知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-24
(45)【発行日】2024-10-02
(54)【発明の名称】免疫老化改善用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 36/73 20060101AFI20240925BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240925BHJP
【ＦＩ】
A61K36/73
A61P37/04
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2020108408
(22)【出願日】2020-06-24
(65)【公開番号】P2022006259
(43)【公開日】2022-01-13
【審査請求日】2023-01-19
(73)【特許権者】
【識別番号】593106918
【氏名又は名称】株式会社ファンケル
(74)【代理人】
【識別番号】100162396
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 泰之
(74)【代理人】
【識別番号】100194803
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 理弘
(72)【発明者】
【氏名】野口 真行
(72)【発明者】
【氏名】渡邉 知倫
(72)【発明者】
【氏名】澤野 健史
【審査官】佐々木 大輔
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０３８１５４８２（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２００６－３１６０２６（ＪＰ，Ａ）
【文献】Pharmaceutical Chemistry Journal，1997年，Vol.31, No.9，pp.488-491
【文献】Experimental Gerontology，2010年，Vol.45，pp.763-771
【文献】Biochimica et Biophysica Acta，2002年，Vol.1593，pp.29-36
【文献】PNAS，2009年，Vol.106, No.37，pp.15807-15812
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３６／７３
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ａ６１Ｐ ３１／１２
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
キンミズヒキ抽出物を有効成分として含有する免疫老化の改善及び／又は抑制用組成物（但し、ナツメ由来の成分を含有しない）。
【請求項2】
免疫老化が加齢によるものである請求項１に記載の免疫老化の改善及び／又は抑制用組成物。
【請求項3】
免疫老化が、ナイーブＴ細胞の減少及び／又はメモリーＴ細胞の増加による免疫応答の低下である請求項１又は２に記載の免疫老化の改善及び／又は抑制用組成物。
【請求項4】
免疫老化が、ＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞のうち、ＰＤ－１を発現するＴ細胞の増加による免疫応答の低下である請求項１～３のいずれかに記載の免疫老化の改善及び／又は抑制用組成物。
【請求項5】
キンミズヒキ抽出物を有効成分として含有する、免疫老化による生体異常の改善、軽減、又は生体異常抑制用組成物（但し、ナツメ由来の成分を含有しない）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫老化改善用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
若年者の加齢は、生体の成熟と安定化をもたらすが、成年後の加齢（老化）には、様々な生理機能の低下が指摘されている。このような生理機能の低下のなかでも、免疫機能の低下現象が特徴的なものとして著名である。加齢に伴う免疫の変化は、胸腺機能の低下に伴う獲得免疫応答能の低下、炎症性素因の増大、自己免疫リスクの増大が具体的な変化である。このような加齢に伴う免疫の変化は免疫老化と呼ばれる。
免疫老化は、免疫系の加齢に伴う変化の特徴を包括して表現した用語であり、おおむね、獲得免疫応答能の低下、炎症性素因の増大、自己免疫リスクの増大、という３つの兆候により特徴づけられている。すなわち、感染源から身体を防御し、それらを排除する正常な免疫応答が低下する一方、慢性炎症や自己免疫応答が亢進するという、二面性をもつことに特徴がある。加齢によりあらゆる免疫細胞が質的および機能的に変化をきたすが、Ｔ細胞を産生する胸腺の機能が早期に低下することから、加齢による変化は、Ｔ細胞がもっとも大きいといわれている。
Ｔ細胞サブセットは、加齢とともにその構成も変化する。特に免疫老化の状態ではナイーブＴ細胞が減少し、メモリーＴ細胞が増加することが知られている。また、老化したＴ細胞は、サイトカインの産生能も減弱し、ＰＤ－１などのＴ細胞の活性化を抑制する抑制性受容体の発現が増加している。いわゆるチェックポイント分子の一つであるＰＤ－１を発現する細胞が増加する。これにより、Ｔ細胞は自己の活性化が抑制され、さらに、ＰＤ－１に結合するリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は、抗原提示細胞の表面や血管内皮等に発現し、老化に伴って増加し、Ｔ細胞を抑制させる。このように免疫老化の指標が明らかになってきた。
これまでの知見から、免疫老化を改善するためには、Ｔ細胞のサブセットを正常化させ、ＰＤ－１発現細胞を低下させることで改善が可能となると考えられている。
免疫老化は、免疫系の加齢に伴う変化の特徴を包括して表現した用語であり、おおむね、獲得免疫応答能の低下、炎症性素因の増大、自己免疫リスクの増大、という３つの兆候により特徴づけられている。すなわち、感染源から身体を防御し、それらを排除する正常な免疫応答が低下する一方、慢性炎症や自己免疫応答が亢進するという、二面性をもつことに特徴がある。加齢によりあらゆる免疫細胞が質的および機能的に変化をきたすが、Ｔ細胞を産生する胸腺の機能が早期に低下することから、加齢による変化は、Ｔ細胞がもっとも大きいといわれている。
Ｔ細胞サブセットは、加齢とともにその構成も変化する。特に免疫老化の状態ではナイーブＴ細胞が減少し、メモリーＴ細胞が増加することが知られている。また、老化したＴ細胞は、サイトカインの産生能も減弱し、ＰＤ－１などのＴ細胞の活性化を抑制する抑制性受容体の発現が増加している。いわゆるチェックポイント分子の一つであるＰＤ－１を発現する細胞が増加する。これにより、Ｔ細胞は自己の活性化が抑制され、さらに、ＰＤ－１に結合するリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は、抗原提示細胞の表面や血管内皮等に発現し、老化に伴って増加し、Ｔ細胞を抑制させる。このように免疫老化の指標が明らかになってきた。
これまでの知見から、免疫老化を改善するためには、Ｔ細胞のサブセットを正常化させ、ＰＤ－１発現細胞を低下させることで改善が可能となると考えられている。
【0003】
さらにまた、このような観点から免疫老化を改善するためのいくつかの提案がなされている。特許文献１には、免疫細胞のＣＤ１１ｂに結合するＣＤ１１ｂモジュレータと免疫細胞を接触させることによって、免疫細胞におけるＰＤ－１の発現を阻害する方法が提案されている。
また特許文献２には、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）により幹細胞を富化した自己血漿と、ＡＢＯ／Ｒｈタイプの適合するドナーの臍帯血から得られる幹細胞豊富な血漿とを組み合わせた、幹細胞豊富な血漿を投与することで、老化したＴ細胞を補強する移植免疫強化の提案がなされている。しかし、まだこのような手法は、実用化には至っていない。
また特許文献２には、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）により幹細胞を富化した自己血漿と、ＡＢＯ／Ｒｈタイプの適合するドナーの臍帯血から得られる幹細胞豊富な血漿とを組み合わせた、幹細胞豊富な血漿を投与することで、老化したＴ細胞を補強する移植免疫強化の提案がなされている。しかし、まだこのような手法は、実用化には至っていない。
【0004】
現在も免疫老化改善のための薬剤や改善方法が探索されており、免疫老化を改善させる薬剤や改善方法が希求されている。
【0005】
一方、植物由来の抽出物が様々な医療用途に用いられている。中でもキンミズヒキ抽出物が近年注目されている。
キンミズヒキ（金水引、学名：Ａｇｒｉｍｏｎｉａ ｐｉｌｏｓａ）は、バラ科キンミズヒキ属の多年草で漢方薬に利用される。生薬名は仙鶴草である。キンミズヒキの花期の地上部の茎葉には、精油とタンニンを含んでおり、そのうちの主成分となるタンニンは、細胞組織を引き締める収斂作用があることが知られている。また、水で煮出した水性エキスには、胆嚢の働きを助ける利胆作用があるといわれている。根には、タンニンのほか、フェノール性配糖体、アグリモノリド、フィトステロール、バニル酸、タキシフォリンなどが含まれることが知られている。
キンミズヒキ（金水引、学名：Ａｇｒｉｍｏｎｉａ ｐｉｌｏｓａ）は、バラ科キンミズヒキ属の多年草で漢方薬に利用される。生薬名は仙鶴草である。キンミズヒキの花期の地上部の茎葉には、精油とタンニンを含んでおり、そのうちの主成分となるタンニンは、細胞組織を引き締める収斂作用があることが知られている。また、水で煮出した水性エキスには、胆嚢の働きを助ける利胆作用があるといわれている。根には、タンニンのほか、フェノール性配糖体、アグリモノリド、フィトステロール、バニル酸、タキシフォリンなどが含まれることが知られている。
【0006】
キンミズヒキ抽出物の薬理効果として、特許文献３にはキンミズヒキ抽出成分を有効成分とする神経活性化組成物が記載されている。
特許文献４には、キンミズヒキ抽出物を含有する美白剤、抗老化剤、皮膚化粧料が記載されている。
特許文献５には、キンミズヒキ抽出物を含有するαグルコシダーゼ阻害剤が記載されている。
特許文献６には、キンミズヒキ抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤及びアレルゲン賦活剤が記載されている。
しかしキンミズヒキ抽出物が、上述の免疫老化の抑制や、その改善用途に用いることができることは知られていない。
特許文献４には、キンミズヒキ抽出物を含有する美白剤、抗老化剤、皮膚化粧料が記載されている。
特許文献５には、キンミズヒキ抽出物を含有するαグルコシダーゼ阻害剤が記載されている。
特許文献６には、キンミズヒキ抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤及びアレルゲン賦活剤が記載されている。
しかしキンミズヒキ抽出物が、上述の免疫老化の抑制や、その改善用途に用いることができることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特表２０１８－５２４３００号公報
【文献】特開２０１９－１１２４６３号公報
【文献】特開２０１８－８８８８号公報
【文献】特開２０１０－６５００９号公報
【文献】特開２００６－１６３８８号公報
【文献】特開２００８－１７４５２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明者らは、Ｔ細胞の分化を研究する過程で、様々な植物抽出物のスクリーニングを行い、Ｔ細胞の分化を制御する抽出物を見出した。そして、この抽出物は、加齢に伴う免疫老化を改善し、細胞性免疫の応答を回復することを見出し、本発明をなした。
すなわち、本発明は、加齢に伴う免疫老化の改善及び／又は抑制用組成物を提供することを課題としている。
すなわち、本発明は、加齢に伴う免疫老化の改善及び／又は抑制用組成物を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の構成は以下のとおりである。
（１）キンミズヒキ抽出物を有効成分として含有する免疫老化の改善及び／又は抑制用組成物。
（２）免疫老化が加齢によるものである（１）に記載の免疫老化の改善及び／又は抑制用組成物。
（３）免疫老化が、ナイーブＴ細胞の減少及び／又はメモリーＴ細胞の増加による免疫応答の低下である（１）又は（２）に記載の免疫老化の改善及び／又は抑制用組成物。
（４）免疫老化が、ＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞のうち、ＰＤ－１を発現するＴ細胞の増加による免疫応答の低下である（１）～（３）のいずれかに記載の免疫老化の改善及び／又は抑制用組成物。
（５）キンミズヒキ抽出物を有効成分として含有する、免疫老化による生体異常の改善、軽減、又は生体異常抑制用組成物。
（１）キンミズヒキ抽出物を有効成分として含有する免疫老化の改善及び／又は抑制用組成物。
（２）免疫老化が加齢によるものである（１）に記載の免疫老化の改善及び／又は抑制用組成物。
（３）免疫老化が、ナイーブＴ細胞の減少及び／又はメモリーＴ細胞の増加による免疫応答の低下である（１）又は（２）に記載の免疫老化の改善及び／又は抑制用組成物。
（４）免疫老化が、ＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞のうち、ＰＤ－１を発現するＴ細胞の増加による免疫応答の低下である（１）～（３）のいずれかに記載の免疫老化の改善及び／又は抑制用組成物。
（５）キンミズヒキ抽出物を有効成分として含有する、免疫老化による生体異常の改善、軽減、又は生体異常抑制用組成物。
【0010】
本発明により、免疫老化の改善及び／又は抑制用組成物が提供される。
また本発明によりキンミズヒキ抽出物を有効成分として含有する、免疫老化によって引き起こされる各種生体異常の改善、軽減又は生体異常の抑制用の組成物が提供される。
また本発明によりキンミズヒキ抽出物を有効成分として含有する、免疫老化によって引き起こされる各種生体異常の改善、軽減又は生体異常の抑制用の組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】ＣＤ４＋Ｔ細胞のうち、ＣＤ４とＰＤ－１で展開したカウンタープロットを示す。データは、ｎ＝５のうち、代表的な１つの結果を載せている。
【図3】ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち、ＣＤ８とＰＤ－１で展開したカウンタープロットを示す。データは、ｎ＝５のうち、代表的な１つの結果を載せている。
【図5】ＣＤ４＋Ｔ細胞のうち、ＣＤ４４とＣＤ６２Ｌで展開したドットプロットである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本願明細書において、「免疫老化」とは、胸腺機能の低下や免疫担当細胞の機能等の変化 (低下)であって、Ｔ細胞に占めるナイーブＴ細胞数の減少及び／又はメモリーＴ細胞数の増加した状態であるか、もしくはＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞のうち、ＰＤ－１を発現するＴ細胞の増加をいう。
また本願明細書において「免疫老化の改善」とは、
１．加齢によって変化したナイーブ／メモリーＴ細胞比率を、若齢様に回帰させること。
２．ＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞のうち、ＰＤ－１を発現するＴ細胞を減少させること。
のいずれか、又は両方を実現することをいう。
さらにまた「免疫老化の抑制」とは、
１．Ｔ細胞に占めるナイーブＴ細胞数の減少を抑制すること及び／又はメモリーＴ細胞の加齢による増加を抑制すること、
２．ＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞のうち、ＰＤ－１を発現するＴ細胞の増加を抑制すること、
のいずれか、又は両方を実現することをいう。
そして、本発明でいう免疫老化によって引き起こされる各種生体異常とは、「獲得免疫応答能の低下、炎症性素因の増大、自己免疫リスクの増大」及び「獲得免疫応答能の低下、炎症性素因の増大、自己免疫リスクの増大に伴う疾患」をいう。
また本願明細書において「免疫老化の改善」とは、
１．加齢によって変化したナイーブ／メモリーＴ細胞比率を、若齢様に回帰させること。
２．ＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞のうち、ＰＤ－１を発現するＴ細胞を減少させること。
のいずれか、又は両方を実現することをいう。
さらにまた「免疫老化の抑制」とは、
１．Ｔ細胞に占めるナイーブＴ細胞数の減少を抑制すること及び／又はメモリーＴ細胞の加齢による増加を抑制すること、
２．ＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞のうち、ＰＤ－１を発現するＴ細胞の増加を抑制すること、
のいずれか、又は両方を実現することをいう。
そして、本発明でいう免疫老化によって引き起こされる各種生体異常とは、「獲得免疫応答能の低下、炎症性素因の増大、自己免疫リスクの増大」及び「獲得免疫応答能の低下、炎症性素因の増大、自己免疫リスクの増大に伴う疾患」をいう。
【0013】
キンミズヒキ（学名：Ａｇｒｉｍｏｎｉａ ｐｉｌｏｓａ）は、バラ科キンミズヒキ属の多年草であり、本州、四国、九州などの林の縁、原野、路傍に生息しており、容易に入手可能である。別名、龍牙草ともいう。本発明において、キンミズヒキは、漢方生薬、民間療法薬、健康食品（ハーブティー）原料として市販されている乾燥物を使用することができる。全草を乾燥させたものは、仙鶴草の生薬名で市販されている。これを使用することもできる。
また自生あるいは栽培された全草を採取し、これを自然乾燥又は加熱乾燥させたものを使用することができる。これを細切し、約１０倍量の水または、含水濃度０～９９．５％（ｖ／ｖ）エタノールに３～５日間浸漬して室温で抽出するか、あるいは還流冷却器を付して５０～８０℃で５～２４時間抽出し、濾過してキンミズヒキ抽出液を回収する。この抽出液は、ロータリーエバポレーターなどの減圧真空乾燥装置、又は凍結乾燥装置によって、水及びエタノールを除去してキンミズヒキ抽出物とする。
また自生あるいは栽培された全草を採取し、これを自然乾燥又は加熱乾燥させたものを使用することができる。これを細切し、約１０倍量の水または、含水濃度０～９９．５％（ｖ／ｖ）エタノールに３～５日間浸漬して室温で抽出するか、あるいは還流冷却器を付して５０～８０℃で５～２４時間抽出し、濾過してキンミズヒキ抽出液を回収する。この抽出液は、ロータリーエバポレーターなどの減圧真空乾燥装置、又は凍結乾燥装置によって、水及びエタノールを除去してキンミズヒキ抽出物とする。
【0014】
キンミズヒキ抽出物を有効成分とする加齢に伴う免疫老化の改善及び／又は抑制用組成物は、前記抽出物をそのまま、あるいは慣用の医薬用製剤担体とともに医薬用組成物として動物及びヒトに投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく、必要に応じて適宜選択すればよい。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤などの経口剤や、注射剤、坐薬などの非経口剤が挙げられる。投与量は、経口剤の場合、通常成人で抽出物の乾燥質量で１～１０００ｍｇを１日数回に分けて服用するのが適当である。
【0015】
本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤などの経口剤は、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類などの賦形剤を用いて常法に従って製造される。この種の経口剤には本発明組成物の他に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを適宜使用できる。
【0016】
有効成分以外の配合成分を次に例示する。結合剤としてはデンプン、デキストリン、アラビアガム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなどが例示できる。崩壊剤としてはデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロースなどを例として挙げることができる。界面活性剤としてはラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどを挙げることができる。滑沢剤としては、タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコールなどを例示できる。流動性促進剤としては軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムなどを例として挙げることができる。
【0017】
またキンミズヒキ抽出物を有効成分として含有する免疫老化による生体異常の改善、軽減、又は生体異常発生抑制用の組成物の含有量には、特に制限はない。通常は、キンミズヒキ抽出物は、組成物当たり０．０１～５０質量％、好ましくは０．１～３０質量％を含むように配合する。
以下、実施例として動物を用いた効果試験例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
以下、実施例として動物を用いた効果試験例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【実施例】
【0018】
＜免疫担当細胞へのキンミズヒキ抽出物の効果試験＞
１．試験方法
（１）試験試料の調製
・キンミズヒキ抽出物の調製
キンミズヒキの生薬（仙鶴草、株式会社栃本天海堂）４００から５００ｇをミキサーで粉砕した。次いで粉砕物質量の１０倍量の９９．５％のエチルアルコールを加え、十分浸漬させた。これを室温で４日間攪拌した後、固液分離して抽出液を得た。本工程を３回繰り返し、得られた抽出液を、常法によりロータリーエバポレーターを用いて、エチルアルコール及び水を蒸発除去し、乾固物を得た。この乾固物を本発明のキンミズヒキ抽出物として以下の試験に用いた。
１．試験方法
（１）試験試料の調製
・キンミズヒキ抽出物の調製
キンミズヒキの生薬（仙鶴草、株式会社栃本天海堂）４００から５００ｇをミキサーで粉砕した。次いで粉砕物質量の１０倍量の９９．５％のエチルアルコールを加え、十分浸漬させた。これを室温で４日間攪拌した後、固液分離して抽出液を得た。本工程を３回繰り返し、得られた抽出液を、常法によりロータリーエバポレーターを用いて、エチルアルコール及び水を蒸発除去し、乾固物を得た。この乾固物を本発明のキンミズヒキ抽出物として以下の試験に用いた。
【0019】
（２）試験動物
・老齢動物：入荷時７８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄性、７８週齢、日本チャールス・リバー株式会社）。
・若齢動物：入荷時７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄性、７週齢、日本チャールス・リバー株式会社）。
老齢動物は、入荷後１週間精製飼料（ＡＩＮ－９３Ｍ オリエンタル酵母工業株式会社）で馴化飼育した後、１群５匹とし、Ｖｅｈｉｃｌｅ群、キンミズヒキ抽出物（Ａ．Ｐ）投与群の２群に群分けし、試験に供した。
また若齢動物（Ｙｏｕｎｇ）５匹は、入荷後精製飼料（ＡＩＮ－９３Ｍ オリエンタル酵母工業株式会社）で１週間馴化飼育したのち採血を行った。
・老齢動物：入荷時７８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄性、７８週齢、日本チャールス・リバー株式会社）。
・若齢動物：入荷時７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄性、７週齢、日本チャールス・リバー株式会社）。
老齢動物は、入荷後１週間精製飼料（ＡＩＮ－９３Ｍ オリエンタル酵母工業株式会社）で馴化飼育した後、１群５匹とし、Ｖｅｈｉｃｌｅ群、キンミズヒキ抽出物（Ａ．Ｐ）投与群の２群に群分けし、試験に供した。
また若齢動物（Ｙｏｕｎｇ）５匹は、入荷後精製飼料（ＡＩＮ－９３Ｍ オリエンタル酵母工業株式会社）で１週間馴化飼育したのち採血を行った。
【0020】
（３）試験動物へのキンミズヒキ抽出物の投与方法
前記のキンミズヒキ抽出物を精製飼料ＡＩＮ－９３Ｍと混合し、キンミズヒキ抽出物が０．５質量％となるよう十分に攪拌混合し、これを試験餌として、試験開始から４か月間自由摂取させた。
前記のキンミズヒキ抽出物を精製飼料ＡＩＮ－９３Ｍと混合し、キンミズヒキ抽出物が０．５質量％となるよう十分に攪拌混合し、これを試験餌として、試験開始から４か月間自由摂取させた。
【0021】
（４）効果の確認方法
試験動物の免疫老化とその改善及び／又は抑制効果を確認するため、Ｔ細胞サブセットの比率を確認した。
老齢動物の飼育期間経過後、イソフルラン吸引麻酔下で心臓採血により全血を採取し、これを血漿と血球に分離した。血球は、フィコール（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）にて白血球を遠心分離した。この白血球画分を用いてＴ細胞のサブセットを解析した。
若齢動物も同様にイソフルラン吸引麻酔下で心臓採血により全血を採取し、これを血漿と血球に分離した。
なお若齢動物の採血及び白血球画分の採取も老齢動物と同様に行った。
Ｔ細胞のサブセット解析は、サブセット特定用の各抗体を用いてラベル染色を行い、セルソーター「ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（商標）」（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって、セルソートして行った。
試験動物の免疫老化とその改善及び／又は抑制効果を確認するため、Ｔ細胞サブセットの比率を確認した。
老齢動物の飼育期間経過後、イソフルラン吸引麻酔下で心臓採血により全血を採取し、これを血漿と血球に分離した。血球は、フィコール（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）にて白血球を遠心分離した。この白血球画分を用いてＴ細胞のサブセットを解析した。
若齢動物も同様にイソフルラン吸引麻酔下で心臓採血により全血を採取し、これを血漿と血球に分離した。
なお若齢動物の採血及び白血球画分の採取も老齢動物と同様に行った。
Ｔ細胞のサブセット解析は、サブセット特定用の各抗体を用いてラベル染色を行い、セルソーター「ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（商標）」（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって、セルソートして行った。
【0022】
Ｔ細胞サブセット解析に用いた抗体は次のとおりである。
ＡＰＣ／ｃｙ７－抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）：ＣＤ４＋Ｔ細胞マーカー
ＡＰＣ－抗ＰＤ－１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）：ＰＤ－１発現細胞マーカー
ＦＩＴＣ－抗ＣＤ４４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）及びＰＥ／Ｃｙ７－抗ＣＤ６２Ｌ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）：ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞マーカー
ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５－抗ＣＤ８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）：ＣＤ８＋細胞マーカー
各抗体を用いて染色を行い、セルソーター「ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（商標）」（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によってＴ細胞サブセットの解析を行った。
なおソーティング結果によって解析した発現細胞の比率は、テューキー・クレーマー法によって統計解析し有意差検定を行った。Ｐ値が０．０５以下の場合、有意差ありと判定した。
ＡＰＣ／ｃｙ７－抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）：ＣＤ４＋Ｔ細胞マーカー
ＡＰＣ－抗ＰＤ－１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）：ＰＤ－１発現細胞マーカー
ＦＩＴＣ－抗ＣＤ４４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）及びＰＥ／Ｃｙ７－抗ＣＤ６２Ｌ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）：ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞マーカー
ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５－抗ＣＤ８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）：ＣＤ８＋細胞マーカー
各抗体を用いて染色を行い、セルソーター「ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（商標）」（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によってＴ細胞サブセットの解析を行った。
なおソーティング結果によって解析した発現細胞の比率は、テューキー・クレーマー法によって統計解析し有意差検定を行った。Ｐ値が０．０５以下の場合、有意差ありと判定した。
【0023】
２．フローサイトメーターによる解析結果
本実験結果に示す「＋」は、その細胞に発現していることを示す。たとえば、ＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞であれば、ＰＤ－１およびＣＤ４をいずれも発現するＴ細胞を示す。
（１）ＰＤ－１及びＣＤ４をマーカーとした解析
図１に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４とＰＤ－１で展開したカウンタープロットのうち、代表的な１つの結果を示す。なお、図中の数値はＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率（％）である。また図２に、図１で示すＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率（％）を平均化し、グラフ化したものを示した。図１、図２から、老化によってＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が増加し、キンミズヒキ抽出物投与によってＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が減少していることが分かる。すなわち加齢によって、ＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は増加するが、キンミズヒキ抽出物を投与することで減少した。
ＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞性免疫を抑制することが知られており、この細胞の白血球当たりの比率を減少させていることは、キンミズヒキ抽出物が加齢（老化）に伴う細胞性免疫能の低下、すなわち免疫老化を改善することを裏付ける結果であった。
本実験結果に示す「＋」は、その細胞に発現していることを示す。たとえば、ＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞であれば、ＰＤ－１およびＣＤ４をいずれも発現するＴ細胞を示す。
（１）ＰＤ－１及びＣＤ４をマーカーとした解析
図１に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４とＰＤ－１で展開したカウンタープロットのうち、代表的な１つの結果を示す。なお、図中の数値はＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率（％）である。また図２に、図１で示すＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率（％）を平均化し、グラフ化したものを示した。図１、図２から、老化によってＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が増加し、キンミズヒキ抽出物投与によってＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が減少していることが分かる。すなわち加齢によって、ＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は増加するが、キンミズヒキ抽出物を投与することで減少した。
ＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞性免疫を抑制することが知られており、この細胞の白血球当たりの比率を減少させていることは、キンミズヒキ抽出物が加齢（老化）に伴う細胞性免疫能の低下、すなわち免疫老化を改善することを裏付ける結果であった。
【0024】
（２）ＰＤ－１及びＣＤ８をマーカーとした解析
図３にＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８とＰＤ－１で展開したカウンタープロットのうち、代表的な１つの結果を示す。なお、図中の数値は図１同様、ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率（％）である。また図４に、図３で示すＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率（％）を平均化し、グラフ化したものを示した。これらの結果からは、マウスの老齢化によってＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が増加し、キンミズヒキ抽出物投与によって減少することが読み取れる。
すなわちキンミズヒキ抽出物投与群によって、加齢に伴って増加するＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が顕著に抑制されることが明らかとなった。
以上の解析（１）（２）から、キンミズヒキ抽出物は、免疫老化によって生じているＣＤ４及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞に発現するＰＤ－１を抑制して免疫老化を改善する作用を有することが明らかとなった。
図３にＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８とＰＤ－１で展開したカウンタープロットのうち、代表的な１つの結果を示す。なお、図中の数値は図１同様、ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率（％）である。また図４に、図３で示すＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率（％）を平均化し、グラフ化したものを示した。これらの結果からは、マウスの老齢化によってＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が増加し、キンミズヒキ抽出物投与によって減少することが読み取れる。
すなわちキンミズヒキ抽出物投与群によって、加齢に伴って増加するＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が顕著に抑制されることが明らかとなった。
以上の解析（１）（２）から、キンミズヒキ抽出物は、免疫老化によって生じているＣＤ４及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞に発現するＰＤ－１を抑制して免疫老化を改善する作用を有することが明らかとなった。
【0025】
（３）ＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌをマーカーとした解析
ナイーブＴ細胞はＣＤ４４の発現が低くＣＤ６２Ｌ発現が高い（ＣＤ４４ｌｏｗＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ）細胞であり、メモリーＴ細胞は、ＣＤ４４の発現が高くＣＤ６２Ｌの発現が低い（ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌｌｏｗ）細胞である。
図５にＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４４とＣＤ６２Ｌで展開したドットプロットを示す。
ＣＤ４４の発現量とＣＤ６２Ｌ発現量で配置したソーティング二次元マップは、若齢動物（Ｙｏｕｎｇ）、Ｖｅｈｉｃｌｅ、キンミズヒキ抽出物（Ａ．Ｐ）投与群の３群、それぞれに異なる分布パターンを示すが、若齢動物とキンミズヒキ抽出物投与群は、類似したパターンを示した。すなわち若齢動物及びキンミズヒキ投与群は、メモリーＴ細胞の密度が低く、ＣＤ４４の発現が低くナイーブＴ細胞の密度が高い。
一方Ｖｅｈｉｃｌｅは、逆のパターンを示す。すなわちメモリーＴ細胞の密度が高く、ナイーブＴ細胞の密度が低いことが分かった。
ナイーブＴ細胞はＣＤ４４の発現が低くＣＤ６２Ｌ発現が高い（ＣＤ４４ｌｏｗＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ）細胞であり、メモリーＴ細胞は、ＣＤ４４の発現が高くＣＤ６２Ｌの発現が低い（ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌｌｏｗ）細胞である。
図５にＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４４とＣＤ６２Ｌで展開したドットプロットを示す。
ＣＤ４４の発現量とＣＤ６２Ｌ発現量で配置したソーティング二次元マップは、若齢動物（Ｙｏｕｎｇ）、Ｖｅｈｉｃｌｅ、キンミズヒキ抽出物（Ａ．Ｐ）投与群の３群、それぞれに異なる分布パターンを示すが、若齢動物とキンミズヒキ抽出物投与群は、類似したパターンを示した。すなわち若齢動物及びキンミズヒキ投与群は、メモリーＴ細胞の密度が低く、ＣＤ４４の発現が低くナイーブＴ細胞の密度が高い。
一方Ｖｅｈｉｃｌｅは、逆のパターンを示す。すなわちメモリーＴ細胞の密度が高く、ナイーブＴ細胞の密度が低いことが分かった。
【0026】
Ｔ細胞には抗原未感作のナイーブフェノタイプ（ナイーブＴ細胞）と抗原感作を受けたメモリーフェノタイプ（メモリーＴ細胞）が存在する。
上記の結果は、キンミズヒキ投与群である老齢動物のＴ細胞サブセットの構成が、メモリーＴ細胞の少ない、ナイーブＴ細胞の多い、若齢動物と同じＴ細胞サブセット構成に変化していることを示している。
すなわち、キンミズヒキ抽出物は、加齢によるＴ細胞サブセットの構成を若齢動物と同じ構成にする作用を有していることが明らかとなった。
上記の結果は、キンミズヒキ投与群である老齢動物のＴ細胞サブセットの構成が、メモリーＴ細胞の少ない、ナイーブＴ細胞の多い、若齢動物と同じＴ細胞サブセット構成に変化していることを示している。
すなわち、キンミズヒキ抽出物は、加齢によるＴ細胞サブセットの構成を若齢動物と同じ構成にする作用を有していることが明らかとなった。
【0027】
（４）ＣＤ４による再解析
上記（３）で解析した細胞群を、ＣＤ４をマーカーとして再解析した。この再解析により、ＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌを発現したＴ細胞当たりのＣＤ４＋Ｔ細胞すなわちナイーブＴ細胞又はメモリーＴ細胞の比率を知ることができる。
１）ナイーブＴ細胞の比率
図６に図５を再解析して得たナイーブＴ細胞の比率（％）を示す。
すなわち、若齢動物の場合、ナイーブＴ細胞の比率は８０．１％であった。一方Ｖｅｃｈｃｌｅは３５．６％に減少した。これに対して、キンミズヒキ抽出物投与群は５９．４％に回復していた。
上記（３）で解析した細胞群を、ＣＤ４をマーカーとして再解析した。この再解析により、ＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌを発現したＴ細胞当たりのＣＤ４＋Ｔ細胞すなわちナイーブＴ細胞又はメモリーＴ細胞の比率を知ることができる。
１）ナイーブＴ細胞の比率
図６に図５を再解析して得たナイーブＴ細胞の比率（％）を示す。
すなわち、若齢動物の場合、ナイーブＴ細胞の比率は８０．１％であった。一方Ｖｅｃｈｃｌｅは３５．６％に減少した。これに対して、キンミズヒキ抽出物投与群は５９．４％に回復していた。
【0028】
２）メモリーＴ細胞の比率
図７に図５を再解析して得たメモリーＴ細胞の比率を示す。
若齢動物の場合、メモリーＴ細胞の比率は１４．７％であった。一方Ｖｅｃｈｃｌｅは５６．３％に増加した。これに対して、キンミズヒキ抽出物投与群は、３３．５％に減少していた。
図７に図５を再解析して得たメモリーＴ細胞の比率を示す。
若齢動物の場合、メモリーＴ細胞の比率は１４．７％であった。一方Ｖｅｃｈｃｌｅは５６．３％に増加した。これに対して、キンミズヒキ抽出物投与群は、３３．５％に減少していた。
【0029】
すなわちＣＤ４＋Ｔ細胞中のナイーブＴ細胞とメモリーＴ細胞の比率を下記の表１のとおりである。
【0030】
【表1】
【0031】
図６、図７及び表１から明らかなように、キンミズヒキ抽出物は、老化動物のＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットの比率を若齢動物のサブセットと同様の、ナイーブＴ細胞とメモリーＴ細胞の比率に近づけ、サブセット比率を改善させることが明らかとなった。すなわちキンミズヒキ抽出物はＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットのナイーブＴ細胞とメモリーＴ細胞比率を若齢動物とサブセットの比率に近づけるように作用していることが明らかとなった。
【0032】
３．キンミズヒキ抽出物の効果試験の総括
以上の解析結果から明らかとなった作用効果を総括すると以下のとおりである。
（１）キンミズヒキ抽出物は、免疫老化を改善及び／又は抑制する。
（２）キンミズヒキ抽出物の主たる作用点はＴ細胞である。
（３）キンミズヒキ抽出物は、免疫老化した老化関連Ｔ細胞である免疫老化の原因であるＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞に発現するＰＤ－１の増加を抑制する。
（４）キンミズヒキ抽出物は、免疫老化したＣＤ４＋Ｔ細胞のナイーブＴ細胞とメモリーＴ細胞の比率を正常化するように作用する。
（５）キンミズヒキ抽出物は、上記（１）～（４）のとおり免疫老化を改善する。したがって、免疫老化によって引き起こされる「獲得免疫応答能の低下、炎症性素因の増大、自己免疫リスクの増大」及び「獲得免疫応答能の低下、炎症性素因の増大、自己免疫リスクの増大に伴う疾患」をそれぞれ改善、軽減、もしくは生じる生体異常疾患発生を抑制するように作用する。
以上の解析結果から明らかとなった作用効果を総括すると以下のとおりである。
（１）キンミズヒキ抽出物は、免疫老化を改善及び／又は抑制する。
（２）キンミズヒキ抽出物の主たる作用点はＴ細胞である。
（３）キンミズヒキ抽出物は、免疫老化した老化関連Ｔ細胞である免疫老化の原因であるＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞に発現するＰＤ－１の増加を抑制する。
（４）キンミズヒキ抽出物は、免疫老化したＣＤ４＋Ｔ細胞のナイーブＴ細胞とメモリーＴ細胞の比率を正常化するように作用する。
（５）キンミズヒキ抽出物は、上記（１）～（４）のとおり免疫老化を改善する。したがって、免疫老化によって引き起こされる「獲得免疫応答能の低下、炎症性素因の増大、自己免疫リスクの増大」及び「獲得免疫応答能の低下、炎症性素因の増大、自己免疫リスクの増大に伴う疾患」をそれぞれ改善、軽減、もしくは生じる生体異常疾患発生を抑制するように作用する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】