(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-24
(45)【発行日】2024-10-02
(54)【発明の名称】有機化合物封入フェリチンの製造方法
(51)【国際特許分類】
C07K 14/00 20060101AFI20240925BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240925BHJP
A61K 9/16 20060101ALI20240925BHJP
A61K 9/50 20060101ALI20240925BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20240925BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20240925BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240925BHJP
A61K 31/704 20060101ALN20240925BHJP
A61K 31/426 20060101ALN20240925BHJP
A61K 31/155 20060101ALN20240925BHJP
A61K 31/506 20060101ALN20240925BHJP
A61K 31/137 20060101ALN20240925BHJP
A61K 31/4168 20060101ALN20240925BHJP
A61K 31/525 20060101ALN20240925BHJP
A61K 31/51 20060101ALN20240925BHJP
A61K 31/455 20060101ALN20240925BHJP
A61K 49/00 20060101ALN20240925BHJP
【ＦＩ】
C07K14/00 ZNA
C07K19/00
A61K9/16
A61K9/50
A61K47/42
A61K47/69
C12N15/12
A61K31/704
A61K31/426
A61K31/155
A61K31/506
A61K31/137
A61K31/4168
A61K31/525
A61K31/51
A61K31/455
A61K49/00
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2020553874
(86)(22)【出願日】2019-10-28
(86)【国際出願番号】 JP2019042116
(87)【国際公開番号】W WO2020090708
(87)【国際公開日】2020-05-07
【審査請求日】2022-10-25
(31)【優先権主張番号】P 2018203246
(32)【優先日】2018-10-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000000066
【氏名又は名称】味の素株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002147
【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】井之上 一平
(72)【発明者】
【氏名】中原 祐一
【審査官】植原 克典
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０６１１０３３３（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５３２９５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】YANG, Rui，Channel directed rutin nano-encapsulation in phytoferritin induced by guanidine hydrochloride，Food Chemistry，2017年，Vol. 240(2018)，pp. 935-939
【文献】SERUGA, Marijan and TOMAC, Ivana，Influence of Chemical Structure of Some Flavonols on Their Electrochemical Behaviour，International Journal of ELECTROCHEMICAL SCIENCE，2017年，Vol. 12，pp. 7616-7637
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １４／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
有機化合物封入フェリチンの製造方法であって、（１）緩衝液中で有機化合物をフェリチンと混合して、有機化合物およびフェリチンの混合物を得ること；ならびに
（２）緩衝液中で前記混合物をインキュベートすることを含み、
緩衝液は、ｐＨ３以上１３未満であり、かつ
緩衝液は、有機化合物のｐＫａが７未満の場合には３以上７未満のｐＨを有し、有機化合物のｐＫａが７以上の場合には６以上１３未満のｐＨを有し、
緩衝液のｐＨと有機化合物のｐＫａが、式：ｐＨ＝２．６＋０．６ｐＫａ±０．４ｐＫａの関係を満たし、
有機化合物の分子量が８００以下であり、
インキュベートの温度が１０℃以上６０℃以下である、
方法。
【請求項2】
有機化合物が、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、および標識物質からなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項3】
インキュベートの温度が１５℃以上５５℃以下である、請求項１または２記載の方法。
【請求項4】
有機化合物の分子量が１００以上８００未満である、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
【請求項5】
有機化合物のｐＫａが２以上１３以下である、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
【請求項6】
１０分子以上２００分子以下の有機化合物がフェリチン１分子に封入されている、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
【請求項7】
混合およびインキュベートの合計時間が３０分以上である、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
【請求項8】
前記混合におけるフェリチンに対する有機化合物の重量比（有機化合物／フェリチン）が０．２０以上０．３６以下である、請求項１～７のいずれか一項記載の方法。
【請求項9】
有機化合物が、正の架電部分、または正に架電し得る部分を有する、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
【請求項10】
正の架電部分が、（ａ）アンモニウム基、グアニジウム基、イミダゾリウム基、オキサゾリウム基、チアゾリウム基、オキサジアゾリウム基、トリアゾリウム基、ピロリジニウム基、ピリジニウム基、ピペリジニウム基、ピラゾリウム基、ピリミジニウム基、ピラジニウム基、およびトリアジニウム基からなる群より選ばれるカチオン性窒素含有基、または（ｂ）ホスホニウム基である、請求項９記載の方法。
【請求項11】
正に架電し得る部分が、（ａ’）アミノ基、グアニジノ基、ニトロ基、アミド基、ヒドラジド基、イミド基、アジド基、およびジアゾ基からなる群より選ばれる窒素含有基、または（ｂ’）ホスフィノ基である、請求項９または１０記載の方法。
【請求項12】
フェリチンが（１）天然フェリチン、または（２）下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの改変を有する遺伝子組換えフェリチン単量体から構成されるフェリチンである、請求項１～１１のいずれか一項記載の方法：（ａ）フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に機能性ペプチドが挿入されているフェリチン単量体；
（ｂ）Ｎ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体；または
（ｃ）Ｃ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれかの方法で得られる有機化合物封入フェリチンを含む緩衝液であって、有機化合物封入フェリチンを含む緩衝液は、有機化合物のｐＫａが７未満の場合には３以上７未満のｐＨを有し、有機化合物のｐＫａが７以上の場合には６以上１２未満のｐＨを有し、
有機化合物封入フェリチンを含む緩衝液のｐＨと有機化合物のｐＫａが、式：ｐＨ＝２．６＋０．６ｐＫａ±０．４ｐＫａの関係を満たし、
有機化合物の分子量が８００以下である、有機化合物封入フェリチンを含む緩衝液。
【請求項14】
緩衝液が、６以上９以下のｐＨを有する、請求項１３記載の緩衝液。
【請求項15】
有機化合物が、６以上９以下のｐＫａを有する、請求項１３または１４記載の緩衝液。
【請求項16】
有機化合物封入フェリチンであって、有機化合物が、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、および標識物質からなる群より選ばれ、
フェリチン１分子への有機化合物の封入分子数が以下である、有機化合物封入フェリチン：
（１）有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンである場合、４０分子以上２００分子以下；
（２）有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが遺伝子組換えフェリチン（但し、少なくとも３つのドメインを含む融合タンパク質であって、
（ａ）第１のドメインは、天然ヒトフェリチンの重鎖のアミノ酸配列、または天然ヒトフェリチンの重鎖のアミノ酸配列との少なくとも９ ０ ％ の同一性を有するその変異体を含み、
（ｂ）第２のドメインは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断部位のアミノ酸配列を含み、そして
（ｃ）第３のＮ末端ドメインは、本質的にプロリン、セリンおよびアラニン（ＰＡＳ）からなる少なくとも２０アミノ酸残基のポリペプチドのアミノ酸配列からなる、
融合タンパク質を除く）である場合、１００分子以上２００分子以下；または
（３）有機化合物がヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、または標識物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンまたは遺伝子組換えフェリチンである場合、１０分子以上２００分子以下。
【請求項17】
アントラサイクリン系物質がドキソルビシンであり、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬がファモチジンであり、
ピグアナイド系物質がメトホルミンであり、
ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬がミノキシジルであり、
β２アドレナリン受容体作動薬がテルブタリンであり、
イミダゾリン系物質がクレアチニンであり、
ビタミンがチアミン、リボフラビン、またはニコチンアミドであり、
標識物質がローダミンＢ、ウラニン、またはコンゴレッドである、請求項１６記載の有機化合物封入フェリチン。
【請求項18】
有機化合物が、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、およびβ２アドレナリン受容体作動薬からなる群より選択される、請求項１６または１７記載の有機化合物封入フェリチン。
【請求項19】
フェリチンが（１）天然フェリチン、または（２）下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの改変を有する遺伝子組換えフェリチン単量体から構成されるフェリチンである、請求項１６～１８のいずれか一項記載の有機化合物封入フェリチン：（ａ）フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に機能性ペプチドが挿入されているフェリチン単量体；
（ｂ）Ｎ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体；または
（ｃ）Ｃ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、有機化合物封入フェリチンの製造方法などに関する。
【背景技術】
【0002】
フェリチンは、動植物から微生物まで普遍的に存在する、複数の単量体から構成される内腔を有する球状タンパク質である。ヒト等の動物では、フェリチンとしてＨ鎖およびＬ鎖の２種の単量体が存在すること、ならびにフェリチンは２４個の単量体から構成される多量体（多くの場合、Ｈ鎖およびＬ鎖の混合物）であって、外径１２ｎｍのカゴ状の形態および内径７ｎｍの内腔を有することが知られている。フェリチンは、生体あるいは細胞中の鉄元素のホメオスタシスに深く関わっており、その内腔中に鉄を保持できるため、鉄の輸送・貯蔵等の生理学的機能の役割を担うことが知られている。
【0003】
フェリチンはまた、その内腔中に薬剤を封入するＤＤＳ担体としての応用が検討されており、また、電子デバイスの作製にも利用されている。フェリチンのこのような用途に関連して、フェリチンに有機化合物を封入する方法が幾つか報告されている。具体的には、このような方法として、（１）溶液のｐＨを変更することによりフェリチンの脱会合および再会合を調節する方法、（２）変性剤によるフェリチンの変性、および再フォールディングを行う方法、ならびに（３）圧力による方法が報告されている。
例えば、非特許文献１では、フェリチンをｐＨ２の酸性条件下で脱会合させ、次いで溶液のｐＨを７～９に変更することでフェリチンを再会合させることにより、約２８個のドキソルビシンをフェリチンに封入できたことが報告されている。
非特許文献２では、フェリチンを改変することによりフェリチンの安定性を向上させつつ、溶液のｐＨをＨＣｌ添加でｐＨ２に変更してフェリチンの脱会合および再会合を調節することにより、約３０～９０個のドキソルビシンをフェリチンに封入できたことが報告されている。
非特許文献３では、先ず、尿素等の変性剤によりフェリチンを変性させ、次いで、変性フェリチンを薬剤と混合した後、溶液中の変性剤を抜くことにより、フェリチンが天然のフォールディング構造に回復する際に約３３個のドキソルビシンをフェリチンに封入できたことが報告されている。
特許文献１では、フェリチンおよびドキソルビシンの混合液を高圧（２００～８００ＭＰａ）下で６～２０時間放置することにより、約１０～２０個のドキソルビシンをフェリチンに封入できたことが報告されている。
例えば、非特許文献１では、フェリチンをｐＨ２の酸性条件下で脱会合させ、次いで溶液のｐＨを７～９に変更することでフェリチンを再会合させることにより、約２８個のドキソルビシンをフェリチンに封入できたことが報告されている。
非特許文献２では、フェリチンを改変することによりフェリチンの安定性を向上させつつ、溶液のｐＨをＨＣｌ添加でｐＨ２に変更してフェリチンの脱会合および再会合を調節することにより、約３０～９０個のドキソルビシンをフェリチンに封入できたことが報告されている。
非特許文献３では、先ず、尿素等の変性剤によりフェリチンを変性させ、次いで、変性フェリチンを薬剤と混合した後、溶液中の変性剤を抜くことにより、フェリチンが天然のフォールディング構造に回復する際に約３３個のドキソルビシンをフェリチンに封入できたことが報告されている。
特許文献１では、フェリチンおよびドキソルビシンの混合液を高圧（２００～８００ＭＰａ）下で６～２０時間放置することにより、約１０～２０個のドキソルビシンをフェリチンに封入できたことが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】中国特許出願公開第１０６１１０３３３号明細書
【非特許文献】
【0005】
【文献】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １９６（２０１４） １８４－１９６
【文献】Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１６，１７，５１４－５２２
【文献】Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１４ １１１（４１）：１４９００－５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記の従来方法は、フェリチンの回収率やフェリチンへの有機化合物への封入効率が低く、また、操作が煩雑である点や、所定の装置を必要とする点、封入率を上げるためにフェリチン表面を特別に改変する必要がある点で負担になるという課題がある。
より具体的には、上記（１）および（２）の方法では、酸性緩衝液または変性剤によるフェリチン構造の破壊（脱会合／変性）が必要であるところ、一旦フェリチン構造を破壊してしまうと、その後に構造の回復プロセス（再会合／再フォールディング）を設けても、フェリチンの一部が破壊されたままの状態となり元に戻らないため、フェリチンの回収率が低下するという課題がある。加えて、フェリチン構造を破壊し、その後に構造を回復させるという上記（１）および（２）の方法は、溶液（反応場）中に分布する有機化合物を取込みフェリチンに封入するに過ぎないものであることから、溶液の濃度以上の有機化合物をフェリチンに封入することができず、フェリチンに封入できる有機化合物の量が少ないという封入効率上の課題がある。
また、上記（１）の方法については、ｐＨ条件の変更を要するために緩衝液の置換が必要である。上記（２）の方法については、再フォールディングのために変性剤の除去が必要であるのみならず、封入率を上げるためにフェリチン表面を特別に改変する必要がある。したがって、上記（１）（２）の方法は、煩雑である。
さらに、上記（３）の方法については、非常に高い圧力条件を達成できる特殊な装置を必要とする点で負担になる。
より具体的には、上記（１）および（２）の方法では、酸性緩衝液または変性剤によるフェリチン構造の破壊（脱会合／変性）が必要であるところ、一旦フェリチン構造を破壊してしまうと、その後に構造の回復プロセス（再会合／再フォールディング）を設けても、フェリチンの一部が破壊されたままの状態となり元に戻らないため、フェリチンの回収率が低下するという課題がある。加えて、フェリチン構造を破壊し、その後に構造を回復させるという上記（１）および（２）の方法は、溶液（反応場）中に分布する有機化合物を取込みフェリチンに封入するに過ぎないものであることから、溶液の濃度以上の有機化合物をフェリチンに封入することができず、フェリチンに封入できる有機化合物の量が少ないという封入効率上の課題がある。
また、上記（１）の方法については、ｐＨ条件の変更を要するために緩衝液の置換が必要である。上記（２）の方法については、再フォールディングのために変性剤の除去が必要であるのみならず、封入率を上げるためにフェリチン表面を特別に改変する必要がある。したがって、上記（１）（２）の方法は、煩雑である。
さらに、上記（３）の方法については、非常に高い圧力条件を達成できる特殊な装置を必要とする点で負担になる。
【0007】
したがって、本発明の目的は、上記のような１以上の課題を解決することができる、有機化合物封入フェリチンの代替的な製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
従来、金属原子および金属化合物（例、金属酸化物）については、サイズが小さいため、フェリチン構造の破壊（脱会合／変性）を引き起こさない条件下で、金属原子および金属化合物をフェリチンに封入できることが知られていた。
しかし、有機化合物については、サイズが相対的に大きく、フェリチン構造におけるフェリチン透過能を有しないと考えられていたため、フェリチン構造の破壊を引き起こさない条件下では、有機化合物をフェリチンに封入できないと考えられていた。実際、非特許文献１は、ドキソルビシンのフェリチンへの封入に際して、フェリチンの脱会合を引き起こすことができる強酸性条件下（ｐＨ約２．５以下）をあえて採用して、フェリチンを脱会合させている。
今回、本発明者らは、鋭意検討した結果、フェリチン構造を破壊しないｐＨ範囲内にある、有機化合物の酸解離定数（ｐＫａ）に応じた適切なｐＨを有する緩衝液を使用するという簡便な方法により、有機化合物をフェリチンに封入できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
しかし、有機化合物については、サイズが相対的に大きく、フェリチン構造におけるフェリチン透過能を有しないと考えられていたため、フェリチン構造の破壊を引き起こさない条件下では、有機化合物をフェリチンに封入できないと考えられていた。実際、非特許文献１は、ドキソルビシンのフェリチンへの封入に際して、フェリチンの脱会合を引き起こすことができる強酸性条件下（ｐＨ約２．５以下）をあえて採用して、フェリチンを脱会合させている。
今回、本発明者らは、鋭意検討した結果、フェリチン構造を破壊しないｐＨ範囲内にある、有機化合物の酸解離定数（ｐＫａ）に応じた適切なｐＨを有する緩衝液を使用するという簡便な方法により、有機化合物をフェリチンに封入できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕有機化合物封入フェリチンの製造方法であって、
（１）緩衝液中で有機化合物をフェリチンと混合して、有機化合物およびフェリチンの混合物を得ること；ならびに
（２）緩衝液中で前記混合物をインキュベートすることを含み、
緩衝液は、ｐＨ３以上１３未満であり、かつ
緩衝液は、有機化合物のｐＫａが７未満の場合には３以上７未満のｐＨを有し、有機化合物のｐＫａが７以上の場合には６以上１３未満のｐＨを有する、方法。
〔２〕緩衝液のｐＨと有機化合物のｐＫａが、式：ｐＨ＝２．６＋０．６ｐＫａ±０．４ｐＫａの関係を満たす、〔１〕の方法。
〔３〕インキュベートの温度が１０℃以上６０℃以下である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕有機化合物の分子量が１００以上１０００未満である、〔１〕～〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕有機化合物のｐＫａが２以上１３以下である、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕１０分子以上２００分子以下の有機化合物がフェリチン１分子に封入されている、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕混合およびインキュベートの合計時間が３０分以上である、〔１〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕前記混合におけるフェリチンに対する有機化合物の重量比（有機化合物／フェリチン）が０．２０以上０．３６以下である、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕有機化合物が、正の架電部分、または正に架電し得る部分を有する、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕正の架電部分が、（ａ）アンモニウム基（例、第一級、第二級、第三級または第四級）、グアニジウム基、イミダゾリウム基、オキサゾリウム基、チアゾリウム基、オキサジアゾリウム基、トリアゾリウム基、ピロリジニウム基、ピリジニウム基、ピペリジニウム基、ピラゾリウム基、ピリミジニウム基、ピラジニウム基、およびトリアジニウム基からなる群より選ばれるカチオン性窒素含有基、または（ｂ）ホスホニウム基である、〔９〕の方法。
〔１１〕正に架電し得る部分が、（ａ’）アミノ基、グアニジノ基、ニトロ基、アミド基、ヒドラジド基、イミド基、アジド基、およびジアゾ基からなる群より選ばれる窒素含有基、または（ｂ’）ホスフィノ基である、〔９〕または〔１０〕の方法。
〔１２〕フェリチンが（１）天然フェリチン、または（２）下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの改変を有する遺伝子組換えフェリチン単量体から構成されるフェリチンである、〔１〕～〔１１〕のいずれかの方法：
（ａ）フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に機能性ペプチドが挿入されているフェリチン単量体；
（ｂ）Ｎ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体；または
（ｃ）Ｃ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体。
〔１３〕有機化合物封入フェリチンを含む緩衝液であって、
緩衝液は、有機化合物のｐＫａが７未満の場合には３以上７未満のｐＨを有し、有機化合物のｐＫａが７以上の場合には６以上１２未満のｐＨを有する、緩衝液。
〔１４〕緩衝液が、６以上９以下のｐＨを有する、〔１３〕の緩衝液。
〔１５〕有機化合物が、６以上９以下のｐＫａを有する、〔１３〕または〔１４〕の緩衝液。
〔１６〕有機化合物封入フェリチンであって、
有機化合物が、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、および標識物質からなる群より選ばれ、
フェリチン１分子への有機化合物の封入分子数が以下である、有機化合物封入フェリチン：
（１）有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンである場合、４０分子以上２００分子以下；
（２）有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが遺伝子組換えフェリチンである場合、１００分子以上２００分子以下；または
（３）有機化合物がヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、または標識物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンまたは遺伝子組換えフェリチンである場合、１０分子以上２００分子以下。
〔１７〕アントラサイクリン系物質がドキソルビシンであり、
ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬がファモチジンであり、
ピグアナイド系物質がメトホルミンであり、
ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬がミノキシジルであり、
β２アドレナリン受容体作動薬がテルブタリンであり、
イミダゾリン系物質がクレアチニンであり、
ビタミンがチアミン、リボフラビン、またはニコチンアミドであり、
標識物質がローダミンＢ、ウラニン、またはコンゴレッドである、〔１６〕の有機化合物封入フェリチン。
〔１８〕有機化合物が、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、およびβ２アドレナリン受容体作動薬からなる群より選択される、〔１６〕または〔１７〕の有機化合物封入フェリチン。
〔１９〕フェリチンが（１）天然フェリチン、または（２）下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの改変を有する遺伝子組換えフェリチン単量体から構成されるフェリチンである、〔１６〕～〔１８〕のいずれかの有機化合物封入フェリチン：
（ａ）フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に機能性ペプチドが挿入されているフェリチン単量体；
（ｂ）Ｎ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体；または
（ｃ）Ｃ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体。
〔１〕有機化合物封入フェリチンの製造方法であって、
（１）緩衝液中で有機化合物をフェリチンと混合して、有機化合物およびフェリチンの混合物を得ること；ならびに
（２）緩衝液中で前記混合物をインキュベートすることを含み、
緩衝液は、ｐＨ３以上１３未満であり、かつ
緩衝液は、有機化合物のｐＫａが７未満の場合には３以上７未満のｐＨを有し、有機化合物のｐＫａが７以上の場合には６以上１３未満のｐＨを有する、方法。
〔２〕緩衝液のｐＨと有機化合物のｐＫａが、式：ｐＨ＝２．６＋０．６ｐＫａ±０．４ｐＫａの関係を満たす、〔１〕の方法。
〔３〕インキュベートの温度が１０℃以上６０℃以下である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕有機化合物の分子量が１００以上１０００未満である、〔１〕～〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕有機化合物のｐＫａが２以上１３以下である、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕１０分子以上２００分子以下の有機化合物がフェリチン１分子に封入されている、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕混合およびインキュベートの合計時間が３０分以上である、〔１〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕前記混合におけるフェリチンに対する有機化合物の重量比（有機化合物／フェリチン）が０．２０以上０．３６以下である、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕有機化合物が、正の架電部分、または正に架電し得る部分を有する、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕正の架電部分が、（ａ）アンモニウム基（例、第一級、第二級、第三級または第四級）、グアニジウム基、イミダゾリウム基、オキサゾリウム基、チアゾリウム基、オキサジアゾリウム基、トリアゾリウム基、ピロリジニウム基、ピリジニウム基、ピペリジニウム基、ピラゾリウム基、ピリミジニウム基、ピラジニウム基、およびトリアジニウム基からなる群より選ばれるカチオン性窒素含有基、または（ｂ）ホスホニウム基である、〔９〕の方法。
〔１１〕正に架電し得る部分が、（ａ’）アミノ基、グアニジノ基、ニトロ基、アミド基、ヒドラジド基、イミド基、アジド基、およびジアゾ基からなる群より選ばれる窒素含有基、または（ｂ’）ホスフィノ基である、〔９〕または〔１０〕の方法。
〔１２〕フェリチンが（１）天然フェリチン、または（２）下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの改変を有する遺伝子組換えフェリチン単量体から構成されるフェリチンである、〔１〕～〔１１〕のいずれかの方法：
（ａ）フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に機能性ペプチドが挿入されているフェリチン単量体；
（ｂ）Ｎ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体；または
（ｃ）Ｃ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体。
〔１３〕有機化合物封入フェリチンを含む緩衝液であって、
緩衝液は、有機化合物のｐＫａが７未満の場合には３以上７未満のｐＨを有し、有機化合物のｐＫａが７以上の場合には６以上１２未満のｐＨを有する、緩衝液。
〔１４〕緩衝液が、６以上９以下のｐＨを有する、〔１３〕の緩衝液。
〔１５〕有機化合物が、６以上９以下のｐＫａを有する、〔１３〕または〔１４〕の緩衝液。
〔１６〕有機化合物封入フェリチンであって、
有機化合物が、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、および標識物質からなる群より選ばれ、
フェリチン１分子への有機化合物の封入分子数が以下である、有機化合物封入フェリチン：
（１）有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンである場合、４０分子以上２００分子以下；
（２）有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが遺伝子組換えフェリチンである場合、１００分子以上２００分子以下；または
（３）有機化合物がヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、または標識物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンまたは遺伝子組換えフェリチンである場合、１０分子以上２００分子以下。
〔１７〕アントラサイクリン系物質がドキソルビシンであり、
ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬がファモチジンであり、
ピグアナイド系物質がメトホルミンであり、
ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬がミノキシジルであり、
β２アドレナリン受容体作動薬がテルブタリンであり、
イミダゾリン系物質がクレアチニンであり、
ビタミンがチアミン、リボフラビン、またはニコチンアミドであり、
標識物質がローダミンＢ、ウラニン、またはコンゴレッドである、〔１６〕の有機化合物封入フェリチン。
〔１８〕有機化合物が、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、およびβ２アドレナリン受容体作動薬からなる群より選択される、〔１６〕または〔１７〕の有機化合物封入フェリチン。
〔１９〕フェリチンが（１）天然フェリチン、または（２）下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの改変を有する遺伝子組換えフェリチン単量体から構成されるフェリチンである、〔１６〕～〔１８〕のいずれかの有機化合物封入フェリチン：
（ａ）フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に機能性ペプチドが挿入されているフェリチン単量体；
（ｂ）Ｎ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体；または
（ｃ）Ｃ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体。
【発明の効果】
【0010】
本発明の方法によれば、有機化合物のｐＫａに応じた適切なｐＨを有する緩衝液を使用するという簡便な方法により、有機化合物をフェリチンに封入することができる。
本発明の方法はまた、有機化合物封入フェリチンの作製効率に優れる。先ず、本発明の方法は、フェリチン構造の破壊（脱会合／変性）を必要としないため、フェリチン構造の破壊（脱会合／変性）および回復プロセスを必要とする従来の方法（回復プロセスを設けても、フェリチンの一部が破壊されたままの状態となり元に戻らない）に比し、フェリチンの回収率に優れる。次に、本発明の方法は、フェリチンの超分子構造が維持可能な環境下でフェリチンの内腔と外殻の電気化学ポテンシャル差を利用することにより、溶液中の濃度以上に有機化合物をフェリチンに封入できることから、溶液中の濃度以上で有機化合物をフェリチンに封入することが困難である従来の方法（フェリチン構造の回復に伴い、溶液をフェリチン内腔中に取り込む方法）に比し、より多くの有機化合物をフェリチンに効率的に封入できる。
本発明の方法はさらに、従来の方法とは異なり、緩衝液の置換、変性剤の除去、または特殊な装置が不要である点で簡便である。
本発明の方法はまた、有機化合物封入フェリチンの作製効率に優れる。先ず、本発明の方法は、フェリチン構造の破壊（脱会合／変性）を必要としないため、フェリチン構造の破壊（脱会合／変性）および回復プロセスを必要とする従来の方法（回復プロセスを設けても、フェリチンの一部が破壊されたままの状態となり元に戻らない）に比し、フェリチンの回収率に優れる。次に、本発明の方法は、フェリチンの超分子構造が維持可能な環境下でフェリチンの内腔と外殻の電気化学ポテンシャル差を利用することにより、溶液中の濃度以上に有機化合物をフェリチンに封入できることから、溶液中の濃度以上で有機化合物をフェリチンに封入することが困難である従来の方法（フェリチン構造の回復に伴い、溶液をフェリチン内腔中に取り込む方法）に比し、より多くの有機化合物をフェリチンに効率的に封入できる。
本発明の方法はさらに、従来の方法とは異なり、緩衝液の置換、変性剤の除去、または特殊な装置が不要である点で簡便である。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図7】図７は、ドキソルビシン封入処理されていないフェリチンと薬剤封入フェリチンの表面電荷が同等であること（それ故、フェリチン表面にドキソルビシンが吸着することで複合化しているわけではないこと）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、以下を含む、有機化合物封入フェリチンの製造方法を提供する：
（１）緩衝液中で有機化合物をフェリチンと混合して、有機化合物およびフェリチンの混合物を得ること；ならびに
（２）緩衝液中で前記混合物をインキュベートすることを含み、
緩衝液は、ｐＨ３以上１３未満であり、かつ
緩衝液は、有機化合物のｐＫａが７未満の場合には３以上７未満のｐＨを有し、有機化合物のｐＫａが７以上の場合には６以上１３未満のｐＨを有する、方法。
（１）緩衝液中で有機化合物をフェリチンと混合して、有機化合物およびフェリチンの混合物を得ること；ならびに
（２）緩衝液中で前記混合物をインキュベートすることを含み、
緩衝液は、ｐＨ３以上１３未満であり、かつ
緩衝液は、有機化合物のｐＫａが７未満の場合には３以上７未満のｐＨを有し、有機化合物のｐＫａが７以上の場合には６以上１３未満のｐＨを有する、方法。
【0013】
フェリチン（２４多量体タンパク質）は、哺乳動物等の種々の高等生物に普遍的に存在する。フェリチンを構成するフェリチン単量体は、種々の高等生物間で高度に保存された６つのα－ヘリックスを有すること、および高等生物のフェリチン単量体としてＨ鎖およびＬ鎖の２種の単量体が存在することが知られている。
【0014】
本発明では、フェリチンを構成するフェリチン単量体として、哺乳動物のフェリチン単量体を使用することができる。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、齧歯類（例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、家畜および使役用の哺乳動物（例、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）が挙げられる。フェリチン単量体としては、Ｈ鎖もしくはＬ鎖、またはそれらの混合物のいずれも使用することができる。フェリチン単量体としては、天然フェチリン単量体、または２４多量体の形成能を有するその遺伝子組換えフェチリン単量体のいずれも使用することができる。
【0015】
一実施形態では、遺伝子組換えフェチリン単量体は、フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックス間のフレキシブルリンカー領域において改変されていてもよい。このような遺伝子組換えフェチリン単量体としては、例えば、フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて１番目と２番目の間、２番目と３番目の間、３番目と４番目の間、４番目と５番目の間、または５番目と６番目の間（好ましくは２番目と３番目の間）のフレキシブルリンカー領域に機能性ペプチドが挿入されたフェリチン単量体が挙げられる（本願実施例、ならびに米国特許出願公開第２０１６／００６０３０７号；Ｊａｅ Ｏｇ Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ（２０１３），７（９），７４６２－７４７１；Ｓｏｏｊｉ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１６），１７（３），１１５０－１１５９；Ｙｏｕｎｇ Ｊｉ Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１２），１３（１２），４０５７－４０６４）。例えば、ヒトフェリチンＨ鎖（配列番号１）、およびヒトフェリチンＬ鎖（配列番号２）では、６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて１～６番目のα－ヘリックスは、表Ａに示されるとおりである。したがって、ヒトフェリチンＨ鎖（配列番号１）のフレキシブルリンカー領域は、１番目と２番目の間のフレキシブルリンカー領域（４３～４９位のアミノ酸残基からなる領域）、２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域（７８～９６位のアミノ酸残基からなる領域）、３番目と４番目の間のフレキシブルリンカー領域（１２５～１２７位のアミノ酸残基からなる領域）、４番目と５番目の間のフレキシブルリンカー領域（１３８位のアミノ酸残基の位置）、または５番目と６番目の間のフレキシブルリンカー領域（１６０～１６４位のアミノ酸残基の領域）である。また、ヒトフェリチンＬ鎖（配列番号２）のフレキシブルリンカー領域は、１番目と２番目の間のフレキシブルリンカー領域（３８～４５位のアミノ酸残基からなる領域）、２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域（７４～９２位のアミノ酸残基からなる領域）、３番目と４番目の間のフレキシブルリンカー領域（１２１～１２３位のアミノ酸残基からなる領域）、４番目と５番目の間のフレキシブルリンカー領域（１３４位のアミノ酸残基の位置）、または５番目と６番目の間のフレキシブルリンカー領域（１５５～１５９位のアミノ酸残基の領域）である。
【0016】
【表A】
【0017】
別の実施形態では、遺伝子組換えフェチリン単量体は、そのＮ末端領域および／またはＣ末端領域において改変されていてもよい。フェリチン単量体のＮ末端は多量体の表面上に露出され、そのＣ末端は表面上に露出し得ない。したがって、フェリチン単量体のＮ末端に付加されるペプチド部分は多量体の表面に露出して、多量体の外部に存在する標的材料と相互作用することができる（例、国際公開第２００６／１２６５９５号）。一方、フェリチン単量体のＣ末端は、そのアミノ酸残基を改変することで、フェリチン内腔中の有機化合物と相互作用することができる（例、Ｙ．Ｊ．Ｋａｎｇ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１２，ｖｏｌ．１３（１２），４０５７）。このような遺伝子組換えフェチリン単量体としては、例えば、Ｎ末端またはＣ末端に機能性ペプチドが付加されたフェリチン単量体が挙げられる。
【0018】
好ましくは、フェリチンは、ヒトへの臨床応用の観点より、ヒトフェリチンである。ヒトフェリチンを構成するフェリチン単量体としては、ヒトフェリチンＨ鎖、もしくはヒトフェリチンＬ鎖、またはそれらの混合物のいずれも使用することができる。
【0019】
本発明では、フェリチン１分子（または１単位）とは、２４個のフェリチン単量体から構成される複合体（２４量体）をいい、フェリチン単量体はフェリチン１分子（または１単位）に該当しないものとする。
【0020】
特定の実施形態では、フェリチンＨ鎖は、以下であってもよい：
（Ａ１）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる、１もしくは数個のアミノ酸残基の修飾を含むアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、２４量体）形成能を有するタンパク質；または
（Ｃ１）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、２４量体）形成能を有するタンパク質。
（Ａ１）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる、１もしくは数個のアミノ酸残基の修飾を含むアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、２４量体）形成能を有するタンパク質；または
（Ｃ１）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、２４量体）形成能を有するタンパク質。
【0021】
好ましくは、フェリチンＬ鎖は、以下であってもよい：
（Ａ２）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ２）配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる、１もしくは数個のアミノ酸残基の修飾を含むアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、２４量体）形成能を有するタンパク質；または
（Ｃ２）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、２４量体）形成能を有するタンパク質。
（Ａ２）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ２）配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる、１もしくは数個のアミノ酸残基の修飾を含むアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、２４量体）形成能を有するタンパク質；または
（Ｃ２）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、２４量体）形成能を有するタンパク質。
【0022】
タンパク質（Ｂ１）および（Ｂ２）では、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる１、２、３または４種の修飾により、１個または数個のアミノ酸残基を改変することができる。アミノ酸残基の修飾は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１または数個」は、タンパク質の活性を大きく損なわない個数を示す。用語「１または数個」が示す数は、例えば１～５０個、好ましくは１～４０個、より好ましくは１～３０個、さらにより好ましくは１～２０個、特に好ましくは１～１０個または１～５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。
【0023】
タンパク質（Ｃ１）または（Ｃ２）では、対象のアミノ酸配列に対する同一性の程度は、好ましくは９２％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、さらにより好ましくは９７％以上であり、最も好ましくは９８％以上または９９％以上である。タンパク質の同一性％の算出は、アルゴリズムｂｌａｓｔｐにより行うことができる。より具体的には、タンパク質の同一性の算定％は、アルゴリズムｂｌａｓｔｐにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を用いて行うことができる。
【0024】
アミノ酸配列において変異を導入すべきアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであるが、配列アライメントをさらに参考にして特定されてもよい。具体的には、当業者は、１）複数のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、配列アライメントを利用することによりアミノ酸配列において変異を導入すべき位置を特定でき、また、既知の二次および三次構造情報を併用して、アミノ酸配列において変異を導入すべきアミノ酸残基の位置を特定することもできる。
【0025】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【0026】
特定の実施形態では、本発明で用いられるフェリチンは、（１）天然フェリチン、または（２）下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの改変を有する遺伝子組換えフェリチン単量体から構成されるフェリチンであってもよい：
（ａ）フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に機能性ペプチドが挿入されているフェリチン単量体；
（ｂ）Ｎ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体；または
（ｃ）Ｃ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体。
（ａ）フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に機能性ペプチドが挿入されているフェリチン単量体；
（ｂ）Ｎ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体；または
（ｃ）Ｃ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体。
【0027】
機能性ペプチドとしては、目的タンパク質と融合された場合に任意の機能を目的タンパク質に付加することができるペプチドを用いることができる。このようなペプチドとしては、標的材料に対する結合能を有するペプチド、プロテアーゼ分解性ペプチド、細胞透過性ペプチド、安定化ペプチドが挙げられる。
【0028】
機能性ペプチドは、所望の機能を有する１個のペプチドのみであってもよいし、または所望の機能を有する同種もしくは異種の複数（例、２個、３個もしくは４個等の数個）のペプチドであってもよい。機能性ペプチドが上記のような複数のペプチドである場合、複数の機能性ペプチドは、任意の順序で挿入されて、フェリチン単量体と融合することができる。フェリチン単量体および機能性ペプチドの融合は、アミド結合を介して達成することができる。このような融合は、アミド結合により、フェリチン単量体および機能性ペプチドを直接的に連結することにより達成されてもよいし、あるいは１個のアミノ酸残基（例、メチオニン）または数個（例えば２～２０個、好ましくは２～１０個、より好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸残基からなるペプチド（ペプチドリンカー）が介在したアミド結合により間接的に達成されてもよい。種々のペプチドリンカーが知られているので、本発明でも、このようなペプチドリンカーを使用することができる。好ましくは、上記機能性ペプチドは、２０個以下（好ましくは１８個以下、より好ましくは１５個以下、さらにより好ましくは１２個以下、特に好ましくは１０個以下）のアミノ酸残基からなるペプチドである。
【0029】
機能性ペプチドとして、標的材料に対する結合能を有するペプチドを用いる場合、標的材料としては、例えば、有機物および無機物（例、導体、半導体および磁性体）が挙げられる。より具体的には、このような標的材料としては、生体有機分子、金属材料、シリコン材料、炭素材料、タンパク質精製用タグ（例、ヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）と相互作用できる材料（例、ニッケル、マルトース、グルタチオン）、標識物質（例、放射性物質、蛍光物質、色素）、ポリマー（例、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリエチレンオキシドまたはポリ（Ｌ－乳酸）等の疎水性有機ポリマーまたは伝導性ポリマー）が挙げられる。
【0030】
生体有機分子としては、例えば、タンパク質（例、オリゴペプチドまたはポリペプチド）、核酸（例、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）、糖質（例、モノサッカリド、オリゴサッカリドまたはポリサッカリド）、脂質が挙げられる。生体有機分子はまた、細胞表面抗原（例、癌抗原、心疾患マーカー、糖尿病マーカー、神経疾患マーカー、免疫疾患マーカー、炎症マーカー、ホルモン、感染症マーカー）であってもよい。生体有機分子はまた、疾患抗原（例、癌抗原、心疾患マーカー、糖尿病マーカー、神経疾患マーカー、免疫疾患マーカー、炎症マーカー、ホルモン、感染症マーカー）であってもよい。このような生体有機分子に対する結合能を有するペプチドとしては、種々のペプチドが報告されている。例えば、タンパク質に対する結合能を有するペプチド（例、Ｆ．Ｄａｎｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１２，ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１１，ｐ．２９６１．、Ｃ－Ｈ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，２０１５，ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２９０，２９０ｒａ９１．Ｌ．Ｖａｎｎｕｃｃｉ ｅｔ．ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２，ｖｏｌ．７，ｐ．１４８９、Ｊ．Ｃｕｔｒｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，ｖｏｌ．１９（８），ｐ．１４６８、Ｒ．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１７，ｖｏｌ．１１０－１１１，ｐ．１３を参照）、核酸に対する結合能を有するペプチド（例、Ｒ．Ｔａｎ ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５、ｖｏｌ．９２，ｐ．５２８２、Ｒ．Ｔａｎ ｅｔ．ａｌ．Ｃｅｌｌ、１９９３、ｖｏｌ．７３， ｐ．１０３１、Ｒ．Ｔａｌａｎｉａｎ ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２，ｖｏｌ．３１，ｐ．６８７１を参照）、糖質に対する結合能を有するペプチド（例、Ｋ．Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，ｖｏｌ．８９，Ｎｏ．１２，ｐ．５３９３－５３９７．，Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌ．１１１，ｐ．４３６，Ａ．Ｂａｉｍｉｅｖ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｃｏｗ），２００５，ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．１，ｐ．９０．を参照）、脂質に対する結合能を有するペプチド（例、Ｏ．Ｋｒｕｓｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｂ Ｚ． Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，１９９５，ｖｏｌ．５０ｃ，ｐ．３８０，Ｏ．Ｓｉｌｖａ ｅｔ．ａｌ．， Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，ｖｏｌ．６，２７１２８．， Ａ．Ｆｉｌｏｔｅｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌ．２６７，Ｎｏ．１７，ｐ．１１８００を参照）等の種々のペプチドが報告されている。
【0031】
好ましくは、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドは、タンパク質に対する結合能を有するペプチドであってもよい。タンパク質に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、Ｄａｎｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１２，ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１１，ｐ．２９６１に開示されるＲＧＤ含有ペプチドやその改変配列（例、ＲＧＤ（配列番号１９）、ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ（配列番号２０）、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号２１）、ＧＲＧＤＳ（配列番号２２）、およびＡＳＤＲＧＤＦＳＧ（配列番号２３））、ならびにその他のインテグリン認識配列（例、ＥＩＬＤＶ（配列番号２４）、およびＲＥＤＶ（配列番号２５））、Ｌ．Ｖａｎｎｕｃｃｉ ｅｔ．ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２，ｖｏｌ．７，ｐ．１４８９に開示されるペプチド（例、ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰ（配列番号２６））、Ｊ．Ｃｕｔｒｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．８，ｐ．１４６８に開示されるペプチド（例、ＶＮＴＡＮＳＴ（配列番号２７））、Ｒ．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１７，ｖｏｌ．１１０－１１１，ｐ．１３に開示されるペプチド（例、ＤＨＬＡＳＬＷＷＧＴＥＬ（配列番号２８）、およびＮＹＳＫＰＴＤＲＱＹＨＦ（配列番号２９）、ＩＰＬＰＰＰＳＲＰＦＦＫ（配列番号３０）、ＬＭＮＰＮＮＨＰＲＴＰＲ（配列番号３１）、ＣＨＨＮＬＴＨＡＣ（配列番号３２）、ＣＬＨＨＹＨＧＳＣ（配列番号３３）、ＣＨＨＡＬＴＨＡＣ（配列番号３４）、ＳＰＲＰＲＨＴＬＲＬＳＬ（配列番号３５）、ＴＭＧＦＴＡＰＲＦＰＨＹ（配列番号３６）、ＮＧＹＥＩＥＷＹＳＷＶＴＨＧＭＹ（配列番号３７）、ＦＲＳＦＥＳＣＬＡＫＳＨ（配列番号３８）、ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（配列番号３９）、ＱＨＹＮＩＶＮＴＱＳＲＶ（配列番号４０）、ＱＲＨＫＰＲＥ（配列番号４１）、ＨＳＱＡＡＶＰ（配列番号４２）、ＡＧＮＷＴＰＩ（配列番号４３）、ＰＬＬＱＡＴＬ（配列番号４４）、ＬＳＬＩＴＲＬ（配列番号４５）、ＣＲＧＤＣＬ（配列番号４６）、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号４７）、ＲＴＤＬＤＳＬＲＴＹＴＬ（配列番号４８）、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（配列番号４９）、ＡＰＳＰＭＩＷ（配列番号５０）、ＬＱＮＡＰＲＳ（配列番号５１）、ＳＷＴＬＹＴＰＳＧＱＳＫ（配列番号５２）、ＳＷＥＬＹＹＰＬＲＡＮＬ（配列番号５３）、ＷＱＰＤＴＡＨＨＷＡＴＬ（配列番号５４）、ＣＳＤＳＷＨＹＷＣ（配列番号５５）、ＷＨＷＬＰＮＬＲＨＹＡＳ（配列番号５６）、ＷＨＴＥＩＬＫＳＹＰＨＥ（配列番号５７）、ＬＰＡＦＦＶＴＮＱＴＱＤ（配列番号５８）、ＹＮＴＮＨＶＰＬＳＰＫＹ（配列番号５９）、ＹＳＡＹＰＤＳＶＰＭＭＳ（配列番号６０）、ＴＮＹＬＦＳＰＮＧＰＩＡ（配列番号６１）、ＣＬＳＹＹＰＳＹＣ（配列番号６２）、ＣＶＧＶＬＰＳＱＤＡＩＧＩＣ（配列番号６３）、ＣＥＷＫＦＤＰＧＬＧＱＡＲＣ（配列番号６４）、ＣＤＹＭＴＤＧＲＡＡＳＫＩＣ（配列番号６５）、ＫＣＣＹＳＬ（配列番号６６）、ＭＡＲＳＧＬ（配列番号１４）、ＭＡＲＡＫＥ（配列番号６７）、ＭＳＲＴＭＳ（配列番号６８）、ＷＴＧＷＣＬＮＰＥＥＳＴＷＧＦＣＴＧＳＦ（配列番号６９）、ＭＣＧＶＣＬＳＡＱＲＷＴ（配列番号７０）、ＳＧＬＷＷＬＧＶＤＩＬＧ（配列番号７１）、ＮＰＧＴＣＫＤＫＷＩＥＣＬＬＮＧ（配列番号７２）、ＡＮＴＰＣＧＰＹＴＨＤＣＰＶＫＲ（配列番号７３）、ＩＶＷＨＲＷＹＡＷＳＰＡＳＲＩ（配列番号７４）、ＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ（配列番号７５）、ＭＱＬＰＬＡＴ（配列番号７６）、ＣＲＡＬＬＲＧＡＰＦＨＬＡＥＣ（配列番号７７）、ＩＥＬＬＱＡＲ（配列番号７８）、ＴＬＴＹＴＷＳ（配列番号７９）、ＣＶＡＹＣＩＥＨＨＣＷＴＣ（配列番号８０）、ＴＨＥＮＷＰＡ（配列番号８１）、ＷＨＰＷＳＹＬＷＴＱＱＡ（配列番号８２）、ＶＬＷＬＫＮＲ（配列番号８３）、ＣＴＶＲＴＳＡＤＣ（配列番号８４）、ＡＡＡＰＬＡＱＰＨＭＷＡ（配列番号８５）、ＳＨＳＬＬＳＳ（配列番号８６）、ＡＬＷＰＰＮＬＨＡＷＶＰ（配列番号８７）、ＬＴＶＳＰＷＹ（配列番号８８）、ＳＳＭＤＩＶＬＲＡＰＬＭ（配列番号８９）、ＦＰＭＦＮＨＷＥＱＷＰＰ（配列番号９０）、ＳＹＰＩＰＤＴ（配列番号９１）、ＨＴＳＤＱＴＮ（配列番号９２）、ＣＬＦＭＲＬＡＷＣ（配列番号９３）、ＤＭＰＧＴＶＬＰ（配列番号９４）、ＤＷＲＧＤＳＭＤＳ（配列番号９５）、ＶＰＴＤＴＤＹＳ（配列番号９６）、ＶＥＥＧＧＹＩＡＡ（配列番号９７）、ＶＴＷＴＰＱＡＷＦＱＷＶ（配列番号９８）、ＡＱＹＬＮＰＳ（配列番号９９）、ＣＳＳＲＴＭＨＨＣ（配列番号１００）、ＣＰＬＤＩＤＦＹＣ（配列番号１０１）、ＣＰＩＥＤＲＰＭＣ（配列番号１０２）、ＲＧＤＬＡＴＬＲＱＬＡＱＥＤＧＶＶＧ（配列番号１０３）、ＳＰＲＧＤＬＡＶＬＧＨＫ（配列番号１０４）、ＳＰＲＧＤＬＡＶＬＧＨＫＹ（配列番号１０５）、ＣＱＱＳＮＲＧＤＲＫＲＣ（配列番号１０６）、ＣＭＧＮＫＣＲＳＡＫＲＰ（配列番号１０７）、ＣＧＥＭＧＷＶＲＣ（配列番号１０８）、ＧＦＲＦＧＡＬＨＥＹＮＳ（配列番号１０９）、ＣＴＬＰＨＬＫＭＣ（配列番号１１０）、ＡＳＧＡＬＳＰＳＲＬＤＴ（配列番号１１１）、ＳＷＤＩＡＷＰＰＬＫＶＰ（配列番号１１２）、ＣＴＶＡＬＰＧＧＹＶＲＶＣ（配列番号１１３）、ＥＴＡＰＬＳＴＭＬＳＰＹ（配列番号１１４）、ＧＩＲＬＲＧ（配列番号１１５）、ＣＰＧＰＥＧＡＧＣ（配列番号１１６）、ＣＧＲＲＡＧＧＳＣ（配列番号１１７）、ＣＲＧＲＲＳＴ（配列番号１１８）、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号１１９）、ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１２０）、ＨＶＧＧＳＳＶ（配列番号１２１）、ＲＧＤＧＳＳＶ（配列番号１２２）、ＳＷＫＬＰＰＳ（配列番号１２３）、ＣＲＧＤＫＲＧＰＤＣ（配列番号１２４）、ＧＧＫＲＰＡＲ（配列番号１２５）、ＲＩＧＲＰＬＲ（配列番号１２６）、ＣＧＦＹＷＬＲＳＣ（配列番号１２７）、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号１２８）、ＴＬＴＹＴＷＳ（配列番号１２９）、ＳＳＱＰＦＷＳ（配列番号１３０）、ＹＲＣＴＬＮＳＰＦＦＷＥＤＭＴＨＥＣ（配列番号１３１）、ＫＴＬＬＰＴＰ（配列番号１３２）、ＫＥＬＣＥＬＤＳＬＬＲＩ（配列番号１３３）、ＩＲＥＬＹＳＹＤＤＤＦＧ（配列番号１３４）、ＮＶＶＲＱ（配列番号１３５）、ＶＥＣＹＬＩＲＤＮＬＣＩＹ（配列番号１３６）、ＣＧＧＲＲＬＧＧＣ（配列番号１３７）、ＷＦＣＳＷＹＧＧＤＴＣＶＱ（配列番号１３８）、ＮＱＱＬＩＥＥＩＩＱＩＬＨＫＩＦＥＩＬ（配列番号１３９）、ＫＭＶＩＹＷＫＡＧ（配列番号１４０）、ＬＮＩＶＳＶＮＧＲＨ（配列番号１４１）、ＱＭＡＲＩＰＫＲＬＡＲＨ（配列番号１４２）、およびＱＤＧＲＭＧＦ（配列番号１４３））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
【0032】
好ましくは、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドは、核酸に対する結合能を有するペプチドであってもよい。核酸に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、Ｒ．Ｔａｎ ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５、ｖｏｌ．９２，ｐ．５２８２に開示されるペプチドおよびその部分ペプチド（例、ＴＲＱＡＲＲ（配列番号１７）、ＴＲＱＡＲＲＮ（配列番号１４４）、ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（配列番号１４５）、ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ（配列番号１４６）、ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ（配列番号１４７）、ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡ（配列番号１４８）、およびＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１４９））、Ｒ．Ｔａｎ ｅｔ．ａｌ．Ｃｅｌｌ、１９９３、ｖｏｌ．７３，ｐ．１０３１に開示されるペプチド（例、ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（配列番号１５０））、Ｔａｌａｎｉａｎ ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２，ｖｏｌ．３１，ｐ．６８７１に開示されるペプチド（例、ＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫ（配列番号１５１））、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
【0033】
好ましくは、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドは、糖質に対する結合能を有するペプチドであってもよい。糖質に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、Ｋ．Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，ｖｏｌ．８９，No１２，ｐ．５３９３－５３９７．に開示されるペプチド（例、ＤＶＦＹＰＹＰＹＡＳＧＳ（配列番号１５２）、およびＲＶＷＹＰＹＧＳＹＬＴＡＳＧＳ（配列番号１５３））、Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌ．１１１，ｐ．４３６に開示されるペプチド（例、ＤＴＷＰＮＴＥＷＳ（配列番号１５４）、ＤＳＹＨＮＩＷ（配列番号１５５）、ＤＴＹＦＧＫＡＹＮＰＷ（配列番号１５６）、およびＤＴＩＧＳＰＶＮＦＷ（配列番号１５７））、Ａ．Ｂａｉｍｉｅｖ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｃｏｗ），２００５，ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．１，ｐ．９０に開示されるペプチド（ＴＹＣＮＰＧＷＤＰＲＤＲ（配列番号１５８）、およびＴＦＹＮＥＥＷＤＬＶＩＫＤＥＨ（配列番号１５９））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
【0034】
好ましくは、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドは、脂質に対する結合能を有するペプチドであってもよい。脂質に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、Ｏ．Ｋｒｕｓｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，１９９５，ｖｏｌ．５０ｃ，ｐ．３８０に開示されるペプチド（例、ＭＴＬＩＬＥＬＶＶＩ（配列番号１６０）、ＭＴＳＩＬＥＲＥＱＲ（配列番号１６１）、およびＭＴＴＩＬＱＱＲＥＳ（配列番号１６２））、Ｏ．Ｓｉｌｖａ ｅｔ．ａｌ．， Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，ｖｏｌ．６，２７１２８に開示されるペプチド（例、ＶＦＱＦＬＧＫＩＩＨＨＶＧＮＦＶＨＧＦＳＨＶＦ（配列番号１６３））、Ａ．Ｆｉｌｏｔｅｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌ．２６７（１７），ｐ．１１８００に開示されるペプチド（例、ＫＫＡＶＫＶＰＫＫＥＫＳＶＬＱＧＫＬＴＲＬＡＶＱＩ（配列番号１６４））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
【0035】
金属材料としては、例えば、金属および金属化合物が挙げられる。金属としては、例えば、チタン、金、クロム、亜鉛、鉛、マンガン、カルシウム、銅、カルシウム、ゲルマニウム、アルミニウム、ガリウム、カドミウム、鉄、コバルト、銀、プラチナ、パラジウム、ハフニウム、テルルが挙げられる。金属化合物としては、例えば、このような金属の酸化物、硫化物、炭酸化物、砒化物、塩化物、フッ化物およびヨウ化物、ならびに金属間化合物が挙げられる。このような金属材料に対する結合能を有するペプチドとしては、種々のペプチドが報告されている（例、国際公開第２００５／０１００３１号；国際公開第２０１２／０８６６４７号；Ｋ．Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．；Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，ｖｏｌ．１５．ｐ．２６９．；Ｋ．Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，ｖｏｌ．６６．ｐ．１０．；Ｕｍｅｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，１７，２５７１－２５７５（２００５）；Ｍ．Ｂ．Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４，ｖｏｌ．１５．ｐ．１７７６．；Ｃ．Ｅ．Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００３，ｖｏｌ．１３．ｐ．２４１４．）。したがって、本発明では、このような種々のペプチドを用いることができる。
【0036】
好ましくは、金属材料に対する結合能を有するペプチドは、チタンまたはチタン化合物（例、酸化チタン）等のチタン材料に対する結合能を有するペプチド、および金または金化合物等の金材料に対する結合能を有するペプチドであってもよい。チタン材料に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、後述する実施例および国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるペプチド（例、ＲＫＬＰＤＡ（配列番号１６５））、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０－４４に開示されるペプチド（例、ＳＳＫＫＳＧＳＹＳＧＳＫＧＳＫＲＲＩＬ（配列番号１６６））、Ｉ．Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００６，ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．５，ｐ．５２８に開示されるペプチド（例、ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＦＭＳ（配列番号１６７））、ならびに国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるペプチド（例、ＲＫＬＰＤＡＰＧＭＨＴＷ（配列番号１６８）、およびＲＡＬＰＤＡ（配列番号１６９））、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。金材料に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、後述する実施例およびＳ．Ｂｒｏｗｎ，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９７，ｖｏｌ．１５， ｐ．２６９に開示されるペプチド（例、ＭＨＧＫＴＱＡＴＳＧＴＩＱＳ（配列番号１７０））、Ｊ．Ｋｉｍ ｅｔ．ａｌ．，Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．，２０１０，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．７，ｐ．２６８１に開示されるペプチド（例、ＴＧＴＳＶＬＩＡＴＰＹＶ（配列番号１７１）、およびＴＧＴＳＶＬＩＡＴＰＧＶ（配列番号１７２））、ならびにＫ．Ｎａｍ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，ｖｏｌ．３１２，Ｎｏ．５７７５，ｐ．８８５．に開示されるペプチド（例、ＬＫＡＨＬＰＰＳＲＬＰＳ（配列番号１７３））、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
【0037】
シリコン材料としては、例えば、シリコンまたはシリコン化合物が挙げられる。シリコン化合物としては、例えば、シリコンの酸化物（例、一酸化ケイ素（ＳｉＯ）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２））、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、シラン（ＳｉＨ４）、シリコーンゴムが挙げられる。このようなシリコン材料に対する結合能を有するペプチドとしては、種々のペプチドが報告されている（例、国際公開第２００６／１２６５９５号；国際公開第２００６／１２６５９５号；Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０－４４）。したがって、本発明では、このような種々のペプチドを用いることができる。
【0038】
好ましくは、シリコン材料に対する結合能を有するペプチドは、シリコンまたはシリコン化合物（例、シリコンの酸化物）に対する結合能を有するペプチドであってもよい。このようなペプチドとしては、例えば、国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるペプチド（例、ＲＫＬＰＤＡ（配列番号１６５））、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０－４４に開示されるペプチド（例、ＳＳＫＫＳＧＳＹＳＧＳＫＧＳＫＲＲＩＬ（配列番号１７４））、ならびに国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるペプチド（ＭＳＰＨＰＨＰＲＨＨＨＴ（配列番号１７５）、ＴＧＲＲＲＲＬＳＣＲＬＬ（配列番号１７６）、およびＫＰＳＨＨＨＨＨＴＧＡＮ（配列番号１７７））、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
【0039】
炭素材料としては、例えば、カーボンナノ材料（例、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、カーボンナノホン（ＣＮＨ））、フラーレン（Ｃ６０）、グラフェンシート、グラファイトが挙げられる。このような炭素材料に対する結合能を有するペプチドとしては、種々のペプチドが報告されている（例、特開２００４－１２１１５４号公報；特開２００４－１２１１５４号公報；Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０－４４）。したがって、本発明では、このような種々のペプチドを用いることができる。
【0040】
好ましくは、炭素材料に対する結合能を有するペプチドは、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）またはカーボンナノホン（ＣＮＨ）等のカーボンナノ材料に対する結合能を有するペプチドであってもよい。このようなペプチドとしては、例えば、後述する実施例および特開２００４－１２１１５４号公報に開示されるペプチド（例、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１７８））、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０－４４に開示されるペプチド（ＨＳＳＹＷＹＡＦＮＮＫＴ（配列番号１７９））、ならびに特開２００４－１２１１５４号公報に開示されるペプチド（例、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号１８０））、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
【0041】
機能性ペプチドとしてプロテアーゼ分解性ペプチドが用いられる場合、プロテアーゼとしては、例えば、カスパーゼやカテプシンなどのシステインプロテアーゼ（Ｄ． ＭｃＩｌｗａｉｎ１ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．，２０１３，ｖｏｌ．５，ａ００８６５６、Ｖ．Ｓｔｏｋａ ｅｔ ａｌ．，ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ．２００５，ｖｏｌ．５７，Ｎｏ．４－５ｐ．３４７）、コラゲナーゼ（Ｇ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，２００７，ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．３，ｐ．６４６）、トロンビンやＸａ因子（Ｒ．Ｊｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２００３，ｖｏｌ．３１，ｐ．１、Ｈ．Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．， ２０１０，ｖｏｌ．８４，Ｎｏ．２，ｐ．１０７６）、ウイルス由来プロテアーゼ（Ｃ．Ｂｙｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｒｅｓ．，２００６，ｖｏｌ．６７，ｐ．５０１）が挙げられる。
【0042】
プロテアーゼ分解性ペプチドとしては、例えば、Ｅ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２０１５，ｖｏｌ．２５，ｐ．１２７９に開示されるペプチド（例、ＧＲＲＧＫＧＧ（配列番号１８１））、Ｇ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，２００７，ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．３，ｐ．６４６に開示されるペプチド（例、ＧＰＬＧＶ（配列番号１８２）、およびＧＰＬＧＶＲＧ（配列番号１８３））、Ｙ．Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１２，ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．１２，ｐ．４０５７に開示されるペプチド（例、ＧＧＬＶＰＲＧＳＧＡＳ（配列番号１８４））、Ｒ．Ｔａｌａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，ｖｏｌ．２７２，ｐ．９６７７に開示されるペプチド（例、ＹＥＶＤＧＷ（配列番号１８５）、ＬＥＶＤＧＷ（配列番号１８６）、ＶＤＱＭＤＧＷ（配列番号１８７）、ＶＤＶＡＤＧＷ（配列番号１８８）、ＶＱＶＤＧＷ（配列番号１８９）、およびＶＤＱＶＤＧＷ（配列番号１９０））、Ｊｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２００３，ｖｏｌ．３１，ｐ．１に開示されるペプチド（例、ＥＬＳＬＳＲＬＲＤＳＡ（配列番号１９１）、ＥＬＳＬＳＲＬＲ（配列番号１９２）、ＤＮＹＴＲＬＲＫ（配列番号１９３）、ＹＴＲＬＲＫＱＭ（配列番号１９４）、ＡＰＳＧＲＶＳＭ（配列番号１９５）、ＶＳＭＩＫＮＬＱ（配列番号１９６）、ＲＩＲＰＫＬＫＷ（配列番号１９７）、ＮＦＦＷＫＴＦＴ（配列番号１９８）、ＫＭＹＰＲＧＮＨ（配列番号１９９）、ＱＴＹＰＲＴＮＴ（配列番号２００）、ＧＶＹＡＲＶＴＡ（配列番号２０１）、ＳＧＬＳＲＩＶＮ（配列番号２０２）、ＮＳＲＶＡ（配列番号２０３）、ＱＶＲＬＧ（配列番号２０４）、ＭＫＳＲＮＬ（配列番号２０５）、ＲＣＫＰＶＮ（配列番号２０６）、およびＳＳＫＹＰＮ（配列番号２０７））、Ｈ．Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１０，ｖｏｌ．８４，Ｎｏ．２，ｐ．１０７６に開示されるペプチド（例、ＬＶＰＲＧＳ（配列番号２０８））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
【0043】
機能性ペプチドとして安定化ペプチドが用いられる場合、安定化ペプチドとしては、例えば、Ｘ．Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，２０１１，ｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，ｐ．９７７に開示されるペプチド（例、ＣＣＡＬＮＮ（配列番号２０９））、ならびにＥ．Ｆａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１６，ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．２，ｐ．５１４に開示されるペプチド（例、ＰＡＳ（配列番号２１０））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
【0044】
機能性ペプチドとして細胞透過性ペプチドが用いられる場合、細胞透過性ペプチドとしては、例えば、Ｚ．Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｐ．，２０１６，ｖｏｌ．４，Ｎｏ．５，ｐ．５２８に開示されるペプチド（例、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号２１１）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２１２）、ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ（配列番号２１３）、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２１４）、ＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号２１５）、ＧＬＡＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭ（配列番号２１６）、ＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２１７）、ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（配列番号２１８）、ＭＶＲＲＦＬＶＴＬ（配列番号２１９）、ＲＩＲＲＡＣＧＰＰＲＶＲＶ（配列番号２２０）、ＭＶＫＳＫＩＧＳＷＩＬＶＬＦＶ（配列番号２２１）、ＳＤＶＧＬＣＫＫＲＰ（配列番号２２２）、ＮＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＱＲ（配列番号２２３）、ＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＱ（配列番号２２４）、ＤＰＫＧＤＰＫＧＶＴＶＴ（配列番号２２５）、ＶＴＶＴＶＴＧＫＧＤＰＫＰＤ（配列番号２２６）、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫ（配列番号２２７）、ＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２２８）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧ（配列番号２２９）、ＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２３０）、ＲＬＳＧＭＮＥＶＬＳＦＲＷ（配列番号２３１）、ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ（配列番号２３２）、およびＰＩＥＶＣＭＹＲＥＰ（配列番号２３３））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
【0045】
機能性ペプチドとしては、標的材料に対する結合能を有するペプチドが好ましい。標的材料に対する結合能を有するペプチドの好ましい例は、有機物に対する結合能を有するペプチドである。有機物に対する結合能を有するペプチドとしては、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドが好ましく、タンパク質に対する結合能を有するペプチドがより好ましい。
【0046】
フェリチンは、フェリチンをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を用いて、フェリチンを宿主細胞に産生させることで入手することができる。このような宿主細胞としては、例えば、動物、昆虫、魚類、または植物に由来する細胞、および微生物が挙げられる。動物としては、哺乳動物または鳥類（例、ニワトリ）が好ましく、哺乳動物がより好ましい。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、齧歯類（例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、家畜および使役用の哺乳動物（例、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）が挙げられる。
【0047】
好ましい実施形態では、宿主細胞は、臨床応用の観点から、ヒト細胞、またはヒトタンパク質の産生に汎用されている細胞（例、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞）であってもよい。
【0048】
別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、フェリチンの大量生産等の観点より、微生物であってもよい。微生物としては、例えば、細菌および真菌が挙げられる。細菌としては、宿主細胞として用いられている任意の細菌を使用することができ、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌〔例、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌〔（例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌〔例、シェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）〕、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌（例、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ））が挙げられる。真菌としては、宿主細胞として用いられている任意の真菌を使用することができ、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属真菌〔例、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属真菌〔例、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）〕が挙げられる。あるいは、微生物として、糸状菌を用いてもよい。糸状菌としては、例えば、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）／タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アルペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、エメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、およびハイポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）に属する細菌が挙げられる。
【0049】
有機化合物としては、任意の有機化合物を用いることができる。このような有機化合物としては、例えば、低分子化合物、糖化合物、ペプチド化合物、核酸化合物（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸）が挙げられるが、低分子化合物が好ましい。
【0050】
本発明では、用語「低分子化合物」とは、分子量１００～１０００の有機化合物をいう。低分子化合物である有機化合物の分子量は、１５０以上、２００以上、２５０以上、または３００以上であってもよい。分子量はまた、９５０以下、９００以下、８５０以下、または８００以下であってもよい。より具体的には、分子量は、１５０～９５０、２００～９００、２５０～８５０、または３００～８００であってもよい。
【0051】
低分子化合物としては、例えば、医薬、ビタミン、標識物質、アミノ酸、オリゴペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、単糖、脂質、脂肪酸、およびそれらの代謝物が挙げられる。
【0052】
特定の実施形態では、本発明で用いられる医薬は、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、または標識物質であってもよい。
アントラサイクリン系物質としては、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロンが挙げられる。なかでも、ドキソルビシンが好ましい。
ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬としては、例えば、ファモチジン、シメチジン、ラニチジン、ニザチジン、ロキサチジンアセテート、ラフチジンが挙げられる。なかでも、ファモチジンが好ましい。
ピグアナイド系物質としては、例えば、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン、プログアニル、クロロプログアニル、クロルヘキシジン、アレキシジンが挙げられる。なかでも、メトホルミンが好ましい。
ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬としては、例えば、ミノキシジル、ニコランジル、ピナシジル、ジアゾキシド、クロマカリム、レブクロマカリム、レマカリムが挙げられる。なかでも、ミノキシジルが好ましい。
β２アドレナリン受容体作動薬としては、例えば、テルブタリン、サルブタモール、レボサルブタモール、ピルブテロール、プロカテロール、メタプロテレノール、フェノテロール、ビトルテロール、サルメテロール、フォルモテロール、ビランテロール、バンブテロール、クレンブテロール、インダカテロールが挙げられる。なかでも、テルブタリンが好ましい。
イミダゾリン系物質としては、例えば、クレアチニン、オキシメタゾリン、クロニジン、シベンゾリン、チザニジン、テトラヒドロゾリン、ナファゾリン、フェントラミン、ブリモニジン、モクソニジンが挙げられる。なかでも、クレアチニンが好ましい。
アントラサイクリン系物質としては、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロンが挙げられる。なかでも、ドキソルビシンが好ましい。
ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬としては、例えば、ファモチジン、シメチジン、ラニチジン、ニザチジン、ロキサチジンアセテート、ラフチジンが挙げられる。なかでも、ファモチジンが好ましい。
ピグアナイド系物質としては、例えば、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン、プログアニル、クロロプログアニル、クロルヘキシジン、アレキシジンが挙げられる。なかでも、メトホルミンが好ましい。
ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬としては、例えば、ミノキシジル、ニコランジル、ピナシジル、ジアゾキシド、クロマカリム、レブクロマカリム、レマカリムが挙げられる。なかでも、ミノキシジルが好ましい。
β２アドレナリン受容体作動薬としては、例えば、テルブタリン、サルブタモール、レボサルブタモール、ピルブテロール、プロカテロール、メタプロテレノール、フェノテロール、ビトルテロール、サルメテロール、フォルモテロール、ビランテロール、バンブテロール、クレンブテロール、インダカテロールが挙げられる。なかでも、テルブタリンが好ましい。
イミダゾリン系物質としては、例えば、クレアチニン、オキシメタゾリン、クロニジン、シベンゾリン、チザニジン、テトラヒドロゾリン、ナファゾリン、フェントラミン、ブリモニジン、モクソニジンが挙げられる。なかでも、クレアチニンが好ましい。
【0053】
ビタミンとしては、例えば、ビタミンＢ１（例、チアミン）、ビタミンＢ２（例、リボフラビン）、ビタミンＢ３（例、ナイアシン、ニコチンアミド）、ビタミンＢ５（例、パントテン酸）、ビタミンＢ６（例、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン）、ビタミンＢ７（例、ビオチン）、ビタミンＢ９（例、葉酸）、ビタミンＢ１２（例、シアノコバラミン、ヒドロキソコバラミン）、ビタミンＣ（例、アスコルビン酸）、ビタミンＡ（例、レチノール、β－カロテン、α－カロテン、β－クリプトキサンチン）、ビタミンＤ（例、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール）、ビタミンＥ（例、トコフェロール、トコトリエノール）、ビタミンＫ（例、フィロキノン、メナキノン）が挙げられる。なかでも、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３が好ましい。
【0054】
標識物質としては、例えば、ローダミン（例、ローダミンＢ、６Ｇ、６ＧＰ、３ＧＯ、１２３）、ウラニン等の蛍光物質、コンゴレッド等の色素および染料、ならびに発光物質が挙げられる。なかでも、ローダミンＢ、ウラニン、またはコンゴレッドが好ましい。
【0055】
アミノ酸としては、例えば、α－アミノ酸（例、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジン、グリシン）、β－アミノ酸（例、β－アラニン、パントテン酸）、γ－アミノ酸（例、γ－アミノ酪酸）が挙げられる。アミノ酸は、Ｌ体であってもＤ体であってもよい。
【0056】
有機化合物のｐＫａは、２以上１３以下であってもよい。有機化合物のｐＫａが２以上１３以下である場合、当該ｐＫａに応じた適切なｐＨを有する緩衝液を使用することで、フェリチンに有機化合物をより効率的に封入することができる。より具体的には、有機化合物のｐＫａが２以上７未満（好ましくは３以上６未満）の場合、緩衝液は、３以上７未満（好ましくは３以上６未満）のｐＨを有することが好ましい。また、有機化合物のｐＫａが７以上１３以下の場合、緩衝液は、６以上１３未満（好ましくは６以上１２未満、より好ましくは６以上１１未満、さらにより好ましくは６以上１０未満）のｐＨを有することが好ましい。
【0057】
有機化合物のｐＫａは、中和滴定法により求めることができる（化学便覧 基礎編 Ｉ、ＩＩ（改訂４版）、日本化学会編、丸善、１９９３）。中和滴定法では、各分子の０．１モル／Ｌ溶液を調製し、２５℃でその溶液に０．１モル／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液または塩酸水溶液を滴定し、ｐＨを測定することで計算することができる。有機化合物が単一のｐＫａ値を有する場合、その値を有機化合物のｐＫａとして採用される。一方、有機化合物が複数（例えば２～６、好ましくは２～５、より好ましくは２～４、さらにより好ましくは２または３）のｐＫａ値を有する場合、それらの平均値が有機化合物のｐＫａとして採用される。
【0058】
好ましくは、有機化合物は、正の荷電部分および／または正に荷電し得る部分を有していてもよい。
【0059】
一実施形態では、有機化合物は、正の荷電部分を有する。正の荷電部分とは、固体の状態で正に荷電している基を意味する。正の荷電部分としては、例えば、カチオン性窒素含有基、およびカチオン性リン含有基が挙げられる。
【0060】
カチオン性窒素含有基とは、正に荷電した窒素原子を有する基を意味する。カチオン性窒素含有基としては、例えば、アンモニウム基（例、第一級、第二級、第三級または第四級）、グアニジウム基、イミダゾリウム基、オキサゾリウム基、チアゾリウム基、オキサジアゾリウム基、トリアゾリウム基、ピロリジニウム基、ピリジニウム基、ピペリジニウム基、ピラゾリウム基、ピリミジニウム基、ピラジニウム基、およびトリアジニウム基が挙げられる。
【0061】
カチオン性リン含有基とは、正に荷電したリン原子を有する基を意味する。カチオン性リン含有基としては、例えばホスホニウム基（例、第一級、第二級、第三級または第四級）が挙げられる。
【0062】
別の実施形態では、有機化合物は、正に荷電し得る部分を有する。正に荷電し得る部分とは、固体の状態では正に荷電していないものの、水溶液中に溶解した状態では水素原子アクセプターとして作用して、水溶液のｐＨに依存して正に荷電することができる基を意味する。正に荷電し得る部分としては、例えば、正に荷電し得る窒素含有基、および正に荷電し得るリン含有基が挙げられる。正に荷電し得る窒素含有基としては、例えば、アミノ基（例、第一級、第二級、または第三級）、グアニジノ基、ニトロ基、アミド基、ヒドラジド基、イミド基、アジド基、ジアゾ基が挙げられる。正に荷電し得るリン含有基としては、例えば、ホスフィノ基（例、第一級、第二級、または第三級）が挙げられる。
【0063】
有機化合物は、正の荷電部分または正に荷電し得る部分に加えて、負の荷電部分（例、アミンオキシドにおけるオキシド基）または負に荷電し得る部分（例、硫酸基）を有していてもよい。有機化合物が、正の荷電部分または正に荷電し得る部分に加えて、負の荷電部分または負に荷電し得る部分を有する場合、正の荷電部分および／または正に荷電し得る部分の総数が、負の荷電部分および／または負に荷電し得る部分の総数に比し多いこと（すなわち、全体として正の電荷を帯びているか、または溶液の所望のｐＨ条件によって全体として正の電荷を帯び易くなっていること）が好ましい。
【0064】
特定の実施形態では、有機化合物のｐＫａとｐＨは、相関式：ｐＨ＝２．６＋０．６ｐＫａ±０．４ｐＫａの範囲内であってもよい（図１１）。変動係数は、好ましくは０．３である。
【0065】
別の特定の実施形態では、有機化合物は、６以上９以下のｐＫａを有していてもよい。この場合、有機化合物封入フェリチンの製造方法に用いた緩衝液（例、ｐＨ６以上９以下）をそのまま保存に用いることで、有機化合物封入フェリチンの製造後に有機化合物封入フェリチンを安定的に保存することができる。したがって、本発明では、６以上９以下のｐＫａを有する有機化合物を好適に使用することができる。
【0066】
本発明の方法では、先ず、緩衝液中で有機化合物をフェリチンと混合することにより、有機化合物およびフェリチンの混合物が得られる。混合は、任意の様式により行うことができる。例えば、フェリチン含有緩衝液中に有機化合物を溶解してもよく、または有機化合物含有緩衝液中に有機化合物を溶解してもよく、あるいは、有機化合物含有緩衝液をフェリチン含有緩衝液と合わせることにより行われてもよい。混合におけるフェリチンに対する有機化合物の重量比（有機化合物／フェリチン）は、フェリチンに有機化合物を封入できる限り特に限定されないが、例えば、０．０５～０．４５であってもよい。フェリチンに有機化合物を効率的に封入する観点から、このような重量比は、例えば、０．２０以上０．３６以下であってもよい。
【0067】
本発明で用いられる緩衝液は、３以上１３未満のｐＨを有する。このような範囲のｐＨであれば、フェリチン構造の破壊（脱会合および変性）を防ぐことができる。緩衝液のｐＨは、有機化合物のｐＫａ等の因子に応じて、４以上、５以上、６以上、または７以上であってもよい。緩衝液のｐＨはまた、有機化合物のｐＫａ等の因子に応じて、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、または７未満であってもよい。緩衝液のｐＨは、ガラス電極法により２５℃で測定される値を用いることができる。
【0068】
緩衝液としては、目的のｐＨに応じて適切なものを選択することができる。目的のｐＨが３以上７未満である場合に好適に使用できる緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、フタル酸緩衝液、グリシン塩酸塩緩衝液、ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液、ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液、ビストリス塩酸塩緩衝液が挙げられる。目的のｐＨが６以上１３未満である場合に好適に使用できる緩衝液としては、例えば、トリス塩酸塩緩衝液、炭酸ナトリウム緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液、ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液、グリシン－ＮａＯＨ緩衝液、ＣＡＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液、塩化カリウム－水酸化ナトリウム緩衝液が挙げられる。
【0069】
特定の実施形態では、緩衝液のｐＨは、６以上９以下であってもよい。この場合、有機化合物封入フェリチンの製造方法に用いた緩衝液をそのまま保存に用いることで、有機化合物封入フェリチンの製造後に有機化合物封入フェリチンを安定的に保存することができる。したがって、本発明では、６以上９以下のｐＨを有する緩衝液を好適に使用することができる。
【0070】
本発明の方法では、次いで、緩衝液中で上記混合物がインキュベートされる。インキュベートは、任意の様式により行うことができる。例えば、インキュベートは、緩衝液中で上記混合物を静置または撹拌することにより、行われる。インキュベートの温度は、有機化合物をフェリチンに封入できる限り特に限定されず、例えば１０℃以上６０℃以下である。インキュベートの温度は、１５℃以上、または２０℃以上であってもよい。インキュベートの温度はまた、５５℃以下、または５０℃以下であってもよい。
【0071】
混合およびインキュベートの合計時間は、有機化合物をフェリチンに封入できる限り特に限定されず、例えば、５分以上、１０分以上、１５分以上、または２０以上であってもよい。好ましくは、有機化合物をフェリチンに十分に封入する観点からは、混合およびインキュベートの合計時間は、３０分以上であってもよい。
【0072】
本発明において、フェリチン１分子に封入される有機化合物の数は特に限定されないが、例えば、１０分子以上２００分子以下の有機化合物をフェリチン１分子に封入することができる。フェリチン１分子に封入される有機化合物の数は、好ましくは２０分子以上、より好ましくは３０分子以上、さらにより好ましくは４０分子以上、なおさらにより好ましくは５０分子以上、特に好ましくは６０分子以上、７０分子以上、８０分子以上、９０分子以上、１００分子以上、１１０分子以上、１２０分子以上、１３０分子以上、１４０分子以上、または１５０分子以上であってもよい。フェリチン１分子に封入される有機化合物の数はまた、好ましくは１９０分子以下、より好ましくは１８０分子以下、さらにより好ましくは１７０分子以下、なおさらにより好ましくは１６０分子以下、特に好ましくは１５０分子以下、１４０分子以下、１３０分子以下、１２０分子以下、１１０分子以下、１００分子以下、９０分子以下、８０分子以下、７０分子以下、６０分子以下、５０分子以下、４０分子以下、３０分子以下、２０分子以下または１５分子以下であってもよい。
【0073】
特定の実施形態では、有機化合物がアントラサイクリン系物質である場合、フェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数は、フェリチンが（ａ）天然フェリチン単量体から構成される天然フェリチン、または（ｂ）遺伝子組換えフェリチン単量体から構成される遺伝子組換えフェリチンである場合に応じて変動してもよい。
【0074】
例えば、有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンである場合、天然フェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数は、４０分子以上２００分子以下であってもよい。天然フェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数は、好ましくは５０分子以上、より好ましくは６０分子以上、さらにより好ましくは７０分子以上、なおさらにより好ましくは８０分子以上、特に好ましくは９０分子以上であってもよい。天然フェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数はまた、好ましくは１７０分子以下、より好ましくは１４０分子以下であってもよい。
【0075】
一方、有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが遺伝子組換えフェリチンである場合、遺伝子組換えフェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数は、１００分子以上２００分子以下であってもよい。遺伝子組換えフェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数は、好ましくは１１０分子以上、より好ましくは１２０分子以上、さらにより好ましくは１３０分子以上、なおさらにより好ましくは１４０分子以上、特に好ましくは１５０分子以上であってもよい。遺伝子組換えフェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数はまた、好ましくは１９０分子以下、より好ましくは１８０分子以下であってもよい。
【0076】
あるいは、有機化合物がアントラサイクリン系物質である場合、フェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数は、（ａ）天然フェリチン、または（ｂ）遺伝子組換えフェリチンの別によらず、規定することもできる。このような場合、フェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数は、１００分子以上２００分子以下であってもよい。フェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数は、好ましくは１１０分子以上、より好ましくは１２０分子以上、さらにより好ましくは１３０分子以上、なおさらにより好ましくは１４０分子以上、特に好ましくは１５０分子以上であってもよい。フェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数はまた、好ましくは１９０分子以下、より好ましくは１８０分子以下であってもよい。
【0077】
特定の実施形態では、有機化合物がヒスタミンＨ２受容体拮抗薬である場合、フェリチン１分子に封入されるヒスタミンＨ２受容体拮抗薬の数は、１０分子以上２００分子以下であってもよい。フェリチン１分子に封入されるヒスタミンＨ２受容体拮抗薬の数は、好ましくは２０分子以上、より好ましくは３０分子以上であってもよい。フェリチン１分子に封入されるヒスタミンＨ２受容体拮抗薬の数はまた、好ましくは１５０分子以下、より好ましくは１００分子以下、さらにより好ましくは５０分子以下であってもよい。
【0078】
特定の実施形態では、有機化合物がピグアナイド系物質である場合、フェリチン１分子に封入されるピグアナイド系物質の数は、１０分子以上２００分子以下であってもよい。フェリチン１分子に封入されるピグアナイド系物質の数は、好ましくは２０分子以上、より好ましくは３０分子以上、さらにより好ましくは４０分子以上、なおさらにより好ましくは５０分子以上、特に好ましくは６０分子以上、または７０分子以上であってもよい。フェリチン１分子に封入されるピグアナイド系物質の数はまた、好ましくは１５０分子以下、より好ましくは１００分子以下であってもよい。
【0079】
特定の実施形態では、有機化合物がＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬である場合、フェリチン１分子に封入されるＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬の数は、１０分子以上２００分子以下であってもよい。フェリチン１分子に封入されるＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬の数は、好ましくは２０分子以上、より好ましくは３０分子以上、さらにより好ましくは４０分子以上、なおさらにより好ましくは５０分子以上、特に好ましくは６０分子以上であってもよい。フェリチン１分子に封入されるＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬の数はまた、好ましくは１５０分子以下、より好ましくは１００分子以下であってもよい。
【0080】
特定の実施形態では、有機化合物がβ２アドレナリン受容体作動薬である場合、フェリチン１分子に封入されるβ２アドレナリン受容体作動薬の数は、１０分子以上２００分子以下であってもよい。フェリチン１分子に封入されるβ２アドレナリン受容体作動薬の数は、好ましくは２０分子以上、より好ましくは３０分子以上、さらにより好ましくは４０分子以上、なおさらにより好ましくは５０分子以上、特に好ましくは６０分子以上、７０分子以上、８０分子以上、９０分子以上、１００分子以上、１１０分子以上、または１２０分子以上であってもよい。フェリチン１分子に封入されるβ２アドレナリン受容体作動薬の数はまた、好ましくは１５０分子以下であってもよい。
【0081】
特定の実施形態では、有機化合物がイミダゾリン系物質である場合、フェリチン１分子に封入されるイミダゾリン系物質の数は、１０分子以上２００分子以下であってもよい。フェリチン１分子に封入されるイミダゾリン系物質の数は、好ましくは１５分子以上、より好ましくは２０分子以上であってもよい。フェリチン１分子に封入されるイミダゾリン系物質の数はまた、好ましくは１５０分子以下、より好ましくは１００分子以下、さらにより好ましくは５０分子以下であってもよい。
【0082】
特定の実施形態では、有機化合物がビタミンである場合、フェリチン１分子に封入されるビタミンの数は、１０分子以上２００分子以下であってもよい。フェリチン１分子に封入されるビタミンの数は、好ましくは１５０分子以下、より好ましくは１００分子以下、さらにより好ましくは５０分子以下、なおさらにより好ましくは３０分子以下、特に好ましくは２０分子以下であってもよい。
【0083】
特定の実施形態では、有機化合物が標識物質である場合、フェリチン１分子に封入される標識物質の数は、１０分子以上２００分子以下であってもよい。フェリチン１分子に封入される標識物質の数は、好ましくは１５０分子以下、より好ましくは１００分子以下、さらにより好ましくは５０分子以下、なおさらにより好ましくは３０分子以下、特に好ましくは２０分子以下であってもよい。
【0084】
フェリチンへの有機化合物の封入の確認は、フェリチンおよび有機化合物の吸収ピークの測定により行うことができる。
【0085】
フェリチンおよび有機化合物の吸収ピークの測定について説明する。先ず、インキュベート後の緩衝液中のフェリチンをゲル濾過カラムにより精製する。次いで、精製後の溶出液についてフェリチンの吸収ピーク（２８０ｎｍの吸光度）および有機化合物の吸収ピーク（例えば、ドキソルビシンであれば４８０ｎｍの吸光度）を同時計測する。このとき、双方の吸収ピークの溶出位置が一致するのであれば、有機化合物がフェリチンに封入されていると判別することができる。本発明の方法によれば、有機化合物がフェリチンの表面に吸着されるのではなく、フェリチンの内腔に再現良く封入されることが確認されているので、吸収ピークの溶出位置の一致により有機化合物がフェリチンに封入されていると考えることができる。
【0086】
フェリチンへの有機化合物の封入の確認では、他の方法が併用されてもよい。このような他の方法としては、例えば、フェリチンの表面電荷および／またはサイズの測定が挙げられる。
【0087】
フェリチンの表面電荷の測定について説明する。インキュベート後の緩衝液中のフェリチンの表面電荷（ゼータ電位）が、有機化合物の封入処理がされていないフェリチンの表面電荷と同等であれば、有機化合物がフェリチンの表面に吸着することで複合化しているわけではない（すなわち、有機化合物がフェリチンに封入されている）と判別することができる。表面電荷の測定は、電気泳動光散乱法により行うことができる。好ましくは、電気泳動光散乱法による測定は、ゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社）を用いて行うことができる。フェリチンの表面電荷の測定が好適に利用される有機化合物のｐＫａは、例えば、１～４（好ましくは１～３）、および６～１４（好ましくは７～１４）である。本発明では、このようなｐＫａ値を有する有機化合物を使用することもまた好ましい。
【0088】
フェリチンのサイズの測定について説明する。この場合、インキュベート後の緩衝液中のフェリチンのサイズが、有機化合物の封入処理がされていないフェリチンのサイズ（外径 約１２ｎｍ）と同等であることがさらに確認されてもよい。サイズの同等性は、動的光散乱法により行うことができる。好ましくは、動的光散乱法による測定は、ゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社）を用いて行うことができる。
【0089】
フェリチンへの有機化合物への封入分子数は、以下のように決定することができる。（１）インキュベート後の緩衝液中のフェリチンおよび有機化合物を分離する（例、脱塩カラムの使用）。（２）フェリチンを脱会合させ（例、ｐＨ２．３に調整）、フェリチン中の有機化合物を溶液中に放出させる。（３）溶液中の有機化合物の濃度（重量／体積）を、吸光度に基づき検量線により決定する。（４）溶液中のフェリチンの濃度（重量／体積）を、標準的なタンパク質定量法（例、ウシアルブミンを標準とするプロテインアッセイＣＢＢ溶液の使用）により決定する。（５）フェリチンへの有機化合物の導入率（有機化合物とフェリチンの総重量に占める有機化合物の重量）を求める。（６）有機化合物の分子量を用いて、溶液中の有機化合物の濃度（重量／体積）から溶液中の有機化合物の濃度（モル／体積）を決定する。（７）フェリチンの分子量を用いて、溶液中のフェリチンの濃度（重量／体積）から溶液中のフェリチンの濃度（モル／体積）を決定する。（８）フェリチンへの有機化合物の導入数（フェリチンの１モルに占める有機化合物のモル数）を求める。
【0090】
本発明はまた、特定の有機化合物封入フェリチンを提供する。本発明の有機化合物封入フェリチンでは、有機化合物は、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、および標識物質からなる群より選ばれ、
フェリチン１分子への有機化合物の封入分子数が以下である：
（１）有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンである場合、４０分子以上２００分子以下；
（２）有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが遺伝子組換えフェリチンである場合、１００分子以上２００分子以下；または
（３）有機化合物がヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、または標識物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンまたは遺伝子組換えフェリチンである場合、１０分子以上２００分子以下。
フェリチン１分子への有機化合物の封入分子数が以下である：
（１）有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンである場合、４０分子以上２００分子以下；
（２）有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが遺伝子組換えフェリチンである場合、１００分子以上２００分子以下；または
（３）有機化合物がヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、または標識物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンまたは遺伝子組換えフェリチンである場合、１０分子以上２００分子以下。
【0091】
好ましくは、本発明の有機化合物封入フェリチンでは、有機化合物は、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、およびβ２アドレナリン受容体作動薬からなる群より選択されてもよい。
【0092】
本発明の有機化合物封入フェリチンにおける特定の有機化合物、フェリチン、および封入分子数等の構成要素の詳細は、上記のとおりである。
【0093】
本発明はさらに、有機化合物封入フェリチンを含む緩衝液を提供する。本発明の緩衝液における有機化合物、フェリチン、緩衝液、および封入分子数等の構成要素の詳細は、上記のとおりである。
【実施例】
【0094】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下で用いた薬剤（低分子）は全て有機化合物である。また、緩衝液のｐＨは、ガラス電極法により２５℃で測定される値を用いた。
【0095】
＜実施例１：フェリチンの調製＞
ヒト由来フェリチンＨ鎖（ＦＴＨ（配列番号１））単量体をコードするＤＮＡを全合成した。全合成されたＤＮＡを鋳型として、５’－ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＴＣＧ－３’（配列番号３）および５’－ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧＴＣ－３’（配列番号４）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型として、５’－ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ－３’（配列番号５）および５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ－３’（配列番号６）をプライマーとしてＰＣＲを行った。各々得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）で、５０℃、１５分間のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素処理することで、ＦＴＨ単量体をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＦＴＨ）を構築した。
ヒト由来フェリチンＨ鎖（ＦＴＨ（配列番号１））単量体をコードするＤＮＡを全合成した。全合成されたＤＮＡを鋳型として、５’－ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＴＣＧ－３’（配列番号３）および５’－ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧＴＣ－３’（配列番号４）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型として、５’－ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ－３’（配列番号５）および５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ－３’（配列番号６）をプライマーとしてＰＣＲを行った。各々得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）で、５０℃、１５分間のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素処理することで、ＦＴＨ単量体をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＦＴＨ）を構築した。
【0096】
続いて、構築したｐＥＴ２０－ＦＴＨを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ－ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３７℃で２４時間フラスコ培養した。得られた菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、ＦＴＨ単量体から構成されるフェリチン（以下、ＦＴＨフェリチンと略記する）を分離精製した。そのタンパク質を含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによってＦＴＨフェリチンを分離精製した。そのＦＴＨフェリチンを含む溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。結果、５ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む溶液１ｍｌを得ることができた。
【0097】
＜実施例２：ｐＨ条件の検討＞
脱会合・再会合プロセス経ずにＦＴＨフェリチン内に低分子を導入する方法（ワンステッププロセス）を確立すべく、ｐＨ条件の検討を行った。
脱会合・再会合プロセス経ずにＦＴＨフェリチン内に低分子を導入する方法（ワンステッププロセス）を確立すべく、ｐＨ条件の検討を行った。
【0098】
５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ３から９） ０．１ｍｌ中に、ＦＴＨフェリチンおよびＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＯＸ、ＣＡＳ Ｎｏ．２５３１６－４０－９、分子量５７９．９８）の終濃度が各々１ｍｇ／ｍｌと０．１ｍｇ／ｍｌとなるように混合し、各々２５℃で６０分間放置した。この反応において、ｐＨ３、４、５および６では酢酸緩衝液、ｐＨ７、８および９ではトリス塩酸塩緩衝液を用いた。放置後、水０．５ｍｌを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて０．１ｍｌに濃縮し、分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて２８０ｎｍおよび４８０ｎｍの吸光を測定した。得られた吸光度から、各種濃度のＤＯＸやＦＴＨフェリチンの２８０ｎｍおよび４８０ｎｍの吸光度から作成された検量線にてＤＯＸとＦＴＨフェリチンの濃度を決定した。その濃度を元に、薬剤導入率（ＤＯＸとＦＴＨフェリチンの総重量に占めるＤＯＸの重量）を求めた。
【0099】
その結果、ｐＨ６以下では、薬剤導入率０．５％（ｗｔ）以下であり、ＤＯＸが若干取り込まれていることが示唆された（図１）。一方、ｐＨ７以上では、ｐＨの上昇と共に、薬剤導入率が上昇し、ｐＨ９では薬剤導入率１％（ｗｔ）以上であった。以上のことから、ｐＨ７以上でＦＴＨフェリチン内にＤＯＸが導入されている可能性が示唆された。
【0100】
＜実施例３：温度条件の検討＞
脱会合・再会合プロセス経ずにＦＴＨフェリチン内に低分子を導入する方法（ワンステッププロセス）を確立すべく、温度条件の検討を行った。
脱会合・再会合プロセス経ずにＦＴＨフェリチン内に低分子を導入する方法（ワンステッププロセス）を確立すべく、温度条件の検討を行った。
【0101】
５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９） ０．１ｍｌ中に、ＦＴＨフェリチンおよびＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＯＸ、ｃａｓ番号２５３１６－４０－９、分子量５７９．９８）の終濃度が各々１ｍｇ／ｍｌと０．１ｍｇ／ｍｌとなるように混合し、１０℃から６０℃で各々６０分間放置した。放置後、水０．５ｍｌを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて０．１ｍｌに濃縮し、分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて２８０ｎｍおよび４８０ｎｍの吸光を測定した。得られた吸光度から、各種濃度のＤＯＸやＦＴＨフェリチンの２８０ｎｍおよび４８０ｎｍの吸光度から作成された検量線にてＤＯＸとＦＴＨフェリチンの濃度を決定した。その濃度を元に、薬剤導入率（ＤＯＸとＦＴＨフェリチンの総重量に占めるＤＯＸの重量）を求めた。
【0102】
その結果、２０℃以上では、反応温度の上昇と共に薬剤導入率が上昇し、６０℃では薬剤導入率５％（ｗｔ）以上であった（図２）。このことから、室温以上で効率的にＦＴＨフェリチン内にＤＯＸが導入されていることが示唆された。
【0103】
＜実施例４：反応時間の検討＞
脱会合・再会合プロセス経ずにＦＴＨフェリチン内に低分子を導入する方法（ワンステッププロセス）を確立すべく、反応時間条件の検討を行った。
脱会合・再会合プロセス経ずにＦＴＨフェリチン内に低分子を導入する方法（ワンステッププロセス）を確立すべく、反応時間条件の検討を行った。
【0104】
５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９） ０．５ｍｌ中に、ＦＴＨフェリチンおよびＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＯＸ、ｃａｓ番号２５３１６－４０－９、分子量５７９．９８）の終濃度が各々１ｍｇ／ｍｌと０．１ｍｇ／ｍｌとなるように混合し、６０℃で５分間から６０分間放置した。放置後、水０．５ｍｌを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮した。その溶液に終濃度１００ｍＭとなるようにグリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３）を添加し、容量０．２ｍｌに調整した。ここで、ｐＨ２．３にすることで、ＦＴＨフェリチンは脱会合し、ＦＴＨフェリチン内に取り込まれたＤＯＸは、溶液中に放出される。その溶液を、分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて４８０ｎｍの吸光を測定し、ＤＯＸの濃度を決定した。また、溶液中のタンパク質濃度は、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。その濃度を元に、薬剤導入率（ＤＯＸとＦＴＨフェリチンの総重量に占めるＤＯＸの重量）を求めた。
【0105】
その結果、放置時間３０分までは、放置時間と共にＤＯＸ取り込み量の上昇が確認され、フェリチン１ｇあたり１．７ｍｇ－ＤＯＸ／分の速度でＤＯＸが取り込まれていた（図３）。また、３０分以降は薬剤導入率に大きな変化は確認されなかった。この時の最大薬剤導入率は５％（ｗｔ）で、ＦＴＨフェリチン１個当たりに取り込まれたＤＯＸの分子数は平均５０個と推定された。
【0106】
＜実施例５：反応液中のＦＴＨフェリチンとＤＯＸ量比の検討＞
脱会合・再会合プロセス経ずにＦＴＨフェリチン内に低分子を導入する方法（ワンステッププロセス）を確立すべく、量比条件の検討を行った。
脱会合・再会合プロセス経ずにＦＴＨフェリチン内に低分子を導入する方法（ワンステッププロセス）を確立すべく、量比条件の検討を行った。
【0107】
終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９） ０．５ｍｌ中に、終濃度が０．０５ｍｇ／ｌから０．５ｍｇ／ｌとなるようにＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＯＸ、ｃａｓ番号２５３１６－４０－９、分子量５７９．９８）を混合し、６０℃で６０分間放置した。放置後、水０．５ｍｌを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮した。その溶液に終濃度１００ｍＭとなるようにグリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３）を添加し、容量０．５ｍｌに調整した。その溶液を、分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて４８０ｎｍの吸光を測定し、ＤＯＸの濃度を決定した。また、溶液中のタンパク質濃度は、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。その濃度を元に、薬剤導入率（ＤＯＸとＦＴＨフェリチンの総重量に占めるＤＯＸの重量）を求めた。
【0108】
その結果、ＦＴＨフェリチンとＤＯＸの濃度比が１０：３までは、濃度比と共にＤＯＸ取り込み量の上昇が確認され、最大で薬剤導入率１６％（ｗｔ）となっていた（図４）。この時のＦＴＨフェリチン１個当たりに取り込まれたＤＯＸの平均分子数は１６５個と推定された。一方、ＦＴＨフェリチンとＤＯＸの濃度比が１０：４では取り込み量が低下し、１０：５ではタンパク質を回収できなかった。これは、高濃度域でＤＯＸが析出し、そのＤＯＸ沈殿と共にＦＴＨフェリチンも沈殿したためと考えられた。
【0109】
このとき、先行知見（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １９６ （２０１４） １８４－１９６、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１４ １１１（４１）：１４９００－５）で報告されたデータから計算されていた従来法でのフェリチン内への薬剤導入率は３％（ｗｔ）から４％（ｗｔ）であり、今回の手法は従来法より４倍から５倍以上の多くの薬剤が導入できていた。また、既に販売されているドキソルビジン封入リポソームであるドキシル（承認番号：２１９００ＡＭＸ００００１０００）の薬剤導入率は１１％（ｗｔ）であり、今回の手法はドキシルよりも１．４倍以上多くの薬剤が導入できていた。
【0110】
＜実施例６：ＤＯＸ封入ＦＴＨフェリチンの分散性＞
ワンステッププロセスで得られた低分子封入ＦＴＨフェリチンが実際に低分子を封入していることを確認した。
ワンステッププロセスで得られた低分子封入ＦＴＨフェリチンが実際に低分子を封入していることを確認した。
【0111】
終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９）１ｍｌ中に、終濃度が０．１ｍｇ／ｌとなるようにＤＯＸを混合し、６０℃で６０分間放置した。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮した。同様に調製された５ｍｌ分のＤＯＸ封入ＦＴＨフェリチンを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）を混合し、さらに限外ろ過により容量１ｍｌとし、その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによって分離精製しながら、２８０ｎｍの吸光と４８０ｎｍの吸光を同時計測した。
【0112】
その結果、ＤＯＸを含有しないＦＴＨフェリチンと同じ溶出位置にＤＯＸ由来と推定される４８０ｎｍの吸光ピークが観察され、ＤＯＸとＦＴＨフェリチンは、限外ろ過による希釈洗浄やゲルろ過カラムでは分離できないほど、強固に複合化していることが分かった（図５）。
このＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体の溶液分散性はゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社）でも測定されたことから、このＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体は、野生型ＦＴＨフェリチンと同等の直径１２ｎｍの水溶液分散性ナノ粒子であることが確認できた（図６）。この測定は、ＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体をＦＴＨフェリチン量として１ｍｇ/ｍｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）５０μｌをＺＥＮ００４０セルに入れ、Ｍａｔｅｒｉａｌ設定（ＲＩ：１．４５０、Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ：０．００１）、Ｄｉｓｐｅｒｓａｎｔ設定（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：２５℃、Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ：０．８８７２ｃＰ、ＲＩ：１．３３０、Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｏｎｓｔａｎｔ：７８．５）、Ｍａｒｋ－Ｈｏｕｗｉｎｋ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ａ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ：０．４２８、Ｋ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ：７．６７×１０－５ｃｍ２／ｓ）、Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｇｌｅは１７３°Ｂａｃｋｓｃａｔｔｅｒにて２５℃で行われた。
このＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体の溶液分散性はゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社）でも測定されたことから、このＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体は、野生型ＦＴＨフェリチンと同等の直径１２ｎｍの水溶液分散性ナノ粒子であることが確認できた（図６）。この測定は、ＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体をＦＴＨフェリチン量として１ｍｇ/ｍｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）５０μｌをＺＥＮ００４０セルに入れ、Ｍａｔｅｒｉａｌ設定（ＲＩ：１．４５０、Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ：０．００１）、Ｄｉｓｐｅｒｓａｎｔ設定（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：２５℃、Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ：０．８８７２ｃＰ、ＲＩ：１．３３０、Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｏｎｓｔａｎｔ：７８．５）、Ｍａｒｋ－Ｈｏｕｗｉｎｋ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ａ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ：０．４２８、Ｋ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ：７．６７×１０－５ｃｍ２／ｓ）、Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｇｌｅは１７３°Ｂａｃｋｓｃａｔｔｅｒにて２５℃で行われた。
【0113】
＜実施例７：ＤＯＸ封入ＦＴＨフェリチンの表面電荷＞
ワンステッププロセスで得られた低分子薬剤封入ＦＴＨフェリチンによる低分子薬剤の封入を、表面電荷の評価により確認した。
ワンステッププロセスで得られた低分子薬剤封入ＦＴＨフェリチンによる低分子薬剤の封入を、表面電荷の評価により確認した。
【0114】
終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌ中に、終濃度が０．３ｍｇ／ｌとなるようにＤＯＸを混合し、４０℃で６０分間放置した。放置および遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、１ｍｌの水に懸濁したＤＯＸとＦＴＨフェリチンの複合体を得た。
【0115】
続いて、そのＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体を終濃度５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ３、６あるいは７）、酢酸緩衝液（（ｐＨ４あるいは５）、トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８あるいは９）、あるいは炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０））に各々ＦＴＨフェリチン量として終濃度０．１ｇ／ｌとなるように懸濁し、その緩衝液中、２５℃での表面電荷をゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社）にて測定した。測定は、サンプル７５０μｌをＤＴＳ１０７０セルに入れ、Ｍａｔｅｒｉａｌ設定（ＲＩ：１．４５０、Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ：０．００１）、Ｄｉｓｐｅｒｓａｎｔ設定（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：２５℃、Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ：０．８８７２ｃＰ、ＲＩ：１．３３０、Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｏｎｓｔａｎｔ：７８．５）、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ ｍｏｄｅｌ（Ｆκａ ｖａｌｕｅ：１．５０）にて行われた。その結果、ＤＯＸ封入処理されていないＦＴＨフェリチンとＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体の表面電荷は同等であり、ＦＴＨフェリチン表面にＤＯＸが吸着することで複合化しているわけではないことが分かった（図７）。
【0116】
すなわち、ＤＯＸとＦＴＨフェリチンを水溶液中で放置してワンステップで得られたこのＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体の表面電荷はＦＴＨフェリチンと同等であり、ＦＴＨフェリチン表面に塩基性のＤＯＸが吸着しているのではなく、ＦＴＨフェリチンの内部にＤＯＸが封入されている構造をとっていると考えられた。
【0117】
＜実施例８：ＤＯＸ封入ＦＴＨフェリチンの安定性評価＞
ワンステッププロセスで得られた低分子薬剤封入ＦＴＨフェリチンの安定性を評価した。
ワンステッププロセスで得られた低分子薬剤封入ＦＴＨフェリチンの安定性を評価した。
【0118】
終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌ中に、終濃度が０．３ｍｇ／ｌとなるようにＤＯＸを混合し、４０℃で６０分間放置した。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、１ｍｌの水に懸濁したＤＯＸとＦＴＨフェリチンの複合体を得た。そして、その含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。
【0119】
そのＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体を含有タンパク質濃度として終濃度１．５ｇ／ｌとなるように、終濃度５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４）、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）、５０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９）、あるいはＤ－ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４、富士フイルム和光純薬株式会社製）に各々懸濁し、各０．１ｍｌを冷暗所（４℃）で保管した。その後、数日おきに各条件のサンプルを３本ずつ回収し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ５００－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）でＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体と緩衝液を分離した。各々４８０ｎｍの吸光度を分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて測定し、緩衝液中に流出せずに、ＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体に維持されているＤＯＸの量を定量した。
【0120】
その結果、２週間以上放置した後も、ｐＨ６からｐＨ９の緩衝液中で保管されたＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体からはほとんどＤＯＸが流出していないことが分かった（図８、平均値±標準偏差）。一方、ｐＨ４では放置直後、３０％（ｗｔ）程度のＤＯＸが流出するものの、その後の流出は緩やかであった。すなわち、ＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体は、適切なｐＨ条件下では、安定的に維持されることが分かった。
【0121】
＜実施例９：ＦＴＨフェリチン中のＤＯＸ状態の推定＞
フェリチンは直径１２ｎｍのかご状をしており、その内部空腔の直径は７ｎｍである。理想的には、内腔の容積は０．１８ｚｌ（ｚｌ：Ｚｅｐｔｏ ｌｉｔｔｌｅ、１０の－２１乗リットル）である。もしも１分子のＤＯＸ（分子量５７９．９８）がフェリチンの内腔に存在した場合、ＤＯＸのフェリチン内腔での濃度は５．４ｇ／ｌとなる。ＤＯＸの室温での水への溶解性は６０ｇ／ｌ以上であることが確認できている。今回、最大でＦＴＨフェリチン１個当たり１６５個のＤＯＸ分子が導入されており、その時のＤＯＸのフェリチン内腔での濃度は８９０ｇ／ｌとなる。この濃度は室温でのＤＯＸの水溶解度を大きく上回り、フェリチン内腔で析出、ナノ粒子を形成している可能性が高い。そのため、フェリチンに取り込まれたＤＯＸの定量には一度フェリチンを脱会合し、ＤＯＸを放出させた後に、分光評価する必要がある。
フェリチンは直径１２ｎｍのかご状をしており、その内部空腔の直径は７ｎｍである。理想的には、内腔の容積は０．１８ｚｌ（ｚｌ：Ｚｅｐｔｏ ｌｉｔｔｌｅ、１０の－２１乗リットル）である。もしも１分子のＤＯＸ（分子量５７９．９８）がフェリチンの内腔に存在した場合、ＤＯＸのフェリチン内腔での濃度は５．４ｇ／ｌとなる。ＤＯＸの室温での水への溶解性は６０ｇ／ｌ以上であることが確認できている。今回、最大でＦＴＨフェリチン１個当たり１６５個のＤＯＸ分子が導入されており、その時のＤＯＸのフェリチン内腔での濃度は８９０ｇ／ｌとなる。この濃度は室温でのＤＯＸの水溶解度を大きく上回り、フェリチン内腔で析出、ナノ粒子を形成している可能性が高い。そのため、フェリチンに取り込まれたＤＯＸの定量には一度フェリチンを脱会合し、ＤＯＸを放出させた後に、分光評価する必要がある。
【0122】
＜実施例１０：ワンステッププロセスと脱会合・再会合プロセスの比較（１）＞
ワンステッププロセスと脱会合・再会合プロセスで各々得られるＤＯＸ封入ＦＴＨフェリチンのＤＯＸ封入量を比較した。
ワンステッププロセスと脱会合・再会合プロセスで各々得られるＤＯＸ封入ＦＴＨフェリチンのＤＯＸ封入量を比較した。
【0123】
脱会合・再会合プロセスでは、終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンと終濃度０．２ｍｇ／ｌのＤＯＸを含む５０ｍＭ グリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３） ０．５ｍｌを、室温で５分間から１２０分間放置した。その後、１Ｍのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）１０μｌを加え中和し、５分間から１２０分間室温で放置した。放置後、水０．５ｍｌを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて０．１ｍｌに濃縮し、分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて２８０ｎｍおよび４８０ｎｍの吸光を測定した。得られた吸光度から、各種濃度のＤＯＸやＦＴＨフェリチンの２８０ｎｍおよび４８０ｎｍの吸光度から作成された検量線にてＤＯＸとＦＴＨフェリチンの濃度を決定した。その濃度を元に、薬剤導入率（ＤＯＸとＦＴＨフェリチンの総重量に占めるＤＯＸの重量）を求めた。
【0124】
その結果、１５分放置されたＦＴＨフェリチンで最も高い薬剤導入率が確認されたが、２％（ｗｔ）程度であった（図９）。一方、終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンと終濃度０．２ｍｇ／ｌのＤＯＸを用いたワンステッププロセスで得られるＤＯＸ封入ＦＴＨフェリチンの薬剤導入率はその５倍高かった（図４）。したがって、ワンステッププロセスにより、より高い薬剤封入率を持つＦＴＨフェリチンを得られることが分かった。
【0125】
＜実施例１１：ワンステッププロセスと脱会合・再会合プロセスの比較（２）＞
ワンステッププロセスと脱会合・再会合プロセスで各々得られるＦＴＨフェリチンの回収率を比較した。
ワンステッププロセスと脱会合・再会合プロセスで各々得られるＦＴＨフェリチンの回収率を比較した。
【0126】
ワンステッププロセスでは、１０ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９） ０．１ｍｌを、６０℃で６０分間放置した。その後、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）２．９ｍｌを加え、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによって分離精製しながら、２８０ｎｍの吸光を計測した。
【0127】
脱会合・再会合プロセスでは、１０ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む５０ｍＭ グリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３） ０．１ｍｌを、室温で１５分間放置することでＦＴＨフェリチンを単量体に脱会合させた。その後、１Ｍのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）１０μｌを加え中和し、１５分間室温放置することでＦＴＨフェリチンを再会合させた。その後、１０ｍＭのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）２．９ｍｌを加え、１０ｍＭのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによって分離精製しながら、２８０ｎｍの吸光を計測した。
【0128】
また、対照として、６０℃放置や脱会合・再会合処理を行っていない等量のＦＴＨフェリチンも１０ｍＭのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによって分離精製しながら、２８０ｎｍの吸光を計測した。
【0129】
その結果、６０℃で６０分間放置されるワンステッププロセスで得られたＦＴＨフェリチンの回収率は未処理ＦＴＨフェリチンの９７％であった。一方、脱会合・再会合プロセスで得られたＦＴＨフェリチンの回収率は未処理ＦＴＨフェリチンの７２％であり、再会合できなかったＦＴＨフェリチン単量体も溶出後半に確認できた。
【0130】
以上のことから、ＦＴＨフェリチンの超分子構造を積極的に壊さないワンステッププロセスは、ＦＴＨフェリチンの超分子構造を一度壊してしまう脱会合・再会合プロセスと比較して、格段に処理後回収されるＦＴＨフェリチン量が多く、効率的な手法であることが分かった（図１０）。
【0131】
＜実施例１２：ワンステッププロセスによる低分子薬剤導入（１）＞
ワンステッププロセスで各種の低分子をＦＴＨフェリチン内に導入した。
ワンステッププロセスで各種の低分子をＦＴＨフェリチン内に導入した。
【0132】
今回導入された低分子薬剤を表１に示す。終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む終濃度５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ３、６あるいは７）、酢酸緩衝液（ｐＨ４あるいは５）、トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８あるいは９）、あるいは炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）に、終濃度が０．２ｍＭから５ｍＭとなるように各種低分子薬剤を混合し、２０℃から６０℃で６０分間各々放置した。全ての反応は容量０．１ｍｌで反応させた。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）し、上清を１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供することで、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて０．１ｍｌに濃縮した。
【0133】
また、対照として、表１に示す一部の低分子薬剤の脱会合・再会合プロセスでのフェリチン内への導入も行った。すなわち、終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンと終濃度０．２ｍｇ／ｌの各種低分子薬剤を各々含む５０ｍＭ グリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３） ０．５ｍｌを、室温で１５分間放置した。その後、１Ｍのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）１０μｌを加え中和し、１５分間室温で放置した。放置後、水０．５ｍｌを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて０．１ｍｌに濃縮した。
【0134】
【表1】
【0135】
それら溶液の吸光度を分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて測定すると共に、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＢとＣｏｎｇｏ Ｒｅｄは２８０ｎｍと４８０ｎｍの吸光度、Ｆａｍｏｔｉｄｉｎｅ、Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ、Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ、Ｔｅｒｂｕｔａｌｉｎｅ、Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ、ＲｉｂｏｆｌａｖｉｎおよびＴｈｉａｍｉｎｅは２５０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定した。その後、プロテインアッセイＣＢＢ溶液にて定量されたタンパク質含有量から推定されるタンパク質由来の吸光度で補正した後、各分子の吸光度から作成された検量線にて低分子薬剤の濃度を決定した。
【0136】
ワンステッププロセスでの各低分子薬剤の導入条件（反応ｐＨ、反応温度および反応時間）と封入数（フェリチン２４量体の１カゴあたりに封入された低分子の数）、導入率（低分子とフェリチンの総重量に占める低分子の重量、重量％）を表２、３に示す。その結果、分子量やｐＫａなどの物性の異なる各種低分子薬剤もワンステッププロセスで簡便にフェリチン内に導入することができた。
【0137】
【表2】
【0138】
【表3】
【0139】
また、各低分子薬剤のｐＫａと最もフェリチン内に導入量の多かった反応で用いた緩衝液ｐＨとの関係を表４、５に示す。それらの相関を図１１に示す。この相関係数は０．８４で優位に正の相関があった（ｔ－検定、ｐ＜１％）。そして、ｐＫａが中性（ｐＨ７）よりも低い分子は酸性条件（ｐＨ６以下）、ｐＫａが中性よりも高い分子は、弱酸性条件からアルカリ性条件（ｐＨ６以上）で、効率的にフェリチン内に導入されることが示唆された。
【0140】
【表4】
【0141】
【表5】
【0142】
さらに、ワンステッププロセスでフェリチン内に導入された低分子薬剤の量と脱会合・再会合プロセスでフェリチン内に導入された低分子薬剤の量を比較した。図１２はワンステッププロセスでの薬剤導入量と脱会合・再会合プロセスでの薬剤導入量の比を示す。ＤＯＸの導入量比較は、実施例５と実施例１０を用いて計算した。いずれの低分子薬剤の場合でも、ワンステッププロセスの方が多くの薬剤をフェリチン内に導入することができ、導入量の差が最も小さかったＭｅｔｆｏｒｍｉｎでも２．５倍、導入量の差が最も大きかったＤＯＸでは３０倍の差を確認できた。脱会合・再会合プロセスでは、フェリチンが再会合する際に、反応液中の低分子を巻き込み封入させるため、反応液中の低分子以上の濃度での封入は難しい。また、酸性条件下でフェリチン単量体に脱会合させる際に、フェリチン単量体構造が一部変性し、再会合後も内部の薬剤が漏れ出てしまう危険性がある。
一方で、ワンステッププロセスではフェリチンの超分子構造が維持可能な環境下で、薬剤をフェリチン内部に導入できている。そのため、反応終了後もフェリチン自体へのダメージは少なく、リークもほとんどないと考えられる。フェリチンの超分子構造が維持されたまま様々な薬剤が導入されたことから、フェリチンへの薬剤導入は、金属イオンと同様に、３回対称チャネルを通過して行われていると推定される（Ｔ Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ ＤＲ Ｒｉｐｏｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，７，１０８３－１０９１．（１９９８）、ＭＡ Ｃａｒｒｏｎｄｏ ＥＭＢＯ Ｊ．２２，１９５９－１９６８．（２００３））。理由として、チャネル以外のフェリチンの構造はタイトで金属イオンですら通過できないと考えており、それよりも排除体積の大きな有機分子は通過できないと考えらえる。そして、中性の緩衝液下で、３回対称チャネルは負に帯電しており、その静電勾配による金属イオンの流入と同様に、有機分子もフェリチン内部に能動的に取り込まれ、負に帯電したフェリチン内部に蓄積されるため、反応液中の低分子以上の濃度での封入が可能となったと考えられる。また、負に帯電したフェリチン表面の穴から、その静電勾配により内部に導入されるのであれば、アミノ基を多く持ち正に帯電しやすい有機分子の方がより取り込まれやすいと推定される。
一方で、ワンステッププロセスではフェリチンの超分子構造が維持可能な環境下で、薬剤をフェリチン内部に導入できている。そのため、反応終了後もフェリチン自体へのダメージは少なく、リークもほとんどないと考えられる。フェリチンの超分子構造が維持されたまま様々な薬剤が導入されたことから、フェリチンへの薬剤導入は、金属イオンと同様に、３回対称チャネルを通過して行われていると推定される（Ｔ Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ ＤＲ Ｒｉｐｏｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，７，１０８３－１０９１．（１９９８）、ＭＡ Ｃａｒｒｏｎｄｏ ＥＭＢＯ Ｊ．２２，１９５９－１９６８．（２００３））。理由として、チャネル以外のフェリチンの構造はタイトで金属イオンですら通過できないと考えており、それよりも排除体積の大きな有機分子は通過できないと考えらえる。そして、中性の緩衝液下で、３回対称チャネルは負に帯電しており、その静電勾配による金属イオンの流入と同様に、有機分子もフェリチン内部に能動的に取り込まれ、負に帯電したフェリチン内部に蓄積されるため、反応液中の低分子以上の濃度での封入が可能となったと考えられる。また、負に帯電したフェリチン表面の穴から、その静電勾配により内部に導入されるのであれば、アミノ基を多く持ち正に帯電しやすい有機分子の方がより取り込まれやすいと推定される。
【0143】
このことから、ワンステッププロセスは、従来の脱会合・再会合プロセスよりも多くの薬剤を導入できることが分かった。
【0144】
＜実施例１３：ＤＯＸ封入変異型ＦＴＨフェリチンの構築（１）＞
ワンステッププロセスを用いて、ペプチドアプタマーを提示したフェリチンへの薬剤導入を行った。
ワンステッププロセスを用いて、ペプチドアプタマーを提示したフェリチンへの薬剤導入を行った。
【0145】
はじめに、フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域にチタン認識ペプチド（ｍｉｎＴＢＰ１：ＲＫＬＰＤＡ（配列番号７））が挿入融合されたヒト由来フェリチンＨ鎖（ＦＴＨ－ＢＣ－ＴＢＰ）単量体をコードするＤＮＡを全合成した。全合成されたＤＮＡを鋳型、５’－ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＴＣＧ－３’（配列番号８）および５’－ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧＴＣ－３’（配列番号９）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型、５’－ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ－３’（配列番号１０）および５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ－３’（配列番号１１）をプライマーとしてＰＣＲを行った。それらＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）で、５０℃、１５分間のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素処理することで、ＦＴＨ－ＢＣ－ＴＢＰ単量体をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＦＴＨ－ＢＣ－ＴＢＰ）を構築した。ＦＴＨ－ＢＣ－ＴＢＰ単量体から構成されるフェリチンを、必要に応じて、ＦＴＨ－ＢＣ－ＴＢＰフェリチンと略記する。
【0146】
また、ヒト由来フェリチンＨ鎖単量体をコードするＤＮＡが搭載されたｐＥＴ２０－ＦＴＨを鋳型として、５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ－３’（配列番号１２）および５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧ－３’（配列番号１３）をプライマーとしてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、制限酵素ＤｐｎＩとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社）で処理し、セルフライゲーションすることで、Ｃ末端にシステインが付与されたＦＴＨｃ単量体をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＦＴＨｃ）を構築した。ＦＴＨｃ単量体から構成されるフェリチンを、必要に応じて、ＦＴＨｃフェリチンと略記する。
【0147】
続いて、構築した変異フェリチン単量体（ＦＴＨ－ＢＣ－ＴＢＰ単量体、またはＦＴＨｃ単量体）が搭載されたベクターｐＥＴ２０－ＦＴＨ－ＢＣ－ＴＢＰあるいはｐＥＴ２０－ＦＴＨｃを各々導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）をそれぞれＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ－ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３７℃で２４時間フラスコ培養した。得られた各菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、目的タンパク質を分離精製した。そのタンパク質を含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによって各変異フェリチンを分離精製した。その各変異フェリチンを含む溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて各々濃縮し、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。結果、０．２ｍｇ／ｍｌのＦＴＨ－ＢＣ－ＴＢＰフェリチンを含む溶液１ｍｌと５ｍｇ／ｍｌのＦＴＨｃフェリチンを含む溶液１ｍｌを各々得ることができた。
【0148】
終濃度１ｍｇ／ｍｌの各変異フェリチンを含む５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌ中に、終濃度が０．３ｍｇ／ｌとなるようにＤＯＸを混合し、５０℃で６０分間放置した。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、１ｍｌの水に懸濁したＤＯＸと各変異フェリチンの複合体を得た。そして、その含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。また、ＤＯＸ濃度を４８０ｎｍの吸光分析によって決定した。
【0149】
その結果、どちらの変異フェリチンにもＤＯＸを導入することができた。この時の薬剤導入率は、ＦＴＨ－ＤＥ－ＴＢＰフェリチンは６．５％（ｗｔ）、ＦＴＨｃフェリチンは８．６％（ｗｔ）であった。すなわち、ペプチドが挿入され機能化したフェリチンにおいてもワンステッププロセスを用いて薬剤が導入できることが分かった。
【0150】
＜実施例１４：ＤＯＸ封入変異型ＦＴＨの構築（２）＞
ワンステッププロセスを用いて、ペプチドアプタマーを提示したフェリチンへの薬剤導入を行った。
ワンステッププロセスを用いて、ペプチドアプタマーを提示したフェリチンへの薬剤導入を行った。
【0151】
はじめに、フェリチン単量体のＮ末端に癌認識ペプチド（ＨＥＲ２ａ：ＭＡＲＳＧＬ（配列番号１４）；Ｍ Ｈｏｕｉｍｅｌ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９２，７４８－７５５．（２００１））が挿入融合されたヒト由来フェリチンＨ鎖（ＨＥＲ２ａ－ＦＴＨ）単量体をコードするＤＮＡを得るために、ヒト由来フェリチンＨ鎖単量体をコードするＤＮＡが搭載されたｐＥＴ２０－ＦＴＨを鋳型として、５’－ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＧＣＡＣＧＴＡＧＴＧＧＴＴＴＡＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＴＣＧ－３’（配列番号１５）および５’－ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ－３’（配列番号１６）をプライマーとしてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、制限酵素ＤｐｎＩとＮｄｅＩ（タカラバイオ社）で処理し、セルフライゲーションすることで、ＨＥＲ２ａ－ＦＴＨをコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＨＥＲ２ａ－ＦＴＨ）を構築した。ＨＥＲ２ａ－ＦＴＨ単量体から構成されるフェリチンを、必要に応じて、ＨＥＲ２ａ－ＦＴＨフェリチンと略記する。
【0152】
フェリチン単量体のＣ末端にＲＮＡ認識ペプチド（Ｕ２ＡＦ：ＴＲＱＡＲＲ（配列番号１７）Ｒ Ｔａｎ ａｎｄ ＡＤ Ｆｒａｎｋｅｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９２， ５２８２－５２８６．（１９９５）））が挿入融合されたヒト由来フェリチンＨ鎖（ＦＴＨ－Ｕ２ＡＦ）をコードするＤＮＡを得るために、ヒト由来フェリチンＨ鎖単量体がコードするＤＮＡが搭載されたｐＥＴ２０－ＦＴＨを鋳型として、５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＴＧＣＧＴＧＣＴＴＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧ－３’（配列番号１８）および５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧ－３’（配列番号１３）をプライマーとしてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、制限酵素ＤｐｎＩとＮｄｅＩ（タカラバイオ社）で処理し、セルフライゲーションすることで、ＦＴＨ－Ｕ２ＡＦ単量体をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＦＴＨ－Ｕ２ＡＦ）を構築した。ＦＴＨ－Ｕ２ＡＦ単量体から構成されるフェリチンを、必要に応じて、ＦＴＨ－Ｕ２ＡＦフェリチンと略記する。
【0153】
続いて、構築した変異フェリチン単量体（ＨＥＲ２ａ－ＦＴＨ単量体、またはＦＴＨ－Ｕ２ＡＦ単量体）が搭載されたｐＥＴ２０を導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ－ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３７℃で２４時間フラスコ培養した。得られた菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、目的タンパク質を分離精製した。そのタンパク質を含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによって各変異フェリチンを分離精製した。その各変異フェリチンを含む溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。結果、０．８ｍｇ／ｍｌのＨＥＲ２ａ－ＦＴＨフェリチンを含む溶液１ｍｌと１．１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨ－Ｕ２ＡＦフェリチンを含む溶液１ｍｌを各々得ることができた。
【0154】
終濃度１ｍｇ／ｍｌの各変異フェリチンを含む５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９）１ｍｌ中に、終濃度が０．３ｍｇ／ｌとなるようにＤＯＸを混合し、５０℃で６０分間放置した。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、１ｍｌの水に懸濁したＤＯＸと変異フェリチンの複合体を得た。そして、その含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。また、ＤＯＸ濃度を４８０ｎｍの吸光分析によって決定した。
【0155】
その結果、いずれの変異フェリチンにもＤＯＸを導入することができた。この時の薬剤導入率は、ＨＥＲ２ａ－ＦＴＨフェリチンは１４．６％（ｗｔ）、ＦＴＨ－Ｕ２ＡＦフェリチンは１７．９％（ｗｔ）であった。すなわち、ペプチドが挿入され機能化したフェリチンにおいてもワンステッププロセスを用いて薬剤が導入できることが分かった。
【0156】
＜実施例１５：ＦＴＨフェリチン構造のｐＨ依存性＞
フェリチンのカゴ状構造のｐＨ依存的な変化を調べるために、ＦＴＨフェリチンを終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるように各ｐＨの溶液に懸濁し２５℃で３０分放置した後、ゼータサイザーナノＺＳを用いた動的光散乱（ＤＬＳ）法で各ｐＨでのフェリチンのサイズを測定した。測定は２５℃で実施された。使用された溶液は、０．１Ｎ ＨＣｌ（ｐＨ１．７），２０ｍＭリン酸（ｐＨ２．６、ｐＨ３．２，ｐＨ５．６，ｐＨ６．７，ｐＨ７．７）、２０ｍＭ 酢酸（ｐＨ４．２，ｐＨ４．９，ｐＨ５．３）、１ｍＭ ＮａＯＨ（ｐＨ１１．１）、１０ｍＭ ＮａＯＨ（ｐＨ１２．３）および１００ｍＭ ＮａＯＨ（ｐＨ１２．８）を用いた。また、ｐＨ２．０からｐＨ２．４の溶液は１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌにＨＣｌを滴下してｐＨを調製した。
フェリチンのカゴ状構造のｐＨ依存的な変化を調べるために、ＦＴＨフェリチンを終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるように各ｐＨの溶液に懸濁し２５℃で３０分放置した後、ゼータサイザーナノＺＳを用いた動的光散乱（ＤＬＳ）法で各ｐＨでのフェリチンのサイズを測定した。測定は２５℃で実施された。使用された溶液は、０．１Ｎ ＨＣｌ（ｐＨ１．７），２０ｍＭリン酸（ｐＨ２．６、ｐＨ３．２，ｐＨ５．６，ｐＨ６．７，ｐＨ７．７）、２０ｍＭ 酢酸（ｐＨ４．２，ｐＨ４．９，ｐＨ５．３）、１ｍＭ ＮａＯＨ（ｐＨ１１．１）、１０ｍＭ ＮａＯＨ（ｐＨ１２．３）および１００ｍＭ ＮａＯＨ（ｐＨ１２．８）を用いた。また、ｐＨ２．０からｐＨ２．４の溶液は１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌにＨＣｌを滴下してｐＨを調製した。
【0157】
その結果、ｐＨ１．７からｐＨ２．４の範囲では、ＤＬＳでの平均粒径は８ｎｍ以下で、フェリチンが脱会合し、カゴ状構造が壊れていることが示唆された（図１３）。一方、ｐＨ２．６からｐＨ１２．８での平均粒径は１１ｎｍ以上であり、カゴ状構造が維持されていることが分かった。すなわち、今回のワンポット法では、カゴ状構造が維持された条件で薬剤をフェリチン内部に導入できていることが分かった。
【0158】
＜実施例１６：ＤＯＸ封入ＦＴＬフェリチンの構築＞
ワンステッププロセスを用いて、Ｌ鎖フェリチンへの薬剤導入を行った。
ヒト由来フェリチンＬ鎖（ＦＴＬ（配列番号２））単量体をコードするＤＮＡを全合成した。全合成されたＤＮＡを鋳型として、５’－ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＴＣＧＴＣＡＧ－３’（配列番号２３４）および５’－ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧ－３’（配列番号２３５）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型として、５’－ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ－３’（配列番号５）および５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ－３’（配列番号６）をプライマーとしてＰＣＲを行った。各々得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）で、５０℃、１５分間のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素処理することで、ＦＴＬ単量体をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＦＴＬ）を構築した。
ワンステッププロセスを用いて、Ｌ鎖フェリチンへの薬剤導入を行った。
ヒト由来フェリチンＬ鎖（ＦＴＬ（配列番号２））単量体をコードするＤＮＡを全合成した。全合成されたＤＮＡを鋳型として、５’－ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＴＣＧＴＣＡＧ－３’（配列番号２３４）および５’－ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧ－３’（配列番号２３５）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型として、５’－ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ－３’（配列番号５）および５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ－３’（配列番号６）をプライマーとしてＰＣＲを行った。各々得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）で、５０℃、１５分間のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素処理することで、ＦＴＬ単量体をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＦＴＬ）を構築した。
【0159】
続いて、構築したｐＥＴ２０－ＦＴＬを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ－ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３７℃で２４時間フラスコ培養した。得られた菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、ＦＴＬ単量体から構成されるフェリチン（以下、ＦＴＬフェリチンと略記する）を分離精製した。そのＦＴＬフェリチンを含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによってＦＴＬフェリチンを分離精製した。そのＦＴＬフェリチンを含む溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。結果、３ｍｇ／ｍｌのＦＴＬフェリチンを含む溶液１ｍｌを各々得ることができた。
【0160】
終濃度１ｍｇ／ｍｌの各変異ＦＴＬフェリチンを含む５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌ中に、終濃度が０．３ｍｇ／ｌとなるようにＤＯＸを混合し、５０℃で６０分間放置した。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、１ｍｌの水に懸濁したＤＯＸとＦＴＬフェリチンの複合体を得た。そして、その含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。また、ＤＯＸ濃度を４８０ｎｍの吸光分析によって決定した。
【0161】
その結果、ＦＴＬフェリチンにＤＯＸを導入することができた。この時の薬剤導入率は、７．０％（ｗｔ）であった。すなわち、ＦＴＬフェリチンにおいてもワンステッププロセスにより薬剤が導入できることが分かった。
【0162】
＜実施例１７：ワンステッププロセスによる低分子薬剤導入（２）＞
ワンステッププロセスにより、負に帯電する官能基を持つウラニン（Ｃａｓ ｎｏ． ５１８－４７－８、分子量３７６、ｐＫａ＝２．２，４．４，６．７）をＦＴＨ内に導入した。
ワンステッププロセスにより、負に帯電する官能基を持つウラニン（Ｃａｓ ｎｏ． ５１８－４７－８、分子量３７６、ｐＫａ＝２．２，４．４，６．７）をＦＴＨ内に導入した。
【0163】
終濃度３ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む終濃度５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ３あるいは７）、あるいは酢酸緩衝液（ｐＨ５）に、終濃度が３００ｍＭとなるようにウラニンを混合し、３０℃あるいは６０℃で６０分間各々放置した。全ての反応は容量１ｍｌで反応させた。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）し、上清を１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供することで、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離し、サンプル溶液３．５ｍｌを得た。それら溶液の４３０ｎｍの吸光度を分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて測定しウラニンの濃度を決定すると共に、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。
【0164】
その結果を表６に示す。今回ウラニンのｐＫａの平均値４．４から予測される反応ｐＨの最適値はｐＨ５前後であり、実際、６０℃、ｐＨ３とｐＨ５で効率よくフェリチン内に導入することができていた。
【0165】
【表6】
【0166】
また、対照として、ウラニンを脱会合・再会合プロセスでフェリチン内へ導入した。すなわち、終濃度５ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンと終濃度１ｍＭから３００ｍＭで各々含む５０ｍＭ グリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３） ０．５ｍｌを、室温で１５分間放置した。その後、１Ｍのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９．０） １０μｌを加え中和し、１５分間室温で放置した。放置後、水０．５ｍｌを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて０．１ｍｌに濃縮した。
【0167】
その結果、反応液中のウラニンが１００ｍＭの場合に最も効率的な内包が確認された（表７）。ワンステップと脱会合・再会合プロセスで各々得られたウラニン内包ＦＴＨフェリチンのウラニン内包量を比較したところ、ワンステップで構築されたサンプルの方が２．７倍多くのウラニンを内包しており、ワンステップでより効率的な薬剤内包が実現されていることが示唆された。
【0168】
【表7】
【0169】
＜実施例１８：ワンステッププロセスで構築された色素内包フェリチンの安定性＞
ワンステッププロセスで構築されたウラニン内包ＦＴＨフェリチンの血漿中での安定性を評価した。はじめに、ヒト血漿（血液凝固試験用標準ヒト血漿、ＧＣＨ－１００Ａ、ＳＩＥＭＥＮＳ、シスメックス販売。Ｌｏｔ５０３２６４Ｂ）４０ｕｌ中、終濃度１ｍｇ／ｍｌのウラニン内包ＦＴＨフェリチンで、３７℃で遮光静置した。反応開始直後、２４時間あるいは４８時間放置後に各々３本ずつ回収し、すぐさま冷蔵保存した。得られた各サンプルを水で５倍希釈し、ゲルろ過カラム分析にてＦＴＨフェリチンと血漿蛋白質を分離しながら、４３０ｎｍの分光を測定し、ＦＴＨフェリチン内のウラニンを定量した。ゲルろ過カラム分析の条件として、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア社）とＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて、流速０．８ｍｌ／分を用いた。
ワンステッププロセスで構築されたウラニン内包ＦＴＨフェリチンの血漿中での安定性を評価した。はじめに、ヒト血漿（血液凝固試験用標準ヒト血漿、ＧＣＨ－１００Ａ、ＳＩＥＭＥＮＳ、シスメックス販売。Ｌｏｔ５０３２６４Ｂ）４０ｕｌ中、終濃度１ｍｇ／ｍｌのウラニン内包ＦＴＨフェリチンで、３７℃で遮光静置した。反応開始直後、２４時間あるいは４８時間放置後に各々３本ずつ回収し、すぐさま冷蔵保存した。得られた各サンプルを水で５倍希釈し、ゲルろ過カラム分析にてＦＴＨフェリチンと血漿蛋白質を分離しながら、４３０ｎｍの分光を測定し、ＦＴＨフェリチン内のウラニンを定量した。ゲルろ過カラム分析の条件として、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア社）とＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて、流速０．８ｍｌ／分を用いた。
【0170】
その結果、内包されたウラニンの内９４％が４８時間後でもＦＴＨフェリチン内に内包されており、ウラニン内包ＦＴＨフェリチンが血漿中で安定であることが分かった（図１４）。
【0171】
＜実施例１９：ワンステッププロセスで構築された色素内包フェリチンの細胞導入＞
フェリチンはトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）依存的に細胞内に輸送されることが知られている。ワンステッププロセスで構築された薬物内包フェリチンの細胞内移行性を評価するため、ウラニンをモデル化合物として、ウラニン内包ＦＴＨフェリチンの細胞内取り込み活性を評価した。
フェリチンはトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）依存的に細胞内に輸送されることが知られている。ワンステッププロセスで構築された薬物内包フェリチンの細胞内移行性を評価するため、ウラニンをモデル化合物として、ウラニン内包ＦＴＨフェリチンの細胞内取り込み活性を評価した。
【0172】
終濃度３ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む終濃度５０ｍＭの酢酸緩衝（ｐＨ５）２ｍｌに、終濃度が１００ｍＭとなるようにウラニンを混合し、４０℃で６０分間放置した。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）し、上清を１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供することで、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。得られたサンプル溶液３．５ｍｌを、ＰＢＳで平衡化されたＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲに供し、ＰＢＳで、流速０．５ｍｌ／分でウラニン内包ＦＴＨフェリチンを溶出し精製した。精製後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０－１００ｋ（ＧＥヘルスケア社）を用いた限外ろ過により濃縮されたウラニン内包ＦＴＨフェリチンの４３０ｎｍの吸光度を分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて測定しウラニンの濃度を決定すると共に、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。その結果、溶液ウラニンを５６９μＭ、およびＦＴＨフェリチンを６．７μＭで含有するウラニン内包ＦＴＨフェリチン水溶液１ｍｌを得られた。
【0173】
評価用培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）＋１％非必須アミノ酸溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ナカライテスク社））にウラニン内包ＦＴＨフェリチンの終濃度が０ｎＭ（ウラニン濃度０μＭ）から８００ｎＭ（ウラニン濃度濃度６７．９μＭ）となるように各々添加された培地１００μｌ中で、ヒト乳癌由来であるＳＫＢＲ－３細胞（２０，０００ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ、９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に添加し、３７℃で培養した。このＳＫＢＲ－３細胞はトランスフェリン受容体ＴｆＲが発現している。各々２４時間培養後、リン酸緩衝生理食塩水１００μｌにて２回洗浄し、Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）５０μｌ中で３７℃、１０分間放置した。その後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ培地１００μｌを加え、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）用プレートに細胞を移し、４００ｘｇ、５分間遠心分離した。各細胞をＦＡＣＳ用緩衝液（ＡｔｔｕｎｅＴＭ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｆｌｕｉｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に懸濁し、ＦＡＣＳ（Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で分析した。
【0174】
その結果、ウラニン内包ＦＴＨフェリチンの濃度依存的な蛍光強度の変化が確認され、濃度依存的に細胞への取り込み量が増加していることが示唆された（図１５）。
【0175】
同じ条件で調整された細胞を二光子励起蛍光顕微鏡（ＣＱ－１、横川電機株式会社）で観察したところ、濃度依存的なウラニン内包ＦＴＨフェリチンの細胞への取り込みを確認することができた（図１６）。
【0176】
以上の結果から、薬物を内包したフェリチンは、天然型フェリチンと同様に、細胞内への輸送能力を持つことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【0177】
本発明の方法は、例えば、新規薬物送達系（ＤＤＳ）として期待される、または電子デバイスの作製に利用される有機化合物封入フェリチンの製造に有望である。例えば、本発明の多量体を構成する融合タンパク質におけるフェリチン単量体がヒトフェリチン単量体である場合、本発明の多量体は、ＤＤＳとして有用である。また、ヒトフェリチン単量体がヒトに対する抗原性および免疫原性を有しないことに照らすと、本発明の多量体は、臨床応用において安全性に優れるという利点も有する。
本発明の緩衝液は、例えば、有機化合物封入フェリチンの製造に有用である。
有機化合物封入フェリチンは、例えば、新規薬物送達系（ＤＤＳ）として有用である。
本発明の緩衝液は、例えば、有機化合物封入フェリチンの製造に有用である。
有機化合物封入フェリチンは、例えば、新規薬物送達系（ＤＤＳ）として有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】