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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-19
(45)【発行日】2024-09-30
(54)【発明の名称】バフィーコート試料に使用するための膵臓癌診断用組成物
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6886 20180101AFI20240920BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240920BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20240920BHJP
C12N 15/24 20060101ALN20240920BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20240920BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6886 Z
G01N33/50 P ZNA
G01N33/68
C12N15/24
C12Q1/686 Z
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2023507694
(86)(22)【出願日】2021-08-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-12
(86)【国際出願番号】 KR2021010329
(87)【国際公開番号】W WO2022031072
(87)【国際公開日】2022-02-10
【審査請求日】2023-02-02
(31)【優先権主張番号】10-2020-0098845
(32)【優先日】2020-08-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】523037691
【氏名又は名称】ヒューベット バイオ，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，ヒョン ファ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ソビン
【審査官】藤澤 雅樹
(56)【参考文献】
【文献】特表２０２０－５１３５７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／２２５９２３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５３７６５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／００７８６６７（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／６８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
インターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上を検出可能な製剤を含み、血液由来バフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）に使用するためのものである、
膵臓癌診断用組成物であって、
前記製剤は、インターロイキン２８もしくはインターロイキン２９に結合することができる、抗体、その抗原結合断片、抗原結合断片を含む抗体類似体、もしくは受容体、またはインターロイキン２８もしくはインターロイキン２９をコードする遺伝子にハイブリダイズすることができる核酸分子であり、かつ
前記バフィーコートは、血液の遠心分離後に上部の血漿層と下部の赤血球層の間に形成される、単核球、顆粒球、およびリンパ球を含む全体白血球層であり、密度勾配媒体を使用しない血液の遠心分離で血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）を形成させることによって得られるものである、前記膵臓癌診断用組成物。
【請求項2】
前記バフィーコートは、血液を次の条件（１）～（３）から選択された一つ以上の条件で遠心分離して血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）を形成させること、およびバフィーコート層（中間）を分離することによって得られるものである、請求項１に記載の膵臓癌診断用組成物：（１）温度：２～３０℃；
（２）速度：３００ｇ～２０００ｇ；および
（３）時間：５～２０分間。
【請求項3】
前記バフィーコートは、血液を次の条件（１）～（３）から選択された一つ以上の条件で遠心分離して血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）を形成させること、およびバフィーコート層（中間）を分離することによって得られるものである、請求項１に記載の膵臓癌診断用組成物：（１）温度：４～２５℃；
（２）速度：５００ｇ～１８００ｇ；および
（３）時間：７～２０分間。
【請求項4】
請求項１～３のうちのいずれか一項の膵臓癌診断用組成物を含み、血液由来バフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）に使用するためのものである、膵臓癌診断用キットであって、
前記バフィーコートは、血液の遠心分離後に上部の血漿層と下部の赤血球層の間に形成される、単核球、顆粒球、およびリンパ球を含む全体白血球層であり、密度勾配媒体を使用しない血液の遠心分離で血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）を形成させることによって得られるものである、膵臓癌診断用キット。
【請求項5】
前記バフィーコートは、血液を次の条件（１）～（３）から選択された一つ以上の条件で遠心分離して血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）を形成させること、およびバフィーコート層（中間）を分離することによって得られるものである、請求項４に記載の膵臓癌診断用キット：
（１）温度：２～３０℃；
（２）速度：３００ｇ～２０００ｇ；および
（３）時間：５～２０分間。
【請求項6】
インターロイキン２８もしくはインターロイキン２９に結合することができる、抗体、その抗原結合断片、抗原結合断片を含む抗体類似体、もしくは受容体、またはインターロイキン２８もしくはインターロイキン２９をコードする遺伝子にハイブリダイズすることができる核酸分子を用いて、対象から分離された血液試料からインターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上のバイオマーカーを検出する段階を含み、
前記血液試料は血液由来バフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）である、
膵臓癌診断のために情報を提供する方法であって、
前記バフィーコートは、血液の遠心分離後に上部の血漿層と下部の赤血球層の間に形成される、単核球、顆粒球、およびリンパ球を含む全体白血球層であり、密度勾配媒体を使用しない血液の遠心分離で血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）を形成させることによって得られるものであり、
前記血液試料内に前記バイオマーカーが存在するか、または正常試料より高い水準で存在する場合、前記対象が膵臓癌患者であるという情報が提供される、前記方法。
【請求項7】
前記バフィーコートは、血液の遠心分離後に上部の血漿層と下部の赤血球層の間に形成された全体白血球層であって、血液を次の条件（１）～（３）から選択された一つ以上の条件で遠心分離して血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）を形成させること、およびバフィーコート層（中間）を分離することによって得られるものである、請求項６に記載の膵臓癌診断のために情報を提供する方法：（１）温度：２～３０℃；
（２）速度：３００ｇ～２０００ｇ；および
（３）時間：５～２０分間。
【請求項8】
前記バフィーコートは、血液を次の条件（１）～（３）から選択された一つ以上の条件で遠心分離して血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）を形成させること、およびバフィーコート層（中間）を分離することによって得られるものである、請求項６に記載の膵臓癌診断のために情報を提供する方法：（１）温度：４～２５℃；
（２）速度：５００ｇ～１８００ｇ；および
（３）時間：７～２０分間。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
膵臓癌診断のためのバイオマーカー、前記バイオマーカーを検出可能な製剤を含む膵臓癌診断用組成物、およびこれを用いた膵臓癌診断方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
バイオマーカー（Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）とは外部的な影響により生命体内部で誘発された変化を見つけ出す指標を意味し、癌、神経系疾患など各種疾病を診断するか特定治療剤の効能を予測するための用途として研究が活発に行われている。
【0003】
一方、膵臓（Ｐａｎｃｒｅａｓ）は胃の後ろ側に位置した２０ｃｍ程度の長さの消化液とホルモンを分泌する臓器であって、一般に膵臓癌といえば膵管癌を意味するものであり得る。膵臓癌は洋式食事が普遍化されるにつれて次第に増加する傾向であり、主に男性に多く発生すると知られており、死亡率が高い。膵臓癌は、初期には症状がよく現れなくて早期発見が難しく、喫煙、コーヒー、飲酒、肉食中心の食事習慣、糖尿、慢性膵臓炎、遺伝性非ポリポーシス大腸癌（リンチ症候群）などの病歴とβ－ナフチルアミン（Ｂｅｔａ－ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、ベンジジン（Ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）などの物質が原因と知られている。
【0004】
膵臓癌は、初期には別に症状が感じられず、すでに全身転移が起こった後に痛みと体重減少などの症状が現れるのが普通なので、死亡率が非常に高い。
【0005】
したがって、膵臓癌の早期診断法の開発が要求される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
一例は、インターロイキン２８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２８；ＩＬ－２８）、インターロイキン２９（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２９；ＩＬ－２９）、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上を含む、膵臓癌診断のためのバイオマーカーを提供する。前記バイオマーカーは、血液のバフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）で検出または分析するためのものであってもよい。
【0007】
他の例は、インターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上を検出可能な製剤を含む、膵臓癌診断用組成物または膵臓癌診断用キットを提供する。前記膵臓癌診断用組成物または膵臓癌診断用キットは、血液のバフィーコートに使用するためのものであってもよい。
【0008】
他の例は、対象から分離された血液試料でインターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上を検出する段階を含む、膵臓癌診断方法または膵臓癌診断に情報を提供する方法を提供する。前記血液試料は、血液のバフィーコートを含むものであってもよい。前記検出する段階は、血液試料でインターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上の存在有無および／または水準を測定する段階を含むことができる。
【0009】
他の例は、インターロイキン２８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２８；ＩＬ－２８）、インターロイキン２９（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２９；ＩＬ－２９）、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上のバイオマーカー、または前記バイオマーカーの検出可能な製剤の膵臓癌診断に使用するための用途および／または膵臓癌診断剤の製造に使用するための用途を提供する。前記膵臓癌診断またはバイオマーカーの検出は、血液のバフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）で行うことであってもよい。
【課題を解決するための手段】
【0010】
以下、より詳しく説明する：
【0011】
膵臓癌診断
本明細書で、“膵臓癌”は、膵臓にできる腫瘍を総称するものであって、漿液性嚢胞腫瘍、粘液性嚢胞腫瘍、膵管内乳頭粘液性腫瘍、固形乳頭状腫瘍、リンパ上皮性嚢腫、嚢腫性奇形腫などの嚢胞腫瘍のような陽性腫瘍、および膵管腺癌腫、腺房細胞癌腫、神経内分泌腫瘍などの悪性腫瘍などを例示することができる。本明細書で提供されるバイオマーカーによって診断可能な膵臓癌は前記膵臓癌から選択でき、例えば、悪性腫瘍から選択できるが、これに制限されるわけではない。
本明細書で、“膵臓癌”は、膵臓にできる腫瘍を総称するものであって、漿液性嚢胞腫瘍、粘液性嚢胞腫瘍、膵管内乳頭粘液性腫瘍、固形乳頭状腫瘍、リンパ上皮性嚢腫、嚢腫性奇形腫などの嚢胞腫瘍のような陽性腫瘍、および膵管腺癌腫、腺房細胞癌腫、神経内分泌腫瘍などの悪性腫瘍などを例示することができる。本明細書で提供されるバイオマーカーによって診断可能な膵臓癌は前記膵臓癌から選択でき、例えば、悪性腫瘍から選択できるが、これに制限されるわけではない。
【0012】
本明細書で、“診断”は、特定疾病または疾患に対する対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を判定すること、対象が特定疾病または疾患を現在有しているかどうかを判定すること、特定疾病または疾患にかかった対象の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）（例えば、前－転移性または転移性癌状態の同定、癌の段階決定、治療に対する癌の反応性決定、など）を判定すること、またはテラメトリックス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例えば、治療効能に対する情報を提供するために客体の状態をモニタリングすること）などを含むことができる。
【0013】
本明細書で、膵臓癌の診断は、対象での前記膵臓癌の発病有無および／または発病の可能性（危険性）を確認することを意味することができる。
【0014】
膵臓癌診断のためのバイオマーカー
本明細書で、膵臓癌診断のためのバイオマーカーとして、インターロイキン２８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２８；ＩＬ－２８）、インターロイキン２９（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２９；ＩＬ－２９）、またはこれらの組み合わせが提供される。本明細書に記載されたバイオマーカーは、蛋白質および／またはこれを暗号化する遺伝子を意味することができる。
本明細書で、膵臓癌診断のためのバイオマーカーとして、インターロイキン２８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２８；ＩＬ－２８）、インターロイキン２９（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２９；ＩＬ－２９）、またはこれらの組み合わせが提供される。本明細書に記載されたバイオマーカーは、蛋白質および／またはこれを暗号化する遺伝子を意味することができる。
【0015】
一具体例で、前記膵臓癌診断のためのバイオマーカーはインターロイキン２８であってもよい。他の具体例で、前記膵臓癌診断のためのバイオマーカーはインターロイキン２８およびインターロイキン２９の組み合わせであってもよい。他の具体例で、前記膵臓癌診断のためのバイオマーカーはインターロイキン２９であってもよい。
【0016】
前記バイオマーカーは、正常対照群試料に対比して膵臓癌患者試料で発現水準が有意に高いことを特徴とする。
【0017】
“インターロイキン２９（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２９、ＩＬ－２９）”は‘インターフェロンラムダ－１（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｌａｍｂｄａ－１）’とも呼ばれ、染色体１９番に位置するＩＬ－２９遺伝子によってコーディングされる蛋白質であって、螺旋形のサイトカインファミリー（ｈｅｌｉｃａｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｆａｍｉｌｙ）に属し、ＩＩＩ型インターフェロンに該当する。本明細書で、ＩＬ－２９はヒト由来のものであってもよく、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_７４２１５２．１（配列番号２）であってもよいが、これに制限されるわけではない。ＩＬ－２９を暗号化する遺伝子はヒト由来のものであってもよく、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_１７２１４０．２と表示できるが、これに制限されるわけではない。
【0018】
“インターロイキン２８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２８、ＩＬ－２８）”は２種のアイソフォームＩＬ－２８Ａ（またはＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｌａｍｂｄａ－２（ＩＦＮＬ２）とも称する）およびＩＬ－２８Ｂ（またはＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｌａｍｂｄａ－３（ＩＦＮＬ３）とも称する）を有するサイトカインの一種であって、ウイルスなどの感染に対する免疫防御作用を果たす。本明細書で、ＩＬ－２８ＡおよびＩＬ－２８Ｂはヒト由来のものであってもよく、例えば、ＩＬ－２８ＡはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_７４２１５０．１（配列番号３）（ＮＭ_１７２１３８．２）と表示され、ＩＬ－２８ＢはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_７４２１５１．２（配列番号３）（ＮＭ_１７２１３９．４）と表示できるが、これに制限されるわけではない。ＩＬ－２８ＡおよびＩＬ－２８Ｂをそれぞれ暗号化する遺伝子はヒト由来のものであってもよく、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_１７２１３８．２（ＩＬ－２８Ａ）、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_１７２１３９．４（ＩＬ－２８Ｂ）と表示できるが、これに制限されるわけではない。本明細書に使用されたものとして、ＩＬ－２８はＩＬ－２８Ａ、ＩＬ－２８Ｂ、またはこれら全てを意味することができ、例えば、ＩＬ－２８Ａを意味することができる。
【0019】
前記バイオマーカーの具体的事項を下記の表１に例示した：
【表1】
【0020】
バイオマーカーの検出可能な製剤
本明細書で、バイオマーカーの検出は、試料でのバイオマーカーの存在有無および／またはバイオマーカーの水準（濃度）を測定するのを意味することができる。
本明細書で、バイオマーカーの検出は、試料でのバイオマーカーの存在有無および／またはバイオマーカーの水準（濃度）を測定するのを意味することができる。
【0021】
本明細書で、バイオマーカー、即ち、インターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上を検出可能な製剤は、前記バイオマーカーに結合可能な全ての小分子化合物、蛋白質、核酸分子から選択できる。
【0022】
一例で、前記バイオマーカーがインターロイキン２８、およびインターロイキン２９からなる群より選択された１種以上の蛋白質である場合、前記バイオマーカーの検出可能な製剤は前記蛋白質に結合する蛋白質（例えば、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体の抗原結合断片を含む抗体類似体、受容体、など）、ペプチド、核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなど）、小分子化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ、ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0023】
他の例で、前記バイオマーカーがインターロイキン２８暗号化遺伝子、およびインターロイキン２９暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上の遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）である場合、前記バイオマーカーの検出可能な製剤は前記遺伝子に結合（または混成化）可能な核酸分子（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなど；例えば、プライマー、プローブ、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）、小分子化合物などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0024】
前記バイオマーカーの検出可能な製剤は、蛍光物質、発色物質、発光物質、放射性同位元素、重金属などの通常の標識物質で標識されるか標識されていないものであってもよい。
【0025】
一例で、前記バイオマーカーがインターロイキン２８、およびインターロイキン２９からなる群より選択された１種以上の蛋白質である場合、前記バイオマーカーの検出は通常の酵素反応、蛍光、発光および／または放射線検出などのような通常の蛋白質検出（または測定または分析）方法を通じて行うことができ、具体的に、免疫クロマトグラフィー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｏｒｅｓｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、マイクロアレイ法、フローサイトメトリー分析法などからなる群より選択された方法によって測定できるが、これに制限されるわけではない。
【0026】
他の例で、前記バイオマーカーがインターロイキン２８暗号化遺伝子、およびインターロイキン２９暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上の遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）である場合、前記バイオマーカーの検出は通常の遺伝子検出（または測定または分析）方法を用いて行うことができる。例えば、前記遺伝子と混成化可能なプライマー、プローブ、アプタマー、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する通常の遺伝子分析方法、具体的に、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ；例えば、ｑＰＣＲ、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑＰＣＲなど）、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、マイクロアレイ法、などを用いて測定することができるが、これに制限されるわけではない。一具体例で、前記プライマーは前記遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）の塩基配列中の連続する５～１０００ｂｐ、例えば１０～５００ｂｐ、２０～２００ｂｐ、または５０～２００ｂｐの遺伝子断片を検出することができるものであって、前記遺伝子断片の３'－末端および５'－末端それぞれの連続する５～１００ｂｐ、例えば、５～５０ｂｐ、５～３０ｂｐ、または１０～２５ｂｐ部位と混成化可能な（例えば、相補的な）塩基配列を含むプライマー対であってもよい。前記プローブ、アプタマー、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは全長が５～１０００ｂｐ、５～５００ｂｐ、５～２００ｂｐ、５～１００ｂｐ、５～５０ｂｐ、５～３０ｂｐ、または５～２５ｂｐであるものであってもよく、インターロイキン２８またはインターロイキン２９を暗号化する遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）の塩基配列中の連続する５～１０００ｂｐ、５～５００ｂｐ、５～２００ｂｐ、５～１００ｂｐ、５～５０ｂｐ、５～３０ｂｐ、または５～２５ｂｐの遺伝子断片と結合可能であるか混成化可能な（例えば、相補的）塩基配列を有するものであってもよい。前記‘結合可能である’とは前記遺伝子の全部または一部と共有結合などの化学的および／または物理的結合によって結合できるのを意味することができ、前記‘混成化可能である’とは前記遺伝子部位の塩基配列と８０％以上、例えば９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有することによって相補的結合が可能であるのを意味することができる。
【0027】
膵臓癌診断用組成物およびキット
本明細書で提供される膵臓癌診断用組成物は、前述のバイオマーカーの検出可能な製剤を含むものであってもよい。
本明細書で提供される膵臓癌診断用組成物は、前述のバイオマーカーの検出可能な製剤を含むものであってもよい。
【0028】
本明細書で提供される膵臓癌診断用キットは、前述のバイオマーカーの検出可能な製剤またはこれを含む膵臓癌診断用組成物、および前記検出手段を含むものであってもよい。前記検出手段は、前記バイオマーカーの検出可能な製剤で検出したバイオマーカーの存在有無および／または水準を定性的および／または定量的に分析することができる手段であってもよい。一例で、前記検出手段は、前述の蛋白質および／または遺伝子検出方法に使用するための手段のうちから選択されたものであってもよい。
【0029】
一例で、前記キットはＲＴ－ＰＣＲキット、ＤＮＡチップキット、ＥＬＩＳＡキット、蛋白質チップキット、ラピッド（ｒａｐｉｄ）キットまたはＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）キットであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0030】
膵臓癌診断方法
本明細書で提供される膵臓癌診断用組成物および診断方法（または診断に情報を提供する方法）は、対象から分離された血液試料でインターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上のバイオマーカーを検出する段階を含むことができる。
本明細書で提供される膵臓癌診断用組成物および診断方法（または診断に情報を提供する方法）は、対象から分離された血液試料でインターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上のバイオマーカーを検出する段階を含むことができる。
【0031】
前記方法において、前記バイオマーカーを検出する段階は、前記試料内のバイオマーカーの存在有無確認、バイオマーカーの水準（濃度）測定、またはこれら全てを行う段階であってもよい。前記方法において、前記試料内に前記バイオマーカーが存在するか、比較対象試料（対照群）より高い水準で存在する場合、前記試料または前記試料が由来した対象を膵臓癌患者と診断（または確認または決定）することができる。
【0032】
本明細書で提供される膵臓癌診断方法または膵臓癌診断に情報を提供する方法は、
（ａ）対象から分離された血液試料でインターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上のバイオマーカーを検出する段階、および
（ｂ）前記血液試料内に前記バイオマーカーが存在するか、比較対象試料（正常試料）より高い水準で存在する場合、前記試料または前記試料が由来した対象を膵臓癌患者と診断（または確認または決定）する段階
を含むことができる。
（ａ）対象から分離された血液試料でインターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上のバイオマーカーを検出する段階、および
（ｂ）前記血液試料内に前記バイオマーカーが存在するか、比較対象試料（正常試料）より高い水準で存在する場合、前記試料または前記試料が由来した対象を膵臓癌患者と診断（または確認または決定）する段階
を含むことができる。
【0033】
また、前記バイオマーカーの測定が試料内バイオマーカー水準を測定することである場合、前記方法は、
（ａ）対象から分離された血液試料でインターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上のバイオマーカーの水準を測定する段階、および
（ｂ）（ｉ）前記血液試料で測定されたバイオマーカー水準を比較対象試料内のバイオマーカーの水準と比較する段階、
（ｉｉ）試料で測定されたバイオマーカーの水準が比較対象試料より高い場合、前記試料または前記試料が由来した対象を膵臓癌患者と診断（または確認または決定）する段階、または
（ｉｉｉ）前記段階（ｉ）および（ｉｉ）の全て
を含むことができる。任意に、前記方法は、前記段階（ｂ）（段階（ｉ）および／または（ｉｉ））以前に、比較対象試料内のバイオマーカーの水準を測定する段階を追加的に含むことができる。
（ａ）対象から分離された血液試料でインターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上のバイオマーカーの水準を測定する段階、および
（ｂ）（ｉ）前記血液試料で測定されたバイオマーカー水準を比較対象試料内のバイオマーカーの水準と比較する段階、
（ｉｉ）試料で測定されたバイオマーカーの水準が比較対象試料より高い場合、前記試料または前記試料が由来した対象を膵臓癌患者と診断（または確認または決定）する段階、または
（ｉｉｉ）前記段階（ｉ）および（ｉｉ）の全て
を含むことができる。任意に、前記方法は、前記段階（ｂ）（段階（ｉ）および／または（ｉｉ））以前に、比較対象試料内のバイオマーカーの水準を測定する段階を追加的に含むことができる。
【0034】
本明細書で、“バイオマーカーの水準が高い”というのは、試料内バイオマーカーの濃度または前記バイオマーカーを発現する細胞の数が比較対象試料に対比して約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．５倍以上、約１．８倍以上、約２倍以上、約２．５倍以上、約３倍以上、約３．５倍以上、約４倍以上、約４．５倍以上、または約５倍以上であることを意味することができる。
【0035】
本明細書で提供される膵臓癌診断方法または膵臓癌診断に情報を提供する方法は、前記検出する段階、比較する段階、または診断する段階以後に、
（ｃ）膵臓癌患者と診断された対象に膵臓癌治療を行う段階
を追加的に含むことができる。
（ｃ）膵臓癌患者と診断された対象に膵臓癌治療を行う段階
を追加的に含むことができる。
【0036】
前記膵臓癌治療は、膵臓癌治療剤（例えば、抗ガン剤：５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、タルセバ（ｔａｒｃｅｖａ；エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ））、抗体など）の投与のような化学的療法、放射線治療、外科的手術、またはこれらのうちの２以上の組み合わせを意味することができる。
【0037】
血液試料
本明細書で提供される膵臓癌診断用組成物、キット、および方法の適用可能な診断対象試料または血液試料は診断対象から得られた（または分離されたまたは由来した）液体生検（ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ）、例えば、血液、血清、血漿、および／またはこれらから分離された細胞を含むものであってもよく、一例で、前記試料は診断対象から分離されたバフィーコートを含むものであってもよい。
本明細書で提供される膵臓癌診断用組成物、キット、および方法の適用可能な診断対象試料または血液試料は診断対象から得られた（または分離されたまたは由来した）液体生検（ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ）、例えば、血液、血清、血漿、および／またはこれらから分離された細胞を含むものであってもよく、一例で、前記試料は診断対象から分離されたバフィーコートを含むものであってもよい。
【0038】
本明細書で、バフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）は、血液の遠心分離時、上部の血漿（ｐｌａｓｍａ）層と下部の赤血球層の間に形成された全体白血球層を意味するものであって、血液中の血漿と赤血球を除いた成分（例えば、単核球、顆粒球、リンパ球など）の混合物であり、末梢血液単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）と明確に区別される意味として使用される（図３参照）。本明細書で使用された血液試料は血液由来バフィーコートであってもよく、末梢血液単核球のみからなる試料ではないのであってもよい。一例で、バフィーコートは、血液を次の条件（１）～（３）から選択された一つ以上（１、２、または３）の条件で遠心分離して上から順次に得られた血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）のうちの中間のバフィーコート層から得られたものであってもよい：
（１）温度：２～３０℃、２～２８℃、２～２５℃、２～２３℃、２～２０℃、２～１８℃、２～１５℃、２～１３℃、２～１０℃、２～８℃、２～６℃、２～５℃、２～４℃、３～３０℃、３～２８℃、３～２５℃、３～２３℃、３～２０℃、３～１８℃、３～１５℃、３～１３℃、３～１０℃、３～８℃、３～６℃、３～５℃、３～４℃、４～３０℃、４～２８℃、４～２５℃、４～２３℃、４～２０℃、４～１８℃、４～１５℃、４～１３℃、４～１０℃、４～８℃、４～６℃、４～５℃、５～３０℃、５～２８℃、５～２５℃、５～２３℃、５～２０℃、５～１８℃、５～１５℃、５～１３℃、５～１０℃、５～８℃、５～６℃、１０～３０℃、１０～２８℃、１０～２５℃、１０～２３℃、１０～２０℃、１０～１８℃、１０～１５℃、１０～１３℃、１５～３０℃、１５～２８℃、１５～２５℃、１５～２３℃、１５～２０℃、１５～１８℃、２０～３０℃、２０～２８℃、２０～２５℃、または２０～２３℃；
（２）速度：３００ｇ～２０００ｇ、３００ｇ～１８００ｇ、３００ｇ～１５００ｇ、３００ｇ～１３００ｇ、３００ｇ～１０００ｇ、５００ｇ～２０００ｇ、５００ｇ～１８００ｇ、５００ｇ～１５００ｇ、５００ｇ～１３００ｇ、５００ｇ～１０００ｇ、６００ｇ～１０００ｇ、７００ｇ～１０００ｇ、８００ｇ～１０００ｇ、５００ｇ～９００ｇ、６００ｇ～９００ｇ、７００ｇ～９００ｇ、８００ｇ～９００ｇ、５００ｇ～８００ｇ、６００ｇ～８００ｇ、または７００ｇ～８００ｇ；および
（３）時間：５～２０分、７～２０分、９～２０分、５～１５分、７～１５分、９～１５分、５～１２分、７～１２分、または９～１２分間。
（１）温度：２～３０℃、２～２８℃、２～２５℃、２～２３℃、２～２０℃、２～１８℃、２～１５℃、２～１３℃、２～１０℃、２～８℃、２～６℃、２～５℃、２～４℃、３～３０℃、３～２８℃、３～２５℃、３～２３℃、３～２０℃、３～１８℃、３～１５℃、３～１３℃、３～１０℃、３～８℃、３～６℃、３～５℃、３～４℃、４～３０℃、４～２８℃、４～２５℃、４～２３℃、４～２０℃、４～１８℃、４～１５℃、４～１３℃、４～１０℃、４～８℃、４～６℃、４～５℃、５～３０℃、５～２８℃、５～２５℃、５～２３℃、５～２０℃、５～１８℃、５～１５℃、５～１３℃、５～１０℃、５～８℃、５～６℃、１０～３０℃、１０～２８℃、１０～２５℃、１０～２３℃、１０～２０℃、１０～１８℃、１０～１５℃、１０～１３℃、１５～３０℃、１５～２８℃、１５～２５℃、１５～２３℃、１５～２０℃、１５～１８℃、２０～３０℃、２０～２８℃、２０～２５℃、または２０～２３℃；
（２）速度：３００ｇ～２０００ｇ、３００ｇ～１８００ｇ、３００ｇ～１５００ｇ、３００ｇ～１３００ｇ、３００ｇ～１０００ｇ、５００ｇ～２０００ｇ、５００ｇ～１８００ｇ、５００ｇ～１５００ｇ、５００ｇ～１３００ｇ、５００ｇ～１０００ｇ、６００ｇ～１０００ｇ、７００ｇ～１０００ｇ、８００ｇ～１０００ｇ、５００ｇ～９００ｇ、６００ｇ～９００ｇ、７００ｇ～９００ｇ、８００ｇ～９００ｇ、５００ｇ～８００ｇ、６００ｇ～８００ｇ、または７００ｇ～８００ｇ；および
（３）時間：５～２０分、７～２０分、９～２０分、５～１５分、７～１５分、９～１５分、５～１２分、７～１２分、または９～１２分間。
【0039】
本明細書で、診断対象はヒト、猿などを含む霊長類、マウス、ラットなどを含む齧歯類などを含む哺乳類のうちから選択され、膵臓癌診断を必要とする個体であってもよい。
【0040】
本明細書で、比較対象試料は正常（例えば、膵臓癌を病まない）個体から得られた（または分離されたまたは由来した）試料であって、例えば、前記正常個体はヒト、猿などを含む霊長類、マウス、ラットなどを含む齧歯類などを含む哺乳類のうちから選択されたものであって前記診断対象と同種の個体であってもよく、比較対象試料は前記比較対象からこれから得られた（または分離されたまたは由来した）血液、血清、血漿、および／またはこれらから分離された細胞を含むものであってもよく、具体的に、バフィーコートを含むものであってもよい。
【0041】
膵臓癌治療剤のスクリーニング
他の例で、候補化合物処理時の前記バイオマーカーの水準を測定して膵臓癌治療薬物の候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
他の例で、候補化合物処理時の前記バイオマーカーの水準を測定して膵臓癌治療薬物の候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【0042】
より具体的に、前記スクリーニング方法は、
生物試料に候補化合物を接触させる段階；
前記生物試料でのインターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上のバイオマーカーの水準を測定する段階；および
前記候補化合物を接触させた生物試料でのバイオマーカーの水準を候補物質を接触させない生物試料でのユビキチン分解酵素および／またはこれを暗号化する遺伝子の水準と比較する段階
を含むことができる。
生物試料に候補化合物を接触させる段階；
前記生物試料でのインターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上のバイオマーカーの水準を測定する段階；および
前記候補化合物を接触させた生物試料でのバイオマーカーの水準を候補物質を接触させない生物試料でのユビキチン分解酵素および／またはこれを暗号化する遺伝子の水準と比較する段階
を含むことができる。
【0043】
前記比較する段階は、同一な生物試料に対して候補化合物接触（処理）前後のバイオマーカーの水準をそれぞれ測定してこれを比較するか、生物試料のうちの一部にのみ候補化合物を接触させ、候補化合物を接触させた部分と候補化合物を接触させない部分のバイオマーカーの水準をそれぞれ測定してこれを比較することによって行うことができる。
【0044】
前記候補化合物を接触させた生物試料でのバイオマーカーの水準が候補物質を接触させない生物試料でのバイオマーカーの水準より減少した場合、即ち、前記候補化合物が生物試料でバイオマーカー水準を減少させるか発現を阻害した場合、前記候補化合物を膵臓癌の予防および／または治療薬物の候補物質と判断することができる。
【0045】
前記生物試料は、生体、例えば、膵臓癌患者から得られた（または分離されたまたは由来した）血液、血清、血漿、および／またはこれらから分離された細胞を含むものであってもよく、具体的に、バフィーコートを含むものであってもよい。
【0046】
前記候補化合物は、各種化合物、例えば、小分子化合物、蛋白質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、植物または動物の抽出物などからなる群より選択されたものであってもよい。
【0047】
前記生物試料でのバイオマーカーの水準測定は、通常の遺伝子または蛋白質定量検出手段によって測定するか、および／または測定された結果を評価して行うことができる。その具体的な測定手段は前述の通りである。
本発明はまた、以下に関する。
［項目１］
インターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上を検出可能な製剤を含み、
血液由来バフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）に使用するためのものである、
膵臓癌診断用組成物。
［項目２］
前記バフィーコートは、血液の遠心分離時、上部の血漿層と下部の赤血球層の間に形成された全体白血球層であって、血液を次の条件（１）～（３）から選択された一つ以上の条件で遠心分離して上から順次に得られた血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）のうちの中間のバフィーコート層から得られるものである、項目１に記載の膵臓癌診断用組成物：
（１）温度：２～３０℃；
（２）速度：３００ｇ～２０００ｇ；および
（３）時間：５～２０分間。
［項目３］
前記バフィーコートは、血液を次の条件（１）～（３）から選択された一つ以上の条件で遠心分離して上から順次に得られた血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）のうちの中間のバフィーコート層から得られるものである、項目１に記載の膵臓癌診断用組成物：
（１）温度：４～２５℃；
（２）速度：５００ｇ～１８００ｇ；および
（３）時間：７～２０分間。
［項目４］
前記検出可能な製剤は、インターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上と結合する小分子化合物、蛋白質、ペプチド、および核酸分子からなる群より選択された１種以上である、項目１～３のうちのいずれか一項に記載の膵臓癌診断用組成物。
［項目５］
項目１～３のうちのいずれか一項の膵臓癌診断用組成物を含む、膵臓癌診断用キット。
［項目６］
血液由来バフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）に使用するためのものである、項目５に記載の膵臓癌診断用キット。
［項目７］
対象から分離された血液試料からインターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上を検出する段階を含み、
前記血液試料は血液由来バフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）である、
膵臓癌診断に情報を提供する方法。
［項目８］
前記検出する段階以後に、
前記血液試料内に前記バイオマーカーが存在するか、正常試料より高い水準で存在する場合、前記試料または前記試料が由来した対象を膵臓癌患者と確認する段階
を追加的に含む、項目７に記載の膵臓癌診断に情報を提供する方法。
［項目９］
前記バフィーコートは、血液の遠心分離時、上部の血漿層と下部の赤血球層の間に形成された全体白血球層であって、血液を次の条件（１）～（３）から選択された一つ以上の条件で遠心分離して上から順次に得られた血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）のうちの中間のバフィーコート層から得られるものである、項目７に記載の膵臓癌診断に情報を提供する方法：
（１）温度：２～３０℃；
（２）速度：３００ｇ～２０００ｇ；および
（３）時間：５～２０分間。
［項目１０］
前記バフィーコートは、血液を次の条件（１）～（３）から選択された一つ以上の条件で遠心分離して上から順次に得られた血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）のうちの中間のバフィーコート層から得られるものである、項目７に記載の膵臓癌診断に情報を提供する方法：
（１）温度：４～２５℃；
（２）速度：５００ｇ～１８００ｇ；および
（３）時間：７～２０分間。
本発明はまた、以下に関する。
［項目１］
インターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上を検出可能な製剤を含み、
血液由来バフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）に使用するためのものである、
膵臓癌診断用組成物。
［項目２］
前記バフィーコートは、血液の遠心分離時、上部の血漿層と下部の赤血球層の間に形成された全体白血球層であって、血液を次の条件（１）～（３）から選択された一つ以上の条件で遠心分離して上から順次に得られた血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）のうちの中間のバフィーコート層から得られるものである、項目１に記載の膵臓癌診断用組成物：
（１）温度：２～３０℃；
（２）速度：３００ｇ～２０００ｇ；および
（３）時間：５～２０分間。
［項目３］
前記バフィーコートは、血液を次の条件（１）～（３）から選択された一つ以上の条件で遠心分離して上から順次に得られた血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）のうちの中間のバフィーコート層から得られるものである、項目１に記載の膵臓癌診断用組成物：
（１）温度：４～２５℃；
（２）速度：５００ｇ～１８００ｇ；および
（３）時間：７～２０分間。
［項目４］
前記検出可能な製剤は、インターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上と結合する小分子化合物、蛋白質、ペプチド、および核酸分子からなる群より選択された１種以上である、項目１～３のうちのいずれか一項に記載の膵臓癌診断用組成物。
［項目５］
項目１～３のうちのいずれか一項の膵臓癌診断用組成物を含む、膵臓癌診断用キット。
［項目６］
血液由来バフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）に使用するためのものである、項目５に記載の膵臓癌診断用キット。
［項目７］
対象から分離された血液試料からインターロイキン２８、インターロイキン２９、およびこれらの暗号化遺伝子からなる群より選択された１種以上を検出する段階を含み、
前記血液試料は血液由来バフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）である、
膵臓癌診断に情報を提供する方法。
［項目８］
前記検出する段階以後に、
前記血液試料内に前記バイオマーカーが存在するか、正常試料より高い水準で存在する場合、前記試料または前記試料が由来した対象を膵臓癌患者と確認する段階
を追加的に含む、項目７に記載の膵臓癌診断に情報を提供する方法。
［項目９］
前記バフィーコートは、血液の遠心分離時、上部の血漿層と下部の赤血球層の間に形成された全体白血球層であって、血液を次の条件（１）～（３）から選択された一つ以上の条件で遠心分離して上から順次に得られた血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）のうちの中間のバフィーコート層から得られるものである、項目７に記載の膵臓癌診断に情報を提供する方法：
（１）温度：２～３０℃；
（２）速度：３００ｇ～２０００ｇ；および
（３）時間：５～２０分間。
［項目１０］
前記バフィーコートは、血液を次の条件（１）～（３）から選択された一つ以上の条件で遠心分離して上から順次に得られた血漿層（上）、バフィーコート層（中間）、および赤血球層（下）のうちの中間のバフィーコート層から得られるものである、項目７に記載の膵臓癌診断に情報を提供する方法：
（１）温度：４～２５℃；
（２）速度：５００ｇ～１８００ｇ；および
（３）時間：７～２０分間。
【発明の効果】
【0048】
本発明によって、患者由来血液のみで非浸湿的であり、簡単でありながらも高い正確度で膵臓癌を早期に診断することができるので、既存の組織検査が必要であって早期診断が難しかった問題を解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図1】膵臓癌患者と正常人から得られたバフィーコート試料とＰＢＭＣ試料でのＩＬ－２９の発現量差を示すグラフである。
【図2】膵臓癌患者と正常人から得られたバフィーコート試料とＰＢＭＣ試料でのＩＬ－２８の発現量差を示すグラフである。
【図3】バフィーコート試料準備過程をＰＢＭＣ試料と比較して例示的に示す模式図である。
【図4】同一人膵臓癌患者から得られたバフィーコート試料とＰＢＭＣ試料でのＩＬ－２８の発現量（上）およびＩＬ－２９の発現量（下）を示すグラフである。
【図5a】膵臓癌患者由来のバフィーコート試料およびＰＢＭＣ試料のＩＬ－２８発現量を正常人ＰＢＭＣ試料のＩＬ－２８発現量と比較した結果を示すグラフである。
【図5b】膵臓癌患者由来のバフィーコート試料およびＰＢＭＣ試料のＩＬ－２８発現量を正常人バフィーコート試料のＩＬ－２８発現量と比較した結果を示すグラフである。
【図6a】膵臓癌患者由来のバフィーコート試料およびＰＢＭＣ試料のＩＬ－２９発現量を正常人ＰＢＭＣ試料のＩＬ－２９発現量と比較した結果を示すグラフである。
【図6b】膵臓癌患者由来のバフィーコート試料およびＰＢＭＣ試料のＩＬ－２９発現量を正常人バフィーコート試料のＩＬ－２９発現量と比較した結果を示すグラフである。
【図7a】膵臓癌患者由来のバフィーコート試料およびＰＢＭＣ試料のＩＬ－２８発現量を正常人試料のＩＬ－２８発現量（ＰＢＭＣ試料とバフィーコート試料のＩＬ－２８発現量平均値）と比較した結果を示すグラフである。
【図7b】膵臓癌患者由来のバフィーコート試料およびＰＢＭＣ試料のＩＬ－２９発現量を正常人試料のＩＬ－２９発現量（ＰＢＭＣ試料とバフィーコート試料のＩＬ－２９発現量平均値）と比較した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0050】
以下、本発明を実施例および試験例を通じてさらに詳しく説明する。しかし、これら実施例および試験例は本発明を例示するためのものであって、本発明を制限するものと解釈されてはならない。
【実施例】
【0051】
実施例１：試料の準備
１．１．バフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）試料の準備
膵臓癌で膵臓癌バイオマーカーの発現変化を確認するために、膵臓癌患者の血液由来バフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）でＩＬ－２９、およびＩＬ－２８のｍＲＮＡ発現を確認した。また、比較のために、膵臓癌を病まない一般人（以下、正常人と称する）血液由来のバフィーコートに対しても同一な試験を行った。
１．１．バフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）試料の準備
膵臓癌で膵臓癌バイオマーカーの発現変化を確認するために、膵臓癌患者の血液由来バフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）でＩＬ－２９、およびＩＬ－２８のｍＲＮＡ発現を確認した。また、比較のために、膵臓癌を病まない一般人（以下、正常人と称する）血液由来のバフィーコートに対しても同一な試験を行った。
【0052】
まず、膵臓癌患者および正常人（正常対照群）の血液５ｃｃをＥＤＴＡチューブに採取して常温に保管した。血液が入ったＥＤＴＡチューブを４℃で８００ｇで１０分間遠心分離した。血漿、バフィーコート、そして赤血球の順に分離された血液から血漿を除去しバフィーコート２５０μｌを回収して－８０℃に保管した。
【0053】
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ ｋｉｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ）を用いて推奨するプロトコルによって、冷凍保管されたバフィーコート２５０μｌからｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。１μｇのＲＮＡを使用してｃＤＮＡ合成した。ｃＤＮＡ合成ｋｉｔは、ＧｏＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。
【0054】
１．２．末梢血液単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）試料の準備
膵臓癌で膵臓癌バイオマーカーの発現変化を確認するために、膵臓癌患者の血液由来末梢血液単核球でＩＬ－２９、およびＩＬ－２８（ＩＬ－２８Ａ）のｍＲＮＡ発現を確認した。また、比較のために、膵臓癌を病まない一般人（以下、正常人と称する）血液由来の末梢血液単核球に対しても同一な試験を行った。
膵臓癌で膵臓癌バイオマーカーの発現変化を確認するために、膵臓癌患者の血液由来末梢血液単核球でＩＬ－２９、およびＩＬ－２８（ＩＬ－２８Ａ）のｍＲＮＡ発現を確認した。また、比較のために、膵臓癌を病まない一般人（以下、正常人と称する）血液由来の末梢血液単核球に対しても同一な試験を行った。
【0055】
まず、膵臓癌患者および正常人（正常対照群）の血液５ｃｃをＥＤＴＡチューブに採取して常温に保管した。血液の粘度が高い場合、単核球の分離が難しいので、１Ｘ ＰＢＳに１：１に希釈して準備した。１５ｍｌコニカルチューブ（ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅ）に比重差のあるリンパ球分離溶液（ＬｙｍｐｈｏｓｅｐＴＭ、Ｌ０５６０－５００、ｂｉｏｗｅｓｔ）を準備し、フィコールの上に血液サンプルが混ざらないように添加した。加速と減速を最小にして８００ｇで３０分間遠心分離すると、比重の異なる血漿、末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）、Ｌｙｍｐｈｏｓｅｐ、顆粒球と赤血球の順に分離される。中間に白い細胞層（単核球）を別途に回収した後、ＰＢＳを添加して４００ｇで３分間遠心分離しながら２回洗浄した後に使用し、残りは－８０℃に保管した。
【0056】
前記のように準備されたＰＢＭＣにＴｒｉｚｏｌ １ｍｌを添加して、凝っている細胞を浮遊させた後、クロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）２００μｌを添加して１２，０００ｇで１５分間遠心分離した。一番上の透明な上澄み液のみ分離して上澄み液と同一な量のイソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）を入れてよく混合した後、１２，０００ｇで１５分間遠心分離した。上澄み液を全て除去し７５％エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）１ｍｌを添加して１２，０００ｇで１０分間遠心分離して洗浄した。上澄み液を全て除去し１時間十分に乾燥させた。Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ３０μｌを添加してＲＮＡ ｐｅｌｌｅｔを十分に溶かしてＲＮＡ濃度を測定し、ｃＤＮＡ合成に１μｇのＲＮＡを使用した。ｃＤＮＡ合成はＧｏＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。
【0057】
実施例２．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ
前記実施例１で準備された試料での遺伝子発現はＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑＰＣＲで測定し、前記Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑＰＣＲはｐｒｏｂｅ－ｂａｓｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲで行った。Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲのために、マーカーであるＩＬ－２９（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_１７２１４０．２）、およびＩＬ－２８Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_１７２１３８．２；以下、ＩＬ－２８と称する）それぞれのプローブはＦＡＭ ｄｙｅで標識し、内部対照遺伝子（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ）として使用するためのＧＡＰＤＨはＨＥＸ ｄｙｅで標識した。プライマーとプローブは、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）で購入して使用した。
前記実施例１で準備された試料での遺伝子発現はＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑＰＣＲで測定し、前記Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑＰＣＲはｐｒｏｂｅ－ｂａｓｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲで行った。Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲのために、マーカーであるＩＬ－２９（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_１７２１４０．２）、およびＩＬ－２８Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_１７２１３８．２；以下、ＩＬ－２８と称する）それぞれのプローブはＦＡＭ ｄｙｅで標識し、内部対照遺伝子（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ）として使用するためのＧＡＰＤＨはＨＥＸ ｄｙｅで標識した。プライマーとプローブは、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）で購入して使用した。
【0058】
試料で各遺伝子発現を確認するために、ＧｏＴａｑ（登録商標） Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプロトコルによって最終ボリューム２０μｌに合わせて準備した。遺伝子発現試験はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３， ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）装備を使用して行い、装備のソフトウェアで提供するＳｔａｎｄａｒｄ Ｃｙｃｌｉｎｇ条件下で行われた。Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ結果は試料で測定されたＩＬ－２９、およびＩＬ－２８のｍＲＮＡ発現水準であるＣｔ値とＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現水準Ｃｔ値を抽出し、試料のＩＬ－２９、およびＩＬ－２８ ｍＲＮＡ発現水準とＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現水準の差を計算して得られたΔＣｔ値で示した。ｍＲＮＡ発現を比較するための全てのデータはΔＣｔを使用して分析した。
【0059】
使用されたプライマーとプローブの核酸配列（５’→３’）を下記の表１に示した：
【表2】
【0060】
実施例３：各試料でのマーカー発現測定
【0061】
【0062】
図１は、膵臓癌患者と正常人から得られたバフィーコート試料（膵臓癌患者５２人、正常人４４人）とＰＢＭＣ試料（膵臓癌患者５４人、正常人１９人）でのＩＬ－２９の発現量差を示すグラフである。図１から確認されるように、バフィーコート試料の場合、膵臓癌患者でのＩＬ－２９の平均ΔＣｔ値が正常人と比較して有意に減少した反面、ＰＢＭＣ試料では膵臓癌患者のＩＬ－２９の平均ΔＣｔ値が正常人に対比してむしろ増加し、その差も有意味な程度に示されなかった。前記得られた結果から、正常人と比較して、膵臓癌患者でＩＬ－２９の発現水準が有意に増加することが分かり、このような膵臓癌患者でのＩＬ－２９発現水準変化様相はＰＢＭＣ試料と有意味な差を示すことが確認された。
【0063】
図２は膵臓癌患者と正常人から得られたバフィーコート試料（膵臓癌患者５１人、正常人４３人）とＰＢＭＣ試料（膵臓癌患者５０人、正常人１９人）でのＩＬ－２８の発現量差を示すグラフである。図２から確認されるように、バフィーコート試料の場合、膵臓癌患者でのＩＬ－２８の平均ΔＣｔ値が正常人と比較して有意に減少した反面、ＰＢＭＣ試料では膵臓癌患者のＩＬ－２８の平均ΔＣｔ値が正常人に対比してむしろ増加し、その差も有意味な程度に示されなかった。前記得られた結果から、正常人と比較して、膵臓癌患者でＩＬ－２８の発現水準が有意に増加することが分かり、このような膵臓癌患者でのＩＬ－２８発現水準変化様相はＰＢＭＣ試料と有意味な差を示すことが確認された。
【0064】
前記結果を総合する時、ＩＬ－２９、およびＩＬ－２８は全て膵臓癌患者と正常人の間の発現水準が有意な差を示して膵臓癌マーカーとして有用であり、これらマーカーを使用する場合、ＰＢＭＣ試料と比較してバフィーコート試料からより有意性高い結果を得ることができるのを示す。また、ＩＬ－２９、およびＩＬ－２８のうち、特にＩＬ－２８が膵臓癌患者と正常人の間で最も大きな差を示した。
【0065】
実施例４：同一人に由来したバフィーコートとＰＢＭＣ試料の比較
同一人（膵臓癌患者（Ｐ．Ｃ）；３人）から、実施例１．１を参照してバフィーコート試料を準備し、実施例１．２を参照してＰＢＭＣ試料を準備した。前記準備されたバフィーコート試料とＰＢＭＣ試料に対して、実施例２を参照してＩＬ－２９およびＩＬ－２８のｍＲＮＡ発現水準（ΔＣｔ）を測定した。
同一人（膵臓癌患者（Ｐ．Ｃ）；３人）から、実施例１．１を参照してバフィーコート試料を準備し、実施例１．２を参照してＰＢＭＣ試料を準備した。前記準備されたバフィーコート試料とＰＢＭＣ試料に対して、実施例２を参照してＩＬ－２９およびＩＬ－２８のｍＲＮＡ発現水準（ΔＣｔ）を測定した。
【0066】
前記得られたＩＬ－２９およびＩＬ－２８のｍＲＮＡ発現水準の平均値を図４に示した（サンプル数：バフィーコート試料３；ＰＢＭＣ試料３）。図４に示されているように、ＰＢＭＣ試料と比較して、バフィーコート試料でのＩＬ－２９およびＩＬ－２８のｍＲＮＡ発現水準（ΔＣｔ）が顕著に高く示された。
【0067】
前記のように得られた膵臓癌患者（同一人）由来のバフィーコート試料およびＰＢＭＣ試料での結果を膵臓癌を病まない正常人から得られた正常人バフィーコート試料および正常人ＰＢＭＣ試料での結果と比較して図５ａ、５ｂ、６ａ、６ｂ、７ａ、および７ｂに示した（結果は全て平均値で表現される）。
【0068】
図５ａは、正常人ＰＢＭＣ試料のＩＬ－２８発現水準に対比して、膵臓癌患者由来のバフィーコート試料およびＰＢＭＣ試料のＩＬ－２８発現水準を比較した結果を示し；図５ｂは、正常人バフィーコート試料のＩＬ－２８発現水準に対比して、膵臓癌患者由来のバフィーコート試料およびＰＢＭＣ試料のＩＬ－２８発現水準を比較した結果を示す（サンプル数：正常人バフィーコート試料４３；膵臓癌バフィーコート試料３；正常人ＰＢＭＣ試料１９；膵臓癌ＰＢＭＣ試料３）。
【0069】
図６ａは、正常人ＰＢＭＣ試料のＩＬ－２９発現水準に対比して、膵臓癌患者由来のバフィーコート試料およびＰＢＭＣ試料のＩＬ－２９発現水準を比較した結果を示し；図６ｂは、正常人バフィーコート試料のＩＬ－２９発現水準に対比して、膵臓癌患者由来のバフィーコート試料およびＰＢＭＣ試料のＩＬ－２９発現水準を比較した結果を示す（サンプル数：正常人バフィーコート試料４４；膵臓癌バフィーコート試料３；正常人ＰＢＭＣ試料１９；膵臓癌ＰＢＭＣ試料３）。
【0070】
図７ａは、正常人試料のＩＬ－２８発現水準（ＰＢＭＣ試料のＩＬ－２８発現水準およびバフィーコート試料のＩＬ－２８発現水準を統合して得られた平均値）に対比して、膵臓癌患者由来のバフィーコート試料およびＰＢＭＣ試料のＩＬ－２８発現水準を比較した結果を示し；図７ｂは、正常人試料のＩＬ－２９発現水準（ＰＢＭＣ試料のＩＬ－２９発現水準およびバフィーコート試料のＩＬ－２９発現水準を統合して得られた平均値）に対比して、膵臓癌患者由来のバフィーコート試料およびＰＢＭＣ試料のＩＬ－２９発現水準を比較した結果を示す（サンプル数：正常人バフィーコート試料４３（ＩＬ－２８の場合）または４４（ＩＬ－２９の場合）；膵臓癌バフィーコート試料３；正常人ＰＢＭＣ試料１９；膵臓癌ＰＢＭＣ試料３）。
【0071】
図５ａ、５ｂ、６ａ、６ｂ、７ａ、および７ｂに示されているように、ＰＢＭＣ試料の場合、正常人と膵臓癌患者間のＩＬ－２８発現水準およびＩＬ－２９発現水準の有意味な差が観察されない反面、バフィーコート試料の場合には正常人と膵臓癌患者間のＩＬ－２８発現水準およびＩＬ－２９発現水準の顕著な差が確認された。このような結果は、バフィーコート試料でＩＬ－２８および／またはＩＬ－２９の水準を測定することによってより正確且つ効率的に膵臓癌患者を診断することができるのを示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図6a】
【図6b】
【図7a】
【図7b】
【配列表】