲーション技術を使用し、これらのコンポーネントの１つまたは複数を含む適切なベクターを構築することができる。ベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであっても良い。

【0078】

ＣＤ７９ｂは、直接的に組換えで生産できるだけでなく、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生産できる；上記の異種ポリペプチドは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を持つシグナル配列または他のポリペプチドであっても良い。一般に、シグナル配列は、ベクターのコンポーネントであっても良く、或いはベクターに挿入された抗ＣＤ７９ｂ抗体をコードするＤＮＡの一部であっても良い。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダー配列から選べられる原核生物のシグナル配列であっても良い。酵母分泌のために、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー配列、アルファ因子リーダー配列（サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のアルファ因子リーダー配列を含む）または酸性ホスファターゼリーダー配列、カンジダアルビカンスグルコアミラーゼリーダー配列などであっても良い。哺乳動物細胞の発現において、哺乳類のシグナル配列（同じまたは関連する種から由来の分泌型ポリペプチドのシグナル配列、およびウイルス分泌リーダー配列など）を使用してタンパク質分泌を誘導することができる。

【0079】

一般に、哺乳類の発現ベクターは複製起点コンポーネントを必要としない。たとえば、ＳＶ４０オリジンは初期のプロモーターを含んでいるため、通常は使用できる。発現とクローニングベクターには、通常に、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子が含まれる。典型的な選択遺伝子は、以下のタンパク質をコードする：（Ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンなどの抗生物質または他の毒素に対する耐性を付与するもの；（Ｂ）栄養不足を補うもの；または（ｃ）バチルスのＤ－アラニンラセマーゼをコードする遺伝子など、複雑な培地からは得られない重要な栄養素を提供するもの。

【0080】

選択プロトコルの例では、薬物を使用して宿主細胞の増殖を阻止する。異種遺伝子で成功に形質転換されたこれらの細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生するため、選択プロトコルを免れる。そのような優勢な選択の例には、ネオマイシン、ミコフェノール酸、およびハイグロマイシンという薬物を使用する。

【0081】

発現とクローニングベクターは、通常に、ｍＲＮＡ合成を指示するために、抗ＣＤ７９ｂ抗体をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。さまざまな潜在的な宿主細胞によって認識されるプロモーターは公知されるものである。酵母宿主に適するプロモーター配列の例には以下が含まれる：３－ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素のプロモーター、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ、３－ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、リン酸トリオースイソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼおよびグルコキナーゼ。

【0082】

哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗ＣＤ７９ｂ抗体の転写は、例えば、ウイルス（ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例：アデノウイルス２型）、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）など）ゲノムから得られた異種哺乳
動物プロモーター（アクチンプロモーターや免疫グロブリンプロモーターなど）および熱ショックプロモーターに由来するプロモーターによって制御される。ある実施の形態において、ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターを使用し、当該フラグメントはさらに、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を含む。

【0083】

高等真核細胞による抗ＣＤ７９ｂ抗体をコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することで改善できる。エンハンサーはＤＮＡのシスエレメントであり、通常は約１０～３００ ｂｐであり、プロモーターに作用して転写を増加させる。哺乳類の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、およびインスリン）からの多くのエンハンサー配列が知られている。ただし、通常、真核細胞ウイルスのエンハンサーが使用される。例としては、ＳＶ４０複製起点の後期側にあるエンハンサー（ｂｐ１００－２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマウイルス複製起点の後期側にあるエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーがある。エンハンサーはベクターにスプライシングされてもよく、抗ＣＤ７９ｂ抗体のコード配列の５ ′または３′の位置に配置されるが、好ましくに、プロモーターの５
′の位置に配置される。

【0084】

真核生物の宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞）に用いられる発現ベクターには、さらに、転写の終結とｍＲＮＡの安定化に必要な配列が含まれる。このような配列は通常、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの非翻訳領域の５ ′末端から、場合によっては３′末端から得られる。これらの領域には、抗ＣＤ７９ｂ抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分で、ポリアデニル化フラグメントに転写されたヌクレオチドセグメントを含む。有用な転写終結コンポーネントの１つは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化領域である。

【0085】

本明細書に記載された核酸配列を含むベクターは、当技術分野で公知の方法を使用し、宿主細胞に導入することができる。インビトロで核酸を宿主細胞に導入するのに適した技術には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ－デキストラン、リン酸カルシウム沈殿などが含まれる。

【0086】

宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞であっても良い。適切な原核生物は、グラム陰性菌またはグラム陽性菌などの古細菌および真正細菌、例えば、大腸菌などの腸内細菌科を含むが、これらに限定されない。他の適切な原核生物宿主細胞には以下が含まれる：エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテオバクテリア属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例えばネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（例えばセラチア・ マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃａｎｓ））と赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）（例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）とバチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）、ビトレオシラ属（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）とストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）。

【0087】

全長抗体、抗体フラグメントおよび抗体融合タンパク質は、特に、グリコシル化とＦｃエフェクター機能が必要ない場合、例えば治療用抗体が細胞毒性剤（例えば毒素）に複合され、免疫複合体自体が腫瘍細胞破壊の有効性を示す場合、細菌で調製することができる。全長抗体は、循環中の長い半減期を有する。大腸菌での調製はより速く、より経済性が高い。細菌における抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現については、例えば、Ｕ
Ｓ５，６４８，２３７、ＵＳ５，７８９，１９９およびＵＳ５，８４０，５２３を参照し、これらは、発現および分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）およびシグナル配列を説明している。発現後、抗体は大腸菌細胞ペーストから可溶性画分に分離され、例えば、アイソタイプに応じてプロテインＡまたはＧカラムによって精製することができる。最終の精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で発現された抗体を精製するために使用される方法と同様に実施することができる。

【0088】

糸状菌や酵母などの真核微生物も、抗ＣＤ７９ｂ抗体をコードするベクターの適切なクローニングまたは発現宿主である。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、一般的に使用される下等真核生物の宿主微生物である。その他には、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属などがある。

【0089】

グリコシル化された抗ＣＤ７９ｂ抗体を発現するのに適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例は、ショウジョウバエＳ２やスポドプテラＳｆ９などの昆虫細胞、及び、綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、タバコなどの植物細胞の細胞培養を含む。多くのバキュロウイルス株およびバリアント、ならびに対応する許容された昆虫宿主細胞は、ヒトスジシマカ、ネッタイシマカ、ヒトスジシマカ、キイロショウジョウバエ、およびボンビックスモリなどの宿主から由来することを同定された。

【0090】

有用な哺乳類宿主細胞株の例は以下のものである：ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ヒト胎児腎臓株（２９３細胞、または浮遊培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）、マウスセルトリ（ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞（ＴＭ４）、サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）、犬の腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）、バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏｒａｔ）肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、ヒト肝肉腫株（ＨｅｐＧ２）など。

【0091】

本発明の抗ＣＤ７９ｂ抗体を産生するために使用される宿主細胞は、当技術分野で周知の培養条件下で様々な培地で培養することができる。

【0092】

さまざまな形態の抗ＣＤ７９ｂ抗体を培養液または宿主細胞溶解物から回収できる。メンブレンに結合している場合は、適切な洗浄剤溶液（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００など）または酵素的切断を使用し、メンブレンから放出させることができる。抗ＣＤ７９ｂ抗体の発現に使用される細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破裂、または細胞溶解剤などのさまざまな物理的または化学的手段によって破裂するができる。

【0093】

細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、好ましい精製技術は、アフィニティークロマトグラフィーである。回収する抗体によって、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^ＴＭでのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフ
ィー、クロマトグラフィーフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿などの他のタンパク質精製技術も使用できる。

【0094】

一方、本明細書は、細胞毒性剤と複合された抗体を含む免疫複合体または抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）、ならびにその使用および調製の方法を提供する。本発明に適する細胞毒性剤は、薬物（化学療法薬など）、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物から由来する酵素的に活性を有する毒素又はそのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射複合体）であっても良い。一般に、免疫複合体は、細胞毒性剤または検出可能な薬剤に共有結合した前述の抗ＣＤ７９ｂ抗体のいずれかを含む。

【0095】

本明細書では、「薬物」とは、所望の生物学的活性を有する任意の化合物を指す。所望の生物学的活性は、ヒトまたは他の動物の疾患の診断、治癒、緩和、治療、および予防が含まれる。したがって、用語「薬物」とは、公式の国家薬局方、ならびに米国の公式のホメオパシー薬局方、公式の国内処方集、またはそれらのサプリメントなどで確認された薬物を含む化合物を指す。典型的な薬物は、医師用医薬品便覧（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｄｒｕｇ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）（ＰＤＲ）およびアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）のオレンジブックにリストされている。新薬の継続的な発見と開発により、これらの薬物は、本明細書に記載の複合薬のプロドラッグにも含まれるべきである。好ましくに、上記の薬物は、本明細書に記載された複合体を調製するために使用できるように、反応性官能基を有する。

【0096】

本明細書に適する例示的な薬物は、以下を含むが、これらに限定されない：がんの治療に使用される細胞毒性薬；所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチド、例えば、アカシア毒素、リシンＡ、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素などの毒素、腫瘍壊死因子、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、神経性成長因子、血小板由来成長因子、組織型プラスミノーゲン成長因子を含む他の適切なタンパク質、及び、リンホカイン、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子または他の成長因子などの生物学的反応修飾因子。

【0097】

例示的な薬物は、以下を含む：マイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）；マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）；オーリスタチンペプチド（Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）薬物（例えばモノメチルオーリスタチンペプチドＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルオーリスタチンペプチドＦ（ＭＭＡＦ））；カリケアマイシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）類（例えば、カリケアマイシン）；アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）類（例えば、アドリアマイシン）；ベンゾジピロール（Ｂｅｎｚｏｄｉｐｙｒｒｏｌｅ）抗生物質（例えばデュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎｓ）、ＣＣ－１０６５など）及び他のシクロプロパピロロインド－４－オン（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｐｙｒｒｏｌｏｉｎｄ－４－ｏｎｅ、ＣＰＩ）誘導体、例えば、シクロプロパベンズインド－４－オン類似体、例えば：

【化1】

及びピロロベンゾジアゼピン類（ＰＢＤ）またはＰＢＤダイマー類、例えば：

【化2】

【0098】

抗体は、直接またはリンカーを介して薬物に複合させることができる。リンカーは、切断可能なリンカーと切断不可能なリンカーの２つのカテゴリに分けられる。切断不可能なリンカーを含む抗体－薬物複合体の場合、その薬物放出メカニズムは次のとおり：複合体が抗原に結合し、細胞にエンドサイトーシスされた後に、抗体は、リソソームで酵素的に消化され、小分子薬、リンカー、および抗体アミノ酸残基で構成される活性分子を放出する。結果としては、生じる薬物分子の構造の変化が、その細胞毒性を低下させないが、活性分子は帯電しているため（アミノ酸残基）、隣接する細胞に浸透することはできなくなる。したがって、そのような活性薬物は、標的抗原を発現しない隣接する腫瘍細胞（抗原陰性細胞）を殺すことはできない（傍観者効果、ｂｙｓｔａｎｄｅｒｅｆｆｅｃｔ）（Ｄｕｃｒｙ等、２０１０、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．２１：５－１３）。切断可能なリンカーは、標的細胞内で切断され、活性薬物を放出することができる。切断可能なリンカーは、化学的に不安定なリンカーと酵素に不安定なリンカーの２つの主要なカテゴリに分けられる。化学的に不安定なリンカーは、血漿と細胞質の特性の違いにより、選択的に切断される可能性がある。このような特性は、ｐＨ、グルタチオン濃度などを含む。ｐＨ感受性リンカーは通常に、酸切断リンカーとも呼ばれ、このようなリンカーは、血液の中性環境（ｐＨ ７．３－７．５）では比較的安定しているが、弱酸性のエンドソーム（ｐＨ ５．０－６．５）およびリソソーム（ｐＨ ４．５－５．０）では加水分解される。グルタチオン感受性リンカーは、ジスルフィド結合リンカーとも呼ばれる。薬物放出は、細胞内の高濃度（ミリモル範囲）のグルタチオンと血中の比較的低濃度（マイクロモル範囲）のグルタチオンの違いに基づくことである。その低い酸素含有量が、増強されたレダクターゼ活性をもたらし、そしてより高いグルタチオン濃度をもたらす腫瘍細胞には、特に当てはまる。ジスルフィド結合は熱力学的に安定しているため、血漿中での安定性が高い。ペプチドリンカーなどの酵素に不安定なリンカーは、薬物放出をよりよく制御することができる。ペプチドリンカーは、カテプシン（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ）やプラスミン（一部の腫瘍組織で増加）などのリソソーム内のプロテアーゼによって効果的に切断される。このペプチドによるリンケージは、血漿循環において非常に安定していると考えられ、これは、細胞外の不適切なｐＨ値と血清プロテアーゼ阻害剤により、プロテアーゼが一般的に不活性になるためである。比較的な高い血漿安定性と良好な細胞内切断選択性および有効性の観点から、酵素に不安定なリンカーは、抗体－薬物複合体の切断可能なリンカーとして広く使用される。典型的な酵素に不安定なリンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ（ｖｃ）、Ｐｈｅ－Ｌｙｓなどを含む。自壊性リンカーは、一般に、切断可能なリンカーと活性薬物との間に埋め込まれるか、またはその自体は、切断可能なリンカーの一部である。自壊性リンカーの作用メカニズムは次のとおり：切断可能なリンカーが適切な条件下で切断されると、自壊性リンカーは自発的に転位し、そして、それと接続された活性薬物を放出することができる。一般的な自壊性リンカーは、ｐ－アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）とβ－グルクロニド（β－Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）を含む。

【0099】

リンカーは、１つまたは複数のリンカーコンポーネントを含んでも良い。例えば、ある実施の形態において、リンカーの構造は、Ｖ－Ｌであっても良く、ただし、Ｖコンポーネントは存在するかまたは存在しなく、以下に説明する三座リンカーコンポーネントまたはテトラマレイミドリンカーコンポーネントであり、Ｌコンポーネントは、前記の切断不可能なリンカーと切断可能なリンカーであっても良く、例えば酸不安定リンカー（例えば、ヒドラゾン）、プロテアーゼ感受性（例えば、ペプチダーゼ感受性）リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーなど。例示的なリンカーコンポーネントは、６－マレイミドヘキサノイル、マレイミドプロピオニルバリン－シトルリン、アラニン－フェニルアラニン、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート、Ｎ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１カルボキシレートとＮ－スクシンイミジル（４－ヨード－アセチル）アミノ安息香酸を含む。他の例示的なリンカーコンポーネントは、また、プロテアーゼ切断を可能にするアミノ酸単位を含むリンカーであっても良く、これにより、細胞内プロテアーゼ（例えばリソソーム酵素）への曝露後の免疫複合体からの薬物の放出が促進される。例示的なアミノ酸単位は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、およびペンタペプチドを含むが、これらに限定されない。例示的なジペプチドは、バリン－シトルリン；アラニン－フェニルアラニン；フェニルアラニン－リジン；またはＮ－メチル－バリン－シトルリンを含む。例示的なトリペプチドは、グリシン－バリン－シトルリンおよびグリシン－グリシン－グリシンを含む。

【0100】

例示的な三座（またはビスマレイミド）リンカーコンポーネントは、以下の構造を有しても良い：

【化3】

例示的なテトラマレイミドリンカーコンポーネントは、以下の構造を有しても良い：

【化4】

【0101】

他の適切なリンカー、薬物、またはリンカー薬物の例としては、ＣＮ １０３９３３５７５ＡおよびＣＮ１０７６５２２１９Ａに記載されて、ＣＮ １０３９３３５７５ Ａに開示された抗体－薬物複合体Ｈ－１－ｖｃＭＭＡＥ、Ｈ－１－ＭＭＡＦ、Ｈ－３－ｖｃＭＭＡＥ、Ｈ－３－ＭＭＡＦ、Ｈ－４－ｖｃＭＭＡＥ、Ｈ－４－ＭＭＡＦに示されたリンカー－薬物、及びＣＮ １０７６５２２１９ Ａに開示された番号は１－ｖｃＭＭＡＥから１２－ｖｃＭＭＡＥまでのものを含むが、これらに限定されない。本明細書では、これら２つの出願の内容全体を参照により本明細書に組み込んでいる。したがって、ある実施の形態において、本発明の抗体－薬物複合体は、以下の構造を有しても良い：
Ａ－（Ｖ－Ｌ－Ｄ）_ｎ
ただし、Ａは、本明細書の抗体である；Ｖ－Ｌは、リンカーであり、Ｖは存在するかまた
は存在しなく、前記のいずれか一つの三座リンカーコンポーネント又はテトラマレイミドリンカーコンポーネントであり、Ｌは、切断可能なリンカー又は切断不可能なリンカーであり、ＶとＬの少なくとも１つが存在する；Ｄは、興味ある細胞毒性剤である；ｎは１－４の整数である。

【0102】

ある実施の形態において、Ｌは、前記のプロテアーゼ切断を可能にするアミノ酸単位を含むリンカーである。

【0103】

本明細書の例示性な抗体－薬物複合体の例として、本願の実施例を参照し、ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００１、ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００２、ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００３、ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００４、ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００５、ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００６、ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００７、ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００８、ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－０１０、ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－０１１とＡＳ１１２５０－ＡＤＣ－００１２を含むが、これらに限定されない。

【0104】

ある実施の形態において、免疫複合体は、高放射性原子を含んでも良い。さまざまな放射性同位体は、放射性複合抗体を生成するために用いられても良い。実例としては、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２とＬｕである放射性同位体を含む。免疫複合体を検出に使用する場合、シンチグラフィー研究用の放射性原子（例えばＴｃ９９ｍやＩ１２３）、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとも呼ばれる）用のスピンマーカー（例えばヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄）を含んでも良い。

【0105】

放射性または他のマーカーは、既知の方法で免疫複合体に組み込むことができる。例えば、ペプチドは生物学的に合成することができ、または、化学的にアミノ酸合成によって合成しても良く、ただし、例えば、水素の代わりにフッ素－１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する。Ｔｃ^９９ｍ又はＩ^１２３、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８とＩｎ^１１１などのマーカーは、ペプチドのシステイン残基を介して結合できる。イットリウム９０はリジン残基を介して結合することができる。

【0106】

本明細書のＡＤＣは、以下を含む、当業者に知られている有機化学反応、条件、および試薬を使用するいくつかの経路を介して調製することができる：（１）抗体の求核基は、共有結合を介して二価リンカー試薬と反応し、共有結合を介して抗体－リンカーを形成し、次に薬物と反応する；及び（２）薬物モジュールの求核基は、二価リンカー試薬と反応し、共有結合を介して薬物－リンカーを形成し、次に抗体の求核基と反応する。

【0107】

本明細書の抗体、その機能的フラグメントまたは抗体－薬物複合体は、治療される疾患に適した任意の経路で投与することができ、これらの投与方式は、経口、胃腸外、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外などを含む。

【0108】

疾患の予防または治療に対して、本明細書に記載された抗体、その機能的フラグメント又は抗体－薬物複合体の適切な投与量（単独で、または化学療法薬などの他の１つ以上の薬と組み合わせて使用する場合）は、治療される疾患の種類、抗体、その機能的フラグメントまたは抗体－薬物複合体の種類、疾患の重篤度および進行、抗体、その機能的フラグメントまたは抗体－薬物複合体の投与は、予防を目的とするか、それとも治療を目的とするか、以前の治療法、患者の病歴と、抗体、その機能的フラグメントまたは抗体－薬物複合体に対する反応、および主治医の判断に依存する。適切には、抗体、その機能的フラグメント又は抗体－薬物複合体は、一度に、または一連の治療を通じて患者に投与される。
疾患の種類および重篤度に応じて、患者への投与の最初の候補投与量は、例えば、１回または複数回の別々の投与または連続注入のいずれかによって、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ ｍｇ／ｋｇ－２０ ｍｇ／ｋｇ）の抗体、その機能的フラグメント又は抗体－薬物複合体であっても良い。上記の要因に基づいて、典型的な１日投与量は、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上であっても良い。数日またはそれ以上にわたる反復投与の場合、状態により、通常に、疾患症状の望ましい抑制が起こるまで治療を続ける。抗体、その機能的フラグメント又は抗体－薬物複合体の例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であっても良い。このようにして、１回分または複数回分の抗体、その機能的フラグメント又は抗体－薬物複合体を、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（またはそれらの任意の組み合わせ）で患者に投与することができる。これらの投与量は、間欠的に、例えば毎週または３週間ごとに投与されても良い（例えば、患者が約２回分から約２０回分、例えば約６回分の抗体または免疫複合体を受け取る）。より高い初期負荷投与量を１回投与し、その後に１回分または複数回分のより低い投与量を投与することができる。例示的な投与計画は、約４ｍｇ／ｋｇの抗体の初期負荷投与量の投与と、それに続く約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持投与量の投与を含む。しかしながら、他の投与計画もまた有用かもしれない。この治療法の進行は、従来の技術とアッセイによって簡単に監視される。

【0109】

患者への抗体タンパク質の投与に加えて、本願は、遺伝子治療による抗体の投与を想定している。細胞内抗体を生成するための遺伝子治療の使用については、例えば、ＷＯ９６
／ ０７３２１を参照される。（任意的にベクターに含まれる）核酸を患者の細胞に取り込ませるには、主に２つの方法、つまりインビボとエクスビボがある。インビボ送達の場合、核酸は、通常に、抗体が必要とされる部位で患者に直接注射される。エクスビボ治療では、患者の細胞を収集し、核酸をこれらの分離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に直接投与するか、または、例えば、多孔質膜に詰められて患者の体内に移植する（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号を参照される）。生細胞に核酸を導入するために使用できるさまざまな技術がある。これらの技術は、核酸が目的の宿主のインビトロ培養細胞またはインビボ細胞のどちらに移されるかによって異なる。インビトロで核酸を哺乳類細胞に導入するのに適した技術には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ－デキストラン、リン酸カルシウム沈殿などが含まれる。遺伝子のエクスビボ送達に一般的に使用されるベクターは、レトロウイルスである。

【0110】

現在好ましいインビボ核酸導入技術は、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、またはアデノ随伴ウイルスなど）および脂質ベースのシステム（脂質の仲介に用いられる遺伝子導入に使用できる脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－Ｃｈｏｌを含む）によるトランスフェクションを含む。

【0111】

本明細書は、さらに、少なくとも一つの本明細書に記載された抗ＣＤ７９ｂ抗体及び／又は少なくとも一つのその免疫複合体及び／又は少なくとも一つの本明細書に記載された抗ＣＤ７９ｂ抗体－薬物複合体を含む薬物組成物を提供する。ある実施の形態において、薬物組成物は、以下を含む：（１）本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体及び／又はその免疫複合体、と（２）薬学的に許容される担体。ある実施の形態において、薬物組成物は、以下を含む：（１）本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体及び／又はその免疫複合体、と任意的な（２）少なくとも一つの既知の治療製剤、例えば既知の治療に用いられるＣＤ７９ｂに仲介された疾患の治療製剤。

【0112】

本明細書によって使用され、抗ＣＤ７９ｂ抗体又は抗ＣＤ７９ｂ抗体－薬物複合体を含む薬物組成物は、所望の純度の抗体または抗体－薬物複合体を、任意の薬学的に許容され
る担体、賦形剤または安定剤と混合して、凍結乾燥剤形または貯蔵用の水溶液を調製することによって調製される。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、以下を含む：酢酸塩、トリス、リン酸塩、クエン酸塩、その他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸とメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；クロルヘキシジンジアンモニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ－ヒドロキシ安息香酸プロピルなどのｐ－ヒドロキシ安息香酸ヒドロカルビル；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール； ３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清タンパク質、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、デキストリンなどの他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；トレハロースや塩化ナトリウムなどの張性調整剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ポリソルベートなどの界面活性剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。インビボ投与用の薬物製剤は、一般に無菌である。これは、滅菌フィルターメンブレンでろ過することで簡単に実現できる。

【0113】

本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体は、哺乳動物においてＣＤ７９ｂを発現する腫瘍を治療するために、または腫瘍の１つまたは複数の症状を軽減するために使用することができる。このような腫瘍は、造血系のがんまたは血液関連のがん、例えばリンパ腫、白血病、骨髄腫、またはリンパ系悪性腫瘍、ならびに脾臓のがんおよびリンパ節のがんを含むが、これらに限定されない。ＣＤ７９ｂを発現する腫瘍は、特にＢ細胞関連がんを含み、その具体的な例は、例えば、高悪性度、中悪性度、および低悪性度のリンパ腫（Ｂ細胞リンパ腫を含み、例えば、粘膜関連リンパ組織Ｂ細胞リンパ腫と非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫とホジキンリンパ腫およびＴ細胞リンパ腫）と白血病（続発性白血病、慢性リンパ性白血病を含む白血病、例えば、Ｂ細胞白血病（ＣＤ５＋Ｂリンパ球）、急性骨髄性白血病などの骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病などのリンパ性白血病および骨髄異形成症候群）。癌は、前述の転移性癌のいずれかを包含する。抗体は、哺乳動物においてＣＤ７９ｂポリペプチドを発現する腫瘍細胞の少なくとも一部に結合することができる。好ましい実施形態において、抗体は、インビトロまたはインビボで、細胞上のＣＤ７９ｂポリペプチドに結合する際に、ＣＤ７９ｂを発現する腫瘍細胞を効果的に破壊または殺すか、或いはそのような腫瘍細胞の増殖を阻害する。このような抗体は、裸の抗ＣＤ７９ｂ抗体（どの薬剤にも複合していないもの）を含む。細胞毒性または細胞増殖抑制特性を有する裸の抗体は、細胞毒性剤とさらに協力し、腫瘍細胞を破壊するのにより効果的にすることができる。例えば、抗体を細胞毒性剤に複合し、本明細書に記載された免疫複合体を形成することにより、抗ＣＤ７９ｂ抗体に細胞毒性特性を付与することができる。

【0114】

本明細書は、さらに、ＣＤ７９ｂを発現する腫瘍を治療、予防、および／または診断するために使用できる物質を含む製品も提供する。製品は、容器と、上記の容器にある又は容器に関連するラベルまたはパッケージインサートを含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、注射器などを含む。容器は、ガラスやプラスチックなど、さまざまな素材で製造できる。容器は、腫瘍状態を治療、予防および／または診断するのに有効な組成物を含み、かつ滅菌アクセスポートを有しても良い（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを備えた静脈内溶液バッグまたはバイアルであっても良い）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書の抗ＣＤ７９ｂ抗体である。ラベルまたはパ
ッケージインサートは、該組成物が腫瘍の治療、予防、および／または診断に使用されることを示している。ラベルまたはパッケージインサートは、腫瘍（特に癌）患者に抗体組成物を投与するためのマニュアルをさらに含む。さらに、製品はまた、第２の容器を含み、その中に、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を収納する。それはまた、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針および注射器を含む、商業的およびユーザーの観点から必要とされる他の材料を含んでも良い。

【0115】

例えば、ＣＤ７９ｂを発現する細胞のキリングアッセイのため、細胞からのＣＤ７９ｂポリペプチドの精製または免疫沈降のためなど複数の目的に使用できるキットも提供する。ＣＤ７９ｂを分離および精製するために、キットは、ビーズ（たとえば、セファロースビーズ）に複合した抗ＣＤ７９ｂ抗体を含む場合がある。ＣＤ７９ｂポリペプチドのインビトロ検出および定量化（例えばＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティング）のための抗体を含むキットを提供することができる。製品と同じ、キットは、容器と、上記の容器にある又は容器に関連するラベルまたはパッケージインサートを含む。容器は、本明細書の少なくとも１つの抗ＣＤ７９ｂ抗体を含む組成物を収納する。例えば、希釈剤および緩衝液、対照抗体を収納する追加の容器を含んでも良い。ラベルまたはパッケージインサートは、組成物の説明およびその意図されたインビトロまたは試験使用のためのマニュアルを提供することができる。

【実施例】

【0116】

実施例
以下、具体的な実施例を参照して、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の単なる例示であることが理解されるべく。以下の実施例に具体的な条件を示しない実験方法は、一般的に、通常の条件またはメーカーの推奨条件に従う。すべての反応は窒素の保護下で行われる（水素化反応を除く）。

【0117】

別段の定義がない限り、本文で使用されているすべての専門用語および科学用語は、当業者によく知られている用語と同じ意味を有する。さらに、記載された内容と類似または同等の任意の方法および材料を本発明の方法に適用することができる。本明細書に記載される実施の形態および材料は、例示のみのためである。
略語
Ａｂ 抗体
ＡＣＮ アセトニトリル
ＡＤＣ 抗体－薬物複合体
ＢＯＣ （Ｂｏｃ） Ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル
ＤＩＰＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着アッセイ
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
Ｅｑ （ｅｑ） 当量
ｇ グラム
ＨＡＴＵ Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＳｕ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド
ＨＩＣ 疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＬＣ－ＭＳ 液体クロマトグラフィー－質量分析
ｍＡｂ モノクローナル抗体
ｍｉｎ 分間
ｍＬ ミリリットル
ＭＳ 質量分析
ｎｍ ナノメートル
μＬ マイクロリットル
ＰＥ 石油エーテル
ｒｔ 室温
Ｒｔ 保留時間
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥＣ サイズ排除クロマトグラフィー
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン

【0118】

特に明記しない限り、すべての無水試薬はサプライヤーから直接購入し、窒素下で保存した。購入した他のすべての試薬と溶媒は高純度であり、使用前にさらに精製することはなかった。

【0119】

核磁気共鳴スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ５００Ｍ 核磁気共鳴分光計で収集された。化学シフトの単位（δ）はｐｐｍであり、テトラメチルシランが参照システムとして使用された（化学シフトは０）。

【0120】

液体クロマトグラフィー－質量分析法では、ＨＰ Ａｇｉｌｅｎｔ１２００高速液体クロマトグラフと接続するＡｇｉｌｅｎｔ ６１１０（酸法）または６１２０Ｂ（アルカリ法）質量分析計で、低分解能質量分析データが収集された。

【0121】

方法１：酸法高速液体クロマトグラフィー方法には、ウォーターズ Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８逆相カラム（４．６０ × ５０ ｍｍ、３．５ μｍ）で単離し、溶離液の勾配は、Ａ相（水相、０．０１％ ＴＦＡを含む）中にあるＢ相（アセトニトリル、０．０１％ＴＦＡを含む）が１．４分間の内に５％－９５％であり、流速は２．０ ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は５０℃であった；
方法２：酸法高速液体クロマトグラフィー方法には、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＥＣ－Ｃ１８逆相カラム（４．６ × ３０ ｍｍ、２．７ μｍ）で単離し、溶離液の勾配は、Ａ相（水相、０．０１％ ＴＦＡを含む）中にあるＢ相（アセトニトリル、０．０１％ＴＦＡを含む）が２分間の内に５％－９５％であり、流速は１．５ ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は５０℃であった；
方法３：アルカリ法高速液体クロマトグラフィー方法には、ウォーターズ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８逆相カラム（４．６０ × ５０ ｍｍ、３．５ μｍ）で単離し、溶離液の勾配は、Ａ相（水相、１０ｍＭ重炭酸アンモニウムを含む）中にあるＢ相（アセトニトリル）が１．５分間の内に５％－９５％であり、流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は４０℃であった。

【0122】

調製は、ギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）装置で逆相－高速液体クロマトグラフィー精製（ｐｒｅｐ－ＲＰ－ＨＰＬＣ）により完成し、使用した分離カラムはウォーターズ Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８逆相クロマトグラフィーカラム（２５０ × １９ｍｍ、１０μｍ）であった。

【0123】

方法４：酸法による調製。移動相：Ａ：０．１％ＴＦＡを含む水相；Ｂ：ＡＣＮ。流速：２０ ｍＬ／ｍｉｎ。

【0124】

方法５：アルカリ法による調製。移動相：Ａ：１０ｍＭ重炭酸アンモニウムを含む水相
；Ｂ：ＡＣＮ。流速：２０ ｍＬ／ｍｉｎ。

【0125】

特に明記しない限り、実施例に記載されている市販の試薬は、製造業者の指示に従って使用された。

【0126】

１、抗原抗体結合試験（ＥＬＩＳＡ）
実施例では、酵素結合免疫吸着アッセイを使用し、インビトロでのＣＤ７９ｂ抗原に対する抗ＣＤ７９ｂ抗体（マウス血清、ハイブリドーマ上清または組換え発現モノクローナル抗体などを含む）の親和性を試験した。

【0127】

実験手順は：ＰＢＳ（１０ ｍＭリン酸、１３８ ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中の１ ｕｇ／ｍｌの抗原（ヒトＣＤ７９ｂ－ＥＣＤ、ノボプロテイン、ＣＡ２９）（１００
ｕｌ ／ウェル）により、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＡＴ＃９０１８）を４℃で一晩コートした後、２５０ ｕｌ／ウェルのブロッキング溶液（ＰＢＳ ＋ １％ＢＳＡ（Ｓａｎｇｏｎ， ＣＡＴ ＃Ａ０３３２））により２５℃で１～３時間ブロッキングした。プレートを洗浄液（ＰＢＳ ＋ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｓａｎｇｏｎ、ＣＡＴ＃ＴＢ０５６０））で３回洗浄した後、１００ ｕｌ のブロッキング溶液中の抗ＣＤ７９ｂ抗体の段階希釈液と共に、二重ウェル中で２５℃で２時間インキュベートした。洗浄液でプレートを３回洗浄した後、１００ｕｌの１：１０，０００の二次抗体（抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰ、Ｓｉｇｍａ、ＣＡＴ＃Ａ００１６８または抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ ′）２－ＨＲＰ、Ｓｉｇｍａ、ＣＡＴ＃Ａ０２９３）と共に、２５℃で１時間インキュベートした。洗浄液でプレートを３回洗浄した後、１００ ｕｌ ／ウェルのＴＭＢ（Ｓａｎｇｏｎ、ＣＡＴ＃ＴＢ０９５４）を各ウェルに加え、発色まで２５℃で（約１５分間）放置した。１００ ｕｌ ／ウェルの停止溶液（１Ｎ Ｈ２ＳＯ４）を加えることで反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで１０分以内にＯＤ４５０／６３０ｎｍを読み取った。

【0128】

２．ＦＡＣＳで細胞表面のＣＤ７９ｂへの抗体の結合を検出
実施例では、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を使用し、抗ＣＤ７９ｂ抗体（マウス血清、ハイブリドーマ抗体などを含む）がインビトロでがん細胞の表面にある天然のＣＤ７９ｂ細胞外ドメインに結合する能を検出した。

【0129】

ＤＳＭＺまたはＡＴＣＣからＣＤ７９ｂ陽性発現または陰性発現がん細胞ビーズを購入し、細胞膜表面受容体定量キットＱＩＦＩＫＩＴ（ＤＡＫＯ、Ｋ００７８）を使用し、細胞表面のＣＤ７９ｂを定量した。結果は、以下の表に示された：

【0130】

【表1】

【0131】

ＳＵ－ＤＨＬ－４細胞株を使用し、免疫したマウスとハイブリドーマ上清の検出およびスクリーニングを行った。具体的な方法は、対数増殖期のＳＵ－ＤＨＬ－４細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、約１００，０００細胞／チューブで１．５ ｍｌ ＥＰチューブに分配し、希釈したマウス血清またはハイブリドーマ上清を１００ ｕｌ ／チューブで加え、４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－２％ＢＳＡで２回洗浄した後、ＰＢＳ－２％ＢＳＡによって１：４００で調製されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ ＋ Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃａｔ＃Ａ１１００１）を１００ ｕｌ ／チューブで添加し、該溶液を暗所で４５分間４℃でインキュベートした。細胞をＰＢＳ－２％ＢＳＡで２回洗浄し、５００ｕｌ ＰＢＳ－２％ＢＳＡで再懸濁し、フローサイトメーターＧｕａｖａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、８ＨＴ）で解析を行い、蛍光強度（ＭＦＩ値）に基づいて、細胞表面のＣＤ７９ｂ受容体に対する抗体の結合強度を決定した。

【0132】

３、薬物複合体の調製
抗ＣＤ７９ｂ抗体の有効性を検証するために、抗体を、さまざまなリンカーを使用し、さまざまな小分子薬物に複合し、薬物複合体を調製し、具体的な複合方法は次のとおりであった。

【0133】

トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、１０ ｅｑ、ストック溶液濃度１０ ｍＭ）を抗体溶液（２０ ｍＭリン酸二水素ナトリウム－リン酸水素二ナトリウムバッファー、１５０ ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ７．２）に加えた。反応溶液を３７℃の恒温水浴中で２時間インキュベートした。反応溶液をほぼ室温まで冷却し、限外濾過（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、５００００ ＭＷＣＯ）またはゲル濾過によって緩衝液（１００ ｍＭリン酸二水素カリウム－リン酸水素二カリウム、１００ ｍＭ塩化ナトリウム、１ ｍＭジエチレントリアミン五酢酸、ｐＨ ７．０－８．０）または緩衝液（２０ ｍＭクエン酸－クエン酸三ナトリウム、５０ ｍＭ塩化ナトリウム、１ ｍＭジエチレントリアミン五酢酸、ｐＨ ６．０）に交換し、ジメチルスルホキシドおよび対応するリンカー－薬物化合物（ジメチルスルホキシドストッ
ク液、抗体に対して３－１０当量）を添加し、反応溶液中のジメチルスルホキシドの体積比を約１０－１５％まで確保した。複合反応は１０℃で０．５時間行った。

【0134】

過剰のシステイン溶液を反応溶液に加えて、未反応のリンカー－薬物化合物をクエンチし、クエンチ反応を１０℃で３０分間行った。反応溶液を最初に限外ろ過（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、５００００ ＭＷＣＯ）またはゲルろ過にかけてリンカー－薬物－システイン付加物と過剰なシステインを除去し、サンプルを保存緩衝液（２０ ｍＭリン酸二水素ナトリウム－リン酸水素二ナトリウムバッファー、１５０ ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ７．２）に交換し、次に０．２２ μｍのフィルター装置（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ Ｆｉｌｔｅｒ）で除菌し、抗ＣＤ７９ｂ－ＡＤＣを得、４℃で保存した。

【0135】

上記の方法で薬物複合体の調製に用いられる抗体は、ラット抗マウスＨＢ５８抗体（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－５８^TM）、抗ＣＤ７９ｂヒトマウスキメラ抗体、およびヒト化後のさまざまなバリアントを含み、さらに本発明で言及された他のコントロール抗体も含む。

【0136】

４． ２次ＡＤＣ実験でリンパ腫細胞ＢＪＡＢに対するハイブリドーマ上清の増殖阻害効果を検出。
少量または精製が困難な抗体の場合、リンカーや小分子毒素との複合実験を完了するのに十分な量がない；この場合、まずリンカーや毒素小分子と複合した抗体に結合させた後、さらに癌細胞と共培養することで、標的抗体のエンドサイトーシスにより、それに結合した抗体－薬物複合体は細胞内部に運ばれ、がん細胞を殺す。この間接反応抗体のエンドサイトーシスの性質と癌細胞に対するその増殖阻害効果は、２次ＡＤＣ実験と呼ばれる。

【0137】

２次ＡＤＣ実験を実施するために、ＨＢ５８細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－５８^TM）をＡＴＣＣから購入し、この細胞株は、ラットＢ細胞とＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞の融合後に得られたハイブリドーマ細胞であり、分泌される抗体は、マウス抗体に特異的に結合することができた。ＨＢ５８細胞株の培地の精製で、十分なＨＢ５８抗体を取得し、抗体－薬物複合体ＨＢ５８－ＡＤＣを調製した。

【0138】

ヒトリンパ腫細胞ＢＪＡＢを、１×１０^５細胞／１００ｕｌ ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレート（ＢＤファルコン、Ｃａｔ＃３５３０７２）に接種し、培地はＡＴＣＣ改変ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃Ａ１０４９１）＋ １０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１００９９１４１）であった。３７℃のインキュベーター（ＳＡＮＹＯ、ＭＣ００１８ＡＩＣ）で１日間インキュベートし、２日目にＨＢ５８－ＡＤＣと１：１の濃度比でプレミックスした抗ＣＤ７９ｂ抗体を含むハイブリドーマ上清および関連コントロールを１００ ｕｌ ／ウェルで、３倍勾配希釈で添加し、合計９つの勾配濃度ウェルと１つのコントロールウェルにした。３７℃のインキュベーターで３日間インキュベートした。５日目に、細胞増殖検出キット（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ
Ｋｉｔ－８）（ＤＯＪＩＮＤＯ、ＣＫ０４）を使用し、発色させた。キットのマニュアルに従って細胞増殖状況を検出した。マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＭＸ）を使用し、４５０／６３０ ｎｍでの吸光度値を読み取り、ＩＣ_５０と阻害率を計算した。

【0139】

５．表面プラズモン共鳴法で抗体親和性を測定
実施例では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用し、インビトロで組換えＣＤ７９ｂ細胞外ドメインタンパク質に対する抗ＣＤ７９ｂ抗体（ヒト－マウスキメラ抗体およびヒト化抗体などを含む）の結合能を検出した。

【0140】

実験はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）マシンで実施し、試験する抗体を、ＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥ、ＢＲ１００８２６）緩衝液で１０ ｕｇ／ｍｌに希釈し、、Ａｍｉｎｅ－Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥ、ＢＲ－１０００－５０）の指示に従って、試験する抗体をＣＭ５チップ（ＧＥ、ＢＲ－１００６－６８）に固定し、固定時間は３００秒、流速は１０ ｕｌ／ｍｉｎ、Ｋｉｎｅｔｉｃｓプログラムを使用して、ＨＢＳバッファーでさまざまな濃度（０．２５ ｎｍ、０．５ ｎｍ、１ ｎｍ、２ ｎｍ、４ ｎｍ、８（×２）ｎｍ、１６ ｎｍ）に勾配希釈した組換えＣＤ７９ｂ細胞外ドメインタンパク質を捕捉し、抗原－抗体結合時間を３００秒、解離時間を９００秒、抗原タンパク質の流速を３０
ｕｌ ／ ｍｉｎに設定した。解離曲線を当てはめて、さまざまな抗体のＫＤ値を計算した。上記の実験のいずれかも２５℃で行った。

【0141】

実施例１：抗ヒトＣＤ７９ｂのマウスモノクローナル抗体細胞株の産生およびスクリーニング
マウス由来の抗ヒトＣＤ７９ｂモノクローナル細胞株は、Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．、Ｌｔｄに委託し、マウスの免疫化、脾臓細胞の融合、およびハイブリドーマスクリーニング法によって得られた。免疫化に使用した抗原は、組換え発現したヒトＣＤ７９ｂ細胞外ドメインタンパク質（上海近岸株式会社、製品名は組換えヒトＣＤ７９Ｂ、製品番号はＣＡ２９、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３５に示されている）であり、免疫化には、Ｂａｌｂ／Ｃ、Ｃ３Ｈ、ＳＪＬ、Ｃ５７ＢＬ／６の合計４種のマウスを選択し、各種マウスを６匹ずつ使用した。免疫アジュバントは従来のフロイントアジュバントであり、最初の免疫の用量はマウスあたり５０ｕｇの抗原であった。２週間間隔で免疫を増強し、用量を２５ｕｇに減らし、最初の追加免疫から、各追加免疫の７日後にマウス血清を収集し、ＥＬＩＳＡによって効力を測定した（方法については、「材料と方法」の１を参照）。２回目の追加免疫の７日後に収集したマウス血清を、ＦＡＣＳ検出（方法については、「材料と方法」の２を参照）に使用し、ＣＤ７９ｂ陽性発現細胞株ＳＵ－ＤＨＬ４の表面のＣＤ７９ｂに結合できるかどうかを確認したと同時に、各マウスの結合効力を測定した。

【0142】

ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳの結果により、２回の追加免疫の後、細胞融合（電気融合法を使用）のために最も効力の高いマウスを選択し、融合効率は、脾臓の約３０００個のＢ細胞ごとに、ハイブリドーマ細胞に融合でき、融合したすべての細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、融合ごとに４０枚のプレートをプレーティングした。ＥＬＩＳＡ試験は１週間後に実行された（方法については、「材料と方法」の１を参照）。ＥＬＩＳＡ試験で陽性であったクローンの上清を、ＦＡＣＳ検出のために収集した（方法については、「材料と方法」の２を参照）。ＦＡＣＳによって陽性と検出されたすべてのクローンをサブクローン化した。１回のサブクローニング後にシングルクローンが出現するウェルにおける上清を収集し、２次ＡＤＣ検出を実行した（方法については、「材料と方法」の３を参照）。２次ＡＤＣ検出でＣＤ７９ｂの陽性発現を伴うＢＪＡＢ癌細胞の増殖を阻害できるクローンは、安定したモノクローナル細胞株が形成されるまで、サブクローニングを続けた。

【0143】

この例では、合計３つの有効な融合を行い、スクリーニング後に、合計３１のＦＡＣＳ陽性クローンを得、最後に、増殖阻害効果が最も高い１８株（以下の表１を参照）を、完全なサブクローニングのために選択した。

【0144】

【表2】

【0145】

実施例２：抗ＣＤ７９ｂハイブリドーマ抗体のシーケンシングおよび組換えキメラ抗体の構築
実施例１の表１に記載された１８のモノクローナル細胞株を、ハイブリドーマシーケンシングを行い、そして、定常領域がヒトＩｇＧ１であるキメラ抗体を組換え発現させ、そして活性を検出した。この実施例では、逆転写ＰＣＲを使用し、抗体の重鎖および軽鎖可変領域の遺伝子を増幅し、担体にライゲートし、シーケンシングにより、モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の配列を得られた。具体的には、まず、ＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ＃７４１０４）を使用し、各モノクローナル細胞株の全細胞ＲＮＡを抽出した。次に、ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのカタログ番号１８０８０－０５１）を使用し、ｃＤＮＡ一本鎖、すなわちオリゴｄＴプライマーｃＤＮＡ逆転写を調製した。これをテンプレートとして、ＰＣＲ法で、抗体の軽鎖および重鎖可変領域配列を合成し、ＰＣＲ産物をＴＡベクターｐＭＤ－１８Ｔにクローニングし、シーケンシングした。

【0146】

重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域の配列を分析することにより、翻訳後修飾される可能性のある部位を有する抗体を排除し、最後に抗体の組換え発現のために６つのクローン（３５Ｂ５、７８Ｂ６、８５Ｇ１１、８８Ｂ１２、１０４Ａ２および１０４Ｅ１）を選択した。
まず、抗体の軽鎖と重鎖の配列を、コドン最適化を経ち、全遺伝子合成を行い、かつＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩ制限部位を重鎖の両端に配置し、ＨｉｎｄＩＩＩ ／ ＢｓｉＷＩ制限部位を軽鎖の両端に配置し、２つのペアの制限部位を使用し、重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を、ヒトＩｇＧ１定常領域配列またはＫ鎖定常領域配列を含む発現ベクターＰＴＴ５に連結し、キメラ抗体の発現ベクターを構築した。２９３Ｆ細胞中の一過性発現により、組換え抗体を得た。

【0147】

実施例３．抗ＣＤ７９ｂ抗体－薬物複合体の細胞毒性の分析
６つの組換えキメラ抗体（３５Ｂ５、７８Ｂ６、８５Ｇ１１、８８Ｂ１２、１０４Ａ２及び１０４Ｅ１）をそれぞれＢＭＰ－ｖｃＭＭＡＥ（リンカー－薬物１）に複合して、抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）を作成し、７つのＣＤ７９ｂ陽性発現リンパ腫細胞株ＢＪＡＢ、Ｒａｍｏｓ、ＤｏＨＨ２、ＳＵ－ＤＨＬ－４、Ｕ－６９８－Ｍ、Ｇｒａｎｔａ－５１９、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２と２つのＣＤ７９ｂ陰性発現リンパ腫細胞株ＲａｊｉとＪｕｒｋａｔにおいて、増殖阻害試験を行った。がん細胞の培養条件は同じで（「材料と方法」の３を参照）、異なるがん細胞株の細胞プレーティング密度とＡＤＣ薬物初期濃度を下の表２に示す。

【0148】

【表3】

【0149】

表３は、各種のがん細胞株に対する６つのＡＤＣの増殖阻害効果の結果を示している。

【0150】

【表4】

【0151】

実施例４：抗ＣＤ７９ｂ抗体のヒト化
１０４Ｅ１に発現された組換えキメラ抗体の薬物複合体は、他の５つの抗体よりも、ＣＤ７９ｂの発現レベルが比較的低いリンパ腫細胞であるＧｒａｎｔａ－５１９およびＷＳＵ－ＤＬＣＬ２の増殖に対して有意に優れた阻害効果を示しているので、１０４Ｅ１のヒト化を行った。

【0152】

抗体１０４Ｅ１の配列情報（Ｋａｂａｔシステムに基づき分ける）は次のとおり：
ＨＣＤＲ１：ＧＮＴＦＴＳＹＧＩＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＨＣＤＲ２：ＧＥＩＦＰＲＳＧＮＩＹＹＮＥＫＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＨＣＤＲ３：ＡＫＧＧＴＧＤＦＤＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
ＬＣＤＲ１：ＲＳＳＱＮＩＶＨＳＤＧＮＴＹＬＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
ＬＣＤＲ２：ＫＶＳＦＲＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
ＬＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＶＰＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
ｍＶＨ：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＳＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＴＳＧＮＴＦＴＳＹＧＩＮＷＶＫＱＲＴＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＦＰＲＳＧＮＩＹＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＫＧＧＴＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７，ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示される）
ｍＶＬ：
ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＨＳＤＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＦＲＬＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＲＲＶＥＡＥＤＬＧＴＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８，ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される）

【0153】

１０４Ｅ１配列のヒト化をＮａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ に委託した。具体的なプロセスは次のとおり：ヒト生殖系列配列データベースでマウス由来の抗ＣＤ７９ｂモノクローナル抗体１０４Ｅ１の重鎖および軽鎖可変領域の配列を比較して、相同性が６４．３％である１０４Ｅ１重鎖可変領域と最も高い相同性を持つヒト生殖細胞系列配列ＩＧＨＶ１－６９ ＊ ０２と、相同性が７９．０％である１０４Ｅ１軽鎖可変領域と最も高い相同性を持つヒト生殖細胞系列配列ＩＧＫＶ２－３０ ＊ ０２を見つけた。次に、ヒト抗体ライブラリーで、これら２つの生殖細胞系列配列から生成された抗体ＡＧＣ７８７８５．１（重鎖可変領域、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）およびＢＡＣ０１７３４．１（軽鎖可変領域、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）の配列を見つけ、配列情報は次のとおり：
ＡＧＣ７８７８５．１ 免疫グロブリン重鎖可変領域 ［ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎ
ｓ）］
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＴＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＩＰＩＬＧＩＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＳＧＶＧＬＨＦＧＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
ＢＡＣ０１７３４．１ 免疫グロブリン軽鎖可変領域［ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）］
ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＫＶＳＮＲＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＧＴＨＷＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＳＡＲＱＳＴＰＦＶＣＥＹＱＧＱＳＳＤＬＰＱＰＰＶＮＡＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）

【0154】

これら２つのヒト抗体のＦＲ領域をフレームとして使用し、それらのＣＤＲ領域配列を対応するマウス１０４Ｅ１ ＣＤＲ領域配列に置き換え、ＣＤＲグラフト化ヒト化抗体を生成し、配列は次のとおり：
ＨＣＤＲをグラフトしたＶＨ：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＮＴＦＴＳＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＦＰＲＳＧＮＩＹＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＧＧＴＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；
ＬＣＤＲをグラフトしたＶＬ：
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＨＳＤＧＮＴＹＬＥＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＫＶＳＦＲＬＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）。

【0155】

抗体親和性に重要な役割を果たすマウスＦＲ領域のアミノ酸部位を見つけるために、マウス１０４Ｅ１抗体に類似した相同性を持つ結晶構造をＰＤＢデータベースに検索した。その結果、１０４Ｅ１抗体配列と７７％の相同性を持ち、十分に高い分解能を有する抗ポリシアル酸抗体Ａｂ７３５のｓｃＦＶ結晶構造が見出された。この結晶を構造テンプレートとして、２つの配列を比較し、１０４Ｅ１抗体の３ＷＢＤｓｃＦｖのホモロジーモデルを確立し、当該ホモロジーモデルに従って、１０４Ｅ１配列のＦＲ領域内の、ＣＤＲドメインによって囲まれるまたはＣＤＲドメインから５A以内のアミノ酸部位を見つけ、そして抗体の親和性に重要な役割を果たす可能性のあるこれらの部位を、ＣＤＲグラフト配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）で復帰突然変異する同時に、グリコシル化、脱アミド化、酸化部位などを回避した。重鎖可変領域には、復帰突然変異される必要が有る可能性がある部位を１５個見つけ、Ａ２４Ｔ、ＲＶ６７ＫＡ、Ｓ８４Ｒ、Ｔ９８Ｋ、Ｋ１２Ａ、Ｓ１６Ａ、Ｖ２０Ｌ、Ａ２４Ｔ、Ｒ３８Ｋ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６８Ａ、Ｉ７０Ｌ、Ｙ９５Ｆ、Ｔ９８ＫとＶ１１３Ｌを含む；軽鎖可変領域には、復帰突然変異される必要が有る可能性がある部位を７個見つけ、Ｖ３Ｌ、Ｆ４１Ｙ、ＲＲ５０ＫＬ、ＦＱ４１ＹＬ、Ｒ５１Ｌ、Ｖ８８ＬとＶ１０９Ｌを含む。次に、ジェンスクリプト（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）の標準操作手順に従ってＦａｂライブラリーを確立し、ファージディスプレイプラットフォームでスクリーニングした。マウス１０４Ｅ１抗体より高い親和性を有するヒト化配列をスクリーニングし、シーケンシングで配列を確認した。

【0156】

ヒト化後の軽鎖と重鎖の可変領域は次のとおり：
１、重鎖可変領域
ＡＳ１１１６１：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＮＴＦＴＳＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＦＰＲＳＧＮＩＹＹＮＥＫＦＫＧＫＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＧＴＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）；
ＡＳ１１１６４：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＮＴＦＴＳＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＦＰＲＳＧＮＩＹＹＮＥＫＦＫＧＫＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＧＴＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）；
ＡＳ１１２５２：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＬＳＣＫＴＳＧＮＴＦＴＳＹＧＩＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＦＰＲＳＧＮＩＹＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＧＴＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）；
ＡＳ１１２５４：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＮＴＦＴＳＹＧＩＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＦＰＲＳＧＮＩＹＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＧＴＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）；
ＡＳ１１２５９：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＮＴＦＴＳＹＧＩＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＦＰＲＳＧＮＩＹＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＧＴＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）；
２、軽鎖可変領域
ＡＳ１１１６１：
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＨＳＤＧＮＴＹＬＥＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＫＶＳＦＲＬＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）；
ＡＳ１１１６４：
ＤＶＬＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＨＳＤＧＮＴＹＬＥＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＦＲＬＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）；
ＡＳ１１２５２：
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＨＳＤＧＮＴＹＬＥＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＫＶＳＦＲＬＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）；
ＡＳ１１２５４：
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＨＳＤＧＮＴＹＬＥＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＫＶＳＦＲＬＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１） ；
ＡＳ１１２５９：
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＨＳＤＧＮＴＹＬＥＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＫＶＳＦＲＬＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩ
ＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２） 。

【0157】

ヒト化された軽鎖および重鎖を、ＩｇＧ１ Ｆｃセグメントと組換え、本発明のヒト化抗ＣＤ７９ｂモノクローナル抗体を得た。使用されるＦｃ配列は次のとおり：
重鎖定常領域：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）；
軽鎖定常領域：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）。

【0158】

遺伝子クローニングと組換え発現法を使用し、上記の抗体をクローニング、発現、精製し、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔで完成）によって抗体の親和性を測定し、最後に最高の活性を維持するヒト化抗体ＡＳ１１１６１、ＡＳ１１１６４、ＡＳ１１２５２、ＡＳ１１２５４、ＡＳ１１２５９を選択し、それらの配列は次のとおり：
ヒト化抗体ＡＳ１１１６１
重鎖
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＮＴＦＴＳＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＦＰＲＳＧＮＩＹＹＮＥＫＦＫＧＫＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＧＴＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
軽鎖
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＨＳＤＧＮＴＹＬＥＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＫＶＳＦＲＬＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）

【0159】

ヒト化抗体ＡＳ１１１６４
重鎖
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＮＴＦＴＳＹＧＩＮＷＶＲＱＡ
ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＦＰＲＳＧＮＩＹＹＮＥＫＦＫＧＫＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＧＴＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）
軽鎖
ＤＶＬＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＨＳＤＧＮＴＹＬＥＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＦＲＬＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）

【0160】

ヒト化抗体ＡＳ１１２５２
重鎖
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＬＳＣＫＴＳＧＮＴＦＴＳＹＧＩＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＦＰＲＳＧＮＩＹＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＧＴＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）
軽鎖
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＨＳＤＧＮＴＹＬＥＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＫＶＳＦＲＬＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）

【0161】

ヒト化抗体ＡＳ１１２５４
重鎖
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＮＴＦＴＳＹＧＩＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＦＰＲＳＧＮＩＹＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＧＴＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤ
ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）
軽鎖
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＨＳＤＧＮＴＹＬＥＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＫＶＳＦＲＬＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）

【0162】

ヒト化抗体ＡＳ１１２５９
重鎖
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＮＴＦＴＳＹＧＩＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＦＰＲＳＧＮＩＹＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＧＴＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３，ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示される）
軽鎖
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＨＳＤＧＮＴＹＬＥＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＫＶＳＦＲＬＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４，ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示される）。

【0163】

「材料と方法」の４で説明した方法を使用し、ヒト化後の抗体の親和性を測定し、結果を以下の表４と図１に示した。

【0164】

【表5】

【0165】

結果は、インビトロでのＣＤ７９ｂ抗原に対する本発明のヒト化抗体の結合力ＫＤ値が約０．０２ｎＭ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって実行されるＢｉａｃｏｒｅ測定）であり、ヒト－マウスキメラ抗体に匹敵することを示し、ヒト化は、抗体の親和性を有意に変化させなかった。

【0166】

実施例５：ヒトＣＤ７９ｂの細胞外ドメインに対するヒト化抗ＣＤ７９ｂ抗体のインビトロ結合活性およびリンパ腫細胞に対するその薬物複合体の増殖阻害効果の測定
「材料と方法」の１に記載されたＥＬＩＳＡを使用し、ヒトＣＤ７９ｂの細胞外ドメインに対するヒト化抗ＣＤ７９ｂ抗体のインビトロ結合活性を検出し、結果を、表５に示す。

【0167】

【表6】

【0168】

ヒト化抗体の抗体－薬物複合体を調製し、インビトロでのリンパ腫細胞に対するその増殖阻害効果（方法については実施例３を参照）を、表６に示す。

【0169】

【表7】

【0170】

実施例６：ヒト化抗ＣＤ７９ｂ抗体の生物物理学的安定性の分析
抗体の安定性を評価するために、５つのヒト化抗体をそれぞれｐＨ ４．５、６．０、７．４の異なる緩衝液に４０℃で２６日目まで貯蔵した。貯蔵の１、６、１２、２６日目に、上記のストレス条件でサンプルの特性を分析し、４℃に置いたサンプルをコントロールとした。ＥＬＩＳＡとＳＥＣ－ＨＰＬＣ（ＴＯＳＯＨ、ＴＳＫｇｅｌ、Ｇ３０００ＳＷＸＬ）でアリコートを分析した。

【0171】

結果は、５つのヒト化抗体を、３つの異なるｐＨ条件下で２６日間４０℃に置くと、ＥＬＩＳＡで検出された活性に有意差がなかったことを示し、ＳＥＣ検出では、純度もすべて９８％を超えており、明らかな集合体は見られなかった。

【0172】

実施例７：マウスのリンパ腫に対するヒト化抗ＣＤ７９ｂ抗体－薬物複合体のインビボ有効性の評価
ヒト化抗ＣＤ７９ｂ抗体の有効性を検証するために、バリアントＡＳ１１２５９を選択し、材料と方法３に記載された方法に従って、薬物複合体ＡＳ１１２５９－ＡＤＣを調製し、Ｒａｍｏｓ、ＤｏＨＨ２、Ｇｒａｎｔａ５１９とＷＳＵ－ＤＬＣＬ２を含む複数種の異種移植モデルでＡＤＣの腫瘍を消失させる能を測定した。

【0173】

リンカー－薬物の合成
リンカー－薬物１の合成

【化5】

ＷＯ２０１４１１４２０７の記載に従い、リンカー薬物１を調製した。
リンカー－薬物２の合成

【化6】

ＷＯ２０１４１１４２０７の記載に従い、リンカー薬物２を調製した。

【0174】

リンカー－薬物３の合成

【化7】

合成スキーム：

【化8】

【0175】

Ｎ－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルエチレンジアミン（７１０ ｍｇ、４．４３ ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（１．５５ ｍＬ、８．８６ ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ ｍＬ）に溶解し、クロロアセチルクロリド（５００ ｍｇ、４．４３ ｍｍｏｌ）を滴下した。反応液を室温で１６時間撹拌した後、ジクロロメタンの添加で希釈し、飽和塩化アンモニウム溶液、飽和重炭酸アンモニウム溶液、水、飽和食塩水の順で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、白色の固体として粗化合物１１を得た。

【0176】

得られた粗生成物１１をアセトン（１０ｍＬ）に溶解し、次にヨウ化ナトリウム（３．３２ｇ、２２．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を５０℃で１６時間撹拌し、次にジクロロメタンの添加で希釈し、水と飽和食塩水で順番に洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル １：１）で精製し、白色固体として化合物１２（４００ｍｇ）を得た。ＬＣ－ＭＳ（方法１）：保持時間 １．６１分間； ［Ｍ ＋ Ｎａ］^＋ ３５１．０。

【0177】

化合物ＤＭ１（４０ ｍｇ、０．０５４ ｍｍｏｌ）と化合物１２（３５．４ ｍｇ、０．１０８ ｍｍｏｌ）をＮ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ ｍＬ）に溶解し、次にジイソプロピルエチルアミン（２９μＬ、０．１６３ ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌し、分取高速液体クロマトグラフィー（方法４：８分以内に５０％－８０％Ｂ →４分以内に９５％Ｂ）で精製して、白色固体として化合物１３（４０ ｍｇ）を得た。

【0178】

化合物１３（４０ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３ｍＬ）に溶解し、次にトリフルオロ酢酸（９７ｍｇ、０．８５２ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で３時間攪拌した後、減圧濃縮して粗生成物を得た。粗生成物と化合物１４（１８．７ｍｇ、０．０６３９ｍｍｏｌ）をＮ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解し、その中に、ＨＡＴＵ（３２．４ｍｇ、０．０８５２ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（７４μＬ、０．４２６ｍｍｏｌ）に順次に添加した。反応液を室温で２時間撹拌し、分取高速液体クロマトグラフィー（方法４：８分以内に５０％－８０％Ｂ →４分以内に９５％Ｂ）で精製して、白色固体としてリンカー－薬物３（８．３ ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ （Ａ０１８）：保持時間 １．９２ 分間、［Ｍ＋Ｎａ］^＋ １１３４．３。

【0179】

リンカー－薬物４の合成

【化9】

合成スキーム：

【化10】

【0180】

化合物１５（０．２５ ｇ、０．３０５ ｍｍｏｌ、ＷＯ ２０１４１１４２０７に従って調製された）、化合物１６（０．２０ ｇ、０．２０８ ｍｍｏｌ、ＷＯ２０１６１
９２５２７に従って調製された）およびＨＯＢｔ（２８．１ｍｇ、０．２０８ｍｍｏｌ）をＮ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）に溶解し、次にピリジン（１ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、分取高速液体クロマトグラフィー（方法５：８分以内に５０％－８０％Ｂ →４分以内に９５％Ｂ）で精製して、ライトピンク固体としてリンカー－薬物４（４５ ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ （方法３）：保持時間 ２．１２７
分間、 １／２［Ｍ＋２Ｈ］^{２ ＋} ８２２．０。

【0181】

リンカー－薬物５の合成

【化11】

合成スキーム：

【化12】

【0182】

化合物１５（１４ ｍｇ、０．０１７ ｍｍｏｌ）、化合物１７（１４ ｍｇ、０．０１４ ｍｍｏｌ、ＷＯ２０１６１９２５２７に従って調製された）およびＨＯＢｔ（３ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）をＮ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解し、次にピリジン（０．５ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、分取高速液体クロマトグラフィー（方法５：８分以内に４５％－７５％Ｂ →４分以内に９５％Ｂ）で精製して、赤色固体としてリンカー－薬物５（１．８ ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ （方法２）：保持時間 １．４０分間、１／２［Ｍ＋２Ｈ］^{２ ＋} ８４３．９。

【0183】

リンカー－薬物６の合成

【化13】

合成スキーム：

【化14】

【0184】

化合物１５（１４ ｍｇ、０．０１７ ｍｍｏｌ）、化合物１８（１４ ｍｇ、０．０１３ ｍｍｏｌ、ＷＯ２０１６１９２５２７に従って調製された）およびＨＯＢｔ（３ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）をＮ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解し、次にピリジン（０．５ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、分取高速液体クロマトグラフィー（方法５：８分以内に４５％－７５％Ｂ →４分以内に９５％Ｂ）で精製して、赤色固体としてリンカー－薬物６（２．０ ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ （方法２）：保持時間 １．４０分間、１／２［Ｍ＋２Ｈ］^{２ ＋} ８６５．３。

【0185】

リンカー－薬物７の合成

【化15】

合成スキーム：

【化16】

【0186】

化合物１５（１０ ｍｇ、０．０１２ ｍｍｏｌ）、化合物１９（８ ｍｇ、０．０２４ ｍｍｏｌ、ＷＯ２０１３／１４９９４８Ａ１に従って調製された）を、Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）とピリジン（０．２ｍＬ）との混合溶液に溶解し、次にＨＯＢｔ（３．２ ｍｇ、０．０２４ ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌し、分取高速液体クロマトグラフィー（方法４：８分以内に６０％－９０％Ｂ →４分以内に９５％Ｂ）で精製して、白色固体として化合物２０（６．０ ｍｇ）を得た。ＬＣ－ＭＳ （方法３）：保持時間 ２．２４ 分間、 ［Ｍ＋Ｎａ］ ^＋ １０２８．３。

【0187】

化合物２０（６．０ｍｇ、０．０００６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解し、次にジクロロ酢酸（１５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で２時間攪拌した後、濃縮して溶剤を除去した。残留物をｎ－ヘキサン／エーテル（１ｍＬ ／ １ｍＬ）で洗浄し、濾過し、そして乾燥して、白色固体として化合物２１（４．５ｍｇ）を得た。ＬＣ－ＭＳ （方法３）：保持時間 １．５７ 分間、 ［Ｍ＋Ｈ］ ^＋ ７６８．３。

【0188】

化合物２１（４．５ ｍｇ、０．００５ ｍｍｏｌ）と化合物２２（５ ｍｇ、０．００８ ｍｍｏｌ、ＵＳ８３８９６９７Ｂ２に従って調製された）をＮ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（１ ｍＬ）に溶解し、次にジイソプロピルエチルアミン（２．６ ｍＬ、０．０２ ｍｍｏｌ）とＨＡＴＵ（３．８ ｍｇ、０．０１ ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、分取高速液体クロマトグラフィー（方法５：８分以内に５０％－８０％Ｂ →４分以内に９５％Ｂ）で精製して、赤色固体としてリンカー－薬物７（０．９ ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ （方法３）：保持時間 ２．０５分間、［Ｍ＋Ｈ］ ^＋
１３７８．３。

【0189】

リンカー－薬物８の合成

【化17】

合成スキーム：

【化18】

【0190】

化合物１５（１００ ｍｇ、０．１２２ ｍｍｏｌ）、化合物２３（６０ ｍｇ、０．０７１ ｍｍｏｌ、ＷＯ２０１６１９２５２７に従って調製された）およびＨＯＢｔ（１０ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、次にピリジン（０．５ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、分取高速液体クロマトグラフィー（方法５：８分以内に５０％－８０％Ｂ →４分以内に９５％Ｂ）で精製して、白色固体として化合物２４（３０ ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ （方法３）：保持時間 ２．４１ 分間、 １／２［Ｍ＋２Ｈ］^{２ ＋} ７６２．０。

【0191】

化合物２４（３０ｍｇ、０．０１９７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．５ｍＬ）に溶解し、次にトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）を加えた。反応液を室温で３時間撹拌した後、濃縮して溶剤を除去した後、分取高速液体クロマトグラフィー（方法Ｘ）により残留物を精製し、白色粉末状固体として化合物２５（１５ｍｇ）を得た。

【0192】

化合物２５（１５ｍｇ、０．０１９７ｍｍｏｌ）および化合物２６（７ ｍｇ、０．０１８９ ｍｍｏｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１、６６、４４９４－４５０３に従って調製された）を乾燥ＤＭＦ（０．４ｍＬ）に溶解し、次にＨＡＴＵ（７．２ｍｇ、０．０１８９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（３．７ｍｇ、０．０２８６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌し、分取高速液体クロマトグラフィー（方法５：８分以内に５０％－８０％Ｂ →４分以内に９５％Ｂ）で精製して、白色粉末状固体としてリンカー－薬物８（４．８ ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ （方法２）：保持時間 １．３７ 分間、 １／２［Ｍ＋２Ｈ］^{２ ＋} ９０９．５。

【0193】

リンカー－薬物９の合成

【化19】

合成スキーム：

【化20】

【0194】

化合物２７（１６５ｍｇ、０．１３２ｍｍｏｌ、ＷＯ２００７０１１９６８に従って調製された）および化合物２８（９０ｍｇ、０．２３１ｍｍｏｌ、ＷＯ２０１４１１４２０７に従って調製された）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、次いで、ＤＩＰＥＡ（５１ｍｇ、０．３９５ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で０．５時間撹拌し、次に氷酢酸（５０ μＬ）を加えて反応をクエンチし、溶液を、分取高速液体クロマトグラフィー（方法４：８分以内に５０％－８０％Ｂ →４分以内に９５％Ｂ）で精製して、白色粉末状固体としてリンカー－薬物９（１２８ ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ （方法２）：保持時間 １．５１ 分間、１／２［Ｍ＋２Ｈ］^{２ ＋} ７０２．８。

【0195】

リンカー－薬物１０の合成

【化21】

リンカー薬物１０の合成は、ＣＮ ２０１７１０６９１０５６．Ｘに従って調製された。

【0196】

抗体－薬物複合体の調製
トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、１０ ｅｑ、ストック溶液濃度１０ ｍＭ）を抗体ＡＳ１１２５９（ＩｇＧ１）溶液（２０ ｍＭリン酸二水素ナトリウム－リン酸水素二ナトリウムバッファー、１５０ ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ７．２）に加えた。反応溶液を３７℃の恒温水浴中で２時間インキュベートした。反応溶液をほぼ室温まで冷却し、限外濾過（Ｍｅｒｃｋ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、５００００ ＭＷＣＯ）またはゲル濾過によって緩衝液（１００ ｍＭリン酸二水素カリウム－リン酸水素二カリウム、１００ ｍＭ塩化ナトリウム、１ ｍＭジエチレントリアミン五酢酸、ｐＨ ７．０－８．０）または緩衝液（２０ ｍＭクエン酸－クエン酸三ナトリウム、５０ ｍＭ塩化ナトリウム、１ ｍＭジエチレントリアミン五酢酸、ｐＨ ６．０）に交換し、ジメチルスルホキシドおよび実施例１に得られたリンカー－薬物１（ジメチルスルホキシドストック液、抗体に対して３－１０当量）を添加し、反応溶液中のジメチルスルホキシドの体積比を最大約１０－１５％まで確保した。複合反応は１０℃で０．５時間行った。

【0197】

過剰のシステイン溶液を上記の複合溶液に加えて、未反応のリンカー－薬物１をクエンチし、クエンチ反応を１０℃で３０分間行った。反応溶液を最初に限外ろ過（Ｍｅｒｃｋ
ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、５００００ ＭＷＣＯ）またはゲルろ過にかけてリンカー－薬物１－システイン付加物と過剰なシステインを除去し、サンプルを保存緩衝液（２０ ｍＭリン酸二水素ナトリウム－リン酸水素二ナトリウムバッファー、１５０ ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ７．２）に交換し、次に得られた溶液を０．２２ μｍのフィルター装置（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ Ｆｉｌｔｅｒ）で除菌し、抗体－薬物複合体ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００１を得、４℃で保存した。

【0198】

上記の調製方法に従い、リンカー－薬物１の代わりにリンカー－薬物２～１０をそれぞれ使用し、本発明の他の抗体－薬物複合体ＡＳ１１２５９－００２からＡＳ１１２５９－０１１を調製した。抗体－薬物複合体ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００１２は、抗体ＡＳ１１２５９をリンカー－薬物１に複合することによって得られ、ただし、抗体は部分還元モードで還元され、平均に、２ペアのジスルフィド結合が還元された。
表６は、本実施で調製した抗体－薬物複合体の概要を示している。

【0199】

【表8】

【0200】

抗体－薬物複合体のキャラクタリゼーション
１）平均ＤＡＲ値の測定
平均ＤＡＲ値の計算方法は、疎水性クロマトグラフィーＨＩＣを採用する（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１３、８５、１６９９－１７０４を参照）。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００）で実行された。固定相はＴＳＫｇｅｌブチル－ＮＰＲカラム（４．６×３５ｍｍ、２．５μｍ、東ソー（上海）バイオテクノロジー株式会社）を採用した。

【0201】

溶出勾配は線形勾配で、２５分間以内に１００％緩衝液Ａ［５０ ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ ７．０）＋ １．５Ｍ硫酸アンモニウム］から１００％緩衝液Ｂ［８０％ｖ／ｖ
５０ ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ ７．０）＋ ２０％ｖ／ｖイソプロパノール］に交換した。流量は０．８ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は３０℃であり、検出波長は２３０ｎｍと２８０ｎｍに設定された。
本発明の抗体－薬物複合体の平均ＤＡＲ値の測定結果を以下の表７に示す。

【0202】

【表9】

【0203】

抗原に対する抗体－薬物複合体の親和性の測定
間接ＥＬＩＳＡ法を使用し、試験する抗体または抗体－薬物複合体の対応する抗原へ結合能を調査した：ＣＤ７９ｂ抗原を固相担体（９６ウェルマイクロタイタープレート）に接続し、固相抗原を形成し、洗浄で未結合の抗原を除去した；勾配希釈した本発明に調製された抗体－薬物複合体またはその対応する抗体を加え、その中で、特異的抗体が抗原に結合し、固相抗原－抗体複合体を形成したが、固相抗原に結合していない抗体または抗体－薬物複合体を洗浄で除去した；ＥＬＩＳＡ抗抗体を加え、固相抗原に結合した抗体またはＡＤＣ抗体に結合させ、未結合の抗抗体を洗浄で除去した；基質溶液を加え、マイクロプレートリーダーで４５０ ｎｍ／６３０ ｎｍでの光学密度（ＯＤ）値を読み取り、曲線をプロットし、ＥＣ_５０を計算した。
ＣＤ７９ｂ抗原に対する本発明の抗体－薬物複合体の親和性測定の結果を表８に示す。

【0204】

【表10】

【0205】

表８から、本発明に調製された抗体－薬物複合体は、裸の抗体ＡＳ１１２５９と比較すると、抗原に対する親和性に有意差がないことが分かる。

【0206】

抗体－薬物複合体の細胞増殖阻害作用
抗体または抗体－薬物複合体の細胞阻害活性は、以下の方法で測定された：腫瘍関連抗原または受容体タンパク質を発現する哺乳動物細胞（この試験では、ＣＤ７９ｂ抗原を発現するＲａｍｏｓ細胞を使用した）を９６ウェルプレートに接種し、ウェルあたり４０，
０００細胞を接種し、１０％ＦＢＳを含む１００ μＬのＲＰＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁した；ＡＤＣサンプルの初期濃度は２μｇ ／ ｍＬであり、２％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３倍に勾配希釈した；元の培地で、１００
μＬの勾配希釈されたＡＤＣサンプルを各ウェルに追加し、薬剤の開始濃度は１ ｕｇ／ｍｌであった。３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートし続けた；元の培地５０
μＬを除去し、各ウェルに７０ μＬのＣＣＫ－８発色溶液（ＣＣＫ－８：ＲＰＭＩ １６４０ ＝ ２：５）を加え、培養を６０～７５分間続けた；マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍ ／ ６３０ ｎｍでの吸光度値を読み取り、曲線をプロットし、ＩＣ_５０を計算した。本発明の抗体－薬物複合体の細胞増殖阻害作用の結果を表９に示す。

【0207】

【表11】

【0208】

結果は、本発明に調製された抗体－薬物複合体は、すべて良好な細胞増殖阻害効果を有することを示している。

【0209】

Ｒａｍｏｓモデル
Ｒａｍｏｓ細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の培養条件で、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。対数増殖期の細胞を数えて集め、１：１ ＰＢＳとマトリゲルに再懸濁し、マウス（ＣＢ１７／ＳＣＩＤマウス、雌、８～９週、平均体重１８．４ｇ、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．、Ｌｔｄから購入、動物証明書番号：２０１３００１８３２０８８。繁殖環境：ＳＰＦレベル）の右側に皮下接種し、マウス１匹あたりに接種する細胞の体積は０．１ｍｌであり、接種する細胞量はマウス１匹あたりに１×１０^７であり、平均腫瘍体積が１９７ｍｍ^３になったとき、体重を量り、ランダムに群分けして投与を開始し、投与方法は尾静脈投与であり、投与頻度は１回のみであった。

【0210】

結果の判断基準
相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩ（％）：ＴＧＩ ＝ １－Ｔ／Ｃ（％）。Ｔ／Ｃ％は、相対的な腫瘍増殖率であり、つまり、特定の時点でのコントロールグループに対する治療グループの相対腫瘍体積または腫瘍重量のパーセンテージ値である。ＴとＣは、それぞれ特定の時点での治療グループとコントロールグループの相対腫瘍体積（ＲＴＶ）である。
計算式は次のとおり：Ｔ／Ｃ％＝ Ｔ_ＲＴＶ／Ｃ_ＲＴＶ＊１００％（Ｔ_ＲＴＶ：治療グループの平均ＲＴＶ；Ｃ_ＲＴＶ：溶媒コントロールグループの平均ＲＴＶ；ＲＴＶ ＝ Ｖ_ｔ／Ｖ_０、Ｖ_０はグループを分ける時の動物の腫瘍体積であり、Ｖｔは、治療後の動物の腫瘍体積である）。
腫瘍体積の計算式は：長径×短径^２／２である。腫瘍細胞接種の当日を０日目と定義した。投与後、週に２回腫瘍を測定した。
溶媒コントロールグループでは、平均腫瘍体積は、投与後１４日目（ＰＧ－Ｄ１４）に
３００３ｍｍ^３に達した。安楽死を行い、投与後１４日目の他の投与グループの相対腫瘍増殖抑制率を算出した。投与後４５日目に実験を終了し、継続観察中の残りのマウスをすべて安楽死させ、腫瘍が完全に消失した各グループのマウス数を記録した。

【0211】

実験結果
実験結果を表１０、図２、図３に示する。

【0212】

【表12】

【0213】

溶媒コントロールグループでは、平均腫瘍体積は、投与後１４日目（ＰＧ－Ｄ１４）に３，００３ ｍｍ^３に達した。

【0214】

試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００１治療グループは、溶媒コントロールグループと比較して、３つの投与量（１ ｍｇ／ｋｇ、２．５ ｍｇ／ｋｇ、５ ｍｇ／ｋｇ）で著しい抗腫瘍効果を示し、明らかな用量反応関係を示した。３つの投与量の投与グループの投与後１４日目（ＰＧ－Ｄ１４）の平均腫瘍体積は、それぞれに１５５８ ｍｍ^３、３３７ ｍｍ^３、１４ ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、それぞれに、４８．７％、９０．１％、９９．６％であり、コントロールグループと比較すると、統計的に有意差がある（ｐ値は、それぞれに０．０２３、０．００１、０．００１である）。高投与量（５ｍｇ／ｋｇ）グループのマウスの腫瘍増殖は、投与後に有意に抑制され、投与後１０日目（ＰＧ－Ｄ１０）に、６匹のマウスのうち３匹の腫瘍が消失し始め、投与後２４日目（ＰＧ－Ｄ２４）には、６匹のマウスの腫瘍がすべて完全に消失し、実験終了時（ＰＧ－
Ｄ４５）に、マウスの腫瘍は成長を回復しなかった。

【0215】

試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００２治療グループは、１ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇの投与量で、溶媒コントロールグループと比較して、一定の抗腫瘍効果を有し、投与後１４日目（ＰＧ－Ｄ１４）の平均腫瘍体積は、それぞれに、２１７１ｍｍ^３、１９８６ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、それぞれに、２８．４％、３３．２％であるが、溶媒コントロールグループと比較すると、統計的に有意な差がない（ｐ値はそれぞれに０．１９５と０．１２６である）；試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００２治療グループは、５ｍｇ／ｋｇの投与量で、溶媒コントロールグループと比較して、著しい抗腫瘍効果を有し、投与後１４日目（ＰＧ－Ｄ１４）の平均腫瘍体積は、１２９４ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、６０．１％であり、コントロールグループと比較すると、統計的に有意な差がある（ｐ＝０．０１４）。試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００２の抗腫瘍効果は、明らかな用量反応関係を示した。

【0216】

試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００４治療グループは、１ｍｇ／ｋｇの投与量で、溶媒コントロールグループと比較して、一定の抗腫瘍効果を有し、投与後１４日目（ＰＧ－Ｄ１４）の平均腫瘍体積は、１，７６２ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、４２．６％であるが、溶媒コントロールグループと比較すると、統計的に有意な差がない（ｐ＝０．０７５）；試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００４治療グループは、２．５ ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇの投与量で、溶媒コントロールグループと比較して、著しい抗腫瘍効果を有し、投与後１４日目（ＰＧ－Ｄ１４）の平均腫瘍体積は、それぞれに、１，８３５ ｍｍ^３と１０３０ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、４１．２％と６６．０％であり、コントロールグループと比較すると、統計的に有意な差がある（ｐ値はそれぞれに、０．０２７と０．００３である）。試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００４の抗腫瘍効果は、明らかな用量反応関係を示した。

【0217】

試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－０１０治療グループは、溶媒コントロールグループと比較して、３つの投与量（１ ｍｇ／ｋｇ、２．５ ｍｇ／ｋｇ、５ ｍｇ／ｋｇ）で著しい抗腫瘍効果を示し、明らかな用量反応関係を示した。投与後１４日目（ＰＧ－Ｄ１４）の平均腫瘍体積は、それぞれに１，２４１ ｍｍ^３、１５ｍｍ^３、１２ ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、それぞれに、５７．８％、９９．５％、９９．６％であり、コントロールグループと比較すると、統計的に有意差がある（ｐ値は、それぞれに０．０１４、０．００１、０．００１である）。中投与量（２．５ｍｇ／ｋｇ）グループのマウスの腫瘍成長は、投与後に有意に抑制され、投与後１０日目（ＰＧ－Ｄ１０）に、６匹のマウスのうち２匹の腫瘍が消失し始め、投与後２８日目（ＰＧ－Ｄ２８）には、６匹のマウスの腫瘍がすべて消失したが、１匹のマウスの腫瘍の成長を回復したが、残り５匹のマウスが、実験終了時（ＰＧ－Ｄ４５）に、マウスの腫瘍は成長を回復しなかった；高投与量（５ｍｇ／ｋｇ）グループのマウスの腫瘍増殖は、投与後に有意に抑制され、投与後１０日目（ＰＧ－Ｄ１０）に、６匹のマウスのうち１匹の腫瘍が消失し始め、投与後２４日目（ＰＧ－Ｄ２４）には、６匹のマウスの腫瘍が全て消失し、実験終了時（ＰＧ－Ｄ４５）に、マウスの腫瘍は成長を回復しなかった。

【0218】

試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００１２治療グループは、５ｍｇ／ｋｇの投与量で、溶媒コントロールグループと比較して、著しい抗腫瘍効果を有し、投与後１４日目（ＰＧ－Ｄ１４）の平均腫瘍体積は、１３ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、９９．６％であり、コントロールグループと比較すると、統計的に有意な差がある（ｐ＝０．００１）。この投与グループのマウスの腫瘍増殖は、投与後に有意に抑制され、投与後１０日目（ＰＧ－Ｄ１０）に、６匹のマウスのうち２匹の腫瘍が消失し始め、投与後３１日目（ＰＧ－Ｄ３１）には、６匹のマウスのうち５匹の腫瘍が消失し、実験終了時（ＰＧ－Ｄ４５）に、当該５匹のマウスの腫瘍は成長を回復しなかった。

【0219】

試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－０１１治療グループは、２ｍｇ／ｋｇと５ ｍｇ／ｋｇの投与量で、溶媒コントロールグループと比較して、著しい抗腫瘍効果を示し、明らかな用量反応関係を示した。投与後１４日目（ＰＧ－Ｄ１４）の平均腫瘍体積は、８１８ｍｍ^３と１７ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、それぞれに、７３．８％と９９．４％であり、溶媒コントロールグループと比較して、統計的に有意な差がある（ｐ値はすべて０．００１）。高投与量（５ｍｇ／ｋｇ）グループのマウスの腫瘍増殖は、投与後に有意に抑制され、投与後１０日目（ＰＧ－Ｄ１０）に、６匹のマウスのうち１匹の腫瘍が消失し始め、投与後２８日目（ＰＧ－Ｄ２８）には、６匹のマウスの腫瘍がすべて消失し、実験終了時（ＰＧ－Ｄ４５）に、マウスの腫瘍は成長を回復しなかった。

【0220】

試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００８治療グループは、２．５ ｍｇ／ｋｇの投与量で、溶媒コントロールグループと比較して、著しい抗腫瘍効果を有し、投与後１４日目（ＰＧ－Ｄ１４）の平均腫瘍体積は、１，３９０ ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、５４．８％であり、コントロールグループと比較すると、統計的に有意な差がある（ｐ＝０．００９）。

【0221】

Ｇｒａｎｔａ－５１９モデル
Ｇｒａｎｔａ－５１９細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の培養条件で、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。対数増殖期の細胞を数えて集め、１：１ ＰＢＳとマトリゲルに再懸濁し、マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、雌、８～９週、平均体重２０．５ｇ、北京安凱エキスポバイオテクノロジー株式会社から購入、動物証明書番号：１１４０２４０００１２４４２。繁殖環境：ＳＰＦレベル）の右側に皮下接種し、マウス１匹あたりに接種する細胞の体積は０．１ｍｌであり、接種する細胞量はマウス１匹あたりに１×１０^７であり、平均腫瘍体積が２００ｍｍ^３になったとき、体重を量り、ランダムに群分けして投与を開始し、投与方法は尾静脈投与であり、投与頻度は１回のみであった。

【0222】

結果の判断基準
実験の最初のバッチの溶媒コントロールグループは、投与後１７日目（ＰＧ－Ｄ１７）に平均腫瘍体積が２７４４ｍｍ^３に達した。コントロールグループを安楽死させたと同時に、投与後１７日目の薬物治療グループのＴＧＩを計算した。投与後４６日目に実験を終了し、残りのマウスをすべて安楽死させ、腫瘍が完全に消失した各グループのマウス数を記録した。

【0223】

実験結果
結果を表１１と１２および図４と５に示した。

【0224】

【表13】

【0225】

【表14】

【0226】

実験の最初のバッチの溶媒コントロールグループでは、平均腫瘍体積は、投与後１７日目（ＰＧ－Ｄ１７）に２，７４４ ｍｍ^３に達した。

【0227】

試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００１治療グループは、溶媒コントロールグループと比較して、３つの投与量（３．５ ｍｇ／ｋｇ、７ ｍｇ／ｋｇ、１４ ｍｇ／ｋｇ）で著しい抗腫瘍効果を示した。３つの投与量の投与グループの投与後１７日目（ＰＧ－Ｄ１７）の平均腫瘍体積は、それぞれに６８ ｍｍ^３、６８ ｍｍ^３、４９ ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、それぞれに、９７．５％、９７．６％、９８．２％であり、コントロールグループと比較すると、統計的に非常に有意な差がある（ｐ値はすべて０．００１未満）。投与後４５日目（ＰＧ－Ｄ４５）には、３つの投与量の投与グループの平均腫瘍体積は、それぞれに、１２６８ｍｍ^３、５３６ｍｍ^３、１８４ｍｍ^３に達したことから、当該試験物質の抗腫瘍効果は、明らかな用量反応関係を示したことが分かる。

【0228】

試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００２治療グループは、溶媒コントロールグループと比較して、３つの投与量（３．５ ｍｇ／ｋｇ、７ ｍｇ／ｋｇ、１４ ｍｇ／ｋｇ）で著しい抗腫瘍効果を示し、明らかな用量反応関係を示した。低投与量（３．５ｍｇ／ｋｇ）グループでは、投与後１７日目（ＰＧ－Ｄ１７）の平均腫瘍体積は８７１ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、６８．５％であり、溶媒コントロールグループと比較して、統計的に非常に有意な差がある（ｐ ＜０．００１）。中投与量（７ｍｇ／ｋｇ）グループでは、投与後１７日目（ＰＧ－Ｄ１７）の平均腫瘍体積は２４６ ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、９０．８％であり、溶媒コントロールグループと比較して、統計的に有意差がある（ｐ ＜０．００１）。高投与量（１４ ｍｇ／ｋｇ）グループでは、投与後１７日目（ＰＧ－Ｄ１７）の平均腫瘍体積は１０１ ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、９６．３％であり、溶媒コントロールグループと比較して、統計的に有意差がある（ｐ ＜０．００１）。

【0229】

試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００４治療グループは、溶媒コントロールグループと比較して、３つの投与量（３．５ ｍｇ／ｋｇ、７ ｍｇ／ｋｇ、１４ ｍｇ／ｋｇ）で著しい抗腫瘍効果を示し、明らかな用量反応関係を示した。低投与量（３．５ｍｇ／ｋｇ）グループでは、投与後１７日目（ＰＧ－Ｄ１７）の平均腫瘍体積は７０３ ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、７４．３％であり、溶媒コントロールグループと比較して、統計的に非常に有意な差がある（ｐ ＜０．００１）。中投与量（７ ｍｇ／ｋｇ）グループでは、投与後１７日目（ＰＧ－Ｄ１７）の平均腫瘍体積は２２２ ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、９２．１％であり、溶媒コントロールグループと比較して、統計的に有意差がある（ｐ ＜０．００１）。高投与量（１４ｍｇ／ｋｇ）グループでは、投与後１７日目（ＰＧ－Ｄ１７）の平均腫瘍体積は１１７ ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、９５．７％であり、溶媒コントロールグループと比較して、統計的に有意差がある（ｐ ＜０．００１）。

【0230】

実験の二回目のバッチの溶媒コントロールグループでは、平均腫瘍体積は、投与後１７日目（ＰＧ－Ｄ１７）に２，５３５ ｍｍ^３に達した。

【0231】

試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００１（２．５ ｍｇ ／ ｋｇ）、ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００１２（６ ｍｇ ／ ｋｇ）、ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－０１１（５ ｍｇ ／ ｋｇ）およびＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－０１０（２．５ ｍｇ ／ ｋｇ）治療グループでは、投与後１７日目（ＰＧ－Ｄ１７）の平均腫瘍体積は、それぞれに、１７ ｍｍ^３、６ ｍｍ^３、１１ ｍｍ^３と９ ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、それぞれに、９９．３％、９９．８％、９９．６％と９９．６％であり、溶媒コントロールグループと比較して、いずれも統計的に有意差がある（ｐ値はすべて０．００１）。

【0232】

ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２モデル
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の培養条件で、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。対数増殖期の細胞を集め、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（雌、８～９週齢、平均体重１９．６ｇ、北京安凱エキスポバイオテクノロジー株式会社から購入、動物証明書番号：１１４０２４０００１２４４１。繁殖環境：ＳＰＦレベル）の右側に注射で皮下接種し、マウス１匹あたりに接種する細胞の体積は０．１ｍｌであり、接種する細胞量は１×１０^７であり、平均腫瘍体積が２００ｍｍ^３になったとき、体重を量り、ランダムに群分けして投与を開始し、投与方法は尾静脈投与であり、投与頻度は１回のみであった。

【0233】

結果の判断基準
実験の最初のバッチの溶媒コントロールグループでは、平均腫瘍体積は、投与後３２日目（ＰＧ－Ｄ３２）に２，１４６ ｍｍ^３に達した。溶媒コントロールグループに安楽死
を行い、３２日目の薬物治療グループのＴＧＩを算出した。投与後４３日目に実験を終了し、残りマウスをすべて安楽死させ、腫瘍が完全に消失した各グループのマウス数を記録した。

【0234】

実験の二回目のバッチの溶媒コントロールグループは、投与後３５日目（ＰＧ－Ｄ３５）に平均腫瘍体積が２，３６０ｍｍ^３に達した。溶媒コントロールグループを安楽死させたと同時に、投与後３５日目の薬物治療グループのＴＧＩを計算した。投与後４２日目に実験を終了し、残りのマウスをすべて安楽死させ、腫瘍が完全に消失した各グループのマウス数を記録した。

【0235】

実験結果
実験結果を表１３と１４および図６と７に示した。

【0236】

【表15】

【0237】

【表16】

【0238】

実験の最初のバッチの溶媒コントロールグループでは、平均腫瘍体積は、投与後３２日目（ＰＧ－Ｄ３２）に２，１４６ ｍｍ^３に達した。試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００１治療グループは、溶媒コントロールグループと比較して、３つの投与量（３．５ ｍ
ｇ／ｋｇ、７ ｍｇ／ｋｇ、１４ ｍｇ／ｋｇ）で著しい抗腫瘍効果を示し、明らかな用量反応関係を示した。低投与量（３．５ｍｇ／ｋｇ）グループでは、投与後３２日目（ＰＧ－Ｄ３２）の平均腫瘍体積は８４５ ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、６０．４％であり、溶媒コントロールグループと比較して、統計的に有意差がある（ｐ＝０．００４）。中投与量（７ ｍｇ／ｋｇ）グループでは、投与後３２日目（ＰＧ－Ｄ３２）の平均腫瘍体積は２７３ ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、８７．６％であり、溶媒コントロールグループと比較して、統計的に有意差がある（ｐ＝０．００１）。高投与量（１４ ｍｇ／ｋｇ）グループでは、投与後３２日目（ＰＧ－Ｄ３２）の平均腫瘍体積は１３２ ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、９３．７％であり、溶媒コントロールグループと比較して、統計的に非常に有意な差がある（ｐ＝０．００１）。

【0239】

試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００４治療グループは、溶媒コントロールグループと比較して、３つの投与量（３．５ ｍｇ／ｋｇ、７ ｍｇ／ｋｇ、１４ ｍｇ／ｋｇ）で、わずかな抗腫瘍効果ををもたらしたが、統計的に有意な差がない。３つの投与量グループでは、投与後３２日目（ＰＧ－Ｄ３２）の平均腫瘍体積は、それぞれに、１５２６ ｍｍ^３、１６３２ ｍｍ^３、１５２１ ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、それぞれに、２８．３％、２４．０％、２８．６％であり、ｐ値は、それぞれに、０．０８０、０．１２３、０．０８０である。

【0240】

二回目のバッチの異種移植モデルにおいて、試験薬ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００１（３．５ ｍｇ ／ ｋｇ）、ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－００１２ （８．４ ｍｇ／ｋｇ）、ＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－０１１（７ ｍｇ／ｋｇ）とＡＳ１１２５９－ＡＤＣ－０１０（３．５ ｍｇ／ｋｇ）治療グループでは、いずれも投与後で腫瘍増殖を有意に抑制し、投与後３５日目（ＰＧ－Ｄ３５）の平均腫瘍体積は、それぞれに、９１２ ｍｍ^３、８４０ ｍｍ^３、７００ ｍｍ^３と９１３ ｍｍ^３であり、相対腫瘍増殖抑制率ＴＧＩは、それぞれに、６１．０％、６４．４％、７１．４％と６２．０％であり、ｐ値は、それぞれに、＜０．００１、＜０．００１、＜０．００１と０．００１である。各グループのマウスはすべて、試験された薬物によく耐えた。

【0241】

本出願に言及されている全ての参考文献は、参照として単独に引用されるように、本出願に引用されて、参照になる。理解すべきのは、本発明の上記の開示に基づき、当業者は、本発明を様々な変更または修正を行っても良い、これらの同等の形態も本出願に添付された請求の範囲に規定される範囲内に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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