特許 7560541 プラズモンセンシング能力を有する水晶振動子マイクロバランス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-24

(45)【発行日】2024-10-02

(54)【発明の名称】プラズモンセンシング能力を有する水晶振動子マイクロバランス

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/65 20060101AFI20240925BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20240925BHJP

   G01N 21/41 20060101ALI20240925BHJP

   G01N 5/02 20060101ALI20240925BHJP

【ＦＩ】

G01N21/65

G01N21/64 G

G01N21/41 102

G01N5/02 A

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2022511075

(86)(22)【出願日】2020-08-18

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-25

(86)【国際出願番号】 EP2020073105

(87)【国際公開番号】W WO2021032744

(87)【国際公開日】2021-02-25

【審査請求日】2023-08-03

(31)【優先権主張番号】LU101354

(32)【優先日】2019-08-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】LU

(73)【特許権者】

【識別番号】516296566

【氏名又は名称】ルクセンブルク・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー・（エルアイエスティ）

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】シヴァシャンカール・クリシュナムルティ

(72)【発明者】

【氏名】リシャブ・ラストーギー

【審査官】伊藤 裕美

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１２－２２０３９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／００４９３３２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／００４５８７７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０１４－１１９２６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１３－２３１６８６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２１／００－２１／８３

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

Ｂ８２Ｙ ３０／００

Ｇ０１Ｎ ５／０２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）センサーであって、
圧電基板と、
前記基板と接触し、逆圧電効果を通じて中に剪断変形を誘発する少なくとも２つの電極とを備え、
前記基板は、センシング表面と、その表面上の、前記表面から突起しているプラズモンナノ粒子蓄積のパターンとを有し、各ナノ粒子蓄積は、楕円体キャップ形状の瘤の周りに配置構成されている複数のプラズモンナノ粒子からなり、蓄積間プラズモンホットスポットは、前記パターンの前記蓄積の平均直径および１０ｎｍのうちの小さいほうに相当するか、またはそれよりも小さい距離で分離されている前記パターンの隣接する蓄積の間に存在し、前記センシング表面は、プラズモン金属表面を含む、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）センサー。

【請求項2】

前記プラズモンナノ粒子は球状である、請求項１に記載のＱＣＭセンサー。

【請求項3】

前記プラズモンナノ粒子は、７から５０ｎｍの範囲、好ましくは８から４０ｎｍの範囲、さらにより好ましくは８から３０ｎｍの範囲内の平均直径を有する、請求項１または２に記載のＱＣＭセンサー。

【請求項4】

前記プラズモンナノ粒子は、平均直径を有し、最近傍ナノ粒子間の前記蓄積内の粒子間分離は、前記プラズモンナノ粒子の前記平均直径に相当するか、またはそれ未満である、請求項１から３のいずれか一項に記載のＱＣＭセンサー。

【請求項5】

前記プラズモンナノ粒子は、プラズモン金属ナノ粒子を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のＱＣＭセンサー。

【請求項6】

前記プラズモンナノ粒子は、金ナノ粒子を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のＱＣＭセンサー。

【請求項7】

前記プラズモンナノ粒子は、キャッピング剤、たとえば、クエン酸塩、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、またはキトサンで安定化される、請求項１から６のいずれか一項に記載のＱＣＭセンサー。

【請求項8】

前記プラズモン金属表面は、金表面である、請求項１から７のいずれか一項に記載のＱＣＭセンサー。

【請求項9】

前記センシング表面は、電極のうちの１つに属する、請求項８に記載のＱＣＭセンサー。

【請求項10】

前記プラズモンナノ粒子は、前記プラズモンナノ粒子のコーティングおよび／または前記電極のコーティングによって前記電極から電気的に絶縁される、請求項９に記載のＱＣＭセンサー。

【請求項11】

前記プラズモンナノ粒子は、被分析物に特異的に結合する受容体部分で官能基化される、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＱＣＭセンサー。

【請求項12】

前記瘤は、回転楕円体キャップ形状である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＱＣＭセンサー。

【請求項13】

前記瘤は、高さおよび底部直径を有し、前記瘤の前記高さと前記底部直径との比は０．１から０．９の範囲内、より好ましくは０．２から０．７の範囲内にある、請求項１２に記載のＱＣＭセンサー。

【請求項14】

前記センシング表面は、前記ナノ粒子蓄積の間に、被分析物に結合するための官能基を備える、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＱＣＭセンサー。

【請求項15】

前記ナノ粒子蓄積は、被分析物に結合するための官能基を備える、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＱＣＭセンサー。

【請求項16】

前記ナノ粒子蓄積は、被分析物に結合するための官能基を備え、前記ナノ粒子蓄積間の前記官能基および前記ナノ粒子蓄積の前記官能基は、同じ被分析物種に特異的である、請求項１４に記載のＱＣＭセンサー。

【請求項17】

前記ナノ粒子蓄積は、被分析物に結合するための官能基を備え、前記ナノ粒子蓄積間の前記官能基および前記ナノ粒子蓄積の前記官能基は、異なる被分析物種に特異的である、請求項１４に記載のＱＣＭセンサー。

【請求項18】

被分析物を検出するための方法であって、
請求項１から１７のいずれか一項に記載のＱＣＭセンサーを提供するステップと、
前記センシング表面を分析されるべき流体に接触させ、それによって前記センシング表面上の前記被分析物の吸着を可能にするステップと、
局所表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、および金属増強蛍光（ＭＥＦ）測定のうちの少なくとも１つによって前記センシング表面上の前記被分析物の吸着を検出するステップと、
ＱＣＭ測定によって吸着質の量を決定するステップとを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般に、生物学的、生化学的、および／または化学的物質を感知するための二重原理センサー（ｄｕａｌ－ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｓｅｎｓｏｒ）に関する。より具体的には、本発明は、たとえば、局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）および金属増強蛍光（ＭＥＦ）などのプラズモンセンシングが可能な水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）センサーに関するものである。

【背景技術】

【0002】

ＱＣＭセンサーは、水晶または他の圧電材料から作られたウェハを含む。ウェハは、その２つの表面上に配設された電極を有する。分析されるべき物質がセンシング表面上に吸着されたときに、これは水晶振動子の共振周波数にわずかな変化を引き起こす。逆圧電効果を介して水晶を機械的共振に励起することによって、共振周波数のシフトが測定され、吸着（または除去）された質量が推定され得る。ＱＣＭセンサーは、ナノグラム／ｃｍ^２の程度で加重できる、非常に感度の高いスケールである。周波数のシフトは、解析的方程式を使用して吸着質量に関連付けられ得る。

【0003】

ＱＣＭは無標識であり、表面に導入された受容体で被分析物特異的にされ得る。被分析物と表面との相互作用すべてが受容体により生じるかどうかを見分ける手段はない（任意の無標識検出の共通の問題点）。これは、一部は、他のタイプの情報、たとえば分子からの振動信号、または蛍光信号によって回避され得る。したがって、バイオアッセイの別のパラメータ、たとえば分子の振動スペクトルまたはそれらの蛍光について独立したフィードバックを提供する追加の技術は、分析感度およびキャリブレーション感度の両方を増強するのに役立ち得、ＱＣＭ測定の結果を検証するのに役立ち得る。しかしながら、そのような直交するセンシングモダリティはＱＣＭと併せて難題であるが、それは、特に、追加のセンシング技術が、好ましくはＱＣＭチップ１つ当たりのコスト（したがって１実験当たりのコスト）を著しく高めることなくＱＣＭチップに適応させる必要があるからである。

【0004】

ＳＰＲは、プラズモン材料と、たとえば空気、水、または別の流体などの、別の媒質との界面で生じる化学変化を検出するための方法である。ＳＰＲは、金属表面上の分子吸着から生じる光学的厚さ（すなわち、屈折率）の変化を測定する。

【0005】

ＳＰＲおよびＱＣＭは、たとえば国際公開第ＷＯ２００６／０３１１９８号および国際公開第ＷＯ２０１０／１３０７７５号において報告されているように、以前に組み合わされている。

【0006】

国際公開第ＷＯ２００６／０３１１９８号では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および重量測定センシングが可能なセンサーで使用するためのセンサーチップアセンブリを開示している。アセンブリは、第１の表面と、第１の表面に対向する第２の表面とを有する透明圧電基板を備える。アセンブリは、基板の第１および第２の表面上にそれぞれ設けられた第１および第２の薄膜金属電極も含む。第２の薄膜金属電極は、光線が基板の第２の表面を透過し、第１の薄膜金属電極から反射することができるように基板の第２の表面上に位置決めされる。アセンブリは、第２の薄膜金属電極に隣接して配設されている減衰全反射（ＡＴＲ）カプラも備える。

【0007】

国際公開第ＷＯ２０１０／１３０７７５号は、散逸モニタリング付き水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ－Ｄ）と局在表面プラズモン共鳴センサー（ＬＳＰＲセンサー）とを組み合わせる配置構成に関する。

【0008】

ＱＣＭおよびＳＰＲセンシング技術は、それ固有の特定の強みと弱みとを有する。ＱＣＭとＳＰＲとの組合せは、個別に取り上げた両方の技術に関して分析能力を改善するが、そのような組み合わされたセンサーにはまだ改善の余地がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【文献】国際公開第ＷＯ２００６／０３１１９８号

【文献】国際公開第ＷＯ２０１０／１３０７７５号

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の第１の態様によれば、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）センサーが提案されている。ＱＣＭセンサーは、圧電基板、および圧電基板と接触する少なくとも２つの電極を備え、これにより、逆圧電効果を通じて中に剪断変形を誘発する。基板は、センシング表面と、その表面上の、表面から突起しているプラズモンナノ粒子蓄積のパターンとを有する。ナノ粒子の各蓄積は、瘤の周りに配置構成されている複数のプラズモンナノ粒子を含む。パターンの蓄積の平均直径に相当するか、またはそれよりも小さい距離（蓄積間距離）で分離されたパターンの隣接する蓄積の間に、プラズモンホットスポットが存在する（これらのプラズモンホットスポットは「蓄積間プラズモンホットスポット」と呼ばれる）。この文脈において、第１の蓄積と第２の蓄積との間の蓄積間距離は、第１の蓄積のナノ粒子と第２の蓄積のナノ粒子との間に見ることができる最小の距離であると考えられることは注目に値する。好ましくは、前記蓄積間距離は、２０ｎｍ以下、より好ましくは１５ｎｍ以下、最も好ましくは１０ｎｍ以下に相当する。好ましくは、瘤は、本質的に楕円体キャップ形状（たとえば、回転楕円体キャップ形状）である。瘤の高さ（ｈ）と底部直径（Ｄ）との比ｈ／Ｄは、好ましくは１以下であり、より好ましくは、０．１≦ｈ／Ｄ≦０．８であり、なおもより好ましくは０．２≦ｈ／Ｄ≦０．７である。瘤の楕円体キャップ形状のおかげで、瘤間の隙間は基板に向かって先細りになり、被分析物部分は隙間の「底」に、したがって蓄積間プラズモンホットスポットにより容易に到達することができる。好ましくは、１０ｎｍ未満である蓄積間距離の割合は、蓄積間距離の総数の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％、なおもより好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％である。

【0011】

表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）および金属増強蛍光（ＭＥＦ）に基づくプラズモンセンシングは、プラズモンナノ構造間の（プラズモン）ホットスポットとして知られている特定の部位における増強された電磁場（ＥＭ）の存在に依存する。これらのナノ構造が特定の波長で励起されると、電磁場が発生し、局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）を生じさせる。ナノ粒子蓄積の近接は、そのようなホットスポットがセンシング表面上に比較的高い密度で出現することの確認である。

【0012】

個々の蓄積の中で、ナノ粒子が近づき合う可能性があることは注目に値する。好ましくは、最近傍ナノ粒子間の蓄積内の粒子間分離は、平均ナノ粒子直径に相当するか、またはそれ未満である。より好ましくは、最近傍ナノ粒子間の蓄積内の粒子間分離は、平均ナノ粒子径の１００％に相当するか、またはそれ未満（または９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％または３０％未満）である。ナノ粒子が蓄積内でナノギャップ（ｎａｎｏｇａｐ）を形成するという事実から、第２のタイプのプラズモンホットスポット（「蓄積内プラズモンホットスポット」）が生じる。したがって、ＱＣＭセンシング表面上のパターンは、二重長さスケール（ｄｕａｌ－ｌｅｎｇｔｈ－ｓｃａｌｅ）プラズモンホットスポットを有する。

【0013】

ＱＣＭを使用するナノ粒子の表面濃度、およびプラズモン表面上の被分析物の正確な測定により、バイオアッセイにおいてより高い感度が見つかった。これは、被分析物のサイズに依存する蓄積内または蓄積間ホットスポットにおける被分析物の共局在化に起因するものとしてよい。

【0014】

瘤の幾何学的形状およびナノ粒子の蓄積を最適化することに加えて、センシング表面を慎重に選択することによって、（局所的に）増強された電磁場が得られ得る。たとえば、反射性金表面は、いわゆるミラー効果を通じてＥＭ場増強に寄与することが可能である。

【0015】

プラズモンナノ粒子は、任意の形状（たとえば、三角形、棒状、立方体、八面体など）であり得る。しかしながら、好ましくは、プラズモンナノ粒子は、球状である。

【0016】

好ましくは、プラズモンナノ粒子は、７から５０ｎｍの範囲、より好ましくは８から４０ｎｍの範囲、さらに好ましくは８から３０ｎｍの範囲内の平均直径を有する。本明細書の文脈において、「直径」という用語は、（ナノ粒子蓄積であり得る）考察対象の物体の凸包に接する２つの対向する平行平面の間に形成され得る最小の距離を意味する。直径の測定は、ＳＥＭおよび／またはＡＦＭによって、直接および／または間接的な測定を使用して行われ得る。ＳＥＭによる直接直径測定が、考察対象の物体の境界がきれいでないという理由から困難であることが判明した場合（高帯電表面の場合）、測定は、ＡＦＭまたはＳＥＭによる間接測定を使用して行われ得る。ＡＦＭは、方位分解能に影響を与えるチップコンボリューション効果に悩まされることが知られている。それにもかかわらず、これらの効果は、チップ仕様を考慮することによって程度補正できる。特徴直径は、ＳＥＭによって間接的に測定することもできる。この技術によれば、知られている直径の導電性（金属など）ナノ粒子は、考察中の物体上に吸着され、導電性および分解能を改善する。次いで、考察中の物体の直径は、二倍のナノ粒子直径を可能な最大偏位として使用して決定され得る。

【0017】

プラズモンナノ粒子は、好ましくは、プラズモン金属ナノ粒子を含む。プラズモン金属は、たとえば、金、銀、またはアルミニウムを含む。これらのうち、金ナノ粒子は、典型的な用途において特に好ましい場合がある。

【0018】

プラズモンナノ粒子は、キャッピング剤、たとえば、クエン酸塩、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、キトサン、または他の有機分子で安定化され得る。

【0019】

センシング表面は、プラズモン金属表面、たとえば、金表面を含むことが可能である。有利には、センシング表面は、ＱＣＭセンサーの電極のうちの１つに属する。

【0020】

プラズモンナノ粒子は、好ましくは、プラズモンナノ粒子上のコーティングおよび／または電極上のコーティングによって電極から電気的に絶縁される。コーティングは、プラズモンナノ粒子上および／または電極表面上のキャッピング剤または官能基化層のコーティングであり得る。

【0021】

ナノ粒子蓄積は、被分析物に結合するための官能基化を含んでいてもよい。好ましくは、プラズモンナノ粒子は、被分析物に特異的に結合する受容体部分で官能基化される。

【0022】

センシング表面は、ナノ粒子蓄積間に、被分析物に結合するための官能基化を含んでいてもよい。ナノ粒子蓄積間の官能基化およびナノ粒子蓄積の官能基化は、同じ被分析物に特異的であり得る。代替的に、ナノ粒子蓄積間の官能基化およびナノ粒子蓄積の官能基化は、異なる被分析物に対して特異的であり得る。

【0023】

本発明のさらなる態様は、被分析物を検出するための方法に関する。この方法は、本明細書において説明されているＱＣＭセンサーを提供することと、センシング表面を被分析物の存在および／または濃度について分析されるべき流体と接触させ、それによってセンシング表面上の被分析物の吸着を可能にすることと、局所表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、および金属増強蛍光（ＭＥＦ）測定のうちの少なくとも１つによってセンシング表面上の被分析物の吸着を検出することと、ＱＣＭ測定によって吸着質の量を決定することとを含む。

【0024】

プラズモンアッセイは、一般に、プラズモン信号（たとえば、ラマン強度または蛍光強度）を、センサーに適用される被分析物の濃度の関数として関係付け、キャリブレーション曲線を取得する。しかしながら、電磁場増強はホットスポットにおいて強く非線形であるので、アッセイは、センシング表面上に存在する実際の分子に関するいかなる情報も提供しない。生体分子付着に関する情報は、アッセイ条件に関連した表面濃度変化に対する独立したフィードバックを介して、センサー界面を最適化するために必要である。したがって、電磁場増強、およびチップ上への生体分子付着は、互いに独立して測定できることが理解されるであろう。これは、合理的な界面設計およびトラブルシューティングに対する新しい可能性を開いている。

【0025】

要約すると、本発明は、蓄積間ホットスポットを有するように設計されたパターンを使用してＱＣＭとプラズモンセンシングとを組み合わせるものである。プラズモンセンシングによって行われる相補的測定は、ＱＣＭによって測定される質量変化と効果的に相関させることができる。プラズモンセンサーは、最終的な信号に実際に寄与している分子の表面濃度も提供する固有の可能性を提供する。ＱＣＭ測定は、プラズモン信号に実際に寄与する分子の表面上の濃度を示し、したがって、両技術の組合せは、ケースバイケースで必要な場合に、特定の被分析物に対してナノスケールレベルでセンシング表面の構造を最適化する可能性を開く。

【0026】

次に、例として、本発明の好ましい非限定的な実施形態は、添付図面を参照しつつ詳細に説明される。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】プラズモンセンシングのためにプラズモンナノ構造（右側の増強された細部）で修飾されたセンシング表面を有するＱＣＭセンサー（左側の分解斜視図に示されている）の概略図である。

【図2】本発明によるＱＣＭセンサーのセンシング表面上のプラズモンナノ構造のパターンの概略斜視図である。

【図3】本発明によるＱＣＭセンサーを用いて実施される実験の説明図である。

【図4】図３の実験と比較するためにガラス基板上で実施された同じ実験の説明図である。

【図5】図５（ａ）は、石英チップ上の２つの異なるナノ粒子パターンで行ったＭＥＦ測定結果を示す図である。図５（ｂ）は、金コーティング石英チップ上の２つの異なるナノ粒子パターンで行ったＭＥＦ測定結果を示す図である。

【図6】石英上の同じナノ粒子パターンおよびこれらのパターンに対する対応するＳＥＲＳスペクトル強度で得られたＳＥＲＳ測定の結果を示す図である。

【図7】金コーティング石英上の同じナノ粒子パターンおよびこれらのパターンに対する対応するＳＥＲＳスペクトル強度で得られたＳＥＲＳ測定の結果を示す図である。

【図8】ナノ粒子蓄積上およびナノ粒子蓄積間のセンサー表面上の表面官能基化を含む逆ミセル瘤上のプラズモンナノ粒子蓄積を含むＱＣＭセンサーの概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本発明の一実施形態によるプラズモンセンシング機能を有するＱＣＭセンサーの一例が図１に例示されている。ＱＣＭセンサー１０は、たとえば水晶振動子（典型的にはＡＴ－またはＳＣ－カット）などの圧電結晶から作られた毛髪のように薄いウェハ１２を含む。ウェハ１２は、その前面１６上に配置構成された第１の平面状の電極１４、さらにはその後面２０上に第２の電極１８を有する。第１の電極と第２の電極との間に印加される電圧は、圧電結晶に剪断変形を誘発させる。交流電圧は、結晶に前後振動を引き起こす。センシング表面上に物質が吸着されるか、またはそれから放出されたときに、これは発振器の共振周波数にわずかな変化を引き起こす。逆圧電効果を介して水晶を機械的共振に励起することによって、共振周波数のシフトが測定され、吸着（または除去）された質量が推定され得る。ＱＣＭセンサーは、ｎｇ／ｃｍ^２の程度で加重できる、非常に感度の高いスケールである。周波数のシフトは、散逸を考慮した解析的方程式を使用して吸着質量に関係付けられ得る（散逸モニタリング付き水晶振動子マイクロバランス、ＱＣＭ－Ｄ）。

【0029】

第１の電極１４の表面は、ＱＣＭセンサー１０のセンシング表面を表す。プラズモンナノ粒子蓄積２２のパターンがセンシング表面上に配置構成される。ナノ粒子２２の各個別蓄積は、瘤２６の周りに配置構成されている複数のプラズモンナノ粒子２４を含む。ナノ粒子は、同じ蓄積の最近傍ナノ粒子間の粒子間分離が平均ナノ粒子直径の１００％に相当するか、またはそれ未満になるように瘤２６の周りに比較的高密度に組織化される。プラズモン結合は、粒子が近づくほど効果が強くなるが、粒子の直径未満の距離で分離されているときに起こり得る。したがって、より小さい粒子間分離、たとえば８０％未満または６０％未満が好ましい場合がある。さらに、瘤２６、したがって蓄積も、密度の高いパターンを形成するように配置構成される。このパターンの格子ピッチは、パターンの隣接する蓄積が１０ｎｍ以下で分離されるように選択される。ナノ粒子間の（蓄積間および蓄積内）距離が小さいおかげで、プラズモンホットスポットがセンシング表面に存在する。これらのホットスポットは、蓄積内ホットスポットおよび蓄積間ホットスポットを含んでもよく、これらは、典型的には、異なる特性寸法を有していてもよい。

【0030】

生体分子被分析物を検出する表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）に基づくプラズモンバイオアッセイは、わずか数ナノメートルの空間分解能で金属ナノ構造幾何学的形状を制御すると同時に、表面上の生体分子相互作用を決定するバイオアッセイパラメータによる影響を受けるという両方のことに依存している。ＳＥＲＳは、金属ナノ構造体に近接した電磁場への非線形増強に依存している。電磁（ＥＭ）場増強は、ランダム表面さらには秩序表面でも示されており、後者は結果として生じるプラズモン増強に向かう幾何学的変数の影響の合理的理解に寄与している。高ＥＭ増強の領域は、別に電磁（またはプラズモン）ホットスポットと呼ばれるが、鋭い金属エッジでの避雷針効果によって生じ、プラズモン結合は分離が密接している金属構造間で生じる。周期的ナノアレイからのナノギャップは、ギャップ特性の分布が少ないという利点を生み出し、モデル化を容易にし、また最適なギャップ寸法が識別されたときに増強を最大化する。高増強ＥＭ場は、金属増強蛍光および表面増強ラマン分光法を含むプラズモン増強分光法の基礎である。高い近接性は結果としてＳＥＲＳに対する最良の増強をもたらすことが知られているが、センシングに対するこれらの構造の直接的な適用は、ギャップそれ自体よりも大きい分子の空間的要件に対して基本的な制限を課す。ギャップから離れたＥＭ場の距離依存減衰が与えられた場合、ホットスポットそれ自体の程度のものであり、それらの領域に戦略的に位置決めされた種によってのみ、増強が最もよく感じられるであろう。センシング実験において、ホットスポットに結合するように被分析物を選択的に誘導する試みがなかった場合、被分析物は、アレイ全体を通して統計的に分布され、ホットスポット領域内に存在する分子からの振動ラマン信号は、信号寄与を不均衡に支配することになる。これは、被分析物の濃度が必ずしも信号強度を決定し得ないが、ホットスポットに関係する分布が最終的に全体の感度を決定することを考えると、定量的センシングを特に難しくする。したがって、プラズモンバイオアッセイの合理的な最適化のためには、独立した光学的および生物学的相互作用分析を実行することによって、ＥＭ増強および被分析物表面濃度の最終的信号に向かう寄与を無相関にすることが必要であろう。

【0031】

ナノ粒子蓄積パターンは、従来のＱＣＭセンサーの平坦金前面電極上のＰＳ－ｂ－Ｐ２ＶＰ（ポリ（スチレンブロック－２－ビニルピリジン））逆ミセルのナノパターンによって誘導される金ナノ粒子の自己組織化によって作製され得る。

【0032】

ＰＳ－ｂ－Ｐ２ＶＰ逆ミセルアレイは、ｍ－キシレンの溶液から析出させることができた。薄膜は、ＱＣＭセンサーの前面電極上にスピンコーティングすることによって得ることができる。この薄膜自体は、ＰＳ薄膜で覆われたＰ２ＶＰドメインの六角格子として現れる。ＰＳ－ｂ－Ｐ２ＶＰのテンプレートまたは瘤の中心間間隔は、共重合体特性を介して調整され得る。ピリジル基部分の塩基性により、各テンプレートの中心Ｐ２ＶＰブロックは、穏やかな塩基性から酸性までのｐＨ値の水媒体中で正味の正電荷を示す。各テンプレートのＰＳコーティングの厚さは、制御された酸素プラズマ反応性イオンエッチングによって減らされ、それによって瘤間の距離は（中心間距離を変えることなく）増やされ得る。テンプレートを有するＱＣＭセンサーの表面は、その後、クエン酸安定化金ナノ粒子の水分散液中でインキュベートされ得る。

【0033】

金ナノ粒子のζ（ゼータ）電位は負であり、逆ミセルテンプレートはナノ粒子懸濁液のｐＨ（ｐＨ＜ｐＩ、「ｐＩ」は逆ミセル膜の等電点を示す）で正のζ電位を示し、金ナノ粒子は逆ミセルテンプレート上に静電的に引き寄せられる。この結果、逆ミセルの瘤の周りに金ナノ粒子の蓄積（クラスター化）が生じる。Ｐ２ＶＰドメインは互いに空間的に隔離されているので、得られるナノ粒子蓄積も空間的によく解像される。

【0034】

Ｎは逆ミセル瘤１個当たりの金ナノ粒子の（平均）個数を表すとする。Ｎは、瘤の寸法をチューニングすることによって調整され得る。これは、異なる凝集数を有する逆ミセルを結果としてもたらす特定の共重合体特性、たとえば、分子量、ブロック組成、またはミセル形成条件を選択することによって行うことができる。それに加えて、または代替的に、瘤の寸法（高さ、直径、形状）は、制御された酸素プラズマ反応性イオンエッチングによって調整することもできる。

【0035】

図３は、その前面金電極の表面上にプラズモンナノ粒子蓄積のパターンを含むＱＣＭセンサーを用いて行われた研究に関係する。ＱＣＭセンサーは、センシング表面上の金ナノ粒子の質量、したがってＮだけ異なる第１（ＮＣＡ＃Ａ）および第２（ＮＣＡ＃Ｂ）のバージョンで生産された（図３ｂ）。ＮＣＡ＃ＡおよびＮＣＡ＃Ｂに対するナノ粒子の質量は、それぞれ約１０μｇ／ｃｍ^２および１５μｇ／ｃｍ^２であったが、ＮＣＡ＃ＡおよびＮＣＡ＃Ｂに対する瘤の密度は、それぞれ１００±１０／μｍ^２および３００±３０／μｍ^２であった。ＮＣＡ＃ＡおよびＮＣＡ＃Ｂの蓄積間距離は、同じ（約１０ｎｍ）であり、同じことが蓄積内距離についても言えた（約５ｎｍ）であった。

【0036】

第１および第２のＱＣＭセンサー上のナノ粒子は、リガンド修飾ナノ粒子を取得するためにビオチン化された。ＮＣＡ＃ＡおよびＮＣＡ＃Ｂは、最初に、ＰＥＧビオチンチオール（０．４ｋＤａ）（ＢＰＴ）を使用し、脱イオン水中の２ｍＭのＰＥＧビオチンチオールの新鮮な溶液に２時間浸漬することによって官能基化された。その後、基板は、ＰＢＳおよびＤＩ水ですすがれて、表面に緩く結合したＢＰＴを除去した。その後、基板はＰＢＳ中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の新しく調製された１％溶液中に漬され、金またはポリマー表面の露出をブロックし、ストレプトアビジンの非特異的結合を防いだ。第３のステップにおいて、さいの目に切られ穴をあけられたＰＤＭＳブロックが官能基化パターンを有する基板よりも上に置かれ／揃えられ、様々な濃度のストレプトアビジン溶液がウェルに注がれ、表面結合ビオチン頭部基をストレプトアビジンコンジュゲート色素分子に露出した（図３ｃ）。各基板は、１～８００ｎＭの濃度範囲で、各ウェル内で異なる濃度のＣｙ５色素（ＳＡ－Ｃｙ５）とコンジュゲートされたストレプトアビジンに２時間暴露された。これに続いて、緩衝液を用いたすすぎを数サイクル繰り返し、次いでＰＤＭＳブロックを除去し、その後窒素で洗浄し、乾燥させた。ＳＡ－Ｃｙ５の異なる表面濃度の領域を露出する基板は、ＳＥＲＳ測定を受けた。吸着質量ＳＡ－Ｃｙ５は、ＱＣＭ－Ｄによって測定された。ＳＡ－Ｃｙ５の吸着質量は、金ナノ粒子の質量とよく相関していることがわかった（図３ｄ）。ＳＥＲＳ強度も同様に測定され（図３ｅ）、金ナノ粒子の質量よりもはるかに多く増えることがわかった（図３ｆ）。

【0037】

図３に例示されているのと同じ実験が、ガラス基板上でも行われた。基板を除き、実験のすべての条件は同一であった。しかしながら、金ナノ粒子の質量が大きくなるとともにＳＥＲＳ強度が低下することが判明した。

【0038】

図５は、（ａ）石英チップおよび（ｂ）金コーティング石英チップについてのＮＣＡ＃ＡおよびＮＣＡ＃Ｂに対するＳＡ－Ｃｙ５の生体分子アッセイを実行することによって得られたＭＥＦシグナルの比較を示している。

【0039】

測定されたＳＥＲＳとＭＥＦの強度の間の有意な差は、いわゆるミラー効果に起因し得る。ミラー効果によってブーストされたプラズモンホットスポット（金基板による）は、実際にＳＥＲＳ信号に不釣り合いに寄与している可能性がある。プラズモンナノ粒子が連続金属膜の上に組織化されるときに、金属膜内での自鏡像と結合することを許される。これは、ＥＭ場を蓄積間ギャップのところに集中させる。基板がガラスであるときには、ミラー効果はなく、ナノ粒子のより高い濃度がＳＥＲＳ信号に悪影響を及ぼすことすらわかった。図３および図４は、電磁場増強がホットスポットにおいて強く非線形であるので、プラズモンアッセイでは、センシング表面に存在する実際の分子に関する情報を提供しないことを例示している。

【0040】

ナノ粒子蓄積のサイズが小さくされたときに、蓄積間距離は一定に保たれている間に、タンパク質バイオアッセイに向けたＱＣＭセンサーの感度が高くなった。感度のこの増大は、大域的ナノ粒子密度にも、タンパク質表面濃度にも相関せず、ホットスポットにおける電磁波増強が決定要因であることを示している。数値シミュレーションは、より大きな蓄積については蓄積内ホットスポットで、またより小さな蓄積については蓄積間ホットスポットで、電磁波増強が大きくなり得ることを示している。ビオチン－ストレプトアビジン対の寸法が与えられた場合、電磁ホットスポットとの結合事象の空間的共局在は、蓄積間ホットスポットでのみ実現できる。表面が蓄積内ホットスポットよりも小さい被分析物分子に対して問題があったときに、より小さい蓄積はより大きな蓄積に比べてわずかに高い感度を示したに過ぎなかった。より小さい蓄積に対するより高い信号レベルに有利な別の因子は、ホットスポットのより高い密度を含む。蓄積のサイズの縮小は、タンパク質などのより大きい被分析物が、タンパク質バイオアッセイの場合のより高い感度を可能にした、蓄積間空間のＥＭホットスポットを利用する機会を増やすことを可能にした。

【0041】

実施された試験において、周期的な金ナノ粒子蓄積アレイの幾何学的形状は、分子被分析物の検出に向かってより高い感度を使用可能にするために被分析物の寸法に関連して手直しされ得る。蓄積間および蓄積内の粒子間距離に対応する２つの異なる長さスケールのプラズモンホットスポットを有するパターンが調査された。より大きいタンパク質分子に対応できるようにより多くの蓄積間ホットスポットを有するより小さい蓄積を有する第１のパターン（ＮＣＡ＃Ａ）は、より少ない蓄積間ホットスポットを有する第２のパターン（ＮＣＡ＃Ｂ）に比べてタンパク質アッセイにおいてより感度が高いことが判明した。しかしながら、両方のパターンは、蓄積間ホットスポットさらには蓄積内ホットスポットの両方に対応できるより小さい被分析物分子に向かう類似の感度を有していた。この研究結果は、プラズモンセンシングに対するナノアレイを合理的に設計するためにホットスポットの幾何学的形状に関して被分析物のサイズを考慮する必要性を支持している。

【0042】

図３および図４を参照しつつ説明されているような類似の実験（ＳＡ－Ｃｙ５の検出）は、著しく小さい標的被分析物１－ナフタレンチオール（１－ＮＴ）を用いて実施された。ＳＡ－Ｃｙ５は比較的大きい分子であり、したがって蓄積内ホットスポットへのアクセスがないかまたは非常に限られていると予想される一方、１－ＮＴは蓄積内ホットスポットへのアクセスがかなり良好であるべきである。

【0043】

反射率の低い基板、すなわち石英、および反射率の高い基板、すなわち金コーティング石英上に作製されたＮＣＡ＃ＡおよびＮＣＡ＃Ｂは、システマティックに濃度を高めた１－ＮＴのエタノール溶液中に一晩漬された。次いで、各濃度からの基板は、直ちに共焦点ラマン装置（ＩｎＶｉａ－Ｒｅｎｉｓｈａｗ Ｉｎｃ．、英国所在）でスキャンされ、１３７２ｃｍ^－１の最も強いピークを辿って、表面からのＳＥＲＳ信号に対する単分子層からサブ単分子層までの影響を理解した。溶液中の濃度が低下すると、表面濃度も同じ傾向を示すと予想され、これはここでＳＥＲＳ信号を通じて観察され得る。

【0044】

図６は、
（ｉ）石英上に作製されたＮＣＡ＃ＡおよびＮＣＡ＃Ｂパターンに対する１－ＮＴ濃度の関数として測定されたＳＥＲＳ強度、および
（ｉｉ）これらのＮＣＡ＃Ａ（左）およびＮＣＡ＃Ｂ（右）パターンに対するＳＥＲＳスペクトル強度
を示す。
図７は、
（ｉ）金コーティング石英（ＱＣＭセンサー）上に作製されたＮＣＡ＃ＡおよびＮＣＡ＃Ｂパターンに対する１－ＮＴ濃度の関数として測定されたＳＥＲＳ強度、および
（ｉｉ）これらのＮＣＡ＃Ａ（左）およびＮＣＡ＃Ｂ（右）パターンに対するＳＥＲＳスペクトル強度
を示す。

【0045】

したがって、ＮＣＡ＃Ａパターンは、下に金膜がない場合に石英チップ上でより良い性能を示すが、ＮＣＡ＃Ｂパターンは、下に金膜があるときにより良い性能を示す。この現象は、パターンの高さの差異、さらには金膜の存在によるミラー効果に対する表面からの臨界距離の差異に起因し得る。

【0046】

図８は、ナノ粒子蓄積上およびナノ粒子蓄積間のセンサー表面上の表面官能基化を含む逆ミセル瘤３２上のプラズモンナノ粒子蓄積を含む発明のＱＣＭチップ３０の一実施形態を示している。この瘤パターンは、従来のＱＣＭセンサーの平坦金前面電極上の逆ミセルの自己組織化によって作製された。次いで、ナノ粒子蓄積は、逆ミセル瘤３２上の金ナノ粒子３４を自己組織化によって形成された。

【0047】

ＱＣＭセンサー表面は、最初に、ＰＥＧビオチンチオール（０．４ｋＤａ）（ＢＰＴ）の官能基化３６を用いて、脱イオン水中の２ｍＭのＰＥＧビオチンチオールの新しく調製された溶液中に２時間浸漬することによって官能基化された。その後、基板は、ＰＢＳおよびＤＩ水ですすがれて、表面に緩く結合したＢＰＴを除去した。その後、基板はＰＢＳ中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の新しく調製された１％溶液中に漬され、金またはポリマー表面の露出をブロックし、ストレプトアビジンの非特異的結合を防いだ。ＢＰＴは、チオール－金相互作用によって誘導される金表面上の自己組織化単分子層を形成し、その後、生体特異的相互作用を通じてＳＡ－Ｃｙ５の付着を誘導すると予想された。ＳＡ－Ｃｙ５の吸着に利用可能なナノ粒子表面の部分は、ＢＰＴ層の厚さおよびキャップの高さと一緒にナノ粒子の半径を考慮して、球状キャップとしてモデル化され得る。

【0048】

ＳＡ－Ｃｙ５ ４０を用いた吸着試験は、ＳＡ－Ｃｙ５の吸着がナノ粒子蓄積間の隙間３８内にも生じることを明らかにした（図８）。実験の条件下では、ＢＰＴまたはＳＡ－Ｃｙ５がナノ粒子蓄積の周り（およびそれらの間）の領域に吸着することはないと予想された。しかしながら、ナノ粒子蓄積の周り（およびそれらの間）の領域は、表面上に析出したときに逆ミセルの冠状ブロックの融合によって形成されたポリマー４２の薄層を有していることがわかった。対照実験（ポリマーの薄膜でコーティングされたＱＣＭセンサーがＢＰＴに対して露出された）では、ＢＰＴはこのようなポリマー表面によく吸着し、約４００ｎｇ／ｃｍ^２の密度、次いで無視できる量のＢＳＡおよび６９０ｎｇ／ｃｍ^２のＳＡ－Ｃｙ５が観察された。露出されたポリマー領域に基づき、これはナノ粒子蓄積間の３６２ｎｇ／ｃｍ^２の密度に対応するであろう。ポリマー層４２上のビオチン－ストレプトアビジン相互作用の強い親和性は、ＳＡ－Ｃｙ５の観察された質量密度に向かう蓄積間表面からの寄与をよく支持している。これは、モデル化された表面からの理論的全質量密度を４１４ｎｇ／ｃｍ^２の観察された値で近似している。ナノ粒子蓄積間でＳＡ－Ｃｙ５が利用可能であることの結果として、蓄積間電磁ホットスポットを利用可能にし、ＭＥＦアッセイにおける高感度を使用可能にする。

【0049】

特定の実施形態および実施例が本明細書において詳細に説明されているが、当業者であれば、それらの詳細に対する様々な修正形態および代替形態が本開示の全体的な教示に照らして開発されることが可能であることを理解するであろう。したがって、開示されている配置構成は、例示することのみを意図しており、本発明の範囲を限定せず、本発明の範囲は付属の請求項の全範囲およびそのすべての等価物に対して与えられるものとする。

【符号の説明】

【0050】

１０ ＱＣＭセンサー
１２ ウェハ
１４ 第１の平面状の電極
１６ 前面
１８ 第２の電極
２０ 後面
２２ プラズモンナノ粒子蓄積
２４ プラズモンナノ粒子
２６ 瘤
３０ ＱＣＭチップ
３２ 逆ミセル瘤
３４ 金ナノ粒子
３６ 官能基化
３８ 隙間
４０ ＳＡ－Ｃｙ５
４２ ポリマー

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】