▶ エルジー ハウスホールド アンド ヘルスケア リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-20
(45)【発行日】2024-10-01
(54)【発明の名称】神経伝達物質分泌抑制組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 8/9789 20170101AFI20240924BHJP
A61K 8/64 20060101ALI20240924BHJP
A61K 8/49 20060101ALI20240924BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20240924BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240924BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20240924BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20240924BHJP
A61K 31/352 20060101ALI20240924BHJP
A61K 36/758 20060101ALI20240924BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240924BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240924BHJP
C07D 311/30 20060101ALN20240924BHJP
C07D 493/06 20060101ALN20240924BHJP
C07H 17/07 20060101ALN20240924BHJP
【ＦＩ】
A61K8/9789
A61K8/64
A61K8/49
A61Q19/08
A61K45/00
A61K38/08
A61K38/02
A61K31/352
A61K36/758
A61P43/00 121
A61P43/00 111
A61P17/00
C07D311/30
C07D493/06
C07H17/07
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2021549366
(86)(22)【出願日】2020-02-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-06
(86)【国際出願番号】 KR2020095007
(87)【国際公開番号】W WO2020171682
(87)【国際公開日】2020-08-27
【審査請求日】2023-02-20
(31)【優先権主張番号】10-2019-0021265
(32)【優先日】2019-02-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0002573
(32)【優先日】2020-01-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】514112488
【氏名又は名称】エルジー・エイチアンドエイチ・カンパニー・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(74)【代理人】
【識別番号】100122161
【弁理士】
【氏名又は名称】渡部 崇
(72)【発明者】
【氏名】ウ－ソン・ファン
(72)【発明者】
【氏名】ユン－スン・キム
(72)【発明者】
【氏名】ム－ヒュン・ジン
(72)【発明者】
【氏名】ネ－ギュ・カン
【審査官】阪▲崎▼ 裕美
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０７８５４３５５（ＣＮ，Ａ）
【文献】韓国公開特許第１０－２０１６－００８０４７６（ＫＲ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５１１６１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０６９６３８２０（ＣＮ，Ａ）
【文献】韓国特許第１０－０８８３７５７（ＫＲ，Ｂ１）
【文献】韓国公開特許第２００８－００５６５７６（ＫＲ，Ａ）
【文献】韓国公開特許第２００８－００８２９５５（ＫＲ，Ａ）
【文献】Hyalinum Lifting Ampoule，ＭＩＮＴＥＬ ＧＮＤＰ，ID#:5343931，2018年01月
【文献】Hyalinum Lifting Mask，ＭＩＮＴＥＬ ＧＮＤＰ，ID#:5343933，2018年01月
【文献】Botal Tension-Up Mask，ＭＩＮＴＥＬ ＧＮＤＰ，ID#:6431741，2019年03月
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ８／００－８／９９
Ａ６１Ｑ １／００－９０／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＫＯＳＭＥＴ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
Ｍｉｎｔｅｌ ＧＮＰＤ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）果実抽出物と、（ｉｉ）ＳＮＡＲＥ形成抑制剤との組合せを有効成分として含む、神経伝達物質分泌抑制用の組成物であって、
前記サンショウ果実抽出物が３～５０ｐｐｍのクエルシトリン（ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）を含み、
前記ＳＮＡＲＥ形成抑制剤がアルジレリン及びＡ型ボツリヌス神経毒素軽鎖（ＢｏＮＴ／Ａ ＬＣ）からなる群より選択される一つ以上であり、
全体組成物中に含まれる前記サンショウ果実抽出物の重量が、前記ＳＮＡＲＥ形成抑制剤の重量に対して同量以上であることを特徴とする神経伝達物質分泌抑制用の組成物。
【請求項2】
前記組成物が、皮膚しわを改善するものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記サンショウ果実抽出物は、サンショウ果実の搾汁抽出物、超音波抽出物、水抽出物、炭素数が１～４である低級アルコール水溶液抽出物及び炭素数が１～４である低級アルコール抽出物からなる群より選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
前記組成物は、前記（ｉ）サンショウ果実抽出物１００～５００ｐｐｍと、前記（ｉｉ）ＳＮＡＲＥ形成抑制剤１０～１００ｐｐｍと、を含み、含まれたサンショウ果実抽出物の重量がＳＮＡＲＥ形成抑制剤の重量に対して同量以上であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記組成物が、化粧料組成物であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物を含む、化粧品。
【請求項7】
（ｉ）サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）果実抽出物と、（ｉｉ）ＳＮＡＲＥ形成抑制剤との組合せを含む化粧料組成物を対象体に適用することを含む、皮膚美容の目的のために神経伝達物質の分泌を抑制する方法であって、
前記サンショウ果実抽出物が３～５０ｐｐｍのクエルシトリンを含み、
前記ＳＮＡＲＥ形成抑制剤がアルジレリン及びＡ型ボツリヌス神経毒素軽鎖（ＢｏＮＴ／Ａ ＬＣ）からなる群より選択される一つ以上であり、
全体組成物中に含まれる前記サンショウ果実抽出物の重量が、前記ＳＮＡＲＥ形成抑制剤の重量に対して同量以上であることを特徴とする、皮膚美容の目的のために神経伝達物質の分泌を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、神経の膜電位生成抑制による神経伝達物質分泌抑制組成物及びそれを含む皮膚しわ改善用の化粧料組成物に関する。
【0002】
本出願は、２０１９年０２月２２日出願の韓国特許出願第１０－２０１９－００２１２６５号及び２０２０年０１月０８日出願の韓国特許出願第１０－２０２０－０００２５７３号に基づく優先権を主張し、該当出願の明細書及び図面に開示された内容は、すべて本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
老化とは、時間が経つことによって身体機能及び能力が退化する現象であって、ヒトを含めたほとんどの生物体に現われる普遍的な現象である。皮膚しわの増加は、老化によって現われる外部的な変化の中でも、目立つ変化の一つである。老化によって顔及び全身にわたってしわが増加するようになり、しわの形成には老化のみならず、皮膚の水分度、紫外線に対する露出程度、筋肉の反復的な動きなどが関与する。筋肉を頻繁に動く眉間、目もと、口周りなどに深いしわができる場合が多くて、反復的な筋肉の動きまたは表情によって生成されるしわを表情しわという。
【0004】
ボツリヌス毒素（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ）とは、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）が生成する神経毒性タンパクである。ボツリヌス毒素は、神経筋接合部に作用して、神経細胞からの神経伝達物質であるアセチルコリンの分泌を抑制して筋肉を麻痺させる役割を果たす。神経細胞からアセチルコリンが分泌されるには、軸索の末端でＳＮＡＲＥ複合体が形成されなければならず、ボツリヌス毒素（血清型Ａ）の場合、ＳＮＡＲＥ複合体の構成タンパク質の一つであるＳＮＡＰ－２５を切断してＳＮＡＲＥ複合体の形成を阻止し、結果的にアセチルコリンの分泌を抑制する。
【0005】
ボツリヌス毒素は、筋肉を麻痺させてしわを改善する効果に優れる。最近、ボツリヌス毒素が美容の目的で大衆的によく使用されているが、半数致死量が１０ｎｇ／ｋｇにすぎない強い毒物であることから安全事故の危険性があり、専門医によってのみ施術可能であるため、消費者が近付しにくいという短所がある。また、施術のためには、侵襲的手術が必ず必要であるという短所がある。このような短所を補うために、副作用が低く、化粧料、外用剤などに適用可能なボトックスに類似の効能を有する素材の開発が求められている実情である。
【0006】
本明細書の全体に亘って多数の文献が参照され、その引用が示されている。引用された文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として挿入され、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者は、神経伝達物質分泌抑制の効果を奏しながらも副作用のないボトックス類似の効能物質を開発するために鋭意研究した結果、多様な天然原料の中で、サンショウ果実抽出物をＳＮＡＲＥ形成抑制剤と組み合わせる場合、神経伝達物質分泌の抑制効果及びしわ改善効果において各々の原料が有する効果よりも顕著なシナジー効果を奏することを見出し、本発明の完成に至った。
【0008】
したがって、本発明は、サンショウ果実抽出物とＳＮＡＲＥ形成抑制剤との組合せを有効成分として含む神経伝達物質分泌抑制用の組成物を提供することを目的とする。
【0009】
また、本発明は、前記組成物を含む皮膚しわ改善用の化粧料組成物及び化粧品を提供することを他の目的とする。
【0010】
本発明の他の目的及び長所は、下記の説明によって理解でき、本発明の実施例によってより明らかに理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明の一観点は、（ｉ）サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）果実抽出物と、（ｉｉ）ＳＮＡＲＥ形成抑制剤との組合せを有効成分として含む、神経伝達物質分泌抑制用の組成物を提供することである。
【0012】
サンショウは、伝統的に局所痲酔、陣痛効果のあるひりひりした神経刺激がある植物であり、葉、幹または果実を乾かして使用する。サンショウの葉、幹または果実抽出物は、主に、抗菌、抗ウイルス、抗アレルギー、陣痛及び紫外線遮断などに効果を奏すると知られている。
【0013】
本発明の組成物は、有効成分として、サンショウ果実抽出物とＳＮＡＲＥ形成抑制剤との組合せを含み、本明細書で使用される用語「抽出物」とは、原物を搾汁、または原物に抽出溶媒を処理して得た抽出結果物やこれを剤形化（例えば、粉末化）した加工物を含む意味である。
【0014】
本発明の組成物に用いられる抽出物を、原物に抽出溶媒を処理して得る場合には、多様な抽出溶媒が用いられる。例えば、極性溶媒または非極性溶媒を用い得る。極性溶媒としては、（ｉ）水、（ｉｉ）アルコール（望ましくは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、１－ペンタノール、２－ブトキシエタノール又はエチレングリコール）、（ｉｉｉ）酢酸、（ｉｖ）ＤＭＦＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ジメチルホルムアミド）及び（ｖ）ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ジメチルスルホキシド）などを使うことができ、非極性溶媒としては、アセトン、アセトニトリル、エチルアセテート、メチルアセテート、フルオロアルカン、ペンタン、ヘキサン、２，２，４－トリメチルペンタン、デカン、シクロヘキサン、シクロペンタン、ジイソブチレン、１－ペンテン、１－クロロブタン、１－クロロペンタン、ｏ－キシレン、ジイソプロピルエーテル、２－クロロプロパン、トルエン、１－クロロプロパン、クロロベンゼン、ベンゼン、ジエチルエーテル、ジエチルスルフィド、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２－ジクロロエタン、アニリン、ジエチルアミン、エーテル、四塩化炭素及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などを使い得る。
【0015】
望ましくは、本発明に用いられる抽出物は、原物を搾汁するか、または超音波抽出器を用いて抽出するか、または水、炭素数が１～４である低級アルコール及びこれらの混合物からなる群より選択されたいずれか一つを抽出溶媒として使用して抽出したものであり得るが、これらに制限されない。より望ましくは、本発明で用いられる抽出物は、サンショウ果実のエタノールまたはエタノール水溶液抽出物である。
【0016】
また、本明細書で使用される用語「抽出物」は、上述したように当業界で生抽出物（ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔ）で通用する意味を有するが、広義には、抽出物をさらに分画（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）した分画物も含む。即ち、原物を搾汁または上述した抽出溶媒を用いて得た抽出物のみならず、ここに精製過程をさらに適用して得たものも含む。例えば、前記抽出物を一定の分子量カットオフ値を有する限外濾過膜を通過させて得た分画、多様なクロマトグラフィー（大きさ、電荷、疎水性または親和性による分離のために製作されたもの）による分離など、追加的に実施された多様な精製方法によって得られた分画も、本発明の抽出物に含まれる。
【0017】
また、本発明の抽出物は、以後の追加的な過程、例えば、濾過や濃縮または乾燥過程を行って溶媒を除去したもの、または、濾過、濃縮及び乾燥を共に行ったものであり得る。濾過は、例えば、濾過紙を用いるか、または減圧濾過器を用い得、濃縮は、減圧濃縮機、乾燥は、噴霧乾燥または凍結乾燥などを行って粉末状態の抽出物を得ることもできる。
【0018】
本発明の一具現例によると、前記のように製造したサンショウ果実抽出物は、３～５０ｐｐｍのクエルシトリン（ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）を含み、望ましくは、４ｐｐｍ以上、５ｐｐｍ以上、６ｐｐｍ以上、７ｐｐｍ以上、８ｐｐｍ以上、９ｐｐｍ以上、１０ｐｐｍ以上、１１ｐｐｍ以上、１２ｐｐｍ以上、１３ｐｐｍ以上、１４ｐｐｍ以上、１５ｐｐｍ以上、１６ｐｐｍ以上、１７ｐｐｍ以上、１８ｐｐｍ以上、１９ｐｐｍ以上、２０ｐｐｍ以上、３０ｐｐｍ以上、４０ｐｐｍ以上、または５０ｐｐｍ以上のクエルシトリンを含み得る。
【0019】
本発明の組成物に含まれるＳＮＡＲＥ形成抑制剤としては、神経伝達物質の排出通路を開くのに核心作用をするＳＮＡＲＥタンパク質を切断するか、またはＳＮＡＲＥ複合体を不安定にする物質として当業界に知られている物質、例えば、韓国登録特許公報第１０－０８８３７５７号に開示されている化合物を含むが、これに制限されることではない。具体的には、本発明の組成物に含まれるＳＮＡＲＥ形成抑制剤は、アルジレリン（Ａｒｇｉｒｅｌｉｎｅ）、Ａ型ボツリヌス神経毒素軽鎖（ＢｏＮＴ／Ａ ＬＣ）、ケンペロール、ケルセチン、ミリセチン、ルテオリン、デルフィニジン、シアニジン、ブテイン及びエラグ酸からなる群より選択される一つ以上であり得る。
【0020】
本発明の組成物において、前述したサンショウ果実抽出物及びＳＮＡＲＥ形成抑制剤は、混合物及び複合物として含まれ得る。前記混合物または複合物は、サンショウ果実抽出物及びＳＮＡＲＥ形成抑制剤の各々の単一物質に比べて相乗効果を有することを特徴とする。より具体的に、相乗効果を奏するためには、前記全体組成物中に含まれる前記サンショウ果実抽出物の重量が、前記ＳＮＡＲＥ形成抑制剤の重量に対して同量以上になるべきである。
【0021】
韓国の「化粧品の全成分表示指針」によると、化粧品に使用された成分を含量の多い順に記載するように規定している。
【0022】
第６条（表示の順序）：成分の表示は、化粧品に使用された含量が多い順に記載する。但し、混合原料は個々の成分として表示し、１％以下に使用された成分、香料及び着色剤に対しては順不同で記載することができる。
【0023】
既存のしわ改善化粧品は、いわゆる「塗るボトックス」という名前でアルジレリンを１％以下に微量含有したこともあるが、このような微量のアルジレリン単独では効果がほとんどない一方、アルジレリンを１％以上に高濃度で使用するには、合成ペプチッドの特性上、価格面で不利であり、また高濃度の使用による副作用が憂慮されるという短所があった。また、既存のしわ改善用の化粧品は、アルジレリンと共にサンショウ果実抽出物を含んだこともあったが、この場合、ローズマリー葉抽出物、緑茶抽出物など、多数の天然植物抽出物を含むと共に、サンショウ果実抽出物をコンセプト原料として極微量で含んでいるだけであった。
【0024】
しかし、本発明者が見出したことによると、サンショウ果実抽出物がアルジレリンより多いか、または少なくとも同量で含まれる場合のみに相乗効果が現われ、アルジレリンよりも少ない量でコンセプト原料として極微量を含む場合には、相乗効果を奏しない（図６参照）。
【0025】
一具現例において、本発明の神経伝達物質分泌抑制用の組成物は、前記（ｉ）サンショウ果実抽出物１００～５００ｐｐｍと、前記（ｉｉ）ＳＮＡＲＥ形成抑制剤１０～１００ｐｐｍと、を含み、この際、含まれたサンショウ果実抽出物の重量がＳＮＡＲＥ形成抑制剤の重量に対して同量以上であることを特徴とする。ここで、ｐｐｍとは、組成物全体重量１，０００，０００ｍｇに入っている物質のｍｇ数（またはｍｇ／ｋｇ）を意味する。
【0026】
他の具現例で、本発明の神経伝達物質分泌抑制用の組成物に含まれる前記サンショウ果実抽出物の含量は、１００ｐｐｍ以上、２００ｐｐｍ以上、３００ｐｐｍ以上、４００ｐｐｍ以上、５００ｐｐｍ以上、６００ｐｐｍ以上、７００ｐｐｍ以上、８００ｐｐｍ以上、９００ｐｐｍ以上、または１，０００ｐｐｍ以上であり得、前記ＳＮＡＲＥ形成抑制剤の含量は、１０ｐｐｍ以上、２０ｐｐｍ以上、３０ｐｐｍ以上、４０ｐｐｍ以上、５０ｐｐｍ以上、１００ｐｐｍ以上、２００ｐｐｍ以上、３００ｐｐｍ以上、または４００ｐｐｍ以上であり得るが、ＳＮＡＲＥ形成抑制剤の含量がサンショウ果実抽出物の含量を超過しない。
【0027】
このように、サンショウ果実抽出物が、アルジレリンなどのＳＮＡＲＥ形成抑制剤よりも多く、または少なくとも同量で含まれる本発明の組成物は、ＳＮＡＲＥ複合体形成抑制に関わる相乗効果を奏することで、神経伝達物質を活性的に分泌できないようにし、これによって、筋収縮が起こりにくくなり、皮膚しわを改善する効果を奏する。本発明のこのような実質的なしわ緩和の効果に基づいて、前記サンショウ果実抽出物とＳＮＡＲＥ形成抑制剤との組合せを含む皮膚しわ改善用の化粧料組成物を提供する。
【0028】
本発明の化粧料組成物は、ボトックスに類似な効能を示し、ボトックス類似の効能とは、しわ改善、リフティング、皮脂分泌改善、にきび改善、汗分泌抑制（多汗症改善）、目の下のくぼみ改善、目の下の涙袋形成、筋弛緩及び痛症緩和、偏頭痛の改善などを意味する。
【0029】
前記化粧料組成物を皮膚外用剤として使用する場合、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤、芳香剤、界面活性剤、水、イオン性または非イオン性乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性または親油性活性剤、脂質素嚢または皮膚用外用剤に通常使用される任意の他の成分のような皮膚科学分野で通常使用される補助剤をさらに含み得る。また、前記成分は、皮膚科学分野において通常使用される量で含まれ得る。
【0030】
前記しわ改善用の組成物が皮膚外用剤の剤形で提供される場合、軟膏、パッチ、ゲル、クリームまたは噴霧剤のような剤形を有し得るが、これらに制限されない。
【0031】
また、本発明のしわ改善用の組成物は、化粧品の製造に用いられ得る。前記組成物を化粧品として使用する場合、一般的な乳化剤形及び可溶化剤形の形態に製造し得る。例えば、柔軟化粧水または栄養化粧水などのような化粧水、フェイシャルローション、ボディーローションなどのような乳液、栄養クリーム、水分クリーム、アイクリームなどのようなクリーム、エッセンス、化粧軟膏、スプレー、ゲル、パック、サンスクリーン、メークアップベース、液状、固状またはスプレータイプなどのファウンデーション、パウダー、クレンジングクリーム、クレンジングローション、クレンジングオイルのようなメークアップ除去剤、クレンジングフォーム、せっけん、ボディウォッシュなどのような洗浄剤などの剤形を有し得る。
【0032】
また、前記化粧品は、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤、芳香剤、界面活性剤、水、イオン性または非イオン性乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性または親油性活性剤、脂質素嚢または化粧品に通常使用される任意の他の成分のような皮膚科学分野で通常使用される補助剤をさらに含み得る。
【発明の効果】
【0033】
本発明による神経伝達物質分泌抑制用の組成物は、ＳＮＡＲＥ複合体形成抑制に関わるシナジー効果を奏することで、神経伝達物質を活性的に分泌できないようにし、これによって、筋収縮が起こりにくくなり、皮膚しわを改善する効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1】サンショウ果実に含有されていると知られたハイペロサイド（ｈｙｐｅｒｏｓｉｄｅ）とクェルシトリン（ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）各々の筋収縮抑制効果を確認した結果を示す。
【図2】神経細胞におけるサンショウ果実抽出物の電気信号伝達抑制能を示す。
【図3】サンショウ果実抽出物の神経伝達物質分泌の抑制効果を示す。
【図4】サンショウ果実抽出物の細胞毒性評価を示す。
【図5】サンショウ果実抽出物の筋麻痺効能を示す。
【図6】サンショウ抽出物とアルジレリン（アセチルヘキサペプチド－８）との相乗効果を示す。
【図7】アルジレリン単独処理時の筋収縮抑制効果を示す。
【図8】サンショウ抽出物とボトックス類似の効能物質であるＢｏＮＴ／Ａ ＬＣとの相乗効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0035】
以下、実施例によって本発明をより詳しく説明する。しかし、これらは本発明をより詳細に説明するためのものであるだけで、本発明の権利範囲がこれによって限定されないことは本発明が属する技術分野における通常の知識を持つ者にとって自明であろう。
【実施例】
【0036】
１．サンショウ抽出物の製造及び効能成分の確認（図１）
（１）サンショウ抽出物の製造
サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）果実を洗浄、乾燥及び粉碎し、それを用いてサンショウエタノール抽出物を製造した。具体的には、エタノール抽出物は、抽出溶媒として７０％エタノールを加えて、常温で２時間抽出した後、得られた抽出物を濾過し濃縮して粉末化する方法で製造した。
（１）サンショウ抽出物の製造
サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）果実を洗浄、乾燥及び粉碎し、それを用いてサンショウエタノール抽出物を製造した。具体的には、エタノール抽出物は、抽出溶媒として７０％エタノールを加えて、常温で２時間抽出した後、得られた抽出物を濾過し濃縮して粉末化する方法で製造した。
【0037】
（２）効能成分の確認
サンショウ果実に含有されていると知られたハイペロサイド（ｈｙｐｅｒｏｓｉｄｅ）とクェルシトリン（ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）各々の筋収縮抑制効果をテストするために、シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）システムを導入した。線虫は、野生型Ｎ２株（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ Ｎ２ ｓｔｒａｉｎ）を用い、ＣＧＣ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ）から供給を受けた。同調された若い成虫期（Ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ ｙｏｕｎｇ－ａｄｕｌｔ ｓｔａｇｅ）のシノラブディス・エレガンスをＭ９（＋０．０１％ＰＥＧ，０．１％ＤＭＳＯ）バッファーで採取して２回ウォッシング及びスピンダウンした後、適正量のＭ９バッファーで希釈して５０ｕｌずつｅ－チューブに分配した。各化合物を入れた後、最終反応体積を１ｍｌに合わせた。各化合物を２０℃のインキュベーターで１時間処理した後、１ｍｌを全て２４ウェルプレートに移してビデオ録画を行った。録画されたビデオで、左右一回の往復をスイミング回数１回にして１０匹に対して２０秒間のスイミング回数を測定し、１分当たりのスイミング回数を計算した。筋麻痺効果は、１００－（実験群のスイミング回数）／（対照群のスイミング回数）×１００で計算した。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｅｒｒｏｒ ｏｆ Ｍｅａｎ）で計算し、統計処理はスチューデントｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）を用いた。
サンショウ果実に含有されていると知られたハイペロサイド（ｈｙｐｅｒｏｓｉｄｅ）とクェルシトリン（ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）各々の筋収縮抑制効果をテストするために、シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）システムを導入した。線虫は、野生型Ｎ２株（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ Ｎ２ ｓｔｒａｉｎ）を用い、ＣＧＣ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ）から供給を受けた。同調された若い成虫期（Ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ ｙｏｕｎｇ－ａｄｕｌｔ ｓｔａｇｅ）のシノラブディス・エレガンスをＭ９（＋０．０１％ＰＥＧ，０．１％ＤＭＳＯ）バッファーで採取して２回ウォッシング及びスピンダウンした後、適正量のＭ９バッファーで希釈して５０ｕｌずつｅ－チューブに分配した。各化合物を入れた後、最終反応体積を１ｍｌに合わせた。各化合物を２０℃のインキュベーターで１時間処理した後、１ｍｌを全て２４ウェルプレートに移してビデオ録画を行った。録画されたビデオで、左右一回の往復をスイミング回数１回にして１０匹に対して２０秒間のスイミング回数を測定し、１分当たりのスイミング回数を計算した。筋麻痺効果は、１００－（実験群のスイミング回数）／（対照群のスイミング回数）×１００で計算した。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｅｒｒｏｒ ｏｆ Ｍｅａｎ）で計算し、統計処理はスチューデントｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）を用いた。
【0038】
実験結果、ハイペロサイドの筋収縮効果は微々たることに対し、クェルシトリンの場合、筋収縮抑制効果が確認された（図１）。
【0039】
（３）クェルシトリンの含量確認
前記製造したサンショウエタノール抽出物とサンショウ熱水抽出物、サンショウ超音波抽出物に含まれているクェルシトリンの含量を測定した。サンショウ熱水抽出物は、ＢＩＯ ＦＤ＆Ｃ社の「サンショウ果実抽出物」を使用し、サンショウ超音波抽出物は、Ｔｈｅ Ｇａｒｄｅｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌｓｏｌｕｔｉｏｎ社のＪｅｊｕ Ｃｈｏｐｈｉ（サンショウ果実抽出物）を使用した。超音波抽出したサンショウ抽出物のクェルシトリンの含量は４ｐｐｍであり、熱水抽出物の場合、クェルシトリン含量３ｐｐｍ、エタノール抽出物の場合、クェルシトリン含量は９ｐｐｍで測定されることから、他の溶媒抽出法よりもエタノール抽出時にクェルシトリンの含量が大幅高くなることが確認された。一方、カホクザンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｂｕｎｇｅａｎｕｍ）抽出物であるＩｎｄｅｎａ社の「Ｚａｎｔｈａｌｅｎｅ」からは、クェルシトリンが検出されなかった（１ｐｐｍ未満）。
前記製造したサンショウエタノール抽出物とサンショウ熱水抽出物、サンショウ超音波抽出物に含まれているクェルシトリンの含量を測定した。サンショウ熱水抽出物は、ＢＩＯ ＦＤ＆Ｃ社の「サンショウ果実抽出物」を使用し、サンショウ超音波抽出物は、Ｔｈｅ Ｇａｒｄｅｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌｓｏｌｕｔｉｏｎ社のＪｅｊｕ Ｃｈｏｐｈｉ（サンショウ果実抽出物）を使用した。超音波抽出したサンショウ抽出物のクェルシトリンの含量は４ｐｐｍであり、熱水抽出物の場合、クェルシトリン含量３ｐｐｍ、エタノール抽出物の場合、クェルシトリン含量は９ｐｐｍで測定されることから、他の溶媒抽出法よりもエタノール抽出時にクェルシトリンの含量が大幅高くなることが確認された。一方、カホクザンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｂｕｎｇｅａｎｕｍ）抽出物であるＩｎｄｅｎａ社の「Ｚａｎｔｈａｌｅｎｅ」からは、クェルシトリンが検出されなかった（１ｐｐｍ未満）。
【0040】
２．神経細胞における電気信号伝達抑制能力（図２）
（１）実験方法
上記のように製造したサンショウ果実（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ ｆｒｕｉｔ）エタノール抽出物を用いて神経細胞における電気信号伝達抑制能力を測定した。具体的には、神経細胞株であるＮＧ１０８－１５でＫＣｌ刺激によるカルシウムイオン流入の変化を測定するために、ＦＬＩＰＲ Ｃａｌｃｉｕｍ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用した。ＮＧ１０８－１５を１×１０４セル／ウェルになるよう、ポリ－Ｌ－リシンがコーティングされた９６ウェルプレートに分注した。分注してから３日後にサンショウ果実抽出物をｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに希釈して１時間処理した。その後、ローディングバッファーを処理し、３７℃でＣＯ２インキュベーターで２時間培養した。ローディングバッファーには、カルシウムイオンに反応する蛍光物質を含み、マスキングダイ（ｍａｓｋｉｎｇ ｄｙｅ）によって細胞内のカルシウムイオンのみと反応して蛍光を示す。培養後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎを用いて細胞に７０ｍＭ ＫＣｌで刺激を与え、４８５／５２５ｎｍで蛍光を測定した。
（１）実験方法
上記のように製造したサンショウ果実（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ ｆｒｕｉｔ）エタノール抽出物を用いて神経細胞における電気信号伝達抑制能力を測定した。具体的には、神経細胞株であるＮＧ１０８－１５でＫＣｌ刺激によるカルシウムイオン流入の変化を測定するために、ＦＬＩＰＲ Ｃａｌｃｉｕｍ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用した。ＮＧ１０８－１５を１×１０４セル／ウェルになるよう、ポリ－Ｌ－リシンがコーティングされた９６ウェルプレートに分注した。分注してから３日後にサンショウ果実抽出物をｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに希釈して１時間処理した。その後、ローディングバッファーを処理し、３７℃でＣＯ２インキュベーターで２時間培養した。ローディングバッファーには、カルシウムイオンに反応する蛍光物質を含み、マスキングダイ（ｍａｓｋｉｎｇ ｄｙｅ）によって細胞内のカルシウムイオンのみと反応して蛍光を示す。培養後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎを用いて細胞に７０ｍＭ ＫＣｌで刺激を与え、４８５／５２５ｎｍで蛍光を測定した。
【0041】
（２）実験結果
神経細胞において７０ｍＭ ＫＣｌで脱分極を誘導すると、Ｃａ２＋が細胞内に流入する。ここにサンショウ果実抽出物を共に処理すると、脱分極によるＣａ２＋の流入が有意に抑制された（図２）。これによって、サンショウ果実抽出物が神経細胞で電気信号の伝達を抑制する能力があることが分かった。
神経細胞において７０ｍＭ ＫＣｌで脱分極を誘導すると、Ｃａ２＋が細胞内に流入する。ここにサンショウ果実抽出物を共に処理すると、脱分極によるＣａ２＋の流入が有意に抑制された（図２）。これによって、サンショウ果実抽出物が神経細胞で電気信号の伝達を抑制する能力があることが分かった。
【0042】
３．サンショウ果実抽出物の神経伝達物質分泌の抑制効果（図３）
（１）実験方法
神経細胞と筋細胞の共同培養条件で、神経伝達物質の分泌変化を調べるために、Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｕｐｔａｋｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用した。共同培養してから３日目に、染料溶液を３０分間処理し、その後、前記製造したサンショウ果実抽出物をＨＢＳＳ ｂｕｆｆｅｒ（ＨＢＳＳ＋２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）に希釈して３０分間処理した。染料溶液は、神経伝達物質を模倣する蛍光物質とマスキングダイを含むようにした。マスキングダイによって蛍光物質が細胞内に入ると、蛍光を示し、放出されると、蛍光が消える。処理後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎを用いて細胞に７０ｍＭ ＫＣｌで刺激を与えて４８５／５２５ｎｍで蛍光を測定した。
（１）実験方法
神経細胞と筋細胞の共同培養条件で、神経伝達物質の分泌変化を調べるために、Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｕｐｔａｋｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用した。共同培養してから３日目に、染料溶液を３０分間処理し、その後、前記製造したサンショウ果実抽出物をＨＢＳＳ ｂｕｆｆｅｒ（ＨＢＳＳ＋２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）に希釈して３０分間処理した。染料溶液は、神経伝達物質を模倣する蛍光物質とマスキングダイを含むようにした。マスキングダイによって蛍光物質が細胞内に入ると、蛍光を示し、放出されると、蛍光が消える。処理後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎを用いて細胞に７０ｍＭ ＫＣｌで刺激を与えて４８５／５２５ｎｍで蛍光を測定した。
【0043】
（２）実験結果
サンショウ果実抽出物が電気信号の伝達を抑制して最終的に神経伝達物質分泌を抑制するかを確認した。神経伝達物質は、神経細胞に活動電位が発生するとき、シナプス前ニューロン（Ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）におけるシナプス間隙から放出される。放出された神経伝達物質は、筋肉にあるシナプス後ニューロン（ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）の水溶体に結合して運動ニューロンに活動電位を生成し、その後、信号は筋収縮に変換される。この過程を研究するために、神経筋接合部（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が形成された環境が適切な研究条件となるため、ＮＧ１０８－１５とＣ２Ｃ１２を共培養して神経筋接合部を形成するインビトロ条件を作った。
サンショウ果実抽出物が電気信号の伝達を抑制して最終的に神経伝達物質分泌を抑制するかを確認した。神経伝達物質は、神経細胞に活動電位が発生するとき、シナプス前ニューロン（Ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）におけるシナプス間隙から放出される。放出された神経伝達物質は、筋肉にあるシナプス後ニューロン（ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）の水溶体に結合して運動ニューロンに活動電位を生成し、その後、信号は筋収縮に変換される。この過程を研究するために、神経筋接合部（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が形成された環境が適切な研究条件となるため、ＮＧ１０８－１５とＣ２Ｃ１２を共培養して神経筋接合部を形成するインビトロ条件を作った。
【0044】
実験結果、対照群と比較したとき、ＫＣｌ処理後に蛍光値が減ったことから、ＫＣｌ処理が神経伝達物質の分泌を促進したことが分かった。ここに、サンショウ果実抽出物を共に処理したところ、ＫＣｌによる神経伝達物質の分泌が減少することが観察された（図３）。これによって、サンショウ果実抽出物が神経伝達物質の分泌を抑制することを確認した。
【0045】
４．サンショウ果実抽出物の細胞毒性評価（図４）
（１）実験方法
サンショウ果実抽出物の処理濃度に対する細胞毒性を確認するために、細胞生存率の測定は、ＭＴＴ ａｓｓａｙで行った。ＮＧ１０８－１５細胞を１×１０４セル／ウェルになるように、ポリ－Ｌ－リシンがコーティングされた９６ウェルプレートに分注し、２４時間培養してプレートに付着した。その後、二つ物質を濃度別にｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに希釈して細胞に処理した後、ＣＯ２インキュベーターで４時間培養した。上澄液を除去した後、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに溶かした０．５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ溶液を細胞に１００μＬずつ処理し、３時間反応させた。反応後、ＭＴＴ溶液を除去してホルマザン結晶（ｆｏｒｍａｚａｎ ｃｒｙｓｔａｌ）を溶解するために、イソプロパノール１００μＬを入れて１０分撹拌して、マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍで吸光度を測定した。
（１）実験方法
サンショウ果実抽出物の処理濃度に対する細胞毒性を確認するために、細胞生存率の測定は、ＭＴＴ ａｓｓａｙで行った。ＮＧ１０８－１５細胞を１×１０４セル／ウェルになるように、ポリ－Ｌ－リシンがコーティングされた９６ウェルプレートに分注し、２４時間培養してプレートに付着した。その後、二つ物質を濃度別にｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに希釈して細胞に処理した後、ＣＯ２インキュベーターで４時間培養した。上澄液を除去した後、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに溶かした０．５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ溶液を細胞に１００μＬずつ処理し、３時間反応させた。反応後、ＭＴＴ溶液を除去してホルマザン結晶（ｆｏｒｍａｚａｎ ｃｒｙｓｔａｌ）を溶解するために、イソプロパノール１００μＬを入れて１０分撹拌して、マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍで吸光度を測定した。
【0046】
（２）実験結果
サンショウ果実抽出物を、１２．５、２５、５０ｐｐｍ処理したとき、全ての濃度で１００％以上の細胞生存率を示すことから、細胞毒性がないことを確認することができた（図４）。
サンショウ果実抽出物を、１２．５、２５、５０ｐｐｍ処理したとき、全ての濃度で１００％以上の細胞生存率を示すことから、細胞毒性がないことを確認することができた（図４）。
【0047】
５．サンショウ果実抽出物の筋麻痺効能（図５）
上記１．（２）で記述したように、シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）システムを用いて、上記のように製造したサンショウ果実抽出物の筋麻痺効能をテストした。
上記１．（２）で記述したように、シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）システムを用いて、上記のように製造したサンショウ果実抽出物の筋麻痺効能をテストした。
【0048】
実験結果、サンショウ果実抽出物を線虫に処理したとき、濃度によって筋麻痺効果が増加した。サンショウ抽出物０．０１％では筋麻痺効果がなかったが、サンショウ抽出物０．０５％処理時に８．５％、サンショウ抽出物０．１％処理時に２４．１％の筋麻痺効果を奏した（図５）。これによって、サンショウ果実抽出物を処理したとき、個体水準で筋麻痺効能を奏することを確認した。また、以前の細胞実験結果に基づいて、ボトックスの機序と類似にサンショウ果実抽出物が神経細胞からの神経伝達物質の分泌を抑制することで筋麻痺を誘導することを類推することができる。
【0049】
６．サンショウ抽出物とアルジレリンとの組合せの相乗効果試験（図６及び図７）
サンショウ果実抽出物とボトックス効能素材との相乗効果をテストした。先ず、神経細胞において、ＳＮＡＰ－２５と結合してＳＮＡＲＥの形成を抑制するアルジレリン（アセチルヘキサペプチド－８）との相乗効果をテストした。
サンショウ果実抽出物とボトックス効能素材との相乗効果をテストした。先ず、神経細胞において、ＳＮＡＰ－２５と結合してＳＮＡＲＥの形成を抑制するアルジレリン（アセチルヘキサペプチド－８）との相乗効果をテストした。
【0050】
実験結果、サンショウ抽出物をアルジレリンよりも少なく（サンショウ５０ｐｐｍ、アルジレリン１００ｐｐｍ）使用すると、相乗効果が現われない一方、最小限のサンショウ抽出物をアルジレリンと同量以上に使用した場合に相乗効果が現われることが確認された（図６）。また、アルジレリン（１００ｐｐｍ）の筋収縮抑制効果がサンショウ抽出物５００ｐｐｍによって約１５倍以上増加することが確認された（図６）。
【0051】
このような効果をアルジレリン単独処方で奏するためには、どのくらいの量を処理すべきであるかを把握するために、アルジレリンの量を次第に増加させていきながら実験した結果、アルジレリン１００ｐｐｍとサンショウ抽出物５００ｐｐｍとの組合せと同等な水準の効果を得るためには、アルジレリンの単独処方時、１００，０００ｐｐｍの処方が必要となることが確認された（図７）。
【0052】
７．サンショウ抽出物とＢｏＮＴ／Ａ ＬＣとの組合せの相乗効果試験（図８）
次に、サンショウ果実抽出物がボツリヌス毒素の効能部分の素材にも相乗効果を奏するかをテストした。ボツリヌス毒素の場合、毒性が非常に強くて規制が厳しいことから実験に使いにくいことから、ボツリヌス毒素タンパク質において酵素活性のある部位であるライトチェーン部位（ＢｏＮＴ／Ａ ＬＣ）を用いて相乗効果を測定した。ボツリヌス毒素の筋麻痺効果のようにＢｏＮＴ／Ａ ＬＣ単独で０．００２％（２０ｐｐｍ）処理時、５０％ほどの筋麻痺効果が得られ、これによって、ボツリヌス毒素のようにＢｏＮＴ／Ａ ＬＣもボトックス効能を奏することが分かる。相乗効果をテストするために、ＢｏＮＴ／Ａ ＬＣにサンショウ果実抽出物０．０１％を共に処理した結果、２０％以上の相乗効果が現われた（図８）。このような結果から、サンショウ果実抽出物が、ボトックスと類似な効能を奏する素材全般にわたって相乗効果を奏することが分かった。
次に、サンショウ果実抽出物がボツリヌス毒素の効能部分の素材にも相乗効果を奏するかをテストした。ボツリヌス毒素の場合、毒性が非常に強くて規制が厳しいことから実験に使いにくいことから、ボツリヌス毒素タンパク質において酵素活性のある部位であるライトチェーン部位（ＢｏＮＴ／Ａ ＬＣ）を用いて相乗効果を測定した。ボツリヌス毒素の筋麻痺効果のようにＢｏＮＴ／Ａ ＬＣ単独で０．００２％（２０ｐｐｍ）処理時、５０％ほどの筋麻痺効果が得られ、これによって、ボツリヌス毒素のようにＢｏＮＴ／Ａ ＬＣもボトックス効能を奏することが分かる。相乗効果をテストするために、ＢｏＮＴ／Ａ ＬＣにサンショウ果実抽出物０．０１％を共に処理した結果、２０％以上の相乗効果が現われた（図８）。このような結果から、サンショウ果実抽出物が、ボトックスと類似な効能を奏する素材全般にわたって相乗効果を奏することが分かった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
